NO176923B - Fremgangsmåte til seteselektiv genomisk modifikasjon av Pichia pastoris, isolert i serie ordnet linært DNA-fragment og lukket sirkelformet plasmid - Google Patents
Fremgangsmåte til seteselektiv genomisk modifikasjon av Pichia pastoris, isolert i serie ordnet linært DNA-fragment og lukket sirkelformet plasmid Download PDFInfo
- Publication number
- NO176923B NO176923B NO864275A NO864275A NO176923B NO 176923 B NO176923 B NO 176923B NO 864275 A NO864275 A NO 864275A NO 864275 A NO864275 A NO 864275A NO 176923 B NO176923 B NO 176923B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- gene
- dna fragment
- insertable
- fragments
- insertable dna
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 155
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims description 70
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 title claims description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 156
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 108010085336 phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase Proteins 0.000 claims description 8
- 101710194180 Alcohol oxidase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710194173 Alcohol oxidase 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 241000235648 Pichia Species 0.000 abstract description 54
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 abstract description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 17
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 abstract description 9
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 2
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 96
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 39
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 description 26
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 23
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 22
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 20
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 20
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 19
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 19
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- 101150031623 aox gene Proteins 0.000 description 16
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101150006240 AOX2 gene Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010067193 Formaldehyde transketolase Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 101150005709 ARG4 gene Proteins 0.000 description 5
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 4
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 4
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010033128 Glucan Endo-1,3-beta-D-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- 101150041132 AO gene Proteins 0.000 description 1
- 101710191958 Amino-acid acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 101150090155 R gene Proteins 0.000 description 1
- 108030001048 Secondary-alcohol oxidases Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012143 dye reagent concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004540 pour-on Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 108700026215 vpr Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Oppfinnelsen angår rekombinant DNA-teknologi. En side ved oppfinnelsen angår fremgangsmåte til seteselektiv genomisk modifikasjon av Pichia pastoris. En annen side ved oppfinnelsen angår isolert i serie ordnet lineært DNA-fragment. Nok en side ved oppfinnelsen angår lukket sirkelformet plasmid.
Etter hvert som rekombinant DNA-teknologi har utviklet seg
i den senere tid, er den regulerte fremstilling ved hjelp av mikroorganismer av en rekke forskjellige nyttige polypeptider blitt mulig. Mange eukaryotiske polypeptider, f.eks. menneskelig veksthormon, leukosyttinterferoner, menneskelig insulin og menneskelig proinsulin er allerede blitt fremstilt ved forskjellige mikroorganismer. Det ventes at den fortsatte anvendelse av teknikker som allerede beherskes, i fremtiden vil tillate fremstilling ved hjelp av mikroorganismer av en rekke andre nyttige polypeptidprodukter.
Et grunnleggende element som ofte anvendes i rekombinant teknologi, er plasmidet, som er et ekstrakromosomalt, dobbelttrådet DNA som finnes i visse mikroorganismer. Der hvor plasmider
er funnet å eksistere naturlig i mikroorganismer, er de ofte funnet å opptre i flere kopier pr. celle. Foruten naturlig forekommende plasmider er en rekke kunstige plasmider eller hybride vektorer blitt fremstilt av mennesker. Dessverre er det ikke alltid mulig for vertscellen å opprettholde plasmidet.
I stedet går plasmidet tapt når organismen reproduseres og
føres gjennom flere generasjoner vekst. Metoder for den stabile innføring av fremmed DNA i egnede vertsorganismer er derfor av stor interesse og potensielt av stor verdi.
Inntil nå har industrielle anstrengelser med hensyn til anvendelse av rekombinant DNA-teknologi for fremstilling av forskjellige polypeptider konsentrert seg om Escherichia coli som en vertsorganisme. I visse situasjoner kan imidlertid E. coli vise seg å være uegnet som vert. For eksempel inneholder E. coli en rekke giftige pyrogene faktorer som må elimineres
fra et hvilket som helst polypeptid som er nyttig som et
farmasøytisk produkt. Virkningsfullheten med hvilken denne rensing kan oppnås, vil selvsagt variere med det spesielle polypeptid. Dessuten kan de proteolytiske aktiviteter av E. coli i alvorlig grad begrense utbyttene av visse nyttige produkter. Videre har en rekke heterologe genprodukter som er blitt produsert i E. coli, vist seg å bli produsert i uoppløselig form. Disse og andre betraktninger har ført til øket interesse for alternative verter. Særlig er bruken av eukaryotiske organismer for produksjonen av polypeptidprodukter tiltrekkende.
Tilgjengeligheten av midler til fremstillingen av polypeptidprodukter i eukaryotiske systemer, f.eks. gjær, kan by på betydelige fordeler sammenlignet med bruken av prokaryotiske systemer såsom E. coli for fremstillingen av polypeptider som er kodet for ved rekombinant DNA. Gjær er blitt anvendt i fermenteringer i stor skala i århundrer sammenlignet med den relativt nye bruk av E. coli-fermenteringer i stor skala. Gjær kan generelt dyrkes til høyere celletettheter enn bakterier og kan lett tilpasses kontinuerlig fermenteringsbehandling. Dyrkingen av gjær såsom Pichia pastoris til ultrahøye celletettheter, dvs. celletettheter høyere enn 100 g/l, er angitt av Wegner i US-PS 4 414 329. Ytterligere fordeler med gjærverter innbefatter det faktum at mange kritiske funksjoner av organismen, f.eks. oksidativ fosforylering, er anordnet inne i organeller og derfor ikke utsatt for mulige skadelige virkninger forårsaket av organismens produksjon av polypeptider som er fremmede for vertsceller av den ville type. Som en eukaryotisk organisme kan gjær vise seg å være i stand til å glyko-sylere uttrykte polypeptidprodukter, noe som kan vise seg å være av betydning der hvor slik glykosylering er viktig for bioaktiviteten av polypeptidproduktet. Det er også mulig at som en eukaryotisk organisme vil gjæren oppvise de samme kodonpreferanser som høyere organismer og være tilbøyelig til mer effektiv produksjon av ekspresjonsprodukter fra patte-dyrgener eller fra komplementært DNA (cDNA) som fås ved revers-transkripsjon fra f.eks. pattedyr-mRNA.
Utviklingen av dårlig karakteriserte gjærarter som vert/vektor-systemer er i høy grad hindret av mangelen på kunnskap om transformasjonsbetingelser og egnede metoder til stabil in-troduksjon av fremmed DNA i vertscellen. Dessuten er auxotrofe mutasjoner ofte ikke tilgjengelige, hvilket utelukker en direkte utvelgelse for transformanter ved auxotrof komple-menter ing. Dersom rekombinant DNA-teknologi fullt ut skal oppfylle hva den lover, må nye vert/vektor-systemer konstrueres som letter manipuleringen av DNA samt optimaliserer ekspresjonen av innsatte DNA-sekvenser, slik at de ønskede polypeptidprodukter kan fremstilles under regulerte betingelser og med høy utbytte.
En hensikt med oppfinnelsen er derfor en fremgangsmåte til innsetting av DNA i genomet av gjær ved på forhånd utvalgte steder i gjærgenomet.
En annen hensikt med oppfinnelsen er en fremgangsmåte til fremstilling av stabile auxotrofe mutanter av gjær som stort sett ikke kan gjennomgå reversjon.
Nok en hensikt med oppfinnelsen er stabile auxotrofe mutanter som stort sett ikke kan gjennomgå reversjon.
Nok en hensikt med oppfinnelsen er nye DNA-sekvenser som er nyttige for transformasjonen av gjær.
En videre hensikt med oppfinnelsen er produksjonen av alkoholoksidase minus mutant vert for den forbedrede produksjon av heterologe proteiner ved gjær.
Disse og andre hensikter med oppfinnelsen vil fremgå fra beskrivelsen og de tilhørende krav.
I henhold til oppfinnelsen er der utviklet en ny fremgangsmåte for den sete-rettede modifikasjon av genomet av gjær av slekten Pichia. Ved transformasjon av gjær med et lineært DNA-fragment som omfatter ved hver ende insettbare DNA-sekvenser, dvs. sekvenser med homologi for vertsgenomet, som hver er på minst 200 nukleotider i lengde, og minst ett ytterligere DNA-fragment, f.eks. et selekterbart markeringsgen derimellom, blir markeringsgenet og de flankerende innsettbare DNA-sekvenser tatt opp av verten med stor hyppighet. Som et resultat av transformasjonen med dette lineære DNA produseres modifiserte gjærstammer hvor DNA-sekvensen på integrasjonssetet er blitt avbrutt og/eller slettet, og det selekterbare markeringsgen såvel som eventuelt annet DNA innlemmet som en del av det transformerende lineære DNA-fragment, er blitt innlemmet i vertsgjærens genom.
Fremmed DNA innsatt i vertsgjærens genom på den ovenfor be-skrevne måte holdes stabilt gjennom mange generasjoners vekst av verten. Praksisen ifølge den foreliggende oppfinnelse elimi-nerer derved problemet med tap av fremmed DNA på grunn av plasmid-instabilitet når fremmed DNA isteden skaffes som en del av et autonomt-replikerende ekstrakromosomalt fragment eller når fremmed DNA isteden integreres inn i genomet som del av et sirkelformet DNA-molekyl. Slike integrasjoner av sirkelformet DNA-molekyl resulterer i innsettingen av fremmede DNA-sekvenser flankert ved en direkte gjentagelse av verts-genomiske sekvenser inn i vertsgenomet. Da slike direkte repeterende sekvenser er substrater for videre rekombinasjon,
er fremmed DNA som er innsatt mellom de direkte repeterende sekvenser ustabilt.
Den sete-rettede genomiske modifisering ifølge den foreliggende oppfinnelse gjør det mulig å produsere mutanter som mangler alle eller utvalgte partier av spesielle gener. Ved eliminering av betydelige partier av genet hvor en mutasjon ønskes, blir sannsynligheten for reversering av mutasjonen stort sett elimi-nert. De resulterende mutantstammer fremstilt i henhold til oppfinnelsen er således meget stabile mutanter.
Den sete-rettede genomiske modifisering ifølge oppfinnelsen sammen med de in vitro rekombinant DNA-teknikker som er kjent av fagfolk, muliggjør også en rekke forskjellige presise verts-genomiske modifikasjoner, f.eks. tilføyelsen av ett eller flere heterologe gener til vertsgenomet, forandringen av regulerende sekvenser som styrer ekspresjonen av et nativt gen, utskiftningen av et nativt gen med et gen av ikke-nativ opprinnelse og lignende.
Det er overraskende funnet at den metanolinduserte ekspresjon av heterologe gener i Pichia forøkes drastisk ved at der som vert for genekspresjonen anvendes en stamme av Pichia hvor det primære alkoholoksidase-gen av Pichia er blitt avbrutt.
Det er videre funnet at. stammer av organismen Pichia pastoris er et andre alkoholoksidase-gen som tillater en vertsstamme hvor det primære alkoholoksidase-gen er blitt avbrutt å bibe-holde evnen til å vokse på metanol, skjønt med en redusert hastighet i forhold til nativt Pichia pastoris.
Kort beskrivelse av figurene
Fig. 1 er et restriksjonskart av plasmid pYMI1.
Fig. 2 viser innsettingen av et parti av plasmid pYMIl i
HIS4-locuset av Pichia-kromosomet.
Fig. 3 er et restriksjonskart av plasmid pYJ8.
Fig. 4 er et restriksjonskart av plasmid pYMI3a.
Fig. 5 viser innsettingen av et parti av plasmid pYMl3a i
HIS4-locuset av Pichia-kromosomet.
Fig. 6 er et restriksjonskart av plasmid pBPGl-1.
Fig. 7 er et restriksjonskart av plasmid pYMI7.
