ES2827277T3

ES2827277T3 - Anticuerpo anti-c-Met

Info

Publication number: ES2827277T3
Application number: ES18188726T
Authority: ES
Inventors: Liliane Goetsch; Thierry Wurch; Cédric Bes
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2009-12-02
Publication date: 2021-05-20
Anticipated expiration: 2029-12-02
Also published as: RS56204B1; MY185200A; CA2743433A1; MY192567A; JP6309657B2; CN102227446A; DK3135691T3; AU2017203929B2; JP2017099392A; RU2560257C2; CR20110324A; LT3135691T; CN102227446B; HK1190414A1; RU2011124751A; CN103351438A; TW201446805A; HUE035047T2; JP2012510280A; GEP20146207B

Abstract

Composición que comprende: un anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional divalente del mismo, apto para inhibir la dimerización de c- Met, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento funcional divalente del mismo: - una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID nº: 1, 2 y 3; y - una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID nº: 5, 6 y 7, y - una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº: 28, comprendiendo además dicha composición, como un producto de combinación para la utilización simultánea, separada o secuencial, un segundo anticuerpo antitumoral o un agente citotóxico/citostático.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-c-Met

Nuevo anticuerpo divalente que puede unirse específicamente al receptor c-Met humano y/o que puede inhibir específicamente la actividad de tirosina cinasa de dicho receptor, así como también las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos que codifican dicho anticuerpo. Más particularmente, el anticuerpo según la invención puede inhibir la dimerización de c-Met. Además, el uso de dicho anticuerpo como un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de cánceres o de cualquier patología relacionada con la sobreexpresión de dicho receptor es divulgado así como también procesos o kits para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con la sobreexpresión de c-Met. Los productos y/o unas composiciones son proporcionados asimismo, que comprenden ese tipo de anticuerpo en combinación con otros anticuerpos y/o compuestos químicos dirigidos contra otros factores de crecimiento involucrados en la progresión de tumores o metástasis y/o compuestos y/o agentes anticancerígenos o agentes conjugados con toxinas y su utilización para la prevención y/o el tratamiento de ciertos cánceres.

Los agentes dirigidos hacia la tirosina cinasa receptora (RTK) tales como los inhibidores de trastuzumab, cetuximab, bevacizumab, imatinib y gefitinib han ilustrado el interés de emplear esta clase de proteína para el tratamiento de cánceres seleccionados.

La c-Met es el miembro prototípico de una subfamilia de RTKs la cual también incluye RON y SEA. La familia de RTK de c-Met es estructuralmente diferente de otras familias de RTK y es el único receptor de alta afinidad conocido para el factor del crecimiento de hapatocitos (HGF), también denominado factor de dispersión (SF, scatter factor) [D.P. Bottaro et al., Science 1991, 251: 802-804; L. Naldini et al., Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10:2867-2878]. c-Met y HGF son ampliamente expresados en una variedad de tejidos y su expresión está normalmente restringida a células de origen epitelial y mesenquimal respectivamente [M.F. Di Renzo et al., Oncogene 1991, 6:1997-2003; E. Sonnenberg et al., J. Cell. Biol. 1993, 123:223-235]. Son ambos requeridos para el desarrollo normal de los mamíferos y han demostrado ser particularmente importantes en la migración celular, diferenciación morfogénica, y organización de las estructuras tubulares tridimensionales así como también el crecimiento y la angiogénesis [F. Baldt et al., Nature 1995, 376:768-771; C. Schmidt et al., Nature. 1995:373:699-702; Tsarfaty et al., Science 1994, 263:98-101]. Si bien la regulación controlada de c-Met y HGF ha demostrado ser importante en el desarrollo de mamíferos, mantenimiento y reparación de los tejidos [Nagayama T., Nagayama M., Kohara S., Kamiguchi H., Shibuya M., Katoh Y., Itoh J., Shinohara Y., Brain Res. 2004, 5;999(2):155-66; Tahara Y., Ido A., Yamamoto S., Miyata Y., Uto H., Hori T., Hayashi K., Tsubouchi H., J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307(1):146-51], su desregulación está implicada en la progresión de cánceres.

La señalización aberrante impulsada por la activación inapropiada de c-Met es una de las alteraciones más frecuentes observada en los cánceres humanos y juega un rol fundamental en la tumorigénesis y en la metástasis [Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915-925; L. Trusolino y Comoglio P. M., Nat Rev. Cancer. 2002, 2(4):289-300].

La activación inapropiada de c-Met puede surgir mediante mecanismos dependientes e independientes del ligando, los cuales incluyen la sobreexpresión de c-Met, y/o la activación paracrina o autocrina, o a través del aumento de la mutación funcional [J.G. Christensen, Burrows J. y Salgia R., Cancer Latters. 2005, 226:1-26]. Sin embargo, una oligomerización del receptor c-Met, en presencia o en ausencia del ligando, es requerida para regular la afinidad de unión y la cinética de unión de la cinasa hacia ATP y los sustratos peptídicos que contienen tirosina [Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 2004 17 de agosto, 43:10570-8]. c-Met activado recluta efectores de la señalización a su sitio “multidocking” ubicado en el dominio citoplasmático, dando como resultado la activación de diversas rutas de señalización claves, incluyendo Ras-MAPK, PI3K, Src y Stat3 [Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005, 15(1):49-51; Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene. 2000, 19(49):5582-9]. Estas rutas son esenciales para la proliferación, invasión y angiogénesis de células tumorales y para evadir la apoptosis [Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene, 2000, 19(49):5582-9; Gu H., Neel BG, Trends Cell Biol. Mar 2003, 13(3):122-30; Fan S., Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q., Cao Y., Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM, Oncogene. 27 de abril 2000, 19(18):2212-23]. Por añadidura, una faceta única de la señalización de c-Met relacionada con otro RTK es su interacción reportada con complejos de adhesión focal y compañeros de la unión no cinasa tales como las integrinas a6p4 [Trusolino L., Bertotti A., Comoglio PM, Cell. 2001, 107:643-54], CD44v6 [Van der Voort R., Taher TE, Wielenga v J, Spaargaren M., Prevo R., Smit L., David G., Hartmann G., Gherardi E., Pals ST, J. Biol. Chem.

1999, 274(10):6499-506], Plexina B1 o semaforinas [Giordano S., Corso S., Conrotto P., Artigiani S., Gilestro G., Barberis D., Tamagnone L., Comoglio PM, Nat Cell Biol. 2002, 4(9):720-4; Conrotto P., Valdembri D., Corso S., Serini G., Tamagnone L., Comoglio PM, Bussolino F., Giordano S., Blood. 2005, 105(11):4321-9; Conrotto P., Corso S., Gamberini S., Comoglio PM, Giordano S., Oncogene. 2004, 23:5131-7] los cuales pueden sumar adicionalmente a la complejidad de regulación de la función celular por este receptor. Finalmente, datos recientes demuestran que c-Met podría estar involucrado en la resistencia tumoral a gefitinib o erlotinib lo cual sugiere que la combinación del direccionamiento de compuestos hacia EGFR y c-Met podría ser de interés significativo [Engelman JA et al., Science, 2007, 316:1039-43].

En los últimos pocos años, se han desarrollado muchas estrategias diferentes para atenuar la señalización de c-Met en líneas celulares cancerígenas. Estas estrategias incluyen i) neutralizar anticuerpos contra c-Met o HGF/SF [Cao B., Su Y., Oskarsson M., Zhao P., Kort EJ, Fisher RJ, Wang LM, Vande Woude GF, Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98(13):7443-8; Martens T., Schmidt NO, Eckerich C., Fillbrandt R., Merchant M., Schwall R., Westphal M., Lamszus K., Clin Cancer Res. 2006, 12(20):6144-52] o el uso de NK4 antagonista de HGF/SF para evitar la unión del ligando a c-Met [Kuba K., Matsumoto K., Date K., Shimura H., Tanaka M., Nakamura T., Cancer Res., 2000, 60:6737-43], ii) inhibidores del sitio de unión a ATP pequeño a c-Met que bloquean la actividad de cinasas [Christensen JG, Schreck R., Burrows J., Kuruganti P., Chan E, Le P., Chen J., Wang X., Ruslim L., Blake R., Lipson KE, Ramphal J., Do S., Cui JJ, Cherrington JM, Mendel DB, Cancer Res. 2003, 63:7345-55], iii) polipéptido de dominio SH2 genomanipulado que interfiere con el acceso al sitio “multidocking” y RNAi o ribozima que reducen la expresión del receptor o del ligando. La mayoría de estos métodos exhiben una inhibición selectiva de c-Met dando como resultado la inhibición tumoral y mostrando que c-Met podría ser interesante para la intervención terapéutica en el cáncer.

Entre las moléculas generadas para el direccionamiento hacia c-Met, algunas son anticuerpos. El más extensamente descrito es el anticuerpo anti-c-Met 5D5 generado por Genentech [WO 96/38557] el cual se comporta como un potente agonista cuando es agregado solo en diversos modelos y como un antagonista cuando se utiliza como un fragmento Fab. Una forma genomanipulada monovalente de este anticuerpo descrito como un 5D5 armado (OA5D5) y producida como una proteína recombinante en E. Coli es también el objeto de una solicitud de patente [documento WO 2006/015371] por Genentech. Sin embargo, esta molécula que no podría ser considerada como un anticuerpo debido a su estructura en particular, exhibe también mutaciones que podrían ser inmunógenas en seres humanos. En términos de actividad, esta molécula no glicosilada está desprovista de funciones efectoras y finalmente, no hay datos claros que demuestran que OA5D5 inhibe la dimerización de c-Met. Adicionalmente, cuando se ensaya en el modelo in vivo de G55, una línea de células de glioblastoma que expresa c-Met pero no ARNm de HGF y proteína y que crece independientemente del ligando, el anti-c-Met armado no tuvo efecto significativo alguno sobre el crecimiento tumoral de G55 lo cual sugiere que OA5D5 actúa principalmente bloqueando la unión de HGF y no es capaz de dirigirse hacia tumores activados independientemente de HGF [Martens T. et al, Clin. Cancer Res., 2006, 12(20):6144-6152].

Otro anticuerpo que se dirige hacia c-Met es descrito por Pfizer como un anticuerpo que actúa “predominantemente como antagonista de c-Met, y en algunos casos como un agonista de c-Met” [documento WO 2005/016382]. No hay datos descritos en esta solicitud que muestren efecto alguno de los anticuerpos de Pfizer sobre la dimerización de c-Met.

La solicitud de patente WO 2007/126799 A2 (Novartis, 8-11-2007) divulga unos anticuerpos humanos de c-Met antagonistas en el formato IgG1 e IgG4, mientras que la solicitud WO 2009/0074227 A2 (Pierre Fabre Medicament, 15-1-2009) divulga unos anticuerpos de c-Met murinos divalentes que presentan una actividad de c-Met antagonista.

Sumario de la invención

Se proporciona en la presente memoria un anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional divalente del mismo, apto para inhibir la dimerización de c-Met, comprendiendo dicho anticuerpo o un fragmento funcional divalente del mismo una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 1, 2 y 3; y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 5, 6 y 7, estando caracterizados dicho anticuerpo o un fragmento funcional divalente del mismo por que:

i) dicho anticuerpo o un fragmento funcional divalente del mismo, comprende asimismo una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n°: 28 y

ii) dicho anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, está acoplado químicamente a un agente citotóxico.

Se divulga en la presente memoria un anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, apto para inhibir la dimerización de c-Met, comprendiendo dicho anticuerpo una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC iD n° 1, 2 y 3; y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 5, 6 y 7, estando dicho anticuerpo caracterizado por que comprende asimismo una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 21.

Preferentemente, este anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, está caracterizado por que dicha región bisagra comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID n° 22 a 28. Más preferentemente, este anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, presenta una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 28.

Preferentemente, este anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, está caracterizado por que consiste en un anticuerpo quimérico.

Preferentemente, este anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, está caracterizado por que consiste en un anticuerpo humano.

Preferentemente, este anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, está caracterizado por que consiste en un anticuerpo humanizado.

Más preferentemente, este anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, está caracterizado por que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4; y un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 8, 9 o 10.

Más preferentemente, este anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, está caracterizado por que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4; un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 8; y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 22.

Más preferentemente, este anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, está caracterizado por que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4; un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 9; y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 22. Más preferentemente, este anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, está caracterizado por que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4; un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 10; una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 22. Más preferentemente, este anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, está caracterizado por que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4; un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 8; una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 28.

Más preferentemente, este anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, está caracterizado por que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4; un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 9; y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 28. Más preferentemente, este anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, está caracterizado por que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4; un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 10; y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 28. En otro aspecto, la presente divulgación se refiere asimismo a un ácido nucleico aislado, caracterizado por que se selecciona de entre los ácidos nucleicos siguientes:

a) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo, o un fragmento funcional o derivado del mismo, como se describe anteriormente;

b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que comprende las secuencias SEC ID n° 11, SEC ID n° 12, SEC ID n° 13 y las secuencias SEC ID n° 15, SEC ID n° 16 y SEC ID n° 17;

c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que comprende las secuencias SEC ID n° 14 y SEC ID n° 18, 19 o 20;

d) los ácidos nucleicos de ARN correspondientes de los ácidos nucleicos como se define en b) o c); e) los ácidos nucleicos complementarios de los ácidos nucleicos como se define en a), b) y c);

f) un ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos apto para hibridar en condiciones de severidad elevada con por lo menos una de las CDR de secuencia SEC ID n° 11 a 13 y 15 a 17.

En otro aspecto, se divulga asimismo un vector que comprende un ácido nucleico como se describe anteriormente. En otro aspecto, se divulga asimismo una célula hospedadora que comprende el vector descrito anteriormente. En otro aspecto, se divulga asimismo un animal transgénico con la excepción del hombre que comprende por lo menos una célula transformada por el vector descrito anteriormente.

En otro aspecto, se divulga asimismo un proceso para la producción de un anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, descrito anteriormente, comprendiendo dicho proceso las etapas siguientes: a) cultivar en un medio y en condiciones de cultivo adecuadas una célula hospedadora como se describe anteriormente; y

b) recuperar dicho anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, producido así partiendo del medio de cultivo o dichas células cultivadas.

En otro aspecto, se divulga asimismo un anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, apto para ser obtenido mediante el proceso descrito anteriormente.

En otro aspecto, se divulga asimismo la utilización del anticuerpo descrito anteriormente como un medicamento. En otro aspecto, se divulga asimismo una composición que comprende a modo de principio activo un compuesto que consiste en un anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, descrito anteriormente. Preferentemente, la composición está caracterizada por que comprende, además, como un producto de combinación para la utilización simultánea, separada o secuencial, un anticuerpo antitumoral.

Preferentemente, la composición está caracterizada por que comprende, además, como un producto de combinación para la utilización simultánea, separada o secuencial, un agente citotóxico/citostático.

