JPH06506117A - ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）蛋白質分解活性に影響する遺伝子およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２９、プロテイナーゼＡ活性とカルボキシペプチダーゼ活性との欠損した請求項 ２８記載の酵母細胞。

３０、タンパク分解感受性組換え産物の表現方法であって、前記産物をコードす るＤＮＡによって請求項２８記載の細胞を形質転換させ、前記細胞を前記タンパ ク分解感受性産物が表現されるような条件下で培養することを含む方法。

３１、表現時に、前記宿主生物のカルボキノペプチダーゼ活性に直接又は間接的 に影響を及ぼすタンパク質をコードする細胞の遺伝子を、前記宿主菌株の栄養要 求性表現型を補足するマーカー遺伝子の挿入によって改質される前記遺伝子の欠 失形によって組換えることによって、細胞のタンパク分解活性を欠損させ：かつ マーカー遺伝子をヒスチノノールデヒドロゲナーゼ遺伝子、アルギニノスクシネ ート　リアーゼ遺伝子、又はオロチジン−５°−ホスフェートデカルボキシラー ゼ遺伝子から選択する請求項３ｏ記載の方法。

３２、請求項１６記載の方法を用いて宿主菌株のタンパク分解活性を欠損させる ことを含む、タンパク分解感受性組換え産物の表現方法であって、前記宿主菌株 が少なくとも１種の栄養要求性マーカー遺伝子を欠き、かつ前記宿主菌株が転写 の読み取りフレーム方向において、下記ヌクレオチド配列：（ｉ）メチロトロー フ酵母のメタノール反応性遺伝子のプロモーター領域：（ｉｉ）本質的に、 （ａ）任意の分泌シグナル配列と、 （ｂ）タンパク分解感受性タンパク質とから成るポリペプチドをコードする配列 と、（ｆｆｌ）メチロトローフ酵母中の機能的転写終結因子と、を有する表現カ セットを含む少な（とも１個のＤＮＡフラグメントによって形質転換され、前記 配列が前記ポリペプチドをコードする配列の転写に関して作用的に相互に関係す る方法。

３３、前記宿主菌株が少なくとも２種の栄養要求性マーカー遺伝子を欠損する請 求項３２記載の方法。

３４−前記栄養要求性マーカー遺伝子がＨＩＳ４遺伝子とＵＲＡ３遺伝子である 請求項３３記載の方法。

３５　タンパク分解感受性産物がＩＧＦ−１であり、ＩＧＦ−１をコードするＤ ＮＡによる前記宿主の形質転換に用いられるマーカー遺伝子がＨＩＳ４遺伝子で ある請求項３４記載の方法。

３６、宿主をタンパク分解活性欠損にさせるために用いられる改質遺伝子が、そ の非改質形において、宿主のカルボキシペプチダーゼ活性に影響を及ぼすタンパ ク質を特徴とする請求項３５記載の方法。

３７、改質遺伝子がコード配列の一部の欠失によって形成される請求項３６記載 の方法。

３８　前記組換え産物を表現する組換え菌株が菌株Ｍ＋［ＭＢ２０６Ｓ１である 請求項３７記載の方法。

３９、ビヒア属の種からのオルチジンー５′−ホスフェートデカルボキシラーゼ 遺伝子を含む単離ＤＮＡフラグメント。

４０、前記遺伝子が図１２に示す地図と実質的に同じ制限地図を有する請求項３ ９記載のＤＮＡフラグメント。

４１、前記遺伝子が配列ＩＤ　Ｎｏ、４に記載した配列と実質的に同じアミノ酸 配列を特徴とする請求項３９記載のＤＮＡフラグメント。

４２、前記遺伝子が配列ＩＤ　Ｎｏ、３に記載した配列と実質的に同じ核酸配列 を有する請求項３９記載のＤＮＡフラグメント。

４３、オルチジン−５°　−ホスフェートデカルボキシラーゼ遺伝子の欠損した ビヒア属の酵母細胞。

４４、前記酵母細胞がピヒア　パストリスの菌株である請求項４３記載の酵母細 胞。

４５、前記酵母細胞が菌株ピヒア　バストリスＧ５４−２である請求項４４記載 の酵母細胞。

４６、さらにタンパク分解活性欠損を含む請求項４３記載の酵母細胞。

４７　プロテアーゼＡ活性とカルボキシペプチダーゼ活性との欠損した請求項４ ６記載の酵母細胞。

４８、ピヒア　バストリス菌株Ｇ５４−２５２１−３／７又はＧ５４−２５２１ −４／１から選択される請求項４７記載の酵母細胞。

明細書 ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）蛋白質分解活性に影響する遺伝子およびその使用技術分 野 本発明は組換えＤＮＡ技術に関する。一つの特定の態様において、本発明は組換 え技術を用いて産生される酵母株および蛋白質分解プロセシングに含まれている 蛋白質、ならびに独立栄養性マーカー蛋白質をコードしているＤＮＡに関する。

別の態様において、本発明は組換え産物、特に蛋白質分解されやすい組換え産物 を産生ずる方法に関する。

従来技術 ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の株は組換え産物の生産のための有効な発現系として 開発されてきた。しかしながら、望ましくないことに組換え法により希望通り産 生されたいくつかの蛋白質産物（例えば、ＩＧＦ−１，ＥＧＦ、ＧＲＦなど）は 宿主生物により産生されるプロテアーゼにより分解されやすい。そのような場合 、高レベルの所望の生成物が発現されても、ある種の宿主株の蛋白質分解酵素の 存在による生成物の分解により生成物の回収率の減少がしばしばおこる。生成物 の回収は種々の蛋白質分解産物の存在のためさらに複雑である。

多（の組換え産物の生産のために２−１−７（Ｐｉｃｈｉａ）に基づく発現系を 良好に作動させるためには旦±７（Ｐｉｃｈｉａ）のある種の蛋白質分解活性を 減少または除去することが望まれるであろう。これにより、組換え旦±工（旦土 旦ｈｉａ）宿主中でのプロテアーゼ感受性産物の分解の可能性が減少するであろ う。

分解の可能性の減少によりそのような産物を実質的に無傷の形で発現および回収 する能力が促進されるであろう。

組換え体により生産される生成物の蛋白質分解の問題を減少または除去させるた めに種々の技術が応用できる。例えば、プロテアーゼ活性が阻害されるように組 換え体株が増殖する条件を修正することができる。例えばこのことは種々のプロ テアーゼ作用を阻害するのに十分なように培地のｐｔ−ｔを調節することにより 達成される。しかしながら、この方法はある種の組換え生成物を発現する宿主生 物の能力に（ならびに発現するやいなや、得られた生成物の安定度にも）影響を 与えるであろう。さらに、この方法は細胞外蛋白質分解に対する効果のみに制限 される。

また、組換えにより生産された蛋白質分解に敏感な生成物を分解する蛋白質分解 活性に関与する宿主生物のプロセシング酵素のいくつかまたは全部を修飾または 除去しようとする試みがある。しかしながら、真核生物における蛋白質分解過程 は非常に複雑であり連係が保たれている。従って、蛋白分解プロセシング経路に 含まれている１つまたはそれ以上の酵素の除去および／または修飾が宿主の生存 度に、および／または組換えにより生産された生成物の安定度に対して影響を及 ぼすかどうかを予測するのは不可能である。

ロテイナーゼＡはＳ、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＥＰ４遺伝子によ りコードされている。プロテアーゼＡは液胞性アスパルチル　プロテアーゼであ り、自己活性化ならびにカルボキシペプチダーゼＹおよびプロテアーゼＢのよう な別の液胞性プロテアーゼを続いて活性化できる。カルボキシペプチダーゼＹは この酵素のプロテイナーゼＡ媒介蛋白質分解プロセシング前では完全に不活性で あるらしいが、プロテアーゼＢ　（Ｓ、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の ＦＲＢ−１遺伝子によりコードされている）はその前駆体形（酵素がプロテアー ゼ媒介プロセシングを受ける前に存在する形）で約５０％生物的に活性であると 報告されている。

蛋白質分解活性を欠（旦、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および糸状菌が 異種ペプチドの組換え発現に使用されてきた。しかしながら、これらの生物はが 存在するため、これらの種々の生物の蛋白質分解プロセシング系は同じである必 要はない。実際、川（Ｐｉｃｈｉａ）内に存在する蛋白質分解活性の型に関して は現在はとんど知られていない。

さらに、サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはアスペルギＬ ｘ　（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｌ　１ｕｓ）と異なって、異種ペプチドの組換え発現に 使用される旦±７（Ｐｉｃｈｉａ）細胞は、典型的には高細胞密度で増殖され、 それは少くとも一部には発酵過程の間の発泡を最少にする株を選択することによ り可能である。そのような細胞の選択は培地内へ分泌される蛋白質の大きさを減 少させて発泡をおさえる多量のエンドおよびエキソプロテアーゼを産生ずる細胞 を選択することにより達成される。さらに、高細胞密度での増殖で異種ペプチド が高収率で得られるが、−刃高細胞密度での増殖は発酵培地中に比較的高レベル の液胞性プロテアーゼを供給する。典型的には〜１％の細胞が酵母発酵の間に溶 菌するので、高細胞密度は培地内へのかなりの量の細胞物質（液胞性プロテアー ゼを含む）の放出を伴う。従って、高細胞密度法における異種ペプチドの産生の 間に、旦±７（Ｐｉｃｈｉａ）により産生され、分泌されたい（らかの異種ペプ チドは実質的な蛋白質分解をうける。

従って、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）のプロテアーゼ欠失株を提供することおよびそ のような株を発生させる手段を提供するのが本発明の目的である。異種蛋白質の 発現のためのプロテアーゼ欠失株の使用もまた本発明の目的である。

発明の概要 本発明に従うと、ピキア（Ｐ　ｉ　ｃ　ｈ　ｉ　ａ）属の種の蛋白質分解過程に 含まれている遺伝子が単離され、特徴付けされた。そのような遺伝子の有効性と は、蛋白質分解感受性生成物の発現のための宿主として有用である蛋白質分解活 性が欠失−ドしている組換え構築物の発現のための優れた宿主である。本発明で 提供され分解感受性生成物の産生のための非常に有効な発現系を提供することで ある。

る。この遺伝子の有効性は、旦±７（Ｐｉｃｈｉａ）の株（Ｕｒａ−）と組合わ せて、蛋白質分解活性が欠損したｅ”ｉ−７（Ｐ　ｉ　ｃｈ　ｉ　ａ）の組換え 株の産生に使用するための選択系が提供されることである。そのようなＵｒａ− 株はまた、種々の異種生成物の組換え発現に使用される組換えＤＮＡ作製物によ る形質転換の宿主としても有用である。

図面の簡単な説明 図１は旦±７（Ｐｉｃｈｉａ）のカルボキシペプチダーゼＹ活性に影響する旦± ７　バストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）遺伝子の制限地図である。

図２はプラスミドｐＥＰ２０２の制限地図である。

図３はプラスミドｐＥＰ２０５の制限地図である。

図４はプラスミドｐＥＰ３０１の制限地図である。

図５はプラスミドｐＤＲ４０１の制限地図である。

図６はプラスミドｐＰＵ２０１の制限地図である。

図７はプラスミドｐＰＵ２０２の制限地図である。

図８はプラスミドｐＰＵ２０３の制限地図である。

図９はプラスミドｐＰＵ２０５の制限地図である。

図１０はプラスミドｐＰＵ２０６の制限地図である。

図１１はプラスミドｐＤＲ４２１の制限地図である。

図１２はと上１　バストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）オロチジン図 １３はｐＤＲ６０１およびｐＤＲ６０２の作製に使用された工程を要約している 。

図１４はプラスミドｐＤＲ６０１の制限地図である。

図１５はプラスミドｐＤＲ６０２の制限地図である。

図１６はプラスミドｐＤＬ５２１の制限地図である。

図１７はす±１　バストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）プロテイナー ゼＢの遺伝子の一部の制限地図である。

図１８はプラスミドｐＤＲ９１１の制限地図である。

発明の詳細な説明 本発明に従うと、ｅＪｅ７　（Ｐｉｃｈ　ｉａ）属の株の蛋白質分解活性に直接 的にまたは間接的に影響する蛋白質をコードしている遺伝子を含む前記の株から 得られた単離ＤＮＡ断片が提供される。

本発明の別の実施態様に従うと、修飾されていない同じ種の宿主株に比較して蛋 白質分解活性が欠失しているピキア（Ｐｉｃｈｉａ）Ｘの修飾株を作り出す方法 が提供される、その方法は： 前記宿主株を上記遺伝子の修飾型（前記修飾はその遺伝子を機能的生成物が産生 できないようにするか、または蛋白質分解活性に影響する遺伝子生成物の能力を 変化させる）と接触させる（ここで前記の接触は前記宿主株のゲノム内への上記 遺伝子の上記修飾型の部位特異的組込みに適した条件下で実施され、前記部位特 異的組込みは、蛋白質分解活性に影響する前記蛋白質をコードしている前記遺伝 子の特定の座位で起こる）ことを含んでいる。

本発明のさらに別の実施態様に従うと、蛋白質分解活性が欠失したピキア（Ｐｉ ｃｈｉａ）属の株が提供される。そのような株は色々な方法で産生できるが、現 在そのような株を産生ずる良好な方法は上記の方法である。

本発明のさらに別の実施態様に従うと、蛋白質分解感受性組換え生成物の発現方 法が提供され、前記方法は、前記蛋白質分解感受性生成物を蛋白質分解活性が欠 失している上記旦±７（Ｐｉｃｈｉａ）細胞中で発現させることを含んでいる。

本発明のさらに別の実施態様に従うと、オロチジン−５′−リン酸デカルボキン ラーゼ遺伝子を含む−く気ヱ（Ｐｉｃｈｉａ）属株から得られた単離ＤＮＡ断片 が提供される。

本発明のさらに別の実施態様に従うと、組換えＤＮＡ作製物を形質転換できる宿 主としての旦±７（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母細胞が提供される（前記宿主はオロ チジン−５′−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が欠失している）。

本明細書で使用される術語“蛋白質分解活性”とは、蛋白質分解経路に含まれる 酵素により示される１つまたはそれ以上の酵素活性を表わしている。蛋白質分解 活性には、プロテイナーゼＡ活性、プロテイナーゼＢ活性、カルボキシペプチダ ーゼＹ活性、カルボキンペプチダーゼＳ活性、アミノペプチダーゼＣ活性、ノペ ブチジルアミノペプチダーゼ活性、プロテイナーゼＤ活性、プロテイナーゼＥ活 性などが含まれる。

本明細書で使用される場合、直接または間接的に酵母株の蛋白質分解活性に影響 する蛋白質をコードしている遺伝子には、プロテイナーゼをコードしている遺伝 子またはプロテイナーゼに作用する蛋白質をコードしている遺伝子が含まれる。

ここに使用される場合、蛋白質に作用する蛋白質とは、プロテイナーゼの活性を 変化させるかまたは調節する蛋白質を表わしている。従って、例えば蛋白質分解 活性に直接影響する蛋白質とはプロテイナーゼをコードしている蛋白質であり、 蛋白質分解活性に間接的に影響する蛋白質とは蛋白質分解プロセシングにより蛋 １ｓｉａｅ）の蛋白質分解活性に直接および間接的に影響を与える蛋白質の例で ある。

本発明の一つの実施態様に従うと、直接または間接的にに±ヱ（ｐｉｃｈｉａ） 属の株のカルボキシペプチダーゼＹ活性に少くとも影響を及ぼす蛋白質をコード 配列内（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＥＰ４遺伝子の間のいくつかの類似性の存在 づけられる。この遺伝子をコードしている配列を含む断片は種々の材料から簡単 な操作により容易に得ることができる。そのような材料の一つはプラスミドｐＥ Ｐ２０２　（図２参照）の約１０．６Ｋｂｐ　ＥｃｏＲＩ断片であり、もしくは プラスミドｐＥＰ３０１　（図４参照）の約２．７Ｋｂｐ　ＥｃｏＲＴ−３ａｃ ［断プロテイナーゼＡ遺伝子をコードしているＤＮＡもまた提供される。本発明 のプロテイナーゼＡ遺伝子は配列番号２に示したアミノ酸配列を参照することに よりさらに特徴付けできる。配列番号２に示されたものと本質的に同一のアミノ 酸配列をコードしている任意の核酸配列を持つＤＮＡ、または相同的遺伝子の破 壊のために有用であるような十分な相同性を持つＤＮＡも本発明の実施に使用で きる。上記のアミノ酸配列をコードしている核酸の例は配列番号１に示されてい る。

ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の株の蛋白質分解活性に直接または間接的に影響を及 ぼす蛋白質をコードしているピキア（Ｐ　ｉ　ｃ　ｈ　ｉ　ａ）遺伝子は、遺伝 子の機能的生成物を産生できないようにするため、または前記旦±７（ｐｉｃｈ ｉａ）株の蛋白質分解活性に影響を及ぼす遺伝子産物の能力を変化させるために 種々の方法により修飾できる。当業者は上記遺伝子の修飾のために多（の方法が あることを認めるであろう。例えば、遺伝子によりコードされている蛋白質のア ミノ酸配列を修飾するためにコード配列に突然変異を起こすことができる。もし くは、コード配列の種々の部分を遺伝子から欠失させることができる。欠失は発 現された生成物を非機能的にするだけで十分である（たとえまだそれが発現でき ていても）。

従って、たった一つのヌクレオチドが欠失されても、残りのコード配列を読み枠 からはずすことにより、たとえ発現できていても生成物の機能を失わせることが できる。もちろん、より大きな欠失は本質的に修飾された生成物を発現するよう にでき、およびそのような生成物は、無傷の遺伝子により産生される生成物と比 較して非常に異なった蛋白質分解性を持っているであろう（もしあったとしても ）。さらに別の方法としては、問題とする遺伝子の読み枠を破壊するようにコー ド配列内へ追加の配列を挿入でき、それにより、発現される生成物は劇的に変化 され、または完全に発現されなくなるであろう。

ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の株の蛋白質分解活性に直接または間接的に影響を見 ）またはサッカ０フイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）ＡＲＧ４遺伝子・旦 ±ヱ（ｐｉｃｈｉａ）またはサツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ） る。現在のところ好適な方法は、適した宿主中、本発明の遺伝子（この遺伝子は 修飾されていない形では２土７（Ｐｉｃｈｉａ）属の株の蛋白質分解活性に、直 接または間接的に影響を及ぼす蛋白質をコードしている）を修飾することから成 る。もしくは、宿主株に無作為的な（即ち非選択的）突然変異を起こさせ、蛋白 質分解活性を欠く突然変異体を選択するためにスクリーニングを行う。

宿主中、本発明の遺伝子を修飾させることにより蛋白質分解欠損欠失株が産生さ れる場合、そのような修飾は例えば、蛋白質分解活性に影響する蛋白質をコード している遺伝子（即ち標的遺伝子）の特定の座位での宿主のゲノム内の修飾遺伝 子の部位特異的組込みに適した形質転換条件下で修飾遺伝子を導入することによ り実施される。組込みは宿主の内在性遺伝子を置き換えまたは修飾するであろう 。酵母宿主の標的座位内への修飾遺伝子の導入に都合の良い方法は宿主内の天然 の遺伝子の２つの別々の相同的な末端を持つ直鎖状ＤＮＡ断片中に修飾遺伝子を 包含させることである。こうすれば形質転換により、その発現生成物が蛋白質分 解活性に影響を与える遺伝子の特定の部位で相同的組換えを起こすように方向付 けられるであろう。

蛋白質分解活性を欠く旦±７（Ｐｉｃｈｉａ）株は上に記したような（即ち、そ の発現生成物が蛋白質分解活性に影響する遺伝子の特定の座位での部位特異的組 込みにより、本発明の修飾遺伝子を適した宿主内へ導入し、それにより、すべて または一部の修飾遺伝子で内在性遺伝子のすべてまたは一部を置き換える）好適 な方法で調製され、内在性遺伝子は破壊されているであろう。

