MX2011005677A

MX2011005677A - Anticuerpo anti-cmet novedoso.

Info

Publication number: MX2011005677A
Application number: MX2011005677A
Authority: MX
Inventors: Liliane Goetsch; Cedric Bes; Thierry Wurch
Original assignee: Pf Medicament
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2011-06-30
Also published as: CY1119172T1; BR122019023930B1; SI3431502T1; CA2743433A1; BRPI0923231B1; PH12015501515A1; KR101838299B1; RU2015127471A; JP6309657B2; RS56204B1; AU2016200725C1; PT3431502T; GEP20135930B; GEP20146207B; CA2743433C; DK2370468T3; ZA201105164B; NZ593853A; LT3135691T; CR20110324A

Abstract

La invención se refiere a un anticuerpo novedoso capaz de unirse específicamente al receptor c-Met humano y/o capaz de inhibir específicamente la actividad de tirosina quinasa de dicho receptor, con una actividad antagonista mejorada, comprendiendo dicho anticuerpo una región bisagra modificada. La invención se refiere además a una composición que comprende ese tipo de anticuerpo antagonista de c-Met y su uso como un medicamento para tratar el cáncer.

Description

ANTICUERPO ANTI-cMET NOVEDOSO DESCRIPCIÓN Antecedentes y campo de la invención La presente invención se refiere a un anticuerpo divalente novedoso capaz de unirse específicamente al receptor c-Met humano y/o capaz de inhibir específicamente la actividad de tirosina quinasa de dicho receptor, así como también las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos que codifican dicho anticuerpo. Más particularmente, el anticuerpo de acuerdo con la invención es capaz de inhibir la dimerización de c-Met. La invención asimismo comprende el uso de dicho anticuerpo como un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de cánceres o de cualquier patología relacionada con la sobreexpresión de dicho receptor así como también en procesos o kits para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con la sobreexpresión de c-Met. La invención finalmente comprende productos y/o composiciones que comprenden ese tipo de anticuerpo en combinación con otros anticuerpos y/o compuestos químicos dirigidos contra otros factores de crecimiento involucrados en la progresión' de tumores o metástasis y/o compuestos y/o agentes anticancerígenos o agentes conjugados con toxinas y su utilización para la prevención y/o el tratamiento de ciertos cánceres.

Los agentes dirigidos hacia la tirosina quinasa receptora (RTK, según sus siglas en inglés) tales como los inhibidores de trastuzumab, cetuximab, bevacizumab, ¡matinib y gefitinib han ilustrado el interés de emplear esta clase de proteína para el tratamiento de cánceres seleccionados. c-Met, es el miembro prototípico de una subfamilia de RTKs la cual también incluye RON y SEA. La familia de RTK de c-Met es estructuralmente diferente de otras familias de RTK y es el único receptor de alta afinidad conocido para el factor del crecimiento de hapatocitos (HGF, según sus siglas en inglés), también denominado factor de dispersión (SF, scatter factor) [D.P. Bottaro et al., Science 1991 , 251 : 802-804; L. Naldini et al., Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10:2867-2878]. c-Met y HGF son ampliamente expresados en una variedad de tejidos y su expresión está normalmente restringida a células de origen epitelial y mesenquimal respectivamente [M.F. Di Renzo et al., Oncogene 1991 , 6:1997-2003; E. Sonnenberg et al., J. Cell. Biol. 1993, 123:223-235]. Son ambos requeridos para el desarrollo normal de los mamíferos y han demostrado ser particularmente importantes en la migración celular, diferenciación morfogénica, y organización de las estructuras tubulares tridimensionales así como también el crecimiento y la angiogénesis [F. Baldt et al., Nature 1995, 376:768-771 ; C. Schmidt et al., Nature. 1995:373:699-702; Tsarfaty et al., Science 1994, 263:98-101]. Si bien la regulación controlada de c-Met y HGF ha demostrado ser importante en el desarrollo de mamíferos, mantenimiento y reparación de los tejidos [Nagayama T., Nagayama M., Kohara S., Kamiguchi H., Shibuya M., Katoh Y., Itoh J., Shinohara Y., Brain Res. 2004, 5;999(2):155-66; Tahara Y., Ido A., Yamamoto S., Miyata Y., Uto H., Hori T., Hayashi K., Tsubouchi H., J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307(1):146-51], su desregulación está implicada en la progresión de cánceres.

La señalización aberrante impulsada por la activación inapropiada de c- Met es una de las alteraciones más frecuentes observada en los cánceres humanos y juega un rol fundamental en la tumorigénesis y en la metástasis [Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915-925; L. Trusolino y Comoglio P. M., Nat Rev. Cáncer. 2002, 2(4):289-300].

La activación inapropiada de c-Met puede surgir mediante mecanismos dependientes e independientes del ligando, los cuales incluyen la sobreexpresión de c-Met, y/o la activación paracrina o autocrina, o a través del aumento de la mutación funcional [J.G. Christensen, Burrows J. y Salgia R., Cáncer Latters. 2005, 226:1-26]. Sin embargo, una oligomerización del receptor c-Met, en presencia o en ausencia del ligando, es requerida para regular la afinidad de' unión y la cinética de unión de la quinasa hacia ATP y los sustratos peptídicos que contienen tirosina [Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 2004 17 de agosto, 43:10570-8]. c-Met activado recluta efectores de la señalización a su sitio "muitidocking" ubicado en el dominio citoplasmático, dando como resultado la activación de diversas rutas de señalización claves, incluyendo Ras-MAPK, PI3K, Src y Stat3 [Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005, 15(1):49-51 ; Furge KA. Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene. 2000, 9(49):5582-9]. Estas rutas son esenciales para la proliferación, invasión y angiogénesis de células tumorales y para evadir la apoptosis [Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene, 2000, 9(49): 5582-9; Gu H., Neel BG, Trends Cell Biol. Mar 2003, 13(3):122-30; Fan S., Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q., Cao Y.. Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM, Oncogene. 27 de abril 2000, 19(18):2212-23]. Por añadidura, una faceta única de la señalización de c-Met relacionada con otro RTK es su interacción reportada con complejos de adhesión focal y compañeros de la unión no quinasa tales como las integrinas a6ß4 [Trusolino L, Bertotti A., Comoglio PM, Cell. 2001 , 107:643-54], CD44v6 [Van der Voort R., Taher TE, Wielenga VJ, Spaargaren M., Prevo R., Smit L, David G., Hartmann G., Gherardi E., País ST, J. Biol. Chem. 1999, 274(10):6499-506], Plexina B1 o semaforinas [Giordano S., Corso S., Conrotto P., Artigiani S., Gilestro G., Barberis D., Tamagnone L., Comoglio PM, Nat Cell Biol. 2002, 4(9):720-4; Conrotto P., Valdembri D., Corso S., Serini G., Tamagnone L, Comoglio PM, Bussolino F., Giordano S., Blood. 2005, 105(1 1):4321-9; Conrotto P., Corso S., Gamberini S., Comoglio PM, Giordano S., Oncogene. 2004, 23:5131 -7] los cuales pueden sumar adicionalmente a la complejidad de regulación de la función celular por este receptor. Finalmente, datos recientes demuestran que c-Met podría estar involucrado en la resistencia tumoral a gefitinib o erlotinib lo cual sugiere que la combinación del direccionamiento de compuestos hacia EGFR y c-Met podría ser de interés significativo [Engelman JA et al., Science, 2007, 316:1039-43].

En los últimos pocos años, se han desarrollado muchas estrategias diferentes para atenuar la señalización de c-Met en líneas celulares cancerígenas. Estas estrategias incluyen i) neutralizar anticuerpos contra c-Met o HGF/SF [Cao B., Su Y., Oskarsson M., Zhao P., : Kort EJ, Fisher RJ, Wang LM, Vande Woude GF, Proc Nati Acad Sci U S A. 2001 , 98(13):7443-8; Martens T., Schmidt NO, Eckerich C, Fillbrandt R., Merchant M., Schwall R., Westphal M., Lamszus K., Clin Cáncer Res. 2006, 12(20):6144-52] o el uso de NK4 antagonista de HGF/SF para evitar la unión del ligando a c-Met [Kuba K., Matsumoto K., Date K., Shimura H., Tanaka M., Nakamura T., Cáncer Res., 2000, 60:6737-43], ii) inhibidores del sitio de unión a ATP pequeño a c-Met que bloquean la actividad de quinasas [Christensen JG, Schreck R., Burrows J., Kuruganti P., Chan E, Le P., Chen J., Wang X., Ruslim L, Blake R., Lipson KE, Ramphal J., Do S., Cui JJ, Cherrington JM, Mendel DB, Cáncer Res. 2003, 63:7345-55], iii) polipéptido de dominio SH2 modificado que interfiere con el acceso al sitio "multidocking" y RNAi o ribozima que reducen la expresión del receptor o del ligando. La mayoría de estos métodos exhiben una inhibición selectiva de c-Met dando como resultado la inhibición tumoral y mostrando que c-Met podría ser interesante para la intervención terapéutica en el cáncer.

Entre las moléculas generadas para el direccionamiento hacia c-Met, algunas son anticuerpos. El más extensamente descrito es el anticuerpo anti-c-Met 5D5 generado por Genentech [WO 96/38557] el .cual se comporta como un potente agonista cuando es agregado solo en diversos modelos y como un antagonista cuando se utiliza como un fragmento Fab. Una forma modificada por ingeniería genética monovalente de este anticuerpo descrito como un 5D5 armado (OA5D5) y producida como una proteína recombinante en E. Coli es también el objeto de una solicitud de patente [WO 2006/015371 ] por Genentech. Sin embargo, esta molécula que no podría ser considerada como un anticuerpo debido a su estructura en particular, exhibe también mutaciones que podrían ser inmunógenas en seres humanos. En términos de actividad, esta molécula no glicosilada está desprovista de funciones efectoras y finalmente, no hay datos claros que demuestran que OA5D5 inhibe la dimerización de c-Met. Adicionalmente, cuando se ensaya en el modelo in vivo de G55, una línea de células de glioblastoma que expresa c-Met pero no ARNm de HGF y proteína y que crece independientemente del ligando, el anti-c-Met armado no tuvo efecto significativo alguno sobre el crecimiento tumoral de G55 lo cual sugiere que OA5D5 actúa principalmente bloqueando la unión de HGF y no es capaz de dirigirse hacia tumores activados independientemente de HGF [Martens T: et al, Clin. Cáncer Res., 2006, 12(20):6144-6 52].

Otro anticuerpo que se dirige hacia c-Met es descrito por Pfizer como un anticuerpo que actúa "predominantemente como antagonista de c-Met, y en algunos casos como un agonista de c-Met" [WO 2005/016382]. No hay datos descritos en esta solicitud que muestren efecto alguno de los anticuerpos de Pfizer sobre la dimerización de c-Met.

Uno de los aspectos innovadores de la presente invención consiste en generar un anticuerpo monoclonal quimérico y/o humanizado sin actividad agonista intrínseca e inhibir la dimerización de c-Met. Más particularmente, un aspecto innovador de la presente invención consiste en generar un anticuerpo monoclonal quimérico y/o humanizado con actividad antagonista e inhibir la dimerización de c-Met.

Además de dirigirse contra tumores dependientes de ligando, este método también disminuirá las activaciones independientes del ligando de c-Met debido a su sobreexpresión o mutaciones de los dominios intracelulares los cuales permanecieron dependientes de la oligomerización para la señalización. Otro aspecto de la actividad de este anticuerpo podría ser un impedimento esférico para la interacción de c-Met con sus socios que dará como resultado un menoscabo de las funciones de c-Met. Este anticuerpo es humanizado y modificado genéticamente con preferencia, aunque sin limitarse a, como lgG1 humana para obtener funciones efectoras tales como ADCC y CDC además de funciones vinculadas con el bloqueo específico del receptor c-Met.

Sorprendentemente, por primera vez, los inventores han podido generar un anticuerpo antagonista monoclonal quimérico y/o humanizado capaz de unirse a c-Met pero también capaz de inhibir la dimerización de c-Met, siendo dicho anticuerpo monoclonal divalente en oposición a los anticuerpos antagonistas existentes dirigidos contra c-Met. Si es cierto que, en la técnica anterior, algunas veces se sugiere que un anticuerpo capaz de inhibir la dimerización de c-Met con sus socios podría ser un anticuerpo interesante, nunca se ha descrito, o claramente sugerido, un anticuerpo capaz de hacerlo. Por añadidura, en cuanto a la especificidad del anticuerpo, no fue evidente para nada el tener éxito en la generación de ese tipo de anticuerpo divalente activo.

Según lo explicado anteriormente, la inhibición de la dimerización de c-Met es un aspecto capital de la invención ya que ese tipo de anticuerpos presentarán un real interés para una población más grande de pacientes. No solo el cáncer de c-Met activado dependiente del ligando, como resultó ser el caso hasta la presente invención, sino además el cáncer de c-Met activado independiente del ligando pudo tratarse con los anticuerpos generados mediante el proceso de la presente invención.

Los anticuerpos fueron evaluados mediante análisis BRET sobre células que expresan tanto c-Met-RLuc/c-Met-YFP y se seleccionaron por su capacidad de inhibir por lo menos 40%, con preferencia 45%, 50%, 55% y con máxima preferencia 60% de la señal de BRET.

La tecnología BRET es conocida como siendo representativa de la dimerización proteica [Angers et al., PNAS, 2000, 97:3684-89].

La tecnología BRET es bien conocida por el experto en la técnica y será detallada en los siguientes ejemplos. Más particularmente, BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer (Transferencia de Energía por Resonancia de Bioluminiscencia)) es un transferencia de energía no radiactiva que ocurre entre un donante bioluminiscente (Renilla Luciferasa (Rluc)) y un aceptor fluorescente, un muíante de GFP (Green Fluorescent Protein (Proteína Fluorescente Verde)) o YFP (Yellow fluorescent protein (Proteína fluorescente amarilla)). En el presente caso, se utilizó EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein (Proteína Fluorescente Amarilla Potenciada)). La eficacia de la transferencia depende de la orientación y la distancia entre el donante y el aceptor. Luego, la transferencia de energía puede ocurrir solamente si las dos moléculas están en cercana proximidad (1-10 nm). Esta propiedad se utiliza para generar ensayos de interacción proteína- proteína. De hecho, a fin de estudiar la interacción entre dos socios, el primero es genéticamente fusionado a la Renilla Luciferasa y el segundo al mutante amarillo de la GFP. Las proteínas de fusión son generalmente, aunque no obligatoriamente, expresadas en células de mamífero. En presencia de su sustrato permeable a la membrana (coelenterazina), Rluc emite luz azul. Si el mutante de GFP está más cerca que 10 nm de la Rluc, puede producirse una transferencia energética y puede detectarse una señal amarilla adicional. La señal de BRET se mide como la relación entre la luz emitida por el aceptor y la luz emitida por el donante. De modo que la señal de BRET aumentará a medida que las dos proteínas de fusión se llevan a proximidad o si un cambio conformacional trae a Rluc y el mutante de GFP más cerca.

Si el análisis de BRET consiste en una realización preferida, cualquier método conocido por el experto en la técnica puede utilizarse para medir la dimerización de c-Met. Sin limitación, pueden mencionarse las siguientes tecnologías: FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer (Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia)), HTRF (Homogenous Time resolved Fluorescence (Fluorescencia Homogénea- resuelta en el Tiempo)), FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (Microscopía por Imágenes de Tiempo de Vida de Fluorescencia)) o SW-FCCS single wavelength fluorescence cross-correlation spectroscopy (espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de longitud de onda única).

Otras tecnologías clásicas también podrían utilizarse, tales como Co-inmunoprecipitación, Alpha screen, Entrecruzamiento químico, Doble Híbrido, Cromatografía de Afinidad, ELISA o Far western blot.

Los términos "anticuerpo", "anticuerpos" o "inmunoglobulina" se utilizan de manera indistinta en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ej., anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes o anticuerpos multiespecificos (por ej., anticuerpos biespecíficos siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada).

Más particularmente, dicha molécula consiste en una glucoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H, del inglés "heavy") y dos cadenas ligeras (L, del inglés "light") interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (o ^dominio) (abreviado en esta invención HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviado en esta invención como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones de VH y VL puede estar adicionalmente subdivididas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR, siglas correspondientes a "complementarity determining regions"), entremezcladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones estructurales (FR, siglas correspondientes a "framework regions"). Cada VH y VL está compuesta por tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde el término amino hasta el término carboxi en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden intervenir en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores huéspedes, incluyendo diversas células del sistema inmune (por ej. células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complementos clásico.

Las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas pueden estar divididas en tres regiones funcionales: la región Fd, la región bisagra, y la región Fe (cristalizable por fragmento). La región Fd comprende los dominios VH y CHI y, en combinación con la cadena ligera, forma Fab - el fragmento de unión al antígeno. El fragmento Fe es responsable de las funciones efectoras de inmunoglobulinas, lo cual incluye, por ejemplo, la fijación al complemento y la unión a los receptores de Fe cognados de las células efectoras. La región bisagra, encontrada en las clases de inmunoglobulinas IgG, IgA, y IgD, actúa como un espaciador flexible que permite que la porción de Fab se mueva libremente en el espacio con relación a la región Fe. Los dominios bisagra son estructuralrhente diversos, variando en la secuencia como en la longitud entre las clases y subclases de inmunoglobulinas.

De acuerdo con estudios cristalográficos, la región bisagra de inmunoglobulina puede estar adicionalmente subdividida estructural y funcionalmente en tres regiones: la bisagra superior, el núcleo y la bisagra inferior (Shin et al., Immunological Reviews 130:87, 1992). La bisagra superior incluye aminoácidos desde el extremo carboxilo de CHI hasta el primer residuo en la bisagra que restringe el movimiento, en general el primer residuo cisteína que forma un enlace disulfuro entre cadenas entre las dos cadenas pesadas. La longitud de la región bisagra superior se correlaciona con la flexibilidad segmental del anticuerpo. La región bisagra núcleo contiene los puentes disulfuro entre las cadenas pesadas. La región bisagra inferior une el extremo terminal amino de, e incluye los residuos en el dominio CH2. La región bisagra núcleo de lgG1 humana contiene la secuencia Cys-Pro-Pro-Cys que, cuando se dimeriza mediante la formulación de un enlace disulfuro, da como resultado un octapéptidó cíclico que se cree que actúa como un pivote, confiriendo de ese modo flexibilidad. Los cambios conformacionales permitidos por la estructura y flexibilidad de la secuencia polipeptídica de la región bisagra de la inmunoglobulina pueden afectar las funciones efectoras de la porción Fe del anticuerpo.

