JP5503968B2 - 成熟インスリンポリペプチドの作製方法 - Google Patents
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Description
自然には分泌顆粒を形成できない遺伝子操作動物細胞において成熟インスリンを作製する方法が米国特許第6348327号に開示されている。
一実施態様では、B鎖のC末端伸長は、2−4のアミノ酸残基長である。
一実施態様では、B鎖のC末端伸長は、2−3のアミノ酸残基長である。
一実施態様では、B鎖のC末端伸長は、2のアミノ酸残基からなる。
一実施態様では、B鎖のC末端伸長におけるアミノ酸残基は、Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp、Val、Met及びAlaからなる群から選択される同一又は異なっている疎水性アミノ酸残基である。
他の実施態様では、B鎖のC末端伸長におけるアミノ酸残基は、Phe、Leu、Ile、Val及びAlaからなる群から選択される疎水性アミノ酸残基である。
他の実施態様では、N末端から数えて、B鎖のC末端伸長における第1のアミノ酸残基はLeuである。
一実施態様では、B鎖のC末端伸長は、続いて、真菌細胞又は培養培地のいずれかにおいて、カルボキシペプチダーゼ活性により切断可能である。
さらなる実施態様では、B鎖のC末端伸長は、カルボキシペプチダーゼにより切断されて、成熟したヒトインスリン又はそのアナログが生じる。
CPYが内在性CPYであるならば、CPYをコードする内在性遺伝子は過剰発現され、培養培地に分泌される。
さらなる実施態様では、2つのKex2部位は、1から約35のアミノ酸残基を有するペプチド鎖により結合している。
他の実施態様では、Kex2部位は、1から10のアミノ酸残基を有するペプチド鎖により結合している。
他の実施態様では、Kex2部位は、1から5のアミノ酸残基を有するペプチド鎖により結合している。
他の実施態様では、Kex2部位は、2−10、2−8、2−7、2−6、2−5又は2−4のアミノ酸残基を有するペプチド鎖により結合している。
他の実施態様では、Kex2部位は、3−5のアミノ酸残基を有するペプチド鎖により結合している。
他の実施態様では、Cペプチドは、A鎖のN末端アミノ酸残基に結合する単一のKex2切断部位を有する。
他の実施態様では、Cペプチドは、単一のKex2切断部位と、A鎖のN末端アミノ酸残基とKex2部位との間に挿入されるアミノペプチダーゼ切断部位を有する。
B-X1-X2-Z-X3-X4-A
[上式中、Bは、インスリン又はそのアナログのB鎖であり、Aはヒトインスリン又はそのアナログのA鎖であり、X1は同一でも異なっていてもよく、真菌細胞内でのより効果的なKex2切断を促進する1−5のアミノ酸残基のペプチド配列であり、X2はKex2切断部位であり、Zは、1〜約35のアミノ酸残基を有するペプチド配列又はペプチド結合であり、X3はKex2切断部位又はペプチド結合であり、X4はアミノペプチダーゼ切断部位又はペプチド結合であり、但しX3及びX4が双方ともペプチド結合である場合、X1におけるN末端から第1のアミノ酸残基はMet残基ではない]
を有する。
他の実施態様では、X1は2−4のアミノ酸残基長である。
他の実施態様では、X1は2−3のアミノ酸残基長である。
他の実施態様では、X1は2のアミノ酸残基からなる。
他の実施態様では、X1におけるアミノ酸残基は、Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp、Val、Met、Ala、Asp及びGlyからなる群から選択される。
本発明の他の実施態様では、X1はPhe-Leuである。
本発明の他の実施態様では、X1はLeu-Glyである。
本発明の他の実施態様では、X1はLeu-Leuである。
本発明の他の実施態様では、X1はLeu-Metである。
本発明の他の実施態様では、X1はLeu-Ileである。
本発明のさらなる実施態様では、X3はKex2切断部位であり、X4はペプチド結合であり、Zは同一でも異なっていてもよく、2−10のアミノ酸残基のペプチド鎖である。
本発明のさらなる実施態様では、X3はKex2切断部位であり、X4はペプチド結合であり、Zは同一でも異なっていてもよく、2−8のアミノ酸残基のペプチド鎖である。
本発明のさらなる実施態様では、X3はKex2切断部位であり、X4はペプチド結合であり、Zは同一でも異なっていてもよく、3−5のアミノ酸残基のペプチド鎖である。
本発明のさらなる実施態様では、X1は同一でも異なっていてもよく、Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp、Val、Met及びAlaからなる群から選択される2-5のアミノ酸残基を含み、X3はKex2切断部位であり、X4はペプチド結合であり、Zは配列D-X5-DLG(配列番号4)を有し、ここでX5はA、R、N、D、N、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y及びVからなる群から選択される。