ここで使用される場合、術語遺伝子“破壊”とは機能性生成物が生じないか、ま たは変化した機能を持つ生成物を得るように遺伝子を最終的に生じさせる標的座 位の操作を意味している。従って、付加された配列の存在（例えば独立栄養性マ ーカーの導入または読み枠のシフトを起こす配列の導入により）、標的遺伝子か らのヌクレオチドの消失（例えば欠失により）、または標的遺伝子の他の突然変 異により破壊をおこすことができる。蛋白質分解活性を欠く旦±ヱ（Ｐｉｃｈｉ ａ）株を調製する好適な方法では遺伝子付加、遺伝子置換またはここで“ポツプ −イン−ポツプ−アウト”と称される付加および置換の組合わせにより遺伝子破 壊が達成される。遺伝子置換においては内在性標的遺伝子が標的座位から物理的 に除去され、修飾遺伝子と置換される。このことは、標的遺伝子の５°および３ °の各々の末端と相同的な末端を持つ直鎖状断片で宿主を形質転換することによ り達成される。遺伝子付加では内在性標的遺伝子へ形質転換ＤＮＡが付加される 。形質転換ＤＮＡの修飾遺伝子が変形される方法に依存して、遺伝子付加により 標的遺伝子の二つの非機能的コピーまたは標的遺伝子の一つの機能的および一つ の非機能的コピーが生じる可能性がある。二つのコピーの各々が内在性遺伝子の 一部および形質転換ＤＮＡの一部から成り立っている。もし、遺伝子付加後に標 的遺伝子の一つの機能性コピーが残っていたら、続いての標的遺伝子の二つのコ ピー間による相同的組換えによりそれを除去することができる。相同的組換えへ と続く遺伝子付加の組合せ過程はボッブーイン−ポツプ−アウト過程である。

ピキア（Ｐ　ｉ　ｃ　ｈ　ｉ　ａ）属の酵母を形質転換する方法ならびにそのよ うな酵母細胞の培養に適用できる方法は本分野では一般的なことである。上記の 修飾遺伝子を含む構成物は、Ｃｒｅｇｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ上、Ｃｅ１１．Ｂ ｉｏｌ。

５・３３７６　（１９８５）および米国特許第４，８７９，２３１号により記載 されているスフェロプラスト技術かまたは星±７（Ｐｉｃｈｉａ）に適応させる ために修正された［欧州特許出願第３１２．９３４号参照：米国特許第４．９２ ９゜５３５号も利用できる］全細胞塩化リチウム酵母形質転換系［Ｉｔｏ　ｅｔ 　ａｌ、、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、旦：３４１　（１９８４）］によ り旦キア（Ｐ　ｉ　ｃ　ｈ　ｉ　ａ）細胞を形質転換する。スフェロプラストの 発生および維持を必要としないので、しばしば全細胞塩化リチウム法が便利であ る。スフェロプラスト法は一般的に形質転換の効率がより良い手段であるので、 本発明の目的にはスフェロプラスト法が好適である。

上記の修飾遺伝子により形質転換される宿主と±ヱ（Ｐ　ｉ　ｃ　ｈ　ｉ　ａ） 株は野生型ピキア（Ｐ　ｉ　ｃ　ｈ　ｉ　ａ）細胞であり、蛋白質分解経路の欠 失遺伝子による形質転換により、減少した蛋白質分解活性でスクリーニングでき ることを当業者は認識するであろう。用いられる宿主株は所望の形質転換体の同 定および選択を助けるだめに一つまたはそれ以上の欠損を持つことができる。

旦±ヱ（Ｐ　ｉ　ｃ　ｈ　ｉ　ａ）株の蛋白質分解活性に直接または間接的に影 響する蛋白質をコードしている遺伝子の修飾形での形質転換に使用される好適な 宿主は、少くとも一つの独立栄養性マーカー遺伝子が欠失した株である。そのよ うな宿主を本発明の修飾形および独立栄養性マーカー遺伝子で同時形質転換する ことにより形質転換ＤＮＡが取り込まれた（従って宿主の蛋白質分解活性に直接 または間接的に影響する蛋白質をコードしている遺伝子の破壊形を持っているは ずである）株の迅速な選択が可能になるため、前記の宿主生物の使用が好適であ る。

本発明の実施に有用な独立栄養性マーカー遺伝子の例としては（即ち、使用され る好適な宿主株に欠損しているマーカー遺伝子）ヒスチジノール　デヒドロゲナ ーゼ遺伝子、アルギニノスクシネート　リアーゼ遺伝子、またはオロチジン−５ ′　−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子などが挙げられる。そのような宿主株が ピキア（Ｐ　ｉ　ｃ　ｈ　ｉ　ａ）の形質転換に用いられた場合、上記の修飾遺 伝子（直鎖状ＤＮＡ断片に含まれている）は、好適には宿主株が欠失している独 立栄養性マーカー遺伝子の無傷の形と会合する（例えば独立栄養性マーカー遺伝 子の各々は修飾遺伝子内に含まれているかまたは形質転換用直鎖状ＤＮＡ断片上 の修飾遺伝子の５゛　または３゛に位置している）。本発明の実施での使用が企 図されている１７：米国特許第４．８１２．４０５号参照）などが挙げられる。

ヒスチジノール　デヒドロゲナーゼをコードしている機能性遺伝子が挿入されて いる上記修飾遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、プラスミドｐＤＲ４０１の約 ５．３ＫｂｐＳａｃ　Ｉ−ＥｃｏＲｒ断片から得ることができる。上記遺伝子の 修飾形を含むＤＮＡ断片（オロチジン−５′−リン酸デカルボキシラーゼをコー ドしている機能性遺伝子の５゛に位置している）の別の断片は、例えば、プラス ミドｐＤＲ４２１の約５．ＯＫｂｐ　Ｂｇｌｌｌ断片から得ることができる。

例えば表皮増殖因子（ＥＧＦ）　、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）　、インシ ュリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）などのような蛋白質分解感受性組換え生成 物の発現である。蛋白質分解活性を欠く組換えピキア（Ｐ　ｉ　ｃ　ｈ　ｉ　ａ ）株で発現された場合、宿主生物の蛋白質分解装置が修飾されているため、生じ る組換え生成物のうける蛋白質分解活性のレベルは低い。

１株は上記のごとく蛋白質分解欠損にでき、次にさらに問題とする異種蛋白質（ 特に蛋白質分解感受性蛋白質）をコードしているＤＮＡで形質転換される。もし くは、問題とする異種蛋白質をコードしているＤＮＡをすでに有する（ｂｅａ株 は上記の修飾遺伝子および問題とする異種の蛋白質分解感受性蛋白質をコードし ているＤＮＡで同時形質転換できた。

ペプチド生成物の組換え発現においての宿主株としてのピキア（Ｐ　ｉ　ｃ　ｈ 　ｉ　ａ）漠の株の使用は以前に非常に詳細に記述されている。本発明の実施に おける使用のために現在のところ好適な酵母種は、唯一の炭素源およびエネルギ ー源としてメチロトローフ酵母には多数のメタノール応答性遺伝子があり、各々 の発現はメタノール応答性制御領域（プロモーターとも称される）により制御さ れている。

そのようなメタノール応答性プロモーターは本発明の実施においての使用にも適 している。特別の制御領域の例としては、旦±ヱ　パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐ ａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸＩからのプライマリ−アルコールオキシダーゼ遺伝子の ためのプロモーター、旦、パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ２　［Ｐ。

パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）は二つの機能的なアルコールオキシダーゼ遺伝 子を含んでいることが知られている：アルコール　オキシダーゼＩ（ＡＯＸＩ） およびアルコール　オキシダーゼ［Ｉ　（ＡＯＸ２）；二つのＡＯＸ遺伝子のコ ード部分はＤＮＡおよび予測されるアミノ酸配列の両方のレベルで非常に相同的 であリ、共通の制限部位を共有している；二つの遺伝子から発現される蛋白質は 類似の酵素性質を持っているがＡＯＸｌのプロモーターはより効率的であり、そ の遺伝子産物はしばしばより多く発現される］からのセカンダリ−アルコール　 オらの葉酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のためのプロモーターなどが挙げられる。

現在のところ、旦、パストリス（ｐａｓｔｏｒｉＳ）宿主において、蛋白質分解 感受性生成物をコードする遺伝子の発現の制御のための好適なプロモーター領５ ５．２３１号参照。

組み換え蛋白質発現株の発生のためにｔ’ｊＦ７　（Ｐ　ｉ　ｃ　ｈ　ｉ　ａ） 細胞の形質転換に使用される現在好適な発現カセットは、転写の読み枠の方向に 、以下のＤＮＡ配列を含んでいる・ （＋）メチロトローフ酵母のメタノール応答性遺伝子のプロモーター領域；（ｉ ｆ）　（ａ）随意の分泌シグナル配列、および（ｂ）問題とする異種蛋白質 から本質的になるポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列：および（ｉ）メチ ロトローフ酵母中の機能的な転写ターミネーター：ここで前記ＤＮＡ配列は、前 記ポリペプチドをコードしている配列の転写のため機能的に作用するようにお互 いに関連している。本発明の実施に使用される発現ベクターに随！に含まれてい る分泌ノブナル配列をコードしているＤＮＡ配列には、蛋白質分解感受性生成物 に関連した天然の分泌シグナル配列をコードしているＤＮＡ、Ｓ、セレビジ−ｃ （ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ａ−接合因子（ａ　Ｍ　Ｆ　）リーダー配列をコード しているＤＮＡ　（プロセシング部位をコードしているＤＮＡ配列を含む、ｌｙ ｓ−ａｒｇ）、およびウシ　リゾチームＣシグナル配列のようなメチロトローフ 酵母細胞で機能するシグナル配列を含んでいる。

本発明に従って使用されるメチロトローフ酵母で機能する転写ターミネータ−は （ａ）転写体中でポリアデニル化信号およびポリアデニル化部位を提供するサブ セグメントおよび／または（ｂ）発現カセットで使用されるプロモーターからの 転写の転写終結信号を提供するサブセグメントを持っている。ここで使用される 術語“発現カセット“とは本明細書および請求の範囲を通して、発現過程に機能 的に作用する配列を含むＤＮＡ配列を意味している。全転写ターミネータ−は蛋 白コード化遺伝子からとられ、それはプロモーター源の遺伝子と同じでも異なっ ていてもよい。

蛋白質分解感受性生成物の組換え発現のための宿主の形質転換に使用される本発 明のＤＮＡ構成物中、発現カセットのセグメントはお互いに“機能するように関 連して′いるであろう。蛋白質分解感受性生成物をコードしているＤＮＡ配列は プロモーター、分泌シグナル配列（もし用いられるなら）および転写ターミネー タ−に関して機能的に作動するように位置し配向されている。従って、プロモー ター領域の制御下、ポリペプチドをコードするセグメントは、翻訳により所望の ポリペプチドを提供できる転写体内へ転写される。適切な読み枠の位置決定およ び発現力セントの種々のセグメントの配向は当業者には周知のことである。より 詳細には説明は実施例に与えである。

本発明の実施には、蛋白質分解感受性生成物の組換え発現のための宿主は、一つ のＤＮＡ断片に含まれている上記発現力セントの多数のコピーで（好適には先端 −末端で配向している）形質転換されるのが好適である。

さらに、本発明に従ったＤＮＡ構成物が部位特異的組込みによる蛋白質分解感受 性生成物の組換え発現の宿主の形質転換に使用された場合、構成物を含む発現カ セットは直鎖状ＤＮＡ断片（その中のＤＮＡ断片の組込みに有効なように宿主の 所望の座位へ配向する）である。もし、導入されるべきＤＮＡが標的遺伝子の断 片座位と０．２ｋｂはどの相同性しか持っていないなら、一工程遺伝子組込みが 通常有用である：しかしながら、効率を上げるには相同性の程度を最大にするの が好適である。

蛋白質分解感受性生成物の組換え発現の宿主の形質転換に本発明に従って使用さ れるＤＮＡ構成物は随意に一つまたはそれ以上の発現カセットに加えて選択可能 マーカー遺伝子をさらに含んでいる。この目的には、メチロトローフ酵母中で機 能的に作動する任意の選択可能マーカー遺伝子が用いられる、即ち、メチロトロ ーフ酵母細胞に表現型を与え、それにより大多数の非形質転換細胞の中でも同定 が可能になり、および選択的に増殖する。適した選択可能マーカー遺伝子には、 例えば、独立栄養性突然変異体旦、バストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主株およ び宿生欠陥を補足する野生型生合成遺伝子から組立てられた選択可能マーカー系 が挙げられる。例えば、ＨＴＳ４−　Ｐ、パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）株の 形質転換に旦　セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓ　１ａｅ）または旦、パストリス（ ２ａｓｔｏｒｉｓ）ＨＩＳ４遺伝子が用いられるであろうし、ＡＲＧ４−突然変 異体旦　パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）株の形質転換には旦、セレビシェ（ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＧ４遺伝子または旦、パストリス（ｐａｓ　ｔｏｒ、 ｉ　５）ＡＲＧ４遺伝子が用いられるであろうし、ＵＲＡ３−突然変異体旦、パ ストリス（ｐａｓｔｏｒｉＳ）株の形質転換には、旦　セレビシェ（ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）ＵＲＡ３遺伝子または旦、パストリス（ｐａｓ　ｔｏｒ　１ｓ）Ｕ ＲＡ３遺伝子が用いられるであろう。

さらに、本発明のこの態様に従った蛋白質分解感受性生成物の組換え発現の宿主 の形質転換に使用されるＤＮＡ構成物は、随意に細菌中で機能的に作動する選択 可能マーカー遺伝子をさらに含んでいる。従って、大多数の非形質転換細胞の中 から同定されおよび選択的に増殖するように細菌細胞を形質転換することを可能 にする細菌表現型を与える任意の遺伝子が使用できる。この追加の選択可能マー カーは本発明のＤＮＡの増幅のため大腸菌のような細菌内への形質転換を可能に する。適した選択可能マーカーにはアンピンリン耐性遺伝子（Ａｍｐ’）　、テ トラサイクリン耐性遺伝子（Ｔ　ｃ　’）などが含まれる。

本発明のＤ　Ｎ　Ａが細菌細胞でも通用するように意図された場合、細菌の世代 から世代へ本発明のＤＮＡが維持されるのを確実にするため、ＤＮＡ構成物中に 細菌の複製起点を包含させる事が望ましい。細菌の複製起点の例としてはｆｌ− 。

ｒｉ１コリシン、Ｃｏｌ　Ｅｌなどが含まれる。

ここで使用される術語“発現ベクター”には、その中に含まれているＤＮＡ配列 を発現できるベクターを含んでいるつもりであり、そのような配列はその発現が 有効なように他の配列と（即ち、プロモーター配列）機能的に作動するような関 係にある。一般には、組換えＤＮＡ技術で通常使用される発現ベクターはしばし ば“プラスミド”の形である（即ち、環状、二本鎖ＤＮＡループ、そのベクター 形では染色体に結合しない）。本明細書においては術語“ベクター”および“プ ラスミド”は互換的に使用されている。しかしながら、本発明には機能的に均等 な他の形の発現ベクターも同様に含まれるつもりである。

ｅ＋ヱ（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母を形質転換する方法、ならびに、そのような酵 母細胞の培養に応用できる方法は一般的には本分野では既知である。

本発明に従うと、上記の修飾遺伝子および／または異種の蛋白質分解感受性生成 物をコードしている発現カセットを含む構成物は上記のように、スフェロプラス ト技術または全細胞塩化リチウム酵母形質転換系によりピキア（Ｐｉｃｈｉａ） 細胞内へ移される。

所望の表現型および遺伝子型である形質転換された株はバッチまたは連続モード で発酵槽中で増殖される。メチロトローフ酵母中の組換えＤＮＡに基づく生成物 の大規模生産には、三段階、高細胞密度発酵系が現在好適な発酵プロトコールと して用いられている。最初の段階（または増殖段階）では、発現宿主は非誘導炭 素源（例えばグリセロール）を過剰に含む限定最小培地中で培養される。そのよ うな炭素源での増殖では異種遺伝子発現は完全に抑制され、異種蛋白質を発現の ｐＨを約５に維持することが現在のところ好適である。次に、さらに細胞塊を増 加させ、メタノール応答性プロモーターを抑制するため、短い期間、非誘導性炭 素源制限増殖を行う。この制限増殖期間の培地のｐＨは適切なｐｉ−を値に維持 される（使用される実際のｐｔ−ｔは発現に使用された特定の宿主株および発現 される生成物に依存する）。

制限条件下での増殖期間に続いて、ブロスからの生成物の同時除去による連続式 法：またはブロスのメタノール含量が低レベルに維持されるバッチ方法（ここで は“メタノール過剰供給−バッチモード”と称される）により発酵槽にメタノー ルが添加される。メタノールの添加はメタノール応答性プロモーターにより制御 されている遺伝子の発現を誘導する。この第３段階は、この段階で大多数の組換 え生成物が発現されるので生産段階と称される。生産段階の間の培地のｐＨは適 切なｐＨ値に維持される（用いられる実際のｐＨは発現に使用される特定の宿主 株および発現される特定の生成物に依存する）。

術語“培養”とは細胞増殖の助けとなる培地中での細胞の増殖、およびそのすべ ての継代培養を意味している。術語“継代培養”とは別の培養の増殖細胞（源培 養）の細胞培養、または問題とする継代培養および源培養間で実施された継代培 養工程の数とは無関係に、源培養の任意の継代培養を意味している。

本発明の好適な実施態様に従うと、蛋白質分解感受性生成物の産生に使用される 異種蛋白質発現系は、非常に効率が良（厳密に制御される旦、バストリス（旦ａ ｓｔｏｒｉｓ）のメタノール制ａｌｌＡＯＸ１遺伝子から誘導されたプロモータ ーが利用される。この遺伝子は同様に転写ターミネータ−源でもありうる。現在 好適白質分解感受性生成物（例えば成熟ＩＧＦ−１、ＥＧＦ、ＧＲＦなと）をコ ードしているＤＮＡ配列、および旦　バストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸＩ 遺伝子から誘導された転写ターミネータ−を含んでいる。好適には一つの隣接す るＤＮＡ断片上の複数の発現カセットを得るため、一つのＤＮＡ断片上に、先端 −末端の配向で二つまたはそれ以上のそのような発現力セントが含まれている。

多発現カセットで形質転換されるべき好適な宿主細胞は現在のところ、形質転換 ＤＮＡ断片上に存在するマーカー遺伝子で補足できる少くとも一つの突然変異を 持つ旦　パストリス（ｐａｓ　ｔｏｒ　ｉ　ｓ）細胞である。好適にはＨＩ３４ −（ＧＳ１１５）またはＡＲＧ、４−　（ＧＳ１９０）単−独立栄養性突然変異 体旦。

バストリス（ｐａｓｔｏｉｓ）株が用いられるが、ＨＩＳ４−／ＵＲＡ３−　（ ＧＳ４−２）またはＨ［Ｓ４−／ＡＲＧ４−　（ＰＰＦＩ）二重独立栄養性突然 変異体旦。

パストリス（ｐａｓｔｏｉｓ）株も用いられる。

一つまたはそれ以上の発現カセットを含む断片は宿主の代謝欠陥を補足するマー カー遺伝子および随意に細菌マーカー遺伝子、ベクター組込みを方向付ける酵母 ＤＮＡ配列などを含むプラスミド内へ挿入される。

