NO177967B - Fremgangsmåte ved fremstilling av aprotinin og aprotinin homologer i gjær, og en gjærstamme som anvendes i fremgangsmåten - Google Patents
Fremgangsmåte ved fremstilling av aprotinin og aprotinin homologer i gjær, og en gjærstamme som anvendes i fremgangsmåten Download PDFInfo
- Publication number
- NO177967B NO177967B NO900920A NO900920A NO177967B NO 177967 B NO177967 B NO 177967B NO 900920 A NO900920 A NO 900920A NO 900920 A NO900920 A NO 900920A NO 177967 B NO177967 B NO 177967B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- aprotinin
- amino acid
- yeast
- dna sequence
- sequence
- Prior art date
Links
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 title claims abstract description 122
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 title claims abstract description 119
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 title claims abstract description 111
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 23
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 10
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 claims description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 239000001257 hydrogen Chemical group 0.000 claims description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 3
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 3
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101000713596 Homo sapiens T-box transcription factor TBX19 Proteins 0.000 description 2
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036773 T-box transcription factor TBX19 Human genes 0.000 description 2
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N Arginine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 101000984722 Bos taurus Pancreatic trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000409898 Empodisma minus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000679359 Homo sapiens Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase TPTE2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010033647 Pancreatitis acute Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102100022577 Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate 3-phosphatase TPTE2 Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- RKDYKIHMFYAPMZ-INIZCTEOSA-N ac1mbmqr Chemical compound N([C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RKDYKIHMFYAPMZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 201000003229 acute pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000988 hyperfibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000007261 sc medium Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
- C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av aprotinin og homologer av denne i gjær, og en gjærstamme som anvendes i fremgangsmåten.
Aprotinin (storfepankreatintrypsininhibitor, BPTI) er et polypeptid som skilles ut av flere organer og vev hos storfe, f.eks. lymfekjertler, pankreas, lunger, den store spytt-kjertelen, milten og leveren. Forbindelsen er et enkeltkjedet polypeptid bestående av 58 aminosyrerester tverrbundet ved hjelp av tre disulfidbroer og med følgende aminosyresekvens:
De tre disulfidbroene befinner seg mellom Cys(5)-Cys(55), Cys(14)-Cys(38) og Cys(30)-Cys(51), hhv..
Aprotinin brukes for behandling av akutt pankreatitt, forskjellige tilstander av sjokksyndrom, hyperfibrinolytisk blødning og myokardialt infarkt. Tilførsel av aprotinin i høye doser reduserer i betydelig grad blodtapet i forbindelse med hjerteoperasjoner.
Aprotinin kan ekstraheres fra forskjellige storfeorganer og vev såsom lunge, pankreas og de store spyttkjertlene. I den foreliggende beskrivelse vil aprotinin fremstilt på denne måten bli betegnet som naturlig aprotinin. Ekstraksjon fra dyrevev er en arbeidskrevende prosess og krever store mengder av storfeets organer eller vev. En langt mer hensiktsmessig fremgangsmåte for kommersiell produksjon ville være en fer-menteringsprosess ved hjelp av hvilken et gen som koder for aprotinin kunne inkorporeres i en egnet mikroorganisme ved hjelp av en rekombinant DNA-teknikk. Mikroorganismen kunne så dyrkes i et egnet næringsmedium for å fremstille det for-ønskede produktet, som ville skille seg ut i mediet og fra hvilket det kunne innvinnes.
Et gen for aprotinin er blitt smeltet sammen eller festet til kodingssekvensen for E^_ coli alkalisk fosfatasesignal-peptid og uttrykt i coli under kontroll av det alkaliske fosfataseaktivatoren (Marks, C.B. et al., The Journal of Biological Chemistry 261 (1986) 7115-7118). Man har også klonet et syntetisk gen som koder for proteinsekvensen i Met-aprotinin i en E^. coli ekspresjonsvektor (von Wilcken-Bermann, B. et al., The EMBO Journal 5 (1986) 3219-3225). Fremstilling av aprotinin og aprotininhomologer er også beskrevet i euro-peisk patentspesifikasjon nr. 238,993 og britisk patentsøknad nr. 2,188,933.
Det er imidlertid et problem med fremstillingen av små fremmede proteiner i E_^coli, fordi slike proteiner lett nedbrytes av vertens proteaser. Det har videre vist seg å være et problem å få etablert de korrekte disulfidbroene og den riktige foldingen i E^coli.