Preferentemente, la composición está caracterizada por que uno, por lo menos, de dichos anticuerpos, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, está conjugado con una toxina celular y/o un radioelemento. Preferentemente, la composición está caracterizada por que dicho agente citotóxico/citostático o dicha toxina y/o un radioelemento está acoplado químicamente a por lo menos uno de los elementos de dicha composición para la utilización simultánea.

En otro aspecto, se divulga asimismo la utilización de la composición descrita anteriormente como un medicamento.

En otro aspecto, se divulga asimismo la utilización del anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, o se divulga de la composición descrita anteriormente para la preparación de un medicamento destinado a inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células tumorales.

En otro aspecto, se divulga la utilización del anticuerpo, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, o de la composición descrita anteriormente, o la utilización anterior, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento del cáncer.

Preferentemente, dicha utilización está caracterizada por que dicho cáncer es seleccionado de entre cáncer de próstata, osteosarcomas, cánceres de pulmón, cáncer de mama, cáncer de endometrio, glioblastoma o cáncer de colon.

Preferentemente, dicha utilización está caracterizada por que dicho cáncer es un cáncer relacionado con la activación de Met dependiente e independiente de HGF.

En otro aspecto, se divulga asimismo un procedimiento de diagnóstico in vitro de enfermedades inducidas por una sobreexpresión o un subexpresión del receptor c-Met que parte de una muestra biológica en la que se sospecha la presencia anormal del receptor c-Met, comprendiendo dicho procedimiento una etapa en la que dicha muestra se pone en contacto con un anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 12, 18 o 19, siendo posible para dicho anticuerpo ser, si resulta necesario, marcado.

Descripción detallada

Uno de los aspectos innovadores de la presente invención consiste en generar un anticuerpo monoclonal quimérico y/o humanizado sin actividad agonista intrínseca e inhibir la dimerización de c-Met. Más particularmente, un aspecto innovador de la presente invención consiste en generar un anticuerpo monoclonal quimérico y/o humanizado con actividad antagonista e inhibir la dimerización de c-Met.

Además de dirigirse contra tumores dependientes de ligando, este método también disminuirá las activaciones independientes del ligando de c-Met debido a su sobreexpresión o mutaciones de los dominios intracelulares los cuales permanecieron dependientes de la oligomerización para la señalización. Otro aspecto de la actividad de este anticuerpo podría ser un impedimento estérico para la interacción de c-Met con sus socios que dará como resultado un menoscabo de las funciones de c-Met. Este anticuerpo es humanizado y genomanipulado con preferencia, aunque sin limitarse a, como IgG1 humana para obtener funciones efectoras tales como ADCC y CDC además de funciones vinculadas con el bloqueo específico del receptor c-Met.

Sorprendentemente, por primera vez, los inventores han podido generar un anticuerpo antagonista monoclonal quimérico y/o humanizado capaz de unirse a c-Met pero también capaz de inhibir la dimerización de c-Met, siendo dicho anticuerpo monoclonal divalente en oposición a los anticuerpos antagonistas existentes dirigidos contra c-Met. Si es cierto que, en la técnica anterior, algunas veces se sugiere que un anticuerpo capaz de inhibir la dimerización de c-Met con sus socios podría ser un anticuerpo interesante, nunca se ha descrito, o claramente sugerido, un anticuerpo capaz de hacerlo. Por añadidura, en cuanto a la especificidad del anticuerpo, no fue evidente para nada el tener éxito en la generación de ese tipo de anticuerpo divalente activo.

Según lo explicado anteriormente, la inhibición de la dimerización de c-Met es un aspecto capital ya que ese tipo de anticuerpos presentarán un real interés para una población más grande de pacientes. No solo el cáncer de c-Met activado dependiente del ligando, como resultó ser el caso hasta el momento, sino además el cáncer de c-Met activado independiente del ligando pudo tratarse con los anticuerpos generados mediante el proceso de la divulgado en la presente memoria.

Los anticuerpos fueron evaluados mediante análisis BRET sobre células que expresan tanto c-Met-RLuc/c-Met-YFP y se seleccionaron por su capacidad de inhibir por lo menos 40%, con preferencia 45%, 50%, 55% y con máxima preferencia 60% de la señal de BRET.

La tecnología BRET es conocida como siendo representativa de la dimerización proteica [Angers et al., PNAS, 2000, 97:3684-89].

La tecnología BRET es bien conocida por el experto en la materia y será detallada en los siguientes ejemplos. Más particularmente, BRET (Transferencia de Energía por Resonancia de Bioluminiscencia) es un transferencia de energía no radiactiva que ocurre entre un donante bioluminiscente (Renilla Luciferasa (Rluc) y un aceptor fluorescente, un mutante de GFP (Proteína Fluorescente Verde) o YFP (Proteína fluorescente amarilla). En el presente caso, se utilizó EYFP ( (Proteína Fluorescente Amarilla Potenciada). La eficacia de la transferencia depende de la orientación y la distancia entre el donante y el aceptor. Luego, la transferencia de energía puede ocurrir solamente si las dos moléculas están en cercana proximidad (1-10 nm). Esta propiedad se utiliza para generar ensayos de interacción proteína- proteína. De hecho, con el fin de estudiar la interacción entre dos socios, el primero es genéticamente fusionado a la Renilla Luciferasa y el segundo al mutante amarillo de la GFP. Las proteínas de fusión son generalmente, aunque no obligatoriamente, expresadas en células de mamífero. En presencia de su sustrato permeable a la membrana (coelenterazina), Rluc emite luz azul. Si el mutante de GFP está más cerca que 10 nm de la Rluc, puede producirse una transferencia energética y puede detectarse una señal amarilla adicional. La señal de BRET se mide como la relación entre la luz emitida por el aceptor y la luz emitida por el donante. De modo que la señal de BRET aumentará a medida que las dos proteínas de fusión se llevan a proximidad o si un cambio conformacional trae a Rluc y el mutante de GFP más cerca.

Si el análisis de BRET consiste en una forma de realización preferida, cualquier método conocido por el experto en la materia puede utilizarse para medir la dimerización de c-Met. Sin limitación, pueden mencionarse las siguientes tecnologías: FRET (Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia), HTRF (Fluorescencia Homogénea resuelta en el Tiempo), FLIM (Microscopía por Imágenes de Tiempo de Vida de Fluorescencia) o SW-FCCS (espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de longitud de onda única).

Otras tecnologías clásicas también podrían utilizarse, tales como Coinmunoprecipitación, Alpha screen, Entrecruzamiento químico, Doble Híbrido, Cromatografía de Afinidad, ELISA o transferencia Far western.

Los términos “anticuerpo”, “anticuerpos” o “inmunoglobulina” se utilizan de manera indistinta en el sentido más amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes o anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada).

Más particularmente, dicha molécula consiste en una glucoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (o dominio) (abreviado en la presente invención HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviado en esta invención como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones de VH y VL puede estar adicionalmente subdivididas en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), mezcladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el término amino hasta el término carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden intervenir en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores huéspedes, incluyendo diversas células del sistema inmune (por ejemplo células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complementos clásico.

Las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas pueden estar divididas en tres regiones funcionales: la región Fd, la región bisagra, y la región Fc (cristalizable por fragmento). La región Fd comprende los dominios VH y CHl y, en combinación con la cadena ligera, forma Fab - el fragmento de unión al antígeno. El fragmento Fc es responsable de las funciones efectoras de inmunoglobulinas, lo cual incluye, por ejemplo, la fijación al complemento y la unión a los receptores de Fc cognados de las células efectoras. La región bisagra, encontrada en las clases de inmunoglobulinas IgG, IgA, y IgD, actúa como un espaciador flexible que permite que la porción de Fab se mueva libremente en el espacio con relación a la región Fc. Los dominios bisagra son estructuralmente diversos, variando en la secuencia como en la longitud entre las clases y subclases de inmunoglobulinas.

De acuerdo con estudios cristalográficos, la región bisagra de inmunoglobulina puede estar adicionalmente subdividida estructural y funcionalmente en tres regiones: la bisagra superior, el núcleo y la bisagra inferior (Shin et al., Immunological Reviews 130:87, 1992). La bisagra superior incluye aminoácidos desde el extremo carboxilo de CHl hasta el primer residuo en la bisagra que restringe el movimiento, en general el primer residuo cisteína que forma un enlace disulfuro entre cadenas entre las dos cadenas pesadas. La longitud de la región bisagra superior se correlaciona con la flexibilidad segmental del anticuerpo. La región bisagra núcleo contiene los puentes disulfuro entre las cadenas pesadas. La región bisagra inferior une el extremo terminal amino de, e incluye los residuos en el dominio CH2. La región bisagra núcleo de IgG1 humana contiene la secuencia Cys-Pro-Pro-Cys que, cuando se dimeriza mediante la formulación de un enlace disulfuro, da como resultado un octapéptido cíclico que se cree que actúa como un pivote, confiriendo de ese modo flexibilidad. Los cambios conformacionales permitidos por la estructura y flexibilidad de la secuencia polipeptídica de la región bisagra de la inmunoglobulina pueden afectar las funciones efectoras de la porción Fc del anticuerpo.

El término “anticuerpo monoclonal” se utiliza de acuerdo con su significado común para denotar un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones de presentación natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Es decir, un anticuerpo monoclonal consiste en un anticuerpo homogéneo que es el resultado de la proliferación de un único clon de células (por ejemplo, células de hibridoma, células hospedadoras eucarióticas transfectadas con ADN que codifica el anticuerpo homogéneo, células hospedadoras procarióticas transformadas con ADN que codifica el anticuerpo homogéneo, etc.), y el cual es generalmente caracterizado por cadenas pesadas de una única clase y subclase, y cadenas ligeras de un solo tipo. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un único antígeno. Adicionalmente, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes, o epítopo, cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un único determinante en el antígeno.

En la presente descripción, los términos polipéptidos, secuencias de polipéptidos, secuencias de aminoácidos, péptidos y proteínas unidos a compuestos de anticuerpo o a su secuencia son intercambiables.

Se proporciona en la presente memoria un anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional divalente del mismo, siendo dicho anticuerpo apto para inhibir la dimerización de c-Met, y comprendiendo una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC iD n° 1,2 y 3; y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 5, 6 y 7, en el que dicho anticuerpo o un fragmento funcional divalente del mismo está caracterizado además por que:

i) dicho anticuerpo o un fragmento funcional divalente del mismo, comprende asimismo una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 28 y

ii) dicho anticuerpo o un fragmento funcional divalente del mismo, está acoplado químicamente a un agente citotóxico.

Es divulgado en la presente memoria un anticuerpo monoclonal, o a un fragmento o derivado del mismo funcional divalente, capaz de inhibir la dimerización de c-Met y que comprende una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 1, 2 y 3 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de la alineación óptima con secuencias SEC ID n° 1, 2 y 3; y una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 5, 6 y 7 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 5, 6 o 7, estando dicho anticuerpo adicionalmente caracterizado por que también comprende una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 21.

La expresión “fragmentos y derivados funcionales” será definida en detalle a continuación en la presente memoria.

Por regiones CDR o CDR(s), se pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas según lo definido por IMGT.

La numeración única de IMGT ha sido definida para comparar los dominios variables cualquiera sea el receptor del antígeno, el tipo de cadena o la especie [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. y Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. En la numeración única de IMGT, los aminoácidos conservados siempre tienen la misma posición, por ejemplo cisteína 23 (1er-CYS), triptófano 41 (TRP-CONSERVADO), aminoácido hidrófobo 89, cisteína 104 (2da-CYS), fenilalanina o triptófano 118 (J-PHE o J-TRP). La numeración única de IMGT proporciona una delimitación estandarizada de las regiones estructurales (FR1-IMGT: posiciones 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 y FR4-IMGT: 118 a 128) y de las regiones determinantes de complementariedad: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3-IMGT: 105 a 117. Como los espacios vacíos representan posiciones no ocupadas, las longitudes de c DR-IMGT (mostradas entre corchetes y separadas por puntos, por ej. [8.8.13]) resultan una información crucial. La numeración única de IMGT se utiliza en representaciones gráficas en 2D, designadas como IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. y Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], y en las estructuras en 3D en IMGT/estructura 3D-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., T cell receptor and Mh C structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Existen tres CDR de cadena pesada y 3 CDR de cadena ligera. El término CDR o CDR se utiliza en esta invención con el fin de indicar, de acuerdo con el caso, una de estas regiones o varias, o incluso la totalidad, de estas regiones las cuales contienen la mayoría de los residuos de aminoácidos responsables de la unión por afinidad del anticuerpo para el antígeno o el epítopo el cual reconoce.

Por “porcentaje de identidad” entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos en el sentido de la presente invención, tiene el propósito de indicar un porcentaje de nucleótidos o de residuos aminoácidos idénticos entre las dos secuencias que se van a comparar, obtenidas después de la mejor alineación (alineación óptima), siendo este porcentaje puramente estadístico y las diferentes entre las dos secuencias son distribuidas al azar y por toda su longitud.

Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se llevan a cabo, tradicionalmente, comparando estas secuencias después de haberlas alineado en forma óptima, siendo dicha comparación capaz se ser llevada a cabo por segmento o por “ventana de comparación”. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, además de manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], por medio del algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], por medio del método de investigación de similitudes de Pearson y Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444), por medio de programas informáticos que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o sino mediante programa informático de comparación BLAST N o BLAST P).

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se determina comparando estas dos secuencias alineadas en forma óptima y en las cuales la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos a ser comparadas pueden comprender adiciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia para una alineación óptima entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando la cantidad de posiciones idénticas para las cuales el nucleótido o el residuo aminoácido es idéntico entre las dos secuencias, dividiendo este número de posiciones idénticas por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado obtenido por 100 con el fin de obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Por ejemplo, es posible utilizar el programa BLAST, “secuencias BLAST 2” (Tatusova et al., “Blast 2 sequences -a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible en el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/bl2.html, siendo los parámetros utilizados aquellos proporcionados por error (en particular para los parámetros “open gap penalty”: 5, y “extension gap penalty”: 2; siendo la matriz seleccionada, por ejemplo, la matriz “BLOSUM 62” propuesta por el programa), el porcentaje de identidad entre las dos secuencias que se van a comparar es calculado directamente por el programa.

Por secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia, aquellas que tienen, con respecto a la secuencia de referencia, ciertas modificaciones, en particular una deleción, adición o sustitución de por lo menos un aminoácido, una truncación o una elongación son preferidas. En el caso de una sustitución de uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos, las sustituciones son preferidas en las cuales los aminoácidos sustituidos son reemplazados por aminoácidos “equivalentes”. La expresión “aminoácidos equivalentes” tiene el propósito de indicar cualquier aminoácido capaz de ser sustituido con uno de los aminoácidos de la estructura de base sin, sin embargo, modificar esencialmente las actividades biológicas de los anticuerpos correspondientes y como serán definidos más adelante, especialmente en los ejemplos. Estos aminoácidos equivalentes pueden ser determinados ya sea basándose en su homología estructural con los aminoácidos que los mismos reemplazan, o en los resultados de ensayos comparativos de actividad biológica entre los diferentes anticuerpos capaces de llevarse a cabo.

