ES2252261T3 - Metodos para producir glicoproteinas modificadas. - Google Patents
Metodos para producir glicoproteinas modificadas.Info
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Abstract
Una célula huésped que es un hongo unicelular o filamentoso que no muestra actividad alfa-1, 6- manosiltransferasa con respecto al N-glicano sobre una glicoproteína, que tiene en su retículo endoplasmático (RE) o aparato de Golgi un enzima híbrido seleccionado para tener actividad óptima en el RE o aparato de Golgi de dicha célula huésped, de manera que dicha célula huésped es capaz de formar de 50 a 100 moles% de Man5GlcNAc2 sobre una glicoproteína sustrato, el enzima híbrido que comprende: (a) un dominio catalítico de manosidasa exógeno que tiene una actividad óptima en dichos RE o Golgi a un pH entre 5, 1 y 8, 0; fusionado a (b) un péptido señal localizador anormalmente asociado con el dominio catalítico de (a), donde dicho péptido señal de selección celular dirige el ya citado dominio catalítico de manosidasas exógenas hacia dicho RE o aparato de Golgi.
Description
Métodos para producir glicoproteínas
modificadas.
Las proteínas sintetizadas de novo pueden
seguir procesándose en células, conocido como modificación
post-traduccional. En particular, pueden añadirse
residuos de azúcar, un proceso conocido como glicosilación. Las
proteínas resultantes que llevan unido covalentemente cadenas
laterales de oligosacáridos se conocen como proteínas glicosiladas o
glicoproteínas. Las bacterias generalmente no glicosilan proteínas;
en casos donde tiene lugar la glicosilación frecuentemente ocurre en
sitios no específicos de la proteína (Moens and Vanderleyden, Arch.
Microbiol. 1997 168(3):169-175).
Los eucariotas comúnmente unen un oligosacárido
específico a la cadena lateral del residuo de asparagina de una
proteína, particularmente una asparagina que aparece en la secuencia
Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys (donde Xaa
representa cualquier aminoácido). Después de la unión de la fracción
del sacárido, conocido como N-glicano, pueden tener
lugar más modificaciones in vivo. Generalmente estas
modificaciones tienen lugar mediante una secuencia ordenada de
reacciones enzimáticas, conocidas como una cascada. Organismos
diferentes proporcionan diferentes enzimas de glicosilación
(glicosiltransferasas y glicosidasas) y diferentes sustratos de
glicosilo, de manera que la composición final de una cadena lateral
de azúcar puede variar marcadamente dependiendo del huésped.
Por ejemplo, microorganismos tales como hongos
filamentosos y levaduras (eucariotas inferiores) generalmente añaden
azúcares adicionales manosa y/o manosilfosfato. El glicano
resultante se conoce como un tipo "alto en manosa" o un manano.
Por lo contrario, en células animales, la cadena lateral del
oligosacárido naciente puede ser modificada para eliminar varios
residuos de manosa y elongarla con residuos de azúcar adicionales
que generalmente no aparecen en los N-glicanos de
eucariotas inferiores. Ver R.K. Bretthauer, et al. Biotechnology
and Applied Biochemistry, 1999, 30, 193-200; W.
Martinet, et al. Biotechnology Letters, 1998, 20,
1171-1177; S. Weikert, et al. Nature
Biotechnology, 1999, 17, 1116-1121; M.
Malissard, et al. Biochemical and Biophysical Research
Communications, 2000, 267, 169-173; Jarvis,
et al. 1998 Engineering N-glycosylation
pathways in the baculovirus-insect cell system,
Current Opinion in Biotechnology, 9:528-533;
y M. Takeuchi, 1997 Trends in Glycoscience and Glycotechnology,
1997, 9, S29-S35.
Los N-glicanos que son producidos
en humanos y animales comúnmente se refieren a
N-glicanos del complejo. Un
N-glicano del complejo significa una estructura
generalmente de dos a seis ramificaciones externas con una secuencia
de sialilactosamina unida a una estructura del núcleo interior
Man_{3}GlcNAc_{2}. Un N-glicano del complejo
tiene como mínimo una ramificación y preferiblemente al menos dos,
residuos alternos de GlcNAc y galactosa (Gal) que terminan en
oligosacáridos tales como, por ejemplo: NeuNAc-;
NeuAc\alpha2-6GalNAc\alpha1-;
NeuAc\alpha2-3Gal\beta1-3GalNAc\alpha1-;
NeuAc\alpha2-3/6Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-;
GlcNAc\alpha1-4Gal\beta1- (solo mucinas);
Fuc\alpha1-2Gal\beta1-(grupo sanguíneo H). Los
ésteres de sulfato pueden encontrarse sobre la galactosa, GalNAc y
residuos GlcNAc; y los ésteres de fosfato pueden encontrarse sobre
los residuos de manosa. NeuAc (Neu: ácido neuramínico; Ac: acetilo)
puede estar O-acetilado o reemplazado por NeuG1
(ácido N-glicolilneuramínico). Los
N-glicanos del complejo también pueden tener
sustituciones intracatenarias de GlcNAc biseccionado y fucosa (Fuc)
del núcleo.
La glicosilación humana empieza con un conjunto
de reacciones secuencial en el retículo endoplasmático (RE) llevando
a una estructura oligosacárida del núcleo, que se transfiere a
proteínas sintetizadas de novo en el residuo de asparagina en
la secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr (ver
Figura 1A). Más procesamientos mediante glucosidasas y manosidasas
tienen lugar en el RE antes de que la glicoproteína naciente se
transfiera al aparato de Golgi proximal, donde los residuos de
manosa adicionales se eliminan mediante
1,2-manosidasas específicas del Golgi. El
procesamiento continúa a medida que la proteína procede a través del
Golgi. En el Golgi medial un número de enzimas modificadores
incluyendo N-acetilglucosamin transferasas (GnT I,
GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI), manosidasa II,
fucosiltransferasas que añaden y eliminan residuos de azúcar
específicos (ver Figura 1B). Finalmente en el Golgi trans, las
galactosiltransferasas y las sialiltransferasas (ST) actúan sobre
los N-glicanos y la glicoproteína acabada se libera
desde el aparato de Golgi. La proteína N-glicano de
glicoproteínas animales tienen bi-, tri- o estructuras
tetra-antenarias y generalmente pueden incluir
galactosa, fucosa y N-acetilglucosamina. Comúnmente
los residuos terminales de los N-glicanos consisten en ácido
siálico. Una estructura típica de un N-glicano se
muestra en la Figura 1B.
Los N-glicanos de glicoproteínas
animales generalmente incluyen galactosa, fucosa y ácido siálico
terminal. Estos azúcares generalmente no se encuentran sobre
glicoproteínas producidas en levaduras y hongos filamentosos. En
humanos, el rango completo de precursores de azúcar de nucleósidos
(p. ej. UDP N-acetilglucosamina,
UDP-N-acetilgalactosamina, ácido
CMP-N-acetilneuramínico,
UDP-galactosa, GDP-fucosa etc.)
generalmente se sintetizan en el citosol y se transportan en el
Golgi, donde se unen al oligosacárido del núcleo mediante
glicosiltransferasas. (Sommers and Hirschberg, 1981 J Cell Biol.
91(2): A406-A406; Sommers and Hirschberg
1982 J. Biol. Chem. 257(18): 811-817;
Perez and Hirschberg 1987 Methods in Enzymology 138:
709-715).
\newpage
Las reacciones de transferencia de glicosilo
generalmente producen un producto secundario que es un nucleósido
difosfato o monofosfato. Mientras que los monofosfatos pueden ser
directamente exportados en intercambio de azúcares nucleósido
trifosfato para un mecanismo de antiport, los difosfonucleósidos (p.
ej. GDP) tienen que ser partidos por fosfatasas (p. ej. GDPasa) para
producir nucleósidos monofosfatos y fosfato inorgánico antes de ser
exportados. Esta reacción es importante para la glicosilación
eficiente; por ejemplo, se ha encontrado que el GDPasa de S.
cerevisiae es necesario para la manosilación. Sin embargo la
GDPasa tiene el 90% de la actividad reducida frente a UDP
(Berninsone et al., 1994 J. Biol. Chem.
269(1):207-21 la). Los eucariotas inferiores
generalmente carecen de actividad difosfatasa específica para UDP en
el Golgi puesto que no utilizan precursores de
azúcar-UDP para la síntesis de glicoproteínas
basadas en el Golgi. Schizosaccharonzyces pombe, una levadura
encontrada para añadir residuos de galactosa a los polisacáridos de
la pared celular (de UDP-galactosa) se ha encontrado
que tiene actividad específica UDPasa, indicando el requerimiento de
un enzima así (Berninsone et al., 1994). Se sabe que UDP es
un potente inhibidor de glicosiltransferasas y la eliminación de
este producto secundario de la glicosilación es importante con el
fin de prevenir la inhibición de glicosiltransferasa en el lúmen del
Golgi (Khatara et al., 1974). Ver Beminsone, P., et
al. 1995. J. Biol. Chem. 270(24):
14564-14567; Beaudet, L., et al. 1998 Abc
Transporters: Biochemical, Cellular, and Molecular Aspects.
292:397-413.
Glicosiltransferasas y manosidasas bordean la
superficie interior (luminal) del RE y el aparato de Golgi y por lo
tanto proporcionan una superficie catalítica que permite el
procesamiento secuencial de glicoproteínas ya que proceden a través
de la red del RE y Golgi. Los múltiples compartimentos del Golgi
cis, medio y trans y la Red Golgi trans (TGN), proporcionan las
diferentes localidades en que la secuencia ordenada de reacciones de
glicoproteínas pueden tener lugar. Como una maduración procede de la
síntesis en el RE hasta la maduración completa en el Golgi distal o
TGN, se expone secuencialmente a diferentes glicosidasas,
manosidasas y glicosiltransferasas tales que puede sintetizarse una
estructura de N-glicano. Los enzimas generalmente
incluyen un dominio catalítico, una región de unión, una región
transmembrana y una cola citoplasmática N-terminal.
Los últimos tres componentes estructurales son responsables de
dirigir un enzima de glicosilación para el sitio apropiado.
Las secuencias de localización de un organismo
pueden funcionar en otros organismos. Por ejemplo, la región
transmembrana de
\alpha-2,6-sialiltransferasa
(\alpha-2,6-ST) de ratas, un
enzima conocido por localizarse en el Golgi trans de rata, se mostró
que también localiza un gen marcador (invertasa) en el Golgi de la
levadura (Schwientek, et al., 1995). Sin embargo, la misma
región transmembrana como parte de la longitud completa de
\alpha-2,6-sialiltransferasa se
retuvo en el RE y no transportó más al Golgi de la levadura
(Krezdorn et al., 1994). Un GalT de longitud completa de
humanos ni siquiera se sintetizó en la levadura, a pesar de los
altos niveles de transcripción que se demostraron. Por otro lado la
región transmembrana del mismo GalT humano fusionada a un marcador
invertasa no fue capaz de dirigir la localización al Golgi de la
levadura, aunque a niveles de producción bajos. Schwientek y
co-trabajadores han demostrado que fusionando 28
aminoácidos de una manosiltransferasa (Mntl) de levadura, una región
que contiene una cola citoplasmática N-terminal, una
región transmembrana y ocho aminoácidos de la región de unión, al
dominio catalítico del GalT humano son suficientes para la
localización del Golgi de un GalT activo (Schwientek et al.
1995 J. Biol. Chem. 270(10):5483-5489).
Otras galactosiltransferasas parecen transmitir sobre interacciones
con enzimas residentes en organelas particulares que después de la
eliminación de su región transmembrana aún son capaces de
localizarlos correctamente.
La localización incorrecta de un enzima de
glicosilación puede prevenir el funcionamiento correcto del enzima
en la ruta. Por ejemplo Aspergillus nidulans, que tiene
numerosas \alpha-1,2-manosidasas
(Eades and Hintz, 2000 Gene 255(1):25-34), no
añade GlcNAc a Man_{5}GlcNAc_{2} cuando se ha transformado con
el gen GnT I de conejo, a pesar de un nivel alto de la actividad GnT
I (Kalsner et al., 1995). GnT1, aunque activamente expresado,
pueden ser incorrectamente localizados de manera que el enzima no
esté en contacto con ambos de sus sustratos: el
N-glicano naciente de la glicoproteína y
UDP-GlcNAc. De forma alternativa, el organismo
huésped no puede proporcionar un nivel adecuado de
UDP-GlcNAc en el Golgi.
Una fracción significativa de proteínas aisladas
de humano u otros animales se glicosilan. Entre las proteínas usadas
terapéuticamente, alrededor del 70% se glicosilan. Sin embargo, si
una proteína terapéutica se produce en un microorganismo huésped tal
como la levadura y se glicosila utilizando la ruta endógena, su
eficiencia terapéutica generalmente se reduce mucho. Tales
glicoproteínas son generalmente inmunogénicas en humanos y muestran
una vida media reducida in vivo después de la administración
(Takeuchi, 1997).
Los receptores específicos en humanos y animales
pueden reconocer los residuos de manosa terminales y promover el
aclaramiento rápido de la proteína desde el torrente sanguíneo.
Efectos adversos adicionales pueden incluir cambios en el
plegamiento de la proteína, solubilidad, susceptibilidad a
proteasas, tráfico, transporte, compartementalización, secreción,
reconocimiento mediante otras proteínas o factores, antigenicidad o
alergenicidad. Como consecuencia, ha sido necesario para producir
glicoproteínas terapéuticas en sistemas de huéspedes animales, de
manera que el patrón de glicosilación es idéntico o al menos similar
al humano o al de las especies receptoras previstas. En la mayoría
de los casos se usa un sistema de huésped de mamífero, tales como un
cultivo de células mamíferas.