本発明の特定の実施態様に従うと、オロチジン−５°　−リン酸デカルポキシラ 標とさせる能力が本新規遺伝子の別の使用法である。この新規遺伝子は図１２に 示した制限地図を参照して特徴付けできる。もしくはこの新規遺伝子は配列番号 ４に示したものと同一アミノ酸配列を実質的に持つ蛋白質をコードしていると特 徴付けできる。当業者は上記のアミノ酸配列は種々のヌクレオチド配列によりコ ードできることを認識しているであろうが、上記のアミノ酸配列をコードしてい る好適なヌクレオチド配列は配列番号３に示された配列と実質的に同一である。

本発明の別の特定の実施態様に従うと、組換えＤＮＡ物質で形質転換できる宿主 として（宿主はオロチジン−５′　−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子欠失しそ れにより所望の形質転換が起こったかどうかを容易に決定できる（形質転換が成 功した細胞ではウラシル原栄養性が戻ることにより）。

ＵＲＡ３−ｔ？±１（Ｐｉｃｈｉａ）株とｅ＋ヱ（Ｐｉｃｈｉａ）オロチジン− ５゛−リン酸デカルボキシラーゼ　マーカー遺伝子の組み合わせは、蛋白質分解 活性を欠く旦±７（Ｐｉｃｈｉａ）の組換え株の産生に使用するための特に有用 な選択系を提供する。そのような選択系はここでは“二方向性選択法”と称され る。蛋白質分解活性を欠く旦±７（Ｐｉｃｈｉａ）の発生のためのこの選択系は 、欠失遺伝子を含むＤＮＡ断片が宿主生物のゲノムへ付加され、続いて内在性標 的遺伝子配列および組み込まれたベクター配列間の相同的組換えにより宿主から ＤＮＡ断片の一部および内在性配列を除去する“ポノプーインーボップーアウド 遺伝子破壊技術を使用する。最初に、形質転換体はＵＲＡ３のようなマーカー遺 伝子を含む破壊ベクターの取り込みにより選択される（即ち、“ポツプ−イン” 工程）。次に、選択された形質転換体は内在性遺伝子配列および組込まれたベク ター配列間で組換えが起こり、それによりマーカー遺伝子を含むベクターの一部 および宿主の内在性配列が切り出された株を同定するためにスクリーニングされ なければならない（即ち、”ポツプ−アウト”工程）。ＵＲＡ３遺伝子およびす ＲＡ３−宿主に基づく二重選択系で所望の株の連続的同定が行われる。

この型の遺伝子破壊は典型的には、５−フルオロ−オロチン酸（５−ＦＯＡ）耐 性により同定できるＵｒａ−株で実施される。破壊されるべき標的遺伝子の欠失 コピーおよび機能的ＵＲＡ３遺伝子を破壊ベクターは含んでいる。Ｕｒａ−宿主 細胞のゲノムへの破壊ベクターの組込みは、一つの機能的標的遺伝子および一つ の非機能的（即ち、破壊された）標的遺伝子を含むＵｒａ＋形質転換体を発生さ せる。Ｕｒａ”形質転換体はウラシル非存在下で増殖できるその能力により、容 易に同定される。

組換えにより、欠失遺伝子のみを残して機能的標的遺伝子が除去された株を単離 するため、組換えに伴うＵＲＡ３遺伝子の損失（“ポツブーアウビ）により生じ た５−ＦＯＡ耐性の復元でＵｒａ“形質転換体がスクリーンされた。ＵＲΔ３遺 伝子型の再生はゲノム中の他の遺伝子の続けての破壊のための“ボッブーイン− ポツプ−アウト”過程の繰返しを可能にする。蛋白質分解活性を欠（り先ヱへ旦 遺伝子を含むＤＮＡ構成物でＵＲＡ３−宿主が形質転換される。遺伝子付加によ る形質転換ＤＮＡの部位特異的組込みにより（即ち、“ポ・ツブ−イン”）、蛋 白質分解活性に直接または間接的に影響を及ぼす遺伝子の座位に一つの機能的お よび一つの非機能的な遺伝子ならびに無傷のＵＲＡ３遺伝子を得る。ＵＲＡ３遺 伝子を取り込んだ株は陽性選択により同定される（当業者にはよく知られている 技術を用いて、例えばウラシルを欠く最小培地上で株を増殖させ、そのような培 地上で増殖できる株を選択することにより）。蛋白質分解活性に影響する蛋白質 をコードしている遺伝子の座位での機能的、非機能的およびＵＲＡ３遺伝子のコ ンフィギユレーションにより、機能的および非機能的遺伝子の一つおよびＵＲΔ 旦遺伝子の喪失を生じる機能的および非機能的遺伝子間の組換えが可能になる（ 即ち”ポツプ−アウト”）。

その後、細胞をウラシル経路中間体の非毒性類似体である５−フルオロ−オロチ ン酸（５−ＦＯＡ）（ＵＲＡ３＋株により代謝された場合、細胞にとって毒性の 点が阻害されているので５−ＦＯＡを代謝せず、その毒性効果を受けない（従っ 与える非常に都合の良い“ボッブーアウト法として使用できる。

同じ種の野生型株中に存在する蛋白質分解活性と比較して蛋白質分解活性が欠失 されているＵＲＡ３−ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）株は天然形のＵＲＡ３遺伝子およ び蛋白質分解感受性生成物を含む発現ベクター（両方とも同一のベクターの一部 として、または宿主内へ形質転換される第二のベクターとして）での形質転換に 特に有用である。ウラシル原栄養性が復元されたこれらの形質転換体は（簡単な スクリーニング法により容易に決定できる）、それらの中に蛋白質分解感受性生 成物をコードしている遺伝子を取り込んでいるはずであり、従って生成物発現に 直接利用できるであろう。

本発明はここで以下の実施例を参照しながらより詳細に説明されるが、以下の実 施例に制限されるわけではない。

実施例 実施例１　：　Ｐ、パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４遺伝子の単離旦、 ハストリス（ｐａｓ　ｔｏｒ　１ｓ）ＰＥＰ４遺伝子は、相同的なサツ力ロマ＜ ＋２　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｐツ ムＤＮＡライブラリーから同定された。ハイブリダイズした組換えファージＤＡ の増殖に必須のバクテリオファージ　λゲノムの要素を含んでいるバクテリオウ ィルスで感染させた大腸菌宿主細胞中の組換えＤＮＡの増殖により達成された。

株、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ、 Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ）は０．１１４／μｇの有効濃度で、３７°Ｃにて７．　１ ４．　２１および２８分のインキュベーションによる５ａｕ３Ａの消化を実施し た。各々のインキュベーション混合物の一部は消化されたＤＮＡ断片の大きさを 決定するため１％アガロースゲル上、電気泳動により分離された。７および１４ 分インキュベーションされた消化物は主として９−２３ｋｂ断片から成っている と思われた。

これらの消化物をプールし、下記のように調製されたＥＭＢＬ３ベクター　アー ムへ連結した。

ＥＭＢＬ３ベクター　アームはベクター（ＥＭＢＬ３クローニングキット、Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ。

ＣＡから得られた：カタログ番号２４１２１１）の旦ａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ による二重消化により調製された。スタファー断片からアームを分離している小 さな旦ａｍＨＩ／旦ｃｏＲＩリンカ−はエタノールによる選択的沈殿により消化 物から除去された。１μｇのＥＭＢＬａ前消化ア前人化アームｕ３Ａ消化ピキア （Ｐｉｃｈｉａ）ゲノムＤＮＡ　（０，５μｇ）の結合は５μｍの反応混合物の ４℃、２日間のインキュベーションにより達成された。

旦、パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムＤＮＡ断片およびＥＭＢＬ３ベクタ ー　アームの結合により調製された組換えバクテリオファージλＤＮＡはインビ トロで市販のパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　ＥＭＢＬ３クロー ニングキット）を用いてパッケージングされた。ＥＭＢＬ３に基づ＜Ｐ、パス上 ’ＩＸ（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムライブラリーは組換えファージをプロファー ジＰ２を含む大腸画情原生宿主株Ｐ２　３９２　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　ＥＭ ＢＬ３クローニングキットで提供されている）とともに播種することにより増幅 された。野生型バクテリオファージは大腸菌株Ｐ２　３９２中では増殖しない。

Ｐ２感受性を与える野生型遺伝子の二つを欠く組換えＥＭＢＬ−３によるバクテ リオファージはこのＰ２含有大腸菌株中でよく増殖できる。増幅において、宿主 株として大腸菌Ｐ２　３９２を使用すれば、細菌宿主中組換えファージのみが増 殖することが保証される。

ＥＭＢＬ３に基づ＜旦、バストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムＤＮＡのすべて のプレートに３Ｍ緩衝液（５，８ｇ　ＮａＣｌ、２ｇ　ＭｇＳＯ４・Ｈｌｏ、５ ｏｍｌ　１Ｍトリス・ＨＣＩ、ｐＨ７，５、および５ｍｌ　２％ゼラチンを１リ ツトルに含む）を層積した。５時間後、上澄み液を集めてプールし、説明書に従 って力価およびゲノム当量を計算した。このライブラリーは約１０ゲノム当量を 含んでおり、その力価は６Ｘ１０”プラーク形成単位／ｍ　ｌ　（ｐ　ｆ　ｕ／ ｍ　ｌ　）であった。

リーニング ＰＥＰ４遺伝子に対する旦±７（Ｐｉｃｈｉａ）ゲノムを充分にスクリーンする ため、５０．０００の組換えファージおよび大腸画情原生宿主株ＬＥ３９２（Ｓ ｔｒａｔａｇｅｎｅ　ＥＭＢＬ３クローニングキットで提供される）を４つの大 きな１５０ｍｍプレートに播種した。６−７時間増殖させた後、プレートを４℃ に冷やした。各々のプレートをマークし、各々のプレートのプラークリフトの複 製は各々のプレート上にニトロセルロースを置くことにより調製した。フィルタ ーを変性させ、中和し、焼いて、Ｓ　セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＥ Ｐ４遺伝子［Ｔｈｏｍａｓ　５ｔｖｅｎｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ２４８ −３２５２　（１９８６）参照］で探査された。ハイブリダイゼーションは３０ ％ホルムアルデヒド、６ＸＳＳＣ，５ｘデンハート溶液、２０ｍＭ　トリス・Ｈ ＣＩ　；　ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ ｍ１サケ***ＤＮＡを含む溶液中、３７℃で実施された。ハイブリダイゼーショ ン後、２ＸＳＳＣおよび０．　１％ＳＤＳを用い室温で３回フィルターを洗浄し た。

これらの最初の洗浄に続いて、２ＸＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて５５° Ｃにて２回洗浄した。

Ｓ　セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＥＰ４遺伝子の断片にハイブリダイ ズするＤＮＡを含む１５の陽性プラークがフィルターのオートラジオグラムから 二通り（ｉｎ　ｄｕｐｌ　１ｃａｔｅ）同定された。１５の陽性プラークの各々 の周りの領域を単離し、８Ｍ緩衝液中に置いた。単離物のうちの６つを１０−Ｓ および１０−７の希釈で大腸菌株ＬＥ３９２と共により小さな１００ｍｍプレー トに播種した。第１のプラークスクリーニングで使用されたものと同一のハイブ リダイゼーションおよび洗浄条件下、各々のプレートのシングル　プラークリフ トがＳ　セレビシェ（ｃｅ　ｒｅｖ　ｉ　ｓ　ｉ　ａｅ）ＰＥＰ４遺伝子断片で 探査された。

この２回目のスクリーニングにおいてオートラジオグラム上１２の陽性プラーク が検出された。これらのシングルプラークの９つが単離され、８Ｍ緩衝液中に置 かれた。これらの９つのプラークの各々が１０−５および１ｏ−７の希釈で大腸 菌株ＬＥ３９２と共に小さな１００ｍｍプレートに播種された。再び、最初の２ 回のスクリーニングで使用したものと同一のハイブリダイゼーションおよび洗浄 条件下・旦　セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＥＰ４遺伝子断片で各々の プレートのシングル　プラーク　リフトが探査された。各々のプレートはプレー トに均等に分布する約１０−２０のプラークを含んでいた。フィルターのオート ラジオグラムにより各々のプレート上のすべてのプラークがＰＥＰ４プローブに ハイブリダイズしたことが明らかにされた。

異なったプレートから５つの別々のプラークを単離し、８Ｍ緩衝液中へ置いた。

これらの単離物の３つ（各々４７２１．５１１１および５１３１と称される）の 大規模培養からＤＮＡが、組換えファージに含まれているＰＥＰ４遺伝子の同定 、特徴付けおよびサブクローン化のためにバクテリオファージ単離の誘導法［Ｍ ａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、およびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ 。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ΔＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ± 、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ 、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ（１９８ ２）］を用いて調製された。

ＥＭＢＬ３Ｅ’±７（Ｐｉｃｈｉａ）ゲノムＤＮＡライブラリーからの３つの単 離物（４７２１，５１１１および５１３１．上記参照）から調製された組換えフ ァージＤＮＡは種々の制限エンドヌクレアーゼで消化され、０．８％アガロース ゲル上で分離され、エチジウムプロミド染色により可視化された。さらに、これ らの消化物の１μＩが第２のアガロースゲル上で分離され、ニトロセルロース上 にプロットされ放射性標識Ｓ、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓ　１ａｅ）ＰＥＰ４ 遺伝子の断片で探査された。３０％ホルムアルデヒド、６ＸＳＳＣ，５ｘデンハ ート溶液、２０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ８，ｏ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌサケ***ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃でハイブ リダイゼーションが実施された。続いてフィルターは２ＸＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを用いて室温で５分間３回、続いて２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用 い５５℃で５分間２回洗浄した。

２つのクローン（５１１１および５１３１）からのＤＮＡの同じ消化物がエチジ ウムプロミド染色により決定され、同じパターンの制限酵素断片が得られたが、 第３のクローン（４７２１）からのＤＮＡの同じ消化物からは異なった断片パタ ーンが得られた。旦、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓ　１ａｅ）ＰＥＰ４遺伝子断 片に対するサザンブロットハイプリダイゼーションにより各々のクローンからの ＤＮＡの制限酵素断片の分析により、クローンの２つの組の両方とも同じ大きさ の一連のハイブリダイズする断片を含んでいることが明らかにされクローンの二 つの組はプローブハイブリダイズした共通の重なったＤＮＡ配列を持っているこ とが示された。

プローブとして相同的なＳ　セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓ　１ａｅ）ＰＥＰ４遺 伝子を用いる旦ｃｏＲＩ消化旦　バストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムＤＮＡ のサザン　プロット　ハイブリダイゼーションにより決定されたごとく、■、ク ハイブリダイゼーションは、それが旦、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓ　１ａｅ） ＰＥＰ４遺伝子ヘハイブリダイズした１０．６ｋｂ断片を含んでいることを明ら かにした。クローン化旦、バストリス（ｐａｓ　ｔｏｒ　１ｓ）ＰＥＰ４遺伝子 の操作を容易にするために、単離４７２１からのＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片上に含 まれる旦。バストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムＤＮＡかｐＵｃ１９内へサブ クローン化された。クローン４７２１（２５μｇ）が３００μｍの総容量中、Ｅ ｃｏＲＩ（６０単位）にて消化された。消化ＤＮＡは０．６５％アガロースゲル 上で分離され、ＤＥ８１ペーパーで１０．６ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片が単離された 。精製断片は４００μｌのＬＭ　ＮａＣ１でペーパーから洗い出され、フェノー ル／クロロホルムで抽出された。ＤＮＡは次にエタノールで沈殿され、１０μｌ の総容量で水に再懸濁された。約５０ｎｇの１０．６ｋｂ断片はＥｃｏＲＩで切 断され、脱リン酸化されている等量のｐＵｃ１９に連結された。連結混合物は大 腸菌株ＭＣ１０６１の形質転換に使用された。アンピシリン耐性コロニーが選択 され、診断１０．６ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片の存在をコロニーＤＮＡの制限酵素消 化物の分析によりスクリーニングした。大規模プラスミド調製物は正しいプラス ミド（ｐＥＰ２０２と名付けられた）を含むコロニーから作製された。プラスミ ドｐＥＰ２０２は完全旦、パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４遺伝子を含 んでいる（図２参照）。

クローン化旦、パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４遺伝子の配列分析を容 易にするために、旦、バストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４遺伝子の一部が ｐＵｃ１９内へサブクローン化された。プラスミドｐＥＰ２０２はＢａｍＨＩリ ン酸化されているｐＵｃ１９（〜２０ｎｇ）と連結された。連結混合物は大腸菌 株ＭＣ１０６１の形質転換に使用された。形質転換体はアンピシリン耐性で選択 され、シングルＢａｍＨＩ断片の存在をコロニーＤＮＡの制限酵素消化物の分析 でスクリーニングした。この形質転換から生じるシングルコロニーは適切なりＮ Ａ構成物を含んでいることが観察され、ｐＥＰ２０５と名付けられた（図３参照 ）。

プラスミドｐＥＰ２０２の配列分析で旦、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） のＰＥＰ４遺伝子と〜７０％の相同性を持つＤＮＡ配列と同定された。ｐＥＰ２ ０２のこの配列によりコードされているアミノ酸配列は互、セレビシェ（旦見工 ｅｖ　ｉ　ｓ　ｉ　ａｅ）ＰＥＰ４遺伝子によりコートされている配列と６９％ 相同的である。

ＡＰ、バストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４遺伝子破壊ベクターｐＤＲ４０ １の作製 旦、バストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＰＥＰ４欠失（ＰＥＰ４−）株の開発に 使用するためベクターｐＤＲ４０１が作製された。このベクターは、旦、ツ各） −’ＪＸ（ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＰＥＰ４株の形質転換に使用された場合、野生 型ＰＥＰ４遺伝子の置換による宿主ゲノム内へ組込まれる、欠陥のあるＰ、／＜ ７．）。

’ＪＸ（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４遺伝子を含んでいる。

ｐＤＲ４０１は以下のごとく２工程法で作製された。第１の工程では、ｐＥＰ２ ０２からｐＤＲ４０１作製における基礎ベクター（基礎ベクターｐＥＰ３０１） が作製された。ベクターｐＥＰ３０１はｐＵｃ１９配列およびｐＥＰ２０２から のクローン化旦　バストリス（ｐａｓ　ｔｏｒ　１ｓ）ＰＥＰ４遺伝子を含んで いる。

プラスミドｐＥＰ２０２　（１５μｇ）は５ａｃＩで消化された。５．５ｋｂＳ ａｃｌ断片（Ｓａｃｌリンカ−から時計回りに５時の５ａｅ１部位まで広がった 断片、およびすべてのｐＵｃ１９配列およびＰＥＰ４遺伝子を含んで（為る：図 ２参照）がＤＥ８１ペーパーを用いて０．７％アガロースゲルから単離された。

断片は４００μｍのＩＭＮａＣ＋でペーパーから溶出され、４００μＩのフェノ ール／クロロホルムで抽出され、エタノールで沈殿された。このＤＮＡは１μｌ のリガーゼおよび１μＩ　（〜Ｌｏｎｇ）のＤＮＡを含む１００μｍの溶液中で それ自身と連結された。連結混合物は室温で１時間インキュベートされた後、大 腸菌株ＭＣ１０６１の形質転換に使用された。アンピシリン耐性コロニーカく選 択され、ノングル５．５ｋｂ　Ｂｇ±ＩＩ断片の存在をコロニーＤＮＡの制限酵 素消化物の分析によりスクリーニングした。プラスミドＤＮＡは正しいプラスミ ド（ｐＥＰ３０１と名付けられた、図４）を含むＭＣ１０６１の形質転換コロニ ーから調製された。