El término "anticuerpo monoclonal" se utiliza de acuerdo con su significado común para denotar un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones de presentación natural que pueden estar presentes en cantidades menores. En otras palabras; un anticuerpo monoclonal consiste en un anticuerpo homogéneo que es el resultado de la proliferación de un único clon de células (por ej., células de hibridoma, células huésped eucarióticas transfectadas con ADN que codifica el anticuerpo homogéneo, células huésped procarióticas transformadas con ADN que codifica el anticuerpo homogéneo, etc.), y el cual es generalmente caracterizado por cadenas Breve pesadas de una única clase y subclase, y cadenas ligeras de un solo tipo. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un único antígeno. Adicionalmente, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes, o epítopo, cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un único determinante en el antígeno.

En la presente descripción, los términos polipéptidos, secuencias de polipéptidos, secuencias de aminoácidos, péptidos y proteínas unidos a compuestos de anticuerpo o a su secuencia son intercambiables.

Breve descripción de la invención La invención se refiere a un anticuerpo monoclonal, o a un fragmento o derivado del mismo funcional divalente, capaz de inhibir la dimerización de c-Met y que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1 , CDR-H2 y CDR-H3 cón respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID Nos. 1 , 2 y 3 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de la alineación óptima con secuencias SEC ID Nos. 1 , 2 y 3; y una cadena ligera que comprende CDR-L1 , CDR-L2 y CDR-L3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID Nos. 5, 6 y 7 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID Nos. 5, 6 o 7, estando dicho anticuerpo adicionalmente caracterizado porque también comprende una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 56.

Más particularmente, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal, o su fragmento o derivado funcional divalente, según lo descrito anteriormente caracterizado porque también contempla una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 57.

En otras palabras, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal, o su fragmento o derivado funcional divalente, capaz de inhibir la dimerización de c-Met y que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1 , CDR-H2 y CDR-H3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID Nos. 1 , 2 y 3 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID Nos. 1 , 2 y 3; y una cadena ligera que comprende CDR-L1 , CDR-L2 y CDR-L3 con respectivamente las secuencias' de aminoácidos SEC ID Nos. 5, 6 y 7 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de la alineación-óptima con las secuencias SEC ID Nos. 5, 6 o 7, estando dicho anticuerpo adicionalmente caracterizado porque también comprende una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 57.

Más particularmente, la invención se refiere a:un anticuerpo monoclonal, o su fragmento o derivado funcional divalente, según lo descrito anteriormente caracterizado porque también comprende una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 21.

En otras palabras, la invención se refiere además a un anticuerpo monoclonal, o su fragmento o derivado funcional divalente, capaz de inhibir la dimerización de c-Met y que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1 , CDR-H2 y CDR-H3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID Nos. 1 , 2 y 3 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID Nos. 1 , 2 y 3; y una cadena ligera que comprende CDR-L1 , CDR-L2 y CDR-L3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID Nos. 5, 6 y 7 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID Nos. 5, 6 o 7, estando dicho anticuerpo adicionalmente caracterizado porque también comprende una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 21.

Como será evidente para el experto en la técnica, las secuencias de consenso SEC ID Nos. 57 y 21 están comprendidas en la secuencia de consenso SEC ID No. 56.

Tabla 1 Para SEC ID No. 56: X1 : P, R, C, - X5: D, C, G, - ?8: H, V, K, - X12: P, - X2: K, C, R, - X6: K, C, - X9: T, C, E, P, - X14: P, T X3: S, C, D, - X7: T, C, - X11 : P, I La expresión "fragmentos y derivados funcionales" será definida en detalle más adelante en la presente memoria descriptiva.

Por regiones CDR o CDR(s), se pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas según lo definido por IMGT.

La numeración única de IMGT ha sido definida para comparar los dominios variables cualquiera sea el receptor del antígeno, el tipo de cadena o la especie [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P., Pommié, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. y Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. En la numeración única de IMGT, los aminoácidos conservados siempre tienen la misma posición, por ejemplo cisteína 23 (1er-CYS), triptófano 41 (TRP-CONSERVADO), aminoácido hidrófobo 89, cisteína 104 (2da-CYS), fenilalanina o triptófano 1 18 (J-PHE o J-TRP). La numeración única de IMGT proporciona una delimitación estandarizada de las regiones estructurales (FR1-IMGT: posiciones 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 y FR4-IMGT: 1 18 a 128) y de las regiones determinantes de complementariedad: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3-IMGT: 105 a 1 17. Como los espacios vacíos representan posiciones no ocupadas, las longitudes:de CDR-IMGT (mostradas entre corchetes y separadas por puntos, por ej. [8.8.13]) se vuelven información crucial. La numeración única de IMGT se utiliza en representaciones gráficas en 2D, designadas como IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. y Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21 -30 (2007)], y en las estructuras en 3D en IMGT/estructura 3D-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucí. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Existen tres CDRs de cadena pesada y 3 CDRs de cadena ligera. El término CDR o CDRs se utiliza en esta invención a fin de indicar, de acuerdo con el caso, una de estas regiones o varias, o incluso la totalidad, de estas regiones las cuales contienen la mayoría de los residuos de aminoácidos responsables de la unión por afinidad del anticuerpo para el antígeno o el epítopo el cual reconoce.

Por "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos en el sentido de la presente invención, tiene el propósito de indicar un porcentaje de nucleótidos o de residuos aminoácidos idénticos entre las dos secuencias que se van a comparar, obtenidas después de la mejor alineación (alineación óptima), siendo este porcentaje puramente estadístico y las diferentes entre las dos secuencias son distribuidas al azar y por toda su longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se llevan a cabo, tradicionalmente, comparando estas secuencias después de haberlas alineado en forma óptima, siendo dicha comparación capaz se ser llevada a cabo por segmento o por "ventana de comparación". La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, además de manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981 ) [Ad. App. Math. 2:482], por medio del algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], por medio del método de investigación de similitudes de Pearson y Lipman (1988) [Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444), por medio de programas informáticos que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl, o sino mediante programa informático de comparación BLAST N o BLAST P).

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se determina comparando estas dos secuencias alineadas en forma óptima y en las cuales la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos a ser comparadas pueden comprender adiciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia para una alineación óptima entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando la cantidad de posiciones idénticas para las cuales el nucleótido o el residuo aminoácido es idéntico entre las dos secuencias, dividiendo este número de posiciones idénticas por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado obtenido por 100 a fin de obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Por ejemplo, es posible utilizar el programa BLAST, "secuencias BLAST 2" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible en el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/bl2.html, siendo los parámetros utilizados aquellos proporcionados por error (en particular para los parámetros "penalidad de espacio vacío abierto": 5, y "penalidad de extensión de espacio vacío": 2; siendo la matriz seleccionada, por ejemplo, la matriz "BLOSUM 62" propuesta por el programa), el porcentaje de identidad entre las dos secuencias que se van a comparar es calculado directamente por el programa.

Por i secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80%, con preferencia 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia, aquellas que tienen, con respecto a la secuencia de referencia, ciertas modificaciones, en particular una deleción, adición o sustitución de por lo menos un aminoácido, una truncación o una elongación son preferidas. En el caso de una sustitución de uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos, las sustituciones son preferidas en las cuales los aminoácidos sustituidos son reemplazados por aminoácidos "equivalentes". La expresión "aminoácidos equivalentes" tiene el propósito de indicar cualquier aminoácido capaz de ser sustituido con uno de los aminoácidos de la estructura de base sin, sin embargo, modificar esencialmente las actividades biológicas de los anticuerpos correspondientes y como serán definidos más adelante, especialmente en los ejemplos. Estos aminoácidos equivalentes pueden ser determinados ya sea basándose en su homología estructural con los aminoácidos que los mismos reemplazan, o en los resultados de ensayos comparativos de actividad biológica entre los diferentes anticuerpos capaces de llevarse a cabo.

A modo de ejemplo, se hace mención de las posibilidades de sustitución capaces de ser llevadas a cabo sin dar como resultado una modificación profunda de la actividad biológica del anticuerpo modificado correspondiente.

Como ejemplo no limitativo, la siguiente tabla 2 proporciona posibilidades de sustitución concebibles con una conservación de la actividad biológica del anticuerpo modificado. Las sustituciones inversas también son, naturalmente, posibles en las mismas condiciones.

Tabla 2 Debe entenderse aquí que la invención no se refiere a los anticuerpos en forma natural, es decir, no están en su medio ambiente natural pero que han sido capaces de ser aislados u obtenidos por purificación de fuentes naturales, o sino han sido obtenidos mediante recombinación genética, o mediante síntesis química, y pueden entonces contener aminoácidos no naturales como será descrito más adelante.

También debe entenderse, según lo mencionado previamente, que la invención se refiere, más particularmente, a un anticuerpo divalente quimérico y/o humanizado, o cualquier fragmento o derivado funcional divalente, con una actividad antagonista. Los anticuerpos divalentes de la técnica anterior son agonistas o agonistas parciales. El anticuerpo monoclonal de la invención, incluyendo una bisagra modificada según lo descrito previamente, es decir, incluyendo una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 56, 57 o 21 , es novedoso y presenta la particularidad de tener una actividad antagonista mejorada en comparación con el anticuerpo quimérico o humanizado 224G1 1 sin ese tipo de bisagra modificada como será evidente de los ejemplos que figuran más adelante.

En oposición a la técnica anterior, los inventores han obtenido una actividad antagonista mejorada sin modificar el formato del anticuerpo. De hecho, en la técnica previa más cercana representada por el anticuerpo 5D5, ha sido necesario desarrollar un fragmento monovalente del anticuerpo para generar una actividad antagonista. En la presente solicitud, mediante el uso de la bisagra de la invención, es posible, por primera vez, obtener un anticuerpo divalente completo con mayor actividad antagonista, y esto se opone al conocimiento general.

En una realización preferida, el anticuerpo de la invención comprende una región:bisagra que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID Nos. 22 a 28 y 58 a 72, o una secuencia que tiene por ló menos 80% de identidad después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID Nos. 22 a 28 y 58 a 72.

Para más claridad, las siguientes tablas 3 y 4 reagrupan a los aminoácidos y secuencias nucleotídicas de las diferentes bisagras preferidas de la invención.

Tabla 3 SEC SEC ID : Aminoácidos Nucleótidos ID No. No. 22 RKCCVECPPCP 29 AGGAAGTGCTGTGTGGAGTGCCCCCCCTGCCCA 23 PRDCGCKPCICT 30 CCCCGGGACTGTGGGTGCAAGCCTTGCATTTGTAC C 24 PKSCGCKPCICT 31 CCCAAGAGCTGTGGGTGCAAGCCTTGCATTTGTACC 25 PKSCGCKPCICP 32 CCAAAGAGCTGCGGCTGCAAGCCTTGTATCTGTCC C 26 PRDCGCKPCPPCP 33 CCACGGGACTGTGGCTGCAAGCCCTGCCCTCCGTG TCCA 27 PRDCGCHTCPPCP 34 CCCAGAGACTGTGGGTGTCACACCTGCCCTCCTTG TCCT 28 PKSCDCHCPPCP 35 CCCAAAAGCTGCGATTGCCACTGTCCTCCATGTCCA Tabla 4 SEC ID SEC ID Aminoácidos Nucleótidos No. No. 58 73 CKSCDKTHTCPPCP TGCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCC CTGCCCT 59 PCSCDKTHTCPPCP 74 CCCTGCAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCC CTGCCCT 60 PKCCDKTHTCPPCP 75 CCCAAGTGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCC CTGCCCT 61 KSCCKTHTCPPCP 76 CCTAAGAGCTGTTGCAAGACCCACACCTGTCCCCC CTGCCCT '. 62 PKSCDCTHTCPPCP 77 CCCAAGAGCTGCGACTGCACCCACACCTGTCCCCC CTGCCCT 63 PKSCDKCHTCPPCP 78 CCCAAGAGCTGCGACAAGTGCCACACCTGTCCCCC CTGCCCT 64 PKSCDKTHCCPPCP 79 CCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACTGCTGTCCCCC CTGCCCT 65 KCDKTHTCPPCP 80 AAGTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCCCTGCCC T 66 PKSCDCHTCPPCP 81 CCCAAGAGCTGCGACTGCCACACCTGTCCCCCCTG CCCT 67 PKSCDCTHCPPCP 82 CCCAAGAGCTGCGACTGCACCCACTGCCCCCCCTG CCCT 68 PCSCKHTCPPCP 83 CCCTGCAGCTGCAAGCACACCTGTCCCCCCTGCCC T 69 PSCCTHTCPPCP 84 CCTAGCTGCTGCACCCACACCTGTCCCCCCTGCCC T 70 P.SCDKHCCPPCP 85 CCCAGCTGCGACAAGCACTGCTGCCCCCCCTGCCC T 71 PKSCTCPPCP 86 CCCAAGAGCTGCACCTGTCCCCCTTGTCCT 72 PKSCDKCVECPPCP 87 CCCAAGAGCTGCGATAAGTGCGTGGAGTGCCCCCC TTGTCCT De acuerdo con un primer enfoque, el anticuerpo será definido por su secuencia de cadena pesada. Más particularmente, el anticuerpo de la invención, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, es caracterizado porque comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una CDR seleccionada entre las CDRs que comprenden las secuencias de aminoácidos SEC ID Nos. 1 a 3.

Las secuencias mencionadas son las siguientes: SEC ID No. 1 : GYIFTAYT SEC ID No. 2: IKPNNGLA SEC ID No. 3: ARSEITTEFDY De acuerdo con un aspecto preferido, el anticuerpo de la invención, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente dos, y con máxima preferencia tres, CDR(s) seleccionadas entre CDR-H1 , CDR-H2 y CDR-H3, donde: - CDR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 1 , - CDR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 2, - CDR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 3.

En un segundo enfoque, el anticuerpo será ahora definido por su secuencia de cadena ligera. Más particularmente, de acuerdo con un segundo aspecto particular de la invención, el anticuerpo, o: uno de sus fragmentos o derivados funcionales, es caracterizado porque comprende una cadena ligera que comprende por lo menos una CDR seleccionada entre CDRs que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID Nos. 5 a 7.

Las secuencias mencionadas son las siguientes: SEC ID No. 5: ESVDSYANSF SEC ID No. 6: RAS SEC ID No. 7: QQSKEDPLT De acuerdo con otro aspecto preferido, el anticuerpo de la invención, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, comprende una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente dos, y con máxima preferencia tres, CDR(s) seleccionadas entre CDR-L1 , CDR-L2 y CDR-L3, donde: - CDR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 5, - CDR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 6, - CDR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 7.

El hibridoma murino capaz de secretar anticuerpos monoclonales de acuerdo con la presente invención, especialmente hibridoma de origen murino, fue depositado en el CNCM (Instituí Pasteur, París, Francia) el 14/03/2007 bajo el número CNCM 1-3731.

En la presente solicitud, se prefiere que lgG1 obtengan funciones efectoras, y con máxima preferencia, ADCC y CDC.

El experto en la técnica reconocerá que las funciones efectoras incluyen, por ejemplo, unión de C1q¡ citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, según sus siglas en inglés); unión al receptor de Fe; citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCC, según sus siglas en inglés); fagocitosis; y regulación descendente de receptores de superficie celular (por ej. el receptor de células B; BCR, según sus siglas en inglés).

Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención, son preferentemente anticuerpos monoclonales específicos, especialmente de origen murino, quimérico o humanizado, los cuales pueden ser obtenidos de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos por el experto en la técnica. 5 En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos o derivados funcionales, especialmente de origen murino, es posible hacer referencia a técnicas las cuales son descritas en particular en el manual "Antibodies" (Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) o a la técnica de l o preparación a partir de hibridomas descrita por Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

Los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención pueden obtenerse, por ejemplo, de una célula animal inmunizada con el c-Met, o uno de sus fragmentos que contiene el epítopo específicamente reconocido por dichos 15 anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención. Dicho c-Met, o uno de sus fragmentos, puede especialmente ser producido de acuerdo con los métodos de elaboración usuales, mediante recombinación genética comenzando con una secuencia de ácidos nucleicos contenida en la secuencia 20 de ADNc que codifica al c-Met o por síntesis peptídica comenzando a partir de una secuencia de aminoácidos comprendida en la secuencia peptídica del c- Met.

Los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención puede ser, por ejemplo, purificados en una columna de afinidad en la cual el c-Met o uno 25 de sus fragmentos que contiene el epítopo específicamente reconocido por dichos anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención ha sido previamente inmovilizado. Más particularmente, dichos anticuerpos monoclonales pueden ser purificados por cromatografía en proteína A y/o G, seguido o no seguido por cromatografía de intercambio iónico que apunta a eliminar los contaminantes proteicos residuales así como también el ADN y el LPS, en si mismo seguido o no seguido por cromatografía de exclusión en gel Sepharose™ a fin de eliminar los potenciales agregados debido a la presencia de dímeros o de otros multímeros. En una forma aun más preferida, la totalidad de estas técnicas pueden utilizarse en forma simultánea o consecutiva.

El anticuerpo de la invención, o su fragmento o derivado funcional divalente, consiste preferentemente en un anticuerpo quimérico.

Por anticuerpo quimérico, se pretende indicar un anticuerpo el cual contiene una región variable natural (de cadena pesada y cadena ligera) derivada de un anticuerpo de una especie determinada en combinación con las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada de un anticuerpo de una especie heteróloga a dicha especie determinada (por ej., ratón, caballo, conejo, perro, vaca, gallina, etc.).

Los Anticuerpos o sus fragmentos del tipo quimérico de acuerdo con la invención pueden prepararse utilizando las técnicas de recombinación genética. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico puede ser producido clonando un ADN recombinante que contiene un promotor y una secuencia que codifica la región variable de un anticuerpo monoclonal, no humano, especialmente murino, de acuerdo con la invención y una secuencia que codifica la región constante de anticuerpo humano. Un anticuerpo quimérico de la invención codificado por ese tipo de gen recombinante será, por ejemplo, una quimera de ratón- hombre, determinándose la especificidad de este anticuerpo por la región variable derivada del ADN murino y su isotipo determinado por la región constante derivada del ADN humano. Para los métodos de preparación de anticuerpos quiméricos, es posible, por ejemplo, referirse a los documentos Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988), Morrison et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:6851-6855, 1984) o Patente de los Estados Unidos No. US 4.816.567.

Más particularmente, dicho anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional, comprende un dominio variable de cadena pesada quimérico de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 46.

SEC.

ID No. 46: EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYIFTAYTMHWVRQSLGESLD I GGIKP NGLANYNQKFKGKATLTVOKSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCARSEITTEFDY GQGTALTVSS Más particularmente, dicho anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo funcional, comprende un dominio variable de cadena ligera quimérico de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 47.

SEC ID No. 47: DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYANSFMH YQQKPGQPP KLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSKEDPLTFGSGTK LEMKR Más particularmente, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G11][lgG2quim], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 22.

En la presente solicitud, el uso de corchetes no es necesario y, como en el ejemplo, la referencia [224G1 1][lgG2quim] debe ser considerada como idéntica a 224G1 1 lgG2chim. En un mismo modo, para indicar que el anticuerpo es un anticuerpo murino, la expresión murino o la letra n puede agregarse para indicar que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, la expresión quim o la letra c puede agregarse y ; para indicar que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, puede agregarse la expresión, hz, Hz o la letra h. Como un ejemplo, él anticuerpo quimérico 224G1 lgG2 puede ser denominado c224G1 1 lgG2, c224G11 [lgG2], c[224G11 ]lgG2, c[224G1 1][lgG2], 224G1 1 lgG2quim, 224G1 1 [lgG2quim], [224G1 1]lgG2quim o [224G1 1][lgG2qu¡m].

