ES2281079T3 - Celula huesped que expresa niveles reducidos de metaloproteasa y metodos de utilizacion de la celula huesped para la produccion de proteinas. - Google Patents
Celula huesped que expresa niveles reducidos de metaloproteasa y metodos de utilizacion de la celula huesped para la produccion de proteinas. Download PDFInfo
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- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6483—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
-
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION TRATA DE NUEVAS CELULAS HUESPED Y DE PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR PROTEINAS. DE FORMA MAS ESPECIFICA LA INVENCION TRATA DE UNA CELULA HUESPED QUE RESULTA UTIL PARA LA EXPRESION DE PROTEINAS HETEROLOGAS, ESTANDO DICHA CELULA HUESPED MODIFICADA GENETICAMENTE CON EL FIN DE QUE EXPRESE UNOS NIVELES SIGNIFICATIVAMENTE REDUCIDOS DE UNA METALOPROTEASA. ADEMAS LA INVENCION TRATA DE UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR UNA PROTEINA HETEROLOGA, INCLUYENDO DICHO PROCEDIMIENTO CULTIVAR LA CELULA HUESPED EN UN MEDIO DE CRECIMIENTO ADECUADO, SEGUIDO DE LA RECUPERACION DE LA PROTEINA DESEADA.
Description
Célula huésped que expresa niveles reducidos de
metaloproteasa y métodos de utilización de la célula huésped para la
producción de proteínas.
La presente invención se refiere a células
huéspedes nuevas y a métodos para la producción de proteínas. Más
específicamente la invención se refiere a una célula huésped de
Aspergillus útil para la expresión de proteínas heterólogas. Además
la invención se refiere a un método para producir una proteína
heteróloga, este método comprende el cultivo de la célula huésped en
un medio de crecimiento adecuado, seguido de la recuperación de la
proteína deseada.
El uso de células huéspedes recombinantes en la
expresión de proteínas heterólogas ha simplificado en los últimos
años inmensamente la producción de cantidades grandes de proteínas
comercialmente valiosas, que por otra parte son obtenibles sólo por
la purificación de sus fuentes nativas. Habitualmente, hay una
selección variada de sistemas de expresión a partir de los cuales
hacer la elección para la producción de cualquier proteína dada,
incluso de huéspedes eubacterianos y eucarióticos. La selección de
un sistema de expresión apropiado frecuentemente no sólo depende de
la capacidad de la célula huésped para producir rendimientos
adecuados de la proteína en un estado activo, sino que también en
gran parte puede ser determinada por el uso final pretendido de la
proteína.
Un problema frecuentemente encontrado es el
nivel alto de enzimas proteolíticas producido por una célula
huésped dada o en el medio de cultivo. Se ha sugerido que se podría
proporcionar un organismo huésped privado de la capacidad de
producir compuestos proteolíticos específicos. Por ejemplo, la
solicitud de patente internacional WO 90/00192 describe huéspedes
filamentosos fúngicos incapaces de excretar una proteinasa aspártica
enzimáticamente activa. Aspergillus awamori carente de una
proteína aspártica y fue usado para expresar quimosina bovina dando
como resultado una expresión aumentada por un factor dos en
comparación con la cepa y EP 574 347 describe huéspedes de
Aspergillus carentes de una serina proteasa del tipo
subtilisina.
Las metaloproteasas han sido aisladas de varias
fuentes eucarióticas. Las metaloproteasas neutras, es decir
metaloproteasas que tienen actividad óptima a pH neutro, aisladas de
cepas de Aspergillus también han sido proporcionadas. Las
metaloproteasas neutras han sido clasificadas en dos grupos. Npl y
NplI [Sekine; Agric. Biol. Chem. 1972 36
207-216]. Recientemente la secuencia de nucleótidos
de ADNc de una metaloproteasa neutra II de Aspergillus
oryzae ha sido descrita [Tatsumi H, Murakami S, Tsuji R F,
Ishida Y, Murakami K, Masaki A, Kawabe H, Arimura H, Nakano E y
Motel H; Mol. Gen. Genet. 1991 228 97-103]- la
secuencia de nucleótidos de ADNc de una metaloproteasa neutra I de
Aspergillus oryzae nunca había sido descrita.
Aunque las metaloproteasas habían sido
descritas, su papel en relación con la reducción de la estabilidad
de los productos obtenidos a partir de estos organismos nunca había
sido descrito.
Según la presente invención se ha encontrado
ahora que las metaloproteasas neutras de Aspergillus pueden reducir
significativamente la estabilidad del producto obtenido por una
célula.
En consecuencia, la presente invención
proporciona una célula huésped de Aspergillus útil para la
expresión de un producto proteico heterólogo, esta célula ha sido
genéticamente modificada para expresar significativamente niveles
reducidos de una metaloproteasa, NplI, con actividad óptima
proteolítica en la gama de pH 6-8, en comparación
con la célula parental.
