JP5863458B2 - 新規な抗ｃＭＥＴ抗体 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトｃ−Ｍｅｔ受容体に特異的に結合することができおよび／または前記受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害することができる新規な二価の抗体、並びに前記抗体をコードするアミノ酸および核酸配列に関する。更に詳細には、本発明による抗体は、ｃ−Ｍｅｔの二量体化を阻害することができる。本発明は、更に、前記受容体の過剰発現と関連した癌または任意の疾患の予防および／または治療処置のための医薬としての前記抗体の使用、並びにｃ−Ｍｅｔの過剰発現と関連した疾病の診断のための方法またはキットを含んでなる。本発明は、最後に、腫瘍進行または転移に関与する他の増殖因子および／または化合物に対する他の抗体および／または化合物、および／または抗癌剤または毒素と接合した薬剤と組合せた前記抗体を含んでなる生成物および／または組成物、およびある種の癌の予防および／または治療のためのそれらの使用を含んでなる。

トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、イマチニブおよびゲフィチニブ阻害薬のような受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を標的とする薬剤は、選択した癌の治療のためのこのタンパク質クラスを標的とすることの重要性を明示している。

ｃ−Ｍｅｔは、ＲＯＮおよびＳＥＡも包含するＲＴＫのサブファミリーの典型的なメンバーである。ｃ−ＭｅｔＲＴＫファミリーは、構造的に他のＲＴＫファミリーとは異なっており、細胞分散因子（ＳＦ）とも呼ばれる肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に対する唯一の既知の高親和性を有する受容体である［D.P. Bottaro et al., Science 1991, 251:802-804; L. Naldini et al., Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10:2867-2878］。ｃ−ＭｅｔおよびＨＧＦは様々な組織で広く発現し、それらの発現は通常はそれぞれ上皮および間葉起源の細胞に限定されている［M.F. Di Renzo et al., Oncogene 1991, 6:1997-2003; E. Sonnenberg et al., J. Cell. Biol. 1993, 123:223-235］。それらは、いずれも正常な哺乳類の発生に必要であり、細胞遊走、形態形成分化、および三次元的管構造の組織化、並びに成長および血管形成に特に重要であることが示されている［F. Baldt et al., Nature 1995, 376:768-771; C. Schmidt et al., Nature. 1995:373:699-702; Tsarfaty et al., Science 1994, 263:98-101］。ｃ−ＭｅｔおよびＨＧＦの制御調節は、哺乳類発生、組織維持および修復に重要であることが示されている［Nagayama T., Nagayama M., Kohara S., Kamiguchi H., Shibuya M., Katoh Y., Itoh J., Shinohara Y., Brain Res. 2004, 5;999(2):155-66; Tahara Y., Ido A., Yamamoto S., Miyata Y., Uto H., Hori T., Hayashi K., Tsubouchi H., J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307(1):146-51］とともに、それらの調節異常は癌の進行に関係している。

ｃ−Ｍｅｔの不適当な活性化によって行われるシグナル伝達異常は、ヒトの癌で見られる極めて頻繁な変化の１つであり、腫瘍形成および転移に決定的な役割を果たしている［Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915-925; L. Trusolino and Comoglio P. M., Nat Rev. 癌 . 2002, 2(4):289-300］。

不適当なｃ−Ｍｅｔ活性化は、ｃ−Ｍｅｔの過剰発現および／またはパラクリンまたはオートクリン活性化などのリガンド依存性および非依存性機構によって、または機能獲得変異によって生じる可能性がある［J.G. Christensen, Burrows J. and Salgia R., Cancer Letters. 2005, 225:1-26］。しかしながら、ＡＴＰおよびチロシン含有ペプチド基質に対するキナーゼの結合親和性および結合キネティクス（kinetics）を調節するには、リガンドの存在下または非存在下では、ｃ−Ｍｅｔ受容体のオリゴマー化が必要である［Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 2004 Aug 17, 43:10570-8］。活性化ｃ−Ｍｅｔは、細胞質ドメインに位置するそのマルチドッキング部位へのシグナル伝達エフェクターを動員し、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ、ＳｒｃおよびＳｔａｔ３など幾つかの重要なシグナル伝達経路を活性化する［Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005, 15(1):49-51; Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene. 2000, 19(49):5582-9］。これらの経路は、腫瘍細胞増殖、侵襲および血管形成、およびアポトーシスの回避に固有である［Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene, 2000, 19(49):5582-9; Gu H., Neel BG, Trends Cell Biol. 2003 Mar, 13(3):122-30; Fan S., Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q., Cao Y., Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM, Oncogene. 2000 Apr 27, 19(18):2212-23］。更に、他のＲＴＫと比べてｃ−Ｍｅｔシグナル伝達のユニークな一面は、この受容体による細胞機能の調節の複雑さに更に加えることができるα６β４インテグリン［Trusolino L., Bertotti A., Comoglio PM, Cell. 2001, 107:643-54］、ＣＤ４４ｖ６［Van der Voort R., Taher TE, Wielenga VJ, Spaargaren M., Prevo R., Smit L., David G., Hartmann G., Gherardi E., Pals ST, J. Biol. Chem. 1999, 274(10):6499-506］、Ｐｌｅｘｉｎ Ｂ１またはセマフォリン［Giordano S., Corso S., Conrotto P., Artigiani S., Gilestro G., Barberis D., Tamagnone L., Comoglio PM, Nat Cell Biol. 2002, 4(9):720-4; Conrotto P., Valdembri D., Corso S., Serini G., Tamagnone L., Comoglio PM, Bussolino F., Giordano S., Blood. 2005, 105(11):4321-9; Conrotto P., Corso S., Gamberini S., Comoglio PM, Giordano S., Oncogene. 2004, 23:5131-7］のような焦点接着複合体および非キナーゼ結合パートナーとのその相互作用の報告である。最後に、最近のデータは、ｃ−Ｍｅｔがゲフィチニブまたはエルロチニブに対する腫瘍の耐性に関与している可能性があり、ＥＧＦＲおよびｃ−Ｍｅｔの両方を標的とする化合物の組合せは極めて興味深いことがあることを示唆している［Engelman JA et al., Science, 2007, 316:1039-43］。

過去数年間に、癌細胞系におけるｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を弱める目的で多くの様々な方法が開発されてきた。これらの方法としては、ｉ）ｃ−ＭｅｔまたはＨＧＦ／ＳＦに対する中和抗体［Cao B., Su Y., Oskarsson M., Zhao P., Kort EJ, Fisher RJ, Wang LM, Vande Woude GF, Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98(13):7443-8; Martens T., Schmidt NO, Eckerich C., Fillbrandt R., Merchant M., Schwall R., Westphal M., Lamszus K., Clin Cancer Res. 2006, 12(20):6144-52］またはｃ−Ｍｅｔへのリガンド結合を防止するためのＨＧＦ／ＳＦ拮抗剤ＮＫ４の使用［Kuba K., Matsumoto K., Date K., Shimura H., Tanaka M., Nakamura T., 癌 Res., 2000, 60:6737-43］、ｉｉ）キナーゼ活性をブロックするｃ−Ｍｅｔに対する小ＡＴＰ結合部位阻害剤［Christensen JG, Schreck R., Burrows J., Kuruganti P., Chan E, Le P., Chen J., Wang X., Ruslim L., Blake R., Lipson KE, Ramphal J., Do S., Cui JJ, Cherrington JM, Mendel DB, Cancer Res. 2003, 63:7345-55］、ｉｉｉ）マルチドッキング部位への接近を干渉する遺伝子工学処理したＳＨ２ドメインポリペプチドおよび受容体またはリガンド発現を減少させるＲＮＡｉまたはリボザイムが挙げられる。これらの方法のほとんどは、ｃ−Ｍｅｔを選択的に阻害して腫瘍を阻害し、ｃ−Ｍｅｔが癌における治療介入に重要である可能性があることを示している。

ｃ−Ｍｅｔターゲッティングのために産生された分子の中、幾つかは抗体である。最も広汎に記載されているものは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ製の抗ｃ−Ｍｅｔ５Ｄ５抗体［WO 96/38557号］であり、様々なモデルに単独で添加したときには強力な作動薬として、またＦａｂ断片として用いたときには拮抗薬として作用する。ｏｎｅ ａｒｍｅｄ５Ｄ５（ＯＡ５Ｄ５）として報告されかつ大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）において組換えタンパク質として産生されたこの抗体の一価の遺伝子工学処理した形態も、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによる特許出願［WO 2006/015371号］の主題である。しかしながら、この分子は、その特定のスカフォールドのために抗体として認識されず、ヒトにおいて免疫原性でありうる突然変異も示す。活性という点で、このグリコシル化されていない分子はエフェクター機能を欠いており、最終的に、ＯＡ５Ｄ５がｃ−Ｍｅｔの二量体化を阻害することを、データーによって明確に示していない。更に、ｃ−Ｍｅｔを発現するが、ＨＧＦｍＲＮＡおよびタンパク質を発現せずかつリガンドとは非依存的に増殖する神経膠芽腫細胞系であるＧ５５インビボモデルで試験したときには、ｏｎｅ ａｒｍｅｄ抗ｃ−ＭｅｔはＧ５５腫瘍増殖に有意な効果を示さず、ＯＡ５Ｄ５は主としてＨＧＦ結合をブロックすることによって作用し、ＨＧＦとは非依存的に活性化された腫瘍を標的とすることはできないことを示唆している［Martens T. et al, Clin. Cancer Res., 2006, 12(20):6144-6152］。

ｃ−Ｍｅｔをターゲッティングするもう一つの抗体は、「主としてｃ−Ｍｅｔ拮抗剤としてまた幾つかの場合にはｃ−Ｍｅｔ作動薬として」作用する抗体としてＰｆｉｚｅｒによって報告されている［WO 2005/016382号］。ｃ−Ｍｅｔ二量体化に対するＰｆｉｚｅｒ抗体の任意の効果を示すデーターは、この出願明細書には記載されていない。

本発明の革新的態様の１つは、内因性作動薬活性を持たずかつｃ−Ｍｅｔ二量体化を阻害するキメラおよび／またはヒト化モノクローナル抗体を生成することである。更に詳細には、本発明の革新的一態様は、拮抗薬活性を有しかつｃ−Ｍｅｔ二量体化を阻害するキメラおよび／またはヒト化モノクローナル抗体を生成することである。

この方法は、またリガンド依存性の腫瘍のターゲッティングに加えて、ｃ−Ｍｅｔの過剰発現またはシグナル伝達のためのオリゴマー化に依存性のままである細胞内ドメインの突然変異により、ｃ−Ｍｅｔのリガンド非依存性活性化を損なうであろう。この抗体の活性のもう一つの態様は、ｃ−Ｍｅｔ機能を損なうｃ−Ｍｅｔとそのパートナーとの相互作用に対する立体障害である可能性がある。この抗体は、ｃ−Ｍｅｔ受容体の特異的阻害に関連した機能に加えＡＤＣＣおよびＣＤＣのようなエフェクター機能を得るために、ヒト化および遺伝子工学処理され優先的には、限定されないが、ヒトＩｇＧ１として、処理される。

驚くべきことには、本発明者らは、ｃ−Ｍｅｔに結合することができるだけでなくｃ−Ｍｅｔ二量体化を阻害することもできるキメラおよび／またはヒト化モノクローナル拮抗薬抗体であって、ｃ−Ｍｅｔに対して既成の拮抗薬抗体とは反対に二価である前記モノクローナル抗体を生成させることに初めて成功した。従来、ｃ−Ｍｅｔとそのパートナーとの二量体化を阻害することができる抗体は興味深いものであると時折示唆されていることが真実であれば、抗体がそのようにすることができることは開示または明確に示唆されたことはなかった。更に、抗体の特異性に関しては、活性な二価の抗体の生成に成功するかは全く明らかではなかった。

以前に説明されているように、このような抗体はより大きな患者の個体群にとって実質的な利益を提供するので、ｃ−Ｍｅｔ二量体化の阻害は本発明の主要な態様である。本発明までの場合であったリガンド依存性の活性化したｃ−Ｍｅｔ癌だけでなく、リガンド非依存性の活性化したｃ−Ｍｅｔ癌も、本発明の方法によって生成した抗体で治療することができた。

抗体は、ｃ−Ｍｅｔ−ＲＬｕｃ／ｃ−Ｍｅｔ−ＹＦＰを両方とも発現する細胞上でＢＲＥＴ分析によって評価し、ＢＲＥＴシグナルを少なくとも４０％、好ましくは４５％、５０％、５５％、および最も好ましくは６０％阻害する能力で選択した。

ＢＲＥＴ法は、タンパク質二量体化の典型的なものとして知られている［Angers et al., PNAS, 2000, 97:3684-89］。

ＢＲＥＴ法は、当業者に周知であり、下記の実施例で詳細に説明される。更に詳細には、ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）は、生物発光ドナー（ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ））と、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）またはＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）の変異体である蛍光受容体との間に起こる非放射性エネルギー移動である。本発明の場合には、ＥＹＦＰ（強化黄色蛍光タンパク質）を用いた。移動の効果は、ドナーと受容体の間の配置および距離によって変化する。次いで、エネルギー移動は、２個の分子が極めて接近している（１〜１０ｎｍ）ときにのみ起こることができる。この特性を用いて、タンパク質−タンパク質相互作用分析を行う。実際に、２個のパートナーの間の相互作用を検討するためには、第一のパートナーをウミシイタケルシフェラーゼに遺伝学的に融合させ、第二のものをＧＦＰの黄色変異体に融合させる。融合タンパク質を、通常は哺乳類細胞で発現させるが強制的なものではない。膜透過性基質（コエレンテラジン）の存在下では、Ｒｌｕｃは青色光を放射する。ＧＦＰ変異体がＲｌｕｃから１０ｎｍより近ければ、エネルギー移動が起こり、追加の黄色シグナルを検出することができる。ＢＲＥＴシグナルは、受容体により放射される光とドナーにより放射される光の比として測定される。従って、２個の融合タンパク質が接近しまたはコンホメーション変化によりＲｌｕｃとＧＦＰ変異体が一層近くなれば、ＢＲＥＴシグナルは増加する。

ＢＲＥＴ分析が好ましい実施形態にある場合には、当業者に知られている任意の方法を用いてｃ−Ｍｅｔ二量体化を測定することができる。ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光）、ＦＬＩＭ（蛍光寿命イメージング顕微鏡法）またはＳＷ−ＦＣＣＳ（単一波長蛍光相互相関分光法）の方法が挙げられるが、これらに限定されない。

共免疫沈降法、アルファスクリーン、化学的架橋、二重ハイブリッド、アフィニティークロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡまたはファーウエスタンブロット法のような他の古典的手法を用いることもできる。

「抗体（antibody）」、「抗体類（antibodies）」または「免疫グロブリン」は、最も広義に互換的に用いられ、モノクローナル抗体（例えば、完全長のまたは完全なモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体または多重特異性抗体（例えば、所望な生物活性を示す限り、二重特異性抗体）が挙げられる。

更に詳細には、このような分子は、ジスルフィド結合によって相互連結した少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含んでなる糖タンパク質である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略記する）と、重鎖定常領域とからなる。重鎖定常領域は、３個のドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなっている。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略記する）と、軽鎖定常領域とからなっている。軽鎖定常領域は、１個のドメインＣＬからなっている。ＶＨおよびＶＬ領域は、更にフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる一層保存されている領域が散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに分けることができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなっており、アミノ末端からカルボキシ末端へと下記の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置されている。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃｌｑ）など、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することがある。

免疫グロブリンの重鎖は、Ｆｄ領域、ヒンジ領域およびＦｃ領域（結晶性断片）の３つの機能性領域に分けることができる。Ｆｄ領域はＶＨおよびＣＨ１ドメインを含んでなり、軽鎖と組み合わさって抗原結合断片Ｆａｂを形成する。Ｆｃ断片は、例えば、補体の固定およびエフェクター細胞の同種のＦｃ受容体への結合などを含む、免疫グロブリンエフェクター機能に関与している。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ免疫グロブリンクラスで見られるヒンジ領域は、Ｆａｂ部分がＦｃ領域に対して空間的に自由に動くことができるようにする柔軟なスペーサーとして作用する。ヒンジドメインは構造的に多様であり、免疫グロブリンクラスおよびサブクラスの中で配列および長さがいずれも変化する。

結晶学的研究によれば、免疫グロブリンのヒンジ領域は、更に構造および機能上から、上部ヒンジ、コアおよび下部ヒンジの３つの領域に分けることができる（Shin et al., Immunological Reviews 130:87, 1992）。上部ヒンジは、ＣＨ１のカルボニル末端から動きを制限するヒンジにおける第一の残基であって、通常は２本の重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成する第一のシステイン残基までのアミノ酸を包含する。上部ヒンジ領域の長さは、抗体の分節柔軟性と相関している。コアヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド橋を含む。下部ヒンジ領域は、ＣＨ２ドメインでの残基のアミノ末端と連結し、これを包含している。ヒトＩｇＧ１のコアヒンジ領域は、配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓを含んでおり、ジスルフィド結合を形成することによって二量体化すると、ピボットとして作用すると思われる環状オクタペプチドを生じることによって柔軟性が付与される。免疫グロブリンのヒンジ領域におけるポリペプチド配列の構造および柔軟性によって可能となるコンホメーション変化は、抗体のＦｃ部分のエフェクター機能に影響することがある。

「モノクローナル抗体」という用語は、その通常の意味に準じて用いられ、実質的に均質な抗体の個体群から得られる抗体、すなわちこの個体群を含んでなる個々の抗体が、少量で存在することがある可能な天然に存在する突然変異体を除き、同一であることを表す。換言すれば、モノクローナル抗体は、細胞（例えば、ハイブリドーマ細胞、均質抗体をコードするＤＮＡでトランスフェクションした真核生物の宿主細胞、均質抗体をコードするＤＮＡでトランスフェクションした原核生物の宿主細胞など）の単一クローンの増殖から生じ、および一般的に単一クラスおよびサブクラスの重鎖および単一タイプの軽鎖を特徴とする、均質抗体である。モノクローナル抗体は、特異性が高く、単一抗原に対応する。更に、典型的には決定基またはエピトープに対する様々な抗体を包含するポリクローナル抗体製剤とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一決定基に対応する。

