NO176025B

NO176025B - DNA-fragment, plasmid, kultur og fremgangsmåte til fremstilling av et hepatitt-B-overflateantigen

Info

Publication number: NO176025B
Application number: NO864704A
Authority: NO
Inventors: Juerg Friedrich Tschopp; James Michael Cregg; Michael Miller Harpold; Richard Gordon Buckholz
Original assignee: Res Corp Technologies Inc; Phillips Petroleum Co
Priority date: 1985-11-26
Filing date: 1986-11-25
Publication date: 1994-10-10
Also published as: IE863021L; JPS62190085A; PT83819A; AU583683B2; PL262598A1; HUT43112A; YU46031B; FI95929C; AU6538486A; PL152882B1; DK565186A; EP0226846A1; NO864704D0; KR920004050B1; TW215457B; FI864791A; YU201386A; CA1285895C; FI95929B; DD252614A5

Description

Oppfinnelsen angår bruken av rekombinant DNA-teknologi for produksjon av hepatitt-B-overflateantigen. En side ved oppfinnelsen angår DNA-fragitienter som omfatter regulerende områder samt det strukturelle kodende område for hepatitt-B-overf lateantigen. En annen side ved oppfinnelsen angår plasmider som kan uttrykke et gen som koder for hepatitt-B-overf lateantigen. En ytterligere side ved oppfinnelsen angår en stort sett ren kultur av gjær som kan uttrykke ovennevnte gen. Enda en ytterligere side ved oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til fremstilling av hepatitt-B-overflateantigen.

Etter hvert som rekombinant DNA-teknologi har utviklet seg i den senere tid, er den regulerte fremstilling ved hjelp av mikroorganismer av en rekke forskjellige nyttige polypeptider blitt mulig. Mange eukaryotiske polypeptider, f.eks. menneskelig veksthormon, leukocyttinterferoner, menneskelig insulin og menneskelig proinsulin er allerede blitt fremstilt ved forskjellige mikroorganismer. Det ventes at den fortsatte anvendelse av teknikker som allerede beherskes i fremtiden vil tillate fremstilling ved hjelp av mikroorganismer av en rekke andre nyttige polypeptidprodukter. Et slikt nyttigt polypeptidprodukt er hepatitt-B-overflateantigen.

Virus av hepatitt B (serumhepatitt) overføres blant mennesker og opptrer som kronisk svekkende infeksjoner som gradvis kan føre til alvorlig leverskade, primærkarsinom og tilslutt dødsfall. I de fleste tilfeller kan fullstendig helbredelse fra hepatitt-B-infeksjoner ventes. Store deler av befolkningen, særlig i mange afrikanske og asiatiske land, er imidlertid kroniske bærere med det farlige potensial av å overføre sykdommen pandemisk.

Virkningsfull beskyttelse mot hepatitt B-viruset består i å gi

en hepatitt-B-virusvaksine som vanligvis er et meget rent hepatitt-B-overflateantigen. En slik hepatitt-B-virusvaksine er virksom i å hindre infeksjon med viruset. Særlige høyrisikogrup-per er mennesker som trenger blodoverføringer eller dialyse-behandling, medisinsk personell som arbeider med slike grupper og lignende. Dessuten er en slik vaksine også virkningsfull for å hindre at det oppstår en ny bærer, og det kan derfor være mulig å eliminere fullstendig hepatitt-B-viruset fra jorden.

Hepatitt-B-viruset har ikke vært infeksiøs i cellekultur og kan derfor bare fås fra infiserte mennesker eller høyere primater. Således har der ikke vært tilgjengelig metoder for oppnåelse og opprettholdelse av tilstrekkelige forsyninger av hepatitt-B-virus til bruk i fremstilling av antigen for immunisering mot hepatitt-B-virus.

Hepatitt B virusvaksine fremstilles vanligvis ved isolering og rensing av hepatitt-B-overflateantigen fra blodplasma av hepatitt B virusbærere. Slik rensing må imidlertid utføres meget effektivt, da bare svært lave konsentrasjoner av det ønskede antigen foreligger i plasmaen som renses. Det har derfor hittil vært svært vanskelig å fremstille den ønskede hepatitt-B-virusvaksine i industriell målestokk.

En hensikt med oppfinnelsen er derfor en fremgangsmåte til fremstilling av hepatitt-B-overflateantigen med høye utbytter.

En annen hensikt med oppfinnelsen er fremstillingen av nye konstruerte DNA-stykker (DNA-construets) som kan uttrykke hepatitt-B-overflateantigen i store mengder.

Disse og andre hensikter er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av kravene.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det funnet at hepatitt-B-overflateantigen kan fremstilles med høye utbytter ved dyrking av gjærceller transformert med konstruerte DNA-stykker omfattende hepatitt-B-overflateantigen kodende sekvenser under styring av regulerende områder som reagerer på metanol, ikke-katabolittundertrykkende karbonkilder og karbonkildehunger.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1 er et restriksjonskart av Pichia dihydroksyacetonsyntase-genet (DAS) regulerende område. Fig. 2 er et restriksjonskart av det primære Pichia alkoholoksidase-gen (A0X1) regulerende område. Fig. 3 er et restriksjonskart av det Pichia p40-gen regulerende

område.

Fig. 4 er et restriksjonskart av plasmid pA0P2.

Fig. 5 viser det skjema som følges for konstruksjonen av plasmider pBSAG5 og pBSAG5l.

Fig. 6 er et restriksjonskart av plasmid pHBS-5.

Fig. 7 er et restriksjonskart av plasmid pAOT-1.

Fig. 8 er et restriksjonskart av plasmid pYJ33.

Fig. 9 viser konstruksjonen av plasmid pYM39 fra plasmider pSA0H5 og pTHBS3. Fig. 10 viser konstruksjonen av plasmid pYMI6 fra plasmider pYM39 og pPG3.2. Fig. 11 viser konstruksjonen av plasmid pBSAGI5I fra plasmider pYMl6 og pBSAG5I. Fig. 12 viser innføyelsen av et parti av plasmid pBSAGI5l inn i lokuset av den primære alkoholoksidase (A0X1) av Pichia-kromosomet. Fig. 13 viser det skjema som følges for konstruksjonen av plasmid pTHBS3.

De følgende forkortelser er benyttet på figurene for å represen-tere de restriksjonsenzymer som anvendes.

På de vedlagte figurer er restriksjonsseter som anvendes for manipulering av DNA-fragmenter, men som ødelegges ved ligasjon, angitt ved at forkortelsen for det ødelagte sete er satt i parentes.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er der tilveiebragt et nytt DNA-fragment omfattende et regulerende område og et polypeptidkodende område hvor det polypeptidkodende omr.åde koder for hepatitt-B-overflateantigen eller porsjoner derav, og det regulerende område kan styre transkripsjonen av messenger-RNA når det er anordnet ved 5'-enden av det polypeptidkodende gen. Kombinasjonen av regulerende område, hepatitt-B-overflateantigen (HBsAG)-gen og et transkripsjonelt avslutningsfragment skal heretter betegnes som en ekspresjonskassett eller ekspresjonsen-het. Det regulerende område som anvendes i utførelse av den foreliggende oppfinnelse reagerer på minst én av betingelsene valgt fra gruppen bestående av: nærværet av metanol i dyrkningsmediet som en vertsorganisme inneholdende ekspresjonskassetten er i kontakt med,

nærværet av en ikke-katabolittundertrykkende karbonkilde annen enn metanol i dyrkningsmediet som en vertsorganisme inneholdende ekspresjonskassetten er i kontakt med, og

karbonkildehunger i det dyrkningsmedium som en vertsorganisme inneholdende ekspresjonskassetten er i kontakt med etter at vertsorganismen er blitt dyrket på en katabolittundertrykkende karbon- og energikilde.

Videre i henhold til oppfinnelsen er der tilveiebragt nye lineære og sirkelformede plasmider inneholdende de ovenfor beskrevne ekspresjonskassetter.

