JP6151183B2 - マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合からキャップを外すことおよびリン酸化n−グリカンを脱マンノシル化することができるマンノシダーゼならびに哺乳動物細胞による糖タンパク質の取り込みを促進する方法 - Google Patents
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Description
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
糖タンパク質におけるマンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分のキャップを外して、リン酸化N−グリカンを脱マンノシル化するための方法であって、
a)該マンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分を含有するリン酸化N−グリカンを有する該糖タンパク質を提供する工程と、
b)該糖タンパク質を、(i)マンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分をマンノース−6−リン酸に加水分解することができかつ(ii)末端α−1,2マンノース結合、α−1,3マンノース結合、および/またはα−1,6マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させる工程
とを含む、前記方法。
(項目2)
リン酸化N−グリカンを脱マンノシル化する方法であって、
a)リン酸化N−グリカンを含む糖タンパク質を提供する工程と、
b)該糖タンパク質を、(i)マンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分をマンノース−6−リン酸に加水分解することができかつ(ii)末端α−1,2マンノース結合、α−1,3マンノース結合、および/またはα−1,6マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させる工程
とを含む、前記方法。
(項目3)
前記マンノシダーゼは、ファミリー38のグリコシルヒドロラーゼである、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記マンノシダーゼは、Canavalia ensiformis由来である、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
前記マンノシダーゼは、Yarrowia lipolytica由来である、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
工程(a)および工程(b)の後に、哺乳類細胞を、前記脱マンノシル化したリン酸化N−グリカンを含む前記糖タンパク質と接触させる工程であって、ここで、該接触させる工程の後に、該糖タンパク質は、該哺乳類細胞の内部へ輸送される工程をさらに含む、項目1〜5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記哺乳類細胞はヒト細胞である、項目6に記載の方法。
(項目8)
糖タンパク質を哺乳類細胞の内部へ向ける方法であって、a)マンノース−6−リン酸部分が脱マンノシル化した糖タンパク質を提供する工程と、b)該細胞を該脱マンノシル化した糖タンパク質と接触させる工程とを含む、方法。
(項目9)
前記マンノシダーゼはファミリー47のグリコシルヒドロラーゼである、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記糖タンパク質は、Aspergillus satoi由来のマンノシダーゼを使用して脱マンノシル化される、項目8または項目9に記載の方法。
(項目11)
前記マンノシダーゼは、ファミリー92のグリコシルヒドロラーゼである、項目8に記載の方法。
(項目12)
前記糖タンパク質は、Cellulosimicrobium cellulans由来のマンノシダーゼを使用して脱マンノシル化される、項目8または項目11に記載の方法。
(項目13)
前記マンノシダーゼは、ファミリー38のグリコシルヒドロラーゼである、項目8に記載の方法。
(項目14)
前記マンノシダーゼは、Canavalia ensiformisまたはYarrowia lipolytica由来である、項目8または項目13に記載の方法。
(項目15)
糖タンパク質を哺乳類細胞の内部へ向ける方法であって、
a)リン酸化N−グリカンを有する糖タンパク質を提供する工程であって、ここで、該糖タンパク質は該細胞のマンノース−6−リン酸受容体に実質的に結合しない工程と、
b)該糖タンパク質を、末端α−1,2マンノース結合を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させる工程であって、基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に脱マンノシル化した糖タンパク質を生成し、ここで、該糖タンパク質は該脱マンノシル化の後、該細胞における該マンノース−6−リン酸受容体に実質的に結合する工程と、
c)該細胞を該脱マンノシル化した糖タンパク質と接触させる工程
とを含む、前記方法。
(項目16)
前記マンノシダーゼはファミリー47のグリコシルヒドロラーゼである、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記マンノシダーゼはAspergillus satoi由来である、項目15または項目16に記載の方法。
(項目18)
前記マンノシダーゼはファミリー92のグリコシルヒドロラーゼである、項目15に記載の方法。
(項目19)
前記マンノシダーゼはCellulosimicrobium cellulans由来である、項目15または項目18に記載の方法。
(項目20)
前記マンノシダーゼはファミリー38のグリコシルヒドロラーゼである、項目15に記載の方法。
(項目21)
前記マンノシダーゼはCanavalia ensiformisまたはYarrowia lipolytica由来である、項目15または項目20に記載の方法。
(項目22)
糖タンパク質を、哺乳類細胞のマンノース−6−リン酸受容体に実質的に結合しない第一の形態から、哺乳類細胞のマンノース−6−リン酸受容体に実質的に結合する第二の形態へと変換する方法であって、該第一の形態の該糖タンパク質を、末端マンノース残基を脱マンノシル化するマンノシダーゼと接触させる工程を含み、ここで、該第一の形態において、該糖タンパク質は、その6位にリン酸残基を含有するマンノース残基に対しその1位で結合するマンノース残基を1つ以上含有する1つ以上のN−グリカンを含む、方法。
