NO177967B

NO177967B - Fremgangsmåte ved fremstilling av aprotinin og aprotinin homologer i gjær, og en gjærstamme som anvendes i fremgangsmåten

Info

Publication number: NO177967B
Application number: NO900920A
Authority: NO
Inventors: Kjeld Norris; Fanny Norris; Soeren Erik Bjoern
Original assignee: Novo Nordisk As; Novo Industri As
Priority date: 1987-08-28
Filing date: 1990-02-27
Publication date: 1995-09-18
Also published as: DK450187D0; DE3852105T2; NO900920D0; ATE113986T1; JP2806958B2; FI900991A0; JPH03502519A; EP0375718A1; NO177967C; WO1989001968A1; FI104428B; EP0375718B1; NO900920L; DE3852105D1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av aprotinin og homologer av denne i gjær, og en gjærstamme som anvendes i fremgangsmåten.

Aprotinin (storfepankreatintrypsininhibitor, BPTI) er et polypeptid som skilles ut av flere organer og vev hos storfe, f.eks. lymfekjertler, pankreas, lunger, den store spytt-kjertelen, milten og leveren. Forbindelsen er et enkeltkjedet polypeptid bestående av 58 aminosyrerester tverrbundet ved hjelp av tre disulfidbroer og med følgende aminosyresekvens:

De tre disulfidbroene befinner seg mellom Cys(5)-Cys(55), Cys(14)-Cys(38) og Cys(30)-Cys(51), hhv..

Aprotinin brukes for behandling av akutt pankreatitt, forskjellige tilstander av sjokksyndrom, hyperfibrinolytisk blødning og myokardialt infarkt. Tilførsel av aprotinin i høye doser reduserer i betydelig grad blodtapet i forbindelse med hjerteoperasjoner.

Aprotinin kan ekstraheres fra forskjellige storfeorganer og vev såsom lunge, pankreas og de store spyttkjertlene. I den foreliggende beskrivelse vil aprotinin fremstilt på denne måten bli betegnet som naturlig aprotinin. Ekstraksjon fra dyrevev er en arbeidskrevende prosess og krever store mengder av storfeets organer eller vev. En langt mer hensiktsmessig fremgangsmåte for kommersiell produksjon ville være en fer-menteringsprosess ved hjelp av hvilken et gen som koder for aprotinin kunne inkorporeres i en egnet mikroorganisme ved hjelp av en rekombinant DNA-teknikk. Mikroorganismen kunne så dyrkes i et egnet næringsmedium for å fremstille det for-ønskede produktet, som ville skille seg ut i mediet og fra hvilket det kunne innvinnes.

Et gen for aprotinin er blitt smeltet sammen eller festet til kodingssekvensen for E^_ coli alkalisk fosfatasesignal-peptid og uttrykt i coli under kontroll av det alkaliske fosfataseaktivatoren (Marks, C.B. et al., The Journal of Biological Chemistry 261 (1986) 7115-7118). Man har også klonet et syntetisk gen som koder for proteinsekvensen i Met-aprotinin i en E^. coli ekspresjonsvektor (von Wilcken-Bermann, B. et al., The EMBO Journal 5 (1986) 3219-3225). Fremstilling av aprotinin og aprotininhomologer er også beskrevet i euro-peisk patentspesifikasjon nr. 238,993 og britisk patentsøknad nr. 2,188,933.

Det er imidlertid et problem med fremstillingen av små fremmede proteiner i E_^coli, fordi slike proteiner lett nedbrytes av vertens proteaser. Det har videre vist seg å være et problem å få etablert de korrekte disulfidbroene og den riktige foldingen i E^coli.

Det har vist seg at gjær er i stand til å uttrykke og fremstille små proteiner med omtrent den samme størrelse som aprotinin. I EP-patentsøknad nr. 0163529A er det beskrevet fremstilling av insulinforløpere med korrekt plasserte disulfidbroer, og i EP patentsøknad nr. 0189998A er det beskrevet fremstillingen av glukagon, et enkeltkjedet polypeptid med 29 aminosyrerester.

