CN102250861A

CN102250861A - 蛋白酶变体

Info

Publication number: CN102250861A
Application number: CN2011101376244A
Authority: CN
Inventors: A.斯文森; S.米宁
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2004-02-13
Filing date: 2005-02-14
Publication date: 2011-11-23
Also published as: CN1942584B; EP2305821A2; EP2325318A1; US20100196990A1; WO2005078074A3; EP2305821A3; EP1713919A2; US8563289B2; CN1942584A; WO2005078074A2; US20070281332A1; JP2007521823A

Abstract

本发明涉及蛋白酶变体，具体的涉及生产亲本RP-II蛋白酶的变体和与亲本RP-II蛋白酶相比具有改变性能的变体的方法。

Description

蛋白酶变体

本申请是申请日为2005年02月14日，申请号为“200580010941.2”(国际申请号为“PCT/DK2005/000097”)，名称为“蛋白酶变体”的发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及属于RP-II或C-组分型蛋白酶的变体，以及构建具有改变性能的这些变体的方法，如稳定性(例如，热稳定性或贮藏稳定性)、Ca2+依赖和pH依赖活性。

发明背景

酶在洗涤剂工业内用作洗涤制剂的一部分已有30多年。从商业角度来看，在这些制剂中蛋白酶是最恰当的酶，但是也常使用其它酶，包括脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶或酶混合物。蛋白酶也用于其它领域，如日用品的生产、兽皮的加工、饲料加工等。

为了提高蛋白酶的价值和/或性能，人们一直在探寻具有改变性能的蛋白酶，如在低温时活性增加、热稳定性增加、在给定的pH下比活增加、Ca²⁺依赖改变、在其它洗涤剂成分(例如，漂白剂、表面活性剂等)存在时稳定性增加、在底物特异性方面发生改变等。

对具有改变性能的蛋白酶的探寻既包括发现天然存在的蛋白酶，即所谓的野生型蛋白酶，也包括例如，通过对编码所述蛋白酶的核酸序列的基因操作来改变公知的蛋白酶。蛋白质三维结构和功能之间关系的知识提高了人们评估要改变哪些蛋白质区域以影响该蛋白质特性的能力。

已表明适用于洗涤剂、食品加工、饲料加工的一组蛋白酶是属于蛋白酶家族S1B谷氨酸特异性内肽酶的RP-II蛋白酶或C-组分蛋白酶。该家族迄今为止仅受到相对较少的关注而且尚未被进一步分成不同的亚组。然而，从所分离的RP-II蛋白酶的氨基酸序列来看，显然存在着亚组。RP-II型芽孢杆菌属蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，其在一级结构上类似于胰凝乳蛋白酶。

在美国专利No.4,266,031(Tang等，Novo Industri A/S)中第一次描述了芽孢杆菌属蛋白酶RP-II家族的蛋白酶，文中该酶被称作组分C，临时性地(并且是不正确地)被表征为不属于丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。组分C被认为是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)碱性蛋白酶即枯草杆菌素(subtilisin)Carlsberg生产中的污染物。

在EP 369 817(Omnigene Bioproducts，Inc.)中，RP-II家族的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)成员通过其氨基酸和DNA序列得以鉴定。该酶再次被认为不是丝氨酸蛋白酶，并被命名为RP-II家族(残余蛋白酶II)。EP 369 817的发明人进一步将该酶表征为金属蛋白酶(Rufo等，1990，J.Bacteriol.21019-1023以及Sloma等，1990，J.Bacteriol.1721024-1029)，将该酶称作mpr。

在WO 91/13553(Novozymes A/S)中，公开了C组分的氨基酸序列，阐明其是特异于谷氨酸和天冬氨酸的丝氨酸蛋白酶，而EP 482 879(Shionogi&Co.Ltd.)公开了来自地衣芽孢杆菌ATCC No.14580的酶和编码C组分的DNA序列，命名为酶Blase。在EP 482 879中，该蛋白酶被描述为特异于谷氨酸(还参见Kakudo等“Purification，characterization，cloning，and expression of aglutamic acid-specific protease from Bacillus licheniformis ATCC 14580”.J.Biol.Chem.267：23782(1992))。

在1997年，Okamoto等(Appl.Microbiol.Biotechnol.(1997)4827-33)发现Blase的枯草芽孢杆菌同系物(命名为BSase)与上述酶mpr/RP-II完全相同。

在1999年，Rebrikov等(Journal of Protein Chemistry，Vol.18，No.1，1999)公开了也属于RP-II家族的来自于中间型芽孢杆菌(B.intermedius)的Glu特异性蛋白酶。

在WO 01/16285中，公开了许多其它的RP-II蛋白酶，连同DNA和氨基酸序列。这些RP-II蛋白酶分离自短小芽孢杆菌(B.pumilus)、哈乌帕拉斯芽孢杆菌(B.halmapalus)和地衣芽孢杆菌。WO 01/16285也公开了许多RP-II蛋白酶变体。这些变体是建立在与RP-II蛋白酶的一级结构(氨基酸序列)有关的各种概念的基础上的。

下表1中的同源性矩阵清楚地表明了RP-II蛋白酶1至8是与矩阵中其它Glu特异性蛋白酶明显有别的独特的一组Glu特异性蛋白酶。

表1

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
														1	100	99	97	60	55	55	47	59	46	45	45	47	49
2		100	99	60	60	59	50	61	50	44	45	46	52
														3			100	60	57	54	47	60	47	45	45	44	49
4				100	94	92	68	57	44	38	40	42	47

5					100	91	59	54	44	42	40	43	45
														6						100	63	53	39	42	46	41	45
7							100	48	41	41	40	36	44
														8								100	50	45	46	46	54
9									100	63	53	55	49
														10										100	53	56	52
11											100	78	54
														12												100	53
13													100

矩阵中，序列以首先公开的专利公开或者序列数据库登录号来标识。

1.芽孢杆菌属菌种JA96谷氨酸特异性内肽酶，JA96，WO 01/16285

2.1p3e中间型芽孢杆菌，谷氨酸特异性内肽酶，BIP，EMBL No.Y5136，Rebrikov等，Journal of Protein Chemistry，Vol.18，No.1，1999

3.芽孢杆菌属菌种BO32谷氨酸特异性内肽酶，BO32，WO 01/16285

4.地衣芽孢杆菌，BLC，WO 01/16285(参见美国专利4,266,031)

5.芽孢杆菌属菌种CDJ31谷氨酸特异性内肽酶，CDJ31，WO 01/16285

6.芽孢杆菌属菌种AC116谷氨酸特异性内肽酶，AC116，WO 01/16285

7.mpr_bacsu枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶，MPR，EP 369 817

8.芽孢杆菌属菌种AA513谷氨酸特异性内肽酶，AA513，WO 01/16285

9.eta_staau金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)表皮剥脱毒素A(Lee等Sequence determination and comparison of the exfoliative toxin A andtoxin B genes from Staphylococcus aureus；J.Bacteriol.169：3904(1987))

10.etb_staau金黄色葡萄球菌表皮剥脱毒素B(Jackson，M.P.；landolo，J.J.；Sequence of the exfoliative toxin B gene of Staphylococcus aureus；J.Bacteriol.167：726(1986))

11.q53781金黄色葡萄球菌(Mu50/ATCC 700699株)(Rieneck等；提交于EMBL/GenBank/DDBJ数据库(1996年6月))

12.q53782金黄色葡萄球菌(Mu50/ATCC 700699株)(Rieneck等，“Molecular cloning and expression of a novel Staphylococcus aureus antigen”.Biochim.Biophys.Acta 1350：128(1997)

13.stsp_staau葡萄球菌丝氨酸内肽酶V8Glu-C(Gray，“Nucleotidesequence of the serine protease gene of Staphylococcus aureus，strain V8”Nucleic Acids Res.15：6757(1987)

已由Cavarelli，J.等Structure Vol.5，p.813 1997确定了属于S1B家族的金黄色葡萄球菌蛋白酶毒素A的三维结构。

然而，尽管属于RP-II蛋白酶的蛋白酶和金黄色葡萄球菌毒素A之间存在序列同源性，但是由于结构的差异，尤其是由于与RP-II蛋白酶同源序列上的显著差异，以金黄色葡萄球菌毒素A三维结构为基础的RP-II蛋白酶三维结构的建模可能导致不正确的三维结构。

本发明的发明人阐明了地衣芽孢杆菌的C组分蛋白酶的三维结构，并且发现这和也属于蛋白酶S1B亚组的金黄色葡萄球菌毒素A的三维结构之间存在着若干的不同。结构上的这种令人惊奇的差别利于我们使用BLC结构作为RP-II蛋白酶的同源性建模的基础，这依次又将提高我们通过蛋白质工程获得在功能性方面发生期望改变的能力。

发明概述

基于C组分的三维结构，发明人修饰了RP-II蛋白酶的氨基酸序列，获得了性能改良的变体。变体将具有改变的性能，如在低温时活性增加、热稳定性增加、在给定的pH下比活增加、Ca²⁺依赖改变、在其它洗涤剂成分(例如，漂白剂、表面活性剂等)存在时稳定性增加等。

从而本发明的目的是提供一种构建具有改变性能的RP-II蛋白酶的方法，特别是提供一种构建具有上述改变性能的RP-II蛋白酶的方法。

因此，就最广义的方面而言，本发明涉及一种构建亲本RP-II蛋白酶变体的方法，其中与所述的亲本RP-II蛋白酶相比，变体具有至少一种改变的性能，该方法包括：

i)分析RP-II蛋白酶的三维结构，以根据结构考虑的评估，鉴定RP-II蛋白酶中至少一个与改变所述性能相关的氨基酸残基或至少一个结构区；

ii)构建RP-II蛋白酶的变体，与亲本RP-II蛋白酶相比，其已在i)中所鉴定的氨基酸残基或结构部分进行修饰以便改变所述性能；和

iii)检验所得RP-II蛋白酶变体的所述性能。

尽管在下面已经描述了预期亲本RP-II蛋白酶在某些区域和/或位置的修饰将会对由此所产生的RP-II蛋白酶变体带来特别的效果，但是应当指出，亲本RP-II蛋白酶在这些区域中的任何一处的修饰也可能产生上述效果外的任何其它效果。例如，所提及的在例如热稳定性提高方面特别有意义的区域和/或位置中任何一处的修饰，也可能引起例如，在更低pH时的更高活性、改变的最佳pH，或者比活增加，如肽酶活性增加。

本发明的另一方面涉及RP-II蛋白酶的变体、编码这些变体的DNA和制备变体的方法。又在本发明的另一方面，涉及变体用于各种工业目的的用途，特别是作为洗涤组合物中的添加剂。本发明的其它方面将由于下面的描述以及所附的权利要求而变得显而易见。

本发明还涉及如下方面：

1、一种构建RP-II蛋白酶变体的方法，其中与亲本RP-II蛋白酶相比，变体具有至少一种改变的性能，该方法包括：

a)分析RP-II蛋白酶的三维结构，以根据结构考虑的评估，鉴定RP-II蛋白酶中至少一个与改变所述性能相关的氨基酸残基或至少一个结构区；

b)修饰编码亲本的多核苷酸的DNA，以构建编码变体RP-II蛋白酶的多核苷酸，与亲本RP-II蛋白酶相比，其通过在a)中所鉴定的氨基酸残基或结构部分的缺失、取代或***进行修饰以改变所述性能；

c)在适当的宿主中表达变体RP-II蛋白酶，和

d)检验所得的RP-II蛋白酶变体的所述性能。

2、一种生产BLC样RP-II蛋白酶变体的方法，其中与亲本BLC样RP-II蛋白酶相比，变体具有至少一种改变的性能，该方法包括：

a)基于BLC三维结构产生亲本BLC样RP-II蛋白酶的模型结构，

b)通过匹配活性位点残基的CA、CB、C、O和N原子，进行结构叠加，将亲本BLC样RP-II蛋白酶的模型三维结构与BLC结构进行比较，

c)在步骤a)比较的基础上鉴定亲本BLC样RP-II蛋白酶中的至少一个结构部分，其中预测所述结构部分的改变将会导致改变的性能；

d)修饰编码亲本BLC样RP-II蛋白酶的核酸序列，产生这样的核酸序列，其在与所述结构部分对应位置上编码一个或多个氨基酸的至少一个缺失或取代，或者在与所述结构部分对应位置上编码一个或多个氨基酸残基的至少一个***；

e)重复进行步骤c)和d)N次，其中N是1或1以上的整数；

f)制备由步骤a)-e)所得的变体；

g)检验所述变体的稳定性；和

h)任选地循环重复步骤a)-g)；和

i)选择与亲本RP-II蛋白酶相比具有至少一种改变的性能的RP-II蛋白酶变体；

j)在宿主细胞中表达修饰的核酸序列以生产变体RP-II蛋白酶；

k)分离所生产的蛋白酶；

l)纯化所分离的蛋白酶，和

m)回收所纯化的RP-II蛋白酶变体。

3、项2的方法，其中步骤(c)鉴定与RP-II蛋白酶亲本的离子结合位点相距10

或更小，优选地6

或更小距离的氨基酸残基位置。

4、项2的方法，其中步骤(c)鉴定RP-II蛋白酶亲本中这样的氨基酸残基位置，所述位置的修饰通过修饰至少一个所鉴定的位置确保除去离子结合位点。

5、项2的方法，其中步骤(c)鉴定RP-II蛋白酶亲本高度活动区域中的氨基酸残基位置。

7、项2的方法，其中步骤(c)鉴定RP-II蛋白酶亲本的活动区域中的氨基酸残基位置。

8、项2的方法，其中步骤(c)鉴定亲本RP-II蛋白酶中这样的氨基酸残基位置，所述位置的修饰通过至少一个Cys残基的***或取代可产生至少一个二硫桥。

9、项2的方法，其中步骤(c)和(d)通过如下操作构建具有修饰的表面电荷分布的亲本RP-II蛋白酶变体：

c’)鉴定亲本RP-II蛋白酶表面上至少一个带电荷的氨基酸残基；

d’)通过缺失或用不带电荷的氨基酸残基取代，修饰在步骤(a)中所鉴定的带电荷残基。

10、项2的方法，其中步骤(c)和(d)通过如下操作构建具有修饰的表面电荷分布的亲本RP-II蛋白酶变体：

c”)鉴定亲本RP-II蛋白酶表面上至少一个为不带电荷的氨基酸残基所占据的位置；

d”)通过用带电荷氨酸残基取代不带电荷氨基酸残基，或者通过在该位置上***带电荷氨基酸残基，对该位置上的电荷进行修饰。

11、项2的方法，其中步骤(c)和(d)通过如下操作构建具有修饰的表面电荷分布的亲本RP-II蛋白酶变体：

c’”)鉴定亲本RP-II蛋白酶表面上至少一个带电荷的氨基酸残基；

d’”)用具有相反电荷的氨基酸残基取代在步骤(a)中所鉴定的带电荷氨基酸残基。

12、项2的方法，其中步骤(c)鉴定亲本RP-II蛋白酶中这样的氨基酸残基位置，其中将所述位置修饰为Pro可产生显示改良稳定性的RP-II蛋白酶变体。

13、项2的方法，其中步骤(c)鉴定亲本RP-II蛋白酶中与活性位点残基相距小于10

的氨基酸残基位置。

14、项2至13中一项或多项的方法，其中步骤(e)中的N是1与50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2之间的整数。

