JPH06343471A - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、そのゲノム中に1 以下の機能的CU
P1遺伝子を含み且つそのポリペプチドをコードしている
遺伝子及び機能的CUP1遺伝子を含んで成るプラスミドを
担持する遺伝子操作された酵母細胞の助けを借りたポリ
ペプチドの製造方法を提供することを目的とする。 【構成】 本発明は、上記方法、上記酵母細胞及び上記
プラスミドに関する。
P1遺伝子を含み且つそのポリペプチドをコードしている
遺伝子及び機能的CUP1遺伝子を含んで成るプラスミドを
担持する遺伝子操作された酵母細胞の助けを借りたポリ
ペプチドの製造方法を提供することを目的とする。 【構成】 本発明は、上記方法、上記酵母細胞及び上記
プラスミドに関する。
Description
【０００１】ポリペプチドの製造方法 本発明は、組み換えDNA 技術の分野に属し、そして、上
記のポリペプチドのための遺伝子を含んで成るハイブリ
ッドベクターを担持する遺伝子操作された酵母細胞の援
助を伴うポリペプチドの製造方法、このハイブリッドベ
クター及び酵母細胞、並びに、このベクター及びこの酵
母細胞の製造方法に関する。
記のポリペプチドのための遺伝子を含んで成るハイブリ
ッドベクターを担持する遺伝子操作された酵母細胞の援
助を伴うポリペプチドの製造方法、このハイブリッドベ
クター及び酵母細胞、並びに、このベクター及びこの酵
母細胞の製造方法に関する。
【０００２】発明の背景 遺伝子工学においては、原核生物及び真核生物の宿主の
ための多数の発現系が既に知られているが、この既知の
系を超える利点をもつ新規系が引き続き要求されてい
る。ポリペプチドの製造のための宿主として非常に広範
に使用されるものは、酵母、例えば、サッカロミセス・
セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であり、このた
めには、様々なタイプのベクターが在る。 * 自律複製配列をもっていない組み込みベクター(ARS)
。これらのベクターは、普通には低い形質転換率をも
ち、そして普通には酵母のゲノム中に1 のコピーの組み
込みを導く。 * 染色体外複製ベクター。これは、以下のようにさらに
分類される: ・自律複製配列をもつベクター(arsベクター) 。これら
のベクターは、普通には、細胞内に多くのコピー数で存
在するが、それらは、細胞***の間にしばしば失われ
る。 ・細胞***の間に動原体(centromer) として働くDNA 配
列を含むベクター(cenベクター) 。これらのベクター
は、非常に安定であるが、細胞内に数個のコピーしか存
在しない。 ・天然の酵母プラスミドから得られたベクター、例え
ば、その2 ミクロン様プラスミドから得られたベクター
(2ミクロン・ベクター) 。このような2 ミクロン誘導プ
ラスミドは、多くのコピー数で生じるが、それらの安定
性は、異種DNA が挿入されたときには弱められる。 上記の安定性を改善し、そしてベクターのコピー数を調
節するためには、幾つかの可能性が在る。この目的を達
成するために、メタロチオネインをコードしているCUP1
遺伝子をベクターに挿入することが提案されている( 米
国特許出願第4,935,350 号;R.C.A.Henderson et al.,Cu
rrent Genetics 9(1985),133-138) 。
ための多数の発現系が既に知られているが、この既知の
系を超える利点をもつ新規系が引き続き要求されてい
る。ポリペプチドの製造のための宿主として非常に広範
に使用されるものは、酵母、例えば、サッカロミセス・
セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であり、このた
めには、様々なタイプのベクターが在る。 * 自律複製配列をもっていない組み込みベクター(ARS)
。これらのベクターは、普通には低い形質転換率をも
ち、そして普通には酵母のゲノム中に1 のコピーの組み
込みを導く。 * 染色体外複製ベクター。これは、以下のようにさらに
分類される: ・自律複製配列をもつベクター(arsベクター) 。これら
のベクターは、普通には、細胞内に多くのコピー数で存
在するが、それらは、細胞***の間にしばしば失われ
る。 ・細胞***の間に動原体(centromer) として働くDNA 配
列を含むベクター(cenベクター) 。これらのベクター
は、非常に安定であるが、細胞内に数個のコピーしか存
在しない。 ・天然の酵母プラスミドから得られたベクター、例え
ば、その2 ミクロン様プラスミドから得られたベクター
(2ミクロン・ベクター) 。このような2 ミクロン誘導プ
ラスミドは、多くのコピー数で生じるが、それらの安定
性は、異種DNA が挿入されたときには弱められる。 上記の安定性を改善し、そしてベクターのコピー数を調
節するためには、幾つかの可能性が在る。この目的を達
成するために、メタロチオネインをコードしているCUP1
遺伝子をベクターに挿入することが提案されている( 米
国特許出願第4,935,350 号;R.C.A.Henderson et al.,Cu
rrent Genetics 9(1985),133-138) 。
【０００３】メタロチオネイン(MT)は、真核生物の中に
広く分布する、小さい、システインが豊富な金属結合ポ
リペプチドである。サッカロミセス・セレビシエ(S.cer
evisiae)は、普通には、上記CUP1遺伝子によりコードさ
れている一種類のMT蛋白を含む。このCUP1座は、酵母細
胞に銅耐性を与えることが示されており、例えば、タン
デムに反復された10以上のコピーから成る。銅耐性は、
外からの銅の添加による、CUP1の増幅とCUP1の翻訳の誘
導との組合せに基づいている。このCUP1遺伝子の銅誘導
性転写を促進するために必要な、シス作用の上流の活性
化部位(UASC )、並びに細胞因子のUAS C への結合が、
同定された。この結合因子は、上記CUP1遺伝子の銅誘導
性転写のために必須であるACE1(=CUP2) の生成物であ
る。このACE1蛋白は、銅イオンに結合し、このことによ
り、そのコンフォメーションを変更し、そして、そのDN
A 結合ドメインを活性化する転写活性化物質である。上
記ACE1蛋白のコンフォメーションの変更及び上記UAS C
への結合は、上記CUP1遺伝子が転写されることを最終的
に許容する。このCUP1システムの重要な特徴は、その自
動調節である。これは、上記CUP1蛋白( メタロチオネイ
ン) それ自身が銅イオンに結合する能力に依存する。そ
れ故、このCUP1蛋白は、細胞内の遊離の銅イオンと複合
体を形成することにより、それ自身の合成を抑制するよ
うであり、これが、次に、ACE1の活性化を妨害する。
広く分布する、小さい、システインが豊富な金属結合ポ
リペプチドである。サッカロミセス・セレビシエ(S.cer
evisiae)は、普通には、上記CUP1遺伝子によりコードさ
れている一種類のMT蛋白を含む。このCUP1座は、酵母細
胞に銅耐性を与えることが示されており、例えば、タン
デムに反復された10以上のコピーから成る。銅耐性は、
外からの銅の添加による、CUP1の増幅とCUP1の翻訳の誘
導との組合せに基づいている。このCUP1遺伝子の銅誘導
性転写を促進するために必要な、シス作用の上流の活性
化部位(UASC )、並びに細胞因子のUAS C への結合が、
同定された。この結合因子は、上記CUP1遺伝子の銅誘導
性転写のために必須であるACE1(=CUP2) の生成物であ
る。このACE1蛋白は、銅イオンに結合し、このことによ
り、そのコンフォメーションを変更し、そして、そのDN
A 結合ドメインを活性化する転写活性化物質である。上
記ACE1蛋白のコンフォメーションの変更及び上記UAS C
への結合は、上記CUP1遺伝子が転写されることを最終的
に許容する。このCUP1システムの重要な特徴は、その自
動調節である。これは、上記CUP1蛋白( メタロチオネイ
ン) それ自身が銅イオンに結合する能力に依存する。そ
れ故、このCUP1蛋白は、細胞内の遊離の銅イオンと複合
体を形成することにより、それ自身の合成を抑制するよ
うであり、これが、次に、ACE1の活性化を妨害する。
【０００４】機能的CUP1遺伝子及びポリペプチド発現カ
セットの2 ミクロン誘導プラスミド中への挿入は、驚く
べきことに、その2 ミクロン誘導プラスミドの安定性強
化を、そして銅イオンの存在中でのプラスミド・コピー
数の増加を介しての増幅を導く。これは、驚くべきこと
である。なぜなら、この2 ミクロン誘導プラスミドは、
それ自身、既に、多くのコピー数の染色体外の存在のた
めの全機能を含んでいるからである。プラスミド・コピ
ー数の増加は、しばしば、これもまたそのプラスミド上
に在る異種遺伝子の発現の改善を引き起こす。その純正
な染色体CUP1遺伝子が破壊された場合、又は増幅される
ことができないCUP1遺伝子の唯一のコピーがそのゲノム
内に存在する場合に、異種遺伝子発現における収率が、
さらに有意に増加されることが、驚くべきことに発見さ
れた。
セットの2 ミクロン誘導プラスミド中への挿入は、驚く
べきことに、その2 ミクロン誘導プラスミドの安定性強
化を、そして銅イオンの存在中でのプラスミド・コピー
数の増加を介しての増幅を導く。これは、驚くべきこと
である。なぜなら、この2 ミクロン誘導プラスミドは、
それ自身、既に、多くのコピー数の染色体外の存在のた
めの全機能を含んでいるからである。プラスミド・コピ
ー数の増加は、しばしば、これもまたそのプラスミド上
に在る異種遺伝子の発現の改善を引き起こす。その純正
な染色体CUP1遺伝子が破壊された場合、又は増幅される
ことができないCUP1遺伝子の唯一のコピーがそのゲノム
内に存在する場合に、異種遺伝子発現における収率が、
さらに有意に増加されることが、驚くべきことに発見さ
れた。
【０００５】発明の説明 本発明は、ポリペプチドの製造方法であって、1 以下の
機能的CUP1遺伝子を含み、そして機能的CUP1遺伝子及び
ポリペプチド発現カセットを含んで成る酵母2ミクロン
誘導プラスミドを宿す酵母株を複合培養培地中で培養す
ること、並びに、生産されたポリペプチドを単離するこ
とを含んで成り、その培養培地に、CUP1プロモーターを
誘導する量の銅塩を供給するような生産方法に関する。
本発明の好ましい態様においては、上記のポリペプチド
発現カセットは、ポリペプチドをコードする第二DNA 配
列に正しい読み取り枠内で連結されている酵母のシグナ
ルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状態
で連結されている酵母プロモーター、及び酵母の転写終
止シグナルを含むDNA 配列から成る。
機能的CUP1遺伝子を含み、そして機能的CUP1遺伝子及び
ポリペプチド発現カセットを含んで成る酵母2ミクロン
誘導プラスミドを宿す酵母株を複合培養培地中で培養す
ること、並びに、生産されたポリペプチドを単離するこ
とを含んで成り、その培養培地に、CUP1プロモーターを
誘導する量の銅塩を供給するような生産方法に関する。
本発明の好ましい態様においては、上記のポリペプチド
発現カセットは、ポリペプチドをコードする第二DNA 配
列に正しい読み取り枠内で連結されている酵母のシグナ
ルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状態
で連結されている酵母プロモーター、及び酵母の転写終
止シグナルを含むDNA 配列から成る。
【０００６】上記第二DNA 配列によりコードされている
ポリペプチドは、酵母に対して同種又は異種であっても
よい。本発明の好ましい態様においては、発現されたポ
リペプチドは、異種のものである。これらの異種ポリペ
プチドは、さらに加工、例えば、グリコシル化されるこ
ともできる。有用なポリペプチドは、例えば、栄養物の
製造のためにそして化学における酵素反応を行うために
使用されることができる酵素、又は栄養物として又はヒ
ト若しくは動物の病気の治療のために又はそれらの予防
のために有用且つ貴重であるポリペプチド、例えば、ホ
ルモン、免疫調節機能のあるポリペプチド、抗ウイルス
及び抗腫瘍の性質物、抗体、ウイルス抗原、ワクチン、
血液凝固因子、酵素阻害剤、食料等である。
ポリペプチドは、酵母に対して同種又は異種であっても
よい。本発明の好ましい態様においては、発現されたポ
リペプチドは、異種のものである。これらの異種ポリペ
プチドは、さらに加工、例えば、グリコシル化されるこ
ともできる。有用なポリペプチドは、例えば、栄養物の
製造のためにそして化学における酵素反応を行うために
使用されることができる酵素、又は栄養物として又はヒ
ト若しくは動物の病気の治療のために又はそれらの予防
のために有用且つ貴重であるポリペプチド、例えば、ホ
ルモン、免疫調節機能のあるポリペプチド、抗ウイルス
及び抗腫瘍の性質物、抗体、ウイルス抗原、ワクチン、
血液凝固因子、酵素阻害剤、食料等である。
【０００７】上記のような異種構成的遺伝子は、例え
ば、ホルモン、例えば、セクレチン、キモシン、レラキ
シン、カルシトニン、黄体形成ホルモン(luteinizing h
ormone) 、甲状腺傍ホルモン(parathyroid hormone) 、
アドレノコルチコトロピン、メラノサイト刺激ホルモ
ン、β- リポトロピン、ウロガストロン若しくはインシ
ュリン、成長因子、例えば、上皮成長因子、インシュリ
ン様成長因子(IGF) 、例えば、IGF-I 及びIGF-II、***
細胞成長因子、神経成長因子、グリア誘導神経細胞成長
因子、又は形質転換成長因子(TGF) 、例えば、TGF α
又はTGF β、例えば、TGF β1,β2,β3 、成長ホルモ
ン、例えば、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイ
キン、例えば、インターロイキン-1若しくは-2、ヒト・
マクロファージ転移抑制因子(MIF) 、インターフェロ
ン、例えば、ヒトα- インターフェロン、例えば、イン
ターフェロンαA,αB,αD 若しくはαF 、β- インター
フェロン、γ- インターフェロン若しくはハイブリッド
・インターフェロン、例えば、αA-αD-若しくはαB-α
D-ハイブリッド・インターフェロン、特にハイブリッド
・インターフェロンBDBB、プロテイナーゼ阻害剤例え
ば、α1 - 抗トリプシン、SLPI等、肝炎ウイルス抗原、
例えば、B 型肝炎ウイルス表面又はコア抗原又はA 型肝
炎ウイルス抗原、又は非A 非B 型肝炎抗原、プラスミノ
ーゲン活性物質、例えば、組織プラスミノーゲン活性物
質又はウロキナーゼ、腫瘍壊死因子、ソマトスタチン、
レニン(renin) 、β- エンドルフィン、免疫グロブリ
ン、例えば、免疫グロブリンD 、E 若しくはG のL 鎖及
び/ 又はH 鎖、又はヒト- マウス・ハイブリッド免疫グ
ロブリン、免疫グロブリン結合因子、例えば、免疫グロ
ブリンE 結合因子、例えば、sCD23 等、カルシトニン、
ヒト・カルシトニン関連ペプチド、血液凝固因子、例え
ば、因子IX若しくは因子VIIIc 、エリトロポイエチン、
eglin、例えば、eglin C 、デスルファトヒルジン、例
えば、デスルファトヒルジンHV1 、HV2 若しくはPA、ヒ
ト・スーパーオキシド・ジムスターゼ、ウイルス・チミ
ジン・キナーゼ、β- ラクタマーゼ、グルコース・イソ
メラーゼをコードしているものである。好ましい遺伝子
は、ヒトα- インターフェロン又はハイブリッド・イン
ターフェロン、特にハイブリッド・インターフェロンBD
BB、そして最も優先的には、デスルファトヒルジンであ
る。
ば、ホルモン、例えば、セクレチン、キモシン、レラキ
シン、カルシトニン、黄体形成ホルモン(luteinizing h
ormone) 、甲状腺傍ホルモン(parathyroid hormone) 、
アドレノコルチコトロピン、メラノサイト刺激ホルモ
ン、β- リポトロピン、ウロガストロン若しくはインシ
ュリン、成長因子、例えば、上皮成長因子、インシュリ
ン様成長因子(IGF) 、例えば、IGF-I 及びIGF-II、***
細胞成長因子、神経成長因子、グリア誘導神経細胞成長
因子、又は形質転換成長因子(TGF) 、例えば、TGF α
又はTGF β、例えば、TGF β1,β2,β3 、成長ホルモ
ン、例えば、ヒト又はウシ成長ホルモン、インターロイ
キン、例えば、インターロイキン-1若しくは-2、ヒト・
マクロファージ転移抑制因子(MIF) 、インターフェロ
ン、例えば、ヒトα- インターフェロン、例えば、イン
ターフェロンαA,αB,αD 若しくはαF 、β- インター
フェロン、γ- インターフェロン若しくはハイブリッド
・インターフェロン、例えば、αA-αD-若しくはαB-α
D-ハイブリッド・インターフェロン、特にハイブリッド
・インターフェロンBDBB、プロテイナーゼ阻害剤例え
ば、α1 - 抗トリプシン、SLPI等、肝炎ウイルス抗原、
例えば、B 型肝炎ウイルス表面又はコア抗原又はA 型肝
炎ウイルス抗原、又は非A 非B 型肝炎抗原、プラスミノ
ーゲン活性物質、例えば、組織プラスミノーゲン活性物
質又はウロキナーゼ、腫瘍壊死因子、ソマトスタチン、
レニン(renin) 、β- エンドルフィン、免疫グロブリ
ン、例えば、免疫グロブリンD 、E 若しくはG のL 鎖及
び/ 又はH 鎖、又はヒト- マウス・ハイブリッド免疫グ
ロブリン、免疫グロブリン結合因子、例えば、免疫グロ
ブリンE 結合因子、例えば、sCD23 等、カルシトニン、
ヒト・カルシトニン関連ペプチド、血液凝固因子、例え
ば、因子IX若しくは因子VIIIc 、エリトロポイエチン、
eglin、例えば、eglin C 、デスルファトヒルジン、例
えば、デスルファトヒルジンHV1 、HV2 若しくはPA、ヒ
ト・スーパーオキシド・ジムスターゼ、ウイルス・チミ
ジン・キナーゼ、β- ラクタマーゼ、グルコース・イソ
メラーゼをコードしているものである。好ましい遺伝子
は、ヒトα- インターフェロン又はハイブリッド・イン
ターフェロン、特にハイブリッド・インターフェロンBD
BB、そして最も優先的には、デスルファトヒルジンであ
る。
【０００８】用語" デスルファトヒルジン" は、文献の
中に記載された、またはデスルファトヒルジンをコード
するDNA を含む形質転換された微生物株から得られるこ
とができる、全てのデスルファトヒルジン化合物を包含
すると意図される。このようなデスルファトヒルジン
は、例えば、デスルファトヒルジン変異体HV1 、HV2 及
びHV3(PA) 、並びにM.Scharf et al.FEBS Lett.255(198
9),105-110により記載された他のヒルジン蛋白である。
ヒルジン活性をもつヒルジン誘導体( すなわち、トロン
ビン阻害作用をもつ) も、上記の用語" デスルファトヒ
ルジン" によりカバーされると理解されるべきである。
このような誘導体は、例えば、C-末端が短くなったデス
ルファトヒルジン、すなわち、1 〜7 つの、好ましくは
1 〜4 つのアミノ酸をそのC-末端で欠いているデスルフ
ァトヒルジン、及び純正なアミノ酸の代わりに1 のまた
は複数の例えば1 〜5 つのアミノ酸を置換することによ
り、後者とは異なっているヒルジンのムテインである。
好ましいデスルファトヒルジンは、デスルファトヒルジ
ン変異体HV1 である。
中に記載された、またはデスルファトヒルジンをコード
するDNA を含む形質転換された微生物株から得られるこ
とができる、全てのデスルファトヒルジン化合物を包含
すると意図される。このようなデスルファトヒルジン
は、例えば、デスルファトヒルジン変異体HV1 、HV2 及
びHV3(PA) 、並びにM.Scharf et al.FEBS Lett.255(198
9),105-110により記載された他のヒルジン蛋白である。
ヒルジン活性をもつヒルジン誘導体( すなわち、トロン
ビン阻害作用をもつ) も、上記の用語" デスルファトヒ
ルジン" によりカバーされると理解されるべきである。
このような誘導体は、例えば、C-末端が短くなったデス
ルファトヒルジン、すなわち、1 〜7 つの、好ましくは
1 〜4 つのアミノ酸をそのC-末端で欠いているデスルフ
ァトヒルジン、及び純正なアミノ酸の代わりに1 のまた
は複数の例えば1 〜5 つのアミノ酸を置換することによ
り、後者とは異なっているヒルジンのムテインである。
好ましいデスルファトヒルジンは、デスルファトヒルジ
ン変異体HV1 である。
【０００９】本発明に記載の好適な酵母株は、内因性の
2-ミクロンのプラスミドを含むサッカロミセス・セレビ
シエ(S.cerevisiae)の株又はこの内因性の2-ミクロンの
プラスミドにより修復されているような株を含む( 欧州
特許出願第340170号を参照のこと）。本発明に記載の好
ましい酵母株は、上記の内因性の2-ミクロンのプラスミ
ドを欠くことができる( いわゆる"cir0 株" と称する)
。好ましい酵母株は、1 のまたは多数のプロテアーゼ-
欠損の酵母株、すなわち、特にカルボキシペプチダー
ゼysc α及びyscYの蛋白分解活性及び、場合によってさ
らに、プロテアーゼyscA及び/ またはyscBの活性を欠い
ている酵母株である( 欧州特許出願第341215号を参照の
こと）。本発明に記載の方法に好適である酵母株は、そ
のゲノム内に1 以下の機能的CUP1遺伝子を含む。特に好
ましい酵母株は、ゲノムのCUP1遺伝子を作る能力を欠い
ている。場合によっては、本発明に記載の酵母株は、1
以上の追加の、例えば、1 〜3 つの、染色体ACE1遺伝子
のコピーを含む。
2-ミクロンのプラスミドを含むサッカロミセス・セレビ
シエ(S.cerevisiae)の株又はこの内因性の2-ミクロンの
プラスミドにより修復されているような株を含む( 欧州
特許出願第340170号を参照のこと）。本発明に記載の好
ましい酵母株は、上記の内因性の2-ミクロンのプラスミ
ドを欠くことができる( いわゆる"cir0 株" と称する)
。好ましい酵母株は、1 のまたは多数のプロテアーゼ-
欠損の酵母株、すなわち、特にカルボキシペプチダー
ゼysc α及びyscYの蛋白分解活性及び、場合によってさ