Det har vist seg at gjær er i stand til å uttrykke og fremstille små proteiner med omtrent den samme størrelse som aprotinin. I EP-patentsøknad nr. 0163529A er det beskrevet fremstilling av insulinforløpere med korrekt plasserte disulfidbroer, og i EP patentsøknad nr. 0189998A er det beskrevet fremstillingen av glukagon, et enkeltkjedet polypeptid med 29 aminosyrerester.
Ved hjelp av de fremgangsmåter som er nevnt ovenfor er et primært produkt bestående av det forønskede protein bundet til et gjærlederpeptid uttrykt i gjær. Under utskillelsen vil det primære produktet bli bearbeidet ved hjelp av Kex2-enzymet
(Julius, D. et al. Cell 32 (1983) 839-852) og det bearbeidede produktet som også betegnes som det modne eller modnede produktet, skilles så ut i mediet. Bearbeiding av det uttrykte primære produktet skjer ved et par basiske aminosyrer (Lys-Arg) i den N-terminale enden av det modnede produktet.
I forbindelse med aprotinin som har en basisk aminosyre (Arg) som den N-terminale aminosyren, kan det oppstå problemer hvis Kex2-bearbeidingsposisjonen Lys-Arg innsettes før den første Arg-resten i aprotininsekvensen, ettersom en "trippelbasisk" spaltningsposisjon vil være tilstede i det uttrykte sammensmeltningsproduktet. Videre vil også paret av basiske aminosyrer i aprotininmolekylet (Lys(41)-Arg(42)) være en mulig potensiell spaltningsposisjon for Kex2-enzymet inne i gjærcellene.
Det er en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveie-bringe en fremgangsmåte for fremstilling av aprotinin eller homologer av denne i gjær, ved hjelp av hvilken man kan få utskilt store mengder av korrekt foldet og modnet protein i mediet.
Foreliggende oppfinnelse er basert på den overraskende oppdagelse at aprotinin og visse homologer av denne forbindelsen kan fremstilles i høyt utbytte med korrekt plasserte disulfidbroer ved at man kultiverer en gjærtype transformert med en DNA-sekvens som koder for slike produkter.
Et første aspekt av foreliggende oppfinnelse angår følge-lig en fremgangsmåte for fremstilling av aprotinin eller
homologer i høyt utbytte i gjær, ved dyrkning av en gjærstamme som inneholder en replikerbar ekspresjonsvektor, idet vektoren omfatter en DNA-sekvens som koder for aprotinin eller en aprotininhomolog kondensert til en DNA-sekvens som koder for et signal- og leder-peptid som gir sekresjon av aprotininet eller aprotininhomologen, i et egnet næringsmedium, og utvinning av det utskilte aprotinin eller aprotininhomologen derifra.
I et andre aspekt av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en gjærtype som er transformert med en vektor omfattende en DNA-sekvens som definert ovenfor kondensert til en DNA-sekvens som koder for et signal- og lederpeptid som gir. sekresjon av aprotininet eller aprotininhomologen.
De aprotininer som fremstilles ved hjelp av foreliggende oppfinnelse kan karakteriseres ved følgende formel (I)
X-aprotinin(3-4 0)-Yn-Zm-aprotinin(43-58) (I) hvori X betyr Arg-Pro, Pro eller hydrogen, aprotinin(3-40) betyr den aminosyresekvens som forefinnes fra aminosyreresten 3 til 40 i naturlig aprotinin, Y kan være Lys, eller en ikke-basisk aminosyrerest, f.eks. Ser, Thr eller Ala, Z kan være Arg eller en ikke-basisk aminosyrerest, f.eks. Ser, Thr ellerAla, n og m er hvér 0 eller 1, og aprotinin(43-58) betyr aminosyresekvensen fra aminosyrerest 43-58 i naturlig aprotinin.
Særlig foretrukne er de med følgende formel (II).
X' -aprotinin(3-40) -Y'n-Z'm-aprotinin(43-58) (II) hvorX' betyr Pro eller hydrogen, aprotinin(3-40) betyr aminosyresekvensen fra aminosyrerest 3 til 40 i naturlig aprotinin,Y'er Lys eller en ikke-basisk aminosyrerest, Z' kan være Arg eller en ikke-basisk aminosyrerest under den forutsetning, at minst én av Y' eller Z' er en ikke-basisk aminosyrerest, n og m er hver 0 eller 1, og aprotinin(43-58) betyr aminosyresekvensen fra aminosyrerest 43 til 58 i naturlig aprotinin.