A título de ejemplo, se mencionan las posibilidades de sustitución que pueden ser llevadas a cabo sin dar como resultado una modificación profunda de la actividad biológica del anticuerpo modificado correspondiente.

Como ejemplo no limitativo, la siguiente tabla 1 proporciona posibilidades de sustitución concebibles con una conservación de la actividad biológica del anticuerpo modificado. Las sustituciones inversas también son, naturalmente, posibles en las mismas condiciones.

Tabla 1

Debe apreciarse que la presente divulgación no se refiere a los anticuerpos en forma natural, es decir, no están en su medio ambiente natural pero que han sido capaces de ser aislados u obtenidos por purificación de fuentes naturales, o han sido obtenidos mediante recombinación genética, o mediante síntesis química, y pueden entonces contener aminoácidos no naturales como será descrito a continuación.

Se proporciona en la presente memoria más particularmente un anticuerpo divalente quimérico y/o humanizado, o cualquier fragmento o derivado funcional divalente, con una actividad antagonista. Los anticuerpos divalentes de la técnica anterior son agonistas o agonistas parciales. Este anticuerpo monoclonal, incluyendo una bisagra modificada según lo descrito anteriormente, es decir, incluyendo una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 56, 57 o 21, es nuevo y presenta la particularidad de tener una actividad antagonista mejorada en comparación con el anticuerpo quimérico o humanizado 224G11 sin ese tipo de bisagra modificada como será evidente de los ejemplos siguientes.

Contrariamente a la técnica anterior, los inventores han obtenido una actividad antagonista mejorada sin modificar el formato del anticuerpo. De hecho, en la técnica previa más cercana representada por el anticuerpo 5D5, ha sido necesario desarrollar un fragmento monovalente del anticuerpo para generar una actividad antagonista. Mediante el uso de la bisagra proporcionada en la presente memoria, es posible, por primera vez, obtener un anticuerpo divalente completo con mayor actividad antagonista, y esto se opone al conocimiento general.

En una forma de realización preferida, el anticuerpo comprende una región bisagra que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID n° 22 a 28, o una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80% tras la alineación óptima con las secuencias SEC ID n° 22 a 28.

Para más claridad, la tabla 2 siguiente reagrupa a los aminoácidos y secuencias de nucleótidos de las diferentes bisagras preferidas de la invención.

Tabla 2

De acuerdo con un primer enfoque, el anticuerpo será definido por su secuencia de cadena pesada. Más particularmente, es divulgado que el anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, es caracterizado por que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una CDR seleccionada entre las CDR que comprenden las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 1 a 3.

Las secuencias mencionadas son las siguientes:

SEC ID n° 1: GYIFTAYT

SEC ID n° 2: IKPNNGLA

SEC ID n° 3: ARSEITTEFDY

Según un aspecto preferido es divulgado que el anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una, preferentemente dos, y todavía más preferentemente tres, CDR(s) seleccionadas entre c Dr -H1, CDR-H2 y CDR-H3, donde:

- CDR-H1 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 1,

- CDR-H2 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 2,

- CDR-H3 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 3.

En un segundo enfoque, el anticuerpo será a continuación definido por su secuencia de cadena ligera. Más particularmente, según un segundo aspecto particular, el anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, es caracterizado por que comprende una cadena ligera que comprende por lo menos una CDR seleccionada entre CDR que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 5 a 7.

Las secuencias mencionadas son las siguientes:

SEC ID n° 5: ESVDSYANSF

SEC ID n° 6: RAS

SEC ID n° 7: QQSKEDPLT

Según otro aspecto preferido, el anticuerpo de la invención, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, que comprende una cadena ligera que comprende por lo menos una, preferentemente dos, y todavía más preferentemente tres, CDR(s) seleccionadas entre CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, donde:

- CDR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 5,

- CDR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 6,

- CDR-L3 comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 7.

El hibridoma murino capaz de secretar anticuerpos monoclonales descritos en la presente memoria, especialmente hibridoma de origen murino, fue depositado en el CNCM (Institut Pasteur, París, Francia) el 14/03/2007 bajo el número CNCM I-3731.

En la presente solicitud, se prefiere que IgG1 obtengan funciones efectoras, y todavía más preferentemente, ADCC y CDC.

El experto en la materia reconocerá que las funciones efectoras incluyen, por ejemplo, unión de Clq; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCC); fagocitosis; y regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo el receptor de células B; BCR).

Los presentes anticuerpos son preferentemente anticuerpos monoclonales específicos, especialmente de origen murino, quimérico o humanizado, los cuales pueden ser obtenidos de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos por el experto en la materia.

En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos o derivados funcionales, especialmente de origen murino, es posible hacer referencia a técnicas que son descritas en particular en el manual “Antibodies” (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) o a la técnica de preparación a partir de hibridomas descrita por Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

Los anticuerpos monoclonales descritos en la presente memoria pueden obtenerse, por ejemplo, de una célula animal inmunizada con el c-Met, o uno de sus fragmentos que contiene el epítopo específicamente reconocido por dichos anticuerpos monoclonales. Dicho c-Met, o uno de sus fragmentos, puede especialmente ser producido de acuerdo con los métodos de elaboración usuales, mediante recombinación genética comenzando con una secuencia de ácidos nucleicos contenida en la secuencia de ADNc que codifica al c-Met o por síntesis peptídica comenzando a partir de una secuencia de aminoácidos comprendida en la secuencia peptídica del c-Met.

Los anticuerpos monoclonales descritos en la presente memoria pueden ser, por ejemplo, purificados en una columna de afinidad en la cual el c-Met o uno de sus fragmentos que contiene el epítopo específicamente reconocido por dichos anticuerpos monoclonales ha sido previamente inmovilizado. Más particularmente, dichos anticuerpos monoclonales pueden ser purificados por cromatografía en proteína A y/o G, seguido o no seguido por cromatografía de intercambio iónico que apunta a eliminar los contaminantes proteicos residuales así como también el ADN y el LPS, en si mismo seguido o no seguido por cromatografía de exclusión en gel Sepharose™ con el fin de eliminar los potenciales agregados debido a la presencia de dímeros o de otros multímeros. En una forma aún más preferida, la totalidad de estas técnicas pueden utilizarse en forma simultánea o consecutiva.

El presente anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, consiste preferentemente en un anticuerpo quimérico.

Por anticuerpo quimérico, se pretende indicar un anticuerpo el cual contiene una región variable natural (de cadena pesada y cadena ligera) derivada de un anticuerpo de una especie determinada en combinación con las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada de un anticuerpo de una especie heteróloga a dicha especie determinada (por ejemplo, ratón, caballo, conejo, perro, vaca, gallina, etc.).

Los anticuerpos o sus fragmentos del tipo quimérico descritos en la presente memoria pueden prepararse utilizando las técnicas de recombinación genética. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico puede ser producido clonando un ADN recombinante que contiene un promotor y una secuencia que codifica la región variable de un anticuerpo monoclonal, no humano, especialmente murino, y una secuencia que codifica la región constante de anticuerpo humano. Un anticuerpo quimérico codificado por ese tipo de gen recombinante será, por ejemplo, una quimera de ratón- hombre, determinándose la especificidad de este anticuerpo por la región variable derivada del ADN murino y su isotipo determinado por la región constante derivada del a Dn humano. Para los métodos de preparación de anticuerpos quiméricos, es posible, por ejemplo, referirse a los documentos Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988), Morrison et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6851-6855, 1984) o patente US n° 4.816.567.

Más particularmente, dicho anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional, comprende un dominio variable de cadena pesada quimérico de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 46 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 46.

SEC. ID. n° 46: EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYIFTAYTMHWVRQSLGESLDWIGGIKPNNGLANYNQ KFKGKATLTVDKSSSTAYMDLRSLTSEDSAVYYCARSEITTEFDYWGQGTALTVSS

Más particularmente, dicho anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo funcional, comprende un dominio variable de cadena ligera quimérico de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 47 o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 47.

SEC ID n° 47: DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIP ARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSKEDPLTFGSGTKLEMKR

Más particularmente, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11][IgG2quim], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 22.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, denominado [224G11] [TH7quim], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 28.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [MHquim], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 23.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [MUP9Hquim], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 26.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, y denominado [224G11] [MMCHquim], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 46, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 47, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 24.

El presente anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, consiste preferentemente en un anticuerpo humano.

El término “anticuerpo humano” incluye a todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. En una forma de realización preferida, todos los dominios variables y constantes (o regiones) son derivados de secuencia de inmunoglobulina humana (anticuerpo totalmente humano). En otras palabras, incluye cualquier anticuerpo que presenta regiones variables y constantes (en caso de estar presentes) derivado de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana, es decir, que posee una secuencia de aminoácidos la cual corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que ha sido preparado utilizando cualquiera de las técnicas para la preparación de anticuerpos humanos conocidas por el experto en la materia.

En una forma de realización, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos mediante un hibridoma el cual incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que presenta un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humano y un transgén de cadena ligera fusionados a una célula inmortalizada.

Como ejemplo para ese tipo de ratón transgénico, puede mencionarse el XENOMOUSE™ el cual es una cepa de ratón modificada por ingeniería genética que comprende fragmentos grandes de los sitios de inmunoglobulina humana y es deficiente en la producción de anticuerpos de ratón (Green at al., 1994, Nature Genetics, 7:13-21). El XENOMOUSE™ produce un repertorio humano del tipo adulto de anticuerpos completamente humanos, y genera anticuerpos monoclonales humanos específico para el antígeno. Una segunda generación XENOMOUSE™ contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos (Green & Jakobovits, 1998, J. Exp. Med., 188:483-495).

Cualquier otra técnica conocida por el experto en la materia, tal como la técnica de exhibición de fagos, también puede utilizarse para la generación de anticuerpo humano.

Preferentemente, dicho anticuerpo, o su fragmento o derivado funcional divalente, consiste en un anticuerpo humanizado.

Mediante la expresión “anticuerpo humanizado”, se pretende indicar un anticuerpo el cual contiene regiones CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano, las otras partes de la molécula del anticuerpo son derivadas de uno (o de varios) anticuerpos humanos. Asimismo, algunos de los residuos de los segmentos del esqueleto (denominado FR) pueden ser modificados con el fin de conservar la afinidad de la unión (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).

Los anticuerpos humanizados de acuerdo con la invención o sus fragmentos pueden prepararse mediante técnicas conocidas por el experto en la materia (tales como, por ejemplo, aquellas descritas en los documentos Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; o Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992).

El experto en la materia conoce otros métodos de humanización como, por ejemplo, el método “CDR Grafting” (“ Injerto de CDR”) descrito por Protein Design Lab (PDL) en las solicitudes de patente EP 0451216, EP 0682040, EP 0939 127, EP 0566 647 o las patentes US n° 5.530.101, US n° 6.180.370, US n° 5.585.089 y US n° 5.693.761. También pueden mencionarse las siguientes solicitudes de patentes: US n° 5.639.641; US n° 6.054.297; US n° 5.886.152 y US n° 5.877.293.

Más particularmente dicho anticuerpo, o un fragmento funcional o derivado del mismo, comprende un dominio variable de cadena pesada humanizado de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4, o una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80% tras una alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 4.

SEC. ID. n° 4: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLAN YAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSS

Más particularmente, dicho anticuerpo, o un fragmento funcional o derivado del mismo, comprende un dominio variable de cadena ligera humanizado seleccionado de entre el grupo de secuencias que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 8, 9 o 10 o una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80% tras una alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 8, 9 o 10.

SEC. ID. n° 8: DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDR FSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKR

SEC. ID. n° 9: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPD RFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKR

SEC. ID. n° 10: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFLHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGV PDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKR

Más particularmente, un anticuerpo preferido o su fragmento o derivado funcional divalente, denominado [224G11] [IgG2Hz1], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 8, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 22.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido o su fragmento o derivado funcional divalente, denominado [224G11] [IgG2Hz2], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 9, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 22.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido, o su fragmento o derivado funcional divalente, denominado [224G11] [IgG2Hz3], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 10, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 22.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, denominado [224G11] [TH7Hz1], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 8, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 28.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, denominado [224G11] [TH7z2], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 9, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 28.

En otro aspecto, un anticuerpo preferido o un fragmento funcional divalente o derivado del mismo, denominado [224G11] [TH7Hz3], comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4, un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 10, y una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 28.

En otro aspecto, los presentes anticuerpos pueden describirse por sus cadenas pesadas y ligeras totales, respectivamente.

Como ejemplo, el anticuerpo [224G11] [IgG2quim] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 50, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 50, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo, el anticuerpo [224G11] [TH7quim] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 51, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 51, y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 52, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 52.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [IgG2Hz1] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 36, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 36 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 38, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 38.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [IgG2Hz2] de la invención comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 36, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 36 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 39, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 39.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [IgG2Hz3] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 36, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 36 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 40, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 40.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [TH7Hz1] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 37, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 37 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 38, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 38.

Como otro ejemplo el anticuerpo [224G11] [TH7Hz2] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 37, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 37 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 39, o una secuencia que tiene por lo menos 80% de identidad después de alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 39.

El anticuerpo [224G11] [TH7Hz3] comprende una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 37 y una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 40.

Por “fragmento funcional” de un anticuerpo, tiene el propósito de indicar en particular un fragmento de anticuerpo, tal como fragmentos Fv, scFv (sc por cadena simple), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc o diacuerpos, o cualquier fragmento del cual el tiempo de vida media se habría incrementado mediante modificación química, tal como la adición de poli(alquilen)glicol tal como poli(etilen)glicol (“PEGilación”) (fragmentos pegilados denominados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG o Fab'-PEG) (“PEG” por Poli(Etilen) Glicol), o mediante la incorporación en un liposoma, teniendo dichos fragmentos por lo menos una de las CDR características de secuencia SEC ID n° 1 a 3 y de 5 a 7, y, especialmente, en que es capaz de ejercer en forma general una actividad parcial uniforme del anticuerpo del cual desciende, tal como, en particular, la capacidad de reconocer y de unirse al c-Met, y, en caso necesario, inhibir la actividad del c-Met.

Preferentemente, dichos fragmentos funcionales estarán constituidos por o comprenderán una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo del cual derivan, siendo dicha secuencia parcial suficiente para retener la misma especificidad de unión que el anticuerpo del cual desciende y una afinidad suficiente, preferentemente por lo menos igual a 1/100, en un modo más preferido hasta por lo menos 1/10, de la del anticuerpo del cual desciende, con respecto al c-Met. Ese tipo de fragmento funcional contendrá por lo menos 5 aminoácidos, preferentemente 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 50 y 100 aminoácidos consecutivos de la secuencia del anticuerpo del cual desciende.