らに、プロテアーゼyscA及び/ またはyscBの活性を欠い
ている酵母株である( 欧州特許出願第341215号を参照の
こと）。本発明に記載の方法に好適である酵母株は、そ
のゲノム内に1 以下の機能的CUP1遺伝子を含む。特に好
ましい酵母株は、ゲノムのCUP1遺伝子を作る能力を欠い
ている。場合によっては、本発明に記載の酵母株は、1
以上の追加の、例えば、1 〜3 つの、染色体ACE1遺伝子
のコピーを含む。
【００１０】形質転換された酵母株は、当業者に知られ
た方法を使用して培養される。それ故、本発明に記載の
形質転換された酵母株は、その酵母株が生存及び増殖す
るために必須である成分、例えば同化できる炭素及び窒
素源、無機塩、ビタミン、成長促進物質、例えば追加の
アミノ酸、砂糖、等を、含む液体の複合培養培地内で培
養される。
た方法を使用して培養される。それ故、本発明に記載の
形質転換された酵母株は、その酵母株が生存及び増殖す
るために必須である成分、例えば同化できる炭素及び窒
素源、無機塩、ビタミン、成長促進物質、例えば追加の
アミノ酸、砂糖、等を、含む液体の複合培養培地内で培
養される。
【００１１】酵母を培養するために使用することができ
る対応する複合培養培地は、当業者に知られている。例
えば、このような培養培地は、トリプトン、ペプトン、
肉エキス、マルトエキス、酵母エキス、カサミノ酸、コ
ーンスティープリカー、大豆粉、ホエー、ホエー加水分
解産物等、並びに特にそれらの混合物を含み、そして場
合により、さらに、全ての下記の必須成分が、上記培地
中に存在すべきでるということを考慮して、砂糖( 例え
ば、デキストロース、グルコース、シュクロース、ガラ
クトース等) 、ビタミン( 例えば、ビオチン) 、個々の
アミノ酸、無機塩( 例えば、ナトリウム、カリウム、マ
グネシウム及びカルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩
及び炭酸塩、さらに、微量元素、例えば、鉄、亜鉛及び
マンガンの対応する塩) 等を補われる。好ましい培養培
地は、場合によって、無機塩及びビタミンを補われた、
商業的に入手可能な培地YPD(酵母エキス(yeast extrac
t)、ペプトン(peptone) 、デキストロース(dextrose);M
ethods Enzymol.194,13 を参照のこと）である。
る対応する複合培養培地は、当業者に知られている。例
えば、このような培養培地は、トリプトン、ペプトン、
肉エキス、マルトエキス、酵母エキス、カサミノ酸、コ
ーンスティープリカー、大豆粉、ホエー、ホエー加水分
解産物等、並びに特にそれらの混合物を含み、そして場
合により、さらに、全ての下記の必須成分が、上記培地
中に存在すべきでるということを考慮して、砂糖( 例え
ば、デキストロース、グルコース、シュクロース、ガラ
クトース等) 、ビタミン( 例えば、ビオチン) 、個々の
アミノ酸、無機塩( 例えば、ナトリウム、カリウム、マ
グネシウム及びカルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩
及び炭酸塩、さらに、微量元素、例えば、鉄、亜鉛及び
マンガンの対応する塩) 等を補われる。好ましい培養培
地は、場合によって、無機塩及びビタミンを補われた、
商業的に入手可能な培地YPD(酵母エキス(yeast extrac
t)、ペプトン(peptone) 、デキストロース(dextrose);M
ethods Enzymol.194,13 を参照のこと）である。
【００１２】上記の培養は、慣用技術を使用することに
より行われる。この培養条件、例えば、温度、培地のpH
及び発酵時間は、ポリペプチドの最大レベルが作り出さ
れるような方法で選択される。選ばれた酵母株は、ポリ
ペプチドの満足すべき収率が得られるように、好ましく
は、好気条件下、液浸培地内で、振とうまたは攪拌を伴
って、約25°〜33℃の、好ましくは約28℃の温度にて、
4 から7 までのpH値で、例えば、約pH5 〜6 で、そして
少なくとも1 〜3 日間、好ましくは3 〜4 日間、培養さ
れる。培養は、バッチ工程、供給バッチ工程、連続供給
バッチ工程、または連続法として、実施され得る。
より行われる。この培養条件、例えば、温度、培地のpH
及び発酵時間は、ポリペプチドの最大レベルが作り出さ
れるような方法で選択される。選ばれた酵母株は、ポリ
ペプチドの満足すべき収率が得られるように、好ましく
は、好気条件下、液浸培地内で、振とうまたは攪拌を伴
って、約25°〜33℃の、好ましくは約28℃の温度にて、
4 から7 までのpH値で、例えば、約pH5 〜6 で、そして
少なくとも1 〜3 日間、好ましくは3 〜4 日間、培養さ
れる。培養は、バッチ工程、供給バッチ工程、連続供給
バッチ工程、または連続法として、実施され得る。
【００１３】上記培養培地に、CUP1プロモーターを誘導
する量の銅(II)塩、特に硫酸銅を供給する。銅の最適量
( ポリペプチドの最大タイターを提供する量) は、とり
わけ、宿主細胞の遺伝的背景、使用される発現ベクター
の成分、及び培養培地の組成に依存し、そして熟練者が
使用する定型的なテスト、例えば" タイトレーション"
(添加銅量の関数として、HPLCによりポリペプチドの濃
度を測定すること) により、測定されることができる。
定型テストは、T.Etcheverry( 引用文中に、文書中324
ページ) により記載されている。本発明に記載の酵母株
は、致死濃度の銅イオンが最適製造のための濃度を遙に
超えているため、高い濃度の銅イオンに対してはむしろ
感度が悪い。そしてそれ故、容易に調整されることがで
きる。擬-構成的なやり方でCUP1プロモーターを使用す
ることが必要な場合には、上記培養培地に、ちょうど接
種のときに、銅塩を供給する。
する量の銅(II)塩、特に硫酸銅を供給する。銅の最適量
( ポリペプチドの最大タイターを提供する量) は、とり
わけ、宿主細胞の遺伝的背景、使用される発現ベクター
の成分、及び培養培地の組成に依存し、そして熟練者が
使用する定型的なテスト、例えば" タイトレーション"
(添加銅量の関数として、HPLCによりポリペプチドの濃
度を測定すること) により、測定されることができる。
定型テストは、T.Etcheverry( 引用文中に、文書中324
ページ) により記載されている。本発明に記載の酵母株
は、致死濃度の銅イオンが最適製造のための濃度を遙に
超えているため、高い濃度の銅イオンに対してはむしろ
感度が悪い。そしてそれ故、容易に調整されることがで
きる。擬-構成的なやり方でCUP1プロモーターを使用す
ることが必要な場合には、上記培養培地に、ちょうど接
種のときに、銅塩を供給する。
【００１４】上記のポリペプチドを、常法により、単離
するこができる。例えば、その最初の段階は、普通に
は、その細胞壁を溶解し、そして遠心分離法によりその
細胞死骸を除去し、分泌蛋白の場合には、その細胞を遠
心分離によりその培養液から分離することにある。得ら
れた上澄を、大部分の非蛋白物質を取り除くためにポリ
エチレンイミンによる処理により、そしてその溶液を硫
酸アンモニウムで飽和することによる蛋白質の沈殿形成
によりポリペプチドについて濃縮することができる。宿
主蛋白を、存在する場合には、例えば、酢酸( 例えば、
0.1%、pH4 〜5)で酸性にすることにより沈殿させること
もできる。その他の精製段階は、例えば、脱塩化、クロ
マトグラフィー法、例えば、イオン交換クロオマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、分配クロマトグ
ラフィー、HPLC、逆相HPLC、等を含む。上記混合液の構
成成分の分離を、透析により、ゲル電気泳動または無担
体電気泳動によるチャージに従って、好適なSephadexカ
ラムによる分子サイズに従って、例えば、抗体、特にモ
ノクロナール抗体を用いたアフィニティークロマトグラ
フィーにより、行うこともできる。
するこができる。例えば、その最初の段階は、普通に
は、その細胞壁を溶解し、そして遠心分離法によりその
細胞死骸を除去し、分泌蛋白の場合には、その細胞を遠
心分離によりその培養液から分離することにある。得ら
れた上澄を、大部分の非蛋白物質を取り除くためにポリ
エチレンイミンによる処理により、そしてその溶液を硫
酸アンモニウムで飽和することによる蛋白質の沈殿形成
によりポリペプチドについて濃縮することができる。宿
主蛋白を、存在する場合には、例えば、酢酸( 例えば、
0.1%、pH4 〜5)で酸性にすることにより沈殿させること
もできる。その他の精製段階は、例えば、脱塩化、クロ
マトグラフィー法、例えば、イオン交換クロオマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、分配クロマトグ
ラフィー、HPLC、逆相HPLC、等を含む。上記混合液の構
成成分の分離を、透析により、ゲル電気泳動または無担
体電気泳動によるチャージに従って、好適なSephadexカ
ラムによる分子サイズに従って、例えば、抗体、特にモ
ノクロナール抗体を用いたアフィニティークロマトグラ
フィーにより、行うこともできる。
【００１５】デスルファトヒルジンの場合においては、
使用された酵母株、プロモーター及びシグナルペプチド
にかかわらず、生産されたデスルファトヒルジンは、主
として( すなわち、90% を超える) 、上記培養培地に分
泌される。遠心分離の後、アフィニティークロマトグラ
フィーに好適な担体と一緒になったトロンビンをヒルジ
ンを分離するために使用することもでき、あるいは、特
に文献により知られた他の方法により、行うこともでき
る。一般的には、本質的に汚染物質を含まないデスルフ
ァトヒルジン生産物を得るためには、ほんの少しの精製
段階のみが必要である。
使用された酵母株、プロモーター及びシグナルペプチド
にかかわらず、生産されたデスルファトヒルジンは、主
として( すなわち、90% を超える) 、上記培養培地に分
泌される。遠心分離の後、アフィニティークロマトグラ
フィーに好適な担体と一緒になったトロンビンをヒルジ
ンを分離するために使用することもでき、あるいは、特
に文献により知られた他の方法により、行うこともでき
る。一般的には、本質的に汚染物質を含まないデスルフ
ァトヒルジン生産物を得るためには、ほんの少しの精製
段階のみが必要である。
【００１６】本発明に記載の形質転換された酵母細胞
は、以下に示す段階: −機能的CUP1遺伝子及びポリペプチド発現カセットを含
んで成る酵母発現プラスミドを用意し、 −上記の酵母発現プラスミドにより、そのゲノム内に1
以下の機能的CUP1遺伝子を含む酵母株を形質転換し、そ
して非形質転換酵母細胞から形質転換酵母細胞を選択す
ることを含んで成る組み換えDNA 技術により調製され得
る。
は、以下に示す段階: −機能的CUP1遺伝子及びポリペプチド発現カセットを含
んで成る酵母発現プラスミドを用意し、 −上記の酵母発現プラスミドにより、そのゲノム内に1
以下の機能的CUP1遺伝子を含む酵母株を形質転換し、そ
して非形質転換酵母細胞から形質転換酵母細胞を選択す
ることを含んで成る組み換えDNA 技術により調製され得
る。
【００１７】酵母発現プラスミド 本発明は、機能的CUP1遺伝子及びポリペプチド発現カセ
ットを含んで成る2 ミクロン誘導ハイブリッド・プラス
ミドに関する。機能的CUP1遺伝子は、クローン化されて
おり、そして例えば、T.R.Butt and D.J.Ecker,Microbi
ol.Rev.51(1987),351-364 及びT.R.Butt et al.Gene 27
(1984),23-33により、広く特徴付けされている。それら
は、例えば、メタロチオネインをコードしているDNA 配
列に作用可能な状態で結合されている酵母CUP1プロモー
ター(CUP1 UAS を含む) 、並びに酵母転写終止シグナル
を含むDNA 配列を含んで成る。最も好ましくは、完全な
メタロチオネイン・コード遺伝子を含む1.3kb のBamHI
フラグメントが、-CUP1-がプラスミドYEp3362xSst(Wrig
ht,C.F.et al.Nucleic Acids Res.14(1986),8489-8499)
から単離されている- 使用される。上記のポリペプチド
発現カセットは、例えば、ポリペプチドをコードしてい
るDNA 配列に作用可能な状態で結合されている酵母プロ
モーターを含んで成る。好ましい態様においては、上記
のポリペプチド発現カセットは、ポリペプチドをコード
している第二DNA 配列に正しい読み取り枠内で結合され
ている、酵母シグナル・ペプチドをコードしている第一
DNA 配列に作用可能な状態で結合されている酵母プロモ
ーター、並びに酵母転写終止シグナルを含むDNA 配列か
ら成る。好ましいポリペプチドは、先に記載したような
異種ポリペプチドである。好適な酵母プロモーターは、
例えば、複合培地中で酵母によりポリペプチドを発現さ
せるために使用されることができる構成的又は誘導的な
酵母プロモターのいずれか、例えば、上記のCUP1プロモ
ーター、GAPDH(それらの短縮された構成的変異体、例え
ば、GAPFL 等を含む)GAL(10),PYK,TPI,ADH及びPGK プロ
モーターである。好ましいプロモーターは、構成的なGA
PFL 及び特にCUP1プロモーターである。これらのプロモ
ーターは、よく知られており、そしてそれ自体既知の方
法により製造され、そして使用されることができる。
ットを含んで成る2 ミクロン誘導ハイブリッド・プラス
ミドに関する。機能的CUP1遺伝子は、クローン化されて
おり、そして例えば、T.R.Butt and D.J.Ecker,Microbi
ol.Rev.51(1987),351-364 及びT.R.Butt et al.Gene 27
(1984),23-33により、広く特徴付けされている。それら
は、例えば、メタロチオネインをコードしているDNA 配
列に作用可能な状態で結合されている酵母CUP1プロモー
ター(CUP1 UAS を含む) 、並びに酵母転写終止シグナル
を含むDNA 配列を含んで成る。最も好ましくは、完全な
メタロチオネイン・コード遺伝子を含む1.3kb のBamHI
フラグメントが、-CUP1-がプラスミドYEp3362xSst(Wrig
ht,C.F.et al.Nucleic Acids Res.14(1986),8489-8499)
から単離されている- 使用される。上記のポリペプチド
発現カセットは、例えば、ポリペプチドをコードしてい
るDNA 配列に作用可能な状態で結合されている酵母プロ
モーターを含んで成る。好ましい態様においては、上記
のポリペプチド発現カセットは、ポリペプチドをコード
している第二DNA 配列に正しい読み取り枠内で結合され
ている、酵母シグナル・ペプチドをコードしている第一
DNA 配列に作用可能な状態で結合されている酵母プロモ
ーター、並びに酵母転写終止シグナルを含むDNA 配列か
ら成る。好ましいポリペプチドは、先に記載したような
異種ポリペプチドである。好適な酵母プロモーターは、
例えば、複合培地中で酵母によりポリペプチドを発現さ
せるために使用されることができる構成的又は誘導的な
酵母プロモターのいずれか、例えば、上記のCUP1プロモ
ーター、GAPDH(それらの短縮された構成的変異体、例え
ば、GAPFL 等を含む)GAL(10),PYK,TPI,ADH及びPGK プロ
モーターである。好ましいプロモーターは、構成的なGA
PFL 及び特にCUP1プロモーターである。これらのプロモ
ーターは、よく知られており、そしてそれ自体既知の方
法により製造され、そして使用されることができる。
【００１８】上記CUP1プロモーターのDNA 配列は、T.R.
Butt et al. により知られている(Proc.Natl.Acad.Sc.U
SA 81(1984)3332-3336) 。従って、このCUP1プロモータ
ーは、化学的なDNA 合成により用意され得るし、または
好適なDNA プローブを使用して、例えば、ポリメラーゼ
連鎖反応(PCR) により、ゲノムのサッカロミセス・セレ
ビシエ(S.cerevisiae)DNA から単離され得る。本発明に
おいて使用されるCUP1プロモーターは、転写開始シグナ
ル、及び-105〜-148位(CUP1 の転写開始部位に対して；
P.Fuerst et al.Cell 55(1988)705-717)に位置する上流
の活性化配列(UASC ) を含む。好ましくは、UAS の現存
5'制限部位が、例えば、上記CUP1遺伝子の-455位に位置
するBamHI 部位(T.R.Butt et al., 前記) が、並びに、
化学合成により、またはPCR において使用されたオリゴ
ヌクレオチドにより人工的に誘導される転写開始シグナ
ル( 例えば、EcoRI 部位) の3'制限部位が、利用され
る。得られた制限フラグメント、特に、配列番号3 の中
で表される構築物内に含まれる、例えば、0.4kB の[Sau
3A]/BamHI-EcoRI フラグメントを、酵母のシグナルペプ
チドをコードするDNA 配列に連結することができる。
Butt et al. により知られている(Proc.Natl.Acad.Sc.U
SA 81(1984)3332-3336) 。従って、このCUP1プロモータ
ーは、化学的なDNA 合成により用意され得るし、または
好適なDNA プローブを使用して、例えば、ポリメラーゼ
連鎖反応(PCR) により、ゲノムのサッカロミセス・セレ
ビシエ(S.cerevisiae)DNA から単離され得る。本発明に
おいて使用されるCUP1プロモーターは、転写開始シグナ
ル、及び-105〜-148位(CUP1 の転写開始部位に対して；
P.Fuerst et al.Cell 55(1988)705-717)に位置する上流
の活性化配列(UASC ) を含む。好ましくは、UAS の現存
5'制限部位が、例えば、上記CUP1遺伝子の-455位に位置
するBamHI 部位(T.R.Butt et al., 前記) が、並びに、
化学合成により、またはPCR において使用されたオリゴ
ヌクレオチドにより人工的に誘導される転写開始シグナ
ル( 例えば、EcoRI 部位) の3'制限部位が、利用され
る。得られた制限フラグメント、特に、配列番号3 の中
で表される構築物内に含まれる、例えば、0.4kB の[Sau
3A]/BamHI-EcoRI フラグメントを、酵母のシグナルペプ
チドをコードするDNA 配列に連結することができる。
【００１９】酵母による外来蛋白の発現のために、上記
のCUP1プロモーターを使用することに関する幾つかの例
が文献の中に存在する(T.R.Butt et al.,Microbiol.Re
v.51(1987),351-364;T.Etcheverry,Methods Enzymol.18
5(1990),319-329; 米国特許出願第4,940,661 号を参照
のこと) 。記述された方法は、銅イオンを含む酵母最小
培地内で、CUP1発現カセットをもつ発現ベクターを宿す
形質転換された酵母株を培養することを含んでいる。化
学的に定義された最小培地が選ばれた。なぜなら、複合
培地の成分( 蛋白等) が、銅イオンと相互作用( 錯体形
成) し、そのことにより、ACE1の活性化を妨害すると、
一般的に信じられているからである。達成可能な細胞の
密度( 吸光度) 及び、結果として得られることができる
タイターは、対応して低い。後者の結果は、今までのと
ころ、生物工学の研究及び生産における上記CUP1プロモ
ーター系の広範囲の利用を限定している。
のCUP1プロモーターを使用することに関する幾つかの例
が文献の中に存在する(T.R.Butt et al.,Microbiol.Re
v.51(1987),351-364;T.Etcheverry,Methods Enzymol.18
5(1990),319-329; 米国特許出願第4,940,661 号を参照
のこと) 。記述された方法は、銅イオンを含む酵母最小
培地内で、CUP1発現カセットをもつ発現ベクターを宿す
形質転換された酵母株を培養することを含んでいる。化
学的に定義された最小培地が選ばれた。なぜなら、複合
培地の成分( 蛋白等) が、銅イオンと相互作用( 錯体形
成) し、そのことにより、ACE1の活性化を妨害すると、
一般的に信じられているからである。達成可能な細胞の
密度( 吸光度) 及び、結果として得られることができる
タイターは、対応して低い。後者の結果は、今までのと
ころ、生物工学の研究及び生産における上記CUP1プロモ
ーター系の広範囲の利用を限定している。
【００２０】驚くべきことに、すべての予想に反して、
観察され得る発現レベルまたは効率に対する何らの有害
な効果を伴わずに、銅により誘導されるCUP1発現カセッ
トと組み合わせて、複合酵母培地を使用できることが見
つかった。さらに、上記CUP1プロモーターが、擬- 構成
的な方法で使用されたとき、すなわち、酵母によるデス
ルファトヒルジンの分泌を上記培養培地へ向けるため
に、ちょうど接種の時に、上記の培養培地に銅を供給す
るときは、このプロモーターは、強力な構成的酵母プロ
モーターよりも優れている。上記のCUP1プロモーターを
含む発現系を使用しては、驚くべきことに、同一ベクタ
ー上のCUP1遺伝子全体の中の同一プロモーター又はそれ
により作られるメタロチオネインによる抑制は全くな
い。
観察され得る発現レベルまたは効率に対する何らの有害
な効果を伴わずに、銅により誘導されるCUP1発現カセッ
トと組み合わせて、複合酵母培地を使用できることが見
つかった。さらに、上記CUP1プロモーターが、擬- 構成
的な方法で使用されたとき、すなわち、酵母によるデス
ルファトヒルジンの分泌を上記培養培地へ向けるため
に、ちょうど接種の時に、上記の培養培地に銅を供給す
るときは、このプロモーターは、強力な構成的酵母プロ
モーターよりも優れている。上記のCUP1プロモーターを
含む発現系を使用しては、驚くべきことに、同一ベクタ
ー上のCUP1遺伝子全体の中の同一プロモーター又はそれ
により作られるメタロチオネインによる抑制は全くな
い。
【００２１】酵母のシグナルペプチド("シグナル配列")
をコードするDNA 配列は、好ましくは、普通に分泌され