En otro aspecto, la invención proporciona un
método para producir un producto proteico heterólogo en una célula
huésped de la invención, este método comprende la introducción en
la célula huésped de una secuencia de ácidos nucleicos que
codifican la proteína, el cultivo de la célula huésped en un medio
de crecimiento adecuado, y el aislamiento del producto proteico
heterólogo.
Con el método de la invención, la acción
proteolítica que surge de NplI metaloproteasa NplI ha sido
significativamente reducida, mejorando de ese modo la estabilidad
de la proteína obtenida por el método. Además, la proteína obtenida
por el método de la invención puede ser obtenido como una proteína
precursora, es decir un zimógeno, una proteína híbrida, una proteína
obtenida como una secuencia pro o secuencia prepro, o en forma no
madurada.
La presente invención está ilustrada con más
detalle en referencia a los dibujos anexos, donde:
Fig. 1 muestra un mapa del plásmido PSO2, cf.
ejemplo 1;
Fig. 2 muestra la construcción de la cepa
HowB101 de Aspergillus oryzae, cf. ejemplo 1;
Fig. 3 muestra la construcción del plásmido
PJaL218, cf. ejemplo 4; y
Fig. 4 muestra un mapa del plásmido PToC56, cf.
ejemplo 3.
La presente invención proporciona una célula
huésped de Aspergillus útil para la expresión de proteínas
heterólogas, esta célula, cuando se compara con la célula parental,
ha sido genéticamente modificada para expresar niveles
significativamente reducidos de una metaloproteasa neutra de
Aspergillus, NplI, que tiene actividad óptima proteolítica en la
gama de pH 6-8.
La célula parental es la fuente de dicha célula
huésped. Puede ser una célula tipo salvaje. De forma alternativa,
además de una reducción a nivel de la metaloproteasa neutra, puede
ser genéticamente alterada en otro aspecto.
Para producir la proteína deseada, la célula
huésped de la invención obviamente debe soportar regiones genéticas
estructurales (es decir regiones que comprenden las secuencias de
nucleótidos codificantes) y reguladoras (es decir regiones que
comprenden secuencias de nucleótidos necesarias para p. ej. la
transcripción, la traducción y la terminación) necesarias para la
expresión del producto deseado. La naturaleza de este tipo de
regiones estructurales y reguladoras depende en gran medida del
producto y de la célula huésped en cuestión. El diseño genético de
la célula huésped de la invención puede ser realizado por un
experto en la técnica, usando la tecnología del ADN recombinante
estándar para la transformación o transfección de una célula
huésped [véase p. ej. Sambrook et al.; Molecular
Cloning, Cold Spring Harbor. NY, 1989].
Preferiblemente, la célula huésped es modificada
por métodos conocidos en la técnica para la introducción de un
vehículo de donación apropiado, es decir un plásmido o un vector,
que comprende un fragmento de ADN que codifica el producto deseado.
El vehículo de donación puede ser introducido en la célula huésped
bien como un plásmido que se replica de manera autónoma o integrado
en el cromosoma. Preferiblemente el vehículo de clonación comprende
una o más regiones estructurales operativamente enlazadas a una o
más regiones reguladoras apropiadas.
Las regiones estructurales son regiones que
soportan secuencias de nucleótidos que codifican el producto
deseado. Las regiones reguladoras incluyen regiones del promotor
que comprenden secuencias de control de la transcripción y de la
traducción, las regiones del terminador que comprenden señales de
parada, y regiones de poliadenilación. El promotor, es decir una
secuencia de nucleótidos que presenta una actividad transcripcional
en la célula huésped de elección, puede ser un derivado de un gen
que codifica una proteína extracelular o intracelular,
preferiblemente una enzima, tal como una amilasa, una glucoamilasa,
una proteasa, una lipasa, una celulasa, una xilanasa, una
oxidorreductasa, una pectinasa, una cutinasa, o una enzima
glicolítica. Ejemplos de promotores adecuados para la transcripción
en una célula huésped fúngica son promotores derivados del gen que
codifica la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae,
\alpha-amilasa neutra de Aspergillus Niger, \alpha-amilasa estable ácida de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamsii (gluA), acetamidasa de Aspergillus niger, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizopus meihei, y lipasa de Rhizopus meihei. Preferidos son los promotores de la TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae y de la gluA de Aspergillus awamsii.
\alpha-amilasa neutra de Aspergillus Niger, \alpha-amilasa estable ácida de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamsii (gluA), acetamidasa de Aspergillus niger, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizopus meihei, y lipasa de Rhizopus meihei. Preferidos son los promotores de la TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae y de la gluA de Aspergillus awamsii.