Ytterligere, i henhold til oppfinnelsen, er der tilveiebragt stort sett rene kulturer av gjærstammer transformert med de ovenfor beskrevne lineære eller sirkelformede plasmider.

I henhold til nok en utførelsesform av oppfinnelsen er der beskrevet en fremgangsmåte til fremstilling av hepatitt-B-overf lateantigen som omfatter å dyrke en gjærstamme transformert med de ovenfor beskrevne plasmider under betingelser hvor ekspresjon av det ønskede proteinprodukt oppnås.

De regulerende områder som anvendes ved utførelse av oppfinnelsen er kjennetegnet ved deres evne til å reagere på medier som inneholder:

(1) metanol,

(2) ikke-katabolittundertrykkende karbonkilder som f.eks. glycerol, galaktose, acetat og lignende, (3) katabolittundertrykkende karbonkilder som f.eks. glukose, etanol, fruktose og lignende, fulgt av karbonkildehunger.

Eksempler på regulerende områder som oppfyller de ovennevnte kriterier er vist ved restriksjonskartene angitt på fig. 1, 2 og 3. Det regulerende område vist på fig. 1 fås fra dihydroksyacetonsyntase-genet (DAS) av Pichia pastoris. Det regulerende område vist på fig. 2 fås fra det primære alkoholoksidasegen (A0X1) av Pichia pastoris (Pichia har to alkoholoksidasegener, her betegnet som A0X1 og A0X2). Det regulerende område vist på fig. 3 fås fra p40-genet av Pichia pastoris. Fagfolk vil innse at andre regulerende områder som har de ovenfor beskrevne egenskaper, kan isoleres fra metylotrofe gjærsorter som f.eks. Pichia pastoris. Slike ytterligere regulerende områder som har regulerende egenskaper lignende egenskapene av de ovenfor beskrevne regulerende områder ligger også innenfor oppfinnelsen omfang.

Hepatitt-B-overflateantigen (HBsAg)-genet er tidligere blitt isolert (Valenzuela et al, (1979) Nature 280, 815) og er tilgjengelig ved riktig restriksjonsenzymbehandling av en rekke forskjellige vektorer som f.eks. pHBS-5 (se fig. 6, og Valenzuela et al (1982), Nature 298, 347) pHBV-T-1A (Genetech, EPA 73,657), pHBS-56 (ATCC aksesjonsnummer 40,047; se EPA 120,551), etc.

Hepatitt-B-overflateantigen-genet ble modifisert ved Bal31-eksonukleasebehandling for å fjerne virale ikke-kodende sekvenser ved 5'-enden av hepatitt-genet. 3'-enden av HBsAg-genet ble modifisert ved endonukleasedigerering og tilføyelse av en linker for å fjerne virale ikke-kodende sekvenser ved 3'-enden av hepatitt-genet. Hepatitt-B-overflateantigen-genet ble ytterligere modifisert for å innlemme passende restriksjonsseter for manipuleringen av DNA-fragmentet. Det resulterende DNA-fragment er et EcoRI-StuI-innskudd og har den følgende nukleotidsekvens:

De konstruerte genmaterialer av regulerende område/strukturelt gen ifølge oppfinnelsen kan tilføres organismene for forstør-relse, reproduksjon og ekspresjon på en rekke forskjellige måter. For autonom replikasjon i gjær er et element av autonom replikasjonssekvens (ARS) nyttig. Eksempler innbefatter PARS1 og PARS2 avledet fra Pichia pastoris (se søkerens samtidig innle-verte US patentsøknad SN 666.577). Der hvor man isteden ønsker integrativ tranformasjon av verten vil ikke noe ARS-element anvendes. En foretrukket fremgangsmåte for oppnåelse av integrativ transformasjon er beskrevet i samtidig innlevert amerikansk patentsøknad nummer 791.013 og omfatter anvendelse av en seterettet integrasjonsvektor som omfatter

et første innsettbart DNA-fragment,

et selekterbart markørgen, og

et andre innsettbart DNA-fragment.

De første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver minst ca. 200 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er homologe med partier av det genomiske DNA av arter av slekten Pichia. De forskjellige komponenter av den integrative vektor er ordnet i serie, hvilket danner et lineært fragment av DNA, slik at ekspresjonskassetten og det selekterbare markørgen er anordnet mellom 3'-enden av det første innsettbare DNA-fragment og 5'-enden av det andre innsettbare DNA-fragment. De første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert i forhold til hverandre i det i rekkefølge ordnede lineære fragment på samme måte som det er orientert i genomet av Pichia.

Det er nødvendig å innlemme minst ett selekterbart markørgen i det DNA som anvendes til å transformere vertsstammen. Dette letter seleksjonen og isoleringen av de organismer som har innlemmet det transformerende DNA. Markørgenet meddeler den transformerte organisme et fenotypisk trekk som verten ikke hadde, f.eks. gjenopprettelse av evnen til å produsere en spesiell aminosyre, hvor den ikke-transformerte vertsstamme har en defekt i den spesielle aminosyrebiosyntetiske vei.

Fagfolk vil innse at ytterligere DNA-sekvenser også kan innlem-mes i de vektorer som anvendes i utførelse av den foreliggende oppfinnelse, så som f.eks. bakterielt plasmid DNA, bakteriofag DNA og lignende. Slike sekvenser tillater oppformering og opprettholdelsen av disse vektorer i bakterieverter.

Ekspresjon i transformert gjær

De ovenfor beskrevne plasmider ifølge oppfinnelsen er nyttige i gjærstammer som kan transformeres. Regulering av genekspresjon i gjær ved de nye DNA-fragmenter ifølge oppfinnelsen kan oppnås ved at de transformerte organismer underkastes karbonkildehunger. Karbonkildehunger etter dyrking på en rekke katabolittundertrykkende, så vel som på ikke-katabolittundertrykkende karbonkilder, induserer ekspresjon av genproduktet som holdes under styring av de regulerende områder ifølge oppfinnelsen. En annen måte å oppnå ekspresjon av det ønskede genprodukt i egnede arter av transformert gjær på, er å dyrke transformerte gjærsorter på metanol. Ytterligere en måte til å indusere ekspresjon av det ønskede genprodukt er å dyrke transformert gjær på medier inneholdende ikke-katabolittundertrykkende karbonkilder.

De regulerende områder ifølge oppfinnelsen er nyttige for ekspresjon i alle gjærstammer, da det er blitt vist at de regulerende områder induseres under en rekke forskjellige betingelser. Således kan gjærsorter som kan vokse på metanol eller på ikke-katabolittundertrykkende karbonkilder, bringes til å produsere fremmede, dvs, heterologe polypeptider direkte, mens gjærsorter som kan vokse på katabolittundertrykkende karbonkilder kan bringes til å produsere fremmede polypeptider ved at gjærcellene som er dyrket på denne måte underkastes betingelser av karbondkildehunger.

Transformerte gjærstammer som foretrekkes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, omfatter medlemmer av slektene:

Candida,

Kloeckera,

Saccharomyces,

Schizosaccharomyces,

Rhodotorula,

Hansenula,

Torulopsis,

Pichia, og

Kluyveromyces.

Gjærsorter fra disse slekter foretrekkes fordi deres sikkerhet ved håndtering, vekstbetingelser og lignende er blitt etablert, og er godt kjent blant fagfolk.

Særlig foretrukkede gjærstammer til bruk i en utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er de gjærstammer som er istand til å vokse på metanol som karbon- og energikilde. Gjærsorter som er kjent for å være istand til å vokse på metanol omfatter medlemmer av slektene:

Candida,

Kloeckera,

Saccharomyces,

Rhodotorula,

Hansenula,

Torulopsis og

Pichia.