15、RP-II蛋白酶变体，其包含与离子结合位点相距10

或更小，优选地6或更小距离位置上的氨基酸残基的至少一种修饰。

16、项15的变体，其中在至少一个如下的位置上进行修饰：1、2、3、4、5、6、7、8、143、144、145、146、158、159、160、161、162、194、199、200和201，优选地在位置2、3、4、5、6、7、144、159、160和161上进行修饰，尤其是BLC(SEQ ID NO：2)中D7E和D7Q的修饰，其中的位置是指BLC或对应的位置。

17、项15或16的变体，其中的修饰包括用中性或带负电荷的残基取代带正电荷的氨基酸残基，或者用带负电荷的残基取代中性残基，或者缺失带正电荷的或中性残基。

18、项15的变体，其中通过至少一个与BLC位置144和/或161相对应的位置上的修饰除去离子结合位点，尤其是BLC(SEQ ID NO：2)中H144R和/或D161R，K+H144Q，N的修饰。

19、RP-II蛋白酶变体，其包含高度活动区域中氨基酸残基的至少一种修饰，所述区域处于至少一个与BLC的如下位置相对应的位置中：26-31(26、27、28、29、30和31)、89-91(89、90和91)、216-221(216、217、218、219、220和221)。

20、项19的变体，其中亲本是BLC，而修饰包括G30A和/或G91A。

21、RP-II蛋白酶变体，其包含在活动区域中进行的至少一种修饰，所述区域处于至少一个与BLC的如下位置相对应的位置中：51-56(51、52、53、54、55、56)、88-94(88、89、90、91、92、93、94)、118-122(118、119、120、121、122)和173-183(173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183)，优选地在区域51-56和118-122中。

22、RP-II蛋白酶变体，具有至少一个通过将BLC位置128和145或对应位置上的氨基酸残基修饰为Cys所提供的二硫桥，优选地是BLC或对应位置上的S145C和T128C取代。

23、RP-II蛋白酶变体，与亲本RP-II蛋白酶相比具有修饰的表面电荷分布，其包含至少一个与BLC的如下位置相对应位置上的修饰：7、17、95、109、143、174、209、216，尤其是BLC(SEQ ID NO.1)如下的修饰：

D7N，S，T

Y17R，K，H

Y95R，K，H

T109R，K，H

Q143R，K，H

Q174R，K，H

E209Q，N

N216R，K，H。

24、RP-II蛋白酶变体，与亲本RP-II蛋白酶相比显示改良的稳定性，其包含至少一个与BLC的位置18、115、185、269和293相对应位置上的Pro取代，尤其是BLC(SEQ ID NO.1)如下取代中的一个或多个：T60P、S221P、G193P、V194P。

25、RP-II蛋白酶变体，其包含与活性位点残基相距小于10

与BLC的如下位置相对应位置上的氨基酸残基上的修饰：1、8、22-35(22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35)、42-58(42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58)、82-100(82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100)、129-135(129、130、131、132、133、134、135)、141-142、153-156(153、154、155、156)、158、161-171(161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171)、188-193(188、189、190、191、192、193)、195、201-207(201、202、203、204、205、206、207)、210、213-214、217。

26、项15至25中任一项的RP-II蛋白酶变体，进一步包含如下修饰中的至少一种：(i)形成Asn-Gly序列部分的位置上的氨基酸残基通过缺失或取代，优选地用Asp、Gln、Ser、Pro、Thr或Tyr取代所进行的修饰；(ii)Trp占据的位置上的氨基酸残基用Phe、Thr、Gln或Gly取代所进行的修饰；(iii)Glu或Asp占据的位置上的氨基酸残基用Ala取代所进行的修饰；(iv)Glu或Asp残基占据的位置之后第一位或第二位上的氨基酸残基用Pro取代所进行的修饰；或者(v)Met占据的位置上的氨基酸残基通过缺失或取代，优选地用Ser或Ala取代所进行的修饰。

27、项15至26中任一项的RP-II蛋白酶，其在许多位置上被修饰，范围从至少1个和多达50个位置，或者从1到45个位置，或者从1到40个位置，或者从1到35个位置，或者从1到30个位置，或者从1到25个位置，或者从1到20个位置，或者从1到15个位置，或者从1到14个位置，或者从1到13个位置，或者从1到12个位置，或者从1到11个位置，或者从1到10个位置，或者从1到9个位置，或者从1到8个位置，或者从1到7个位置，或者从1到6个位置，或者从1到5个位置，或者从1到4个位置，或者从1到3个位置，或者从1到2个位置，这些修饰包括在所示数目位置上的取代、缺失、***以及它们的组合。

28、分离的多核苷酸，包含编码前述项中任一项所定义或生产的RP-II蛋白酶变体的核酸序列。

29、项28的多核苷酸，其中核酸序列与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13或SEQ ID NO：15所示的核酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的同源性。

30、分离的核酸构建体，其包含如项28-29中任一项所定义的核酸序列，有效地连接于一个或多个能够指导多肽在适宜的表达宿主中表达的控制序列。

31、包含项30的核酸构建体的重组宿主细胞。

32、一种生产如项1至27中任一项所定义或生产的RP-II变体的方法，该方法包括：

a)在益于生产RP-II蛋白酶变体的条件下培养项31的重组宿主细胞；和

b)回收变体。

33、洗涤制剂组合物，其包含项1至27中任一项所定义或生产的RP-II蛋白酶变体。

34、项1至27中任一项所定义或生产的RP-II蛋白酶变体在洗涤或清洁目的中的用途。

35、项1至27中任一项所定义或生产的RP-II蛋白酶变体在加工食品中的用途。

36、项1至27中任一项所定义或生产的RP-II蛋白酶变体在加工饲料中的用途。

37、项1至27中任一项所定义或生产的RP-II蛋白酶变体在处理兽皮中的用途。

附图简述

图1提供了地衣芽孢杆菌的RP-II蛋白酶BLC的结构示意图。

图2显示了表1野生型RP-II蛋白酶1至8基于3D结构的序列比对。

图3显示了用黑色表示的BLC蛋白酶的带状结构，标出了活性位点残基、结合的肽和离子结合位点。钙离子是位于图底部的球体，活性位点残基是浅灰色的并以棒状模型显示，结合的肽DAFE是中等灰色并以棒状模型显示。

附录简述

附录1以标准的pdf格式提供了BLC RP-II蛋白酶溶解晶体的3D结构的结构坐标。将残基编号从1到217，钙离子编号为301，底物DAFE编号为401-404。

定义

在更详细讨论本发明前，将首先定义下列术语和约定。

为了详细描述通过基因操作在多肽或蛋白质中，尤其是在RP-II蛋白酶中所引入的氨基酸和核酸以及修饰的命名法，我们引用WO 01/16285第5-15页，在此并入作为参考。

术语“RP-II蛋白酶”指丝氨酸蛋白酶亚组，属于蛋白酶家族S1B谷氨酸特异性内肽酶。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶是特征为在活性位点上具有丝氨酸的蛋白酶的亚组，其与底物形成共价加合物。此外，RP-II蛋白酶(和丝氨酸蛋白酶)的特征还在于除了丝氨酸外还具有两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸和天冬氨酸残基。

RP-II蛋白酶与S1B蛋白酶家族的其余成员有大约50％的同源性(使用第8版UWGCG软件的GAP程序)，或者更优选地同源性高于55％。表1显示了多种S1B蛋白酶之间的同源性。1-8号的RP-II蛋白酶在表1中用粗体表示，9-13号的其它S1B蛋白酶用粗斜体表示。表1证明了RP-II蛋白酶与其它S1B蛋白酶之间明显不同，但同样显然的是，在RP-II蛋白酶中存在着亚组。一个亚组包括1、2和3号蛋白酶；而另一个亚组包括第4、5和6号蛋白酶。所列RP-II蛋白酶的长度从215到222个氨基酸残基不等，有关枯草杆菌蛋白酶(subtilases)的枯草杆菌素亚组的经验显示，长度的这种变化可能对这些和其它RP-II蛋白酶亚组的三维结构仅有很小的影响。

亲本

在本发明的上下文中，术语“亲本”应理解为蛋白质，对其进行修饰以产生蛋白质变体。亲本蛋白质可以是天然存在的(野生型)多肽或者其可以是通过任何适宜手段制备的其变体。例如，亲本蛋白质可以是天然存在的蛋白质的变体，其通过天然存在的多肽的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基的取代、化学修饰、缺失或截短，或者添加或***一个或多个氨基酸残基进行修饰。因此，术语“亲本RP-II蛋白酶”指对其进行修饰以产生RP-II蛋白酶变体的RP-II蛋白酶。

变体

在本发明的上下文中，术语“变体”应理解为与亲本蛋白质相比已在一个或多个氨基酸残基上被修饰的蛋白质。

修饰

在本发明的上下文中，术语“修饰”或“修饰的”应理解为包括蛋白质的化学修饰以及编码蛋白质的DNA的基因操作。修饰可以是氨基酸侧链的替换、目的氨基酸处的取代、缺失和/或***。因此，术语“修饰的蛋白质”，例如，“修饰的RP-II蛋白酶”应理解为与亲本蛋白质例如RP-II蛋白酶相比，含有修饰的蛋白质。

同源性

在本发明的上下文中，“同源性”或“与...同源的”应理解为其常规含义，两氨基酸序列之间的“同源性”应当使用由威斯康星大学遗传学计算机组(UWGCG)软件包中的GAP程序所定义的“相似性”参数确定，使用缺省设置的比对参数、比较矩阵、空位和空位延伸罚分。GAP罚分的默认值，即GAP建立罚分为3.0和GAP延伸罚分为0.1(威斯康星软件包的程序指南，第8版，1994年8月，遗传学计算机组，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)。该方法也描述于S.B.Needleman和C.D.Wunsch，Journal ofMolecular Biology，48，443-445(1970)中。可从相同的计算中求取同一性。两氨基酸序列之间的同源性也可利用9.1版UWGCG软件包的GAP常规程序通过“同一性”或“相似性”确定，采用缺省设置的比对参数、比较矩阵、空位和空位延伸罚分为默认设置，也可使用下列参数：空位建立罚分＝8，空位延伸罚分＝8，而所有其它参数保持其默认值。除氨基酸序列比对外，常规程序的输出是两序列之间的“同一性百分比”和“相似性”的计算结果。使用9.1版UWGCG软件包所计算的数值与第8版的略微不同。

RP-II蛋白酶的命名

在描述本发明RP-II蛋白酶过程中，为了便于引用，使用下列缩写：

BLC＝地衣芽孢杆菌的RP-II蛋白酶(美国专利No.4,266,031)，

AA513＝哈乌帕拉斯芽孢杆菌AA513的RP-II蛋白酶(WO01/16285)，

AC116＝地衣芽孢杆菌AC116的RP-II蛋白酶(WO 01/16285)，

BO32＝短小芽孢杆菌BO32的RP-II蛋白酶(WO 01/16285)，

CDJ31＝地衣芽孢杆菌CDJ31的RP-II蛋白酶(WO 01/16285)，

JA96＝短小芽孢杆菌JA96的RP-II蛋白酶(WO01/16285)，

MPR＝枯草芽孢杆菌IS75的RTI RP-II蛋白酶(EP 369 817 B1)，

BIP＝中间型芽孢杆菌的RP-II蛋白酶(Rebrikov等，Journal of ProteinChemistry，Vol.18，No.1，1999)。

序列表

在所附的序列表中，RP-II蛋白酶表示为：

SEQ.ID.NO.1＝BLC(DNA)，SEQ.ID.NO.2＝BLC(AA)，

SEQ.ID.NO.3＝AA513(DNA)，SEQ.ID.NO.4＝AA513(AA)，

SEQ.ID.NO.5＝AC116(DNA)，SEQ.ID.NO.6＝AC116(AA)

SEQ.ID.NO.7＝BO32(DNA)，SEQ.ID.NO.8＝BO32(AA)

SEQ.ID.NO.9＝CDJ31(DNA)，SEQ.ID.NO.10＝CDJ31(AA)

SEQ.ID.NO.11＝JA96(DNA)，SEQ.ID.NO.12＝JA96(AA)

SEQ.ID.NO.13＝BSMPR(DNA)，SEQ.ID.NO.14＝BSMPR(AA)

SEQ.ID.NO.15＝BIP(DNA)，SEQ.ID.NO.16＝BIP(AA)

位置

在本发明的上下文中，术语“位置”应理解为当从肽/多肽/蛋白质的N末端开始计数时，所述肽、多肽或蛋白质中氨基酸残基的编号。这里所使用的位置编号正常地直接指不同的RP-II蛋白酶。

根据SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14和16中的每一个序列对RP-II蛋白酶单独进行编号。

对应位置

不过，本发明并不限于这些特定RP-II蛋白酶的变体，而是可扩展到含有在位置上与在地衣芽孢杆菌RP-II蛋白酶中所鉴定的特定残基“等同”的氨基酸残基的亲本蛋白酶。在本发明的一些优选的实施方案中，亲本蛋白酶是JA96或BIP RP-II蛋白酶，并且取代是在JA96或BIP中在与上面所列那些对应的等同氨基酸残基位置上进行的。

如果某RP-II蛋白酶的残基(氨基酸)位置与地衣芽孢杆菌RP-II蛋白酶的特定残基或该特定残基的部分同源(即在一级或三级结构的位置上相对应)或类似(即具有相同或相似的能进行化学结合、反应或相互作用的功能)，那么该RP-II蛋白酶的残基(氨基酸)位置与地衣芽孢杆菌RP-II蛋白酶的残基(位置)等同。

为了建立与一级结构的同源性，通过将分离的或亲本野生型酶的氨基酸序列与界定参照框架的同组或同类酶中的适当公知酶进行比对，将前体蛋白酶的氨基酸序列直接与地衣芽孢杆菌RP-II蛋白酶BLC的一级序列进行比较。在WO 01/16285中使用了这种类型的编号方式。如果文中没有其它说明，在本案中选择地衣芽孢杆菌RP-II蛋白酶作为标准，其最初被命名为组分C，因此这里缩写为BLC。

为了建立与BLC三级结构(3D结构)的同源性，已在图2中提供了基于3D结构的比对。通过使用这种比对，可直接将前体RP-II蛋白酶的氨基酸序列与地衣芽孢杆菌RP-II蛋白酶BLC的一级序列联系起来。对于一个新的RP-II蛋白酶序列，通过下列步骤寻找与BLC中位置对应的(基于3D的)位置：

i)由图2的比对鉴定与新序列最同源的RP-II蛋白酶，

ii)将新序列与所鉴定的序列进行比对以寻找图2中RP-II蛋白酶的对应位置，和

iii)由图2建立BLC的对应位置。

为了比较和寻找最同源的序列，使用如下所述的GCG软件包的GAP程序。

可通过第8版GCG软件包的GAP常规程序使用下列参数对变体进行编号获得如上所示的比对：空位建立罚分＝3，空位延伸罚分＝0.1，而所有其它参数保持其默认值。

图2的比对明确了相对于BLC序列的许多缺失和***。在序列比对中，参照序列中的缺失用星号(*)表示，且认为参照酶在所讨论的位置上具有一个空位。BLC序列中的***以星号(*)表示，而参照酶中的位置指定为标准酶中存在对应氨基酸残基处的最后一个氨基酸残基的位置编号，并按字母顺序后附小写字母，例如82a、82b、82c、82d，见图2。