Fig. 8 viser innsettingen av et parti av plasmid pYMI7 i
alkoholoksidase-locuset av Pichia-kromosomet.
Fig. 9 viser konstruksjonen av plasmid pYM39 fra plasmider
pSA0H5 og pTHBS3.
Fig. 10 viser konstruksjonen av plasmid pYMl6 fra plasmider
pYM39 og pPG3.2.
Fig. 11 viser konstruksjonen av plasmid pBSAGI5I fra plasmid
pYMI6 og pBSAG5I.
Fig. 12 er et restriksjonskart som viser større detaljer av
plasmid pBSAGI5I enn det som er angitt på fig. 11.
Fig. 13 viser innsetinngen av et parti av plasmid pBSAGI5I
i alkoholoksidase-locuset av Pichia-kromosomet.
Fig. 14 er et restriksjonskart av plasmid pYMI12a.
Fig. 15 viser innsettingen av et parti av plasmid pYMI12a
i locuset av det andre Pichia-alkoholoksidase-gen (A0X2). Fig. 16 er et restriksjonskart av Pichia-innføyelsene i de pBR322-baserte plasmider pPG4.0 og pPG3.0. Innføyelsen vist på fig. 16a er fra locuset av det første Pichia-alkoholoksidase-gen (A0X1), mens innføyelsen vist på fig. 16b er fra locuset av det andre Pichia-alkoholoksidase-gen (A0X2). Fig. 16c viser det kjente alkoholoksidase (AOX) kodende parti av A0X1-genlocuset (med henvisning til fig. 16a).
Fig. 17 er et restriksjonskart av plasmid pYM25.
Fig. 18 er et restriksjonskart av plasmid pT76H3.
De følgende forkortelser er brukt i beskrivelsen for å repre-sentere de anvendte restriksjonsenzymer:
På de ledsagende figurer er restriksjonsseter som er anvendt for manipuleringen av DNA-fragmenter, men som ødelegges ved ligatisering, angitt ved at forkortelsen for det ødelagte sete er innesluttet i parenteser.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
I henhold til den foreliggende oppfinnelse er der skaffet en fremgangsmåte til seteselektiv genomisk modifikasjon av Pichia pastoris på et på forhånd bestemt genomisk sete. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at den omfatter å transformere en vertstamme av Pichia pastoris med et serieordnet lineært DNA-fragment som omfatter et første innsettbart DNA-fragment, et selekterbart markørgen, og et andre innsettbart DNA-fragment; idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver tilnærmet 200 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er homologe med separate partier av det native Pichia pastoris genomiske sete hvor genomisk modifikasjon skal skje; idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert med hensyn til hverandre i nevnte lineære DNA-fragment slik de er orientert i Pichia pastoris-genomet og hvor nevnte markørgen er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment og hvor nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter blir valgt fra gruppen som består av fragmenter av; alkoholoksidase-genene, og histidinolhehydrogenasegenet; og eventuelt at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter, et hetereologt gen, hvori nevnte hetereologe gen, såvel som nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment; eller eventuelt at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter, et reguleringsområde, og et hetereologt gen, hvor nevnte hetereologe gen er under kontroll av reguleringsområdet, og hvor reguleringsområdet hetereologe gen - konstruksjonen, i tillegg til nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment .
Det er foretrukket at nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er fragmenter av alkoholoksidasegenet, spesielt AOX 1-genet og AOX 2-genet, og histidinoldehydrogenasegenet.
Videre i henhold til oppfinnelsen er der skaffet et isolert i serie ordnet lineært DNA-fragment som omfatter et første innsettbart DNA-fragment, et selekterbart markørgen og et andre innsettbart DNA-fragment, idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver minst 200 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er homologe med partier av det genomiske DNA i Pichia pastoris, idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er anordnet med hensyn på hverandre i det lineære DNA-fragment slik som de er anordnet i Pichia pastoris-genomet, hvor nevnte markørgen er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment og hvor nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er selektert fra gruppen som består av fragmenter av; alkoholoksidasegenene, og histidinoldehydrogenasegenet; og eventuelt ett av følgende alternativer;
(a) at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter, et hetereologt gen, hvor nevnte hetereologe gen, såvel som nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment, (b) at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter, et reguleringsområde, og et hetereologt gen, idet nevnte hetereologe gen er under kontroll av reguleringsområdet og hvor reguleringsområdet hetereologe genkonstruksjon, i tillegg til nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment, (c) at nevnte DNA-fragment ytterligere omfatter bakteriell plasmid DNA.
De første og andre innsettbare DNA-fragmenter bør hver være på minst 200 nukleotider i lengde, idet lengder generelt i området fra 20 0 inntil 5 000 nukleotider vanligvis anvendes. Fortrinns-vis, for enkel manipulering og håndtering anvendes fragmenter i området 500-2000 nukleotider.
Nukleotidsekvenser som er nyttige som de første og andre innsettbare DNA-fragmenter er nukleotidsekvenser som er homo-
loge med separate partier av det native Pichia genomiske sete hvor genomisk modifisering skal finne sted. Således, dersom f.eks. genomisk modifisering skal finne sted ved locuset av alkoholoksidase-genet, vil de første og andre innsettbare DNA-fragmenter som anvendes, være sekvenser som er homologe med separate partier av alkoholoksidase-genlocuset. For at genomisk modifikasjon i henhold til den foreliggende oppfinnelse skal finne sted, må de to innsettbare DNA-fragmenter være orientert med hensyn til hverandre i det lineære fragment med den samme relative orientering som de har i Pichia-genomet.
De tre minimumskomponenter av det transformerende DNA som anvendes ved utførelse av oppfinnelsen, er ordnet i serie for å danne et lineært DNA-fragment hvor det selekterbare markeringsgen er anordnet mellom det første innsettbare fragment og det andre innsettbare fragment. Eksempler på selekterbare markeringsgener innbefatter ARG4-genet fra Pichia pastoris og Saccharomyces cerevisiae, HIS4-genet fra Pichia pastoris og S.cerevivisiae, G418-fosfotransferase-genet fra det E. coli overførbare element Tn601 og lignende. Fagfolk vil også innse at en rekke egnede flankeringssekvenser, dvs. de første og andre innsettbare DNA-fragmenter, kan avledes fra gener som er blitt isolert fra Pichia pastoris-genomet. Eksempler på gener innbefatter alkoholoksidase-genene (A0X1 og A0X2, Pichia har to alkoholoksidase-gener), dihydroksyacetonsyntase-genet (DAS), argininosuccinatlyase-genet (ARG4), histidinoldehydrogenasegenet (HIS4) og lignende.
De transformerende lineære DNA-fragmenter kan innbefatte en rekke andre DNA-sekvenser som f.eks. heterologe gener, dvs.
et hvilket som helst gen eller parti av et gen som ikke normalt finnes på det locus av genomet hvor innsetting i vertscellen skal finne sted, hvilken ekspresjon ønskes i P. pastoris. Generelt betyr uttrykket heterologt et DNA som ikke er nativt for verts-Pichia-cellen. Det heterologe gen kan eventuelt
kombineres med et reguleringsområde som uavhengig styrer produksjonen av det heterologe genprodukt, eller det heterologe gen kan uttrykkes i den transformerte celle under påvirkning av det native reguleringsområde av genet som er blitt avbrutt
i transformasjonsprosessen.
Dessuten kan det transformerende lineære DNA-fragment som anvendes ved utførelse av den foreliggende oppfinnelse, også innbefatte bakterielt plasmid DNA, som f.eks. pBR322- eller pBR325-sekvenser. Slike bakteriesekvenser er nyttige for in vitro-manipuleringen og produksjonen ved forstørrelse i E. coli av disse DNA-sekvenser.
En spesiell nyttig form for det transformerende lineære DNA er et lukket sirkelformet plasmid som omfatter det lineære DNA-parti som angitt om den isolerte i serie ordnede lineære DNA-fragment, og bakteriell plasmid DNA hvor nevnte bakterielle plasmid DNA er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment.
Det nevnte plasmid er pSA0H5 (NRRL B-15862), pYMl2a, vist i fig. 4, og pYMI7, vist i fig. 7.
I en foretrukket utførelsesform blir det lukkede sirkelformede plasmid konstruert bestående av to partier, "transformasjons"-partiet og "bakterie"-partiet. Transformasjonspartiet omfatter, i rekkefølge anordnet, det første innsettbare DNA-fragment,
det selekterbare markeringsgen og det andre innsettbare DNA-fragment, idet de første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert med hensyn til hverandre på samme måte som de eksisterer i Pichia-genomet, og det selekterbare markeringsgen er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment. Det bakterielle parti er da anordnet slik at det forbinder det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment og derved danner en lukket, sirkelformet vektor.
Den lukkede, sirkelformede vektor fremstilt som beskrevet
i avsnittet ovenfor, kan anvendes til å produsere store mengder plasmid i E. coli, hvilket plasmid deretter isoleres og diges-teres med egnede restriksjonsenzymer for å kløyve transformasjonspartiet fra bakteriepartiet. Det lineære transforma-sjonsparti av gjær-DNA kan deretter anvendes til å transformere stammer av slekten Pichia for å utføre den ønskede genomiske modifikasjon.
Det vil selvsagt være åpenbart for fagfolk at "transformasjons"-partiet av det lukkede, sirkulære plasmid som er beskrevet ovenfor, kan inneholde ytterligere DNA-sekvenser. For eksempel kan de bakteriesekvenser som anvendes in vitro for manipulering og produksjon av DNA ved forstørrelse i E. coli, være en del av det transformerende DNA, dvs. bakterisekvensene kan på
samme måte som sekvensene for de selekterbare markeringsgen-sekvenser også være anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre DNA-fragment. Når en slik konfigura-sjon av DNA komponenter anvendes, vil bakteriesekvensene også bli innlemmet i genomet av vertsgjæren som underkastes fremgangsmåten for genomisk modifikasjon ifølge oppfinnelsen.
Transformasjonen av Pichia pastoris er tidligere blitt beskrevet i den samtidig innleverte søknad nr. 666 5 79 til Stroman et al., overdratt til Phillips Petroleum Company. De eksperi-mentelle fremgangsmåter som anvendes for transformasjonen av Pichia pastoris, er vist i større detalj nedenunder (se eksempel I). Gjærstammer av slekten Pichia kan transformeres ved enzymatisk digestion av celleveggene for å gi sfæroplaster. Sfæroplastene blir deretter blandet med det transformerende
DNA og inkubert i nærvær av kalsiumioner og polyetenglykol, deretter regenerert i selektivt vekstmedium. Det transformerende DNA innbefatter et selekterbart markeringsgen som tillater seleksjon av celler som har tatt opp transformerende DNA,
da bare transformerte celler kan overleve og vokse under de selektive dyrkingsbetingelser som anvendes (de selektive dyrkingsbetingelser er en funksjon av det selektive markeringsgen som anvendes som en del av det transformerende DNA).
Når stammer av Pichia hvor det primære alkoholoksidase-gen (A0X1) ble avbrutt, ble anvendt som verter for ekspresjonen av heterologe gener, ble det overraskende observert at ekspresjonsnivået av de heterologe genprodukter, når de var under styring av visse promotorer (f.eks. A0X1- eller DAS-promotorer), gjennomgikk en mangedobling i forhold til det ekspresjonsnivå som ble oppnådd når en fullt ut alkoholoksidase-kompetent vert ble anvendt. Som et resultat av denne observasjon og ytterligere utforskning av dette fenomen, er det blitt fastslått at en generell metode til å øke ekspresjonsnivået i vertsorganismer av heterologe gener eksisterer, hvilken omfatter dyrking av vertsstammen under ernæringsmessig begrensende betingelser på et substrat for hvilket der eksisterer et område med en sterk promotor som reagerer på substratet, idet det heterologe gen er under regulerende styring av denne sterke, på substrat reagerende promotor.