Preferentemente, estos fragmentos funcionales serán fragmentos de tipo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc o diacuerpos, los cuales generalmente tienen la misma especificidad de unión que el anticuerpo del cual descienden. Más preferentemente, estos fragmentos son seleccionados entre fragmentos divalentes tales como fragmentos F(ab')2. Los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse comenzando de anticuerpos tales como los descritos anteriormente mediante métodos tales como digestión por enzimas, tal como pepsina y/o papaína y/o por disociación de los puentes disulfuro mediante reducción química. De otro modo, los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse mediante técnicas de recombinación genética asimismo bien conocidas por el experto en la materia o de otro modo mediante síntesis peptídica por medio de, por ejemplo, sintetizadores peptídicos automáticos tales como aquellos suministrados por la compañía Applied Biosystems, etc.

Por “fragmento divalente”, debe entenderse cualquier fragmento de anticuerpo que comprende dos brazos y, más particularmente, fragmentos F(ab')2.

Por “derivados” de un anticuerpo, se hace referencia a una proteína de unión que comprende una estructura proteica y por lo menos una de las CDR seleccionadas del anticuerpo original con el fin de mantener la capacidad de unión. Dichos compuestos son bien conocidos por el experto en la materia y serán descritos con mayor detalle en la siguiente memoria.

Más particularmente, el anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, descrito en la presente memoria está caracterizado por que dicho derivado consiste en una proteína de unión que comprende una estructura en la cual por lo menos una CDR ha sido injertada para la conservación de las propiedades de reconocimiento paratópicas del anticuerpo original.

Una o varias secuencias a través de las 6 secuencias de CDR descritas en la presente memoria pueden presentarse en una estructura proteica. En este caso, la estructura proteica reproduce el armazón proteico con pliegue apropiado de las CDR(s) injertada(s), permitiéndole(s) mantener sus propiedades de reconocimiento paratópicas del antígeno.

El experto en la materia sabe cómo seleccionar la estructura proteica sobre la cual por lo menos una CDR seleccionada del anticuerpo original podría ser injertada. Más particularmente, es conocido que, para ser seleccionada, dicha estructura debería exhibir diversas características como sigue (Skerra A., J. Mol. Recogn., 13, 2000, 167-187):

- filogenéticamente buena conservación,

- arquitectura robusta con una organización molecular tridimensional bien conocida (tal como, por ejemplo, cristalografía o RMN),

- tamaño pequeño,

- ningún grado o solamente bajo grado de modificaciones postraducción,

- fácil de producir, expresar y purificar.

Dicha estructura proteica puede ser, aunque sin limitarse a, una estructura seleccionada del grupo formado por fibronectina y preferentemente el décimo dominio del tipo III de fibronectina (FNfn10), lipocalina, anticalina (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4):257-75), el derivado de proteína Z del dominio B de la proteína A estafilocóccica, tioredoxina A o cualquier proteína con dominio repetido tal como “repetición de anquirina” (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No.4, 1700-1705), “repetición de armadillo”, “repetición rica en leucina” o “repetición de tetratricopéptido”. También puede mencionarse el derivado de estructura de toxinas (tales como, por ejemplo, toxinas de escorpión, insecto, planta o molusco) o inhibidores proteicos de la sintasa de óxido nítrico neuronal (PIN).

Como un ejemplo no limitativo de dichas construcciones híbridas, puede mencionarse la inserción de la CDR-H1 (cadena pesada) de un anticuerpo anti-CD4, es decir, el anticuerpo 13B8.2, en uno de los lazos expuestos de la PIN. Las propiedades de unión de la proteína de unión obtenida siguen siendo similares al anticuerpo original (Bes et al., BBRC 343, 2006, 334-344). También puede mencionarse el injerto de la CDR-H3 (cadena pesada) de un anticuerpo VHH anti-lisozima en un lazo de neocarzinostatina (Nicaise et al., 2004).

Según lo mencionado anteriormente, dicha estructura proteica puede comprender entre 1 y 6 CDR(s) del anticuerpo original. En una forma de realización preferida, pero sin limitación alguna, el experto en la materia seleccionaría por lo menos una CDR de la cadena pesada, sabiendo que dicha cadena pesada está particularmente implicada en la especificidad del anticuerpo. La selección de la(s) CDR(s) de interés será evidente para el experto en la materia con método conocido (BES et al., FEBS letters 508, 2001, 67-74).

Como una evidencia, estos ejemplos no son limitativos y cualquier otra estructura conocida o descrita debe estar incluida en la presente memoria descritiva.

Según otro aspecto, se proporciona en la presente memoria un ácido nucleico aislado, siendo dicho ácido nucleico seleccionado de entre los siguientes ácidos nucleicos:

a) un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, descrito en la presente memoria;

b) una secuencia de ácidos nucleicos que comprende las secuencias SEC ID n° 11, SEC ID n° 12, SEC ID n° 13 y las secuencias SEC ID n° 15, SEC ID n° 16 y SEC ID n° 17;

c) una secuencia de ácidos nucleicos que comprende las secuencias SEC ID n° 14 y SEC ID n° 18, 19 o 20; d) los correspondientes ácidos nucleicos de ARN de los ácidos nucleicos según lo definido en b) o c); e) los ácidos nucleicos complementarios de los ácidos nucleicos según lo definido en a), b) y c); y f) un ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos apto para hibridar en condiciones de severidad elevada con por lo menos una de las CDR de secuencia SEC ID n° 11 a 13 y 15 a 17.

Por ácido nucleico, nucleico o secuencia de ácido nucleico, polinucleótido, oligonucleótido, secuencia de polinucleótidos, secuencia de nucleótidos, términos que serán empleados en forma indistinta en la presente memoria, se pretende indicar una ligación precisa de nucleótidos, los cuales están modificados o sin modificar, permitiendo la definición de un fragmento o una región de un ácido nucleico, que contiene o no contiene nucleótidos no naturales, y pudiendo corresponder también con un ADN de doble hebra, un ADN de hebra simple como a los productos de transcripción de dichos ADN.

Debe entenderse también en este punto que la presente divulgación no se ocupa de las secuencias de nucleótidos en su entorno cromosómico natural, es decir, en el estado natural. Se refiere a secuencias las cuales han sido aisladas y/o purificadas, es decir, han sido seleccionadas en forma directa o indirecta, por ejemplo por copia, habiendo sido su entorno por lo menos parcialmente modificado. Por lo tanto, asimismo se pretende indicar en este punto los ácidos nucleicos aislados obtenidos por recombinación genética por medio de, por ejemplo, células hospedadoras u obtenidos por síntesis química.

Una hibridación bajo condiciones de elevada severidad significa que las condiciones de temperatura y las condiciones de resistencia iónica se seleccionan de modo tal que permiten el mantenimiento de la hibridación entre dos fragmentos de ADN complementario. A modo de ilustración, las condiciones de elevada severidad de la etapa de hibridación para los propósitos de definir los fragmentos polinucleotídicos antes descritos son ventajosamente las siguientes.

La hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN se lleva a cabo en dos etapas: (1) prehibridación a 42°C durante 3 horas en tampón de fosfato (20 mM, pH 7,5) que contiene 5 x SSC (1 x SSC corresponde a una solución de NaCl 0.15 M citrato sódico 0.015 M), 50% de formamida, 7% de dodecilsulfato sódico (SDS), 10 x Denhardt's, 5% de sulfato de dextrano y 1% de ADN de esperma de salmón; (2) hibridación real durante 20 horas a una temperatura dependiente del tamaño de la sonda (es decir,: 42°C, para un tamaño de sonda > 100 nucleótidos) seguido por 2 lavados de 20 minutos a 20°C en 2 x SSC 2% de s Ds , 1 lavado de 20 minutos a 20°C en 0,1 x Ss C 0,1% de SDS. El último lavado se lleva a cabo en 0,1 x SSC 0,1% de SDS durante 30 minutos a 60°C para un tamaño de sonda de > 100 nucleótidos. Las condiciones de hibridación de elevada severidad antes descritas para un polinucleótido de tamaño definido pueden adaptarse por el experto en la materia para oligonucleótidos de tamaño mayor o menor, de acuerdo con las enseñanzas de Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual.

2nd Ed. Cold Spring Harbor).

La presente divulgación se refiere asimismo a un vector que comprende un ácido nucleico como se describe en la presente memoria.

La divulgación se refiere especialmente a vectores de clonación y/o expresión que contienen una secuencia de nucléotidos como se describe en la presente memoria.

Los presentes vectores preferentemente contienen elementos los cuales permiten la expresión y/o la secreción de las secuencias de nucleótidos traducidas en unas células hospedadoras determinadas. Por lo tanto, el vector debe contener un promotor, señales de iniciación y terminación de la traducción, así como también regiones apropiadas de regulación de la transcripción. Debe poder mantenerse en forma estable en la célula hospedadora y puede opcionalmente tener señales particulares las cuales especifican la secreción de la proteína traducida. Estos elementos diferentes son seleccionados y optimizados por el experto en la materia en función de la célula hospedadora utilizada. Con este fin, las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria pueden insertarse en vectores de replicación autónomos en el hospedador seleccionado, o pueden ser vectores integrativos del hospedador seleccionado.

Ese tipo de vectores son preparados mediante métodos actualmente utilizados por el experto en la materia, y los clones resultantes pueden ser introducidos en un hospedador apropiado mediante métodos convencionales, tales como lipofección, electroporación, choque térmico, o métodos químicos.

Los vectores descritos en la presente memoria son, por ejemplo, vectores de origen plasmídico o viral. Son útiles para transformar células hospedadoras con el fin de clonar o expresar las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria.

Son proporcionadas asimismo unas células hospedadoras transformadas mediante o que comprenden un vector descrito en la presente memoria.

La célula hospedadora puede seleccionarse entre sistemas procarióticos o eucarióticos, por ejemplo, células bacterianas pero asimismo células de levadura o células animales, en particular células de mamífero. Es asimismo posible utilizar células de insecto o células vegetales.

Son proporcionados asimismo animales, excepto el hombre, que comprenden por lo menos una célula transformada como se describe en la presente memoria.

Otro aspecto se refiere a un proceso para la producción de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales descrito en la presente memoria, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) cultivar en un medio y unas condiciones de cultivo apropiadas una célula hospedadora descrita en la presente memoria; y

b) recuperar dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, producidos de ese modo a partir del medio de cultivo o dichas células cultivadas.

Las células transformadas como se describe en la presente memoria pueden utilizarse en procesos para la preparación de polipéptidos recombinantes. Los procesos para la preparación de un polipéptido descrito en la presente memoria en forma recombinante, caracterizado por que emplean un vector y/o una célula transformada mediante un vector descrito en la presente memoria, están comprendidos en la presente divulgación. Preferentemente, una célula transformada por un vector descrito en la presente memoria se cultiva bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido y se recupera dicho péptido recombinante.

Según lo mencionado, la célula hospedadora puede seleccionarse entre sistemas procarióticos o eucarióticos. En particular, es posible identificar secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención, facilitando la secreción en dicho sistema procariótico o eucariótico. Un vector de acuerdo con la invención portador de ese tipo de secuencia puede, por lo tanto, utilizarse ventajosamente para la producción de proteínas recombinantes, destinadas a ser secretadas. En efecto, la purificación de estas proteínas recombinantes de interés será facilitada por el hecho de que están presentes en el sobrenadante del cultivo celular más que en el interior de las células hospedadoras.

Es asimismo posible preparar los polipéptidos descritos en la presente memoria mediante síntesis química. Ese tipo de proceso de preparación es asimismo un objeto de la presente divulgación. El experto en la materia conoce los procesos de síntesis química, por ejemplo las técnicas que emplean fases sólidas [Steward et al., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2da ed., (1984)] o técnicas que utilizan fases sólidas parciales, por condensación de fragmentos o mediante una síntesis clásica en solución. Los polipéptidos obtenidos mediante síntesis química y que son capaces de contener aminoácidos no naturales correspondientes están asimismo comprendidos en la presente divulgación.

Los anticuerpos, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, pueden ser obtenidos mediante un procedimiento descrito en la presente memoria son comprendidos asimismo en la presente divulgación.

La divulgación se refiere asimismo al presente anticuerpo como un medicamento.

Se proporciona en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende a modo de principio activo un compuesto que consiste en un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales descrito en la presente memoria, preferentemente mezclado con un excipiente y/o un vehículo aceptable para uso farmacéutico.

Otra forma de realización de la divulgación consiste en una composición tal como se describe con anterioridad la cual comprende, adicionalmente, como un producto de combinación para el uso simultáneo, separado o consecutivo, un anticuerpo antitumoral.

Todavía más preferentemente, dicho segundo anticuerpo antitumoral podría seleccionarse entre los anticuerpos anti-IGF-IR, anti-EGFR, anti-HER2/neu, anti-VEGFR, anti-VEGF, etc.,o entre cualquiera de los otros anticuerpos antitumorales conocidos por el experto en la materia. Resulta evidente que el uso, como segundo anticuerpo, de fragmentos funcionales o derivados de los anticuerpos mencionados anteriormente forma parte de la divulgación.

Como un anticuerpo más preferido, los anticuerpos anti-EGFR se seleccionan tal como por ejemplo el anticuerpo C225 (Erbitux).

“Uso simultáneo” quiere decir la administración de los dos compuestos de la composición descrita en la presente memoria en una forma farmacéutica única e idéntica.

“Uso por separado” se entiende que significa la administración, al mismo tiempo, de los dos compuestos de la composición descrita en la presente memoria en formas farmacéuticas distintas.

“Uso consecutivo” debe apreciarse que significa la administración sucesiva de los dos compuestos de la composición descrita en la presente memoria, cada uno en una forma farmacéutica distinta.

De manera general, la composición aumenta considerablemente la eficacia del tratamiento del cáncer. En otras palabras, el efecto terapéutico de los anticuerpos anti-c-Met con la invención es potenciado en forma inesperada mediante la administración de un agente citotóxico. Otra ventaja subsiguiente principal producida por dicha composición se refiere a la posibilidad de utilizar dosis eficaces inferiores de principio activo, lo cual permite evitar los riesgos de aparición de efectos secundarios o la reducción de los mismos, en particular los efectos del agente citotóxico.

Además, esta composición permitiría el logro del efecto terapéutico esperado de manera más rápida.

La composición también puede ser caracterizada por que comprende, adicionalmente, como un producto combinado para el uso simultáneo, separado o consecutivo, un agente citotóxico/citostático.