ｐＤＲ４０１の作製の第２工程においては、Ｐ、　／（ストリス（ｐａｓｔｏｒ ｉｓ）ＨＩＳ４遺伝子がＰＥＰ４含有プラスミドｐＥＰ３０１内へ挿入され、最 終ベクターが得られる。旦、パストリフ、（ｐａｓ　ｔｏｒ　１ｓ）ＨＩＳ４遺 伝子（マｐＹＪ８ΔＣ１ａから誘導される２、６ｋｂ　Ｂｇｌｌ＋断片［Ｃｒｅ ｇｇ、Ｊ。

ｅｔ　ａ±、、Ｍｏ上　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、５：３３７６−３３８５（１９８ ５）］から単離された。プラスミドｐＹＪ　８Δｑ土且（１５μｇ）は旦呈±Ｉ Ｉで消化され、消化されたＤＮＡは０．７％アガロースゲル上で分離された。２ ゜６ｋｂ断片含有ＨＩＳ４遺伝子は４００μｌのＩＭ　ＮａＣ１で溶出してＤＥ ８１ペーパーから単離され、４００μｍのフェノール／クロロホルムで抽出され 、−ゼおよび水を含む総量で１０μｍの溶液中で連結させることにより２．　６ ｋｂＨＩＳ４含有断片がｐＥＰ３０１内へ挿入された。結合は室温で３時間実施 され、連結混合物はＭＣ１０６１細胞の形質転換に使用された。アンピシリン耐 性コロニーから調製されたプラスミドＤＮＡは旦呈上ＩＩ、旦見土■、旦工ＩＩ Ｉ／旦見Ｉ１．旦ｌ±ＩＩ／旦見±！、旦ヱ旦１．Ｎ旦旦■およびべ２旦Ｉで消 化サレ、ｐＤＲ４０１の作製が確認された。制限断片パターンは正しいプラスミ ドｐＤＲ４０１に期待されるものと一致した（図５参照）。プラスミドｐＤＲ４ ０１は旦旦旦ま構造遺伝子内の特異的旦呈±１１部位に旦、バストリス（且且互 工且Ｌ±５）ＨＩＳ４遺伝子が挿入されたｐＵｃ１９であり、したがってＰＥＰ ４構造遺伝子を破壊している。

旦、バストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＰＥＰ４株を作り出すため、旧５４ＰＥ Ｐ４　旦・″ストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）株Ｇ５１１５　（ＡＴＣＣ２０８６ ４）がスフェロプラスト法（米国特許第４．８７９．２３１号参照）に従ってｐ ＤＲ４０１の５．　３ｋｂ　旦旦旦ＲＩ／旦」」、■断片２０μｇで形質転換さ れた。ｐＤＲ４０１のこの断片はＨＩＳ４遺伝子含有ＰＥＰ４欠失遺伝子と一致 している。この型の組込みにより生じる形質転換株は原栄養性であり、それに基 づいて非形質転換細胞から区別できる。形質転換の頻度は約１０３μｇ−ＩＤＮ Ａ１、形質転換体カルボキシペプチダーゼＹ活性の分析Ｈｉｓ”形質転換体は次 にコロニーオーバーレイ比色スクリーニング法［Ｊ。

ｎｅｓ、Ｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　８５：２３−３３　（１９７７）参照］を用い てカルボキシペプチダーゼＹ活性が分析された。このアッセイでは、Ｈｉｓ＋形 質転換体細胞は寒天プレートから離されプレート当り〜３００コロニーの密度で ＹＥＰＤ　（酵母抽出物、１％ペプトン、２％デキストロースおよび２％寒天） プレート上で増殖された。細胞の透過性を上げるため、プレートに４０％ジメチ ルホルムアミド（ＤＭＦ）を含む０．６％アガロースゲルおよび１．２ｍｇ／ｍ ｌの基質ＡＰＮＥ　（Ｎ−アセチルＤＬフェニルアラニンβ−ナフチルエステル ）をかぶせた。細胞は透過性を上げられるため、細胞の液泡含有物のいくつかは 試薬ＡＰＮＥに近づくことができる。アガロース　オーバーレイが固化後、プレ ートを５ｍｇ／ｍｌファースト　ガーネット塩の溶液中に浸漬した。ＡＰＮＥは カルボキシペプチダーゼＹのエステル分解活性により切断される。この反応の生 成物はファースト　ガーネット塩に結合してコロニー中赤色を発する。カルボキ シペプチダーゼＹ活性を欠くコロニーは塩と結合せず、従ってこの活性を持つコ ロニーでピンク色と区別された。このアッセイの結果に基づいて低いカルボキシ ペプチダーゼＹ活性を持つことが明らかにされたコロニー（即ち、ＰＥＰ４”コ ロニーの指標としての強い赤色を発色しなかったコロニー）が単離され、マスタ ープレートに移され、対照コロニーとともに継代培養され、オーバーレイアッセ イを用いて再びスクリーニングされた。再び強い赤色を発色しなかった２０のコ ロニーが、ベクターｐＤＲ４０１の断片の組込みによりこれらの形質転換体のＰ ＥＰ４座位が破壊されているかどうかを決定するサザンブロットハイブリダイゼ ーノヨンによる分析ために選択された。

２　サザンブロントハイブリダイゼーション分析低カルボキノペプチダーゼ活性 を示した２０の形質転換体株（ｐｉ−ｐ２０とた。二の過程はＨＩＳ４含有ＰＥ Ｐ４欠失遺伝子を株の形質転換に使用された５゜３ｋｂ　Ｅｃ旦Ｒ１／５ａｃｌ 断片として遊離させるはずである。これらの消化ＤＮＡから２つのサザンプロッ トフィルターが調製された；１つのプロットはクローン化旦　パストリス（ｐａ ｓ　ｔｏｒ　ｉ　５）ＰＥＰ４遺伝子の一部を含むｐＥＰ３０１　（図４参照） からの放射性標識１．　４ｋｂ　λ上」」／旦旦旦ＲＶ断片で探査され、他のプ ロットはＨＩＳ４遺伝子を含むｐＤＲ４０１からの放射性標識２．　６ｋｂ　旦 呈上ＴＩ断片で探査された。比較の目的でＳａｃ　ＩおよびＥｃｏＲＩで消化さ れている形質転換宿主株Ｇ５１１５からの対照ＤＮＡも分析された。

Ｓａｃ　ＩおよびＥｃｏＲＩによるＧ５１１５からのゲノムＤＮＡの消化により ｐＥＰ３０１の放射性標識Ｘｂａｌ／ＥｃｏＲＶ断片中に含まれているＰＥＰ４ 遺伝子の一部にハイブリダイズする２、９ｋｂ断片が得られた。対照的にこのプ ローブは分析された２０の形質転換体のうちの１９からの旦ａｃｔ／ＥｃｏＲ１ 消化ＤＮＡ中の異なった大きさの断片にハイブリダイズした。株ｐ１７からのＤ ＮＡのみが親株からのＤＮＡハイブリダイゼーションパターンと同一のパターン を与えた。残りの１９株は非破壊ＰＥＰ４座位に特徴的な２．９ｋｂハイブリダ イズ断片を欠き、ＰＥＰ４遺伝子ブローブヘハイプリダイズする約５．３ｋｂ断 片および／またはより大きな断片を含んでいた。５．３ｋｂ断片は一８ａｃＩ／ 旦ｃｏＲＩによる消化によりベクターｐＤＲ４０１から放出される形質転換ＤＮ Ａと同じ大きさであった。

株ｐｉ−ｐ１６およびｐｉ８−ｐ２０からのＤＮＡのサザンブロットハイプリダ イゼーションの結果は、これらの株は無傷のＨＩ３４遺伝子とともに欠損ＰＥＰ ４遺伝子を含んでおり株のＰＥＰ４座位は破壊されていることを示している。

旦　バスト’）７．（ｐａｓ　ｔｏｒ　ｉｓ）のＰＥＰ４株のより大規模な培養 物のブロスの蛋白質分解活性を分析するため、実施例ＩＩＩに記載されているよ うに株ｐ１３が１リットル発酵で増殖された。

［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　上０２　：　６５５　（１９８２）］に基づく酵素アッセ イを用いて評価された。いくつかの対照株もまたこのアッセイで評価された：　 ＰＥＰ４およびＳ、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＰＥＰ４株（株ＤＢ Ｙ７４７および２０Ｂ１２、各々Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃ ｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、Ｂｅｒｋｅ ｌｅｙ。

ＣＡから）および旦、パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＰＥＰ４野生型株（株 ＮＲＲＬ　Ｙ−１１４３０，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅａｓｅ ａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｐｅｏｒｉａ、ＩＬ）。

プロテイナーゼＡはアスパルチル　プロテアーゼ活性に関与する液泡性酵素であ り、Ｓ　セレビン１（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＰＥＰ４遺伝子によりコードさ れている。形質転換体細胞抽出物のプロテイナーゼ活性の評価に使用される方法 は酸変性ヘモグロビンからのプロテイナーゼ媒介アミノ酸放出の測定に基づいて いる。形質転換体細胞抽出物は酸変性ヘモグロビンとインキュベートされ、抽出 物中に存在するプロテイナーゼＡ活性はゼロ時間と９０分のインキュベーション 後に放出されるアミノ酸の量の相違を算定することにより決定された。

Ｓ、セレビジｚ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）対照株ＤＢＹ７４７　（ＰＥＰ４）お よび２０Ｂ１２　（ＰＥＰ４−）、ＰＥＰ４　旦、パストリス（ｐａｓｔｏｒｉ ｓ）株ＮＲＲＬ　Ｙ−１１４３０および旦、パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）の 実験ＰＥＰ４株の培養物をＹＥＰＤ培地中定常期まで増殖させた。培養細胞（２ ００Ｄ６゜。単位）を１０ｍＭアジ化ナトリウム中で洗い、次に４００μＩの１ ００ｍ〜１トリス、ｐＨ７，５中細胞と酸洗浄ガラスピーズを１分間ポルテック スすることにより溶菌させた。溶菌細胞はエーペンドルフチューブ中で１０分間 遠心分離して細胞破片を除去した。遠心後に得られた上澄液（粗抽出物）は以下 のごとくプロテイナーゼＡ活性が試験された。酸変性１％ヘモグロビン（４００ μｍ）を５０μｍの粗抽出物に加え、３７℃で９０分間インキュベートした。０ ．２ｍＩのＩＮ過塩素酸の添加により反応を停止させた。遠心分離により不溶性 物質を除去し、２００μｌの０．３１Ｍ　ＮａＣｌを２００μｍの上澄液に加え た。この溶液の４０μｍに対し、遊離アミノ酸のためのＰｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ蛋 白質アッセイキット（例えばば米国特許第４，８３９．２９５号参照）を用いて アッセイを行った。９０分間インキュベーションを行った試料中に存在する遊離 アミノ酸の量がブランク（ゼロ時間で停止された反応混合物の試料から成る）中 に存在する量と比較された。これら２つの試料間の遊離アミノ酸の相対的相違が プロテアーゼＡ活性の尺度である。

ｂ、結果 対照および形質転換株のプロテイナーゼＡアッセイの結果（表Ｉ参照；ΔＯＤが 試料中の遊離アミノ酸の濃度の尺度である）はＳ、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ）のＰＥＰ４−株のプロテイナーゼＡ活性は互、セレビシェ（ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）のＰＥＰ４”株のそれのたった１０％であることを示している。

同様に、ＰＥＰ４形質転換株（株ｐｉ、ｐ２．ｐ５．ｐ８．ｐ１３．ｐｉ６およ びｐ２０）のプロテイナーゼＡ活性も旦、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓ　１ａｅ ）のＰＥＰ４”株のそれの約１０分の１のみである。旦、パストリス（ｐａｓｔ 。

Ｌ土Σ）のＰＥＰ４野生型株は旦　セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の旦旦 Ｐ４株の約半分のプロテイナーゼＡ活性を示した。

プロテイナーゼＡアッセイ結果 ＤＢＹ７４７（Ｓ、セレビシェ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））　ＰＥＰ４°　２８ ．１２０Ｂ１２（Ｓ、セレビジｚ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））　ＰＥＰ４−　２ ．７Ｐ、パストリＸ（ｐａｓｔｏｒｉｓ）対照　ＰＥＰ４”　１３．１（ＮＲＲ Ｌ　Ｙ−１１４３０） ｐ１３　ＰＥＰ４−　３．３ ｐ２０　ＰＥＰ４−　４．２ ｐ１７　ＰＥＰ４＋（？）　７．５ ｐ１６　ＰＥＰ４−　０ ｐ１６　ＰＥＰ４−　０ ｐ１３　ＰＥＰ４−　３．３ ｐ８　ＰＥＰＣ３，３ ｐ５　ＰＥＰ４−　５．０ ｐ２　ＰＥＰ４−　６．６ １　ＰＥＰ４−　６．０ の形質転換体からのＤＮＡのサザンプロット分析の結果と一致した。

５１１５を形質転換することにより発生させた旦、バストリス（ｐａｓｔｏｒｉ 且）のＰＥＰ４株、ｐ１３はグリセロールバッチ増殖相、制限グリセロール供給 −バッチ相およびメタノール供給−バッチ相からなる相プロトコールに従って以 下のごとく１リツトル発酵により増殖された。

１０１００Ｏの最小項培地（２１ｍｌ　８５％リン酸、０．９ｇ硫酸カルシウム ・２４０，１４．３ｇ硫酸カリウム、１１．７ｇ硫酸マグネシウムおよび３８２ ｇ水酸化カリウム）および２％グリセロールを含む２リツトルの発酵槽をオー、 トクレーブした。殺菌後、４ｍｌのＰＴＭ、微量塩溶液［６ｇ／ｌ硫酸銅・５Ｈ ＩＯ９領　８ｇ／ｊ！ヨウ化ナトリウム、３ｇ／ｌ硫酸マンガン・Ｈ２Ｏ，０， ２ｇ／ｌモリブデン酸ナトリウム・２ＨｚＯ，０，０２ｇ／ｌ’ホウ酸、０．　 ５ｇ／６塩化コバルト、２０ｇ／ｌ塩化亜鉛、６５ｇ／ｌ硫酸第一鉄・Ｈ，Ｏ， ０，２ｇ／ｌビオチンおよび５ｍｌ硫酸）を発酵槽に添加し、濃ＮＨ４ＯＨ”Ｃ ｐＨを５に調整した。培地のｐＨは領　１％ストルクトールＪ６７３泡消剤を含 む５０％ＮＨ４ＯＨを添加することにより５に維持された。接種物は緩衝化酵母 窒素塩基（ＹＮＢ）グリセロール　プレート（リン酸緩衝化ＹＮＢ、２％グリセ ロール。

２％寒天）から調製され、２％グリセロールを含むリン酸緩衝化ＹＮＢ（１１゜ ５ｇ／Ｌ、ＫＨｚＰＯ＊　、２．６６ｇ／Ｌ　ＫｔＨＰＯ４，領　６７％酵母窒 素塩基、ｐＨ５）中３０℃にて一夜増殖させた。１−８のＯＤａ。、まで増殖さ れている培養細胞の１０１０−５Ｏを発酵槽に接種し、バッチ増殖をグリセロー ルが枯渇するまで約１日の間続ける。グリセロール枯渇した時点で（溶存酸素の 増加により示される）、１０ｍ１／ｈでのグリセロールの供給（５０％グリセロ ールに１２ｍ１／ＬのＰＴＭ、を加えたもの）を開始し、４０ｍ１のグリセロー ルが添加されるまで続けられた。グリセロール供給の終了後、メタノールの供給 （１００％メタノールに１２ｍ１／ＬのＰＴＭＩを加えたもの）を約２ｍｌ／ｈ の初期速度で開始した。３時間後メタノール供給速度を６　ｍ　ｌ　／　ｈに増 加させた。メタノール供給速度は１２−１８時間６ｍｌ／ｈに維持し、次に１０ ｍ１／ｈに増加し、発酵を持続する間１０ｍ１／ｈに維持された。４００ｍ１の メタノールが発酵槽に添加された後、容器を取り出した。

Ｂ　試料調製 発酵培養の試料（１５ｍＩづつ）は発酵工程を通して種々の時間間隔で発酵槽か ら取り出した。各々の試料は６５００ｘｇで５分間遠心分離してブロスおよび細 胞を分離した。これらの時点でのＮＨ，Ｏ）（、泡消剤・グリセロールおよびメ タノール蓄積のレベルが記録された。上澄中のメタノールおよびエタノール濃度 はＰｏｒａｐａｋＱカラム（ＡＩｌｔｅｃｈ）を用いるガスクロマトグラフィー により決定された。

さらに、培養物の湿潤重量が発酵槽中の細胞増殖の指標として決定された。この 目的のためには、発酵培養物の１ｍｌをマイクロフユージ中４分間遠心分離し、 上澄液を傾斜させて捨て、湿潤ペレットを秤量した。

Ｃ１結果 １リツトル発酵中の旦、バストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｐ１３のＰＥＰ４株の 増殖は発酵の間種々の時間で発酵培養物の湿潤細胞重量（ｇ／ｌ）を決定するこ とによりモニターされた。発酵のメタノール供給バッチ相の間のｐｌａ株の増殖 の時間変化は、類似の１リツトル発酵の間のＨＩＳ４　ＰＥＰ４株Ｇ＋ＰＡ０８ ０４Ｈ２（野生型ＨＩＳ４遺伝子を含む発現ベクターでＨＩＳ４　ＰＥＰ４ルタ め、旦旦Ｐ４株１株ｐ１３．およびＰＥＰ４株の１リツトル発酵からのブロスの 蛋白質分解活性が比較された。この研究においては、２つの異なったペプチド、 表皮増殖因子（ＥＧＦ　；米国特許出願番号３２３，９６４号に記載されている ごと（、標品５３アミノ酸ＥＧＦ分子の最初の５２アミノ酸から成る組換えで合 成された分子）および成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ；ＥＰ２０６７８３に記載 されているごとく組換えで合成された）が別々にＰＥＰ４　Ｐ、バストリス０４ 　Ｈ２の同様な１リツトル発酵からの細胞を含まないブロス中で室温にてインキ ュベートされた。特定の期間のインキュベーションの後、各々のインキュベーシ ョン混合物の一部が逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により試験さ れて（下に記載）各々の試料中に残存する無傷のペプチドの量が決定され、それ によりペプチドの蛋白質分解の程度が決定された。

ＥＧＦおよびＧＲＦペプチドの分析に使用された逆相ＨＰＬＣ系は、Ｗａｔｅｒ ｓ６００　（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）溶媒送液システム、ＷａｔｅｒＳモデル４ ８１Ｌａｍｂｄａ　Ｍａｘ可変波長検出器、Ｗｉｓｐ７１０Ｂオートインジェク ターおよびＳｈｉｍａｄｚｕ　Ｃｈｒｏｍ−Ｐａｃ積分器（Ｃｏｌｅ　５ｃｉｅ ｎン酸ナトリウム、ｐＨ５，０で１：１０に希釈した。１５マイクロリツトルの 濃縮ＧＲＦ貯蔵液が２８５μｍの希釈ブロスに添加され４時間インキュベートさ れた。リン酸緩衝液で同様に希釈したＧＲＦ貯蔵液もまた対照として４時間イン キュベートされた。６０マイクロリツトルのＥＧＦ貯蔵液は２４０μＩの希釈ブ ロスまたは緩衝液に添加され、８時間インキュベートされた。各々のインキュベ ーション混合物試料は別々に、Ｗａｔｅｒｓ　μＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８逆相 カラムにインジェクトされた。２０−６０％移動相Ｂ（９５％アセトニトリル、 ５％水。

０．１％トリフルオロ酢酸）の２０分での直線濃度勾配によりペプチドがカラム から溶出された。移動相Ａ（０，１％トリフルオロ酢酸）は溶出濃度勾配を作製 する移動相Ｂの希釈に使用された。