El vehículo de clonación puede también
comprender un marcador seleccionable, p. ej- un gen, cuyo producto
complementa un defecto en la célula huésped, o uno que confiere
resistencia a los antibióticos, tal como resistencia a la
ampicilina, a la canamicina, al cloranfenicol o a la tetraciclina.
Ejemplos de marcadores de la selección de Aspergillus
incluyen amdS, pyrG, argB, niaD y sC, un marcador que
da lugar a la resistencia a la higromicina. Preferidos para el uso
en una célula huésped de Aspergillus son los marcadores amdS
y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus
oryzae. Un marcador mamífero frecuentemente usado es el gen
dihidrofolato reductasa (DHFR). Además, la selección puede ser
realizada por cotransformación.
Los procedimientos usados para enlazar el
constructo de ADN de la invención, el promotor, terminador y otros
elementos, respectivamente, y para insertarlos en vehículos de
clonación adecuados conteniendo la información necesaria para la
replicación, son conocidos por los expertos en la técnica [véase p.
ej. Sambrook et al.; Molecular Cloning, Cold
Spring Harbor. NY, 1989].
La célula huésped de la invención puede ser
cualquier célula huésped de Aspergillus usada de forma convencional
para la expresión heteróloga de proteínas.
En una forma de realización preferida, el hongo
Aspergillus es una cepa seleccionada del grupo que consiste en
Aspergillus oryzae, Aspergillus Niger, Aspergillus nidulans,
Aspergillus awamori, Aspergillus phoenicis, Aspergillus japonicus,
Aspergillus foetus.
El producto final deseado, es decir la proteína
heteróloga expresada por la célula huésped de la invención, puede
ser cualquier proteína eubacteriana o eucariótica.
Tal y como se define aquí, un "producto
proteico heterólogo" es una proteína que no es nativa de la
célula huésped, o una proteína nativa en la que se han hecho
modificaciones para alterar la secuencia nativa, o una proteína
nativa cuya expresión es alterada de forma cuantitativa como
resultado de una manipulación de una secuencia nativa reguladora
requerida para la expresión de la proteína nativa, tal como un
promotor, un centro de unión del ribosoma, etc., u otra
manipulación de la célula huésped por técnicas de ADN
recombinante.
Debido a la ausencia de metaloproteasa neutra,
la proteína heteróloga expresada por la célula huésped puede
también ser una proteína precursora, es decir un zimógeno, una
proteína híbrida, una proteína obtenida como una secuencia pro o
secuencia pre-pro, o en forma no madurada. En una
forma de realización preferida el producto es una enzima.
En una forma de realización más específica, el
producto es una enzima eucariótica, tal como insulina, hormona del
crecimiento, glucagón, somatostatina, interferón, PDGF, factor VII,
factor VIII, uroquinasa, EPO, quimosina, activador del tejido
plasminógeno, o albúmina de suero.
En otra forma de realización preferida, el
producto es una enzima fúngica, de levadura, o de origen
bacteriano.
Preferiblemente la enzima es una enzima de
glicosidasa, p. ej. una amilasa, en particular una
\alpha-amilasa (EC 3.2.1.1), una
\beta-amilasa (EC 3.2.1.2), una glucan
1,4-\alpha-glucosidasa (EC
3.2.1.3), una celulasa (EC 3,2.1.4), una
endo-1,3(4)-\beta-glucanasa
(EC 3.2.1,6), un
endo-1,4-\beta-glucanasa
(EC 3.2.1.8), una poligalacturonasa (EC 3,2.1.15), una
\alpha-glucosidasa (EC 3.2.1.20), una
\beta-glucosidasa (EC 3.2.1.21), una
\alpha-galactosidasa (EC 3.2.1.22), una
\beta-galactosidasa (EC 3.2.1.23), una
xilan-endo-1,3-\beta-xilosidasa
(EC 3.2.1.32), una
endo-1,3-\beta-glucanasa
(EC 3.2.1.39), una
endo-1,3-\alpha-glucanasa
(EC 3.2.1.59), una
endo-1,2-\beta-glucanasa
(EC 3.2.1.71), una
endo-1,6-8-glucanasa
(EC 3,2.1.75), una
celulosa-1,4-\beta-celobiosidasa
(EC 3.2.1.91, también conocidas como celobiohidrolasas).
En otra forma de realización preferida la enzima
es una enzima lipolítica, en particular una lipasa, una esterasa,
una fosfolipasa, o una liso-fosfolipasa.
En una tercera forma de realización preferida la
enzima es una fitasa, en particular una 3-fitasa
(EC 3.1.3.8) o una 6-fitasa (EC 3.1.3.26).
En una cuarta forma de realización preferida la
enzima es una enzima proteolítica.