如果与BLC相比，参照酶含有N-或C-末端延伸，那么在N-末端方向上给予N末端延伸0a、0b等位置编号；而C-末端延伸将给予按字母顺序后附小写字母的BLC的C-末端氨基酸残基的位置编号，或者简单地继续连续编号。

因此，为了比较的目的，通过参照如图2中所提供的BLC RP-II蛋白酶(SEQ ID NO：2)的位置对RP-II蛋白酶进行编号。然后将所述位置表述为“与BLC对应”。

发明详述

本发明的发明人通过X-射线晶体学阐明了BLC即SEQ ID NO：2的三维结构，并且发现与其它蛋白酶如RP-II蛋白酶的已知结构相比，在该BLC蛋白酶的结构中有几个有趣的特征。这些特征既包括相似性也包括差异。

RP-II蛋白酶

如上所述，在本发明的上下文中RP-II蛋白酶应理解为与BLC(SEQ IDNO：2)具有至少50％同源性的蛋白酶。特别是，所述蛋白酶可以与BLC，即与SEQ ID NO：2具有至少55％的同源性。本发明因此涉及与BLC具有至少50％同源性的变体RP-II蛋白酶。

具体地，本发明的变体可以包括含有许多修饰或者许多位置上的修饰的RP-II蛋白酶，范围从至少1个和多达50个，或从1到45个，或从1到40个，或从1到35个，或从1到30个，或从1到25个，或从1到20个，或从1到15个，或从1到14个，或从1到13个，或从1到12个，或从1到11个，或从1到10个，或从1到9个，或从1到8个，或从1到7个，或从1到6个，或从1到5个，或从1到4个，或从1到3个，或从1到2个的修饰或位置。这种修饰包括用所示数字或位置数表示的取代、缺失和***。

本发明的RP-II蛋白酶变体由分离的多核苷酸编码，该核酸序列与SEQID NO：1所示的核酸序列具有至少50％的同源性，且其中多核苷酸编码与亲本蛋白酶有关的变体RP-II蛋白酶。

在本发明的第一个实施方案中，适于本文所述目的的RP-II蛋白酶可以是与BLC的三维结构同源的RP-II蛋白酶，即其可能因为包含下文所定义的结构元件而与由附录1中的结构坐标所定义的三维结构同源。

本领域技术人员众所周知的是，蛋白质或其一部分的结构坐标集合是定义三维形状的点的相关集合；完全不同的坐标集合可能定义完全相同或相似的形状。而且，个别坐标中的轻微改变可能对整体形状影响很小或者没有影响。

坐标的这些变化可能是因结构坐标的数学处理产生的。例如，附录1的结构坐标(BLC结构)可通过结构坐标的晶体排列、将结构坐标分成几部分、结构坐标集合的整数加减(integer additions or substractions)、结构坐标的倒置或者上述改变的任意组合进行操作。可选地，所述改变可能是由于一级氨基酸序列的差异。

在本发明的上下文内，当与附录1的结构坐标相比，这些变化是在可接受的标准误差之内时，所述三维结构应理解为与附录1的结构同源。标准误差可通常表示为(例如保守主链残基的)均方根差，其中术语“均方根差”(RMS)意思是均值误差平方的算术平均数的平方根。

同样为本领域技术人员众所周知的是，在具有同源结构的一组蛋白质内，在结构的某些区域或结构域例如环中，三维结构可能有变化，其对结构的功能域不重要，或者至少重要性很小，但是其可能导致所述结构之间保守残基主链原子的很大的均方根差。

因此结构坐标集合对于结晶蛋白质是唯一的，这是公知的。没有其它的三维结构将具有精确相同的坐标集合，不管是同源结构或者甚至还是以不同方式结晶的同一蛋白质。坐标有天然的波动。可以发现整体结构和原子间关系是相似的。可根据结构中每个原子与另一结构中的每个“同源”原子之间的均方根差讨论相似性。然而，只有完全相同的蛋白质具有完全相同数量的原子。因此，相似性低于100％的蛋白质常常将具有不同数量的原子，因此可能不对所有原子都计算均方根差，而是仅计算被认为是“同源”原子的均方根差。因此很难根据坐标精确描述相似性，并且很难对同源蛋白质进行计算。关于本发明，可通过同源结构元件的内容，和/或氨基酸或DNA序列的相似性，描述不同RP-II蛋白酶3D结构的相似性。

BLC样RP-II蛋白酶的实例包括BLC＝地衣芽孢杆菌的RP-II蛋白酶(参见美国专利No.4,266,031)、AA513＝哈乌帕拉斯芽孢杆菌AA513的RP-II蛋白酶(NP000368)、AC116＝地衣芽孢杆菌AC116的RP-II蛋白酶(NP000364)、BO32＝短小芽孢杆菌BO32的RP-II蛋白酶(NP000366)、CDJ31＝地衣芽孢杆菌CDJ31的RP-II蛋白酶(NP000365)、JA96＝短小芽孢杆菌JA96的RP-II蛋白酶(NP000367)、MPR＝枯草芽孢杆菌IS75的RTI RP-II蛋白酶(参见EP 369817B1)、BIP＝中间型芽孢杆菌的RP-II蛋白酶(EMBL No.Y5136，Rebrikov等，Journal of Protein Chemistry，Vol.18，No.1，1999)。

因此，本发明优选的实施方案是亲本RP-II蛋白酶的变体或RP-II蛋白酶变体，其与SEQ ID NO 2的序列至少50％同源，优选地至少55％，优选地与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14或16的序列至少65％、至少70％、至少74％、至少80％、至少83％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％同源。

本发明的另一实施方案是包含下列结构特征的RP-II蛋白酶变体：

a)两个β桶结构域，每个域包括六个反平行结构的长链，

b)三个α螺旋，

c)至少一个离子结合位点，

d)包含氨基酸残基His、Asp和Ser的活性位点。

潜在的离子结合位点定义为与BLC的3D结构类似的配位或配位排列，其中BLC的3D结构具有一个与Ile 3羧基O原子、Ser 5羧基O原子配位、并与Asp 161羧酸根双配位的钙离子，以及由水构成的其它配位。可用水取代结构中的钙，但仍然具有相同的配位。

本发明的RP-II蛋白酶变体由分离的多核苷酸编码，其中核酸序列与SEQID NO：1、3、5、7、9、11、13或15所示的核酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或者至少99％同源，其中多核苷酸编码与亲本蛋白酶相关的变体RP-II蛋白酶。

此外，编码本发明RP-II蛋白酶变体的分离的核酸序列与SEQ ID NO：1所示的核酸序列的互补链杂交，优选地在低严格条件下、至少在中等严格条件下、至少在中等/高度严格条件下、至少在高度严格条件下、至少在极高严格条件下。

确定核苷酸探针和同源DNA或RNA序列之间在低、中等或高度严格条件下杂交的适当的实验条件包括将含有待杂交DNA片段或RNA的滤膜在5×SSC(氯化钠/柠檬酸钠，Sambrook等1989)中预浸渍10分钟，并将滤膜在5×SSC、5×Denhardt’s液(Sambrook等1989)、0.5％SDS和100μg/ml超声变性鲑鱼精DNA(Sambrook等1989)的溶液中预杂交，随后在含有10ng/ml浓度的随机引物(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)Anal.Biochem.132：6-13)、³²P-dCTP标记(比活＞1×10⁹cpm/μg)探针的相同溶液中于45℃左右杂交12小时。然后将滤膜在2×SSC、0.5％SDS中于至少55℃(低严格条件)、更优选地在至少60℃(中等严格条件)，更优选地在至少65℃(中等/高度严格条件)，甚至更优选地在至少70℃(高度严格条件)，甚至更优选地在至少75℃(极高严格条件)洗涤两次共30分钟。

RP-II蛋白酶的三维结构

使用BLC RP-II蛋白酶阐明构成本发明基础的三维结构。

根据X-射线晶体学方法的原理解决了BLC的结构，例如，如在X-RayStructure Determination，Stout，G.K.和Jensen，L H.，John Wiley & Sons，Inc.NY，1989中所给出的原理。

在附录1中以标准PDB格式给出了所解决的BLC的晶体结构的结构坐标(Protein Data Bank，Brookhaven National Laboratory，Brook-haven，CT)。应当理解的是，附录1构成本申请的一部分。在附录1的上下文中，使用下列缩写：CA指c-α(碳原子)或指钙离子(然而为了避免误会，我们在本说明书中正常使用全称“c-α原子”、“钙”、“Ca”或“离子”)。氨基酸残基以其标准的三字母代码或标准的单字母代码形式给出。附录1中的结构坐标含有这样的蛋白酶结构，其中活性丝氨酸被丙氨酸取代，并与肽DAFE(＝Asp-Ala-Phe-Glu)以及水分子络合。蛋白酶坐标具有称作A的链，其中肽称作B，钙离子称作C，水称作W。在下文，所述残基的位置是指如SEQ ID NO：2所公开的BLC序列。

BLC的整体结构落入S1组蛋白酶的范畴(MEROPS；http://merops.sanger.ac.uk/)。结构为具有两个β-桶结构域的胰蛋白酶折叠型。每个β-桶由折叠成β-桶的六个反平行的β-片层构成。两个β-桶中链的拓扑结构都可描述为S1-S2-S3-S6-S5-S4。假定所有RP-II蛋白酶都落入相同的总的整体结构内。

地衣芽孢杆菌C组分丝氨酸蛋白酶的3D结构有16条链，其中12条较长的链组成两个β-桶和3个螺旋。4个极短的链是从N-末端开始计数的1、5、6和10号链，由编号为9-10、50-51、56-57和114-115的残基组成。其它链的残基编号是22-26、31-36、41-44、62-65、77-83、99-102、126-131、142-151、156-159、171-177、182-192和201-205。一个主要的螺旋是C-末端残基数编号208-219。两个非常小的螺旋是由86-90和106-110位的残基组成的。

活性位点由包括167位的Ser、47位的His和96位的Asp的三联体构成。

BLC的3D结构有一个与第3位Ile的羧基氧原子、第5位Ser的羧基氧原子配位、并与第161位上的Asp的羧酸根双配位的钙离子。其它的配位由水分子形成。

钙离子位于与活性位点CA原子和168位Gly相距如下所示的距离处：

Ser 167CA原子到Ca离子：16.07

His 47CA原子到Ca离子：24.27

Asp 96CA原子到Ca离子：23.72

Gly 168CA原子到Ca离子：19.20

离子结合位点的位置可定义为到核心结构中四个特定原子的距离来定义。已选取了离子结合位点到三个活性位点残基的c-α原子的距离。在所有RP-II蛋白酶中，活性位点中的Ser、His和Asp残基高度保守。在BLC中，它们是Asp96、His47和Ser167。所选取的第4个距离是到序列中活性位点丝氨酸残基后第一个出现的氨基酸残基(下文称之为“邻近Ser”)的c-α原子的距离；在BLC的3D结构中为Gly168。

在本发明的优选实施方案中，离子结合位点和i)Asp c-α原子之间的距离是22.50-24.00

和ii)His c-α原子之间的距离是23.25-25.25

和iii)Ser c-α原子之间的距离是15.00-17.00

和iv)邻近Ser c-α原子之间的距离是18.20-20.20

然而，这些距离可能在一种RP-II蛋白酶到另一种蛋白酶之间有变化，如上所述，离子结合位点可能也结合钠离子。本发明的距离是就结构中的钙离子给出的。如果结合钠离子，那么距离将移动一点点。通常距离可变化±0.8优选地±0.7±0.6

±0.5

±0.4

或者更优选地±0.3

此外，在RP-II蛋白酶中，界定离子结合位点的肽结构由位于1-7、159-162和143-145位的氨基酸残基构成，配位原子是I3、S5、D161残基的主链羧基氧原子以及水分子。

可使用相关蛋白酶的已知结构和如实施例1所示的通用建模工具建立RP-II蛋白酶3D结构的模型。获得逼真的3D模型结构的先决条件是模型要基于与结构已知蛋白酶序列的同源性高于50％、优选地高于55％、甚至更优选地高于60％的足够的序列同源性。可基于图2中BLC的3D引导的序列比对构建RP-II蛋白酶模型。

因此原则上通过使用建模工具和蛋白酶Exf家族金黄色葡萄球菌毒素A蛋白酶已知的3D结构(Cavarelli等(1997)The Structure of Staphylococcus aureusEpidermolytic Toxin A，an atypic serine protease，at 1.7

resolution，Structure，Vol.5，p.813(命名为1ARP的pdb)建立RP-II蛋白酶的3D结构模型。

如果与金黄色葡萄球菌毒素A蛋白酶的结构相比，RP-II蛋白酶的结构以BLC为代表，可分成“蛋白酶共有”区、“中间”区和“非同源”区。

活性位点可见于蛋白酶的共有区中，其在结构上与毒素A结构密切相关。蛋白酶共有区由残基58、70-83组成。蛋白酶共有区的RMS低于1.2。

蛋白酶共有区之外，RP-II蛋白酶BLC的结构在很大程度上与毒素A结构不同。

中间区由残基14-28、29-51、94-104、155-175构成。中间区的RMS高于1.2，低于1.8。可能很难根据金黄色葡萄球菌3D结构的模型在RP-II蛋白酶的该区域中预测三维结构和功能性之间的任何关系。

共有区和中间区构成了两个中心β-桶的大部分，尤其是β-桶的链。

非同源区由残基1-6、7-13、52-57、59-69、84-88、89-93、105-153构成。非同源区的RMS高于1.5。极难根据金黄色葡萄球菌3D结构的模型在RP-II蛋白酶的该区域中预测三维结构和功能性之间的任何关系。

基于金黄色葡萄球菌毒素A的3D结构建模的RP-II蛋白酶3D结构所推断的结构-功能关系因此将非常不确定并且很难推测。

RP-II蛋白酶的同源构模

可这样建立RP-II蛋白酶的模型结构，使用附录1的BLC结构，或者与BLC结构类似的结构，其包括结构元件(a)两个β-桶结构域，每个域包括反平行结构的六条长链，(b)三个α螺旋，(c)至少一个低亲和力的离子结合位点，和(d)包括氨基酸残基His、Asp和Ser的活性位点，或者其它3D RP-II蛋白酶结构，例如，由X-射线结构测定法建立的未来可能利用的结构，以及通过HOMOlogy^TM程序或与之相当的程序，例如，Modeller^TM(两者都来自Molecular Simulations，Inc.，San Diego，CA)所建立的结构。原理是将3D结构已知的蛋白质的氨基酸序列与需要构建模型3D结构的蛋白质的氨基酸序列进行比对。然后可根据共有序列建立结构上保守的区域。在缺乏同源性的区域，可***环结构，或者可缺失序列，随后使用例如Homology程序键合必需的残基。应当使用Homology或者其它的分子模拟程序例如MolecularSimulations的CHARNMm^TM进行随后的松弛和结构的优化。