Ved hjelp av de fremgangsmåter som er nevnt ovenfor er et primært produkt bestående av det forønskede protein bundet til et gjærlederpeptid uttrykt i gjær. Under utskillelsen vil det primære produktet bli bearbeidet ved hjelp av Kex2-enzymet

(Julius, D. et al. Cell 32 (1983) 839-852) og det bearbeidede produktet som også betegnes som det modne eller modnede produktet, skilles så ut i mediet. Bearbeiding av det uttrykte primære produktet skjer ved et par basiske aminosyrer (Lys-Arg) i den N-terminale enden av det modnede produktet.

I forbindelse med aprotinin som har en basisk aminosyre (Arg) som den N-terminale aminosyren, kan det oppstå problemer hvis Kex2-bearbeidingsposisjonen Lys-Arg innsettes før den første Arg-resten i aprotininsekvensen, ettersom en "trippelbasisk" spaltningsposisjon vil være tilstede i det uttrykte sammensmeltningsproduktet. Videre vil også paret av basiske aminosyrer i aprotininmolekylet (Lys(41)-Arg(42)) være en mulig potensiell spaltningsposisjon for Kex2-enzymet inne i gjærcellene.

Det er en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveie-bringe en fremgangsmåte for fremstilling av aprotinin eller homologer av denne i gjær, ved hjelp av hvilken man kan få utskilt store mengder av korrekt foldet og modnet protein i mediet.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den overraskende oppdagelse at aprotinin og visse homologer av denne forbindelsen kan fremstilles i høyt utbytte med korrekt plasserte disulfidbroer ved at man kultiverer en gjærtype transformert med en DNA-sekvens som koder for slike produkter.

Et første aspekt av foreliggende oppfinnelse angår følge-lig en fremgangsmåte for fremstilling av aprotinin eller

homologer i høyt utbytte i gjær, ved dyrkning av en gjærstamme som inneholder en replikerbar ekspresjonsvektor, idet vektoren omfatter en DNA-sekvens som koder for aprotinin eller en aprotininhomolog kondensert til en DNA-sekvens som koder for et signal- og leder-peptid som gir sekresjon av aprotininet eller aprotininhomologen, i et egnet næringsmedium, og utvinning av det utskilte aprotinin eller aprotininhomologen derifra.

I et andre aspekt av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt en gjærtype som er transformert med en vektor omfattende en DNA-sekvens som definert ovenfor kondensert til en DNA-sekvens som koder for et signal- og lederpeptid som gir. sekresjon av aprotininet eller aprotininhomologen.

De aprotininer som fremstilles ved hjelp av foreliggende oppfinnelse kan karakteriseres ved følgende formel (I)

X-aprotinin(3-4 0)-Yn-Zm-aprotinin(43-58) (I) hvori X betyr Arg-Pro, Pro eller hydrogen, aprotinin(3-40) betyr den aminosyresekvens som forefinnes fra aminosyreresten 3 til 40 i naturlig aprotinin, Y kan være Lys, eller en ikke-basisk aminosyrerest, f.eks. Ser, Thr eller Ala, Z kan være Arg eller en ikke-basisk aminosyrerest, f.eks. Ser, Thr ellerAla, n og m er hvér 0 eller 1, og aprotinin(43-58) betyr aminosyresekvensen fra aminosyrerest 43-58 i naturlig aprotinin.

Særlig foretrukne er de med følgende formel (II).

X' -aprotinin(3-40) -Y'n-Z'm-aprotinin(43-58) (II) hvorX' betyr Pro eller hydrogen, aprotinin(3-40) betyr aminosyresekvensen fra aminosyrerest 3 til 40 i naturlig aprotinin,Y'er Lys eller en ikke-basisk aminosyrerest, Z' kan være Arg eller en ikke-basisk aminosyrerest under den forutsetning, at minst én av Y' eller Z' er en ikke-basisk aminosyrerest, n og m er hver 0 eller 1, og aprotinin(43-58) betyr aminosyresekvensen fra aminosyrerest 43 til 58 i naturlig aprotinin.

Foreliggende oppfinnelse vil bli ytterligere illustrert med henvisning til de vedlagte tegninger hvor: Fig. 1 viser et syntetisk gen som koder aprotinin (3-58) ; Fig. 2 illustrerer konstruksjonen av plasmidene pKFN374 og pKFN375; Fig. 3 illustrerer konstruksjonen av plasmid pMT 636; Fig. 4 viser et syntetisk gen som koder for aprotinin (3-58,42 Ser); Fig. 5 illustrerer konstruksjonen av plasmidene pKFN414 og pKFN416; Fig. 6 viser et syntetisk gen som koder for aprotinin (1-58); og Fig. 7 viser et syntetisk gen som koder for aprotinin (1-58,42 Ser).