(項目23)
前記マンノシダーゼは、キャップを外してかつ脱マンノシル化する活性を有する、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記マンノシダーゼはファミリー38のグリコシルヒドロラーゼである、項目22または項目23に記載の方法。
(項目25)
前記マンノシダーゼはCanavalia ensiformisまたはYarrowia lipolytica由来である、項目22〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記マンノシダーゼはキャップを外す活性を有しない、項目22に記載の方法。
(項目27)
前記マンノシダーゼは、ファミリー47またはファミリーの92グリコシルヒドロラーゼである、項目22または項目26に記載の方法。
(項目28)
前記マンノシダーゼは、Aspergillus satoiまたはCellulosimicrobium cellulans由来である、項目22、項目26、または項目27に記載の方法。
(項目29)
1つ以上のマンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分を含む糖タンパク質を哺乳類細胞の内部へ向ける方法であって、(a)該糖タンパク質における該1つ以上のマンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分をマンノース−6−リン酸へとキャップを外す工程であって、ここで、キャップを外した後、該糖タンパク質は該細胞のマンノース−6−リン酸受容体に実質的に結合しない工程、および、工程(a)の後、(b)該糖タンパク質におけるリン酸化N−グリカンを脱マンノシル化する工程であって、ここで、該キャップを外す工程および該脱マンノシル化する工程の両者の後に、該糖タンパク質は該細胞のマンノース−6−リン酸受容体に実質的に結合する工程、の後に該細胞を該糖タンパク質と接触させる工程を含む、方法。
(項目30)
工程(a)および工程(b)は2つの異なる酵素によって触媒される、項目29に記載の方法。
(項目31)
工程(a)および工程(b)は単一の酵素によって触媒される、項目29に記載の方法。
(項目32)
糖タンパク質を哺乳類細胞の内部へ向ける方法であって、キャップを外されかつ脱マンノシル化したリン酸化N−グリカンを有する糖タンパク質を提供する工程と、該哺乳類細胞を該糖タンパク質と接触させる工程とを含む、方法。
(項目33)
前記糖タンパク質はヒトタンパク質である、項目1〜32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記糖タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質である、項目1〜32のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記リソソームタンパク質はリソソーム酵素である、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記リソソーム酵素は、酸性αグルコシダーゼまたはαガラクトシダーゼである、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記糖タンパク質はLSDと関連している、項目33に記載の方法。
(項目38)
前記LSDは、ファブリー病、ムコ多糖症I型、ファーバー病、ゴーシェ病、GM1ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、GM2活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、1型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症である、項目37に記載の方法。
(項目39)
項目1〜38のいずれか一項に記載の方法で処理された、哺乳類細胞の内部へ輸送されることのできる糖タンパク質。
(項目40)
項目39に記載の糖タンパク質を含む哺乳類細胞。
(項目41)
前記細胞はヒト細胞である、項目40に記載の哺乳類細胞。
(項目42)
項目39に記載の糖タンパク質の投与を必要とする被験体に、該糖タンパク質を投与する工程を含む、処置方法。
(項目43)
脱マンノシル化したリン酸化N−グリカンを含む糖タンパク質を産生するよう遺伝子操作された単離された真菌細胞であって、マンノシダーゼをコードする核酸を含み、該マンノシダーゼが、(i)マンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分をマンノース−6−リン酸に加水分解することができかつ(ii)末端α−1,2マンノース結合、α−1,3マンノース結合、および/またはα−1,6マンノース結合を加水分解することができる、真菌細胞。
(項目44)
前記真菌細胞はさらに、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含む、項目43に記載の真菌細胞。
(項目45)
前記真菌細胞は、OCH1活性を欠損しているよう遺伝子操作される、項目43または項目44に記載の真菌細胞。
(項目46)
標的タンパク質をコードする核酸をさらに含む項目43〜45のいずれか一項に記載の真菌細胞であって、ここで、該標的タンパク質が糖タンパク質である、該真菌細胞。
(項目47)
前記標的タンパク質はヒトタンパク質である、項目46に記載の真菌細胞。
(項目48)
前記標的タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質である、項目46に記載の真菌細胞。
(項目49)
前記リソソームタンパク質はリソソーム酵素である、項目48に記載の真菌細胞。
(項目50)
前記リソソーム酵素は酸性αグルコシダーゼまたはαガラクトシダーゼである、項目49に記載の真菌細胞。
(項目51)
前記糖タンパク質は、LSDと関連しているタンパク質である、項目47に記載の真菌細胞。
(項目52)
前記LSDは、ファブリー病、ムコ多糖症I型、ファーバー病、ゴーシェ病、GM1ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、GM2活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、1型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症である、項目51に記載の真菌細胞。