るポリペプチドをコードする酵母遺伝子に由来する。こ
の酵母シグナル配列は、例えば、上記酵母のインベルタ
ーゼ(SUC2)、α- 因子、フェロモン・ペプチダーゼ(KEX
1)、" キラー毒素" 及び抑制酵素である酸性ホスファタ
ーゼ(PHO5)の遺伝子の、シグナル及びプレプロ配列、並
びにアスペルギルス・アワモリ( Aspergillus awamori)
からのグルコアミラーゼのシグナル配列である。追加の
配列、例えば、特異的プロセシング・シグナルを担持す
ることができるプロ- またはスペーサー- 配列も、前駆
体分子の正確なプロセシングを容易にする構築物の中に
含まれることができる。例えば、このプロセシング・シ
グナルは、ゴルジ膜内に位置する酵母のエンドペプチダ
ーゼにより認識されるLys-Arg 残基を含む。本発明に記
載の好ましいシグナル配列は、酵母のPHO5遺伝子の、及
び酵母のインベルターゼ遺伝子のものである。
をコードするDNA 配列は、好ましくは、普通に分泌され
るポリペプチドをコードする酵母遺伝子に由来する。こ
の酵母シグナル配列は、例えば、上記酵母のインベルタ
ーゼ(SUC2)、α- 因子、フェロモン・ペプチダーゼ(KEX
1)、" キラー毒素" 及び抑制酵素である酸性ホスファタ
ーゼ(PHO5)の遺伝子の、シグナル及びプレプロ配列、並
びにアスペルギルス・アワモリ( Aspergillus awamori)
からのグルコアミラーゼのシグナル配列である。追加の
配列、例えば、特異的プロセシング・シグナルを担持す
ることができるプロ- またはスペーサー- 配列も、前駆
体分子の正確なプロセシングを容易にする構築物の中に
含まれることができる。例えば、このプロセシング・シ
グナルは、ゴルジ膜内に位置する酵母のエンドペプチダ
ーゼにより認識されるLys-Arg 残基を含む。本発明に記
載の好ましいシグナル配列は、酵母のPHO5遺伝子の、及
び酵母のインベルターゼ遺伝子のものである。
【００２２】上記のポリペプチド、特に異種ポリペプチ
ドをコードするDNA 配列を、例えば、ゲノムのDNA から
単離することができ、又は2 本鎖DNA(ds cDNA)を、その
対応mRNAに相補的に作り、又は、上記ポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を、それ自体既知の方法
により、化学的及び酵素的方法により作る。酵母の転写
終止シグナルを含むDNA 配列は、好ましくは、転写終止
及びポリアデニレーションのための正しいシグナルを含
む酵母遺伝子の3'フランキング配列である。この好まし
いフランキング配列は、酵母のPHO5遺伝子のものであ
る。
ドをコードするDNA 配列を、例えば、ゲノムのDNA から
単離することができ、又は2 本鎖DNA(ds cDNA)を、その
対応mRNAに相補的に作り、又は、上記ポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を、それ自体既知の方法
により、化学的及び酵素的方法により作る。酵母の転写
終止シグナルを含むDNA 配列は、好ましくは、転写終止
及びポリアデニレーションのための正しいシグナルを含
む酵母遺伝子の3'フランキング配列である。この好まし
いフランキング配列は、酵母のPHO5遺伝子のものであ
る。
【００２３】上記の酵母プロモーター、シグナルペプチ
ドをコードするDNA 配列、上記ポリペプチドをコードす
るDNA 配列、及び酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配
列は、それぞれ互いに作用可能な状態で連結されてお
り、すなわち、それらの正常な機能が維持されるような
やり方で並置される。この列は、上記酵母プロモーター
が、シグナル配列- ポリペプチド遺伝子複合体の正しい
発現を生じさせ、上記転写終止シグナルが、本来の転写
終了及びポリアデニレーションを生じさせ、そして、上
記シグナル配列が、上記シグナル配列の最終コドンが上
記ポリペプチドのための遺伝子の最初のコドンに直接的
に連結されているようなやり方で、上記ポリペプチド遺
伝子に本来の読み取り枠内で連結される、ようなもので
ある。この酵母プロモーターは、好ましくは、主要mRNA
の始点と上記プロモーター遺伝子に自然に結合されてい
るATG との間で、上記シグナル配列に結合される。この
シグナル配列は、翻訳開始のためのそれ自身のATG をも
つ。これらの配列の結合は、例えば、エンドヌクレアー
ゼの認識配列を担持する合成オリゴヌクレオチド・リン
カーにより、行われることができる。対応するデスルフ
ァトヒルジン発現カセットのための例は、欧州特許出願
第341 215 号中に記載されている。
ドをコードするDNA 配列、上記ポリペプチドをコードす
るDNA 配列、及び酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配
列は、それぞれ互いに作用可能な状態で連結されてお
り、すなわち、それらの正常な機能が維持されるような
やり方で並置される。この列は、上記酵母プロモーター
が、シグナル配列- ポリペプチド遺伝子複合体の正しい
発現を生じさせ、上記転写終止シグナルが、本来の転写
終了及びポリアデニレーションを生じさせ、そして、上
記シグナル配列が、上記シグナル配列の最終コドンが上
記ポリペプチドのための遺伝子の最初のコドンに直接的
に連結されているようなやり方で、上記ポリペプチド遺
伝子に本来の読み取り枠内で連結される、ようなもので
ある。この酵母プロモーターは、好ましくは、主要mRNA
の始点と上記プロモーター遺伝子に自然に結合されてい
るATG との間で、上記シグナル配列に結合される。この
シグナル配列は、翻訳開始のためのそれ自身のATG をも
つ。これらの配列の結合は、例えば、エンドヌクレアー
ゼの認識配列を担持する合成オリゴヌクレオチド・リン
カーにより、行われることができる。対応するデスルフ
ァトヒルジン発現カセットのための例は、欧州特許出願
第341 215 号中に記載されている。
【００２４】上記のポリペプチド発現カセット上記のCU
P1遺伝子とは別に、本発明に記載の発現プラスミドは、
複製起点を含む2 ミクロンのDNA から生じたDNA セグメ
ント、または、2 ミクロンのDNA をもたない酵母株が使
われた場合には、2 ミクロンのDNA の全体を含んで成
る。後者のタイプのプラスミドが、好ましい。例えば、
本発明に記載のプラスミドは、連続した形態において、
完全な2 ミクロンのDNAを含み、すなわち、2 ミクロン
のDNA が、一旦、制限エンドヌクレアーゼで解裂される
と、その直線状DNA が、再環化に先立って、そのベクタ
ーの他の成分で連結される。この制限部位は、REP1、RE
P2及びFLP 遺伝子の、並びに、2 ミクロンのDNA のORI
、STB 、IR1 及びIR2 部位の、並びに(FLP組み換え体
が作用するところで、それぞれの逆に反復された(IR)中
心の近くに位置する) 小さな"FLP認識標識"(FRT)部位
の、正常な機能が維持されるように選ばれる。場合によ
って、この制限部位は、2 ミクロンのDNA のD 遺伝子も
無傷であるように選ばれる。好適な制限部位は、例え
ば、上記D 遺伝子内に位置するユニークPstI部位、並び
に上記遺伝子及び部位の全ての外に位置するユニークHp
aI及びSnaBI である。しかしながら、2 ミクロンのDNA
内に、上記発現カセット、異なった( 例えば2 つの)制
限部位におけるさらなる成分( 以下参照) 、特に前述の
ようなもの、を挿入することができそうである。
P1遺伝子とは別に、本発明に記載の発現プラスミドは、
複製起点を含む2 ミクロンのDNA から生じたDNA セグメ
ント、または、2 ミクロンのDNA をもたない酵母株が使
われた場合には、2 ミクロンのDNA の全体を含んで成
る。後者のタイプのプラスミドが、好ましい。例えば、
本発明に記載のプラスミドは、連続した形態において、
完全な2 ミクロンのDNAを含み、すなわち、2 ミクロン
のDNA が、一旦、制限エンドヌクレアーゼで解裂される
と、その直線状DNA が、再環化に先立って、そのベクタ
ーの他の成分で連結される。この制限部位は、REP1、RE
P2及びFLP 遺伝子の、並びに、2 ミクロンのDNA のORI
、STB 、IR1 及びIR2 部位の、並びに(FLP組み換え体
が作用するところで、それぞれの逆に反復された(IR)中
心の近くに位置する) 小さな"FLP認識標識"(FRT)部位
の、正常な機能が維持されるように選ばれる。場合によ
って、この制限部位は、2 ミクロンのDNA のD 遺伝子も
無傷であるように選ばれる。好適な制限部位は、例え
ば、上記D 遺伝子内に位置するユニークPstI部位、並び
に上記遺伝子及び部位の全ての外に位置するユニークHp
aI及びSnaBI である。しかしながら、2 ミクロンのDNA
内に、上記発現カセット、異なった( 例えば2 つの)制
限部位におけるさらなる成分( 以下参照) 、特に前述の
ようなもの、を挿入することができそうである。
【００２５】このようなプラスミド誘導体は、2 つの逆
に反復するFRT 部位または追加の、3 つ目のFRT 部位を
含んで成ることができる。前者の種類のプラスミドを、
本明細書中で、" 対称2 ミクロン様ハイブリッドベクタ
ー" と称する。後者の種類のプラスミドを、本明細書中
で、" 対称2 ミクロン様分散ベクター" と称するが、そ
れは、真に対称なプラスミドではないにもかかわらず、
それにより形質転換された酵母細胞内で、対称2 ミクロ
ン様ハイブリッドベクターを生じさせる。
に反復するFRT 部位または追加の、3 つ目のFRT 部位を
含んで成ることができる。前者の種類のプラスミドを、
本明細書中で、" 対称2 ミクロン様ハイブリッドベクタ
ー" と称する。後者の種類のプラスミドを、本明細書中
で、" 対称2 ミクロン様分散ベクター" と称するが、そ
れは、真に対称なプラスミドではないにもかかわらず、
それにより形質転換された酵母細胞内で、対称2 ミクロ
ン様ハイブリッドベクターを生じさせる。
【００２６】本発明の対称2 ミクロン様ハイブリッドベ
クターは、優先的には、バクテリアのまたはウイルスの
DNA 配列、すなわちバクテリアのゲノム、プラスミドも
しくはウイルス由来のDNA を含まない。しかしながら、
本発明の2 ミクロン様分散ベクターは、上記の対称2 ミ
クロン様ハイブリッドベクターが上記の分散ベクターか
ら生じているところの形質転換された酵母内のベクター
から切り取られた2 つの直接的に反復したFRT 部位の間
の、原核生物起源のDNA 配列を含むことができる。これ
らのDNA 配列は、以下に記載するようなバクテリアの配
列であり、そして、そのベクターに、本質的に構成的
な、または機能的な特徴を提供することができ、あるい
は、対称2 ミクロン様ハイブリッドベクターまたは対称
分散ベクターを構築するために、非対称の2 ミクロン様
プラスミド誘導体のまたは" 非対称の" 分散ベクター
の、2 つの逆に反復されたFRT 部位の間の上記2 つの領
域を埋める機能だけをもつこともできる。
クターは、優先的には、バクテリアのまたはウイルスの
DNA 配列、すなわちバクテリアのゲノム、プラスミドも
しくはウイルス由来のDNA を含まない。しかしながら、
本発明の2 ミクロン様分散ベクターは、上記の対称2 ミ
クロン様ハイブリッドベクターが上記の分散ベクターか
ら生じているところの形質転換された酵母内のベクター
から切り取られた2 つの直接的に反復したFRT 部位の間
の、原核生物起源のDNA 配列を含むことができる。これ
らのDNA 配列は、以下に記載するようなバクテリアの配
列であり、そして、そのベクターに、本質的に構成的
な、または機能的な特徴を提供することができ、あるい
は、対称2 ミクロン様ハイブリッドベクターまたは対称
分散ベクターを構築するために、非対称の2 ミクロン様
プラスミド誘導体のまたは" 非対称の" 分散ベクター
の、2 つの逆に反復されたFRT 部位の間の上記2 つの領
域を埋める機能だけをもつこともできる。
【００２７】本発明の意味の中において対称である2 ミ
クロン様ハイブリッドベクターにおいて、またはこのよ
うな対称2 ミクロン様ハイブリッドベクターを生じさせ
る分散ベクターにおいて、2 つの逆に反復したFRT 間に
位置する領域の長さは、約1:1 から約5:4 までの比をも
ち、すなわち、その大きい方の領域は、その小さい方の
ものよりも約20% まで、より大きい。本発明の好ましい
態様においては、上記2 ミクロンDNA の環状形態の逆に
反復したFRT 部位間の2 つの領域は、殆ど同じ長さをも
つ。好ましくは、本発明に記載の発現プラスミドは、 1
以上の、特に1 又は2 の、酵母のための選択的遺伝マー
カー、並びにバクテリア宿主、特に大腸菌(E.coli)のた
めのこのようなマーカー及び( 対称2 ミクロン様ハイブ
リッド・ベクターを除く) 複製起点を含む。
クロン様ハイブリッドベクターにおいて、またはこのよ
うな対称2 ミクロン様ハイブリッドベクターを生じさせ
る分散ベクターにおいて、2 つの逆に反復したFRT 間に
位置する領域の長さは、約1:1 から約5:4 までの比をも
ち、すなわち、その大きい方の領域は、その小さい方の
ものよりも約20% まで、より大きい。本発明の好ましい
態様においては、上記2 ミクロンDNA の環状形態の逆に
反復したFRT 部位間の2 つの領域は、殆ど同じ長さをも
つ。好ましくは、本発明に記載の発現プラスミドは、 1
以上の、特に1 又は2 の、酵母のための選択的遺伝マー
カー、並びにバクテリア宿主、特に大腸菌(E.coli)のた
めのこのようなマーカー及び( 対称2 ミクロン様ハイブ
リッド・ベクターを除く) 複製起点を含む。
【００２８】酵母の選択的遺伝マーカーに関して、その
マーカー遺伝子の表現型の発現による、形質転換細胞の
ための選択を容易にする、いずれのマーカー遺伝子も使
用できる。酵母のための好適なマーカーは、例えば、抗
生物質の耐性を発現するもの、または、栄養要求性株の
場合には、宿主の病変を補う遺伝子である。対応する遺
伝子は、例えば、抗生物質G418、ハイグロマイシンもし
くはブレオマイシンに耐性を与え、または、栄養要求性
酵母変異株、例えば、URA3、LEU2、LYS2、HIS3若しくは
TRP1遺伝子における原栄養性を提供する。
マーカー遺伝子の表現型の発現による、形質転換細胞の
ための選択を容易にする、いずれのマーカー遺伝子も使
用できる。酵母のための好適なマーカーは、例えば、抗
生物質の耐性を発現するもの、または、栄養要求性株の
場合には、宿主の病変を補う遺伝子である。対応する遺
伝子は、例えば、抗生物質G418、ハイグロマイシンもし
くはブレオマイシンに耐性を与え、または、栄養要求性
酵母変異株、例えば、URA3、LEU2、LYS2、HIS3若しくは
TRP1遺伝子における原栄養性を提供する。
【００２９】上記発現プラスミドの増幅が、原核生物、
例えば、大腸菌(E.coli)において、便利に行われるの
で、原核生物、例えば、大腸菌(E.coli)の遺伝マーカ
ー、及び原核生物、例えば、大腸菌(E.coli)の複製起点
が、有利に含まれる。これらは、対応する原核生物のプ
ラスミド、例えば、大腸菌(E.coli)のプラスミド、例え
ば、pBR322またはpUC プラスミド、例えば、pUC18 また
はpUC19 ( これらは、原核生物、例えば、大腸菌(E.col
i)の複製起点、及び抗生物質、例えば、アンピシリンに
耐性を与える遺伝マーカーの両方を含む) から得ること
ができる。
例えば、大腸菌(E.coli)において、便利に行われるの
で、原核生物、例えば、大腸菌(E.coli)の遺伝マーカ
ー、及び原核生物、例えば、大腸菌(E.coli)の複製起点
が、有利に含まれる。これらは、対応する原核生物のプ
ラスミド、例えば、大腸菌(E.coli)のプラスミド、例え
ば、pBR322またはpUC プラスミド、例えば、pUC18 また
はpUC19 ( これらは、原核生物、例えば、大腸菌(E.col
i)の複製起点、及び抗生物質、例えば、アンピシリンに
耐性を与える遺伝マーカーの両方を含む) から得ること
ができる。
【００３０】上記のポリペプチド発現カセットとは別
に、本発明に記載の複製起点及び遺伝マーカーの上記発
現プラスミド、場合によって、追加の発現カセット、例
えば、1 〜3 つの追加のポリペプチド発現カセット及び
/ または追加の転写活性物質ACE1の発現カセットを含
む。この追加のポリペプチド発現カセットは、それぞれ
互いに同じか、または異なり、そして、そのベクターに
既に存在するポリペプチド発現カセットと同じか、また
は異なり、そして、それぞれ、ポリペプチドをコードす
る第二DNA 配列に本来の読み取り枠内で連結されたシグ
ナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状
態で連結された酵母のプロモーター、及び酵母の転写終
止シグナルを含むDNA 配列を含んで成る。このような追
加のポリペプチド発現カセット内の好適な酵母プロモー
ターは、例えば、先に記載したように、複合培地内の酵
母によるポリペプチドの発現のために使用することがで
きる構成的または誘導的な酵母プロモーターのいずれか
である。好適なシグナル配列及び転写シグナルは、特に
前記のものである。追加のACE1発現カセットは、それ自
体の転写並びに翻訳の開始及び終止シグナルを含み、ま
たは、あるいは、ACE1プロモーターとは異なる構成的ま
たは誘導的な酵母プロモーター、例えば、CUP1もしくは
構成的な( 短縮)GAPDHプロモーター( 例えば、GAPFL プ
ロモーター) により、転写的に制御されている。好適な
ACE1発現カセットは、例えば、サッカロミセス・セレビ
シエ(S.cerevisiae)のゲノムの1.7 kb EcoRVフラグメン
ト内に含まれる(P.Fuerst et al.Cell55(1988),705-717
を参照のこと) 。そこでの純正なACE1プロモーターは、
慣用の手段及び方法により、他の酵母プロモーター、例
えば、CUP1プロモーターにより置き換えられることがで
きる。上記の追加のポリペプチド及び/ 又はACE 発現カ
セットの転写の方向は、必須ではなく、そして本発明の
ベクター内に既に存在する上記ポリペプチド発現カセッ
トの転写の方向と同じであっても、又は反対であっても
よい。
に、本発明に記載の複製起点及び遺伝マーカーの上記発
現プラスミド、場合によって、追加の発現カセット、例
えば、1 〜3 つの追加のポリペプチド発現カセット及び
/ または追加の転写活性物質ACE1の発現カセットを含
む。この追加のポリペプチド発現カセットは、それぞれ
互いに同じか、または異なり、そして、そのベクターに
既に存在するポリペプチド発現カセットと同じか、また
は異なり、そして、それぞれ、ポリペプチドをコードす
る第二DNA 配列に本来の読み取り枠内で連結されたシグ
ナルペプチドをコードする第一DNA 配列に作用可能な状
態で連結された酵母のプロモーター、及び酵母の転写終
止シグナルを含むDNA 配列を含んで成る。このような追
加のポリペプチド発現カセット内の好適な酵母プロモー
ターは、例えば、先に記載したように、複合培地内の酵
母によるポリペプチドの発現のために使用することがで
きる構成的または誘導的な酵母プロモーターのいずれか
である。好適なシグナル配列及び転写シグナルは、特に
前記のものである。追加のACE1発現カセットは、それ自
体の転写並びに翻訳の開始及び終止シグナルを含み、ま
たは、あるいは、ACE1プロモーターとは異なる構成的ま
たは誘導的な酵母プロモーター、例えば、CUP1もしくは
構成的な( 短縮)GAPDHプロモーター( 例えば、GAPFL プ
ロモーター) により、転写的に制御されている。好適な
ACE1発現カセットは、例えば、サッカロミセス・セレビ
シエ(S.cerevisiae)のゲノムの1.7 kb EcoRVフラグメン
ト内に含まれる(P.Fuerst et al.Cell55(1988),705-717
を参照のこと) 。そこでの純正なACE1プロモーターは、
慣用の手段及び方法により、他の酵母プロモーター、例
えば、CUP1プロモーターにより置き換えられることがで
きる。上記の追加のポリペプチド及び/ 又はACE 発現カ
セットの転写の方向は、必須ではなく、そして本発明の
ベクター内に既に存在する上記ポリペプチド発現カセッ
トの転写の方向と同じであっても、又は反対であっても
よい。
【００３１】本発明は、先に定義した新規の発現プラス
ミドの製造方法にも関する。本発明に記載の発現プラス
ミドを、当業者に知られた方法により、例えば、慣用の
化学的または生物学的なインビトロにおける合成手順を
使用して、予め決めた順序で、ポリペプチド発現カセッ
トを、CUP1遺伝子を、酵母及び場合によりバクテリア宿
主のための選択的遺伝マーカーを含むDNA フラグメント
を、酵母及び場合によりバクテリア宿主のための複製起
点を、そして場合により追加のポリペプチド及び/ 又は
ACE1発現カセットを連結することにより、製造する。優
先的に、組み換えDNA 技術を使用して、上記プラスミド
を構築し、そして製造する。組み換えDNA 技術による製
造のために、好適なDNA フラグメントを、常法によりイ
ンビトロにおいて連結する。次に、この連結混合物を、
使用される調節元素の性質に依存して、好適な原核生物
または真核生物宿主に形質転換し、そして、所望のベク
ターを含む形質転換細胞を、慣用の手順に従って選択す
る。このプラスミドを、形質転換された宿主により増幅
することができ、そして常法により単離することができ
る。この宿主の選択は、ベクター上に位置するその調節
配列に依存する。本発明の発現ベクターは、優先的に、
原核生物、例えば、大腸菌(E.coli)内で作用できる調節
配列を含んで成るので、原核生物宿主、例えば、大腸菌
(E.coli)が、上記ベクターの構築及び増幅のために好ま
れる。
ミドの製造方法にも関する。本発明に記載の発現プラス
ミドを、当業者に知られた方法により、例えば、慣用の
化学的または生物学的なインビトロにおける合成手順を
使用して、予め決めた順序で、ポリペプチド発現カセッ