本明細書の記載において、抗体化合物またはそれらの配列に結合したポリペプチド、ポリペプチド配列、アミノ酸配列、ペプチドおよびタンパク質という用語は、相互可換である。

本発明は、ｃ−Ｍｅｔ二量体化を阻害することができ、かつそれぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖または最適アラインメント後に配列番号１、２および３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列と、それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖または最適アラインメント後に配列番号５、６または７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列とを含んでなる、モノクローナル抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体であって、前記抗体が、配列番号５６のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域をも含んでなることをさらに特徴とする、モノクローナル抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体に関する。

更に詳細には、本発明は、上記のように配列番号５７のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域をも含んでなることを特徴とする、モノクローナル抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体に関する。

換言すれば、本発明は、ｃ−Ｍｅｔ二量体化を阻害することができ、かつそれぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖または最適アラインメント後に配列番号１、２および３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列と、それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖または最適アラインメント後に配列番号５、６または７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列とを含んでなる、モノクローナル抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体であって、前記抗体が、配列番号５７のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域をも含んでなることをさらに特徴とする、モノクローナル抗体または二価の機能性断片もしくは誘導体に関する。

更に詳細には、本発明は、上記のように配列番号２１のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域をも含んでなることを特徴とする、モノクローナル抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体に関する。

換言すれば、本発明は、ｃ−Ｍｅｔ二量体化を阻害することができ、かつそれぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖または最適アラインメント後に配列番号１、２および３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列と、それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖または最適アラインメント後に配列番号５、６または７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列とを含んでなる、モノクローナル抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体であって、前記抗体が、配列番号２１のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域をも含んでなることをさらに特徴とする、モノクローナル抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体にも関する。

当業者には明らかであるように、配列番号５７および２１の共通配列は、配列番号５６の共通配列の中に含まれる。

「機能性断片または誘導体」という表現は、本明細書において後で詳細に定義される。

ＣＤＲ領域またはＣＤＲとは、ＩＭＧＴによって定義された免疫グロブリンの重および軽鎖の超可変領域を示すことを意味する。

ＩＭＧＴのユニークナンバリングは、どのような抗原受容体、鎖のタイプ、または種であっても可変ドメインを比較するために定義されている［Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V.およびLefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)］。ＩＭＧＴのユニークナンバリングでは、保存されるアミノ酸は常に同じ位置を有し、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）である。ＩＭＧＴユニークナンバリングにより、フレームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６位、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５位、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４位およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８位）および相補性決定領域（ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８位、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５位およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７位）の標準化限界が設定される。ギャップは非占有位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧で示されドットによって区切られている、例えば［８．８．１３］）は、重要な情報となる。ＩＭＧＴユニークナンバリングは、ＩＭＧＴ Ｃｏｌｌｉｅｒｓ ｄｅ Ｐｅｒｌｅｓと呼ばれる２Ｄ図形表現［Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)］およびＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢにおける３Ｄ構造［Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., 「Ｔ細胞受容体およびＭＨＣ構造データー（Ｔ cell receptor and MHC structure data)」. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)］において用いられる。

３種類の重鎖ＣＤＲと３種類の軽鎖ＣＤＲが存在する。ＣＤＲという用語は、本明細書では、抗体が認識する抗原またはエピトープに対する抗体の親和性による結合に関与するアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の、場合によっては、１つ、またはこれらの領域の幾つか、または全部を示す目的で用いられる。

本発明の意味における２個の核酸またはアミノ酸配列間の「同一性率」とは、最良のアラインメント（最適アラインメント）後に得られる比較を行う２配列間のヌクレオチドまたは同一アミノ酸残基の割合を示すことを意味し、この割合は純粋に統計学的なものであり、２配列間の差異はランダムかつそれらの全長にわたって分布している。２個の核酸またはアミノ酸配列間の配列の比較は、従来それらを最適な状態に整列した後にこれらの配列を比較することによって行われ、前記比較はセグメントによってまたは「比較ウインドウ」によって行うことができる。比較のための配列の最適アラインメントは、手作業の他に、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ(1981)の局所的相同性アルゴリズム法［Ad. App. Math. 2:482］、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ(1970)の局所的相同性アルゴリズム法［J. Mol. Biol. 48: 443］、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ(1988)の類似性検索法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444］、これらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウェア法（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、あるいはＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰ比較ソフトウェア）によって行うことができる。

２個の核酸またはアミノ酸配列間の同一性の割合は、最適状態に整列したこれら２個の配列を比較することによって決定され、比較を行う核酸またはアミノ酸配列は、これら２個の配列間で最適アラインメントに対する参照配列に関して付加または欠失を含んでなる可能性がある。同一性の割合は、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が２個の配列間で同一である同一位置の数を決定し、この同一位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で割り、得られた結果に１００を乗じて、これら２個の配列間の同一性の割合を得ることによって計算される。

例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlなるサイトで入手可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」（Tatusova et al.,「Ｂｌａｓｔ２配列−タンパク質およびヌクレオチド配列を比較するための新たなツール（Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences）」,FEMS Microbiol Lett. 174:247-250）を用いることができ、用いられるパラメーターはデフォルトによって与えられるものであり（詳細には、パラメーターについては「オープンギャップペナルティー」：５、および「延長ギャップペナルティー」：２であり、選択されるマトリックスは、例えば、プログラムによって提案されているマトリックス「ＢＬＯＳＵＭ６２」である）、比較を行う２個の配列間の同一性の割合は、プログラムによって直接計算される。

参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有するアミノ酸配列に関しては、参照配列に対してある種の変更、詳細には少なくとも１個のアミノ酸の欠失、付加または置換、トランケーションまたは伸張を有するものが好ましい。１個以上の連続的または非連続的アミノ酸の置換の場合には、置換アミノ酸が「同等な」アミノ酸によって置き換えられている置換が好ましい。「同等なアミノ酸」という表現は、本明細書では、対応する抗体の生物活性を本質的に変更することなくしかしながら基本構造のアミノ酸の１つで置換することができ、かつ後で、特に実施例で定義されるような任意のアミノ酸を示すものである。これらの同等なアミノ酸は、それらが置換されるアミノ酸との構造的相同性か、または様々な抗体間で実施することができる生物活性の比較試験の結果に基づいて決定することができる。

例えば、対応する変更された抗体の生物活性に大きな変更を生じることなく行うことができる置換の可能性が挙げられる。

非制限的例として、下表２に、変更された抗体の生物活性が保存されると考えられる置換の可能性を示す。逆置換も、当然のことながら同一条件では可能である。

ここで、本発明は、自然状態の抗体に関するものではなく、すなわち、抗体は自然環境中にはなく、天然供給源から精製によって単離または得ることができ、あるいは遺伝学組換えまたは化学的合成により得ることができ、抗体はその上更に記載されるように非天然アミノ酸を含むことができることを理解しなければならない。

また、上記のように、本発明は、更に詳細には、拮抗薬活性を有するキメラおよび／またはヒト化二価抗体、または任意の二価の機能性断片もしくは誘導体に関することも理解しなければならない。従来技術の二価抗体は、作動薬または部分作動薬である。上記のように変更されたヒンジを包含する、すなわち配列番号５６、５７または２１のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を包含する本発明のモノクローナル抗体は、新規であり、下記の実施例から明らかになるようにこのような変更されたヒンジのないキメラまたはヒト化抗体２２４Ｇ１１と比較して改良された拮抗薬活性を有するという特徴を提供する。

従来技術とは反対に、発明者らは、抗体のフォーマットを変更することなしに改良された拮抗薬活性を得ている。実際に、抗体５Ｄ５によって表される最近の従来技術では、拮抗薬活性を生成するには、一価の抗体断片を開発する必要があった。本願明細書では、本発明のヒンジを用いることによって、拮抗薬活性が増加した完全な二価抗体を得ることが初めて可能となり、これは一般的知識に反することである。

好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２２〜２８および５８〜７２からなる群から選択されるアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号２２〜２８および５８〜７２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

更に明確にするために、下表３および４に、本発明の様々な好ましいヒンジのアミノ酸およびヌクレオチド配列を再編成する。

第一の方法によれば、抗体はその重鎖配列によって定義される。更に詳細には、本発明の抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体の１つは、配列番号１〜３のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲから選択される少なくとも１種類のＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。

上記配列は、下記の配列である：
配列番号１：ＧＹＩＦＴＡＹＴ
配列番号２：ＩＫＰＮＮＧＬＡ
配列番号３：ＡＲＳＥＩＴＴＥＦＤＹ。

好ましい態様によれば、本発明の抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体の１つは、少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３から選択されるＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号１のアミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号２のアミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号３のアミノ酸配列を含んでなる。

第二の方法では、抗体はその軽鎖配列によって現在、定義される。更に詳細には、本発明の第二の特定態様によれば、抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体の１つは、配列番号５〜７のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲから選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。

上記配列は、下記の配列である：
配列番号５：ＥＳＶＤＳＹＡＮＳＦ
配列番号６：ＲＡＳ
配列番号７：ＱＱＳＫＥＤＰＬＴ。

もう一つの好ましい態様によれば、本発明の抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体の１つは、少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つのＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３から選択されるＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５のアミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号６のアミノ酸配列を含んでなり、
ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号７のアミノ酸配列を含んでなる。

本発明によるモノクローナル抗体を分泌することができるネズミハイブリドーマ、特にネズミ起源のハイブリドーマを、２００７年３月１４日にＣＮＣＭ（Institut Pasteur, Paris, France）にＣＮＣＭ Ｉ−３７３１の番号で寄託した。

本願明細書では、ＩｇＧ１は、好ましくはエフェクター機能、最も好ましくはＡＤＣＣおよびＣＤＣを得る上で好ましい。

当業者であれば、エフェクター機能としては、例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体−依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、貪食作用、および細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御（down regulation）が挙げられる。

本発明による抗体は、好ましくは特にネズミ、キメラまたはヒト化起源の特異的モノクローナル抗体であり、それは当業者に周知の標準的方法に準じて得ることができる。

一般に、モノクローナル抗体またはそれらの機能性断片もしくは誘導体、特にネズミ起源のものの調製のためには、マニュアル「抗体」（Harlow and Lane，抗体：実験室便覧（Antibodies: A Laboratory Manual) ,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988）に詳細に記載されている手法またはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Nature, 256:495-497, 1975）によって報告されているハイブリドーマからの調製の手法を参照することができる。

本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、ｃ−Ｍｅｔ、または本発明によるモノクローナル抗体によって特異的に認識されるエピトープを含むその断片の１つに対して免疫した動物細胞から得ることができる。前記ｃ−Ｍｅｔまたはその断片の１つは、特にｃ−ＭｅｔをコードするｃＤＮＡ配列に含まれる核酸配列用いて開始される遺伝学的組換えによってまたはｃ−Ｍｅｔのペプチド配列に含まれるアミノ酸の配列から開始されるペプチド合成によって通常の作業方法に準じて産生させることができる。

本発明によるモノクローナル抗体は、例えば、ｃ−Ｍｅｔまたは本発明によるモノクローナル抗体によって特異的に認識されるエピトープを含むその断片の１つが予め固定されているアフィニティーカラム上で精製することができる。更に詳細には、前記モノクローナル抗体は、プロテインＡおよび／またはＧ上でのクロマトグラフィーの後に、残留タンパク質混入物並びにＤＮＡおよびＬＰＳの除去を目的とするイオン交換クロマトグラフィーを行いまたは行わず、それ自体の二量体または他のマルチマーの存在による潜在的集合体を除去するためのＳｅｐｈａｒｏｓｅゲル上での排除クロマトグラフィーを行うまたは行わないことによって、精製することができる。更に一層好ましい方法では、これらの手法のすべてを同時または連続的に用いることができる。

本発明の抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、好ましくはキメラ抗体からなる。

キメラ抗体とは、所定の種の抗体由来の天然可変（軽鎖および重鎖）領域を前記所定の種とは異種（例えば、マウス、ウマ、ウサギ、イヌ、ウシ、ニワトリなど）の抗体の軽鎖および重鎖定常領域と組み合わせて含む抗体を示すものである。

本発明によるキメラ型の抗体またはそれらの断片は、遺伝学的組換えの手法を用いることによって調製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターと、本発明による非ヒト、特にネズミのモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列と、ヒト抗体の定常領域をコードする配列とを含む組換えＤＮＡをクローニングすることによって産生させることができる。このような組換え遺伝子によってコードされる本発明のキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであり、この抗体の特異性はネズミＤＮＡ由来の可変領域によって決定され、そのアイソタイプはヒトＤＮＡ由来の定常領域によって決定される。キメラ抗体の調製方法については、例えば、Ｖｅｒｈｏｅｙｎ ｅｔ ａｌ．（BioEssays, 8:74, 1988）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6851-6855, 1984）、または米国特許第４，８１６，５６７号明細書の文献を参照することができる。

更に詳細には、前記抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号４６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる配列のキメラ重鎖可変ドメインを含んでなる。
配列番号４６：ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＴＳＧＹＩＦＴＡＹＴＭＨＷＶＲＱＳＬＧＥＳＬＤＷＩＧＧＩＫＰＮＮＧＬＡＮＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＲＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＳＥＩＴＴＥＦＤＹＷＧＱＧＴＡＬＴＶＳＳ。

更に詳細には、前記抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４７のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号４７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる配列のキメラ軽鎖可変ドメインを含んでなる。
配列番号４７：ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＳＹＡＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＮＬＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＮＰＶＥＡＤＤＶＡＴＹＹＣＱＱＳＫＥＤＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＭＫＲ。

更に詳細には、本発明による［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２ｃｈｉｍ］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

本願明細書において、角括弧の使用は必要なく、例えば、［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２ｃｈｉｍ］という表示は２２４Ｇ１１ＩｇＧ２ｃｈｉｍと同一であると考えなければならない。同様に、抗体がネズミ抗体であることを示すには、ネズミという表現またはｍという文字を加えることができ、抗体がキメラ抗体であることを示すには、ｃｈｉｍという表現またはｃという文字を加えることができ、抗体がヒト化抗体であることを示すには、ｈｕｍ、ｈｚ、Ｈｚという表現またはｈという文字を加えることができる。一例として、キメラ抗体２２４Ｇ１１ＩｇＧ２は、ｃ２２４Ｇ１１ＩｇＧ２、ｃ２２４Ｇ１１［ＩｇＧ２］、ｃ［２２４Ｇ１１］ＩｇＧ２、ｃ［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２］、２２４Ｇ１１ＩｇＧ２ｃｈｉｍ、２２４Ｇ１１［ＩｇＧ２ｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］ＩｇＧ２ｃｈｉｍまたは［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２ｃｈｉｍ］と表すことができる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ｃｈｉｍ］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号２８のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

本願明細書において、表示ＴＨ７は、Ｃ７Δ６−９またはＴＨ７Ｃ７Δ６−９と同一であると考えなければならない。符号Δは欠失を意味する。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［ＭＨｃｈｉｍ］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号２３のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［ＭＵＰ９Ｈｃｈｉｍ］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号２６のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［ＭＭＣＨｃｈｉｍ］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号２４のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［Ｃ１］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号５８のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［Ｃ２］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号５９のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［Ｃ３］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号６０のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［Ｃ５］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号６１のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［Ｃ６］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号６２のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［Ｃ７］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号６３のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［Ｃ９］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号６４のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［Δ１−３］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号６５のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［Ｃ７Δ６］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号６６のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［Ｃ６Δ９］と命名された好ましい抗体またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号６７のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［Ｃ２Δ５−７］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号６８のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［Ｃ５Δ２−６］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号６９のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［Ｃ９Δ２−７］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号７０のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［Δ５−６−７−８］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号７１のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ１／ＩｇＧ２］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号４７のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号７２のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

本発明の抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、好ましくはヒト抗体からなる。

「ヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン配列由来の１以上の可変および定常領域を有するすべての抗体を包含する。好ましい実施形態では、すべての可変および定常ドメイン（または領域）は、ヒト免疫グロブリン配列（完全ヒト抗体）に由来する。換言すれば、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の（存在するとすれば）可変および定常領域を有する、すなわちヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するおよび／または当業者に知られているヒト抗体を作成する任意の手法を用いて作成されたアミノ酸配列を有する任意の抗体を包含する。

一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られる、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子と軽鎖導入遺伝子とを含んでなるゲノムを有するＢ細胞を包含するハイブリドーマによって産生される。

このようなトランスジェニックマウスの例としては、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きな断片を含んでなり、マウス抗体産生を欠いている遺伝子工学的処理をしたマウス系統であるＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^（商標）を挙げることができる（Green at al., 1994, Nature Genetics, 7:13-21）。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^（商標）は、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体を生成する。第二世代のＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^（商標）は、ヒト抗体レパートリーの約８０％を含んでいる（Green & Jakobovits, 1998, J. Exp. Med., 188:483-495）。

ファージディスプレー法のような当業者に知られている任意の他の手法を、本発明によるヒト抗体の生成に用いることもできる。

本発明の抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、好ましくはヒト化抗体からなっている。

「ヒト化抗体」という表現は、非ヒト起源の抗体由来のＣＤＲ領域を含む抗体であって、抗体分子の他の部分は１個（または数個）のヒト抗体に由来する抗体を示すことを意味する。更に、その骨格セグメント残基（ＦＲと呼ばれる）の幾つかは結合親和性を保存するために変更することができる（Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988）。

本発明によるヒト化抗体またはそれらの断片は、当業者に知られている手法によって調製することができる（例えば、文献Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992、Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992、またはBebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992に記載されているもの）。

他のヒト化法は当業者に知られており、例えば、特許出願ＥＰ０４５１２６１号明細書、ＥＰ０６８２０４０号明細書、ＥＰ０９１２７号明細書、ＥＰ０５６６６４７号明細書またはＵＳ５，５３０，１０１号明細書、ＵＳ６，１８０，３７０号明細書、ＵＳ５，５８５，０８９号明細書およびＵＳ５，６９３，７６１号明細書にＰｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂ（ＰＤＬ）によって記載された「ＣＤＲグラフティング」法である。下記の特許出願明細書も挙げることができる：ＵＳ５，６３９，６４１号明細書、ＵＳ６，０５４，２９７号明細書、ＵＳ５，８８６，１５２号明細書およびＵＳ５，８７７，２９３号明細書。

更に詳細には、前記抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる配列のヒト化重鎖可変ドメインまたは最適アラインメント後に配列番号４の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる。
配列番号４：ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＩＦＴＡＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＫＰＮＮＧＬＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＥＩＴＴＥＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ。