De "ernæringsmessig begrensende betingelser" som kreves for
den økte genekspresjon ifølge oppfinnelsen, kan skaffes enten ved at cellene mates med begrensende mengder av et nærings-middel eller ved anvendelse av en mutant vert, hvilken, som et resultat av mutasjonen, er ernæringsmessig begrenset under visse vekstbetingelser. Således, f.eks. når det er ønskelig å øke nivået av ekspresjon av heterologe gener som holdes under styring av de sterke alkoholoksidase- eller dihydroksyacetonsyntase-promotorer, som begge reagerer på nærværet av metanol i dyrkingsmediet, vil enten bruken av en vert som er delvis defekt med hensyn til sin evne til å benytte metanol, eller bruken av metanolbegrensede vekstbetingelser sammen med en fullt ut alkoholoksidase-kompetent vert, skaffe de ønskede ernæringsmessig begrensende betingelser slik at forbedret genekspresjon vil oppnås.
Det antas at fremgangsmåten til forbedring av ekspresjonen
av heterologe genprodukter som her er beskrevet, er en generell metode som er nyttig i en hvilken som helst organisme for hvilken promotorer som reagerer på ernæringsmessige begrens-
ninger, eksisterer. Således, ved plassering av et heterologt gen under styring av et slikt promotorområde og deretter dyrking av vertsorganismen under betingelser med ernæringsmessige begrensninger med hensyn til det eller de næringsmidler som bevirker at den sterke promotor blir skrudd på, bør øket genekspresjon finne sted. De for tiden foretrukne metoder til å skaffe ernæringsmessig begrensede vekstbetingelser, er å anvende en mutant vertsorganisme som er delvis defekt i evnen til å metabolisere næringsmidlene, hvilket bevirker at visse promotorer uttrykkes ved meget høyere nivåer enn i den ikke-mutante vert. I Pichia er dette blitt vist som beskrevet i nærmere detalj i eksempel V.
Når en stamme av Pichia pastoris hvor det primære alkoholoksidase-gen ble avbrutt ved fremgangsmåten for genomisk modifikasjon ifølge oppfinnelsen, ble dyrket med metanol som karbonkilde, ble det overraskende funnet at slike stammer som er defekte i det primære alkoholokside-gen, fortsatt var i stand til å vokse på metanol, skjønt med en redusert hastighet i forhold til Pichia-celler av vill type. Denne observasjon antydet det mulige nærvær av et andre alkoholoksidase-gen i metanol som anvender stammer av Pichia.
Sortering av et arkiv av Pichia kromosomalt DNA har ført til isoleringen av et 3 kbp fragment som synes å kode for et parti av et andre alkoholoksidase-gen (A0X2). Dette fragment er blitt deponert som en innføyelse i pBR322 (ved det unike BamHI-sete). Plasmidet er betegnet som pPG3.0, og det bæres av E. coli-verten LE392. Denne stamme er deponert hos the Northern Regional Research Center hos De forente staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois for å sikre offentlig adgang ved utstedelse av den foreliggende søknad som et patent og er blitt gitt aksesjonsnr. NRRL B-18022.
Et restriksjonskart av pPG3.0 er angitt på fig. 16b, hvor det sammenlignes med et genomisk fragment av det primære alkoholoksidase-gen pPG4.0. Det sistnevnte fragment er tidligere blitt angitt og beskrevet i detalj i søkernes samtidig innleverte søknad nr. 666 391 til Stroman et al., overdratt til Philips Petroleum Company. En sammenligning mellom de to alkoholoksidase-gener (se fig. 16) gjør det klart at de to fragmenter er ikke bare overlappende partier av det samme genomiske locus. Der er helt klart en viss homologi mellom de to fragmenter, slik man kan se ved tilstedeværelsen av flere felles restriksjonsseter på de to fragmenter. Restriksjonssetene som er felles for de to gener, A0X1 og A0X2, er angitt på
fig. 16 ved stjerner. Tilstedeværelsen av flere restriksjonsseter på hvert fragment som ikke foreligger på det andre, indikerer imidlertid at der er flere forskjeller mellom frag-mentene på nukleotidnivået.
Oppfinnelsen skal nå beskrives i nærmere detalj under henvisning til de følgende eksempler.
EKSEMPLER
Buffrene og oppløsningene anvendt i de følgende eksempler har de nedenfor angitte sammensetninger:
De følgende forkortelser er brukt i eksemplene med den følgende betydning:
EKSEMPEL I
Pichia pastoris transformasjonsfremgangsmåte
A. Celledyrking
1. Pod en koloni av Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) inn i ca. 10 ml YPD-medium og rist kulturen ved 30°C i 12-
20 timer.
2. Etter 12-20 timer, fortynn cellene til en OD6UU
på 0,01-0,1 og hold cellene i logaritmisk vekstfase i YPD-medium ved 30°C i 6-8 timer. 3. Etter 6-8 timer, pod 100 ml YPD-medium med 0,5 ml av startkulturen ved en OD^qq på ca. 0,1 (eller ekvivalent mengde). Rist ved 30°C i 12-20 timer. 4. Høst kulturen når "ODg00 er 0,2-0,3 (etter 16-20 timer) ved sentrifugering ved 1500 g i 5 min.
B. Fremstilling av sfæroplaster
1. Vask cellene en gang i 10 ml sterilt vann (alle sentrifu-geringer for trinn 1-5 er ved 1500 g i 5 min.).
2. Vask cellene en gang i 10 ml nylig fremstilt SED.
3. Vask cellene to ganger i 10 ml steril 1 M sorbitol.
4. Resuspender cellene i 10 ml SCE-buffer.
5. Tilsett 5-10 ul av 4 mg/ml Zymolase 60.000 (Miles Laboratories). Inkuber cellene ved 30°C i 30-60 min.
Da fremstillingen av sfæroplaster er et kritisk trinn i trans-formasjonsfremgangsmåten, bør dannelsen av sfæroplaster over-våkes som følger: Tilsett 100 ul porsjoner av celler til 900 yl av 5% SDS og 900 yl av 1 M sorbitol før eller like etter tilsetningen av zymolase og ved forskjellige tidspunkter under inkubasjonsperioden. Stopp inkubasjonen ved det punkt hvor cellene lyserer i SDS, men ikke i sorbitol (vanligvis mellom 30 og 60 minutters inkubasjon). 6. Vask sfæroplastene to ganger i 10 ml steril M sorbitol ved sentrifugering ved 1.000 g i 5-10 min (tiden og hastigheten for sentrifugeringen kan variere; sentrifuger tilstrekkelig til å pelletere sfæroplastene, men ikke så mye at de brytes opp ved kraften).
7. Vask cellene en gang i 10 ml sterilt CaS.
8. Resuspender cellene i en samlet mengde på 0,6 ml CaS.
C. Transformasjon
1. Tilsett DNA-prøver (inntil 20 yl volum) til 12 x 75 mm sterile polypropenrør (DNA bør foreligge i vann eller TE-buffer; for maksimale transformasjonshypppigheter med små mengder DNA er det tilrådelig å tilsette ca. 1 yl av 5 mg/ml lydbehandlet (sonicated) E. coli-DNA til hver prøve). 2. Tilsett 10 yl sfæroplaster til hver DNA-prøve, og inkuber ved værelsetemperatur i ca. 20 min. 3. Tilsett 1 ml PEG-oppløsning til hver prøve, og inkuber ved værelsetemperatur i ca. 15 min. 4. Sentrifuger prøvene ved 1.000 g i 5-10 min, og dekanter PEG-oppløsningen. 5. Resuspender prøvene i 150 yl SOS og inkuber i 30 min ved værelsetemperatur. 6. Tilsett 850 yl steril 1 M sorbitol og dann plater av porsjoner av prøver som beskrevet nedenunder.
D. Regenerering av sfæroplaster
1. Oppskrift for regenereringsagarmedium:
a. Agar-KCl: 9 g Bacto-agar, 13,4 g KC1, 240 ml H20, autoklav. b. 10X glukose: 20 dekstrose, 100 ml H20, autoklav. c. 10X SC: 6,75 g gjær-nitrogenbase uten aminosyrer, 100 ml P^O, autoklav (tilsett en hvilken som helst ønsket aminosyre eller nukleinsyre inntil en konsentrasjon på 200 yg/ml før eller etter autoklaving). d. Tilsett 30 ml 10X glukose og 30 ml 10X SC til 240 ml av den smeltede agar/KCl-oppløsning. Tilsett 0,6 ml av 0,2 mg/ml biotin og en hvilken som helst annen ønskelig aminosyre eller
nukleinsyre til en konsentrasjon på 20 ug/ml. Hold smeltet regenereringsagar på 55-60°C.
2. Plating av transformasjonsprøver:
Hell bunnagarlag på 10 ml regenereringsagar pr. plate minst
30 min før transformasjonsprøvene er klare. Fordel 10 ml porsjoner av regenereringsagar på rør i et bad på 45-50°C i løpet av den periode som transformasjonsprøvene er i SOS. Tilsett porsjoner av transformasjonsprøver beskrevet ovenfor til rør med regenereringsagar og hell oppå bunnagarlaget av platene. 3. Bestemmelse av kvaliteten av sfaeroplastfremstilling: Fjern 10 yl av en prøve og fortynn 100 ganger ved tilsetning til 990 yl av 1 M sorbitol. Fjern 10 yl av oppløsningen som er fortynnet 100 ganger, og fortynn ytterligere 100 ganger ved tilsetning til en andre 990 yl porsjon av 1 M sorbitol. Stryk ut på agarplater 100 pl av begge fortynninger inneholdende YPD-medium for å bestemme konsentrasjonen av ikke-sfæroplast-dannede hele celler som er tilbake i preparatet. Tilsett 100 yl av hver fortynning til 10 ml regenereringsagar supplert med 40 yg/ml histidin for å bestemme de samlede regenererbare sfæroplaster. Gode verdier for et transformasjonseksperiment er 1-3 x 10 samlede regenererbare sfæroplaster/ml og ca. 1x10 3 hele celler/ml.
4. Inkuber platene ved 30°C i 3-5 dager.
EKSEMPEL II
Sete- spesifikk innsetting av Saccharomyces ARG4- genet og pBR322 og sletting av Pichia HIS4 i GS190 ( NRRL Y- 18014)
Fig. 1 viser plasmid pYMI1, og fig. 2 viser et diagram av hendelser som fører til plasmidets sete-rettede innsetting i P. pastoris-genomet. Vektoren er konstruert for å sette inn Saccharomyces ARG4-genet og DNA-sekvenser fra pBR322 i Pichia HIS4-locuset, samtidig med sletting av hele HIS4-genlocuset fra Pichia-genomet. Andre sekvenser såsom ekspresjons-kasetter, kan med letthet innsettes i pYMI1 og deretter på samme måte innlemmes i P_;_ pastoris-genomet.
Plasmid pYMI1 er sammensatt av et EcoRI- BamHI-fragment som
er anordnet in situ ved 5'-enden av Pichia HlS4-genet, og et EcoRI- Clal-fragment som er anordnet 3' i forhold til Pichia HIS4-genet. Begge HIS4-gen-flankerende fragmenter kan fås
fra plasmid pYJ8 (tilgjengelig i en E. coli-vert fra the Northern Regional Research Center av De forente staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois som NRRL B-15889, se fig.
3), og er ca. 400 bp lange og føyet sammen ved dere EcoRI-ender i pYMI1. Som en selekterbar markør inneholder pYMI1-vektoren et HindIII-SalI-fragment på 2,6 kbp fra pYM25 (tilgjengelig i en E. coli-vert som NRRL B-18015, se fig. 17)
som koder for Saccharomyces argininosuccinatlyase (ARG4-gen-produktet). Når det skjæres med EcoRI blir pYMI1 lineært med de HIS4-gen-flankerende fragmenter ved sine ender.