Da de regulerende områder ifølge oppfinnelsen også induseres ved vekst på ikke-katabolittundertrykkende karbonkilder, samt betingelser av karbonkildehunger, er gjærsorter som kan dyrkes på slike ikke-metanolske substrater, så som:

glukose,

acetat,

glycerol,

etanol,

laktose,

galaktose,

fruktose,

sukrose,

og lignende, og blandinger av hvilke som helst to eller flere derav, også nyttige i utførelsen av oppfinnelsen. Ved å dyrke vertsorganismen på en egnet ikke-katabolittundertrykkende ikke-metanolsk karbonkilde, som f.eks. glycerol eller galaktose, eller ved å dyrke vertsorganismen på en egnet katabolittundertrykkende karbonkilde som f.eks. etanol, glukose og fruktose,og deretter underkaste vertsorganismen betingelser av karbonkildehunger, kan man oppnå ekspresjon av et genprodukt under styring av de regulerende områder ifølge oppfinnelsen.

En særlig foretrukket vertsgjærstamme er mutanten Pichia pastoris GS115 som er en mutant som er defekt med hensyn til evnen å produsere histidin. GS115 er blitt betegnet som å ha mutantgenotypen his4, som et resultat av at defekten i histidinveien virker inn på det histidinoldehydrogenasekodende gen. GS115 fås fra Pichia pastoris NRRL Y-11430 og er blitt deponert i the Northern Regional Research Center hos De forente staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois, og er blitt gitt aksesjonsnummeret NRRL Y-15851. Denne spesielle vert er nyttig fordi det er en auxotrof mutant som mangler histidinveien. Transformasjon av denne vert med en vektor som inneholder, blant andre DNA-sekvenser, sekvenser som koder for HIS4-genfunksjonen, tillater lett utvelgelse av transformerte verter.

En annen foretrukket gjærstamme til bruk i utførelse av den foreliggende oppfinnelse er mutanten Pichia pastoris GL190, som er en mutant som er defekt i argininveien, hvilket virker inn på det gen som koder for argininosuccinatlyase. GS190 fås fra Pichia pastoris NRRL Y-11430 og er blitt deponert i the Northern Regional Research Center hos De forente staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois, og er blitt gitt aksesjonsnummer NRRL Y-18014.

Nok en foretrukket vertsgjærstamme er den dobbeltauxotrofe mutant PPF1, som er en mutant som er defekt både i histidin- og argininveien. PPF1 er defekt både i histidinveien, som virker inn på det gen som koder for histidinoldehydrogenase og argininveien, som virker inn på det gen som koder for argininosuccinatlyase. PPF1 er blitt deponert i the Northern Regional Research Center hos De forente staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois, og er blitt gitt aksesjonsnummer NRRL Y-18017.

Escherichia coli er også en egnet vert for plasmidene ifølge oppfinnelsen. Fagfolk vet at mange stammer av E. coli er egnede verter. Noen stammer som anvendes i det foreliggende arbeid er angitt nedenunder:

Pichia pastoris transformasjonsfremgangsmåte

De eksperimentelle fremgangsmåter for transformasjonen av Pichia pastoris er beskrevet tidligere og er angitt i nærmere detalj nedenunder (eksempel I).

Pichia pastoris kan transformeres ved enzymatisk digerering av celleveggene for å gi sfæroplaster, sfæroplastene blandes deretter med det transformerende DNA og inkuberes i nærvær av kalsiumioner og polyetenglykol, deretter regenereres de i selektivt dyrkingsmedium som mangler histidin. Det transformerende DNA innbefatter HIS4-genet, som vertsstammen mangler, således overlever kun transformerte celler på det selektive dyrkningsmedium som anvendes.

Ekstraksjon av hepatitt- B- overflateantigen

Fagfolk kjenner til en rekke metoder som kan brukes til ekstraksjon av heterologt protein fra en encellet rekombinant vert. Hvilke som helst av disse teknikker kjent av fagfolk for celleoppbrytning og proteinkonsentrasjon og/eller ekstraksjon fra de oppbrutte celler er egnet til utvinning av det HBsAg som fremstilles i henhold til den foreliggende oppfinnelse.

Analyse av hepatitt- B- overflateantigen

De transformerte celler ble dyrket under riktige betingelser for ekspresjon, som beskrevet ovenfor. Deretter, etter oppbrytning av cellene, ble de oppløselige og uoppløselige fraksjoner analysert for HBsAg. Den oppløselige fraksjon ble analysert for 22nm-partikkel med en i handelen tilgjengelig "AUSRIA II" analysepakke (Abbott Laboratories). Både den oppløselige og uoppløselige fraksjon ble analysert for monomer ved anvendelse av Western blottingsmetoder, hvilket anvendte antisera utviklet mot (raised against) den monomere form av HBsAg og protein A merket med radioaktivt 125js

Oppfinnelsen skal nå beskrives i nærmere detalj under henvisning til de følgende ikke-begrensende eksempler.

Eksempler

De følgende forkortelser er benyttet i eksemplene med følgende betydning:

Buffrene og oppløsningene som ble anvendt i de følgende eksempler har de sammensetninger som er angitt nedenunder:

Basalsalt-samraensetning (for fermentordyrking av transformert Pichia) Pichia-matningsmedium (for fermentordyrking av GS115/pBSAG5)

Sporsaltoppløsning [for dyrking av GS115 (pBSAGI5I) ]

Med mindre noe annet er angitt, representerer de ovenfor angitte oppløsninger den grunnleggende (1x) konsentrasjon som anvendes. I eksemplene, der hvor flere konsentrasjonsnivåer anvendes, er dette vist ved å angi oppløsningen som et multippel av den grunnleggende (1x) konsentrasjon.

Eksempel I

Pichia pastoris- transformasjonsfremgangsmåte

A. Celledyrking

1. Inokuler en koloni av Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) inn i ca. 10 ml YPD-medium og rist kulturen ved 30°C i 12-20 h. 2. Etter ca. 12-20 h, fortynn cellene til en ODgoo Pa ca. 0,01-0. 1 og hold cellene i logaritmisk vekstfase i YPD-medium ved 30°C i ca. 6-8 h. 3. Etter ca. 6-8 h, inokuler 100 ml av YPD-medium med 0,5 ml av startkulturen ved en ODgoo Pa ca# ®^ (eller ekvivalent mengde). Rist ved 30OC i ca. 12-20 h. 4. Innhøst kulturen når ODgQO er ca* 0,2-0,3 (etter ca. 16-20 h) ved sentrifugering ved 1500 g i 5 minutter.

B. Fremstilling av sfæroplaster

1. Vask cellene en gang i 10 ml sterilt vann. (Alle sentrifuge-ringer for trinn 1-5 er ved 1500 g i 5 minutter.)

2. Vask cellene en gang i 10 ml nylig fremstilt SED.

3. Vask cellene 2 ganger i 10 ml steril 1 M sorbitol.

4. Resuspender cellene i 10 ml SCE-buffer.

5. Tilsett 5-10 ul av 4 mg/ml Zymolyase 60.000 (Miles Laboratories). Inkuber cellene ved 30°C i 30-60 minutter.

Da fremstillingen av sfæroplaster er et kritisk trinn i trans-formasjonsfremgangsmåten, bør man overvåke sfæroplastdannelsen som følger: tilsett 100 ul porsjoner av celler til 900 ul av 5% SDS og 900 jil av 1 M sorbitol før eller like etter tilsetningen av zymolase, og på forskjellige tidsrom under inkubasjonspe-rioden. Stopp inkubasjonen på det punkt hvor cellene lyserer i SDS, men ikke i sorbitol (vanligvis mellom 30 og 60 minutters inkubasjon). 6. Vask sfæroplastene 2 ganger i 10 ml steril 1 M sorbitol ved sentrifugering ved 1000 g i 5-10 minutter. (Tiden og hastigheten for sentrifugeringen kan variere, sentrifuger tilstrekkelig til å pelletere sfæroplaster, men ikke så mye at de revner pga. kraften.)