本発明のさらなる実施態様では、X1は同一でも異なっていてもよく、Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp、Val、Met及びAlaからなる群から選択される2-5のアミノ酸残基を含み、X3はKex2切断部位であり、X4はペプチド結合であり、Zは配列DDX6LG(配列番号24)を有し、ここでX6はA、R、N、D、N、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y及びVからなる群から選択される。
本発明のさらなる実施態様では、X1は同一でも異なっていてもよく、Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp、Val、Met及びAlaからなる群から選択される2のアミノ酸残基からなり、X3はKex2切断部位であり、X4はペプチド結合であり、Zは配列D-X5-DLG(配列番号4)を有し、ここでX5はA、R、N、D、N、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y及びVからなる群から選択される。
本発明のさらなる実施態様では、X1は同一でも異なっていてもよく、Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp、Val、Met及びAlaからなる群から選択される2のアミノ酸残基からなり、X3はKex2切断部位であり、X4はペプチド結合であり、Zは配列DDX6LG(配列番号24)を有し、ここでX6はA、R、N、D、N、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y及びVからなる群から選択される。
一実施態様では、Zは、1−35、1−34、1−33、1−31、1−30、1−29、1−28、1−27、1−26、1−25、1−24、1−23、1−22、1−21、1−20、1−19、1−18、1−17、1−16、1−15、1−14、1−13、1−12、1−11、1−10、1−9、1−8、1−7、1−6、1−5、1−4、1−3又は1−2のアミノ酸残基のサイズのものである。
さらなる実施態様では、Zは、2−35、2−34、2−33、2−31、2−30、2−29、2−28、2−27、2−26、2−25、2−24、2−23、2−22、2−21、2−20、2−19、2−18、2−17、2−16、2−15、2−14、2−13、2−12、2−11、2−10、2−9、2−8、2−7、2−6、2−5、2−4又は2−3のアミノ酸残基のサイズのものである。
さらなる実施態様では、Zは、4−35、4−34、4−33、4−31、4−30、4−29、4−28、4−27、4−26、4−25、4−24、4−23、4−22、4−21、4−20、4−19、4−18、4−17、4−16、4−15、4−14、4−13、4−12、4−11、4−10、4−9、4−8、4−7、4−6及び4−5のアミノ酸残基のサイズのものであってよい。
他の実施態様では、Zは1〜5のアミノ酸残基のサイズである。
他の実施態様では、Zは2−10、2−8、2−7、2−6、2−5又は2−4のアミノ酸残基のサイズである。
他の実施態様では、Zは3−5のアミノ酸残基のサイズである。
一実施態様では、切断部位X3に対し最後から2番目の位置にあるZのアミノ酸残基はLeuである。
一実施態様では、切断部位X3に対し最後から2番目の位置にあるZのアミノ酸残基はIleである。
一実施態様では、切断部位X3に対し最後から2番目の位置にあるZのアミノ酸残基はTyrである。
一実施態様では、切断部位X3に対し最後から2番目の位置にあるZのアミノ酸残基はArgである。
一実施態様では、切断部位X3に対し最後から2番目の位置にあるZのアミノ酸残基はHisである。
一実施態様では、切断部位X3に対し最後から2番目の位置にあるZのアミノ酸残基はProである。
一実施態様では、切断部位X3に対し最後から2番目の位置にあるZのアミノ酸残基はPheである。
一実施態様では、切断部位X3に対し最後から2番目の位置にあるZのアミノ酸残基はMetである。
一実施態様では、切断部位X3に対し最後から2番目の位置にあるZのアミノ酸残基はValである。
他の実施態様では、Zは配列DLGを有する。
他の実施態様では、Zは配列D-X5-DLG(配列番号4)を有し、ここでX5はA、R、N、D、N、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y及びVからなる群から選択される。
さらなる実施態様では、X5はA、R、N、D、Q、H、I、L、P、S、T及びYからなる群から選択される。