Foreliggende oppfinnelse vil bli ytterligere illustrert med henvisning til de vedlagte tegninger hvor: Fig. 1 viser et syntetisk gen som koder aprotinin (3-58) ; Fig. 2 illustrerer konstruksjonen av plasmidene pKFN374 og pKFN375; Fig. 3 illustrerer konstruksjonen av plasmid pMT 636; Fig. 4 viser et syntetisk gen som koder for aprotinin (3-58,42 Ser); Fig. 5 illustrerer konstruksjonen av plasmidene pKFN414 og pKFN416; Fig. 6 viser et syntetisk gen som koder for aprotinin (1-58); og Fig. 7 viser et syntetisk gen som koder for aprotinin (1-58,42 Ser).
DETALJERT BESKRIVELSE AV FORETRUKNE UTFØRELSER
For sekresjonsformål kan DNA-sekvensen som koder for det forønskede aprotinin eller aprotininhomologen smeltes sammen med eller festet til en DNA-sekvens som koder en signal og lederpeptidsekvens. Signal- og lederpeptidene spaltes av ved hjelp av den transformerte mikroorganismen under utskillelsen av det uttrykte proteinproduktet fra cellene, noe som sikrer en enklere isolasjonsmetode med hensyn til det forønskede produkt. Et godt egnet lederpeptidsystem for gjær er gjær MFal-ledersekvensen eller en del av denne (Kurjan, J. ogHerskowitz, I., Cell 30 (1982) 933-943) eller en ledersekvens beskrevet i dansk patentsøknad nr. 4638/87. Man kan imidlertid i foreliggende oppfinnelse bruke enhver signalstrek eller lederstreksekvens som tilveiebringer sekresjon i gjær, og foreliggende oppfinnelse er således ikke begrenset til et spesifikt sekresjonssystem.
For ekspresjonsformål vil en promotor bli plassert foran DNA-sekvensen for det forønskede proteinproduktet. Det er foretrukket at man bruker en promotor fra et gen som er naturlig i gjærvertorganismen, f.eks. promotoren for TPI-(triosefosfatisomerase)genet. DNA-sekvensen for det for-ønskede produkt følges av en transkripsjonsterminator-sekvens, fortrinnsvis en terminatorsekvens fra et gen som er naturlig i vertsgjærorganismen, f.eks. terminatoren for TPI-genet eller MFal-genet.
DNA-sekvensen som koder for aprotinin- eller aprotinin-homologene smeltet sammen med den passende promotor,
signal-, leder og terminatorsekvensene settes inn i en ekspresjonsvektor for ekspresjon av aprotinin eller aprotininhomolog i gjær.
Ekspresjonsvektoren kan være et plasmid som er i stand til uavhengig å replikere seg i gjær eller er i stand til å bli integrert i gjærkromosomet. Plasmidet er fortrinnsvis stabilisert mot plasmidtap i vertsmikroorganismen ved at det er satt inn i et gen som er absolutt vesentlig for levedyktig-het eller normal vekst hos vertscellene, f.eks. i et gen som koder for celledeling, celleveggbiosyntese, proteinsyntese etc..
I foreliggende beskrivelse betyr aprotinin(1-58) aprotinin med samme aminosyresekvens som man finner i naturlig aprotinin, mens aprotinin(3-58) betyr en aprotininhomolog som mangler de to første N-terminale aminosyrerestene.Aprotinin(1-58,42 Ser) betyr en aprotininhomolog hvor Arg i stilling42 er blitt erstattet med Ser, og aprotinin (3-58,42 Ser) betyr en aprotininhomolog som mangler de to første N-terminale aminosyrerestene og dessuten har Arg i stilling 42 erstattet med Ser.
Fremgangsmåter for transformasjon av gjær og dyrking av transformerte gjærtyper er de som er velkjente, f.eks. av den type som er beskrevet i ovennevnte EP patentsøknader nr. 0163529A og 0189998A.
For å minimalisere mulige komplikasjoner under utskillelsen som måtte kunne forårsakes av en "trippelbasisk" spaltningsposisjon ved den N-terminale enden av aprotiningenet, ble det fremstilt en aprotininhomolog som manglet de to første N-terminale aminosyrerestene (Arg-Pro).
Videre for å unngå eller å minimalisere en mulig Kex2 spaltning av aprotinin ved Lys(41)-Arg(42) ble det fremstilt en aprotininhomolog hvor én eller begge aminosyrerestene Lys(41) og Arg(42) var erstattet med en ikke-basisk aminosyrerest. En foretrukken aprotininhomolog av denne typen er én hvor man har Ser i posisjon 42 istedenfor Arg.
Overraskende kunne man vise at uansett det faktum at naturlig aprotinin inneholder en N-terminal basisk aminosyrerest og inneholder en dibasisk sekvens, så er gjær ikke desto mindre i stand til å uttrykke og skille ut et produkt som er identisk med naturlig aprotinin uten modifikasjon av aprotiningenet.