DETALJERT BESKRIVELSE AV FORETRUKNE UTFØRELSER

For sekresjonsformål kan DNA-sekvensen som koder for det forønskede aprotinin eller aprotininhomologen smeltes sammen med eller festet til en DNA-sekvens som koder en signal og lederpeptidsekvens. Signal- og lederpeptidene spaltes av ved hjelp av den transformerte mikroorganismen under utskillelsen av det uttrykte proteinproduktet fra cellene, noe som sikrer en enklere isolasjonsmetode med hensyn til det forønskede produkt. Et godt egnet lederpeptidsystem for gjær er gjær MFal-ledersekvensen eller en del av denne (Kurjan, J. ogHerskowitz, I., Cell 30 (1982) 933-943) eller en ledersekvens beskrevet i dansk patentsøknad nr. 4638/87. Man kan imidlertid i foreliggende oppfinnelse bruke enhver signalstrek eller lederstreksekvens som tilveiebringer sekresjon i gjær, og foreliggende oppfinnelse er således ikke begrenset til et spesifikt sekresjonssystem.

For ekspresjonsformål vil en promotor bli plassert foran DNA-sekvensen for det forønskede proteinproduktet. Det er foretrukket at man bruker en promotor fra et gen som er naturlig i gjærvertorganismen, f.eks. promotoren for TPI-(triosefosfatisomerase)genet. DNA-sekvensen for det for-ønskede produkt følges av en transkripsjonsterminator-sekvens, fortrinnsvis en terminatorsekvens fra et gen som er naturlig i vertsgjærorganismen, f.eks. terminatoren for TPI-genet eller MFal-genet.

DNA-sekvensen som koder for aprotinin- eller aprotinin-homologene smeltet sammen med den passende promotor,

signal-, leder og terminatorsekvensene settes inn i en ekspresjonsvektor for ekspresjon av aprotinin eller aprotininhomolog i gjær.

Ekspresjonsvektoren kan være et plasmid som er i stand til uavhengig å replikere seg i gjær eller er i stand til å bli integrert i gjærkromosomet. Plasmidet er fortrinnsvis stabilisert mot plasmidtap i vertsmikroorganismen ved at det er satt inn i et gen som er absolutt vesentlig for levedyktig-het eller normal vekst hos vertscellene, f.eks. i et gen som koder for celledeling, celleveggbiosyntese, proteinsyntese etc..

I foreliggende beskrivelse betyr aprotinin(1-58) aprotinin med samme aminosyresekvens som man finner i naturlig aprotinin, mens aprotinin(3-58) betyr en aprotininhomolog som mangler de to første N-terminale aminosyrerestene.Aprotinin(1-58,42 Ser) betyr en aprotininhomolog hvor Arg i stilling42 er blitt erstattet med Ser, og aprotinin (3-58,42 Ser) betyr en aprotininhomolog som mangler de to første N-terminale aminosyrerestene og dessuten har Arg i stilling 42 erstattet med Ser.

Fremgangsmåter for transformasjon av gjær og dyrking av transformerte gjærtyper er de som er velkjente, f.eks. av den type som er beskrevet i ovennevnte EP patentsøknader nr. 0163529A og 0189998A.

For å minimalisere mulige komplikasjoner under utskillelsen som måtte kunne forårsakes av en "trippelbasisk" spaltningsposisjon ved den N-terminale enden av aprotiningenet, ble det fremstilt en aprotininhomolog som manglet de to første N-terminale aminosyrerestene (Arg-Pro).

Videre for å unngå eller å minimalisere en mulig Kex2 spaltning av aprotinin ved Lys(41)-Arg(42) ble det fremstilt en aprotininhomolog hvor én eller begge aminosyrerestene Lys(41) og Arg(42) var erstattet med en ikke-basisk aminosyrerest. En foretrukken aprotininhomolog av denne typen er én hvor man har Ser i posisjon 42 istedenfor Arg.

Overraskende kunne man vise at uansett det faktum at naturlig aprotinin inneholder en N-terminal basisk aminosyrerest og inneholder en dibasisk sekvens, så er gjær ikke desto mindre i stand til å uttrykke og skille ut et produkt som er identisk med naturlig aprotinin uten modifikasjon av aprotiningenet.