P. pastoris arg4-stammen, GS190 (NRRL Y-18014) ble transformert med EcoRI-skåret pYMI1 til argininprototrofi (ARg<+>). Regene-reringsagarmediet ble supplert med 40 ug/ml histidin for å unngå å utøve seleksjonstrykk mot transformantene som krevde histidin som et resultat av sletting av HIS4-genet.
Arg<+->transformantene ble deretter sortert for dem som var blitt His" som et resultat av slettingen av HIS4-genet. For å sortere for His~-transformanter ble regenereringsagaren med de innleirede Arg<+->kolonier overført til et sterilt 50 ml<1>s rør som inneholdt 25 ml sterilt vann. Agaren ble deretter pulverisert ved blanding ved et homogeniseringsapparat av typen Brinkman Instruments Polytron ved en innstilling på 5 i ca. 1 min. Gjærcellene ble separert fra agaren ved filtrer-ing gjennom tre lag av sterilt gasbind (gauze). En porsjon
av gjærcellene ble deretter lydbehandlet, fortynnet og spredt på SD-mediumagarplater supplert med 40 ug/ml histidin.
For lydbehandling ble prøver av celler fortynnet til A5qq=(^'1 og lydbehandlet i 10 s med en Sonifier Cell Disrupter 350
(Branson Sonic Power Co.) ved en styrkeinnstilling på 4, en behandling som er tilstrekkelig til å separere celler, men ikke til å redusere cellenes levedyktighet. Etter 2-3 dager ble kolonier som vokste på agarplatene av SD pluss histidin, platet i replikat på sett av SD-plater, en med og en uten histidin.
Proporsjonen av Arg<+> His -kolonier var i gjennomsnitt 0,7%
av de samlede Arg<+->transformanter. Genomisk DNA fra tre Arg<+ >His -stammer ble undersøkt ved Southern blot hybridisering. Hele His4-genet var fraværende i alle tre og det lineære plasmid ble innsatt som vist nederst på fig. 2.
Foruten det faktum at GS190-pYMI1-stammen krever histidin
og ikke lenger krever arginin for vekst, ble ingen andre for-andringer i ernæringsmessige behov eller veksthastigheter observert.
EKSEMPEL III
Sletting av HIS4- genet fra P. pastoris NRRL Y- 11430
Fig. 4 viser plasmid pYMI3a, og fig. 5 angir de hendelser som fører til den lineære innsetting av et fragment fra plasmidet inn i HIS4-locuset av P^ pastoris-stammen NRRL Y-11430. Vektoren inneholder G418 motstandsgenet (G418<R>) fra pBPG1-1 (tilgjengelig fra De forente staters landsbruksdeparte-ment, Northern Regional Research Center i Peoria, Illinois i en E. coli-vert som stamme NRRL B-18020; se fig. 6) som en selekterbar markør. G418 -genet ble fjernet fra pBPG1-1
på et ca. 2,2 kbp BamHI (pBR322-sete)/ Bglll (PARS 1-sete)-fragment og innsatt i Bglll-setet av pYJ8 (NRRL B-15889; se fig. 3), hvilket erstattet 2,7 kbp BglII-fragmentet som inneholder Pichia HIS4-genet.
Vektoren pYM13a ble digestert med EcoRI for å produsere et
2,9 kbp-fragment som inneholdt G418 -genet flankert av ca.
450 og 250 bp av DNA fra området anordnet henholdsvis 5' og
3' i forhold til HIS4-genet. Det EcoRI-skårne plasmid ble transformert inn i P. pastoris-verten.
Transformantene ble valgt ved deres evne til å vokse i nærvær av 300 ug/ml av antibiotikaet G418. For G418-seleksjonen ble regenereringsmediumagaren modifisert fra den som er beskrevet i eksempel I, avsnitt D som følger:
1. Oppskrift for regenereringsagarmedium:
a. Agar-sorbitol: 9 g bacto-agar, 54,6 g sorbitol,
240 ml H20, autoklav.
b. 10x glukose: 20 g dekstrose, 100 ml H20, autoklav. c. 10x YP: 10 g gjærekstrakt, 20 g pepton, 100 ml H20, autoklav. d. Tilsett 30 ml 10x glukose og 30 ml 10x YP til 240 ml smeltet agar-sorbitol-oppløsning. Hold den smeltede regenereringsmediumagar på 55-60°C.
2. Plating av transformanter. Prøve:
Minst 30 min før transformasjonsprøver var klare ble der helt 10 ml/plate bunnagarlag av regenereringsmediumagar supplert med 600 yg/ml G418. I løpet av perioden var transformasjons-prøvene i SOS, 10 ml porsjoner av regenereringsmediumagar (uten G418) ble fordelt til rør i et bad på 45-50°C. Når trans-formasjonsprøvene var ferdige, ble porsjoner av prøvene satt til rørene med regenereringsagar og helt oppå bunnagarlaget på 10 ml inneholdende G418. Plater ble inkubert ved 30°C i 3-5 dager.
Etter at kolonier hadde dannet seg på regenereringsagarplatene med G418, ble cellene sortert for deres evne til å vokse uten histidin. Celler ble ekstrahert fra regenereringsagaren, lydbehandlet og spredt på SD-mediumagarplater supplert med 40 yg/ml histidin som beskrevet i eksempel II. Etter 2-3 dagers inkubasjon ved 30°C ble koloniene platet pånytt (replica plated)
på SD-mediumagarplater med og uten histidin.
Ca. 0,1% av G418<R->koloniene var His- (2 ut av ca. 2 000 sortert). Southern blot hybridiserings-eksperimenter viste at HIS4-genet var slettet fra genomene av begge His~-stammer
og at begge genomer inneholdt G418 R -genet som vist på o fig.
5. En av disse His~-stammer som er gitt laboratoriebetegnelsen KM31 (tilgjengelig fra De forente staters landbruksdepartement, Northern Regional Research Center i Peoria, Illinois som NRRL Y-18018), er med hell blitt transformert med flere HIS4-holdige Pichia-baserte plasmider som f.eks. pSA0H5 (tilgjengelig i
en E. coli-vert som NRRL B-15862), hvilket gir ytterligere bevis på at KM31 er spesielt en HIS4-genslettende organisme.
Dette er første gang at "vill type" P^ pastoris NRRL Y-11430
er blitt transformert direkte (dvs. uten først å isolere og karakterisere et auxotroft derivat). En mulig fordel ved disse HlS4-mutantstammer er at fordi de ble konstruert ved den sete-spesifikke innsetting/slettings-metode, er de frie for sekundære mutasjoner som sannsynligvis eksisterer i Pichia auxotrofe verter som produseres, f.eks., ved kjemisk mutagenese, som f.eks. GS115 (NRRL Y-15851) og GS190 (NRRL Y-18014).
Det skal bemerkes at slettingen av Pichia HIS4-genet fra Pichia-genomet ved innsetting av EcoRI-fragmentet fra pYMI3a ikke resulterte i tilføyelsen av store porsjoner pBR322 (hvilket fant sted når pYMH ble innsatt; se eksempel II). Da de fleste autonome ARS-baserte Pichia-ekspresjonsvektorer som f.eks. PSA0H5 (se fig. 9) primært består av sekvenser fra pBR322
og Pichia HIS4-genet, har disse autonome vektorer liten homologi med genomet av disse Pichia HIS4-utslettingsverter og derfor bør den ikke integrere hyppig.
EKSEMPEL IV
Avbrytelse av det primære alkoholoksidase- gen Pichia-stammer som mangler alkoholoksidase-gener (det primære alkoholoksidase-gen er her betegnet som A0X1 og det sekundære alkoholoksidase-gen er betegnet som A0X2) er av interesse av minst to grunner. For det første som et hjelpemiddel i undersøkelsene vedrørende regulering av genekspresjon ved
metanol. For eksempel, med en mutant stamme defekt i A0X1-
og A0X2-genene som beskrevet i nærmere detalj i eksempel VII, kan bevis fås hvorvidt metanol eller noen annen metabolitt (formaldehyd, format etc.) er det faktiske induserende molekyl av metanol-regulerte gener. En annen interesse i en AOX-defekt Pichia-stamme ligger i den mulighet at en slik stamme muligens kunne uttrykke høyere nivåer av heterologe genprodukter som beskrevet i nærmere detalj i eksempel V og VI.
For å bryte opp AO-genet ble plasmid pYM17 dannet (fig. 7). Plasmidet ble konstruert ved innsetting av et 2,9 kbp fragment av BamHI- Sall fra plasmid pYM25 (NRRL B-18015; se fig. 17)
som inneholder Saccharomyces ARG4-genet inn i BamHI-skåret pPG4.0 (NRRL B-15868; se fig. 16a for et restriksjonskart av Pichia-partiet av dette plasmid). Innsettingen resulterer i en utsletting av ca. 600 bp fra 5'-partiet av AOX1-genet (ca. en fjerdedel av genet). Plasmid pYM17 ble linearisert ved digestion med PvuII og EcoRI og transformert inn i PPF1 ( arg4 his4, NRRL Y-18017) ved selektering for Arg<+->prototrofer. Transformanter ble ekstrahert fra regenereringsagaren og lydbehandlet som beskrevet i eksemel II og spredt på SD-mediumagarplater inneholdende 0,1% glukose (istedenfor 2%) og 40 yg/ml histidin. Kolonier som resulterte ble deretter replikatplatet på et sett SD-mediumagarplater (inneholdende histidin) med de følgende karbonkilder: 1) ikke noe karbon; 2) 0,5% metanol og 3) 2% glukose. Ca. 81,0% av Arg<+->koloniene kunne ikke vokse normalt på metanol. Southern blot anlyse av genomisk DNA fra to av disse ikke-brukere av metanol, dvs. KM71 og KM72, bekreftet at A0X1-genet var avbrutt i disse stammer,
og at vektoren var innsatt som vist nederst på fig. 8.
De PPF1-pYM17-alkoholoksidase-defekte konstruksjoner som har genotypen: (his4 aox1::SARG4) er av stor potensiell verdi. For eksempel, da stammen er his4, kan Pichia-vektorer som inneholder HIS4-genet som en selekterbar markør, såsom pSA0H5 (NRRL B-15862; se fig. 9), transformeres inn i denne vert slik det er beskrevet i nærmere detalj i eksempel V nedenunder.
EKSEMPEL V
Metanolregulert ekspresjon av lacZ- genet i en alkoholoksidåse- defekt mutantstamme av Pichia pastoris Dette eksempel beskriver forsøk angående ekspresjonen av lacZ-genet i Pichia-verten KM71 (en PPF1-pYM17-alkoholoksidase-defekt konstruksjon) som ble fremstilt som beskrevet i eksempel
IV.
Aox1 -verten for disse sammenlignbare eksperimenter var KM71 (his4 aox1::SARG4) og Aox1<+->verten var PPF1 (arg4 his4; NRRL Y-18017). Ekspresjonskassetten A0X1-promotor/lacZ som ble transformert inn i begge stammer, var på plasmidet pSA0H5
(se fig. 9, NRRL B-15862). Flere stabile His<+->transformanter fra begge stammer ble isolert. Deres genomiske DNA ble undersøkt ved Southern blot analyse for å oppnå et matchet sett av stammer, hver inneholdende pSA0H5 integrert ved A0X1-promotor-locuset. På samme måte ble fusjonen av dihydroksyacetonsyntase (DAS)-promotor/lacZ-gen transformert inn i KM71 og PPF1 på plasmid pT76H3 (se fig. 18; NRRL B-18000) ved selektering for histidinprototrofi.