(項目53)
前記真菌細胞は、Yarrowia lipolytica細胞またはArxula adeninivorans細胞である、項目32〜41のいずれか一項に記載の真菌細胞。
(項目54)
マンノシルリン酸化を促進することのできる前記ポリペプチドはMNN4ポリペプチドである、項目33に記載の真菌細胞。
(項目55)
前記MNN4ポリペプチドは、Yarrowia lipolyticaポリペプチド、S.cerevisiaeポリペプチド、Ogataea minutaポリペプチド、Pichia pastorisポリペプチド、またはC.albicansポリペプチドである、項目43に記載の真菌細胞。
(項目56)
マンノシルリン酸化を促進することのできる前記ポリペプチドは、P.pastoris PNO1ポリペプチドである、項目44に記載の真菌細胞。
(項目57)
前記マンノシダーゼは分泌シグナルを含む、項目43〜56のいずれか一項に記載の真菌細胞。
(項目58)
前記マンノシダーゼは、該マンノシダーゼを細胞内区画へ導くためのターゲッティングシグナルを含む、項目43〜56のいずれか一項に記載の真菌細胞。
一般に、本文書は、マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合またはマンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分をホスホ−6−マンノース(本明細書においては「マンノース−6−リン酸」とも呼ぶ)に加水分解すること(「キャップを外すこと」)、かつこのようなホスフェート含有グリカンの末端α−1,2マンノース結合、α−1,3マンノース結合、および/もしくはα−1,6マンノース結合または末端α−1,2マンノース部分、α−1,3マンノース部分、および/もしくはα−1,6マンノース部分を加水分解すること(「脱マンノシル化すること」)のための方法および材料を提供する。(個別の酵素または単一の酵素のいずれかによる)キャップを外すことおよび脱マンノシル化の両方が糖タンパク質の哺乳類細胞への取り込みを達成するために必要とされる場合に哺乳類細胞による糖タンパク質の取り込みを促進する方法も提供される。本明細書に記載される方法および材料は、リソソーム中の蓄積産物の分解に関与する触媒酵素のそこなわれた活性によるリソソーム中の該蓄積産物の蓄積を特徴とする遺伝性代謝障害の1つの異なる群であるリソソーム蓄積障害(LSD)を有する患者を処置するための薬剤を生成するのに特に有用である。蓄積産物の集積は、細胞の機能障害および進行性の臨床症状をもたらす。異化酵素の欠損は、酵素補充療法(ERT)によって修正することができるが、但し、投与される酵素が罹患した細胞のリソソームへ導かれることができることを条件とする。リソソーム酵素は、典型的には、小胞体(ER)において合成され、分泌経路を介してゴルジ体へ輸送され、次いでリソソームへ動員される糖タンパク質である。本明細書に記載される方法および材料を用いて、微生物を基にしたプロセスは、脱マンノシル化したリン酸化N−グリカンを有する治療タンパク質を得るために使用することができる。したがって、本明細書に記載される方法および材料は、LSDのような代謝障害の処置のために糖タンパク質を調製するのに有用である。
本文書は、(i)マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合もしくはマンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分をホスホ−6−マンノースに加水分解することができる、かつ/または(ii)このようなホスフェート含有グリカンの末端α−1,2マンノース結合、α−1,3マンノース結合、および/もしくはα−1,6マンノース結合または末端α−1,2マンノース部分、α−1,3マンノース部分、および/もしくはα−1,6マンノース部分を加水分解することができるマンノシダーゼをコードする単離された核酸を提供する。用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書においては互換可能に使用され、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、および核酸類似体を含有するDNA(またはRNA)を含む、RNAおよびDNAの両方を指す。ポリヌクレオチドは、任意の3次元構造を有することができる。核酸は、二本鎖または一本鎖(すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖)であることができる。ポリヌクレオチドの非限定例としては、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、転移RNA、リボソームRNA、siRNA、ミクロRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、枝分かれポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマー、ならびに核酸類似体が挙げられる。
本明細書に記載されるとおり、リン酸化N−グリカンを含有する糖タンパク質は脱マンノシル化され得、マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合またはマンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分を含有するリン酸化N−グリカンを含有する糖タンパク質は、該糖タンパク質を(i)マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合またはマンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分をマンノース−6−リン酸に加水分解することができかつ(ii)末端α−1,2マンノース結合、α−1,3マンノース結合、および/もしくはα−1,6マンノース結合または末端α−1,2マンノース部分、α−1,3マンノース部分、および/もしくはα−1,6マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させることによってキャップを外されかつ脱マンノシル化され得る。このようなマンノシダーゼの非限定例としては、Canavalia ensiformis(タチナタマメ(Jack bean))マンノシダーゼおよびYarrowia lipolyticaマンノシダーゼ(例えば、AMS1)が挙げられる。タチナタマメマンノシダーゼおよびAMS1マンノシダーゼの両方は、ファミリー38のグリコシドヒドドラーゼである。