设计BLC和RP-II或S1B家族蛋白酶变体的方法

不同蛋白质的分子动力学的比较可能会给出关于哪些结构域很重要或者与各蛋白质的某些性能相关的暗示。

本发明包括生产亲本BLC样RP-II蛋白酶变体的方法，与亲本BLC样RP-II蛋白酶相比，变体具有至少一种改变的性能，所述方法包括：

a)基于BLC的三维结构产生亲本BLC样RP-II蛋白酶的模型结构，

d)修饰编码亲本BLC样RP-II蛋白酶的核酸序列，产生这样的核酸序列，其在与所述结构部分对应位置上编码一个或多个氨基酸的缺失或取代，或者在与所述结构部分对应位置上编码一个或多个氨基酸残基的***；

e)在宿主细胞中表达修饰的核酸序列以产生变体RP-II蛋白酶；

f)分离所产生的蛋白酶；

g)纯化分离的蛋白酶，和

h)回收纯化的RP-II蛋白酶。

离子结合位点的稳定性改变

离子结合位点是酶很重要的特征。因此，靠近离子结合位点的氨基酸残基的改变可能将导致酶的稳定性改变。尤其是影响该位点处或其附近的电荷分配和/或静电场强度的修饰很重要。

提高的稳定性

可通过邻近离子结合位点的位置上的修饰实现RP-II蛋白酶离子结合位点的稳定化。

这种修饰可包括在邻近离子结合位点的位置上用中性或带负电荷的残基取代带正电荷的氨基酸残基，或者用带负电荷的残基取代中性残基，或者缺失带正电荷或中性的残基。

与BLC离子结合位点相距10

或更小距离的位置是：1、2、3、4、5、6、7、8、143、144、145、146、158、159、160、161、162、194、199、200和201。与离子结合位点相距6

或更小距离的位置2、3、4、5、6、7、144、159、160、161尤其重要。

可使用文中图2鉴定其它RP-II蛋白酶中的对应位置。

BLC中D7E和D7Q的修饰是对这些位置之一进行适当修饰的实例。

BLC中离子结合位点的去除

通过去除离子结合位点，可能改变酶对溶液中钙或其它离子的依赖。

可通过H144R和/或D161R，K+H144Q，N取代(SEQID NO：2)除去BLC中的钙(结合)位点。可对其它RP-II蛋白酶中结构上对应的残基进行类似的修饰。

热稳定性的改变

可通过修饰所鉴定区域的活动性获得稳定性提高(一般是热稳定性增加)的变体，如通过引入二硫键、用脯氨酸取代、氢键接触的改变、改变电荷分布、引入盐桥、用一个或多个具有更庞大侧链基团的氨基酸填充内部结构腔(在例如，结构上活动的区域)、用其它氨基酸取代组氨酸残基、除去脱酰胺作用位点或者通过螺旋加帽。

活动性增加的区域

下面所示的BLC区域在该酶的结晶结构中具有增强的活动性，目前认为这些区域可能负责BLC及其它RP-II蛋白酶的稳定性或活性。尤其是可通过改变高度活动区域获得热稳定性。通常，可通过使这些区域更少活动而提高热稳定性。可通过在下面所鉴定的区域和位置上进行修饰而实现酶的改善。引入例如更大的残基或者在侧链中具有更多原子的残基可提高稳定性，或者，例如，引入侧链中具有更少原子的残基可能对于活动性很重要，并从而影响酶的活性类型。可通过分析从附录1的坐标文件和/或从各向同性波动的分子动力学计算结果中所采集的B因子寻找该区域。这些可通过使用MSI的程序CHARMm(Molecular Simulations Inc.)实现。

BLC在300K和400K处的分子动力学模拟显示下列高度活动的区域：

分别是26-31、50-55、89-91和193-198，以及4-5、11-12、26-31、50-55、69-70、89-91、178-183、195-199和216-221。

考虑到这些区域中的修饰可能影响RP-II蛋白酶的热稳定性。修饰优选地在区域26-31(26、27、28、29、30、31)；89-91(89、90、91)；216-221(216、217、218、219、220、221)中进行，尤其在BLC中进行G30A和G91A取代。可对其它RP-II蛋白酶中结构上对应的残基进行类似的修饰。

结晶学数据B因子(见“X-Ray Structure Determination，Stout，G K.和Jensen，L H.，John Wiley & Sons，Inc.NY，1989”)也表明BLC(RP-II蛋白酶)结构中下列区域更易活动：

51-56(即51、52、53、54、55、56)，

88-94(即88、89、90、91、92、93、94)，

118-122(即118、119、120、121、122)，

173-183(即173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183)。

考虑到这些区域的修饰可能影响RP-II蛋白酶的热稳定性。优选地在区域51-56和118-122中进行修饰。

二硫键

可通过引入新的域间或域内键以提供更刚性的和稳定的结构，如通过建立域间或域内二硫桥，以获得与亲本RP-II蛋白酶相比，具有改善的稳定性如热稳定性的本发明的RP-II蛋白酶变体。这可通过在RP-II分子的适当位置上通过取代或***引入半胱氨酸来完成。

根据上述指导方针，认为下面所提到的在SEQ ID NO：2的氨基酸序列中所鉴定的氨基酸残基适于半胱氨酸置换。一个或多个这样的半胱氨酸取代可在BLC变体中形成二硫桥。通过下列取代可构建稳定的二硫桥：S145C和T128C。

表面电荷分布

可通过改变RP-II蛋白酶的表面电荷分布获得与亲本RP-II蛋白酶相比稳定性提高(一般是热稳定性或贮藏稳定性提高)的变体。例如，当pH降至大约5或以下时，组氨酸残基一般带有正电荷，结果在蛋白表面可能发生不利的静电相互作用。通过基因改造RP-II蛋白酶的表面电荷，可以避免这种不利的静电相互作用，其反过来可能导致RP-II蛋白酶的稳定性更高。

带电荷的氨基酸残基是(a)带正电荷的：Lys、Arg、His(pH＜5)、Tyr(pH＞9)和Cys(pH＞10)以及(b)带负电荷的：Asp和Glu。

表面电荷分布可以如下修饰：(a)通过缺失带电荷的残基，或者用不带电荷的残基取代带电荷的残基，从表面除去带电荷的残基，(b)通过***带电荷的残基，或者用带电荷的残基取代不带电荷的残基，向表面添加带电荷的残基，或者(c)通过用带正电荷的残基取代带负电荷的残基，或者用带负电荷的残基取代带正电荷的残基，以逆转残基的电荷。

因此，本发明的另一方面涉及构建具有修饰的表面电荷分布的亲本RP-II蛋白酶变体的方法，该方法包括：

a)鉴定亲本RP-II蛋白酶表面上至少一个带电荷的氨基酸残基；

b)通过缺失或者用不带电荷的氨基酸残基取代，修饰在步骤(a)中所鉴定的带电荷的残基；

c)任选地循环重复步骤a)和b)；

d)制备由步骤a)-c)所得的变体；

e)检验所述变体的稳定性；和

f)任选地循环重复步骤a)-e)；和

g)选择与亲本RP-II蛋白酶相比稳定性增加的RP-II蛋白酶变体。

正如技术人员将会理解的那样，在一些情况中用带电荷的氨基酸残基取代不带电荷的氨基酸残基可能也是有利的，或者，可选地，在一些情况中用带相反符号电荷的氨基酸残基取代带电荷的氨基酸残基可能是有利的。因此为这些目的计，技术人员也可采用上述方法。在用带有电荷的氨基酸残基取代不带电荷的氨基酸残基的情况中，可使用上述方法，差别仅在步骤a)和b)，叙述如下：

a)鉴定亲本RP-II蛋白酶表面上至少一个为不带电荷的氨基酸残基所占据的位置；

b)通过用带电荷的氨基酸残基取代不带电荷的氨基酸残基，或者通过在该位置上***带电荷的氨基酸残基，修饰该位置上的电荷。

在改变RP-II蛋白酶表面上存在的氨基酸残基(电荷)符号的情况中也可使用上述方法。与上述方法相比，在这种情况中差别再次仅在于步骤a)和b)，叙述如下：

a)鉴定亲本RP-II蛋白酶表面上至少一个带电荷的氨基酸残基；

b)用具有相反电荷的氨基酸残基取代步骤(a)中所鉴定的带电荷氨基酸残基。

为了确定存在于酶表面上的蛋白酶的氨基酸残基，使用DSSP程序测量表面可及区(Kabsch和Sander，Biopolymers(1983)，22，2577-2637)。所有表面可接近性高于0、0.10、0.20、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55或0.60的残基都被认为是表面残基。

使用上述方法在BLC的表面上寻找到的氨基酸残基是T109，并认为T109R，K，H的取代特别有益。

可在其它RP-II蛋白酶的等同位置上引入类似的取代。

为了提供显示改良洗涤性能的RP-II蛋白酶变体的目的，可如WO91/00345(Novozymes A/S)和/或WO 99/20771(Genencor International，Inc.)中所指出的那样，通过修饰表面电荷来修饰RP-II蛋白酶的pI。

改变RP-II蛋白酶的pI尤其有益。

BLC中的改变：

T109R，K，H

Q143R，K，H

E209Q，N

D7N，S，T

Q174R，K，H

N216R，K，H

Y17R，K，H

Y95R，K，H

可在其它RP-II蛋白酶的对应位置上进行相应的修饰。

用脯氨酸残基的取代

可通过对所讨论的RP-II蛋白酶的二级结构进行分析，鉴定RP-II蛋白酶中两面角φ(phi)和ψ

(psi)限于间隔[-90°＜φ＜-40°和-180°＜ψ＜180°

]，优选地限于间隔[-90°＜φ＜-40°和120°＜ψ＜180°

]或者[-90°＜φ＜-40°和-50°＜ψ＜10°

]的残基，并且除去位于特征在于具有α-螺旋或β片层结构的RP-II蛋白酶区域中的残基，实现RP-II蛋白酶的热稳定性提高。

计算氨基酸的两面角φ(phi)和ψ

(psi)后，基于晶体RP-II蛋白酶的原子结构，有可能选择具有利于用脯氨酸残基取代的两面角φ和ψ

的位置。脯氨酸残基的脂肪族侧链共价结合到肽基的氮原子上。所得到的环状5元环因此使围绕肽主链N-C_a键的旋转受到刚性约束并且同时防止与主链N原子形成氢键。

由于这些结构的原因，脯氨酸残基通常不与α-螺旋和β-片层二级构象共存。

如果脯氨酸残基并非已经存在于所鉴定的位置上，那么用脯氨酸残基取代天然存在的氨基酸残基，优选地通过在编码该RP-II蛋白酶的基因上应用定点诱变。

在BLC-样蛋白酶类中，可在位置18、115、185、269和293上引入脯氨酸残基。因此，优选的BLC变体具有如下的一个或多个取代：T60P、S221P、G193P和V194P。

活性的改变

与活性位点残基的距离小于10

的氨基酸残基最有可能影响RP-II蛋白酶的特异性和活性，因此包含位置1、8、22-35(22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35)、42-58(42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58)、82-100(82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100)、129-135(129、130、131、132、133、134、135)、141-142、153-156(153、154、155、156)、158、161-171(161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171)、188-193(188、189、190、191、192、193)、195、201-207(201、202、203、204、205、206、207)、210、213-214、217上的修饰的变体可提供RP-II蛋白酶变体的活性和/或特异性的改变。

底物结合位点

底物结合位点是通过与底物模型如DAFE接触的残基鉴定的。可在附录1中找到活性位点中与DAFE结合的BLC蛋白酶的3D结构坐标。不受任何理论束缚，目前据信底物和酶之间的结合收到距底物分子10

特别是距底物分子6

的球形范围内所发现的有利相互作用的支持。这种有利键的实例是氢键、强静电作用和/或疏水作用。

BLC蛋白酶(SEQID NO：1)的下列残基在离肽DAFE 10

的距离内，因而被认为参与与所述底物的相互作用：1、2、3、8、25、29、30、31、32、33、34、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、90、91、92、93、94、95、96、97、129、131、132、133、134、135、155、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、171、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、200和204。

BLC蛋白酶(SEQID NO：1)的下列残基在离肽DAFE 6

的距离内，因而被认为参与与所述底物的相互作用：1、2、31、32、47、48、88、91、93、96、162、163、164、165、166、167、168、190、191、192、193、194、195和201。

螺旋加帽

对于RP-II蛋白酶，螺旋加帽可通过修饰与BLC位置221结构上对应的位置，特别是通过BLC中A221N，T的修饰实现。

除去脱酰胺作用位点

对于RP-II蛋白酶，可通过修饰与BLC位置213、216和222结构上对应的位置，特别是在BLC中的修饰除去脱酰胺作用位点。

N213A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，Q，R，S，T，V，Y，M，W优选N213L，T，S

N216A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，Q，R，S，T，V，Y，M，W优选N216L，T，S

N222A，C，D，E，F，G，H，I，K，L，P，Q，R，S，T，V，Y，M，W优选N222L，T，S

联合修饰

本发明也涵盖任何这样的上述RP-II蛋白酶变体，其联合了该氨基酸序列的任何其它修饰。设想尤其是与本领域中其它已知修饰的联合将为酶提供改良的性能。下面举例说明了待与上述修饰中的任何一种结合的这类修饰。

除去关键的氧化位点

为了增加RP-II蛋白酶的稳定性，用不易氧化的其它氨基酸残基取代或缺失关键的氧化位点，如甲硫氨酸，可能是有利的。

因此，在另一实施方案中，本发明涉及RP-II蛋白酶变体，其中一个或多个易被氧化的氨基酸残基，尤其是暴露于分子表面的甲硫氨酸残基，被缺失或者被用不易被氧化的其它氨基酸残基置换。例如，不易被氧化的氨基酸残基可选自A、E、N、Q、I、L、S或K。

具体的这样的变体包括至少一个如下的缺失或取代：M36{*，S，A，N，Q，K}；BLC蛋白酶的M160{*，S，A，N，Q，K}；AC116和CDJ31蛋白酶的M144{*，S，A，N，Q，K}；BO32、BIP和JA96蛋白酶的M67{*，S，A，N，Q，K}、M79{*，S，A，N，Q，K}、M137{*，S，A，N，Q，K}、M144{*，S，A，N，Q，K}和M171{*，S，A，N，Q，K}；BO32蛋白酶的M159{*，S，A，N，Q，K}；MPR蛋白酶的M81{*，S，A，N，Q，K}和M141{*，S，A，N，Q，K}；以及AA513蛋白酶的M17{*，S，A，N，Q，K}、M67{*，S，A，N，Q，K}、M144{*，S，A，N，Q，K}、M160{*，S，A，N，Q，K}、M186{*，S，A，N，Q，K}和M217{*，S，A，N，Q，K}(位置相对于图2所示的BLC蛋白酶表示)。

蛋白酶中Asn-Gly序列的修饰

已知在碱性pH下，Asn的侧链可与连续的邻近氨基酸的NH基团相互作用形成isoAsp残基，其中主链穿过Asp侧链。这将使主链更易于蛋白水解。如果随后的残基是Gly，那么更有可能发生脱酰胺作用。改变Gly前的Asn或所述Gly将防止这种情况的发生，从而提高稳定性，尤其是关于热稳定性和贮藏稳定性。