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [TH7quim], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 28.

En la presente solicitud, la referencia TH7 debe ser considerada como idéntica a C7A6-9 o TH7C7A6-9. El símbolo ? significa deleción.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [MHquim], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 23.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [MUP9Hquim], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 26.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o. su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [MMCHquim], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 24.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G11] [C1], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 58.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G11] [C2], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia 5 de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 59.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G11] [C3], I G comprendé un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprendé la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 60.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o. su fragmento o derivado 15 funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G11] [C5], comprendé un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra 20 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 61.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G11] [C6], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que 25 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 62.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1 ] [C7], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprend la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 63.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o. su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [C9], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 64.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [?1 -3], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprend la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 65.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [C7A6], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 66.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [C6A9], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 67.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, ?· su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [C2A5-7], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 68.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [C5A2-6], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 69.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o. su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [C9A2- 7], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 70.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [?5-6-7-8], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 71.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [lgG1/lgG2], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 72.

El anticuerpo de la invención, o su fragmento o derivado funcional divalente, consiste preferentemente en un anticuerpo humano.

El término "anticuerpo humano" incluye a todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. En una realización preferida, todos los dominios variables y constantes (o regiones) son derivados de secuencia de inmunoglobulina humana (anticuerpo totalmente humano). En otras palabras, incluye cualquier anticuerpo el cual tiene regiones variables y constantes (en caso de estar presentes) derivado de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana, es decir, que posee una secuencia de aminoácidos la cual corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano y/o que ha sido preparado utilizando cualquiera de las técnicas para la preparación de anticuerpos humanos conocidas por el expertos en la técnica.

En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos mediante un hibridoma el cual incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ej., un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humano y un transgén de cadena ligera fusionados a una célula inmortalizada.

Como ejemplo para ese tipo de ratón transgénico, puede mencionarse el XENOMOUSE™ el cual es una cepa de ratón modificada por ingeniería genética que comprende fragmentos grandes de los sitios de inmunoglobulina humana y es deficiente en la producción de anticuerpos de ratón (Green at al., 1994, Nature Genetics, 7:13-21). El XENOMOUSE™ produce un repertorio humano del tipo adulto de anticuerpos completamente humanos, y genera anticuerpos monoclonales humanos específico para el antígeno. Una segunda generación XENOMOUSE™ contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos (Green & Jakobovits, 1998, J. Exp. Med., 188:483-495).

Cualquier otra técnica conocida por el experto en la técnica, tal como la técnica de exhibición de fagos, también puede utilizarse para la generación de anticuerpo humano de acuerdo con la invención.

El anticuerpo de la invención, o su fragmento o derivado funcional dívalente, consiste preferentemente en un anticuerpo humanizado.

Mediante la expresión "anticuerpo humanizado", se pretende indicar un anticuerpo el cual contiene regiones CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano, las otras partes de la molécula del anticuerpo son derivadas de uno (o de varios) anticuerpos humanos. Asimismo, algunos de los residuos de los segmentos del esqueleto (denominado FR) pueden ser modificados a fin de conservar la afinidad de la unión (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).

Los anticuerpos humanizados de acuerdo con la invención o sus fragmentos pueden prepararse mediante técnicas conocidas por el experto en la técnica (tales como, por ejemplo, aquellas descritas en los documentos Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; o Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992).

El experto en la técnica conoce otros métodos de humanización como, por ejemplo, el método "CDR Grafting" ("Injerto de CDR") descrito por Protein Design Lab (PDL) en las solicitudes de patente EP 0 451261 , EP 0 682 040, EP 0 9127, EP 0 566 647 o US 5.530.101 , US 6.180.370, US 5.585.089 y US 5.693.761. También pueden mencionarse las siguientes solicitudes de patentes: US 5.639.641 ; US 6.054.297; US 5.886.152 y US 5.877.293.

Más particularmente, dicho anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional, comprende un dominio variable de cadena pesada humanizado de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 4 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 4.

SEC. ID No. 4: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGL EWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTE FDYWGQGTLVTVSS Más particularmente, dicho anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional, comprende un dominio variable de cadena ligera humanizado seleccionado del grupo de secuencias que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 8, 9 o 10 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 8, 9 o 10.

SEC. ID No. 8: DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFMHWYQQKPG QPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGG GTKVEIKR SEC. ID No. 9: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFMHWYQQKPG QPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGG GTKVEIKR SEC. ID No. 10: DIV TQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKP GQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFG GGTKVEIKR Más particularmente, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G11] [lgG2Hz1], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 8, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 22.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G11] [lgG2Hz2], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 9, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 22.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [lgG2Hz3], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende 5 la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 10, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 22.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o: su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] í o [TH7Hz1 ], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 8, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 28.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado 15 funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [TH7z2], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 9, y una región 2 0 bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 28.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con la invención y denominado [224G1 1] [TH7Hz3], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 4, un dominio variable de cadena ligera 25 que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 0, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 28.

En otro aspecto, los anticuerpos de la invención pueden describirse por sus cadenas pesadas y ligeras totales, respectivamente.

Como un ejemplo, el anticuerpo [224G1 1] [lgG2quim] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 50, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 50, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G1 1] [TH7quim] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 51 , o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 51 , y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G1 1] [C1] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 88, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 88, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G1 1] [C2] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 89, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 89, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G11] [C3] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 90, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 90, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G11 ] [C5] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 91 , o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 91 , y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o úna secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G11] [C6] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 92, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 92, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G1 1] [C7] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 93, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 93, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G1 1 ] [C9] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 94, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 94, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o úna secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G11] [?1-3] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 95, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 95, y una cadena ligéra completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G11] [C7A6] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 96, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 96, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G11 ] [C6A9] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 97, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 97, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G1 1] ; [C2A5-7] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 98, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 98, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G11] [C5A2-6] de la invención comprendé una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 99, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 99, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G11] [C9A2-7] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 100, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 100, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G1 1] [?5-6-7-8] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 101 , o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 101 , y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G1 1] [lgG1/lgG2] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 102, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 102, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 52, o una secuencia que tiene por lo menos :80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G1 1] [lgG2Hz1 ] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 36, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 36 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 38, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 38.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G11] [lgG2Hz2] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 36, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 36 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 39, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 39.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G11 ] [lgG2Hz3] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 36, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 36 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 40, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 40.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G1 1] [TH7Hz1] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 37, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 37 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 38, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 38.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G11] [TH7Hz2] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 37, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 37 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 39, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 39.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G1 1] [TH7Hz3] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 37, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 37 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 40, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID No. 40.

Otros ejemplos de anticuerpos, o sus derivados, de acuerdo con la invención comprende cadena pesadas completas que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID No. 88 a 102 (secuencias nucleotídicas correspondientes son SEC ID Nos. 103 a 117).

Por "fragmento funcional" de un anticuerpo de acuerdo con la invención, tiene el propósito de indicar en particular un fragmento de anticuerpo, tal como fragmentos Fv, scFv (se por cadena simple), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc o diacuerpos, o cualquier fragmento del cual el tiempo de vida media se habría incrementado mediante modificación química, tal como la adición de poli(alquilen)glicol tal como poli(etilen)gl¡col ("PEGilación") (fragmentos pegilados denominados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(abVPEG o Fab'-PEG) ("PEG" por Poli(Etilen) Glicol), o mediante la incorporación en un liposoma, teniendo dichos fragmentos por lo menos una de las CDRs características de secuencia SEC ID Nos. 1 a 3 y de 5 a 7 de acuerdo con la invención, y, especialmente, en que es capaz de ejercer en forma general una actividad parcial uniforme del anticuerpo del cual desciende, tal como, en particular, la capacidad de reconocer y de unirse al c-Met, y, en caso necesario, inhibir la actividad del c-Met.

Con preferencia, dichos fragmentos funcionales estarán constituidos o comprenderán una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo del cual derivan, siendo dicha secuencia parcial suficiente para retener la misma especificidad de unión que el anticuerpo del cual desciende y una afinidad suficiente, preferentemente por lo menos igual a 1/100, en un modo más preferido hasta por lo menos 1/10, de la del anticuerpo del cual desciende, con respecto al c-Met. Ese tipo de fragmento funcional contendrá como mínimo 5 aminoácidos, con preferencia 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 50 y 100 aminoácidos consecutivos de la secuencia del anticuerpo del cual desciende.

Preferentemente, estos fragmentos funcionales serán fragmentos de tipo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc o diacuerpos, los cuales generalmente tienen la misma especificidad de unión que el anticuerpo del cual descienden. En una realización más preferida de la invención, estos fragmentos son seleccionados entre fragmentos divalentes tales como fragmentos F(ab')2- De acuerdo con la presente invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención pueden obtenerse comenzando de anticuerpos tales como los descritos anteriormente mediante métodos tales como digestión por enzimas, tal como pepsina y/o papaína y/o por disociación de los puentes disulfuro mediante reducción química. De otro modo, los fragmentos de anticuerpo comprendidos en la presente invención pueden obtenerse mediante técnicas de recombinación genética igualmente bien conocidas por el experto en la técnica o de otro modo mediante síntesis peptídica por medio de, por ejemplo, sintetizadores peptídicos automáticos tales como aquellos suministrados por la compañía Applied Biosystems, etc.

Por "fragmento divalente", debe entenderse cualquier fragmento de anticuerpo que comprende dos brazos y, más particularmente, fragmentos F(ab')2.

Por "derivados" de un anticuerpo de acuerdo con la invención, se quiere decir una proteína de unión que comprende una estructura proteica y por lo menos una de las CDRs seleccionadas del anticuerpo original a fin de mantener la capacidad de unión. Dichos compuestos son bien conocidos por el experto en la técnica y serán descritos en forma más detallada en la siguiente memoria descriptiva.

Más particularmente, el anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, de acuerdo con la invención es caracterizado porque dicho derivado consiste en una proteína de unión que comprende una estructura en la cual al menos una CDR ha sido injertada para la conservación de las propiedades de reconocimiento paratópicas del anticuerpo original.

Una o varias secuencias a través de las 6 secuencias de CDR descritas en la invención pueden presentarse en una estructura proteica. En este caso, la estructura proteica reproduce el armazón proteico con pliegue apropiado de las CDR(s) injertada(s), permitiéndole(s) mantener sus propiedades de reconocimiento paratópicas del antígeno.

El experto en la técnica sabe como seleccionar la estructura proteica sobre la cual al menos una CDR seleccionada del anticuerpo original podría ser injertada. Más particularmente, se sabe que, para ser seleccionada, dicha estructura debería exhibir diversas características como sigue (Skerra A., J. Mol. Recogn., 13, 2000, 167-187): filogenéticamente buena conservación, : • arquitectura robusta con una organización molecular tridimensional bien conocida (tal como, por ejemplo, cristalografía o RMN), tamaño pequeño, ningún grado o solamente bajo grado de modificaciones posttraducción, fácil de producir, expresar y purificar.

Dicha estructura proteica puede ser, aunque sin limitarse a, una estructura seleccionada del grupo formado por fibronectina y preferentemente el décimo dominio del tipo III de fibronectina (FNfnIO), lipocalina, anticalina (Skerra A., J. Biotechnol., 2001 , 74(4):257-75), el derivado de proteína Z del dominio B de la proteína A estafilocóccica, tioredoxina A o cualquier proteína con dominio repetido tal como "repetición de anquirina" (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 00, No.4, 1700-1705), "repetición de armadillo", "repetición rica en leucina" o "repetición de tetratricopéptido".

También puede mencionarse el derivado de estructura de toxinas (tales como, por ejemplo, toxinas de escorpión, insecto, planta o molusco) o inhibidores proteicos de la sintasa de óxido nítrico neuronal (PIN, según sus siglas en inglés).

Como un ejemplo no limitativo de dichas construcciones híbridas, puede mencionarse la inserción de la CDR-H1 (cadena pesada) de un anticuerpo anti-CD4, es decir, el anticuerpo 13B8.2, en uno de los lazos expuestos de la PIN. Las propiedades de unión de la proteína de unión obtenida siguen siendo similares al anticuerpo original (Bes et al., BBRC 343, 2006, 334-344). También puede mencionarse el injerto de la CDR-H3 (cadena pesada) de un anticuerpo VHH anti-lisozima en un lazo de neocarzinostatina (Nicaise et al., 2004).

Según lo mencionado con anterioridad, dicha estructura proteica puede comprender entre 1 y 6 CDR(s) del anticuerpo original. En una realización preferida, pero sin limitación alguna, el experto en la técnica seleccionaría por lo menos una CDR de la cadena pesada, sabiendo que dicha cadena pesada está particularmente implicada en la especificidad del anticuerpo. La selección de la(s) CDR(s) de interés será evidente para el experto en la técnica con método conocido (BES et al., FEBS letters 508, 2001 , 67-74).

Como una evidencia, estos ejemplos no son limitativos y cualquier otra estructura conocida o descrita debe estar incluida en la presente memoria descriptiva.

De acuerdo con un aspecto novedoso, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado, caracterizado porque se selecciona entre los siguientes ácidos nucleicos: a) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica para un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, de acuerdo con la invención; b) una secuencia de ácidos nucleicos que comprende las secuencias SEC ID No. 1 1 , SEC ID No. 12, SEC ID No. 13 y las secuencias SEC ID No. 15, SEC ID No. 16 y SEC ID No. 17; c) una secuencia de ácidos nucleicos que comprende las secuencias SEC ID No. 14 y SEC ID No. 18, 19 o 20; d) los correspondientes ácidos nucleicos de ARN de los ácidos nucleicos según lo definido en b) o c); e) los ácidos nucleicos complementarios de los ácidos nucleicos según lo definido en a), b) y c); y f) un ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos capaz de hibridación bajo condiciones de elevada severidad con por lo menos una de las CDRs de la secuencia SEC ID Nos. 1 1 a 13 y 15 a 17.

De acuerdo con aun otro aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado, caracterizado porque se selecciona entre los siguientes ácidos nucleicos: - un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica para un anticuerpo, o uno de sus fragnm seleccionada entre el grupo formado por las secuencias SEC ID Nos. 29 a 35 y SEC ID Nos. 73 a 87.

Por ácido nucleico, nucleico o secuencia de ácido nucleico, polinucleótido, oligonucleótido, secuencia de polinucleótidos, secuencia de nucleótidos, términos que serán empleados en forma indistinta en la presente invención, se pretende indicar una ligación precisa de nucleótidos, los cuales están modificados o sin modificar, permitiendo la definición de un fragmento o una región de un ácido nucleico, que contiene o no contiene nucleótidos no naturales, y pudiendo corresponder también con un ADN de doble hebra, un ADN de hebra simple como a los productos de transcripción de dichos ADNs.

Debe entenderse también en este punto que la presente invención no se ocupa de las secuencias nucleotídicas en su entorno cromosómico natural, es decir, en el estado natural. Se refiere a secuencias las cuales han sido aisladas y/o purificadas, es decir, han sido seleccionadas en forma directa o indirecta, por ejemplo por copia, habiendo sido su entorno por lo menos parcialmente modificado. Por lo tanto, igualmente se pretende indicar en este punto los ácidos nucleicos aislados obtenidos por recombinación genética por medio de, por ejemplo, células huéspedes u obtenidos por síntesis química.

Una hibridación bajo condiciones de elevada severidad significa que las condiciones de temperatura y las condiciones de resistencia iónica se seleccionan de modo tal que permiten el mantenimiento de la hibridación entre dos fragmentos de ADN complementario. A modo de ilustración, las condiciones de elevada severidad del paso de hibridación para los propósitos de definir los fragmentos polinucleotídicos antes descritos son ventajosamente las siguientes.

La hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN se lleva a cabo en dos pasos: (1 ) prehibridación a 42°C durante 3 horas en buffer de fosfato (20 mM, pH 7,5) que contiene 5 x SSC (1 x SSC corresponde a una solución de NaCI 0.15 M + citrato sódico 0.015 M), 50% de formamida, 7% de dodecilsulfato sódico (SDS), 10 x Denhardt's, 5% de sulfato de dextrano y 1 % de ADN de esperma de salmón; (2) hibridación real durante 20 horas a una temperatura dependiente del tamaño de la sonda (es decir,: 42°C, para un tamaño de sonda > 100 nucleótidos) seguido por 2 lavados de 20 minutos a .20°C en 2 x SSC + 2% de SDS, 1 lavado de 20 minutos a 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % de SDS. El último lavado se lleva a cabo en 0,1 x SSC + 0, 1 % de SDS durante 30 minutos a 60°C para un tamaño de sonda de > 100 nucleótidos. Las condiciones de hibridación de elevada severidad antes descritas para un polinucleótido de tamaño definido pueden adaptarse por el experto en la técnica para oligonucleótidos de tamaño mayor o menor, de acuerdo con las enseñanzas de Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).

La invención se refiere, asimismo, a un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.

La invención apunta especialmente a la clonación y/o expresión de vectores los cuales contienen una secuencia nucleotídica de acuerdo con la invención.

Los vectores de acuerdo con la invención preferentemente contienen elementos los cuales permiten la expresión y/o la secreción de las secuencias nucleotídicas traducidas en una células huésped determinada. Por lo tanto, el vector debe contener un promotor, señales de iniciación y terminación de la traducción, así como también regiones apropiadas de regulación de la transcripción. Debe poder mantenerse en forma estable en la célula huésped y puede opcionalmente tener señales particulares las cuales especifican la secreción de la proteína traducida. Estos elementos diferentes son seleccionados y optimizados por el experto en la técnica en función de la célula huésped utilizada. Con este fin, las secuencias nucleotídicas de acuerdo con la invención pueden insertarse en vectores de replicación autónomos en el huésped seleccionado, o pueden ser vectores integrativos del huésped seleccionado.

Ese tipo de vectores son preparados mediante métodos actualmente utilizados por el experto en la técnica, y los clones resultantes pueden ser introducidos en un huésped apropiado mediante métodos convencionales, tales como lipofección, electroporación, choque térmico, o métodos químicos.

Los vectores de acuerdo con la invención son, por ejemplo, vectores de origen plasmídico o viral. Son útiles para transformar células huéspedes a fin de clonar o expresar las secuencias nucleotídicas de acuerdo con la invención.

Igualmente, la invención comprende las células huéspedes mediante o comprendiendo un vector de acuerdo con la invención. La célula huésped puede seleccionarse entre sistemas procarióticos o eucarióticos, por ejemplo, células bacterianas pero igualmente células de levadura o células animales, en particular células de mamífero. Es asimismo posible utilizar células de insecto o células vegetales.