本明細書に記載される遺伝子操作された細胞は、キャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子を産生するために使用することができる。例えば、細胞を基にした方法は、マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合またはマンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分をホスホ−6−マンノースに加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含むよう遺伝子操作された真菌細胞に標的分子をコードする核酸を導入する工程であって、ここで、該細胞は、キャップを外されたリン酸化N−グリカンを含有する標的分子を産生する工程を含むことができる。このようなリン酸化N−グリカンは、上に記載したとおり脱マンノシル化され得る。細胞を基にした別の方法は、(i)マンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合またはマンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分をホスホ−6−マンノースに加水分解することができる工程と、(ii)ホスフェート含有グリカンの末端α−1,2マンノース結合、α−1,3マンノース結合、および/もしくはα−1,6マンノース結合または末端α−1,2マンノース部分、α−1,3マンノース部分、および/もしくはα−1,6マンノース部分を加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含むよう遺伝子操作された真菌細胞に標的分子をコードする核酸を導入する工程であって、ここで、該細胞は、キャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子を産生する工程を含むことができる。一部の実施形態においては、上記マンノシダーゼおよび標的分子をコードする核酸は、該マンノシダーゼおよび標的分子が共分泌されるよう、分泌配列を含有する。
本文書は、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞のうちの任意の実質的に純粋な培養物も提供する。本明細書において使用する場合、遺伝子操作された細胞の「実質的に純粋な培養物」とは、該培養物における生細胞の総数の約40%未満(すなわち、約35%未満、約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、約0.25%未満、約0.1%未満、約0.01%未満、約0.001%未満、約0.0001%未満、またはさらにより小)が遺伝子操作された細胞、例えば細菌細胞、真菌細胞(酵母を含む)、マイコプラズマ細胞、または原生動物細胞以外の生細胞である。本文脈における用語「約」とは、関連した百分率が、指定された百分率の15%ほど指定された百分率を上回るまたは下回ることができることを意味する。したがって、例えば、約20%とは、17%〜23%であることができる。遺伝子操作された細胞のこのような培養物には、細胞および、増殖媒体、保存媒体、または輸送媒体が含まれる。媒体は、液体、半固形(例えば、ゼラチン媒体)、または凍結であることができる。上記培養物には、液体または半固形媒体で増殖する細胞、または、凍結保存媒体または輸送媒体を含む保存媒体または輸送媒体中で保存または輸送される細胞が含まれる。上記培養物は、培養容器または保存容器または基材(例えば、培養皿、培養フラスコ、もしくは培養チューブ、または保存バイアルもしくは保存チューブ)の中にある。
キャップを外されかつ脱マンノシル化した分子は、種々の代謝障害を処置するために使用することができる。代謝障害とは、個々のヒト(または動物)細胞内でのエネルギー産生に影響する障害である。ほとんどの代謝障害は遺伝性であるが、一部は、食事、毒素、感染症などの結果として「後天的」であることができる。遺伝性代謝障害は、先天性代謝異常としても公知である。一般に、遺伝性代謝障害は、細胞の代謝過程における一部のプロセスに必要な酵素を失うことまたは不適切に構成されることを結果的に生じる遺伝的欠陥に起因する。最大のクラスの代謝障害は、炭水化物代謝の障害、アミノ酸代謝の障害、有機酸代謝の障害(有機酸性尿)、脂肪酸酸化およびミトコンドリア代謝の障害、ポルフィリン代謝の障害、プリン代謝もしくはピリミジン代謝の障害、ミトコンドリア機能におけるステロイド代謝障害の障害、ペルオキシソーム機能の障害、およびリソソーム蓄積障害(LSD)である。
キャップを外されかつ脱マンノシル化した標的分子は、治療有効量の該分子と1種類以上のアジュバント、賦形剤、キャリア、および/または希釈剤とを含有する薬学的組成物へと組み込むことができる。許容し得る希釈剤、キャリア、および賦形剤は典型的には、受容者の恒常性(例えば、電解質平衡)に有害に影響することはない。許容し得るキャリアには、生体適合性、不活性、または生体吸収可能な塩、緩衝剤、オリゴ糖または多糖、ポリマー、粘度改善剤、保存剤などが含挙げられる。ある例示的なキャリアは、生理食塩水(0.15M NaCl、pH7.0〜7.4)である。別の例示的なキャリアは、50mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウムである。薬学的組成物の製剤化および投与についての技術に関するさらなる詳細は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.、米国ペンシルバニア州イーストン)において得ることができる。補充用活性化合物も上記組成物中に組み込むことができる。
(ヒトαグルコシダーゼ発現株の生成)
Y.lipolytica株OXYY1589を以下のとおり構築した。上記株は、3コピーのヒトαグルコシダーゼ遺伝子(huGAA、酸性αグルコシダーゼまたは酸性マルターゼEC3.2.1.3としても公知)および2コピーのY.lipolytica MNN4遺伝子を含有する。OXY1589株の遺伝子型は、以下のとおりである。
110kDAのhuGAA前駆体をコードするヌクレオチド配列を化学的に合成し、Y.lipolytica発現についてコドン最適化した。表1は、Y.lipolyticaについてのコドン使用頻度を示す。データは、5,967のコード配列に存在する2,945,919のコドンに由来した。表1の内容は、kazusa.or.jp/codon/cgi−bin/showcodon.cgi?species=284591におけるワールドワイドウェブ見出すことのできるコドン使用頻度データベースから得た。