De foreliggende nye aprotininhomologer har samme spesifikke hemmende effekt mot storfetrypsin som naturlig aprotinin og kan følgelig brukes som en erstatning for dette.

Den spesifikke hemmende effekten av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse ble målt ved å følge hemmingen av trypsinhydrolysen av benzoylarginin-p-nitroanilid (BAPNA) ved den spektrometriske analyse som er beskrevet av Erlanger, B.F., Kokonski, N., og Cohen, W., Arch. Biochem. Biophys. 95,

(1961) 271.

DNA-sekvensene som koder for de foreliggende aprotininhomologer blir fortrinnsvis fremstilt ved oligonukleotid-synteser ved hjelp av kjent teknikk, fordi dette gjør det mulig å velge kodoner som er kjent for å være foretrukket for gj ærekspresj on.

De følgende syntetiske gener ble således konstruert:

DETALJERT BESKRIVELSE

Eksempel 1

Fremstilling av aprotininf3- 58)

Det syntetiske genet for aprotinin(3-58) ble konstruert fra en rekke oligonukleotider ved hjelp av vanlig sammenbind-ing.

01igonukleotidene ble syntetisert ved hjelp av et automa-tisk DNA-synteseapparat hvor man brukte fosforamidittkjemi på et kontrollert poreglassunderlag (Beaucage, S.L., ogCaruthers, M.H., Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859-1869).

De følgende 10 oligonukleotider ble syntetisert:

5 duplekser A-E ble fremstilt fra de ovennevnte 10 oligonukleotider som vist i fig. 1. 20 pmol av hver av dupleksene A-E ble fremstilt fra de tilsvarende parene av 5'-fosforylerte oligonukleotider I-X ved oppvarming i 5 min. ved 90°C fulgt av avkjøling til romtemperatur i løpet av 75 min.. De fem dupleksene ble blandet og behandlet med T4-ligase. Det syntetiske genet ble isolert som et 176 bp bånd etter elektroforese av sammenbindingsblandingen på en 2% agarosegel. Det fremstilte syntetiske genet er vist på fig. 1.

Det syntetiske genet ble bundet til et 330 bp EcoRI-Hgal-fragment fra plasmid pKFN9 som koder for MFal-signal og ledersekvens(1-85) og til det store EcoRI-Xbal-fragmentet fra pUC19. Konstruksjonen av pKFN9 inneholdende en Hgal-posisjon umiddelbart etter MFal-ledersekvensen er beskrevet i EP-patentsøknad nr. 0214826.

Sammenbindingsblandingen ble brukt for å omforme en kompetent E^. coli-stamme (r"'m<+>) som var valgt for ampicillinresistens. Sekvensering av et<32>P-XbaI-EcoRI-fragment (Maxam, A. og Gilbert, W., Methods enzymol. 65 (1980) 499-560) viste at plasmider fra de resulterende kolonier inneholdt den korrekte DNA-sekvensen for aprotinin(3-58).

Et plasmid pKNF305 ble valgt for videre bruk. Konstruksjonen av plasmidet pKFN305 er vist på fig. 2.

pKFN305 ble kuttet med EcoRI og Xbal, og 0,5 kb fragmentet ble bundet til 9,5 kb NcoI-Xbal-fragmentet fra pMT636 og til 1,4 kb NcoI-EcoRI-fragmentet fra pMT636, noe som resul-terte i plasmidet pKFN374, se fig. 2. Plasmidet pMT636 var konstruert fra pMT608 etter utelatelse av LEU-2 genet og fra pMT479 se fig. 3. pMT608 er beskrevet i EP-patentsøknad nr. 195691. pMT479 er beskrevet i EP-patentsøknad nr. 163529. pMT479 inneholder Schizo. pombe TPI genet (POT) , Sj^cerevisiae triosefosfatisomeraseaktivatoren og terminator, TPIPog TPIT(Alber, T. og Kawasaki, G. J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982) 419-434). Plasmid pKFN374 inneholder den følgende sekvensen:

TPIp-MFal-signal-leder(1-85)-aprotinin(3-58)-TPIT.

hvor MFal er S^. cerevisiae tilpasningsfaktoren alfa 1 kodingssekvensen (Kurjan, J. og Herskowitz, I., Cell 30, (1982) 933-943), og hvor signal-leder(1-85) betyr at sekvensen inneholder de første 85 aminosyrerestene av MFal-signal-ledersekvensen og at aprotinin(3-58) er den syntetiske sekvens som koder for et aprotininderivat som mangler de to første aminosyrerestene.