En una quinta forma de realización preferida la
enzima es una oxidorreductasa, tal como una peroxidasa o una
lacasa, una pectinasa, o una cutinasa.
Polipéptidos preferidos híbridos son
proquimosina y proteasas tipo pro-tripsina.
En el contexto de esta invención una
metaloproteasa es una enzima proteolítica que contiene un centro
metálico de zinc catalítico que participa en la hidrólisis del
esqueleto peptídico. El centro de zinc activo diferencia a estas
proteasas de las calpainas, cuyas actividades son dependientes de la
presencia de calcio. La confirmación de una proteasa como una
metaloproteasa es la pérdida de actividad proteolítica realizada por
eliminación del centro de zinc. El centro de zinc puede ser
eliminado con 1,10-fenantrolina (1 mM). Después de
la titulación con Zn^{2+} (0,1-100 \muM), la
actividad proteolítica es restaurada.
En una forma de realización preferida, la
metaloproteasa contemplada en el contexto de esta invención es una
metaloproteasa neutra, que es una metaloproteasa que posee
actividad óptima proteolítica en la región del pH neutro, es decir
en la gama de aproximadamente pH 6-8,
preferiblemente la gama de aproximadamente pH
6.5-7.5, alrededor de pH 7.
Más particularmente, la metaloproteasa
contemplada en el contexto de esta invención es una metaloproteasa
neutra de Aspergillus de grupo NplI.
La célula huésped de la invención, genéticamente
modificada para expresar niveles significativamente reducidos de
una metaloproteasa neutra puede ser modificada usando la tecnología
del ADN recombinante estándar, conocida por el experto en la
técnica. La secuencia de genes responsable de la producción de la
metaloproteasa puede ser inactivada o eliminada en su
totalidad.
En una forma de realización particular, la
célula huésped de la invención es una modificada genéticamente en
las regiones estructurales o reguladoras que codifican la
metaloproteasa. Las técnicas conocidas y útiles incluyen, pero no
se limitan a, mutagénesis específica o aleatoria, mutagénesis
generada por PCR, deleción, inserción y/o sustitución del ADN sitio
específico, técnicas de interrupción génica o de sustitución
génica, técnicas antisentido, o una combinación de éstas.
La mutagénesis puede ser realizada usando un
agente mutagenizante físico o químico adecuado. Ejemplos de un
agente mutagenizante físico o químico adecuado para el presente
objetivo incluye irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil
metano sulfonato (EMS), bisulfito sódico, ácido fórmico, y análogos
del nucleótido. Cuando estos agentes son usados, la mutagénesis es
normalmente realizada incubando la célula para ser mutagenizada en
presencia del agente mutagenizante de elección bajo condiciones
adecuadas para que ocurra la mutagénesis, y seleccionando las
células mutadas que tienen una producción significativamente
reducida de metaloproteasa.
La modificación puede también ser realizada por
introducción, sustitución o eliminación de uno o más nucleótidos en
la secuencia de codificación de la metaloproteasa o un elemento
regulador requerido para la transcripción o traducción de la misma.
Los nucleótidos pueden, p. ej., ser insertados o eliminados para
resultar en la introducción de un codón de detención, la
eliminación del codón de iniciación o un cambio en el marco de
lectura abierto. La modificación o inactivación de la secuencia
estructural o un elemento regulador puede ser realizada por
mutagénesis dirigida o mutagénesis generada por PCR conforme a
métodos conocidos en la técnica. Aunque en principio, la
modificación puede ser realizada in vivo, es decir
directamente en la célula que lleva el gen de la metaloproteasa, se
prefiere actualmente la realización de la modificación in
vitro.
Un modo conveniente de inactivar o reducir la
producción de la metaloproteasa de una célula huésped de elección
se basa en los principios de interrupción génica. Este método
conlleva el uso de una secuencia de ADN correspondiente al gen
endógeno o fragmento del gen que se desea destruir. Dicha secuencia
de ADN es mutada in vitro a un gen defectuoso y transformado
en la célula huésped. Por recombinación homóloga, el gen defectuoso
reemplaza el gen endógeno o fragmento de gen. Puede ser deseable
que el gen defectuoso o fragmento de gen codifique un marcador que
pueda ser usado para la selección de transformantes donde el gen que
codifica la metaloproteasa ha sido modificado o destruido.
De forma alternativa, la modificación o
inactivación de la secuencia de ADN puede ser realizada usando
técnicas antisentido establecidas usando una secuencia de
nucleótidos complementaria a la secuencia de codificación de la
metaloproteasa.
Debido a la modificación genética, la célula
huésped de la invención expresa niveles de metalproteasas
significativamente reducidos. En una forma de realización preferida
el nivel de metaloproteasa expresado por la célula huésped es
reducido más de aproximadamente el 50%, preferiblemente más de
aproximadamente el 85%, más preferido más de aproximadamente el 90%,
aún más preferido más de aproximadamente el 95%. En una forma de
realización más preferida, el producto expresado por la célula
huésped está esencialmente libre de cualquier actividad
metaloproteasa.