Ｂ、結果 ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，０、中に含まれている無傷のＥＧＦ またはＧＲＦおよびブロス中に含まれているＥＧＦまたはＧＲＦのＨＰＬＣ分析 で得られたクロマトグラムを比較することにより無傷のペプチド［ＰＥＰ４旦、 バストリス（ｐａｓｔｏｒｊｓ）株の発酵ブロス中および旦、バストリス（ｐａ ｓｔｏｒｉｓ）株Ｇ＋ＰＡＯ８０４Ｈ２のブロス中でインキュベートされたＥＧ ＦまたはＧＲＦ分子の］の量が評価された。標準の無傷のペプチドのＨＰＬＣ分 析によるクロマトグラムは試料中に存在するＷ＃準ペプチドの量およびペブ千ド の特有の保持時間を反映した主ピークから成っている。対照的に両方のペプチド の蛋白質分解断片は無傷のペプチドに関連した保持時間と異なった種々の長さの 時間ＨＰＬＣカラム上に保持される。従って、両方のペプチド（ＥＧＦまたはＧ ＲＦ）の蛋白質分解断片のＨＰＬＣ分析からのクロマトグラムはピークの数およ び大きさおよび断片化種に付随する保持時間などが無傷のペプチドのＨＰＬＣ分 析で得られるクロマトグラムと異なっている。これらの相違に基づいて、ブロス インキュベーンコン試料中の無傷のＥＧＦまたはＧＲＦペプチドの量を算定する ことが可能であった。

ＰＥＰ４　Ｐ、パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）対照ブロス中でインキュベート されたＧＲＦおよびＥＧＦ試料のＨＰＬＣ分析に基づくと、ＰＥＰ４株Ｇ＋ＰＡ Ｏ８０４Ｈ２の発酵からのブロス中でインキュベーションした後、１０％未満の 各々の２つのペプチドが無傷で残っていることが決定された。対照的に、ＰＥＰ ４　Ｐ、パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）株のブロス中のこれらのペプチドの蛋 白質分解のレベルはＰＥＰ４株のブロス中よりも著しく低い（４時間のインキュ ベーション後でも〉６０％のＧＲＦが無傷で残存：８時間のインキュベーション 後でも〉９０％が無傷で残存）。これらのデータは旦、パストリス（ｐａｓｔ。

Ｌ１互）のＰＥＰ４遺伝子の破壊は株のブロス中の蛋白質分解活性をかなり減少 させることを示している。

実施例ｖ　：　ｐ、パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ３遺伝子の単離■　 パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ３遺伝子は、大腸菌株Ｃ３Ｈ−２８中の ｐｙｒＦ突然変異（オロチジン−リン酸デカルボキシラーゼ活性の欠失に対応す る）を補足するその能力でプラスミド（ＹＥ　ｐ　１３）に基づくピキア（Ｐｉ ｃｈｉａ）ゲノム　ライブラリ中で同定される。Ｐ、パストリス（ｐａｓｔ。

ｒ　ｉ　５）ＵＲＡ３遺伝子はライブラリーＤＮＡで形質転換され、ウラシルを 欠く培地上で増殖できる大腸菌株Ｃ３Ｈ−２８のコロニーを単離することにより クロア９）］は、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　（Ｓ、セレビシェ）　（２μＬ／ プリコン）とＥ、ｃｏｌｉ（大腸菌）（ｐＢＲｏｒｉ）の両方の複製の起源を含 む便利なシャトルベクターである。さらに、ＹＥｐ１３は大腸菌の形質転換の選 択的マーカーとして用いるためのＡｍｐ’　（アンピシリン耐性）遺伝子と、ｓ 、セレビシェにおける選択的マーカーとして用いるためのＬＥＵ遺伝子（ロイシ ン生合成経路遺伝子）とを含む。Ｐ、パストリス（菌株ＮＲＲＬ　Ｙ−１１４３ ０）ゲノムＤＮＡライブラリーは、Ｃｒｅｇｇ等が述べているように［Ｍｏ　Ｉ 、Ｃｅ　Ｉ　１゜Ｂｉｏｌ、５：３３７６−３３８５　（１９８５）］、プラス ミドＹＥｐ１３を用いて作製されている。

ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＰｒｅＳＳ、−ニューヨーク州、コ ールドスプリングハーバ−（１９７２）を参照のこと］はオロチジン−５′　− ホスフェート　デカルボキシラーゼ活性を有さす、合成培地上で増殖する場合に ウラシルを必要とする。Ｓ、セレビシェＵＲＡ３遺伝子が大腸菌におけるｐｙｒ Ｆ突然変異を相補できることは実証されている［Ｒｏｓｅ、Ｍ、、Ｇｒｉｓａｆ 　ｉ。

Ｐ　及びＢｏｔｓｔｅｉｎ、Ｄ、、Ｇｅｎｅ　λ９　：１１３−１２４　（１９ ８４）］。それ故、大腸菌株Ｃ３Ｈ−２８のｐｙｒＦ突然変異を相補できるＰ、 パストリスＵＲＡ３遺伝子に関してＰ、パストリスＹＥｐ１３ゲノムＤＮＡライ ブラリーをスクリーニングするために、このライブラリーからのＤＮＡによって 、大腸菌株Ｃ３Ｈ−２８を形質転換した。

形質転換Ｃ３Ｈ−２８細胞をウラツルを含まない半合成培地上に置いた。非形質 転換細胞はこの培地上で増殖しなかった。ウラノルを含まない平板培地（ｐｉａ ｔｅ）上で増殖できるＣ５Ｈ−２８形質転換細胞（Ｐ、パストリスゲノムライブ ラリーＤＮＡによって形質転換）は−１０／形質転換用ＤＮＡ　μｇの頻度で発 生した。増殖のためにウラシルを必要としない形質転換細胞１０個からプラスミ ドＤＮＡを単離した。これらのプラスミドを大腸菌株Ｃ３Ｈ−２８の形質転換に 用いた、１０個のプラスミドの中の１０個がこの菌株のウラシル要求性を高頻度 で相補した。Ｐ、パストリスＹＥｐ１３ゲノムライブラリーＤＮＡによるｃｓＨ −２８の形質転換によって発生した選択形質転換細胞の一つは６．　６ｋｂ　５ ｐｈｌフラグメントを含む９．０ｋｂインサートを収容する。６．　６ｋｂ　５ ｐｈＩフラグメントをさらに分析するためにｐＵｃ１９の５ｐｈＩ部位にサブク ローン化した。

この形質転換細胞からのプラスミドＤＮＡを５ｐｈＩによって消化させ、０゜６ ％アガロースゲル上の電気泳動に供した。ＤＥ８１ペーパーを用いて６．６ｋｂ フラグメントを単離し、このペーパーからＬＭ　ＮａＣ１４００μｌによって溶 出した。ＤＮＡはフェノール／クロロホルム　４００μＩによって抽出し、エタ ノールによって沈殿させた。次に、６．６ｋｂフラグメントをアルカリホスファ ターゼ処理５ｐｈＩｆｉ化ｐＵｃ１９と結合させた。この結合混合物を用いて大 腸菌ＭＣ１０６１細胞を形質転換させた。アンピシリン耐性形質転換細胞を制限 酵素消化コロニーＤＮＡの分析によって６．６ｋｂＳｐｈＩフラグメントの存在 に関してスクリーニングした。この正確なプラスミドはｐＰＵ２０１と名付けた 。プラスミドｐＰＵ２０１を用いてＣ３Ｈ−２８を形質転換させた、このプラス ミドはこの菌株のウラシル要求性を相補することができた。

ＣプラスミドｐＰＵ２０１におけるインサートの特性化ｐＰＵ２０１を種々な酵 素によって消化させ、生ずるフラグメントをＤＮＡ長さコンピュータプログラム （ＭａｐＳｏｒｔ；ウイスコンンン大学　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ウイスコンノン州 、マジソン）を用いて分析して、フラグメントの大体のサイズを判定することに よって、プラスミドｐＰＵ２０１中のＰ、パストリスＤＮＡの６．６ｋｂインサ ートの制限酵素認識部位の地図（図６）を作成した。

ｐＰＵ２０１の６．６ｋｂインサート中に含まれるＵＲＡ３遺伝子を正確に描写 するために、ｐＰＵ２０１の各制限酵素消化物の５ｎｇアリコートを１％アガロ 号を参照のこと）。２５％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ１５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶 液、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，０１１ｍＭ　ＥＤＴＡ、領　１％ド デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び１００μｇ／ｍｌサケ***ＤＮＡを含む溶 液を用いて、フィルターをこのプローブに２７℃においてハイブリッド形成した 。

ハイブリッド形成後に、フィルターを１ｘｓｓｃと１％ＳＤＳを用いて、室温に おいて、１回洗浄につき５〜１０分間かけて、３回洗浄し、次に０．５ｘＳＳＣ と０．５％ＳＤＳを用いて、４５℃において、１回洗浄につき１０分間がけて、 ２回洗浄した。これらの緩和な条件は互いに異なるＵＲＡ３遺伝子配列の間のハ イブリッド形成を可能にした。ｐＰＵ２０１の各消化物の追加のサンプルを同じ １％アガロースゲル上で分離し、ハイブリッド形成フラグメントと非ハイブリッ ド形成フラグメントとを比較するために臭化エチジウムによって染色した。ハイ ブリッド形成フラグメントとｐＰＵ２０１の制限マツプとの比較は、ｐＰＵ２０ １中のＵＲＡ３遺伝子を図６に示す約１．３ｋｂ　ＮｃｏＩ−３ａｉｌフラグメ ントに局在化することを可能にした。これを知ることによって、次には、Ｐ、パ ストリスＵＲＡ３遺伝子の塩基配列を決定し、さらに特性化するために適したサ ブクローンを構成することが可能になった。

ｐＰＵ２０１を旦ｃｏＲＶと一旦下」工Ｉとによって消化させ、ＵＲＡ３遺伝子 を含む約４．０ｋｂフラグメントを単離し、これをｐＵｃ１９中に旦ｍａｒとハ エ１部位において結合することによって、プラスミドｐＰＵ２０２　（図７）を 形成した。ｐＰＵ２０２をそれぞれ、旦見旦■、べ旦旦■及び旦旦旦Ｒ１によっ て消化させ、大量（２００μｍ）に再結合させることによって、プラスミドｐＰ Ｕ２０３、ｐＰＵ２０５及びｐＰＵ２０６　（図８−１０）を形成した。クロー ン化Ｐ、バストリスゲノムインサートＤＮＡフラグメント中並びにｐＰＵ２０２ のｐＵＣ１９ポリリンカー中にこれらの酵素の各々の認識部位が存在するので、 この方法はｐＰＵ２０２中のこれらの部位の間のＤＮＡの便利な除去を可能にし た。

生ずるプラスミドを次に用いて、大腸菌株Ｃ３Ｈ−２８を形質転換させて、各欠 失構造体がｐｙｒＦ突然変異を相補するか否かを判定した。この結果はｐＰＵ２ ０３とｐＰＵ２０５がウラシルを含まない合成培地上でｐｙｒＦ菌株の増殖を可 能にする機能ＵＲＡ３遺伝子を含むが、ｐＰＵ２０６は含まないことを実証した 。

これらの研究結果はｐＰＵ２０１におけるＰ、バストリスＵＲＡ３遺伝子の地図 作成（ｍａｐｐｅｄ）位置と一致する。

推定の（ｐｕｔａ　ｔ　ｉ　ｖｅ）ＵＲＡ３遺伝子を有するＰ、バストリスゲノ ムＤＮＡフラグメントのサブクローンをＳａｎｇｅｔジデオキシ方法によって塩 基配列決定した［Ｓａｎｇｅｒ等のＰｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　 ｉ、ＵＳＡ７４　：　５４６３−５４６７　（１９７７）を参照のこと］。この 構造遺伝子と約１００ｂｐのフランキング配列との塩基配列を両方向において調 べて、配列番号３に表す。クローン化Ｐ、バストリスＵＲＡ３遺伝子から演鐸さ れるアミノ酸配列（配列番号４を参照のこと）は、Ｓ、セレビシェＵＲＡ３遺伝 子から演鐸されるアミノ酸配列との７３％相同を有し、Ｃ，トロピカリスのＵＲ Ａ３ＡとＵＲＡ３Ｂ遺伝子から演締されるアミノ酸配列との７１％相同を有し、 Ｋｌｅｕｖｅｒ。

ｍｙｃｅｓ　Ｉａｃｔｉｓ　（クロイペロミセス　ラクチス）ＵＲＡ３遺伝子か ら演締されるアミノ酸配列との７２％相同を有する。

内因性ＰＥＰＪ座に不完全ＰＥＰ４遺伝子を加えることによる、宿主ＰＥＰ４遺 伝子の破壊によって、ピキア　バストリスのＰＥＰ４欠失（ＰＥＰ４→菌株の発 生に用いるためのプラスミドｐＤＲ４２１を形成した。このベクターはＰＥＰ４ 遺伝子の内部部分を含み、この部分はＰ、パストリスのＰＥＰ４菌株の形質転換 に用いる場合に、ＰＥＰＪ座において宿主ゲノムに結合して、ＰＥＰ４遺伝子の 不完全な非機能性コピーを発生させる。

破壊ベクターｐＤＲ４２１を発生させるために、ピキアのＵＲＡ３遺伝子をベク ターｐＥＰ２０５　（ｐＵｃ１９配列と、ｐＥＰ２０２から誘導される一４５０ ｂｐＢａｍＨＩフラグメントに含まれるＰＥＰ４遺伝子部分とから成る）にクロ ーン化させた。これは、ｐＥＰ２０５のＸｂａ［−８ｐｈｌ部位（図３参照）中 に２ｋｂ　旦且旦■一旦ｐｈｌＤＮＡフラグメントとしてｐＰＵ２０５からのＵ ＲＡ３遺伝子（図９参照）をサブクローン化することによって実施した。

プラスミドｐＰＵ２０５をΣ２且１と５ｐｈｌとによって消化させ、この反応混 合物を０．８％アガロースゲル上で分離させた。ＵＲΔ３遺伝子を含む２ｋｂＤ ＮＡフラグメントをＤＥ８１ペーパーを用いてゲルから単離させ、溶離し、精製 した。プラスミドｐＥＰ２０５をＸｂａｌと旦ｐｈｌとによりて消化させた。

ｐＰＵ２０５から単離させた２ｋｂ　ＵＲＡ３遺伝子含有５ｐｅｌ−８ｐｈｌフ ラグメントをＸｂａＩ／５ｐｈｌ消化ｐＥＰ２０５に結合させ、この混合物を用 いて大腸菌株ＭＣ１０６１をアンピシリン耐性に形質転換させた。アンピシリン 耐性コロニーを、ＢａｍＨＩ／５ｐｈＩ制限酵素消化コロニーＤＮＡの２．７ｋ ｂ、０．４ｋｂ、１．９ｋｂ診断フラグメントの存在に関する分析によってスク リーニングした。形質転換体はｐＤＲ４２１と名付けられた正確なりＮＡ構造を 有するプラスミドを含むことが判明した（図１１）。

Ｐ、パストリスのＵＲＡ３　１ＧＦ−１発現菌株、ＩＧＦ−Ｕ、をｐＤＲ４２１ によって形質転換させて、Ｐ、パストリスのＰＥＰ４．ＩＧＦ−１発現菌株を発 生させた。

ａ、ＩＧＦ−Ｕの発生 ５−フルオロ−オロチン酸（５−ＦＯＡ）はウラシル生合成経路中間体の類似体 であり、これはＵｒａ”菌株によって消化されるときに有害な化合物を生ずる。

Ｕｒａ”菌株によるウラシル生合成経路はある一定の段階においてブロックされ るので、これらの菌株は５−ＦＯＡ　（細胞にとって有害な化合物を形成する） を代謝せず、このため５−ＦＯＡ耐性である。これに反して、Ｕｒａ”″菌株は ５−ＦＯＡを代謝し、５７ＦＯＡ含有培地上では生き残ることができない。それ 故、５−ＦＯＡ含有含有上地上細胞培養は自然突然変異によってＵｒａ”菌株を 発生させるための方法として用いることができる［例えば、Ｂｏｅｋｅ等、Ｍｏ ｌ。

Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１９７：３４５−３４６　（１９８４）を参照のこと］。

ＩＧＦ−１産生菌株Ｇ＋■ＭＢ２０６Ｓ１のＵＲＡ３誘導体［この菌株の説明に 関しては、ここにその全体において参考文献として関係する、１９９０年９月４ 日出願の共通に譲渡された米国特許出願第０７１５７８．７２８号を参照のこと ］は、ウラシル補充５−ＦＯＡ含有培地［０，６７％酵母窒素塩基、２％寒天、 ２％グルコース、５−ＦＯＡ　７５０ｍｇ／ｌとウランル４８ｍｇ／ｌ］中にこ の菌株の一５ｘｌＯ’細胞を直接培養することによって形成された。３０℃にお ける１週間の培養後に、この平板上で増殖するＩＧＦ−Ｕと名付けられたコロニ ーを単離した。増殖のためにウラシルを必要とする、このコロニーはピキア　パ ストリスのＵＲＡ３菌株を相補することができなかった。

ト形質転換方法によるＩＧＦ−Ｕの形質転換に用いた。形質転換体を６日間にわ たるウラジル不存在下で増殖しつるか否かによって選択した。

Ｕｒａ’形質転換体を、次に実施例ＩＩに述べるようなコロニーオーバーレイ比 色検査方法によって、カルボキシペプチダーゼＹ活性に関して分析した。この分 析結果に基づいて低カルボキシペプチダーゼＹ活性を有するように思われるＵｒ ａ”形質転換体のコロニー（すなわち、ＰＥＰ４加口二一を指示する強い赤色を 発色できなかったコロニー）を単離し、マスターブレイス（ｍａｓｔｅｒ　ｐｌ ａｃｅ）に移し、対照コロニーと共に継代培養し、オーバーレイ分析法を用いて 再スクリーニングした。再度強い赤色を発色することができなかった１コロニー をＭ＋ｒＭＢ２０６Ｓ１と名付けた。

ｂ、１リットル発酵と１０リットル発酵とで増殖したＰ、バストリスのＩＧＦ− １発現ＰＥＰ４菌株の完全なＩＧＦ−１発現レベルの分析ｔ、Ｐ　バストリスの ＩＧＦ−１発現ＰＥＰ４菌株の発酵実施例Ｖｌ、　Ａ、２．　ｂ、に述べたよう に形成されたＰ、パストリスのＩＧＦ−１発現ＰＥＰ４菌株、〜ｆ＋１Ｂ２０６ ｓ１をグリセロールバッチ増殖相、制限グリセロール供給バッチ相及びメタノー ル供給バッチ相から成る三相プロトコールによる１リットル発酵と１０リットル 発酵において増殖させた。Ｐ、バストリスのＰＥＰ４１ＧＦ−１発現菌株間の完 全ＩＧＦ−１発現レベルを比較するために、ＩＣＦ−１遺伝子発現力セントの４ コピーと６コピーをそれぞれ含む、Ｐ。

バストリスの２種ＰＥＰ４菌株、Ｇ十夏ＭＢ２０４Ｓ１４とＧ＋１ＭＢ２０６Ｓ Ｉをも次のように比較可能な発酵において増殖させた。

１リットル発酵プロトコール ２リットル発酵器（Ｂｉｏｌａｆｉｔｔｅ、ニューシャーシー州、プリンストン ）に最少塩培地　９００ｍ１　（８５％リン酸　２１ｍ１、硫酸カルシウム２Ｈ ｔｏ　０．９ｇと、硫酸カリウム　１４．３ｇと、硫酸マグネシウム１１．７ｇ と、水酸化カリウム　３．２ｇ）とグリセロール３０ｇとを加えて、オートクレ ーブ処理した。滅菌後に、ＰＴＭ、微量（ｔｒａｃｅ）塩溶液（硫酸第二銅・５ Ｈ２０６ｇ／Ｉ、ヨウ化ナトリウム　０．０８ｇ／ｌ、硫酸マンガン・Ｈ，０３ ｇ／Ｉ、モリブデン酸ナトリウム・２Ｈ２００，２ｇ／Ｌホウ酸　０．０２ｇ／ ］、塩化コバルト　０．５ｇ／ｌ、塩化亜鉛　２０ｇ／Ｉ、塩化亜鉛　２０ｇ／ Ｉ、硫酸第一鉄・ＨｚＯ６５ｇ／Ｌビオチン　０．２ｇ／Ｌ及び硫酸　５ｍｌ） ４ｍｌを発酵器に加え、ｐＨを濃ＮＨ４ＯＨによって５に調節した。