Por “agentes terapéuticos anticancerígenos” o “agentes citotóxicos/citostáticos”, se quiere decir una sustancia la cual, cuando se administra a un sujeto, trata o previene el desarrollo de cáncer en el cuerpo del sujeto. Como un ejemplo no limitativo de ese tipo de agentes, puede mencionarse agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, inhibidores mitóticos, inhibidores de la función de cromatina, agentes antiangiogénesis, antiestrógenos, antiandrógenos o inmunomoduladores.

Dichos agentes son, por ejemplo, citados en la edición 2001 de VIDAL, en la página dedicada a los compuestos vinculados con la columna de cancerología y hematología “Citotóxicos”, estos compuestos citotóxicos citados haciendo referencia a este documento son citados en la presente memoria como agentes citotóxicos preferidos.

Más particularmente, los agentes siguientes son preferidos.

“Agente alquilante” se refiere a cualquier sustancia la cual puede entrecruzar o alquilar cualquier molécula, con preferencia, ácido nucleico (por ejemplo, ADN), dentro de una célula. Los ejemplos de agentes alquilantes incluyen mostaza de nitrógeno tal como mecloretamina, clorambucol, melfalen, cloridrato, pipobromen, prednimustina, fosfato disódico o estramustina; oxazoforinas tales como ciclofosfamida, altretamina, trofosfamida, sulfofosfamida o ifosfamida; aziridinas o imina-etilenos tales como tiotepa, trietilenamina o altetramina; nitrosourea tales como carmustina, estreptozocina, fotemustina o lomustina; alquilen-sulfonatos tales como busulfan, treosulfan o improsulfan; triacenos tales como dacarbazina; o complejos de platino tales como cis-platino, oxaliplatino y carboplatino.

“Antimetabolitos” se refieren a sustancias que bloquean el crecimiento y/o el metabolismo celular interfiriendo con ciertas actividades, generalmente con la síntesis del ADN. Los ejemplos de anti-metabolitos incluyen metotrexato, 5-fluoruracilo, floxuridina, 5-fluorodesoxiuridina, capecitabina, citarabina, fludarabina, arabinósido de citosina, 6-mercaptopurina (6-MP), 6-tioguanina (6-TG), clorodesoxiadenosina, 5-azacitidina, gemcitabina, cladribina, desoxicoformicina y pentostatina.

“Antibióticos antitumorales” se refieren a compuestos los cuales pueden evitar o inhibir la síntesis del ADN, ARN y/o proteína. Los ejemplos de antibióticos antitumorales incluyen doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, valrubicina, mitoxantrona, dactinomicina, mitramicina, plicamicina, mitomicina C, bleomicina, y procarbazina.

“ Inhibidores mitóticos” previenen la evolución normal del ciclo celular y la mitosis. En general, los inhibidores microtubulares o taxoides tales como paclitaxel y docetaxel son capaces de inhibir la mitosis. Los alcaloides de la Vinca tales como vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina son también capaces de inhibir la mitosis.

“ Inhibidores de la función de la cromatina” o “inhibidores de la topoisomerasa” se refieren a sustancias las cuales inhiben la función normal de las proteínas de modelado de la cromatina tales como topoisomerasa I o topoisomerasa II. Los ejemplos de los inhibidores de la función de la cromatina incluyen, para topoisomerasa I, camptotecina y sus derivados tales como topotecan o irinotecan, y, para la topoisomerasa II, etopósido, fosfato de etopósido y tenipósido.

“Agente antiangiogénesis” se refiere a cualquier fármaco, compuesto, sustancia o agente el cual inhibe el crecimiento de los vasos sanguíneos. Los agentes antiangiogénesis ejemplares incluyen, aunque sin limitarse a, razoxina, marimastat, batimastat, prinomastat, tanomastat, ilomastat, CGS-27023A, halofuginon, COL-3, neovastat, BMS-275291, talidomida, CDC 501, DMXAA, L-651582, escualamina, endostatina, SU5416, SU6668, interferón-alfa, EMD121974, interleucina-12, IM862, angiostatina y vitaxin.

“Antiestrógeno” o “agente antiestrogénico” se refiere a cualquier sustancia la cual reduce, antagoniza o inhibe la acción de estrógeno. Los ejemplos de agentes antiestrogénicos son tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno, iodoxifeno, anastrozol, letrozol, y exemestano.

“Antiandrógenos” o “agentes antiandrógenos” se refiere a cualquier sustancia la cual reduce, antagoniza o inhibe la acción de un andrógeno. Los ejemplos de antiandrógenos son flutamida, nilutamida, bicalutamida, espironolactona, acetato de ciproterona, finasterida y cimitidina.

“Inmunomoduladores” son sustancias que estimulan el sistema inmunitario.

Los ejemplos de inmunomoduladores incluyen interferón, interleucina tales como aldesleucina, OCT-43, denileucina diflitox y interleucina-2, factores de necrosis tumoral tales como tasonermina u otros inmunomoduladores tales como lentinan, sizofiran, roquinimex, pidotimod, pegademase, timopentina, poli I:C o levamisol en conjunto con 5-fluorouracilo.

Para más detalle, el experto en la materia podría hacer referencia al manual editado por the “Association Frangaise des Enseignants de Chimie Thérapeutique” y titulado “Traité de chimie thérapeutique”, vol. 6, Médicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, edición TEC & DOC, 2003.

Se pueden mencionar además como agentes químicos o agentes citotóxicos, todos los inhibidores de cinasa tales como, por ejemplo, gefitinib o erlotinib.

En una forma de realización particularmente preferida, dicha composición como un producto de combinación es caracterizada por que dicho agente citotóxico es acoplado químicamente a dicho anticuerpo para uso simultáneo.

Con el fin de facilitar el acoplamiento entre dicho agente citotóxico y dicho anticuerpo, es especialmente posible introducir moléculas espaciadoras entre los dos compuestos que se van a acoplar, tales como poli(alquilen)glicoles tal como polietilenglicol, o sino aminoácidos, o, en otra forma de realización, para utilizar derivados activos de dichos agentes citotóxicos en los cuales se habrían introducido funciones capaces de reaccionar con dicho anticuerpo. Estas técnicas de acoplamiento son bien conocidas por el experto en la materia y no serán descritas con mayor detalle en la presente descripción.

En otro aspecto, se proporciona una composición, que está caracterizada por que uno, por lo menos, de dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, se conjuga con una toxina celular y/o un radioelemento.

Preferentemente dicha toxina o dicho radioelemento es capaz de inhibir por lo menos una actividad celular de células que expresan el c-Met, en un modo más preferido capaz de prevenir el crecimiento o la proliferación de dicha célula, especial o totalmente inactivando dicha célula.

Preferentemente asimismo dicha toxina es una toxina enterobacteriana, especialmente la exotoxina A de Pseudomonas.

Los radioelementos (o radioisótopos) preferentemente conjugados a los anticuerpos empleados para la terapia son radioisótopos los cuales emiten rayos gamma y preferentemente yodo131, itrio90, oro199, paladio100, cobre67, bismuto217 y antimonio211. Los radioisótopos los cuales emiten rayos beta y alfa pueden asimismo utilizarse para la terapia.

Por toxina o radioelemento conjugado a por lo menos un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, se pretende indicar cualesquier medios que permitan a dicha toxina o dicho radioelemento unirse a dicho por lo menos un anticuerpo, especialmente mediante acoplamiento covalente entre los dos compuestos, con o sin introducción de una molécula de enlace.

Entre los agentes que permiten la unión en una forma química (covalente), electrostática o no covalente de la totalidad o parte de los componentes del conjugado, puede mencionarse particularmente a la benzoquinona, carbodiimida y más particularmente EDC (clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetil-aminopropil]-carbodiimida), dimaleimida, ácido ditiobis-nitrobenzoico (DTNB), N-succinimidil S-acetil tio-acetato (SATA), los agentes puente que tienen uno o más grupos fenilazida que reaccionan con los ultravioletas (U.V.) y con preferencia N-[-4-(azidosalicilamino)butil]-3'-(2'-piridilditio)-propionamida (APDP), N-succinimid-il 3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), 6-hidrazinonicotinamida (HYNlC).

Otra forma de acoplamiento, especialmente para los radioelementos, puede consistir en el uso de un quelante iónico bifuncional.

Entre estos quelatos, es posible mencionar los quelatos derivados de EDTA (ácido etilendiaminatetraacético) o de DTPA (ácido dietilentriaminapentaacético) los cuales han sido desarrollados para unir metales, especialmente metales radiactivos e inmunoglobulinas. Por lo tanto, DTPA y sus derivados pueden ser sustituidos por diferentes grupos en la cadena de carbono con el fin de aumentar la estabilidad y la rigidez del complejo de ligando -metal (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); patente US n° 4.831.175).

Por ejemplo, el ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA) y sus derivados, los cuales han sido ampliamente utilizados en medicina y en biología durante un largo tiempo ya sea en su forma libre, o en la forma de un complejo con un ión metálico, tienen la característica notable de formar quelatos estables con iones metálicos y de ser acoplados con proteínas de interés terapéutico o de diagnóstico tales como anticuerpos para el desarrollo de radioinmunoconjugados en terapia contra el cáncer (Meases et al., 1984; Gansow et al., 1990).

Asimismo, preferentemente, dicho por lo menos un anticuerpo que forma dicho conjugado se selecciona de entre sus fragmentos funcionales, especialmente los fragmentos amputados de su componente de Fc tales como los fragmentos scFv.

Como se ha mencionado anteriormente, en una forma de realización, dicho agente citotóxico/ citostático o dicha toxina y/o un radioelemento es acoplado químicamente a por lo menos uno de los elementos de dicha composición para uso simultáneo.

La presente composición se proporciona asimismo como un medicamento.

La presente divulgación comprende el uso de dicha composición para la preparación de un medicamento.

En otro aspecto, la divulgación se refiere al uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, y/o de una composición según lo descrito anteriormente para la preparación de un medicamento destinado a inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células tumorales.

Otro aspecto de la divulgación consiste en el uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos o derivados funcionales y/o de una composición, según lo descrito anteriormente o el uso mencionado anteriormente, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento del cáncer.

Está comprendido asimismo en la presente divulgación un método destinado a inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células tumorales en un paciente que comprende la administración a un paciente que lo necesita de un anticuerpo, o de uno de sus fragmentos o derivados funcionales según la divulgación, un anticuerpo producido por un hibridoma según la divulgación o una composición según la divulgación.

La presente divulgación proporciona además un método para la prevención o el tratamiento del cáncer en un paciente que lo necesita, que comprende la administración al paciente de un anticuerpo, o de uno de sus fragmentos o derivados funcionales descrito en la presente memoria, un anticuerpo producido por un hibridoma descrito en la presente memoria o una composición descrita en la presente memoria.

En un aspecto preferido particular dicho cáncer es un cáncer seleccionado entre cáncer de próstata, osteosarcomas, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de endometrio, glioblastoma o cáncer de colon.

Como se ha explicado anteriormente, una ventaja de la invención consiste en el tratamiento de la activación de Met dependiente o independiente de HGF relacionada con cánceres.

La divulgación, todavía en otro aspecto, comprende un método de diagnóstico in vitro de enfermedades inducidas por una sobreexpresión o una expresión insuficiente del receptor c-Met comenzando a partir de una muestra biológica en la cual la presencia anormal del receptor c-Met es sospechada, estando dicho método caracterizado por que comprende un paso donde dicha muestra biológica se pone en contacto con un anticuerpo descrito en la presente memoria, siendo posible que dicho anticuerpo sea etiquetado en caso de ser necesario.

Preferentemente, dichas enfermedades conectadas con una presencia anormal del receptor c-Met en dicho método de diagnóstico serán cánceres.

Dicho anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, puede estar presente en la forma de un inmunoconjugado o de un anticuerpo etiquetado de modo de obtener una señal detectable y/o cuantificable.

Los anticuerpos etiquetados o sus fragmentos funcionales incluyen, por ejemplo, anticuerpos denominados inmunoconjugados los cuales pueden ser conjugados, por ejemplo, con enzimas tales como peroxidasa, fosfatasa alcalina, beta-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucosa amilasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa, lisozima, malato deshidrogenasa o glucosa 6-fosfato deshidrogenasa o mediante una molécula tal como biotina, digoxigenina o 5-bromodesoxiuridina. Las etiquetas fluorescentes pueden asimismo conjugarse a los anticuerpos o a sus fragmentos funcionales descritos en la presente memoria y especialmente incluyen fluoresceína y sus derivados, fluorocromo, rodamina y sus derivados, GFP (GFP por “Green Fluorescent Protein” (Proteína Fluorescente Verde), dansilo, umbeliferona etc. En ese tipo de conjugados, los anticuerpos o sus fragmentos funcionales pueden prepararse mediante métodos conocidos por el experto en la materia. Pueden acoplarse a las enzimas o a las etiquetas fluorescentes directamente o mediante el intermediario o un grupo espaciador o de un grupo de ligación tal como un polialdehído, tal como glutaraldehído, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), ácido dietilen-triaminapentaacético (DPTA), o en presencia de agentes de acoplamiento tales como aquellos antes mencionados para los conjugados terapéuticos. Los conjugados que contienen etiquetas de tipo fluoresceína pueden prepararse mediante reacción con un isotiocianato.

Otros conjugados pueden incluir, asimismo, etiquetas quimiluminiscentes tales como luminol y los dioxetanos, etiquetas bio-luminiscentes tales como luciferasa y luciferina, o sino etiquetas radiactivas tales como yodo123, yodo125, yodo126, yodo133, bromo77, tecnetio99m, indio111, indio113m, galio67, galio68, rutenio95, rutenio97, rutenio103, rutenio105, mercurio107, mercurio203, renio99m, renio101, renio105, escandio47, telurio121m, telurio122m, telurio125m, tulio165, tulio167, tulio168, flúor18, itrio199, yodo131. Los métodos conocidos por el experto en la materia existentes para acoplar los radioisótopos terapéuticos a los anticuerpos ya sea directamente o por medio de un agente quelante tales como EDTA, DTPA mencionados anteriormente pueden utilizarse para los radioelementos los cuales pueden utilizarse en diagnóstico. Asimismo, es posible mencionar el marcado con Na[I125] mediante el método de cloramina T [Hunter W.M. y Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495] o sino con tecnetio99m mediante la técnica de Crockford et al. (patente US n° 4.424.200) o unido por medio de Dt PA según lo descrito por Hnatowich (patente US n° 4.479.930). Por lo tanto, el anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, descrito en la presente memoria, puede emplearse en un proceso para la detección y/o la cuantificación de una sobreexpresión o de una expresión insuficiente, preferentemente una sobreexpresión, del receptor c-Met en una muestra biológica, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo, o con su fragmento o derivado funcional, descrito en la presente memoria; y

b) la demostración del complejo de c-Met/anticuerpo posiblemente formado.