En otro aspecto, la invención proporciona un
método para producir proteínas (es decir polipéptidos y/o
proteínas), este método comprende el cultivo de la célula huésped
de la invención en un medio de crecimiento adecuado, seguido de la
recuperación del producto deseado.
Con el método de la invención, la acción
proteolítica de la metaloproteasa neutra, NplI, ha sido
significativamente reducida, de ese modo mejorando la estabilidad
del producto obtenido. Además, debido a la ausencia de
metaloproteasa, la proteína heteróloga expresada por la célula
huésped puede ser obtenida como una proteína precursora, es decir
un zimógeno, una proteína híbrida, una proteína obtenida como una
secuencia pro o secuencia pre-pro, o en forma no
madurada.
El caldo o medio usado para el cultivo puede ser
cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer la célula
huésped en cuestión, y puede estar compuesto según los principios
de la técnica anterior. El medio preferiblemente contiene fuentes
de nitrógeno y carbono y otras sales inorgánicas. Los medios
adecuados, p. ej. medios mínimos o complejos, están disponibles por
proveedores comerciales, o pueden ser preparados según recetas
publicadas, p. ej. el catálogo de cepas de la American Type Culture
Collection (ATCC).
Después del cultivo, la proteína es recuperada
por el método convencional para el aislamiento y purificación de
las proteínas de un caldo de cultivo. Los procedimientos de
purificación bien conocidos incluyen la separación de las células
del medio por centrifugado o filtración, precipitación de los
componentes proteicos del medio mediante una sal tal como sulfato de
amonio, y métodos cromatográficos tales como p. ej. la
cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de filtración
en gel, cromatografía de afinidad, etc.
La invención está posteriormente ilustrada con
referencia a los ejemplos siguientes que no están destinados a ser
de ninguna manera limitadores del objetivo de la invención según
está reivindicado.
IFO 4177 de Aspergillus oryzae,
disponible por Institute for Fermentation, Osaka,
17-25 Juso Hammachi 2- Chome
Yodogawa-Ku, Osaka, Japón.
DH5a de Escherichia coli, Hanahan D, J. Mol.
Biol. 1983 166 557.
\vskip1.000000\baselineskip
NplI, gen que codifica la Metaloproteasa II
Neutra.
pyrG: gen que codifica la
orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa,
una enzima implicada en la biosíntesis de uridina.
\vskip1.000000\baselineskip
pUC118; Yanish-Perron et
al., 1985 Gene 33 103.
pSO2; la construcción de este plásmido está
descrita en el ejemplo 1.
pJers4; un subclón de pSO2.
pSO5; construcción de este plásmido a partir de
pS02 está descrita en el ejemplo 1.
pJaL198; la construcción de este plásmido a
partir de pJaL198 está descrita en el ejemplo 1.
pJaL218: la construcción de este plásmido a
partir de pJaL218 está descrita en el ejemplo 2.
p3SR2; Kelly J M y Hynes M J, EMBO
Journal 1985 4 475-479.
pToC90; un subclón de p3SR2.
pToC56; la construcción de este plásmido está
descrita en EP 238,023 B.
pCR^{TM} II; Disponible por Invitrogen
Corporation, San Diego, CA, EEUU.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
A partir de la secuencia de nucleótidos de ADNc
publicada que codifica NplI de Aspergillus oryzae
[Tatsumi et al.: mol. Gen. Genet. 1991 228
97-103], dos oligonucleótidos fueron diseñados de
modo que la parte de codificación del gen NplI fue amplificada en
una reacción PCR.
Un cebador
(CTAGGATCCAAGGCATTTATGCGTGTCACTACTCTC; SEC ID NO: 7) fue
construido de modo que el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos
corresponda con la parte N-terminal del gen NplI
(subrayado), y el extremo 5' es para facilitar la clonación
(contiene un sitio de la endonucleasa de restricción BamHI).
Un cebador
(CTACTCGAGTTAGCACTTGAGCTCGATAGC; SEC ID NO: 8) fue
construido de modo que el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos
corresponda con la parte C terminal del gen NplI (subrayado),
y el extremo 5' es para facilitar la clonación (contiene un sitio
de la endonucleasa de restricción XhoI).
El ADN genómico de IFO 4177 de Aspergillus
oryzae fue usado como molde en la reacción PCR. La reacción de
amplificación fue realizada en volúmenes de 100 \mul conteniendo
2,5 unidades de Taq-polimerasa, 100 ng de ADN
genómico de Aspergillus oryzae, 50 mM de KCl, 10 mM de
tris-HCl pH 8.0, 1,5 mM de MgCl_{2}, 250 nM de
cada dNTP, y 100 pM de cada uno de los dos cebadores anteriormente
descritos.