S. cerevisiae-stammen MT663 (E2-7B XE11-36 a/a,AtpiAtpi, pep 4-3/pep 4-3) dyrket på YPGaL (1% Bacto gjær-ekstrakt, 2% Bactopepton, 2% galaktose, 1% laktat) til en O.D. ved 600 nm på 0,6.

100 ml av kulturen ble høstet ved sentrifugering, vasket med 10 ml vann, igjen sentrifugert og suspendert i en 10 ml oppløsning inneholdende 1,2 M sorbitol, 25 mM Na2EDTA pH = 8,0 og 6,7 mg/ml ditiotreitol. Suspensjonen ble inkubert ved 30°C i 15 min., sentrifugert, hvoretter cellene igjen ble suspendert i 10 ml av en oppløsning inneholdende 1,2 M sorbitol, 10 mM Na2EDTA, 0,1 M natriumcitrat, pH = 5,8 og 2 mg Novozym'234.

Suspensjonen ble inkubert ved 30°C i 30 min., hvoretter cellene ble oppsamlet ved sentrifugering, vasket i 10 ml 1,2 M sorbitol og 10 ml CAS (1,2 M sorbitol, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris HC1 (Tris = Tris(hydroksymetyl)aminometan) pH = 7,5) og igjen suspendert i 2 ml CAS. For transformasjon ble 0,1 ml av de CAS-resuspenderte cellene blandet med ca. 1 (ig av plasmidet pKFN374 og hensatt ved romtemperatur i 15 min.. 1 ml (20% polyetylenglykol 4000, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris HC1, pH = 7,5) ble tilsatt, og blandingen ble hensatt i ytterligere 30 min. ved romtemperatur. Blandingen ble sentrifugert, og det utsentrifugerte materialet ble resuspendert i 0,1 ml SOS (1,2 M sorbitol, 33% volum/volum YPD, 6,7 mM CaCl2, 14Mg/ml leucin) og inkubert ved 30°C i 2 timer. Suspensjonen ble så sentrifugert, og det utsentrifugerte materialet ble igjen suspendert i0,5 ml 1,2 M sorbitol. Deretter ble 6 ml toppagar (SC-mediet fra Sherman et al., (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) inneholdende 1,2 M sorbitol og 2,5% agar) tilsatt ved 52°C, og suspensjonen ble helt på toppen av plater som inneholdt samme stivnede agar og som inneholdt sorbitol. Transformante kolonier ble plukket ut etter 3 døgn ved 30°C, igjen isolert og brukt for å starte væskeku1turer. Én slik transformant KFN322 ble valgt for ytterligere karakte-risering.

Gjærtypen KFN322 ble dyrket på et YPD-medium (1% gjær-ekstrakt, 2% pepton (fra Difco Laboratories) og 2% glukose). En 10 ml kultur av denne rasen ble ristet ved 30°C til en O.D. ved 600 nm på 32. Etter sentrifugering ble supernatanten analysert ved hjelp av FPLC ioneutbyttingskromatografi. Gjær supernatanten ble filtrert gjennom et 0,22/xm Millex'GV filter og 1 ml ble påsatt en MonoS kationutbyttingskolonne (0,5 x 5 cm) ekvilibrert med 20 mM Bicine, pH 8,7. Etter vasking med ekvilibreringsbufferen ble kolonnen eluert med en lineær NaCl-gradient (0-1 M) i ekvilibreringsbufferen. Trypsininhibitoraktivitet ble kvantifisert i de eluerte fraksjoner ved en spektrofotometrisk analyse og ytterligere ved integrasjon ved hjelp av absorpsjonen ved 280 nm fra 1%

E2ao(aprotinin) =8,3

Utyttet var ca. 3 mg/liter av aprotinin(3-58).