本发明因此还涉及RP-II蛋白酶变体，其中亲本RP-II蛋白酶的氨基酸序列中出现的Asn-Gly序列中的任一或两个残基被缺失或者用不同的氨基酸残基取代。

例如，Asn和/或Gly残基可用选自A、Q、S、P、T或Y的氨基酸残基取代。

更具体地，可缺失或者用选自A、Q、S、P、T或Y的氨基酸残基取代占据如下位置处的Asn-Gly的Asn或Gly残基中的任何一个：BLC蛋白酶位置68-69、182-183和/或192-193；AC116和CDJ-31蛋白酶位置68-69和/或192-193；BO32、JA96和BIP蛋白酶位置45-46、74-75、196-197和/或201-202；MPR蛋白酶位置68-69、103-104和/或192-196；以及AA513蛋白酶的位置90-91和/或201-202(位置相对于图2所示的BLC蛋白酶表示)。

BLC的具体变体有：

N68{*，A，Q，S，P，T，Y}；G69{*，A，Q，S，P，T，Y}

N68{*，A，Q，S，P，T，Y}+G69{*，A，Q，S，P，T，Y}

N182{*，A，Q，S，P，T，Y}；G183{*，A，Q，S，P，T，Y}

N182{*，A，Q，S，P，T，Y}+G183{*，A，Q，S，P，T，Y}

N192{*，A，Q，S，P，T，Y}；G193{*，A，Q，S，P，T，Y}

N192{*，A，Q，S，P，T，Y}+G193{*，A，Q，S，P，T，Y}

以及它们的组合。

AC116和CDJ-31蛋白酶的具体变体有：

N68{*，A，Q，S，P，T，Y}；G69{*，A，Q，S，P，T，Y}

N68{*，A，Q，S，P，T，Y}+G69{*，A，Q，S，P，T，Y}

N192{*，A，Q，S，P，T，Y}；G193{*，A，Q，S，P，T，Y}

N192{*，A，Q，S，P，T，Y}+G193{*，A，Q，S，P，T，Y}

N68{*，A，Q，S，P，T，Y}+N192{*，A，Q，S，P，T，Y}

以及它们的组合。

BO32、JA96和BIP蛋白酶的具体变体有：

N45{*，A，Q，S，P，T，Y}；G46{*，A，Q，S，P，T，Y}

N45{*，A，Q，S，P，T，Y}+G46{*，A，Q，S，P，T，Y}

N74{*，A，Q，S，P，T，Y}；G75{*，A，Q，S，P，T，Y}

N74{*，A，Q，S，P，T，Y}+G75{*，A，Q，S，P，T，Y}

N196{*，A，Q，S，P，T，Y}；G197{*，A，Q，S，P，T，Y}

N196{*，A，Q，S，P，T，Y}+G197{*，A，Q，S，P，T，Y}

N201{*，A，Q，S，P，T，Y}；G202{*，A，Q，S，P，T，Y}

N201{*，A，Q，S，P，T，Y}+G202{*，A，Q，S，P，T，Y}

N45{*，A，Q，S，P，T，Y}+N74{*，A，Q，S，P，T，Y}

N45{*，A，Q，S，P，T，Y}+N196{*，A，Q，S，P，T，Y}

N45{*，A，Q，S，P，T，Y}+N201{*，A，Q，S，P，T，Y}

N74{*，A，Q，S，P，T，Y}+N196{*，A，Q，S，P，T，Y}

N74{*，A，Q，S，P，T，Y}+N201{*，A，Q，S，P，T，Y}

N196{*，A，Q，S，P，T，Y}+N201{*，A，Q，S，P，T，Y}

N45{*，A，Q，S，P，T，Y}+N74{*，A，Q，S，P，T，Y}+N196{*，A，Q，S，P，T，Y}

N45{*，A，Q，S，P，T，Y}+N74{*，A，Q，S，P，T，Y}+N201{*，A，Q，S，P，T，Y}

N45{*，A，Q，S，P，T，Y}+N196{*，A，Q，S，P，T，Y}+N201{*，A，Q，S，P，T，Y}

N74{*，A，Q，S，P，T，Y}+N196{*，A，Q，S，P，T，Y}+N201{*，A，Q，S，P，T，Y}

N45{*，A，Q，S，P，T，Y}+N74{*，A，Q，S，P，T，Y}+N196{*，A，Q，S，P，T，Y}+201{*，A，Q，S，P，T，Y}

以及它们的组合。

AA513的具体变体有：

N90{*，A，Q，S，P，T，Y}；G91{*，A，Q，S，P，T，Y}

N90{*，A，Q，S，P，T，Y}+G91{*，A，Q，S，P，T，Y}

N201{*，A，Q，S，P，T，Y}；G202{*，A，Q，S，P，T，Y}

N201{*，A，Q，S，P，T，Y}+G202{*，A，Q，S，P，T，Y}

N90{*，A，Q，S，P，T，Y}+N201{*，A，Q，S，P，T，Y}

以及它们的组合。

MPR的具体变体有：

N68{*，A，Q，S，P，T，Y}；G69{*，A，Q，S，P，T，Y}

N68{*，A，Q，S，P，T，Y}+G69{*，A，Q，S，P，T，Y}

N103{*，A，Q，S，P，T，Y}；G104{*，A，Q，S，P，T，Y}

N103{*，A，Q，S，P，T，Y}+G104{*，A，Q，S，P，T，Y}

N192{*，A，Q，S，P，T，Y}；G196{*，A，Q，S，P，T，Y}

N192{*，A，Q，S，P，T，Y}+G196{*，A，Q，S，P，T，Y}

N68{*，A，Q，S，P，T，Y}+N103{*，A，Q，S，P，T，Y}

N68{*，A，Q，S，P，T，Y}+N192{*，A，Q，S，P，T，Y}

N103{*，A，Q，S，P，T，Y}+N192{*，A，Q，S，P，T，Y}

N68{*，A，Q，S，P，T，Y}+N103{*，A，Q，S，P，T，Y}+N192{*，A，Q，S，P，T，Y}

以及它们的组合。

除去自溶位点

根据本发明的另一方面，可通过改变自溶位点上的氨基酸除去自溶位点。由于RP-II蛋白酶在Glu和Asp残基处裂解，因此优选修饰具有相同或相似特异性的亲本RP-II蛋白酶的这些残基，优选地通过用除Glu外的任何其它氨基酸取代。

亲本RP-II蛋白酶主要是对Glu特异的，在较小程度上对Asp残基特异。因此可优选地通过将Glu变为其它氨基酸残基(包括Asp)来修饰亲本(胰蛋白酶样)RP-II蛋白酶。实验已经表明用Ala取代Asp或Glu提供了良好的结果。

在BLC、CDJ31和AC116蛋白酶的E101、E152、E173、E209、D6、D51、D96、D135、D161和D212位上发现有Glu和Asp残基。BLC还有E104位上的Glu和D7位上的Asp。

因而具体的BLC、CDJ31和AC116变体有E101A、E152A、E173A、E209A、D6A、D51A、D135A、D161A、D212A，以及它们中的两个、三个、四个等的组合。其它具体的BLC变体有E104A和D7A。

在JA96、BO32和BIP的E81、E143、E151、E209、D5、D6、D69、D96、D103、D135、D152、D161和D173位上发现有Glu和Asp。

因而具体的JA96、B032和BIP变体有E81A、E143A、E151A、E202A、D5A、D6A、D69A、D96A、D103A、D135A、D152A、D161A、D173A，以及它们中的两个、三个、四个等的组合。

在MPR的E7、E89a、E152、D6、D54、D92、D96、D135、D144、D161、D177和D209位上发现有Glu和Asp。

因而具体的MPR变体有E7A、E89aA、E152A、D6A、D54A、D92A、D96A、D135A、D144A、D161A、D177A和D209A，以及它们中的两个、三个、四个等的组合。

在AA513的E26、E55、E94、E117、E123、E137b、E199、D40、D96、D103b、D103d、D135、D149、D154、D161、D184和D209位上发现有Glu和Asp。

因而具体的AA513变体有E26A、E55A、E94A、E117A、E123A、E137bA、E199A、D40A、D96A、D103bA、D103dA、D135A、D149A、D154A、D161A、D184A和D209A，以及它们中的两个、三个、四个等的组合。

可以很容易地在任何其它RP-II蛋白酶中鉴定相应的变体。

可选择地，可通过将该Glu或Asp残基后的第一和/或第二位上的氨基酸残基变为Pro来防止自溶。例如，这可在BLC、CDJ31和AC116中174和/或175位上进行如下修饰：

Q174P；S175P；Q174P+S175P；

或者在JA96、BO32或BIP的152和/或153位上以类似的方式修饰，如D152P；T153P；或D152P+T153P。

可以很容易地在这些和任何其它RP-II蛋白酶中鉴定相应的变体。

色氨酸残基的修饰

为了稳定蛋白质，例如，如在US 5,118,623中所述，取代或缺失蛋白质表面上的色氨酸残基可能是有利的。色氨酸残基可有利地被F、T、Q或G取代。因此，在另一实施方案中，本发明涉及一种包括下列取代中的一个或多个的RP-II变体：

BLC和AC116：

W35{F，T，Q，G}；W88{F，T，Q，G}；W142{F，T，Q，G}；W217{F，T，Q，G}

CDJ31：

W142{F，T，Q，G}；W217{F，T，Q，G}；

B032，JA96和BIP：

W142{F，T，Q，G}；

AA513：

W30{F，T，Q，G}；W72{F，T，Q，G}；W142{F，T，Q，G}

MPR：

W57{F，T，Q，G}；W88{F，T，Q，G}；W112{F，T，Q，G}；W142{F，T，Q，G}；W217{F，T，Q，G}。

酪氨酸的修饰

关于洗涤性能，已发现某些酪氨酸残基修饰为苯丙氨酸将提供改良的洗涤性能。不受任何特殊理论的束缚，据信这些Tyr残基在碱性洗液中的滴定具有负效应，用其它残基，尤其是Phe或Trp，特别是Phe取代Tyr残基将会减轻这种负效应。

在BLC、AC116和CDJ31亲本RP-II蛋白酶中，可修饰下列酪氨酸残基：

19、50、72、74、82、95、97、112、115、117、132、154、163、195、200。也可修饰BLC和CDJ31中17和158位上的酪氨酸，以及AC116和CDJ31中的172位的酪氨酸。

具体变体的实例包括下列取代中的一种或多种：

Y17{F，W}、Y19{F，W}、Y50{F，W}、Y72{F，W}、Y74{F，W}、Y82{F，W}、Y88{F，W}、Y95{F，W}、Y97{F，W}、Y112{F，W}、Y115{F，W}、Y117{F，W}、Y132{F，W}、Y154{F，W}、Y158{F，W}、Y163{F，W}、Y172{F，W}、Y195{F，W}、Y200{F，W}。

在JA96、B032和BIP亲本RP-II蛋白酶中，可修饰下列酪氨酸残基：

19、24、50、57、64、83、88、95、112、132、157、158、195、216。

具体分JA96、B032和BIP变体的实例包括下列取代中的一个或多个：

Y19{F，W}、Y24{F，W}、Y50{F，W}、Y57{F，W}、Y64{F，W}、Y83{F，W}、Y88{F，W}、Y95{F，W}、Y112{F，W}、Y132{F，W}、Y157{F，W}、Y158{F，W}、Y195{F，W}和Y216{F，W}。

在AA513亲本RP-II蛋白酶中，可修饰下列酪氨酸残基：

24、74、77、84、88、97、130、132、158、163、193a

具体AA513变体的实例包括下列取代中的一个或多个：

Y24{F，W}、Y74{F，W}、Y77{F，W}、Y84{F，W}、Y88{F，W}、Y97{F，W}、Y130{F，W}、Y132{F，W}、Y158{F，W}、Y163{F，W}、Y193A{F，W}

在MPR亲本RP-II蛋白酶中，可修饰下列酪氨酸残基：

19、28a、30、50、72、74、77、83、95、97、113、115、154、158、163、172、175、200、216。

具体MPR变体的实例包括下列取代中的一个或多个：

Y19{F，W}、Y28Ad{F，W}、Y30{F，W}、Y50{F，W}、Y72{F，W}、Y74{F，W}、Y77{F，W}、Y83{F，W}、Y95{F，W}、Y97{F，W}、Y113{F，W}、115{F，W}、Y154{F，W}、Y158{F，W}、Y163{F，W}、Y172{F，W}、Y175{F，W}、Y200{F，W}、Y216{F，W}。

其它联合修饰

具体BLC变体的实例包括下列取代中的一个或多个：

E152{A、R、K、G}

E173A

E209A

E152G+G164R。

制备RP-II蛋白酶变体的方法

可通过本领域内的任何已知方法生产本发明的RP-II蛋白酶变体。本发明也涉及编码本发明RP-II蛋白酶变体的多核苷酸、包含这种多核苷酸的DNA构建体以及包含这种构建体或多核苷酸的宿主细胞。

一般地，可通过培养表达蛋白质的生物体和随后纯化蛋白质来生产天然存在的蛋白，或者通过重组方法将多核苷酸，例如，编码蛋白质的基因组DNA或cDNA克隆到表达载体中，将所述的表达载体导入到宿主细胞内，培养宿主细胞并纯化所表达的蛋白质。

定点诱变

蛋白质变体通常可通过定点诱变编码亲本蛋白质的基因、将突变的基因导入到表达载体、宿主细胞中等步骤生产。编码亲本蛋白质的基因可从产生多肽的菌株或者从表达文库中克隆，即可从基因组DNA中分离或者从cDNA中制备，或者它们的组合。该基因甚至可能是完全通过合成所产生的基因。

通常为了获得亲本RP-II蛋白酶，或者本发明的RP-II蛋白酶变体，可使用克隆基因和/或向所述基因中导入突变(随机的和/或定点的)的标准操作。为了进一步描述适宜的技术，参见Molecular cloning：A laboratory manual(Sambrook等(1989)，Cold Spring Harborlab.，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M.等(编))；Current protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(编))；Molecular Biological Methodsfor Bacillus(John Wiley和Sons，1990)；DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes I and 11(D.N.Glover编1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins编(1985))；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins，编(1984))；AnimalCell Culture(R.I.Freshney，编(1986))；Immobilized Cells And Enzymes(IRLPress，(1986))；A Practical Guide To Molecular Cloning(B.PRTI Perbal，(1984))以及WO 96/34946。

局部和区域特异的随机诱变

随机诱变适宜在翻译成讨论所示氨基酸序列的基因的至少三个部分中，或者在整个基因内进行局部或区域特异的随机诱变。

可通过使用本领域中的任何已知方法，便利地对编码亲本RP-II蛋白酶的DNA序列进行随机诱变。

就上述诱变而言，本发明的另一方面涉及一种产生亲本RP-II蛋白酶变体的方法，其中变体显示改变的性能，如相对于亲本RP-II蛋白酶，热稳定性增加、在低pH和在低钙浓度时稳定性增加，该方法包括：

a)对编码亲本蛋白酶的DNA序列进行局部或区域特异的随机诱变，

b)在宿主细胞中表达步骤(a)中所获得的突变DNA序列，和

c)筛选表达RP-II蛋白酶变体的宿主细胞，其中相对于亲本RP-II蛋白酶，变体具有改变的性能。

优选地使用掺杂引物进行本发明上述方法的步骤(a)。

当使用寡核苷酸进行诱变时，可在寡核苷酸合成期间在寡核苷酸待改变的位置上掺杂或者掺合三种非亲本核苷酸。可如此进行掺杂或者掺合以避免不需要的氨基酸的密码子。可通过任何公开的技术将掺杂或掺合的寡核苷酸掺入到编码RP-II蛋白酶的DNA中，使用例如，PCR、LCR或者认为合适的任何DNA聚合酶和连接酶。