La amplificación se efectuó en un
Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480, y consistió en
un ciclo de 3 minutos a 94ºC, seguido de 25 ciclos de 1 minuto a
94ºC, 30 segundos a 55ºC, y 1 minuto a 72ºC. La reacción PCR produce
un fragmento de ADN de aprox. 1,1 kb de longitud. Este fragmento
fue aislado por electroforesis en gel, purificado, clonado en el
vector pCR^{TM} II (Invitrogen Corporation), y secuenciado usando
métodos estándar conocidos en la técnica de biología molecular. El
plásmido resultante fue llamado pJaL 198.
Ejemplo
2
Para generar cepas de Aspergillus oryzae
que fueron específicamente deficitarias en la producción de NplI,
una estrategia de sustitución génica como se describe por
Miller et al.: Mol. Cell. Biol. 1985 5
1714-1721, fue empleada.
El gen pyrG de Aspergillus oryzae fue
clonado por hibridación cruzada con el gen pyrG de Aspergillus
Niger [W. van Hartingsveldt et al.: Mol, Gen.
Genet. 1987 206 71-75]. Una biblioteca lambda de
ADN de IFO 4177 de Aspergillus oryzae parcialmente digerido
con SauIIIA fue evaluado a baja astringencia con un fragmento de 1
kb de ADN del gen pyrG de Aspergillus Niger. ADN de un clon
positivo fue subclonado en un vector pUC118. El plásmido resultante,
pS02, demostró contener el gen pyrG por complementación de un pyrG
mutante de Aspergillus Niger, cf. Fig. 1.
Un plásmido de deleción de pyrG, pSOS,
conteniendo aproximadamente 1 kb de secuencias flanqueantes de pyrG
en cada extremo, fue construido a partir del plásmido pSO2. La cepa
IFO 4177 de Aspergillus oryzae fue transformada con este
constructo, y los transformantes fueron seleccionados por
resistencia al ácido
5-fluoro-orótico, una característica
del fenotipo de los mutantes de pyrG. Un transformante, HowB101,
demostró por el análisis de Southern que tenía la deleción prevista
en el locus de pyrG. Siendo un mutante de pyrG. HowB101 requiere
uridina para el crecimiento. HowB101 puede ser transformado con el
gen pyrG tipo salvaje por selección por la capacidad para crecer
sin uridina.
Las fases implicadas en la construcción de
HowB101 están ilustradas en la Fig. 2.
El pásmido pJaL198 es digerido con BstEII y
tratado con polimerasa Klenow para hacer los extremos romos. El
fragmento de 4,9 kb fue aislado por electroforesis en gel y
purificado. Este fragmento de ADN fue luego tratado con fosfatasa
alcalina bacteriana para eliminar los grupos 5' fosfato, según las
instrucciones del fabricante, extraído con fenol y precipitado.
El plásmido pJers4 fue digerido con HindIII y
tratado con polimerasa Klenow para hacer los extremos romos. El
fragmento de 1,8 kb que codifica el gen pyrG de Aspergillus
oryzae fue aislado por electroforesis en gel y purificado.
Los dos fragmentos fueron mezclados y ligados.
Después de las transformaciones de DH5\alpha de E. coli,
las colonias que llevan los plásmidos correctos son identificadas
por digestión con la enzima de restricción de minipreparaciones
plásmidas. La construcción de pJaL218 está ilustrada en la Fig.
3.
pJaL218 consiste en el vector pCR^{TM} II que
contiene un fragmento que lleva el gen NplII flanqueado por sitios
EcoRI, donde el fragmento central BstEII ha sido sustituido por un
fragmento de ADN de 1,8 kb que codifica el gen pyrG de
Aspergillus oryzae.
15 \mug de plásmido pJaL218 es digerido hasta
la terminación por EcoRI. La terminación de la digestión fue
controlada realizando una alícuota en un gel. El resto del ADN fue
extraído con fenol, precipitado y resuspendido en 10 \mul de agua
estéril.
La transformación de la cepa huésped HowB101 de
Aspergillus oryzae fue realizada por el método del
protoplasto [Christensen et al.: Biotechnoloqy
1988 6 1419-1422]. Normalmente, los micelios de
Aspergillus oryzae fueron hechos crecer en un caldo
nutritivo rico. Los micelios fueron separados del caldo por
filtración. Novozyme^{TM} (disponible por Novo Nordisk A/S,
Dinamarca) fue añadida a los micelios en un tampón estabilizante
osmóticamente, 1,2 M de MgSO_{4}, tampón fosfato sódico pH 5.0.
La suspensión fue incubada durante 60 minutos a 37ºC con agitación.