For aminosyreanalyse og N-terminalsekvensering ble gjær-supernatanten (7 ml) justert til pH 8,7 med 0,1 M NaOH og filtrert (0,22Atm). Den utløpende væske fra Q-Sepharoseanion-bytterkolonnen (1x4 cm) ekvilibrert med 20 mM Bicine, pH8,7, ble satt på en MonoS-kationutbyttingskolonne (0,5 x 5 cm). Kationbytterkromatografien ble utført som beskrevet ovenfor. Konsentrasjon av den gradienteluerte aprotinin(3-58) ble utført ved rekromatografi på MonoS og eluering med en steilere NaCl-gradient. De oppsamlede fraksjoner ble ytterligere konsentrert ved vakuumsentrifugering til ca. 100 jul og påsatt en RP-HPLC-kolonne (Vydac C4, 4,6 x 250 mm). Eluering ble utført med en CH3CN-gradient i 0,1% TFA. De oppsamlede fraksjonene ble konsentrert til ca. 100/il ved vakuumsentrifugering, og det ble tatt ut prøver for N-terminalsekvensering og aminosyreanalyse.

Ved N-terminalsekvensering fant man følgende sekvens:

som bekrefter at den N-terminale enden er korrekt.

Aminosyreanalysen er vist i den følgende tabell 1. Detfremgår av denne tabellen at produktet hadde den forventede aminosyresammensetningen, dvs. minus Arg og Pro. Det svakt senkede innholdet av Ile kan sannsynligvis tilskrives en ufullstendig hydrolyse av Ile(18)-Ile(19) (noe som er velkjent i genteknologien). Videre er Pro og Arg noe høyere enn for-ventet. Dette er imidlertid også tilfelle med aprotinin (tabell 1, andre kolonne).

Ved hjelp av ovenfornevnte fremgangsmåte til Erlanger et al. fant man ved en sammenligning at den spesifikke aktiviteten for aprotinin(3-58) var identisk innenfor den eksperimen-telle feilen med den spesifikke aktivitet man har for naturlig aprotinin.

Eksempel 2

Fremstilling av aprotinin( 3- 58, 42 Ser).

Et syntetisk gen for aprotinin(3-58,42 Ser) ble konstruert som beskrevet i eksempel 1. For å erstatte Arg(42) med Ser ble de følgende oligonukleotider Vila og Villa brukt istedenfor VII og VIII:

Det fremstilte syntetiske genet er vist på fig. 4. Dette genet ble smeltet sammen med MFal-signal-leder(1-85) sekvensen og ble klonet i et pUC19 avledet plasmid pKFN306 (se fig.2).

Ved å bruke den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 1, fikk man fremstilt et plasmid pKFN375 som inneholdt følgende konstruksjon

TPIp-MFotl-signal-leder (1-85) -aprotinin(3-58,42 Ser)-TPIT

hvor aprotinin(3-58,42 Ser) er det syntetiske genet som koder for et aprotininderivat som mangler de to første aminosyrerestene, og som inneholder en Ser-gruppe istedenfor Arg i stilling 42.

Gjærtypen MT663 ble transformert med plasmidet pKFN375 som beskrevet ovenfor, og en dyrking av den transformerte rasen KFN324 ga ca. 12 mg/liter av aprotinin(3-58,42 Ser).

Den N-terminale sekvenseringen ble utført som beskrevet ovenfor og bekreftet den følgende N-terminale sekvensen Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Tyr-Thr-Gly-Pro-Cys-Lys-Ala-Arg-Ile-Ile-Arg-Tyr-Phe

dvs. den korrekte sekvensen.

Aminosyreanalysen er vist i tabell 1 og bekrefter den forventede aminosyresammensetning, dvs. mindre Pro og Arg og mer Ser (se også de ovennevnte bemerkninger i eksempel 1).

Ved hjelp av ovennevnte fremgangsmåte til Erlanger et al. sammenlignet man den spesifikke aktiviteten .for aprotinin(3-58,42 Ser) og fant at den var identisk innenfor den eksperi mentelle feilmargin, med den spesifikke aktiviteten for naturlig aprotinin.

Eksempel 3

Fremstilling av aprotininf1- 58)

Den syntetiske dupleksen som er vist på fig. 5 ble bundet til 330 bp EcoRI-Hgal-fragmentet fra plasmid pKFN9 som koder for MFal signal- og ledersekvensen og til 144 bp Avall-Xbal-fragmentet fra pKFN305 og til det store EcoRI-Xbal-fragmentet fra pUC19.