トを、CUP1遺伝子を、酵母及び場合によりバクテリア宿
主のための選択的遺伝マーカーを含むDNA フラグメント
を、酵母及び場合によりバクテリア宿主のための複製起
点を、そして場合により追加のポリペプチド及び/ 又は
ACE1発現カセットを連結することにより、製造する。優
先的に、組み換えDNA 技術を使用して、上記プラスミド
を構築し、そして製造する。組み換えDNA 技術による製
造のために、好適なDNA フラグメントを、常法によりイ
ンビトロにおいて連結する。次に、この連結混合物を、
使用される調節元素の性質に依存して、好適な原核生物
または真核生物宿主に形質転換し、そして、所望のベク
ターを含む形質転換細胞を、慣用の手順に従って選択す
る。このプラスミドを、形質転換された宿主により増幅
することができ、そして常法により単離することができ
る。この宿主の選択は、ベクター上に位置するその調節
配列に依存する。本発明の発現ベクターは、優先的に、
原核生物、例えば、大腸菌(E.coli)内で作用できる調節
配列を含んで成るので、原核生物宿主、例えば、大腸菌
(E.coli)が、上記ベクターの構築及び増幅のために好ま
れる。
【００３２】形質転換酵母株 本発明は、さらに、そのゲノム内に1 以下の機能的なCU
P1遺伝子を含み、そしてポリペプチド発現カセット及び
機能的なCUP1遺伝子を含んで成る酵母発現ハイブリッド
・プラスミドを宿す酵母株、並びにそれらの製造方法に
関する。本発明に記載の上記ハイブリッド・プラスミド
による酵母の形質転換は、当業者に知られた方法に従っ
て達成され得る。好ましい酵母株は、上記のものであ
り、例えば、内因性の2 ミクロンプラスミド("cir
0 株")を修復されており、そして特に、酵母のプロテア
ーゼ、例えば、カルボキシペプチダーゼysc α及びyscY
における1 のまたは多数の欠損のあるサッカロミセス・
セレビシエ(S.cerevisiae)株である。さらに好ましい酵
母株は、ゲノムのCUP1遺伝子を作る能力を欠いている。
このような酵母株の生産方法は、例えば、欧州特許出願
第340170号及び第341215号に記載されている。ゲノムの
CUP1遺伝子を作る能力を欠いており、又はそのゲノム内
に1 以下の機能的なCUP1遺伝子を含む酵母株が知られて
おり、そしてそれ自体公知の方法で製造されることがで
き、例えば、部位特異的突然変異誘発または遺伝子破壊
または遺伝子置換により、CUP1遺伝子のより少ないコピ
ーをもつ酵母株が調製され得る[H.Rudolph et al.,Gen
e, 36(1985)87-95]。上記染色CUP1遺伝子の配列が知ら
れているので、適切に改良した突然変異誘発性オリゴヌ
クレオチド・プライマーの調製を含む、よく知られた部
位特異的突然変異誘発手順( 例えば、M.J.Zoller and
M.Smith Methods Enzymol.100(1983),468) を利用した
挿入、置換、欠失により、後者を欠損にすることができ
る。
P1遺伝子を含み、そしてポリペプチド発現カセット及び
機能的なCUP1遺伝子を含んで成る酵母発現ハイブリッド
・プラスミドを宿す酵母株、並びにそれらの製造方法に
関する。本発明に記載の上記ハイブリッド・プラスミド
による酵母の形質転換は、当業者に知られた方法に従っ
て達成され得る。好ましい酵母株は、上記のものであ
り、例えば、内因性の2 ミクロンプラスミド("cir
0 株")を修復されており、そして特に、酵母のプロテア
ーゼ、例えば、カルボキシペプチダーゼysc α及びyscY
における1 のまたは多数の欠損のあるサッカロミセス・
セレビシエ(S.cerevisiae)株である。さらに好ましい酵
母株は、ゲノムのCUP1遺伝子を作る能力を欠いている。
このような酵母株の生産方法は、例えば、欧州特許出願
第340170号及び第341215号に記載されている。ゲノムの
CUP1遺伝子を作る能力を欠いており、又はそのゲノム内
に1 以下の機能的なCUP1遺伝子を含む酵母株が知られて
おり、そしてそれ自体公知の方法で製造されることがで
き、例えば、部位特異的突然変異誘発または遺伝子破壊
または遺伝子置換により、CUP1遺伝子のより少ないコピ
ーをもつ酵母株が調製され得る[H.Rudolph et al.,Gen
e, 36(1985)87-95]。上記染色CUP1遺伝子の配列が知ら
れているので、適切に改良した突然変異誘発性オリゴヌ
クレオチド・プライマーの調製を含む、よく知られた部
位特異的突然変異誘発手順( 例えば、M.J.Zoller and
M.Smith Methods Enzymol.100(1983),468) を利用した
挿入、置換、欠失により、後者を欠損にすることができ
る。
【００３３】あるいは、上記のゲノムのCUP1遺伝子を、
外来DNA により置換することができ、またはこの外来DN
A を、このCUP1遺伝子の好適な制限部位に挿入すること
ができる。例えば、その染色体CUP1遺伝子内で欠損のあ
る酵母突然変異体を調製するために、外来DNA を、この
CUP1遺伝子内にある好適な制限部位に挿入することがで
きる。この使用された酵母株が、アミノ酸またはプリン
( 例えば、ウラシル)の生合成についての酵素をコード
する染色体遺伝子内に欠損を持つ場合には、対応する無
傷の遺伝子( 例えば、URA3) を、その染色体CUP1遺伝子
に挿入し、これにより、栄養要求性酵母株において原栄
養性を付与し、そしてCUP1からcup1にその遺伝子型を同
時に変更することができる。この遺伝子置換または特異
的突然変異誘発手順は、一般的に当業者に利用されてお
り、そして、完全に再現できる。
外来DNA により置換することができ、またはこの外来DN
A を、このCUP1遺伝子の好適な制限部位に挿入すること
ができる。例えば、その染色体CUP1遺伝子内で欠損のあ
る酵母突然変異体を調製するために、外来DNA を、この
CUP1遺伝子内にある好適な制限部位に挿入することがで
きる。この使用された酵母株が、アミノ酸またはプリン
( 例えば、ウラシル)の生合成についての酵素をコード
する染色体遺伝子内に欠損を持つ場合には、対応する無
傷の遺伝子( 例えば、URA3) を、その染色体CUP1遺伝子
に挿入し、これにより、栄養要求性酵母株において原栄
養性を付与し、そしてCUP1からcup1にその遺伝子型を同
時に変更することができる。この遺伝子置換または特異
的突然変異誘発手順は、一般的に当業者に利用されてお
り、そして、完全に再現できる。
【００３４】所望の遺伝的背景をもつ、例えば、破壊さ
れた染色体CUP1遺伝子をもち、そして/ 又は特定のプロ
テアーゼに欠損をもつ酵母株を創出するさらなる最新の
方法は、好適な酵母株の減数***交差及び四分子分析に
ある。この四分子は、その2倍体細胞から生じ、標準的
な遺伝子技術に従い分析される。四分子の4 つの胞子間
のランダムな各種取り合わせは、その次の交差における
好適な突然変異体の構築を許容する。ランダム胞子分析
を、それに代わる系として使用することもできる。上記
染色体ACE1遺伝子の1 〜3 個の追加のコピーを含む酵母
株を、常法により製造することもできる。例えば、上記
ACE1遺伝子を、抗生物質耐性を与える染色体遺伝子の適
切な制限部位中に挿入することができ、または、上記AC
E1遺伝子の上記のような追加のコピー(copies)を含む得
られた酵母株に、抗生物質感受性を、そして、それぞれ
に、その対応するアミノ酸、プリン、またはピリミジン
塩基に関する原栄養性を与える、アミノ酸またはプリン
またはピリミジン塩基の合成に関連する遺伝子中に挿入
することができる。 （図面の簡単な説明）以下の実験パートにおいては、本
発明の様々な態様を、添付した付属図面を参照しながら
記載する。
れた染色体CUP1遺伝子をもち、そして/ 又は特定のプロ
テアーゼに欠損をもつ酵母株を創出するさらなる最新の
方法は、好適な酵母株の減数***交差及び四分子分析に
ある。この四分子は、その2倍体細胞から生じ、標準的
な遺伝子技術に従い分析される。四分子の4 つの胞子間
のランダムな各種取り合わせは、その次の交差における
好適な突然変異体の構築を許容する。ランダム胞子分析
を、それに代わる系として使用することもできる。上記
染色体ACE1遺伝子の1 〜3 個の追加のコピーを含む酵母
株を、常法により製造することもできる。例えば、上記
ACE1遺伝子を、抗生物質耐性を与える染色体遺伝子の適
切な制限部位中に挿入することができ、または、上記AC
E1遺伝子の上記のような追加のコピー(copies)を含む得
られた酵母株に、抗生物質感受性を、そして、それぞれ
に、その対応するアミノ酸、プリン、またはピリミジン
塩基に関する原栄養性を与える、アミノ酸またはプリン
またはピリミジン塩基の合成に関連する遺伝子中に挿入
することができる。 （図面の簡単な説明）以下の実験パートにおいては、本
発明の様々な態様を、添付した付属図面を参照しながら
記載する。
【００３５】以下の例は、本発明を説明するものであ
り、そして、それらを限定するものとして解釈されるべ
きではない。実験パート 株及びプラスミド 大腸菌(E.coli) DH5αF':Eschericha coli K12F'endA1
hsdR17(r- m + )supE44thil recA1 pyrA relA1 PHI80la
cZdelM15 del(lacZYA-argF)U169;HanahanD(1983) によ
るプラスミドを用いた Eschericha coliの形質転換に関
する研究。J.Mol.Biol.166:577(Bethesda Research Lab
oratories)。 酵母(S.cerevisiae) H449:Saccharomyces cerevisiaeMA
Ta,ura3 Δ15,leu2-3,leu2-112,prb1,cps1,[cir 0 ].DS
M4413;1988年2 月18日。 酵母(S.cerevisiae) HT462/TH3:MATα,cup1::URA3,kex
1,prc1,leu2-3;leu2-212;DSM7190;1992年7 月22日。 酵母(S.cerevisiae)株55.6B;MATa,his3,leu2,trp1,ura3
-52,cup1::URA3;Thiele,D.J. et al.Science 231(198
6),854-856 を参照のこと.
り、そして、それらを限定するものとして解釈されるべ
きではない。実験パート 株及びプラスミド 大腸菌(E.coli) DH5αF':Eschericha coli K12F'endA1
hsdR17(r- m + )supE44thil recA1 pyrA relA1 PHI80la
cZdelM15 del(lacZYA-argF)U169;HanahanD(1983) によ
るプラスミドを用いた Eschericha coliの形質転換に関
する研究。J.Mol.Biol.166:577(Bethesda Research Lab
oratories)。 酵母(S.cerevisiae) H449:Saccharomyces cerevisiaeMA
Ta,ura3 Δ15,leu2-3,leu2-112,prb1,cps1,[cir 0 ].DS
M4413;1988年2 月18日。 酵母(S.cerevisiae) HT462/TH3:MATα,cup1::URA3,kex
1,prc1,leu2-3;leu2-212;DSM7190;1992年7 月22日。 酵母(S.cerevisiae)株55.6B;MATa,his3,leu2,trp1,ura3
-52,cup1::URA3;Thiele,D.J. et al.Science 231(198
6),854-856 を参照のこと.
【００３６】プラスミドYEp3362xSst:Wright,C.F.et a
l.Nucleic Acids Res.14(1986),8489-8499 。 プラスミドpDP34:EP-A-340 170, 文書中の図 3; E.coli
のためのアンピシリン耐性マーカー並びにURA3及びdLEU
2 酵母選択マーカーをもつ酵母- E.coliシャトルベクタ
ー。それは、A 型で、その完全な2 ミクロン配列を含
み、そしてREP1、REP2及びFLP プロフィシェントであ
る。DSM4473;1988年3 月14日。 プラスミドpJDB207/GAPFL-YHIR: 酵母グリセルアルデヒ
ド-3- リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH) 遺伝子の、短
い、構成的プロモーターの制御下での、デスルファトヒ
ルジン変異体HV1 の発現のための酵母プラスミド。デス
ルファトヒルジンのコード配列は、好ましい酵母のコド
ンから成る;EP-A-340 170 を参照のこと。 プラスミドpTZ18R:pUC18由来のプラスミドは、M13 複製
起点を含み、その為、一本鎖に成ることができ、そして
ヘルパーM13 ファージの助けを借りてM13 ファージの頭
に包み込まれることができる。Mead DA,Szczesna-Skoru
pa E,Kemper B, 一本鎖DNA 'blue' T7 プロモータープ
ラスミド: クローニング及び蛋白工学のための多用途の
タンデム・プロモーター系、Protein Engineering 1(1
986),67-74(pharmacia) 。 プラスミドpFBY2:このプラスミドは、酵母(S.cerevisia
e)の2 ミクロンプラスミド由来のFRT を含む166 塩基対
のAluIフラグメントを、pTZ18RのHindIII 部位とEcoRI
部位との間に挿入し、そしてXbaIにより切断した2 ミク
ロンプラスミドの全体を、pTZ18RのユニークXbaI部位に
挿入することにより構築される。DSM 6271;1990 年12月
14日。
l.Nucleic Acids Res.14(1986),8489-8499 。 プラスミドpDP34:EP-A-340 170, 文書中の図 3; E.coli
のためのアンピシリン耐性マーカー並びにURA3及びdLEU
2 酵母選択マーカーをもつ酵母- E.coliシャトルベクタ
ー。それは、A 型で、その完全な2 ミクロン配列を含
み、そしてREP1、REP2及びFLP プロフィシェントであ
る。DSM4473;1988年3 月14日。 プラスミドpJDB207/GAPFL-YHIR: 酵母グリセルアルデヒ
ド-3- リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH) 遺伝子の、短
い、構成的プロモーターの制御下での、デスルファトヒ
ルジン変異体HV1 の発現のための酵母プラスミド。デス
ルファトヒルジンのコード配列は、好ましい酵母のコド
ンから成る;EP-A-340 170 を参照のこと。 プラスミドpTZ18R:pUC18由来のプラスミドは、M13 複製
起点を含み、その為、一本鎖に成ることができ、そして
ヘルパーM13 ファージの助けを借りてM13 ファージの頭
に包み込まれることができる。Mead DA,Szczesna-Skoru
pa E,Kemper B, 一本鎖DNA 'blue' T7 プロモータープ
ラスミド: クローニング及び蛋白工学のための多用途の
タンデム・プロモーター系、Protein Engineering 1(1
986),67-74(pharmacia) 。 プラスミドpFBY2:このプラスミドは、酵母(S.cerevisia
e)の2 ミクロンプラスミド由来のFRT を含む166 塩基対
のAluIフラグメントを、pTZ18RのHindIII 部位とEcoRI
部位との間に挿入し、そしてXbaIにより切断した2 ミク
ロンプラスミドの全体を、pTZ18RのユニークXbaI部位に
挿入することにより構築される。DSM 6271;1990 年12月
14日。
【００３７】プラスミドpFBY4:このプラスミドは、pTZ1
8RのユニークXbaI部位にクローニングされたサッカロミ
セス・セレビシエ(S.cerevisiae)のURA3遺伝子の全体を
含む1.1kb のXbaIフラグメントから成る。このプラスミ
ドは、XbaIフラグメントを含む1.1kb のURA のための便
利な源として役立つ。 DSM 6272;1990年12月14日。 プラスミドpFBY5:pFBY5 は、サッカロミセス・セレビシ
エ(S.cerevisiae)の2 ミクロンプラスミドの全体を含む
大きなプラスミド、並びに、バクテリアのベクターpUC1
8 中のサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)のUR
A3及びLeu2遺伝子から得られる。このベクターのユニー
クSalI部位中に、1.1k塩基対のSalIフラグメントが挿入
され、このフラグメントは、PHO5シグナル配列に融合し
たサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)GAPDH 由
来のプロモーター、これに融合する合成ヒルジンをコー
ドするDNA フラグメント、次に、これに融合するPHO5タ
ーミネーターから成る発現カセットを含む。DSM 6273;1
990 年12月14日。 プラスミドpFBY29: このプラスミドは、LEU2遺伝子を含
む2k塩基対のBamHI/SalIフラグメントから成る。このフ
ラグメントは、pTZ18RのBamHI 部位とSalI部位との間に
挿入される。pFBY29は、LEU2を含む2.0k塩基対のフラグ
メント源として役立つ。DSM 6275;1990 年12月14日。 全てのDNA 操作を、- 別段の定めなき場合- 、標準的な
手順書( 例えば、Maniatis,T.et al.:Molecular clonin
g:a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laborator
y,Cold Spring Harbor,New York(1982) に従い、実施す
る。
8RのユニークXbaI部位にクローニングされたサッカロミ
セス・セレビシエ(S.cerevisiae)のURA3遺伝子の全体を
含む1.1kb のXbaIフラグメントから成る。このプラスミ
ドは、XbaIフラグメントを含む1.1kb のURA のための便
利な源として役立つ。 DSM 6272;1990年12月14日。 プラスミドpFBY5:pFBY5 は、サッカロミセス・セレビシ
エ(S.cerevisiae)の2 ミクロンプラスミドの全体を含む
大きなプラスミド、並びに、バクテリアのベクターpUC1
8 中のサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)のUR
A3及びLeu2遺伝子から得られる。このベクターのユニー
クSalI部位中に、1.1k塩基対のSalIフラグメントが挿入
され、このフラグメントは、PHO5シグナル配列に融合し
たサッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)GAPDH 由
来のプロモーター、これに融合する合成ヒルジンをコー
ドするDNA フラグメント、次に、これに融合するPHO5タ
ーミネーターから成る発現カセットを含む。DSM 6273;1
990 年12月14日。 プラスミドpFBY29: このプラスミドは、LEU2遺伝子を含
む2k塩基対のBamHI/SalIフラグメントから成る。このフ
ラグメントは、pTZ18RのBamHI 部位とSalI部位との間に
挿入される。pFBY29は、LEU2を含む2.0k塩基対のフラグ
メント源として役立つ。DSM 6275;1990 年12月14日。 全てのDNA 操作を、- 別段の定めなき場合- 、標準的な
手順書( 例えば、Maniatis,T.et al.:Molecular clonin
g:a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laborator
y,Cold Spring Harbor,New York(1982) に従い、実施す
る。
【００３８】例1: プラスミドpHE112R の構築、GAPFLp
- ヒルジン発現カセット及びCUP1遺伝子の全部を含む2
ミクロン・プラスミド プラスミドの安定性を増しそしてプラスミドのコピー数
を増加させるために、全体の長さのCUP1遺伝子を含む1.
3kb フラグメントを、プラスミドpDP34/GAPFL-YHIR中に
挿入する。このプラスミドは、酵母のグリセルアルデヒ
ド-3- リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH) 遺伝子の短い、
構成的なプロモーター(GAPFLp)の制御下でデスルファト
ヒルジン変異体HV1 を発現するために設計されたもので
ある。pDP34/GAPFL-YHIRの構築のために、出発プラスミ
ドとしてpDP34 を使用する。pDP34(欧州特許出願第3401
70号、その中の図 3を参照のこと) は、大腸菌(E.coli)
にのためのアンピシリン耐性マーカー並びにURA3及びdL
EU2 酵母選択マーカーをもつ酵母- 大腸菌(E.coli)シャ
トルベクターである。それは、A 型で、その完全な2 ミ
クロン配列を含み、そしてREP1、REP2及びFLP プロフィ
シェントである。プラスミドpDP34 をBamHI により処理
する。この制限部位の付着末端を、Klenow DNAポリメラ
ーゼ反応によりフィルインする(T.Maniatis et al.,i
n:"Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold S
pring Harbor Laboratory,1982) 。このDNA をさらにSa
lIにより切断し、そして11.8kbのベクターフラグメント
を分離用0.6%アガロースゲル上で単離する。電気的溶出
及びエタノール沈殿によりこのDNA を回収する。
- ヒルジン発現カセット及びCUP1遺伝子の全部を含む2
ミクロン・プラスミド プラスミドの安定性を増しそしてプラスミドのコピー数
を増加させるために、全体の長さのCUP1遺伝子を含む1.