Con el fin de producir proteínas terapéuticas que
tienen glicoformas apropiadas y que tienen efectos terapéuticos
satisfactorios, se han usado sistemas de expresión basados en
animales o plantas. Los sistemas disponibles incluyen:
1. Células de ovario de hámster chino (CHO),
células de fibroblasto de ratón y células de mieloma de ratón
(Arzneimittelforschung. 1998 Aug;
48(8):870-880);
2. Animales transgénicos tales como cabras,
ovejas, ratones y otros (Dente Prog. Clin. Biol. 1989 Res.
300:85-98, Ruther et al., 1988 Cell
53(6):847-856; Ware, J., et al. 1993
Thrombosis and Haemostasis 69(6): 11941194; Cole, E.
S., et al. 1994 J. Cell. Biochem.
265-265);
3. Plantas (Arabidopsis thaliana, tobacco
etc.) (Staub, et al. 2000 Nature Biotechnology 18(3):
333-338) (MeGarvey, P. B., et al. 1995
Bio-Technology 13(13):
1484-1487; Bardor, M., et al. 1999 Trends in
Plant Science 4(9): 376-380);
4. Células de insecto (Spodoptera frugiperda
Sf9, Sf21, Trichoplusia ni, etc. en combinación con baculovirus
recombinantes tales Autographa californica como el virus
polihedrosis múltiple nuclear que infecta célulaslepidópteras)
(Altmans et al., 1999 Glycoconj. J.
16(2):109-123).
Las proteínas humanas recombinantes expresadas en
los sistemas huésped antes mencionados aún pueden incluir
glicoformas no-humanas (Raju et al., 2000
Annals Biochem. 283(2):123-132). En
particular, la fracción de los N-glicanos puede
carecer de ácido siálico terminal, generalmente encontrado en la
glicoproteína humana. Los esfuerzos sustanciales se han dirigido a
desarrollar procesos para obtener glicoproteínas con la estructura
lo más cercana posible a la de las formas humanas o bien tener otras
ventajas terapéuticas. Las glicoproteínas que tienen glicoformas
específicas pueden ser especialmente útiles, por ejemplo en la
estimulación de las proteínas terapéuticas. Por ejemplo, la adición
de uno o más residuos de ácido siálico a la cadena lateral del
glicano puede incrementar la vida media de una glicoproteína
terapéutica in vivo después de la administración. Como
consecuencia, las células huésped de mamífero pueden ser
genéticamente diseñadas para incrementar la extensión del ácido
siálico terminal en glicoproteínas expresadas en las células. De
forma alternativa, el ácido siálico puede ser conjugado a la
proteína de interés in vitro antes de la administración
usando una transferasa de ácido siálico y un sustrato apropiado.
Además, los cambios en la composición del medio de crecimiento o la
expresión de enzimas implicados en la glicosilación humana se han
empleado para producir glicoproteínas mucho mas parecidas a las
formas humanas (S. Weikert, et al., Nature Biotechnology,
1999, 17, 1116-1121; Werner, Noe, et al
1998 Arzneimittelforschung 48(8):870880; Weikert, Papac et
al., 1999; Andersen and Goochee 1994 Cur. Opin. Biotechnol.
5: 546-549; Yang and Butler 2000 Biotechnol.
Bioengin. 68(4): 370-380).
Alternativamente se pueden usar las células humanas cultivadas.
Sin embargo, todos los sistemas existentes tienen
inconvenientes significativos. Solamente ciertas proteínas
terapéuticas son adecuadas para la expresión en sistemas de animales
o plantas (p. ej. aquellos que carecen de algún efecto citotóxico u
otro efecto adverso para el crecimiento). Los sistemas de cultivo de
células animales y vegetales normalmente son muy lentos,
frecuentemente requieren más de una semana de crecimiento bajo
condiciones controladas para producir cualquier cantidad útil de la
proteína de interés. Los rendimientos proteicos, sin embargo, se
comparan de forma desfavorable con aquellos de los procesos de
fermentación microbiana. Además los sistemas de cultivo celular
generalmente requieren nutrientes y cofactores complejos y caros,
tales como suero fetal bovino. Además el crecimiento puede estar
limitado por la muerte celular programada (apoptosis).
Además, las células animales (particularmente las
células de mamíferos) son altamente susceptibles a infecciones
virales o contaminación. En algunos casos los virus u otros agentes
infecciosos pueden comprender el crecimiento del cultivo, mientras
que en otros casos el agente puede ser un patógeno humano que
presenta el producto proteico terapéutico incapacitado para su uso
previsto. Además muchos procesos de cultivo celular requieren el uso
de componentes del medio de crecimiento derivado de animales,
complejos, sensibles, que pueden llevar patógenos tales como los
priones de la encefalopatía espongiforme bovina (BSE). Tales
patógenos son difíciles de detectar y/o dificultan la eliminación o
esterilización sin comprometer el medio de cultivo. En cualquier
caso, el uso de células animales para producir proteínas
terapéuticas necesita controles de calidad costosos para asegurar la
seguridad del
producto.
producto.
Los animales transgénicos también pueden usarse
para la elaboración de proteínas terapéuticas de alto volumen tales
como la albúmina sérica humana, activador de plasminógeno de tejido,
anticuerpos monoclonales, hemoglobina, colágeno, fibrinógeno y
otros. Mientras las cabras trasngénicas y otros animales
transgénicos (ratones, ovejas, vacas, etc.) pueden ser diseñados
genéticamente para producir proteínas terapéuticas a altas
concentraciones en la leche, el proceso es costoso puesto que cada
lote debe someterse a un riguroso control de calidad. Los animales
pueden hospedar una variedad de patógenos animales o humanos,
incluyendo bacterias, virus, hongos, y priones. En el caso de
escrapie y encefalopatía espongiforme bovina, el test puede durar
alrededor de un año para excluir la infección. Así, la producción de
compuestos terapéuticos se lleva a cabo preferiblemente en un
ambiente estéril bien controlado, p. ej. bajo condiciones de Buenas
Prácticas de Fabricación (GMP). Sin embargo, generalmente no es
viable para mantener animales en tales ambientes. Además, mientras
que las células crecidas en un fermentador derivan de un Banco de
Células Maestras (MCB), la tecnología de animales transgénicos
depende de los diferentes animales y así es inherentemente no
uniforme. Además de los factores externos tales como el consumo de
alimentos, enfermedad y falta de homogeneidad con una multitud,
pueden afectar los patrones de glicosilación del producto final. Se
sabe que en humanos, por ejemplo, los diferentes hábitos
alimentarios resultan en diferir los patrones de glicosilación.
Las plantas transgénicas se han desarrollado como
una fuente potencial para obtener proteínas de valor terapéutico.
Sin embargo, la expresión de altos niveles de proteínas en plantas
sufre de silenciamiento del gen, un mecanismo por el que los genes
para las proteínas altamente expresadas son
sub-reguladas en las subsiguientes generaciones
vegetales. Además, los vegetales añaden xilosa y/o
\alpha-1,3-fucosa unida a los
N-glicanos proteicos, resultando en glicoproteínas
que difieren en la estructura de animales y son inmunogénicos en
mamíferos (Altmann, Marz et al., 1995 Glycoconj. J.
12(2);150-155). Además, generalmente el
crecimiento de plantas en un ambiente estéril o de GMP y la
recuperación de proteínas de tejidos de vegetales es más costosa que
la recuperación de microorganismos fermentados.
Así, la falta de un sistema de expresión adecuado
es un obstáculo significativo a la producción de bajo coste y segura
de glicoproteínas humanas recombinantes. La producción de
glicoproteínas mediante la fermentación de microorganismos ofrecerá
numerosas ventajas sobre los sistemas existentes. Por ejemplo,
procesos basados en la fermentación pueden ofrecer (a) la producción
rápida de concentraciones altas de proteína; (b) la capacidad para
usar condiciones de producción estériles, bien controladas (p. ej.
condiciones de las GMP); (c) la capacidad para usar un medio de
crecimiento químicamente definido; (d) facilidad de manipulación
genética; (e) la ausencia de la contaminación de patógenos humanos
o animales; (f) la capacidad para expresar una amplia variedad de
proteínas, incluyendo aquellos pobremente expresados en el cultivo
celular pendiente a causa de toxicidad, etc.; (g) facilidad de la
recuperación de proteínas (p. ej. mediante secreción en el medio).
Además, los equipos para fermentación generalmente son mucho menos
costosos de construir que los equipos de cultivo celular.
Como se ha citado antes, sin embargo, las
bacterias, incluyendo las especies tales como Escherichia
coli comúnmente usadas para producir proteínas recombinantes, no
glicosilan proteínas de forma específica como los eucariotas. Varios
hongos metilotróficos tales como Pichia pastoris, Pichia
methanolica y Hansenula polymorpha, son particularmente útiles
como sistemas de expresión eucarióticos, puesto que son capaces de
crecer a altas densidades celulares y/o secretan altas cantidades de
proteína recombinante. Sin embargo, como se ha citado antes, las
glicoproteínas expresadas en estos microorganismos eucarióticos
difieren sustancialmente en la estructura del
N-glicano de las de los animales. Esto ha impedido
el uso de levaduras u hongos filamentosos como huéspedes para la
producción de muchas glicoproteínas útiles.
Se han realizado muchos esfuerzos para modificar
las vías de glicosilación de microorganismos eucarióticos para
proporcionar glicoproteínas más adecuadas para el uso como agentes
terapéuticos de mamíferos. Por ejemplo, varias glicosiltransferasas
se han clonado por separado y se expresan en S. cerevisiae
(GalT, GnT I), Aspergillus nidulans (GnT I) y otros hongos
(Yoshida et al., 1999, Kalsner et al., 1995
Glycoconj. J. 12(3):360-370, Schwientek et
al., 1995). Sin embargo, no se obtuvieron los
N-glicanos con características humanas.
Las levaduras producen una variedad de
manosiltransferasas por ejemplo.
1,3-manosiltransferasas (p. ej. MNN1 en S.
cerevisiae) (Graham and Emr, 1991 J. Cell. Biol.
114(2):207-218),
1,2-manosiltransferasas (p. ej. familia KTR/KRE de
S. cerevisiae), 1,6-manosiltransferasas (OCHI
de S. cerevisiae), transferasas manosilfosfato (MNN4 y MNN6
de S. cerevisiae) y enzimas adicionales que están implicadas
en reacciones de glicosilación endógena. Muchos de estos genes se
han eliminado de forma individual, ocasionando organismos viables
que tienen los perfiles de glicosilación alterados. Los ejemplos se
muestran en la Tabla 1.
| Cepa | N-glicano ) | Mutación | N-glicano (mutante) | Referencia |
| (tipo salvaje | ||||
| S. pombe | Man_{>9}GlcNAc_{2} | OCH1 | Man_{8}GlcNAc_{2} | Yoko-o et al., 2001 FEBS Lett. |
| 489(1):75-80 | ||||
| S. cerevisiae | Man_{>9}GlcNAc2 | OCH1/MNN1 | Man_{8}GlcNAc_{2} | Nakanishi-Shindo et al,. 1993 J. |
| Biol. Checo. 268(35):26338-26345 | ||||
| S. cerevisiae | Man_{>9}GlcNAc_{2} | OCHI/MNN1 | Man_{8}GlcNAc_{2} | J. Biol. Chem. 273, 26298-26304 |
Además, la Solicitud de Patente Japonesa Pública
No. 8-336387 revela una cepa OCH1 mutante de
Pichia pastoris. El gen OCH1 codifica
1,6-manosiltransferasa, que añade una manosa a la
estructura de glicano Man_{9}GlcNAc_{2} para producir
Man_{9}GlcNAc_{2}. La estructura Man_{9}GlcNAc_{2} entonces
es un sustrato para más manosilación in vivo, llevando a las
glicoproteínas hipermanosilatadas que son características de
levaduras y generalmente pueden tener al menos 30-40
residuos de manosa por N-glicano. En la cepa mutante
OCH1, las proteínas glicosiladas con Man_{9}GlcNAc_{2} se
acumulan y la hipermanosilación no tiene lugar. Sin embargo, la
estructura Man_{8}GlcNAc_{2} no es un sustrato para enzimas de
glicosilación animales, tales como UDP-GlcNAc
transferasa I, y de acuerdo con el método no es útil para producir
proteínas con patrones de glicosilación humanos.
Martinet et al. (Biotechnol. Lett. 1998,
20(12), 1171-1177) informa sobre la expresión
de \alpha-1,2-manosidasa de
Trichoderma reesei en P. pastoris. Se han observado
algunos ribetes de manosa de los N-glicanos de una
proteína modelo. Sin embargo, la proteína modelo no tenía
N-glicanos con la estructura Man_{5}GlcNAc_{2},
que serían necesarios como un intermediario para la generación de
N-glicanos complejos. Concretamente, el método no
es útil para producir proteínas con patrones de glicosilación
humanos o animales.