El protoplasto fue filtrado a través de Miracloth para eliminar el
detrito micelial. El protoplasto fue cosechado y lavado dos veces
con STC (1,2 M de sorbitol, 10 mM de CaCl_{2}, 10 mM de
tris-HCl pH 7.5). El protoplasto fue finalmente
resuspendido en 200-1000 \mul de STC.
Para la transformación. Se añadieron 5 \mug de
ADN a 100 \mul de suspensión del protoplasto. Se añadieron 200
\mul de solución PEG (60% PEG 4000,10 mM de CaCl_{2}. 10 mM de
tris-HCl pH 7.5), y la mezcla fue incubada durante
20 minutos a temperatura ambiente. El protoplasto fue cosechado y
lavado dos veces con 1,2 M de sorbitol. El protoplasto fue
finalmente resuspendido 200 \mul 1,2 M sorbitol, colocado en
placas selectivas (medio mínimo + 10 g/l Bacto-agar
(Difco), e incubado a 37ºC.
Después de 3-4 días de
crecimiento a 37ºC, los transformantes estables aparecen como
colonias que crecen enérgicamente y se esporulan.
A partir de colonias estables, las esporas
individuales son alineadas en placas mínimas frescas. Las colonias
individuales son seleccionadas y realineadas para dar cultivos
puros.
Treinta y tres transformantes fueron
seleccionados para ver si el fragmento de ADN transformado se había
integrado por un doble cruzamiento en el gen correspondiente en el
cromosoma por PCR. La reacción PCR y el ADN genómico de los
transformantes fueron realizados según el modo descrito
anteriormente.
Los cebadores usados fueron CCCTTCTTTCCAAACCG
(SEC ID NO: 9), que está localizado en 5' desde la región de la
codificación del gen NplI, y pyrG-5'
(GGGTGAGCCACTGCCTC; SEC ID NO: 10), que es específico para el gen
pyrG. Un transformante dio el producto de PCR previsto en 1,1
kb.
A partir de los análisis de Southern, donde el
ADN genómico del transformante y de Aspergillus oryzae fue
digerido con EcoRI, fraccionado por electroforesis en gel de
agarosa, transferido a filtros de membrana
Immobilan-N, y evaluado con el fragmento EcoRI de
1,1 kb de pJaL1 98 conteniendo el gen NplI, se descubrió que la
banda tipo salvaje en 3,8 kb había sido desplazada a una banda en
el transformante de 10 kb. Esto demuestra que el ADN transformado
se había integrado en el gen NplI en múltiples copias. La cepa fue
designada JaL121.
Ejemplo
3
La cepa JaL121 de Aspergillus oryzae fue
transformada con el plásmido pToC56 (cf. Fig. 4), que es un
plásmido de expresión fúngico para la enzima quimosina de mamífero,
por cotransformación con pToC90. La construcción del plásmido
pToC56 está descrita en EP 98 993 A.
Los transformantes fueron seleccionados por
crecimiento en un medio mínimo que contenía 10 mM de acetamida, y
cribados por presencia de pToC56 por la capacidad de producir
quimosina. Un transformante fue hecho crecer en frascos de
agitación durante 4 días a 30ºC en un medio que contenía
maltodextrina, harina de soja y peptona. Un transformante de pToC56
en IFO 4177 de Aspergillus oryzae fue hecho crecer con el
transformante JaL121.
Cada día, las muestras del caldo de fermentación
fueron recogidas y aplicadas a SDS-PAGE y
transferencia de Western. La membrana de transferencia fue incubada
con el anticuerpo de conejo específico de quimosina, seguido del
anticuerpo de conejo de la cabra acoplado a la peroxidasa.
La coloración de la membrana mostró que en el
primero y en el segundo día de fermentación, los sobrenadantes de
los transformantes de IFO 4177 de Aspergillus oryzae
contenían cantidades pequeñas de quimosina, o productos de
degradación de la misma. Más adelante no se detectó más
quimiotripsina. Por el contrario, los transformantes de JaL121
contenían al menos diez veces el tamaño completo de quimosina. La
cantidad de quimosina en los sobrenadantes aumentó durante los
dos-tres primeros días y luego se mantuvo
constante.