7. Vask cellene en gang i 10 ml sterilt CaS.

8. Resuspender cellene i en samlet mengde på 0,6 ml CaS.

C. Transformasj on

1. Tilsett DNA-prøver (inntil 20 ul volum) til 12 x 75 mm sterile polypropenrør (DNA bør foreligge i vann eller TE-buffer; for maksimale transformasjonshyppigheter med små mengder DNA er det tilrådelig å tilsette ca. 1 ul av 5 mg/ml E. coli-DNA behandlet med lydbølger (sonicated) til hver prøve). 2. Tilsett 100 ul sfæroplaster til hver DNA-prøve og inkuber ved værelsestemperatur i ca. 20 minutter. 3. Tilsett 1 ml PEG-oppløsning til hver prøve og inkuber ved værelsestemperatur i ca. 15 minutter. 4. Sentrifuger prøvene ved 1000 g i 5-10 minutter og dekanter PEG-oppløsningen. 5. Resuspender prøvene i 150 ul SOS og inkuber i 30 minutter ved værelsestemperatur. 6. Tilsett 850 ul av steril 1 M sorbitol og påfør porsjoner av prøvene på plater som beskrevet nedenunder.

D. Regenerering av sfæroplaster

1. Resept for regenererings-agarmedium:

a. Agar/KCl - 9 g Bacto-agar, 13,4 g KC1, 240 ml H2O, autoklav. b. 10X glukose - 20 g dekstrose, 100 ml H2O, autoklav. c. 10X SC - 6,75 g gjær-nitrogenbase uten aminosyrer, 100 ml H2O, autoklav (tilsett en hvilken som helst ønsket aminosyre eller nukleinsyre inntil en konsentrasjon på 200 ug/ml før eller etter behandling i autoklav). d. Tilsett 30 ml 10X glukose og 30 ml 10X SC til 300 ml av den smeltede agar/KCl-oppløsning. Tilsett 0,6 ml av 0,2 mg/ml biotin og en hvilken som helst annen ønsket aminosyre eller nukleinsyre til en konsentrasjon på 20 ug/ml. Hold smeltet regenerasjonsagar på 55-60°C.

2. Påføring av transformasjonsprøver på plater:

Hell bunnagarlag på 10 ml regenereringsagar pr. plate minst 30 minutter før transformasjonsprøvene er klare. Fordel 10 ml porsjoner av regenereringsagar til rør i et bad på 45-50°C under den tid transformasjonsprøvene er i SOS. Tilsett en porsjon av hver prøve til 10 ml porsjoner av smeltet regenereringsagar som holdes på 45-50°C/ og hell hver av disse på plater inneholdende et fast 10 ml bunnagarlag av regenereringsagar.

3. Bestemmelse av kvaliteten av sfæroplastpreparat:

Fjern 10 ul av en prøve og fortynn 100 ganger ved at den settes til 990 pl av 1 M sorbitol. Fjern 10 ul av den 100 ganger fortynnede oppløsning, og fortynn ytterligere 100 ganger ved at den settes til en andre 990 ul porsjon av 1 M sorbitol. Stryk ut på plate 100 ul av begge de fortynnede oppløsninger på YPD-agarmedium for å bestemme konsentrasjonen av hele celler som ikke er blitt til sfæroplast, og som er tilbake i preparatet. Tilsett 100 ul av hver fortynnet prøve til 10 ul regenereringsagar supplert med 40 ul/ml histidin for å bestemme de samlede regenererbare sfæroplaster. Gode verdier for et transformasjons-eksperiment er 1-3 X 10<?> samlede regenererbare sfæroplaster/ml og ca. 1 x 10^ hele celler/ml.

4. Inkuber platene ved 30°C i 3-5 dager.

Eksempel II

Konstruksjon av pAOP2- familien av vektorer

1. Plasmid pPG2.5 (et pBR322-basert plasmid inneholdende det ca. 2,5 kbp EcoRI-Sall-fragment fra plasmid pPG4.0, hvilket plasmid inneholder det primære alkoholoksidasegen (OAX1) og regulerende områder og som er tilgjengelig i en E. coli-vert fra the Northern Regional Research Center av De forente staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois, som NRRL B-15868) ble digerert med BamHI.

2. Det lineariserte plasmid ble digestert med BAL31.

3. Det resulterende DNA ble behandlet med Klenow-fragment for å fremme butte ender, og ligatisert til EcoRI-linkere. 4. Ligasjonsproduktene ble transformert inn i E. coli-stamme MM294. 5. Transformanter ble sortert ut ved kolonihybridiserings-teknikken ved bruk av et syntetisk oligonukleotid som hadde den følgende sekvens:

Dette oligonukleotid inneholder A0X1-promotorsekvensen opptil, men ikke innbefattet, ATG-initieringskodonet, sammensmeltet med EcoRI-linkerens sekvens. 6. Positive kloner ble sekvensert ved Maxam-Gilberts teknikk. Alle tre positiver hadde den følgende sekvens:

Alle sammen beholdt "A" av ATG (understreket i den ovenfor angitte sekvens). Det ble besluttet at dette A sannsynligvis ikke ville være skadelig, således er alle etterfølgende kloner derivater av disse positive kloner. Disse kloner er blitt gitt laboratoriebetegnelsen henholdsvis pA0P1, pA0P2 og pA0P3.

7. To andre kloner ble identifisert ved sortering av de BAL31/linker-ligatiserte produkter. De har den følgende sekvens:

Disse kloner er blitt betegnet som pA0P5 og pA0P6.

I en variasjon av den ovenfor angitte fremgangsmåte ble plasmid pPG2.5 kappet med AsuII istedenfor BamHI, det lineariserte fragment ble behandlet med Klenow-fragment (ikke noen BAL31-behandling som utført ovenfor), deretter ligatisert til EcoRI-linkere. Det resulterende plasmid inneholder A0X1-promotorsek-venser som mangler ATG-initieringskodonet. Det plasmid som således er fremstilt er blitt betegnet som pA0P4, og har den følgende sekvens:

A0X1-promotoren (pA0X1) reagerer på karbonkatabolsk undertryk-king ved en kraftig stans i enzymsyntesen. Dessuten reagerer A0-promotoren på karbonhunger. Dyrking på metanol fører til en ytterligere induksjon av A0X1-promotoren. Videre er det klart fra omfattende undersøkelser, som f.eks. de som er beskrevet av Ellis, Brust, Koutz, Waters, Harpold og Gingeras i Molecular and Cellular Biology, mai 1985, p. 1111-1121, at de A0X1-promotor-fragment som anvendes i den foreliggende oppfinnelse reguleres på lignende måte som A0X1-promotoren i kromosomet. Hver av klonene som er fremstilt og isolert som beskrevet i det foreliggende eksempel oppviser reaksjoner på katabolsk undertrykkelse, karbonhunger og metanolinduksjon, slik som A0X1-promotoren selv.

Beskrivelse av AO- terminatoren

Fragmentet Stul-Hindlll som ble anvendt som AO-terminatoren, inneholder sekvenser som skaffer en mal for polyadenylering av A0X1-mRNA-transkriptet. Disse sekvenser innbefatter følgende:

TATAGTATAGGATTTTTTTTGTC-polyadenylering.

Når StuI-HindIII-fragmentet er anordnet på et plasmid som er 3' i forhold til et polypeptidkodende område, fremmer det RNA-avslutning. A0X1-avslutningssekvensene er blitt isolert og kan utvinnes fra plasmid pPG3.2, som er et pBR322-basert plasmid inneholdende A0X1-avslutningssekvensene. Plasmidet transformert inn i en E. coli-vert vil være tilgjengelig for offentligheten fra the Northern Regional Research Center i De forente staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois, ved utstedelse av søknaden som et patent under aksesjonsnummer NRRL B-15999.

Eksempel III

Rekkefølgen av trinn som ble anvendt for fremstillingen av plasmidene som er innholdet i dette eksempel er oppsummert i den ledsagende fig. 5.

Konstruksjon av pBSAG5 og pBSAG5I

1. Konstruksjon av pCFL2

Vektor pA0P2, som inneholder A0X1-promotoren minus TG i ATG ved sin 3'-ende, ble kappet med HincII. Det promotorholdige DNA-fragment ble isolert og ligatisert inn i pBR322, som tidligere var blitt kappet med Hindlll og fylt inn med Klenow-fragment. Denne reaksjon skapte vektor pCFL2.