Hver av de fire stammer ble opprinnelig dyrket, i SD-medium bortsett fra at 2% glycerol var den eneste karbon- og energi-kilde istedenfor 2% glukose. Hver kultur ble deretter flyttet, dvs. samlet opp ved sentrifugering og overført til et annet medium, dvs. SD-medium med 0,5% metanol som den eneste karbonkilde. Prøver av disse kulturer ble analysert for B-galaktosidase, med de resultater som er angitt i tabell I.
A. Nødvendige oppløsninger:
2. O- nitrofenyl- B- D- galaktosid ( ONPG)
Løs opp 400 mg ONPG (Sigma N-1127) i 100 ml destillert vann for å gi 4 mg/ml ONPG-oppløsning.
B. Analysefremgangsmåte:
1. Ta ut en porsjon fra dyrkingsmediet (20-50 OD60Q av gjærceller), sentrifuger og vask cellepelleten med kaldt sterilt vann. 2. Tilsett 1 yl 40% Z-buffer til cellepelleten og 0,2 yg syrevaskede 0,45-0,50 mm glassperler. Hold alle prøvene på is. Svirr blandingen rundt på den høyeste innstilling fire (4) ganger i ett min hver gang. Prøvene bør holdes på is i minst ett min mellom hver gang de svirres. 3. Overfør lysatene til mikrosentrifugerør og sentrifuger i en mikrofuge ved 4°C i 5 min. Overfør de ovenpåflytende væsker til nye mikrosentrifugerør og hold ekstraktene på is. 4. Konsentrasjonen av samlet protein i et ekstrakt ble målt ved bruk av Bio-Rad Laboratories (Bradford) proteinanalyse-metode. For dette ble Bio-Rad Dye Reagent Concentrate fortynnet med fire volumer av avionisert E^ O og filtrert gjennom Whatman 3MM papir. En standard konsentrasjonskurve ble deretter fremstilt ved tilsetting av 3, 10, 30 og 100 yg bovinserumalbumen (BSA)
i 100 yl Z-buffer til et sett på 13 x 100 mm's glassrør som hver inneholdt 2,5 ml av fargereagensen. Prøvene ble blandet og holdt på værelsetemperatur i 5 min, og deres optiske densi-teter ved 595 nm ble bestemt. For ekstraktene ble 3, 10 og 30 yl's prøver bragt til 100 yl med en oppløsning inneholdende Z-bufferen og målt for proteininnhold som beskrevet ovenfor.
En proteinkonsentrasjonsverdi for hvert ekstrakt ble deretter interpolert ved bruk av BSA-konsentrasjonskurven. 5. For B-galaktosidase-målingene ble 10 yl aven 10x fortynning av ekstrakt satt til 1 ml Z-buffer, og blandingen ble inkubert i 5 min ved 30°C. 6. Start reaksjonen ved tilsetning av 0,2 ml ONPG (4 mg/ml), svirr rundt. 7. Stopp reaksjonen ved tilsetning av 0,5 ml av en 1 M Na2C0^-oppløsning ved passende tidspunkt (vanligvis mellom
1 og 30 min, og ved A^q < 1).
8. Les absorbansen av ovenpåflytende væske ved 420 nm.
C. Beregning av 8- galaktosidaseaktivitetenheter:
1 U = 1 nmol av ortonitrofenol (ONP) dannet pr. min ved 30°C
og pH 7.
1 nmol ONP har en absorbans ved 420 nm (a42q^ <p>^ 0,0045 med en 1 cm banelengde; således representerer en absorbans på 1 ved 420 nm 222 nmol ONP/ml eller 378 nmol/1,7 ml, da det samlede volum av ovenpåflytende væske som analyseres, er 1,7 ml. Enhetene vist i tabellene blir derfor beregnet som følger:
Hver av de fire kulturer viste nesten ingen påvisbar B-galaktosidaseaktivitet under glycerol-vekstfasen. 10-20 h etter ombytting til metanolmedium oppviste de to kulturer som inneholdt ekspresjonskassettene AOX1-lacZ og DAS-lacZ i Aox1<+->verten 8-galaktosidaseaktivitet som jevnet seg ut på ca. 20 enheter 8-galaktosidaseaktivitet pr. ug protein. AOX1-lacZ-kassetten i Aox1 -bakgrunnen viste imidlertid aktivitet som nådde opp i ca. 60 enheter/ug. DAS-lacZ-kassetten i Aox1 - verten viste også en økning i 6-galaktosidase-aktivitetsnivåene. Således uttrykte den transformerte Aox1 -vert, KM71, B-galaktosidase på et nivå som var 2-3 ganger nivået for den transformerte isogene Aox1 +-stamme, PPF1.
EKSEMPEL VI
Innsetting av hepatitt B overflate- antigen- genet
og sletting av AOX1- genet
I dette eksempel på sete-rettet innsetting/sletting ble hele kodesekvensen av AOX1-genet slettet og hepatitt B overflateantigen-genet (HBsAg) ble innsatt under styring av AOX1-gen-promotoren som forblir i genomet. For denne P^ pastoris verts-konstruksjon ble der dannet plasmid pBSAGI5I (deponert i en E. coli-vert hos the Northern Regional Research Center hos
De forente staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois
og tilgjengelig for offentligheten uten restriksjoner ved
utstedelse av et patent fra den foreliggende søknad, med aksesjonsnr. NRRL B-18021; fig. 12). Plasmidet inneholder et 1,0 kbp-fragment fra sekvenser som flankerer 5'-enden av AOX1-genet fulgt av hepatitt B overflateantigen-sekvensen (HBsAg) og det 300 bp AOX1-avslutningsfragment, alt sammen sammensatt som vist på fig. 9, 10 og 11. Ekspresjonskassetten ble fulgt av fragmentet på 2,7 kbp som koder for Pichia HIS4-genet og til slutt et 1,5 kbp PvuII-fragment inneholdende sekvenser 3' til AOX1-genet. Når pBSAGI5I ble digestert med Bglll, ble en 7,2 kbp lineær vektor frigjort, som inneholdt 0,85 kbp av 5<1->AOX1-gensekvensen ved én ende og 1,1 kbp av 3'-AOX1-sekvensen ved den andre ende. Bglll-skåret pBSAGI5I ble transformert inn i GS115 ved selektering for histidin-prototrofi, transformanter ble ekstrahert fra regenereringsagaren og lydbehandlet som beskrevet i eksempel II og spredt på SD-mediumagarplater med 0,1% glukose (istedenfor 2,0%). Koloniene som resulterte, ble deretter replikatplatet på minimale agarplater med de følgende karbonkilder: 1) ingen karbonkilde, 2) 0,5% metanol og 3) 2% glukose. I gjennomsnitt kunne 32% av de undersøkte kolonier ikke vokse normalt på metanol.
Southern blot analyse av det genomiske DNA fra to av ikke-brukerne av metanol viste at A0X1-genet var slettet og at vektorsek-vensene var innsatt som vist på fig. 13.
Når den ble dyrket i metanol, uttrykte GS115-pBSAGI5I-stammen (aoxl::HBsAg-HIS4) HBsAg på høyere nivåer enn det som ble uttrykt ved fult alkoholoksidase-kompetente celler transformert på lignende måte.
EKSEMPEL VII
Identifisering av det andre alkoholoksidase- gen av
P. pastoris ved den sete- rettede innsettingsteknikk Nærværet av et andre alkoholoksidase-gen kan utledes fra de følgende observasjoner: 1) Southern blots hvor probene fra enten AOX cDNA eller et genomisk DNA ble hybridisert til begrenset Pichia-genomisk DNA viste alltid minst to bånd; 2) to Pichia genomiske DNA-fragmenter ble opprinnelig isolert, hvilke var like, men ikke identiske med hverandre (se fig. 16) og 3) mutante Pichia-stammer såsom KM71 og GS115-pBSAGI5I hvor det primære AOX-gen (A0X1) var slettet eller avbrutt, kunne fortsatt vokse på metanol og inneholdt alkoholoksidase-aktivitet. Veksthastigheten og AOX-aktivitet i metanoldyrkede celler av disse Aox -stammer var meget mindre enn i isogene Aox1<+->stammer. Det synes derfor som om det andre AOX-gen (A0X2) uttrykkes på et lavere nivå eller at dets produkt er mindre aktivt på metanol. I eksempel IV ble det vist at Pichia-DNA-fragmentet i pPG4.0 inneholder A0X1-genet.
Den mest overbevisende metode til å demonstrere at det genomiske DNA-fragment fra pPG3.0 inneholder minst en porsjon av A0X2-genet, er ved konstruksjon av en mutant stamme.hvor dette mulige A0X2-gen er blitt avbrutt eller slettet. For dette ble den sete-rettede vektor pYMI12a konstruert (fig. 14). Plasmidet består primært av pPG3.0 (fig. 16b) som inneholder det mulige A0X2-gen på et 3,0 kbp BamHI-fragment. Et 2,7 kbp Bglli-fragment som inneholder Pichia HIS4-genet, ble isolert fra pYJ8 (fig. 3; NRRL B-15889) og innsatt istedenfor sekvensene som var anordnet mellom Bglll- og det lengst til venstre Kpnl-setet av pPG3.0. (Kpnl-setet ble omdannet til et Bglll-sete med en oligonukleotid-adaptor før innsetting, og BamHI-setet av HIS4-genet ble ødelagt ved "innfylling" før innsetting i pPG3.0). Sammenligning mellom AOX1 og de mulige AOX2-gener (fig. 16) viser at denne konstruksjon burde føre til slettingen av ca. 800 bp fra midten av AOX2. Ved digestion av pYMI12a med BamHI ble en 4,5 kbp lineær vektor frigjort, som inneholdt HIS4-genfragmentet flankert ved sekvenser fra det mulige AOX2-locus på henholdsvis 1,1 og 0,7 kbp (se fig. 15).
Denne lineære vektor ble transformert inn i Aox1 -stammen, KM71, (aoxl his4::SARG4), og transformantene ble isolert ved selektering for histidin-prototrofer. Transformantene ble så sortert for evnen til å anvende metanol ved replikatplating på et sett av agarplater.
Den ikke-transformerte Aox1 -stamme KM71 vokste så langsomt
på metanolplater at dersom metanol ble innlemmet i agaren, fordampet den før noen betydelig vekst kunne observeres. Dette problem ble løst ved mating av metanol til cellene i dampfase. For denne fremgangsmåte ble ca. 0,2 ml 100% metanol plassert under lokket av en plate som ikke inneholdt noen karbonkilde i agarmediet. Platen ble etterlatt ved værelsetemperatur,
og lokket ble skiftet ut hver 2. til 4. dag med et lokk inneholdende nytt metanol. Etter 1-2 uker var forskjellen i metanoldyrking av vill type (Aox1<+> Aox2<+>) og mutantstammene (Aox1~ Aox2<+>) og (Aox1~ Aox2 ) klar.
Etter dampfase-matemetoden ble det funnet at ca. 0,1% av His<+->transformantene fra Aox1 -stammen var ute av stand til å vokse på metanol. DNA fra åtte av Aox1 -Aox2 -His+-transformantene ble analysert ved Southern filter hybridiseringsfremgangsmåte. Tre av disse DNA inneholdt den lineære pYMI12a-vektor innsatt som vist på fig. 15. Analyse ved en av Aox1 -Aox2 -dobbelt-mutantene, KM7121 (NRRL Y-18019), viste at stammen avgjort ikke vokser på metanol og at stammen ikke har påvisbar AOX-aktivitet. Fra disse resultater med KM7121 er det klart at Pichia-fragmentet i pPG3.0 ikke inneholder sekvenser fra et andre AOX-gen, og at bortsett fra disse to alkoholoksidaser eksisterer ingen andre metanoloksiderende aktiviteter i P. pastoris.