De forma similar, Chiba et al. 1998
expresó \alpha-1,2-manosidasa de
Aspergillus saitoi en la levadura Saccharomyces
cerevisiae. Una secuencia péptido señal
(His-Asp-Glu-Leu) se
diseñó en la manosidasa exógena para promover la retención en el
retículo endoplasmático. Además, el huésped de la levadura era un
mutante al que le faltaban las tres actividades enzimáticas
asociadas con la hipermanosilación de proteínas:
1,6-manosiltransferasa (OCH1);
1,3-manosiltransferasa (MNN1); y
manosilfosfatotransferasa (MNN4). Los
N-glicanos del huésped triple mutante consistía así,
de la estructura Man_{8}GlcNAc2, más que las altas formas de
manosa encontradas en S. cerevisiae de tipo salvaje. En
presencia de la manosidasa diseñada altamente expresada, los
N-glicanos de una proteína modelo (carboxipeptidasa
Y) se ribetearon para dar una mezcla que consiste en 27 moles %
Man_{5}GlcNAc_{2}, 22 moles Man_{6}GlcNAc_{2}, 22 moles %
Man_{7}GlcNAc_{2}, 29 moles % Man_{8}GlcNAc_{2}. El
ribeteado de las glicoproteínas de la pared celular fue menos
eficiente, solamente 10 moles % de los N-glicanos
tenían la estructura deseada Man_{5}GlcNAc_{2}. El trabajo de
Chiba también se revela en EP-A1 1 211 311. Aunque
Chiba expresó en alta copia más que la cantidad saturante de su
manosidasa y se obtuvieron rendimientos relativamente pobres,
sugiere que incluso más enzimas sean expresados para resolver el
problema de los bajos rendimientos. Nunca sugiere que el enzima
objetivo debería ser escogido para trabajar óptimamente en la célula
huésped seleccionada en el sitio subcelular donde se convierte su
sustrato.
Puesto que solamente los glicanos
Man_{5}GlcNAc_{2} serían susceptibles de más conversión
enzimática a glicoformas humanas, el método no es eficiente para la
producción de proteínas que tienen patrones de glicosilación. En
proteínas que tienen un sitio de N-glicosilación
sencillo, al menos 73 moles % tendrían una estructura incorrecta. En
proteínas que tienen dos o tres sitios de
N-glicosilación, respectivamente al menos 93 o 98
moles % tendrían una estructura incorrecta. Tales eficiencias bajas
de conversión son insatisfactorias para la producción de agentes
terapéuticos, particularmente como la separación de proteínas que
tienen diferentes glicoformas generalmente es costosa y
difícil.
Con el objetivo de proporcionar una glicoproteína
como la humana derivada de un huésped fúngico, Patente
Estadounidense No. 5.834.251 a Maras y Contreras revela un método
para producir una glicoproteína híbrida derivada de Trichoderma
reesei. Un híbrido N-glicano tiene solamente
residuos de manosa en el brazo Mana 1-6 del núcleo y
uno o dos complejos antena en el brazo Mana 1-3.
Mientras que esta estructura tiene utilidad, el método tiene la
desventaja que numerosos pasos enzimáticos deben ser realizados
in vitro, lo cual es costoso y consume mucho tiempo. Enzimas
aisladas son caras de preparar y mantener, pueden necesitar
sustratos inusuales y caros (p. ej. UDP-GlcNAc) y
son propensos a perder la actividad y/o proteolisis bajo condiciones
de uso.
Por tanto es un objetivo de la presente invención
proporcionar un sistema y métodos para la glicosilación humanizante
de glicoproteínas recombinantes expresadas en Pichia pastoris
y otros eucariotas inferiores tales como Hansenula polymorpha,
Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Kluyveromyces sp.,
Candida albicans, Aspergillus nidulans y Trichoderma
reseei.
Se han desarrollado líneas celulares que tienen
modificados genéticamente los mecanismos de glicosilación que les
permite llevar a cabo una secuencia de reacciones enzimáticas, que
imitan el procesamiento de glicoproteínas en humanos. Las proteínas
recombinantes expresadas en estos huéspedes diseñados produjeron
glicoproteínas más similares, sino sustancialmente idénticas, a sus
homólogos humanos. Los eucariotas inferiores, que ordinariamente
producen N-glicanos que contienen muchas manosas,
incluyendo hongos unicelulares y multicelulares tales como
Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Pichia stiptis, Pichia
methanolica, Pichia sp., Kluyveromyces sp., Candida albicans,
Aspergillus nidulans y Trichodenna reseei, se modifican
para producir N-glicanos tales como
Man_{5}GlcNAc_{2} u otras estructuras a lo largo de las rutas de
glicosilación. Esto se consigue usando una combinación de diseño y/o
selección de cepas que no expresan ciertas enzimas que crean las
estructuras no deseadas características de las glicoproteínas
fúngicas, que expresan enzimas exógenas seleccionadas para tener la
actividad óptima bajo condiciones presentes en el hongo donde se
desea la actividad, o que se destinan a una organela donde se
consigue la actividad óptima y las combinaciones de las mismas en
donde el diseño genéticamente eucariota expresa múltiples enzimas
requeridas para producir glicoproteínas
"tipo-humanas".
En una primera realización, la invención se
refiere a una célula huésped que es un hongo unicelular o
filamentoso que no muestra actividad
alfa-1,6-manosiltransferasa con
respecto al N-glicano sobre una glicoproteína, que
tiene en su retículo endoplasmático (RE) o aparato de Golgi un
enzima híbrido seleccionado para tener actividad óptima en el RE o
aparato de Golgi de dicha célula huésped, de manera que dicha célula
huésped es capaz de formar de 50 a 100 moles % de
Man_{5}GlcNAc_{2} sobre una glicoproteína sustrato, el enzima
híbrido que comprende:
(a) un dominio catalítico de manosidasa exógena
que tiene actividad óptima en dichos RE o Golgi a un PH entre 5,1 y
8,0; fusionado a
(b) un péptido señal diana anormalmente
asociado con el dominio catalítico de (a), en donde dichas dianas
péptido señal celular llamadas dominio catalítico de manosidasas
exógenas a dichos RE o aparato de Golgi.
Así, la invención se refiere a un microorganismo
que se diseña para expresar un enzima exógeno
\alpha-1,2-manosidasa que tiene un
pH óptimo entre 5,1 y 8,0, preferiblemente entre 5,9 y 7,5. Así, el
enzima exógeno se destina al retículo endoplasmático o aparato de
Golgi del organismo huésped, donde ribetea
N-glicanos tales como Man_{5}GlcNAc_{2} para
producir Man_{5}G1cNAc_{2}. La estructura tardía es útil porque
es idéntica a una estructura formada en mamíferos, especialmente
humanos; es un sustrato para más reacciones de glicosilación in
vivo y/o in vitro que producen un
N-glicano acabado que es similar o idéntico al que
se forma en mamíferos, especialmente humanos; y no es un sustrato
para reacciones de hipermanosilación que tienen lugar in vivo
en levaduras y otros microorganismos y estos presentan una
glicoproteína altamente inmunogénica en animales.
En una segunda realización, la invención se
refiere a un método para producir la célula huésped presentada aquí,
el método que comprende el paso de transformación de dicho hongo
unicelular o filamentoso con una molécula de ácido nucleico que
codifica un enzima híbrido seleccionado para tener una actividad
óptima en el RE o Golgi de dicha célula huésped, de manera que dicha
célula huésped sea capaz de formar 50 a 100 moles %
Man_{5}GlcNAc_{2} sobre una glicoproteína sustrato, el enzima
híbrido comprende:
(a) un dominio catalítico de manosidasa exógena
que tiene una actividad óptima en RE o Golgi a un pH entre 5,1 y
8,0; fusionado a
(b) un péptido señal de destino celular
normalmente no asociado al dominio catalítico de (a), en donde dicho
péptido señal de localización celular se dirige a dicho dominio
catalítico exógeno de dicho RE o aparato de Golgi.
En una tercera realización, la invención se
refiere a un método para la producción de una glicoproteína en una
célula huésped que es un hongo unicelular o filamentoso que no
presenta actividad alfa-1,6 manosiltransferasa con
respecto a al N-glicano sobre la glicoproteína, el
método que comprende los pasos de:
(a) expresar dicha proteína en una población
de dichas células huésped transformadas con una biblioteca de DNA
que comprende al menos dos construcciones genéticas diferentes, al
menos una de las que comprende un fragmento de DNA que codifica un
enzima híbrido que comprende:
- (i)
- un dominio catalítico de glicosilación de enzima que tienen actividad óptima en dichos RE o Golgi a un pH entre 5,1 y 8,0; fusionado a
- (ii)
- un péptido señal de localización celular normalmente no asociado con el domino catalítico de (i), en donde el péptido señal de localización celular se dirige al RE o aparato de Golgi de la célula huésped; y
(b) seleccionando la célula huésped que
muestra una glicoproteína con un patrón de glicosilación deseado en
dicha glicoproteína.
Así, la ruta de glicosilación de un
microorganismo eucariótico se modifica en esta realización mediante
(a) la construcción de una biblioteca de DNA incluyendo al menos dos
genes que codifican los enzimas de glicosilación exógenos; (b) la
transformación del microorganismo con la biblioteca para producir
una población mezclada genéticamente que expresa al menos dos
enzimas de glicosilación exógenos distintos; (c) la selección de la
población un microorganismo que tiene el fenotipo de glicosilación
deseado. En otra realización, una biblioteca de DNA incluye genes
quiméricos que codifican una secuencia de localización de la
proteína y una actividad catalítica relacionada con la
glicosilación. En consecuencia, en una cuarta realización la
invención proporciona una biblioteca de DNA que comprende
construcciones genéticas, las construcciones que comprenden un
fragmento de DNA que codifica un péptido señal de localización
celular que se dirige al retículo endoplasmático o aparato de Golgi
ligado en el marco con un fragmento de DNA que codifica un enzima de
glicosilación o un fragmento catalíticamente activo del mismo que
tienen una actividad óptima en dichos RE o Golgi a un pH entre 5,1 y
8,0, dicha biblioteca de DNA incluyendo al menos dos fragmentos de
DNA que codifican un péptido señal de localización celular y al
menos dos fragmentos de DNA que
codifican enzimas de glicosilación exógenos. Los organismos modificados que usan el método son útiles para producir glicoproteínas que tienen un patrón de glicosilación similar o idéntico a los mamíferos, especialmente humanos.
codifican enzimas de glicosilación exógenos. Los organismos modificados que usan el método son útiles para producir glicoproteínas que tienen un patrón de glicosilación similar o idéntico a los mamíferos, especialmente humanos.
En una quinta realización, la ruta de
glicosilación se modifica para expresar un enzima transportador
nucleótido de azúcar. En una realización preferida, también se
expresa un enzima difosfatasa nucleótido. El transportador y la
difosfatasa mejoran la eficiencia de los pasos de glicosilación
diseñados, proporcionando los sustratos apropiados para los enzimas
de glicosilación en los compartimentos apropiados, reduciendo la
inhición competitiva del producto y promoviendo la eliminación de
nucleósidos difosfatos.
Finalmente, la invención se refiere a una
composición de glicoproteínas obtenibles mediante los métodos
presentados aquí, comprendiendo de 50 a 100 moles % de
Man_{5}GlcNAc_{2} convertido mediante GnT I in vivo en
GlcNAcMan_{5}
GlcNAc_{2}, dicha glicoproteína carente de galactosa, fucosa y ácido siálico terminal.
GlcNAc_{2}, dicha glicoproteína carente de galactosa, fucosa y ácido siálico terminal.
La Figura 1A es un diagrama esquemático de la
ruta general de N-glicosilación de los hongos.
La Figura 1B es un diagrama esquemático de una
ruta general de N-glicosilación en humanos.
Los métodos y cepas de eucariotas recombinantes
descritos aquí se usan para hacer "glicoproteínas humanizadas".
Los eucariotas inferiores recombinantes se hacen por construyendo
eucariotas inferiores que no expresan una o más enzimas implicadas
en la producción de estructuras de alta manosa para expresar los
enzimas requeridos para producir azúcares de tipo humano. Como se
usa aquí, un eucariota inferior es un hongo unicelular o
filamentoso. Como se usa aquí, una "glicoproteína humanizada"
se refiere a una proteína que tiene, unida a ella
n-glicanos incluyendo menos de cuatro residuos de
manosa, e intermediarios sintéticos (que son útiles y pueden ser más
manipulados in vitro) que tienen al menos cinco residuos de
manosa. En una realización preferida, las glicoproteínas producidas
en las cepas eucarióticas inferiores recombinantes que contienen al
menos 27 moles % del intermediario Man_{5}. Esto se consigue
clonando en una manosidasa mejor, p. ej., un enzima seleccionado
para tener una actividad óptima bajo las condiciones presentes en
los organismos en el sitio donde las proteínas se glicosilan o
localizando el enzima en la organela donde se desea la
actividad.
En una realización preferida, se usan las cepas
eucarióticas que no expresan uno o más enzimas implicados en la
producción de estructuras altas en manosa. Estas cepas pueden ser
manipuladas o uno de estos mutantes ya descritos en levaduras,
incluyendo un mutante de hipermanosilación-negativa
(OCH1) en Pichia pastoris.
Las cepas pueden ser manipuladas en un enzima a
la vez, o se puede crear una biblioteca de genes que codifican
potencialmente enzimas útiles, y aquellas cepas que tienen enzimas
con actividades óptimas o que producen la mayoría de las proteínas
"tipo humanas" seleccionadas.