3kb フラグメントを、プラスミドpDP34/GAPFL-YHIR中に
挿入する。このプラスミドは、酵母のグリセルアルデヒ
ド-3- リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH) 遺伝子の短い、
構成的なプロモーター(GAPFLp)の制御下でデスルファト
ヒルジン変異体HV1 を発現するために設計されたもので
ある。pDP34/GAPFL-YHIRの構築のために、出発プラスミ
ドとしてpDP34 を使用する。pDP34(欧州特許出願第3401
70号、その中の図 3を参照のこと) は、大腸菌(E.coli)
にのためのアンピシリン耐性マーカー並びにURA3及びdL
EU2 酵母選択マーカーをもつ酵母- 大腸菌(E.coli)シャ
トルベクターである。それは、A 型で、その完全な2 ミ
クロン配列を含み、そしてREP1、REP2及びFLP プロフィ
シェントである。プラスミドpDP34 をBamHI により処理
する。この制限部位の付着末端を、Klenow DNAポリメラ
ーゼ反応によりフィルインする(T.Maniatis et al.,i
n:"Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold S
pring Harbor Laboratory,1982) 。このDNA をさらにSa
lIにより切断し、そして11.8kbのベクターフラグメント
を分離用0.6%アガロースゲル上で単離する。電気的溶出
及びエタノール沈殿によりこのDNA を回収する。
【００３９】プラスミドpJDB207/GAPFL-YHIR( 欧州特許
出願第340170号を参照のこと) をHindIII により処理す
る。その付着末端を、Klenow DNAポリメラーゼにより平
滑末端に変換する。このDNA をエタノール沈殿し、そし
てさらに、SalIにより処理する。この1.1kb のSalI-[Hi
ndIII]/ 平滑末端フラグメントは、pBR322配列、GAPFL
プロモーター、デスルファトヒルジンのコード配列にフ
レーム内で融合されたPHO5シグナル配列、及びPHO5転写
終止フラグメントをもつ完全な発現カセットを含む。こ
の1.1kb フラグメントを分離用0.8%アガロースゲル上で
単離し、電気的溶出によりそのゲルから回収し、そして
DE52イオン交換クロマトグラフィー及びエタノール沈殿
により精製する。0.2 ピコモルの1.1kb フラグメント及
び0.1 ピコモルの11.8kbベクター・フラグメントを、10
μl の60mM Tris-HCl pH 7.5,10mM MgCl2 ,5mM DTT,3.5
mM ATP及び400 ユニットのT4 DNAリガーゼ(Biolabs) 中
で、16時間、15℃で、連結する。1 μl の部分を、大腸
菌(E.coli)HB 101Ca2+ 細胞を形質転換するために使用
する。5 つの形質転換された、アンピシリン耐性コロニ
ーを分析する。プラスミドDNA をBamHI 及びSalI/BamHI
により処理する。正しい制限フラグメントをもつ1つの
コロニーを選び、そしてpDP34/GAPFL-YHIRと呼ぶ( 詳し
くは、欧州特許出願第340170号を参照のこと) 。
出願第340170号を参照のこと) をHindIII により処理す
る。その付着末端を、Klenow DNAポリメラーゼにより平
滑末端に変換する。このDNA をエタノール沈殿し、そし
てさらに、SalIにより処理する。この1.1kb のSalI-[Hi
ndIII]/ 平滑末端フラグメントは、pBR322配列、GAPFL
プロモーター、デスルファトヒルジンのコード配列にフ
レーム内で融合されたPHO5シグナル配列、及びPHO5転写
終止フラグメントをもつ完全な発現カセットを含む。こ
の1.1kb フラグメントを分離用0.8%アガロースゲル上で
単離し、電気的溶出によりそのゲルから回収し、そして
DE52イオン交換クロマトグラフィー及びエタノール沈殿
により精製する。0.2 ピコモルの1.1kb フラグメント及
び0.1 ピコモルの11.8kbベクター・フラグメントを、10
μl の60mM Tris-HCl pH 7.5,10mM MgCl2 ,5mM DTT,3.5
mM ATP及び400 ユニットのT4 DNAリガーゼ(Biolabs) 中
で、16時間、15℃で、連結する。1 μl の部分を、大腸
菌(E.coli)HB 101Ca2+ 細胞を形質転換するために使用
する。5 つの形質転換された、アンピシリン耐性コロニ
ーを分析する。プラスミドDNA をBamHI 及びSalI/BamHI
により処理する。正しい制限フラグメントをもつ1つの
コロニーを選び、そしてpDP34/GAPFL-YHIRと呼ぶ( 詳し
くは、欧州特許出願第340170号を参照のこと) 。
【００４０】メタロチオネイン・コード遺伝子全体-CUP
1-を含む1.3kb のBamHI フラグメントを、プラスミドYE
p3362xSst(Wright,C.F.et al.Nucleic Acids Res.14(19
86),8489-8499)から単離する。YEp3362xSst を、BamHI
により処理し、その1.3kb のフラグメントを単離し、精
製し、そしてBumHI により切断されたpUC19 と連結す
る。得られたプラスミドをpHE105と名付ける。CUP1プロ
モーター、CUP1によりコードされたメタロチオネインの
オープン・リーディング・フレーム(ORF) 及びCUP1ター
ミネーターを含む1311塩基対のBamHI フラグメントを配
列番号1 中に示す。pHE105をBamHI により処理し、1.3k
b のCUP1含有フラグメントを単離し、そしてKlenowDNA
ポリメラーゼによりその付着末端を平滑末端に変換す
る。pDP34/GAPFL-YHIRをSnaBI により処理し、切断され
たプラスミドを精製し、そしてその平滑末端をアルカリ
性ホスファターゼ処理により脱リン酸化する。CUP1を含
む1.3kb の[BamHI]/平滑末端フラグメントを、SnaBI-切
断pDP34/GAPFL-YHIR中に連結する。大腸菌(E.coli)を、
得られたプラスミドpHE112R により形質転換する。pHE1
12R をKpnIによる処理により、そのメタロチオネインOR
F の方向についてテストする。このメタロチオネインOR
F は、GAPFL-ヒルジン発現カセットに関しては、pHE112
R 内で反時計回りの方向で含まれている。pHE112R を図
1 中に示す。
1-を含む1.3kb のBamHI フラグメントを、プラスミドYE
p3362xSst(Wright,C.F.et al.Nucleic Acids Res.14(19
86),8489-8499)から単離する。YEp3362xSst を、BamHI
により処理し、その1.3kb のフラグメントを単離し、精
製し、そしてBumHI により切断されたpUC19 と連結す
る。得られたプラスミドをpHE105と名付ける。CUP1プロ
モーター、CUP1によりコードされたメタロチオネインの
オープン・リーディング・フレーム(ORF) 及びCUP1ター
ミネーターを含む1311塩基対のBamHI フラグメントを配
列番号1 中に示す。pHE105をBamHI により処理し、1.3k
b のCUP1含有フラグメントを単離し、そしてKlenowDNA
ポリメラーゼによりその付着末端を平滑末端に変換す
る。pDP34/GAPFL-YHIRをSnaBI により処理し、切断され
たプラスミドを精製し、そしてその平滑末端をアルカリ
性ホスファターゼ処理により脱リン酸化する。CUP1を含
む1.3kb の[BamHI]/平滑末端フラグメントを、SnaBI-切
断pDP34/GAPFL-YHIR中に連結する。大腸菌(E.coli)を、
得られたプラスミドpHE112R により形質転換する。pHE1
12R をKpnIによる処理により、そのメタロチオネインOR
F の方向についてテストする。このメタロチオネインOR
F は、GAPFL-ヒルジン発現カセットに関しては、pHE112
R 内で反時計回りの方向で含まれている。pHE112R を図
1 中に示す。
【００４１】例 2: プラスミドpPFY56の構築、CUP1プロ
モーター、PHO5リーダー配列及び合成ヒルジン遺伝子を
含むハイブリッド遺伝子 分泌デスルファトヒルジンの誘導的・高レベルの発現を
達成するために、ヒルジン及びPHO5リーダー配列をコー
ドするDNA 配列を融合し、そして銅誘導可能CUP1プロモ
ーターの制御下に置く。PHO5リーダー配列に融合された
合成ヒルジン遺伝子を、PHO5転写終止配列をも含む0.5k
b のEcoRI フラグメントとして、プラスミドpDP34/GAPF
L-YHIR( 前記)から単離する。
モーター、PHO5リーダー配列及び合成ヒルジン遺伝子を
含むハイブリッド遺伝子 分泌デスルファトヒルジンの誘導的・高レベルの発現を
達成するために、ヒルジン及びPHO5リーダー配列をコー
ドするDNA 配列を融合し、そして銅誘導可能CUP1プロモ
ーターの制御下に置く。PHO5リーダー配列に融合された
合成ヒルジン遺伝子を、PHO5転写終止配列をも含む0.5k
b のEcoRI フラグメントとして、プラスミドpDP34/GAPF
L-YHIR( 前記)から単離する。
【００４２】Perkin Elmer製PCR キット及びプライマー
としての以下の2 つのオリゴヌクレオチドを使用したポ
リメラーゼ連鎖反応(PCR) により、酵母(S.cerevisiae)
のゲノムDNA から、CUP1プロモーター(T.R.Butt et al.
Proc.Natl.Sci USA 81(1984),3332-3336) をクローン化
する。 5'-GGATCCATTACCGACATTTGGGCGCTAT ( 配列番号5 ） 5'-GAATTCACAGTTTGTTTTTCTTAATATCTA ( 配列番号6 ）
としての以下の2 つのオリゴヌクレオチドを使用したポ
リメラーゼ連鎖反応(PCR) により、酵母(S.cerevisiae)
のゲノムDNA から、CUP1プロモーター(T.R.Butt et al.
Proc.Natl.Sci USA 81(1984),3332-3336) をクローン化
する。 5'-GGATCCATTACCGACATTTGGGCGCTAT ( 配列番号5 ） 5'-GAATTCACAGTTTGTTTTTCTTAATATCTA ( 配列番号6 ）
【００４３】10mM TRIS pH 8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2
中に2.5 ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ、0.02mMのそ
れぞれのプライマー、並びに0.2mM のdATP、dCTP、TTP
及びdGTPを含む0.1ml 中で、100ng の酵母のgenomic DN
A(酵母株H449から単離した)をインキュベートする。92
℃で30秒、42℃で1 分間、そして72℃で1 分間、の30サ
イクルの間、この反応物をインキュベートする。単離
し、精製し、そしてBamHI 及びEcoRI による制限酵素処
理の後、0.4kb のCUP1プロモーターフラグメントを、Ba
mHI 及びEcoRI により切断されたpBR322に挿入する。得
られたプラスミドpBR322-CUP1 を、EcoRI により制限酵
素処理する。このCUP1プロモーターを含む4.4kb のベク
ターを単離し、精製し、そして0.5kb のヒルジン・フラ
グメントと連結する。大腸菌(E.coli)HB101 を、得られ
たプラスミドpPFY53により形質転換する。pPFY53を、Sa
lIによる処理により、ヒルジン・フラグメントの正しい
方向についてテストする。CUP1プロモーター、PHO5リー
ダー配列、ヒルジン遺伝子、及びPHO5ターミネーターを
含む1082塩基対のBamHI/SalIフラグメントを、配列番号
3 に示す。
中に2.5 ユニットのTaq DNA ポリメラーゼ、0.02mMのそ
れぞれのプライマー、並びに0.2mM のdATP、dCTP、TTP
及びdGTPを含む0.1ml 中で、100ng の酵母のgenomic DN
A(酵母株H449から単離した)をインキュベートする。92
℃で30秒、42℃で1 分間、そして72℃で1 分間、の30サ
イクルの間、この反応物をインキュベートする。単離
し、精製し、そしてBamHI 及びEcoRI による制限酵素処
理の後、0.4kb のCUP1プロモーターフラグメントを、Ba
mHI 及びEcoRI により切断されたpBR322に挿入する。得
られたプラスミドpBR322-CUP1 を、EcoRI により制限酵
素処理する。このCUP1プロモーターを含む4.4kb のベク
ターを単離し、精製し、そして0.5kb のヒルジン・フラ
グメントと連結する。大腸菌(E.coli)HB101 を、得られ
たプラスミドpPFY53により形質転換する。pPFY53を、Sa
lIによる処理により、ヒルジン・フラグメントの正しい
方向についてテストする。CUP1プロモーター、PHO5リー
ダー配列、ヒルジン遺伝子、及びPHO5ターミネーターを
含む1082塩基対のBamHI/SalIフラグメントを、配列番号
3 に示す。
【００４４】上記のCUP1- ヒルジン発現カセットを、1.
1kb のSalIフラグメントとして、pPFY53から単離する。
次に、このフラグメントを、SalIにより線状になったpD
P34(前記) に挿入する。大腸菌(E.coli)HB101 を、得ら
れたプラスミドpPFY56により形質転換する。この形質転
換された大腸菌(E.coli)株を、大腸菌(E.coli)/PFY56と
名付ける。pPFY56を図 2に示す。
1kb のSalIフラグメントとして、pPFY53から単離する。
次に、このフラグメントを、SalIにより線状になったpD
P34(前記) に挿入する。大腸菌(E.coli)HB101 を、得ら
れたプラスミドpPFY56により形質転換する。この形質転
換された大腸菌(E.coli)株を、大腸菌(E.coli)/PFY56と
名付ける。pPFY56を図 2に示す。
【００４５】例 3: プラスミドpPHE11の1 構築、CUP1-
ヒルジン発現カセット及び完全な長さのCUP1遺伝子を含
む2 ミクロン・プラスミド pPFY56をSnaBIUにより処理し、切断されたプラスミドを
精製し、そしてその平滑末端をアルカリ性ホスファター
ゼ処理により脱リン酸化する。CUP1を含む1.3kb の[Bam
HI]/平滑末端フラグメント( 例1)を、SnaBI-切断pDP56
中に連結する。大腸菌(E.coli)HB101 を、得られたプラ
スミドpHE111により形質転換する。pHE111をKpnIによる
処理により、そのメタロチオネインORF の方向について
テストする。このメタロチオネインORF は、CUP1p-ヒル
ジン発現カセットに関しては、pHE111内で時計回りの方
向で含まれている。pHE111を図3 中に示す。
ヒルジン発現カセット及び完全な長さのCUP1遺伝子を含
む2 ミクロン・プラスミド pPFY56をSnaBIUにより処理し、切断されたプラスミドを
精製し、そしてその平滑末端をアルカリ性ホスファター
ゼ処理により脱リン酸化する。CUP1を含む1.3kb の[Bam
HI]/平滑末端フラグメント( 例1)を、SnaBI-切断pDP56
中に連結する。大腸菌(E.coli)HB101 を、得られたプラ
スミドpHE111により形質転換する。pHE111をKpnIによる
処理により、そのメタロチオネインORF の方向について
テストする。このメタロチオネインORF は、CUP1p-ヒル
ジン発現カセットに関しては、pHE111内で時計回りの方
向で含まれている。pHE111を図3 中に示す。
【００４６】例 4: サッカロミセス・セレビシエ(S.cer
evisiae)株TR1456の構築 サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株Tr1456
を、欧州特許出願第341215 号に記載されたように構築
する。サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cer
evisiae)株H449から出発して、2 つの引き続く一連の実
験において、2 つのカルボキシペプチダーゼysc α及び
yscYを、それぞれ、それらをコードする遺伝子KEX1及び
PRC1を破壊することにより、株H449から取り除く。最初
に、ysc αをコードする遺伝子KEX1を破壊する。この目
的のために、株H449を、KEX1をコード遺伝子をコードす
るDNA フラグメントにより形質転換する。ここで、URA3
遺伝子の全体が、KEX1コード領域の中央に挿入される。
ウラシルの原栄養性形質転換細胞を選択し、そしてysc
α活性の無いことについてテストする。次に、KEX1座に
おいて挿入されたURA3遺伝子を、URA3遺伝子の破壊され
た変異体であるura3Δ( 欧州特許出願第341 215 号を参
照のこと) を含むプラスミドによる形質転換により破壊
する。ウラシル栄養要求性の形質転換細胞を選択し、そ
して以下の段階において、カルボキシペプチダーゼyscY
をコードするそれらの内因性PRC1遺伝子内で破壊する。
KEX1の破壊について記載したものと全体として類似する
方法で、この実験を実施する。最後に得られた株H449の
相同遺伝子誘導体はTr1456と称され、そして以下の遺伝
子型: Tr1456 = MATa,leu2-3,112,ura3,prb1,kex1::ura3,prc
1::ura3,[cir 0 ] をもつ。
evisiae)株TR1456の構築 サッカロミセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株Tr1456
を、欧州特許出願第341215 号に記載されたように構築
する。サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cer
evisiae)株H449から出発して、2 つの引き続く一連の実
験において、2 つのカルボキシペプチダーゼysc α及び
yscYを、それぞれ、それらをコードする遺伝子KEX1及び
PRC1を破壊することにより、株H449から取り除く。最初
に、ysc αをコードする遺伝子KEX1を破壊する。この目
的のために、株H449を、KEX1をコード遺伝子をコードす
るDNA フラグメントにより形質転換する。ここで、URA3
遺伝子の全体が、KEX1コード領域の中央に挿入される。
ウラシルの原栄養性形質転換細胞を選択し、そしてysc
α活性の無いことについてテストする。次に、KEX1座に
おいて挿入されたURA3遺伝子を、URA3遺伝子の破壊され
た変異体であるura3Δ( 欧州特許出願第341 215 号を参
照のこと) を含むプラスミドによる形質転換により破壊
する。ウラシル栄養要求性の形質転換細胞を選択し、そ
して以下の段階において、カルボキシペプチダーゼyscY
をコードするそれらの内因性PRC1遺伝子内で破壊する。
KEX1の破壊について記載したものと全体として類似する
方法で、この実験を実施する。最後に得られた株H449の
相同遺伝子誘導体はTr1456と称され、そして以下の遺伝
子型: Tr1456 = MATa,leu2-3,112,ura3,prb1,kex1::ura3,prc
1::ura3,[cir 0 ] をもつ。
【００４７】例5: サッカロミセス・セレビシエ(Sacch
aromyces cerevisiae)株TR1456の銅耐 性相同遺伝子変異
体の構築 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces
cerevisiae)株TR1456は、- ほとんどは実験酵母株と同
様に- 、培地への銅添加に対し中程度に耐性である。こ
の耐性は、タンデムとして整列したCUP1遺伝子の2 つの
コピーを含む2kb の染色体DNA セグメントの存在による
[Hamer D.,et al.Science 228(1985),685-690]。培地中
の大量の銅の存在中、より高い耐性変異体が得られる
が、これは、上記の2kb のCUP1含有染色体DNA セグメン
トのタンデムの反復による。このような高い耐性変異体
を構築するために、サッカロミセス・セレビシエ(S.cer
evisiae)TR1456を、例 6に記載したように、合成最小培
地に接種し、1.2mM の硫酸銅を補給する。この培養を、
30℃で8 日間、そして180r.p.m. で行う。次ぎに、この
培養液を、銅添加のない、単一コロニーを得るのに好適
な濃度で合成最小培地上にプレーテングする。選択され
た個々のコロニーからのDNA を調製し、EcoRI により処
理し、アガロースゲル上で分離し、そしてサザンブロッ
ト法によりCUP1座の存在及び長さについて分析する。実
験条件は、Hameret al.[ 前記を参照のこと] に従う。C
UP1座の電気泳動法での移動における、CUP1座の少なく
とも10コピーの存在を示すシフトをもつ1 つのコロニー
を選択し、そしてサッカロミセス・セレビシエ(S.cerev
isiae)株TR1631と名付ける。
aromyces cerevisiae)株TR1456の銅耐 性相同遺伝子変異
体の構築 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces
cerevisiae)株TR1456は、- ほとんどは実験酵母株と同
様に- 、培地への銅添加に対し中程度に耐性である。こ
の耐性は、タンデムとして整列したCUP1遺伝子の2 つの
コピーを含む2kb の染色体DNA セグメントの存在による
[Hamer D.,et al.Science 228(1985),685-690]。培地中
の大量の銅の存在中、より高い耐性変異体が得られる
が、これは、上記の2kb のCUP1含有染色体DNA セグメン
トのタンデムの反復による。このような高い耐性変異体
を構築するために、サッカロミセス・セレビシエ(S.cer
evisiae)TR1456を、例 6に記載したように、合成最小培
地に接種し、1.2mM の硫酸銅を補給する。この培養を、
30℃で8 日間、そして180r.p.m. で行う。次ぎに、この
培養液を、銅添加のない、単一コロニーを得るのに好適
な濃度で合成最小培地上にプレーテングする。選択され
た個々のコロニーからのDNA を調製し、EcoRI により処
理し、アガロースゲル上で分離し、そしてサザンブロッ
ト法によりCUP1座の存在及び長さについて分析する。実
験条件は、Hameret al.[ 前記を参照のこと] に従う。C
UP1座の電気泳動法での移動における、CUP1座の少なく
とも10コピーの存在を示すシフトをもつ1 つのコロニー
を選択し、そしてサッカロミセス・セレビシエ(S.cerev
isiae)株TR1631と名付ける。
【００４８】例6: サッカロミセス・セレビシエ(S.cer
evisiae)株55.6B(cup1::URA3) とサッカロミセス・セレ
ビシエ(S.cerevisiae)株TR1456との接合及び銅感受性に
関するその胞子の分析 CUP1座の中に欠損のあるサッカロミセス・セレビシエ
(S.cerevisiae)株55.6B(MATa his3 leu2 trp1 ura3-52,
cup1::URA3;Thiele,D.J.et al.Science 231(1986),854-
856 を参照のこと) を、CUP1座の約3 コピー( すなわ
ち、タンデムに整列したCUP1遺伝子の6 コピー) を担持
する株TR1456(MATa leu2-3,212,ura3 Δ5 kex1 prb1 pr
c1) と接合させる。遺伝子型cup1::URA3/CUP1 の2 倍体
のヘテロ接合細胞を、この接合体から単離する。この2
倍体細胞から生じる4 倍体を、標準的な遺伝子技術[Met
hods in Yeast genetics 1986(Sherman F.,Fink G.R.,H
icks J.B.,eds.)Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.]
に従って分析する。それぞれの4 倍体の4 つの胞子の子
孫を、0 μM 、250 μM 、500 μM または1mM の硫酸銅
を補ったYPD 寒天プレート(2回蒸留した水1 リッター当
たり、10g の酵母エキス、20g のペプトン、20g のグル
コース及び25g の寒天) 上での増殖能力についてテスト
する。破壊されたcup1::URA3遺伝子を受け継いでいる胞
子が、銅寒天上で僅かに増殖する子孫を作るのに対し、
無傷のCUP1遺伝子を受け継いでいる胞子は、銅寒天上で
活発に増殖する子孫を作る。幾つかの完全な四分子の2
つの銅感受性胞子の子孫を、株TR1456とのそれらの接合
能力についてテストする。適切な接合型の胞子の子孫
を、TR1456と接合させ、そして遺伝子型cup1::URA3/CUP
1 の2倍体ヘテロ接合細胞を、この接合体から単離す
る。上記2 倍体細胞から生じた四分子を分析し、そして
その胞子を、前記のように硫酸銅の感受性についてテス
トする。約50の完全な四分子から得られた銅感受性コロ
ニーを、SD寒天( 水1 リッター当たり、アミノ酸を含ま
ない6.7gのBacto 酵母ナイトロジェンベース、20gのグ
ルコース及び25g の寒天) 上、並びに200 μM のロイシ
ンを補ったSD寒天上での増殖についてテストする。この
SDプレート上で増殖しないが、200 μM のロイシンを補
ったSD寒天上では増殖するコロニーは、遺伝子型cup1::
URA3,HIS3,TRP1,leu2-3,212 をもち、そしてさらなる研
究のために選択される。
evisiae)株55.6B(cup1::URA3) とサッカロミセス・セレ
ビシエ(S.cerevisiae)株TR1456との接合及び銅感受性に
関するその胞子の分析 CUP1座の中に欠損のあるサッカロミセス・セレビシエ
(S.cerevisiae)株55.6B(MATa his3 leu2 trp1 ura3-52,
cup1::URA3;Thiele,D.J.et al.Science 231(1986),854-
856 を参照のこと) を、CUP1座の約3 コピー( すなわ
ち、タンデムに整列したCUP1遺伝子の6 コピー) を担持
する株TR1456(MATa leu2-3,212,ura3 Δ5 kex1 prb1 pr
c1) と接合させる。遺伝子型cup1::URA3/CUP1 の2 倍体
のヘテロ接合細胞を、この接合体から単離する。この2
倍体細胞から生じる4 倍体を、標準的な遺伝子技術[Met
hods in Yeast genetics 1986(Sherman F.,Fink G.R.,H
icks J.B.,eds.)Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.]