ｐＨは０，１％５ｔｒｕｋｔｏｌ　Ｊ６７３消泡剤（起泡を制御するために加え る）を含む５０％ＮＨ４ＯＨの添加によって調節した。温度を３０℃に維持し、 溶解酸素を撹拌、通気、又は酸素を含む空気供給（ｆｅｅｄ）の補充の強化によ って飽和の２０％以上に維持した。

２％グリセロールを含む緩衝化（ｂｕｆｆｅｒｅｄ）ＹＮＢ中で３０℃において 一晩増殖させた細胞から接種物を形成した。発酵器に０Ｄｓｏｏ　２〜８までに 増殖させた培養細胞４０〜７Ｑｍｌを接種し、バッチ増殖法（ｇｒｏｗｔｈ　ｒ ｅｇｉｍｅｎ）をグリセロールが消耗されるまで１８〜２４時間続けた。溶解酸 素濃度の増加によって指示されるグリセロール消耗の時点で、グリセロール供給 （５０％ｗ／ｖグリセロール　プラス　１２　ｍ　ｌ　／　Ｌ　Ｐ　ＴＭ＋）を １０ｍ１／時で開始した。ｐＨ５，０発酵では、培養物のｐＨを発酵を通して５ に維持した。

低ｐＨ発酵（すなわち、ｐＨ２，８又はｐＨ３，５）では、グリセロール供給の 開始後に、ｐＨコントローラーの設定点を所望のｐＨに調節した。４時間後に、 細胞代謝の結果として培養物のｐＨはこの設定点値にまで低下した。この低いｐ Ｈを発酵の残りを通して維持した。次にグリセロール供給を停止し、メタノール 供給（１００％メタノール　プラス　Ｐ　ＴＭ＋　１２　ｍ　ｌ　／　Ｌ）を２ ｍｌ／時の速度で開始した。３時間のメタノール供給後に、供給速度を６ｍｌ／ 時に高め、この速度を発酵の残りに対して維持した。メタノール供給の開始から ７２時間後に、容器を回収した。

発酵をＮＨ，ＯＨ，消泡剤、グリセロール、メクロール、エタノール、及び湿細 胞重量レベルに関して実施例ＩＩＩに述べたように監視した。ブロス（ｂｒ。

ｔｈ）サンプルと細胞サンプルも実施例ＩＩＩに述べたように発酵を通して回収 した。

１０リットル発酵プロトコール ５．５リツトルの全量で、１０Ｘ基本塩（８５％リン酸　４２ｍ１／Ｉ、硫酸カ ルシウム・２８２０　１．８ｇ／Ｌ硫酸カリウム　２８．６ｇ／Ｌ硫酸マグネシ ウム　２３．４ｇ／Ｌ水酸化カリウム　６．５ｇ／］）３．５リツトルとグリセ ロール　２２０ｇとを含む１５リットル発酵器を滅菌した。発酵器が冷却した後 に、ＰＴＭ＋微量塩　２４ｍ１を加え、ｐＨを２８％水酸化アンモニウムの添加 によって５に調節した。ｐＨは同溶液の添加によって調節した。起泡は５ｔｒｕ ｋｔｏｌ　Ｊ６７３の５％溶液の添加によって制御した。温度は３０℃に維持し 、溶解酸素は撹拌、通気、反応器圧の強化によって又は酸素を含む空気供給の補 充の強化によって飽和の２０％以上に維持した。２％グリセロールを含む緩衝化 酵母窒素塩基（ＹＮＢ；ＫＨ２ＰＯ４１１，５ｇ／Ｌ、ＫＨ２Ｏ４２゜６６ｇ／ Ｌ、酵母窒素塩基　６．７ｇ／Ｌ、ｐＨ６）中で一晩増殖させた細胞から接種物 を作製した。発酵器にＯＤ、。。　２〜８までに増殖させた培養細胞５００〜７ ００ｍ１を接種し、バッチ増殖法を１８〜２４時間続けた。溶解酸素濃度の増加 によって指示されるグリセロール消耗の時点で、グリセロール供給（５０％ｗ／ ｖグリセロール　プラス　１２ｍ１／Ｌ　ＰＴＭ＋）を１００ｍ１／時で開始し 、４時間続けた。次にグリセロール供給を停止し、メタノール供給（１００％メ タノール　プラス　１２ｍ１／Ｌ　ＰＴＭ＋）を２０ｍ１／時の速度で開始した 。メタノール供給の開始と共に、ｐＨコントローラーの設定点を２゜８に調節し た。次にｐＨは細胞代謝の結果として、設定点値まで徐々に低下した。

４時間のメタノール供給後に、メタノール供給速度を６０ｍ１／時に高め、この 速度に全体で約７２時間維持し、７２時間目に容器を回収した。

ｔｉ、ＰＥＰ４　１ＧＦ−１発現歯株間のＩＧＦ−１発現レベルＰ、バストリス の組換え体ＩＧＦ−１分泌菌株の発酵で産生される数形成の■ＧＦ−１の一つは 、ジスルフィド結合によって一緒に維持される２個以上のＩＧＦ−１分子フラグ メントから成る、ニックが入った（ｎｉｃｋｅｄ）種である。

これらのフラグメントはＩＣＦ−１分子のアミノ酸バックボーンの１個以上のペ プチド結合のタンパク分解開裂によって形成された。ニツクドＩＧＦ−１分子と 完全ＩＧＦ−１分子とは見かけの分子量［非還元性条件下で、５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって測定］に基づいては識別 不能であるので、これらの種は非還元性条件下での逆相ＨＰＬＣによって、また 還元性条件下（すなわち、例えばジチオスレイトールのような還元剤の存在下） での５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離することができる。ニックが入ったＩＧＦ− １のフラグメントを保持するジスルフィド結合の還元は、完全な分子よりも小さ い分子量を有する、タンパク分解によって生ずる個々のフラグメントを遊離させ る。

ＩＧＦ−１発現レベルの定量 細胞を含まないブロスにおけるニックドＩＧＦ−１と真正の（ａｕｔｈｅｎｔｉ ｃ）（完全な、正確に折り畳まれた、モノマーの）ＩＣ；Ｆ−１の収量を定量逆 相ＨＰＬＣによって測定した。用いたＨＰＬＣ系は、０１８カラムの代わりに■ ｙｄａｃ　Ｃ４カラム（０，４６ｘ５ｃｍ）を用いた以外は、実施例ＩＶで述べ た系と同じであった。１％／分勾配の２５〜４２％移動相をカラムに１ｍｌ／分 の流速度で１７分間通して、このカラムからサンプルを溶出した。検出器を０゜ ０５吸光度単位フルスケール（ＡＵＦＳ）にセットし、最大感度のために２１５ ｎｍの波長を用いた。

Ｐ、バストリス　ブロス中の真正ＩＧＦ−１種とニックが入ったＩＧＦ−１種と をＨＰＬＣによって識別するために、ブロス　サンプルをＨＰＬＣカラムに負荷 する前にブロスから若干の内因性Ｐ　パストリス汚染物を除去することによって 、ブロスを洗浄することが必要であった。これは、このブロスを０．２５ｍ１カ ラムに含まれるスルホプロピルベースドカチオン交換樹脂に通すことによって達 せられた。この樹脂を最初に０．２Ｍ酢酸によって洗浄し、次に０．０２Ｍ酢酸 　２ｍｌと平衡化させた。一定量の細胞を含まない粗ブロス（１ｍｌ）をカラム に負荷し、このカラムを０．０２Ｍ酢酸　１ｍｌによって洗浄した。ＩＧＦ−１ を００２Ｍ　酢酸ナトリウム、ｐＨ５，５，プラス　ＬＭ　ＮａＣｌの２ｍｌに よって溶出した。溶出液の最初の１ｍｌは全ＩＧＦ−１の７５〜８０％を含み、 通常は回収された唯一の溶出量であった。カラムを次に１００％メタノール　２ ｍｌによる洗浄によって再生し、それによって再使用のために利用可能にした。

ピキア−産生ＩＧＦ−１のレベルの定量のために、既知量の標準ＩＧＦ−１（Ａ ｍｇｅｎ、カリフォルニア州、オークス）をＨＰＬＣカラムに注入し、クロマト グラムの対応ピーク下の面積を測定した。面積をＨＰＬＣカラムに負荷したｒＧ Ｆ−１のμｇに対してプロットすることによって、標準曲線を形成した。ＨＰＬ Ｃクロマトグラム　ピーク下の面積をＩＧＦ−１濃度に換算するために用いる相 関係数を標準曲線から算出した。検出器を０．０５ＡＵＦＳと２１５ｎｍの波長 にセントした場合に、相関係数はカラムに注入したＩＧＦ−１について３５０単 位／μｇであった。この情報を用いて、洗浄されたブロス　サンプル中に存在す る正確に折り畳まれた、完全なモノマーＩＧＦ−１の濃度を、サンプルのＨＰＬ Ｃ分析からのクロマトグラムの対応ピーク下の面積の測定によって、算出するこ とが可能であった。この相関係数を用いて、二ツクが入ったＩＧＦ−１種の大体 の濃度をも同様に算出した。しかし、ニックが入った種の絶対濃度は完全■ＧＦ −１とニックが入ったＩＧＦ−１の固有相関係数の差に依存して変動する。

１リツトル発酵の結果 該ＰＥＰ４　ＴＧＦ−１発現歯株の１リツトル低ｐＨ（ｐＨ２，８）発酵は一貫 して、ＰＥＰ４　１ＧＦ−１発現歯株の１リツトル低ｐＨ発酵（〜１６０−１９ ０ｍｇ／Ｌ）よりも多量の総モノマー（真正　プラス　ニノクド）ＩＧＦ−１（ 〜２００−２５０ｍｇ／Ｉ）を生成した。さらに、該ＰＥＰ４菌株のブロス中の 真正ＴＧＦ（の割合はＰＥＰ４菌株のブロスにおける同割合（６５％）よりも多 少高かった（７７％）。しかし、該ＰＥＰ４菌株とＰＥＰ４菌株とのモノマーＩ ＧＦ−１産生レベルの非常に大きい明白な差が、これらの菌株のｐＨ５，０発酵 ニオイテ検出された。ＰＥＰ４　１ＧＦ−１発現歯株、Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１・ １とＧ＋ｌＭＢ２０６ＳＬとの１リットルｐＨ５，０発酵においてはＩＧＦ−１ は本質的に検出されなかった。この結果は、ＰＥＰ４菌株の発酵において産生さ れる真正ＩＧＦ−１がｐＨ５，０においては大規模なタンパク分解を受けるが、 低いｐＨではごく限定されたタンパク分解を受けるに過ぎないことを示す。これ に反シテ、該ＰＥＰ４　１ＧＦ−１発現歯株Ｍ＋■ＭＢ２ｏ６ｓ１の１リットル ｐＨ５，０発酵は少な（とも２００ｍｇのモノｖ−ＩＧＦ−１／Ｉを生じ、その 約８０％は真正ＩＧＦ−１であった。従って、該ＰＥＰ４　ＩＧＦ−１発現歯株 はＰＥＰ４　１ＧＦ−１発現歯株に比べてｐＨ５，０＋＝おける真正ＩＧＦ−１ １７）産生に関して有意に改良され、ｐＨ２，８における真正ＩＧＦ−１の産生 に関して多少改良されたように見える。

１０リットル発酵の結果 Ｐ、パストリスの該ＰＥＰ４　ＩＧＦ−１発現歯株の１０リットル発酵は、ＰＥ Ｐ４　１ＧＦ−１発現歯株の１０リットル発酵（〜１７０ｍｇ／Ｉ）よりも多量 の総モノマーＩＧＦ−１（〜２００ｍｇ／］）を生成した。

該ＰＥＰ４菌株とＰＥＰ４菌株の１０リットル発酵において産生される総モノ？ −ＩＧＦ−１の組成も異ナッた。該ＰＥＰ４菌株Ｍ＋ｌＭＢ２０６Ｓ１（７）１ ０リットル発酵における総モノマーＩＧＦ−１の７５％（１６４ｍｇ／Ｉ）以上 が真正ＩＧＦ−１であツタが、ＰＥＰ４菌株Ｇ＋ｌＭＢ２０４Ｓ１４（７）１０ リットル発酵における総モノマーＩＧＦ−１の約５０％（８８ｍｇ／ｌ）のみが 真正■る細胞収率よりも〜３０％低かったので、真正ＩＧＦ−１の細胞当たりの 収率はＰＥＰ４菌株の発酵において非常に強化された。該ＰＥＰ４菌株の発酵に おける細胞収率が低い結果として、該ＰＥＰ４菌株の発酵から多量の細胞を含ま ないブロスが回収された（ＰＥＰ４菌株の発酵から回収される細胞を含まないブ ロスの量に比べて）。これは該ＰＥＰ４菌株の発酵からの分泌ＩＧＦ−１の高レ ベルの回収を生ずる（ＰＥＰ４菌株の発酵から回収される分泌ＩＧＦ−１量に比 べて）。

上記結果は、該ＰＥＰ４　［ＧＦ−１発現歯株が真正ＩＣＦ−１の産生に関して 、ＰＥＰ４　１ＧＦ−１発現歯株に比べて、大規模に改良されることを実証する 。

１、Ｐ、バストリス遺伝子破壊ベクターｐＤＲ６０１とｐＤＲ６０２の形成ベク ターｐＤＲ６０１とｐＤＲ６０２とを、欠陥ＰＥＰ４遺伝子による内因性ＰＥＰ ４遺伝子の置換による宿主ＰＥＰ４遺伝子の破壊によるＰＥＰ４欠損（ＰＥＰ４ →菌株の発生に用いた。このベクターは下記のように数工程で形成した（図１３ の線図も参照のこと）。

ｐＵｃ１９配列と、ｐＥＰ２０２からのクローン化Ｐ、バストリスＰＥＰ４遺伝 子とから成るプラスミドｐＥＰ３０１　（図４参照）をＮｃｏｌによって開裂し 、次にＤＮＡをエタノールによって沈殿させ、回収し、再懸濁させ、連結反応混 合物中に連結させた。この消化と連結は〜０．５ｋｂ　ＮｃｏＩフラグメントに 含まれるＰＥＰ４遺伝子の内部部分を効果的に除去した。連結後に、ＤＮＡをＢ ｇＩＩＩによって消化させ、残りの親プラスミドを直鎖状化し、このＤＮＡを用 いて、大腸菌株ＭＣ１０６１を形質転換させる。アンピシリン耐性コロニーを選 択して、コロニーＤＮＡの制限酵素消化物の分析によって、０．５ｋｂ　Ｎｃ旦 Ｉフラグメントの存在に関してスクリーニングした。〜０．５ｋｂ　ＮｃｏＩフ ラグメントを有さない欠陥ＰＥＰ４遺伝子を含む正確なプラスミドはｐＤＬ３２ １と名付けた。第２プラスミド、ｐＵｃ１９ＸＸは、Ｓｍａ　Ｉと旦±ｎｃｌｌ とによってｐＵｃ１９を開裂させ、再連結させ、旦ａｍＨＩとＸｂａ１部位を含 むポリリンカ一部分を効果的に除去することによって形成した。次に、プラスミ ドｐた、このフラグメントはゲル精製され、ＤＥ８１ペーパーによって単離され たものである。この結合ミックスを用いて、ＭＣ１０６１細胞を形質転換させ、 旦旦ｔＥＩＩ／Ｘｂａｌ消化コロニーＤＮＡの分析によってアンピシリン耐性コ ロニーをスクリーニングした。正確な消化物パターンを示すプラスミドはｐＤＬ ３２２と名付けた。

次にｐＤＬ３２２をＸｂａｌｌこよって切断し、１０ｎｇを配列５’　−ＣＴＡ ＧＣＧＧＣＣＧ−３’　のオリゴヌクレオチドリンカーＬｏｎｇと結合させた、 このリンカ−はＸｂａ１部位に結合されたときにＸｂａ１部位を破壊さ也独特の Ｎせた。アンミンリン耐性コロニーをＮｏ±Ｉ消化コロニーＤＮＡの分析によっ てスクリーニングした。正確なプラスミドをｐＤＬ３２３と名付けた。

ベクターｐＤＲ６０１とｐＤＲ６０２とを形成するために、ピキアＵＲＡ３遺伝 子を下記のようにｐＤＬ３２３中に挿入した。プラスミドｐＰＵ２０５　（図９ 参照）をＰｖｕｌｌとΔａｔＩによって消化させ、約２．５ｋｂＰｖｕＩＩフラ グメント上のＵＲＡ３遺伝子を遊離させた。この消化物を０．８アガロースゲル 上で分離させた。〜２．５ｋｂフラグメントをＤＥ８１ペーパーを用いてゲルか ら単離させ、溶出し、精製した。プラスミドｐＤＬ３２３をＥｃｏＲＶによる切 断によって直鎖状化した。この直鎖状化プラスミド（〜１０ｎｇ）をｐＤＵ２０ ５ｎｏＵＲＡ３含有Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉフラグメントと結合させて、挿入されるＵＲ Ａ３遺伝子の配向に依存して、ｐＤＲ６０１とｐＤＲ６０２とを形成した（それ ぞれ、図１４と１５を参照のこと）。

２、ｐＤＲ６０１とｐＤＲ６０２とによるＩＧＦ−Ｕの形質転換ＵＲＡ３　１Ｇ Ｆ−１発現Ｐ、パストリス菌株ＩＧＦ−Ｕ　（実施例Ｖ１．Ａ。

２　ａを参照のこと）をｐＤＲ６０１とｐＤＲ６０２とから誘導されたＤＮＡの 直鎖状フラグメントによって形質転換させた。この直鎖状フラグメントは各側で ＰＥＰ４遺伝子の一部をコードするＤＮＡによってフランクされるＵＲＡ３遺伝 子を含有した。このフラグメントの末端とＰＥＰ４遺伝子との相同性はこのフラ グメントのＰＥＰ４座における組込みを刺激し、遺伝子置換イベントを生じた。

宿主ゲノム中へのいずれのフラグメントの安定な組込みも、フラグメントに含ま れるＵＲＡ３遺伝子の存在のために原栄養株形質転換体を生じた。この形質転換 は下記のように実施した： ｐＤＲ６０１とｐＤＲ６０２の両方をＮｏ±Ｉと旦且杏Ｅｌｆとによって消化さ せることによって、各側でＰＥＰ４遺伝子の一部をコードするＤＮＡによってフ ランクされるＵＲＡ３遺伝子から成る直鎖状ＤＮＡフラグメント（〜４．Ｏｋｂ 長さ）を得た。消化されたＤＮＡ　（２０μｇ）を用いて、標準スフェロプラス ト方法によって菌株ＩＧＦ−Ｕを形質転換させた。再生培地上で増殖し、ＹＥＰ Ｄ培地上に継代培養した形質転換体から単離したＵｒａ”コロニーを実施例ＩＩ に述べたオーバーレイ方法によってカルボキノペオブチダーゼＹ活性に関してス クリーニングした。対照コロニーに比べて赤色を発色しなかったコロニーをサザ ンプロットハイブリッド形成による分析のために選択した。