Los eucariotas inferiores que son capaces de
producir glicoproteínas que tienen unidos N-glicanos
de Man_{5}GlcNAc_{2} son particularmente útiles a partir de (a)
la falta de un alto grado de manosilación (p. ej. más de 8 manosas
por N-glicano, o especialmente 30-40
manosas), muestran inmunogenicidad reducida en humanos; y (b) el
N-glicano es un sustrato para más reacciones de
glicosilación para formar incluso más glicoformas tipo humanas, p.
ej. por la acción de GlcNAc transferasa I para formar
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}. Man_{5}GlcNAc_{2} debe formarse
in vivo en un alto rendimiento, al menos transitoriamente,
puesto que todas las reacciones de glicosilación subsiguientes
requieren Man_{5}GlcNAc_{2} o un derivado del mismo. En
consecuencia, se obtiene un rendimiento de más de 27 moles %, más
preferiblemente un rendimiento de 50-100 moles % de
glicoproteínas en que una alta proporción de
N-glicanos tienen Man_{5}GlcNAc_{2}. Las
células huésped preferidas de la invención produjeron
50-100 moles % de glicoproteínas en las que los
N-glicanos tenían Man_{5}GlcNAc_{2} que se ha
convertido mediante GlcNac transferasa I in vivo. Entonces es
posible realizar más reacciones de glicosilación in vitro,
usando por ejemplo el método de la Patente Estadounidense No.
5,834,251 a Maras y Contreras. En una realización preferida, al
menos una reacción más de glicosilación se realiza in vivo.
En una realización altamente preferida de la misma, se expresan
formas activas de los enzimas glicosilantes en el retículo
endoplasmático y/o aparato de Golgi.
Las levaduras y hongos filamentosos han sido
ambos utilizados para la producción de proteínas recombinantes,
ambas intracelulares y secretadas (Cereghino, J. L. and J. M.
Cregg 2000 FEMS Microbiology Reviews 24 (1):
45-66; Harkki, A., et al. 1989
Bio-Technology 7 (6): 596; Berka, R. M.,
et al. 1992 Abstr. Papers Amer. Chem. Soc. 203:
121-BIOT; Svetina, M., et al. 2000 J.
Biotechnol. 76 (2-3):
245-251.
Aunque la glicosilación en levaduras y hongos es
muy diferente que en humanos, se comparten algunos elementos
comunes. El primer paso, la transferencia de la estructura de
oligosacáridos del núcleo a la proteína naciente, es altamente
conservada en todos los eucariotas incluyendo levaduras, hongos,
vegetales y humanos (comparar las Figuras 1A y 1B). El procesamiento
subsiguiente de los oligosacáridos del núcleo, sin embargo, difiere
significativamente en hongos e implica la adición de varios azúcares
de manosa. Este paso es catalizado por manosiltransferasas que
residen en el Golgi (p. ej. OCH1, MNT1, MNN1, etc.), que
secuencialmente añaden azúcares de manosa a los oligosacáridos del
núcleo. La estructura resultante es indeseable para la producción de
proteínas humanoides y así se desea reducir o eliminar la actividad
manosiltransferasa. Mutantes de S. cerevisiae, deficiente en la
actividad manosil transferasa (p. ej. los mutantes ochl o mnn9) se
han mostrado no letales y presentan un contenido en manosas reducido
en el oligosacárido de las glicoproteínas del núcleo. Otros enzimas
de procesamiento de oligosacáridos, tales como manosilfosfato
transferasa también puede tener que ser eliminado dependiendo del
patrón de glicosilación endógeno particular del huésped. Después de
reducir reacciones de glicosilación endógenas no deseadas la
formación de complejos N-glicanos tiene que ser
modificada en el sistema huésped. Esto requiere la expresión estable
de varios enzimas y transportadores de
azúcar-nucleótidos. Además, se deben localizar estos
enzimas de modo que se asegure un procesamiento secuencial de la
estructura de glicosilación.
Los métodos descritos aquí son útiles para
producir glicoproteínas, especialmente glicoproteínas usadas
terapéuticamente en humanos. Tales proteínas terapéuticas
generalmente se administran por inyección oralmente, pulmonarmente o
de otras maneras.
Ejemplos de glicoproteínas diana adecuadas
incluyen, sin limitación: eritropoyetina, citocinas tales como
interferón-\alpha,
interferón-\beta,
interferón-\gamma,
interferón-\omega y
granulocito-CSF, factores de coagulación tales como
el factor VIII, factor IX y la proteína humana C, cadena a del
receptor de IgE soluble, IgG, IgM, uroquinasa, quimasa e inhibidor
de tripsina urea, proteína de unión al IGF, factor de crecimiento
epidérmico, factor de liberación de la hormona del crecimiento,
proteína de fusión a la anexina V, angiostatina,
factor-2 de crecimiento endotelial vascular,
factor-1 inhibitorio progenitor mieloide y
osteoprotegerina.
El primer paso implica la selección o creación de
un eucariota inferior que es capaz de producir una estructura
precursora específica de Man_{5}GlcNAc_{2}, que es capaz de
aceptar GlcNAc in vivo por la acción de una GlcNAc
transferasa I. Este paso requiere que la formación de una estructura
isomérica particular de Man_{5}GlcNAc_{2}. Esta estructura tiene
que formarse dentro de la célula a un alto rendimiento (en exceso
del 30%) puesto que las manipulaciones subsiguientes son
contingentes a la presencia de este precursor: estructuras
Man_{5}GlcNAc_{2} son necesarias para la formación del complejo
N-glicano, sin embargo, su presencia no es
suficiente de ninguna manera, puesto que Man_{5}GlcNAc_{2} puede
presentarse en diferentes formas isoméricas, que pueden o no servir
como un sustrato para GlcNAc transferasa I. La mayoría de reacciones
de glicosilación no son completas y así una proteína particular
generalmente contiene un rango de estructuras de carbohidrato
diferentes (es decir glicoformas) sobre su estructura. La mera
presencia de cantidades pequeñas (menos del 5%) de una estructura
particular como Man_{5}GlcNAc_{2} es de poca relevancia
práctica. Es la formación de un intermediario particular que acepta
la GlcNAc transferasa I (Estructura I) en altos rendimientos (cerca
del 30%), el cual se requiere. La formación de este intermediario es
necesaria y permite subsiguientemente la síntesis in vivo del
complejo de N-glicanos.
Pueden seleccionarse tales eucariotas inferiores
de la naturaleza u hongos u otros eucariotas inferiores existentes
modificados genéticamente de forma alternativa para proporcionar la
estructura in vivo. No se ha mostrado eucariotas inferiores
que proporcionen tales estructuras in vivo en exceso del 1,8%
de los N-glicanos totales (Maras et al.,
1997), de manera que se prefiere un organismo modificado
genéticamente. Métodos tales como aquellos descritos en la Patente
Estadounidense No. 5.595.900, pueden usarse para identificar la
ausencia o presencia de glicosiltransferasas particulares,
manosidasas y transportadores de nucleótidos de azúcares en un
organismo diana de interés.
El método descrito aquí puede usarse para
modificar el patrón de glicosilación de un amplio rango de
eucariotas inferiores (p. ej. Hansenula polymorpha, Pichia
stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp, Kluyveromyces sp, Candida
albicans, Aspergillus nidulans, Trichoderma reseei, etc.). Se
usa Pichia pastoris para ejemplificar los pasos de
manipulación requeridos. Similar a otros eucariotas inferiores,
P. pastoris procesa estructuras Man_{9}GlcNAc_{2} en el
RE con una 1,2-\alpha-manosidasa
para producir Man_{8}GlcNAc_{2}. A través de la acción de
varias manosiltransferasas, esta estructura entonces se convierte en
estructuras hipermanosiladas (Man_{> 9}GlcNAc_{2}), también
conocidas como mananos. Además, se ha encontrado que P.
pastoris es capaz de añadir grupos fosfato no terminales, a
través de la acción de manosilfosfato transferasas a la estructura
de carbohidrato. Esto es contrario a las reacciones encontradas en
células de mamífero, que implica la eliminación de azúcares de
manosa ya que se oponen a su adición. Es de importancia particular
eliminar la capacidad del hongo para hipermanosilar la estructura
Man_{8}GlcNAc_{2} existente. Esto puede conseguirse
seleccionando un hongo que no hipermanosile o modificando
genéticamente dicho hongo.
Los genes que están implicados en este proceso
han sido identificados en Pichia pastoris y creando
mutaciones en estos genes se puede reducir la producción de
glicoformas "indeseables". Tales genes pueden ser identificados
por homología a manosiltransferasas existentes (p. ej. OCH1, MNN4,
MNN6, MNN1), encontradas en otros eucariotas inferiores tales como
C. albicans, Pichia angusta o S. cerevisiae o por
mutagénesis de la cepa huésped y seleccionado un fenotipo con
manosilación reducida. Basado en homologías entre
manosiltransferasas conocidas y manosilfosfato transferasas, se
pueden diseñar cebadores para PCR, ejemplos de los cuales se
muestran en la Tabla 2, o el uso de genes o fragmentos de genes que
codifican tales enzimas como sondas o identificar homólogos en
bibliotecas de DNA del organismo diana. Alternativamente, se pueden
complementar fenotipos particulares en organismos relacionados. Por
ejemplo, con el fin de obtener el gen o genes que codifican la
actividad 1,6-manosiltransferasa en P.
pastoris, se llevarían a cabo los siguientes pasos. Los mutantes
OCH1 de S. cerevisiae son sensibles a la temperatura y
crecen lentamente a temperaturas elevadas. Así, se pueden
identificar homólogos funcionales de OCH1 en P. pastoris
complementando un mutante OCH1 de S. cerevisiae con una
biblioteca de DNA de P. pastoris o una biblioteca de cDNA.
Tales mutantes de S. cerevisiae pueden encontrarse en
http://genome-www.stanfgrd.edu/Saccharomyces/ y
están disponibles comercialmente en
http://www.resgen.com/products/YEASTD.php3. Los mutantes que
muestran un fenotipo de crecimiento normal a temperatura elevada,
después de haber sido transformados con una biblioteca de DNA P.
pastoris, probablemente llevarán un homólogo OCH1 de P.
pastoris. Tal biblioteca puede ser creada mediante la digestión
parcial del DNA cromosomal de P. pastoris con una enzima de
restricción apropiada y después de inactivar la enzima de
restricción ligando el DNA digerida a un vector adecuado, que ha
sido digerido con una enzima de restricción compatible. Vectores
adecuados serían pRS314, un plásmido de pocas copias (CEN6/ARS4)
basado en el pBluescript que contiene el marcador Trp1 (Sikorski, R
S., and Hieter, P., 1989, Genetics 122, pg. 19-27)
o pFL44S, un plásmido de muchas copias (2\mu) plásmido basado en
un pUC19 modificado que contiene el marcador URA3 (Bonneaud, N.,
et al., 1991, Yeast 7, pg. 609-615). Dichos
vectores son comúnmente utilizados por investigadores académicos o
vectores similares están puestos a disposición por diferentes
vendedores tales como Invitrogen (Carlsbad, CA), Pharmacia
(Piscataway, NJ), New England Biolabs (Beverly, MA). Ejemplos de
éstos son pYES/GS, plásmido de expresión de levadura basado en un
origen de replicación 2\mu de Invitrogen o Yep24 vehículo de
clonación de New England Biolabs. Después de la unión del DNA
cromosómico y el vector, uno puede transformar la biblioteca de DNA
en cepa de S. cerevisiae con una mutación específica y
seleccionar para la corrección del correspondiente fenotipo. Después
de sub-clonar y secuenciar el fragmento de DNA que
es capaz de restablecer el fenotipo tipo salvaje, uno podría
utilizar este fragmento para eliminar la actividad del producto del
gen codificado por OCH1 en P. pastoris.
De forma alternativa, si se conoce la secuencia
genómica completa de un hongo particular, se podrían identificar
tales genes simplemente buscando en bases de datos de DNA públicas
disponibles, que se pueden conseguir de diferentes fuentes tales
como NCBI, Swissprot, etc. Por ejemplo, buscando una secuencia
genómica dada o base de datos con un gen conocido 1,6
manosiltransferasa (OCH1) de S. cerevisiae, uno es capaz de
identificar genes de alta homología en dicho genoma, con un alto
grado de certeza codifica un gen que tiene actividad 1,6
manosiltransferasa. Se han identificado homólogos para diversas
manosiltransferasas conocidas de S. cerevisiae en P.
pastoris utilizando cualquiera de estas aproximaciones. Estos
genes tienen funciones similares a las de los genes involucrados en
la manosilación de proteínas en S. cerevisiae y así su
deleción puede utilizarse para manipular el patrón de glicosilación
en P. pastoris o cualquier otro hongo con vías similares de
glicosilación.
La creación de genes knock-out;
una vez se ha determinado una secuencia génica diana dada, es una
técnica bien establecida en la comunidad de la biología molecular de
hongos y levaduras, y puede ser llevada a cabo por cualquier experto
en la materia (R. Rothsteins, (1991) Methods in Enzymology, vol.
194, pg. 281). De hecho, la elección de un organismo huésped puede
estar influenciada por la disponibilidad de técnicas de buena
transformación y disrupción génica para dicho huésped. Si diversas
manosiltransferasas deben ser suprimidas, el método desarrollado
por Alani y Kleckner permite el uso repetido de los marcadores URA3
para eliminar secuencialmente toda la actividad manosiltransferasa
endógena no deseada. Esta técnica ha sido perfeccionada por otros
pero básicamente incluye la utilización de dos secuencias de DNA
repetidas, flanqueando a un marcador seleccionable contrario. Por
ejemplo, URA3 puede utilizarse cómo marcador para asegurar la
selección de transformantes que han integrado una construcción.
Flanqueando los marcadores URA3 con repeticiones directas uno puede
seleccionar primero transformantes que hayan integrado la
construcción y hayan así alterado el gen diana. Después del
aislamiento de los transformantes y su caracterización, uno podría
contraseleccionar en una segunda ronda a aquellos que son
resistentes a 5'FOA. Las colonias que son capaces de sobrevivir en
placas que contienen 5'FOA han perdido otra vez el marcador URA3 a
través de un evento de cruzamiento que involucra las repeticiones
mencionadas anteriormente. Así, esta aproximación permite el uso
repetido del mismo marcador y facilita la alteración de múltiples
genes sin requerir marcadores adicionales.