Y.lipolytica MNN4(YlMNN4)遺伝子を、誘導性pPOX2プロモーターの制御下で、かつ(半)構成的hp4dプロモーターの制御下でクローン化した。YlMNN4のこれら2つの発現カセットを1つのベクターにおいて、ゲノムのADE2遺伝子座への標的化組込みのためのADE2遺伝子と選択的マーカーとしてのADE2遺伝子からなる隣接領域(PT)を保有する縦列コンストラクトとしてサブクローニングした。
第一の形質転換は、中間の組換え株OXYY1569を作製するため、URA3マーカーおよびLEU2マーカーを使用して、pRAN058ベクターおよびpRAN059ベクターから精製した発現カセットを有するY.lipolyticaのG014株の共形質転換であった。したがって、OXYY1569は、G014株のゲノムに無作為に組み込まれたpPOX2プロモーターの制御下でhuGAAの2つの発現コンストラクトを保有している。
Y.lipolytica MNN4遺伝子の2つのコピーをそのゲノムに組み込んで、OXYY1584を生成するために、プラスミドOXYP1479Bから切り出した発現カセットを使用して組換え株OXYY1569を形質転換した。プラスミドOXYP1479BからSacII/XmaI制限消化を使用して、発現カセットを切り出した。Y.lipolyticaゲノムのADE2遺伝子座への標的化組込みのために発現カセットを設計した。組換え株をサザンブロット法およびグリカン分析の後に選択して、増大したリン酸化に関する該株の挙動を評価した。任意に選択したいくつかの形質変換体のゲノムDNAをSpeIで消化し、MNN4特異的なDIG標識したプローブを使用して探査した。Y.lipolyticaゲノムのADE2遺伝子座へのMNN4発現カセットの正確な標的化組込みは、SpeI消化後に4207塩基対および5683塩基対のバンドを生じた。陽性クローンを標準的な振盪フラスコ手順で増殖させた。中間のクローンOXYY1584を選択するために、分泌したタンパク質のN−グリカン分析を実施した。親株OXXY1569と比較して、MNN4過剰発現後の支配的な構造は、Man8GlcNAc2(PMan)1およびMan8GlcNAc2(PMan)2であった。
最終の原栄養体産生株OXYY1589を生成するために、huGAAの第三のコピーを組換えOXYY1584株のゲノムに組み込んだ。pRAN069からNotIで切り出した発現カセットを使用して形質転換を実施した。最初に、huGAAの追加のコピーの存在について、形質転換体のゲノムDNAをPCRによってスクリーニングした。huGAA産生を評価するために、標準的な振盪フラスコ培養後の発現について、任意に選択したPCR陽性クローンをさらに分析した。最高レベルのhuGAAを発現するクローン(OXYY1589)をウェスタンブロット分析および酵素活性アッセイ(実施例3に記載される4−MUGアッセイ)後に選択した。M8のMP2−M8 N−グリカンおよびMP−M8 N−グリカンへの転換レベルが追加のhuGAA発現カセットの存在によって影響されないことも再確認した。
(OXYY1589株の流加培養)
OXYY1589株(実施例1)からhuGAAを産生するために、作業容積6〜8Lを有する撹拌した10Lタンクを使用して流加プロセスを確立した。上記プロセスを2つの相に分割した。
2)限定されたオレイン酸供給の支援による誘導による産物形成。
(組換えhuGAA(rhGAA)の精製)
培養後の上清(実施例2を参照されたい)を、デプス濾過を介して清澄化した。次に、結果として生じる材料を、タンジェンシャルフロー濾過(TFF)を介して20倍濃縮し、10kDaのMNCOメンブラン(Millipore)を使用して、20mMリン酸ナトリウム(pH6)および100mM NaClに対して透析濾過した。
(YlAMS1のクローニングおよび発現)
Yarrowia lipolytica由来のAms1遺伝子(YlAms1)を、YarrowiaゲノムDNAから、遺伝子特異的プライマーを使用してPCR増幅した。C末端Hisタグを有するYlAMS1タンパク質が生成され得るよう、HIS6タグ付きコード配列をYlAms1のORFの3’末端に融合し、かつN末端Hisタグを有するYLAMS1タンパク質が生成され得るよう、YlAms1 ORFの5’末端へも融合した。両ORFを半構成的hp4dプロモーターの制御下でクローン化し(図3Aおよび図3B)、発現カセットをYarrowia lipolyticaへと形質転換した。細胞を複合培地(YPD)中で増殖させ、72時間の増殖後に収穫した。細胞を超音波処理によってばらばらにした後、AMS1タンパク質を、NTAカラムを使用して精製した。精製した材料を、PNP−マンノースを基質として使用して活性について分析した。活性のある画分をプールし、グリカン分析のために維持した。
(APTS標識したリン酸化N−グリカンのGH38α−マンノシダーゼを用いた脱マンノシル化およびホスフェートのキャップ外し)
タチナタマメα−マンノシダーゼ(Canavalia ensiformis)をSigma−Aldrichから得た。3.0M硫酸アンモニウム懸濁液(Sigma−M7257)およびプロテオミクス等級のタチナタマメα−マンノシダーゼ(Sigma−M5573)の両方をN−グリカン分析において使用した。両バッチは、同一の結果を与えたので、さらなる記載においてはJbManと命名する。実施例4に記載したとおり、YlAms1を発現させ精製した。JbManおよびYlAMS1を、MNN4を過剰発現するYarrowia lipolytica株に由来する、8−アミノ−1,3,6,−ピレントリスルホン酸(APTS)で標識した糖の混合物で試験した。上記糖は、Man8GlcNAc2(M8)、一リン酸化ManP−Man8GlcNAc2(MP−M8)、および/または二リン酸化(ManP)2−Man8GlcNAc2((MP)2−M8)糖(MNN4糖またはMNN4 N−グリカンと呼ぶ)を含有している。図4においては、潜在的な最終加水分解産物を概略的に示し、ここで、α−マンノシダーゼは、MNN4 N−グリカンも完全に刈り込むことができることを想定しており、これには、非リン酸化アームの加水分解、基礎をなすマンノースがリン酸化されている場合の、末端α−1,2−マンノースの加水分解、および/またはマンノース−1−ホスホ−6−マンノース結合におけるホスフェートのキャップ外しを含む。
(より高次のリン酸化N−グリカンを有するYarrowia lypolytica株において発現した糖タンパク質のGH38α−マンノシダーゼを使用した脱マンノシル化およびホスフェートのキャップ外し)