更に詳細には、前記抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体は、配列番号８、９または１０のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号８、９または１０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる配列の群から選択されるヒト化軽鎖可変ドメインを含んでなる。
配列番号８：ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＥＳＶＤＳＹＡＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＳＫＥＤＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ、
配列番号９：ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＥＳＶＤＳＹＡＮＳＦＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＳＫＥＤＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ、
配列番号１０：ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＥＳＶＤＳＹＡＮＳＦＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＲＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＳＫＥＤＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ。

更に詳細には、本発明による［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２Ｈｚ１］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２Ｈｚ２］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号９のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２Ｈｚ３］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号２２のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７Ｈｚ１］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号２８のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ｚ２］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号９のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号２８のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明による［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７Ｈｚ３］と命名された好ましい抗体、またはその二価の機能性断片もしくは誘導体は、配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン、および配列番号２８のアミノ酸配列を含んでなるヒンジ領域を含んでなる。

もう一つの態様では、本発明の抗体は、それぞれそれらの全重鎖および全軽鎖によって記載することができる。

例えば、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２ｃｈｉｍ］は、配列番号５０のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ｃｈｉｍ］は、配列番号５１のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［Ｃ１］は、配列番号８８のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号８８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［Ｃ２］は、配列番号８９のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号８９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［Ｃ３］は、配列番号９０のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号９０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［Ｃ５］は、配列番号９１のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号９１の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［Ｃ６］は、配列番号９２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号９２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［Ｃ７］は、配列番号９３のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号９３の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［Ｃ９］は、配列番号９４のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号９４の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［Δ１−３］は、配列番号９５のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号９５の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［Ｃ７Δ６］は、配列番号９６のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号９６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［Ｃ６Δ９］は、配列番号９７のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号９７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［Ｃ２Δ５−７］は、配列番号９８のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号９８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［Ｃ５Δ２−６］は、配列番号９９のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号９９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［Ｃ９Δ２−７］は、配列番号１００のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号１００の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［Δ５−６−７−８］は、配列番号１００のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号１００の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ１／ＩｇＧ２］は、配列番号１０２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号１０２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号５２のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号５２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２Ｈｚ１］は、配列番号３６のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号３６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号３８のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号３８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２Ｈｚ２］は、配列番号３６のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号３６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号３９のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号３９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２Ｈｚ３］は、配列番号３６のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号３６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号４０のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号４０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７Ｈｚ１］は、配列番号３７のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号３７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号３８のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号３８の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７Ｈｚ２］は、配列番号３７のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号３７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号３９のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号３９の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

もう一つの例としては、本発明の抗体［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７Ｈｚ３］は、配列番号３７のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号３７の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全重鎖、および配列番号４０のアミノ酸配列または最適アラインメント後に配列番号４０の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでなる完全軽鎖を含んでなる。

本発明による他の抗体またはその誘導体の例は、配列番号８８〜１０２（対応するヌクレオチド配列は、配列番号１０３〜１１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる完全重鎖を含んでなる。

本発明による抗体の「機能性断片」とは、詳細には、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃ：一本鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片または二重特異性抗体のような抗体断片、またはポリ（エチレン）グリコール（「ＰＥＧ化」）（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）_２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれるペグ化断片）（「ＰＥＧ」：ポリ（エチレン）グリコール）のようなポリ（アルキレン）グリコールの付加などの化学修飾によって、もしくはリポソームへの組込みによって半減期が増加された任意の断片を示すことを意味し、前記断片は、本発明による配列番号１〜３および５〜７の配列の特徴的なＣＤＲの少なくとも１つを有し、特に、一般的には、詳細にはｃ−Ｍｅｔを認識して結合し、必要な場合には、ｃ−Ｍｅｔの活性を阻害する能力のような、それが由来する抗体のたとえ部分的であっても活性を示すことができる。

好ましくは、前記機能性断片は、それらが由来する抗体の重または軽可変鎖の部分配列から構成されまたは含んでなり、前記部分配列は、それが由来する抗体と同一の結合特異性、およびｃ−Ｍｅｔに関して十分な親和性、好ましくは、それが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましくは少なくとも１／１０を保持するに十分なものである。このような機能性断片は、それが由来する抗体の配列の最低でも５つのアミノ酸、好ましくは６、７、８、９、１０、１２、１５、２５、５０および１００の連続するアミノ酸を含む。

好ましくは、これらの機能性断片は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ型または二重特異性抗体の断片であり、一般にそれらが由来する抗体と同じ結合特異性を有する。本発明の更に好ましい実施形態では、これらの断片はＦ（ａｂ’）_２断片のような二価の断片の中から選択される。
本発明によれば、本発明の抗体断片は、ペプシンまたはパパインのような酵素による消化および／または化学的還元によるジスルフィド橋の開裂による消化のような方法によって上記のような抗体から出発して得ることができる。もう一つの方法では、本発明に含まれる抗体断片は、同様に当業者に周知の遺伝子組換えの手法によって、または例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社などによって供給されるような自動ペプチド合成装置によるペプチド合成によって得ることができる。

「二価の断片」とは、２個のアームと、更に詳細にはＦ（ａｂ’）_２断片とを含んでなる任意の抗体断片と理解されねばならない。

本発明による抗体の「誘導体」とは、タンパク質スカフォールドと、結合能を保持するために元の抗体から選択される少なくとも１種のＣＤＲとを含んでなる結合タンパク質を意味する。このような化合物は当業者に周知であり、下記の明細書で更に詳細に説明される。

更に詳細には、本発明による抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体は、前記誘導体が元の抗体のパラトープ認識特性が保存されるように少なくとも１つのＣＤＲがグラフトされたスカフォールドを含んでなる結合タンパク質であることを特徴とする。

本発明に記載の６種のＣＤＲ配列中１または数種の配列は、タンパク質スカフォールド上に存在することができる。この場合、このタンパク質スカフォールドはグラフトされるＣＤＲの適当な折りたたみを有するタンパク質主鎖を再生するので、それらの抗原パラトープ認識特性を保持することができる。

当業者であれば、元の抗体から選択される少なくとも１つのＣＤＲをグラフトすることができるタンパク質スカフォールドを選択する方法を知っている。更に詳細には、選択されるこのようなスカフォールドは、下記のような幾つかの特徴を示すことが知られている（Skerra A., J. Mol. Recogn., 13, 2000, 167-187）：
系統発生的保存が良好なこと
周知の三次元分子構成を有する強固な構造（例えば、結晶学またはＮＭＲ）
サイズが小さいこと
転写後修飾がないかまたはごく僅かであること
産生、発現および精製が容易なこと。

このようなタンパク質スカフォールドは、限定なしに、フィブロネクチンおよび優先的には第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮｆｎ１０）、リポカリン、アンチカリン（Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4):257-75）、ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢ由来のプロテインＺ誘導体、チオレドキシンＡまたは「アンキリン反復」（Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No.4, 1700-1705）、「アルマジロ反復」、「ロイシンリッチ反復」または「テトラトリコペプチド反復」のような反復ドメインを有する任意のタンパク質からなる群から選択される構造であることができる。

毒素（例えば、サソリ、昆虫、植物、軟体動物毒素など）由来のスカフォールド、またはニューロン型一酸化窒素シンターゼのタンパク質阻害剤（ＰＩＮ）を挙げることもできる。

このようなハイブリッド構造の非限定的例としては、抗ＣＤ４抗体、すなわち１３Ｂ８．２抗体のＣＤＲ−Ｈ１（重鎖）のＰＩＮの露出したループの１つへの挿入を挙げることができる。得られた結合タンパク質の結合特性は、元の抗体と同様のままである（Bes et al., BBRC 343, 2006, 334-344）。ネオカルジノスタチンのループ上での抗リゾチームＶＨＨ抗体のＣＤＲ−Ｈ３（重鎖）のグラフトを挙げることもできる（Nicaise et al., 2004）。

上記のように、このようなタンパク質スカフォールドは、元の抗体由来の１〜６種のＣＤＲを含んでなることができる。好ましい実施形態では、何らの限定なしに、当業者であれば重鎖から少なくとも１つのＣＤＲを選択するであろうし、前記重鎖は特に抗体特異性に関係していることが知られている。目的とするＣＤＲの選択は、既知の方法によることが当業者には明らかであろう（BES et al., FEBS letters 508, 2001, 67-74）。

証拠として、これらの例は制限的ではなく、知られているまたは報告されている任意の他のスカフォールドを本明細書に包含しなければならない。

新規な態様によれば、本発明は、下記の核酸：
ａ） 本発明による抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体の１つをコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ、
ｂ） 配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３の配列と、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７の配列とを含んでなる核酸、
ｃ） 配列番号１４と、配列番号１８、１９または２０の配列とを含んでなる核酸配列、
ｄ） ｂ）またはｃ）で定義された核酸の対応するＲＮＡ核酸、
ｅ） ａ）、ｂ）およびｃ）で定義された核酸の相補性核酸、および
ｆ） 配列番号１１〜１３および１５〜１７の配列のＣＤＲの少なくとも１つと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも１８個のヌクレオチドの核酸
から選択されることを特徴とする単離核酸に関する。

更にもう一つの態様によれば、本発明は、下記の核酸：
本発明による抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体の１つをコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡであって、前記抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列が、配列番号２９〜３５および配列番号７３〜８７の配列からなる群から選択される配列を含んでなりまたは有するもの
から選択されることを特徴とする単離核酸に関する。

核酸、ヌクレイック（ｎｕｃｌｅｉｃ）または核酸配列、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列、本発明で同じように用いられる用語は、修飾または未修飾であり、核酸の断片または領域を画定することができ、非天然（ｕｎｎａｔｕｒａｌ）ヌクレオチドを含むまたは含まない、かつ二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ並びに前記ＤＮＡの転写産物にちょうど対応させることができるヌクレオチドの正確な連鎖を示すものと解釈される。

本明細書では、本発明は、天然染色体環境、すなわち天然状態でのヌクレオチド配列には関するものではないことも理解しなければならない。本発明は、単離されおよび／または精製された、すなわち、例えば、コピーによって直接または間接的に選択された配列に関するものであり、その配列の環境は少なくとも部分的に修飾されている。従って、同様に本明細書では、例えば宿主細胞の遺伝学組換えによって得られるまたは化学合成によって得られる単離核酸を示すものと解釈される。

高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、温度条件およびイオン濃度条件は、相補性ＤＮＡの２つの断片の間のハイブリダイゼーションを維持できるような方法で選択されることを示している。例えば、上記ポリヌクレオチド断片の画定を目的とするハイブリダイゼーション段階の高ストリンジェンシー条件は、有利には次の通りである。

ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、（１）５ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは、０．１５ＭＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液に相当する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、５％デキストラン硫酸および１％サケ***ＤＮＡを含むリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中で４２℃で、３時間の予備ハイブリダイゼーション、（２）プローブのサイズによって変化する温度（すなわち、プローブサイズ＞１００ヌクレオチドでは４２℃）で２０時間の実際のハイブリダイゼーションの後、２ｘＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中で２０℃、２０分間の２回の洗浄、０．１ｘＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で２０℃、２０分間の１回の洗浄の、２段階で行う。最後の洗浄は、０．１ｘＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中でプローブサイズ＞１００ヌクレオチドについては６０℃で３０分間行った。画定したサイズのポリヌクレオチドについて上記した高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．の教示（１９８９，分子クローニング：実験室便覧（Molecular cloning:a laboratory manual）．第２版，Cold Spring Harbor）に準じて、当業者は、一層大きなまたは一層小さなサイズのオリゴヌクレオチドに適合させることができる。

本発明は、本発明による核酸を含んでなるベクターにも関する。

本発明は、特に本発明によるヌクレオチド配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターを目的とする。

本発明によるベクターは、好ましくは決められた宿主細胞で翻訳されたヌクレオチド配列を発現および／または分泌することができる成分を含む。従って、ベクターは、プロモーター、翻訳の開始および終止シグナル、並びに適当な転写調節領域を含んでいなければならない。ベクターは、宿主細胞で安定的に保持されなければならず、かつ場合によっては翻訳タンパク質の分泌を指定する特定のシグナルを有することができる。これらの様々な成分は、用いられる宿主細胞の機能によって、当業者により選択され、最適化される。この趣意で、本発明によるヌクレオチド配列は、選択された宿主の自律性の複製ベクターに挿入することができ、または選択された宿主の組込みベクターであることができる。

このようなベクターは、当業者によって現在用いられている方法により調製され、得られるクローンをリポフェクション、電気穿孔、熱ショックまたは化学的方法のような標準的方法によって適当な宿主に導入することができる。

本発明によるベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。それらは、宿主細胞を形質転換し、本発明によるヌクレオチド配列をクローニングまたは発現させるのに有用である。

本発明は、本発明によるベクターによって形質転換されたまたはを含んでなる宿主細胞も含んでなる。

宿主細胞は、原核生物または真核生物系、例えば、細菌細胞、更には酵母細胞または動物細胞、詳細には哺乳類細胞から選択することができる。昆虫細胞または植物細胞を用いることもできる。

本発明は、本発明によって形質転換された少なくとも１つの細胞を含んでなるヒト以外の動物にも関する。

もう一つの態様によれば、本発明の主題は、本発明による抗体、またはその機能性断片の１つを産生する方法であって、下記の段階：
ａ） 培地および適当な培養条件での本発明による宿主細胞の培養、および
ｂ） 培地または前記培養細胞から出発して産生した前記抗体、またはそれらの機能性断片の１つの回収
を含んでなることを特徴とする方法である。

本発明による形質転換細胞は、本発明による組換えポリペプチドの調製方法に用いることができる。組換え形態での本発明によるポリペプチドの調製方法であって、ベクターおよび／または本発明によるベクターによって形質転換した細胞を用いることを特徴とする方法は、それら自身本発明に含まれる。好ましくは、本発明によるベクターによって形質転換した細胞は、前記ポリペプチドを発現させる条件下で培養され、前記組換えペプチドが回収される。

上記のように、宿主細胞は、原核生物または真核生物系から選択することができる。詳細には、本発明によるヌクレオチド配列を特定し、このような原核生物または真核生物系での分泌を促進することができる。従って、このような配列を有する本発明によるベクターは、分泌しようとする組換えタンパク質の産生に好都合に用いることができる。要するに、目的とするこれらの組換えタンパク質の精製は、宿主細胞の内部よりはむしろ細胞培養物の上清に含まれているという事実によって容易になる。

同様に、本発明によるポリペプチドを化学合成によって調製することもできる。このような調製方法も、同様に本発明の主題である。当業者であれば、化学合成の方法、例えば、固相を用いる手法［Steward et al.,1984,固相ペプチド合成（Solid phase peptide synthesis）， Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 第２版（１９８４）］または断片の縮合によるまたは溶液での古典的合成による部分固相を用いる手法を知っている。化学合成によって得ることができかつ対応する非天然アミノ酸を含むことができるポリペプチドも、本発明に包含される。

本発明による方法によって得ることができる抗体、またはそれらの機能性断片もしくは誘導体の１つも、同様に本発明に包含される。

本発明は、医薬としての本発明の抗体にも関する。

本発明は、また本発明による抗体、またはその機能性断片の１つからなる、好ましくは賦形剤および／または薬学上許容可能なビヒクルと混合した化合物を活性成分として含んでなる医薬組成物にも関する。

本発明のもう一つの補完的実施形態は、同時、単独または逐次使用の組合せ物として抗腫瘍抗体をさらに含んでなる上記のような組成物である。

最も好ましくは、前記第二の抗腫瘍抗体は、抗ＩＧＦ−ＩＲ、抗ＥＧＦＲ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗ＶＥＧＦＲ、抗ＶＥＧＦなど、当業者に知られている抗体または任意の他の抗腫瘍抗体から選択することができる。上記抗体の機能性断片または誘導体の第二の抗体としての使用が本発明の部分であることは明らかである。

最も好ましい抗体としては、例えば、抗体Ｃ２２５（アービタックス（Erbitux））のような抗ＥＧＦＲ抗体が選択される。

「同時使用」は、本発明による組成物の２種類の化合物を単一かつ同一医薬形態で投与する意味と理解される。

「単独使用」は、本発明による組成物の２種類の化合物を別個の医薬形態で同時に投与する意味と理解される。

「逐次使用」は、本発明による組成物の２種類の化合物をそれぞれ別個の医薬形態で連続的に投与する意味と理解される。

一般的やり方では、本発明による組成物は、癌の治療効果をかなり増加させる。換言すれば、本発明による抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の治療効果は、細胞傷害性剤の投与によって予想外に強化される。本発明による組成物によって得られるもう一つの主要なその後の利点は、活性成分を一層低めの有効用量で用いることが可能であり、副作用、特に細胞傷害性剤の効果が出現する危険性を回避しまたは減少させることができることに関する。

更に、本発明によるこの組成物は、予想される治療効果を一層速やかに達成することができる。

本発明の組成物は、同時、単独または逐次使用の組合せ物として細胞傷害性／細胞増殖抑制剤をさらに含んでなることも特徴とすることができる。

「抗癌治療剤」または「細胞傷害性／細胞増殖抑制剤」とは、被験者に投与したときに、被験者の身体における癌の発生を治療または予防する物質を意味する。このような薬剤の非制限的例としては、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、有糸***抑制因子、クロマチン機能阻害薬、抗血管新生薬、抗エストロゲン剤、抗アンドロゲン剤または免疫調節剤が挙げられる。

このような薬剤は、例えば、ＶＩＤＡＬの２００１年版に腫瘍学および血液学の欄「細胞傷害性」に添付された化合物に当てられた頁に引用され、この文献に引用されている細胞傷害性化合物は本明細書において好ましい細胞傷害性薬剤として引用される。