Igualmente, la invención se refiere a animales, excepto el hombre, los cuales comprenden por lo menos una célula transformada de acuerdo con la invención.

De acuerdo con otro aspecto, un objeto de la invención es un proceso para la producción de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la invención, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) cultivo en un medio y condiciones de cultivo apropiadas de una célula huésped de acuerdo con la invención; y b) la recuperación de dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, producidos de ese modo comenzado del medio de cultivo o dichas células cultivadas.

Las células transformadas de acuerdo con la invención pueden utilizarse en procesos para la preparación de polipéptidos recombinantes de acuerdo con la invención. Los procesos para la preparación de un polipéptido de acuerdo con la invención en forma recombinante, caracterizado porque emplean un vector y/o una célula transformada mediante un vector de acuerdo con la invención, son por sí mismos comprendidos en la presente invención. Preferentemente, una célula transformada por un vector de acuerdo con la invención se cultiva bajo condiciones las cuales dan lugar a la expresión de dicho polipéptido y se recupera dicho péptido recombinante.

Según lo mencionado, la célula huésped puede seleccionarse entre sistemas procarióticos o eucarióticos. En particular, es posible identificar secuencias nucleotídicas de acuerdo con la invención, facilitando la secreción en dicho sistema procariótico o eucariótico. Un vector de acuerdo con la invención que porta ese tipo de secuencia puede, por lo tanto, utilizarse ventajosamente para la producción de proteínas recombinantes, destinadas a ser secretadas. En efecto, la purificación de estas proteínas recombinantes de interés será facilitada por el hecho de que están presentes en el sobrenadante del cultivo celular más que en el interior de las células huéspedes.

Es igualmente posible preparar los polipéptidos de acuerdo con la invención mediante síntesis química. Ese tipo de proceso de preparación es igualmente un objeto de la invención. El experto en la técnica conoce los procesos de síntesis química, por ejemplo las técnicas que emplean fases sólidas [Steward et al., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 1 1 1 , 2da ed., (1984)] o técnicas que utilizan fases sólidas parciales, por condensación de fragmentos o mediante una síntesis clásica en solución. Los polipéptidos obtenidos mediante síntesis química y que son capaces de contener aminoácidos no naturales correspondientes están igualmente comprendidos en la invención.

Los anticuerpos, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, capaces de ser obtenidos mediante un proceso de acuerdo con la invención están igualmente comprendidos en la presente invención.

La invención también se refiere al anticuerpo de la invención como un medicamento.

La invención se refiere igualmente a una composición farmacéutica que comprendé a modo de principio activo un compuesto que consiste en un anticuerpo,- o uno de sus fragmentos funcionales de acuerdo con la invención, preferentemente mezclado con un excipiente y/o un vehículo aceptable para uso farmacéutico.

Otra realización complementaria de la invención consiste en una composición tal como se describe con anterioridad la cual comprende, adicionalmente, como un producto de combinación para el uso simultáneo, separado ó consecutivo, un anticuerpo anti-tumoral. : Con máxima preferencia, dicho segundo anticuerpo anti-tumoral podría seleccionarse entre los anticuerpos anti-IGF-IR, anti-EGFR, anti-HER2/neu, anti-VEGFR, anti-VEGF, etc., o entre cualquiera de los otros anticuerpos antitumorales conocidos por el experto en la técnica. Es evidente que el uso, como segundo anticuerpo, de fragmentos funcionales o derivados de los anticuerpos antes mencionados es parte de la invención.

Como un anticuerpo más preferido, los anticuerpos anti-EGFR se seleccionan tal como por ejemplo el anticuerpo C225 (Erbitux).

"Uso simultáneo" quiere decir la administración de los dos compuestos de la composición de acuerdo con la invención en una forma farmacéutica única e idéntica.

"Uso por separado" se entiende que significa la administración, al mismo tiempo, de los dos compuestos de la composición de acuerdo con la invención en formas farmacéuticas distintas.

"Uso consecutivo" se entiende que significa la administración sucesiva de los dos compuestos de la composición de acuerdo con la invención, cada uno en una forma farmacéutica distinta.

En forma general, la composición de acuerdo con la invención aumenta considerablemente la eficacia del tratamiento del cáncer. En otras palabras, el efecto terapéutico de los anticuerpos anti-c-Met de acuerdo con la invención es potenciado en forma inesperada mediante la administración de un agente citotóxico. Otra ventaja subsiguiente principal producida por una composición de acuerdo con la invención se refiere a la posibilidad de utilizar dosis eficaces inferiores de principio activo, lo cual permite evitar los riesgos de aparición de efectos secundarios o la reducción de los mismos, en particular los efectos del agente citotóxico.

Por añadidura, esta composición de acuerdo con la invención permitiría el logro del efecto terapéutico esperado de manera más rápida.

La composición de la invención también puede ser caracterizada porque comprende, adicionalmente, como un producto combinado para el uso simultáneo, separado o consecutivo, un agente citotóxico/ citostático.

Por "agentes terapéuticos anticancerígenos" o "agentes citotóxicos / citostáticos", se quiere decir una sustancia la cual, cuando se administra a un sujeto, trata o previene el desarrollo de cáncer en el cuerpo del sujeto. Como un ejemplo no limitativo de ese tipo de agentes, puede mencionarse agentes alquilantes, anti-metabolitos, antibióticos antitumorales, inhibidores mitóticos, inhibidores de la función de cromatina, agentes anti-angiogénesis, anti-estrógenos, anti-andrógenos o inmunomoduladores.

Dichos agentes son, por ejemplo, citados en la edición 2001 de VIDAL, en la página dedicada a los compuestos vinculados con la columna de cancerología y hematología "Citotóxicos", estos compuestos citotóxicos citados con referencia a este documento son citados aquí como agentes citotóxicos preferidos.

Más particularmente, los siguientes agentes son preferidos de acuerdo con la invención.

"Agente alquilante" se refiere a cualquier sustancia la cual puede entrecruzar o alquilar cualquier molécula, con preferencia, ácido nucleico (por ej., ADN), dentro de una célula. Los ejemplos de agentes alquilantes incluyen mostaza de nitrógeno tal como mecloretamina, clorambucol, melfalen, cloridrato, pipobromen, prednimustina, fosfato disódico o estramustina; oxazoforinás tales como ciclofosfamida, altretamina, trofosfamida, sulfofosfamida o ifosfamida; aziridinas o imina-etilenos tales como tiotepa, trietilenamina o altetramina; nitrosourea tales como carmustina, estreptozocina, fotemustina o lomustina; alquilen-sulfonatos tales como busulfan, treosulfan o improsulfan; triacenos tales como dacarbazina; o complejos de platino tales como cis-platino, oxaliplatino y carboplatino.

"Anti-metabolitos" se refieren a sustancias que bloquean el crecimiento y/o el metabolismo celular interfiriendo con ciertas actividades, generalmente con la síntesis del ADN. Los ejemplos de anti-metabolitos incluyen metotrexato, 5-fluoruracilo, floxuridina, 5-fluorodesoxiuridina, capecitabina, citarabina, fludarabina, arabinósido de citosina, 6-mercaptopurina (6-MP), 6-tioguanina (6-TG), clorodesoxiadenosina, 5-azacitidina, gemcitabina, cladribina, desoxicoformicina y pentostatina.

"Antibióticos antitumorales" se refieren a compuestos los cuales pueden evitar o inhibir la síntesis del ADN, ARN y/o proteína. Los ejemplos de antibióticos antitumorales incluyen doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, valrubicina, mitoxantrona, dactinomicina, mitramicina; plicamicina, mitomicina C, bleomicina, y procarbazina.

"Inhibidores mitóticos" previenen la evolución normal del ciclo celular y la mitosis. En general, los inhibidores microtubulares o taxoides tales como paclitaxel y docetaxel son capaces de inhibir la mitosis. Los alcaloides de la Vinca tales como vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina son también capaces de inhibir la mitosis.

"Inhibidores de la función de la cromatina" o "inhibidores de la topoisomerasa" se refieren a sustancias las cuales inhiben la función normal de las proteínas de modelado de la cromatina tales como topoisomerasa I o topoisomerasa II. Los ejemplos de los inhibidores de la función de la cromatina incluyen, para topoisomerasa I, camptotecina y sus derivados tales como topotecan o irinotecan, y, para la topoisomerasa II, etopósido, fosfato de etopósido y tenipósido.

"Agente anti-angiogénesis" se refiere a cualquier fármaco, compuesto, sustancia o agente el cual inhibe el crecimiento de los vasos sanguíneos. Los agentes antiangiogénesis ejemplares incluyen, aunque sin limitarse a, razoxina, marimastat, batimastat, prinomastat, tanomastat, ¡lomastat, CGS-27023A, halofuginon, COL-3, neovastat, BMS-275291 , talidomida, CDC 501 , DMXAA, L-651582, escualamina, endostatina, SU5416, SU6668, ¡nterferón-alfa,EMD121974, ¡nterleucina-12, IM862, angiostatina y vitaxin.

"Anti-estrógeno" o "agente anti-estrogénico" se refiere a cualquier sustancia la cual reduce, antagoniza o inhibe la acción de estrógeno. Los ejemplos de agentes antiestrogénicos son tamoxiféno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, iodoxifeno, anastrozol, letrozol, y exemestano.

"Anti-andrógenos" o "agentes anti-andrógenos" se refiere a cualquier sustancia la cual reduce, antagoniza o inhibe la acción de un andrógeno. Los ejemplos de antiandrógenos son flutamida, nilutamida, bicalutamida, espironolactona, acetato de ciproterona, finasterida y:cimit¡dina.

"Inmunomoduladores" son sustancias las cuales estimulan el sistema inmune.

Los ejemplos de inmunomoduladores incluyen interferón, interleuquina tales como aldesleuquina, OCT-43, denileuquina diflitox y interleuquina-2, factores de necrosis tumoral tales como tasonermina u otros inmunomoduladores tales como lentinan, sizofiran, roquinimex, pidotimod, pegademase, timopentina, poli l:C o levamisol en conjunto con 5-fluorouracilo.

Para más detalle, el experto en la técnica podría hacer referencia al manual editado por the "Association Francaise des Enseignants de Chimie Thérapeutique" y titulado "Traité de chimie thérapeutique", vol. 6, Médicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, edición TEC & DOC, 2003.

Se pueden mencionar además como agentes químicos o agentes citotóxicos, todos los inhibidores de quinasa tales como, por ejemplo, gefitinib o erlotinib.

En una realización particularmente preferida, dicha composición como un producto de combinación de acuerdo con la invención es caracterizada porque dicho agente citotóxico es acoplado químicamente a: dicho anticuerpo para uso simultáneo: A fin de facilitar el acoplamiento entre dicho agente citotóxico y dicho anticuerpo de acuerdo con la invención, es especialmente posible introducir moléculas espadadoras entre los dos compuestos que se van a acoplar, tales como poli(alquilen)glicoles tal como polietilenglicol, o sino aminoácidos, o, en otra realización, para utilizar derivados activos de dichos agentes citotóxicos en los cuales se habrían introducido funciones capaces de reaccionar con dicho anticuerpo de acuerdo con la invención. Estas técnicas de acoplamiento son bien conocidas por el experto en la técnica y no serán descritas con más detalle en la presente descripción.

La invención se refiere, en otro aspecto, a una composición caracterizada porque uno, por lo menos, de dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, se conjuga con una toxina celular y/o un radioelemento.

Preferentemente, dicha toxina o dicho radioelemento es capaz de inhibir por lo menos una actividad celular de células que expresan el c-Met, en un modo más preferido capaz de prevenir el crecimiento o la proliferación de dicha célula, especialmente o totalmente inactivando dicha células.

Preferentemente también, dicha toxina es una toxina enterobacteriana, especialmente la exotoxina A de Pseudomonas.

Los radioelementos (o radioisótopos) preferentemente conjugados a los anticuerpos empleados para la terapia son radioisótopos los cuales emiten rayos gamma y preferentemente yodo131, itrio90, oro199, paladio100, cobre67, bismuto217 y antimonio211. Los radioisótopos los cuales emiten rayos beta y alfa pueden igualmente utilizarse para la terapia.

Por toxina o radioelemento conjugado a por lo menos un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, de acuerdo con la invención, se pretende indicar cualquier medio que permita a dicha toxina o dicho radioelemento unirse a dicho por lo menos un anticuerpo, especialmente mediante acoplamiento covalente entre los dos compuestos, con o sin introducción de una molécula de enlace.

Entre los agentes que permiten la unión' en una forma química (covalente), electrostática o no covalente de la totalidad o parte de los componentes del conjugado, puede mencionarse particularmente a la benzoquinona, carbodiimida y más particularmente EDC (clorhidrato de 1 -etil-3-[3-dimetil-aminopropil]-carbodiimida), dimaleimida, ácido ditiobis-nitrobenzoico (DTNB), N-succinimidil S-acetil tio-acetato (SATA), los agentes puente que tienen uno o más grupos fenilazida que reaccionan con los ultravioletas (U.V.) y con preferencia N-[-4-(azidosalicilamino)butil]-3'-(2'-pindilditio)-propionamida (APDP), N-succinimid-il 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), 6-hidrazino- nicotinamida (HYNIC).

Otra forma de acoplamiento, especialmente- para los radioelementos, puede consistir en el uso de un quelante iónico bifuncional.

Entre estos quelatos, es posible mencionar los quelatos derivados de EDTA (ácido etilendiaminatetraacético) o de DTPA (ácido dietilentriaminapentaacético) los cuales han sido desarrollados para unir metales, especialmente metales radiactivos e ¡nmunoglobulinas. Por ende, DTPA y sus derivados pueden ser sustituidos por diferentes grupos en la cadena de carbono a fin de aumentar la estabilidad y la rigidez del complejo de ligando -metal (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991 ); Gansow (1991 ); Patente de los Estados Unidos No. 4.831.175).

Por ejemplo, el ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA) y sus derivados, los cuales han sido ampliamente utilizados en medicina y en biología durante un largo tiempo ya sea en su forma libre, o en la forma de un complejo con un ion metálico, tienen la característica notable de formar quelatos estables con iones metálicos y de ser acoplados con proteínas de interés terapéutico o de diagnóstico tales como anticuerpos para el desarrollo de radioinmunoconjugados en terapia contra el cáncer (Meases et al., 1984; Gansow et al., 1990).

Asimismo, con preferencia, dicho por lo menos un anticuerpo que forma dicho conjugado de acuerdo con la invención se selecciona entre sus fragmentos funcionales, especialmente los fragmentos amputados de su componente de Fe tales como los fragmentos scFv.

Según lo ya mencionado, en un realización' preferida de la invención, dicho agente citotóxico/ citostático o dicha toxina y/o un radioelemento es acoplado químicamente a por lo menos uno de los elementos de dicha composición para uso simultáneo.

La presente invención comprende la composición descrita como un medicamento.

La presente invención comprende además el uso de una composición de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, y/o de una composición según lo descrito anteriormente para la preparación de un medicamento destinado a inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células tumorales.

Otro aspecto de la invención consiste en el uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales y/o de una composición, según lo descrito anteriormente o el uso antes mencionado, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento del cáncer.

La presente invención también comprende un método destinado a inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células tumorales en un paciente que comprende la administración a un paciente que lo necesita de un anticuerpo, o de uno de sus fragmentos o derivados funcionales de acuerdo con la invención, un anticuerpo producido por un hibridoma de acuerdo con la invención o una composición de acuerdo con la invención.

La presente invención comprende además un método para la prevención o el tratamiento del cáncer en un paciente que lo necesita, que comprende la administración al paciente de un anticuerpo, o de uno de sus fragmentos o derivados funcionales de acuerdo con la invención, un anticuerpo producido por un hibridoma de acuerdo con la invención o una composición de acuerdo con la invención.

En un aspecto preferido en particular, dicho cáncer es un cáncer seleccionado entre cáncer de próstata, osteosarcomas, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de endometrio, glioblastoma o cáncer de colon.

Según lo ejemplificado anteriormente, una ventaja de la invención consiste en el tratamiento de la activación de Met dependiente o independiente de HGF relacionada con cánceres.

La invención, en aun otro aspecto, abarca un método de diagnóstico in vitro de enfermedades inducidas por una sobreexpresión o una expresión insuficiente del receptor c-Met comenzando a partir de una muestra biológica en la cual la presencia anormal del receptor c-Met es sospechada, estando dicho método caracterizado porque comprende un paso donde dicha muestra biológica se pone en contacto con un anticuerpo de la invención, siendo posible que dicho anticuerpo sea etiquetado en caso de ser necesario.

Preferentemente, dichas enfermedades conectadas con una presencia anormal del receptor c-Met en dicho método de diagnóstico serán cánceres. Dicho anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, puede estar presente en la forma de un inmunoconjugado o de un anticuerpo etiquetado de modo de obtener una señal detectable y/o cuantificable.

Los anticuerpos etiquetados de acuerdo con la invención o sus fragmentos funcionales incluyen, por ejemplo, anticuerpos denominados inmunoconjugados los cuales pueden ser conjugados, por ejemplo, con enzimas tales como peroxidasa, fosfatasa alcalina, beta-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucosa amilasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa, lisozima, malato deshidrogenasa o glucosa 6-fosfato deshidrogenasa o mediante una molécula tal como biotina, digoxigenina o 5-bromodesoxiuridina.

Las etiquetas fluorescentes pueden asimismo conjugarse a los anticuerpos o a sus fragmentos funcionales de acuerdo con la invención y especialmente incluyen fluoresceína y sus derivados, fluorocromo, rodamina y sus derivados, GFP (GFP por "Green Fluorescent Protein" (Proteína Fluorescente Verde), dansilo, umbeliferona etc. En ese tipo de conjugados, los anticuerpos de la invención o sus fragmentos funcionales pueden prepararse mediante métodos conocidos por el experto en la técnica. Pueden acoplarse a las enzimas o a las etiquetas fluorescentes directamente o mediante el intermediario o un grupo espaciador; o de un grupo de ligación tal como un polialdehído, tal como glutaraldehído, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilen-triaminapentaacético (DPTA), o en presencia de agentes de acoplamiento tales como aquellos antes mencionados para los conjugados terapéuticos. Los conjugados que contienen etiquetas de tipo fluoresceína pueden prepararse mediante reacción con un isotiocianato.

Otros conjugados pueden incluir, asimismo, etiquetas quimiluminiscentes tales como luminol y los dioxetanos, etiquetas bio-iuminiscentes tales como luciferasa y luciferina, o sino etiquetas radiactivas tales como yodo123, yodo125, yodo126, yodo133, bromo77, tecnetio99"1, indio111 , indio113"1, galio67, galio68, rutenio95, rutenio97, rutenio103, rutenio105, mercurio107, mercurio203, renio99m, renio10 , renio105, escandio47, telurio121"1, telurio122"1, telurio125"1, tulio165, tulio167, tulio168, flúor18, itrio199, yodo131. Los métodos conocidos por el experto en la técnica existentes para acoplar los radioisótopos terapéuticos a los anticuerpos ya sea directamente o por medio de un agente quelante tales como EDTA, DTPA mencionados anteriormente pueden utilizarse para los radioelementos los cuales pueden utilizarse en diagnóstico. Igualmente, es posible mencionar el marcado con Na[l125] mediante el método de cloramina T [Hunter W.M. y Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495] o sino con tecnetio99m mediante la técnica de Crockford et al. (Patente de los Estados Unidos No. 4.424.200) o unido por medio de DTPA según lo descrito por Hnatowich (Patente de los Estados Unidos No. 4.479.930).