La eliminación de manosiltransferasas
específicas, tales como 1,6 manosiltransferasa (OCH1),
manosilfosfato transferasas (MNN4, MNN6 o genes que complementan los
mutantes lbd) en P. pastoris, permite la creación de
cepas de este organismo que sintetizan sobretodo
Man_{8}GlcNAc_{2} y así puede ser utilizado para modificar más
el patrón de glicosilación para parecerse lo máximo posible a las
estructuras humanas más complejas. Una realización preferida de este
método utiliza secuencias conocidas de DNA, que codifican
actividades de glicosilación bioquímica conocidas para eliminar
similares o idénticas funciones bioquímicas en P. pastoris,
de tal manera que la estructura de glicosilación de la variedad
resultante genéticamente alterada de P. pastoris está
modificada.
| Cebador A de PCR | Cebador B de PCR | Gen(es) diana en P. Pastoris | Homólogos |
| ATGGCGAAGGCAGA | TTAGTCCTTCCAAC | 1,6-manosiltransferasa | OCH1 S. cerevisiae, |
| TGGCAGT | TTCCTTC | Pichia albicans | |
| TAYTGGMGNGTNGA | GCRTCNCCCCANCK | 1,2 manosiltransferasas | Familia KTR/KRE, |
| RCYNGAYATHAA | YTCRTA | S. cerevisiae | |
| \begin{minipage}[t]{145mm}Leyenda: M = A o C, R= A o G, W = A o T, S = C o G, Y = C o T, K = G o T, V = A o C o G, H = A o C o T, D = A o G o T, B = C o G o T, N = G o A o T o C.\end{minipage} |
El proceso aquí descrito permite obtener dicha
estructura en gran producción para el propósito de modificarlas para
proporcionar N-glicanos complejos. Un esquema
exitoso para obtener estructuras Man_{5}GlcNAc_{2} adecuadas
incluiría dos aproximaciones paralelas: (1) reducción de la
actividad manosiltransferasa endógena y (2) eliminación de
1,2-\alpha-manosa por manosidasas
para producir altos niveles de estructuras Man_{5}GlcNAc_{2}
convenientes. Lo que distingue a este método del anterior es que
éste trata directamente con aquellos dos temas. Cómo el trabajo de
Chiba y sus colaboradores demuestra, uno puede reducir estructuras
Man_{8}GlcNAc_{2} a un isómero Man_{5}GlcNAc_{2} en S.
cerevisiae, mediante la utilización de la presencia de una
manosidasa fúngica de A. saitoi dentro del RE. Los defectos
de su teoría son dobles: (1) Se forman cantidades insuficientes de
Man_{5}GlcNAc_{2} en la fracción de glicoproteína extracelular
(10%) y (2) no está claro que la estructura formada in vivo
de Man_{5}GlcNAc_{2,} de hecho, sea capaz de aceptar GlcNAc por
acción de GlcNAc transferasa I. Si diversos sitios de glicosilación
están presentes en una proteína deseada la probabilidad (P) de
obtener dicha proteína en una forma correcta sigue la relación
P=(F)^{n}, donde n es igual al número de sitios de
glicosilación, y F es igual a la fracción de glicoformas deseadas.
Una glicoproteína con tres sitios de glicosilación tendría un 0,1%
de posibilidades de aportar los precursores apropiados para el
procesamiento de N-glicanos complejos o híbridos en
todos sus sitios de glicosilación, lo cuál limita el valor comercial
de tal aproximación.
La mayoría de enzimas que están activas en el RE
y en el aparato de Golgi de S. cerevisiae tienen un pH
óptimo que está entre 6,5 y 7,5 (ver Tabla 3). Todas las
aproximaciones previas para reducir la manosilación mediante la
acción de manosidasas recombinantes se han concentrado en enzimas
que tienen un pH óptimo alrededor de 5,0 (Martinet et al.,
1998, and Chiba et al., 1998), aunque la actividad de estas
enzimas se reduce a menos del 10% a pH 7,0 y así más probablemente
proporcionan una insuficiente actividad en su punto de utilización,
el RE y el Golgi proximal de P. pastoris y S.
cerevisiae. Un proceso preferido utiliza una manosidasa in
vivo, dónde el pH óptimo de la manosidasa está dentro de 1,4
unidades de pH de la mediana de pH óptimo de otras enzimas
marcadoras representativas en los mismos orgánulo(s). El pH
óptimo de la enzima para ser dirigida a un orgánulo específico se
igualaría con el pH óptimo de otras enzimas que se encuentren en el
mismo orgánulo, de tal manera que se obtiene la máxima actividad por
unidad de enzima. La Tabla 3 resume la actividad de manosidasas de
varias fuentes y su respectivo pH óptimo. La Tabla 4 resume su
localización.
| Fuente | Enzima | pH óptimo | Referencia |
| Aspergillus saitoi | 1,2-\alpha-manosidasa | 5,0 | Ichishima et al., 1999 Biochem. J. |
| 339 (Pt 3):589-597 | |||
| Trichoderma reesei | 1,2-\alpha-manosidasa | 5,0 | Maras et al., 2000 J. Biotechnol. |
| 77(2-3):255-263 | |||
| Penicillium citrinum | 1,2-\alpha-D-manosidasa | 5,0 | Yoshiba et al., 1993 Biochem. J. |
| 290(Pt 2):349-354 | |||
| Aspergillus nidulans | 1,2-\alpha-manosidasa | 6,0 | Eades and Hintz, 2000 |
| Homo sapiens (IA)Golgi | 1,2-\alpha-manosidasa | 6,0 | |
| Homo sapiens IB (Golgi) | 1,2-\alpha-manosidasa | 6,0 | |
| Células de insectos | Tipo I 1,2-\alpha-Mann_{6}-manosidasa | 6,0 | Ren et al., 1995 Biochem. 34(8): |
| Lepidopteran | 2489-2495 | ||
| Homo sapiens | \alpha-D-manosidasa | 6,0 | Chandrasekaran et al., 1984 Cancer |
| Res. 44(9):4059-68 | |||
| Xanthomonas manihotis | 1,2,3-\alpha-manosidasa | 6,0 | |
| Ratón IB (Golgi) | 1,2-\alpha-manosidasa | 6,5 | Schneikert and Herscovics, 1994 |
| Glycobiology. 4(4):445-50 | |||
| Bacillus sp. (secretado) | 1,2-\alpha-D-manosidasa | 7,0 | Maruyama et al., 1994 Carbohydrate |
| Res. 251:89-98 |
Cuando uno procura ajustar estructuras superiores
de manosa para producir Man_{5}GlcNAc_{2} en el RE o en el
aparato de Golgi de S. cerevisiae, podría escoger cualquier
enzima o combinación de enzimas que (1) tenga/tengan un pH
suficientemente cercano al pH óptimo (es decir, entre pH 5,2 y pH
7,8) y (2) sea/sean conocidos por generar, solo o en conjunto, la
estructura isomérica específica de Man_{5}GlcNAc_{2} requerida
para aceptar la subsiguiente adición de GlcNAc por GnT I. Cualquier
enzima o combinación de enzimas que haya/hayan mostrado generar una
estructura que puede ser convertida en GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}
por GnT I in vitro constituiría una elección adecuada. Este
conocimiento podría obtenerse de la literatura científica o
experimentalmente determinada que una manosidasa potencial puede
convertir Man_{8}GlcNAc_{2}-PA a
Man_{5}GlcNAc_{2}-PA y después probando, si la
estructura Man_{5}GlcNAc_{2}-PA obtenida puede
servir como sustrato para GnT I y UDP-GlcNAc para
dar GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} in vitro. Por ejemplo,
manosidasa IA de una fuente humana o murina sería una elección
apropiada.
Planteamientos previos para reducir la
manosilación mediante la acción de manosidasas exógenas clonadas han
fallado para producir glicoproteínas que tengan una fracción
suficiente (por ejemplo, >27 mol %) de N-glicanos
con la estructura Man_{5}GlcNAc_{2} (Martinet et al.,
1998, y Chiba et al., 1998). Estas enzimas deberían funcionar
eficientemente en el RE o en el aparato de Golgi para ser efectivos
en transformar glicoproteínas nacientes. Mientras las dos
manosidasas utilizadas en la práctica anterior (de A. saitoi
y T. reesei) tienen un pH óptimo de 5,0, la mayoría de
enzimas que están activas en el RE y en el aparato de Golgi de
levaduras (por ejemplo, S. cerevisiae) tienen un pH óptimo
que está entre 6,5 y 7,5 (ver Tabla 3). Puesto que la glicosilación
de proteínas es un proceso altamente evolucionado y eficiente, puede
concluirse que el pH interno del ER y el Golgi también está en el
rango de 6-8. A pH 7,0, la actividad de las
manosidasas utilizadas en la práctica anterior se ve reducida a
menos del 10%, lo cuál es insuficiente para la producción eficiente
de Man5GlcNAc2 in vivo. El trabajo de Chiba fue también
presentado en EP-Al 1 211 310. Se proporcionan más
comentarios aquí anteriormente.
| Gen | Actividad | Localización | pH óptimo | Autor(es) |
| Ktrl | \alpha-1,2-manosiltransferasa | Golgi | 7,0 | Romero et al., 1997 Biochem. J. 321(Pt 2): |
| 289-295 | ||||
| Mnsl | \alpha-1,2-manosidasa | RE | 6,5 | |
| CWH4l | Glucosidasa I | RE | 6,8 | |
| - - - | manosiltransferasa | Golgi | 7-8 | Lehele and Tanner, 1974 Biochim. Biophys. |
| Acta 350(1):225-235 | ||||
| Kre2 | \alpha-1,2 manosiltransferasa | Golgi | 6,5-9,0 | Romero et al., 1997 |
La enzima
\alpha-1,2-manosidasa tendría una
actividad óptima a un pH entre 5,1 y 8,0. En una realización
preferida, la enzima tiene una actividad óptima a un pH entre 5,9 y
7,5. El pH óptimo puede determinarse bajo condiciones de ensayo
in vitro. Manosidasas preferidas incluyen aquellas listadas
en la Tabla 3 que tienen un pH óptimo apropiado, por ejemplo,
Aspergillus nidulans, Homo sapiens IA(Golgi), Homo
sapiens IB (Golgi), células de insectos Lepidópteros
(IPLB-SF21AE), Homo sapiens, ratón IB
(Golgi), y Xanthomonas manihotis. En una realización
preferida, un gen único clonado manosidasa es expresado en el
organismo huésped. Sin embargo, en algunos casos podría ser deseable
expresar diversos genes manosidasa diferentes, o diversas copias de
un gen particular, para alcanzar una adecuada producción de
Man_{5}GlcNAc_{2}. En casos dónde son usados múltiples genes,
las manosidasas codificadas tendrían todas un pH óptimo dentro del
rango preferente de 5,1 a 8,0, o especialmente entre 5,9 y 7,5. En
una realización especialmente preferida la actividad manosidasa está
dirigida al RE o cis Golgi, donde ocurren las reacciones tempranas
de glicosilación.
Un segundo paso del proceso involucra la adición
secuencial de azúcares a la estructura de carbohidrato naciente
mediante la modificación de la expresión de glucosiltransferasas
dentro del aparato de Golgi. Este proceso requiere primero la
expresión funcional de GnT I en el aparato de Golgi proximal o medio
así como también asegurarse el suficiente aporte de
UDP-GlcNAc.
Puesto que el objetivo último de este esfuerzo de
ingeniería genética es una cepa fuerte de producción de proteína que
sea capaz de llevarse a cabo con éxito en un proceso de fermentación
industrial, la integración de múltiples genes en el cromosoma
fúngico implica una planificación cuidadosa. La cepa modificada
seguramente tendrá que ser transformada con un rango de diferentes
genes, y estos genes tendrán que ser transformados en una forma
estable para asegurar que la actividad deseada se mantenga a lo
largo del proceso de fermentación. Cualquier combinación de las
siguientes actividades enzimáticas tendrá que ser creada en el
huésped de expresión de proteína fúngica: sialiltransferasas,
manosidasas, fucosiltransferasas,galactosiltransferasas,
glucosiltransferasas, GlcNAc transferasas, transportadores
específicos de RE yGolgi (por ejemplo, transportadores syn y
antiport para UDP-galactosa y otros precursores),
otras enzimas involucradas en el procesado de oligosacáridos y
enzimas involucradas en la síntesis de precursores de oligosacáridos
activados tales como UDP-galactosa y el ácido
CMP-N-acetilneuramínico. Al mismo
tiempo, un número de genes que codifican enzimas conocidos por ser
característicos de reacciones de glicosilación no humanas, tendrán
que ser eliminados.
Glicosiltransferasas y manosidasas cubren la
superficie interna (luminal) del RE y del aparato de Golgi y de ese
modo proporcionan una superficie "catalítica" que permite el
procesamiento secuencial de glicoproteínas cuando éstas avanzan a lo
largo de la cadena del RE y Golgi. De hecho, los múltiples
compartimentos del Golgi cis, medio y trans y la cadena
trans-Golgi (TGN: Trans Golgi Network), proporcionan
las diferentes localizaciones dónde la secuencia ordenada de
glicosilación puede llevarse a cabo. Puesto que una glicoproteína
procede de la síntesis en el RE para madurar completamente en el
Golgi distal o TGN, éste está expuesto secuencialmente a diferentes
glicosidasas, manosidasas y glicosiltransferasas de tal manera que
puede sintetizarse una estructura de carbohidrato específica. Mucho
trabajo se ha dedicado a revelar el mecanismo exacto por el cual
estas enzimas son retenidas y ancladas en su respectivo orgánulo. La
imagen desarrollada es compleja pero las evidencias sugieren que la
región troncal, la región de rotación de la membrana y la cola
citoplasmática individualmente o en conjunto dirigen las enzimas a
la membrana de orgánulos individuales y así localizan el dominio
catalítico asociado a aquel locus.