更に詳細には、下記の薬剤は、本発明に好ましい。

「アルキル化剤」とは、細胞内で任意の分子、好ましくは核酸（例えば、ＤＮＡ）を架橋またはアルキル化することができる任意の物質を指す。アルキル化剤の例としては、メクロレタミン、クロラムブシル（chloranbucol）、メルファラン（melaphalen）、クロロヒドレート（chlorydrate）、ピポブロマン（pipobromen）、プレドニムスチン、リン酸二ナトリウム（disodic−phospate）またはエストラムスチンなどのナイトロジェンマスタード；シクロホスファミド、アルトレタミン、トロフォスファミド、スルホホスファミドまたはイホスファミドなどのオキサザホスホリン（oxazophorin）；チオテパ、トリエチレンアミンまたはアルテトラミンなどのアジリジンまたはイミン−エチレン；カルムスチン、ストレプトゾシン、フォテムスチンまたはロムスチンなどのニトロソ尿素；ブスルファン、トレオスルファンまたはインプロスルファンなどのスルホン酸アルキル；ダカルバジンなどのトリアゼン；またはシスプラチン、オキサリプラチンもしくはカルボプラチンなどの白金複合体が挙げられる。

「代謝拮抗物質」は、ある種の活性、通常はＤＮＡ合成を妨げることによって細胞増殖および／または代謝を遮断する物質をいう。代謝拮抗物質の例としては、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、クロロデスオキシアデノシン、５−アザシチジン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコフォルマイシンおよびペントスタチンが挙げられる。

「抗腫瘍抗生物質」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質合成を防止または阻害することがある化合物をいう。抗腫瘍抗生物質の例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびプロカルバジンが挙げられる。

「有糸***抑制因子」は、細胞サイクルおよび有糸***の正常な進行を妨げる。一般に、パクリタキセルおよびドセタキセルなどの微小管阻害剤またはタキソイドは有糸***を阻害することができる。ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイドも、有糸***を阻害することができる。

「クロマチン機能阻害剤」または「トポイソメラーゼ阻害剤」は、トポイソメラーゼＩまたはトポイソメラーゼＩＩなどの、クロマチン形成タンパク質の正常な機能を阻害する物質をいう。クロマチン機能阻害剤の例としては、トポイソメラーゼＩとしては、トポテカンまたはイリノテカンのようなカンプトテシンおよびその誘導体；およびトポイソメラーゼＩＩとしては、エトポシド、エトポシドリン酸およびテニポシドが挙げられる。

「抗血管新生剤」とは、血管の成長を阻害する任意の薬剤、化合物、物質または因子をいう。抗血管新生剤の例としては、ラゾキシン、マリマスタット、バチマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、イロマスタット、ＣＧＳ−２７０２３Ａ、ハロフギノン、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、サリドマイド、ＣＤＣ５０１、ＤＭＸＡＡ、Ｌ−６５１５８２、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン−α、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチンおよびビタキシンが挙げられるが、これらに限定されない。

「抗エストロゲン剤」または「エストロゲン拮抗剤」とは、エストロゲンの作用を減少、拮抗または阻害する物質をいう。抗エストロゲン剤の例としては、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ヨードキシフェン、アナストロゾール、レトロゾールおよびエキセメスタンが挙げられる。

「抗アンドロゲン剤」または「アンドロゲン拮抗剤」とは、アンドロゲン作用を減少、拮抗または阻害する物質をいう。抗アンドロゲン剤の例としては、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、スピロノラクトン、シプロテロン酢酸、フィナステリドおよびシミチジンが挙げられる。

「免疫調節剤」は、免疫系を刺激する物質である。

免疫調節剤の例としては、インターフェロン、アルデスロイキン、ＯＣＴ−４３、デニロイキンディフィトックス（denileukin diflitox）およびインターロイキン−２のようなインターロイキン、タソネルミンのような腫瘍壊死因子、またはレンチナン、シゾフィラン、ロキニメックス、ピドチモド、ペガデマーゼ、チモペンチン、ポリＩ：Ｃもしくはレバミゾールと５−フルオロウラシルとの組合せのような他種の免疫調節剤が挙げられる。

更に詳細については、当業者であれば、「Association Francaise des Enseignants de Chimie Therapeutique」によって編集された「治療化学概論（Traite de chimie therapeutique）」という標題の便覧、第６巻、抗腫瘍薬と癌治療の展望（Medicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers）、ＴＥＣ＆ＤＯＣ刊、２００３年を参照することができる。

化学薬剤または細胞傷害性剤としては、例えば、ゲフィチニブまたはエルロチニブのようなすべてのキナーゼ阻害剤を挙げることもできる。

特に好ましい実施形態では、本発明による組合せ物としての前記組成物は、前記細胞傷害性剤が同時使用のために前記抗体に化学的にカップリングしていることを特徴とする。

前記細胞傷害性剤と本発明による前記抗体との間のカップリングを促進するには、特にカップリングを行う２つの化合物の間にポリエチレングリコールのようなポリ（アルキレン）グリコールあるいはアミノ酸などのスペーサー分子を導入し、またはもう一つの実施形態では、本発明による前記抗体と反応することができる機能が導入されている前記細胞傷害性剤の活性誘導体を用いることが可能である。これらのカップリング法は当業者に周知であり、本明細書の説明ではこれ以上詳細には説明しない。

本発明は、もう一つの態様では、前記抗体の少なくとも１つ、またはそれらの機能性断片もしくは誘導体の１つを細胞毒素および／または放射性元素と接合させることを特徴とする組成物に関する。

好ましくは、前記毒素または前記放射性元素は、ｃ−Ｍｅｔを発現する細胞の少なくとも１つの細胞活性を阻害することができ、更に好ましくは前記細胞の成長または増殖を防止し、特に前記細胞を完全に不活性化することができる。

また、好ましくは、前記毒素は腸内細菌毒素、特にシュードモナス外毒素Ａである。

放射性元素（または放射性同位元素）、好ましくは治療に用いられる抗体に接合したものは、γ線を放射する放射性同位元素であり、好ましくはヨウ素^１３１、イットリウム^９０、金^１９９、パラジウム^１００、銅^６７、ビスマス^２１７およびアンチモン^２１１である。βおよびα線を放射する放射性同位元素も、同様に治療に用いることができる。

本発明による少なくとも１つの抗体、またはその機能性断片の１つに接合した毒素または放射性元素は、前記毒素または前記放射性元素を前記の少なくとも１つの抗体に、特に結合分子を導入してまたは導入せずに２個の化合物の間の共有カップリングによって結合させる任意の手段を示すものと解釈される。

接合の成分のすべてまたは部分を化学（共有）、静電または非共有的に結合させる薬剤の中では、特にベンゾキノン、カルボジイミド、更に詳細にはＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチル−アミノプロピル］−カルボジイミド塩酸塩）、ジマレイミド、ジチオビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオ−アセテート（ＳＡＴＡ）、紫外線（Ｕ．Ｖ．）と反応する１以上のフェニルアジド基を有する架橋剤、および好ましくはＮ−［−４−（アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミド−イル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）を挙げることができる。

カップリングのもう一つの形態であって、特に放射性元素に対するものは、二官能価イオンキレート剤の使用であることができる。

これらのキレートの中では、金属、特に放射性金属、および免疫グロブリンを結合する目的で開発されたＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）から誘導されるキレートを挙げることができる。例えば、ＤＴＰＡおよびその誘導体は、炭素鎖上の様々な基によって置換し、リガンド−金属錯体の安定性および剛性を増加させることができる（Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991)；米国特許第４，８３１，１７５号明細書）。

例えば、遊離形態または金属イオンとの錯体形態のいずれかで薬および生物学で広汎に長期間使用されているジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびその誘導体は、金属イオンと安定なキレートを形成しかつ癌治療における放射免疫接合体の開発のため抗体などの治療または診断目的のタンパク質とカップリングする顕著な特徴を有する（Meases et al., 1984; Gansow et al., 1990）。

また、好ましくは、前記接合体を形成する本発明の少なくとも１つの抗体は、その機能性断片、特にｓｃＦｖ断片などそれらのＦｃ成分を切断した断片から選択される。

上記のように、本発明の好ましい実施形態では、前記細胞傷害性／細胞増殖抑制剤または前記毒素および／または放射性元素は、同時使用の目的で前記組成物の成分の少なくとも１つに化学的にカップリングされる。

本発明は、上記組成物を医薬として含んでなる。

本発明は、医薬の調製の目的で本発明による組成物の使用をさらに含んでなる。

もう一つの態様では、本発明は、腫瘍細胞の成長および／または増殖の阻害を目的とする医薬を調製するため上記した抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体の１つ、および／または組成物の使用を論じるものである。

本発明のもう一つの態様は、上記の抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体の１つおよび／または組成物の使用、または癌の予防もしくは治療を目的とする医薬を調製するための上記の使用である。

本発明には、本発明による抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体の１つ、本発明によるハイブリドーマによって産生された抗体、または本発明による組成物を、投与を必要とする患者に投与することを含んでなる、患者での腫瘍細胞の成長および／または増殖の阻害を目的とする方法も包含される。

本発明は、本発明による抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体の１つ、本発明によるハイブリドーマによって産生された抗体、または本発明による組成物を、患者に投与することを含んでなる、投与を必要とする患者での癌の予防または治療方法もさらに含んでなる。

特に好ましい態様では、前記癌は、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、神経膠芽腫または結腸癌から選択される癌である。

上記のように、本発明の利点は、ＨＧＦ依存性および非依存性のＭｅｔ活性化に関連した癌を治療できることである。

本発明は、更にもう一つの態様では、ｃ−Ｍｅｔ受容体の異常存在が疑われる生物試料から出発するｃ−Ｍｅｔ受容体の過剰発現または過小発現によって誘発される疾病のインビトロ診断の方法であって、前記生物試料を本発明の抗体と接触させる段階を含んでなり、必要ならば、前記抗体を標識することができることを特徴とする前記方法を包含する。

好ましくは、前記診断方法におけるｃ−Ｍｅｔ受容体の異常存在と関係している上記疾病は、癌である。

前記抗体、またはその機能性断片の１つは、免疫接合体または標識抗体の形態で存在して、検出可能なおよび／または定量可能なシグナルが得られるようにすることができる。

本発明によって標識した抗体またはそれらの機能性断片としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リソチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、またはグルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼのような酵素で、またはビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブロモデオキシウリジンのような分子によって接合させることができる免疫接合体と呼ばれる抗体が挙げられる。蛍光標識を本発明による抗体またはそれらの機能性断片に接合させることもでき、特にフルオレセインおよびその誘導体、フルオロクロム、ローダミンおよびその誘導体、ＧＦＰ（ＧＦＰ：「緑色蛍光タンパク質」）、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。このような接合体において、本発明の抗体またはそれらの機能性断片は、当業者に知られている方法によって調製することができる。それらは、直接またはグルタルアルデヒドのようなポリアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）などのスペーサー基または結合基の介在によって、または治療用接合体について上記したようなカップリング剤の存在下にて、酵素または蛍光標識にカップリングすることができる。フルオレセインタイプの標識を含む接合体は、イソチオシアネートとの反応によって調製することができる。

他の接合体は、ルミノールおよびジオキセタンなどの化学発光標識、ルシフェラーゼおよびルシフェリンなどの生物発光標識、またはヨウ素^１２３、ヨウ素^１２５、ヨウ素^１２６、ヨウ素^１３３、臭素^７７、テクネチウム^９９ｍ、インジウム^１１１、インジウム^１１３ｍ、ガリウム^５７、ガリウム^５８、ルテニウム^９５、ルテニウム^９７、ルテニウム^１０３、ルテニウム^１０５、水銀^１０７、水銀^２０３、レニウム^９９ｍ、レニウム^１０１、レニウム^１０５、スカンジウム^４７、テルル^１２１ｍ、テルル^１２２ｍ、テルル^１２５ｍ、ツリウム^１６５、ツリウム^１６７、ツリウム^１６８、フッ素^１８、イットリウム^１９９およびヨウ素^１３１などの放射性標識も含むことができる。治療用の放射性同位元素を直接または上記のＥＤＴＡもしくはＤＴＰＡなどのキレート剤を介して抗体に結合させるための当業者に知られている既存の方法は、診断に用いることができる放射性元素について使用することができる。同様に、クロラミンＴ法によるＮａ［Ｉ^１２５］［Hunter W.M. and Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495］、Ｃｒｏｃｋｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．の手法（米国特許第４，４２４，２００号明細書）によるテクネチウム^９９ｍ、またはＨｎａｔｏｗｉｃｈ（米国特許第４，４７９，９３０号明細書）により記載されているようなＤＴＰＡを介した標識を挙げることができる。

従って、本発明による抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体は、生物試料におけるｃ−Ｍｅｔ受容体の過剰発現または過小発現、好ましくは過剰発現の検出および／または定量の方法であって、下記の段階
ａ） 生物試料と本発明による抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体との接触、および
ｂ） ことによると形成されるｃ−Ｍｅｔ／抗体複合体の証明
を含んでなることを特徴とする、方法に用いることができる。

特定の実施形態では、本発明による抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体を、生物試料におけるｃ−Ｍｅｔ受容体の検出および／または定量の方法に用いて、ｃ−Ｍｅｔ−依存性癌の予防的および／または治療的処置の効果を観察することができる。

更に一般的には、本発明による抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体を、ｃ−Ｍｅｔ受容体の発現を定性的および／または定量的に観察しなければならない任意の状況に好都合に用いることができる。

好ましくは、生物試料は、血清、全血、細胞、組織試料またはヒトの生験材料などの生物学的流体によって形成される。

任意の手続きまたは通常試験を用いて、このような検出および／または投薬を行うことができる。前記試験は、競争またはサンドイッチ試験、または抗体−抗原タイプの免疫複合体の形成に依存している当業者に知られている任意の試験であることができる。本発明による適用の後で、抗体またはその機能性断片もしくは誘導体を固定または標識することができる。この固定は、当業者に知られている非常に多くの支持体上で行うことができる。これらの支持体としては、特にガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロンまたは天然または修飾細胞を挙げることができる。これらの支持体は、可溶性または不溶性であることもできる。

例えば、好ましい方法は、免疫蛍光またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法または準ずるものによるＥＬＩＳＡ法による免疫酵素法を利用している。

従って、本発明は、またｃ−Ｍｅｔ受容体の過剰発現または過小発現によって誘発される疾病の診断方法を行い、または生物試料におけるｃ−Ｍｅｔ受容体の過剰発現または過小発現、好ましくは前記受容体の過剰発現の検出および／または定量の方法を行うのに必要なキットまたはセットを含んでなり、前記キットまたはセットは、下記の成分：
ａ） 本発明による抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体、
ｂ） 場合によっては、免疫反応に好都合な媒質の形成のための試薬、
ｃ） 場合によっては、免疫反応によって産生したｃ−Ｍｅｔ／抗体複合体を証明することができる試薬
を含んでなることを特徴とする。

本発明の主題は、またｃ−Ｍｅｔ受容体を発現または過剰発現する細胞への生物活性化合物の特異的ターゲッティングを目的とする医薬を調製するための本発明による抗体または組成物の使用である。

本明細書では、生物活性化合物は、細胞活性、詳細にはそれらの成長、それらの増殖、転写または遺伝子翻訳を調節、特に阻害することができる任意の化合物を示すものと解釈される。

本発明の主題は、また本発明による抗体、またはその機能性断片もしくは誘導体であって、好ましくは標識され、特に放射能標識されたものを含んでなるインビボ診断試薬、および医療画像化における、詳細にはｃ−Ｍｅｔ受容体の細胞による発現または過剰発現と関係した癌を検出するための、その使用である。

本発明は、更に組合せ物としての組成物、または医薬としての本発明による抗ｃ−Ｍｅｔ／毒素接合体または放射性元素にも関する。

好ましくは、組合せ物としての前記組成物または本発明による前記接合体は、賦形剤および／または薬学上許容可能なビヒクルと混合される。

本発明の説明では、薬学上許容可能なビヒクルは、副作用を誘発しない医薬組成物に入り、例えば、活性化合物の投与を促進し、体内におけるその寿命および／または効力を増加させ、溶液でのその溶解度を増加させ、あるいはその保存を向上させることができる化合物または化合物の組合せを示すものと解釈される。これらの薬学上許容可能なビヒクルは周知のものであり、選択される活性化合物の性質および投与様式の機能に応じて当業者によって馴化される。

好ましくは、これらの化合物は、全身経路によって、詳細には静脈内経路によって、筋肉内、皮内、腹腔内または皮下経路によって、または経口経路によって投与される。更に好ましくは、本発明による抗体を含んでなる組成物は、連続的に数回投与される。

それらの投与様式、投薬量および最適医薬形態は、例えば、患者の年齢または体重、患者の一般的健康状態の重さ、治療および注目される副作用に対する耐性など患者に適合した治療の確立を一般に考慮した基準によって決定することができる。