Por lo tanto, el anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, de acuerdo con la invención puede emplearse en un proceso para la detección y/o la cuantificación de una sobreexpresión o de una expresión insuficiente, preferentemente una sobreexpresión, del receptor c-Met en una muestra biológica, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) el poner en contacto a la muestra biológica con un anticuerpo, o con su fragmento o derivado funcional, de acuerdo con la invención; y b) la demostración del complejo de c-Met/anticuerpo posiblemente formado.

En una realización en particular, el anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, de acuerdo con la invención, puede emplearse en un proceso para la detección y/o la cuantificación del receptor c-Met en una muestra biológica, para el monitoreo de la eficacia de un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de cáncer dependiente de c-Met.

Más generalmente, el anticuerpo o un fragmento o derivado funcional del mismo, de acuerdo con la invención puede emplearse ventajosamente en cualquier situación donde la expresión del receptor c-Met debe ser observada en forma cualitativa y/o cuantitativa.

Con preferencia, la muestra biológica es formada mediante un fluido biológico, tal como suero, sangre entera, células, una muestra de tejido o biopsias de origen humano.

Puede emplearse cualquier procedimiento o ensayo convencional a fin de llevar a cabo ese tipo de detección y/o dosificación. Dicho ensayo puede ser un ensayo de competición o sandwich, o cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica dependiente de la formación de un complejo inmune de tipo anticuerpo- antígeno. Luego de las aplicaciones de acuerdo con la invención, el anticuerpo o un fragmento o derivado funcional del mismo puede ser inmovilizado o marcado. Esta inmovilización puede llevarse a cabo en numerosos soportes conocidos por el expertos en la técnica. Estos soportes pueden incluir, especialmente, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, o células naturales o modificadas. Estos soportes pueden ser solubles o insolubles.

A modo de ejemplo, un método preferido implica procesos inmunoenzimáticos de acuerdo con la técnica ELISA, por inmunofluorescencia, o técnica de radio-inmunoensayo (RIA) o equivalente.

Por lo tanto, la presente invención comprende igualmente los kits o conjuntos necesarios para llevar a cabo un método de diagnóstico de enfermedades inducidas por una sobreexpresión o una expresión insuficiente del receptor c-Met o para llevar a cabo un proceso para la detección y/o la cuantificación de una sobreexpresión o de una expresión insuficiente del receptor c-Met en una muestra biológica, con preferencia, una sobreexpresión de dicho receptor, caracterizado porque dicho kit o conjunto comprende los siguientes elementos: a) un anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, de acuerdo con la invención; b) opcionalmente, los reactivos para la formación del medio favorables para la reacción inmunológica; c) opcionalmente, los reactivos que permiten la demostración de complejos de c-Met/anticuerpo producidos mediante la reacción inmunológica.

Un objetivo de la invención es asimismo el uso de un anticuerpo o una composición de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento destinado al direccionamiento específico de un compuesto biológicamente activo hacia células que expresan, o que sobreexpresan el receptor c-Met.

Se quiere decir en la presente por compuesto biológicamente activo cualquier compuesto capaz de modular, especialmente de inhibir, la actividad celular, en particular su crecimiento, su proliferación, transcripción o traducción genética.

Un objetivo de la invención es además un reactivo de diagnóstico in vivo que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención, o un fragmento o derivado funcional del mismo, con preferencia marcado, especialmente radioetiquetado, y su uso en la obtención de imágenes médicas, en particular para la detección del cáncer en conexión con la expresión o la sobreexpresión por una célula del receptor c-Met.

La invención se refiere igualmente a una composición como un producto combinado o a un conjugado anti-c-Met/toxina o radioelemento, de acuerdo con la invención, como un medicamento.

Preferentemente, dicha composición como un producto combinado o dicho conjugado de acuerdo con la invención se mezclará con un excipiente y/o un vehículo aceptable para uso farmacéutico.

En la presente descripción, vehículo aceptable para uso farmacéutico tiene el propósito de indicar un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica sin provocar reacciones secundarias y el cual permite, por ejemplo, la facilitación de la administración del o de los compuestos activos, un aumento en su vida útil y/o en su eficacia en el cuerpo, un aumento de su solubilidad en solución o sino una mejora en su conservación. Estos vehículos aceptables para uso farmacéutico son bien conocidos y serán adaptados por el experto en la técnica en función de la naturaleza y del modo de administración del compuesto o de los compuestos activos seleccionados.

Con preferencia, estos compuestos serán administrados por la ruta sistémica, en particular mediante la ruta intravenosa, por la ruta intramuscular, ¡ntradérmica, intraperitoneal o subcutánea, o por la ruta oral. En una forma más preferida, la composición que comprende los anticuerpos de acuerdo con la invención será administrada varias veces, en forma consecutiva.

Sus modos de administración, dosificaciones y formas farmacéuticas óptimas pueden determinarse de acuerdo con los criterios generalmente tomados en cuenta en el establecimiento de un tratamiento adaptado a un paciente tal como, por ejemplo, la edad o el peso corporal del paciente, la seriedad de su condición general, la tolerancia al: tratamiento y los efectos secundarios observados.

Otras características y ventajas de la invención aparecen a continuación de la descripción con los ejemplos y las figuras donde: Breve descripción de las figuras Figura 1 : Efecto de Mabs de lgG1 irrelevantes de origen murino y humano y PBS sobre la fosforilación del receptor c-Met sobre células A549.

Figuras 2A y 2B: Efecto de Mabs 224G11 murinos y humanizados producidos como un isotipo humano de lgG1/kappa sobre la fosforilación del receptor c-Met sobre las células A549.

Figura 2A: efecto agonista calculado como porcentaje versus estimulación máxima de la fosforilación de c-Met por HGF [100 ng/ml].

Figura 2B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibición de la estimulación máxima de fosforilación de c-Met por HGF [100 ng/ml].

Figuras 3A y 3B: Comparación entre Mab 224G1 murino y Mabs 224G1 1 quiméricos que contienen diversas regiones bisagra modificadas por ingeniería genética, sobre la fosforilación del receptor c-Met sobre las células A549.

Figura 3A: efecto agonista calculado como porcentaje contra la estimulación máxima de la fosforilación de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figura 3B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibición de la estimulación máxima de la fosforilación de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figuras 4A y 4B: Comparación entre Mab 224G1 1 murino y Mabs 224G1 1 quiméricos y humanizados producidos como un isotipo de lgG2/kappa humano, sobre la fosforilación del receptor c-Met en células A549.

Figura 4A: efecto agonista calculado como porcentaje contra la estimulación máxima de la fosforilación de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figura 4B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibición de la estimulación máxima de fosforilación de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figuras 5A y 5B: Comparación entre Mab 224G1 1 murino y Mabs 224G1 1 quiméricos y humanizados producidos como un muíante bisagra 5 modificado por ingeniería genéíica TH7lgG1/kappa, sobre la fosforilación del recepíor c-Met en células A549.

Figura 5A: efecto agonista calculado como porcentaje contra la estimulación máxima de la fosforilación de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figura 5B: efecto anfagonista calculado como porcentaje de inhibición de í o la estimulación máxima de fosforilación de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figuras 6A y 6B, Figuras 7A y 7B, Figuras 8A y 8B, Figuras 9A y 9B, Figuras 10A y 10B: modelos de BRET con Figuras A: modelo de dimerización de c-Met; y Figuras B: modelo de activación de c-Met.

Figura 1 1 : reconocimiento de c-Met mediante formas de 224G1 1 15 quiméricas y humanizadas.

Figura 12: Efecto de anticuerpos murinos y quiméricos sobre la proliferación inducida por HGF de células NCI-H441 in vitro. Las células NCI- H441 fueron plaqueadas en medio libre de suero. 24 horas después de 20 colocación en placas, se agregaron m224G11 y [224G ]quim ya sea en ausencia o en presencia de HGF. Las flechas negras indican los pocilios plaqueados con células solas ya sea en ausencia 1¿ o en presencia ^ de HGF. Una lgG1 murina (mlgG1) se introdujo como un control de isotipo.

Figura 13: Comparación in vivo de Mabs de 224G 1 quiméricos de lgG1 25 y murinos en el modelo de xenoinjerto de NCI-H44 . · Figuras 14A y 14B: Efecto el Mab 224G1 1 murino y de diversas versiones quiméricas y humanizadas de este anticuerpo sobre la proliferación inducida por HGF de células NCI-H441 in vitro. Las células NCI-H441 se colocaron en placas en medio libre de suero. 24 Horas después de colocación en placa, los anticuerpos que se van a analizar se agregaron ya sea en ausencia o en presencia de HGF. En el panel (Figura 14A), Las versiones m224G1 1 murino, lgG1 quimérica [224G1 1]quim, lgG1 humanizada [224G1 1] [Hz1 ], [224G1 1 ] [Hz2], [224G1 1 ] [Hz3] se mostraron. En el panel (Figura 14B), se presentaron las formas de m224G1 1 murino y ; diversas formas de lgG1 quiméricas ([224G1 1] quim, [224G1 1 ] [MH quim], [224G1 1] [MUP9H quim], [224G1 1 ] [MMCH quim], [224G1 1] [TH7 quim]). Las flechas negras indican los pocilios plaqueados con células solas ya sea en ausencia 1¿ o en presencia ^ de HGF. Se introdujo una lgG1 murina como un control negativo para la actividad agonista. El m5D5 se utilizó como un control agonista completo dosis-dependiente.

Figura 15: Efecto del Mab 224G1 1 murino. y de diversas versiones quiméricas y humanizadas de este anticuerpo sobre la proliferación inducida por HGF de células NCI-H441 in vitro. Las células NC1-H441 se plaquearon en medio libre de suero. 24 Horas después de la colocación en placas, los anticuerpos que se van a analizar se agregaron ya sea en ausencia o en presencia de HGF. Se presentaron las formas m224G1 1 murina, [224G1 1] quim, [224G1 1 ] [TH7 quim]) lgG1 quiméricas y [224G1 1 ] [TH7 Hz1 ], [224G1 1] [TH7 Hz3]): Las flechas negras indican los pocilios con células solas ya sea en ausencia i¿ o en presencia de HGF. Se introdujo una lgG1 murina como un control negativo para la actividad agonista. Se utilizó el m5D5 como un control agonista completo dependiente de la dosis.

Figura 16: Comparación in vivo de Mabs 224G1 1 murinos, quiméricos y humanizados en el modelo de xenoinjerto NCI-H441.

Figura 17A: efecto agonista calculado como porcentaje contra la estimulación máxima de la fosforilación de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figura 17B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibición de la estimulación máxima de fosforilación de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figura 8: Modelos de BRET con modelo de activación de c-Met.

Figura 19: Efecto de m224G1 1 y h224G11 sobre la degradación de c-Met en células A549. A) Media de 4 experimentos independientes +/- s.e.m. B) Imagen de western blot representativa de los 4 experimentos independientes realizados.

Figura 20: Efecto de m224G y h224G11 sobre la degradación de c-Met en células NCI-H441. A) Media de 4 experimentos independientes +/- s.e.m. B) Imagen de Western blot representativa de los 4 experimentos independientes realizados.

Figura 21 : Configuración de un ELISA para evaluar la eliminación de c- Met.

Figura 22: Evaluación in vitro de eliminación de c-Met en células NCI- H441 tratadas durante 5 días con m224G1 1. mlgG1 es un anticuerpo irrelevante utilizado como un control de isotipo.

Figura 23: Evaluación in vitro de eliminación de c-Met en líneas celulares Hs746T, MKN45 y EBC- amplificadas tratadas durante 5 días con m224G 1. mlgG1 es un anticuerpo irrelevante utilizado como un control de isotipo. PMA es un inductor de eliminación utilizado como un control positivo.

Figura 24: Evaluación in vitro de eliminación de c-Met en NCI-H441 y líneas celulares Hs746T, KN45 y EBC-1 amplificadas tratadas durante 5 días con m224G1 1. mlgG1 es un anticuerpo irrelevante utilizado como un control de isotipo. PMA es un inductor de la eliminación utilizado como un control positivo.

Figura 25: Estudio de fosforilación intrínseca de h224G11 en línea celular Hs746T.

Figura 26: Estudio de fosforilación intrínseca de h224G11 en línea celular NCI-H441. A) fosfo-ELISA y B) análisis Western.

Figura 27: Estudio de fosforilación intrínseca de h224G11 en línea celular Hs578T. A) fosfo-ELISA y B) análisis Western.

Figura 28: Estudio de fosforilación intrínseca de h224G1 1 en línea celular NCI-H125. A) fosfo-ELISA y B) análisis Western.

Figura 29: Estudio de fosforilación intrínseca de h224G1 1 en línea celular T98G. A) fosfo-ELISA y B) análisis Western.

Figura 30: Estudio de fosforilación intrínseca de h224G1 1 en línea celular MDA-MB-231. A) fosfo-ELISA y B) análisis Western.

Figura 31 : Estudio de fosforilación intrínseca de h224G1 en línea celular PC3. A) fosfo-ELISA y B) análisis Western.

Figura 32: Estudio de fosforilación intrínseca de h224G11 en células HUVEC. : Figura 33: Comparación ¡n vivo del anticuerpo 224G11 murino de tipo salvaje con Mabs del 224G1 1 quimérico con modificación en la región bisagra [C2D5-7] en el modelo de xenoinjerto NCI-H441.

Figura 34: Inducción ADCC por h224G1 1 en células Hs746T y NCI-H441 . Se mezclaron células Hs746T marcadas con 51Cr (A) o NCI-H441 (B) cargadas (cuadrados llenos) o no (cuadrados vacíos) con h224G1 1 con relación diferente de células NK humanas y se incubaron durante 4 horas. Se cosecharon las células y se realizó el recuento de cpm de 51 Cr liberado por lisis. Los resultados se representaron como la lisis porcentual frente a la relación de efector/células objetivo. NL corresponde a las células sin carga.

Figura 35: Tinción con h224G1 1 en xenoinjerto tumoral que expresó diversos niveles de c-Met (A : línea celular amplificada Hs746T para c-Met, B : alto nivel de expresión c-Met en NCI-H441 y C : bajo nivel de c-Met en MCF-7).

Descripción detallada de la invención Ejemplos Ejemplo 1 : Generación de anticuerpos contra c-Met Para generar anticuerpos anti-c-Met se inmunizaron ratones BALB/c de 8 semanas de edad ya sea 3 a 5 veces subcutáneamente con una línea celular transfectada CHO que expresa c-Met en su membrana plasmática (20x106 células/dosis/ratón) o 2 a 3 veces con una proteína de fusión de dominio extracelular de c-Met (10-15 pg/dosis/ratón) (R&D Systems, Catálogo # 358MT) o fragmentos de esta proteína recombinante mezclada con adyuvante completo de Freund para la primera inmunización y adyuvante incompleto de Freund para las siguientes. Los protocolos mixtos en los cuales los ratones recibieron tanto células CHO-cMet como proteínas recombinantes también se llevaron a cabo. Tres días antes de la fusión celular, los ratones fueron estimulados i.p. o i.v. con la proteína recombinante o fragmentos. Luego, los bazos de ratones se recolectaron y fusionaron a células de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC) y se sometieron a selección de HAT. Se llevaron a cabo cuatro fusiones. En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, es posible hacer referencia a técnicas las cuales son descritas en particular en el manual "Anticuerpos" (Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) o a la técnica de preparación de hibridomas descrita por Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

Los hibridomas obtenidos fueron ¡nicialmente. cribados por ELISA sobre la proteína recombinante de c-Met y luego mediante análisis FACS en líneas celulares A549 NSCLC, BxPC3 pancreática, y U87-MG glioblastoma para asegurarse de que los anticuerpos producidos serán capaces de reconocer también al receptor nativo en células tumorales. Los reactores positivos en estos 2 ensayos fueron amplificados, clonados y un conjunto de hibridomas fue recuperado, purificado y cribado para determinar su capacidad de inhibir la proliferación celular ¡n vitro en el modelo BxPC3.

Para ese propósito 50.000 células BxPC3 se colocaron en placas de 96 pocilios en medio RPMI, 2 m L. Glutamina, sin SVF. 24 Horas después de colocación en placas, los anticuerpos que se van a analizar se agregaron a una concentración final que oscilaba entre 0,0097 y 40 g/ml 60 min antes de la adición de 100 ng/ml de hHGF. Después de 3 días, las células fueron pulsadas con 0,5 pCi de [3H]timidina durante 16 horas. La magnitud de [3H]timidina incorporada en ADN insoluble en ácido tricloroacético se cuantificó mediante recuento por centelleo líquido. Los resultados fueron expresados como datos sin elaborar para realmente evaluar el efecto agonista intrínseco de cada Mab.

Luego, los anticuerpos que inhiben por lo menos 50% de proliferación celular se evaluaron para determinar su actividad en la dimerización de c-Met y análisis de BRET de activación en células transfectadas. La actividad del receptor c-Met se cuantificó midiendo el reclutamiento de moléculas de señalización de Gab1 en c-Met activado. Para ese propósito, se generaron líneas celulares estables CHO que expresan C-Met-Rluc o C-Met-Rluc y C-Met-K1100A-YFP para la dimerización de c-Met o C-Met-Rluc y una forma mutada de Gab1 [Maroun et al., Mol. Cell. Biol., 1999, 19:1784-1799] fusionada a YFP para la activación de c-Met. Las células fueron distribuidas en microplacas de 96 pocilios blancas en DMEM-F12/FBS 5% de medio de cultivo uno o dos días antes de los experimentos de BRET. Las células fueron cultivadas, en primer lugar, a 37°C con C02 5% a fin de permitir la unión celular a la placa. Luego, las células se matan de hambre con 200 pl de DMEM/pocillo durante la noche. Inmediatamente antes del experimento, DMEM se eliminó y las células se lavaron rápidamente con PBS. Las células se incubaron en PBS en presencia o ausencia de anticuerpos a ser analizados o compuestos de referencia, 10 min a 37°C con anterioridad a la adición de coelenterazina con o sin HGF en un volumen final de 50 µ?. Después de la incubación durante otros 10 minutos a 37°C, se inició la adquisición de emisión de luz a 485 nm y 530 nm utilizando el luminómetro Mithras (Berthold) (1s/longitud de onda /pocilio repetido 15 veces).