一実施態様では、Zは配列DADLG(配列番号5)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DRDLG(配列番号6)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DNDLG(配列番号7)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DQDLG(配列番号9)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DEDLG(配列番号10)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DGDLG(配列番号11)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DHDLG(配列番号12)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DIDLG(配列番号13)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DLDLG(配列番号14)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DMDLG(配列番号16)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DFDLG(配列番号17)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DPDLG(配列番号18)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DSDLG(配列番号19)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DTDLG(配列番号20)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DWDLG(配列番号21)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DYDLG(配列番号22)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DVDLG(配列番号23)を有する。
他の実施態様では、X6はR、N、D、N、E、H、K及びSからなる群から選択される。
他の実施態様では、Zは配列DDRLG(配列番号26)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DDNLG(配列番号27)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DDQLG(配列番号29)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DDELG(配列番号30)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DDGLG(配列番号31)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DDHLG(配列番号32)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DDILG(配列番号33)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DDLLG(配列番号34)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DDMLG(配列番号36)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DDFLG(配列番号37)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DDPLG(配列番号38)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DDSLG(配列番号39)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DDTLG(配列番号40)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DDWLG(配列番号41)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DDYLG(配列番号42)を有する。
他の実施態様では、Zは配列DDVLG(配列番号43)を有する。
ここで使用される「インスリンアナログ」とは、天然インスリン中に生じる少なくとも一つのアミノ酸残基を欠失させ、及び/又は置換することにより、及び/又は少なくとも一つのアミノ酸残基を付加することによって、天然に生じるインスリン、例えばヒトインスリンの構造から形式的には誘導することができる分子構造を有し、インスリン活性を伴うポリペプチドを意味する。付加された及び/又は置換されたアミノ酸残基は、コード可能なアミノ酸残基又は他の天然に生じるアミノ酸残基又は純粋に合成のアミノ酸残基の何れかでありうる。
インスリンアナログは、ヒトインスリンと比較して、典型的には約7を越える変異、より典型的には5を越える変異、最も典型的には3を越える変異を含まない。