本発明の他の特徴および利点は、実施例および図面による説明に継続して現れる。

Ａ５４９細胞上でのｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化に対する無関連のマウスおよびヒト起源のＩｇＧ１ＭａｂおよびＰＢＳの効果。 図２Ａおよび２Ｂ：Ａ５４９細胞上でのｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化に対するヒトＩｇＧ１／κアイソタイプとして生成したネズミおよびヒト化２２４Ｇ１１Ｍａｂの効果。図２Ａ：ＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］によるｃ−Ｍｅｔリン酸化の最大刺激に対する割合として計算した作動薬効果。図２Ｂ：ＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］によるｃ−Ｍｅｔリン酸化の最大刺激の阻害率として計算した拮抗薬効果。 図３Ａおよび３Ｂ：Ａ５４９細胞上でのｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化に対するネズミ２２４Ｇ１１Ｍａｂおよび様々な遺伝子工学処理したヒンジ領域を含むキメラ２２４Ｇ１１Ｍａｂの比較。図３Ａ：ＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］によるｃ−Ｍｅｔリン酸化の最大刺激に対する割合として計算した作動薬効果。図３Ｂ：ＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］によるｃ−Ｍｅｔリン酸化の最大刺激の阻害率として計算した拮抗薬効果。 図４Ａおよび４Ｂ：Ａ５４９細胞上でのｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化に対するネズミ２２４Ｇ１１ＭａｂおよびヒトＩｇＧ２／κアイソタイプとして産生したキメラおよびヒト化２２４Ｇ１１Ｍａｂの比較。図４Ａ：ＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］によるｃ−Ｍｅｔリン酸化の最大刺激に対する割合として計算した作動薬効果。図４Ｂ：ＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］によるｃ−Ｍｅｔリン酸化の最大刺激の阻害率として計算した拮抗薬効果。 図５Ａおよび５Ｂ：Ａ５４９細胞上でのｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化に対するネズミ２２４Ｇ１１Ｍａｂおよび遺伝子工学処理したヒンジ変異体ＴＨ７ＩｇＧ１／κとして産生したキメラおよびヒト化２２４Ｇ１１Ｍａｂの比較。図５Ａ：ＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］によるｃ−Ｍｅｔリン酸化の最大刺激に対する割合として計算した作動薬効果。図５Ｂ：ＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］によるｃ−Ｍｅｔリン酸化の最大刺激の阻害率として計算した拮抗薬効果。 図６Ａおよび６Ｂ：図Ａ：ｃ−Ｍｅｔ二量体化モデル、および図Ｂ：ｃ−Ｍｅｔ活性化モデルを用いるＢＲＥＴモデル。 図７Ａおよび７Ｂ：図Ａ：ｃ−Ｍｅｔ二量体化モデル、および図Ｂ：ｃ−Ｍｅｔ活性化モデルを用いるＢＲＥＴモデル。 図８Ａおよび８Ｂ：図Ａ：ｃ−Ｍｅｔ二量体化モデル、および図Ｂ：ｃ−Ｍｅｔ活性化モデルを用いるＢＲＥＴモデル。 図９Ａおよび９Ｂ：図Ａ：ｃ−Ｍｅｔ二量体化モデル、および図Ｂ：ｃ−Ｍｅｔ活性化モデルを用いるＢＲＥＴモデル。 図１０Ａおよび１０Ｂ：図Ａ：ｃ−Ｍｅｔ二量体化モデル、および図Ｂ：ｃ−Ｍｅｔ活性化モデルを用いるＢＲＥＴモデル。 キメラおよびヒト化２２４Ｇ１１形態によって認識されるｃ−Ｍｅｔ。 インビトロでのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞のＨＧＦ誘発増殖に対するネズミおよびキメラ抗体の効果。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞は、無血清培地で培養した。２４時間培養後、ｍ２２４Ｇ１１および［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍを、ＨＧＦの非存在下または存在下にて加えた。黒矢印は、ＨＧＦの非存在下（左下向き矢印）または存在下（右下向き矢印）における細胞のみを培養したウェルを示す。ネズミＩｇＧ１（ｍＩｇＧ１）を、アイソタイプコントロールとして導入した。 ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルに対するネズミおよびＩｇＧ１キメラ２２４Ｇ１１Ｍａｂのインビトロ比較。 図１４Ａおよび１４Ｂ：インビトロでのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞のＨＧＦ誘発増殖に対するネズミ２２４Ｇ１１Ｍａｂおよびこの抗体の様々なキメラおよびヒト化バージョンの効果。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞は、無血清培地で培養した。２４時間培養後、試験を行う抗体をＨＧＦの非存在下または存在下にて加えた。パネル（図１４Ａ）に、ネズミｍ２２４Ｇ１１、キメラＩｇＧ１［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ、ヒト化ＩｇＧ１［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ１］、［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ２］、［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ３］バージョンを示した。パネル（図１４Ｂ）に、ネズミｍ２２４Ｇ１１および様々なキメラＩｇＧ１形態（［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ、［２２４Ｇ１１］［ＭＨｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＵＰ９Ｈｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＭＣＨｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ｃｈｉｍ］）を示した。黒矢印は、ＨＧＦの非存在下（左下向き矢印）または存在下（右下向き矢印）における細胞のみを培養したウェルを示す。ネズミＩｇＧ１を、作動薬活性についての負のコントロールとして導入した。ｍ５Ｄ５を、用量−依存性の完全な作動薬コントロールとして用いた。 インビトロでのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞のＨＧＦ誘発増殖に対するネズミ２２４Ｇ１１Ｍａｂおよびこの抗体の様々なキメラおよびヒト化バージョンの効果。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞は、無血清培地で培養した。２４時間培養後、試験を行う抗体をＨＧＦの非存在下または存在下にて加えた。ネズミｍ２２４Ｇ１１、［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ｃｈｉｍ］）ＩｇＧ１キメラ形態および［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７Ｈｚ１］、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７Ｈｚ３］）を示した。黒矢印は、ＨＧＦの非存在下（左下向き矢印）または存在下（右下向き矢印）における細胞のみを培養したウェルを示す。ネズミＩｇＧ１を、作動薬活性についての負のコントロールとして導入した。ｍ５Ｄ５を、用量−依存性の完全な作動薬コントロールとして用いた。 ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルに対するネズミ、キメラおよびヒト化２２４Ｇ１１Ｍａｂのインビボでの比較。 図１７Ａ：ＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］によるｃ−Ｍｅｔリン酸化の最大刺激に対する割合として計算した作動薬効果。図１７Ｂ：ＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］によるｃ−Ｍｅｔリン酸化の最大刺激の阻害率として計算した拮抗薬効果。 ｃ−Ｍｅｔ活性化モデルを用いるＢＲＥＴモデル。 Ａ５４９細胞上でのｃ−Ｍｅｔ分解に対するｍ２２４Ｇ１１およびｈ２２４Ｇ１１の効果。Ａ）４つの非依存性実験の平均値 ＋／−ｓ．ｅ．ｍ．（標準誤差） Ｂ）行った４つの非依存性実験の典型的なウェスタンブロットイメージ。 ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞上でのｃ−Ｍｅｔ分解に対するｍ２２４Ｇ１１およびｈ２２４Ｇ１１の効果。Ａ）４つの非依存性実験の平均値＋／−ｓ．ｅ．ｍ． Ｂ）行った４つの非依存性実験の典型的なウェスタンブロットイメージ。 ｃ−Ｍｅｔシェディング（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を評価するためのＥＬＩＳＡのセットアップ。 ｍ２２４Ｇ１１で５日間処理したＮＣＩ−Ｈ４４１細胞でのｃ−Ｍｅｔシェディングのインビトロ評価。ｍＩｇＧ１は、アイソタイプコントロールとして用いた無関連の抗体である。 ｍ２２４Ｇ１１で５日間処理した増幅Ｈｓ７４６Ｔ、ＭＫＮ４５およびＥＢＣ−１細胞系でのｃ−Ｍｅｔシェディングのインビトロ評価。ｍＩｇＧ１は、アイソタイプコントロールとして用いた無関連の抗体である。ＰＭＡは、正のコントロールとして用いたシェディング誘発因子である。 ｍ２２４Ｇ１１で５日間処理したＮＣＩ−Ｈ４４１および増幅Ｈｓ７４６Ｔ、ＭＫＮ４５およびＥＢＣ−１細胞系でのｃ−Ｍｅｔシェディングのインビトロ評価。ｍＩｇＧ１は、アイソタイプコントロールとして用いた無関連の抗体である。ＰＭＡは、正のコントロールとして用いたシェディング誘発因子である。 Ｈｓ７４６Ｔ細胞系でのｈ２２４Ｇ１１の固有のリン酸化の検討。 ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞系でのｈ２２４Ｇ１１の固有のリン酸化の検討。Ａ）ホスホ−ＥＬＩＳＡ、およびＢ）ウェスタンブロット分析。 Ｈｓ５７８Ｔ細胞系でのｈ２２４Ｇ１１の固有のリン酸化の検討。Ａ）ホスホ−ＥＬＩＳＡ、およびＢ）ウェスタンブロット分析。 ＮＣＩ−Ｈ１２５細胞系でのｈ２２４Ｇ１１の固有のリン酸化の検討。Ａ）ホスホ−ＥＬＩＳＡ、およびＢ）ウェスタンブロット分析。 Ｔ９８Ｇ細胞系でのｈ２２４Ｇ１１の固有のリン酸化の検討。Ａ）ホスホ−ＥＬＩＳＡ、およびＢ）ウェスタンブロット分析。 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系でのｈ２２４Ｇ１１の固有のリン酸化の検討。Ａ）ホスホ−ＥＬＩＳＡ、およびＢ）ウェスタンブロット分析。 ＰＣ３細胞系でのｈ２２４Ｇ１１の固有のリン酸化の検討。Ａ）ホスホ−ＥＬＩＳＡ、およびＢ）ウェスタンブロット分析。 ＨＵＶＥＣ細胞でのｈ２２４Ｇ１１の固有のリン酸化の検討。 ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルでの、野生型ネズミ２２４Ｇ１１抗体と、キメラヒンジ−遺伝子工学処理した２２４Ｇ１１［Ｃ２Ｄ５−７］Ｍａｂとのインビボ比較。 Ｈｓ７４６ＴおよびＮＣＩ−Ｈ４４１細胞でのｈ２２４Ｇ１１によるＡＤＣＣ誘導。ｈ２２４Ｇ１１を装填した（黒四角）または装填していない（白四角）^５１Ｃｒ標識した（Ａ）Ｈｓ７４６Ｔまたは（Ｂ）ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を、様々な比率のヒトＮＫ細胞と混合し、４時間インキュベーションした。細胞を回収して、ライシス（lysis）によって溶出された^５１Ｃｒのｃｐｍを計測した。結果は、エフェクター／ターゲット細胞比に対するライシスの割合としてプロットしている。ＮＬ：非装填細胞。 様々なレベルのｃ−Ｍｅｔを発現した腫瘍異種移植片でのｈ２２４Ｇ１１染色（Ａ：ｃ−ＭｅｔについてのＨｓ７４６Ｔ増幅細胞系、Ｂ：ＮＣＩ−Ｈ４４１高レベルのｃ−Ｍｅｔ発現、およびＣ：ＭＣＦ−７低レベルのｃ−Ｍｅｔ）。

例１：ｃ−Ｍｅｔに対する抗体の生成
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を生成させるために、８週齢のＢＡＬＢ／ｃを、ＣＨＯの細胞膜上にｃ−Ｍｅｔを発現するトランスフェクションしたＣＨＯ細胞系（２０ｘ１０^６個／用量／マウス）で３〜５回皮下免疫し、または最初の免疫には完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントと、また引き続く免疫には不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバントと、混合したｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメイン融合タンパク質（１０〜１５μｇ／用量／マウス）(R&D Systems,Catalog #358MT)またはこの組換えタンパク質の断片を２〜３回皮下に免疫した。マウスにＣＨＯ−ｃＭｅｔ細胞と組換えタンパク質との両方を投与した混合プロトコルも行った。細胞融合の３日前に、マウスに組換えタンパク質または断片をｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．で追加免疫した。次いで、マウスの脾臓を回収してＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ATCC）に融合させ、ＨＡＴ選択を行った。４回の融合を行った。一般に、モノクローナル抗体またはそれらの機能性断片、特にネズミ起源のものの調製には、マニュアル「抗体」(Harlow and Lane,抗体：実験室マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に詳細に記載されている手法、またはＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ(Nature, 256:495-497, 1975)によって報告されているハイブリドーマの調製手法を参照することができる。

得られたハイブリドーマを、最初にｃ−Ｍｅｔ組換えタンパク質上でＥＬＩＳＡによってスクリーニングした後、Ａ５４９ＮＳＣＬＣ、ＢｘＰＣ３膵臓、およびＵ８７−ＭＧ神経膠芽腫細胞系上でＦＡＣＳ分析によってスクリーニングし、産生した抗体は腫瘍細胞上の本来の受容体を認識することもできることを確かめた。これら２種類の試験で陽性反応を示すものを増幅して、クローニングし、１セットのハイブリドーマを回収して、精製し、ＢｘＰＣ３モデルにおけるインビトロでの細胞増殖を阻害するその能力についてスクリーニングした。

その目的のために、５０，０００個のＢｘＰＣ３細胞を、９６穴プレートで２ｍＭＬ−グルタミンを補足しＳＶＦを含まないＲＰＭＩ培地で培養した。２４時間の培養後、試験を行う抗体を、０．００９７〜４０μｇ／ｍｌの最終濃度でｈＨＧＦ１００ｎｇ／ｍｌの添加の６０分前に添加した。３日後に、細胞を［^３Ｈ］チミジン０．５μＣｉで１６時間パルス標識した。トリクロロ酢酸不溶性ＤＮＡに組込まれた［^３Ｈ］チミジンの大きさを、液体シンチレーションカウンティングによって定量した。結果を、それぞれのＭａｂの本質的な作動薬効果を実際に評価するために生データーとして表した。

次いで、少なくとも５０％細胞増殖を阻害する抗体を、ｃ−Ｍｅｔ二量体化に対するそれらの活性およびトランスフェクション細胞に対する活性化ＢＲＥＴ分析について評価した。ｃ−Ｍｅｔ受容体活性を、活性化ｃ−Ｍｅｔに対するＧａｂ１シグナル伝達分子増加を測定することによって定量した。その目的のために、ｃ−Ｍｅｔ二量体化のためにＣ−Ｍｅｔ−ＲｌｕｃまたはＣ−Ｍｅｔ−ＲｌｕｃとＣ−Ｍｅｔ−Ｋ１１００Ａ−ＹＦＰとを発現するＣＨＯ安定細胞系、またはｃ−Ｍｅｔ活性化のためにＣ−Ｍｅｔ−ＲｌｕｃとＹＦＰに融合したＧａｂ１の突然変異形態とを発現するＣＨＯ安定細胞系［Maroun et al., Mol. Cell. Biol., 1999, 19:1784-1799］を生成した。細胞を、白色の９６穴マイクロプレート中のＤＭＥＭ−Ｆ１２／ＦＢＳ５％培養培地にＢＲＥＴ実験の１または２日前に分配した。細胞を最初に５％ＣＯ_２で３７℃にて培養して、細胞をプレートに接着させた。次に、細胞を２００μｌＤＭＥＭ／ウェルで一晩飢餓状態に置いた。実験の直前に、ＤＭＥＭを除去し、細胞をすばやくＰＢＳで洗浄した。細胞を、試験を行う抗体または参照化合物の存在または非存在下において３７℃にてＰＢＳ中で１０分間インキュベーションした後、ＨＧＦを含むまたは含まないコエレンテラジンを５０μｌの最終容積で添加した。３７℃で更に１０分間インキュベーションした後、４８５ｎｍおよび５３０ｎｍにおける発光取得(light-emission acquisition)を、Ｍｉｔｈｒａｓルミノメーター(Berthold)を用いて開始した（１ｓ／波長／ウェル １５回反復）。

ＢＲＥＴ比は、以前に［（５３０ｎｍにおける発光）−（４８５ｎｍにおける発光）×Ｃｆ］／（４８５ｎｍにおける発光）（上記式中、Ｃｆは、同一実験条件でＲｌｕｃ融合タンパク質のみを発現する細胞についての（５３０ｎｍにおける発光）／（４８５ｎｍにおける発光）に相当する）として定義されている［Angers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:3684-3689］。この方程式を簡略化すると、ＢＲＥＴ比は、Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼに融合したパートナーだけがアッセイに存在するときに同一実験条件下で得られた比５３０／４８５ｎｍによって補正された、２つのパートナーが存在するときに得られた比５３０／４８５ｎｍに相当することを示している。理解しやすくするため、結果をミリＢＲＥＴ単位（ｍＢＵ）で表しており、ｍＢＵはＢＲＥＴ比に１０００を乗じたものに相当する。

この第二のインビトロ試験の後、ｉ）増殖の機能試験において全分子として固有活性を持たない、ｉｉ）ＢｘＰＣ３増殖を有意に阻害する、およびｉｉｉ）ｃ−Ｍｅｔ二量体化を阻害する抗体２２４Ｇ１１を選択した。実験では、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ製でありかつＡＴＣＣで入手可能な５Ｄ５Ｍａｂを、固有作動薬活性に対するコントロールとして添加した。

例２：ＣＤＲ−移植によるマウス２２４Ｇ１１Ｍａｂのヒト化工程
１°）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のヒト化
予備段階として、２２４Ｇ１１ＶＬのヌクレオチド配列をＩＭＧＴデーターベース（http://imgt.cines.fr）に含まれるネズミの生殖細胞系遺伝子配列と比較した。それぞれ、Ｖ領域について９９．３１％およびＪ領域について９４．２８％の配列同一性を示すネズミＩＧＫＶ３−５^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０１生殖細胞系遺伝子を同定した。これらの高い相同性に関して、対応するマウス生殖細胞系の代わりに２２４Ｇ１１ＶＬヌクレオチド配列を用いて、直接ヒト相同性を調査した。

第二段階では、２２４Ｇ１１ＶＬと最高の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を調査して、ＣＤＲ移植のための最良のヒト候補を同定した。選択を最適にするため、アミノ酸配列間のアラインメントを行った。ヒトＩＧＫＶ４−１^＊０１生殖細胞系遺伝子では、配列同一性は６７．３０％となったが、ＣＤＲ１については異なる長さを示した（２２４Ｇ１１ＶＬでは１０アミノ酸、およびＩＧＫＶ４−１^＊０１では１２アミノ酸）。Ｊ領域については、ヒトＩＧＫＪ４^＊０２生殖細胞系遺伝子（配列同一性７７．１４％）を選択した。

次の段階では、マウス２２４Ｇ１１ＶＬのＣＤＲ領域を、上記で選択したヒトフレームワーク配列に移植した。それぞれのアミノ酸位置を、ＶＨ／ＶＬ界面、抗原結合またはＣＤＲ構造における関与、可変ドメインの３Ｄ構造における残基の局在化、ＣＤＲアンカー、Ｖｅｒｎｉｅｒゾーンに属する残基のような幾つかの基準について分析した。配列番号８、配列番号９および配列番号１０に対応し、ＦＲ領域およびマウス２２４Ｇ１１ＶＬに対応するＣＤＲにそれぞれ４つ（４、３９、４０、８４）、２つ（３９、４０）または１つ（４０）のネズミ残基を含む３種類のヒト化バージョンを構築した。

２°）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のヒト化
予備段階として、２２４Ｇ１１ＶＨのヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴデーターベース（http://imgt.cines.fr）に含まれるネズミの生殖細胞系遺伝子配列と比較した。

それぞれ、Ｖ領域について９２．７０％、Ｄ領域について７５．００％およびＪ領域について８９．３６％の配列同一性を有するネズミＩＧＨＶ１−１８^＊０１、ＩＧＨＤ２−４^＊０１およびＩＧＨＪ２^＊０１生殖細胞系遺伝子を同定した。対応するマウス生殖細胞系の代わりに、これらの高い相同性に関して、２２４Ｇ１１ＶＨヌクレオチド配列を直接用いてヒト相同性を検索することに決定した。