La relación de BRET ha sido definida previamente [Angers et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 2000, 97:3684-3689] como: [(emisión a 530 nm) - (emisión a 485 nm) X Cf] / (emisión a 485 nm), donde Cf corresponde a (emisión a 530 nm) / (emisión a 485 nm) para células que expresan proteína de fusión Rluc solamente en las mismas condiciones experimentales. La simplificación de esta ecuación muestra que la relación de BRET corresponde a la relación 530/485 nm obtenida cuando los dos socios estaban presentes, corregido por la relación 530/485 nm obtenida bajo las mismas condiciones experimentales, cuando solamente el socio fusionado a R. reniformis luciferasa estaba presente en el ensayo. Por cuestiones de legibilidad, los resultados son expresados en unidades miliBRET (mBU); mBU corresponde a la relación de BRET multiplicada por 1000.

Después de este segundo ensayo in vitro, se seleccionó el anticuerpo 224G1 1 i) sin actividad intrínseca como una molécula entera en el ensayo funcional de proliferación, ¡i) inhibiendo significativamente la proliferación de BxPC3 y iii) inhibiendo la dimerización de c-Met. En los experimentos, el Mab 5D5, generado por Genentech, y disponible en la ATCC, se agregó como un control para la actividad agonista intrínseca.

Ejemplo 2: Proceso de humanización de Mab 224G11 de ratón por injerto de CDR 1 o) Humanización del dominio variable (VL) de cadena ligera Como un paso preliminar, la secuencia nucleotídica de 224G11 VL se comparó con las secuencias genéticas de línea germinal murinas incluidas en la base de datos de IMGT (http://imgt.cines.fr). Los genes de línea germinal murinos IGKV3-5*01 y IGKJ4*01 que muestran una identidad de secuencia de 99,31 % para la región V y 94,28% para la región J, respectivamente, han sido identificados. Considerando estas homologías elevadas, la secuencia nucleotídica 224G1 1VL ha sido utilizada directamente para buscar homologías humanas, en lugar de líneas germinales de ratón correspondientes.

En un segundo paso, el gen de linea germinal humano que exhibe la mejor identidad con el 224G11VL ha sido buscado para identificar el mejor candidato humano para el injerto de CDR (CDR grafting). Para la optimización de la selección, se han llevado a cabo alineaciones entre las secuencias de aminoácidos. El gen de línea germinal humano IGKV4-1 *01 produjo una identidad de secuencia de 67,30%, pero mostró una longitud diferente para CDR1 (10 aminoácidos en 224G1 1 VL y 12 aminoácidos en IGKV4-1 *01 ). Para la región J, se seleccionó el gen de línea germinal humano IGKJ4*02 (identidad de secuencia de 77,14%).

En un paso siguiente, las regiones de CDR de 224G1 1 VL de ratón se injertaron en las secuencias estructurales humanas seleccionadas anteriormente. Se analizó cada posición de aminoácido para diversos criterios tales como participación en la inferíase VH/VL, en la unión al antígeno o en la estructura de CDR, localización del residuo en la estructura 3D del dominio variable, anclajes de CDR, residuos pertenecientes a la zona Vernier. Se construyeron tres versiones humanizadas, correspondientes a SEC ID No. 8, SEC ID No. 9 y SEC ID No. 10, y que contenían respectivamente cuatro (4, 39, 40, 84), dos (39, 40) o un (40) residuos murinos en sus regiones FR y las CDRs correspondientes a 224G11 VL de ratón. 2o) Humanización del dominio variable de cadena pesada (V ) Corno un paso preliminar, la secuencia nucleotídica del 224G1 1 VH se comparó con las secuencias de genes de línea germinal murinas incluidas en la base de datos de IMGT (http://imgt.cines.fr).

Los genes murinos de líneas germinales IGHV1-18*01 , IGHD2-4*01 y IGHJ2*01 con una identidad de secuencia de 92,70% para la región V, 75,00% para la región D y 89,36% para la región J, respectivamente, han sido identificados. Conforme a estas homologías elevadas, se ha decidido utilizar directamente las secuencias nucleotidicas 224G1 1VH para buscar homologías humanas, en lugar de líneas germinales de ratón correspondientes.

En un segundo paso, el gen de línea germinal humano que exhibe la 5 mejor identidad con el 224G1 1 VH ha sido investigado para identificar el mejor candidato humano para el injerto de CDR. Con este propósito, la secuencia nucleotídicá de 224G1 1 VH ha sido alineada con las secuencias de genes de líneas germinales humanas pertenecientes a la base de datos de IMGT. La secuencia humana IGHV1-2*02 V exhibió una identidad de secuencia de í o 75.00% en el nivel nucleotídico y 64,30% en el nivel de aminoácidos. Buscando homologías para la región H se ha arribado a la identificación del gen de línea germinal IGHJ4*04 humano con una identidad de secuencia de 78,72%.

En un siguiente paso, se injertaron regiones de CDR de 224G11 VH de ratón en las secuencias estructurales humanas antes seleccionadas. Se analizó 15 cada posición de aminoácido para diversos criterios tales como la participación en la ¡nterfase VH/VL, en la unión al antígeno o :en la estructura de CDR, localización del residuo en la estructura 3D del dominio variable, anclajes de CDR, residuos pertenecientes a la zona Vernier. Se construyó una forma 20 completamente humanizada, correspondiente a SEC ID 4; contiene residuos exclusivamente humanos en su regiones FR y las CDRs correspondientes a 224G1 1 VH de ratón.

Ejemplo 3: Construcción de mutantes bisagra mejorados 25 Es bien sabido por el experto en la técnica que la región bisagra participa fuertemente en la flexibilidad del dominio variable de inmunoglobulinas (véase Brekke et al., 1995; Roux et al., 1997). Durante el proceso de quimerización de Mab 224G1 , el dominio constante murino IGHG1 fue reemplazado por la porción IGHG1 equivalente de origen humano. Puesto que las secuencias de aminoácidos de la región bisagra eran altamente divergentes, la "murinización" de la región bisagra se llevó a cabo a fin de mantener su longitud y rigidez. Puesto que la región bisagra IGHG2 humana corresponde al homólogo más cercano de la bisagra IGHG1 murina, esta secuencia también fue considerada. Una serie de 7 secuencias bisagra diferentes fueron construidas (SEC ID Nos. 22 a 28) mediante la incorporación de porciones de las bisagras IGHG1 de ratón y la bisagra IGHG2 humana en la porción bisagra IGHG1 humana.

Otra serie de mutantes bisagra fue diseñada y construida (SEC ID Nos. 58 a 72) para evaluar la influencia de una cisteína adicional y su posición a lo largo del dominio bisagra, la deleción de 1 , 2, 3 o 4 aminoácidos a lo largo del dominio bisagra y una combinación de estos dos parámetros (adición de cisteína y deleción de aminoácidos).

Ejemplo 4: Producción de Mab 224G11 humanizado y formatos de Mab bisagra construidos genéticamente Todas las formas de Mab antes descritas que contenían regiones bisagra quiméricas, humanizadas y/o construidas genéticamente fueron producidas luego de l transfección transitoria y utilizando el sistema HEK293/EBNA con un vector de expresión pCEP4 (InVitrogen, US).

Las secuencias nucleotídicas enteras correspondientes a las versiones humanizadas del dominio variable de las cadenas ligera (SEC ID No. 18, SEC ID No. 19 y SEC ID No. 20) y pesada (SEC ID No. 14) de Mab 224G11 se sintetizaron mediante síntesis genética global (Genecust, Luxemburgo). Se subclonaron en un vector pCEP4 (InVitrogen, US) portando la secuencia codificante entera del dominio constante [CH1-B¡sagra-CH2-CH3] de una inmunoglobulina lgG1 o lgG2 humana. La modificación de la región bisagra se llevó a cabo intercambiando un fragmento de restricción {Nhe11-Bcl1} por la porción equivalente que porta las modificaciones deseadas, siendo sintetizado cada fragmento {Nhe1-Bcl1} respectivo mediante síntesis genética global (Genecust LU). Todos los pasos de clonación se llevaron a cabo de acuerdo con técnicas de biología molecular convencionales según lo descrito en el manual dé Laboratorio (Sambrook y Russel, 2001) o de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Cada constructo genético fue completamente validado por secuenciamiento de nucleótidos utilizando el kit de secuenciamiento de ciclo terminador Big Dye terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, US) y analizado utilizando un Analizador Genético 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, US).

Las células HEK293 EBNA adaptadas en suspensión (InVitrogen, US) se cultivaron rutinariamente en frascos de 250 mi en 50 mi de medio libre de suero Excell 293 (SAFC Biosciences) suplementado con glutamina 6 mM en un agitador orbital (velocidad de rotación 110 rpm). La transfección transitoria se llevó a cabo con 2.106 células/ml utilizando polietilenimina de 25 kDa lineal (PEI) (Polysciences) preparada en agua a una concentración final de 1 mg/ml de ADN mixto y plásmido (concentración final de 1 ,25 pg/ml para relación de plásmido de cadena pesada a ligera de 1 :1). A las 4 horas post-transfección, el cultivo se diluyó con un volumen de medio de cultivo fresco para lograr una densidad celular final de 06 células/ml. El proceso de cultivo se monitoreó sobre la base de la viabilidad celular y producción de Mab. Típicamente, los cultivos se mantuvieron durante 4 a 5 días. Los Mabs se purificaron utilizando un método de cromatografía convencional en una resina de Proteína A (GE Healthcare, US). 5 Todas las formas diferentes de Mabs fueron producidas en niveles adecuados con evaluaciones funcionales. Los niveles de productividad fueron producidos a niveles adecuados con evaluaciones funcionales. Los niveles de productividad oscilan típicamente entre 15 y 30 mg/l de Mabs purificados. í o Ejemplo 5: Evaluación de estado de fosforilación de c-Met mediante ensayo ELISA específico para Fosfo-c-Met Este ensayo funcional permite controlar la modulación del estado de fosforilación de c-Met ya sea por Mabs solos o en la presencia conjunta de HGF. 15 Se sembraron células A549 en una placa de 12MW en medio de crecimiento completo [F12K + 10 % FCS]. Las células se sometieron a inanición durante 16 horas antes de la estimulación con HGF [100 ng/ml], y cada Mab que se va a analizar se agregó en su concentración final de 30 pg/ml 15 20 minutos antes de la estimulación del ligando. Se agregó buffer de lísis enfriado con hielo 15 minutos después de la adición de HGF para detener la reacción de fosforilación. Las células se rasparon mecánicamente y los lisados celulares se recolectaron por centrifugación a 13000 rpm durante 10 min. a 4°C y corresponden a la fase de sobrenadante. El contenido proteico se cuantificó 25 utilizando un kit BCA (Pierce) y se almacenó a -20°C hasta su utilización. El estado de fosforilación de c-Met se cuantificó por ELISA. Se utilizó un Mab anti-c-Met de cabra (R&D, ref AF276) como un anticuerpo de captura (recubrimiento durante toda la noche a 4°C) y después un paso de saturación con un buffer de 5% de TBS-BSA (1 hora a temperatura ambiente (TA)), se agregaron 25 pg de lisados proteicos a cada pocilio de la placa de 96 MW recubierta. Después de una incubación de 90 minutos a TA, las placas se lavaron cuatro veces y se agregó el anticuerpo de detección (Mab anti-fosfo-c-Met, dirigido contra los residuos Tyr fosforilados en posición 1230, 1234 y 1235). Después de una incubación adicional de 1 hora y 4 lavados, se agregó un anticuerpo anti-conejo acoplado a HRP (Biosource) durante 1 hora a TA, y se llevó a cabo la detección por luminiscencia agregando Luminol. Las lecturas de luminiscencia eran en un lector de placas multimodo Mithras LB920 (Berthold).

Tanto el nivel basal como el nivel de fosforilación del receptor c-Met inducido por HGF [100 ng/ml] no se vieron afectados ni por el tratamiento con PBS, ni por la adición de Mabs murinos o humanos los cuales no se dirigen contra el receptor c-Met humano (Figura 1 ). Por otro lado, el Mab murino (m) 224G1 1 inhibió fuertemente la fosforilación de c-Met inducida por HGF [100 ng/ml] (Figura 2B) sin alterar por si mismo la fosforilación del receptor (Figura 2A). Sorprendentemente, la forma quimérica de Mab 224G1 1 (224G11 quim/lgG1 ), lo que significa dominio variable (VH+VL) de m224G1 1 combinado con dominio constante humano lgG1/kappa proporcionó actividad agonista fuerte (17% del efecto máximo de HGF, Figura 2A) asociada con una eficacia antagonista reducida (54% de inhibición del efecto máximo de HGF comparado con el m224G11 que produce 75% de inhibición del efecto máximo de HGF, Figura 2B). Tres formas humanizadas de Mab 224G1 1 , [224G1 1]Hz1/lgG1 , [224G1 1]Hz2/lgG1 y [224G1 1]Hz3/lgG1 , también construidas en una estructura humana lgG1/kappa, produjeron también una disminución de la eficacia antagonista y actividad agonista significativa (1 1 a 24% del nivel de HGF máximo) en comparación con 224G11 murino (Figuras 2A y 2B). Se construyó una serie de versiones modificadas genéticamente del dominio bisagra de cadena pesada y se analizaron en el ensayo de fosforilación del receptor c-Met. Como se muestra en la Figura 3A, se observó una importante reducción del efecto agonista asociada con el isotipo de hlgG1/kappa tanto para el constructo basado en lgG2 como para los constructos de lgG1/kappa modificados genéticamente [MH, MUP9H y TH7]. También se obtuvo un aumento concomitante de la eficacia antagonista. El mutante bisagra TH7 basado en hlgG1/kappa, con la secuencia más humana, se seleccionó para completar el proceso de humanización. En un paso siguiente, se generaron tres versiones humanizadas de dominio variable de Mab 224G1 1 mediante combinación con ya sea un lgG2/kappa humano o un dominio constante bisagra construido genéticamente de TH7 basado en lgG1/kappa. Para los constructos humanizados de hlgG2/kappa, la versión humanizada Hz3 produjo un fuerte agonismo (Figura 4A), y para las tres versiones humanizadas, la eficacia antagonista estaba por debajo de aquella observada con Mab 224G11 murino y comparable con Mab basado en hlgG1 quimérico (56-57% de inhibición de efecto de HGF, Figura 4B). Por otro lado, la combinación de las tres versiones humanizadas Hz1 , Hz2 o Hz3 con el mutante lgG1/TH7 construido por ingeniería genética casi restauró por completo las propiedades del Mab murino 224G1 1 en términos de actividad agonista débil (5- 6% de efecto de HGF) y actividad antagonista fuerte (68 a 72% de inhibición del efecto de HGF) de la fosforilación del receptor c-Mét (Figuras 5A y 5B). Estas variantes fueron altamente mejoradas en comparación con Mab 224G11 basado en lgG1 quimérico pero también con las formas humanizadas basadas en lgG2.

Una segunda serie de versiones construidas por ingeniería genética del dominio bisagra de cadena pesada se construyó y analizó en el ensayo de fosforilación de receptor c-Met. Como se muestra en la Figura 17A, todas esas versiones nuevas (c224G11 [C2], c224G1 1 [C3], c224G1 1 [C5], c224G1 1 [C6], c224G1 1 [C7], c224G11 [A1-3], c224G1 1 [C7A6], c224G1 1 [C6A9], c224G1 1 [C2A5-7], c224G11 [C5A2-6], C224G1 1 [C9A2-7] y C224G1 1 [?5-6-7-8]) exhibieron efecto agonista más débil que c224G1 1 puesto que sus actividades agonistas están comprendidas entre el 6 y el .14% del efecto de HGF comparado con 23% para c224G1 1. Como c224G1 1 [TH7], todas esas nuevas versiones exhibieron un aumento concomitante en la eficacia antagonista [Figura 17B]. Dichos resultados mostraron que la construcción por ingeniería genética del dominio de cadena pesada por mutación puntual y/o deleción podría modificar las propiedades agonistas/ antagonistas de un anticuerpo.

Ejemplo 6: análisis de BRET En un primer grupo de experimentos, se había controlado que lgG1 murino, lgG1 humano e lgG2 humano irrelevantes no tuvieron efecto alguno de señal de BRET inducida por HGF en ambos modelos de BRET (experimento representativo de 12 experimentos independientes; Figura 6). Estos Mabs son mencionados como controles.

Se evaluó el efecto de una forma quimérica de lgG1 de Mab 224G1 de ratón ([224G11]quim) tanto en el modelo BRET de dimerización de c-Met como de activación de c-Met. Si bien el Mab 224G11 de ratón inhibió 59,4% de la señal de BRET inducida por HGF en el modelo de dimerización de c-Met, el Mab [224G1 1]quim inhibió solamente 28,9% (Figura 7A). El anticuerpo [224G11]quim también era menos eficaz en la inhibición de la activación de c-Met inducida por HGF puesto que los anticuerpos [224G11]quim y m224G11 inhibieron respectivamente 34,5% y 56,4% de la señal de BRET inducida por HGF (Figura 7B). Por añadidura, m224G11 solo no tuvo efecto alguno sobre la activación de c-Met mientras que [224G11]quim tuvo un efecto agonista parcial sobre la activación de c-Met correspondiente a 32,9% de la señal inducida por HGF. Este efecto agonista parcial del [224G11]quim también fue observado en el modelo BRET de dimerización de c-Met puesto que [224G1 1]quim solo indujo un aumento de BRET correspondiente a 46,6% de la señal inducida por HGF contra 21 ,3% para m224G11 (Figura 7A).

En las Figuras 8A y 8B, las formas quiméricas mutadas bisagra de anticuerpo' 224G11 mostraron un efecto inhibidor mayor sobre la señal de BRET inducida por HGF que [224G11]quim puesto que mostraron una inhibición del 59,7%, 64,4%, 53,2% y 73,8% de la señal de BRET de activación inducida por HGF (Figura 8B) y 61 ,8%, 64,4% 52,5% y 64,4% de inhibición de la señal de BRET de dimerización de c-Met inducida por HGF (Figura 8A) para [224G11][MH quim], [224G11][MUP9H quim], [224G1 1][MMCH quim] y [224G11][TH7 quim] respectivamente. En contrario a [224G 1]quim, el cual tuvo un efecto agonista parcial sobre la activación de c-Met, las formas quiméricas mutadas bisagra del anticuerpo 224G11 no mostraron un efecto significativo sobre la activación de c-Met solamente (5,1 %, 7,6%, -2,0% y -6,9% respectivamente) según lo observado para m224G11.

En la Figura 9B, al igual que el [224G11] [TH7 quim], las 3 versiones humanizadas de anticuerpo de lgG1 224G11 con la bisagra TH7 no indujeron un aumento significativo de la señal de BRET en el modelo de activación cuando se analizó solo y mostró una fuerte inhibición de la señal de BRET inducida por HGF: 59,9%, 41 ,8% y 57,9% para las formas Hz1 , Hz2 y Hz3 respectivamente. Asimismo, [224G11] [TH7 Hz1], [224G1 1] [TH7 Hz2] y [224G11] [TH7 Hz3] inhibieron la señal de BRET inducida por HGF en el modelo de dimerización de 52,2%, 35,8% y 49,4% respectivamente (Figura 9A).