2. Konstruksjon av pBSA0P2

pBR322-BgllI, som er pBR322 med PvuII-setet erstattet av et Bglll-sete, ble digerert med EcoRI og Clal. Dette lineariserte

plasmid ble kombinert med det 5' A0X1-holdige Clal/EcoRI-fragment fra pCFL2 i en ligasjonsreaksjon. Den resulterende vektor ble betegnet pBSA0P2.

3. Konstruksjon av pBSAG22

Plasmid pHBS-5 (beskrevet av Valenzuela et al i Nature 298, 347-350 (1982); se fig. 6), som inneholder HBsAg-genet innsatt i EcoRI-setet i pBR322 ble digerert med Clal. Ca. 60 basepar ble fjernet i begge retninger med Bal31 eksonuklease. Det resterende DNA-fragment ble digerert med BamHI og fylt inn med Klenow-fragment. Etter ligasjon ble et forråd på ca. 200 transformanter kappet med Ncol. De lineariserte plasmider ble isolert og religatisert. Etter transformasjon av E. coli hadde ca. 10% av alle plasmider (betegnet som pBSAGI) et nylig opprettet Ncol-sete. pBSAGI ble digerert med Ncol, fylt inn med Klenow-fragment og digerert med BamHI. Dette plasmid-fragment ble ligatisert til pBSAOP2, som tidligere var digerert med EcoRI, fylt inn med Klenow-fragment og digerert med BamHI. Den resulterende vektor ble betegnet pBSAG22.

4. Konstruksjon av pBSAG4, pBSAG5, pBSAG5I

Plasmid pAOT-1 (et pBR322-basert plasmid fått ved ligatisering av det 1,6 kpb SalI-HindIII-fragment av pPG3.2 (tilgjengelig i en E. coli-vert som NRRL B-15999) inn i et Sall-Hindlll-kappet pBR322 AEcoRI (dvs. pBR322 med EcoRI-setet ødelagt; se fig. 7), som bærer det 3'-A0X1 transkripsjonene avslutningsfragment, ble kappet med Xbal og Pstl. Det terminatorholdige fragment ble ligatisert til pBSAG22, som tidligere var kappet med Xbal og Pstl, hvilket ga pXP-1. pBSAG22 ble digerert med Dral, deretter ble Stul-linkere tilføyet, og til slutt ble Stul og EcoRI brukt til ytterligere digerering. Det HBsAg-strukturelle gen ble isolert og ligatisert inn i pXP-1, som tidligere var blitt kappet med Stul og EcoRI, hvilket ga pBSAG4.

Det HBsAg-holdige Clal-fragment fra pBSAG4 ble ligatisert inn i det unike Clal-sete av pYJ33 (se fig. 8), hvilket ga pBSAG5 og pBSAG5I. Et restriksjonskart av plasmid pBSAG5I er vist på fig.

11. Plasmider pBSAG5 og pBSAG5I avviker fra hverandre bare i orienteringen av Clal-fragmentet som inneholder ekspresjonskassetten 5'-A0X1/HBsAg/3'-A0X1. Således, i pBSAG5, slutter 5'-A0X1-fragmentet opp til Pichia HIS4-genet, mens 3'-A0X1-fragmentet slutter opp til det autonome element PARS2. Plasmid pBSAG5, transformert inn i en E. coli-vert, er blitt deponert hos Northern Regional Research Center hos De forente staters landbruksdepartement for å sikre adgang for offentligheten ved utstedelse av den foreliggende søknad som et patent. E. coli-stammen MC1061-pBSAG5 er blitt gitt aksesjonsnummer NRRL B-18028.

Eksempel IV

Konstruksjon av Pichia pastoris HBsAG ekspresjonsvert GS115

( PBSAGI5I)

Fremstillingen av en Pichia pastoris-vert hvor det primære alkoholoksidasegen (AOX1) erstattes med hepatitt-B-overflateantigen-genet (HBsAg) i Pichia-kromosomet, er beskrevet i dette eksempel.

For å fremstille P. pastoris HBsAg-ekspresjons-AOX1-mutantverten ble plasmid pBSAGI5I konstruert som vist på fig. 9-11. Det første trinn i konstruksjonen var å digerere AOXl-promotor/- LacZ-genekspresjonsvektoren pSAOH5 og A0X1-promotor/HBsAg-ekspresjonsvektoren pTHBS3, fremstilt som beskrevet nedenunder og angitt på fig. 13, med restriksjonsendonuklease Hindlll. For å fremstille pTHBS3, ble plasmid pAOT-1 (se fig. 7) kappet med Stul, ligatisert med EcoRI-linkere og deretter digerert med Pstl. EcoRI-Pstl-fragmentet inneholdende 3<1->AOX1-fragmentet ble isolert. Vektor pAOP3, som inneholder 5<1->AOX1-sekvenser, ble kappet med EcoRI og Ssti, det resulterende 5'-AOX1-fragment ble ligatisert inn i E. coli-S. cerevisiae skyttelvektoren pSEYlOI (Douglas et al (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81_, 3983-3987), som tidligere var blitt kappet med EcoRI og Sstl. Resultatet av ligatisering av disse pAOP3- og pSEY101-fragmenter var plasmid pTAO20. Plasmid pTAO20 inneholder URA3- og ampicil-lin-gener for seleksjon i henholdsvis S. cerevisiae og bakte-rier, 2 ji-sirkelen for replikasjon i S. cerevisiae og 5'-AOX1-sekvenser.

Plasmid pTAO20 ble delvis kappet med Pstl. Den lineariserte vektor ble isolert og kappet med EcoRI. Det største fragment (som inneholdt 2 n-sirkelsekvensene, URA3-genet og 5'-A0X1-fragmentet) ble ligatisert til 3'-A0X1-fragmentet som ble oppnådd fra pAOT-1, for å produsere vektor pTHBSI.

Det HBsAg-holdige EcoRI-fragment fra pHBS-5 ble isolert ved digestion med EcoRI, deretter ligatisert med pTHBSI, som tidligere var blitt digestert med EcoRI og behandlet med bakterielt alkalisk fosfatase. Den resulterende vektor, betegnet pTHBS2, har HBsAg-genet innsatt mellom 3<1-> og 5'-A0X1-sekvensene.

Plasmid pYJ30 (tilgjengelig i en E. coli-vert som NRRL B-15890) ble kappet med EcoRI, fylt inn med Klenow-fragment og deretter kappet med Pstl. Det P. pastoris HIS4/PARS1-holdige fragment ble isolert og ligatisert med Pstl-Sstl-fragment fra vektor pTHBS2 (som inneholder HBsAg-genet flankert av A0X1-sekvensene). Denne ligasjon gir vektor pTHBS3.

Fragmentet på 1,4 kbp som ble oppnådd fra pTHBS3 ved digerering med Hindlll (hvilket fragment inneholder HBsAg-genet, A0X1 - avslutningssekvensen og et parti av A0X1-promotorsekvensen), ble utvunnet og innsatt i 7,7 kbp-fragmentet fra pSA0H5, som inneholder Pichia HIS4-genet, mesteparten av A0X1-promotorsek-vensen og sekvensene fra pBR322. Et 9,1 kbp rekombinant plasmid pYM39, som inneholder de gjenopprettede A0X1-promotorsekvenser ble deretter isolert.

For det andre konstruksjonstrinn ble plasmidet pPG3.2 (tilgjengelig i en E. coli-vert som NRRL B-15999) digerert med PvuII og et 1,5 kbp fragment som inneholder sekvenser like i nærheten av 3' av A0X1-genet ble innsatt i det eneste Nrul-sete av pYM39. Et 10,6 kbp rekombinant plasmid pYMl6 ble isolert, hvilket inneholdt PvuII-fragmentet orientert slik at 3'-AOX1-genets proksi-male sekvenser var orientert med HIS4-genpartiet av vektoren. Plasmid pYMI6 inneholdt alle komponenter nødvendige for sletting av AOX1-genet fra Pichia-verten og ekspresjon av HBsAg med A0X1-promotorkontroll, men det inneholder ikke det trimmede HBsAg-genfragment av pBSAG5.