また、A21位のAsnは、Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr又はVal、特にGly、Ala、Ser、又はThr、特にGlyに修飾されてもよい。さらに、B3位のAsnは、Lys又はAspに修飾されてもよい。インスリンアナログのさらなる具体例は、des(B30)ヒトインスリン、B1及びB2の一方又は双方が欠失したインスリンアナログ;A鎖及び/又はB鎖がN末端伸長を有するインスリンアナログ、及びA鎖及び/又はB鎖がC末端伸長を有するインスリンアナログである。またA18位にある天然アミノ酸残基はGln残基に変化していてもよく、またB26−B30位又はB27−30位にある一又は複数のアミノ酸残基は欠失している。
インスリンアナログのさらなる具体例は、A21、B10、A8、A14、B25、B27及びB1の一又は複数の位置に変異を含むヒトインスリンアナログである。
また標的インスリン分子は、B鎖のC末端伸長が後続する切断工程で切断されないインスリン分子であってもよい。
このようなインスリンアナログは構造B-X1……Aを有し、ここでB、A及びX1は上述した意味を有し、B及びA鎖はヒトインスリンと同様、2つのジスルフィド架橋により結合している。
よって、本発明の一実施態様では、真菌細胞は酵母細胞であり、さらなる実施態様では、酵母細胞はSaccharomyces cerevisiaeである。
C末端伸長を有するインスリンアナログの非限定的な例は、B31Leu、B32Alaヒトインスリン;B31Leu、B32Ala、desB30ヒトインスリン、B31Phe、B32Leuヒトインスリン、及びB31Phe、B32Leu、desB30ヒトインスリンである。
さらなる態様では、本発明は、適切な製薬的に許容可能なアジュバント及び添加剤、例えば安定化、保存(防腐)又は等張性に関して適切な一又は複数の薬剤と組合せて、ヒトインスリンアナログを含有する製薬用製剤に関する。
1)細胞から分泌されているC末端が伸長した2本鎖産物B-(X)n……Aをプロセシングするために、発酵ブロスにCPYを直接添加することによる;
2)分泌経路を介して向かっている内在性CPYによってC末端伸長した2本鎖産物B-(X)n……Aをプロセシングすることによる、又は
3)CPYをコードする遺伝子PRC1の過剰発現、もしくは培養培地へのCPYの誤った局在化に至らしめる変異により、CPYで2本鎖生成物B-(X)n……Aをプロセシングすることによる。
図3において、インスリン前駆体コンストラクトは、連結ペプチド内に、配列XXにより例証される、B鎖のC末端伸長、KR、及び一つのKex2を有する。第1の切断は、Kex2によるKex2部位の切断であり、単鎖構造を、B鎖に結合し、配列XXKRを有する2本鎖構造に開裂させる。ついで、酵素Kex1はKR配列を切断し、最終的にカルボキシペプチダーゼはB鎖のXX伸長部を切断して、成熟した2本鎖インスリン生成物が付与されるであろう。
Kex2及びKex1切断の双方は、真菌細胞内で生じるが、上で説明したように、カルボキシペプチダーゼによる切断は真菌細胞又は培養培地のいずれかで生じうることに留意すべきである。さらに、カルボキシペプチダーゼは内在性酵素であってもよいし、培養培地に添加されてもよい。同じことが、図4に示されるアミノペプチダーゼ切断にも当てはまる。
カルボキシペプチダーゼは、任意の適切な天然のカルボキシペプチダーゼ、例えばCPY、又はその突然変異体であってよい。
よって一実施態様では、B鎖のC末端伸長は、真菌細胞内で切断され、他の実施態様では、培養培地において切断され、成熟したヒトインスリン又はそのアナログが形成される。
天然のCペプチドのサイズは35アミノ酸残基である。よって、本発明の一態様では、2つのKex2部位の間にあるペプチド配列は、天然Cペプチドとほぼ同じ長さのものであろう。
A鎖に結合したKex2部位の切断は、2つのKex2部位の間に挿入されるペプチド配列が、A鎖に隣接するKex2部位に対して最後から2番目の位置に、Leu、Ile、Tyr、Arg、Lys、His、Pro、Phe、Met又はValアミノ酸残基を有するならば高められうる。また我々は、同位置のアミノ酸残基がAsp、Glu、Gly又はAlaではないことを見出した。
商業的規模で使用されるクロマトグラフィー用カラム材料は、非常に高価であり、よって、このようなクロマトグラフィー工程の数を減らすことは、生産経済において、顕著な影響を持っている。また下流の転換及び精製工程を減らすと、労働者の仕事量及びプロセスに費やされる時間がさらに減少し、よって生産経済がさらに改善される。
酵母における効果的な分泌のために、リーダーペプチドをコードする配列を、シグナル配列の下流とインスリン前駆体をコードするDNA配列の上流に挿入してもよい。
B(1-30)はヒトインスリンの天然B鎖を意味し、「A(1-21)」は天然インスリンA鎖を意味する。
A18Qヒトインスリンは、ヒトインスリンA鎖のA18位にGlnを有するインスリンアナログである。B10E、A8H、A14Eは、それぞれB10位にGlu、A8位にHis、及びA14位にGluを有するインスリンアナログである。
「B1」、「A1」等とは、それぞれインスリンのB鎖の1位(N末端から数える)のアミノ酸残基及びインスリンのA鎖の1位(N末端から数える)のアミノ酸残基を意味する。特定の位置にあるアミノ酸残基は、例えばB1位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であることを意味するPheB1として表すことができる。