En contrario a [224G1 1]quim, la forma quimérica del anticuerpo de lgG2 224G1 1 ([224G1 1 ] [lgG2 quim]) no mostró efecto agonista parcial alguno solo e inhibió 66,3% del efecto de HGF sobre el modelo de activación de c-Met (Figura 10B). En el modelo de dimerización de c-Met, [224G1 1] [lgG2 quim] inhibió 62,4% de la señal de BRET inducida por HGF (Figura 10A).

La eficacia agonista de la segunda serie de versiones construidas por ingeniería genética del dominio bisagra de cadena pesada se evaluó en el modelo BRET de activación del c-Met (Figura 18). En contraste con C224G 1 , el cual tenía un efecto agonista parcial sobre la activación del c-Met, las formas quiméricas mutadas bisagra c224G11 [C2], c224G11 [C3], c224G1 1[C5], c224G1 1 [C6], c224G1 1 [C7], c224G1 1 [?1-3], c224G1 1 [C7A6], c224G1 1 [C6A9], c224G1 1 [G2A5-7], c224G11 [C5A2-6], c224G1 1 [C9A2-7] y C224G1 1 [?5-6-7-8] del anticuerpo 224G1 1 no mostraron efecto significativo alguno sobre la activación del c-Met sola.

Ejemplo 7: Reconocimiento del c-Met por formas de 224G11 quiméricas y humanizadas Se ha llevado a cabo un ELISA directo para determinar la habilidad de unión de las diversas formas quiméricas y humanizadas en el c-Met recombinante. Brevemente, c-Met dimérico recombinante de R&D Systems fue recubierto a 1 ,25 pg/ml en placas de 96 pocilios Immunlon II. Después de una incubación durante toda la noche a 4°C, los pocilios fueron saturados con una solución dé 0,5% de gelatina/PBS. A continuación; las placas se incubaron durante 1 hora a 37°C antes de la adición de diluciones de 2 veces de anticuerpos que se van a analizar. Las placas se incubaron durante 1 hora más antes de la adición de un HRP de IgG de cabra anti-ratón para detectar el anticuerpo :murino y una HRP de cadena ligera Kappa anti-humana de cabra para el reconocimiento de anticuerpos quiméricos y humanizados. Las placas se incubaron durante una hora y se agregó el sustrato de peroxidasa TMB Uptima durante 5 min antes de la neutralización con H2SO4 M. Los resultados presentados en la Figura 1 1 demostraron que todas las formas analizadas eran comparables para el reconocimiento del c-Met.

Ejemplo 8: Efecto de 224G11 murino y quimérico sobre la proliferación inducida por HGF de células NCI-H441 in vitro Se cultivaron de manera rutinaria células NCI-H441 de ATCC en medio RPMI 1640 (Invitrogen Corporation, Escocia, Reino Unido), 10% FCS (Invitrogen ; Corporation), 1% L-Glutamina (Invitrogen corporation). Para los ensayos de proliferación, las células se separaron 3 días antes del uso de modo que estuviesen en la fase confluente de crecimiento antes del plaqueo. Las células NCI-H441 se colocaron en placas de cultivo tisular de 96 pocilios a una densidad de 3,75x104 células/pocilio en 200 µ? de medio libre de suero (medio RPMI 1640 más 1 % de L-Glutamina). Veinticuatro horas después de la colocación en placas, se agregaron los anticuerpos que se van a analizar a NCI-H441 y se incubaron a 37°C durante treinta minutos antes del agregado de HGF a una concentración final de 400 ng/ml (5 nM) durante 142 horas adicionales. El rango de dosis ensayado para cada anticuerpo es de 10 a 0,0097 pg/ml (concentración final en cada pocilio). En este experimento, se agregó un- Mab de lgG1 murino como un control de isotipo murino y los anticuerpos ensayados eran los siguientes: m224G11 y su forma quimérica de lgG1 humana identificada como [224G11]quim. Los pocilios plaqueados con células solas -/+ HGF también fueron incluidos. Luego, las células se pulsaron con 0,25 pCi de [3H]Timidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) durante 7 horas y 30 minutos. La magnitud de [3H]T¡midina incorporada en ADN insoluble en ácido tricloroacético se cuantificó por recuento por centelleo líquido. Los resultados son expresados como datos de cpm no transformados para evaluar mejor la actividad agonista intrínseca potencial que podría ocurrir con Mabs anti-c-Met cuando se agregan solos a célula tumoral.

Los resultados descritos en la Figura 12 demostraron que, según lo esperado, el anticuerpo murino m224G11 no exhibió efecto agonista alguno cuando se agregó solo a células cancerígenas cualquiera sea la dosis ensayada. No se observó inhibición significativa alguna de la proliferación inducida por HGF con el control de isotipo con respecto a las variaciones de cpm observadas para este compuesto en este experimento. Cuando se agrega solo, el anticuerpo m224G11 no mostró efecto agonista alguno en comparación con el Mab control de isotipo de mlgG1 o las células solas. Se observó una actividad antiproliferativa dependiente de la dosis que alcanzó 78% para m224G1 1 (% de cálculo de inhibición: 100-[(cpm de células+Mab a ser ensayadas- cpm media de mlgG1 "background") x 100 / (cpm media de células + HGF- cpm media células solas)]). Sorprendentemente, la forma quimérica de los Mabs 224G1 1 indujo un efecto agonista dependiente de la dosis, significativo, cuando se agregó sola. Este efecto agonista tuvo un impacto sobre la inhibición in vitro de la proliferación inducida por HGF que cambió de 78% para el 224G11 murino hasta 50% para su forma quimérica. Para determinar su dicha actividad agonista intrínseca in vitro "inferior" era compatible con un efecto in vivo sin cambiar, se produjeron tanto m224G11 como [224G11]quim para el ensayo in vivo. Como, en estudios previos, la dosis de 30 g/ratón había demostrado una actividad in vivo significativa, esa dosis fue seleccionada para la evaluación in vivo.

Ejemplo 9: Comparación in vivo de Mabs 224G11 murinos y quiméricos en el modelo de xenoinjerto de NCI-H441 NCI-H441 es derivado de adenocarcinoma pulmonar papilar, expresa altos niveles de c-Met, y demuestra fosforilación constitutiva de c-Met RTK.

Para evaluar el efecto in vivo de anticuerpos en el modelo de xenoinjerto de NCI-H441 , se alojaron ratones atímicos de seis a ocho semanas de edad en jaulas esterilizadas con filtro superior, se mantuvieron en condiciones estériles y se manipularon de acuerdo con las pautas francesas y europeas. Los ratones recibieron inyecciones subcutáneas con 9x106 células. Luego, seis días después del implante de células, se midieron los tumores (aproximadamente 100 mm3), los animales se dividieron en grupos de 6 ratones con tamaño de tumores comparable y se trataron, en primer lugar, con una dosis de carga de 60 pg de anticuerpo/ratón y luego dos veces por semana con 30 pg/dosis de cada anticuerpos que se va a analizar. Los ratones fueron monitoreados para la observación del índice de crecimiento del xenoinjerto. El volumen tumoral se calculó mediante la fórmula: p (Pi)/6 X largo X ancho X altura. Los resultados descritos en la Figura 13 demuestran que el Mab murino desprovisto de actividad agonista se comporta, in vivo, según lo esperado, como antagonista potente incluso a la dosis analizada baja. Contrariamente a lo observado con el Mab murino, el Mab quimérico exhibió una actividad in vivo muy transitoria y el tumo escapó completamente al tratamiento a la inyección de células luego de D20. Este experimento demuestra claramente que el aumento del efecto agonista in vitro que dio como resultado una disminución de la actividad antagonista también fue responsable de una pérdida in vivo significativa de actividad antagonista.

Ejemplo 10: Efecto del Mab 224G11 murino y de diversas versiones quiméricas y humanizadas de este anticuerpo sobre la proliferación inducida por HGF de células NCI-H441 ¡n vitro Se cultivaron rutinariamente células NCI-H44 de ATCC en medio RPMI 1640 (Invitrogen Corporation, Escocia, Reino Unido), 10% de FCS (Invitrogen Corporation), 1 % de L-Glutamina (Invitrogen Corporation). Para los ensayos de proliferación, las células se dividieron 3 días antes del uso de modo que estuviesen en la fase confluente de crecimiento antes de la colocación en placas. Las células NCI-H441 se colocaron en placas de cultivo tisular de 96 pocilios a una densidad de 3,75x104 células/pocilio en 200 µ? de medio libre de suero (medio RPMI 1640 más 1 % de L-Glutamina). Veinticuatro horas después de la colocación en placas, los anticuerpos que se van a ensayar fueron agregados a NCI-H441 e incubados a 37°C durante treinta minutos antes de agregar HGF a una concentración final de 400 ng/ml (5 nM) durante 142 horas más. El rango de dosis ensayado para cada anticuerpo es de 10 a 0,0097 pg/ml (concentración final en cada pocilio). En este experimento, se agregó Mab de lgG1 murino como un control de isotipo murino y como un control negativo agonista. Los anticuerpos ensayados fueron los siguientes: i) m224G1 1 , ii) sus formas quiméricas de lgG1 humanas respectivamente identificadas como [224G1 1] quim, [224G11] [MH quim], [224G11] [MUP9H quim], [224G1 1] [MMCH quim], [224G1 1] [TH7 quim] iii) sus formas de lgG1 humanizadas respectivamente descritas como [224G1 1] [Hz1], [224G1 1] [Hz2], [224G1 1] [Hz3]. También se incluyeron pocilios plaqueados con células solas -/+ HGF. El anticuerpo entero 5D5 de Genentech disponible en el mercado en la ATCC como una línea de células de hibridoma se introdujo como un control positivo agonista completo y llamado a continuación m5D5. Luego, las células fueron pulsadas con 0,25 pCi de [3H]Timidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) durante 7 horas y 30 minutos. La magnitud de [3H]Timidina incorporada en ADN insoluble en ácido tricloroacético se cuantificó por recuento por centelleo líquido. Los resultados son expresados como datos de cpm no transformados para evaluar mejor la actividad agonista intrínseca potencial que podría ocurrir con Mabs anti-c-Met cuando se agregan solos a células tumoral.

Los resultados descritos en la Figura 14A demostraron que, según lo esperado, ni el control de isotipo ni el m224G11 exhibieron actividad agonista alguna en la proliferación de NCI-H441. El control isotipo no tuvo efecto alguno sobre la proliferación celular inducida por HGF mientras que m224G1 1 mostró un 66% de inhibición cuando se agregó a la concentración final de 10 pg/ml. El m5D5 utilizado como control agonista mostró, según lo esperado, un efecto completo agonista dependiente de la dosis cuando se agrega solo a las células. Como ya se ha observado, el Mab [224G1 1] quim exhibió un efecto agonista dependienté de la dosis significativo y, se observó una actividad inhibidora disminuida de esta forma quimérica: 19% en lugar de 66% para la forma murina. Cuando se agregan por si solos, los 3 Mabs humanizados de lgG1 demostraron efectos agonistas dependientes de la dosis comparados con la forma m224G11. [224G1 1] [Hz1], [224G11] [Hz2] y [224G11 ] [Hz3] tuvieron actividades antagonistas comparables aproximadamente 46, 30 y 35%. Estas actividades son significativamente inferiores que : aquella observada para m224G1 1. En la Figura 14B, se analizaron diversas formas quiméricas de lgG1. Comparada con la forma [224G11] quim la cual exhibió un efecto agonista dependiente de la dosis cuando se agregó por si sola a células NCI-H441 , las formas [224G11] [MH quim], [224G11] [MUP9H quim], [224G11] [MMCH quim], [224G1 1] [TH7 quim] no tuvieron un efecto agonista intrínseco significativo. Su actividad antagonista era superior a la observada para el Mab m224G 1 (57%) con inhibiciones que alcanzan 79, 78, 84 y 93% respectivamente para [224G1 1] [MH quim], [224G11] [MUP9H quim], [224G1 1] [MMCH quim] y [224G11] [TH7 quim].

Ejemplo 11 : Efecto in vitro de diversas formas humanizadas de lgG1 del Mab 224G11 Se cultivaron rutinariamente células NCI-H441 de ATCC en medio RPMI 1640 (Invitrogen Corporation, Escocia, Reino Unido), 10% de FCS (Invitrogen Corporation), 1 % de L-Glutamina (Invitrogen Corporation). Para los ensayos de proliferación, las células se separaron 3 días antes del uso de modo que estuviesen en la fase confluente de crecimiento antes de la colocación en placas. Las células NCI-H441 se colocaron en placas de cultivo tisular de 96 pocilios a una densidad de 3,75x104 células/pocilio en 200 µ? de medio libre de suero (medio RPMI 1640 más 1 % de L-Glutamina). Veinticuatro horas después de la colocación en placas, se agregaron los anticuerpos que se van a analizar a NCI-H441 y se incubaron a 37°C durante treinta .minutos antes de agregar HGF a una concentración final de 400 ng/ml (5: nM) durante 142 horas adicionales. El rango de dosis analizado para cada anticuerpo es de 10 a 0,0097 pg/ml (concentración final en cada pocilio). En este experimento, se agregó Mab de lgG1 murino como un control negativo de "background" para la actividad agonista y los anticuerpos analizados eran los siguientes: i) m224G1 , ii) sus formas quiméricas de lgG1 humanas respectivamente identificadas como [224G1 1] quim, [224G11] [TH7 quim] iii) sus formas de lgG1 humanizadas respectivamente descritas como [224G1 1] [TH7 Hz1], [224G11] [TH7 Hz3]. También se incluyeron pocilios plaqueados con células solas -/+ HGF. El anticuerpo entero 5D5 de Genentech disponible en el mercado en la ATCC como una línea celular de hibridoma se introdujo como un control positivo agonista completo y luego se lo llamó m5D5. Luego, las células fueron pulsadas con 0,25 pCi de [3H]Timidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) durante 7 horas y 30 minutos. La magnitud de [3H]Timidina incorporada en ADN insoluble en ácido tricloroacético se cuantificó mediante recuento por centelleo líquido. Los resultados son expresados como datos de cpm no transformados para evaluar mejor la potencial actividad agonista intrínseca que podría producirse con Mabs anti-c-Met cuando se agregan por si solos a células tumorales.

La Figura 15 mostró que el Mab m224G1 1 exhibió el efecto inhibidor usual (74% de inhibición). La forma de lgG1 quimérica [224G11] quim tuvo, según lo esperado, un efecto agonista intrínseco dependiente de la dosis y un efecto antagonista inferior comparado con la forma murina: 33% contra 74% de inhibición. El [224G11] [TH7 quim] tuvo una actividad agonista muy débil en este experimento. Sin embargo, exhibió un efecto inhibidor elevado (81 %) cercano al: observado para el Mab murino. Las 2 formas humanizadas no tuvieron efecto agonista intrínseco alguno y tuvieron una actividad antagonista cercana a las observadas para el Mab murino o el [224G1 1] [TH7 quim] con respectivamente 67 y 76% de inhibición para [224G1 1] [TH7 Hz1] y [224G1 1] [TH7 Hz3].

Ejemplo 12: Comparación ¡n vivo de Mabs 224G11 murinos, quiméricos y humanizados que portan el tipo salvaje o la bisagra construida por ingeniería genética TH7 (modelo de xenoinjerto NCI-H441).

NCI H441 es derivado de adenocarcinoma pulmonar papilar, expresa altos niveles de c-Met, y demuestra fosforilación constitutiva de c-Met RTK.

Para evaluar la necesidad de la construcción por ingeniería genética de bisagra para ahorrar actividad in vivo del anticuerpo murino 224G 1 , se albergaron ratones atímicos de seis a ocho semanas de edad en jaulas esterilizadas con filtro superior, mantenidas en condiciones estériles y manipuladas de acuerdo con las pautas Francesas y Europeas. Los ratones recibieron inyecciones subcutáneas con 9x106 células NCI-H441. Luego, seis días después de la implantación celular, los tumores eran medibles (aproximadamente 100 mm3), los animales se dividieron en grupos de 6 ratones con tamaño tumoral comparable y se trataron, en primer lugar, con una dosis de carga de 2 mg de anticuerpo/ratones y luego dos veces a la semana con una dosis de 1 mg de cada anticuerpo que se va a ensayar. Se evaluaron diez anticuerpos en este experimento incluyendo el m224G1 1 , la forma quimérica que exhibe la bisagra del tipo salvaje (c224G11), la forma quimérica construida por ingeniería genética TH7 (224G1 1[TH7 quim:]), portando tres formas humanizadas la bisagra del tipo salvaje (224G11 [lgG1 Hz1 ], 224G1 1 [lgG1 Hz2] y 224G1 1 [1gG1 Hz3]) y las tres formas construidas por ingeniería genética TH7 correspondientes (224G1 1 [TH7 Hz1], 224G11 [TH7 Hz2] y 224G1 1 [TH7 Hz3]). Se les hizo un seguimiento a los ratones para la observación del índice de crecimiento de los xenoinjertos.

El volumen tumoral se calculó mediante la fórmula: p (P¡)/6 X largo X ancho X altura.

Los resultados descritos en la Figura 16 demuestran que el Mab murino desprovisto de cualquier actividad agonista ¡n vitro se comportó, según lo esperado, como un potente antagonista ¡n vivo. En contraste con lo observado con el Mab murino, ambas formas quiméricas y humanizadas que portan la bisagra del tipo salvaje exhibieron solamente una actividad in vivo muy transitoria. En cualquiera de los casos, la sustitución de la bisagra del tipo salvaje por la construida por ingeniería genética - TH7 dio como resultado una completa restauración de la actividad in vivo observada con anticuerpos murinos. Este experimento demuestra claramente que el aumento del efecto agonista in vitro que dio como resultado una reducción de la actividad antagonista también fue responsable de una pérdida in vivo significativa de la actividad antagonista. También demuestra que el uso de una región construida genéticamente - TH7 en lugar de la del tipo salvaje es necesaria para mantener las propiedades in vivo del Mab murino.

Ejemplo 13: Efecto de m224G11 y su forma humanizada h224G11 sobre la regulación descendente de c-Met in vitro En los siguientes ejemplos, para que lo haya lugar a duda alguna, la expresión h224G11 se refiere a la forma humanizada 224G1 1 [TH7 Hz3] del anticuerpo de la invención.

Se han seleccionado dos líneas celulares para ensayar la actividad de anticuerpos anti-c-Met en la degradación del receptor c-Met. A549 (#HTB-174) y NCI-H441 (#CCL-185) son dos líneas celulares NSCLC de la recolección ATCC. Las células NCI-H441 se sembraron en RPMI 1640 + 1 % de L-glutamina + 10% de FBS inactivado por calor, a 3x104 células/cm2 en placas de seis pocilios durante 24 h a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2. Las células A549 se sembraron en F12K + 10% de FBS inactivado por calor, a 2x104 células/cm2 en placas de seis pocilios durante 24 h a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2.