De foreliggende nye aprotininhomologer har samme spesifikke hemmende effekt mot storfetrypsin som naturlig aprotinin og kan følgelig brukes som en erstatning for dette.
Den spesifikke hemmende effekten av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse ble målt ved å følge hemmingen av trypsinhydrolysen av benzoylarginin-p-nitroanilid (BAPNA) ved den spektrometriske analyse som er beskrevet av Erlanger, B.F., Kokonski, N., og Cohen, W., Arch. Biochem. Biophys. 95,
(1961) 271.
DNA-sekvensene som koder for de foreliggende aprotininhomologer blir fortrinnsvis fremstilt ved oligonukleotid-synteser ved hjelp av kjent teknikk, fordi dette gjør det mulig å velge kodoner som er kjent for å være foretrukket for gj ærekspresj on.
De følgende syntetiske gener ble således konstruert:
DETALJERT BESKRIVELSE
Eksempel 1
Fremstilling av aprotininf3- 58)
Det syntetiske genet for aprotinin(3-58) ble konstruert fra en rekke oligonukleotider ved hjelp av vanlig sammenbind-ing.
01igonukleotidene ble syntetisert ved hjelp av et automa-tisk DNA-synteseapparat hvor man brukte fosforamidittkjemi på et kontrollert poreglassunderlag (Beaucage, S.L., ogCaruthers, M.H., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859-1869).
De følgende 10 oligonukleotider ble syntetisert:
5 duplekser A-E ble fremstilt fra de ovennevnte 10 oligonukleotider som vist i fig. 1. 20 pmol av hver av dupleksene A-E ble fremstilt fra de tilsvarende parene av 5'-fosforylerte oligonukleotider I-X ved oppvarming i 5 min. ved 90°C fulgt av avkjøling til romtemperatur i løpet av 75 min.. De fem dupleksene ble blandet og behandlet med T4-ligase. Det syntetiske genet ble isolert som et 176 bp bånd etter elektroforese av sammenbindingsblandingen på en 2% agarosegel. Det fremstilte syntetiske genet er vist på fig. 1.
Det syntetiske genet ble bundet til et 330 bp EcoRI-Hgal-fragment fra plasmid pKFN9 som koder for MFal-signal og ledersekvens(1-85) og til det store EcoRI-Xbal-fragmentet fra pUC19. Konstruksjonen av pKFN9 inneholdende en Hgal-posisjon umiddelbart etter MFal-ledersekvensen er beskrevet i EP-patentsøknad nr. 0214826.
Sammenbindingsblandingen ble brukt for å omforme en kompetent E^. coli-stamme (r"'m<+>) som var valgt for ampicillinresistens. Sekvensering av et<32>P-XbaI-EcoRI-fragment (Maxam, A. og Gilbert, W., Methods enzymol. 65 (1980) 499-560) viste at plasmider fra de resulterende kolonier inneholdt den korrekte DNA-sekvensen for aprotinin(3-58).
Et plasmid pKNF305 ble valgt for videre bruk. Konstruksjonen av plasmidet pKFN305 er vist på fig. 2.
pKFN305 ble kuttet med EcoRI og Xbal, og 0,5 kb fragmentet ble bundet til 9,5 kb NcoI-Xbal-fragmentet fra pMT636 og til 1,4 kb NcoI-EcoRI-fragmentet fra pMT636, noe som resul-terte i plasmidet pKFN374, se fig. 2. Plasmidet pMT636 var konstruert fra pMT608 etter utelatelse av LEU-2 genet og fra pMT479 se fig. 3. pMT608 er beskrevet i EP-patentsøknad nr. 195691. pMT479 er beskrevet i EP-patentsøknad nr. 163529. pMT479 inneholder Schizo. pombe TPI genet (POT) , Sj^cerevisiae triosefosfatisomeraseaktivatoren og terminator, TPIPog TPIT(Alber, T. og Kawasaki, G. J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982) 419-434). Plasmid pKFN374 inneholder den følgende sekvensen:
TPIp-MFal-signal-leder(1-85)-aprotinin(3-58)-TPIT.
hvor MFal er S^. cerevisiae tilpasningsfaktoren alfa 1 kodingssekvensen (Kurjan, J. og Herskowitz, I., Cell 30, (1982) 933-943), og hvor signal-leder(1-85) betyr at sekvensen inneholder de første 85 aminosyrerestene av MFal-signal-ledersekvensen og at aprotinin(3-58) er den syntetiske sekvens som koder for et aprotininderivat som mangler de to første aminosyrerestene.