３、形質転換体からのＤＮＡのサザンプロット／１イブリッド形成選択した形質 転換体からＨｏｆｆｍａｎとＷｉｎｓｔｏｎの方法［Ｇｅｎｅ。

５７　：　２６７−２７２　（１９８７）］を用いて、ゲノムＤＮＡを単離した 。各菌株からのゲノムＤＮＡをＢｓ±Ｅｌｆによって消化させた。この処置はｐ ＤＲ５０１又はｐＤＲ６０２のフラグメントの組込み領域を含むＰＥＰ座の一部 を遊離させる。それ故、この領域のサイズはＩＧＦ−Ｕのゲノム中への形質転換 用ＤＮＡの適切な組込みに特徴的である。消化されたＤＮＡに対して０．８％ア ガロースゲル上で電気泳動を実施し、ニトロセルロースフィルターにこのＤＮＡ をプロ、ソトした。このフィルターをＰ、パストリスＰＥＰ４遺伝子の一部を含 むｐＥＰ３０１の放射能標識した１、４ｋｂ　Ｘｂａｌ／ＥｃｏＲＶフラグメン トによって、標準方法を用いて、ハイブリッド形成した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ 、　、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ　及びＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｃ１ｏｎｉユ呈、Δ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ１３８５−３８ ８頁、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｐｒｅｓｓ、米国−ｘ−ヨーク州 、コールドスプリングハーバ−（１９８２）］。ノノビイブリッド成は５０％ホ ルムアミド、６ＸＳｓｃ、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　Ｈ ＣＩ、ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０，１％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ　 サケ***ＤＮＡを含む溶液中で３７℃において実施した。次にフィルターを１ｘ ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で３回（１回の洗浄につき１０分間）、次に０．５ｘ ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で６５°Ｃにおいて１時間洗浄した。比較用対照とし ては、ｐ、　ｔ＜ストＩＪス菌株Ｇ５１１５、ＰＥＰ４菌株、からのゲノムＤＮ Ａをこの分析に含めた。

Ｇ５１１５からのゲノムＤＮＡのＢｓｔＩＩによる消化は４．４ｋｂフラグメン トを生じ、これはプローブ中に含まれるＰＥＰ４遺伝子の一部にノーイブリッド 化した。これに反して、このプローブは少なくとも二つの形質転換体、ＩＧＦＵ ２６０１−５とＩＧＦＵ２６０２−５とからのＤＮＡの５，９ｋｂフラグメント にハイブリッド形成した。対照ＰＥＰ座に比べて大きいサイズの形質転換体ＰＥ Ｐ４座（６，９対４．４ｋｂ）は、その構造領域内にＵＲＡ３遺伝子を有する非 機能性ＰＥＰ４遺伝子による宿主ＰＥＰ４遺伝子の置換と一致した。

これらの結果から、菌株ＩＧＦＵ２６０１−５とＩＧＦＵ２６０２−５とが遺伝 子置換による宿主菌株ＩＧＦ−ＵのＰＥＰ４遺伝子の破壊によって生ずる幾つか のＰＥＰ４菌株の例であると結論された。

“ｐｏｐ−ｉｎ／ｐｏｐ−ｏｕｔ”方法による宿主ＰＥＰ４遺伝子の破壊による Ｐ、パストリスのＰＥＰ４欠失（ＰＥＰ４つ菌株の発生に、ベクターｐＤＬ５２ １を用いた。この方法では、小欠失を含む欠陥ＰＥＰ４遺伝子を宿主ＰＥＰ４座 に加え、ＰＥＰ４座から機能性ＰＥＰ４遺伝子を除去する（すなわち、ｐＯｐ− ｉｎ／ｐｏｐ−ｏｕｔ）。

ｐＤＬ５２１は２工程で形成した。最初に、ｐＤＬ３２３の２．　２ｋｂ　旦旦 旦Ｒ１／旦且旦■フラグメントと、ｐＰＵ２０５の２．　２ｋｂ　旦見旦Ｉ／旦 互１■フラグメントと、ｐＵｃ１９の２．　７ｋｂ　旦ｃｏＲＩ／Ｐｓ±■フラ グメントとを三方向結合（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ　ｌ　ｉｇａｔ　ｔｏｎ）により て結合させて、中間体プラスミド、ｐＤＬ５０１を形成した。これらの３フラグ メントは次のようにして得た。Ｐ、パストリスＵＲＡ３遺伝子を含むｐＰＵ２０ ５　（図９）製した。完全ＰＥＰ４遺伝子中に存在する０、５ｋｂ　Ｎｃｏｌフ ラグメントを欠いた欠陥ＰＥＰ４遺伝子を含むプラスミドｐＤＬ３２３　（図１ ３参照のこと）をＥｃｏＲＩと５ａｃｌとによって消化させた。欠陥ＰＥＰ４遺 伝子を含む２゜２ｋｂフラグメントをゲル単離させ、ＤＥＳ！ペーパーを用いて 精製した。ｐＵ合で結合させた。この結合ミックスを用いて、大腸菌株ＭＣ１０ ６１を形質転換させた。アンピシリン耐性コロニーをＮｃｏｌ消化コロニーＤＮ Ａの分析によつてスクリーニングした。正確に結合したフラグメントをｐＤＬ５ ０１と名付けた。

９ｋｂ　５ａｃｌフラグメント０，０２μｇと結合させ、ＤＥ８１ペーパーを用 いて精製した。これはｐＤＬ５０１中の欠陥ＰＥＰ４遺伝子の３′末端にさらに ＰＥＰ４フランキング配列を加えて、Ｐ、バストリス宿主ＩＣＦ−Ｕの形質転換 中の内因性ＰＥＰ４遺伝子による組換えのためにさらに多量の相同配列を保証し た。この結合ミックスを用いて、大腸菌株ＭＣ１０６１を形質転換させた。アン フラグメントの存在に関してスクリーニングした。正確なプラスミドをｐＤＬ５ ２１と名付けた（図１６参照）。

ｐ（＋ｐ−ｏｕｔプロセスによるＰＥＰ菌株の発生に宿主として、Ｐ、パストリ スのＵＲＡ３菌株が必要であった。ウラシルを補充した５−フルオロオロチン酸 培地（０，６７％酵母窒素塩基、２％寒天、２％グルコース、７５０ｎｇ５−Ｆ ＯＡ／Ｉ及び４８ｍｇ　ウラシル／Ｉ）における普遍的（ｇｅｎｅｒａ　］）Ｈ ［ＳＡ　Ｐ　バストリス宿主菌株Ｇ５１１５の１０６細胞の直接培養によってＵ ＲＡ３菌株を発生させた。３０℃における１週間のインキュベーション後に、平 板上で増殖したコロニーを単離した。このＨｉｓ−Ｕｒａ−菌株をＧ５４−２と 名４遺伝子から配列が欠失して、この遺伝子を不完全にする部位の５°に隣接し て、Ｎｏｔ［部位を配置する。Ｎｏｔｌフラグメントの両端はＧ５４−２の内因 性ＰＥＰ４遺伝子の配列に相同であり、このことはＰＥＰＪ座における相同的組 換えによるフラグメントの組込みを促進する。

による消化によって直鎖状化したｐＤＬ５２１　２０μｇによって形質転換させ た。形質転換体をそれらがウラシルを欠いた培地で増殖しつるか否かによって選 択した。これらの形質転換体の１２種を取り上げ、これらの形質転換体から単離 した（実施例Ｖ１．　８．　３に述べるように）ゲノムＤＮＡをＳａ±■によっ て切断し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動を受けさせた。このＤＮＡをニ トロセルロースフィルターに移し、ＰＥＰ４遺伝子の放射能標識１．２ｋｂ　Ｅ ｃ。

ＲＶ／Ｘｂａｌフラグメントによって調べた。ゲノムＤＮＡのサザンプロットハ イブリッド化パターンに基づいて、ＰＥＰ４座に組込まれたｐＤＬ５２１を有す るように見える２菌株、Ｇ５４−２５２１−３とＧ５４−２５２１−４とをさら に選択するために選んだ。これらの菌株はＵＲＡ３マーカー遺伝子を含有し、こ のマーカー遺伝子の片側には無傷の、完全なＰＥＰ遺伝子を有し、他方の側には 欠陥ＰＥＰ４遺伝子（配列の〜０．５ｋｂを欠く）を有する。この形態のＰＥＰ ４座はＰＥＰ４遺伝子の２コピーの間の組換えを可能にし、ＰＥＰ遺伝子の一方 とＵＲＡ３遺伝子との脱離を生ずる（すなわち、ｐｏｐ−ｏｕｔ）。この２種の ＰＥＰ４遺伝子のいずれの一方もこの組換えイベントから脱離する（ｂｅ　ｅｖ ｉｃｔｅｄ）ことができる。２種ＰＥＰ４遺伝子間の組換えが生ずるかどうか、 また何時束ずるかを確認するために、菌株Ｇ５４−２５２１−３とＧ５４−２５ ２１−４とを５−ＦＯＡを含むＹＰＤ培地上で連続１０倍希釈方法で培養した。

Ｕｒａ−菌株のみが５−ＦＯＡの存在下で増殖し、従って、このような培地での 増殖が所望の組換えイベントの発生を実証する。５−ＦＯＡ含有培地で増殖する ことができる菌株はＰＥＰ４遺伝子の２コピ一間の組換えによって発生するウラ シル要求型であった。Ｕｒａ−コロニーは３０℃における１週間の培養後に５− ＦＯＡ含有平板上に出現した：これらのコロニーの中の１０コロニーはＧ５４− ２５２１−３から誘導されたものであり、これらのコロニーの中の１４コロニー はＧ５４−２５２１−４から誘導されたものである。

３　形質転換体の特性化 Ｕｒａ−形質転換体コロニーの１４コロニーを精製し、各々からゲノムＤＮＡを 形成し、Ｅｃ旦Ｒ１とＥｃｏＲＶとによって消化させ、０．　８％アガロースゲ ル上で電気泳動を受けさせ、ニトロセルロース上にプロットし、Ｐ、バストリス ＰＥＰ４遺伝子の放射能標識１．　２ｋｂ　入亘ａＴ／旦旦ｏＲＶフラグメント によってハイブリッド形成した。このようにして分析した１４単離体の中の７単 離体からのＤＮＡは完全ＰＥＰ４遺伝子に存在する〜０．５ｋｂの配列を欠いた 欠陥ＰＥＰ４遺伝子のみから成るＰＥＰ４座と一致するハイブリッド化プロフィ ルを有した。これらの菌株の中の２種がＧ５４−２５２１−３／７とＧ５４−２ ５２１−４／１であった。

実施例Ｖｌｌｌ：Ｐ、バストリスのＰＲＢ−１遺伝子の一部のクローニングプロ テイナーゼＢ遺伝子、ＦＲＢ−１はＳ、セレビシェにおける液胞セリンエ鎖反応 （ＰＣＲ）遺伝子増幅方法を用いてＰ、バストリスからクローン化した［例えば 、Ｇｏｕｌｄ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８６・１９３ ４−１９３８　（１９８９）を参照のこと］。種全体に維持される、プロテイナ ーゼＢタンパク質の領域をコードするＦＲＢ−１遺伝子間列への相同性を有する 縮退オリゴヌクレオチド（Ｍｏｅｈｌｅ等、上記文献）をＰ、バストリスＦＲＢ −Ｉ　ＤＮＡのＰＣＲ増幅にプライマーとして用いるために合成した。このオリ ゴヌクレオチドは次の配列を有したオリゴヌクレオチド　１： λ オリゴヌクレオチド　２ 増幅されたＤＮＡフラグメントのシャトル　プラスミドへのサブクローニングを 促進するために、品オリゴヌクレオチドはその５°末端に１個以上の制限エンド ヌクレアーゼ認識部位をも含んだ　オリゴヌクレオチド　２ではＳ、ｈ　１部位 、ＰＣＲ反応培地はＴ、Ｅ、（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ ）２μｍ中のＰ、パストリス（ＮＲＲＬ　Ｙ−１１４３０株）ゲノムＤＤＮＡ１ ００ｎと、オリゴヌクレオチド　１１０μｌと、オリゴヌクレオチド　２１０μ ｌと、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰの１．２５ｍＭ溶液１６μｌ と、１０ｘ緩衝液（５００ｍＭ　ＫＣＩ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ ８，３，１５ｍＭ　ＭｇＣＬ）１０μｌと、０．１％ゼラチンと、水７０μｍと 、５単位／μｌ　ＴａｇＤＮＡポリメラーゼ　０．５μｌとから成るものであっ た。溶液を９４℃において２分間加熱した。３１回反復されるＰＣＲ循環反応は ９６℃における２分間の変性と、５０℃における１分間のアニーリングと、７２ ℃における３、５分間の重合を含むものであった。

このＰＣＲの生成物をアガロースゲル上の電気泳動に供し、オリゴヌクレオチド 　１と２に対応する位置間のＰＲＢ−１遺伝子の増幅生成物に予想されるサイｂ ｐフラグメントをＤＥ８１ペーパーによって単離させ、ｐＵｃ１９　１０ｎｇに 結合させた、このｐＵｃ１９はポリリンカー中でＥｃｏ　Ｉとｓｐｈ　Ｉとによ って消化されて、直鎖状化されたものである。この結合ミックスを用いて、大腸 菌ＭＣ１０６１細胞を形質転換させた。アンピシリン耐性の形質転換体からの制 限酵素消化プラスミドＤＮＡを正確な５００ｂｐ　ＥｃｏＩ−５ｐｈｌフラグメ ントの存在に関して分析した。１コロニーのみがｐＰＲＢＰＰと名付けられた、 正確なプラスミドを含有した。このプラスミドのピキア部分の制限地図を図１７ に示す。

ｐＰＲＢＰＰに含まれるＰ、パストリスＰＲＢ−１遺伝子のクローン化部分の配 列をＳａｎｇｅｒジデオキシ方法を用いて発生させ（Ｓａｎｇｅｒ等、上記文献 ）、配列番号５に示す。Ｐ、バストリスＰＲＢ−１遺伝子のこの配列はＳ、セレ ビシェＦＲＢ−１遺伝子の配列に対して７４％の相同性を有する。

実施例ＩＸ：Ｐ、バストリスのＰＲＢ−１菌株の発生Ｐ　パストリスのＰＲＢ− １菌株の発生に用いるために、プラスミドｐＤＲ９１１を形成した。このベクタ ーはＰ　バストリスのＰＲＢ−１菌株の内部部分を含み、これはＰ　バストリス のＰＲＢ−１菌株の形質転換に用いる場合に、宿主ゲノムにＦＲＢ−１座におい て組込まれ、ＦＲＢ−１遺伝子の２種の不完全な非機能性コピーを形成する。ベ クターｐＤＲ９１１はＰ、バストリスのＵＲＡ３宿主菌株に選択性マーカーとし て用いるために完全な機能性Ｐ、バストリス　ＵＲＡ３遺伝子をも含む。

とΣ見互■とによるｐＰＲＢＰＰの制限消化によって単離させた。この反応混合 物を０，８％アガロースゲル上に負荷させ、０．５ｋｂフラグメントをＤＥ８１ ペーパーによって精製した。

この０．５ｋｂフラグメントを直鎖状形のプラスミドｐＰＵ２０３に、Ｐ、パス トリスＵＲＡ３含有ｐＵＣベースドプラスミドに結合させた（図８参照）。プラ スミドｐＰＵ２０３をｓｐｈ　ＩとＰｓ±■による開裂によって直鎖状化し、〜 １０ｎｇをピキアＤＮＡフラグメント〜１１００ｎと結合させた。この結合混合 物を用いて大腸菌株ＭＣ１０６１をアンピシリン耐性に形質転換させた。アンピ シリン耐性コロニーを特徴的なフラグメントに関するＰｓｔｌ／５ｐｈｌ消化コ ロニーＤＮＡの分析によってスクリーニングした。正確なプラスミドをｐＤＲ９ １１と名付けた（図１８参照）。

よって直鎖状化されたｐＤＲ９１１による標準スフェロプラスト形質転換によっ て、Ｇ５４−２を形質転換させることができる。Ｕｒａ’形質転換体からのＤＮ Ａのサザンプロットハイブリッド化は、ＦＲＢ−１座の破壊によって形成される ＦＲＢ−１菌株の確認を可能にした。形質転換体のプロテイナーゼＢ活性分析［ 例えば、Ｊｏｎｅｓ等のＧｅｎｅｔｉｃｓ　１０２＋６６５−６７７　（１９８ ２）を参照のこと］は、菌株のプロテイナーゼＢ欠失をさらに実証する。

Ｃ，Ｐ、パストリスのｐｒｂ−１，ｐｅｐ４菌株の発生Ｇ５４−２５２１−４の 単離体であるＰ、パストリスＧ５４−２５２１−４−５のｐｅｐ４．Ｕｒａ３． ｈｉｓ４菌株のＦＲＢ−１遺伝子（実施例ＶＩ［参照）を、旦（±ＩＩによる開 裂によって直鎖状化されたベクターｐＤＲ９１１による形質転換によって破壊し た。Ｕｒａ”表現型を有する形質転換体を選択して、サザンプロットハイブリッ ド形成によって分析した。予想される）１イブリツド形成帯パターンを示す特定 形質転換体をＭ０１８と名付けた。この菌株をＩＧＦ−１の発現のための宿主と して用いた。ＩＧＦ−１発現菌株をＣ＋ＩＧＦ８１６Ｓ１と名付けた。