Claims (14)
1. Fremgangsmåte til seteselektiv genomisk modifikasjon av Pichia pastoris på et på forhånd bestemt genomisk sete, karakterisert ved at den omfatter å transformere en vertstamme av Pichia pastoris med et serieordnet lineært DNA-fragment som omfatter;
et første innsettbart DNA-fragment,
et selekterbart markørgen, og
et andre innsettbart DNA-fragment;
idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver tilnærmet 200 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er homologe med separate partier av det native Pichia pastoris genomiske sete hvor genomisk modifikasjon skal skje;
idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert med hensyn til hverandre i nevnte lineære DNA-fragment slik de er orientert i Pichia pastoris-genomet og hvor nevnte markørgen er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment og hvor nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter blir valgt fra gruppen som består av fragmenter av;
alkoholoksidasegenene, og histidinolhehydrogenasegenet; og eventuelt at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter, et hetereologt gen, hvori nevnte hetereologe gen, såvel som nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-framgent; eller eventuelt at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter,
et reguleringsområde, og
et hetereologt gen, hvor nevnte hetereloge gen er under kontroll av reguleringsområdet, og hvor reguleringsområdet hetereologe gen - konstruksjonen, i tillegg til nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at av nevnte første og
andre innsettbare DNA-fragmenter anvendes fragmenter av alkoholoksidase-genet.
3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at av nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter anvendes fragmenter av AOX 1-genet.
4. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at av nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter anvendes fragmenter av AOX 2-genet.
5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at av nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter anvendes fragmenter av histidinoldehydrogenasegenet.
6. Isolert i serie ordnet lineært DNA-fragment, karakterisert ved at det omfatter et første innsettbart DNA-fragment, et selekterbart markørgen og et andre innsettbart DNA-fragment, idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver minst 200 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er homologe med partier av det genomiske DNA i Pichia pastoris, idet nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er anordnet med hensyn på hverandre i det lineære DNA-fragment slik som de er anordnet i Pichia pastoris-genomet, hvor nevnte markørgen er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment og hvor nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er selektert fra gruppen som består av fragmenter av;
alkoholoksidasegenene, og
histidinoldehydrogenasegenet; og eventuelt ett av følgende alternativer; (a) at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter,
et hetereologt gen, hvor nevnte hetereologe gen, såvel som nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment, (b) at nevnte lineære DNA-fragment ytterligere omfatter,
et reguleringsområde, og
et hetereologt gen, idet nevnte hetereologe gen er under kontroll av reguleringsområdet og hvor reguleringsområdet hetereologe genkonstruksjon, i tillegg til nevnte selekterbare markørgen, er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment, (c) at nevnte DNA-fragment ytterligere omfatter bakteriell plasmid DNA
7. Isolert i serie ordnet lineært DNA-fragment som angitt i krav 6, karakterisert ved at nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er fragmenter av alkoholoksidasegenet.
8. Isolert i serie ordnet lineært DNA-fragment som angitt i krav 7, karakterisert ved at nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er fragmenter av AOX 1-genet.
9. Isolert i serie ordnet lineært DNA-fragment som angitt i krav 7, karakterisert ved at nevnte første og andre innsettbare DNA-fragmenter er fragmenter av AOX 2-genet.
10. Isolert i serie ordnet lineært DNA-fragment som angitt i krav 6, karakterisert ved at nevnte første og andre innsettbare DNA-fragment er fragmenter av histidinoldehydrogenasegenet .
11. Lukket sirkelformet plasmid,
karakterisert ved at det omfatter det lineære DNA-parti som angitt i krav 6, og bakteriell plasmid DNA hvor
nevnte bakterielle plasmid DNA er anordnet mellom det første innsettbare DNA-fragment og det andre innsettbare DNA-fragment.
12. Lukket sirkelformet plasmid som angitt i krav 11, karakterisert ved at nevnte plasmid er PSA0H5 (NRRL B-15862).
13. Lukket sirkelformet plasmid som angitt i krav 11, karakterisert ved at nevnte plasmid er pYMI2a, vist i fig. 4.
14. Lukket sirkelformet plasmid som angitt i krav 11, karakterisert ved at nevnte plasmid er PYMI7, vist i fig. 7.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NO932675A NO301939B1 (no) | 1985-10-25 | 1993-07-23 | DNA som koder for alkoholoksidase-2-genet i gjær av slekten Pichia |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/791,013 US4882279A (en) | 1985-10-25 | 1985-10-25 | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO864275D0 NO864275D0 (no) | 1986-10-24 |
NO864275L NO864275L (no) | 1987-04-27 |
NO176923B true NO176923B (no) | 1995-03-13 |
NO176923C NO176923C (no) | 1995-06-21 |
Family
ID=25152397
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO864275A NO176923C (no) | 1985-10-25 | 1986-10-24 | Fremgangsmåte til seteselektiv genomisk modifikasjon av Pichia pastoris, isolert i serie ordnet linært DNA-fragment og lukket sirkelformet plasmid |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4882279A (no) |
EP (2) | EP0226752B1 (no) |
JP (1) | JP2614215B2 (no) |
KR (1) | KR930002738B1 (no) |
CN (1) | CN86107108A (no) |
AT (2) | ATE197962T1 (no) |
AU (2) | AU581107B2 (no) |
CA (1) | CA1339209C (no) |
DD (1) | DD255544A5 (no) |
DE (2) | DE3689411T2 (no) |
DK (1) | DK510786A (no) |
EG (1) | EG17985A (no) |
ES (2) | ES2061433T3 (no) |
FI (1) | FI98931C (no) |
HU (1) | HU208552B (no) |
IE (1) | IE68454B1 (no) |
IL (1) | IL80286A (no) |
IN (1) | IN166443B (no) |
MX (1) | MX168390B (no) |
NO (1) | NO176923C (no) |
NZ (1) | NZ217809A (no) |
PH (1) | PH25990A (no) |
PL (1) | PL154843B1 (no) |
PT (1) | PT83618B (no) |
YU (1) | YU46758B (no) |
ZA (1) | ZA867650B (no) |
Families Citing this family (162)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5032516A (en) * | 1985-10-25 | 1991-07-16 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region |
US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
IL89991A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of hepatitis b pres2 protein in methylotrophic yeasts |
IL89989A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human interleukin-2 in methylotrophic yeasts |
IL90021A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Process for the production of interferon |
IL89993A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of the hiv 24kda gag protein in methylotrophic yeasts |
IL89992A0 (en) | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts |
AT390267B (de) * | 1988-06-08 | 1990-04-10 | Vogelbusch Gmbh | Verfahren zum markieren und identifizieren von industriell eingesetzten mikroorganismen, vorzugsweise hefestaemmen |
US5102789A (en) * | 1989-03-15 | 1992-04-07 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells |
US5204252A (en) * | 1989-02-08 | 1993-04-20 | Henkel Research Corporation | Candida tropicalis transformation system |
WO1990009434A1 (en) * | 1989-02-13 | 1990-08-23 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of superoxide dismutase in pichia pastoris yeast cells |
JPH0669365B2 (ja) * | 1989-05-22 | 1994-09-07 | 株式会社ミドリ十字 | アルブミン遺伝子を含むプラスミド、形質転換体、形質転換体の製造方法、アルブミンの製造方法 |
CA2017176A1 (en) * | 1989-05-22 | 1990-11-22 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries Ltd. | Albumin gene-containing plasmid, transformant carrying same, production of such transformant and production of albumin |
US6440681B1 (en) | 1990-04-03 | 2002-08-27 | Merck & Co., Inc. | Methods for identifying agonists and antagonists for human neuronal nicotinic acetylcholine receptors |
US5369028A (en) * | 1990-04-03 | 1994-11-29 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | DNA and mRNA encoding human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and cells transformed with same |
US5258302A (en) * | 1990-07-03 | 1993-11-02 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells |
JPH06500470A (ja) * | 1990-09-04 | 1994-01-20 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | メチロトローフ酵母細胞におけるインスリン様成長因子の産生 |
US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
US5268273A (en) * | 1990-12-14 | 1993-12-07 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same |
WO1992013951A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-20 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells |
CA2063890C (en) * | 1991-03-27 | 2007-03-13 | Masami Miura | Mutant aox2 promoter, microorganism carrying same, method of preparation thereof and production of heterologous protein using such microorganism |
AU661844B2 (en) * | 1991-04-01 | 1995-08-10 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Genes which influence (pichia) proteolytic activity, and uses therefor |
CA2058820C (en) * | 1991-04-25 | 2003-07-15 | Kotikanyad Sreekrishna | Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells |
US5330901A (en) * | 1991-04-26 | 1994-07-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Expression of human serum albumin in Pichia pastoris |
US5665600A (en) * | 1991-09-18 | 1997-09-09 | Research Corporation Technologies, Inc. | Pichia pastoris linear plasmids and DNA fragments thereof |
PL310523A1 (en) * | 1993-03-03 | 1995-12-27 | Du Pont | Method of producing glycolane oxidase in methylothrophic yeast |
GB2286397C (en) * | 1993-03-08 | 1997-09-10 | Sibia Neurosciences Inc | Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods of applying same |
US5849895A (en) | 1993-04-20 | 1998-12-15 | Sibia Neurosciences, Inc. | Human N-methyl-D-aspartate receptor subunits, nucleic acids encoding same and uses therefor |
EP0701622A1 (en) * | 1993-05-28 | 1996-03-20 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Process for preparing glyoxylic acid/dialkyl aminomethylphosphonate mixtures |
US5521297A (en) | 1993-06-04 | 1996-05-28 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates | Nucleic acids encoding human metabotropic glutamate receptors |
US5912122A (en) * | 1993-06-04 | 1999-06-15 | Sibia Neurosciences, Inc. | Nucleic acids encoding and method for detecting nucleic acid encoding human metabotropic glutamate receptor subtype mGluR6 |
US6001581A (en) | 1993-06-04 | 1999-12-14 | Sibia Neurosciences, Inc. | Cation-based bioassay using human metabotropic glutamate receptors |