S. cerevisiae-stammen MT663 (E2-7B XE11-36 a/a,AtpiAtpi, pep 4-3/pep 4-3) dyrket på YPGaL (1% Bacto gjær-ekstrakt, 2% Bactopepton, 2% galaktose, 1% laktat) til en O.D. ved 600 nm på 0,6.
100 ml av kulturen ble høstet ved sentrifugering, vasket med 10 ml vann, igjen sentrifugert og suspendert i en 10 ml oppløsning inneholdende 1,2 M sorbitol, 25 mM Na2EDTA pH = 8,0 og 6,7 mg/ml ditiotreitol. Suspensjonen ble inkubert ved 30°C i 15 min., sentrifugert, hvoretter cellene igjen ble suspendert i 10 ml av en oppløsning inneholdende 1,2 M sorbitol, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M natriumcitrat, pH = 5,8 og 2 mg Novozym'234.
Suspensjonen ble inkubert ved 30°C i 30 min., hvoretter cellene ble oppsamlet ved sentrifugering, vasket i 10 ml 1,2 M sorbitol og 10 ml CAS (1,2 M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris HC1 (Tris = Tris(hydroksymetyl)aminometan) pH = 7,5) og igjen suspendert i 2 ml CAS. For transformasjon ble 0,1 ml av de CAS-resuspenderte cellene blandet med ca. 1 (ig av plasmidet pKFN374 og hensatt ved romtemperatur i 15 min.. 1 ml (20% polyetylenglykol 4000, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris HC1, pH = 7,5) ble tilsatt, og blandingen ble hensatt i ytterligere 30 min. ved romtemperatur. Blandingen ble sentrifugert, og det utsentrifugerte materialet ble resuspendert i 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitol, 33% volum/volum YPD, 6,7 mM CaCl2, 14Mg/ml leucin) og inkubert ved 30°C i 2 timer. Suspensjonen ble så sentrifugert, og det utsentrifugerte materialet ble igjen suspendert i0,5 ml 1,2 M sorbitol. Deretter ble 6 ml toppagar (SC-mediet fra Sherman et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) inneholdende 1,2 M sorbitol og 2,5% agar) tilsatt ved 52°C, og suspensjonen ble helt på toppen av plater som inneholdt samme stivnede agar og som inneholdt sorbitol. Transformante kolonier ble plukket ut etter 3 døgn ved 30°C, igjen isolert og brukt for å starte væskeku1turer. Én slik transformant KFN322 ble valgt for ytterligere karakte-risering.
Gjærtypen KFN322 ble dyrket på et YPD-medium (1% gjær-ekstrakt, 2% pepton (fra Difco Laboratories) og 2% glukose). En 10 ml kultur av denne rasen ble ristet ved 30°C til en O.D. ved 600 nm på 32. Etter sentrifugering ble supernatanten analysert ved hjelp av FPLC ioneutbyttingskromatografi. Gjær supernatanten ble filtrert gjennom et 0,22/xm Millex'GV filter og 1 ml ble påsatt en MonoS kationutbyttingskolonne (0,5 x 5 cm) ekvilibrert med 20 mM Bicine, pH 8,7. Etter vasking med ekvilibreringsbufferen ble kolonnen eluert med en lineær NaCl-gradient (0-1 M) i ekvilibreringsbufferen. Trypsininhibitoraktivitet ble kvantifisert i de eluerte fraksjoner ved en spektrofotometrisk analyse og ytterligere ved integrasjon ved hjelp av absorpsjonen ved 280 nm fra 1%
E2ao(aprotinin) =8,3
Utyttet var ca. 3 mg/liter av aprotinin(3-58).
For aminosyreanalyse og N-terminalsekvensering ble gjær-supernatanten (7 ml) justert til pH 8,7 med 0,1 M NaOH og filtrert (0,22Atm). Den utløpende væske fra Q-Sepharoseanion-bytterkolonnen (1x4 cm) ekvilibrert med 20 mM Bicine, pH8,7, ble satt på en MonoS-kationutbyttingskolonne (0,5 x 5 cm). Kationbytterkromatografien ble utført som beskrevet ovenfor. Konsentrasjon av den gradienteluerte aprotinin(3-58) ble utført ved rekromatografi på MonoS og eluering med en steilere NaCl-gradient. De oppsamlede fraksjoner ble ytterligere konsentrert ved vakuumsentrifugering til ca. 100 jul og påsatt en RP-HPLC-kolonne (Vydac C4, 4,6 x 250 mm). Eluering ble utført med en CH3CN-gradient i 0,1% TFA. De oppsamlede fraksjonene ble konsentrert til ca. 100/il ved vakuumsentrifugering, og det ble tatt ut prøver for N-terminalsekvensering og aminosyreanalyse.