に従って分析する。それぞれの4 倍体の4 つの胞子の子
孫を、0 μM 、250 μM 、500 μM または1mM の硫酸銅
を補ったYPD 寒天プレート(2回蒸留した水1 リッター当
たり、10g の酵母エキス、20g のペプトン、20g のグル
コース及び25g の寒天) 上での増殖能力についてテスト
する。破壊されたcup1::URA3遺伝子を受け継いでいる胞
子が、銅寒天上で僅かに増殖する子孫を作るのに対し、
無傷のCUP1遺伝子を受け継いでいる胞子は、銅寒天上で
活発に増殖する子孫を作る。幾つかの完全な四分子の2
つの銅感受性胞子の子孫を、株TR1456とのそれらの接合
能力についてテストする。適切な接合型の胞子の子孫
を、TR1456と接合させ、そして遺伝子型cup1::URA3/CUP
1 の2倍体ヘテロ接合細胞を、この接合体から単離す
る。上記2 倍体細胞から生じた四分子を分析し、そして
その胞子を、前記のように硫酸銅の感受性についてテス
トする。約50の完全な四分子から得られた銅感受性コロ
ニーを、SD寒天( 水1 リッター当たり、アミノ酸を含ま
ない6.7gのBacto 酵母ナイトロジェンベース、20gのグ
ルコース及び25g の寒天) 上、並びに200 μM のロイシ
ンを補ったSD寒天上での増殖についてテストする。この
SDプレート上で増殖しないが、200 μM のロイシンを補
ったSD寒天上では増殖するコロニーは、遺伝子型cup1::
URA3,HIS3,TRP1,leu2-3,212 をもち、そしてさらなる研
究のために選択される。
【００４９】例7: プロテアーゼyscY及びプロテアーゼ
ysc αの追加の欠損に関する確認cup1::URA3突然変異体
の分類 例6 の下で開示されたように得られたサッカロミセス・
セレビシエ(S.cerevisiae)cup1::URA3突然変異体を、KE
X1及びPRC1遺伝子によりコードされるプロテアーゼの欠
損に関して、さらに分類する。KEX1遺伝子内に欠損のあ
るコロニーを、それらのα- 因子分泌能力の減少に基づ
いて同定する。野生型KEX1遺伝子を担持するコロニーと
kex1遺伝子において突然変異誘発されたコロニーとの間
を区別するために使用される手順の詳細な説明について
は、欧州特許出願第341215号、文書中の例 1として見い
だすことができる。上記PRC1遺伝子内欠損コロニーを、
PRC1遺伝子の生成物、すなわちプロテアーゼyscYの蛋白
分解活性を測定する生化学的なテストにより同定する。
このテストは、欧州特許出願第341215号に記載されてい
る。遺伝子型cup1::URA3 kex1 prc1 leu2-3,212 の単一
コロニーを拾い上げ、そしてサッカロミセス・セレビシ
エ(Saccharomyces cerevisiae)HT462/TH3 と称する。
ysc αの追加の欠損に関する確認cup1::URA3突然変異体
の分類 例6 の下で開示されたように得られたサッカロミセス・
セレビシエ(S.cerevisiae)cup1::URA3突然変異体を、KE
X1及びPRC1遺伝子によりコードされるプロテアーゼの欠
損に関して、さらに分類する。KEX1遺伝子内に欠損のあ
るコロニーを、それらのα- 因子分泌能力の減少に基づ
いて同定する。野生型KEX1遺伝子を担持するコロニーと
kex1遺伝子において突然変異誘発されたコロニーとの間
を区別するために使用される手順の詳細な説明について
は、欧州特許出願第341215号、文書中の例 1として見い
だすことができる。上記PRC1遺伝子内欠損コロニーを、
PRC1遺伝子の生成物、すなわちプロテアーゼyscYの蛋白
分解活性を測定する生化学的なテストにより同定する。
このテストは、欧州特許出願第341215号に記載されてい
る。遺伝子型cup1::URA3 kex1 prc1 leu2-3,212 の単一
コロニーを拾い上げ、そしてサッカロミセス・セレビシ
エ(Saccharomyces cerevisiae)HT462/TH3 と称する。
【００５０】例8: プラスミドpDP34/GAPFL-YHIR、pHE1
11、pHE112R 及びpFY56 による、株TR1456、TR1631及び
HT462/TH3 の形質転換 プラスミドpPFY56、pDP34/GAPFL-YHIR、pHE111及びpHE1
12R を、宿主株TR1456、TR1631及びHT462 中に、Hinnen
et al. により記載された形質転換手順書（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 75(1978),1929) を使用して形質転換す
る。この手順のさらなる詳細は、欧州特許出願第341 21
5 号中に記載されている。最適濃度( 株TR1456、1631)
の又は最適濃度以下( 株HT462)のロイシンを補われた酵
母最小培地上で、形質転換酵母細胞を選択する。単一の
形質転換酵母コロニーを単離し、そして、サッカロミセ
ス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) TR1456/pD
P34/GAPFL-YHIR サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) TR1456/pPFY56 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) HT462/pDP34/GAPFL-YHIR サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) HT462/pPFY56 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) HT462/pHE111 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) HT462/pHE112R サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) TR1631/pDP34/GAPFL-YHIR サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) TR1631/pPFY56 と称する。
11、pHE112R 及びpFY56 による、株TR1456、TR1631及び
HT462/TH3 の形質転換 プラスミドpPFY56、pDP34/GAPFL-YHIR、pHE111及びpHE1
12R を、宿主株TR1456、TR1631及びHT462 中に、Hinnen
et al. により記載された形質転換手順書（Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 75(1978),1929) を使用して形質転換す
る。この手順のさらなる詳細は、欧州特許出願第341 21
5 号中に記載されている。最適濃度( 株TR1456、1631)
の又は最適濃度以下( 株HT462)のロイシンを補われた酵
母最小培地上で、形質転換酵母細胞を選択する。単一の
形質転換酵母コロニーを単離し、そして、サッカロミセ
ス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) TR1456/pD
P34/GAPFL-YHIR サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) TR1456/pPFY56 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) HT462/pDP34/GAPFL-YHIR サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) HT462/pPFY56 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) HT462/pHE111 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) HT462/pHE112R サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) TR1631/pDP34/GAPFL-YHIR サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) TR1631/pPFY56 と称する。
【００５１】例 9: プラスミドpDP34/GAPFL-YHIR、又は
pPFY56、又はpHE111、又はpHE112R により形質転換され
たHT462 株によるデスルファトヒルジンの製造及び複合
培地中での振とうフラスコ内での増殖 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)HT462/pDP34/GAPFL-YHIR、又はHT462/pPFY56、又はHT
462/pHE111、又はHT462/pHE112R の細胞を、 Difco 酵母ナイトロジェンベース ( アミノ酸の含まない) 6.7 L-アスパラギン 10 L-ヒスチジン 1 グルコース 20 L-ロイシン 0.02 (g/l) から成る20mlの合成培地内で、2 つの連続する前
培養において、それぞれ増殖させる。上記培地のpHを5.
8 に調整する。第一の前培養を、28℃で60時間、そして
180r.p.m.で実施する。第二の前培養を、第一前培養の
2%( 体積対体積) で接種し、そして28℃で24時間、そし
て180r.p.m. で実施する。主培養の培地は、 ペプトン 5 イースト抽出物 10 グルコース 20 シュクロース 40 硫酸アンモニウム 3 リン酸2 水素カリウム 2 硫酸マグネシウム7 水和物 0.5 塩化ナトリウム 0.1 塩化カルシウム 0.1 ビオチン 10 -5 (g/l) から成る。主培養(100ml培地) を、約106 細胞/m
l で接種し、そして28℃で72時間、そして180r.p.m. で
インキュベートする。接種直後に、無菌硫酸銅を、所望
の濃度で添加する。この発酵の終了時に、この培養液の
一部分を取り出し、遠心分離によりその細胞を除去し、
そしてこの培養液の上澄を、欧州特許出願第340 170 号
中に記載したようにデスルファトヒルジンについて分析
する。結果を以下の表 1に示す。
pPFY56、又はpHE111、又はpHE112R により形質転換され
たHT462 株によるデスルファトヒルジンの製造及び複合
培地中での振とうフラスコ内での増殖 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)HT462/pDP34/GAPFL-YHIR、又はHT462/pPFY56、又はHT
462/pHE111、又はHT462/pHE112R の細胞を、 Difco 酵母ナイトロジェンベース ( アミノ酸の含まない) 6.7 L-アスパラギン 10 L-ヒスチジン 1 グルコース 20 L-ロイシン 0.02 (g/l) から成る20mlの合成培地内で、2 つの連続する前
培養において、それぞれ増殖させる。上記培地のpHを5.
8 に調整する。第一の前培養を、28℃で60時間、そして
180r.p.m.で実施する。第二の前培養を、第一前培養の
2%( 体積対体積) で接種し、そして28℃で24時間、そし
て180r.p.m. で実施する。主培養の培地は、 ペプトン 5 イースト抽出物 10 グルコース 20 シュクロース 40 硫酸アンモニウム 3 リン酸2 水素カリウム 2 硫酸マグネシウム7 水和物 0.5 塩化ナトリウム 0.1 塩化カルシウム 0.1 ビオチン 10 -5 (g/l) から成る。主培養(100ml培地) を、約106 細胞/m
l で接種し、そして28℃で72時間、そして180r.p.m. で
インキュベートする。接種直後に、無菌硫酸銅を、所望
の濃度で添加する。この発酵の終了時に、この培養液の
一部分を取り出し、遠心分離によりその細胞を除去し、
そしてこの培養液の上澄を、欧州特許出願第340 170 号
中に記載したようにデスルファトヒルジンについて分析
する。結果を以下の表 1に示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】例 10: 各種銅濃度を提供された複合培地
上での株HT462/pHE111及びHT462/pHE112R の増殖の間の
プラスミドpHE111及びpHE112R の***安定性 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) HT462/pHE111及びサッカロミセス・セレビシエ(Sac
charomyces cerevisiae) HT462/pHE112R の細胞を、例
9に記載したように、20mlの合成培地の2 つの連続した
前培養において、それぞれ増殖させる。次に、それら
を、例 9中に記載した複合培地に、約106細胞/ mlの初
期細胞密度で移す。28℃で72時間、そして180r.p.m. で
インキュベートした後、その培養液をNaClの滅菌溶液(9
g/水1 l)で希釈し、そして適切な容量を、YPD-寒天( 水
1l中、10g イースト抽出物、10g ペプトン、20g グルコ
ース、30g 寒天) 上にプレーティングする。このコロニ
ーを、2mM の硫酸銅を補われたYPD-寒天上にレプリカ・
プレーティングする。プラスミドを有する細胞から得ら
れたコロニーは、この基質上で増殖可能であり、一方、
このプラスミドを欠いた細胞から得られたコロニーは、
死滅するであろう。それ故、プラスミドを有する細胞の
パーセンテージは、2mM の硫酸銅を含むか又は含まない
寒天上で、そのコロニー数を比較することにより計算す
ることができる。結果を以下の表 2中に示す。
上での株HT462/pHE111及びHT462/pHE112R の増殖の間の
プラスミドpHE111及びpHE112R の***安定性 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e) HT462/pHE111及びサッカロミセス・セレビシエ(Sac
charomyces cerevisiae) HT462/pHE112R の細胞を、例
9に記載したように、20mlの合成培地の2 つの連続した
前培養において、それぞれ増殖させる。次に、それら
を、例 9中に記載した複合培地に、約106細胞/ mlの初
期細胞密度で移す。28℃で72時間、そして180r.p.m. で
インキュベートした後、その培養液をNaClの滅菌溶液(9
g/水1 l)で希釈し、そして適切な容量を、YPD-寒天( 水
1l中、10g イースト抽出物、10g ペプトン、20g グルコ
ース、30g 寒天) 上にプレーティングする。このコロニ
ーを、2mM の硫酸銅を補われたYPD-寒天上にレプリカ・
プレーティングする。プラスミドを有する細胞から得ら
れたコロニーは、この基質上で増殖可能であり、一方、
このプラスミドを欠いた細胞から得られたコロニーは、
死滅するであろう。それ故、プラスミドを有する細胞の
パーセンテージは、2mM の硫酸銅を含むか又は含まない
寒天上で、そのコロニー数を比較することにより計算す
ることができる。結果を以下の表 2中に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】例11: プラスミドpDP34/GAPFL-YHIR又はpP
FY56により形質転換されたTR1456株及びTR1631株による
デスルファトヒルジンの製造及び複合培地中での振とう
フラスコ内での増殖 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)TR1456(CUP1 遺伝子の約6 個の染色体コピーを含む)
、又はTR1631( 約20個のCUP1コピーを含む) を、プラ
スミドpPFY56又はDP34/GAPFL-YHIR で、先に記載したよ
うに形質転換する。また、HT462/TH3 株を、pHE111で形
質転換する。形質転換株を、最小培地中での2 つの連続
した前培養、その後の例9 中に記載したような複合培地
中での主培養において、それぞれ増殖させる。主培養の
接種直後に、無菌硫酸銅を、所望の濃度で添加する。こ
の発酵の終了時に、この培養液の一部分を取り出し、遠
心分離によりその細胞を除去し、そしてこの培養液の上
澄を、( 欧州特許出願第340170 号中に記載したように)
デスルファトヒルジンについて分析する。結果を以下
の表 3に示す。
FY56により形質転換されたTR1456株及びTR1631株による
デスルファトヒルジンの製造及び複合培地中での振とう
フラスコ内での増殖 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisia
e)TR1456(CUP1 遺伝子の約6 個の染色体コピーを含む)
、又はTR1631( 約20個のCUP1コピーを含む) を、プラ
スミドpPFY56又はDP34/GAPFL-YHIR で、先に記載したよ
うに形質転換する。また、HT462/TH3 株を、pHE111で形
質転換する。形質転換株を、最小培地中での2 つの連続
した前培養、その後の例9 中に記載したような複合培地
中での主培養において、それぞれ増殖させる。主培養の
接種直後に、無菌硫酸銅を、所望の濃度で添加する。こ
の発酵の終了時に、この培養液の一部分を取り出し、遠
心分離によりその細胞を除去し、そしてこの培養液の上
澄を、( 欧州特許出願第340170 号中に記載したように)
デスルファトヒルジンについて分析する。結果を以下
の表 3に示す。
【００５６】
【表３】
【００５７】上記の結果は、酵母メタロチオネイン蛋白
が多数の染色体コピー(TR1631)から過剰発現されたと
き、CUP1-YHIR(GAPFL-YHIRではない) カセットの生産性
が劣ることを示している。反対に、マルチ・コピー・プ
ラスミドからの( 株HT462/pHE111) 酵母メタロチオネイ
ンの発現は、ジルジンの収量を増加させる。上記発現プ
ラスミド中のCUP1の組み込みは、より高いヒルジンの収
率を与え、その染色体からのCUP1の過剰発現は、実際に
はそのタイターを減少させる。上記発現プラスミド中へ
組み込まれたCUP1のコピーは、良好な生産性が達成でき
るより広範囲の銅濃度をも、もたらす( 表1 及び表3)。
が多数の染色体コピー(TR1631)から過剰発現されたと
き、CUP1-YHIR(GAPFL-YHIRではない) カセットの生産性
が劣ることを示している。反対に、マルチ・コピー・プ
ラスミドからの( 株HT462/pHE111) 酵母メタロチオネイ
ンの発現は、ジルジンの収量を増加させる。上記発現プ
ラスミド中のCUP1の組み込みは、より高いヒルジンの収
率を与え、その染色体からのCUP1の過剰発現は、実際に
はそのタイターを減少させる。上記発現プラスミド中へ
組み込まれたCUP1のコピーは、良好な生産性が達成でき
るより広範囲の銅濃度をも、もたらす( 表1 及び表3)。
【００５８】例 12: pFBY23 の構築 CA緩衝液(20mM のトリス( ヒドロキシメチル) アミノメ
タン;7mMの MgCl 2 ;5mMのジチオトレイトール;100mMの
KCl;HCl でpH 7.5に) 中のFspIにより、2 μgのpFBY2
を完全に解裂する。この制限エンドヌクレアーゼを、65
℃で10分間の加熱により不活性化する。水の添加により
その容積を倍にし、そしてそのDNA フラグメントを、0.
05mMのdATP、dCTP、dGTP及びdTTPのそれぞれの存在中、
37℃で30分間、T4ポリメラーゼの1 ユニットにより、平
滑末端とする。この酵素を、65℃で10分間の加熱により
不活性化する。エタノール沈殿の後、このDNA を、Hind
III 及びEcoRI により再び切断する。これらのフラグメ
ントを、TAE 緩衝液(40mMのトリス( ヒドロキシメチル)
アミノメタン;2mMのエチレンジアミンテトラ酢酸(2ナ
トリウム塩);酢酸でpH 7.6に) 中の2%LGT ゲル( 低ゲル
化温度のアガロース) 上で分離する。170 塩基対及び52
3 塩基対のフラグメントを切り出し、そしてそのDNA を
ElutipD クロマトグラフィーにより精製する。2 μg の
pTZ18Rを、CA緩衝液中でEcoRI 及びHindIII により完全
に解裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.
8%LTG ゲル上で分離する。2.8k塩基対のバンドを切り出
し、そのDNA をElutipD クロマトグラフィーにより精製
する。
タン;7mMの MgCl 2 ;5mMのジチオトレイトール;100mMの
KCl;HCl でpH 7.5に) 中のFspIにより、2 μgのpFBY2
を完全に解裂する。この制限エンドヌクレアーゼを、65
℃で10分間の加熱により不活性化する。水の添加により
その容積を倍にし、そしてそのDNA フラグメントを、0.
05mMのdATP、dCTP、dGTP及びdTTPのそれぞれの存在中、
37℃で30分間、T4ポリメラーゼの1 ユニットにより、平
滑末端とする。この酵素を、65℃で10分間の加熱により
不活性化する。エタノール沈殿の後、このDNA を、Hind
III 及びEcoRI により再び切断する。これらのフラグメ
ントを、TAE 緩衝液(40mMのトリス( ヒドロキシメチル)
アミノメタン;2mMのエチレンジアミンテトラ酢酸(2ナ
トリウム塩);酢酸でpH 7.6に) 中の2%LGT ゲル( 低ゲル
化温度のアガロース) 上で分離する。170 塩基対及び52
3 塩基対のフラグメントを切り出し、そしてそのDNA を
ElutipD クロマトグラフィーにより精製する。2 μg の
pTZ18Rを、CA緩衝液中でEcoRI 及びHindIII により完全
に解裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.