优选地，使用“恒定的随机掺杂”进行掺杂，其中预设每个位置上野生型和修饰的百分比。此外，掺杂可定向为优先引入某些核苷酸，因而优先引入一种或多种特定的氨基酸残基。例如，可进行掺杂以便能够在每个位置上引入90％野生型和10％修饰。在选择掺杂方案方面另外的考虑建立在遗传以及蛋白质-结构约束的基础上。可使用DOPE程序制订掺杂方案，尤其确保避免引入终止密码子(L.J.Jensen等Nucleic Acid Research，26，697-702(1998)。

待诱变的DNA序列可方便地存在于从表达亲本RP-II蛋白酶的生物体中制备的基因组或cDNA文库上。可选择地，DNA序列可能存在于适当的载体上，如质粒或噬菌体，这样其可与诱变剂孵育或者以其它方式接触。通过整合到宿主细胞的基因组中，或者通过存在于所述细胞内所含的载体上，待诱变的DNA也可能存在于宿主细胞中。最后，待诱变的DNA可以是分离的形式。应当理解的是，待进行随机诱变的DNA序列优选地是cDNA或基因组DNA序列。

在有些情况中，在进行表达步骤b)或者筛选步骤c)前，扩增突变的DNA序列可能更方便。可根据本领域中的已知方法进行这种扩增，目前优选的方法是使用根据亲本酶的DNA或氨基酸序列所制备的寡核苷酸引物通过PCR所产生的扩增。

与诱变剂孵育或接触后，在允许发生表达的条件下，通过培养携带该DNA序列的适当的宿主细胞表达突变的DNA。用于这个目的的宿主细胞可以是已用突变的DNA序列转化过的宿主细胞，任选地(突变的DNA序列)存在于载体上，或者是在诱变处理期间携带编码亲本酶的DNA序列的宿主细胞。适当宿主细胞的实例如下：***如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulants)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megatermm)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)；以及革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。

突变的DNA序列可进一步包括编码具有容许突变DNA序列表达功能的DNA序列。

局部随机诱变

随机诱变可能有利地是局限于所讨论亲本RP-II蛋白酶的一部分。例如，当酶的某些区域已被鉴定为对于酶的给定性能特别重要时，并且预期修饰会产生具有改良性能的变体时，这可能是有利的。当亲本酶的三级结构已被阐明且与酶的功能有关时，可正常地鉴定出这些区域。

通过使用上述PCR产生诱变的技术或者本领域中已知的任何其它适当的技术，可很方便地进行局部的或区域特异的随机诱变。可选择地，可分离编码待修饰部分DNA序列的DNA序列，例如，通过***到适当的载体中，随后可使用上述诱变方法中的任何一种对所述部分进行诱变。

使用DOPE程序进行局部随机诱变的一般方法

可通过下列步骤进行局部随机诱变：

1、在亲本酶中选择用于修饰的目的区域；

2、在所选择的区域中决定突变位点和非突变的位点；

3、决定将要进行何种突变，例如，就待构建变体期望的稳定性和/或性能而言；

4、选择基于结构的突变；

5、考虑到步骤4，调整在步骤3中所选择的残基；

6、使用适当的掺杂算法分析核苷酸的分布；

7、必要的话，调整所需的残基使之适于遗传密码子现实性，例如，考虑由于遗传密码子引起的约束，例如，为了避免引入终止密码子；技术人员将会意识到一些密码子组合在实践中不能使用而需要进行修改；

8、制备引物；

9、使用引物进行局部随机诱变；

10、筛选所期望的改良性能，选择所得的RP-II蛋白酶变体。

用于步骤6的适当的掺杂算法是本领域中公知的。一种这样的算法由Tomandl，D.等，1997，Journal of Computer-Aided Molecular Design 11：29-38所描述。另一种算法是DOPE(Jensen，LJ，Andersen，KV，Svendsen，A和Kretzschmar，T(1998)Nucleic Acids Research 26：697-702)。

表达载体

包含编码本发明RP-II蛋白酶变体的核酸序列的重组表达载体可以是任何可很方便地进行重组DNA操作并且可使核酸序列表达的载体。

载体的选择常常将取决于其将被引入的宿主细胞。适当载体的实例包括线性的或闭合的质粒或病毒。载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖染色体的复制，例如，质粒，染色体外元件，微型染色体或者人工染色体。载体可能含有确保自我复制的任何部件。细菌复制起点的实例有质粒pBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。用于酵母宿主细胞的复制起点的实例有2微米复制起点、CEN6和ARS4的组合，以及CEN3和RS1的组合。复制起点可以是具有突变的复制起点，其中突变使得复制起点在宿主细胞中对温度敏感(例如参见Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 75：1433)。

可选择地，载体可以是一种当被引入到宿主细胞中时，被整合到基因组内并与被整合到其中的染色体一同复制的载体。被整合到宿主细胞基因组内的载体可含有能使之整合到染色体内的任何核酸序列；特别是其可包含便于通过同源或非同源重组整合到基因组内的核酸序列。载体***可以是单个载体，例如，质粒或病毒，或者是两个或多个载体，例如，多个质粒或多个病毒，它们一起包含将被引入到宿主细胞基因组内的总DNA，或者转座子。

载体可特别地是表达载体，其中编码本发明RP-II蛋白酶变体的DNA序列有效地连接于DNA转录所需的另外的片段或控制序列。术语“有效地连接于”表示将片段如此排列，从而它们协同作用，以达到其预期目的，例如，转录从启动子开始并且持续到整个编码P-II蛋白酶变体的DNA序列。另外的片段或控制序列包括启动子、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号序列和转录终止子。控制序列最低限度包括启动子以及转录和翻译终止信号。

启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，可来自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。

用于细菌宿主细胞的适当的启动子的实例包括枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖(maltogenic)淀粉酶基因(amyM)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因、或者短小芽孢杆菌木糖苷酶基因、解淀粉芽孢杆菌BAN淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、以及原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：3727-3731)的启动子。其它实例包括噬菌体入P_R或P_L启动子或者大肠杆菌lac、trp或tac启动子或者天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)的启动子。其它的启动子描述于“Useful proteins from recombinant bacteria”inScientific American，1980，242：74-94；和Sambrook等，1989，同前。

用于丝状真菌宿主细胞的适当的启动子的实例有从编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶的基因中获得的启动子(如美国专利No.4,288,627中所述，其在此引入作为参考)，以及它们的杂合体。用于丝状真菌宿主细胞的特别优选的启动子有TAKA淀粉酶、NA2-tpi(编码黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂合体)，以及glaA启动子。用于丝状真菌宿主细胞的其它适当的启动子有ADH3启动子(McKnight等，The EMBO J.4(1985)，2093-2099)或者tpiA启动子。

用于酵母宿主细胞的适当的启动子的实例包括酵母糖酵解基因(Hitzeman等，J.Biol.Chem.255(1980)，12073-12080；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Gen.1(1982)，419-434)或者乙醇脱氢酶基因(Young等，在GeneticEngineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender等，编)，Plenum Press，New York，1982)的启动子，或者TPI1(US 4,599,311)或ADH2-4c(Russell等，Nature 304(1983)，652-654)启动子。

其它有用的启动子是从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)，以及酿酒酵母3-磷酸甘油激酶基因中获得的。用于酵母宿主细胞的其它有用的启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。在哺乳动物宿主细胞中，有用的启动子包括病毒启动子如那些来自猿猴病毒40(SV40)、Rous肉瘤病毒(RSV)、腺病毒以及牛***瘤病毒(BPV)的启动子。

用于哺乳动物细胞的适当的启动子的实例是SV40启动子(Subramani等，Mol.Cell Biol.1(1981)，854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子(Palmiter等，Science 222(1983)，809-814)或者腺病毒2主要晚期启动子。

用于昆虫细胞的适当的启动子的实例是多角体蛋白启动子(US4,745,051；Vasuvedan等，FEBS Lett.311，(1992)7-11)、P10启动子(J.M.Vlak等，J.Gen.Virology 69，1988，第765-776页)、苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)多角体病毒碱性蛋白质启动子(EP 397 485)、杆状病毒即早期基因1启动子(US 5,155,037；US 5,162,222)或者杆状病毒39K晚早期基因启动子(US 5,155,037；US 5,162,222)。

如有必要，编码本发明RP-II蛋白酶变体的DNA序列也可以，有效地连于适当的终止子。

本发明的重组载体可进一步包括能使载体在所讨论宿主细胞中进行复制的DNA序列。

载体也可以包含选择标记，例如，其产物补偿宿主细胞缺陷的基因，或者编码如下抗性的基因：例如，氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素、新霉素、潮霉素、氨甲蝶呤抗生素抗性，或者重金属、病毒或者除草剂抗性，或者提供原养型或营养缺陷型的基因。细菌选择标记的实例有枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal抗性基因。频繁使用的哺乳动物标记是二氢叶酸还原酶基因(DHFR)。酵母宿主细胞的适当标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记可选自如下，包括但不限于：amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)和草铵膦(glufosinate)抗性标记，以及来自其它物种的等同物。特别是，用于曲霉属细胞的选择标记是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar标记。此外，选择可通过共转化实现，例如，如在WO 91/17243中所描述的，其中选择标记位于单独的载体上。

为了将本发明的RP-II蛋白酶变体定向到宿主细胞的分泌通路中，可在重组载体中提供分泌信号序列(也称作前导序列，前原序列或前序列)。将分泌信号序列以正确的阅读框连于编码酶的DNA序列上。分泌信号序列通常位于编码酶的DNA序列的5′端。分泌信号序列可以是正常地与该酶结合的序列，或者可以来自编码其它分泌蛋白的基因。

如下操作是本领域技术人员公知的：分别将编码本发明酶的DNA序列、启动子和任选地终止子和/或分泌信号序列连接起来，或者通过适当的PCR扩增方案将这些序列装配起来，以及将它们***到含有复制或整合所需信息的适当载体内(例如参见Sambrook等)。

可将编码本发明酶的核酸序列的一个以上拷贝***到宿主细胞内以扩大核酸序列的表达。可使用本领域中的公知方法，通过将序列的至少一个附加拷贝整合到宿主细胞基因组内从而获得核酸序列的稳定扩增。

本发明的核酸构建体也可包括一个或多个这样的核酸序列，其编码一个或多个利于多肽表达的因子，例如激活剂(例如，反式作用因子)、蛋白伴侣以及加工蛋白酶。任何在所选的宿主细胞中有功能的因子都可在本发明中使用。编码一种或多种这些因子的核酸不必与编码多肽的核酸序列串连。

宿主细胞

编码本发明RP-II蛋白酶变体的DNA序列与将要被引入的宿主细胞可以同源或异源。如果与宿主细胞同源，即由宿主细胞天然产生的，那么其通常将被有效地连接于其它启动子序列或者，如果适用的话，连接于并非其天然环境中的其它分泌信号序列和/或终止子序列。术语“同源的”旨在包括编码所讨论宿主生物体的天然酶的DNA序列。术语“异源的”旨在包括不被宿主细胞天然所表达的DNA序列。因此，DNA序列可能来自另一种生物体，或者其可能是合成的序列。

本发明的DNA构建体或重组载体被引入其中的宿主细胞可以是能够产生亲本RP-II蛋白酶变体的任何细胞，如原核细胞，例如，细菌或者真核细胞，如真菌细胞，例如酵母或丝状真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。

经培养，能产生本发明RP-II蛋白酶变体的细菌宿主细胞的实例有***，如芽孢杆属菌株，例如枯草芽孢杆菌株、地衣芽孢杆菌株、迟缓芽孢杆菌株、短芽孢杆菌株、嗜热脂肪芽孢杆菌株、嗜碱芽孢杆菌株、解淀粉芽孢杆菌株、凝结芽孢杆菌株、环状芽孢杆菌株、灿烂芽孢杆菌株、巨大芽孢杆菌株或苏云金芽孢杆菌株，或者链霉菌株，如浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌，或者是革兰氏阴性细菌如大肠杆菌或假单孢菌属菌种(Pseudomonas sp)。

细菌的转化可通过原生质体转化、电穿孔、接合，或者通过其本身已知的方式使用感受态细胞来完成(参考Sambrook等，同前)。

当在细菌如大肠杆菌中表达RP-II蛋白酶变体时，酶可保留在细胞质中，一般地作为不溶的颗粒(称作包涵体)，或者其可通过细菌的分泌序列定向到胞质空间中。在前者的情况下，溶解细胞，回收颗粒并变性，其后通过稀释变性剂使酶重折叠。在后者的情况下，可通过裂解细胞从胞质空间中回收酶，例如，通过超声处理或渗透休克以释放胞质空间的内容物并回收酶。

当在***如芽孢杆菌属或链霉菌属菌株中表达RP-II蛋白酶变体时，酶可被保留在细胞质中，或者其可通过细菌的分泌序列被定向到细胞外的培养基中。在后者的情况下，可根据下面的描述从培养基中回收酶。

酵母宿主细胞的实例包括假丝酵母(Candida)、克鲁维斯酵母(Kluyveromyces)、酵母菌(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansehula)或亚罗酵母(Yarrowia)菌种的细胞。在特定的实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔斯伯酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticu)、Saccharomyces douglasii、克氏酵母(Saccharomyces kluyveri)、Saccharomyces norbensis或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。其它有用的酵母宿主细胞是乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维斯酵母(Kluyveromyces fragilis)、多形汉逊酵母(Hansehula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastors)、解酯亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、Ustilgo maylis、麦芽糖假丝酵母(Candida maltose)、Pichiaguillermondii和Pichia methanolio细胞(参见Gleeson等，J.Gen.Microbiol.132，1986，pp.3459-3465；US 4,882,279和US 4,879,231)。由于酵母的分类将来可能会改变，因此对于本发明的目的而言，将根据在Biology and Activities ofYeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980中所描述的对酵母进行定义。酵母的生物学和酵母遗传学的操作是本领域公知的(例如见，Biochemistry andGenetics of Yeast，Bacil，M.，Horecker，B.J.和Stopani，A.O.M.编辑，第二版，1987；The Yeasts，Rose，A.H.和Harrison，J.S.编辑，第二版，1987；以及TheMolecular Biology of the Yeast Saccharomyces，Strathem等编辑，1981)。可使用由Becker和Guarente，In Abelson，J.N.和SimoB，M.I.编辑，Guide toYeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journal of Bacteriology153：163；以及Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 75：1920所描述的方法转化酵母。