Ved N-terminalsekvensering fant man følgende sekvens:
som bekrefter at den N-terminale enden er korrekt.
Aminosyreanalysen er vist i den følgende tabell 1. Detfremgår av denne tabellen at produktet hadde den forventede aminosyresammensetningen, dvs. minus Arg og Pro. Det svakt senkede innholdet av Ile kan sannsynligvis tilskrives en ufullstendig hydrolyse av Ile(18)-Ile(19) (noe som er velkjent i genteknologien). Videre er Pro og Arg noe høyere enn for-ventet. Dette er imidlertid også tilfelle med aprotinin (tabell 1, andre kolonne).
Ved hjelp av ovenfornevnte fremgangsmåte til Erlanger et al. fant man ved en sammenligning at den spesifikke aktiviteten for aprotinin(3-58) var identisk innenfor den eksperimen-telle feilen med den spesifikke aktivitet man har for naturlig aprotinin.
Eksempel 2
Fremstilling av aprotinin( 3- 58, 42 Ser).
Et syntetisk gen for aprotinin(3-58,42 Ser) ble konstruert som beskrevet i eksempel 1. For å erstatte Arg(42) med Ser ble de følgende oligonukleotider Vila og Villa brukt istedenfor VII og VIII:
Det fremstilte syntetiske genet er vist på fig. 4. Dette genet ble smeltet sammen med MFal-signal-leder(1-85) sekvensen og ble klonet i et pUC19 avledet plasmid pKFN306 (se fig.2).
Ved å bruke den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 1, fikk man fremstilt et plasmid pKFN375 som inneholdt følgende konstruksjon
TPIp-MFotl-signal-leder (1-85) -aprotinin(3-58,42 Ser)-TPIT
hvor aprotinin(3-58,42 Ser) er det syntetiske genet som koder for et aprotininderivat som mangler de to første aminosyrerestene, og som inneholder en Ser-gruppe istedenfor Arg i stilling 42.
Gjærtypen MT663 ble transformert med plasmidet pKFN375 som beskrevet ovenfor, og en dyrking av den transformerte rasen KFN324 ga ca. 12 mg/liter av aprotinin(3-58,42 Ser).
Den N-terminale sekvenseringen ble utført som beskrevet ovenfor og bekreftet den følgende N-terminale sekvensen Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe
dvs. den korrekte sekvensen.
Aminosyreanalysen er vist i tabell 1 og bekrefter den forventede aminosyresammensetning, dvs. mindre Pro og Arg og mer Ser (se også de ovennevnte bemerkninger i eksempel 1).
Ved hjelp av ovennevnte fremgangsmåte til Erlanger et al. sammenlignet man den spesifikke aktiviteten .for aprotinin(3-58,42 Ser) og fant at den var identisk innenfor den eksperi mentelle feilmargin, med den spesifikke aktiviteten for naturlig aprotinin.
Eksempel 3
Fremstilling av aprotininf1- 58)
Den syntetiske dupleksen som er vist på fig. 5 ble bundet til 330 bp EcoRI-Hgal-fragmentet fra plasmid pKFN9 som koder for MFal signal- og ledersekvensen og til 144 bp Avall-Xbal-fragmentet fra pKFN305 og til det store EcoRI-Xbal-fragmentet fra pUC19.
Sammenbindingsblandingen ble brukt for å transformere en kompetent E^. coli-rase (r'm<+>) som gir ampicillinresistens. Sekvensering av et<32>P-merket Xbal-EcoRI-fragment viste at plasmidene fra de resulterende kolonier inneholdt den korrekte DNA-sekvens for aprotinin(1-58).
Et plasmid pKFN414 ble valgt for ytterligere bruk. Konstruksjonen av dette plasmidet er vist på fig. 5.
Ved å følge den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 1, fikk man fremstilt et gjærplasmid pKFN418 som inneholdt følgende konstruksjon: TPIp-MFal-signal-leder(1-85)-aprotinin(1-58)-TPIT
Gjærtypen MT663 ble transformert med plasmidet pKFN418 som beskrevet ovenfor. Dyrking av den transformerte rasen KFN385 ga ca. 1-13 mg/l av aprotinin(1-58).
Når man sammenlignet ved hjelp av ovennente fremgangsmåte til Erlanger et al., den spesifikke aktiviteten for aprotinin(1-58) fremstilt som beskrevet i dette eksempel, så var denne aktiviteten identisk innenfor den eksperimentelle feilmarginen med den spesifikke aktiviteten man har for naturlig aprotinin.