8%LTG ゲル上で分離する。2.8k塩基対のバンドを切り出
し、そのDNA をElutipD クロマトグラフィーにより精製
する。
【００５９】調製されたフラグメントのそれぞれの約20
ngを、室温で3 時間、0.5 ユニットのT4リガーゼによ
り、10pMの配列GGGATCCCのリン酸化されていないBamHI
リンカー及び1mM のATP 及び連結緩衝液と一緒に連結す
る。この連結混合物を、40μl のコンピテントな大腸菌
(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使用し、そ
してアンピシリン、Xgal及びIPTGを含む2YT プレート(
水1 リッター当たり16g のトリプトン;10gの酵母エキ
ス;10gのNaCl) 上にプレーティングする。37℃で16時間
のインキュベーション後、白いコロニーを拾い上げ、そ
してその正しい挿入物の存在を確認するためのEcoRI Hi
ndIII の二重処理、及び前のFspI部位内のBamHI リンカ
ーを表すためのHindIII/BamHI の二重処理を使用して、
ミニスクリーニングする。
ngを、室温で3 時間、0.5 ユニットのT4リガーゼによ
り、10pMの配列GGGATCCCのリン酸化されていないBamHI
リンカー及び1mM のATP 及び連結緩衝液と一緒に連結す
る。この連結混合物を、40μl のコンピテントな大腸菌
(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使用し、そ
してアンピシリン、Xgal及びIPTGを含む2YT プレート(
水1 リッター当たり16g のトリプトン;10gの酵母エキ
ス;10gのNaCl) 上にプレーティングする。37℃で16時間
のインキュベーション後、白いコロニーを拾い上げ、そ
してその正しい挿入物の存在を確認するためのEcoRI Hi
ndIII の二重処理、及び前のFspI部位内のBamHI リンカ
ーを表すためのHindIII/BamHI の二重処理を使用して、
ミニスクリーニングする。
【００６０】例 13: pFBY24の構築 2 μg のpFBY23を、CA緩衝液中でHindIII 及びEcoRI に
より完全に解裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝
液中の0.8%LTG ゲル上で分離する。701 塩基対のバンド
を切り出し、そのDNA をElutipD クロマトグラフィーに
より精製する。2 μg のpFBY2 を、CA緩衝液中でHindII
I 及びPstIにより完全に解裂する。これらのフラグメン
トをTAE 緩衝液中の0.8%LTG ゲル上で分離する。3.8k塩
基対のフラグメントを切り出し、そのDNA をElutipD ク
ロマトグラフィーにより精製する。2 μg のpFBY2 を、
CA緩衝液中でPstI及びXbalI により完全に解裂する。こ
れらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%LTG ゲル上で
分離する。1.95k 塩基対のフラグメントを切り出し、そ
のDNA をElutipD クロマトグラフィーにより精製する。
2 μg のpFBY2 を、CA緩衝液中でXbalI 及びEcoRI によ
り完全に解裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝液
中の0.8%LTG ゲル上で分離する。2.9k塩基対のフラグメ
ントを切り出し、そのDNA をElutipD クロマトグラフィ
ーにより精製する。1mM のATP 及び連結緩衝液の存在
中、室温で3 時間、0.5 ユニットのT4リガーゼにより、
用意したフラグメントのそれぞれの約20ngを共に連結す
る。この連結混合物を、40μl のコンピテントな大腸菌
(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使用し、そ
してアンピシリン、Xgal及びIPTGを含む2YT プレート上
でプレーティングする。37℃で16時間のインキュベーシ
ョン後、白いコロニーを拾い上げ、そしてその正しい挿
入物の存在を確認するためのEcoRI HindIII及びPstI Xb
alIの二重処理、並びに新規のBamHI 部位の存在を表す
ためのBamHIを使用して、ミニスクリーニングする。pFB
Y24は、プラスミドpTZ18R及び直接的に繰替えされたFRT
部位により分割された2 μプラスミドの完全な配列を
もつpFBY2 と同一である。但し、FLP 遺伝子の3'末端に
おいてFspI部位中にBamHI を挿入してある。
より完全に解裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝
液中の0.8%LTG ゲル上で分離する。701 塩基対のバンド
を切り出し、そのDNA をElutipD クロマトグラフィーに
より精製する。2 μg のpFBY2 を、CA緩衝液中でHindII
I 及びPstIにより完全に解裂する。これらのフラグメン
トをTAE 緩衝液中の0.8%LTG ゲル上で分離する。3.8k塩
基対のフラグメントを切り出し、そのDNA をElutipD ク
ロマトグラフィーにより精製する。2 μg のpFBY2 を、
CA緩衝液中でPstI及びXbalI により完全に解裂する。こ
れらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%LTG ゲル上で
分離する。1.95k 塩基対のフラグメントを切り出し、そ
のDNA をElutipD クロマトグラフィーにより精製する。
2 μg のpFBY2 を、CA緩衝液中でXbalI 及びEcoRI によ
り完全に解裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝液
中の0.8%LTG ゲル上で分離する。2.9k塩基対のフラグメ
ントを切り出し、そのDNA をElutipD クロマトグラフィ
ーにより精製する。1mM のATP 及び連結緩衝液の存在
中、室温で3 時間、0.5 ユニットのT4リガーゼにより、
用意したフラグメントのそれぞれの約20ngを共に連結す
る。この連結混合物を、40μl のコンピテントな大腸菌
(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使用し、そ
してアンピシリン、Xgal及びIPTGを含む2YT プレート上
でプレーティングする。37℃で16時間のインキュベーシ
ョン後、白いコロニーを拾い上げ、そしてその正しい挿
入物の存在を確認するためのEcoRI HindIII及びPstI Xb
alIの二重処理、並びに新規のBamHI 部位の存在を表す
ためのBamHIを使用して、ミニスクリーニングする。pFB
Y24は、プラスミドpTZ18R及び直接的に繰替えされたFRT
部位により分割された2 μプラスミドの完全な配列を
もつpFBY2 と同一である。但し、FLP 遺伝子の3'末端に
おいてFspI部位中にBamHI を挿入してある。
【００６１】例 14: pFBY74 の構築 2 μg のpFBY29を、CA緩衝液中でBamHI により完全に解
裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%LT
G ゲル上で分離する。2.0k塩基対のバンドを切り出し、
そのDNA をElutipD クロマトグラフィーにより精製す
る。2 μg のpFBY24を、CA緩衝液中でBamHI により完全
に解裂する。そのベクターの自己連結を防止するため
に、65℃で30分間、BAP 緩衝液(50mM のトリス( ヒドロ
キシメチル) アミノメタン;50mM のNaCl;HClでpH8.0
に) 中の500 ユニットのBAP により、5'のリン酸塩基を
取り除く。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%
LTG ゲル上で分離する。9.3k塩基対のバンドを切り出
し、そのDNA をElutipD クロマトグラフィーにより精製
する。1mM のATP 及び連結緩衝液の存在中、室温で3 時
間、0.5 ユニットのT4リガーゼにより、用意したフラグ
メントのそれぞれ約20ngを共に連結する。この連結混合
物を、40μl のコンピテントな大腸菌(E.coli)DH5 αF'
細胞を形質転換するために使用し、そしてアンピシリ
ン、Xgal及びIPTGを含む2YT プレート上でプレーティン
グする。37℃で16時間のインキュベーション後、白いコ
ロニーを拾い上げ、そしてその正しい挿入物の存在及び
方向を確認するためのBamHI並びにSalI XbalIの二重処
理を使用して、ミニスクリーニングする。そのLEU2遺伝
子は、pFBY74のampRと同じ方向にある。pFBY74は、酵母
内でバクテリアの配列を失った2 ミクロンのプラスミド
を含んでいる対称なLEU2である。
裂する。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%LT
G ゲル上で分離する。2.0k塩基対のバンドを切り出し、
そのDNA をElutipD クロマトグラフィーにより精製す
る。2 μg のpFBY24を、CA緩衝液中でBamHI により完全
に解裂する。そのベクターの自己連結を防止するため
に、65℃で30分間、BAP 緩衝液(50mM のトリス( ヒドロ
キシメチル) アミノメタン;50mM のNaCl;HClでpH8.0
に) 中の500 ユニットのBAP により、5'のリン酸塩基を
取り除く。これらのフラグメントをTAE 緩衝液中の0.8%
LTG ゲル上で分離する。9.3k塩基対のバンドを切り出
し、そのDNA をElutipD クロマトグラフィーにより精製
する。1mM のATP 及び連結緩衝液の存在中、室温で3 時
間、0.5 ユニットのT4リガーゼにより、用意したフラグ
メントのそれぞれ約20ngを共に連結する。この連結混合
物を、40μl のコンピテントな大腸菌(E.coli)DH5 αF'
細胞を形質転換するために使用し、そしてアンピシリ
ン、Xgal及びIPTGを含む2YT プレート上でプレーティン
グする。37℃で16時間のインキュベーション後、白いコ
ロニーを拾い上げ、そしてその正しい挿入物の存在及び
方向を確認するためのBamHI並びにSalI XbalIの二重処
理を使用して、ミニスクリーニングする。そのLEU2遺伝
子は、pFBY74のampRと同じ方向にある。pFBY74は、酵母
内でバクテリアの配列を失った2 ミクロンのプラスミド
を含んでいる対称なLEU2である。
【００６２】例 15: プラスミドpMK18 及びpMK19 の構
築: 酵母内でバクテリアの配列を欠き、そしてCUP1p-ヒ
ルジン発現カセット及びCUP1遺伝子を含む2 つの対称な
2 ミクロンプラスミド 2 μg のプラスミドpFBY4 を、EcoRI により解裂する。
得られたDNA-フラグメントを分離用0.8%アガロースゲル
上で分離し、切り出し、そしてElutipD クロマトグラフ
ィー(Schleicher und Schuell,Dassel,Germany) により
精製する。このフラグメントを、次に0.05mMのdATP、dC
TP、dGTP及びdTTPのそれぞれの存在中、37℃で30分間、
1 ユニットのT4ポリメラーゼにより平滑末端とする。こ
のポリメラーゼを、65℃で10分間、加熱により不活性化
する。室温で3 時間、0.5 ユニットのT4リガーゼによ
り、0.4 ピコモルの配列GGTCGACCのリン酸化されていな
いSalIリンカー及び1mM のATP と一緒に、約30ngのフラ
グメントを連結する。この連結混合物を、コンピテント
な大腸菌(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使
用し(Hanahan,D.:J.Mol.Biol.166:557(1983)) 、そして
その細胞を、アンピシリンを添加したLB培地上にプレー
ティングする。アンピシリン耐性コロニーを拾い上げ、
そしてその前のEcoRI 部位内にSalIリンカーを示すため
のSalIを用いて、それらのプラスミドDNA を切断するこ
とにより分析を行う。得られたプラスミドを、pMK2と称
する。
築: 酵母内でバクテリアの配列を欠き、そしてCUP1p-ヒ
ルジン発現カセット及びCUP1遺伝子を含む2 つの対称な
2 ミクロンプラスミド 2 μg のプラスミドpFBY4 を、EcoRI により解裂する。
得られたDNA-フラグメントを分離用0.8%アガロースゲル
上で分離し、切り出し、そしてElutipD クロマトグラフ
ィー(Schleicher und Schuell,Dassel,Germany) により
精製する。このフラグメントを、次に0.05mMのdATP、dC
TP、dGTP及びdTTPのそれぞれの存在中、37℃で30分間、
1 ユニットのT4ポリメラーゼにより平滑末端とする。こ
のポリメラーゼを、65℃で10分間、加熱により不活性化
する。室温で3 時間、0.5 ユニットのT4リガーゼによ
り、0.4 ピコモルの配列GGTCGACCのリン酸化されていな
いSalIリンカー及び1mM のATP と一緒に、約30ngのフラ
グメントを連結する。この連結混合物を、コンピテント
な大腸菌(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使
用し(Hanahan,D.:J.Mol.Biol.166:557(1983)) 、そして
その細胞を、アンピシリンを添加したLB培地上にプレー
ティングする。アンピシリン耐性コロニーを拾い上げ、
そしてその前のEcoRI 部位内にSalIリンカーを示すため
のSalIを用いて、それらのプラスミドDNA を切断するこ
とにより分析を行う。得られたプラスミドを、pMK2と称
する。
【００６３】2 μg のpMK2をBamHI により切断する。そ
の5'のリン酸塩基を、65℃で30分間、BAP-緩衝液中のBA
P(ウシ・アルカリ性ホスファターゼ) の500 ユニットに
より除去する。このフラグメントを分離用0.8%アガロー
スゲル上で分離し、切り出し、そしてElutipD クロマト
グラフィーにより精製する。このフラグメントを、次に
先に記載したように、平滑末端とする。 2μg のpPFY53
をSalIにより解裂する。GAPFL-ヒルジン発現カセットを
含む1.1kb のフラグメントを、前記のように、分離用0.
8%アガロースゲル上で分離し、精製し、そしてT4ポリメ
ラーゼにより平滑末端とする。この調製されたフラグメ
ントのそれぞれ約22ngを一緒に結合し、そして、この連
結混合物を、先に記載したようなコンピテントな大腸菌
(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使用する。
アンピシリン耐性コロニーを拾い上げ、そして正しい挿
入物の存在を確認するため、及び方向を決定するため
に、PstIを用いて分析する。生成されたプラスミドを、
pMK12 及びpMK13 と呼ぶ。pMK12 は、URA3遺伝子と比べ
て逆方向にあるGAPFLp- ヒルジン発現カセットを含む
が、一方、pMK13 は、これと同方向にあるそれぞれの遺
伝子を含む。
の5'のリン酸塩基を、65℃で30分間、BAP-緩衝液中のBA
P(ウシ・アルカリ性ホスファターゼ) の500 ユニットに
より除去する。このフラグメントを分離用0.8%アガロー
スゲル上で分離し、切り出し、そしてElutipD クロマト
グラフィーにより精製する。このフラグメントを、次に
先に記載したように、平滑末端とする。 2μg のpPFY53
をSalIにより解裂する。GAPFL-ヒルジン発現カセットを
含む1.1kb のフラグメントを、前記のように、分離用0.
8%アガロースゲル上で分離し、精製し、そしてT4ポリメ
ラーゼにより平滑末端とする。この調製されたフラグメ
ントのそれぞれ約22ngを一緒に結合し、そして、この連
結混合物を、先に記載したようなコンピテントな大腸菌
(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使用する。
アンピシリン耐性コロニーを拾い上げ、そして正しい挿
入物の存在を確認するため、及び方向を決定するため
に、PstIを用いて分析する。生成されたプラスミドを、
pMK12 及びpMK13 と呼ぶ。pMK12 は、URA3遺伝子と比べ
て逆方向にあるGAPFLp- ヒルジン発現カセットを含む
が、一方、pMK13 は、これと同方向にあるそれぞれの遺
伝子を含む。
【００６４】2 μg のpFBY74をSnaBI により切断する。
前記のように、BAP により、5'のリン酸塩基を取り除
き、そして得られたDNA-フラグメントを0.8%アガロース
ゲル及びElutipD クロマトグラフィーを介して精製す
る。2 μg のpMK12 をSalIにより切断する。GAPFLp- ヒ
ルジン発現カセット及びURA3を含む2.3kb のフラグメン
トを、前記のように、ゲル精製し、そして平滑末端とす
る。切断されたpFBY74及びpMK12 フラグメントのそれぞ
れ約20ngを共に連結し、そして前記のように、コンピテ
ントDH5 αF'細胞に形質転換する。正しい挿入物を確認
するため、そしてその方向を決定するために、SalI及び
NcoIによりそれらのプラスミドDNA を切断して、アンピ
シリン耐性コロニーを分析する。2 つのプラスミドが得
られ、pMK14及びpMK15 と呼ぶ。これらの2 つのプラス
ミドの違いは、LEU2遺伝子と比べて、前者においては、
GAPFLp- ヒルジン発現カセットが逆であるのに、後者に
おいては、同じ方向をもつということである。
前記のように、BAP により、5'のリン酸塩基を取り除
き、そして得られたDNA-フラグメントを0.8%アガロース
ゲル及びElutipD クロマトグラフィーを介して精製す
る。2 μg のpMK12 をSalIにより切断する。GAPFLp- ヒ
ルジン発現カセット及びURA3を含む2.3kb のフラグメン
トを、前記のように、ゲル精製し、そして平滑末端とす
る。切断されたpFBY74及びpMK12 フラグメントのそれぞ
れ約20ngを共に連結し、そして前記のように、コンピテ
ントDH5 αF'細胞に形質転換する。正しい挿入物を確認
するため、そしてその方向を決定するために、SalI及び
NcoIによりそれらのプラスミドDNA を切断して、アンピ
シリン耐性コロニーを分析する。2 つのプラスミドが得
られ、pMK14及びpMK15 と呼ぶ。これらの2 つのプラス
ミドの違いは、LEU2遺伝子と比べて、前者においては、
GAPFLp- ヒルジン発現カセットが逆であるのに、後者に
おいては、同じ方向をもつということである。
【００６５】2 μg のpMK14 をSalIにより切断する。5'
リン酸基をBAP により除去し、そしてDNA フラグメント
を先に記載したようにゲル精製する。このフラグメント
を、次にT4ポリメラーゼにより平滑末端とする。2 μg
のpHE105( 例1 を参照のこと) をKpnIにより切断する。
そのプロモーターを含んでいるCUP1遺伝子を含む940塩
基対のフラグメントを、1%アガロース・ゲル上で分離
し、精製し、そして先に記載したようにT4ポリメラーゼ
により平滑末端とする。この調製されたフラグメントの
それぞれ約20ngを、先に記載したようなT4リガーゼによ
り一緒に結合する。連結混合物を、コンピテントDH5 α
F'細胞を形質転換するために使用する。アンピシリン耐
性コロニーを拾い上げ、そしてそれらのプラスミドDNA
を、正しい挿入物及びその方向の存在を確認するため
に、BamHI を使用して分析する。得られたプラスミド
を、pMK18 及びpMK19(図4 及び図5)と称する。これらの
2 つのプラスミドの違いは、上記のGAPFLp- ヒルジン発
現カセットと比べて、前者においては、CUP1遺伝子が同
じ方向をもち、そして後者においては、逆方向をもつと
いうことである。
リン酸基をBAP により除去し、そしてDNA フラグメント
を先に記載したようにゲル精製する。このフラグメント
を、次にT4ポリメラーゼにより平滑末端とする。2 μg
のpHE105( 例1 を参照のこと) をKpnIにより切断する。
そのプロモーターを含んでいるCUP1遺伝子を含む940塩
基対のフラグメントを、1%アガロース・ゲル上で分離
し、精製し、そして先に記載したようにT4ポリメラーゼ
により平滑末端とする。この調製されたフラグメントの
それぞれ約20ngを、先に記載したようなT4リガーゼによ
り一緒に結合する。連結混合物を、コンピテントDH5 α
F'細胞を形質転換するために使用する。アンピシリン耐
性コロニーを拾い上げ、そしてそれらのプラスミドDNA
を、正しい挿入物及びその方向の存在を確認するため
に、BamHI を使用して分析する。得られたプラスミド
を、pMK18 及びpMK19(図4 及び図5)と称する。これらの
2 つのプラスミドの違いは、上記のGAPFLp- ヒルジン発
現カセットと比べて、前者においては、CUP1遺伝子が同
じ方向をもち、そして後者においては、逆方向をもつと
いうことである。
【００６６】例 16: プラスミドpMK26 及びpMK27 の構
築: 酵母内でバクテリアの配列を欠き、そしてCUP1p-ヒ
ルジン発現カセット及びCUP1遺伝子を含む2 つの対称な
2 ミクロンプラスミド 2 μg のpMK2( 例15を参照のこと) をBamHI により切断
する。その5'のリン酸塩基を、65℃で30分間、BAP-緩衝
液中のBAP(ウシ・アルカリ性ホスファターゼ)の500 ユ
ニットにより除去する。このフラグメントを分離用0.8%
アガロースゲル上で分離し、切り出し、そしてElutipD
クロマトグラフィー(Schleicher und Schuell,Dassel,G
ermany) により精製する。このフラグメントを、その
後、0.05mMのdATP、dCTP、dGTP及びdTTPのそれぞれの存
在中、37℃で30分間、1 ユニットのT4ポリメラーゼによ
り平滑末端とする。このポリメラーゼを、65℃で10分
間、加熱のより不活性とする。2 μg のpPFY53( 例 2を
参照のこと) をSalIにより解裂する。CUP1p-ヒルジン発
現カセットを含む1.3kb のフラグメントを、前記のよう
に、0.8%アガロースゲル上で分離し、精製し、そしてT4
ポリメラーゼにより平滑末端とする。この調製されたフ
ラグメントのそれぞれ約20ngを、室温で3 時間、0.5 ユ
ニットのT4リガーゼにより、1mM のATP の存在中で一緒
に結合する。この連結混合物を、コンピテントな大腸菌
(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使用し(Han
ahan,D.:J.Mol.Biol.166:557(1983)) 、そしてその細胞
を、アンピシリンを添加したLB培地上にプレーティング
する。アンピシリン耐性コロニーを拾い上げ、そして正
しい挿入物の存在を確認するため、及び方向を決定する
ために、XbaIを用いて分析する。生成されたプラスミド
を、pMK3/1及びpMK3/2と呼ぶ。pMK3/1は、URA3遺伝子と
比べて同じ方向にあるCUP1p-ヒルジン発現カセットを含
むが、pMK3/2は、これと逆方向にあるそれぞれの遺伝子
を含む。
築: 酵母内でバクテリアの配列を欠き、そしてCUP1p-ヒ
ルジン発現カセット及びCUP1遺伝子を含む2 つの対称な
2 ミクロンプラスミド 2 μg のpMK2( 例15を参照のこと) をBamHI により切断
する。その5'のリン酸塩基を、65℃で30分間、BAP-緩衝
液中のBAP(ウシ・アルカリ性ホスファターゼ)の500 ユ
ニットにより除去する。このフラグメントを分離用0.8%
アガロースゲル上で分離し、切り出し、そしてElutipD
クロマトグラフィー(Schleicher und Schuell,Dassel,G
ermany) により精製する。このフラグメントを、その
後、0.05mMのdATP、dCTP、dGTP及びdTTPのそれぞれの存
在中、37℃で30分間、1 ユニットのT4ポリメラーゼによ
り平滑末端とする。このポリメラーゼを、65℃で10分
間、加熱のより不活性とする。2 μg のpPFY53( 例 2を
参照のこと) をSalIにより解裂する。CUP1p-ヒルジン発
現カセットを含む1.3kb のフラグメントを、前記のよう
に、0.8%アガロースゲル上で分離し、精製し、そしてT4
ポリメラーゼにより平滑末端とする。この調製されたフ
ラグメントのそれぞれ約20ngを、室温で3 時間、0.5 ユ
ニットのT4リガーゼにより、1mM のATP の存在中で一緒
に結合する。この連結混合物を、コンピテントな大腸菌
(E.coli)DH5 αF'細胞を形質転換するために使用し(Han
ahan,D.:J.Mol.Biol.166:557(1983)) 、そしてその細胞
を、アンピシリンを添加したLB培地上にプレーティング
する。アンピシリン耐性コロニーを拾い上げ、そして正
しい挿入物の存在を確認するため、及び方向を決定する
ために、XbaIを用いて分析する。生成されたプラスミド
を、pMK3/1及びpMK3/2と呼ぶ。pMK3/1は、URA3遺伝子と
比べて同じ方向にあるCUP1p-ヒルジン発現カセットを含
むが、pMK3/2は、これと逆方向にあるそれぞれの遺伝子
を含む。
【００６７】2 μg のpFBY74をSnaBI により切断する。
前記のように、BAP により、5'のリン酸基を取り除き、
そして得られたDNA-フラグメントを0.8%アガロースゲル
及びElutipD クロマトグラフィーを介して精製する。2
μg のpMK3/2をSalIにより切断する。CUP1p-ヒルジン発
現カセット及びURA3遺伝子を含む2.6kb のフラグメント
を、前記のように、ゲル精製し、そして平滑末端とす
る。切断されたpFBY74及びpMK3/2フラグメントのそれぞ
れ約20ngを共に連結し、そして前記のように、コンピテ
ントな大腸菌(E.coli)DH5 αF'細胞に形質転換する。正
しい挿入物を確認するため、及び方向を決定するため
に、SalI及びNcoIによりそれらのプラスミドDNA を切断
して、アンピシリン耐性コロニーを分析する。2 つのプ
ラスミドが得られ、pMK5x1及びpMK5x2と称する。これら
の2 つのプラスミドの違いは、そのLEU2遺伝子と比べ
て、前者においては、CUP1p-ヒルジン発現カセットが逆
であるのに、後者においては、同じ方向をもつというこ
とである。
前記のように、BAP により、5'のリン酸基を取り除き、
そして得られたDNA-フラグメントを0.8%アガロースゲル
及びElutipD クロマトグラフィーを介して精製する。2
μg のpMK3/2をSalIにより切断する。CUP1p-ヒルジン発
現カセット及びURA3遺伝子を含む2.6kb のフラグメント
を、前記のように、ゲル精製し、そして平滑末端とす
る。切断されたpFBY74及びpMK3/2フラグメントのそれぞ
れ約20ngを共に連結し、そして前記のように、コンピテ
ントな大腸菌(E.coli)DH5 αF'細胞に形質転換する。正
しい挿入物を確認するため、及び方向を決定するため
に、SalI及びNcoIによりそれらのプラスミドDNA を切断
して、アンピシリン耐性コロニーを分析する。2 つのプ
ラスミドが得られ、pMK5x1及びpMK5x2と称する。これら
の2 つのプラスミドの違いは、そのLEU2遺伝子と比べ
て、前者においては、CUP1p-ヒルジン発現カセットが逆
であるのに、後者においては、同じ方向をもつというこ
とである。
【００６８】2 μg のpMK5x1をSalIにより切断する。5'
リン酸基をBAP により除去し、そしてDNA フラグメント
を先に記載したようにゲル精製する。このフラグメント
を、次にT4ポリメラーゼにより平滑末端とする。2 μg
のpHE105( 例1 を参照のこと) をKpnIにより切断する。
そのプロモーターを含んでいるCUP1遺伝子を含む940塩
基対のフラグメントを、1%アガロース・ゲル上で分離
し、精製し、そして先に記載したようにT4ポリメラーゼ
により平滑末端とする。この調製されたフラグメントの
それぞれ約20ngを、先に記載したようなT4リガーゼによ
り一緒に結合する。連結混合物を、コンピテントDH5 α
F'細胞を形質転換するために使用する。アンピシリン耐
性コロニーを拾い上げ、そしてそれらのプラスミドDNA
を、正しい挿入物及びその方向の存在を確認するため
に、BamHI を使用して分析する。得られたプラスミド
を、pMK26 及びpMK27(図6 及び図7)と称する。これらの
2 つのプラスミドの違いは、上記のCUP1p-ヒルジン発現
カセットと比べて、前者においては、CUP1遺伝子が同じ
方向をもち、そして後者においては、逆方向をもつとい
うことである。
リン酸基をBAP により除去し、そしてDNA フラグメント
を先に記載したようにゲル精製する。このフラグメント
を、次にT4ポリメラーゼにより平滑末端とする。2 μg
のpHE105( 例1 を参照のこと) をKpnIにより切断する。
そのプロモーターを含んでいるCUP1遺伝子を含む940塩
基対のフラグメントを、1%アガロース・ゲル上で分離
し、精製し、そして先に記載したようにT4ポリメラーゼ
により平滑末端とする。この調製されたフラグメントの
それぞれ約20ngを、先に記載したようなT4リガーゼによ
り一緒に結合する。連結混合物を、コンピテントDH5 α
F'細胞を形質転換するために使用する。アンピシリン耐
性コロニーを拾い上げ、そしてそれらのプラスミドDNA
を、正しい挿入物及びその方向の存在を確認するため
に、BamHI を使用して分析する。得られたプラスミド
を、pMK26 及びpMK27(図6 及び図7)と称する。これらの