Sammenbindingsblandingen ble brukt for å transformere en kompetent E^. coli-rase (r'm<+>) som gir ampicillinresistens. Sekvensering av et<32>P-merket Xbal-EcoRI-fragment viste at plasmidene fra de resulterende kolonier inneholdt den korrekte DNA-sekvens for aprotinin(1-58).

Et plasmid pKFN414 ble valgt for ytterligere bruk. Konstruksjonen av dette plasmidet er vist på fig. 5.

Ved å følge den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 1, fikk man fremstilt et gjærplasmid pKFN418 som inneholdt følgende konstruksjon: TPIp-MFal-signal-leder(1-85)-aprotinin(1-58)-TPIT

Gjærtypen MT663 ble transformert med plasmidet pKFN418 som beskrevet ovenfor. Dyrking av den transformerte rasen KFN385 ga ca. 1-13 mg/l av aprotinin(1-58).

Når man sammenlignet ved hjelp av ovennente fremgangsmåte til Erlanger et al., den spesifikke aktiviteten for aprotinin(1-58) fremstilt som beskrevet i dette eksempel, så var denne aktiviteten identisk innenfor den eksperimentelle feilmarginen med den spesifikke aktiviteten man har for naturlig aprotinin.

Ekserne1 4

Fremstilling av aprotnind- 58, 42 Ser)

Et plasmid pKFN416 inneholdende et gen for aprotinin(1-58,42 Ser) ble konstruert fra pKFN306 som beskrevet i eksempel 3. Ved å bruke den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 1, fikk man fremstilt et gjærplasmid pKFN420 som inneholdt følgende konstruksjon:

TPIp-MFal-signal-leder(1-85)-aprotinin(1-58,42 Ser)-

TPIT

Gjærtypen MT663 ble transformert med plasmidet pKFN420 som beskrevet ovenfor. Dyrking av den transformerte stammen KFN387 ga ca. 1-13 mg/l av aprotinin(1-58,42 Ser).

Ved hjelp av ovennevnte fremgangsmåte til Erlanger et al. sammenlignet man den spesifikke aktiviteten for aprotinin(1-58,42 Ser) og fant at denne var identisk innenfor den eksperimentelle feilkilde, med den spesifikke aktiviteten for naturlig aprotinin.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktivt aprotinin eller homologer derav i gjær,karakterisert veddyrkning av en gjærstamme som inneholder en replikerbar ekspresjonsvektor, idet vektoren omfatter en DNA-sekvens som koder for aprotinin eller en aprotininhomolog kondensert til en DNA-sekvens som koder for et signal- og leder-peptid som gir sekresjon av aprotininet eller aprotininhomologen, i et egnet næringsmedium, og utvinning av det utskilte aprotinin eller aprotininhomologen derifra.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat DNA-sekvensen som anvendes koder for en aprotininhomolog med følgende formel: X' -aprotinin (3-40) -Y 'n-Z ' m-aprotinin (43-58) hvor X' er Pro eller hydrogen, aprotinin(3-40) er amino-syre-sekvensen fra aminosyre 3 til 40 i naturlig aprotinin, Y' er Lys eller en ikke-basisk aminosyrerest, Z' er Arg eller en ikke-basisk aminosyrerest under den forutsetning at minst én avY'og Z' er en ikke-basisk aminosyrerest, n og m er hver0eller 1, og aprotinin(43-58) er aminosyresekvensen fra aminosyrerest 43 til 58 i naturlig aprotinin.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 og 2, karakterisert vedat DNA-sekvensen som anvendes koder for en aprotinin-homolog hvori X' er hydrogen, Y' er Lys, Z' er Ser, og n og m hver er 1.

4.Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat DNA-sekvensen som anvendes koder for aprotinin(3-58) og har følgende sekvens:

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat DNA-sekvensen som anvendes koder for aprotinin(3-58,42 Ser) og har følgende sekvens

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,

karakterisert vedat DNA-sekvensen som anvendes koder for aprotinin(1-58) og har følgende sekvens 7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat DNA-sekvensen som anvendes koder for aprotinin(1-58,42 Ser) og har følgende nukleotidsekvens

8. Gjærstamme, karakterisert vedat den er transformert med en vektor omfattende en DNA-sekvens som definert i krav 1 kondensert til en DNA-sekvens som koder for et signal- og leder-peptid som gir sekresjon av aprotininet eller aprotininhomologen.