Ekserne1 4
Fremstilling av aprotnind- 58, 42 Ser)
Et plasmid pKFN416 inneholdende et gen for aprotinin(1-58,42 Ser) ble konstruert fra pKFN306 som beskrevet i eksempel 3. Ved å bruke den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 1, fikk man fremstilt et gjærplasmid pKFN420 som inneholdt følgende konstruksjon:
TPIp-MFal-signal-leder(1-85)-aprotinin(1-58,42 Ser)-
TPIT
Gjærtypen MT663 ble transformert med plasmidet pKFN420 som beskrevet ovenfor. Dyrking av den transformerte stammen KFN387 ga ca. 1-13 mg/l av aprotinin(1-58,42 Ser).
Ved hjelp av ovennevnte fremgangsmåte til Erlanger et al. sammenlignet man den spesifikke aktiviteten for aprotinin(1-58,42 Ser) og fant at denne var identisk innenfor den eksperimentelle feilkilde, med den spesifikke aktiviteten for naturlig aprotinin.
Claims (8)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt aprotinin eller homologer derav i gjær,karakterisert veddyrkning av en gjærstamme som inneholder en replikerbar ekspresjonsvektor, idet vektoren omfatter en DNA-sekvens som koder for aprotinin eller en aprotininhomolog kondensert til en DNA-sekvens som koder for et signal- og leder-peptid som gir sekresjon av aprotininet eller aprotininhomologen, i et egnet næringsmedium, og utvinning av det utskilte aprotinin eller aprotininhomologen derifra.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert vedat DNA-sekvensen som anvendes koder for en aprotininhomolog med følgende formel: X' -aprotinin (3-40) -Y 'n-Z ' m-aprotinin (43-58) hvor X' er Pro eller hydrogen, aprotinin(3-40) er amino-syre-sekvensen fra aminosyre 3 til 40 i naturlig aprotinin, Y' er Lys eller en ikke-basisk aminosyrerest, Z' er Arg eller en ikke-basisk aminosyrerest under den forutsetning at minst én avY'og Z' er en ikke-basisk aminosyrerest, n og m er hver0eller 1, og aprotinin(43-58) er aminosyresekvensen fra aminosyrerest 43 til 58 i naturlig aprotinin.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2,
karakterisert vedat DNA-sekvensen som anvendes koder for en aprotinin-homolog hvori X' er hydrogen, Y' er Lys, Z' er Ser, og n og m hver er 1.
4.Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert vedat DNA-sekvensen som anvendes koder for aprotinin(3-58) og har følgende sekvens:
5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert vedat DNA-sekvensen som anvendes koder for aprotinin(3-58,42 Ser) og har følgende sekvens
6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert vedat DNA-sekvensen som anvendes koder for aprotinin(1-58) og har følgende sekvens 7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert vedat DNA-sekvensen som anvendes koder for aprotinin(1-58,42 Ser) og har følgende nukleotidsekvens
8. Gjærstamme,
karakterisert vedat den er transformert med en vektor omfattende en DNA-sekvens som definert i krav 1 kondensert til en DNA-sekvens som koder for et signal- og leder-peptid som gir sekresjon av aprotininet eller aprotininhomologen.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK450187A DK450187D0 (da) | 1987-08-28 | 1987-08-28 | Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner |
PCT/DK1988/000138 WO1989001968A1 (en) | 1987-08-28 | 1988-08-26 | Aprotinin homologues and process for the production of aprotinin and aprotinin homologues in yeast |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO900920D0 NO900920D0 (no) | 1990-02-27 |
NO900920L NO900920L (no) | 1990-04-25 |
NO177967B true NO177967B (no) | 1995-09-18 |
NO177967C NO177967C (no) | 1995-12-27 |
Family
ID=8134111
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO900920A NO177967C (no) | 1987-08-28 | 1990-02-27 | Fremgangsmåte ved fremstilling av aprotinin og aprotinin homologer i gjær, og en gjærstamme som anvendes i fremgangsmåten |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0375718B1 (no) |
JP (1) | JP2806958B2 (no) |
AT (1) | ATE113986T1 (no) |
DE (1) | DE3852105T2 (no) |
DK (1) | DK450187D0 (no) |
FI (1) | FI104428B (no) |
NO (1) | NO177967C (no) |
WO (1) | WO1989001968A1 (no) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5591603A (en) * | 1987-08-28 | 1997-01-07 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing aprotinin and aprotinin analogs in yeast cells |
US5223409A (en) * | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
DK105489D0 (da) * | 1989-03-03 | 1989-03-03 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