第二段階では、２２４Ｇ１１ＶＨと最良の同一性を示すヒト生殖細胞系遺伝子を検索して、ＣＤＲ移植のための最良のヒト候補を同定した。この目的のため、２２４Ｇ１１ＶＨのヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴデーターベースに属するヒト生殖細胞系遺伝子配列と共にアライメントした。ヒトＩＧＨＶ１−２^＊０２Ｖ配列は、ヌクレオチドレベルでは７５．００％およびアミノ酸レベルでは６４．３０％の配列同一性を示した。Ｊ領域についての相同性の検索では、ヒトＩＧＨＪ４^＊０４生殖細胞系遺伝子が７８．７２％の配列同一性で同定された。

次の段階では、マウス２２４Ｇ１１ＶＨＣＤＲ領域を、上記で選択されたヒトフレームワーク配列に移植した。それぞれのアミノ酸位置を、ＶＨ／ＶＬ界面、抗原結合またはＣＤＲ構造における関与、可変ドメインの３Ｄ構造における残基の局在化、ＣＤＲアンカー、Ｖｅｒｎｉｅｒゾーンに属する残基のような幾つかの基準について分析した。配列番号４に対応する１つの完全にヒト化形態を構築し、これは、ＦＲ領域およびマウス２２４Ｇ１１ＶＨに対応するＣＤＲに全くヒト残基のみを含む。

例３：改良されたヒンジ変異体の遺伝子工学処理
ヒンジ領域は、免疫グロブリンの可変ドメインの柔軟性に強力に関与していることは、当業者に周知である（Brekke et al., 1995; Roux et al., 1997を参照）。２２４Ｇ１１Ｍａｂのキメラ化工程中に、マウス定常ドメインＩＧＨＧ１をヒト起源の同等なＩＧＨＧ１部分で置換した。ヒンジ領域のアミノ酸配列は高度に分岐していたので、ヒンジ領域の「ネズミ化(murinization)」を行ってその長さと剛性を保持した。ヒトＩＧＨＧ２ヒンジ領域は、マウスＩＧＨＧ１ヒンジの最も近い相同物に対応しているので、この配列も同様に考慮した。マウスＩＧＨＧ１およびヒトＩＧＨＧ２ヒンジの部分をヒトＩＧＨＧ１ヒンジ部分に組込むことによって、一連の７種類のヒンジ配列を構築した（配列番号２２〜２８）。

もう一つの一連のヒンジ変異体をデザインして構築し（配列番号５８〜７２）、付加システインおよびヒンジドメインに沿ったその位置、ヒンジドメインに沿った１、２、３または４つのアミノ酸の欠失、およびこれら２つのパラメーターの組合せ（システイン付加およびアミノ酸欠失）の影響を評価した。

例４：ヒト化２２４Ｇ１１Ｍａｂおよび遺伝子工学処理したヒンジＭａｂフォーマットの産生
キメラ、ヒト化および／または遺伝子工学処理したヒンジ領域を含むすべての上記Ｍａｂ形態を、一過性トランスフェクションおよびｐＣＥＰ４発現ベクターを有するＨＥＫ２９３／ＥＢＮＡ系を用いることによって産生した（InVitrogen,米国）。

２２４Ｇ１１Ｍａｂ軽鎖（配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０）および重鎖（配列番号１４）の可変ドメインのヒト化バージョンに対応する全ヌクレオチド配列を、包括的遺伝子合成によって合成した（Genecust,ルクセンブルグ）。それらを、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２免疫グロブリンの定常ドメイン［ＣＨ１−Ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３］の全コード配列を有するｐＣＥＰ４ベクター（InVitrogen,米国）にサブクローニングした。ヒンジ領域の修飾を、｛Ｎｈｅ１Ｉ−Ｂｃｌ１｝制限断片を所望な修飾を有する同等な部分に交換することによって行い、それぞれの｛Ｎｈｅ１−Ｂｃｌ１｝断片は包括的遺伝子合成によって合成した（Genecust,ルクセンブルグ）。すべてのクローニング段階は、実験室マニュアル(Sambrook and Russel, 2001)に記載の通常の分子生物学の手法によってまたは供給業者の指示に従って行った。それぞれの遺伝子構築物は、Ｂｉｇ Ｄｙｅターミネーターサイクルシークエンシングキット（Applied Biosystems,米国）を用いるヌクレオチドシークエンシングによって完全に確認し、３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems,米国）を用いて分析した。

懸濁液に馴化したＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（InVitrogen,米国)は、オービタルシェーカー（１１０ｒｐｍ回転速度）上で２５０ｍｌフラスコ中の６ｍＭグルタミンを補足した５０ｍｌの無血清培地Ｅｘｃｅｌｌ２９３(SAFC Biosciences)で日常的に増殖した。一過性トランスフェクションは、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で混合した水中で調製した線状の２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ）(Polysciences)およびプラスミドＤＮＡ（重鎖対軽鎖プラスミド比１：１に対して最終濃度１．２５μｇ／ｍｌ）を用いて２×１０^６細胞／ｍｌで行った。トランスフェクションの４時間後に、培養物を１容の新鮮な培養培地で希釈し、最終細胞密度１０^６細胞／ｍｌを達成した。培養工程は、細胞生育力およびＭａｂ産生に基づいて観察した。典型的には、培養物を４〜５日間保持した。Ｍａｂは、プロテインＡ樹脂（GE Healthcare,米国）上で通常のクロマトグラフィー法を用いて精製した。

すべての様々な形態のＭａｂは、機能評価に適したレベルで産生した。生産性レベルは、典型的には１５〜３０ｍｇ／ｌの精製Ｍａｂである。

例５：ホスホ−ｃ−Ｍｅｔ特異的ＥＬＩＳＡアッセイによるｃ−Ｍｅｔリン酸化状態の評価
この機能アッセイにより、ＭａｂのみによるまたはＨＧＦの共存におけるｃ−Ｍｅｔリン酸化状態の変化を観察することができる。

Ａ５４９細胞を、１２ＭＷプレートの完全増殖培地［Ｆ１２Ｋ＋１０％ＦＣＳ］に播種した。細胞をＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］で刺激する前に１６時間飢餓状態に置き、試験を行うそれぞれのＭａｂを、リガンド刺激の１５分前に３０μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。ＨＧＦ添加の１５分後に氷冷ライシスバッファーを加えて、リン酸化反応を停止した。細胞を機械的に掻き出し、細胞溶解物を１３，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間の遠心分離によって集め、細胞溶解物は上清相に相当する。タンパク質含量をＢＣＡキット(Pierce)を用いて定量し、使用まで−２０℃で保管した。ｃ−Ｍｅｔのリン酸化状態を、ＥＬＩＳＡによって定量した。ヤギ抗ｃ−ＭｅｔＭａｂ（R&D,参照番号ＡＦ２７６）をキャプチャー抗体として用い（４℃で一晩コーティング）、ＴＢＳ−ＢＳＡ５％緩衝液による飽和段階（室温（ＲＴ）で１時間）の後、タンパク質溶解物２５μｇを、コーティングを施した９６ＭＷプレートのそれぞれのウェルに加えた。ＲＴで９０分間インキュベーションの後、プレートを４回洗浄し、検出抗体を加えた（抗ホスホ−ｃ−ＭｅｔＭａｂ；１２３０、１２３４および１２３５位のリン酸化Ｔｙｒ残基に対する）。更に１時間インキュベーションして４回洗浄した後、ＨＲＰ(Biosource)にカップリングした抗ウサギ抗体を室温で１時間加え、発光検出を、ルミノールを加えることによって行った。発光は、Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９２０マルチモードプレートリーダー(Berthold)上で読み取った。

基底およびＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］誘発ｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化レベルはいずれも、ＰＢＳ処理によってもまたは付加ヒトｃ−Ｍｅｔ受容体をターゲットとしないマウスまたはヒトＭａｂの添加によっても影響を受けなかった（図１）。一方、マウス（ｍ）２２４Ｇ１１Ｍａｂは、ＨＧＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］誘発ｃ−Ｍｅｔリン酸化を強力に阻害したが（図２Ｂ）、それだけで受容体リン酸化を変更しなかった（図２Ａ）。驚くべきことには、ヒト定常ドメインＩｇＧ１／κと組み合わさったｍ２２４Ｇ１１由来の可変ドメイン（ＶＨ＋ＶＬ）を意味するキメラ形態の２２４Ｇ１１Ｍａｂ（２２４Ｇ１１ｃｈｉｍ／ＩｇＧ１）は、減少した拮抗薬効力と関連した強力な作動薬活性（最大ＨＧＦ効果１７％、図２Ａ）を生じた（ＨＧＦ最大効果を７５％阻害するｍ２２４Ｇ１１と比較して、ＨＧＦ最大効果を５４％阻害、図２Ｂ）。またヒトＩｇＧ１／κ主鎖上で構築された２２４Ｇ１１Ｍａｂの３種類のヒト化形態である［２２４Ｇ１１］Ｈｚ１／ＩｇＧ１、［２２４Ｇ１１］Ｈｚ２／ＩｇＧ１および［２２４Ｇ１１］Ｈｚ３／ＩｇＧ１も、マウス２２４Ｇ１１と比較して減少した拮抗薬効果と有意な作動薬活性（最大ＨＧＦレベルの１１〜２４％）を生じた（図２Ａおよび２Ｂ）。重鎖ヒンジドメインの一連の遺伝子工学処理したバージョンを構築し、ｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化アッセイを行った。図３Ａに示されるように、ｈＩｇＧ１／κアイソタイプと関連した作動薬効果の著しい減少がＩｇＧ２ベースの構築物と遺伝子工学処理したＩｇＧ１／κ構築物［ＭＨ、ＭＵＰ９ＨおよびＴＨ７］のいずれについても観察された。拮抗薬効果も、付随して増加した。最高のヒト配列を有するｈＩｇＧ１／κベースのＴＨ７ヒンジ変異体を選択して、ヒト化工程を完成した。次の段階で、２２４Ｇ１１Ｍａｂ可変ドメインの３種類のヒト化バージョンを、ヒトＩｇＧ２／κまたはＩｇＧ１／κベースのＴＨ７遺伝子工学処理したヒンジ定常ドメインに組み合わせることによって作成した。ｈＩｇＧ２／κヒト化構築物については、ヒト化バージョンＨｚ３は強力なアゴニズムを示し（図４Ａ）、３種類すべてのヒト化バージョンについては、拮抗薬効果はネズミ２２４Ｇ１１Ｍａｂで観察されたものより低く、およびキメラｈＩｇＧ１ベースのＭａｂに匹敵した（ＨＧＦ効果の阻害５６〜５７％、図４Ｂ）。一方、３種類のヒト化バージョンＨｚ１、Ｈｚ２またはＨｚ３と遺伝子工学処理したＩｇＧ１／ＴＨ７変異体の組合せは、ｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化の弱い作動薬活性（５〜６％のＨＧＦ効果）および強力な拮抗薬効果（ＨＧＦ効果の阻害６８〜７２％）に関してマウス２２４Ｇ１１Ｍａｂの特性をほぼ完全に回復した（図５Ａおよび５Ｂ）。これらの変異体は、キメラＩｇＧ１ベースの２２４Ｇ１１Ｍａｂと比較して高度に改良されていたが、ＩｇＧ２ベースのヒト化形態と比較しても高度に改良されていた。

第二の一連の重鎖ヒンジドメインの遺伝子工学処理したバージョンを構築し、ｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化アッセイを行った。図１７Ａに示されるように、すべての新たなバージョン（ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ２］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ３］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ５］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ６］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ７］、ｃ２２４Ｇ１１［Δ１−３］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ７Δ６］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ６Δ９］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ２Δ５−７］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ５Δ２−６］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ９Δ２−７］およびｃ２２４Ｇ１１［Δ５−６−７−８］）は、それらのアゴニズム活性がｃ２２４Ｇ１１についての２３％と比較してＨＧＦ効果の６〜１４％の間にあるので、ｃ２２４Ｇ１１より弱い作動薬効果を示した。ｃ２２４Ｇ１１［ＴＨ７］として、すべての新たなバージョンでは拮抗薬効果が付随して増加した［図１７Ｂ］。これらの結果は、点突然変異および／または欠失による重鎖ドメインの遺伝子工学処理は抗体の作動薬／拮抗薬特性を変更する可能性があることを示していた。

例６：ＢＲＥＴ分析
最初のセットの実験では、無関連のマウスＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ２は、いずれのＢＲＥＴモデルでもＨＧＦ誘発ＢＲＥＴシグナルの効果を持たなかった（１２回の独立した実験からの典型的実験；図６）。これらのＭａｂを、直ちにコントロールとして引用する。

マウス２２４Ｇ１１ＭａｂのＩｇＧ１キメラ形態（［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ）のｃ−Ｍｅｔ二量体化およびｃ−ｍｅｔ活性化ＢＲＥＴモデルに対する効果を評価した。マウス２２４Ｇ１１Ｍａｂは、ｃ−Ｍｅｔ二量体化モデルではＨＧＦ誘発ＢＲＥＴシグナルの５９．４％を阻害したが、［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍＭａｂは２８．９％しか阻害しなかった（図７Ａ）。［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍおよびｍ２２４Ｇ１１抗体はＨＧＦ誘発ＢＲＥＴシグナルをそれぞれ３４．５％および５６．４％阻害した（図７Ｂ）ので、［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ抗体はＨＧＦ誘発ｃ−Ｍｅｔ活性化の阻害にも余り有効ではなかった。更に、［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍはｃ−Ｍｅｔ活性化に対してＨＧＦ誘発シグナルの３２．９％に対応する部分作動薬効果を有したが、ｍ２２４Ｇ１１単独ではｃ−Ｍｅｔ活性化に全く効果がなかった。ｍ２２４Ｇ１１については２１．３％であったのに対して［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ単独ではＨＧＦ誘発シグナルの４６．６％に対応するＢＲＥＴ増加を誘発したので、この［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍの部分作動薬効果はｃ−Ｍｅｔ二量体化ＢＲＥＴモデルでも見られた（図７Ａ）。

図８Ａおよび８Ｂにおいて、２２４Ｇ１１抗体のヒンジが突然変異したキメラ形態は、それぞれ［２２４Ｇ１１］［ＭＨｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＵＰ９Ｈｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＭＣＨｃｈｉｍ］および［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ｃｈｉｍ］についてＨＧＦ誘発活性化ＢＲＥＴシグナルを５９．７％、６４．４％、５３．２％および７３．８％阻害し（図８Ｂ）、ＨＧＦ誘発ｃ−Ｍｅｔ二量体化ＢＲＥＴシグナルを６１．８％、６４．４％、５２．５％および６４．４％阻害した（図８Ａ）ので、ＨＧＦ誘発ＢＲＥＴシグナルに対して［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍよりも大きな阻害効果を示した。ｃ−Ｍｅｔ活性化に対して部分作動薬効果を有する［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍとは逆に、２２４Ｇ１１抗体のヒンジが突然変異したキメラ形態は、ｍ２２４Ｇ１１について見られるようにｃ−Ｍｅｔ活性化単独に対しては有意な効果を示さなかった（それぞれ５．１％、７．６％、−２．０％および−６．９％）。

図９Ｂでは、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ｃｈｉｍ］と同様に、ＴＨ７ヒンジを有する２２４Ｇ１１ＩｇＧ１抗体の３種類のヒト化バージョンは、単独で試験したときには活性化モデルにＢＲＥＴシグナルの有意な増加を誘発せず、ＨＧＦ誘発ＢＲＥＴシグナルを強力に阻害した：Ｈｚ１、Ｈｚ２およびＨｚ３形態について、それぞれ５９．９％、４１．８％および５７．９％。更に、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７Ｈｚ１］、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７Ｈｚ２］および［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７Ｈｚ３］は、二量体化モデルではＨＧＦ誘発ＢＲＥＴシグナルを、それぞれ５２．２％、３５．８％および４９．４％阻害した（図９Ａ）。

［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍとは逆に、２２４Ｇ１１ＩｇＧ２抗体のキメラ形態（［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２ｃｈｉｍ］）は、単独では部分作動薬効果示さず、ｃ−Ｍｅｔ活性化モデルではＨＧＦ効果の６６．３％を阻害した（図１０Ｂ）。ｃ−Ｍｅｔ二量体化モデルでは、［２２４Ｇ１１］［ＩｇＧ２ｃｈｉｍ］は、ＨＧＦ誘発ＢＲＥＴシグナルの６２．４％を阻害した（図１０Ａ）。

重鎖ヒンジドメインの遺伝子工学処理したバージョンの第二の一連の作動薬効果を、ｃ−Ｍｅｔ活性化ＢＲＥＴモデルで評価した（図１８）。ｃ−Ｍｅｔ活性化についての部分作動薬効果を有するｃ２２４Ｇ１１とは対照的に、２２４Ｇ１１抗体のｃ２２４Ｇ１１［Ｃ２］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ３］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ５］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ６］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ７］、ｃ２２４Ｇ１１［Δ１−３］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ７Δ６］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ６Δ９］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ２Δ５−７］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ５Δ２−６］、ｃ２２４Ｇ１１［Ｃ９Δ２−７］およびｃ２２４Ｇ１１［Δ５−６−７−８］ヒンジが突然変異したキメラ形態は、ｃ−Ｍｅｔ活性化単独については有意な効果を示さなかった。

例７：キメラおよびヒト化２２４Ｇ１１形態によるｃ−Ｍｅｔ認識
直接ＥＬＩＳＡを開始し、組換えｃ−Ｍｅｔ上での様々なキメラおよびヒト化形態の結合能を決定した。簡単に説明すれば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製の組換え二量体性ｃ−Ｍｅｔを、９６穴のＩｍｍｕｎｌｏｎ ＩＩプレート上に１．２５μｇ／ｍｌでコーティングした。４℃で一晩インキュベーションした後、ウェルを０．５％ゼラチン／ＰＢＳ溶液で飽和した。次いで、プレートを３７℃で１時間インキュベーションした後、試験を行う抗体の２倍希釈液を加えた。プレートを更に１時間インキュベーションした後、ネズミの抗体を検出するためのヤギ抗マウスＩｇＧＨＲＰと、キメラおよびヒト化抗体認識のためのヤギ抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰを加えた。プレートを１時間インキュベーションし、ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢＵｐｔｉｍａを加え、５分後に１ＭＨ_２ＳＯ_４で中和した。図１１に示した結果は、すべての試験形態はｃ−Ｍｅｔ認識について類似していることを示していた。