En una forma de realización particular, anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, descrito en la presente memoria, puede emplearse en un proceso para la detección y/o la cuantificación del receptor c-Met en una muestra biológica, para la monitorización de la eficacia de un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de cáncer dependiente de c-Met.

Más generalmente, el anticuerpo o un fragmento o derivado funcional del mismo descrito en la presente memoria puede emplearse ventajosamente en cualquier situación donde la expresión del receptor c-Met debe ser observada en forma cualitativa y/o cuantitativa.

Preferentemente, la muestra biológica es formada mediante un fluido biológico, tal como suero, sangre entera, células, una muestra de tejido o biopsias de origen humano.

Puede emplearse cualquier procedimiento o ensayo convencional con el fin de llevar a cabo ese tipo de detección y/o dosificación. Dicho ensayo puede ser un ensayo de competición o sándwich, o cualquier ensayo conocido por el experto en la materia dependiente de la formación de un complejo inmune de tipo anticuerpo-antígeno. Tras las aplicaciones descritas en la presente memoria, el anticuerpo o un fragmento o derivado funcional del mismo puede ser inmovilizado o marcado. Esta inmovilización puede llevarse a cabo en numerosos soportes conocidos por el expertos en la materia. Estos soportes pueden incluir, especialmente, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, o células naturales o modificadas. Estos soportes pueden ser solubles o insolubles.

A título de ejemplo, un método preferido implica procesos inmunoenzimáticos de acuerdo con la técnica ELISA, por inmunofluorescencia, o técnica de radio-inmunoensayo (RIA) o equivalente.

Por lo tanto, la presente divulgación se refiere asimismo los kits o conjuntos necesarios para llevar a cabo un método de diagnóstico de enfermedades inducidas por una sobreexpresión o una expresión insuficiente del receptor c-Met o para llevar a cabo un proceso para la detección y/o la cuantificación de una sobreexpresión o de una expresión insuficiente del receptor c-Met en una muestra biológica, preferentemente, una sobreexpresión de dicho receptor, caracterizado por que dicho kit o conjunto comprende los siguientes elementos:

a) un anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, descrito en la presente memoria;

b) opcionalmente, los reactivos para la formación del medio favorables para la reacción inmunitaria;

c) opcionalmente, los reactivos que permiten la demostración de complejos de c-Met/anticuerpo producidos mediante la reacción inmunitaria.

Un objeto de la divulgación es asimismo la utilización de un anticuerpo o una composición como se describe anteriormente para la preparación de un medicamento destinado al direccionamiento específico de un compuesto biológicamente activo hacia células que expresan o que sobreexpresan el receptor c-Met.

Se pretende en la presente memoria indicar por compuesto biológicamente activo cualquier compuesto capaz de modular, especialmente de inhibir, la actividad celular, en particular su crecimiento, su proliferación, transcripción o traducción genética.

Se proporciona asimismo en la presente memoria un reactivo de diagnóstico in vivo que comprende un anticuerpo como se describe anteriormente, o un fragmento o derivado funcional del mismo, preferentemente marcado, especialmente radioetiquetado, y su uso en la obtención de imágenes médicas, en particular para la detección del cáncer en conexión con la expresión o la sobreexpresión por una célula del receptor c-Met.

La presente divulgación se refiere asimismo a una composición como un producto combinado o a un conjugado anti-c-Met/toxina o radioelemento, como se describe anteriormente, como un medicamento.

Preferentemente, dicha composición como un producto combinado o dicho conjugado se mezclará con un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En la presente descripción, vehículo aceptable para uso farmacéutico tiene el propósito de indicar un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica sin provocar reacciones secundarias y el cual permite, por ejemplo, la facilitación de la administración del o de los compuestos activos, un aumento en su vida útil y/o en su eficacia en el cuerpo, un aumento de su solubilidad en solución o sino una mejora en su conservación. Estos vehículos aceptables para uso farmacéutico son bien conocidos y serán adaptados por el experto en la materia en función de la naturaleza y del modo de administración del compuesto o de los compuestos activos seleccionados.

Preferentemente, estos compuestos serán administrados por la ruta sistémica, en particular mediante la ruta intravenosa, por la ruta intramuscular, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea, o por la ruta oral. En una forma más preferida, la composición que comprende los anticuerpos descritos en la presente memoria será administrada varias veces, en forma consecutiva.

Sus modos de administración, dosificaciones y formas farmacéuticas óptimas pueden determinarse de acuerdo con los criterios generalmente tomados en cuenta en el establecimiento de un tratamiento adaptado a un paciente tal como, por ejemplo, la edad o el peso corporal del paciente, la seriedad de su condición general, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios observados.

Otras características y ventajas aparecen a continuación en la descripción con los ejemplos y las figuras en las que:

figura 1: Efecto de Mabs de IgG1 irrelevantes de origen murino y humano y PBS sobre la fosforilación del receptor c-Met sobre células A549.

Figuras 2A y 2B: Efecto de Mabs 224G11 murinos y humanizados producidos como un isotipo humano de IgG1/kappa sobre la fosforilación del receptor c-Met sobre las células A549.

Figura 2A: efecto agonista calculado como porcentaje versus estimulación máxima de la fosforilación de c-Met por HGF [100 ng/ml].

Figura 2B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibición de la estimulación máxima de fosforilación de c-Met por HGF [100 ng/ml].

Figuras 3A y 3B: Comparación entre Mab 224G11 murino y Mabs 224G11 quiméricos que contienen diversas regiones bisagra genomanipuladas, sobre la fosforilación del receptor c-Met sobre las células A549.

Figura 3A: efecto agonista calculado como porcentaje contra la estimulación máxima de la fosforilación de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figura 3B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibición de la estimulación máxima de la fosforilación de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figuras 4A y 4B: Comparación entre Mab 224G11 murino y Mabs 224G11 quiméricos y humanizados producidos como un isotipo de IgG2/kappa humano, sobre la fosforilación del receptor c-Met en células A549. Figura 4A: efecto agonista calculado como porcentaje contra la estimulación máxima de la fosforilación de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figura 4B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibición de la estimulación máxima de fosforilación de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figuras 5A y 5B: Comparación entre Mab 224G11 murino y Mabs 224G11 quiméricos y humanizados producidos como un mutante bisagra genomanipulado TH7IgG1/kappa, sobre la fosforilación del receptor c-Met en células A549.

Figura 5A: efecto agonista calculado como porcentaje contra la estimulación máxima de la fosforilación de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figura 5B: efecto antagonista calculado como porcentaje de inhibición de la estimulación máxima de fosforilación de c-Met mediante HGF [100 ng/ml].

Figuras 6A y 6B, figuras 7A y 7B, figuras 8A y 8B, figuras 9A y 9B, figuras 10A y 10B: modelos de BRET con figuras A: modelo de dimerización de c-Met; y figuras B: modelo de activación de c-Met.

Figura 11: reconocimiento de c-Met mediante formas de 224G11 quiméricas y humanizadas.

Figura 12: Efecto de anticuerpos murinos y quiméricos sobre la proliferación inducida por HGF de células NCI-H441 in vitro. Las células NCI-H441 fueron plaqueadas en medio libre de suero. 24 horas después de colocación en placas, se agregaron m224G11 y [224G11]quim ya sea en ausencia o en presencia de HGF. Las flechas negras indican los pocillos plaqueados con células solas ya sea en ausencia £ o en presencia ^ de HGF. Una IgG1 murina (mIgG1) se introdujo como un control de isotipo.

Figura 13: Comparación in vivo de Mabs de 224G11 quiméricos de IgG1 y murinos en el modelo de xenoinjerto de NCI-H441.

Figuras 14A y 14B: Efecto del Mab 224G11 murino y de diversas versiones quiméricas y humanizadas de este anticuerpo sobre la proliferación inducida por HGF de células NCI-H441 in vitro. Las células NCI-H441 se colocaron en placas en medio libre de suero. Veinticuatro horas después de colocación en placa, los anticuerpos que se van a analizar se agregaron ya sea en ausencia o en presencia de HGF. En el panel (figura 14A), Las versiones m224G11 murino, IgG1 quimérica [224G11]quim, IgG1 humanizada [224G11] [Hz1], [224G11] [Hz2], [224G11] [Hz3] se mostraron. En el panel (figura 14B), se presentaron las formas de m224G11 murino y diversas formas de IgG1 quiméricas ([224G11] quim, [224G11] [MH quim], [224G11] [MUP9H quim], [224G11] [MMCH quim], [224G11] [TH7 quim]). Las flechas negras indican los pocillos plaqueados con células solas ya sea en ausencia £ o en presencia ^ de HGF. Se introdujo una IgG1 murina como un control negativo para la actividad agonista. El m5D5 se utilizó como un control agonista completo dosis-dependiente.

Figura 15: Efecto del Mab 224G11 murino y de diversas versiones quiméricas y humanizadas de este anticuerpo sobre la proliferación inducida por HGF de células NCI-H441 in vitro. Las células NCI-H441 se plaquearon en medio libre de suero. 24 Horas después de la colocación en placas, los anticuerpos que se van a analizar se agregaron ya sea en ausencia o en presencia de HGF. Se presentaron las formas m224G11 murina, [224G11] quim, [224G11] [TH7 quim]) IgG1 quiméricas y [224G11] [TH7 Hz1], [224G11] [TH7 Hz3]). Las flechas negras indican los pocillos con células solas ya sea en ausencia £ o en presencia ^ de HGF. Se introdujo una IgG1 murina como un control negativo para la actividad agonista. Se utilizó el m5D5 como un control agonista completo dependiente de la dosis.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos contra c-Met

Para generar anticuerpos anti-c-Met se inmunizaron ratones BALB/c de 8 semanas de edad ya sea 3 a 5 veces subcutáneamente con una línea celular transfectada CHO que expresa c-Met en su membrana plasmática (20x106 células/dosis/ratón) o 2 a 3 veces con una proteína de fusión de dominio extracelular de c-Met (10-15 pg/dosis/ratón) (R&D Systems, Catálogo # 358MT) o fragmentos de esta proteína recombinante mezclada con adyuvante completo de Freund para la primera inmunización y adyuvante incompleto de Freund para las siguientes. Los protocolos mixtos en los cuales los ratones recibieron tanto células CHO-cMet como proteínas recombinantes también se llevaron a cabo. Tres días antes de la fusión celular, los ratones fueron estimulados i.p. o i.v. con la proteína recombinante o fragmentos. A continuación, los bazos de ratones se recolectaron y fusionaron a células de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC) y se sometieron a selección de HAT. Se llevaron a cabo cuatro fusiones. En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, es posible hacer referencia a técnicas las cuales son descritas en particular en el manual “Anticuerpos” (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) o a la técnica de preparación de hibridomas descrita por Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

Los hibridomas obtenidos fueron inicialmente cribados por ELISA sobre la proteína recombinante de c-Met y luego mediante análisis FACS en líneas celulares A549 NSCLC, BxPC3 pancreática, y U87-MG glioblastoma para asegurarse de que los anticuerpos producidos serán capaces de reconocer también al receptor nativo en células tumorales. Los reactores positivos en estos 2 ensayos fueron amplificados, clonados y un conjunto de hibridomas fue recuperado, purificado y cribado para determinar su capacidad de inhibir la proliferación celular in vitro en el modelo BxPC3.

Para ese propósito 50.000 células BxPC3 se colocaron en placas de 96 pocillos en medio RPMI, 2 mM L. Glutamina, sin SVF. 24 Horas después de colocación en placas, los anticuerpos que se van a analizar se agregaron a una concentración final que oscilaba entre 0,0097 y 40 pg/ml 60 min antes de la adición de 100 ng/ml de hHGF. Después de 3 días, las células fueron pulsadas con 0,5 pCi de [3H]timidina durante 16 horas. La magnitud de [3H]timidina incorporada en ADN insoluble en ácido tricloroacético se cuantificó mediante recuento por centelleo líquido. Los resultados fueron expresados como datos sin elaborar para realmente evaluar el efecto agonista intrínseco de cada Mab.

A continuación, los anticuerpos que inhiben por lo menos 50% de proliferación celular se evaluaron para determinar su actividad en la dimerización de c-Met y análisis de BRET de activación en células transfectadas. La actividad del receptor c-Met se cuantificó midiendo el reclutamiento de moléculas de señalización de Gab1 en c-Met activado. Para ese propósito, se generaron líneas celulares estables CHO que expresan C-Met-Rluc o C-Met-Rluc y C-Met-K1100A-YFP para la dimerización de c-Met o C-Met-Rluc y una forma mutada de Gab1 [Maroun et al., Mol. Cell. Biol., 1999, 19:1784-1799] fusionada a YFP para la activación de c-Met. Las células fueron distribuidas en microplacas de 96 pocillos blancas en DMEM-F12/FBS 5% de medio de cultivo uno o dos días antes de los experimentos de BRET. Las células fueron cultivadas, en primer lugar, a 37°C con CO25% con el fin de permitir la unión celular a la placa. A continuación, las células se matan de hambre con 200 pl de DMEM/pocillo durante la noche. Inmediatamente antes del experimento, DMEM se eliminó y las células se lavaron rápidamente con PBS. Las células se incubaron en PBS en presencia o ausencia de anticuerpos a ser analizados o compuestos de referencia, 10 min a 37°C con anterioridad a la adición de coelenterazina con o sin HGF en un volumen final de 50 pl. Después de la incubación durante otros 10 minutos a 37°C, se inició la adquisición de emisión de luz a 485 nm y 530 nm utilizando el luminómetro Mithras (Berthold) (1s/longitud de onda /pocillo repetido 15 veces).

La relación de BRET ha sido definida previamente [Angers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:3684-3689] como: [(emisión a 530 nm) -(emisión a 485 nm) X Cf] / (emisión a 485 nm), donde Cf corresponde a (emisión a 530 nm) / (emisión a 485 nm) para células que expresan proteína de fusión Rluc solamente en las mismas condiciones experimentales. La simplificación de esta ecuación muestra que la relación de BRET corresponde a la relación 530/485 nm obtenida cuando los dos socios estaban presentes, corregido por la relación 530/485 nm obtenida bajo las mismas condiciones experimentales, cuando solamente el socio fusionado a R. reniformis luciferasa estaba presente en el ensayo. Por cuestiones de legibilidad, los resultados son expresados en unidades miliBRET (mBU); mBU corresponde a la relación de BRET multiplicada por 1000.

Después de este segundo ensayo in vitro, se seleccionó el anticuerpo 224G11 i) sin actividad intrínseca como una molécula entera en el ensayo funcional de proliferación, ii) inhibiendo significativamente la proliferación de BxPC3 y iii) inhibiendo la dimerización de c-Met. En los experimentos, el Mab 5D5, generado por Genentech, y disponible en la ATCC, se agregó como un control para la actividad agonista intrínseca.