「成熟したインスリン」とは、正しいアミノ酸残基組成と、天然のヒトインスリン分子と同じ立体構造、すなわちCysA7とCysB7との間、及びCysA20とCysB19との間のジスルフィド架橋、及びCysA6とCysA11との間の内部ジスルフィド架橋、及びインスリン活性を有する2本鎖インスリンを意味する。よって、本発明の成熟したインスリンはヒトインスリンである。成熟したヒトインスリンのアナログは、先に説明したように、インスリン分子に一又は複数の変異を有するであろう。よって、成熟したインスリンアナログは、B28Aspヒトインスリン、desB30ヒトインスリン、A14Glu、B25Hisヒトインスリン、及びB31Leu、B32Alaヒトインスリンであってもよい。
ここで使用される「インスリン誘導体」なる用語は、例えばインスリン骨格の一又は複数の位置に側鎖が導入されることにより、もしくはインスリンのアミノ酸残基の基を酸化又は還元することにより、もしくは遊離のアミノ基又はヒドロキシ基をアシル化することにより、化学的に修飾された天然に生じるインスリン又はインスリンアナログを意味する。
「Kex1」又は「Kex1p」とは、C末端のリジル及び/又はアルギニル残基の除去を優先的に触媒するセリンカルボキシペプチダーゼを意味する(Shilton BH, Thomas DY, Cygler M 1997 Crystal structure of Kex1deltap, a prohormone-processing carboxypeptidase from Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry 36: 9002-9012)。
CPYとは、疎水性又は大きなC末端アミノ酸残基、例えばPhe及びLeuの除去を優先的に触媒するカルボキシペプチダーゼYを意味する(Remington, S.J. & Breddam, K. (1994) Carboxypeptidases C and D. Methods Enzymol. 244、231-248)。
「効果的な切断」とは、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、さらに好ましくは少なくとも95%の切断を意味することを意図している。
「POT」は、Schizosaccharomyces pombeトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子であり、「TP11」はS. cerevisiaeトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子である。
「リーダー」は、プレペプチド(シグナルペプチド)及びプロペプチドからなるアミノ酸配列を意味する。
糸状菌宿主細胞についての有効なシグナルペプチドコード領域は、Aspergillus oryzaeのTAKAアミラーゼ遺伝子、Aspergillus nigerの中性アミラーゼ遺伝子、Rhizomucor mieheiのアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、Humicola lanuginosaのセルラーゼ又はリパーゼ遺伝子、又はRhizomucor mieheiのリパーゼ又はプロテアーゼ遺伝子、Aspergillus種のアミラーゼ又はグルコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiのリパーゼ又はプロテアーゼをコードする遺伝子から得られたシグナルペプチドコード領域である。シグナルペプチドは、好ましくはA. oryzaeのTAKAアミラーゼ、A. nigerの中性a-アミラーゼ、 A. nigerの酸安定性アミラーゼ、又はA. nigerのグルコアミラーゼをコードする遺伝子から誘導される。
一実施態様では、組換え発現ベクターは酵母中で複製可能である。ベクターを酵母中で複製させることができる配列の例は、酵母プラスミド2μm複製遺伝子REP1-3及び複製起点である。
糸状菌宿主細胞における使用される選択可能マーカーには、amdS(アセタミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、pyrG(オロチジン-5'-ホスファートデカルボキシラーゼ)及びtrpC(アントラニル酸シンターゼ)が含まれる。
酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、及びURA3である。酵母にとって好ましい選択可能なマーカーはSchizosaccharomyces pompeTPI遺伝子(Russell (1985) Gene 40:125-130)である。
糸状菌宿主細胞において転写を行わしめるのに適切なプロモーターの例は、Aspergillus oryzaeのTAKAアミラーゼ、Rhizomucor mieheiのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Aspergillus nigerの中性アルファ-アミラーゼ、及びAspergillus nigerの酸安定性アルファ-アミラーゼから得られるプロモーターである。