US6495343B1 (en) | 1993-06-18 | 2002-12-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Cloning and recombinant production of CRF receptor(s) |
US6638905B2 (en) * | 1993-06-18 | 2003-10-28 | The Salk Institute For Biological Studies | Cloning and recombinant production of CFR receptor(s) |
GB2287941B (en) * | 1993-11-08 | 1998-01-28 | Salk Inst Biotech Ind | Human alpha2 neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same |
EP0733059B1 (en) * | 1993-12-09 | 2000-09-13 | Thomas Jefferson University | Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells |
US5866542A (en) * | 1994-10-18 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
US5945275A (en) * | 1994-10-18 | 1999-08-31 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
US5866543A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
US5872098A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-16 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
CA2202351A1 (en) * | 1994-10-18 | 1996-04-25 | George Phillip Vlasuk | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
PL183855B1 (pl) * | 1994-10-18 | 2002-07-31 | Corvas International | Białko, cząsteczka cDNA, oligonukleotyd, kompozycja farmaceutyczna i środek farmaceutyczny do hamowania krzepnięcia krwi |
US5863894A (en) * | 1995-06-05 | 1999-01-26 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
NZ303162A (en) | 1995-03-17 | 2000-01-28 | Novo Nordisk As | Enzyme preparations comprising an enzyme exhibiting endoglucanase activity appropriate for laundry compositions for textiles |
US6485967B1 (en) | 1995-06-07 | 2002-11-26 | Merck & Co., Inc. | Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor α6 and β3 nucleic acid |
WO1997014786A1 (en) * | 1995-10-18 | 1997-04-24 | New York Blood Center, Inc. | RECOMBINANT α-N-ACETYLGALACTOSAMINIDASE ENZYME |
WO1997017451A2 (en) * | 1995-11-09 | 1997-05-15 | Zymogenetics, Inc. | Production of gad65 in methylotrophic yeast |
US6001597A (en) * | 1995-11-09 | 1999-12-14 | Zymogenetics, Inc. | Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica |
CZ297338B6 (cs) | 1996-03-01 | 2006-11-15 | Novo Nordisk A/S | Peptid potlacující chut k jídlu, farmaceutický prostredek jej obsahující a jeho pouzití |
US5731181A (en) * | 1996-06-17 | 1998-03-24 | Thomas Jefferson University | Chimeric mutational vectors having non-natural nucleotides |
US5989866A (en) | 1996-10-16 | 1999-11-23 | Zymogenetics, Inc. | FGF homologs |
MX9605082A (es) | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Univ Autonoma De Nuevo Leon | Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano. |
CZ20011026A3 (cs) | 1998-09-23 | 2001-08-15 | Zymogenetics, Inc. | Izolovaný polynukleotid, expresní vektor, kultivovaná buňka, konstrukt DNA, způsob produkce proteinu, izolovaný polypeptid, způsob produkce protilátky, protilátka a způsob detekce |
CA2354325C (en) | 1998-12-07 | 2011-08-16 | Zymogenetics, Inc. | Growth factor homolog zvegf3 |
US6780615B1 (en) | 1998-12-31 | 2004-08-24 | Genway Biotech Inc. | Production of recombinant monellin using methylotrophic yeast expression system |
AU780805B2 (en) | 1999-01-07 | 2005-04-21 | Ares Trading S.A. | Soluble receptor BR43x2 and methods of using |
US7833529B1 (en) | 1999-01-07 | 2010-11-16 | Zymogenetics, Inc. | Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor |
CA2366921C (en) | 1999-03-09 | 2013-12-17 | Zymogenetics, Inc. | Novel cytokine zalpha11 ligand |
US7504253B2 (en) * | 1999-06-11 | 2009-03-17 | The Burnham Institute For Medical Research | Nucleic acid encoding proteins involved in protein degradation, products and methods related thereof |
EP2241623A3 (en) | 1999-07-07 | 2010-12-01 | ZymoGenetics, Inc. | Monoclonal antibody against a human cytokine receptor |
JP2003524415A (ja) | 1999-12-23 | 2003-08-19 | ザイモジェネティクス,インコーポレイティド | サイトカインzcyto18 |
DE60142511D1 (de) | 2000-05-11 | 2010-08-19 | Zymogenetics Inc | Zsig33-ähnliche peptide |
DK1325115T3 (en) | 2000-06-26 | 2016-11-21 | Zymogenetics Inc | CYTOKINRECEPTOR ZCYTOR17 |
US8697394B2 (en) * | 2000-06-28 | 2014-04-15 | Glycofi, Inc. | Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures |
US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
US7863020B2 (en) | 2000-06-28 | 2011-01-04 | Glycofi, Inc. | Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes |
US7625756B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-12-01 | GycoFi, Inc. | Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells |
US7449308B2 (en) | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
ES2252261T3 (es) * | 2000-06-28 | 2006-05-16 | Glycofi, Inc. | Metodos para producir glicoproteinas modificadas. |
DE60128093T2 (de) | 2000-06-30 | 2007-12-27 | Zymogenetics, Inc., Seattle | Interferon-ähnliches protein zcyto21 |
WO2002000856A2 (en) | 2000-06-30 | 2002-01-03 | Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology (Vib) | Protein glycosylation modification in pichia pastoris |
US7009045B2 (en) * | 2000-07-14 | 2006-03-07 | Archer-Daniels-Midland Company | Transformation systems for flavinogenic yeast |
EP1736545A3 (en) | 2000-08-08 | 2007-03-28 | ZymoGenetics, Inc. | Soluble zcytor 11 cytokine receptors |
AU2002238052A1 (en) | 2001-02-20 | 2002-09-04 | Zymogenetics, Inc. | Antibodies that bind both bcma and taci |
EP1373493B1 (en) | 2001-03-22 | 2013-07-31 | Novo Nordisk Health Care AG | Coagulation factor vii derivative |
CA2442935A1 (en) | 2001-04-05 | 2002-10-17 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Alcohol oxidase 1 regulatory nucleotide sequences for heterologous gene expression in yeast |
EA010594B1 (ru) | 2001-05-24 | 2008-10-30 | Займодженетикс, Инк. | Слитые белки taci-иммуноглобулина |
WO2003040313A2 (en) | 2001-11-05 | 2003-05-15 | Zymogenetics, Inc | Il-21 antagonists |
US7087418B2 (en) * | 2001-12-19 | 2006-08-08 | Bristol-Myers Squibb Company | Pichia pastoris formate dehydrogenase and uses therefor |
EP2338910B1 (en) | 2002-01-18 | 2015-07-08 | ZymoGenetics, Inc. | Cytokine receptor Zcytor17 multimers |
EP1961811B1 (en) | 2002-01-18 | 2010-08-25 | ZymoGenetics, Inc. | Cytokine ligand for the treatment of asthma and airway hyper-responsiveness |
EP1497434A4 (en) * | 2002-04-15 | 2005-08-24 | Merck & Co Inc | MATRIX ANALYSIS OF GENE EXPRESSION IN CELLS |
JP4409962B2 (ja) | 2002-04-19 | 2010-02-03 | ザイモジェネティクス,インコーポレイティド | サイトカイン受容体 |
US7252933B2 (en) | 2002-06-26 | 2007-08-07 | Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology | Protein glycosylation modification in methylotrophic yeast |
ATE494367T1 (de) * | 2002-12-18 | 2011-01-15 | Hoffmann La Roche | Rekombinante desoxyribonuclease i aus rinder- pankreas mit hoher spezifischer aktivität |
DE60319333D1 (de) * | 2002-12-20 | 2008-04-10 | Roche Diagnostics Gmbh | Hitzelabile Desoxyribonuklease I-Varianten |
US7332299B2 (en) * | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
EP1460425A1 (en) * | 2003-03-17 | 2004-09-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Deglycosylated enzymes for conjugates |
CN1910200A (zh) | 2003-08-07 | 2007-02-07 | 津莫吉尼蒂克斯公司 | Il-28和il-29的均一化制剂 |
ES2381110T3 (es) | 2003-09-09 | 2012-05-23 | Novo Nordisk Health Care Ag | Polipéptidos de factor VII de coagulación |
DE602004025192D1 (de) * | 2003-12-05 | 2010-03-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Rekombinante Carboxypeptidase B und ihre Aufreinigung |
CN102250861A (zh) | 2004-02-13 | 2011-11-23 | 诺维信公司 | 蛋白酶变体 |
WO2005087810A2 (en) | 2004-03-08 | 2005-09-22 | Zymogenetics, Inc. | Dimeric fusion proteins and materials and methods for producing them |
EP1793845A2 (en) | 2004-07-29 | 2007-06-13 | ZymoGenetics, Inc. | Use of il-28 and il-29 to treat cancer |
EP2166104B1 (en) | 2004-08-02 | 2013-06-12 | BASF Plant Science GmbH | Method for isolation of transcription termination sequences |
US20060177447A1 (en) | 2005-02-08 | 2006-08-10 | Wenfeng Xu | Anti-IL-20, anti-IL-22 and anti-IL-22RA antibodies and binding partners and methods of using in inflammation |
MX2007012887A (es) | 2005-04-18 | 2007-12-10 | Novo Nordisk As | Variantes il-21. |
EP3683230A1 (en) | 2005-05-12 | 2020-07-22 | ZymoGenetics, Inc. | Compositions and methods for modulating immune responses |
WO2006130657A2 (en) * | 2005-05-31 | 2006-12-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Stereoselective reduction process for the preparation of pyrrolotriazine compounds |
AU2006278227B2 (en) | 2005-08-09 | 2011-10-20 | Ares Trading S.A. | Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using TACI-fusion molecules |
CA2618765A1 (en) * | 2005-08-09 | 2007-02-15 | Zymogenetics, Inc. | Methods for treating b-cell malignancies using taci-ig fusion molecule |
US9056921B2 (en) | 2005-08-16 | 2015-06-16 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
MX2008003362A (es) * | 2005-09-14 | 2008-03-25 | Sanofi Aventis Deutschland | Escision de precursores de insulinas mediante una variante de tripsina. |
EP1926817A2 (en) | 2005-09-14 | 2008-06-04 | Novo Nordisk Health Care AG | Human coagulation factor vii polypeptides |
US7855279B2 (en) | 2005-09-27 | 2010-12-21 | Amunix Operating, Inc. | Unstructured recombinant polymers and uses thereof |
EP1931697B1 (en) | 2005-09-28 | 2010-09-15 | ZymoGenetics, Inc. | Il-17a and il-17f antagonists and methods of using the same |
UA98462C2 (ru) * | 2006-05-15 | 2012-05-25 | Арес Трейдинг С.А. | Способы лечения аутоиммунных заболеваний с использованием слитой молекулы taci-ig |
JP5503968B2 (ja) | 2006-09-27 | 2014-05-28 | ノボ・ノルデイスク・エー/エス | 成熟インスリンポリペプチドの作製方法 |
KR101812400B1 (ko) * | 2007-04-03 | 2017-12-27 | 옥시레인 유케이 리미티드 | 분자의 글리코실화 |
WO2008157263A2 (en) | 2007-06-15 | 2008-12-24 | Arkansas State University | Methods of delivery of molecules to cells using a ricin subunit and compositions relating to same |
DK2602263T3 (da) | 2007-11-21 | 2019-10-21 | Roskilde Univ | Polypeptider omfattende en isbindende aktivitet |
EP2231702A1 (en) * | 2007-12-21 | 2010-09-29 | Ifxa A/s | Protease inhibitor |
EP2245052B1 (en) * | 2008-01-25 | 2017-05-24 | Aarhus Universitet | Selective exosite inhibition of papp-a activity against igfbp-4 |
TWI449788B (zh) | 2008-03-03 | 2014-08-21 | Abbvie Inc | 轉型酵母菌之方法 |
SI2274008T1 (sl) | 2008-03-27 | 2014-08-29 | Zymogenetics, Inc. | Sestavki in metode za zaviranje PDGFRBETA in VEGF-A |
WO2009139349A1 (ja) * | 2008-05-14 | 2009-11-19 | Bio-energy株式会社 | 酵母細胞に遺伝子を導入する方法およびそのためのベクター |
US8658766B2 (en) | 2008-06-27 | 2014-02-25 | Zymogenetics, Inc. | Soluble hybrid Fcγ receptors and related methods |
EP2379718B2 (en) | 2008-12-16 | 2020-12-30 | Novartis AG | Yeast display systems |
US20110046060A1 (en) | 2009-08-24 | 2011-02-24 | Amunix Operating, Inc., | Coagulation factor IX compositions and methods of making and using same |
DK3178835T3 (da) | 2009-02-03 | 2019-06-24 | Amunix Pharmaceuticals Inc | Forlængede rekombinante polypeptider og sammensætninger omfattende samme |
EP2406282A1 (en) | 2009-03-11 | 2012-01-18 | Novo Nordisk A/S | Interleukin-21 variants having antagonistic binding to the il-21 receptor |