Las secuencias de localización son bien conocidas
y están descritas en la literatura científica y en bases de datos
públicas, tal y como se discute en mayor detalle a continuación
respecto a las bibliotecas sobre la selección de secuencias de
localización y enzimas dirigidas.
Una biblioteca que al menos incluye dos genes que
codifican los enzimas de glicosilación exógenos se transforman en el
organismo huésped, produciendo una población genéticamente mixta.
Los transformantes que tienen los fenotipos de glicosilación
deseados se seleccionan entonces a partir de la población mixta. En
una realización preferida, el organismo huésped es una levadura,
especialmente P. pastoris, y la vía de glicosilación del
huésped se modifica mediante la expresión operativa de uno o más
enzimas de glicosilación humanos o animales, produciendo
N-glicanos proteicos similares o idénticos a las
glicoformas humanas. En una realización especialmente preferida, la
biblioteca de DNA incluye constructos genéticos que codifican
fusiones de enzimas de glicosilación con secuencias localizadoras
para varios sitios celulares implicados en la glicosilación
especialmente el RE, Golgi cis, Golgi medio o Golgi
trans.
trans.
Los ejemplos de modificaciones de la
glicosilación que pueden ser efectuados usando el método son: (1)
generar un microorganismo eucariótico para añadir residuos de manosa
a partir de Man_{8}GlcNAc_{2} para producir
Man_{5}GlcNAc_{2} como un N-glicano proteico;
(2) generar un microorganismo eucariótico para añadir un residuo de
N-acetilglucosamina (GlcNAc) a Man_{5}GlcNAc_{2}
mediante la acción de GlcNAc transferasa 1; (3) generar un
microorganismo eucariótico para expresar funcionalmente un enzima
tal como la N-acetilglucosamina transferasa (GnT 1,
GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT VI), manosidasa II,
fucosiltransferasa, galactosil tranferasa (GalT) o
sialiltransferasas (ST).
Por repetición del método, pueden generarse
incrementalmente vías de glicosilación complejas en los
microorganismos diana. En una realización preferida el organismo
huésped se transforma dos o más veces con bibliotecas de DNA que
incluyen secuencias que codifican las actividades de glicosilación.
La selección de los fenotipos deseados puede ser realizada después
de cada ronda de transformación o alternativamente después que se
hayan dado varias transformaciones. La vías de glicosilación
complejas pueden ser rápidamente modificadas de esta manera.
Es necesario ensamblar una biblioteca de DNA que
incluya al menos dos genes exógenos que codifiquen los enzimas de
glisosilación. Además de las secuencias del marco de lectura
abierto, generalmente se prefiere proporcionar cada constructo de la
biblioteca con tales promotores, terminadores de la transcripción,
cebadores, sitios de unión al ribosoma, y otras secuencias
funcionales puesto que puede ser necesario asegurar la transcripción
efectiva y la traducción de genes bajo la transformación en el
organismo huésped. Donde el huésped es Pichia pastoris, los
promotores adecuados incluyen, por ejemplo, los promotores AOXI,
AOX2, DAS y P40. También se prefiere proporcionar cada
constructo con al menos un marcador selectivo, tal como un gen para
impartir resistencia al fármaco o para complementar una lesión
metabólica del huésped. La presencia del marcador es útil en la
subsiguiente selección de transformantes; por ejemplo, en levadura
los genes URA3, HIS4, SUC2, G418, BLÁ o SHBLE
pueden
usarse.
usarse.
En algunos casos la biblioteca puede ensamblarse
a partir de los genes existentes o de los de tipo salvaje. En una
realización preferida sin embargo la biblioteca de DNA se ensambla a
partir de la fusión de dos o más sub-bibliotecas.
Mediante ligación, es posible crear un gran número de constructos
que codifican actividades útiles de glicosilación dirigida. Por
ejemplo, una sub-biblioteca útil incluye secuencias
de DNA que codifican cualquier combinación de enzimas tales como
sialiltransferasas, manosidasas, fucosiltransferasas,
galactosiltransferasas, glucosiltransferasas y GlcNAc transferasas.
Preferiblemente, los enzimas son de origen humano, aunque otros
enzimas mamíferos animales o fúngicos también son útiles. En una
realización preferida, los genes son truncados para dar fragmentos
que codifican los dominios catalíticos de los enzimas. Eliminando
las secuencias endógenas localizadoras, los enzimas entonces pueden
ser redireccionados y expresados en otros sitios celulares. La
opción de tales dominios catalíticos puede ser guiada mediante el
conocimiento del ambiente particular en que el dominio catalítico
subsiguientemente se activa. Por ejemplo, si un enzima de
glicosilación particular se activa en el Golgi distal, y todos los
enzimas conocidos del organismo huésped en el Golgi distal tienen un
cierto pH óptimo, entonces se escoge un dominio catalítico el cual
muestra actividad adecuada a este pH.
Otra sub-biblioteca útil incluye
secuencias de DNA que codifican péptidos señal que resultan en la
localización de una proteína a un sitio particular dentro del RE,
Golgi o red trans Golgi. Estas secuencias señal pueden ser
seleccionadas a partir del organismo huésped así como a partir de
otros organismos relacionados o no relacionados. Las proteínas de
unión a la membrana del RE o Golgi generalmente también pueden
incluir, por ejemplo, secuencias N-terminales que
codifican una cola citosólica (ct), un dominio transmembrana (tmd),
y una región de unión (sr). Las secuencias de la ct, el tmd y la sr
son suficientes individualmente o en combinación con proteínas
ancla a la membrana interna (luminal) de la organela. En
consecuencia, una realización preferida de la
sub-biblioteca de secuencias señal incluye las
secuencias de la ct, el tmd y/o la sr de estas proteínas. En algunos
casos se desea proporcionar la sub-biblioteca con
longitudes variadas de las secuencias de la sr. Esto puede
realizarse mediante PCR usando cebadores que se unan al extremo 5'
del DNA que codifican la región citosólica y empleando una serie de
cebadores opuestos que se unen a varias partes de la región de
unión. Aún otras fuentes útiles de secuencias señal incluyen
péptidos señal recuperados, p. ej. los tetrapéptidos HDEL o KDEL,
que generalmente se encuentran en el C-terminal de
proteínas que se transportan retrógadas en el RE o Golgi. Aún otras
fuentes de las secuencias señal incluyen (a) proteínas de membrana
de tipo II, (b) los enzimas de la lista de la Tabla 3, (c)
transportadores de nucleótidos azúcar que abarcan la membrana que se
localizan en el Golgi, y (d) secuencias citadas en la Tabla 5.
| Gen o secuencia | Organismo | Función | Ubicación del |
| producto génico | |||
| MnsI | S.cerevisiae | \alpha-1,2-manosidasa | ER |
| OCH1 | S. cerevisiae | 1,6-manosiltransferasa | Golgi (cis) |
| MNN2 | S. cerevisiae | 1,2-manosiltransferasa | Golgi (medial) |
| MNN1 | S. cerevisiae | 1,3-manosiltransferasa | Golgi (trans) |
| OCH1 | P. pastoris | 1,6-manosiltransferasa | Golgi (cis) |
| 2,6 ST | H. sapiens | 2,6-sialiltransferasa | red trans Golgi |
| UDP-Gal T | S. pombe | transportador UDP-Gal | Golgi |
| Mntl | S. cerevisiae | 1,2-manosiltransferasa | Golgi (cis) |
| HDEL en el C-terminal | S. cerevisiae | recuperación de la señal | RE |
En cualquier caso, es altamente preferido que las
secuencias señal se seleccionen sean apropiadas para la actividad
enzimática o actividades que sean modificadas en el huésped. Por
ejemplo, en el desarrollo de un microorganismo modificado capaz de
sialilación terminal de N-glicanos nacientes, un
proceso que tiene lugar en el Golgi distal en humanos, se desea
utilizar una sub-biblioteca de secuencias señal
derivadas de las proteínas del Golgi distal. Similarmente, la
modificación de Man_{8}GlcNAc_{2} mediante una
\alpha-1,2-manosidasa para dar
Man_{5}GlcNAc_{2} es un paso temprano en la formación del
complejo N-glicano en humanos. En consecuencia es
deseable que esta reacción tenga lugar en el RE o Golgi proximal de
un microorganismo huésped modificado. Se usa una
sub-biblioteca que codifica señales de retención del
RE y del Golgi proximal.
En una realización preferida, Se construye
entonces una biblioteca de DNA, mediante el marco de ligación de una
subbiblioteca que incluye secuencias de señal que codifican DNA con
una subbiblioteca que incluye enzimas de glicosilación que codifican
DNA o fragmentos catalíticamente activos de los mismos. La
biblioteca resultante incluye genes sintéticos que codifican
proteínas de fusión. En algunos casos es aconsejable proporcionar
una secuencia señal al N-terminal de una proteína de
fusión, o en otros casos al C-terminal. En
ocasiones, las secuencias señal se pueden insertar en el marco de
lectura abierto de un enzima, siempre y que no afecte la estructura
proteica de los dominios plegados individuales.
El método es más efectivo cuando una biblioteca
de DNA transformada en el huésped contiene una gran diversidad de
secuencias, con lo cual aumenta la probabilidad de que por lo menos
un transformante mostrará el fenotipo deseado. En consecuencia,
antes de la transformación, una biblioteca de DNA o una
subbiblioteca constituyente puede estar sometida a una o más rondas
de barajado de genes, EP-PCR o mutagénesis in
vitro.
Entonces la biblioteca de DNA se transforma en el
organismo huésped. En la levadura, se puede utilizar cualquier
método necesario de transferencia de DNA, como la electroporación,
el método de cloruro de litio o el método de esferoplasto. Para
producir una cepa estable adecuada para la fermentación de alta
densidad, es aconsejable integrar las construcciones de biblioteca
de DNA en el cromosoma del huésped. En una realización preferida, la
integración se lleva a cabo vía recombinación homóloga, utilizando
las técnicas ya conocidas en el campo. Por ejemplo, a los elementos
de la biblioteca de DNA se les proporciona secuencias flanqueadoras
homólogas a las secuencias del organismo huésped. De este modo, la
integración se realiza en un lugar definido en el genoma del
huésped, sin afectar los genes deseados o esenciales. En una
realización preferida especial, la biblioteca de DNA se integra en
el lugar de un gen no deseado en un cromosoma huésped, lo que
efectúa la interrupción o supresión del gen. Por ejemplo, la
integración en los lugares de los genes OCHl, MNNl o MNN4 permite la
expresión de la biblioteca de DNA deseada mientras se previene la
expresión de los enzimas involucrados en la hipermanosilación de
levadura de las glicoproteínas. En otras realizaciones, la
biblioteca de DNA se puede introducir en el huésped vía un
cromosoma, un plasmidio, un vector retroviral o una integración
aleatoria en el genoma huésped. En cualquier caso, es generalmente
aconsejable incluir con cada construcción de biblioteca de DNA por
lo menos un gen marcador seleccionable para permitir la fácil
selección de los organismos que se han transformado de forma
estable. Los genes marcadores reciclables como ura3, que se
pueden seleccionar a favor o en contra, son especialmente
adecuados.
Después de la transformación de una cepa huésped
con la biblioteca de DNA, se seleccionan los transformantes que
presentan el fenotipo de glicosilación deseado. La selección se
puede realizar en un solo paso o con una serie de pasos de
enriquecimiento y/o agotamiento fenotípicos utilizando alguno de los
varios ensayos o métodos de detección. La caracterización fenotípica
se puede llevar a cabo manualmente o utilizando equipos de cribaje
de alta producción automatizados. Normalmente, un microorganismo
huésped muestra N-glicanos proteicos en la
superficie de la célula, donde se localizan varias glicoproteínas.
En consecuencia, se pueden cribar para un fenotipo de glicosilación
mediante la exposición de las células a una lectina o anticuerpo que
une específicamente al N-glicano esperado. Una gran
variedad de lectinas oligosacárido-específicas
están disponibles a nivel comercial (EY Laboratories, San Mateo,
CA). De forma alternativa, los anticuerpos a
N-glicanos humanos o animales específicos están
disponibles a nivel comercial o se pueden producir utilizando
técnicas estándar. Una lectina o anticuerpo apropiados se pueden
conjugar a una molécula indicadora, como un cromóforo, fluoróforo,
radioisótopo o un enzima que tiene un sustrato cromogénico (Guillen
et al., 1998. Proc. Natl. Acad Sci. USA
95(14):7888-7892). Entonces, el cribaje se
puede llevar a cabo utilizando métodos analíticos como
espectrofotometría, fluorimetría, clasificación de células activada
por fluorescencia o contador de centelleo. En otros casos, puede
ser necesario analizar glicoproteínas aisladas o
N-glicanos de células transformadas. El aislamiento
de la proteína se puede realizar con técnicas ya conocidas en el
campo. En los casos donde es necesario un N-glicano
aislado, se puede utilizar un enzima como
endo-(\beta-N-acetilglucosaminidasa
(Genzyme Co., Boston, MA) para partir los N-glicanos
de las glicoproteínas. Entonces, las proteínas aisladas o los
N-glicanos se pueden analizar con cromatografía
líquida (por ejemplo HPLC), espectroscopía de masas u otros medios
adecuados. La patente Estadounidense No. 5.595.900 enseña distintos
métodos mediante los cuales se pueden identificar las células con
las estructuras de carbohidrato extracelulares deseadas. Antes de la
selección de un transformante deseado, puede ser aconsejable vaciar
la población transformada de células con fenotipos no deseados. Por
ejemplo, cuando se utiliza el método para generar una actividad de
manosidasa funcional en las células, los transformantes deseados
tendrán niveles más bajos de manosa en la glicoproteína celular. Al
exponer la población transformada a un radioisótopo letal de manosa
en el medio de cultivo vacía la población de transformantes con el
fenotipo no deseado, es decir altos niveles de manosa incorporada.