酵母宿主では、有用なプロモーターは、Saccharomyces cerevisiaeMa1、TPI、ADH又はPGKプロモーターである。
本発明のポリヌクレオチドコンストラクトは典型的には適切なターミネーターに作用可能に結合しているであろう。酵母において、適切なターミネーターはTPIターミネーター(Alberら(1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434)である。
ベクターは、まず本発明のインスリン前駆体をコードする全DNA配列を含有するDNAコンストラクトを調製し、続いて適切な発現ベクターにこの断片を挿入するか、又は個々のエレメント(例えば、シグナル、プロペプチド、修飾されたCペプチド、A鎖及びB鎖)についての遺伝的情報を含むDNA断片を挿入し、続いてライゲーションすることにより構築されうることが理解されるであろう。
本文脈において、アミノ酸の3文字又は1文字標記を、次に示すようにその一般的な意味で使用した。明示的に示さない限り、ここに述べるアミノ酸はLアミノ酸である。さらに、ペプチドのアミノ酸配列の左及び右端は、特に記載しない限り、それぞれN末端及びC末端である。
製薬用組成物は、通常のアジュバント、例えば安定化、保存又は等張に適した一又は複数種の薬剤、例えば亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール又はマンニトールを含む。
全ての発現プラスミドは、欧州特許第171142号に記載されているものと類似するC-POTタイプのものである。これらは、S. cerevisiaeにおけるプラスミドの選択及び安定化の目的のために、Schizosaccharomyces pombeトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子(POT)を含むことにより特徴付けられる2μベースの発現ベクターである。また、該プラスミドは、S. cerevisiaeトリオースリン酸イソメラーゼプロモーター及びターミネーター(図1)を含む。これらの配列は、1)リーダー及びインスリン産物の融合タンパク質をコードするEcoRI-Xbal断片の配列、及び2)発現ベクターの2μ領域におけるNcoI部位の除去を生じるサイレント変異が導入された点を除き、全ての配列が、プラスミドpKFN1003(国際公開第9010075号に記載)における対応配列に類似している。異なった融合タンパク質のクローニングを容易にするために、MFα1プレプロリーダーをコードするDNA配列が改変されてNcoI部位が導入され(図2を参照)、MFα1*プレプロリーダーと呼ばれる。このようにNcoI-Xbal断片は、関心あるインスリンコンストラクトをコードするNcoI-Xbal断片によって単に置き換えられる。このようなNcoI-Xbal断片は、標準的な技術に従い、合成オリゴヌクレオチド及びPCRを使用して合成されうる。アルファ-リーダーに加えて、他のリーダーを使用することもできる。
インスリン前駆体A14E、B25H、B(1-30)-LARRDLGKR(配列番号45)-A(1-21)のための酵母発現系の構築
図1には、pESI42-33と呼ばれる酵母プラスミドが示されている。該プラスミドは、S. cerevisiaeTPI遺伝子の転写プロモーターと転写ターミネーターとの間のプラスミドに挿入されたEcoRI-XbaI断片を含む発現カセットを含んでいる。プラスミドpESI42-33において、EcoRI-XbaI断片は、MFα1*プレプロリーダー、二塩基プロセシングエンドペプチダーゼKex2に対するLys-Arg切断部位、及びインスリン前駆体A14E、B25H、B(1-30)-LARRDLGKR(配列番号45)-A(1-21)からなる融合産物をコードしている。
発酵ブロスへのCPYの直接添加によるインスリン前駆体のプロセシング
A14E、B25H、B(1-30)-LARRDLGKR(配列番号45)-A(1-21)の発現についてプラスミドを用いて形質転換されたS. Cerevisiae菌株MT663を、5g/Lの(NH4)2SO4、184mg/Lの(NH4)2HPO4、2.88g/LのKH2PO4、1.42g/LのMgSO4・H2O、1.28g/LのK2SO4、10.00g/Lのコハク酸、10.00g/Lのカザミノ酸、0.0112g/LのFeSO4・7H2O、0.0086g/LのMnSO4 .H2O、0.0014g/LのCuSO4・5H2O、0.00185g/LのZnSO4・7H2O、0.0129g/LのCaCl2・2H2O、0.071g/Lのクエン酸、28.0mg/Lのm-イノシトール、14.0mg/Lの塩化コリン、2.8mg/Lのチアミン、2.8mg/Lのナイアシンアミド、2.1mg/LのCa-パントテン酸、0.14mg/Lのビオチン、0.14mg/Lの葉酸、40g/Lのグルコースからなる5mlの培地に播種した。30℃で3日間培養した。発酵ブロスのLC-MS分析により、分泌された全インスリン種の〜50%が、十分にプロセシングされたことが示唆された(Mw=5763)。残った〜50%は、LAで伸長したB鎖のC末端を有するインスリン(Mw=5947)であった。LA伸長のタンパク質分解的除去について、100μlの発酵ブロスを、S.cerevisiae(〜0.1単位)から精製された0.8μlのCPYに添加し、LC-MS分析の前に、30℃で5分、インキュベートした。このことにより、LA伸長が完全に除去されたことが示された。