例８：インビトロでのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞のＨＧＦ誘発増殖に対するネズミおよびキメラ２２４Ｇ１１の効果
ＡＴＣＣのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen Corporation, Scotland,英国）、１０％ＦＣＳ(Invitrogen Corporation)、１％Ｌ−グルタミン(Invitrogen corporation)中で常法により培養した。増殖アッセイのため、細胞を使用の３日前に継代し、プレートに播種する前に増殖のコンフルエント期になるようにした。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を、９６穴組織培養プレートで２００μｌの無血清培地（ＲＰＭＩ１６４０培地＋１％Ｌ−グルタミン）中で３．７５ｘ１０^４細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間の培養後、試験を行う抗体をＮＣＩ−Ｈ４４１に加え、３７℃で３０分間インキュベーションした後、ＨＧＦを４００ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）の最終濃度で更に１４２時間加えた。それぞれの抗体について試験した用量は、１０〜０．００９７μｇ／ｍｌ（それぞれのウェルでの最終濃度）の範囲である。この実験において、ネズミＩｇＧ１Ｍａｂをネズミアイソタイプコントロールとして加え、試験した抗体は下記のものであった：ｍ２２４Ｇ１１およびそのヒトＩｇＧ１キメラ形態であって、［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍとして同定されたもの。細胞単独−／＋ＨＧＦで培養したウェルも包含された。次いで、細胞を、［^３Ｈ］チミジン（Amersham Biosciences AB, Uppsala,スウェーデン）０．２５μＣｉで７時間および３０分間パルス標識した。トリクロロ酢酸不溶性のＤＮＡに取り込まれた［^３Ｈ］チミジンの大きさを、液体シンチレーションカウンティングによって定量した。結果は、未変換ｃｐｍデーターとして表しており、腫瘍細胞に抗ｃ−ＭｅｔＭａｂを単独で加えたときに起こり得る潜在的な固有作動薬活性を一層良好に評価できる。

図１２に示した結果は、予想されるように、ネズミ抗体ｍ２２４Ｇ１１は、癌細胞に単独で加えたときには、試験用量がいくらであっても作動薬効果を示さなかった。この実験でこの化合物について観察されたｃｐｍ変動に関するアイソタイプコントロールでは、ＨＧＦ誘発増殖の有意な阻害は観察されなかった。ｍ２２４Ｇ１１抗体を単独で加えたときには、ｍＩｇＧ１アイソタイプコントロールＭａｂまたは細胞単独と比較して作動薬効果を全く示さなかった。７８％に達する用量依存性抗増殖活性が、ｍ２２４Ｇ１１について見られた（阻害％の計算：１００−［（試験細胞＋Ｍａｂのｃｐｍ−バックグラウンドｍＩｇＧ１の平均ｃｐｍ）×１００／（細胞＋ＨＧＦの平均ｃｐｍ−細胞単独の平均ｃｐｍ）］）。驚くべきことには、２２４Ｇ１１Ｍａｂのキメラ形態を単独で加えたときには、有意な用量依存性作動薬効果を誘発した。この作動薬効果は、インビトロでのＨＧＦ誘発増殖阻害に影響し、ネズミ２２４Ｇ１１についての７８％からそのキメラ形態についての５０％へと変化した。このような「低め」のインビトロでの固有作動薬活性が、未変化のインビボ効果と互換性があるかどうかを決定するため、ｍ２２４Ｇ１１および［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍの両方をインビボ試験のために産生した。上記検討では、３０μｇ／マウスの用量は有意なインビボ活性を示したので、その用量をインビボ評価に選択した。

例９：ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルでのネズミおよびキメラ２２４Ｇ１１Ｍａｂのインビボ比較
ＮＣＩ−Ｈ４４１は、乳頭状肺腺癌に由来し、高レベルｃ−Ｍｅｔを発現し、ｃ−ＭｅｔＲＴＫの構成性リン酸化を示す。

ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルでの抗体のインビボ効果を評価するため、６〜８週齢の無胸腺マウスを滅菌フィルターを頂部に取り付けたケージに収容し、無菌条件に保持し、仏国および欧州指針に準じて操作した。マウスに、９ｘ１０^６個の細胞を皮下投与した。次いで、細胞移植の６日後に、腫瘍は測定可能となり（約１００ｍｍ^３）、動物を類似した腫瘍サイズの６尾のマウスの群に分け、最初に抗体／マウスを６０μｇの初回量で投与し、次いで週２回それぞれの試験抗体を３０μｇ／用量で投与した。マウスを、異種移植片増殖速度の観察のために追跡した。腫瘍体積は、式：π（パイ）／６×長さ×幅×高さによって計算した。図１３に示した結果は、作動薬活性を欠いているネズミＭａｂは、予想されるように、インビボでは低試験用量であっても強力な拮抗薬として機能することを示している。ネズミＭａｂで見られたのとは対照的に、キメラ抗体は、大変一過性のインビボ活性を示し、腫瘍は細胞接種後２０日で治療を完全に免れた。この実験は、拮抗薬活性の減少を生じるインビトロでの作動薬効果の増加も、インビボでの拮抗薬活性の有意な喪失に関与していることを明らかに示している。

例１０：ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞のインビトロでのＨＧＦ誘発増殖に対するネズミ２２４Ｇ１１Ｍａｂならびにこの抗体の様々なキメラおよびヒト化バージョンの効果
ＡＴＣＣのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen Corporation, Scotland,英国）、１０％ＦＣＳ(Invitrogen Corporation)、１％Ｌ−グルタミン(Invitrogen corporation)中で常法により培養した。増殖アッセイのため、細胞を使用の３日前に継代し、プレートに播種する前に増殖のコンフルエント期になるようにした。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を、９６穴組織培養プレートで２００μｌの無血清培地（ＲＰＭＩ１６４０培地＋１％Ｌ−グルタミン）中で３．７５ｘ１０^４細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間の培養後、試験を行う抗体をＮＣＩ−Ｈ４４１に加え、３７℃で３０分間インキュベーションした後、ＨＧＦを４００ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）の最終濃度で更に１４２時間で加えた。それぞれの抗体について試験した用量は、１０〜０．００９７μｇ／ｍｌ（それぞれのウェルでの最終濃度）の範囲である。この実験において、ネズミＩｇＧ１Ｍａｂをネズミアイソタイプコントロールとしておよび作動薬の負のコントロールとして加えた。試験した抗体は下記のものであった：ｉ）ｍ２２４Ｇ１１、ｉｉ）それぞれ、［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ、［２２４Ｇ１１］［ＭＨｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＵＰ９Ｈｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＭＣＨｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ｃｈｉｍ］として同定されるそのヒトＩｇＧ１キメラ形態、ｉｉｉ）それぞれ、［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ１］、［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ２］、［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ３］と表されるそのヒト化ＩｇＧ１形態。細胞単独−／＋ＨＧＦで培養したウェルも包含された。ハイブリドーマ細胞系としてＡＴＣＣで入手可能なＧｅｎｅｔｅｃｈ製の５Ｄ５全長（whole）抗体を、完全作動薬の正のコントロールとして導入し、その後ｍ５Ｄ５と命名した。次いで、細胞を、［^３Ｈ］チミジン（Amersham Biosciences AB, Uppsala,スウェーデン）０．２５μＣｉで７時間および３０分間パルス標識した。トリクロロ酢酸不溶性のＤＮＡに取り込まれた［^３Ｈ］チミジンの大きさを、液体シンチレーションカウンティングによって定量した。結果は、未変換ｃｐｍデーターとして表しており、腫瘍細胞に抗ｃ−ＭｅｔＭａｂを単独で加えたときに起こり得る潜在的な固有作動薬活性を一層良好に評価できる。

図１４Ａに記載の結果は、予想された通り、アイソタイプコントロールまたはｍ２２４Ｇ１１のいずれもＮＣＩ−Ｈ４４１増殖に対して作動薬活性を全く示さないことを示していた。アイソタイプコントロールはＨＧＦ誘発細胞増殖に対して効果が見られなかったが、ｍ２２４Ｇ１１は、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で加えたときには６６％阻害を示した。作動薬コントロールとして用いたｍ５Ｄ５は、予想されたように、単独で細胞に加えたときには完全な用量依存性作動薬効果を示した。既に観察されているように、［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍＭａｂは有意な用量依存性作動薬効果を示し、このキメラ形態の阻害活性は、ネズミ形態についての６６％の代わりに１９％と減少した。単独で加えると、３種類のＩｇＧ１ヒト化Ｍａｂは、ｍ２２４Ｇ１１形態と比較して用量依存性作動薬効果を示した。［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ１］、［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ２］および［２２４Ｇ１１］［Ｈｚ３］は、約４６、３０および３５％の類似する拮抗薬活性を示した。これらの活性は、ｍ２２４Ｇ１１について見られた活性より有意に低い。図１４Ｂでは、様々なＩｇＧ１キメラ形態を試験した。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞に単独で加えたときに用量依存性作動薬効果を示した［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ形態と比較して、［２２４Ｇ１１］［ＭＨｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＵＰ９Ｈｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＭＣＨｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ｃｈｉｍ］形態は有意な固有作動薬効果を持たなかった。それらの拮抗薬活性は、ｍ２２４Ｇ１１Ｍａｂ（５７％）について見られたものより高く、［２２４Ｇ１１］［ＭＨｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＵＰ９Ｈｃｈｉｍ］、［２２４Ｇ１１］［ＭＭＣＨｃｈｉｍ］および［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ｃｈｉｍ］について阻害はそれぞれ７９、７８、８４および９３％に達した。

例１１：２２４Ｇ１１Ｍａｂの様々なＩｇＧ１ヒト化形態のインビトロ効果
ＡＴＣＣのＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen Corporation, Scotland,英国）、１０％ＦＣＳ(Invitrogen Corporation)、１％Ｌ−グルタミン(Invitrogen corporation)中で常法により培養した。増殖アッセイのため、細胞を使用の３日前に継代し、プレートに播種するに増殖のコンフルエント期になるようにした。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を、９６穴組織培養プレートで２００μｌの無血清培地（ＲＰＭＩ１６４０培地＋１％Ｌ−グルタミン）中で３．７５ｘ１０^４細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間の培養後、試験を行う抗体をＮＣＩ−Ｈ４４１に加え、３７℃で３０分間インキュベーションした後、ＨＧＦを４００ｎｇ／ｍｌ（５ｎＭ）の最終濃度で更に１４２時間で加えた。それぞれの抗体について試験した用量は、１０〜０．００９７μｇ／ｍｌ（それぞれのウェルでの最終濃度）の範囲である。この実験において、作動薬活性についてのネズミＩｇＧ１Ｍａｂをバックグラウンドの負のコントロールとして加え、試験した抗体は下記のものであった：ｉ）ｍ２２４Ｇ１１、ｉｉ）それぞれ、［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍ、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ｃｈｉｍ］として同定されたそのヒトＩｇＧ１キメラ形態、ｉｉｉ）それぞれ、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７Ｈｚ１］、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７Ｈｚ３］と表されるそのヒト化ＩｇＧ１形態。細胞単独−／＋ＨＧＦで培養したウェルも包含された。ハイブリドーマ細胞系としてＡＴＣＣから入手可能なＧｅｎｅｔｅｃｈ製の５Ｄ５全長抗体を、完全作動薬の正のコントロールとして導入し、その後ｍ５Ｄ５と命名した。次いで、細胞を、［^３Ｈ］チミジン（Amersham Biosciences AB, Uppsala,スウェーデン）０．２５μＣｉで７時間および３０分間パルス標識した。トリクロロ酢酸不溶性のＤＮＡに取り込まれた［^３Ｈ］チミジンの大きさを、液体シンチレーションカウンティングによって定量した。結果は、未変換ｃｐｍデーターとして表しており、腫瘍細胞に抗ｃ−ＭｅｔＭａｂを単独で加えたときに起こり得る潜在的な固有作動薬活性を一層良好に評価できる。

図１５は、ｍ２２４Ｇ１１Ｍａｂが通常の阻害効果（７４％阻害）を示したことを示していた。キメラＩｇＧ１形態［２２４Ｇ１１］ｃｈｉｍは、予想されたように、用量依存性の固有作動薬効果、およびネズミ形態と比較して低めの拮抗薬効果を示した：７４％阻害に対して３３％。［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ｃｈｉｍ］は、この実験では極めて弱い作動薬活性を有した。しかしながら、それは、ネズミＭａｂについて見られたものに近い高い阻害効果（８１％）を示した。２種類のヒト化形態は、固有作動薬効果を持たず、またネズミＭａｂまたは［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７ｃｈｉｍ］について見られたものに近い拮抗薬活性を有しており、［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７Ｈｚ１］および［２２４Ｇ１１］［ＴＨ７Ｈｚ３］についてはそれぞれ６７および７６％阻害であった。

例１２：野生型またはＴＨ７−遺伝子工学処理したヒンジ（ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデル）を有するネズミ、キメラおよびヒト化２２４Ｇ１１Ｍａｂのインビボ比較
ＮＣＩ−Ｈ４４１は、乳頭状肺腺癌由来であり、高レベルのｃ−Ｍｅｔを発現し、ｃ−ＭｅｔＲＴＫの構成的リン酸化を明らかにしている。

２２４Ｇ１１ネズミの抗体のインビボ活性をセーブするためのヒンジの遺伝子工学処理の必要性を評価するため、６〜８週齢の無胸腺マウスを滅菌フィルターを頂部に取り付けたケージに収容し、無菌条件に保持し、仏国および欧州指針に準じて操作した。マウスに、９ｘ１０^６個の細胞を皮下接種した。次いで、細胞移植の６日後に、腫瘍は測定可能となり（約１００ｍｍ^３）、動物を類似した腫瘍サイズの６尾のマウスの群に分け、最初に抗体／マウスを２ｍｇの初回量で投与し、次いで週２回それぞれの試験抗体を１ｍｇ／用量で投与した。ｍ２２４Ｇ１１、野生型ヒンジ（ｃ２２４Ｇ１１）を示すキメラ形態、ＴＨ７遺伝子工学処理キメラ形態（２２４Ｇ１１［ＴＨ７ｃｈｉｍ］）、野生型ヒンジを有する３種類のヒト化形態（２２４Ｇ１１［ＩｇＧ１Ｈｚ１］、２２４Ｇ１１［ＩｇＧ１Ｈｚ２］および２２４Ｇ１１［ＩｇＧ１Ｈｚ３］）、および３種類の対応するＴＨ７−遺伝子工学処理形態（２２４Ｇ１１［ＴＨ７Ｈｚ１］、２２４Ｇ１１［ＴＨ７Ｈｚ２］および２２４Ｇ１１［ＴＨ７Ｈｚ３］）を含む１０種類の抗体を、この実験で評価した。マウスを、異種移植片増殖速度の観察のために追跡した。

腫瘍体積は、式：π（パイ）／６×長さ×幅×高さによって計算した。

図１６に示した結果は、作動薬活性を欠いているネズミＭａｂは、予想されるように、インビボでは強力な拮抗薬として機能することを示している。ネズミＭａｂで見られたのとは対照的に、野生型ヒンジを有するキメラおよびヒト化抗体はいずれも、大変一過性のインビボ活性のみを示した。いずれにせよ、野生型ヒンジをＴＨ７遺伝子工学処理したものに代えることによって、ネズミ抗体で見られたインビボ活性が完全に回復した。この実験は、拮抗薬活性の減少を生じるインビトロでの作動薬効果の増加も、インビボでの拮抗薬活性の有意な喪失に関与していることを明らかに示している。ネズミＭａｂのインビボ特性を保持するには、野生型の代わりにＴＨ７遺伝子工学処理領域が必要であることも示している。

例１３：インビトロでのｃ−Ｍｅｔダウンレギュレーションに対するｍ２２４Ｇ１１およびそのヒト化形態ｈ２２４Ｇ１１の効果
下記の例では、紛らわしさを回避するため、ｈ２２４Ｇ１１という表現は、本発明の抗体のヒト化形態２２４Ｇ１１［ＴＨ７Ｈｚ３］を指す。

ｃ−Ｍｅｔ受容体分解に対する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の活性を検討するために、２種類の細胞系を選択した。Ａ５４９（＃ＨＴＢ−１７４）およびＮＣＩ−Ｈ４４１（＃ＣＣＬ−１８５）は、ＡＴＣＣコレクションからの２種類のＮＳＣＬＣ細胞系である。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を、６穴プレートで、ＲＰＭＩ１６４０＋１％Ｌ−グルタミン＋１０％の熱不活性化したＦＢＳ中に、３ｘ１０^４細胞／ｃｍ^２で、３７℃にて５％ＣＯ_２雰囲気中で２４時間播種した。Ａ５４９細胞を、６穴プレートで、Ｆ１２Ｋ＋１０％の熱不活性化したＦＢＳ中に、２ｘ１０^４細胞／ｃｍ^２で、３７℃にて５％ＣＯ_２雰囲気中で２４時間播種した。

次いで、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて２回洗浄した後、更に２４時間血清飢餓状態とした。抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（１０μｇ／ｍｌ）、無関連のｍＩｇＧ１（１０μｇ／ｍｌ）、またはＨＧＦ（４００ｎｇ／ｍＬ）を、無血清ＤＭＥＭ培地に３７℃で加えた。４時間または２４時間インキュベーションした後、培地を徐々に除き、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、５００μｌの氷冷ライシスバッファー［５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１５０ｍＭＮａＣｌ；１％ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０；０．５％デオキシコール酸；および１錠の完全プロテアーゼ阻害剤カクテル＋１％アンチホスファターゼ］で溶解した。細胞溶解物を４℃で９０分間振盪し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。この段階において、細胞溶解物をウェスタンブロット分析で必要とされるまで−２０℃で保管することができた。タンパク質濃度は、ＢＣＡを用いて定量した。全細胞溶解物（２０μｌ中５μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を０．１％ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）；５％乾燥脱脂粉乳で室温にて１時間飽和し、ＴＢＳＴ−５％乾燥脱脂粉乳中で４℃にて抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（希釈度１／１０００）で反応させた。抗体は、１％乾燥脱脂粉乳を含むトリス緩衝食塩水−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）（ＴＢＳＴ）で希釈した。次いで、膜をＴＢＳＴで洗浄し、ペルオキシダーゼ接合二次抗体（希釈度１：１０００）と共に室温で１時間インキュベーションした。免疫反応性タンパク質を、ＥＣＬ(Pierce # 32209)で可視化した。ｃ−Ｍｅｔ可視化の後、膜を再度ＴＢＳＴで洗浄し、ＴＢＳＴ−５％乾燥脱脂粉乳中でマウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（希釈度１／２０００００）と共にＲＴで１時間インキュベーションした。次いで、膜をＴＢＳＴで洗浄し、ペルオキシダーゼ接合二次抗体と共に室温で１時間インキュベーションした。膜を洗浄し、ＧＡＰＤＨを、ＥＣＬを用いて明らかにした。バンド強度は、デンシトメトリーによって定量した。