ヒトリソソームα−グルコシダーゼhuGAAをY.lypolytica株OXYY1589において発現させ、高次のリン酸化N−グリカン構造を有する糖タンパク質を生じた。huGAAを実施例3に記載したとおり精製した。
(組換えヒトα−グルコシダーゼ(huGAA)のCcMan5およびCcMan4を用いたキャップ外しおよび脱マンノシル化)
Cellulosimicrobium cellulansマンノシダーゼ4(CcMan4)およびCellulosimicrobium cellulansマンノシダーゼ5(CcMan5)をコードする核酸を、DsbAシグナル配列を含有して結果的にN末端HISタグを有するタンパク質の発現を生じるpLSAH36ベクターへとクローン化した。DsbA−CcMan5およびDsbA−CcMan4のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を図8および図9にそれぞれ提供する。これらのタンパク質を大腸菌(E.coli)B21細胞において発現させ、ペリプラズムに存するタンパク質を、Talonカラムを使用して単離および精製した。pLSAHCcMan5プラスミドおよびpLSAHCcMan4プラスミドの図解表示を図10に与える。
(タチナタマメα−マンノシダーゼを使用した組換えhuGAAのキャップ外しおよび脱マンノシル化)
実施例6のキャップ外し実験および脱マンノシル化実験を、JbManの硫酸アンモニウム懸濁液をSuperdex200カラムによるゲル濾過によってさらに精製して、混入しているホスファターゼ活性を除去した後に反復した。
(ポンペ線維芽細胞への組換えhuGAAの取り込み)
実施例7および実施例8由来のキャップを外されかつ脱マンノシル化したhuGAAおよびミオザイム(登録商標)(CcMan4で未処理および処理済み)を細胞取り込み実験において使用した。キャップされたhuGAAまたは、CcMan5(huGAA_CcMan5)、Ccman4(huGAA_CcMan4)、CcMan4およびCcMan5の併用(huGAA_CcMan4/5)、またはタチナタマメマンノシダーゼ(huGAA_JBMan)のいずれかで処理したhuGAAの酵素比活性(実施例7および実施例8を参照されたい)を、4−MUGアッセイを使用して試験した。グルコシダーゼによる基質4−MUGの切断は、蛍光原性産物4−MUの生成をもたらし、この4−MUは、紫外光による照射によって可視化または検出することができる。実施例3を参照されたい。huGAAの活性をミオザイム(登録商標)の活性と比較した。上記酵素を3つの異なる濃度(125ng/ml、62.5ng/ml、および31.25ng/ml)へ、0.1%BSAを含有する100mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.0)(反応緩衝液)において希釈し、50μlの各希釈物を96ウェルプレートへ三つ組で入れた。4−MUG基質(Sigma)を反応緩衝液で4mMに希釈し、この希釈した基質50μlを各ウェルに添加した。酵素反応物を37℃で60分間インキュベートした後、100μlの150mM EDTA−Na2塩(pH11.5)を添加して、この反応をクエンチした。蛍光を励起360/40nmおよび発光460/40nmで測定した。4−メチルウンベリフェロン(4−MU)を使用した標準曲線を適応させて、比活性を算出した。種々の酵素の活性をU/mgとして報告した。ここで、1単位は、100mM酢酸ナトリウムバッファ(pH4.0)+0.1%BSA中の2mM基質濃度での1時間あたりの1nmol基質の加水分解を触媒する酵素の量として定義する。上記酵素の各々の比活性は、約200×103U/mgであった。
(ポンペ線維芽細胞のリソソームにおけるhuGAAのプロセシング)
huGAAは、小胞体において110kDa前駆体として産生される。該huGAAは、ゴルジ装置においてN−グリカンプロセシングを受け、リソソームにおいてさらに、中間の分子形態の95kDaを経て76kDaおよび70kDaの活性のあるタンパク質へとタンパク質分解でプロセシングされる。この活性のあるタンパク質は、その天然基質であるグリコーゲンの分解に関与する。以下の実験においては、Y.lipolyticaで110kDaタンパク質として産生される、精製された組換えhuGAAの細胞内プロセシングを調べた。これらの実験については、調製緩衝液を2mM CaCl2および100mMマンニトールを有する100mM HEPES(pH7)へと交換して、実施例9において使用されたものとは異なる精製バッチ由来のhuGAA(実施例7を参照されたい)を、実施例7に記載したとおり、CcMan4およびCcMan5を併用して、またはタチナタマメマンノシダーゼで処理した。キャップを外された酵素の比活性を、4−MUGアッセイを使用して決定した。実験前日、GM00248線維芽細胞を、上記のとおり、取り込み媒体中5×105細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種した。翌日、線維芽細胞を2ml取り込み媒体中1000U/mlのhuGAA_CcMan4/5またはhuGAA_JBManとともに14時間または46時間インキュベートした。対照標準として、細胞をミオザイム(登録商標)とともにインキュベートし、酵素とともにインキュベートしなかった細胞を陰性対照として使用した。各細胞取り込み実験を二つ組で実施した。インキュベーション後、GM00248線維芽細胞を氷冷PBSで洗浄し、トリプシン処理(0.53mM EDTAを有する0.05%トリプシン)によって収穫した。細胞を遠心分離し、プロテアーゼインヒビターを補充した0.5ml PBS+0.5% TritonX100に溶解した。細胞溶解産物を遠心分離して細胞残屑を除去し、上記のような4−MUGアッセイを使用して細胞内GAA活性についてアッセイした。タンパク質濃度をBCA法によって決定した。
(CcMan5およびタチナタマメα−マンノシダーゼによる組換えhuGAAのキャップ外しおよび脱マンノシル化)
huGAA:CcMan5:JbManについて100:5:10のw:w比でCcMan5およびJBManによって組換えhuGAAのキャップを外しかつ脱マンノシル化した。1.08mlのhuGAA(40mM NaClを有する10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中4.8mg/ml)の溶液に、1.69mlのCcMan5(PBS緩衝液中0.154mg/ml)および1.04mlのJbMan(PBS緩衝液中0.5mg/ml)を添加した。総反応容積を、2mM CaCl2を含有する100mM酢酸ナトリウムバッファ(pH5.0)により5.2mlに調整した。反応混合物を30℃で15時間インキュベートした。キャップを外されかつ脱マンノシル化したhuGAAを、実施例3に記載したとおり、Hiload 16/60 superdex 200ゲル濾過カラム(GE Healthcare)を使用して精製した。