EP2454281B1 (en) | 2009-07-17 | 2018-11-14 | Omeros Corporation | Masp isoforms as inhibitors of complement activation |
BR112012007099A2 (pt) | 2009-09-29 | 2015-09-15 | Oxyrane Uk Ltd | hidrólise da ligação manose-1-fosfo-6-manose a fosfo-manose |
CA2781240A1 (en) | 2009-11-19 | 2011-05-26 | Oxyrane Uk Limited | Yeast strains producing mammalian-like complex n-glycans |
US8815541B2 (en) | 2009-11-25 | 2014-08-26 | Novo Nordisk A/S | Method for making polypeptides |
CN102666570B (zh) | 2009-12-01 | 2015-12-02 | 诺沃—诺迪斯克有限公司 | 新的肽基α-羟基甘氨酸α-酰胺化裂合酶 |
US9815876B2 (en) | 2010-03-05 | 2017-11-14 | Omeros Corporation | Chimeric inhibitor molecules of complement activation |
MX2012013899A (es) | 2010-06-09 | 2013-03-20 | Zymogenetics Inc | Proteinas de fusion vstm3 dimericas y composiciones y metodos relacionados. |
JP6151183B2 (ja) | 2010-09-29 | 2017-06-21 | オキシレイン ユーケー リミテッド | マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合からキャップを外すことおよびリン酸化n−グリカンを脱マンノシル化することができるマンノシダーゼならびに哺乳動物細胞による糖タンパク質の取り込みを促進する方法 |
KR101979220B1 (ko) | 2010-09-29 | 2019-05-16 | 옥시레인 유케이 리미티드 | 인산화된 n-글리칸들의 탈-만노실화 |
JP2015503338A (ja) | 2011-12-30 | 2015-02-02 | オキシレイン ユーケー リミテッド | 組換えタンパク質の分解を低減させる方法および材料 |
DK2809795T3 (da) | 2012-02-01 | 2019-12-16 | Sgi Dna Inc | Materialer og fremgangsmåder til syntese af fejlminimerede nukleinsyremolekyler |
CA2861051C (en) | 2012-02-09 | 2021-06-22 | Var2 Pharmaceuticals Aps | Targeting of chondroitin sulfate glycans |
AU2013204636B2 (en) | 2012-02-15 | 2016-04-14 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Recombinant Factor VIII proteins |
BR112014020694A2 (pt) | 2012-02-15 | 2018-05-08 | Amunix Operating Inc. | proteína de fusão do fator viii compreendendo polipeptídeo do fator viii fusionado a polipeptí-deo recombinante estendido (xten) e seu método de fabricação, ácido nucleico, vetores, célula hospedeira, bem como composição farmacêutica e seu uso no tratamento de coagulopatia, episódio de hemorragia e hemofilia a |
CA2867237C (en) | 2012-03-15 | 2024-01-02 | Wouter Vervecken | Methods and materials for treatment of pompe's disease |
KR101958234B1 (ko) * | 2012-05-09 | 2019-03-14 | 엘지이노텍 주식회사 | 보이스 코일 모터 |
JP2015532307A (ja) | 2012-10-15 | 2015-11-09 | ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー | 凝固因子viiポリペプチド |
WO2014136065A2 (en) | 2013-03-05 | 2014-09-12 | Oxyrane Uk Limited | Production of catalytically active type i sulfatase |
JP6594293B2 (ja) | 2013-03-21 | 2019-10-23 | コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション | 三重らせんタンパク質の精製 |
EP3004156A1 (en) | 2013-06-07 | 2016-04-13 | Novo Nordisk A/S | Method for making mature insulin polypeptides |
WO2014202089A2 (en) | 2013-06-18 | 2014-12-24 | Roskilde Universitet | Variants of anti-freeze polypeptides |
TWI667255B (zh) | 2013-08-14 | 2019-08-01 | 美商生物化學醫療公司 | 因子viii-xten融合物及其用途 |
CN105764920B (zh) | 2013-09-09 | 2020-07-24 | 联邦科学工业研究组织 | 修饰的细菌胶原蛋白样蛋白 |
KR102259028B1 (ko) | 2014-07-30 | 2021-06-02 | 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 | 단백질의 개량 고분비 생산 방법 |
TWI741992B (zh) | 2015-08-03 | 2021-10-11 | 美商百歐維拉提夫治療公司 | 因子ix融合蛋白以及其製備及使用方法 |
CA2997263C (en) | 2015-09-08 | 2022-10-04 | Theripion, Inc. | Apoa-1 fusion polypeptides and related compositions and methods |
WO2018136163A2 (en) | 2016-12-09 | 2018-07-26 | Theripion, Inc. | Tandem apoa-1 fusion polypeptides |
JP7012663B2 (ja) * | 2016-12-15 | 2022-02-14 | 株式会社カネカ | 新規宿主細胞及びそれを用いた目的タンパク質の製造方法 |
BR112020001180A2 (pt) | 2017-07-20 | 2020-09-08 | Aptevo Research And Development Llc | proteínas de ligação a antígenos que se ligam a 5t4 e 4-1bb e composições e métodos relacionados |
AU2018391831B2 (en) | 2017-12-20 | 2022-08-04 | Harbour Biomed (Shanghai) Co., Ltd | Antibodies binding CTLA-4 and uses thereof |
EP3732190A1 (en) | 2017-12-27 | 2020-11-04 | Imunami Laboratories Pte. Ltd. | Recombinant polypeptides and methods of use thereof |
US10150801B1 (en) | 2017-12-27 | 2018-12-11 | Imunami Laboratories Pte. Ltd. | Recombinant polypeptides and methods of use thereof |
DE202019005554U1 (de) * | 2018-03-06 | 2021-01-18 | Joywell Foods, Inc. | Rekombinant exprimierte geschmacksmodifizierende Polypeptide und Präparate und Formulierungen, die diese enthalten |
MX2020012397A (es) | 2018-05-18 | 2021-04-12 | Bioverativ Therapeutics Inc | Metodos de tratamiento de la hemofilia a. |
CN112789504A (zh) | 2018-07-13 | 2021-05-11 | 瓦克特诊断有限责任公司 | 使用重组疟疾蛋白var2csa分离胎儿来源的循环细胞 |
CN111378585B (zh) * | 2018-12-28 | 2023-06-16 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 用于表达外源基因的毕赤酵母突变株 |
EP4021512A1 (en) | 2019-08-26 | 2022-07-06 | Imunami Laboratories Pte. Ltd. | Recombinant polypeptides and methods of use thereof |
US10675332B1 (en) | 2019-08-26 | 2020-06-09 | Imunami Laboratories Pte. Ltd. | Recombinant polypeptides and methods of use thereof |
AU2020454690A1 (en) | 2020-06-22 | 2023-02-02 | Imunami Laboratories Pte. Ltd. | Recombinant polypeptides and combinations for use in the treatment of cancer |
WO2022178090A2 (en) | 2021-02-19 | 2022-08-25 | Theripion, Inc. | Dnase fusion polypeptides and related compositions and methods |
WO2024148328A2 (en) | 2023-01-06 | 2024-07-11 | Aptevo Research And Development Llc | Bispecific pd-l1 and cd40 binding molecules and uses thereof |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4530901A (en) * | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
US4414329A (en) * | 1980-01-15 | 1983-11-08 | Phillips Petroleum Company | Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities |
JPS57206699A (en) * | 1981-06-10 | 1982-12-18 | Takeda Chem Ind Ltd | Plasmid patm 3 and its preparation |
US4855231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-08-08 | Phillips Petroleum Company | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
US4837148A (en) * | 1984-10-30 | 1989-06-06 | Phillips Petroleum Company | Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia |
US4879231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
-
1985
- 1985-10-25 US US06/791,013 patent/US4882279A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-07-29 CA CA000514838A patent/CA1339209C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-06 IE IE263786A patent/IE68454B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-10-06 NZ NZ217809A patent/NZ217809A/en unknown
- 1986-10-07 ZA ZA867650A patent/ZA867650B/xx unknown
- 1986-10-08 IN IN731/CAL/86A patent/IN166443B/en unknown
- 1986-10-08 MX MX003971A patent/MX168390B/es unknown
- 1986-10-09 PH PH34343A patent/PH25990A/en unknown
- 1986-10-10 IL IL80286A patent/IL80286A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-10-14 AU AU63882/86A patent/AU581107B2/en not_active Expired
- 1986-10-20 JP JP61249403A patent/JP2614215B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-20 KR KR1019860008825A patent/KR930002738B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-10-22 EG EG659/86A patent/EG17985A/xx active
- 1986-10-23 DE DE3689411T patent/DE3689411T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 EP EP86114700A patent/EP0226752B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 YU YU180386A patent/YU46758B/sh unknown
- 1986-10-23 EP EP93105818A patent/EP0560401B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 AT AT93105818T patent/ATE197962T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-10-23 AT AT86114700T patent/ATE98695T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-10-23 DE DE3650749T patent/DE3650749T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 ES ES86114700T patent/ES2061433T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-23 ES ES93105818T patent/ES2152233T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-24 PT PT83618A patent/PT83618B/pt not_active IP Right Cessation
- 1986-10-24 DK DK510786A patent/DK510786A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-10-24 CN CN198686107108A patent/CN86107108A/zh active Pending
- 1986-10-24 NO NO864275A patent/NO176923C/no unknown
- 1986-10-24 HU HU864480A patent/HU208552B/hu not_active IP Right Cessation
- 1986-10-24 PL PL1986262030A patent/PL154843B1/pl unknown
- 1986-10-24 DD DD29558586A patent/DD255544A5/de unknown
- 1986-10-24 FI FI864319A patent/FI98931C/fi not_active IP Right Cessation
-
1988
- 1988-04-15 AU AU14699/88A patent/AU593436B2/en not_active Expired
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO176923B (no) | Fremgangsmåte til seteselektiv genomisk modifikasjon av Pichia pastoris, isolert i serie ordnet linært DNA-fragment og lukket sirkelformet plasmid | |
US5166329A (en) | DNA encoding the alcohol oxidase 2 gene of yeast of the genus Pichia | |
Greenleaf et al. | Yeast RPO41 gene product is required for transcription and maintenance of the mitochondrial genome. | |
Araki et al. | Molecular and functional organization of yeast plasmid pSR1 | |
JP2710610B2 (ja) | 機能遺伝子を含むdna断片 | |
EP0329203B1 (en) | Yeast expression systems with vectors having pyk promoters, and synthesis of foreign protein | |
DK175105B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af et proteinprodukt i en værtscelle, fremgangsmåde til udvælgelse af transformerede celle, DNA-konstruktion, der omfatter et gen, der komplementerer en mangel i en værtscelle samt transformeret stamme | |
CA1318617C (en) | Enhanced secretion of heterologous proteins by hosts using substituted promoters | |
NO176025B (no) | DNA-fragment, plasmid, kultur og fremgangsmåte til fremstilling av et hepatitt-B-overflateantigen | |
NO301285B1 (no) | DNA-sekvens som koder for det regulatoriske område for alkoholoksidase II hos Pichia pastoris | |
US5135868A (en) | Cultures of yeast of the genus Pichia altered by site selective genomic modification | |
NO864276L (no) | Gen som koder for produksjonen av pichia-argininsuccinatlyase. | |
US6361966B1 (en) | Over-expression of proteins | |
US4935350A (en) | Materials and methods for controlling plasmid copy number and stability | |
Obraztsova et al. | Genetic damage following introduction of DNA in Phycomyces | |
US5068185A (en) | Trains of yeast for the expression of heterologous genes | |
Taguchi et al. | The cloning and mapping of ADR6, a gene required for sporulation and for expression of the alcohol dehydrogenase II isozyme from Saccharomyces cerevisiae | |
EP0128743A2 (en) | Expression of foreign genes in yeast | |
Karnitz et al. | Identification and characterization of three genes that affect expression of ADH2 in Saccharomyces cerevisiae. | |
GB2178431A (en) | Genetically engineered lactose utilizing yeast strains | |
JPH06343471A (ja) | ポリペプチドの製造方法 | |
US5541084A (en) | Hybrid yeast promoter comprising an ENO2 UAS and TATA region and an additional UAS located between said ENO2 UAS and TATA region | |
IE83234B1 (en) | DNA fragment encoding an AOX | |
NO891485L (no) | Fremgangsmaate til fremstilling av 22 kd sgh-protein og lineaer genevektor. | |
KR0185980B1 (ko) | 알부민 유전자-함유 플라스미드, 이를 함유하는 형질전환체, 이러한 형질전환체의 생산방법 및 알부민의 생산방법 |