図１９Ａおよび２０Ａに示した結果は、ｍ２２４Ｇ１１およびｈ２２４Ｇ１１はＡ５４９およびＮＣＩ−Ｈ４４１細胞系のいずれにおいても用量依存的にｃ−Ｍｅｔを有意に下降調節することができることを示していた。この下降調節は４時間のインキュベーション時間後には既に有意であり、２４時間後更に増加した。図１９Ａおよび２０Ａに示したヒトスグラムは、それぞれ４および３回の独立した実験の平均値に相当する。１つの有意な実験に対応するウェスタンブロット分析画像を、図１９Ｂおよび２０Ｂに包含させた。

例１４：インビトロでのｃ−Ｍｅｔシェディングに対するｍ２２４Ｇ１１およびそのヒト化形態ｈ２２４Ｇ１１の効果
ｃ−Ｍｅｔ受容体の可溶性シェディング形態は、天然ではヒト腫瘍を異種移植したマウスの血清またはｃ−Ｍｅｔを発現している腫瘍を有するヒト患者の血清に見られる。更に、ＤＮ３０Ｍａｂのようなｃ−Ｍｅｔに対する抗体は、インビトロ実験におけるｃ−Ｍｅｔシェディング誘発因子として記載されている。ｍ２２４Ｇ１１がそのような特性を有するかどうかを決定するため、細胞を６穴プレートで、１０％ＦＣＳ培地中に播種した。細胞が８０％コンフルエンスに達したときに、培地を除去し、新鮮な完全培地＋／−試験を行う化合物を加えた。細胞を、ｍ２２４Ｇ１１、アイソタイプコントロールｍＩｇＧ１またはＰＢＳと共に更に７２時間インキュベーションした。ＰＭＡ（ホルボールミリステートアセテート）を、シェディング誘発因子として導入した。ＨＧＦも細胞で試験し、天然に存在するシェディングに対するｃ−Ｍｅｔリガンドの影響を決定した。次いで、上清を集めて０．２μｍフィルターで濾過した後、ＥＬＩＳＡ試験を用いて、ｃ−Ｍｅｔの可溶性形態をｍ２２４Ｇ１１またはｃ１１Ｅ１と同じエピトープを認識しない抗ｃ−Ｍｅｔ抗体で捕捉した（図２１）。更に、それぞれのウェル由来の細胞をＰＢＳで洗浄し、溶解して、タンパク質濃度を決定した。ＥＬＩＳＡのため、２２４Ｄ１０をキャプチャー抗体として用い、プレート飽和の後、６穴プレートからの濾過した上清をＥＬＩＳＡ試験に加えた。モノマー性ｃ−Ｍｅｔ形態を、正のコントロールとして用いた。上清をインキュベーションした後、プレートを洗浄して未結合ｃ−Ｍｅｔを除去し、ｃ１１Ｅ１を用いて２２４Ｇ１１Ｍａｂによって捕捉されたｃ−Ｍｅｔを検出した。試験の顕色(revelation)は、ＨＲＰ接合抗ｈＦｃポリクローナル抗体を添加することによって最後に行った。

図２２に示される結果は、ｃ−Ｍｅｔの天然シェディングは、細胞をインビトロで７２時間培養したときに起きたことを示している。ｍＩｇＧ１の効果は見られなかった。しかしながら、ｍ２２４Ｇ１１の添加はｃ−Ｍｅｔシェディングを阻害すると思われた。これらの結果は、図２３の他の３種類の細胞系（Ｈｓ７４６Ｔ、ＥＢＣ１およびＭＫＮ４５）について確かめられた。その第二の実験では、正のシェディング誘発因子として加えたＰＭＡは、予想した通り、ｃ−Ｍｅｔシェディングを少なくとも２細胞系（Ｈｓ７４６ＴおよびＭＫＮ４５）で有意に増加した。最後に、第三の実験では（図２４）、ＨＧＦをコントロールとして導入した。細胞単独または細胞＋ｍＩｇＧ１と比較して、ＨＧＦによっては更なるシェディングは誘発されなかった。また、ｃ−Ｍｅｔシェディングの有意な阻害は、ｍ２２４Ｇ１１で再度観察された。

例１５：様々な細胞系に対するｈ２２４Ｇ１１Ａｂの本質的効果
本発明の上記実験では、５Ｄ５などの他の抗体で見られたのとは対照的に、ｍ２２４Ｇ１１およびそのヒト化形態ｈ２２４Ｇ１１は有意な固有活性腫瘍細胞系を示さないことが明らかになった。この特性を他の細胞系にひろげるため、Ｈｓ７４６Ｔ、ＮＣＩ−Ｈ４４１、Ｈｓ５７８Ｔ、ＮＣＩ−Ｈ１２５、Ｔ９８Ｇ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ３など様々なレベルのｃ−Ｍｅｔ発現を有する癌細胞系のセットで、ウェスタンブロット分析およびホスホＥＬＩＳＡ実験を様々な時間に加えた抗体単独で行った。同じ試験は、正常細胞ＨＵＶＥＣでも行った。

ホスホｃＭｅｔＥＬＩＳＡアッセイの方法は、本特許明細書の例５に既に記載した。ウェスタンブロット分析については、タンパク質溶解物をペレット化した細胞からプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害薬［１０ｎＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、０．５％ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０、１００ｍＭフッ化ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、２ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、２ｍＭＰＭＳＦ、１０ｍｇ／ｍｌロイペプチン、１０ｍｇ／ｍｌアプロチニン］を用いて４℃でライシスバッファー中でインキュベーションすることによって作製した。タンパク質溶解物を遠心分離によって細胞破片を除き、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜にエレクトロトランスファーした。ｃ−Ｍｅｔ実験については、溶解物を目的とする特異的タンパク質について免疫沈降させた後、電気泳動およびトランスファーした。

図２５〜３２に示された結果も、ｈ２２４Ｇ１１抗体の固有活性は、試験細胞で見られなかったことを再度明らかにしている。

例１６：ネズミ野生型２２４Ｇ１１と、２２４Ｇ１１［Ｃ２Ｄ５−７］（ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデル）として記載されたキメラヒンジ遺伝子工学処理２２４Ｇ１１形態とのインビボ比較
ＮＣＩ−Ｈ４４１は、乳頭状肺腺癌由来であり、高レベルのｃ−Ｍｅｔを発現し、ｃ−ＭｅｔＲＴＫの構成的リン酸化を示す。

２２４Ｇ１１ネズミの抗体のインビボ活性をセーブするためのヒンジの遺伝子工学処理の必要性を評価するため、６〜８週齢の無胸腺マウスを、滅菌フィルターを頂部に取り付けたケージに収容し、無菌条件に保持し、仏国および欧州指針に準じて操作した。マウスに、９ｘ１０^６個の ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を皮下接種した。次いで、細胞移植の６日後に、腫瘍は測定可能となり（約１００ｍｍ^３）、動物を類似した腫瘍サイズの６尾のマウスの群に分け、最初に抗体／マウスを２ｍｇの初回量で投与し、次いで週２回それぞれの試験抗体を１ｍｇ／用量で投与した。マウスを、異種移植片増殖速度の観察のために追跡した。腫瘍体積は、式：π（パイ）／６×長さ×幅×高さによって計算した。図３３に示した結果は、インビトロでは作動薬活性を欠いているネズミＭａｂは、予想されるように、強力なインビボ拮抗薬として機能することを示している。インビトロで得られた結果から示唆されるように、リン酸化アッセイでは、有意な作動薬効果を示さなかったｃ２２４Ｇ１１［Ｃ２Ｄ５−７］ヒンジ遺伝子工学処理した抗体は、ＮＣＩ−Ｈ４４１異種移植モデルに対するｍ２２４Ｇ１１の活性に匹敵する強力なインビボ活性を示す。

例１７：ＡＤＣＣ試験におけるｈ２２４Ｇ１１の評価
ｈ２２４Ｇ１１はＩｇＧ１アイソタイプであるので、ＡＤＣＣはヒトにおけるそのインビボ効果の部分である可能性がある。イン・トロでの［^５１Ｃｒ］放出細胞傷害性アッセイは、ターゲット細胞としてＨｓ７４６ＴまたはＮＣＩ−Ｈ４４１細胞と、ヒト末梢血単核リンパ球から精製したＮＫ細胞を用いて行った。

簡単に説明すれば、百万個のＨｓ７４６ＴまたはＮＣＩ−Ｈ４４１ターゲット細胞を、１００μＣｉの^５１クロム(Perkin Elmer)の存在下にて２０μｇのｈ２２４Ｇ１１Ａｂと共にまたはなしで、１時間インキュベーションした。次いで、４ｘ１０^３個の細胞を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離したヒト天然キラー（ＮＫ）細胞と共にＮｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ(Stemcell Technologies)を用いて培養した。細胞を、一緒にして更に４時間、３７℃でインキュベーションした。細胞溶解率は、下式から計算した：［（実験での^５１Ｃｒ放出−自発的^５１Ｃｒ放出）／（完全な^５１Ｃｒ放出−自発的^５１Ｃｒ放出）］×１００。自発的放出は、ターゲット細胞を天然キラー細胞の非存在下で培養したときに得られるカウント数を表す。完全放出は、ターゲット細胞を１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で溶解したときに得られるカウント数を表す。ｈ２２４Ｇ１１は、ＮＫ／ターゲット細胞比１００では、Ｈｓ７４６Ｔ（図３４ａ）およびＮＣＩ−Ｈ４４１（図３４ｂ）細胞の溶解を、それぞれ６２．９％および６３．２％有意に増加した。

例１８：免疫組織化学的検討（ＩＨＣ）
パラフィン包埋腫瘍ＩＨＣ染色の手順：冷凍腫瘍の８〜１２μＭ切片を、予め冷却した−２０℃のアセトンで直ぐに３分間固定した。次に、スライドを室温で３０分間〜１時間冷却した。ＰＢＳで２回洗浄した後、内在性ペルオキシダーゼ活性をペルオキシダーゼ遮断試薬(Dako K4007)を用いて５分間遮断した。切片をＰＢＳで洗浄して、アビジン／ビオチン遮断試薬(Dako X0590)中でインキュベーションした直後、非特異的部位をＰＢＳ−ＢＳＡ４％で室温にて３０分間飽和した。次いで、スライドを、ビオチン化ｈ２２４Ｇ１１（５０〜１０μｇ／ｍｌ）またはヒトビオチン化ＩｇＧ１／κ（５０〜１０μｇ／ｍｌ、結合部位）をネガティブコントロールとして室温にて２時間インキュベーションした。

切片をＰＢＳで洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体ユニバーサル(Dako K0679)と共に３０〜４５分間インキュベーションした。３−アミノ−９−エチルカルバゾールを用いて、赤色反応生成物を発色させた(Sigma)。スライドをヘマトキシリンに４分間浸漬して対比染色した(Dako S3309)。

結果を、図３５に示す。

ｈ２２４Ｇ１１は、様々な腫瘍タイプの細胞膜を差別的に染色する。この免疫組織化学の手順では、赤色反応生成物は細胞膜の正の染色に相関し、赤色反応生成物の欠如は負の染色および細胞膜が可視化されないことと相関している。ＩｇＧコントロールであるヒトＩｇＧ１／κは、コントロールと同等のアイソタイプである。

Claims (41)

1. ｃ−Ｍｅｔ二量体化を阻害することができるモノクローナル抗体またはその二価の機能性断片であって、それぞれ配列番号１、２および３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖と、それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖とを含んでなり、更に配列番号５６のアミノ酸配列を含むヒンジ領域をも含んでなる、モノクローナル抗体またはその二価の機能性断片。
2. 前記ヒンジ領域が配列番号５７のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の抗体またはその二価の機能性断片。
3. 前記ヒンジ領域が配列番号２１のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の抗体またはその二価の機能性断片。
4. 前記ヒンジ領域が配列番号２２〜２８および配列番号５８〜７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の抗体またはその二価の機能性断片。
5. キメラ抗体からなる、請求項１に記載の抗体またはその二価の機能性断片。
6. ヒト抗体からなる、請求項１に記載の抗体またはその二価の機能性断片。
7. ヒト化抗体からなる、請求項１に記載の抗体またはその二価の機能性断片。
8. 配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる配列の重鎖可変ドメインと、配列番号８、９または１０のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる、請求項７に記載の抗体またはその二価の機能性断片。
9. 配列番号４のアミノ酸配列を含む配列の重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒンジ領域とを含んでなる、請求項８に記載の抗体またはその二価の機能性断片。
10. 配列番号４のアミノ酸配列を含む配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒンジ領域とを含んでなる、請求項８に記載の抗体またはその二価の機能性断片。
11. 配列番号４のアミノ酸配列を含む配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号２２のアミノ酸配列を含むヒンジ領域とを含んでなる、請求項８に記載の抗体またはその二価の機能性断片。
12. 配列番号４のアミノ酸配列を含む配列の重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号２８のアミノ酸配列を含むヒンジ領域とを含んでなる、請求項８に記載の抗体またはその二価の機能性断片。
13. 配列番号４のアミノ酸配列を含む配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号２８のアミノ酸配列を含むヒンジ領域とを含んでなる、請求項８に記載の抗体またはその二価の機能性断片。
14. 配列番号４のアミノ酸配列を含む配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号２８のアミノ酸配列を含むヒンジ領域とを含んでなる、請求項８に記載の抗体またはその二価の機能性断片。
15. 下記の核酸：
    ａ） 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその二価の機能性断片をコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ、
    ｂ） 配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３の配列および配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７の配列を含むＤＮＡ配列を含んでなる核酸、
    ｃ） 配列番号１４および配列番号１８、１９または２０の配列を含むＤＮＡ配列を含んでなる核酸、
    ｄ） ｂ）またはｃ）で定義された核酸の対応するＲＮＡ核酸、
    ｅ） ａ）、ｂ）およびｃ）で定義された核酸の相補性核酸、
    から選択される、単離核酸。
16. 下記の核酸：
    請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその機能性断片をコードし、かつ前記抗体のヒンジ領域をコードする核酸配列が配列番号２９〜３５および配列番号７３〜８７の配列からなる群から選択される配列を含んでなるまたは有する核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ
    から選択される、単離核酸。
17. 請求項１５または１６に記載の核酸を含んでなるベクター。
18. 請求項１７に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
19. 請求項１７に記載のベクターによって形質転換された少なくとも１個の細胞を含んでなる、ヒトを除くトランスジェニック動物。
20. 下記の段階：
    ａ） 請求項１８に記載の細胞の培地および適当な培養条件での培養、および
    ｂ） このようにして培養培地または前記培養細胞から出発して産生された前記抗体またはその二価の機能性断片の回収
    を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体またはその二価の機能性断片の産生方法。
21. 請求項２０に記載の方法によって得ることができる、抗体またはその二価の機能性断片。
22. 医薬としての、請求項１〜１４および２１のいずれか一項に記載の抗体。
23. 請求項１〜１４、２１または２２のいずれか一項に記載の抗体またはその二価の機能性断片からなる化合物を活性成分として含んでなる、組成物。
24. 同時、単独または逐次使用の組合せ物として抗腫瘍抗体を更に含んでなる、請求項２３に記載の組成物。
25. 同時、単独または逐次使用の組合せ物として細胞傷害性／細胞増殖抑制剤を更に含んでなる、請求項２３に記載の組成物。
26. 前記細胞傷害性／細胞増殖抑制剤が同時使用のために前記抗体またはその二価の機能性断片に化学的にカップリングしている、請求項２５に記載の組成物。
27. 前記細胞傷害性／細胞増殖抑制剤が、アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗腫瘍抗生物質、有糸***抑制因子、クロマチン機能阻害薬、抗血管新生薬、抗エストロゲン剤、抗アンドロゲン剤および免疫調節剤からなる群から選択される、請求項２６に記載の組成物。
28. 前記細胞傷害性／細胞増殖抑制剤が、有糸***抑制因子である、請求項２７に記載の組成物。
29. 前記抗体またはその二価の機能性断片の少なくとも１つが細胞毒素および／または放射性元素と接合している、請求項２３に記載の組成物。
30. 前記毒素および／または放射性元素を、同時使用の組成物の成分の少なくとも１つに化学的にカップリングしている、請求項２９に記載の組成物。
31. 医薬としての、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
32. 腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するための、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
33. 癌を予防または治療するための、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
34. 前記癌が前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、神経膠芽腫または結腸癌から選択される癌である、請求項３３に記載の組成物。
35. 前記癌がＨＧＦ依存性および独立性のＭｅｔ−活性化関連癌である、請求項３３または３４に記載の組成物。
36. 腫瘍細胞の成長および／または増殖の阻害を目的とする医薬の調製のための、請求項１〜１４、２１または２２のいずれか一項に記載の抗体またはその二価の機能性断片、または請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の組成物の、使用。
37. 癌の予防または治療を目的とする医薬の調製のための、請求項１〜１４、２１または２２のいずれか一項に記載の抗体もしくはその二価の機能性断片、もしくは請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の組成物の使用、または請求項３６に記載の使用。
38. 前記癌が前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、神経膠芽腫または結腸癌から選択される癌である、請求項３７に記載の使用。
39. 前記癌がＨＧＦ依存性および独立性のＭｅｔ−活性化関連癌である、請求項３７または３８に記載の使用。
40. ｃ−Ｍｅｔ受容体の異常存在が疑われる生物試料から出発するｃ−Ｍｅｔ受容体の過剰発現または過小発現によって推定される癌のインビトロで検出するのを補助する方法であって、前記生物試料を請求項１〜１４、２１または２２のいずれか一項に記載の抗体と接触させる段階を含んでなる、方法。
41. 前記抗体は標識することが可能である、請求項４０に記載の方法。