Det siste konstruksjonstrinn gikk derfor ut på å rekombinere det ønskede HBsAg-gen inn i en A0X1-genslettingsvektor. For dette formål ble pYMI6 og pBSAG5I (et plasmid identisk med pBSAG5 bortsett fra at Clal-fragmentet som inneholder HBsAg-ekspresjonskassetten har den motsatte orientering) digerert ved restriksjonsenzymer Pstl og Sphl. Fragmentet på 6,3 kbp fra pBSAG5I, som inneholder den trimmede HBsAg-genekspresjonskassett og Pichia HIS4-genet, ble innsatt i 4,6 kbp fragmentet fra pYMI6r som inneholder 3'-A0X1-sekvensene og mesteparten av pBR322 for å gi det endelige 10,9 kbp plasmid, pBSAGI5l. Plasmid pBSAGI5I, båret i en E. coli-vert, er blitt deponert hos the Northern Regional Research Center i Peoria, Illinois, for å sikre tilgjengelighet for offentligheten ved utstedelse av den foreliggende søknad som et patent og er blitt gitt aksesjonsnummer NRRL B-18021.

For å transformere P. pastoris his4 mutantstamme GS115 (NRRL Y-15851), ble pBSAGI51 først digerert med restriksjonsenzym Bglll for å gi en 7,2 kbp lineær vektor som inneholder 0,85 kbp av sekvens fra 5<1> på AOX1-genet ved én ende og 1 ,1 kbp av sekvens fra 3<*> på AOX1-genet ved den andre ende (fig. 12). Ca. 2 ug Bglll-kappet pBSAGI5I ble transformert inn i GS115 ved seleksjon for histidinprototrofi. Ca. 5 x 10<3> His<+->kolonier resulterte fra transformasj onen.

Transformasjonsfremgangsmåter hvor pBSAGI5I ble innsatt som et lineært molekyl ved det AOX1 kromosomale lokus fører til sletting av AOX1-genet. Derfor ble His<+->transformerte stammer, hvor den ønskede lineære innsetting hadde funnet sted, identifisert ved deres meget langsomme veksthastighet på metanol (P. pastoris har et andre "svakere" alkoholoksidasegen, AOX2, som produserer alkoholoksidase tilstrekkelig for metanolvekst ved en lav hastighet i stammer som er defekte med hensyn til det primære alkoholoksidasegen).

Fremgangsmåten for identifisering av His<+->transformantene som ikke vokste godt på metanol, var å først utvinne de His<+->celler som var innleiret i den selektive agar. Dette utvinningstrinn ble utført ved overføring av agaren til et 50 ml rør inneholdende 20 ml sterilt vann og pulverisering av agaren ved bruk av et Brinkman homogeniseringsapparat ved lav hastighet i 30 sekunder. Agaravfall ble separert fra cellene ved filtrering av blandingen gjennom gas (gauze) og rensing av agaren med 30 ml sterilt vann. Gjærcellene ble deretter fortynnet til en optisk densitet ved A500 på- 0,1, lydbehandlet (sonicated) i 10 sekunder ved bruk av en Branson sonifier ved en innstilling på 4 for å bryte fra hverandre klumper av gjærceller og fortynnet 100 ganger med sterilt vann. Porsjoner på 10 og 100 ul ble spredt på agarplater inneholdende 0,67 prosent gjær-nitrogenbase uten aminosyrer (Difco) og 0,1 prosent glukose. Etter inkubering ved 30°C i 3 dager ble kolonier som kom til syne på platene sortert for deres evne til å vokse på metanol ved replikatplating av koloniene på en serie agarplater inneholdende 0,67 prosent gjær-nitrogenbase uten aminosyrer og de følgende karbonkilder: 1) ingen karbonkilde, 2) 0,5 prosent metanol og 3) 2 prosent glukose. Av de kolonier som vokste på 2 prosent glukose var det

32 prosent som ikke kunne vokse godt på metanol.

For å bekrefte at pBSAGl5I-sekvensene var innsatt som vist på fig. 12, ble det samlede DNA ekstrahert fra en av P. pastoris-stammene defekt i metanolbenyttelse, digerert med restriksjons-endonukleaser og hybridisert ved Southern blot-metoden med <32p_ >merkede prober. I ett sett Southern blots ble DNA fra Aox1~-stammen, GS115 (pBSAGI5I) og Aox1<+->stammen GS115 digestert med Hindlll og hybridisert med merket pPG4.0, et plasmid bestående av AOX1-genet og sekvenser fra pBR322 tilgjengelig i en E. coli-vert fra the Northern Regional Research Center i Peoria, Illinois, som NRRL B-15868. Et 2,3 kbp fragment som koder for AOX1 ble sett i feltene inneholdende GS115-DNA. 2,3 kbp fragmentet var imidlertid fraværende, og ingen nye fragmenter viste seg i de felter som inneholdt GS115(pBSAGI5I)-DNA. Dette resultat viser at AOX1-genet var blitt slettet fra GS115(pBSAGI5I)-stammen.

Eksempel V

Dyrking av Pichia- gjær transformert med HBsAg- kodende vektorer 1 . Dyrking av GSH5 ( pBSAG5) i et gjæringsapparat. 10 prosent podestoff ble dyrket over natten i gjær-nitrogenbase (YNB) + 2 prosent glukose i en ristekolbe ved 30°C. Podestoffet ble satt til steriliserte basalsalter (justert til pH 4) i gjæringsapparatet. Glukosematningsmaterialet ble tilført ved en fortynnelseshastighet på 0,05-0,1 h-1 . Når celletettheten nådde et jevnt nivå og glukosenivåene i gjæringsapparatet nærmet seg mindre enn 100 ppm, ble HBsAg-produksjonen indusert ved ombyt-ting av matningskarbonkilden til metanol eller en 50 prosent glukose/50 prosent metanol-blanding. 2. Dyrking av GS115 ( pBSAGI5I) ( Aox1~) i et gjæringsapparat Optimal ekspresjon av oppløselig HBsAg Ausria aktivitet (3-4 prosent oppløselig protein) er blitt oppnådd ved dyrking av denne Aox1"-organisme i satsvis mode på glycerol, fulgt av et metanolholdig matningsmateriale. Podestoff kan dyrkes på YNB + glycerol. Basalsalter pluss glycerol (1 prosent og 4 prosent glycerol er blitt benyttet) og biotin kan underkastes autokla-ving i gjæringsapparatet. Etter avkjøling bør pH-verdien justeres på mellom 3,5 og 6 og sporsalter (2,5 ml/l) tilsatt før poding. Et hundre prosent metanol kan startes før eller etter at glycerolen er blitt oppbrukt. Metanolnivåer så høye som 2 prosent virker ikke forstyrrende på HBsAg-akumulering, som kan fortsette så lenge som 200 timer. 5 prosent metanol i gjæringsapparatet vil imidlertid stoppe akkumuleringen av HBsAg-partikkel.

Dyrking til høyere celletettheter er blitt oppnådd ved økning av konsentrasjonene av matningssalt. Økede sinknivåer er særlig viktige for økede celletettheter ved dyrking på metanol. Høyere nivåer av ekstraherbar Ausria-aktivitet er blitt oppnådd når veksten ikke var begrenset ved sink, men det ekstraherbare protein var også høyere, hvilket førte til en netto reduksjon i Ausria-aktivitet som en prosentandel av oppløselig protein.