De forma alternativa, una lectina citotóxica o anticuerpo, dirigida
contra un N-glicano no deseado, se puede usar para
vaciar la población transformada de fenotipos no deseados.
Para que una glicosiltransferasa funcione
satisfactoriamente en el aparato de Golgi, es necesario que se
proporcione al enzima una concentración suficiente de un azúcar de
nucleótido apropiado, que es el donante de alta energía de la
fracción de azúcar añadida a una glicoproteína naciente. Se
proporcionan estos azúcares nucleótidos a los compartimientos
apropiados mediante la expresión de un gen exógeno que codifica un
transportador de azúcar nucleótido en el microorganismo huésped. La
elección del enzima transportador está influenciada por la
naturaleza de la glicosiltransferasa exógena que se utiliza. Por
ejemplo, una transferasa GlcNAc puede necesitar un transportador de
UDP-GlcNAc, una fucosiltransferasa puede necesitar
un transportador de GDP-fucosa, una
galactosiltransferasa puede necesitar un transportador de
UDP-galactosa o una sialiltransferasa puede
necesitar un transportador de ácido CMP-siálico.
La proteína transportadora añadida lleva un
azúcar nucleótido del citosol al aparato de Golgi, donde el azúcar
nucleótido puede reaccionar con la glicosiltransferasa, por ejemplo
para alargar un N-glicano. La reacción libera un
difosfato o monofosfato nucleósido, por ejemplo UDP, GDP o CMP. Como
la acumulación de un difosfato nucleósido inhibe la siguiente
actividad de una glicosiltranferasa, frecuentemente también es
aconsejable proporcionar una copia expresada de un gen que codifica
una difosfatasa nucleótida. La difosfatasa (específica para UDP o
GDP como apropiada) hidroliza el difosfonucleósido para producir un
monosfosfato nucleósido y fosfato inorgánico. El monofosfato
nucleósido no inhibe la glicotransferasa y en ningún caso se exporta
del aparato de Golgi con un sistema celular endógeno. Más abajo se
describen enzimas transportadores adecuados, que son típicamente de
origen mamífero.
El uso del anterior método general es posible
entenderlo tomando como referencia los siguientes ejemplos no
determinativos. También aparecen resumidos en la Tabla 6 los
ejemplos de las realizaciones preferidas.
Se necesita una
\alpha-1,2-manosidasa para el
ribeteado de Man_{8}GlNAc_{2} y producir Man_{5}GlNAc_{2,}
intermediario esencial para la formación del complejo
N-glicano. Se modifica un mutante OCHl de
P. pastoris para expresar el
interferón-\beta humano secretado bajo el control
de un promotor de aox. Se construye una biblioteca de DNA
mediante la ligación en el marco del dominio catalítico de la
manosidasa humana IB (una
\alpha-1,2-manosidasa) con una
subbiblioteca que incluye secuencias que codifican los péptidos
tempranos de localización del aparato de Golgi. Entonces la
biblioteca de DNA se transforma en el organismo huésped, lo que
resulta en una población genéticamente mezclada donde cada individuo
transformante expresa el interferón-\beta del
mismo modo que un gen manosidasa sintético de la biblioteca. Se
cultivan las colonias de individuos transformantes y se induce la
producción de interferón mediante la adición de metanol. Bajo estas
condiciones, más de un 90% de la proteína segregada incluye
interferón-\beta. Se purifican los sobrenadantes
para eliminar las sales y los contaminantes de bajo peso molecular
con cromatografía en fase inversa sílice C_{18}. Los
transformantes deseados que expresan apropiadamente la
\alpha-1,2-manosidasa diana,
activa producen interferón-\beta incluyendo los
N-glicanos de la estructura Man_{5}GlcNAc_{2},
la cual tiene una masa molecular reducida en comparación con el
interferón de la cepa parental. Los sobrenadantes purificados,
incluyendo el interferón-\beta, se analizan con
espectroscopía de masas MALDI-TOF y se identifican
colonias que expresan la forma deseada del
interferón-\beta.
interferón-\beta.
Es necesaria la actividad de GlcNAc Transferasa I
para la maduración de los complejos N-glicanos.
Man_{5}GlcNAc_{2} solo se puede añadir con manosidasa II, un
paso necesario en la formación de las glicoformas humanas, antes de
la adición de GlcNAc al residuo terminal
\alpha-1,3 manosa mediante GlcNAc Transferasa I
(Schachter, 1991 Glycobiology 1(5):453-461).
Así, se prepara una biblioteca donde se incluyen fragmentos de DNA
que codifican genes GlcNAc Transferasa I identificados debidamente.
El organismo huésped es una cepa, por ejemplo una levadura, con
bajo contenido de hipermanosilación (ej. un mutante OCHl);
proporciona el sustrato UDP-GlcNAc en el aparato de
Golgi y/o en el RE, y les proporciona N-glicanos de
la estructura de Man_{5}GlcNAc_{2}. Después de la transformación
del huésped con la biblioteca de DNA, se cribran los transformantes
que tienen la mayor concentración de GlcNAc terminal en la
superficie celular o de forma alternativa segregan la proteína
teniendo el contenido de GlcNAc terminal más alto. Dicho cribaje se
realiza usando un método visual (ej. Un procedimiento de tinción),
un anticuerpo específico de unión GlcNAc terminal o una lectina. O
bien, los transformantes escogidos presentan una unión reducida de
algunas lectinas específicas para los residuos de manosa
específicos.
En otro ejemplo es aconsejable, para generar una
glicoforma humana en un microorganismo, quitar las dos manosas
terminales aún existentes de la estructura
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} mediante la acción de manosidasa II. Se
fusiona una biblioteca de DNA que incluye las secuencias que
codifican las señales de localización de la caras cis y media del
aparato de Golgi en el marco de una biblioteca que codifica dominios
catalíticos de manosidasa II. El organismo huésped es una cepa, por
ejemplo una levadura, con bajo contenido de hipermanosilación (ej.
un mutante OCHl) y proporciona N-glicanos con la
estructura GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2} en el aparato de Golgi y/o
en el RE. Después de la transformación, se seleccionan los
organismos con el fenotipo de glicosilación esperado. Se utiliza un
ensayo in itro en un método. La estructura deseada
GlcNAcMan_{3}GlcNAc_{2} (pero no la no deseada
GlcNAcMan_{5}GlcNAc_{2}) es un sustrato para el enzima GlcNAc
Transferasa II. Así, se puede ensayar con colonias simples
utilizando dicho enzima in vitro en presencia del sustrato,
UDP-GlcNAc. La liberación de UDP está determinado o
bien por HPLC o bien por un ensayo enzimático de UDP.
Alternativamente, se usa UDP-GLcNAc marcado con
radioactividad.
Los anteriores ensayos in vitro se
realizan convenientemente en colonias concretas utilizando el equipo
de cribaje de alta producción. O bien, en otras ocasiones, se usa un
ensayo de unión de lectina. En este caso, la unión reducida de
lectinas específica para las manosas terminales, permite la
selección de los transformantes con el fenotipo esperado. Por
ejemplo, la lectina Galantus nivalis se une específicamente a
la \alpha-1,3-manosa terminal, la
concentración de la cual se reduce con la presencia de la actividad
de la manosidasa II expresada operativamente. En un método útil, la
lectina G. nivalis juntada a un soporte agarosa sólido
(disponible en Sigma Chemical, St. Louis, MO) se usa para reducir la
población transformada de células con altos niveles de
\alpha-1,3-manosa terminal.
Los enzimas
\alpha2,3-sialiltransferasa y
\alpha2,6-sialiltransferasa añaden ácido siálico
terminal a los residuos de galactosa en los
N-glicanos humanos nacientes, llevando a
glicoproteínas maduras. En los seres humanos las reacciones aparecen
en la cara trans del aparato de Golgi o TGN. Así se construye una
biblioteca de DNA mediante el marco de fusión de secuencias que
codifican dominios catalíticos de sialiltransferasa con secuencias
que codifican la cara trans de Golgi o las señales de localización
TGN. El organismo huésped es una cepa, por ejemplo una levadura, con
bajo contenido de hipermanosilación (ej. un mutante OCH1), que
proporciona N-glicanos con residuos de galactosa
terminal en la cara trans del aparato de Golgi o TGN, y proporciona
una concentración suficiente de ácido CMP-siálico en
la cara trans del aparato de Golgi o TGN. Después de la
transformación, los transformantes con el fenotipo deseado se
seleccionan usando anticuerpos fluorescentes específicos para los
N-glicanos con un ácido siálico terminal.
\vskip1.000000\baselineskip
Ishida y colaboradores han clonado el cDNA del
transportador UDP-GlcNAc del aparato de Golgi de los
seres humanos (Ishida, N., et al. 1999 J Biochem.
126(1): 68-77). Guillen y colaboradores
han clonado el transportador UDP-GlcNAc de Golgi de
riñón canino mediante la corrección fenotípica de un mutante
Kluyveromyces lactis con bajo contenido de transporte
UDP-GlcNAc Golgi (Guillen, E., et al. 1998).
Así, un gen transportador de UDP-GlcNAc Golgi de
mamífero tiene toda la información necesaria para que la proteína se
exprese y se identifique de manera funcional en el aparato de Golgi
de la levadura.
\vskip1.000000\baselineskip
Puglielli, L. y C. B. Hirschberg 1999 J. Biol.
Chem. 274(50):35596-35600 han
identificado y depurado el transportador GDP-fucosa
de la membrana de Golgi de hígado de rata. El gen correspondiente
se puede identificar usando técnicas estándar, como la secuenciación
N-terminal y el Southern blotting utilizando una
sonda de DNA degenerado. Entonces el gen íntegro se puede expresar
en un microorganismo huésped que también expresa una
fucosiltrans-
ferasa.
ferasa.
\vskip1.000000\baselineskip
El transportador UDP-galactosa
(UDP-Gal) humano se ha clonado y se ha mostrado como
activo en S. cerevisiae. (Kainuma, M., et al. 1999
Glycobiology 9(2): 133-141). Se ha
clonado y expresado funcionalmente un segundo transportador
UDP-galactosa humano (hUGTl) en células ováricas de
hámsters Chinos. Aoki, K., et al. 1999 J. Biochem
126(5): 940-950. Del mismo modo, Segawa y
colaboradores han clonado un transportador
UDP-galactosa de Schizosaccharomyces pombe
(Segawa, H., et al. 1999 Febs Letters 451(3):
295-298).
Aoki y colaboradores (1999) han clonado y
expresado en células Lec 8 CHO el transportador de ácido
CMP-Siálico humano (hCST). También se ha conseguido
la clonación molecular del transportador de ácido
CMP-siálico de hámster (Eckhardt y Gerardy Schahn
1997 Eur. J. Biochem. 248(1):
187-192). La expresión funcional del transportador
de ácido CMP-siálico de murino la consiguió en
Saccharomyces cerevisiae Berninsone, P., et al. 1997 J
Biol. Chenz. 272(19):12616-12619.