A continuación, las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de ser sometidas a privación de suero durante 24 horas adicionales. Se agregaron los anticuerpos anti-c-Met (10 g/ml), mlgG1 (10 pg/ml) irrelevante, o HGF (400 ng/mL) en medio DMEM libre de suero a 37°C. Después de 4 horas o 24 horas de incubación, el medio se retiró suavemente y las células se lavaron dos veces con PBS fría. Las células se lisaron con 500 pL de buffer de lisis enfriado con hielo [50 mM de Tris-HCI (pH 7,5); NaCI 150 mM; 1 % de Nonidet P40; 0,5% de desoxicolato; y 1 tableta de cóctel de inhibidor de proteasa completo más 1 % de antifosfatasas]. Los lisados celulares se agitaron durante 90 min a 4°C y se aclararon a 15.000 rpm durante 10 minutos. En esta etapa, los lisados celulares pudieron almacenarse a -20°C hasta ser necesarios para el análisis western blot. Se cuantificó la concentración proteica utilizando BCA. Se separaron los lisados de células enteras (5pg en 20 µ?) por SDS-PAGE y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. Las membranas se saturaron durante 1 h a TA con TBS-Tween 20 0,1 %(TBST); 5% de leche en polvo descremada y se sondearon con anticuerpo anti-c-Met (dilución 1/ 000) durante toda la noche a 4°C en TBST-5% de leche en polvo descremada. Los anticuerpos se diluyeron en solución salina tamponada con TRIS -0,1 % de tween 20 (v/v) (TBST) con 1 % de leche en polvo descremada. A continuación, las membranas se lavaron con TBST y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (dilución 1 :1000) durante 1 h a TA. Las proteínas inmunorreactivas se visualizaron con ECL (Pierce # 32209). Después de la visualización de c-Met, las membranas se lavaron una vez más con TBST y se incubaron durante 1 h a TA con anticuerpo anti-GAPDH de ratón (dilución 1/200 000) en TBST-5% de leche en polvo descremada. Luego, las membranas se lavaron en TBST y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa, durante 1 h a TA. Las membranas se lavaron y GAPDH se reveló utilizando ECL. Se midió la intensidad de banda por densitometría.

Los resultados presentados en las Figuras 19A y 20A demostraron que tanto m224G11 como h224G11 son capaces de regular en forma descendente y significativamente c-Met, de un modo dependiente de la dosis, en líneas de células A549 y NCI-H441. La regulación descendente ya es significativa después de un tiempo de incubación de 4 horas y siguió aumentando a 24 horas. Los histogramas presentados en las Figuras 9A y 20A corresponden a los valores medios o respectivamente 4 y 3 experimentos independientes. Se incluyeron las imágenes de Western blot correspondientes a un experimento significativo en las Figuras 19B y 20B.

Ejemplo 14: Efecto de m224G11 y su forma humanizada h224G11 sobre la propagación de c-Met in vitro Las ' formas propagadas solubles del receptor c-Met se producen naturalmente en el suero de ratones con xenoinjerto de tumor humano o en suero de paciente humano con tumores que expresan c-Met. Adicionalmente, los anticuerpos dirigidos contra c-Met tales como el: Mab DN30, son descritos como inductores de la propagación de c-Met en experimentos in vitro. Para determinar si el m224G11 como ese tipo de propiedad, las células se sembraron- en placas de seis pocilios en medio de FCS al 10%. Cuando alcanzaron aproximadamente 80% de confluencia, se retiró el medio y se agregó medio de cultivo completo fresco +/- los compuestos que se van a ensayar. Las células se incubaron 72 horas adicionales con m224G1 1 , un control de isotipo mlgG1 o PBS. Se introdujo PMA (acetato de forbol meristato) como un inductor de la propagación. También se ensayó HGF en células para determinar el impacto del ligando de c-Met sobre la propagación natural. Los sobrenadantes se recolectaron y filtraron en 0,2 pm antes del uso en un ensayo ELISA cuyas formas solubles de c-Met fueron capturadas con un anticuerpo anti-c-Met que no reconoce el mismo epítopo como m224G11 o el c11 E1 (Figura 21 ). Por añadidura, las células de cada pocilio se lavaron una vez con PBS y se lisaron para determinar la concentración proteica. Para el ELISA, 224D10 se utilizó como un anticuerpo de captura y después saturación de placas, los sobrenadantes filtrados de placas de seis pocilio se agregaron en el ensayo ELISA. Se utilizó una forma de c-Met monomérica como un control positivo. Después de la incubación de los sobrenadantes, las placas se lavaron para eliminar el c-Met no unido y se utilizó c11 E1 para detectar c-Met capturado por el Mab 224G1 1. La revelación del ensayo se llevó a cabo finalmente mediante la adición de un anticuerpo policlonal anti-hFc HRP-conjugado.

Los resultados mostrados en la Figura 22 indican que se produjo una propagación natural de c-Met cuando las células se cultivaron durante 72 horas in vitro. No se observó efecto alguno del mlgG1. Sin embargo, la adición de m224G1 1 pareció inhibir la propagación del c-Met. Estos resultados fueron confirmados para 3 otras líneas celulares (Hs746T, EBC1 y MKN45) en la Figura 23. En ese segundo experimento, el PMA, agregado como un inductor de propagación positivo, aumentó significativamente, según lo esperado, la propagación del c-Met por lo menos en 2 líneas celulares (Hs746T y MKN45). Finalmente, en un tercer experimento (Figura 24), se introdujo HGF como un control. No se indujo propagación adicional por HGF en comparación con células solas o células + mlgGl Una vez más, se observó una inhibición significativa de la propagación de c-Met con m224G1 1.

Ejemplo 15: Efecto intrínseco de h224G11 Ab sobre diversas líneas celulares En experimentos previos descritos en esta patente, se ha demostrado que, en contraste con lo observado con otros anticuerpos tales como 5D5, el m224G1 1 y su forma humanizada h224G11 no exhiben actividad intrínseca significativa en líneas celulares tumorales. Para extender esta propiedad a otras líneas celulares, se llevaron a cabo experimentos western blot y fosfo-ELISA con el anticuerpo por si solo, agregado en diversos momentos, en un conjunto de líneas dé células cancerígenas, con niveles variables de expresión de c-Met, incluyendo Hs746T, NCI-H441 , Hs578T, NCI-H125, T98G, MDA-MB-231 , PC3. También se llevó a cabo el mismo ensayo en una célula normal: HUVEC.

El método para el ensayo ELISA de fosfo cMet ya fue descrito en el ejemplo 5 de la presente solicitud de patente. Para el análisis western, se prepararon lisados proteicos a partir de células peletizadas mediante incubación en buffer de lisis con proteasas e inhibidores de fosfatasas [10nM Tris (pH 7,4), NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 0,5% de Nonidet P40, fluoruro sódico 100 mM, pirofosfato sódico 10 mM, ortovanadato sódico 2 mM, PMSF 2 mM, 10 mg/ml de leupeptina, 10 mg/ml de aprotinina] a 4°C. Se aclararon los lisados proteicos de restos celulares por centrifugación, se resolvieron por electroforesis en geles 8% SDS-PAGE, y se électrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Para los experimentos con c-Met, los lisados fueron inmunoprecipitados para proteína específica de interés antes de la electroforesis y transferencia.

Los resultados presentados en las Figuras 25: a 32 demuestran una vez más que no se observó actividad intrínseca alguna del anticuerpo h224G11 en las células ensayadas.

Ejemplo 16: Comparación in vivo del anticuerpo 224G11 murino de tipo salvaje con una forma del 224G11 quimérico con modificación en la región bisagra descripta como 224G11 [C2D5-7] (modelo de xenoinjerto 5 NCI-H441 ).

El NCI-H441 deriva de adenocarcinoma pulmonar papilar, expresa niveles elevados de c-Met y demuestra fosforilación constitutiva de c-Met RTK.

A los efectos de evaluar la necesidad de la modificación en la región bisagra para proteger la actividad in vivo del anticuerpo murino 224G1 1 , se í o colocaron en jaulas tapadas con filtro esterilizado ratones atímicos de seis a ocho semánas de vida, se los mantuvo en condiciones estériles y se los manipuló de acuerdo con los lineamientos franceses y europeos. A los ratones se les inyectó por vía subcutánea 9x106 de células NCI-H441. Posteriormente, a los seis días del implante celular, fue posible medir los tumores 15 (aproximadamente 100 mm3), se dividió a los animales en grupos de seis ratones con tamaño de tumor comparable y se los trató primero con una dosis de carga de 2 mg de anticuerpo/ratón y luego dos: veces por semana con 1 mg/dosis de cada anticuerpo a ser evaluado. Se llevó a cabo un seguimiento de 20 los ratones a fin de observar el índice de crecimiento del xenoinjerto. El volumen tümoral fue calculado por medio de la fórmula: p (Pi)/6 X longitud X ancho X alto. Los resultados que se describen en la Figura 33 demuestran que el Mab murino desprovisto de toda actividad agonista in vitro, se comporta, según lo esperado, como un potente antagonista in vivo. Tal como lo sugieren 25 los resultados obtenidos in vitro, en los ensayos de fosforilación, el anticuerpo con modificación en la región bisagra 224G11 [C2D5-7], que no demostraba un efecto agonista significativo, demuestra una fuerte actividad in vivo, comparable a la del m224G 1 en el modelo de xenoinjerto NCI-H441.

Ejemplo 17: Evaluación de h224G11 en un ensayo ADCC Puesto que h224G11 es del isotipo lgG1 , el ADCC podría ser parte de su eficacia in vivo en seres humanos. Se llevó a cabo un ensayo in vitro de citotoxicidad de liberación [51Cr] usando ya sea células Hs746T o NCI-H441 como células objetivo y células NK purificadas a partir de linfocitos mononucleares de sangre periférica humana.

En resumen, se incubaron un millón de células objetivo Hs746T o NCI-H441 con b sin 20 pg de h224G11 Ab en presencia de 100 pCi de 51Cromo (Perkin Elmer) por espacio de 1 hr. A continuación; se plaquetearon 4 X 103 células con una cantidad creciente de células asesinas naturales (NK) aisladas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) usando una selección negativa (Stemcell Technologies). Las células se incubaron juntas durante un lapso adicional de 4 horas a 37°C. Se calculó el porcentaje de lisis celular siguiendo la fórmula: [(liberación experimental de 5 Cr - liberación espontánea de 5 Cr)/(liberación total de 51Cr - liberación espontánea 51Cr)] X 100. La liberación espontánea representa los recuentos obtenidos cuando las células objetivo fueron cultivadas en ausencia de células asesinas naturales. La liberación total representa los recuentos obtenidos cuando las células objetivo fueron lisadas con 1 % Tritón X-100. El h224G1 1 aumentó significativamente la lisis de tanto células Hs746T (Figura 34a) como NCI-H441 (Figura 34b) en un 62,9% y 63,2%, respectivamente, en una relación de células NK/Objetivo de 100.

Ejemplo 18: Estudios Inmunohistoquímicos (IHC) Procedimientos para la tinción IHC de tumores incrustados en parafina: Se fraccionaron secciones de 8 a 12 µ? de tumor congelado e inmediatamente se las fijó en acetona pre enfriada -20°C durante 3 minutos. Los cortes se enfriaron a temperatura ambiente durante 30 minutos a 1 hora. Luego de dos lavados en PBS se bloqueó la actividad de peroxidasa endógena usando Reactivo de Bloqueo de Peroxidase (Peroxidase Blocking Reagent) (Dako K4007) durante cinco minutos. Las secciones fueron lavados con PBS y se incubaron en reactivo de bloqueo avidina/biotina (Dako X0590) inmediatamente antes de la saturación de los sitios no específicos en PBS-BSA 4% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, se incubaron los cortes con h224G11 biotinilado (50 a 10 pg/ml) o lgG1/kappa biotinilado humano (50 a 10 Mg/ml, el Sitio de Unión) como control negativo durante 2 horas a temperatura ambiente.

Las secciones se lavaron con PBS y se incubaron con complejo universal estreptavidina-peroxidasa (Dako K0679) por espacio de 30 a 45 minutos. Se usó 3-amino-9-etilcarbazol para el desarrollo de un producto de reacción de color rojo (Sigma). Los cortes fueron sumergidos en hematoxilina durante 4 minutos para contrateñir (Dako S3309).

Los resultados están representados en la Figura 35.

El h224G11 tiñe diferencialmente la membrana celular de diversos tipos de tumor. En este procedimiento inmunohistoquímico, el producto de reacción rojo se correlaciona con la tinción positiva de la membrana celular y la falta de producto de reacción rojo se correlaciona con la tinción negativa y la no v'isualización de la membrana celular. El control IgG, lgG1/kappa humano es un control correlacionado con el isotipo.

Claims

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descrito y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma cómo la misma ha de ser llevada a la práctica se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo: 1. Un anticuerpo monoclonal, o su fragmento o derivado funcional divalente, capaz de inhibir la dimerización de c-Met, comprendiendo dicho anticuerpo una cadena pesada que comprende CDR-H1 , CDR-H2 y CDR-H3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID Nos. 1 , 2 y 3; y una cadena ligera que comprende CDR-L1 , CDR-L2 y CDR-L3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEG ID Nos. 5, 6 y 7, estando dicho anticuerpo adicionalmente caracterizado porque también comprende una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 56. 2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 , o su fragmento o derivado funcional divalente, caracterizado porque dicha región bisagra comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No..57. 3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 , o su fragmento o derivado funcional divalente, caracterizado porque dicha región bisagra comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No..21. 4. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 , o su fragmento o derivado funcional divalente, caracterizado porque dicha región bisagra comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEC ID Nos. 22 a 28 y SEC ID Nos. 72 a 86. 5. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 , o su fragmento o derivado funcional divalente, caracterizado porque consiste en un anticuerpo quimérico. 6. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 , o su fragmento o derivado funcional divalente, caracterizado porque consiste en un anticuerpo humano. 7. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 , o su fragmento o derivado funcional divalente, caracterizado porque consiste en un anticuerpo humanizado. 8. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7, o su fragmento o derivado funcional divalente, caracterizado porque comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 4; y un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 8, 9 o 10. 9. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, o su fragmento o derivado funcional divalente, caracterizado porque comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 4; un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 8; y una región bisagra qué comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 22. 10. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, o su fragmento o derivado funcional divalente, caracterizado porque comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 4; un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 9; y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 22. 11 . El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, o su fragmento o derivado funcional divalente, caracterizado porque comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 4; un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 10; y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 22. 12. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, o su fragmento o derivado funcional divalente, caracterizado porque comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 4; un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 8; y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 28. 13. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, o su fragmento o derivado funcional divalente, caracterizado porque comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 4; un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 9; y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 28. 14. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, o su fragmento o derivado funcional divalente, caracterizado porque comprende un dominio variable dé cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 4; un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID No. 10; y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos- SEC ID No. 28. 15. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque se selecciona entre los siguientes ácidos nucleicos: a) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica para un anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, según lo reivindicado en una de las reivindicaciones 1 a 14; b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que comprende las secuencias SEC ID No. 1 1 , SEC ID No. 12, SEC ID No. 13 y las secuencias SEC ID No. 15, SEC ID No. 16 y SEC ID No. 17; c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que comprende las secuencias SEC ID No. 14 y SEC ID No. 18, 19 o 20; d) los correspondientes ácidos nucleicos de ARN de los ácidos nucleicos según lo definido en b) o c); e) los ácidos nucleicos complementarios de los ácidos nucleicos según lo definido en a), b) y c); f) un ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos capaz de hibridarse bajo condiciones de alta severidad con por lo menos una de las CDRs de secuencia SEC ID Nos. 11 a 13 y 15 a 17. 16. ; Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque se selecciona entre los siguientes ácidos nucleicos: - un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica para un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, de acuerdo con la presente invención y donde la secuencia nucleica que codifica para la región bisagra de dicho anticuerpo comprende o tiene una secuencia seleccionada del grupo formado por las secuencias SEC ID Nos. 29 a 35 y SEC ID Nos. 73 a 87. 17. Un vector que comprende un ácido nucleico según lo reivindicado en la reivindicación 15 o 16. 18. Una célula huésped que comprende un vector según lo reivindicado en la reivindicación 17. 19. Un animal transgénico con la excepción del hombre que comprende por lo menos una célula transformada por un vector según lo reivindicado en la reivindicación 17. 20. Un proceso para la producción de un anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con lo reivindicado en una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) cultivo en un medio y condiciones de cultivo apropiadas de una célula según lo reivindicado en la reivindicación 8; y b) la recuperación de dicho anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, producido comenzando a partir del medio de cultivo o de dichas células cultivadas. 21. Un anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, capaz de ser obtenido mediante un proceso según lo reivindicado en la reivindicación 20. 22. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicaciones 1 a 14 y 21 como un medicamento. 23. Una composición que comprende, a modo de principio activo, un compuesto que consiste en un anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con lo reivindicado en una de las reivindicaciones 1 a 14, 21 o 22. porque comprende, además, como un producto combinado para el uso simultáneo, separado o consecutivo, un anticuerpo antitumoral. 25. La composición de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizada porque comprende, además, como un producto combinado para el uso simultáneo, separado o consecutivo, un agente citotóxico/ citostático. 26. La composición de acuerdo con la reivindicación 23, caracterizada porque uno, por lo menos, de dichos anticuerpos, o su fragmento o derivado funcional divalente, es conjugado con una toxina celular y/o con un radioelemento. 27. La composición de acuerdo con la reivindicación 25 o 26, caracterizada porque dicho agente citotóxico/ citostático o dicha toxina y/o un radioelemento es acoplado químicamente a por lo menos uno de los elementos de dicha composición para el uso simultáneo. 28. La composición de acuerdo con lo reivindicado en una de las reivindicaciones 23 a 27 como un medicamento. 29. El uso de un anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 14, 21 o 22 o de una composición de acuerdo con las reivindicaciones 23 a 28 para la preparación de un medicamento destinado a inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células tumorales. 30. · El uso de un anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 14, 21 o 22 o de una composición de acuerdo con las reivindicaciones 23 a 28, o el uso de acuerdo con la reivindicación 29, para la preparación de un medicamento destinado para la prevención o para el tratamiento del cáncer. 31. El uso de acuerdo con la reivindicación 30, caracterizado porque dicho cáncer es un cáncer seleccionado entre cáncer de próstata, osteosarcomas, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer del endometrio, glioblastoma o cáncer de colon. 32. El uso de acuerdo con la reivindicación 30 o 31 , caracterizado porque dicho cáncer es un cáncer relacionado con la activación de Met dependiente e independiente de HGF. 33. Un método de diagnóstico in vitro de enfermedades inducidas por una sobreexpresión o una expresión insuficiente del receptor c-Met comenzando a partir de una muestra biológica en la; cual la presencia anormal del receptor c-Met es sospechada, caracterizado porque dicho método comprendé un paso donde dicha muestra biológica se pone en contacto con un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 14, 21 o 22, siendo posible que dicho anticuerpo sea rotulado, en caso de ser necesario.