2 つのプラスミドの違いは、上記のCUP1p-ヒルジン発現
カセットと比べて、前者においては、CUP1遺伝子が同じ
方向をもち、そして後者においては、逆方向をもつとい
うことである。
【００６９】微生物の寄託 以下の微生物株を、the Deuiche Sammlung von Mikroor
ganismen(DSM),Mascheroder Weg 1b,D-3300 Braunschwe
igに寄託した( その寄託番号及び寄託日を以下に示す)
。 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)H449 DSM 4413 1988 年 2月18日 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)HT462/TH3 DSM 7190 1992 年 7月22日 大腸菌(E.coli) DH5αF'/pDP34 DSM 4473 1988 年 3月14日 大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY2 DSM 6271 1990 年12月14日 大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY4 DSM 6272 1990 年12月14日 大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY5 DSM 6273 1990 年12月14日 大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY29 DSM 6275 1990 年12月14日
ganismen(DSM),Mascheroder Weg 1b,D-3300 Braunschwe
igに寄託した( その寄託番号及び寄託日を以下に示す)
。 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)H449 DSM 4413 1988 年 2月18日 サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)HT462/TH3 DSM 7190 1992 年 7月22日 大腸菌(E.coli) DH5αF'/pDP34 DSM 4473 1988 年 3月14日 大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY2 DSM 6271 1990 年12月14日 大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY4 DSM 6272 1990 年12月14日 大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY5 DSM 6273 1990 年12月14日 大腸菌(E.coli) DH5αF'/pFBY29 DSM 6275 1990 年12月14日
【００７０】配列表 (1) 一般情報: (i)出願人: (A) 法人の名称: チバ- ガイギーAG(CIBA-GEIGY AG) (B) 番地: クリベクスト.141(Klybeckstr. 141) (C) 市: バーゼル(Basel) (E) 国: スイス(Switzerland) (F) 郵便番号(ZIP):4002 (G) 電話番号:+41 61 69 11 11 (H) ファックス番号:+41 61 696 79 76 (I) テレックス: 962 991 (A) 法人の名称: UCP Gen-Pharma AG (B) 番地: Kraftstrasse 6 (C) 市: Zuerich (E) 国: スイス(Switzerland) (F) 郵便番号(ZIP):8044 (ii)発明の名称: ポリペプチドの製造方法 (iii)配列数:6 (iv)コンピューター読込媒体: (A) 媒体形式: フロッピーディスク (B) コンピューター:IBM PC 互換性 (C) オペレーティングシステム:PC-DOS/MS-DOS (D) ソフトウェアー:PatentIn Release #1.0, version
#1.25(EPO) (vi)先行出願データ: (A) 出願番号:EP 92811005.5 (B) 提出日:1992 年12月12日
#1.25(EPO) (vi)先行出願データ: (A) 出願番号:EP 92811005.5 (B) 提出日:1992 年12月12日
【００７１】
配列番号 : 1 配列の長さ : 1318 配列の型 : 核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー :直鎖状 配列の種類 : Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号 : (misc feature) 存在位置 : 1..6 他の情報 :機能= "BamHIリンカー" 配列の特徴 特徴を表す記号 : promoter 存在位置 : 7..460 他の情報 :標準名= "CUP1 プロモーター" 配列の特徴 特徴を表す記号 : CDS 存在位置 : 461..646 他の情報 :製品= " メタロチオネイン" 配列の特徴 特徴を表す記号 : terminator 存在位置 : 647..1312 他の情報 :標準名= "CUP1 転写終止配列" 配列の特徴 特徴を表す記号 : (misc feature) 存在位置 : 1313..1318 他の情報 :機能= " BamHI リンカー" 配列 GGATCCCCAT TACCGACATT TGGGCGCTAT ACGTGCATAT GTTCATGTAT 50 GTATCTGTAT TTAAAACACT TTTGTATTAT TTTTCCTCAT ATATGTGTAT 100 AGGTTTATAC GGATGATTTA ATTATTACTT CACCACCCTT TATTTCAGGC 150 TGATATCTTA GCCTTGTTAC TAGTTAGAAA AAGACATTTT TGCTGTCAGT 200 CACTGTCAAG AGATTCTTTT GCTGGCATTT CTTCTAGAAG CAAAAAGAGC 250 GATGCGTCTT TTCCGCGGAA CCGTTCCAGC AAAAAAGACT ACCAACGCAA 300 TATGGATTGT CAGAATCATA TAAAAGAGAA GCAAATAACT CCTTGTCTTG 350 TATCAATTGC ATTATAATAT CTTCTTGTTA GTGCAATATC ATATAGAAGT 400 CATCGAAATA GATATTAAGA AAAACAAACT GTACAATCAA TCAATCAATC 450 ATCACATAAA ATG TTC AGC GAA TTA ATT AAC TTC CAA AAT GAA GGT 496 Met Phe Ser Glu Leu Ile Asn Phe Gln Asn Glu Gly 1 5 10 CAT GAG TGC CAA TGC CAA TGT GGT AGC TGC AAA AAT AAT GAA CAA 541 His Glu Cys Gln Cys Gln Cys Gly Ser Cys Lys Asn Asn Glu Gln 15 20 25 TGC CAA AAA TCA TGT AGC TGC CCA ACG GGG TGT AAC AGC GAC GAC 586 Cys Gln Lys Ser Cys Ser Cys Pro Thr Gly Cys Asn Ser Asp Asp 30 35 40 AAA TGC CCC TGC GGT AAC AAG TCT GAA GAA ACC AAG AAG TCA TGC 631 Lys Cys Pro Cys Gly Asn Lys Ser Glu Glu Thr Lys Lys Ser Cys 45 50 55 TGC TCT GGG AAA TGAAA CCGCGGGTCT TTAATATATT CATCTAACTA 678 Cys Ser Gly Lys 60 TTTGCTGTTT TTAATTTTTA AAAGGAGAAG GAAGTTTAAT CGACGATTCT 728 ACTCAGTTTG AGTACACTTA TGTATTTTGT TTAGATACTT TGTTAATTTA 778 TAGGTATACG TTAATAATTA AGAAAAGGAA ATAAAGTATC TCCATATGTC 828 GCCCCAAGAA TAAAATATTA TTACCAAATT CTAGTTTGCC TAACTTACAA 878 CTCTGTATAG AATCCCCAGA TTTCGAATAA AAAAAAAAAA AAAAGCTATT 928 CATGGTACCC GCTGCTGAAA ACCTATCTCC GATACCTGCC TCTATTGATA 978 CGAACGACAT TCCTTTAATT GCTAACGATT TAAAATTACT GGAAACGCAA 1028 GCAAAATTGA TAAATATTCT GCAAGGTGTT CCTTTCTACT TGCCAGTAAA 1078 TTTAACCAAA ATTGAAAGTC TGATAGAAAC CTTGACTATG GGCGTGAGTA 1128 ATACAGTAGA CTTATATTTT CATGACAACG AAGTCAGAAA AGAATGGAAA 1178 GACACTTTAA ATTTTATCAA TACCATTGTT TATACAAATT TTTTCCTTTT 1228 TGTTCAAAAC GAATCCTCTT TGTCCATGGC AGTTCAACAT TCTTCTAACA 1278 ACAATAAGAC CTCGAACTCT GAAAGATGTG CAAAGGATCC 1318
【００７２】配列番号 : 2 配列の長さ : 61 配列の型 :アミノ酸 トポロジー :直鎖状 配列の種類 :タンパク質(protein) 配列 Met Phe Ser Glu Leu Ile Asn Phe Gln Asn Glu Gly His Glu Cys 1 5 10 15 Gln Cys Gln Cys Gly Ser Cys Lys Asn Asn Glu Gln Cys Gln Lys 20 25 30 Ser Cys Ser Cys Pro Thr Gly Cys Asn Ser Asp Asp Lys Cys Pro 35 40 45 Cys Gly Asn Lys Ser Glu Glu Thr Lys Lys Ser Cys Cys Ser Gly 50 55 60 Lys
【００７３】配列番号 : 3 配列の長さ : 1082 配列の型 : 核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー :直鎖状 配列の種類 : Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号 : (misc feature) 存在位置 : 1..6 他の情報 :機能= "BamHIリンカー" 配列の特徴 特徴を表す記号 : promoter 存在位置 : 7..432 他の情報 :標準名= "CUP1 プロモーター" 配列の特徴 特徴を表す記号 : (misc feature) 存在位置 : 433..441 他の情報 :機能= "EcoRIリンカー" 配列の特徴 特徴を表す記号 : sig peptide 存在位置 : 442..492 他の情報 :標準名= "PHO5 シグナル配列" 配列の特徴 特徴を表す記号 : mat peptide 存在位置 : 493..690 他の情報 :製品= " デスルファトヒルジンHV1"/ 標準名
= "HV1" 配列の特徴 特徴を表す記号 : terminator 存在位置 : 691..1068 他の情報 :標準名= "PHO5 転写ターミネーター" 配列の特徴 特徴を表す記号 : (misc feature) 存在位置 : 1069..1082 他の情報 :機能= "salI リンカー" 配列の特徴 特徴を表す記号 : CDS 存在位置 : 442..690 他の情報 :製品= " 一次転写物" 配列 GGATCCCCAT TACCGACATT TGGGCGCTAT ACGTGCATAT GTTCATGTAT 50 GTATCTGTAT TTAAAACACT TTTGTATTAT TTTTCCTCAT ATATGTGTAT 100 AGGTTTATAC GGATGATTTA ATTATTACTT CACCACCCTT TATTTCAGGC 150 TGATATCTTA GCCTTGTTAC TAGTTAGAAA AAGACATTTT TGCTGTCAGT 200 CACTGTCAAG AGATTCTTTT GCTGGCATTT CTTCTAGAAG CAAAAAGAGC 250 GATGCGTCTT TTCCGCTGAA CCGTTCCAGC AAAAAAGACT ACCAACGCAA 300 TATGGATTGT CAGAATCATA TAAAAGAGAA GCAAATAACT CCTTGTCTTG 350 TATCAATTGC ATTATAATAT CTTCTTGTTA GTGCAATATC ATATAGAAGT 400 CATCGAAATA GATATTAAGA AAAACAAACT GTGAATTCAA A ATG TTT 447 Met Phe -17 AAA TCT GTT GTT TAT TCA ATT TTA GCC GCT TCT TTG GCC AAT GCA 492 Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala -15 -10 -5 GTT GTT TAC ACC GAC TGT ACC GAA TCT GGT CAA AAC TTG TGT TTG 537 Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Glu Asn Leu Cys Leu 1 5 10 15 TGT GAA GGT TCT AAC GTT TGT GGT CAA GGT AAC AAG TGT ATC TTG 582 Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu 20 25 30 GGT TCT GAC GGT GAA AAG AAC CAA TGT GTT ACC GGT GAA GGT ACC 627 Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr 35 40 45 CCA AAG CCA CAA TCT CAC AAC GAC GGT GAC TTC GAA GAA ATC CCA 672 Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro 50 55 60 GAA GAA TAC TTG CAA TAGGATCCTG GTACGTTCCT CAAGGTGCTC 717 Gln Glu Tyr Leu Gln 65 GTGTCTACAC CGAAAAATTC CAATGTTCTA ACGACACCTA CGTCAGATAC 767 GTCATTAACG ATGCTGTTGT TCCAATTGAA ACCTGTTCCA CTGGTCCAGG 817 GTTCTCTTGT GAAATCAATG ACTTCTACGA CTATGCTGAA AAGAGAGTAG 867 CCGGTACTGA CTTCCTAAAG GTCTGTAACG TCAGCAGCGT CAGTAACTCT 917 ACTGAATTGA CCTTCTACTG GGACTGGAAC ACTACTCATT ACAACGCCAG 967 TCTATTGAGA CAATAGTTTT GTATAACTAA ATAATATTGG AAACTAAATA 1017 CGAATACCCA AATTTTTTAT CTAAATTTTG CCGAAAGATT AAAATCTGCA 1067 GCCAAGCTGG TCGAC 1082
= "HV1" 配列の特徴 特徴を表す記号 : terminator 存在位置 : 691..1068 他の情報 :標準名= "PHO5 転写ターミネーター" 配列の特徴 特徴を表す記号 : (misc feature) 存在位置 : 1069..1082 他の情報 :機能= "salI リンカー" 配列の特徴 特徴を表す記号 : CDS 存在位置 : 442..690 他の情報 :製品= " 一次転写物" 配列 GGATCCCCAT TACCGACATT TGGGCGCTAT ACGTGCATAT GTTCATGTAT 50 GTATCTGTAT TTAAAACACT TTTGTATTAT TTTTCCTCAT ATATGTGTAT 100 AGGTTTATAC GGATGATTTA ATTATTACTT CACCACCCTT TATTTCAGGC 150 TGATATCTTA GCCTTGTTAC TAGTTAGAAA AAGACATTTT TGCTGTCAGT 200 CACTGTCAAG AGATTCTTTT GCTGGCATTT CTTCTAGAAG CAAAAAGAGC 250 GATGCGTCTT TTCCGCTGAA CCGTTCCAGC AAAAAAGACT ACCAACGCAA 300 TATGGATTGT CAGAATCATA TAAAAGAGAA GCAAATAACT CCTTGTCTTG 350 TATCAATTGC ATTATAATAT CTTCTTGTTA GTGCAATATC ATATAGAAGT 400 CATCGAAATA GATATTAAGA AAAACAAACT GTGAATTCAA A ATG TTT 447 Met Phe -17 AAA TCT GTT GTT TAT TCA ATT TTA GCC GCT TCT TTG GCC AAT GCA 492 Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala -15 -10 -5 GTT GTT TAC ACC GAC TGT ACC GAA TCT GGT CAA AAC TTG TGT TTG 537 Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Glu Asn Leu Cys Leu 1 5 10 15 TGT GAA GGT TCT AAC GTT TGT GGT CAA GGT AAC AAG TGT ATC TTG 582 Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys Ile Leu 20 25 30 GGT TCT GAC GGT GAA AAG AAC CAA TGT GTT ACC GGT GAA GGT ACC 627 Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr 35 40 45 CCA AAG CCA CAA TCT CAC AAC GAC GGT GAC TTC GAA GAA ATC CCA 672 Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro 50 55 60 GAA GAA TAC TTG CAA TAGGATCCTG GTACGTTCCT CAAGGTGCTC 717 Gln Glu Tyr Leu Gln 65 GTGTCTACAC CGAAAAATTC CAATGTTCTA ACGACACCTA CGTCAGATAC 767 GTCATTAACG ATGCTGTTGT TCCAATTGAA ACCTGTTCCA CTGGTCCAGG 817 GTTCTCTTGT GAAATCAATG ACTTCTACGA CTATGCTGAA AAGAGAGTAG 867 CCGGTACTGA CTTCCTAAAG GTCTGTAACG TCAGCAGCGT CAGTAACTCT 917 ACTGAATTGA CCTTCTACTG GGACTGGAAC ACTACTCATT ACAACGCCAG 967 TCTATTGAGA CAATAGTTTT GTATAACTAA ATAATATTGG AAACTAAATA 1017 CGAATACCCA AATTTTTTAT CTAAATTTTG CCGAAAGATT AAAATCTGCA 1067 GCCAAGCTGG TCGAC 1082
【００７４】配列番号 : 4 配列の長さ : 82 配列の型 :アミノ酸 トポロジー :直鎖状 配列の種類 :タンパク質(protein) 配列 Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala -17 -15 -10 -5 Asn Ala Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu 1 5 10 Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gln Gly Asn Lys Cys 15 20 25 Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu 30 35 40 Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu 45 50 55 Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln 60 65
【００７５】配列番号 : 5 配列の長さ : 28 配列の型 : 核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー :直鎖状 配列の種類 : Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号 : (misc feature) 存在位置 : 1..28 他の情報 :製品= "PCRプライマー" 配列 GGATCCATTA CCGACATTTG GGCGCTAT 28
【００７６】配列番号 : 6 配列の長さ : 30 配列の型 : 核酸 鎖の数 :一本鎖 トポロジー :直鎖状 配列の種類 : Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号 : (misc feature) 存在位置 : 1..30 他の情報 :製品= "PCRプライマー" 配列 GAATTCACAG TTTGTTTTTC TTAATATCTA 30
【図１】図１は、プラスミドpHE112R の図解説明図であ
る。
る。
【図２】図２は、プラスミドpPFY56の図解説明図であ
る。
る。
【図３】図３は、プラスミドpHE111の図解説明図であ
る。
る。
【図４】図４は、プラスミドpMK18 の図解説明図であ
る。
る。
【図５】図５は、プラスミドpMK19 の図解説明図であ
る。
る。
【図６】図６は、プラスミドpMK26 の図解説明図であ
る。
る。
【図７】図７は、プラスミドpMK27 の図解説明図であ
る。
る。
term…PHO5転写ターミネーター CUP1p 、GAPFLp及びACE1p 中のp …プロモーター
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/81 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ユッタ ハイム スイス国，4433 ラムリンスブルク，ツェ ルグリリンク 17 (72)発明者 トーマス ホッティガー スイス国，4450 ジスザッハ，ゲルベガス ライン ４ (72)発明者 ガブリーレ ポーリク スイス国，4125 リーヘン，バッセルステ ルツェンベーク 60 (72)発明者 ペーター フュルシュト スイス国，4058 バーゼル，ショレンベー ク 40
Claims (27)
- 【請求項１】 ポリペプチドの製造方法であって、ゲノ
ム内に1 以下の機能的CUP1遺伝子を含みそして機能的CU
P1遺伝子及びポリペプチド発現カセットを含んで成る酵
母の2 ミクロン誘導プラスミドを宿している酵母株を、
複合培養培地中で培養し、そして製造されたポリペプチ
ドを単離することを含んで成り; その培養培地に、CUP1
プロモーターを誘導する量の銅塩を供給するような方
法。 - 【請求項２】 上記のポリペプチド発現カセットが、上
記ポリペプチドをコードする第二DNA 配列に正しい読み
取り枠内で連結されている酵母のシグナルペプチドをコ
ードする第一DNA 配列に作用可能な状態で連結されてい
る酵母プロモーター、及び酵母の転写終止シグナルを含
むDNA 配列から成る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 上記のプロモーターが、上記の酵母CUP1
プロモーターである、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 上記のプロモーターが、上記の酵母GAPF
L プロモーターである、請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】 上記のポリペプチドが、異種ポリペプチ
ドである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 上記のポリペプチドが、デスルファトヒ
ルジンである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 上記のポリペプチドが、デスルファトヒ
ルジン変異体HV1 である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 上記の酵母株が、サッカロミセス・セレ
ビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株である、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項９】 上記の酵母株が、１のまたは多数のプロ
テアーゼ- 欠損性である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 上記の酵母株が、ゲノムCUP1遺伝子を
作る能力を欠いている、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 上記の機能的CUP1遺伝子及びポリペプ
チド発現カセットを含んで成る、酵母2 ミクロン誘導ハ
イブリッド・プラスミド。 - 【請求項１２】 上記のポリペプチド発現カセットが、
上記のポリペプチドをコードする第二DNA 配列に正しい
読み取り枠内で連結されている酵母のシグナルペプチド
をコードする第一DNA 配列に作用可能な状態で連結され
ている酵母CUP1プロモーター、及び酵母の転写終止シグ
ナルを含むDNA 配列から成る、請求項１１に記載の酵母
プラスミド。 - 【請求項１３】 上記のプロモーターが、上記のGAPFL
及び上記の酵母CUP1プロモーターから成る群から選ばれ
ている、請求項１２に記載の酵母プラスミド。 - 【請求項１４】 上記のプロモーターが、上記の酵母CU
P1プロモーターである、請求項１２に記載の酵母プラス
ミド。 - 【請求項１５】 上記のポリペプチドが、デスルファト
ヒルジンである、請求項１２に記載の酵母プラスミド。 - 【請求項１６】 シグナルペプチドをコードするDNA 配
列が、上記酵母のインベルターゼ、α- 因子、フェロモ
ンペプチダーゼ(KEX1)、" キラー毒素" 及び抑制性酸性
ホスファターゼ(PHO5)の遺伝子のシグナル及びプレプロ
配列、並びにアスペルギルス・アワモリ( Aspergillus
awamori)からのグルコアミラーゼのシグナル配列から成
る群から選ばれている、請求項１２に記載の酵母プラス
ミド。 - 【請求項１７】 シグナルペプチドをコードする上記の
DNA 配列が、上記酵母のインベルターゼ及びPHO5の遺伝
子のシグナル配列から成る群から選ばれている、請求項
１２に記載の酵母プラスミド。 - 【請求項１８】 酵母の転写終止シグナルを含むDNA 配
列が、転写終止及びポリアデニレーションのための正し
いシグナルを含む酵母遺伝子の3'フランキング配列であ
る、請求項１２に記載の酵母プラスミド。 - 【請求項１９】 配列番号3 中に示すような、CUP1プロ
モーター、PHO5リーダー配列、ヒルジン遺伝子及びPHO
ターミネーターを含んで成る1082塩基対のBamHI/SalIフ
ラグメントを含んで成る、請求項１１に記載の酵母プラ
スミド。 - 【請求項２０】 配列番号1 中に示すような、CUP1プロ
モーター、CUP1コード領域及びCUP1ターミネーターを含
んで成る1311塩基対のBamHI フラグメントを含んで成
る、請求項１１に記載の酵母プラスミド。 - 【請求項２１】 完全な2 ミクロンDNA を含んで成る、
請求項１１に記載の酵母プラスミド。 - 【請求項２２】 対称性を示し、そしてバクテリアの配
列を欠いている、請求項１１に記載の酵母プラスミド。 - 【請求項２３】 1 〜3 の追加のポリペプチド発現カセ
ットを含んで成る、請求項１１に記載の酵母プラスミ
ド。 - 【請求項２４】 1 つの追加の転写活性化物ACE1発現カ
セットを含んで成る、請求項１１に記載の酵母プラスミ
ド。 - 【請求項２５】 ゲノム内に1 以下の機能的CUP1遺伝子
を含み、そしてポリペプチド発現カセット及び機能的CU
P1遺伝子を含んで成る酵母ハイブリッド・プラスミドを
宿している酵母株。 - 【請求項２６】 ゲノムのCUP1遺伝子を作る能力を欠い
ている、請求項２５に記載の酵母株。 - 【請求項２７】 請求項１１に記載の酵母プラスミド宿
している、請求項２５に記載の酵母株。
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