丝状真菌细胞的实例包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚门的丝状体(如由Hawksworth等，1995，同前，所定义的)，特别是其可以是枝顶孢霉属(Acremonium)，如产黄顶孢霉菌(A.chrysogenum)，曲霉(Aspergillus)，如泡盛曲霉、臭曲霉(A.Foetidus)、日本曲霉(A.Japonicus)、黑曲霉、构巢曲霉或米曲霉，镰孢菌(Fusarium)，如F.bactridioides、谷物镰孢菌(F.cereals)、弯钩镰孢菌(F.crookwellense)、黄色镰刀菌(F.culmorum)、禾谷镰孢菌(F.graminearum)、F.graminum、异孢镰刀菌(F.heterosporum)、F.negundi、网状镰孢菌(F.reticulatum)、粉红镰孢(F.roseum)、接骨木镰刀菌(F.sambucinum)、F.sarcochroum、硫色镰孢菌(F.sulphureum)、F.trichothecioides或者尖孢镰孢菌(F.oxysporum)，腐质霉(Humicola)，如特异腐质霉(H.insolerns)或H.Lanuginose，毛霉菌(Mucor)，如米黑毛霉(M.Miehei)，毁丝霉(Myceliophthora)，如嗜热毁丝霉(M.Thermophilum)，脉孢霉(Neurospora)，如粗糙脉孢霉(N.Crassa)，青霉菌(Penicillium)，如产紫青霉菌(P.Purpurogenum)，梭孢壳(Thielaviav)，如栖土梭孢壳(T.Terrestris)，弯颈霉(Tolypocladium)，或者木霉(Trichoderma)，如哈茨木霉(T.harzianum)、康氏木霉(T.koningii)、长枝木霉(T.Longibrachiatum)、里氏木霉(T.Reesei)或者绿色木霉(T.Viride)，或者有性型或其同义词菌种细胞的丝状体。在例如EP 272 277、EP 230 023中描述了曲霉属在蛋白质表达中的用途。

昆虫细胞的实例包括鳞翅目细胞系，如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(参见US 5,077,214)。培养条件可适当地如WO 89/01029或WO 89/01028中所描述的条件。可如在US 4,745,051；US4,775,624；US 4,879,236；US 5,155,037；US 5,162,222；EP 397,485中所描述的方法进行昆虫细胞的转化和在其中生产异种多肽。

哺乳动物细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞或者其它可利用的永生化细胞系的任何成员，例如，获自美国典型培养物保藏中心的哺乳动物细胞。转染哺乳动物细胞和在细胞中表达所引入的DNA序列的方法描述于例如，Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.159(1982)，601-621；Southem和Berg，J.Mol.Appl.Genet.1(1982)，327-341；Loyter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79(1982)，422-426；Wigler等，Cell 14(1978)，725；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7(1981)，603，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，Inc.，N.Y.，1987，Hawley-Nelson等，Focus 15(1993)，73；Ciccarone等，Focus 15(1993)，80；Graham和van der Eb，Virology 52(1973)，456；以及Neumann等，EMBO J.1(1982)，841-845。可使用Graham和Van der Eb(1978，Virology 52：546)的磷酸钙沉淀法，通过直接摄入转染哺乳动物细胞。

蛋白质表达和分离的方法

为了表达本发明的酶，一般地在适当的营养培养基中，在允许产生期望分子的条件下培养用含有编码本发明酶的核酸序列的载体转化或转染的上述宿主细胞，其后从细胞或者从培养肉汤中回收这些酶。

用于培养宿主细胞的培养基可以是适于培养宿主细胞的任何常规培养基，如含有适当补充物的基本培养基或者复合培养基。适当培养基可从商品供应商获得或者可根据公开的配方(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)进行制备。培养基可使用本领域中的已知方法进行制备(例如参见，关于细菌和酵母的参考资料；Bennett，J.W.和LaSure，L.编辑，More GeneManipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)。

如果本发明的酶分泌到营养培养基中，那么它们可直接从培养基中回收。如果它们不被分泌，那么它们可从细胞裂解物中回收。本发明的酶可通过常规方法从培养基中回收，包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，利用盐例如硫酸铵沉淀上清液或滤液的蛋白原性组分，通过多种层析方法进行纯化，例如，离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等，视所讨论的酶而定。

可使用本领域中特异于这些蛋白质的已知方法检测本发明的酶。这些检测方法包括特异性抗体的使用、产物的形成或者底物的消失。例如，可使用酶测定法测定分子的活性。测定多种活性的方法是本领域中已知的。

可通过本领域中已知的各种方法纯化本发明的酶，包括但不限于：层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水层析、色谱聚焦层析以及大小排阻层析)、电泳法(例如，制备型等电聚焦(IEF)、差异溶解(例如，硫酸铵沉淀)或者萃取(例如参见，Protein Purification，J-C Janson和Lars Ryden编辑，VCH Publishers，New York，1989)。

当将含有编码本发明酶的DNA序列的表达载体转化/转染到异源宿主细胞中时，有可能进行酶的异源重组生产。使用异源宿主细胞的好处是能得到高度纯化的酶组合物，特点是没有通常当蛋白质或肽在同源宿主细胞中表达时所存在的同源杂质。在本上下文中，同源杂质是指任何杂质(例如，与本发明的酶不同的其它多肽)，其来自本发明的酶最初获自的同源细胞。

洗涤剂应用

本发明的酶可添加到洗涤剂组合物中而成为其中的组分。

本发明的洗涤剂组合物可例如配制成手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理污染织物的洗衣添加剂组合物和漂洗时添加的织物柔软剂组合物，或制成用于普通家庭硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制以用于手洗或机洗洗盘操作。

在一特定的方面，本发明提供包含本发明酶的洗涤添加剂。所述的洗涤添加剂和洗涤剂组合物可以包含一种或多种其它的酶如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、***糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶，和/或过氧化物酶。

一般来说，所选择的酶的性质应当与所选择的洗涤剂相适应(即最适pH，与其它酶和非酶组分具相容性等)，且所述的酶应以有效量存在。

蛋白酶：

合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。优选微生物来源的蛋白酶。包括经化学修饰或蛋白质工程化的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌素，尤其是来自芽孢杆菌的那些，例如，枯草杆菌素Novo、枯草杆菌素Carlsberg、枯草杆菌素309、枯草杆菌素147和枯草杆菌素168(描述于WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)和在WO 89/06270和WO 94/25583中所描述的镰孢菌蛋白酶。

有用的蛋白酶的实例是在WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946中所描述的变体，特别是在一个或多个下述位置发生取代的变体：27、36、57、68、76、87、97、101、104、106、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、245、252和274。

优选地可商购的蛋白酶包括Alcalase^TM、Savinase^TM、Primase^TM、Duralase^TM、Esperase^TM、Coronase^TM和Kannase^TM(Novozymes A/S)、Maxatase^TM、M axacal^TM、M axapem^TM、Properase^TM、Purafect^TM、Purafect OxP^TM、FN2^TM和FN3^TM(Genencor International Inc.)。

脂肪酶：

适当的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些脂肪酶。包括经化学修饰或蛋白质工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质酶(Humicola)(Thermomyces与之同物异名)的脂肪酶，例如，如在EP 258 068和EP 305216中所描述的来自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶或者如在WO96/13580中所描述的来自特异腐质霉(H.Insolens)的脂肪酶，假单孢菌(Pseudomonas)脂肪酶，例如，来自产碱假单孢菌(P.alcaligenes)或类产碱假单孢菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单孢菌(P.cepacia)(EP331 376)、施氏假单孢菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单孢菌(P.fluorescens)、假单孢菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶，芽孢杆菌脂肪酶，例如，来自枯草芽孢杆菌(Dartois等(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)的脂肪酶。

其它实例为如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407 225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中所述的脂肪酶变体。

优选的可商购的脂肪酶包括Lipolase^TM、Lipolase Ultra^TM和Lipex^TM(Novozymes A/S)。

淀粉酶：

合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些淀粉酶。包括经化学修饰或蛋白质工程化的变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌中获得的α-淀粉酶，例如来自地衣芽孢杆菌的特定菌株，详细内容参见GB 1,296,839。

有用的淀粉酶的实例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873和WO 97/43424中所描述的变体，尤其是在一个或多个下述位置发生取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Stainzyme^TM、Fungamyl^TM和BAN^TM(Novozymes A/S)、Rapidase^TM和Purastar^TM(来自GenencorInternational Inc.)。

纤维素酶：

合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些纤维素酶。包括经化学修饰或蛋白质工程化的变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单孢菌属、腐质霉属、镰孢霉属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，在US4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259中公开的由特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)和尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。

特别合适的纤维素酶是具有颜色保护优势的碱性或中性纤维素酶。这些纤维素酶的实例是在EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO96/29397、WO 98/08940中所描述的纤维素酶。其它实例为如那些在WO94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO95/24471、WO 98/12307和PCT/DK98/00299中所述的纤维素酶变体。

可商购的纤维素酶包括Renozyme^TM、Celluzyme^TM和Carezyme^TM(Novozymes A/S)、Clazinase^TM和Puradax HA^TM(Genencor International Inc.)以及KAC-500(B)^TM(Kao Corporation)。

过氧化物酶/氧化酶：

适当的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些氧化物酶/氧化酶。包括经化学修饰或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括如在WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所描述的来自鬼伞属(Coprinus)(例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus))的过氧化物酶，以及它们的变体。

可商购的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(Novozymes A/S)。

这些洗涤剂酶可以通过添加含一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加含所有这些酶的组合添加剂而被包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，也就是独立添加剂或组合添加剂可以制成例如颗粒状、液体、浆状等等。优选的洗涤剂添加剂制剂为颗粒(特别是无粉尘颗粒)、液体(特别是被稳定化的液体)或浆。

无粉尘颗粒可依照例如US 4,106,991和4,661,452所述进行生产并可任选地用本领域已知的方法加包衣。蜡质包衣材料的实例是平均分子量为1000到20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；含有16到50个环氧乙烷单位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中，醇含12到20个碳原子且其中存在15到80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、二-和三酸甘油酯。GB 1483591中给出了适合于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例。液体酶制剂可以例如依照现成的方法通过添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸得以稳定。受保护的酶可依照EP 238,216中所公开的方法进行制备。

本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如块状、片状、粉末、颗粒、膏状或液体。液体洗涤剂可以是含水的，一般含高达70％的水和0-30％的有机溶剂，或是不含水的。

洗涤剂组合物包括一种或多种表面活性剂，它们可以是非离子(包括半极性的)和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子表面活性剂。表面活性剂一般占到0.1％到60％的重量。

当包含在所述洗涤剂中时，洗涤剂通常包含约1％到约40％的阴离子表面活性剂，如直链烷基苯磺酸盐、α-烯属磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧化硫酸盐、仲链烷磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或链烯基琥珀酸或皂。

当包含在所述洗涤剂中时，通常含有约0.2％到约40％的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。

洗涤剂可以包含0-65％的洗涤剂助洗剂或络合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸酯、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或链烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层叠式硅酸盐(例如购自Hoechst的SKS-6)。

洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂醇酯/丙烯酸共聚物。

洗涤剂可以含有漂白体系，所述漂白体系可以包含H₂O₂来源如过硼酸盐或过碳酸盐，其可以与形成过酸的漂白活化剂如四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐相结合。可选择地，所述的漂白体系可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类的过氧酸。

本发明的洗涤剂组合物中的酶可以通过诸如以下的常规稳定剂稳定：多元醇如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，且所述的组合物可以按例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制。

洗涤剂还可以包含其它的常规洗涤剂成分，例如织物调理剂包括粘土、发泡剂、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污物再沉淀剂、染料、杀菌剂、光学增白剂、水助溶剂、晦暗抑制剂或香料。

目前认为在所述洗涤剂组合物中任何酶，特别是本发明的酶可以以相当于每升洗涤液中具有0.01-100mg酶蛋白质，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白质，特别优选每升洗涤液中具有0.1-1mg酶蛋白质的量加入。

本发明的酶可以额外地添加到如WO 97/07202所公开的洗涤剂制剂中，该文献引入本文作为参考。

食物加工应用

本发明的RP-II蛋白酶变体也可用于食物的加工，尤其是用于乳制品(diary product)领域，如奶、奶油和乳酪，但也用于肉和蔬菜的加工。

饲料加工应用

本发明的RP-II蛋白酶变体也可用于牛、家禽和猪饲料的加工，尤其用于宠物食品的饲料加工。

兽皮的处理

本发明的RP-II蛋白酶变体也可用于兽皮的处理。

可能污染的材料的消毒

为了分解朊病毒或其它传染剂，本发明的RP-II蛋白酶变体也可用于仪器、表面以及医院、诊所和肉加工厂中的其它材料等的消毒。

材料和方法

菌株：

枯草芽孢杆菌DN1885：在WO 01/16285中公开。

质粒：

pNM1003：在WO01/16285中公开

pSX222：在WO 96/34946中公开

pNM 1008：见实施例2

生产蛋白酶变体的方法

本发明提供了生产根据本发明的分离的酶的方法，其中在允许生产酶的条件下培养已用编码酶的DNA序列转化的适当的宿主细胞，并从培养物中回收所得的酶。

当将包含编码酶的DNA序列的表达载体转化到异源宿主细胞内时，有可能进行本发明酶的异源重组生产。因此有可能制备高度纯化的RP-II蛋白酶组合物，特征是无异源杂质。

用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是适于培养该宿主细胞的任何常规培养基。所表达的RP-II蛋白酶可常规地被分泌到培养基中，并可用公知的方法从其中回收，方法包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，利用盐如硫酸铵沉淀培养基的蛋白原性成分，接下来进行层析操作如离子交换层析、亲和层析等。

蛋白水解活性

可使用PNA试验测量酶活性，使用琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-谷氨酸-对硝基苯胺作为底物。在Journal of American Oil Chemists Society，Rothgeb，T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison，P.H.和Smith，L.A.，(1988)中描述了PNA试验的原理。

织物

标准织物片获得自瑞士的EMPA St.Gallen，Lerchfeldstrasse 5，CH-9014St.Gallen。尤其是类型EMPA116(污有血液、奶和墨水的棉织物)和EMPA117(污有血液、奶和墨水的聚酯/棉织物)。可将织物切成更小的5×3cm或13×3cm的织物片。

也可使用其它的相关蛋白酶污渍，例如，荷兰Vlaardingen CFT(试验材料中心)的C-03、C-05和C-10。

洗涤条件

*°dH：通过向milli-Q水中添加CaCl₂*2H₂O；MgCl₂*6H₂O；NaHCO₃(Ca²⁺∶Mg²⁺∶HCO^3-之比＝2∶1∶6)进行调整。

洗涤剂

本发明的酶可在WO 97/07202所公开的洗涤剂制剂或者在从wfktestgewebe GmbH或类似供应商购买的洗涤剂制剂中测试。

wfk testgewebe的测试洗涤剂列表

·IEC 60456A型*碱性洗涤剂

·IEC 60456B型碱性洗涤剂

·IEC 60456C型洗涤剂

·有磷酸盐的ECE参照洗涤剂(1977)

·无磷酸盐的ECE参照洗涤剂(1998)

·AHAM标准洗涤剂

·EU ECOLABEL(洗涤剂)轻垢型洗涤剂

·EU ECOLABEL(洗涤剂)PVP

不过，也可在洗涤试验中使用下列商品化洗涤剂之一，例如

·Omo Multi Acao HDP，Unilever(联合利华)，巴西

·Tide HDL，P&G (宝洁)，US

·Wisk HDL，Unilever(联合利华)，美国

·TOP HDP，Lion，日本

·Attack HDP，Kao(花王)，日本

·Ariel Regular HDP，P&G(宝洁)，欧洲

·Ariel Compact HDPC，P&G(宝洁)，欧洲

·Persil Megaperls，Henkel，德国

·Persil，Unilever(联合利华)，英国

此外，也可使用上述洗涤剂的品牌延伸或彩装/浓缩装。

如果洗涤剂含有酶，那么为了除去已在洗涤剂中存在的酶活性，洗涤剂在使用前应当是灭活的。这通过将洗涤剂原液在微波炉中加热到85℃，持续5分钟。微波炉中洗涤剂原液的浓度在4-20g/l之间。