3. Ristekolbe- dvrking av cellekulturer av GS115 ( pBSAG5) og

GS115 ( pBSAGI5I)

En transformert koloni ble plukket ut og strøket ut på en SD-plate. Et utstryk av celler ble podet i 50 ml YNB-næringsvæske (1 x YNB, 5 ug/ml biotin) med 5 prosent glucose i en 250 ml ristekolbe og ristet ved 30°C ved 250 omdreininger pr. minutt i et luftristeapparat over natten. ODgøQ-avlesningen om morgenen var mellom 2 og 3. 100 ODgøo-enheter celler (ca. 10<9> celler) ble fjernet fra ristekolben og sentrifugert i en IEC-sentrifuge i 7 minutter ved 2000 x g ved værelsetemperatur. Cellepelleten ble resuspendert i 500 ml YNB-næringsvæske med 2 prosent glycerol i en 2 liters ristekolbe (ODgoo = °/2). Kulturen ble inkubert ved 30°C og 250 omdreininger pr. minutt i et luftristeapparat inntil ODgoo nådde 2-3 ODgoo* 1 tilfellet for Aox1"-verten ble 500 OD600 fjernet fra kulturen. Cellesuspensjonen ble sentrifugert i et IEC i 7 minutter ved 2000 x g. Cellepelleten ble resuspendert i 500 ml YNB-næringsvæske med 0,5 prosent metanol (1,0 ODgoo)* 1 tilfellet for Aox1<+->verten ble 170 ODgoo-celler fjernet fra kulturen, sentrifugert under de samme betingelser og resuspendert i 500 ml YNB-næringsvæske med 0,5 prosent metanol (0,3 ODgoo)- Begge kulturer ble ristet i 2 liters risteflasker ved 30°C og 250 omdreininger pr. minutt. I de tilfeller hvor en ODgoo <2> 2 ble oppnådd, ble kulturene fortynnet to ganger med de samme dyrkningsmedia. 100 ODgoo-prøver ble fjernet periodisk og sentrifugert i 7 minutter ved 2000 x g. De resulterende celle-pellets kan lagres i frossen tilstand ved -70°C i 1-2 uker.

Eksempel VI

Analyse av HBsAg: 22 nm- partikkel og HBsAg- monomer

1. Fremstilling av ekstrakter og proteinbestemmelse Alle de følgende operasjoner ble utført ved 0-4°C. Den frosne cellepellet ble tinet opp, deretter vasket to ganger med 2 ml iskald oppløseliggjørende buffer. Cellene (100 ODgoo-enheter) ble overført til et engangsglassrør (13 x 100 mm). 0,35 ml oppløseliggjørende buffer og 0,5 g syrevaskede glassperler (0,45 mm i diameter) ble satt til cellepelleten. Denne suspensjon ble ristet på en virvelmikser (vortex mixer) ved maksimal innstilling fire ganger på ett minutt hver og holdt på is i intervaller på ett minutt mellom hver risting på is. Oppslemmingen av hele celler ble fjernet, og glasskulene ble vasket med 0,35 ml oppløseliggjørende buffer. Vaskebufferen ble kombinert med celleoppslemmingen og overført til et Eppendorf-rør. Ekstraktet ble sentrifugert i en Eppendorf-sentrifuge i 15 minutter. Den ovenpåflytende væske (oppløselig fraksjon, 0,7 ml) ble fjernet fra pelleten. For å ekstrahere HBsAg-protein fra pelleten blé 0,7 ml av 2 x konsentrert SDS/oppløseliggjørende-buffer satt til pelleten, og blandingen ble omrørt på en virvelmikser og kokt i 15 minutter. Blandingen ble sentrifugert i 15 minutter, deretter ble den ovenpåflytende væske (uoppløselige fraksjon) fjernet fra celleavfallet. Porsjoner fra de oppløselige og uoppløselige fraksjoner ble analysert for proteininnhold ved bruk av TCA-bunnfelling og Lowrys metode. BSA tjente som en proteinkonsen-trasjonsstandard. Både de uoppløselige og oppløselige fraksjoner hadde vanligvis proteinkonsentrasjoner i området 3-15 mg/ml. 2. Alternativ fremgangsmåte for fremstilling av ekstrakter Denne fremgangsmåte beskriver betingelser for ekstraksjon av det monomere heterologe protein HBsAg eller proteinkomplekset, 22 nm-partikkel, fra kulturer a<y> Pichia pastoris transformert med vektorer inneholdende sekvenser som koder for HBsAg-proteinet.

Kulturer av P. pastoris ble dyrket til en celletetthet på 10-100 O<D>goo-enheter pr. ml. En porsjon av 100 ODgoo_<e>nheter ^ le overført til et 13 x 100 ml borsilikat dyrkingsrør og vasket to ganger med 20 volumer oppløseliggjørende buffer.

Cellene ble pelletert, og deretter ble der til de pelleterte celler (IEC klinisk sentrifuge) tilsatt 0,5 g syrevaskede glasskuler (0,5 mm), fulgt av 0,35 ml oppløseliggjørende buffer. Den oppløseliggjørende buffer inneholdt enten 0,5 M NaCl og 0,1 prosent Triton X-100 (vekt/volum) som en sammenligningsprøve, eller en 3 M-konsentrasjon av kaliumiodid eller kaliumtiocyanat i nærvær eller fravær av 0,1 prosent Triton X-100. Alle oppløs-ninger ble buffret ved pH = 7,5 med 10 mM natriumfosfat. Blandingen ble agitert i fire intervaller på ett minutt hver ved maksimal hastighet ved bruk av en virvelmikser. Mellom interval-lene ble blandingen avkjølt på is i ikke mindre enn 1 minutt. Etter at lyse var fullstendig, ble oppløsningen av oppbrudte celler fjernet, glasskulene ble vasket med 0,35 ml oppløselig-gj ørende buffer, og de to oppløsninger ble kombinert og under-kastet sentrifugering i 15 minutter ved 13.000 x g. De ovenpåflytende væsker ble fjernet og analysert for immunoreaktiv HBsAg-partikkel (Ausria-analyse) og samlet trikloreddiksyre utfellbart protein (Lowry). Resultatene, som omfatter 5 eksperi-menter, er vist i tabell I.

Skjønt ingen av betingelsene omfattende kaliumiodid eller kaliumtiocyanat gir verdier for HBsAg-partikkel høyere enn betingelsene som anvender natriumklorid (kolonne A), er det klart at kaliumiodid eller kaliumtiocyanat hindrer frigjøringen av samlet protein (kolonne B), hvilket øker den spesifikke aktivitet av partikkelen 2-5 ganger (kolonne C). 3. Analyser av 22 nm- partikkel ( AUSRI<A>™ II- pakke Den oppløselige fraksjon ble fortynnet fra 1000 til 10.000 ganger med Ausria-fortynningsbuffer, og porsjoner på mellom 25 og 100 ul ble analysert som følger:

Første inkubasjon

1. For å konstruere en standardkurve ble en fortynningsserie inneholdende fra 0,1 ng inntil 4 ng sammenligningsprøve i et samlet volum på 200 ul hver overført med pipette inn i bunnen av individuelle brønner i et reaksjonsbrett (sammen med 4 negative sammenligningsprøver).

For at prøvene skulle bli analysert, ble 200 ul av hver fortynnet oppløselige fraksjon overført med pipette til bunnen av

separate brønner på reaksjonsbrettet.

2. Én glasskule (bead) ble omhyggelig satt til hver brønn inneholdende en prøvefraksjon eller kontrollprøve. Alternativt kan kuler dispenseres før tilsetningen av kontrollprøver eller forsøksprøver. 3. Det tettende lokk ble lagt på reaksjonsbrettet, som ble forsiktig banket på for å dekke kulene og fjerne eventuelle innesluttede luftbobler.

4. Reaksjonen ble deretter inkubert ved 45°C i 2 timer.

5. Tetningslokket ble fjernet og kassert. Væsken ble luftet, og hver kule vasket to ganger med 4-6 ml destillert eller avionisert vann.

Andre inkubasi on

6. 200 ul av <125>j_Anti-HBs ble overført med pipette til hver brønn inneholdende en kule. 7. Et nytt tetningslokk ble brukt, og reaksjonsbrettet forsiktig banket på for å dekke kulene og fjerne eventuelle innesluttede luftbobler. 8. Reaksjonsbrettet ble deretter inkubert ved 45°C i 1 time. 9. Tetningslokket ble fjernet og kassert. Væsken ble luftet, og hver kule vasket fire ganger som i trinn 5. 10. Kulene ble deretter straks overført til riktig identifi-serte tellerør.