Ejemplo 2: Proceso de humanización de Mab 224G11 de ratón por injerto de CDR

1°) Humanización del dominio variable (VL) de cadena ligera

Como una etapa preliminar, la secuencia de nucleótidos de 224G11 VL se comparó con las secuencias genéticas de línea germinal murinas incluidas en la base de datos de IMGT (http://imgt.cines.fr). Los genes de línea germinal murinos IGKV3-5*01 y IGKJ4*01 que muestran una identidad de secuencia de 99,31% para la región V y 94,28% para la región J, respectivamente, han sido identificados. Considerando estas homologías elevadas, la secuencia de nucleótidos 224G11VL ha sido utilizada directamente para buscar homologías humanas, en lugar de líneas germinales de ratón correspondientes.

En una segunda etapa, el gen de línea germinal humano que exhibe la mejor identidad con el 224G11VL ha sido buscado para identificar el mejor candidato humano para el injerto de CDR. Para la optimización de la selección, se han llevado a cabo alineaciones entre las secuencias de aminoácidos. El gen de línea germinal humano IGKV4-1*01 produjo una identidad de secuencia de 67,30%, pero mostró una longitud diferente para CDR1 (10 aminoácidos en 224G11 VL y 12 aminoácidos en IGKV4-1*01). Para la región J, se seleccionó el gen de línea germinal humano IGKJ4*02 (identidad de secuencia de 77,14%).

En una etapa siguiente, las regiones de CDR de 224G11 VL de ratón se injertaron en las secuencias estructurales humanas seleccionadas anteriormente. Se analizó cada posición de aminoácido para diversos criterios tales como participación en la interfase VH/VL, en la unión al antígeno o en la estructura de CDR, localización del residuo en la estructura 3D del dominio variable, anclajes de CDR, residuos pertenecientes a la zona Vernier. Se construyeron tres versiones humanizadas, correspondientes a SEC ID n° 8, SEC ID n° 9 y SEC ID n° 10, y que contenían respectivamente cuatro (4, 39, 40, 84), dos (39, 40) o un (40) residuos murinos en sus regiones FR y las CDR correspondientes a 224G11 VL de ratón.

2°) Humanización del dominio variable de cadena pesada (VH)

Como una etapa preliminar, la secuencia de nucleótidos del 224G11 VH se comparó con las secuencias de genes de línea germinal murinas incluidas en la base de datos de IMGT (http://imgt.cines.fr).

Los genes murinos de líneas germinales IGHV1-18*01, IGHD2-4*01 y IGHJ2*01 con una identidad de secuencia de 92,70% para la región V, 75,00% para la región D y 89,36% para la región J, respectivamente, han sido identificados. Conforme a estas homologías elevadas, se ha decidido utilizar directamente las secuencias de nucleótidos 224G11VH para buscar homologías humanas, en lugar de líneas germinales de ratón correspondientes.

En una segunda etapa, el gen de línea germinal humano que exhibe la mejor identidad con el 224G11 VH ha sido investigado para identificar el mejor candidato humano para el injerto de c Dr . Con este propósito, la secuencia de nucleótidos de 224G11 VH ha sido alineada con las secuencias de genes de líneas germinales humanas pertenecientes a la base de datos de IMGT. La secuencia humana IGHV1-2*02 V exhibió una identidad de secuencia de 75.00% en el nivel nucleotídico y 64,30% en el nivel de aminoácidos. Buscando homologías para la región H se ha alcanzado la identificación del gen de línea germinal IGHJ4*04 humano con una identidad de secuencia de 78,72%.

En una etapa siguiente, se injertaron regiones de CDR de 224G11 VH de ratón en las secuencias estructurales humanas seleccionadas anteriormente. Se analizó cada posición de aminoácido para diversos criterios tales como la participación en la interfase VH/VL, en la unión al antígeno o en la estructura de CDR, localización del residuo en la estructura 3D del dominio variable, anclajes de CDR, residuos pertenecientes a la zona Vernier. Se construyó una forma completamente humanizada, correspondiente a SEC ID 4; contiene residuos exclusivamente humanos en su regiones FR y las CDR correspondientes a 224G11 VH de ratón.

Ejemplo 3: Genomanipulación de mutantes bisagra mejorados

Es bien conocido por el experto en la materia que la región bisagra participa fuertemente en la flexibilidad del dominio variable de inmunoglobulinas (véase Brekke et al., 1995; Roux et al., 1997). Durante el proceso de quimerización de Mab 224G11, el dominio constante murino IGHG1 fue reemplazado por la porción IGHG1 equivalente de origen humano. Puesto que las secuencias de aminoácidos de la región bisagra eran altamente divergentes, la “murinización” de la región bisagra se llevó a cabo con el fin de mantener su longitud y rigidez. Puesto que la región bisagra IGHG2 humana corresponde al homólogo más cercano de la bisagra IGHG1 murina, esta secuencia también fue considerada. Una serie de 7 secuencias bisagra diferentes fueron construidas (SEC ID n° 21, SEC ID n° 22, SEC ID n° 23, SEC ID n° 24, SEC ID n° 25, SEC ID n° 26, SEC ID n° 27) mediante la incorporación de porciones de las bisagras IGHG1 de ratón y la bisagra IGHG2 humana en la porción bisagra IGHG1 humana.

Ejemplo 4: Producción de Mab 224G11 humanizado y formatos de Mab bisagra genomanipulados

Todas las formas de Mab descritas anteriormente que contenían regiones bisagra quiméricas, humanizadas y/o genomanipuladas fueron producidas luego de la transfección transitoria y utilizando el sistema HEK293/EBNA con un vector de expresión pCEP4 (InVitrogen, US).

Las secuencias de nucleótidos enteras correspondientes a las versiones humanizadas del dominio variable de las cadenas ligera (SEC ID n° 18, SEC ID n° 19 y SEC ID n° 20) y pesada (SEC ID n° 14) de Mab 224G11 se sintetizaron mediante síntesis genética global (Genecust, Luxemburgo). Se subclonaron en un vector pCEP4 (InVitrogen, US) portando la secuencia codificante entera del dominio constante [CH1-Bisagra-CH2-CH3] de una inmunoglobulina IgG1 o IgG2 humana. La modificación de la región bisagra se llevó a cabo intercambiando un fragmento de restricción {Nhe1I-Bcl1} por la porción equivalente que porta las modificaciones deseadas, siendo sintetizado cada fragmento {Nhe1-Bcl1} respectivo mediante síntesis genética global (Genecust, LU). Todos los pasos de clonación se llevaron a cabo de acuerdo con técnicas de biología molecular convencionales según lo descrito en el manual de Laboratorio (Sambrook y Russel, 2001) o de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Cada constructo genético fue completamente validado por secuenciamiento de nucleótidos utilizando el kit de secuenciamiento de ciclo terminador Big Dye terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, US) y analizado utilizando un Analizador Genético 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, US).

Las células HEK293 EBNA adaptadas en suspensión (InVitrogen, US) se cultivaron rutinariamente en frascos de 250 ml en 50 ml de medio libre de suero Excell 293 (SAFC Biosciences) suplementado con glutamina 6 mM en un agitador orbital (velocidad de rotación 110 rpm). La transfección transitoria se llevó a cabo con 2.106 células/ml utilizando polietilenimina de 25 kDa lineal (PEI) (Polysciences) preparada en agua a una concentración final de 1 mg/ml de ADN mixto y plásmido (concentración final de 1,25 pg/ml para relación de plásmido de cadena pesada a ligera de 1:1). A las 4 horas postransfección, el cultivo se diluyó con un volumen de medio de cultivo fresco para lograr una densidad celular final de 106 células/ml. El proceso de cultivo se monitoreó sobre la base de la viabilidad celular y producción de Mab. Típicamente, los cultivos se mantuvieron durante 4 a 5 días. Los Mabs se purificaron utilizando un método de cromatografía convencional en una resina de Proteína A (GE Healthcare, US).

Todas las formas diferentes de Mabs fueron producidas en niveles adecuados con evaluaciones funcionales. Los niveles de productividad fueron producidos a niveles adecuados con evaluaciones funcionales. Los niveles de productividad oscilan típicamente entre 15 y 30 mg/l de Mabs purificados.

Ejemplo 5: Evaluación de estado de fosforilación de c-Met mediante ensayo ELISA específico para Fosfoc-Met

Este ensayo funcional permite controlar la modulación del estado de fosforilación de c-Met ya sea por Mabs solos o en la presencia conjunta de HGF.

Se sembraron células A549 en una placa de 12MW en medio de crecimiento completo [F12K 10 % FCS]. Las células se sometieron a inanición durante 16 horas antes de la estimulación con HGF [100 ng/ml], y cada Mab que se va a analizar se agregó en su concentración final de 30 pg/ml 15 minutos antes de la estimulación del ligando. Se agregó tampón de lisis enfriado con hielo 15 minutos después de la adición de HGF para detener la reacción de fosforilación. Las células se rasparon mecánicamente y los lisados celulares se recolectaron por centrifugación a 13000 rpm durante 10 min. a 4°C y corresponden a la fase de sobrenadante. El contenido proteico se cuantificó utilizando un kit BCA (Pierce) y se almacenó a -20°C hasta su utilización. El estado de fosforilación de c-Met se cuantificó por ELISA. Se utilizó un Mab anti-c-Met de cabra (R&D, ref AF276) como un anticuerpo de captura (recubrimiento durante toda la noche a 4°C) y después un paso de saturación con un tampón de 5% de TBS-BSA (1 hora a temperatura ambiente (TA)), se agregaron 25 pg de lisados proteicos a cada pocillo de la placa de 96 MW recubierta. Después de una incubación de 90 minutos a TA, las placas se lavaron cuatro veces y se agregó el anticuerpo de detección (Mab anti-fosfo-c-Met, dirigido contra los residuos Tyr fosforilados en posición 1230, 1234 y 1235). Después de una incubación adicional de 1 hora y 4 lavados, se agregó un anticuerpo anti-conejo acoplado a HRP (Biosource) durante 1 hora a TA, y se llevó a cabo la detección por luminiscencia agregando Luminol. Las lecturas de luminiscencia eran en un lector de placas multimodo Mithras LB920 (Berthold).

Tanto el nivel basal como el nivel de fosforilación del receptor c-Met inducido por HGF [100 ng/ml] no se vieron afectados ni por el tratamiento con PBS, ni por la adición de Mabs murinos o humanos los cuales no se dirigen contra el receptor c-Met humano (figura 1). Por otro lado, el Mab murino (m) 224G11 inhibió fuertemente la fosforilación de c-Met inducida por HGF [100 ng/ml] (figura 2B) sin alterar por si mismo la fosforilación del receptor (figura 2A). Sorprendentemente, la forma quimérica de Mab 224G11 (224G11quim/IgG1), lo que significa dominio variable (VH+VL) de m224G11 combinado con dominio constante humano IgG1/kappa proporcionó actividad agonista fuerte (17% del efecto máximo de HGF, figura 2A) asociada con una eficacia antagonista reducida (54% de inhibición del efecto máximo de HGF comparado con el m224G11 que produce 75% de inhibición del efecto máximo de HGF, figura 2B). Tres formas humanizadas de Mab 224G11, [224G11]Hz1/IgG1, [224G11]Hz2/IgG1 y [224G11]Hz3/IgG1, también construidas en una estructura humana IgG1/kappa, produjeron también una disminución de la eficacia antagonista y actividad agonista significativa (11 a 24% del nivel de HGF máximo) en comparación con 224G11 murino (figuras 2A y 2B). Se construyó una serie de versiones genomanipuladas del dominio bisagra de cadena pesada y se analizaron en el ensayo de fosforilación del receptor c-Met. Como se muestra en la figura 3A, se observó una importante reducción del efecto agonista asociada con el isotipo de hIgG1/kappa tanto para el constructo basado en IgG2 como para los constructos de IgG1/kappa genomanipulados [MH, MUP9H y TH7]. También se obtuvo un aumento concomitante de la eficacia antagonista. El mutante bisagra TH7 basado en hIgG1/kappa, con la secuencia más humana, se seleccionó para completar el proceso de humanización. En una etapa siguiente, se generaron tres versiones humanizadas de dominio variable de Mab 224G11 mediante combinación con ya sea un IgG2/kappa humano o un dominio constante bisagra genomanipulado de TH7 basado en IgG1/kappa. Para los constructos humanizados de hIgG2/kappa, la versión humanizada Hz3 produjo un fuerte agonismo (figura 4A), y para las tres versiones humanizadas, la eficacia antagonista estaba por debajo de aquella observada con Mab 224G11 murino y comparable con Mab basado en hIgG1 quimérico (56-57% de inhibición de efecto de HGF, figura 4B). Por otro lado, la combinación de las tres versiones humanizadas Hz1, Hz2 o Hz3 con el mutante IgG1/TH7 genomanipulado casi restauró por completo las propiedades del Mab murino 224G11 en términos de actividad agonista débil (5-6% de efecto de HGF) y actividad antagonista fuerte (68 a 72% de inhibición del efecto de HGF) de la fosforilación del receptor c-Met (figuras 5A y 5B). Estas variantes fueron altamente mejoradas en comparación con Mab 224G11 basado en IgG1 quimérico pero también con las formas humanizadas basadas en IgG2.

Ejemplo 6: análisis de BRET

En un primer grupo de experimentos, se había controlado que IgG1 murino, IgG1 humano e IgG2 humano irrelevantes no tuvieron efecto alguno de señal de BRET inducida por HGF en ambos modelos de BRET (experimento representativo de 12 experimentos independientes; figura 6). Estos Mabs son mencionados como controles.

Se evaluó el efecto de una forma quimérica de IgG1 de Mab 224G11 de ratón ([224G11]quim) tanto en el modelo BRET de dimerización de c-Met como de activación de c-Met. Si bien el Mab 224G11 de ratón inhibió 59,4% de la señal de BRET inducida por HGF en el modelo de dimerización de c-Met, el Mab [224G11]quim inhibió solamente 28,9% (figura 7A). El anticuerpo [224G11]quim también era menos eficaz en la inhibición de la activación de c-Met inducida por HGF puesto que los anticuerpos [224G11]quim y m224G11 inhibieron respectivamente 34,5% y 56,4% de la señal de BRET inducida por HGF (figura 7B). Además, m224G11 solo no tuvo efecto alguno sobre la activación de c-Met mientras que [224G11]quim tuvo un efecto agonista parcial sobre la activación de c-Met correspondiente a 32,9% de la señal inducida por HGF. Este efecto agonista parcial del [224G11]quim también fue observado en el modelo BRET de dimerización de c-Met puesto que [224G11]quim solo indujo un aumento de BRET correspondiente a 46,6% de la señal inducida por h Gf contra 21,3% para m224G11 (figura 7A).