实施例

实施例1：

根据BLC的3D结构对RP-II蛋白酶建模

地衣芽孢杆菌蛋白酶BLC与其它RP-II蛋白酶的总同源性很高。表1中提供了不同RP-II蛋白酶之间的相似性。使用图2的序列比对，使用适当的建模工具象Accellrys同源性软件，或Modeller(也来自Accellrys)，或者象Nest的其它软件，可建立JA96蛋白酶的模型。这些程序提供作为最初粗糙模型的结果，在Modeller和Nest程序中进行某些优化。

最初的粗糙模型确保JA96蛋白酶模型和BLC的3D结构之间紧密的结构同源性，因为模型结构中没有重叠侧链。为优化结构，可将计算机芯片上的蛋白质浸在水盒中并使能量减少到最低，使用例如Accelrys的CHARMm^TM软件，进一步进行分子动力学模拟。通过在Insight II程序(购自Accelrys)中添加盒体积为75*75*75

的水，可很方便地将蛋白质芯片浸在水中。可使用300最速下降法(SD)和另一600共轭梯度(CJ)的设置使能量减少到最小。使用300K的Verlet算法和标准参数(见CHARMm手册)运行1.2ns，可很方便地进行分子动力学模拟。可以类似方式建立其它RP-II蛋白酶的3D模型。

实施例2：

RP-II蛋白酶变体文库的构建

BLC的构建和表达

构建了适于编码RP-II蛋白酶BLC及其突变体基因的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pNM1003。其衍生自如在WO 01/16285中所描述的枯草芽孢杆菌表达载体pSX222(描述于WO 96/34946)。为了便于克隆，通过在Hind III位点下游引入kpn I限制性位点构建pNM1008，以便于片段克隆到载体内。为进行芽孢杆菌内的转化，将pNM1008用Hind III进行酶切，分离并连接4350bp的DNA片段。使用连接混合物转化感受态枯草芽孢杆菌DN1885，如WO01/16285所述，对蛋白酶活性进行选择。

定点诱变

通过由含有期望修饰的寡核苷酸所产生的PCR片段的常规克隆(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor)，制备分子中包含特异性取代、***或缺失的本发明的BLC定点变体。使用pNM1008作为模板。在使用突变引物(反义)的第一次PCR中，使用MluI位点下游的适当的相反有义引物(如，5′-CTGTGCCCTTTAACCGCACAGC(SEQ ID No.17))。在第二次PCR中，使用所得的DNA片段作为有义引物，连同KpnI消化位点上游的适当的反义引物(例如5′-GCATAAGCTTTTACAGGTACCGGC(SEQ ID No.18))。将该所得的PCR产物用KpnI和MluI消化，并连于用相应的酶消化的pNM1008中。

通过公知技术将连接反应物转化到大肠杆菌内，对5个随机选取的菌落进行测序以证实所设计的突变。

为了表达本发明的BLC变体，将含有变体的从pNM1008衍生的质粒用Hind III消化，连接并转化到感受态枯草芽孢杆菌株内，对蛋白酶的活性进行选择。

实施例3：

酶和变体的纯化

本操作涉及在芽孢杆菌宿主细胞中生产本发明蛋白酶RP-II的2升规模发酵的纯化。

将大约1.6升发酵肉汤在1升烧杯以在5000rpm离心35分钟。使用10％乙酸将上清液调整到pH 7并通过Seitz Supra S100过滤板进行过滤。

在室温下，将滤液施加到用0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钙(缓冲液A)平衡的100ml杆菌肽亲和柱上，缓冲液用氢氧化钠调整到pH 7。用缓冲液A洗涤柱以除去未结合的蛋白质，使用补充了25％2-丙醇和1M氯化钠的缓冲液A将蛋白酶从杆菌肽柱中洗脱下来。

汇集从杆菌肽纯化步骤中洗脱的具有蛋白酶活性的级分，并施加到用缓冲液A平衡的750ml葡聚糖凝胶G25柱(直径5cm)上。

汇集从葡聚糖凝胶G25柱中洗脱的具有蛋白水解活性的级分，用10％乙酸将pH调整到pH 6，并施加到用含有0.01M二甲基戊二酸、0.1M硼酸以及0.002M氯化钙的缓冲液平衡的150ml CM琼脂糖CL 6B阳离子交换柱(直径5cm)上，其中缓冲液用氢氧化钠调整到pH 6。

将蛋白酶用溶于2升相同缓冲液的0-0.2M氯化钠的线性梯度洗脱。

最后，汇集从CM琼脂糖柱中洗脱的含有蛋白酶的级分，通过0.2μ滤器进行过滤。

通过使用实施例2中用于变体的构建和发酵的技术以及上述分离操作，可生产和分离下列RP-II蛋白酶和变体：

实施例4：

包含修饰酶的洗涤剂组合物的洗涤性能

AMSA

本申请的酶变体使用自动机械应力试验(AMSA)测试。使用AMSA试验可检查大量的小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多装受试溶液的槽和将织物布样紧紧挤压以使之在槽中洗涤并防止所有的槽打开的盖子。在洗涤期间，将板、受试溶液、织物和盖子剧烈摇动，以使受试溶液与织物接触并施加机械应力。进一步的描述见WO02/42740，尤其见第23-24页“特定方法的实施方案”。

试验在下述试验条件下进行。就所使用的洗涤剂而言，上面在“材料和方法”中所列的所有洗涤剂都可以使用：

洗涤剂基础	实例：Omo Acao
		洗涤剂剂量	实例：1.5g/l
受试溶液体积	160microl
		pH	实例：原本的样子
洗涤时间	实例：14分钟
		温度	实例：20℃
水硬度	实例：9°dH
		受试溶液中的酶浓度	5nM、10nM和30nM
受试材料	实例：EMPA 117

洗涤后织物片用自来水冲洗并风干。

酶变体的洗涤性能测量为用特定酶变体洗涤的织物样本颜色的亮度。亮度也可表示为当用白色光照射时自织物样本反射的光强度。当织物有污渍时，反射光的强度较干净的织物低。因此反射光的强度可用于测量酶变体的洗涤性能。

颜色测量用专业的平台扫描仪(PFU DL2400pro)进行，该仪器用于捕捉经洗涤织物样本的成像。使用分辨率200dpi和输出色浓度24比特进行扫描。为了获得准确的结果，将扫描仪经常用柯达反射性IT8靶标校正。

为了从扫描图像获取光强度的值，使用了专门设计的软件(Novozymes颜色向量分析仪)。该程序自图像获取24比特像素值，并将它们转化为红、绿和蓝(RGB)的值。通过将作为向量的RGB值相加然后得到向量长度而计算强度值(Int)：

Int = \sqrt{r^{2} + g^{2} + b^{2}}

根据下式计算变体的洗涤性能(P)：

P＝Int(v)-Int(r)

其中

其中Int(v)为用酶变体洗涤的织物表面的光强度值，且Int(r)为用参照酶BLC洗涤的织物表面的光强度值。

根据如下定义，给出性能分值作为小型洗涤的结果：

性能分值(S)将受试酶变体的性能(P)概括为：

S＝2表明在所有三个浓度(5、10和30nM)下变体表现出优于参照物，和

S＝1表明在一个或两个浓度下变体表现出优于参照物。

如果在至少一种洗涤剂组合物中表现出优于参照物，则认为变体显示改良的洗涤性能。

小型洗涤试验

在下列条件下进行毫升级洗涤性能试验：

洗涤后将织物片用自来水冲洗并风干，使用Zeiss MCS 521VIS分光光度计在460nm处测量受试材料的好转。根据生产商的方案进行测量。

根据如下定义，给出性能分值作为小型洗涤的结果：

性能分值(S)将受试酶变体的性能(P)概括为：

S＝1表明在一个或两个浓度下变体表现出优于参照物。

性能分值高于1表明较好的洗涤性能。

如实施例2所示构建了下列RP-II变体，以根据实施例3进行纯化，并根据上述方法进行测试：

离子结合修饰：

D7E；D7Q；H144R；D161R；D161K；

H144Q+D161R

活动性修饰：

G30A；G91A

Cys桥形成：

S145C+T128C

表面电荷修饰：

D7N，S，T；Y17R，K，H；Y95R，K，H；T109R，K，H；Q143R，K，H；Q174R，K，H；E209Q，N；N216R，K，H

脯氨酸稳定性：

T60P；S221P；G193P；V194P

实施例5：

修饰酶的贮藏稳定性

通过在规律的时间间隔内测量亲本和变体的“残余活性”，确定本发明变体的贮藏稳定性。贮藏稳定性通常表达为半衰期T_1/2，活性为最初值一半时所流逝的时间。

残余活性＝(在t＝i时的活性)/((在t＝0时的活性)×100)％

蛋白水解活性根据上述方法(PNA试验)测量。

实施例6：

修饰酶的热稳定性

本发明蛋白酶变体的热稳定性通过差示扫描量热法(DSC)测定，加热速率在含大约2mg/ml变体的溶液中一般为每分钟0.5℃。

实施例7：

修饰酶的自我水解稳定性

对比发酵实验

在发酵实验中将本发明的RP-II变体与亲本RP-II蛋白酶进行比较。

将变体和亲本都克隆到pNM1008表达载体背景中并在适当的培养基中进行发酵。

发酵5天后，将1.5ml发酵培养基进行离心，根据上述方法使用上清液测量蛋白水解活性(KPNU)。

认为与亲本的活性相比蛋白水解活性增加的变体具有相对于亲本的改良的自我水解稳定性。

实施例8：

修饰酶的氧化稳定性

将变体在0.01M过乙酸中于50℃pH 7处理20分钟后，测试变体的氧化稳定性。使用亲本蛋白酶作为参照。

结果表示为热处理标本相对于未用氧化剂或热处理的标本的残余蛋白水解活性。

附录1

Claims

1.RP-II蛋白酶变体，其包含与离子结合位点相距10

或更小，优选地6

或更小距离位置上的氨基酸残基的至少一种修饰。

2.权利要求1的变体，其中在至少一个如下的位置上进行修饰：1、2、3、4、5、6、7、8、143、144、145、146、158、159、160、161、162、194、199、200和201，优选地在位置2、3、4、5、6、7、144、159、160和161上进行修饰，尤其是BLC(SEQ ID NO：2)中D7E和D7Q的修饰，其中的位置是指BLC或对应的位置。

3.权利要求1或2的变体，其中的修饰包括用中性或带负电荷的残基取代带正电荷的氨基酸残基，或者用带负电荷的残基取代中性残基，或者缺失带正电荷的或中性残基。

4.权利要求1的变体，其中通过至少一个与BLC位置144和/或161相对应的位置上的修饰除去离子结合位点，尤其是BLC(SEQ ID NO：2)中H144R和/或D161R，K+H144Q，N的修饰。

5.RP-II蛋白酶变体，其包含高度活动区域中氨基酸残基的至少一种修饰，所述区域处于至少一个与BLC的如下位置相对应的位置中：26-31(26、27、28、29、30和31)、89-91(89、90和91)、216-221(216、217、218、219、220和221)。

6.权利要求5的变体，其中亲本是BLC，而修饰包括G30A和/或G91A。

7.RP-II蛋白酶变体，其包含在活动区域中进行的至少一种修饰，所述区域处于至少一个与BLC的如下位置相对应的位置中：51-56(51、52、53、54、55、56)、88-94(88、89、90、91、92、93、94)、118-122(118、119、120、121、122)和173-183(173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183)，优选地在区域51-56和118-122中。

8.RP-II蛋白酶变体，具有至少一个通过将BLC位置128和145或对应位置上的氨基酸残基修饰为Cys所提供的二硫桥，优选地是BLC或对应位置上的S 145C和T128C取代。

9.RP-II蛋白酶变体，与亲本RP-II蛋白酶相比具有修饰的表面电荷分布，其包含至少一个与BLC的如下位置相对应位置上的修饰：7、17、95、109、143、174、209、216，尤其是BLC(SEQ ID NO.1)如下的修饰：

D7N，S，T

Y17R，K，H

Y95R，K，H

T109R，K，H

Q143R，K，H

Q174R，K，H

E209Q，N

N216R，K，H。

10.RP-II蛋白酶变体，与亲本RP-II蛋白酶相比显示改良的稳定性，其包含至少一个与BLC的位置18、115、185、269和293相对应位置上的Pro取代，尤其是BLC(SEQ ID NO.1)如下取代中的一个或多个：T60P、S221P、G193P、V194P。

11.RP-II蛋白酶变体，其包含与活性位点残基相距小于10

12.权利要求1至11中任一项的RP-II蛋白酶变体，进一步包含如下修饰中的至少一种：(i)形成Asn-Gly序列部分的位置上的氨基酸残基通过缺失或取代，优选地用Asp、Gln、Ser、Pro、Thr或Tyr取代所进行的修饰；(ii)Trp占据的位置上的氨基酸残基用Phe、Thr、Gln或Gly取代所进行的修饰；(iii)Glu或Asp占据的位置上的氨基酸残基用Ala取代所进行的修饰；(iv)Glu或Asp残基占据的位置之后第一位或第二位上的氨基酸残基用Pro取代所进行的修饰；或者(v)Met占据的位置上的氨基酸残基通过缺失或取代，优选地用Ser或Ala取代所进行的修饰。

13.权利要求1至12中任一项的RP-II蛋白酶变体，其在许多位置上被修饰，范围从至少1个和多达50个位置，或者从1到45个位置，或者从1到40个位置，或者从1到35个位置，或者从1到30个位置，或者从1到25个位置，或者从1到20个位置，或者从1到15个位置，或者从1到14个位置，或者从1到13个位置，或者从1到12个位置，或者从1到11个位置，或者从1到10个位置，或者从1到9个位置，或者从1到8个位置，或者从1到7个位置，或者从1到6个位置，或者从1到5个位置，或者从1到4个位置，或者从1到3个位置，或者从1到2个位置，这些修饰包括在所示数目位置上的取代、缺失、***以及它们的组合。

14.分离的多核苷酸，包含编码前述权利要求中任一项所定义或生产的RP-II蛋白酶变体的核酸序列。

15.权利要求14的多核苷酸，其中核酸序列与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13或SEQ ID NO：15所示的核酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的同源性。

16.分离的核酸构建体，其包含如权利要求14-15中任一项所定义的核酸序列，有效地连接于一个或多个能够指导多肽在适宜的表达宿主中表达的控制序列。

17.包含权利要求16的核酸构建体的重组宿主细胞。

18.一种生产如权利要求1至13中任一项所定义或生产的RP-II变体的方法，该方法包括：

a)在益于生产RP-II蛋白酶变体的条件下培养权利要求17的重组宿主细胞；和

b)回收变体。

19.洗涤制剂组合物，其包含权利要求1至13中任一项所定义或生产的RP-II蛋白酶变体。

20.权利要求1至13中任一项所定义或生产的RP-II蛋白酶变体在洗涤或清洁目的中的用途。

21.权利要求1至13中任一项所定义或生产的RP-II蛋白酶变体在加工食品中的用途。

22.权利要求1至13中任一项所定义或生产的RP-II蛋白酶变体在加工饲料中的用途。

23.权利要求1至13中任一项所定义或生产的RP-II蛋白酶变体在处理兽皮中的用途。