実施例1に記載されたようにしてさらなるインスリンアナログを調製した。発現収率を、欧州特許第163529号に開示されたインスリン前駆体:B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)(MT748)の発現収率と比較した。さらに、Kex2により十分にプロセシングされた割合を測定し、B鎖のC末端伸長を有していないインスリンと比較した。全てのインスリンアナログはA14E及びB25H変異を有している。
結果を以下の表に表す。
発酵ブロスへのCPY及びDAP1の直接添加による単一Kex2部位でのインスリン前駆体のプロセシング
A14E、B25H、B(1-30)-LGRREAEA(配列番号47)-A(1-21)の発現についてプラスミドを用いて形質転換されたS. cerevisiae菌株MT663を、実施例2に記載されたようにして、5mlの培地に播種した。
30℃で3日間培養した。発酵ブロスのLC-MS分析により、分泌された全インスリン種の〜50%が、Kex1及びKex2によりプロセシングされ、LGで伸長したB鎖のC末端、及びEAEAで伸長したA鎖のN末端を有する形態(Mw=6333)に至ることが示唆された。残った〜50%はプロセシングされていない前駆体(Mw=6628)であった。
LG伸長のタンパク質分解的除去について、100μlの発酵ブロスを、S.cerevisiae(〜0.2単位)から精製された1.6μlのCPYに添加した。EAEA(配列番号3)を除去するために、ニワトリの肝臓から精製された5μl(〜0.1単位)のDAP1(カテプシンC、EC3.4.14.1)を添加した。LC-MS分析の前に、混合物を30℃で200分インキュベートした。このことにより、LG伸長が完全に除去され、〜75%のEAEA(配列番号3)伸長が除去され、成熟したインスリンアナログA14E、B25H-LGRREAEA(配列番号47)-(A1-21)(Mw=5763)が得られたことが示された。
実施例1に記載されたようにしてさらなるインスリンアナログを調製した。発現収率を、上述したインスリン前駆体MT748の発現収率と比較した。全てのインスリンアナログはA14E、B25H変異を有する。
結果を以下の表に表す。
Claims (8)
- 配列
B-X 1 -X 2 -Z-X 3 -X 4 -A
(上式中、Bは、ヒトインスリン又はそのアナログのB鎖であり、Aはヒトインスリン又はそのアナログのA鎖であり、X 1 は同一でも異なっていてもよく、Phe、Leu、Ile、Val及びAlaからなる群から選択され、真菌細胞内でのより効果的なKex2切断を促進する2つのアミノ酸残基のペプチド配列であり、X 2 はKex2切断部位であり、Zは1から35のアミノ酸残基のペプチド配列又はペプチド結合であり、X 3 はKex2切断部位であり、X 4 はペプチド結合である)のヒトインスリン又はヒトインスリンアナログの前駆体をコードするDNA配列を含む真菌細胞を培養することにより、成熟したヒトインスリン又はそのアナログを作製する方法であって、
ヒトインスリンの前記アナログは、天然インスリン中の少なくとも一つのアミノ酸残基を欠失及び/又は置換し、及び/又は天然インスリンに少なくとも一つのアミノ酸残基を付加することによって得られる方法。 - X 1 のN末端アミノ酸残基がLeuである請求項1に記載の方法。
- Zが、同一でも異なっていてもよい1から5のアミノ酸残基を有する請求項1に記載の方法。
- Zが、同一でも異なっていてもよい3−5のアミノ酸残基を有する請求項1に記載の方法。
- X 1 がカルボキシペプチダーゼによりB鎖から続いて切断されて、成熟したヒトインスリン又はそのアナログを生じる請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- カルボキシペプチダーゼが培養培地に添加される請求項5に記載の方法。
- 真菌細胞が酵母細胞である請求項1から6の何れか一項に記載の方法。
- 配列
B-X1-X2-Z-X3-X4-A
(上式中、Bは、ヒトインスリン又はそのアナログのB鎖であり、Aはヒトインスリン又はそのアナログのA鎖であり、X1は同一でも異なっていてもよく、Phe、Leu、Ile、Val及びAlaからなる群から選択され、真菌細胞内でのより効果的なKex2切断を促進する2つのアミノ酸残基のペプチド配列であり、X2はKex2切断部位であり、Zは1から35のアミノ酸残基のペプチド配列又はペプチド結合であり、X3はKex2切断部位であり、X4 はペプチド結合である)を有するヒトインスリン又はヒトインスリンアナログの前駆体であって、
ここで、ヒトインスリンの前記アナログは、天然インスリン中の少なくとも一つのアミノ酸残基を欠失及び/又は置換し、及び/又は天然インスリンに少なくとも一つのアミノ酸残基を付加することによって得られる、前駆体。
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