En las figuras 8A y 8B, las formas quiméricas mutadas bisagra de anticuerpo 224G11 mostraron un efecto inhibidor mayor sobre la señal de BRET inducida por HGF que [224G11]quim puesto que mostraron una inhibición del 59,7%, 64,4%, 53,2% y 73,8% de la señal de BRET de activación inducida por HGF (figura 8B) y 61,8%, 64,4% 52,5% y 64,4% de inhibición de la señal de BRET de dimerización de c-Met inducida por HGF (figura 8A) para [224G11][MH quim], [224G11][MUP9H quim], [224G11][MMCH quim] y [224G11][TH7 quim] respectivamente. En contrario a [224G11]quim, el cual tuvo un efecto agonista parcial sobre la activación de c-Met, las formas quiméricas mutadas bisagra del anticuerpo 224G11 no mostraron un efecto significativo sobre la activación de c-Met solamente (5,1%, 7,6%, -2,0% y -6,9% respectivamente) según lo observado para m224G11.

En la figura 9B, al igual que el [224G11] [TH7 quim], las 3 versiones humanizadas de anticuerpo de IgG1 224G11 con la bisagra TH7 no indujeron un aumento significativo de la señal de BRET en el modelo de activación cuando se analizó solo y mostró una fuerte inhibición de la señal de BRET inducida por HGF: 59,9%, 41,8% y 57,9% para las formas Hz1, Hz2 y Hz3 respectivamente. Asimismo, [224G11] [TH7 Hz1], [224G11] [TH7 Hz2] y [224G11] [TH7 Hz3] inhibieron la señal de BRET inducida por HGF en el modelo de dimerización de 52,2%, 35,8% y 49,4% respectivamente (figura 9A).

Contrariamente a [224G11]quim, la forma quimérica del anticuerpo de IgG2 224G11 ([224G11] [IgG2 quim]) no mostró efecto agonista parcial alguno solo e inhibió 66,3% del efecto de HGF sobre el modelo de activación de c-Met (figura 10B). En el modelo de dimerización de c-Met, [224G11] [IgG2 quim] inhibió 62,4% de la señal de BRET inducida por HGF (figura 10A).

Ejemplo 7: Reconocimiento del c-Met por formas de 224G11 quiméricas y humanizadas

Se ha llevado a cabo un ELISA directo para determinar la habilidad de unión de las diversas formas quiméricas y humanizadas en el c-Met recombinante. Brevemente, c-Met dimérico recombinante de R&D Systems fue recubierto a 1,25 |jg/ml en placas de 96 pocillos Immunlon II. Después de una incubación durante toda la noche a 4°C, los pocillos fueron saturados con una solución de 0,5% de gelatina/PBS. A continuación, las placas se incubaron durante 1 hora a 37°C antes de la adición de diluciones de 2 veces de anticuerpos que se van a analizar. Las placas se incubaron durante una hora más antes de la adición de un HRP de IgG de cabra anti-ratón para detectar el anticuerpo murino y una HRP de cadena ligera Kappa anti-humana de cabra para el reconocimiento de anticuerpos quiméricos y humanizados. Las placas se incubaron durante una hora y se agregó el sustrato de peroxidasa TMB Uptima durante 5 min antes de la neutralización con H2SO4 1M. Los resultados presentados en la figura 11 demostraron que todas las formas analizadas eran comparables para el reconocimiento del c-Met.

Ejemplo 8: Efecto de 224G11 murino y quim érico sobre la proliferación inducida por HGF de células NCI-H441 in vitro

Se cultivaron de manera rutinaria células NCI-H441 de ATCC en medio RPMI 1640 (Invitrogen Corporation, Escocia, Reino Unido), 10% FCS (Invitrogen Corporation), 1% L-Glutamina (Invitrogen corporation). Para los ensayos de proliferación, las células se separaron 3 días antes del uso de modo que estuviesen en la fase confluente de crecimiento antes del plaqueo. Las células NCI-H441 se colocaron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos a una densidad de 3,75x104 células/pocillo en 200 j l de medio libre de suero (medio RPMI 1640 más 1% de L-Glutamina). Veinticuatro horas después de la colocación en placas, se agregaron los anticuerpos que se van a analizar a NCI-H441 y se incubaron a 37°C durante treinta minutos antes del agregado de HGF a una concentración final de 400 ng/ml (5 nM) durante 142 horas adicionales. El rango de dosis ensayado para cada anticuerpo es de 10 a 0,0097 jg/m l (concentración final en cada pocillo). En este experimento, se agregó un Mab de IgG1 murino como un control de isotipo murino y los anticuerpos ensayados eran los siguientes: m224G11 y su forma quimérica de IgG1 humana identificada como [224G11]quim. Los pocillos plaqueados con células solas -/+ HGF también fueron incluidos. Luego, las células se pulsaron con 0,25 jC i de [3H]Timidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) durante 7 horas y 30 minutos. La magnitud de [3H]Timidina incorporada en ADN insoluble en ácido tricloroacético se cuantificó por recuento por centelleo líquido. Los resultados son expresados como datos de cpm no transformados para evaluar mejor la actividad agonista intrínseca potencial que podría ocurrir con Mabs anti-c-Met cuando se agregan solos a célula tumoral.

Los resultados descritos en la figura 12 demostraron que, según lo esperado, el anticuerpo murino m224G11 no exhibió efecto agonista alguno cuando se agregó solo a células cancerígenas cualquiera sea la dosis ensayada. No se observó inhibición significativa alguna de la proliferación inducida por HGF con el control de isotipo con respecto a las variaciones de cpm observadas para este compuesto en este experimento. Cuando se agrega solo, el anticuerpo m224G11 no mostró efecto agonista alguno en comparación con el Mab control de isotipo de mIgG1 o las células solas. Se observó una actividad antiproliferativa dependiente de la dosis que alcanzó 78% para m224G11 (% de cálculo de inhibición: 100-[(cpm de células+Mab que va a ser ensayadas- cpm media de mIgG1 “de fondo”) x 100 / (cpm media de células HGF- cpm media células solas)]). Sorprendentemente, la forma quimérica de los Mabs 224G11 indujo un efecto agonista dependiente de la dosis, significativo, cuando se agregó sola. Este efecto agonista tuvo un impacto sobre la inhibición in vitro de la proliferación inducida por HGF que cambió de 78% para el 224G11 murino hasta 50% para su forma quimérica. Para determinar su dicha actividad agonista intrínseca in vitro “inferior” era compatible con un efecto in vivo sin cambiar, se produjeron tanto m224G11 como [224G11]quim para el ensayo in vivo. Como, en estudios previos, la dosis de 30 jg/ratón había demostrado una actividad in vivo significativa, esa dosis fue seleccionada para la evaluación in vivo.

Ejemplo 9: Comparación in vivo de Mabs 224G11 murinos y quiméricos en el modelo de xenoinjerto de NCI-H441

NCI-H441 es derivado de adenocarcinoma pulmonar papilar, expresa altos niveles de c-Met, y demuestra fosforilación constitutiva de c-Met RTK.

Para evaluar el efecto in vivo de anticuerpos en el modelo de xenoinjerto de NCI-H441, se alojaron ratones atímicos de seis a ocho semanas de edad en jaulas esterilizadas con filtro superior, se mantuvieron en condiciones estériles y se manipularon de acuerdo con las pautas francesas y europeas. Los ratones recibieron inyecciones subcutáneas con 9x106 células. A continuación, seis días después del implante de células, se midieron los tumores (aproximadamente 100 mm3), los animales se dividieron en grupos de 6 ratones con tamaño de tumores comparable y se trataron, en primer lugar, con una dosis de carga de 60 |jg de anticuerpo/ratón y luego dos veces por semana con 30 jg/dosis de cada anticuerpos que se va a analizar. Los ratones fueron monitoreados para la observación del índice de crecimiento del xenoinjerto. El volumen tumoral se calculó mediante la fórmula: n (Pi)/6 X largo X ancho X altura. Los resultados descritos en la figura 13 demuestran que el Mab murino desprovisto de actividad agonista se comporta, in vivo, según lo esperado, como antagonista potente incluso a la dosis analizada baja. Contrariamente a lo observado con el Mab murino, el Mab quimérico exhibió una actividad in vivo muy transitoria y el tumo escapó completamente al tratamiento a la inyección de células luego de D20. Este experimento demuestra claramente que el aumento del efecto agonista in vitro que dio como resultado una disminución de la actividad antagonista también fue responsable de una pérdida in vivo significativa de actividad antagonista.

Ejemplo 10: Efecto del Mab 224G11 murino y de diversas versiones quiméricas y humanizadas de este anticuerpo sobre la proliferación inducida por HGF de células NCI-H441 in vitro

Se cultivaron rutinariamente células NCI-H441 de ATCC en medio RPMI 1640 (Invitrogen Corporation, Escocia, Reino Unido), 10% de FCS (Invitrogen Corporation), 1% de L-Glutamina (Invitrogen Corporation). Para los ensayos de proliferación, las células se dividieron 3 días antes del uso de modo que estuviesen en la fase confluente de crecimiento antes de la colocación en placas. Las células NCI-H441 se colocaron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos a una densidad de 3,75x104 células/pocillo en 200 j l de medio libre de suero (medio RPMI 1640 más 1% de L-Glutamina). Veinticuatro horas después de la colocación en placas, los anticuerpos que se van a ensayar fueron agregados a NCI-H441 e incubados a 37°C durante treinta minutos antes de agregar HGF a una concentración final de 400 ng/ml (5 nM) durante 142 horas más. El rango de dosis ensayado para cada anticuerpo es de 10 a 0,0097 jg/m l (concentración final en cada pocillo). En este experimento, se agregó Mab de IgG1 murino como un control de isotipo murino y como un control negativo agonista. Los anticuerpos ensayados fueron los siguientes: i) m224G11, ii) sus formas quiméricas de IgG1 humanas respectivamente identificadas como [224G11] quim, [224G11] [MH quim], [224G11] [MUP9H quim], [224G11] [MMCH quim], [224G11] [TH7 quim] iii) sus formas de IgG1 humanizadas respectivamente descritas como [224G11] [Hz1], [224G11] [Hz2], [224G11] [Hz3]. También se incluyeron pocillos plaqueados con células solas -/+ HGF. El anticuerpo entero 5D5 de Genentech disponible en el mercado en la ATCC como una línea de células de hibridoma se introdujo como un control positivo agonista completo y llamado a continuación m5D5. Luego, las células fueron pulsadas con 0,25 jC i de [3H]Timidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) durante 7 horas y 30 minutos. La magnitud de [3H]Timidina incorporada en ADN insoluble en ácido tricloroacético se cuantificó por recuento por centelleo líquido. Los resultados son expresados como datos de cpm no transformados para evaluar mejor la actividad agonista intrínseca potencial que podría ocurrir con Mabs anti-c-Met cuando se agregan solos a células tumoral.

Los resultados descritos en la figura 14A demostraron que, según lo esperado, ni el control de isotipo ni el m224G11 exhibieron actividad agonista alguna en la proliferación de NCI-H441. El control isotipo no tuvo efecto alguno sobre la proliferación celular inducida por HGF mientras que m224G11 mostró un 66% de inhibición cuando se agregó a la concentración final de 10 jg/ml. El m5D5 utilizado como control agonista mostró, según lo esperado, un efecto completo agonista dependiente de la dosis cuando se agrega solo a las células. Como ya se ha observado, el Mab [224G11] quim exhibió un efecto agonista dependiente de la dosis significativo y, se observó una actividad inhibidora disminuida de esta forma quimérica: 19% en lugar de 66% para la forma murina. Cuando se agregan por si solos, los 3 Mabs humanizados de IgG1 demostraron efectos agonistas dependientes de la dosis comparados con la forma m224G11. [224G11] [Hz1], [224G11] [Hz2] y [224G11] [Hz3] tuvieron actividades antagonistas comparables aproximadamente 46, 30 y 35%. Estas actividades son significativamente inferiores que aquella observada para m224G11. En la figura 14B, se analizaron diversas formas quiméricas de IgG1. Comparada con la forma [224G11] quim la cual exhibió un efecto agonista dependiente de la dosis cuando se agregó por si sola a células NCI-H441, las formas [224G11] [MH quim], [224G11] [MUP9H quim], [224G11] [MMCH quim], [224G11] [TH7 quim] no tuvieron un efecto agonista intrínseco significativo. Su actividad antagonista era superior a la observada para el Mab m224G11 (57%) con inhibiciones que alcanzan 79, 78, 84 y 93% respectivamente para [224G11] [MH quim], [224G11] [MUP9H quim], [224G11] [MMCH quim] y [224G11] [TH7 quim].

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición que comprende:

un anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional divalente del mismo, apto para inhibir la dimerización de c-Met, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento funcional divalente del mismo:

• una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos Se C ID n°: 1, 2 y 3; y

• una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 con respectivamente las secuencias de aminoácidos SEC ID n°: 5, 6 y 7, y

• una región bisagra que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n°: 28,

comprendiendo además dicha composición, como un producto de combinación para la utilización simultánea, separada o secuencial, un segundo anticuerpo antitumoral o un agente citotóxico/citostático.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que dicho anticuerpo, o un fragmento funcional divalente del mismo, comprende:

• un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n°: 4 y

• un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n°: 10.

3. Composición según la reivindicación 1 o 2, caracterizada por que dicho anticuerpo, o un fragmento funcional divalente del mismo, comprende:

• una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n°: 37 y

• una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n°: 40.

4. Composición según las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho segundo anticuerpo antitumoral es seleccionado de entre anticuerpos anti-IGF-1R, anti-EGFR, anti-HER/neu, anti-VEGFR o anti-VEGF.

5. Composición según la reivindicación 4, en la que dicho segundo anticuerpo antitumoral consiste en el cetuximab.

6. Composición según las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicho agente citotóxico/citostático es seleccionado de entre el grupo que consiste en agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, inhibidores mitóticos, inhibidores de la función de la cromatina, agentes antiangiogénesis, agentes antiestrógenos, agentes antiandrógenos, inmunomoduladores o inhibidores de cinasa

7. Composición según la reivindicación 6, en la que dicho agente citotóxico/citostático es el carboplatino.

8. Composición según la reivindicación 6, en la que dicho agente citotóxico/citostático es el erlotinib.

9. Composición según las reivindicaciones 1 a 8, para su utilización como un medicamento.

10. Composición según las reivindicaciones 1 a 8, para su utilización para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de las células tumorales.

11. Composición según las reivindicaciones 1 a 8, para su utilización en la prevención o el tratamiento del cáncer.

12. Composición para la utilización según la reivindicación 11, en la que dicho cáncer es un cáncer seleccionado de entre cáncer de próstata, osteosarcomas, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de endometrio, glioblastoma o cáncer de colon.

13. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, en la que dicho cáncer es un cáncer relacionado con la activación de Met dependiente o independiente de HGF.