(CcMan5およびJbManによってキャップを外されかつ脱マンノシル化した組換えhuGAAのポンペ線維芽細胞への取り込み)
実施例9に記載したとおりGM00248線維芽細胞系を使用して、キャップを外され、脱マンノシル化し、かつ精製されたhuGAA(実施例11に記載されたとおりJbManおよびCcMan5で処理した)の細胞取り込みを、ミオザイム(登録商標)の細胞取り込みと比較した。
(CcMan5およびJbManによってキャップを外されかつ脱マンノシル化した組換えhuGAAのポンペ線維芽細胞のリソソームにおけるプロセシング)
実施例11に記載されたようにCcMan5およびJbManで処理したYarrowia産生huGAAがリソソーム中で該huGAAの成熟形態へとプロセシングされるかどうかを決定するために、細胞取り込みアッセイを実施した。実験前日、GM00248線維芽細胞を、取り込み媒体中3×105細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種した。翌日、線維芽細胞を2ml取り込み媒体中2000U/ml huGAAで8時間もしくは24時間刺激し、または24時間刺激した(「パルス」期間)後、細胞を洗浄し、2mlの増殖培地を細胞へ最長100時間のチェイス期間にわたって添加した。酵素で処理されていない細胞を陰性対照として使用した。
本発明は、その詳細な説明とともに記載されてきたが、上の記載は、本発明の範囲を明示するよう意図されており、かつ該範囲を限定するものではなく、添付の特許請求の範囲によって定義される。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
Claims (30)
- 糖タンパク質におけるマンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分のキャップを外して、リン酸化N−グリカンを脱マンノシル化するための方法であって、
a)該マンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分を含有するリン酸化N−グリカンを有する該糖タンパク質を提供する工程と、
b)該糖タンパク質を、単一の酵素として(i)マンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分をマンノース−6−リン酸に加水分解し、かつ(ii)末端α−1,2マンノース結合、α−1,3マンノース結合、および/またはα−1,6マンノース結合を加水分解するマンノシダーゼと接触させる工程
とを含み、該マンノシダーゼはファミリー38のグリコシルヒドロラーゼである、前記方法。 - リン酸化N−グリカンを脱マンノシル化する方法であって、
a)リン酸化N−グリカンを含む糖タンパク質を提供する工程と、
b)該糖タンパク質を、単一の酵素として(i)マンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分をマンノース−6−リン酸に加水分解し、かつ(ii)末端α−1,2マンノース結合、α−1,3マンノース結合、および/またはα−1,6マンノース結合を加水分解するマンノシダーゼと接触させる工程
とを含み、該マンノシダーゼはファミリー38のグリコシルヒドロラーゼである、前記方法。 - 前記マンノシダーゼは、Canavalia ensiformis由来であるか、または
前記マンノシダーゼは、Yarrowia lipolytica由来である、請求項1または2に記載の方法。 - 工程(a)および工程(b)の後に、哺乳類細胞を、インビトロで前記脱マンノシル化したリン酸化N−グリカンを含む前記糖タンパク質と接触させる工程であって、ここで、該接触させる工程の後に、該糖タンパク質は、該哺乳類細胞の内部へ輸送される工程をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項4に記載の方法。
- 糖タンパク質を哺乳類細胞の内部へ向けるインビトロでの方法であって、
a)基礎をなすマンノース残基にα1,2結合によって結合された末端マンノース残基を含むリン酸化N−グリカンを有する糖タンパク質を提供する工程であって、ここで、該基礎をなすマンノースは、6位でリン酸化されており、該基礎をなすマンノースに結合しているリン酸残基は、キャップされておらず、かつ該糖タンパク質は該細胞のマンノース−6−リン酸受容体に実質的に結合しない工程と、
b)該糖タンパク質を、単一の酵素として、該基礎をなすマンノースがリン酸化される場合に末端α−1,2マンノース結合を加水分解し、かつ、マンノース残基の6位に結合しているリン酸残基のキャップを外すマンノシダーゼと接触させて、脱マンノシル化した糖タンパク質を生成する工程であって、ここで、該糖タンパク質は該脱マンノシル化の後、該細胞における該マンノース−6−リン酸受容体に実質的に結合する工程と、
c)インビトロで該細胞を該脱マンノシル化した糖タンパク質と接触させる工程
とを含み、ここで、該マンノシダーゼが、ファミリー38のグリコシルヒドロラーゼである、前記方法。 - 前記マンノシダーゼはCanavalia ensiformisもしくはYarrowia lipolytica由来である、請求項6に記載の方法。
- 糖タンパク質を、哺乳類細胞のマンノース−6−リン酸受容体に実質的に結合しない第一の形態から、哺乳類細胞のマンノース−6−リン酸受容体に実質的に結合する第二の形態へと変換するインビトロでの方法であって、該第一の形態の該糖タンパク質を、単一の酵素として1つ以上の末端マンノース残基を除去し、かつ、マンノース残基の6位に結合しているリン酸残基のキャップを外すマンノシダーゼと接触させる工程を含み、ここで、該第一の形態において、該糖タンパク質は、それぞれ、その6位にリン酸残基を含有する基礎をなすマンノース残基に対しその1位で結合している末端マンノース残基を1つ以上含有する1つ以上のN−グリカンを含み、かつ該リン酸残基は、キャップされておらず、ここで、該マンノシダーゼはファミリー38のグリコシルヒドロラーゼである、方法。
- 前記マンノシダーゼはCanavalia ensiformisもしくはYarrowia lipolytica由来である、請求項8に記載の方法。
- マンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分を含む糖タンパク質を哺乳類細胞の内部へ向けるインビトロでの方法であって、ここで、6位に結合しているリン酸残基を有するマンノース残基は、末端マンノース残基の1位において該末端マンノース残基に結合しており、該方法は、糖タンパク質に
(a)該糖タンパク質における該マンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分をマンノース−6−リン酸へとキャップを外す工程、および、(b)該末端マンノース残基を除去する工程
を行った後にインビトロで該糖タンパク質を該細胞と接触させる工程を含み、
ここで、(a)を行ってかつ(b)を行っていないかまたは(b)を行ってかつ(a)を行っていない糖タンパク質は、該細胞のマンノース−6−リン酸受容体に実質的に結合せず、
ここで、(a)および(b)を行った糖タンパク質は該細胞のマンノース−6−リン酸受容体に実質的に結合し、そして
ここで、工程(a)と(b)とは、単一のマンノシダーゼ酵素によって触媒され、該マンノシダーゼは、ファミリー38のグリコシルヒドロラーゼである、方法。 - 前記糖タンパク質はヒトタンパク質である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糖タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リソソームタンパク質はリソソーム酵素である、請求項12に記載の方法。
- 前記リソソームタンパク質は、酸性αグルコシダーゼまたはαガラクトシダーゼであるリソソーム酵素である、請求項13に記載の方法。
- 前記糖タンパク質はLSDと関連している、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記LSDは、ファブリー病、ムコ多糖症I型、ファーバー病、ゴーシェ病、GM1ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、GM2活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、1型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症である、請求項15に記載の方法。
- 脱マンノシル化したリン酸化N−グリカンを含む糖タンパク質を産生するよう遺伝子操作された単離された真菌細胞であって、マンノシダーゼをコードする核酸を含み、該マンノシダーゼが、単一の酵素として、(i)マンノース−1−ホスホ−6−マンノース部分をマンノース−6−リン酸に加水分解することができかつ(ii)末端α−1,2マンノース結合、α−1,3マンノース結合、および/またはα−1,6マンノース結合を加水分解することができ、該マンノシダーゼはファミリー38のグリコシルヒドロラーゼである、真菌細胞。
- 前記真菌細胞はさらに、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含むか、または
前記真菌細胞は、OCH1活性を欠損しているよう遺伝子操作されているか、または
前記真菌細胞は、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、該真菌細胞が、OCH1活性を欠損しているように遺伝子操作されている、請求項17に記載の真菌細胞。 - 標的タンパク質をコードする核酸をさらに含む請求項17または18のいずれか一項に記載の真菌細胞であって、ここで、該標的タンパク質が糖タンパク質である、該真菌細胞。
- 前記標的タンパク質はヒトタンパク質である、請求項19に記載の真菌細胞。
- 前記標的タンパク質は、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合断片、または融合タンパク質である、請求項19に記載の真菌細胞。
- 前記リソソームタンパク質はリソソーム酵素である、請求項21に記載の真菌細胞。
- 前記リソソーム酵素は、酸性αグルコシダーゼまたはαガラクトシダーゼであるリソソーム酵素である、請求項22に記載の真菌細胞。
- 前記糖タンパク質は、LSDと関連しているタンパク質である、請求項19に記載の真菌細胞。
- 前記LSDは、ファブリー病、ムコ多糖症I型、ファーバー病、ゴーシェ病、GM1ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、GM2活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シェイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコース蓄積症、マンノース蓄積症、シンドラー病、1型シアリドーシス、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多発性スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸蓄積障害、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン蓄積症、ヘルマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病、または幸福顔貌骨異形成症である、請求項24に記載の真菌細胞。
- 前記真菌細胞は、Yarrowia lipolytica細胞またはArxula adeninivorans細胞である、請求項17〜25のいずれか一項に記載の真菌細胞。
- マンノシルリン酸化を促進することのできる前記ポリペプチドはMNN4ポリペプチドであるか、または
マンノシルリン酸化を促進することのできる前記ポリペプチドは、P.pastoris
PNO1ポリペプチドである、請求項18に記載の真菌細胞。 - 前記MNN4ポリペプチドは、Yarrowia lipolyticaポリペプチド、S.cerevisiaeポリペプチド、Ogataea minutaポリペプチド、Pichia pastorisポリペプチド、もしくはC.albicansポリペプチドである、請求項27に記載の真菌細胞。
- 前記マンノシダーゼは分泌シグナルを含むか、または
前記マンノシダーゼは、該マンノシダーゼを細胞内区画へ導くためのターゲッティングシグナルを含む、請求項17〜28のいずれか一項に記載の真菌細胞。 - 前記マンノシダーゼがCanavalia ensiformis由来であるか、または前記マンノシダーゼがYarrowia lipolytica由来である、請求項17〜29のいずれか一項に記載の真菌細胞。
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