本発明をそのある一定の好ましい実施態様に関して詳述したが、ここに述べ、特 許請求する本発明の要旨と範囲内で変化と変更が行われることは理解されよう。

配列表 配列番号１ （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ　２０３２塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）　ＩＩの数　不明 （Ｄ）トポロジー　不明 （６）配列の種類　ｃ　ＤＮＡ （ＩＸ）特徴− （Ａ）特徴を表す記号　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置　２３６．．１４６８ （ｆ）特徴 （Ａ）特徴を表す記号−成熟ペプチド （Ｂ）存在位置　２３６．．１４６８ （ｕ）配列　配列番号１゜ 入Ａλ　丁Ｃτ　入ＡＧ　丁＾τ　Ｇ入＾　ＧＧ＾　入ＸＣＸテｃ　Ａｃｃ　Ｔ ｃｃ　ｍｃ　ｅｃ丁　Ｇ丁ａｘｅ＾　＾Ｇ＾　＾ＡＧ　１０r４ ｃｃＡｃ丁ＧＧＣＣτ　＾Ｃ入ＧＴ入ＡＧＣＧ　入＾ＧへＣτ入ττＣＣＣ＾↑ Ｃ八ＴＧＣへ　Ｃ入へＣＣτ丁ＧＧＴ　ＣτＧＣＴＴＴτＣb１９Ｇ８ 丁丁丁τＧ八ｃｃ入＾　ＴＣＴＣ＾丁ＴＴＣＡ　Ｇ入＾Ｃτて入τｃｃ　Ｃ′ｒ ｃｃｃ心八Ｇ八〇〇へτへｃ＾Ｃτ八Ｇ　ＣへＧＧ＾ＣＴＣ■bス０２１１ ＾Ｇ＾Ｃ２０３ス 配列番号２ ←Ｄ配列の特徴： （Ａ）配列の長さ一４１０アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （＋１）配列の種類　タンパク質 （ｎ）配列　配列番号２ Ｌｙｖ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｃ１ｕ〒ｈｔ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｇ Ｌｕλ１ａ入ａｎ　Ｐｈｅ　Ｃ１ｙ　ＧｉｎηｒコＳ　４０　４５ ＶａｌＳｅｒＡｌａＬａｕＣ１ｕＨｉｍＬｙｓＴＹｒＶａ１！倫ｒＬａｕＰｈ− ＾ａｎＧｌｕＧｉｎ＾−ｎ５ｏ　ｇ５　６０ ｐｈＩ！　丁ｈｒ　Ｃ１ｕ　ＶａＩ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｔ　Ｐｒｏ 　Ｐｒｏ　（ｋｎ　Ｂａｒ　ｉ’ｈｅ　Ｌｙｍ　Ｖａｔ　Ｎп■ １００　１０Ｓ　１１０ Ｌｓｕ　Ａｍｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　 Ｖａｔ　ｐｒｏ　５ｅｒ　Ｌｙｅ　Ａｍｐ　Ｃｙｍ　Ｇｌｙ５１１ｒ　Ｌｅｕ　 Ａｌａ　Ｃｙｍ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｈｉｓ　Ａｉｍ　Ｌｙｅ　Ｔｉｔ　入ｓｐ　 １４Ｌ＊　入−ｐ　Ｇｌｕ　Ｂａｒ　ｍ≠■ τｈ【　丁ｙｒ　Ｌｙｅ　ＬｙＩＩ　Ａｓｎ　ＧＬｙ　Ｂａｒ　５＠ｒ　Ｐｈｅ 　（：ｌｕ　１１＠　λｒ９　丁ｙｒ　Ｃ１ｙ　Ｂａｒ　ＣPｙ 丁ｈｒ　Ｚｌｅ　Ｐｒｏ　ＬｙＩＩ　Ｖａｔ　＾−ｐＰｈ−Ａｌａ　Ｃ１ｕ　Ａ ＩＩＩ　Ｔｈｒ　Ｓ＠ｔ　Ｃ１ｕ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｙ　Ｌａｕｌｌｌｏ　１８５　 １９０ ｓｉｒ　Ｉｌａ　Ｂａｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｌｙｅ　１１ｍ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　 Ｐｒｏ　ｌｅ　Ｔａｒ　ＬＹ＃　ｋＬ息　Ｌ・ｕ　Ｇｌｕ２１０　２ＬＳ　２２ ０ Ｌ＠ｕ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ａ１ｐ　ＣＬｕ　ｌ’ｒｅ　Ｌｙｓ　Ｉ’ｈ ―　人Ｌｍ　ｔｈｅ　↑ｙｒ　Ｌａｕ　Ｃ１ｙ　＾１ｐテｈ■ ２２５　２３０　２３％　２４０ 人＠Ｐ　Ｌｙｓ　Ａｍｐ　Ｇｌｕ　５＊ｒ　Ａｍｐ　（ｉｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ 　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　ＧＬｙ　（：１ｙ　Ｖａｌ　＾Pｐ ２４５　２ＳＯス５Ｓ Ｌｙｖ　５ｅｒ　ＬＹ＠　Ｔａｒ　Ｃ；ＬＩＪ　（ｉｌｙ　Ｌｙｓ　Ｘ１書　テ ｈｒ　テｒｐ　ｔａｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　入ｒ９人ｒｇ　ｔ凾■ ２６０　２６Ｓ　２７０ Ａｉｍ　丁ｙｒ　丁ｒｐ　Ｃ１ｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈ＠　入−ｐ　Ｇｌｙ　 Ｖａｌ　Ｃ１ｙ　Ｌａｕ　Ｃ７１ｙ　５ｅｒ　Ｇｌｕ　？ｙ■ ２７５　２１１０　２ｍ％ 人ｉｌｌ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　Ｃ１ｙ　λ１轟　入１ｍ 　Ｎ＠　入−ｐ　′Ｔｈｒ　Ｃ１ｙテｈｒ　Ｂａｒ　Ｌａｕ２９０　２９５　コ ｏＯ 工ｌ＠　Ａｉｍ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　入１ａ　Ｇｌｕ　 Ｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｃ１ｕ　Ｘｌ・　ＧｌｙコＯ５３１０３１５コ ２０ １１・　丁ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　入１ｐ　丁ｙｔ　Ｔｈｒ　Ｌ＠％ｌ　（Ｊｕ 　Ｖａｔ　Ｓｉｒ　Ｃ１ｙ　Ｓｅｒ　Ｃｙｍ　ＩＬｅ　Ｂａ■ コ５５　コロｏ　コロ５ 八ｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　 Ｐｒｏ　Ｘ１ｍ　Ｃ１ｙ　Ｐｒｏ　Ｌｗｕ　Ａｌａ　工１鹸コア０　ｕｓ　３１ １０ ！１＊　Ｃ４ｙ　Ａｓｐ　Ｓａｔ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　’ｔｙｒ 　Ｔａｒ　１ｉａｒ　ＶａＬ　Ｔａｒ　ｋｗｐ　ｔａｕ　ＣPｙ ３８５　３９０　コ９５　４００ 配列番号３ （ｉ）配列の特徴４ （Ａ）配列の長さ：　２６８８塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　不明 （Ｄ）トポロジー、不明 （■）配列の種類　ｃ　ＤＮＡ （Ｌｘ）特徴 （Ａ）特徴を表す記号　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置　６４３．．１４３１ （１）特徴 （Ａ）特徴を表す記号　成熟ペプチド （Ｂ）存在位！！：６４３．．１４３１（ｉ）配列−配列番号３・ τＣ八へ丁τ入＾Ｃ＾　丁Ｃ入＾ｃｃｔｃ入τ　Ｃ入入＾ＣＧＧＡτ＾　Ｇ入子 ＸＣＣ丁＾ＧＡｅＡ　０〒ＣｃＣＴ　Ｃｃｅ　＾Ｇτ　６５S ＧＴＧ　ＡＣＣ入ＣＡ　λＣＴ　ＡＡＡ　にＡＡ　ＴＴＡ　Ｔ’ｒｌｌｉ　ＧＡ Ｇ　Ｃ？Ｔ　ｅ？Ａ　ＣＡＴ　ｊＩＡＡ　ｍ　ＣＴＣ（０７X８ Ｔ丁丁　ｋＴｃ　丁Ｃ，ＴＴ丁ｃ　ｃｃｃ　＾＾Ｇ　＾Ｃ丁　ＣＡＴ　＾丁ＣＣ ＾Ｃ＾丁＾　＾ｉ丁　ＣＡＴ　ＣＡＣ’１’ＴＣＡＣＣ！１S６ ＴＴＧ　ＣＣＴ　Ｇ入Ａ　ＣＴＣＴＣＧ　ＴＣＡ　ｋＡＧ　ＧＩＪ　丁ＣＡ　Ａ ’ｒ？　ＣＣｅ　ＣＡＴ　ＧＧＴ　ｋｋＧ　ｒＡｃ　ＡＣＣP１３４ ＡＴＴ　Ｃ’ＴＧ　＾ＣＪ　ＴＡ）Ｊ丁ＴｋＣ入＾　Ｃ丁＾丁Ｃ丁ＡＣＡＣＯＧ Ｃ＾ＴＣＡＡＴ丁　ＣＴ丁ＴｅＣＣ１４７１配列番号４ ＡｆｆｌＣＡＡＣ’ｒＣＡ　入τｅｃ＾τＣ丁丁ＣＡＡＴｆ丁Ｃ入テｃＧ　ｃ丁 Ｃ入＾ｆｆτ’ｒＴＧ＾ｅｃｃ＾Ｇ丁入ｉ　丁ＴＣλ入＾Ｃ■■■@ｉｓコ１ （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・２６３アミノ酸 （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｆ）配列の種類、タンパク質 配列番号５ （＋）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ　５５５壜基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）ＩＩの数　不明 （Ｄ）トポロジー　不明 （ｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ （匡）特徴 （Ａ）特徴を表す記号　ＣＤ５ （Ｂ）存在位！！＋３．．５５４ （ｕ）特徴 （Ａ）特徴を表す記号・成熟ペプチド （Ｂ）存在位１ｆ：３．．５５４ （ｌＩ）配列、配列番号５− Ａｌｍ　ｃｌｙ　Ｌａｕ　ＨＬｍ　ｋｌａ　５１１ｒ　Ｌａｕ　Ａｌｍ　！、＠ ｕ配列番号６− （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１８４アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー°１１ｉＮｉ状 （ｎ）配列のｆ！ＪＩ類−タンパク質 ｂｊ）配列　配列番号６− １ｉｅ　Ｌ＠ｕ　Ｇｉｎ　にｌｙ　Ａｍｎ　Ｃ１ｙ　！４ｉｓ　Ｇｌｙ　テｈｒ 　Ｈｌｍ　Ｃｙｓ　ＡＬａ　Ｃ１ｙ　Ｔｈｅ　Ｘｉ＠　入１■ Ｉ　Ｓ　１０　１ｓ Ｓｅｒ　ＧＬｕ　Ｓｅｒ　丁ｙｒ　Ｃ１ｙ　Ｖｍｌ　入１ａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｅ　 Ａｌｍ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　入１晶　！ｌ＠ＬＹ雪Ｌｙｓ　Ｌｙｅ　Ｐｈ ＠　ＬｙＩＩ　Ｇｌｙ　Ｓ＠ｒ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　Ａｍｎ　Ｍｅｔ　釦ｒ　Ｌａ ｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｃ１ｙ　Ｌｙｓ６５　７０　フＳ　８０ Ｐｈｅ　Ａｌｍ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｍｎ　！ｉ＠　Ｌｅｕ　Ｓ＠ｒ　 Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ｍａｒ　＾１ｐ　＾ｍｐＰｓｔＩ（ＳｐｈＩ ＜Ｈｉｎｄｍ 図４ 図５ 図６ ｃｏＲＩ 図７ プラスミド地図：　ｐＰＵ　２０３　配列＝１〜４８３８図８ プラスミド地図：ｐＰＵ２０５　配列＝１〜４８５５図９ プラスミド地図：　ｐＰＵ２Ｑ６　配列：１〜３Ｙｏ。

図１０ 図１１ 図１４ 図１６ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８）　Ｊ 平成　５年　９月１４日

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. １．ピヒア属の菌株から得られる単離ＤＮＡフラグメントであって、直接又は間 接的に前記菌株のタンパク分解活性に影響を及ぼすタンパク質をコードする遺伝 子を含むＤＮＡフラグメント。
2. ２．前記タンパク質が前記菌株のカルボキシペプチダーゼＹ活性に影響を及ぼす 請求項１記載のＤＮＡフラグメント。
3. ３．前記遺伝子が図面の図１の制限地図を有する請求項２記載のＤＮＡフラグメ ント。
4. ４．前記フラグメントがプラスミドｐＥＰ２０２の約１．６ｋｂｐＥｃｏＲＩフ ラグメントである請求項２記載のＤＮＡフラグメント。
5. ５．前記フラグメントが、前記菌株のカルボキシペプチダーゼＹ活性に影響を及 ぼすタンパク質をコードする、プラスミドｐＥＰ３０１の約２．７ｋｂｐＥｃｏ ＲＩ−ＳａｃＩフラグメント又はその部分である請求項２記載のＤＮＡフラグメ ント。
6. ６．前記遺伝子の前記核酸配列が配列ＩＤＮｏ．２に記載されるアミノ酸配列と 実質的に同じであるアミノ酸配列をコードする請求項２記載のＤＮＡフラグメン ト。
7. ７．前記遺伝子の核酸配列が配列ＩＤＮｏ．１に記載される核酸配列と実質的に 同じである請求項２記載のＤＮＡフラグメント。
8. ８．請求項１記載の遺伝子の改質形を含む単離ＤＮＡフラグメントであって、前 記改質が遺伝子の機能産物の産生を不能にし、前記菌株のタンパク分解活性に影 響を及ぼす、遺伝子産物の能力を変化させるＤＮＡフラグメント。
9. ９．前記遺伝子の改質形が相同的組み替えによるピヒア属の酵母宿主中への導入 に適する請求項８記載のＤＮＡフラグメントであって、その表現産物がタンパク 分解活性に影響を及ぼす前記遺伝子の特定座において相同的組み替えが生ずるＤ ＮＡフラグメント。
10. １０．改質遺伝子が、その非改質形において、前記菌株のカルボキシペプチダー ゼＹ活性に影響を及ぼすタンパク質をコードする請求項８記載のＤＮＡフラグメ ント。
11. １１．前記遺伝子がその中への栄養要求性マーカー遺伝子の挿入によって改質さ れる請求項９記載のＤＮＡフラグメント。
12. １２．前記栄養要求性マーカー遺伝子がピヒアもしくはサッカロミセスＨＩＳ４ 遺伝子、ピヒアもしくはサッカロミセスＡＲＧ４遺伝子、又はピヒアもしくはサ ッカロミセスＵＲＡ３遺伝子から選択される請求項１１記載のＤＮＡフラグメン ト。
13. １３．前記フラグメントがプラスミドｐＤＲ４０１中に含まれる請求項１２記載 のＤＮＡフラグメント。
14. １４．前記遺伝子がそれからの欠失の生成によって改質される請求項９記載のＤ ＮＡフラグメント。
15. １５．前記フラグメントがプラスミドｐＤＲ４２１中に含まれる請求項１４記載 のＤＮＡフラグメント。
16. １６．ピヒア属の宿主菌株に比べて、タンパク分解活性の欠損したピヒア属菌株 の形成方法であって、前記宿主菌株を請求項８記載のＤＮＡフラグメントと、前 記宿主菌株のゲノム中に前記ＤＮＡフラグメントを部位特異的組込みに適した条 件下で接触させることを含み、前記部位特異的組込みがタンパク分解活性に影響 を及ぼすタンパク質をコードする前記遺伝子の特定座において生ずる方法。
17. １７．前記接触の結果として得られる菌株を、前記宿主菌株に比べて低いタンパ ク分解活性を有する菌株の存在に関して検査する工程と；前記宿主菌株に比べて 低いタンパク分解活性を有するような菌株を選択する肯定と をさらに含む請求項１６記載の方法。
18. １８．前記ＤＮＡフラグメントの組込みが前記宿主生物のプロテイナーゼＡ活性 とカルボキシペプチダーゼ活性とに影響を及ぼす請求項１６記載の方法。
19. １９．請求項１６記載の方法によって形成されるタンパク分解活性の欠損したピ ヒア菌株。
20. ２０．プロテイナーゼＡ活性とカルボキシペプチダーゼ活性との欠損した請求項 １９記載の菌株。
21. ２１．Ｐ．バストリスの菌株ｐ１、ｐ２、ｐ５、ｐ８、ｐ１３、ｐ１６又はｐ２ ０から選択される請求項２０記載の菌株。
22. ２２．前記宿主菌株がヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子、アルギニノスク シネートリアーゼ遺伝子、又はオロチジン−５′−ホスフェートデカルボキシラ ーゼ遺伝子から選択される少なくとも１種の栄養要求性マーカー遺伝子を欠き、 前記フラグメントの改質遺伝子が宿主菌株に欠けている栄養要求性マーカー遺伝 子の完全形のその中への挿入によって改質される請求項１６記載の方法。
23. ２３．請求項２２記載の方法によって生成されるタンパク分解活性の欠損したピ ヒア菌株。
24. ２４．プロテイナーゼＡ活性とカルボキシペプチダーゼ活性との欠損した請求項 ２３記載の菌株。
25. ２５．Ｐ．パストリスの菌株ｐ１、ｐ２、ｐ５、ｐ８、ｐ１３、ｐ１６又はｐ２ ０から選択される請求項２４記載の菌株。
26. ２６．遺伝子の前記フラグメントがそれからの欠失の生成によって改質される請 求項１６記載の方法。
27. ２７．前記宿主菌株がＧＳ１１５であり、前記ＤＮＡフラグメントがプラスミド ｐＤＲ４０１の約５．３ｋｂｐＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントである請求項 ２２記載の方法。
28. ２８．ピヒア種の野生型菌株に比べて、タンパク分解活性の欠損したピヒア属の 酵母細胞。
29. ２９．プロテイナーゼＡ活性とカルボキシペプチダーゼ活性との欠損した請求項 ２８記載の酵母細胞。
30. ３０．タンパク分解感受性組換え産物の表現方法であって、前記産物をコードす るＤＮＡによって請求項２８記載の細胞を形質転換させ、前記細胞を前記タンパ ク分解感受性産物が表現されるような条件下で培養することを含む方法。
31. ３１．表現時に、前記宿主生物のカルボキシペプチダーゼ活性に直接又は間接的 に影響を及ぼすタンパク質をコードする細胞の遺伝子を、前記宿主菌株の栄養要 求性表現型を補足するマーカー遺伝子の挿入によって改質される前記遺伝子の欠 失形によって組換えることによって、細胞のタンパク分解活性を欠損させ；かつ マーカー遺伝子をヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子、アルギニノスクシネ ートリアーゼ遺伝子、又はオロチジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼ 遺伝子から選択する請求項３０記載の方法。
32. ３２．請求項１６記載の方法を用いて宿主菌株のタンパク分解活性を欠損させる ことを含む、タンパク分解感受性組換え産物の表現方法であって、前記宿主菌株 が少なくとも１種の栄養要求性マーカー遺伝子を欠き、かつ前記宿主菌株が転写 の読み取りフレーム方向において、下記ヌクレオチド配列：（ｉ）メチロトロー フ酵母のメタノール反応性遺伝子のプロモーター領域；（ｉｉ）本質的に、 （ａ）任意の分泌シグナル配列と、 （ｂ）タンパク分解感受性タンパク質とから成るポリペプチドをコードする配列 と、（ｉｉｉ）メチロトローフ酵母中の機能的転写終結因子と、を有する表現カ セットを含む少なくとも１個のＤＮＡフラグメントによって形質転換され、前記 配列が前記ポリペプチドをコードする配列の転写に関して作用的に相互に関係す る方法。
33. ３３．前記宿主菌株が少なくとも２種の栄養要求性マーカー遺伝子を欠損する請 求項３２記載の方法。
34. ３４．前記栄養要求性マーカー遺伝子がＨＩＳ４遺伝子とＵＲＡ３遺伝子である 請求項３３記載の方法。
35. ３５．タンパク分解感受性産物がＩＧＦ−１であり、ＩＧＦ−１をコードするＤ ＮＡによる前記宿主の形質転換に用いられるマーカー遺伝子がＨＩＳ４遺伝子で ある請求項３４記載の方法。
36. ３６．宿主をタンパク分解活性欠損にさせるために用いられる改質遺伝子が、そ の非改質形において、宿主のカルボキシペプチダーゼ活性に影響を及ぼすタンパ ク質をコードする請求項３５記載の方法。
37. ３７．改質遺伝子がコード配列の一部の欠失によって形成される請求項３６記載 の方法。
38. ３８．前記組換え産物を表現する組換え菌株が菌株Ｍ＋ＩＭＢ２０６Ｓ１である 請求項３７記載の方法。
39. ３９．ピヒア属の種からのオルチジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼ 遺伝子を含む単離ＤＮＡフラグメント。
40. ４０．前記遺伝子が図１２に示す地図と実質的に同じ制限地図を有する請求項３ ９記載のＤＮＡフラグメント。
41. ４１．前記遺伝子が配列ＩＤＮｏ．４に記載した配列と実質的に同じアミノ酸配 列をコードする請求項３９記載のＤＮＡフラグメント。
42. ４２．前記遺伝子が配列ＩＤＮｏ．３に記載した配列と実質的に同じ核酸配列を 有する請求項３９記載のＤＮＡフラグメント。
43. ４３．オルチジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼ遺伝子の欠損したピ ヒア属の酵母細胞。
44. ４４．前記酵母細胞がピヒアパストリスの菌株である請求項４３記載の酵母細胞 。
45. ４５．前記酵母細胞が菌株ピヒアパストリスＧＳ４−２である請求項４４記載の 酵母細胞。
46. ４６．さらにタンパク分解活性欠損を含む請求項４３記載の酵母細胞。
47. ４７．プロテイナーゼＡ活性とカルボキシペプチダーゼ活性との欠損した請求項 ４６記載の酵母細胞。
48. ４８．ピヒアパストリス菌株ＧＳ４−２５２１−３／７又はＧＳ４−２５２１− ４／１から選択される請求項４７記載の酵母細胞。