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2052 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Fusarium oxysporum
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: DSM 2672
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLAMIENTO INDIVIDUAL: p45
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: mat_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:785..2049
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sig_péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:55..784
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:364..415
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:802..854
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:1821..1868
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 388 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Fusarium oxysporum
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: DSM 2672
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLAMIENTO INDIVIDUAL: p45
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Fusarium oxysporum
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: DSM 2672
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLAMIENTO INDIVIDUAL: p45
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Thr Tyr Lys Val Tyr Pro Trp Gly Val Asn
Asp Pro Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 747 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus oryzae
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: IFO 4177
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- AISLAMIENTO INDIVIDUAL: Npl
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- descripción de la secuencia: SEC ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGGAAGATCTCTCTGGTACTCTTCGATCTC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGGAGAATTCAAGCTTCTTCTACATCACAGTTTGAAAGC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGGATCCA AGGCATTTAT GCGTGTCACT ACTCTC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTACTCGAGT TAGCACTTGA GCTCGATAGC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCTTCTTTC CAAACCG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTGAGCCA CTGCCTC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Célula huésped de Aspergillus útil
para la expresión de un producto proteico heterólogo, célula que ha
sido modificada genéticamente para expresar niveles
significativamente reducidos de una metaloproteasa neutra de
Aspergillus, NplI, con actividad proteolítica óptima en la
gama de pH 6-8, en comparación con una célula
parental.
2. Célula huésped según la reivindicación 1, que
es una cepa seleccionada del grupo que consiste en Aspergillus
otyzae, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus
awamori, Aspergillus phoenicis, Aspergillus japonicus, Aspergillus
foetus.
3. Célula huésped según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2, que ha sido modificada
genéticamente en las regiones estructurales o reguladoras de
codificación de la metaloproteasa.
4. Célula huésped según la reivindicación 3, que
ha sido modificada genéticamente por mutagénesis específica o
aleatoria. mutagénesis generada por PCR, deleción, inserción y/o
sustitución del ADN sitio específico, técnicas interrupción génica
o de sustitución génica, técnicas antisentido, o una combinación de
éstas.
5. Célula huésped según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en la cual el nivel de
metaloproteasa expresada es reducido más de aproximadamente el 50%,
preferiblemente más de aproximadamente el 85%, más preferido más de
aproximadamente el 90%, aún más preferido más de aproximadamente el
95%.
6. Célula huésped según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, la cual está esencialmente
libre de cualquier actividad metaloproteasa.
7. Método para producir un producto proteico
heterólogo en la célula huésped según la reivindicación 1, dicho
método comprendiendo,
(a) introducir en dicha célula huésped una
secuencia de ácidos nucleicos que codifica dicho producto
proteico;
(b) cultivar en un medio de crecimiento
adecuado, la célula huésped de la fase (a); y
(c) aislar dicho producto proteico
heterólogo.
8. Método según la reivindicación 7, donde la
célula huésped es una cepa seleccionada del grupo que consiste en
Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans,
Aspergillus awamori, Aspergillus phoenicis, Aspergillus japonicus,
Aspergillus foetus.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7-8, donde la célula huésped ha
sido modificada genéticamente en las regiones estructurales o
reguladoras de codificación de la metaloproteasa.
10. Método según la reivindicación 9, donde la
célula huésped ha sido modificada genéticamente por mutagénesis
específica o aleatoria; mutagénesis generada por PCR, deleción,
inserción y/o sustitución del ADN sitio específico, técnicas de
interrupción génica o de sustitución génica, técnicas antisentido,
o una combinación de éstas.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7-10, donde el nivel de
metaloproteasa expresado por la célula huésped es reducido más del
50%, preferiblemente más del 85%, más preferido más del 90%, aun
más preferido más del 95%.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7-10, donde el producto expresado
por la célula huésped está esencialmente libre de cualquier
actividad metaloproteasa.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7-12, donde el producto proteico
es una enzima eucariótica, tal como insulina, hormona del
crecimiento, glucagón, somatostatina, interferón. PDGF, factor VII,
factor VIII, uroquinasa, EPO, quimosina, activador del tejido
plasminógeno, o albúmina de suero.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7-13. donde el producto proteico
es una proteína de origen fúngico.
15. Método según la reivindicación 14, donde el
producto proteico es una enzima fúngica, en particular una enzima
amilolítica, tal como una alfa-amilasa, una
beta-amilasa, una glucoamilasa, una
beta-galactosidasa, una enzima celulítica, una
enzima lipolítica, una enzima xilanolítica, una enzima
proteolítica, una oxidorreductasa, tal como una peroxidasa o una
lacasa, una pectinasa, o una cutinasa.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7-15, donde el producto proteico
es una proteína bacteriana.
17. Método según la reivindicación 16, donde el
producto proteico es una enzima bacteriana, en particular una
enzima amilolítica, tal como una alfa-amilasa, una
beta-amilasa, una glucoamilasa, una
beta-galactosidasa, una enzima celulítica, una
enzima lipolítica, una enzima xilanolítica, una enzima
proteolítica, una oxidorreductasa, tal como una peroxidasa o una
lacasa, una pectinasa, o una cutinasa.
18. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7-17, donde el producto proteico
es una proteína precursora, es decir un zimógeno, una proteína
híbrida, una proteína obtenida como una secuencia pro o secuencia
pre-pro, o en forma no madurada.
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