| Estructura deseada | Actividades catalíticas | Fuentes adecuadas de secuencias de | Deleción genética | Transportadores |
| adecuadas | localización | adecuada | adecuados y/o | |
| fosfatasas | ||||
| Man_{5}GlcNAc_{2} | \alpha-1,2-manosidasa | Mns1 (N-terminal, S. cerevisiae) | OCH1 | ninguno |
| (murina, humano, esp. | Ochl (N-terminal, S. cerevisiae, | MNN4 | ||
| Bacillus, A. nidulans) | P. pastoris) Ktr1 Mnn9 Mnt1 | MNN6 | ||
| (S. cerevisiae) KDEL, HDEL | ||||
| (C-terminal) | ||||
| GlcNAcMan_{5} | GlcNAc Transferasa I, | Och1 (N-terminal, S. cerevisiae, | OCH1 | UDP-GlcNAc |
| GlcNAc_{2} | (humana, murina, rata, | P. pastoris) KTRl (N-terminal) | MNN4 | Transportador |
| etc.) | KDEL, HDL (C-terminal) | MNN6 | (humano, murino, | |
| Mnn1(N-terminal, S. cerevisiae) | K. lactis) UDPasa | |||
| Mnt1 (N-terminal, S. cerevisiae) | (humana) | |||
| GDPasa(N-terminal, S. cerevisiae) | ||||
| GlcNAcMan_{3} | Manosidasa II | Ktr1 | OCH1 | UDP-GlcNAc |
| GlcNAc_{2} | Mnn1 (N-terminal, S. cerevisiae) | MNN4 | transportador | |
| Mnt1 (N-terminal, S. cerevisiae) | MNN6 | (humano, murino, | ||
| Kre2 (P. pastoris) Ktr1 (S. cerevisiae) | K. lactis) UDPasa | |||
| Ktr1 (P. pastoris) Mnn1 (S. cerevisiae) | (humana) | |||
| GlcNAc_{(2-4)} | GlcNAc Transferasa | Mnn1(N-terminal, S. cerevisiae) | OCH1 | UDP-GlcNAc |
| Man_{3}GlcNAc_{2} | II, III, IV, V (humana, | Mnt1(N-terminal, S. cerevisiae) | MNN4 | transportador |
| murina) | Kre2/Mntl (S. cerevisiae) | MNN6 | (humano, murino, | |
| Kre2 (P. pastoris) Ktr1 (S. cerevisiae) | K. lactis) UDPasa | |||
| Ktr1 (P. pastoris) Mnn1 (S. cerevisiae) | (humana) | |||
| Gal_{(1-4)}GlcNac_{(2-4)-} | \beta-1,4-Galactosil | Mnn1 (N-terminal, S. cerevisiae) | OCH1 | UDP-Galactosa y |
| Man_{3}GlcNac_{2} | transferasa (humana) | Mnt1 (N-terminal, S. cerevisiae) | MNN4 | transportadora |
| Kre2/Mnt1 (S.cerevisiae) | MNN6 | (humana, S. pombe) | ||
| Kre2 (P. pastoris) | ||||
| Ktr1 (S. cerevisiae) Ktr1 (P. pastoris) | ||||
| Mnn1 (S. cerevisiae) | ||||
| NANA_{(1-4)-}Gal_{(1-4)} | \alpha-2,6-Sialiltransferasa | KTR1 MNN1 (N-terminal, | OCH1 | Ácido CMP-Siálico |
| GlcNac_{(2-4)-} Man_{3} | (humana) \alpha-2,3- | S. cerevisiae) MNT1 (N-terminal, | MNN4 | transportador |
| GlcNAc_{2} | Sialiltransferasa | S. cerevisiae) Kre2/Mntl | MNN6 | (humano) |
| (S. cerevisiae) Kre2 (P. pastoris) | ||||
| Ktr1 (S. cerevisiae) | ||||
| Ktr1 (P. pastoris) MNN1 | ||||
| (S. cerevisiae) |
\newpage
1. El European Bioinformatics Institute (EBI) es
un centro para la investigación y servicios en bioinformática:
http://www.ebi.ac.uk
2. Base de datos Swissprot:
http://www.expasy.ch/spr
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52. mRNA de rata (fragmentos), Wen et al
(1992) J. Biol. Chem. 267:2512-2518
Métodos adicionales y reactivos que se pueden
utilizar en los métodos para modificar la glicosilación están
descritos en diferentes publicaciones, como Patente Estadounidense
No. 5.955.422, Patente Estadounidense No. 4.775.622, Patente
Estadounidense No. 6.017.743, Patente Estadounidense No. 4.925.796,
Patente Estadounidense No. 5.766.910, Patente Estadounidense No.
5.834.251, Patente Estadounidense No. 5.910.570, Patente
Estadounidense No. 5.849.904, Patente Estadounidense No. 5.955.347,
Patente Estadounidense No. 5.962.294, Patente Estadounidense No.
5.135.854, Patente Estadounidense nº 4.935.349, Patente
Estadounidense No. 5.707.828 y Patente Estadounidense No.
5.047.335.
Sistemas de expresión de levadura apropiados se
pueden obtener de fuentes como American Type Culture Collection,
Rockville, MD. Los vectores están disponibles a nivel comercial en
diferentes fuentes.
Claims (34)
1. Una célula huésped que es un hongo unicelular
o filamentoso que no muestra actividad
alfa-1,6-manosiltransferasa con
respecto al N-glicano sobre una glicoproteína, que
tiene en su retículo endoplasmático (RE) o aparato de Golgi un
enzima híbrido seleccionado para tener actividad óptima en el RE o
aparato de Golgi de dicha célula huésped, de manera que dicha célula
huésped es capaz de formar de 50 a 100 moles % de
Man_{5}GlcNAc_{2} sobre una glicoproteína sustrato, el enzima
híbrido que comprende:
(a) un dominio catalítico de manosidasa exógeno
que tiene una actividad óptima en dichos RE o Golgi a un pH entre
5,1 y 8,0; fusionado a
(b) un péptido señal localizador anormalmente
asociado con el dominio catalítico de (a), donde dicho péptido señal
de selección celular dirige el ya citado dominio catalítico de
manosidasas exógenas hacia dicho RE o aparato de
Golgi.
Golgi.
2. La célula huésped de la reivindicación 1,
donde dicho dominio catalítico tiene una actividad
\alpha-1,2-manosidasa.
3. La célula huésped de las reivindicaciones 1 o
2, donde dicha manosidasa comprende un dominio catalítico de
\alpha-1,2-manosidasa derivado de
ratón, humano, Lepidoptera, Aspergillus nidulans, Xanthomonas
manihotis o de la especie Bacillus.
4. La célula huésped de cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 3, donde la manosidasa tiene una
actividad óptima a un pH entre 5,9 y 7,5.
5. La célula huésped de cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 4, que más adelante expresa uno o más
enzimas seleccionados de un grupo compuesto por manosidasas,
glicosiltransferasas y glicosidasas.
6. La célula huésped de la reivindicación 5,
donde por lo menos se localiza un enzima exógeno adicional para la
producción de una glicoproteína mediante la formación de una
proteína de fusión entre el dominio catalítico del enzima exógeno y
un péptido de señal de selección celular anormalmente asociado con
el dominio catalítico que lo dirige al retículo endoplasmático, el
Golgi proximal, medio o distal o la red trans Golgi de la célula
huésped.
7. La célula huésped de la reivindicación 6,
donde dicho dominio catalítico es seleccionado de una glicosidasa o
glicosiltransferasa de GnTI, GnT II, GnT III, GnT IV, GnT V, GnT
VI.
8. La célula huésped de cualquiera de las
reivindicaciones de la 5 a la 7, que más adelante expresa uno o más
enzimas exógenos seleccionados de un grupo formado por transferasa
UDP-GlcNAc, transportador UDP-GlcNAc
y difosfatasas nucleótidas.
9. La célula huésped de cualquiera de las
reivindicaciones de la 5 a la 8, que más adelante expresan uno o más
enzimas exógenos seleccionados de una difosfatasa
UDP-específica y de una difosfatasa
GDP-específica.
10. La célula huésped de cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 9, obtenidas mediante la introducción
de moléculas de ácido nucleico codificando dichos enzimas.
11. La célula huésped de la reivindicación 10,
donde por lo menos una de las moléculas de ácido nucleico
codificando dichos enzimas es integrada en el cromosoma de la célula
huésped.
12. La célula huésped de cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 11, la cual se selecciona del grupo
compuesto por Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia
trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia
opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum,
Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, esp. Pichia,
Saccharomyces cerevisiae, esp.Saccharomyces, Hansenula polymorpha,
esp. Kluyveromyces, Candida albicans, Aspergillus nidulans, y
Trichoderma reesei.
13. La célula huésped de cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 12, que es deficiente adicionalmente
en la actividad de uno o más enzimas seleccionados del grupo
compuesto por manosiltransferasas y fosfomanosiltransferasas.
14. La célula huésped de la reivindicación 13,
que además no expresa un enzima seleccionado del grupo formado por
1,6 manosiltransferasa; 1,3 manosiltransferasa; y 1,2
manosiltransferasa respecto al N-glicano.
15. La célula huésped de cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 14, donde el huésped es un mutante
OCH1 de P. pastoris.
16. Un método para producir la célula huésped de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, el método que comprende
la transformación de dicho hongo unicelular o filamentoso con una
molécula de ácido nucleico que codifica una enzima seleccionada para
tener una actividad óptima en el RE o Golgi de dicha célula huésped,
por lo que dicha célula huésped es capaz de formar 50 a 100 Mol %
Man_{5}GlcNAc_{2} en un sustrato de glicoproteína, comprendiendo
el enzima híbrido:
(a) un dominio catalítico manosidasa exógeno
con una actividad óptima en dicho RE o Golgi a un pH entre 5,1 y
8,0; fusionado a
(b) un péptido señal localizador celular que
no está asociado normalmente al dominio catalítico de (a), donde
dicho péptido señal localizador celular se dirige a dicho dominio
catalítico exógeno a dicho RE o aparato de Golgi.
17. Un método para producir una glicoproteína que
comprende la expresión de la glicoproteína en una célula huésped de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
18. El método de la reivindicación 17, donde
dicha glicoproteína comprende N-glicanos con menos
de seis residuos manosa.
19. El método de la reivindicación 17 o 18, donde
dicha glicoproteína comprende
N-acetilglucosamina.
20. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 19, donde dicha glicoproteína comprende al
menos una rama de oligosacárido que comprende la estructura
GlcNAc-Man.
21. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 20, en donde dicha glicoproteína se selecciona
del grupo consistente en eritropoyetina,
interferón-\alpha,
interferón-\beta,
interferón-\gamma,
interferón-\omega,
granulocito-CSF, factor VIII, factor IX, proteína C,
cadena a del receptor IgE humano soluble, IgG, IgM; uroquinasa,
quimasa, inhibidor tripsina urea, proteína de unión a IGF, factor de
crecimiento epidérmico, factor liberador de la hormona de
crecimiento, proteína de fusión anexina V, angiostatina,
factor-2 de crecimiento del endotelio vascular,
factor-1 inhibidor del progenitor mieloide y
osteoprotegerina.
22. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 21, comprendiendo además el paso de aislar la
glicoproteína del huésped.
23. El método de la reivindicación 22,
comprendiendo además el paso de sujetar la glicoproteína aislada al
menos a una reacción más de glicosilación in vitro, posterior
a su aislamiento del huésped.
24. Un método para producir una glicoproteína en
una célula huésped que es un hongo filamentoso o unicelular que no
presenta actividad alfa-1,6 manosiltransferasa
respecto al N-glicano en una glicoproteína,
comprendiendo el método los pasos de:
(a) expresar dicha glicoproteína en una
población de dichas células huésped transformadas con una biblioteca
de DNA que comprende al menos dos construcciones genéticas
diferentes, comprendiendo ambas un fragmento de DNA que codifica un
enzima híbrido que comprende: (i) un dominio catalítico de
glicosilación de enzimas con una actividad óptima en dicho RE o
Golgi a un pH entre 5,1 y 8,0; fusionado a
- (ii)
- un péptido señal localizador celular que no está asociado normalmente al dominio catalítico de (i), donde dicho péptido señal localizador celular se dirige al RE o al aparato de Golgi de la célula huésped; y
(b) seleccionar la célula huésped presentando
una glicoproteína con un patrón de glicosilación en dicha
glicoproteína.
25. El método de la reivindicación 24, donde la
biblioteca comprende al menos un gen o construcción genética
previamente sometida a técnicas seleccionadas de: barajado de genes,
mutagénesis in vitro, y EP-PCR.
26. El método de la reivindicación 24 o 25, donde
el fragmento de DNA que codifica el dominio catalítico de
glicosilación de enzimas posee una actividad seleccionada del grupo
consistente de manosidasa, glicosidasa, UDP-GlcNAc
transferasa, glicosiltransferasa seleccionado de GnT I, GnT II, GnT
III, GnT IV, GnT V, GnT VI; y donde el péptido señal de localización
celular localiza el enzima predominantemente en un organelo de la
célula huésped seleccionado del grupo consistente de retículo
endoplasmático, cis Golgi, medio Golgi, y trans Golgi.
27. El método de las reivindicaciones 24 o 25,
donde el dominio catalítico de glicosilación de enzimas codificado
posee una actividad manosidasa.
28. El método de la reivindicación 27, donde la
célula huésped además expresa GnT1.
29. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 28, donde la biblioteca comprende al menos un
fragmento de DNA que codifica un enzima de glicosilación de tipo
salvaje.
30. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 29, donde la selección comprende el paso de
analizar una proteína glicosilada o N-glicano
aislado por uno o más métodos seleccionados del grupo consistente
en: (a) espectrometría de masas como
MALDI-TOF-MS; (b) cromatografía
líquida; (c) caracterización de células usando un "sorter" de
células activado por fluorescencia, espectrofotómetro, fluorímetro,
o contador de centelleo; (d) exponer las células huésped a una
lectina o anticuerpo con una afinidad específica para una fracción
oligosacárido deseada; y (e) exponer las células a una molécula
citotóxica o radioactiva seleccionada del grupo consistente en
azúcares, anticuerpos y lectinas.
31. Una célula huésped transformada producida en
el método de cualquiera de las reivindicaciones 16 o 24 a 30.
32. Una composición de glicoproteína obtenible
por cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 17 a 30,
comprendiendo del 50 al 100 mol % de Man_{5}GlcNAc_{2}
convertido por GnT I in vivo a GIcNAcMan_{5}GlcNAc_{2},
dicha glicoproteína sin galactosa, fucosa y el ácido siálico
terminal.
33. Una biblioteca de DNA que comprende
construcciones genéticas, comprendiendo las construcciones un
fragmento de DNA que codifica un péptido señal localizador celular
que se dirige al retículo endoplasmático o aparato de Golgi ligado
en marco con un fragmento de DNA que codifica un enzima de
glicosilación o fragmento catalíticamente activo del mismo con
actividad óptima en dicho RE o Golgi a un pH entre 5,1 y 8,0, dicha
biblioteca de DNA incluye al menos fragmentos de DNA codificando
péptido señal localizador celular y al menos dos fragmentos de DNA
que codifican enzimas de glicosilación exógeno.
34. Una pluralidad de células huésped
comprendiendo una biblioteca DNA de la reivindicación 33.
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