Gamma scintillasi onsteller- avlesning

11. Tellehastigheten ble bestemt i ett minutt.

12. Prøvene ble tellet innen 24 timer etter den endelige vask.

Nivået av 22 nm-partikler ble beregnet ved bruk av standardkur-ven generert som beskrevet i trinn 1.

4. Monomeranalyse ( Western analyse)

Det ekvivalente volum av 25 ug protein (oppløselig eller uoppløselig fraksjon), vanligvis 2-5 ul, ble bragt på et volum av 10 ul med H2O. 10 ul 2 x konsentrert SDS-gel lastebuffer (100 mM DTT i 1 x buffer) ble tilsatt, og prøven ble kokt i 15 minutter. De kokte prøver ble lastet på en 12 prosent SDS-akrylamidgel (Laemmli). Etter gelelektroforese ble proteinene overført til nitrocellulosepapir (Twobin et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76, 4350-4354 (1979)). HBsAg ble påvist med HBsAg-antisera (utviklet mot plasmaavledet HBsAg) og 1^j-mer^gt protein A. Nitrocellulosepapiret ble utsatt for Kodak XAR-5-film over natten ved -70°C. Kvantitativ bedømmelse av monomeren ble utført ved telling av de radioaktive bånd fra nitrocellulosepapiret i en gammateller. Rekombinant HBsAg fremstilt ved S. cerevisiae (100-500 ng/felt) ble brukt som en standard.

Eksempel VII

Ekspresjonsnivå av HBsAg i Pichia pastoris

Produksjonen av HBsAg ved forskjellige transformerte P. pastoris-stammer ble bestemt ved analysefremgangsmåten som angitt i eksempel VI ved bruk av den oppløseliggjørende fremgangsmåte beskrevet i del 1 av eksempel VI. Resulatene er angitt i tabell

II.

HBsAg-nivåa (fermentordyrking)

Resultatene angitt ovenfor viser at høye nivåer av HBsAg kan produseres i Pichia pastoris under styring av det primære alkoholoksidasegen (A0X1) regulerende område fra Pichia pastoris.

Claims

1. DNA-fragment, karakterisert ved at det omfatter: (a) et tilnærmet 2,9 kbp-langt regulerende område som fås fra dihydroksyacetonsyntase-genet (DAS) av Pichia eller et tilnærmet 2,0 kbp-langt regulerende område som fås fra det primære alkoholoksidase-gen (AOX1) av Pichia eller et tilnærmet 3 kbp-langt regulerende område som fås fra p40-genet av Pichia som kan styre transkripsjonen av messenger-RNA når det er anordnet ved 5'-enden av det polypeptidkodende område, idet det nevnte regulerende område reagerer på minst én av betingelsene valgt fra: (i) nærværet av metanol i det dyrkingsmedium som en vertsorganisme inneholdende det nevnte DNA-fragment er i kontakt med, (ii) nærværet av en ikke-katabolittundertrykkende karbonkilde annen enn metanol i det dyrkningsmedium som en vertsorganisme inneholdende det nevnte DNA-fragment er i kontakt med, og (iii) karbonkildehunger i det dyrkningsmedium som en vertsorganisme inneholdende det nevnte DNA- I M ^ mS V ■ fragment er i kontakt med etter dyrking av vertsorganismen på en katabolittundertrykkende karbon- og energikilde; og (b) et polypeptidkodende område hvor det nevnte kodende område koder for hepatitt-B-overflateantigen, og eventuelt (c) ett eller flere av de følgende: en 3' sekvens av DNA på nedsiden av det polypeptidkodende område, idet 3'-sekvensen av DNA kan styre polyadenylerin-gen og avslutningen av transkripsjonen av messenger-RNA kodet for ved det nevnte polypeptidkodende område, én eller flere ytterligere DNA-sekvenser som fås fra bakterielt plasmid DNA bakteriofag DNA gjærplasmid DNA, og gjær kromosomalt DNA, i serie anordnet DNA som omfatter: et første innsettbart DNA-fragment, et selekterbart markørgen, og et andre innsettbart DNA-fragment; idet de første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver minst 2 00 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er homologe med partier av det genomiske DNA av arter av slekten Pichia, idet det nevnte DNA-fragment og det nevnte markørgen er anordnet mellom 3'-enden av det nevnte første innsettbare DNA-fragment og 5•-enden av det nevnte andre innsettbare DNA-fragment, og hvor de første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert i forhold til hverandre slik de er orientert i genomet av Pichia.

2. DNA-fragment som angitt i krav 1, karakterisert ved at det nevnte Pichia primære alkoholoksidase (A0X1) regulerende område er identifisert som vist ved restriksjonskartet på fig. 2 på tegningen.

3. DNA-fragment som angitt i krav 1, karakterisert ved at det nevnte Pichia DAS regulerende område er identifisert som vist på restriksjonskartet på fig. 1 på tegningen.

4. DNA-fragment som angitt i krav 1, karakterisert ved at det Pichia p40 regulerende område er identifisert som vist ved restriksjonskartet på fig. 3 på tegningen.

5. DNA-fragment som angitt i krav 1, karakterisert ved at de nevnte AOX1 eller p40 eller DAS regulerende områder fås fra Pichia pastoris.

6. DNA-fragment som angitt i krav 1, karakterisert ved at det nevnte gjær-kromosomale DNA omfatter en autonomt replikerende DNA-sekvens og et markørgen.

7. DNA-fragment som angitt i krav 1, karakterisert ved at det polypeptidkodende område omfatter EcoRI-StuI-fragmentet med en størrelse på tilnærmet 700 basepar som vist nedenfor:

8. Plasmid som kan uttrykke et gen som koder for hepatitt-B-overf lateantigen, karakterisert ved at det omfatter DNA-fragmentet som angitt i krav 1, bakterielt plasmid DNA, et selekterbart gjær-markørgen og en gjærautonom replika-sj onsfrekvens.

9. Plasmid som angitt i krav 8, karakterisert ved at det nevnte plasmid er valgt fra pBSAG5 (NRRL B-18028), pBSAG5I som vist på fig. 11 og pBSAGI5I (NRRL B-18021) som vist på fig. 11, idet C på fig. 11 svarer til et Clal-restriksjonssete og pBSAG5 og pBSAG5I avviker med hensyn til orienteringen av Clal-fragmentet.

10. Stort sett ren kultur av en stamme av slekten Pichia som kan uttrykke det nevnte gen og dermed produsere hepatitt-B-overf lateantigen, karakterisert ved at den er transformert med et plasmid valgt fra pBSAG5 (NRRL B-18028), pBSAG5I og pBSAGI5I (NRRL B-18021) slik de er angitt i krav 9.

11. Stort sett ren kultur som angitt i krav 10, karakterisert ved at stammen er av slekten Pichia pastoris.

12. Stort sett ren kultur av en stamme av slekten Pichia som kan uttrykke det nevnte gen og dermed produsere hepatitt-B-overf lateantigen, karakterisert ved at den er transformert med en ekspresjonsvektor som omfatter DNA-fragmentet ifølge et av kravene 1-7.

13. Fremgangsmåte til fremstilling av hepatitt-B-overflateantigen, karakterisert ved dyrking av en Pichia-stamme transformert med plasmidet ifølge krav 11 i et næringsmedium som omfatter minst én karbon- og energikilde valgt fra metanol og en ikke-katabolittundertrykkende karbonkilde, omfattende de følgende trinn: (a) dyrking av en gjærstamme transformert med plasmidet som angitt i krav 8 i et næringsmedium som omfatter minst én katabolittundertrykkende karbon- og energikilde, (b) produktet fra trinn (a) underkastes betingelser av karbonkildehunger, og (c) isolering og rensing av det nevnte hepatitt-B-overflateantigen.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at den nevnte transformerte Pichia-stamme som kan vokse på metanol som karbon- og energikilde er Pichia pastoris GS 115.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at den nevnte transformerte Pichia-stamme som kan vokse på metanol som en karbon- og energikilde er Pichia pastoris GS 190.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 13, karakterisert ved at den transformerte Pichia-stamme er Pichia pastoris PPF1.