US7413537B2 (en) | 1989-09-01 | 2008-08-19 | Dyax Corp. | Directed evolution of disulfide-bonded micro-proteins |
DE3930522A1 (de) * | 1989-09-13 | 1991-03-21 | Bayer Ag | Rekombinante aprotinin-varianten - gentechnisches verfahren zur mikrobiellen herstellung von homogen prozessierten aprotinin-varianten sowie die therapeutische anwendung derselben |
US5258302A (en) * | 1990-07-03 | 1993-11-02 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells |
IL99585A0 (en) * | 1990-10-01 | 1992-08-18 | Novo Nordisk As | Aprotinin analogues,their production and pharmaceutical compositions containing them |
AU1545692A (en) | 1991-03-01 | 1992-10-06 | Protein Engineering Corporation | Process for the development of binding mini-proteins |
DE4417353A1 (de) * | 1994-05-18 | 1996-01-25 | Bayer Ag | Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Aprotinin und rekombinanten Aprotinin Varianten mit der natürlichen N-terminlaen Sequenz |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK58285D0 (da) * | 1984-05-30 | 1985-02-08 | Novo Industri As | Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf |
US5219569A (en) * | 1985-04-22 | 1993-06-15 | Genentech, Inc. | Protease resistant urokinase |
DE3930522A1 (de) * | 1989-09-13 | 1991-03-21 | Bayer Ag | Rekombinante aprotinin-varianten - gentechnisches verfahren zur mikrobiellen herstellung von homogen prozessierten aprotinin-varianten sowie die therapeutische anwendung derselben |
-
1987
- 1987-08-28 DK DK450187A patent/DK450187D0/da not_active Application Discontinuation
-
1988
- 1988-08-26 WO PCT/DK1988/000138 patent/WO1989001968A1/en active IP Right Grant
- 1988-08-26 JP JP63507339A patent/JP2806958B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1988-08-26 EP EP88907646A patent/EP0375718B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-26 DE DE3852105T patent/DE3852105T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-08-26 AT AT88907646T patent/ATE113986T1/de not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-02-27 FI FI900991A patent/FI104428B/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-02-27 NO NO900920A patent/NO177967C/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK450187D0 (da) | 1987-08-28 |
DE3852105T2 (de) | 1995-03-23 |
NO900920D0 (no) | 1990-02-27 |
ATE113986T1 (de) | 1994-11-15 |
JP2806958B2 (ja) | 1998-09-30 |
FI900991A0 (fi) | 1990-02-27 |
JPH03502519A (ja) | 1991-06-13 |
EP0375718A1 (en) | 1990-07-04 |
NO177967C (no) | 1995-12-27 |
WO1989001968A1 (en) | 1989-03-09 |
FI104428B (fi) | 2000-01-31 |
EP0375718B1 (en) | 1994-11-09 |
NO900920L (no) | 1990-04-25 |
DE3852105D1 (de) | 1994-12-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5514585A (en) | Yeast processing system | |
EP0195691B1 (en) | Process for the preparation of insulin precursors and process for the preparation of human insulin | |
EP0339942B1 (en) | Aprotinin analogues and process for the production thereof | |
US5631144A (en) | Application of novel DNA fragments as a coding sequence for a signal peptide for the secretion of mature proteins by recombinant yeast, expression cassettes, transformed yeast and corresponding process for the preparation of proteins | |
IL114160A (en) | Dna constructs encoding heterologous proteins and processes for the heterologous protein production in yeast | |
CA1294232C (en) | Process for preparing glucagon or derivatives or fragments thereof in yeast | |
NO174351B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av human insulinforloeper samt DNA-sekvens og vektor til anvendelse av fremgangsmaaten | |
NO180593B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling, i Saccharomyces cerevisiae, av et heterologt protein i homogen form | |
NO177967B (no) | Fremgangsmåte ved fremstilling av aprotinin og aprotinin homologer i gjær, og en gjærstamme som anvendes i fremgangsmåten | |
NO176915B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av et hirudin-derivat | |
CA2047119C (en) | Vitro processing of fusion proteins | |
DK171239B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af aprotinin eller homologer deraf, vektor der er i stand til at replicere i gær samt gærstamme | |
NO178870B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av modifisert Eglin B eller C samt DNA, ekspresjonsvektor og vertsmikroorganisme | |
DK171417B1 (da) | Aprotininalaloger med Ala eller Gly i position 17 og fremgangsmåde til fremstilling deraf |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |