CN109771642B

CN109771642B - c-MET激动型抗体及其用途

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Publication number: CN109771642B
Application number: CN201711116927.1A
Authority: CN
Inventors: 房健民; 蒋明; 尹衍新; 郭佳; 于丽华
Original assignee: SUZHOU RESEARCH INSTITUTE OF TONGJI UNIVERSITY
Current assignee: SUZHOU RESEARCH INSTITUTE OF TONGJI UNIVERSITY
Priority date: 2017-11-13
Filing date: 2017-11-13
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2037-11-13
Also published as: CA3082421A1; JP2021507936A; CN109771642A; US20210087277A1; AU2018364034B2; JP7232537B2; WO2019091306A1; CA3082421C; US11634496B2; EP3711777A4; EP3711777A1; AU2018364034A1

Abstract

本发明涉及c‑MET激动型抗体及其用途，属于医药技术领域。本发明提供了c‑MET激动剂在制备用于治疗或预防血管内皮细胞损伤性疾病的药物中的用途，尤其是用于脑梗塞或心肌梗塞的药物的用途。本发明还涉及具体的c‑MET激动剂。本发明的c‑MET激动剂可以有效地促进血管内皮细胞损伤的修复，用于治疗缺血性疾病以及血脑屏障损伤性疾病。本发明中的所述c‑MET激动剂优选地是c‑MET激动型抗体。本发明还涉及包含所述c‑MET激动剂的药物组合物。

Description

c-MET激动型抗体及其用途

技术领域

本发明涉及c-MET激动型抗体在制备用于治疗或预防血管内皮细胞损伤性疾病(包括例如缺血性疾病或血脑屏障损伤性疾病)的药物中的用途，尤其是在制备用于治疗或预防脑梗塞或心肌梗塞的药物中的用途。本发明还涉及具体的c-MET激动型抗体。

背景技术

缺血组织在恢复血液灌流后,会发生组织细胞功能代谢障碍和结构破坏进一步加重的病理过程,称为缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IR)。临床上,凡是由于各种原因引起器官和组织的缺血和缺氧,在治疗恢复程中都会涉及到IR的问题,如器官移植、脑卒中、外伤休克、心肌梗死、下肢缺血等。血管内皮细胞是贴附于微血管内壁的单层细胞，它不仅构成血管-组织间的屏障,而且通过分泌各种生物活性物质调节血管张力、凝血-纤溶平衡和炎症免疫反应,是调节组织细胞代谢的枢纽。脑血管内皮细胞更是血脑屏障的重要组成部分，其损伤将引起众多继发性的病理过程。近年来的研究发现,血管内皮细胞是IR发生的重要部位。保护微血管内皮细胞则是防治IR的关键。

肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)及其受体c-MET已被证明是保护血管内皮细胞的有效靶点。HGF与受体c-MET结合可激活相关的信号通路，特异性地促进和维持内皮细胞增殖和功能，促进新生血管新生，进而促进血管生成形成侧枝循环。因此HGF/c-MET作为靶点被广泛用于保护和修复血管的研究中。中国专利申请公开说明书CN101925362A公开了包含两种或更多种HGF同工型的组合物用于促进血管中内皮细胞生长的药物中的用途，包括增加受试者中缺血心脏组织的灌注或者心肌膜中血管密度，增强内皮修复，以及为血管损伤或病变血管部位提供治疗的方法。

目前，HGF在体内及临床应用的方法学上仍然具有巨大的障碍。由于HGF的血清半衰期极短，小于5分钟，因此极大地限制了重组HGF的应用。为此，人们通常采用将HGF基因通过病毒载体直接导入体内的策略，使其在缺血部位内源持续表达来研究其潜在的临床应用价值。例如，中国专利申请公开说明书CN1502368A公开了一种携带HGF基因的重组腺病毒在脑缺血中的应用，通过细胞内质粒同源重组将人肝细胞生长因子基因整合到腺病毒载体上，获得重组腺病毒，并制备一定量的病毒颗粒，建立脑缺血动物模型和合适的基因转移方法，观察腺病毒在脑内的表达，证明人肝细胞生长因子能减轻脑缺血引起的神经细胞死亡。然而，这种方法仍不能令人满意，包括在安全性和治疗效果方面。由于从载体进入细胞到蛋白质需要一定的时间，即使采用载体注射方法也不能保证立即获得HGF表达，而保证迅速起效对于缺血性疾病或血管内皮细胞缺血性损伤(特别是脑梗塞或心肌梗塞病)是特别重要的。因此，现有技术中仍迫切需要有效地促进血管内皮细胞损伤修复的方法。

发明内容

本发明人意外地发现，c-MET激动剂可以有效地促进血管内皮细胞损伤的修复，用于治疗缺血性疾病以及血脑屏障损伤性疾病。c-MET属于酪氨酸激酶受体(receptortyrosine kinase,RTKs)，由两个单体组成，每个单体是由二硫键链接成的双链蛋白。c-MET的激活起始于两个单体的二聚化，酪氨酸激酶区随之发生自身磷酸化，并发生信号传导。利用抗体的二价结构，可以同时结合两个c-MET单体，使它们在空间上相互接近，发生二聚化，进而导致酪氨酸激酶发生自身磷酸化，从而达到激活c-MET的目的。

本发明人发现c-MET是保护血管内皮细胞的有效靶点，并验证了c-MET抗体具有激活HGF/c-MET通路的作用。本发明的目的在于利用c-MET抗体的有益特性，提供一种保护血管内皮细胞的方法及其在缺血性疾病和血脑屏障损伤性疾病中的应用及一种抗体药物。

因此，在本发明的第一方面，提供了c-MET激动剂在制备用于治疗或预防血脑屏障损伤性疾病，尤其是缺血性疾病或血管内皮细胞缺血性损伤的药物中的用途。优选地，本发明中的所述c-MET激动剂是c-MET激动型抗体。本领域技术人员能够理解，对于c-MET激动型抗体而言，其能与抗原结合，这种结合也体现了配体与受体意义上的结合，并且结合后导致效应配体的活性或能力增强。

优选地，所述缺血性疾病是脑梗塞或心肌梗塞。在一些优选的实施方案中，所述治疗或预防脑梗塞是通过降低血脑屏障通透性和/或通过保护和修复脑血管和/或通过减少脑梗塞体积来实现的。

在本发明的上述用途中，所述c-MET激动剂可以是通过c-MET抗原对动物免疫制备的单克隆抗体，也可以是具有免疫原性的c-MET全长分子、融合蛋白、分子片段或多肽。在一个优选的实施方案中，所述c-MET激动剂通过筛选B淋巴细胞抗体文库获得，也可以通过筛选人工合成的抗体文库获得。在另一个优选的实施方案中，所述c-MET激动剂为经过基因工程改造但仍保持激动活性的抗体化合物。

在本发明的上述用途中，所述c-MET激动剂可以是全人源化抗体。或者，所述c-MET激动剂可以是FR和/或Fc片段经过人源化改造的抗体。

在一个特别优选的实施方案中，所述c-MET激动剂为包含重链和轻链的抗体分子，并且

所述重链包含至少1个选自以下的重链可变区序列或其突变序列:

SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；并且

所述轻链包含至少1个选自以下的轻链可变区序列或其突变序列:

SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。

在本发明的上述用途中，所述c-MET激动剂可以是抗体-药物缀合物。所述药物可以是除了本发明的上述抗体外已知的另一种药物活性成分，例如但不限于IRF5抑制剂、紫杉醇、降脂药或血管发生抑制剂。

在本发明的另一方面，提供了一种抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段能够结合至c-MET，所述抗体包含重链和轻链，并且

SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；并且

SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。

在本发明的又一方面，提供了一种药物组合物，其包含上述抗体或其功能片段，以及可药用载体。

本发明的药物组合物可以是通过静脉途径、肌肉、皮内、腹膜内或者皮下途径、或者通过口服途径施用。特别优选地，本发明的药物组合物采用静脉途径给药，是静脉注射剂。

在本发明的药物组合物中，还可以包含另外一种或多种具有治疗或预防缺血性疾病或血管内皮细胞缺血性损伤的药物活性化合物。所述药物活性化合物可以是现有技术中已知的任何具有治疗或预防缺血性疾病或血管内皮细胞缺血性损伤的化合物。

在本发明的又一个方面，提供了一种对缺血性损伤的血管内皮细胞进行保护的方法，所述方法包括向对象给予c-MET激动剂。在一个优选的方面，所述c-MET激动剂为c-MET抗体。

在优选的实施方案中，所述c-MET抗体具有促使c-MET二聚化、酪氨酸磷酸化以及激活c-MET信号通路的活性。

在另一优选实施方案中，所述c-MET抗体为通过c-MET抗原对动物免疫制备的单克隆抗体。

在另一优选实施方案中，所述c-MET抗原为具有免疫原性的c-MET全长分子、融合蛋白、分子片段或多肽。

在另一优选实施方案中，所述c-MET抗体通过筛选B淋巴细胞抗体文库获得。

在另一优选实施方案中，所述c-MET抗体为基因工程改造过但仍保持激动活性的抗体。

在另一优选实施方案中，所述c-MET抗体为FR，Fc片段经过人源化改造的抗体。

在另一优选实施方案中，所述c-MET抗体为全人源化抗体。

在另一优选实施方案中，所述c-MET抗体为具有激动活性的多克隆抗体。

在另一优选实施方案中，所述缺血性疾病为脑梗死。

在另一优选实施方案中，所述组合物的给药方式为静脉注射。

在另一优选实施方案中，所述组合物用于保护和修复脑血管。

在另一优选实施方案中，所述组合物用于降低血脑屏障通透性。

在另一优选实施方案中，所述组合物用于保护神经元。

在另一优选实施方案中，所述组合物用于减少脑梗死体积。

在另一优选实施方案中，所述组合物用于保持梗死区的血流。

本发明第三方面，提供一种按照本发明第一方面所述方法开发的治疗缺血性疾病的抗体药物。

在另一优选例中，所述抗体药物通过杂交瘤细胞系制备。

在另一优选例中，所述抗体药物为或其抗原结合片段，其包含至少1个选自以下的CDR区序列或其突变序列:

抗体重链可变区HCDR区序列:SEQ ID NO：9，SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11；和

抗体轻链可变区LCDR区序列:SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14。

本发明为治疗缺血性疾病提供了一种药学上可行的方案，以及提供了一种药效良好的备选药物。

附图说明

图1a为表明本发明实施例1中的慢病毒穿梭载体pRRL-CMV-ED酶切鉴定图，图1b为本发明实施例1中c-MET关键结构域ED融合蛋白表达检测结果图。

图2为表明本发明实施例2中c-MET抗体杂交瘤细胞上清与ED蛋白结合能力检测结果的图。

图3为表明本发明实施例3中c-MET单克隆抗体对c-MET胞外区ED蛋白的结合能力的图。

图4为表明本发明实施例4中c-MET抗体的重、轻链可变区VH和VL基因的调取结果的图。

图5为表明本发明实施例5中慢病毒穿梭载体pRRL-CMV-VH和pRRL-CMV-VL酶切鉴定结果的图。

图6为表明本发明实施例6中c-MET人源化嵌合抗体靶向性检测结果的图。

图7为表明本发明实施例7中c-MET人源化嵌合抗体在不同作用时间下诱导的Bend.3细胞中c-MET Tyr1234磷酸化检测结果的图。

图8为表明本发明实施例8中c-MET人源化嵌合抗体体外结合活性检测结果的图。

图9为表明本发明实施例9中c-MET单克隆抗体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的作用的图。

图10为表明本发明实施例10中c-MET单克隆抗体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移的作用的图。

图11为表明本发明实施例11中c-MET单克隆抗体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形成微管的作用的图。

图12为表明本发明实施例13中c-MET人源化嵌合抗体对氧糖剥夺血管内皮细胞(Bend.3)活性保护作用的图。

图13为表明本发明实施例14中人源化嵌合抗体对氧糖剥夺后血管内皮细胞(Bend.3)凋亡保护作用的图。

图14为表明本发明实施例15中人源化嵌合抗体对氧糖剥夺血管内皮细胞(Bend.3)死亡后乳酸脱氢酶(LDH)释放浓度的图。

图15为表明本发明实施例17中c-MET单克隆抗体对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型的脑血管内皮细胞保护作用的图。

图16为表明本发明实施例17中c-MET人源化嵌合抗体在体内模型(小鼠MCAO模型)中对血脑屏障相关紧密连接蛋白的影响结果。

图17为本发明实施例17中c-MET人源化嵌合抗体对小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)心脏梗死区组织切片VWF染色的图。

图18为本发明实施例18中抗c-MET人源化嵌合抗体对氧糖剥夺血脑屏障体外模型的作用的图。

图19为表明本发明实施例18中c-MET单克隆抗体对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型的血脑屏障通透性保护作用的图。

图20为本发明实施例18体外模型(Bend.3细胞模型)中c-MET人源化嵌合抗体对血脑屏障相关紧密连接蛋白的影响的图。

图21为本发明实施例19中c-MET人源化嵌合抗体对脑缺血线栓小鼠模型(MCAO)的脑梗死体积作用的图。

图22为表明本发明实施例19中c-MET单克隆抗体对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型的脑梗死体积作用的图。

图23为表明本发明实施例19中c-MET人源化嵌合抗体对小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)的心脏梗死区组织切片Masson染色的图。

图24为表明本发明实施例20中c-MET单克隆抗体对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型的神经元保护作用的图。

图25为表明本发明实施例20中c-MET单克隆抗体对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型的神经功能保护作用的图。

图26为本发明实施例20中抗c-MET人源化嵌合抗体对小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)的心脏功能评价的图。

关于本发明上述附图涉及实验及其结果的详细说明如下：

图1-a为慢病毒穿梭载体pRRL-CMV-ED酶切电泳图，泳道1为DNAmarker，泳道2为慢病毒穿梭载体pRRL-CMV-ED使用AgeⅠ和SalⅠ双酶切样品，酶切结果显示：获得7500bp的载体条带和2700bp的目的基因条带，证明人MET胞外区ED片段的慢病毒表达质粒pRRL-CMV-ED构建成功；

图1-b为MET关键结构域ED融合蛋白表达检测结果图，其中泳道1：表达上清原液(1:5稀释)；泳道2：柱穿过液(1:5稀释)；泳道3：20mM咪唑洗脱组分；泳道4-5：50mM咪唑洗脱组分；泳道6-9：200mM咪唑洗脱组分；M：蛋白分子量标准品。其中泳道5-9中105KDa的条带大小与目的条带预期大小一致，证明MET胞外区ED融合蛋白成功表达和纯化获得。

图2为本发明实施例2中c-MET抗体杂交瘤细胞上清与ED蛋白结合能力检测结果，其中横坐标为c-MET抗体杂交瘤上清的上样体积，单位μl，纵坐标为波长450nm下的吸光值。结果显示：1H9D6杂交瘤上清可以与MET胞外区ED融合蛋白特异性结合，随着加入体积的增加，信号增强。

图3为本发明实施例3中c-MET单克隆抗体对c-MET胞外区ED蛋白的结合能力，其中横坐标为c-MET抗体的浓度，单位ng/ml，纵坐标为波长450nm下的吸光值。结果显示：c-MET单克隆抗体可以与c-MET胞外区ED融合蛋白特异性结合，随着加入浓度的增加，信号增强，在该体系条件下，c-MET单克隆抗体的最低检测浓度为0.06ng/ml，证明c-MET单克隆抗体1H9D6与MET胞外区ED融合蛋白结合能力强。

图4为本发明实施例4中c-MET抗体的重、轻链可变区VH和VL基因的调取，其中泳道1为DNAmarker，泳道2为VH基因的PCR产物，泳道3为VL基因的PCR产物，电泳结果显示：鼠源VH和VL基因的PCR产物分别可见约351和336bp的特异性条带，证明鼠源VH和VL基因成功调取。

图5为本发明实施例5中慢病毒穿梭载体pRRL-CMV-VH和pRRL-CMV-VL酶切鉴定，其中泳道1为DNAmarker，泳道2为慢病毒穿梭载体pRRL-CMV-重链使用AgeⅠ和SalⅠ双酶切样品，泳道3为慢病毒穿梭载体pRRL-CMV-轻链使用AgeⅠ和SalⅠ双酶切样品，酶切结果显示：获得7500bp的载体条带和1400bp(重链)及700bp(轻链)的目的基因条带，证明嵌合抗体的轻、重链慢病毒表达质粒构建成功。

图6为本发明实施例6中c-MET人源化嵌合抗体靶向性检测，其中横坐标为c-MET人源化嵌合抗体的浓度，单位ng/ml，纵坐标为波长450nm下的吸光值。结果显示：c-MET人源化嵌合抗体可以阻断HGF/MET特异性结合，随着加入浓度的增加，阻断效应增强，在该体系条件下，c-MET人源化嵌合抗体对HGF/c-MET特异性结合的最大阻断率为79.7％。

图7为本发明实施例7中c-MET人源化嵌合抗体抗体在不同作用时间下诱导的Bend.3细胞中c-MET Tyr1234磷酸化检测结果。

图8为本发明实施例8中c-MET人源化嵌合抗体体外结合活性检测，其中横坐标为c-MET人源化嵌合抗体的上样浓度，单位ng/ml，纵坐标为波长450nm下的吸光值。结果显示：c-MET人源化嵌合抗体可以与HUVEC细胞表面的c-MET蛋白特异性结合，随着加入浓度的增加，信号增强。

图9为本发明实施例9中c-MET单克隆抗体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的作用，其中横坐标为c-MET单克隆抗体的浓度，单位ng/ml，纵坐标为波长450nm下的吸光值。结果显示：c-MET单克隆抗体可以促进HUVEC细胞的增殖效应，随着加入浓度的增加，效应更显著。

图10为本发明实施例10中c-MET单克隆抗体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移的作用，其中横坐标为c-MET单克隆抗体的浓度，单位ng/ml，纵坐标为transwell小室下表面的细胞数量。结果显示：c-MET单克隆抗体可以促进HUVEC细胞的迁移效应，随着加入浓度的增加，效应更显著。

图11为本发明实施例11中c-MET单克隆抗体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形成微管的作用，其中图11-A为铺胶0小时后的对照组细胞照片，11-B为铺胶0小时后的1H9D6加药组细胞照片，其中1H9D6的浓度为1μg/ml；图11-C为铺胶72小时后的对照组细胞照片，图11-D为铺胶72小时后的1H9D6加药组细胞照片，其中1H9D6的浓度为1μg/ml。A和B比较显示：初始细胞状态一致，C和D比较显示：在1H9D6(1μg/ml)作用72小时后，HUVEC细胞的微管形成数量显著增加，证明c-MET单克隆抗体可以促进HUVEC细胞的微管生成。

图12为本发明实施例13中c-MET人源化嵌合抗体对氧糖剥夺血管内皮细胞(Bend.3)活性保护作用，其中横坐标为样品信息，其中对照组为未进行氧糖剥夺处理的样品，损伤组为进行进行氧糖剥夺处理的样品；保护组数值为c-MET人源化嵌合抗体的浓度，单位ng/ml，纵坐标为波长450nm下的吸光值。结果显示：c-MET人源化嵌合抗体对氧糖剥夺后的血管内皮细胞(Bend.3)有保护效应，随着加入浓度的增加，效应更显著。

图13为表明本发明实施例14中c-MET人源化嵌合抗体对氧糖剥夺处理后血管内皮细胞(Bend.3)凋亡的影响，图13-a中对照组为未进行氧糖剥夺处理的样品，损伤组为进行进行氧糖剥夺处理的样品；治疗组为进行进行氧糖剥夺处理，同时加入抗c-MET人源化抗体的样品，数值为抗c-MET人源化抗体的浓度，单位ng/ml。图13-b为抗c-MET人源化抗体对氧糖剥夺处理后血管内皮细胞(Bend.3)凋亡细胞数量的统计结果。结果显示：血管内皮细胞(Bend.3)经氧糖剥夺处理后，凋亡细胞数量显著增加，随着抗c-MET人源化抗体的加入，凋亡细胞数量减少，证明c-MET人源化嵌合抗体对氧糖剥夺后血管内皮细胞(Bend.3)凋亡有保护效应，随着抗c-MET人源化抗体加入浓度的增加，保护效应更显著。

图14为表明本发明实施例15中c-MET人源化嵌合抗体对氧糖剥夺引起的血管内皮细胞(Bend.3)死亡指标乳酸脱氢酶(LDH)的影响，其中横坐标为样品信息，其中对照组为未进行氧糖剥夺处理的样品，损伤组为进行进行氧糖剥夺处理的样品；治疗组数值为c-MET人源化嵌合抗体的浓度，单位ng/ml，纵坐标为LDH浓度，单位为μg/ml。结果显示：结果显示：血管内皮细胞(Bend.3)经氧糖剥夺处理后，LDH浓度显著增加，随着抗c-MET人源化抗体的加入，LDH浓度减少，证明c-MET人源化嵌合抗体对氧糖剥夺血管内皮细胞(Bend.3)LDH浓度有降低效应，随着抗c-MET人源化抗体加入浓度的增加，降低效应更显著。

图15为表明本发明实施例17中c-MET单克隆抗体对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型的脑血管内皮细胞保护作用的脑血管内皮细胞免疫组化染色结果，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg；VWF是血管内皮细胞标志物，DAPI是细胞核染色标志物，合并指VWF和DAPI染色的同一视野照片经过合并图像后生成的图片。结果显示：c-MET单克隆抗体可以显著减少光化学损伤后的脑血管内皮细胞损伤，血管完整性好，对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型引起的脑梗有保护作用。

图16为本发明实施例17中c-MET人源化嵌合抗体在体内模型(小鼠MCAO模型)。图16-a为c-MET抗体对脑缺血线栓小鼠模型(MCAO)的脑血管内皮细胞的影响和紧密连接蛋白ZO-1的表达丰度影响结果，其中假手术组对动物进行水合氯醛麻醉，仰卧固定。行颈正中切口，游离右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，不进行损伤造模。损伤组注射生理盐水，治疗组注射1H9D6纯化抗体，剂量为1mg/kg；VWF是血管内皮细胞标志物，ZO-1是紧密连接蛋白，合并指VWF和Z0-1染色的同一视野照片经过合并图像后生成的图片。结果显示：c-MET人源化嵌合抗体组的脑梗死缺血区半暗带微血管完整性比损伤组好，ZO-1的表达丰度也比损伤组高，证明血脑屏障破坏较小。图16-b为c-MET抗体对脑缺血线栓小鼠模型(MCAO)的脑梗区域组织中紧密连接蛋白ZO-1的表达丰度的WB结果，其中假手术组对动物进行水合氯醛麻醉，仰卧固定。行颈正中切口，游离右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，不进行损伤造模。损伤组注射生理盐水，治疗组注射1H9D6纯化抗体，剂量为1mg/kg；β-actin是管家蛋白，作为WB内参，ZO-1是紧密连接蛋白。结果显示：损伤组ZO-1蛋白的表达水平显著降低，而c-MET人源化嵌合抗体组ZO-1蛋白表达水平与假手术组基本一致，证明ZO-1蛋白在小鼠MCAO模型中有显著下降，c-MET人源化嵌合抗体能显著提高ZO-1蛋白的表达水平，使其表达水平接近假手术组。

图17为本发明实施例17中c-MET人源化嵌合抗体对小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)心脏梗死区组织切片VWF染色结果。其中对照组为假手术组，损伤组为小鼠MI心梗损伤后尾静脉注射等量生理盐水，治疗组为小鼠MI心梗损伤后尾静脉注射3mg/kg的1H9D6人源化抗体；结果显示：对照组VWF染色清楚，血管结构清晰完整，损伤组VWF染色清楚，血管部位结构破损严重，说明MI心梗后导致的血管损伤严重；治疗组VWF染色清楚，血管结构仍然保持较完整；证明抗c-MET人源化抗体对小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)引起的心脏微血管损伤有保护作用。

图18为本发明实施例18中抗c-MET人源化嵌合抗体对氧糖剥夺血脑屏障体外模型的作用结果，其中横坐标为样品信息，其中对照组为未进行氧糖剥夺处理的样品，损伤组为进行进行氧糖剥夺处理的样品；损伤组数值为抗c-MET人源化嵌合抗体的浓度，单位ng/ml，纵坐标为波长450nm下的吸光值。结果显示：血管内皮细胞(Bend.3)经氧糖剥夺处理后，细胞层完整性受损，透过细胞层的小鼠外周血淋巴细胞数量显著增加，抗c-MET人源化嵌合抗体对氧糖剥夺后的血脑屏障体外模型有保护效应，透过的小鼠外周血淋巴细胞数量减少，随着加入浓度的增加，效应更显著。

图19为本发明实施例18中c-MET抗体对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型的血脑屏障通透性保护作用，其中图19-a为动物脑组织照片，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg；图19-b为统计后的伊文思蓝含量结果。横坐标表示分组情况，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg，纵坐标为伊文思蓝含量，单位为μg/g脑组织；结果显示：c-MET单克隆抗体可以显著减少光化学损伤后动物脑组织中的伊文思蓝含量，对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型引起的血脑屏障通透性有修复作用。

图20为本发明实施例18体外模型(Bend.3细胞模型)中c-MET人源化嵌合抗体对血脑屏障相关紧密连接蛋白的影响结果。图20-a和20-b分别为Bend.3氧糖剥夺模型中紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1的荧光定量PCR结果，其中图20-a为紧密连接蛋白claudin-5的结果，图20-b为紧密连接蛋白ZO-1的结果。其中对照组是未进行氧糖剥夺处理的细胞样品；损伤组是进行进行氧糖剥夺处理，未加入c-MET人源化嵌合抗体的细胞样品；治疗组是进行进行氧糖剥夺处理，加入c-MET人源化嵌合抗体(浓度为10000ng/ml)的细胞样品。其中横坐标为样品信息，纵坐标为各基因的mRNA相对转录水平结果，以对照组目的基因的mRNA转录水平为1.0。结果显示：氧糖剥夺后的血管内皮细胞(Bend.3)的claudin-5和ZO-1蛋白的mRNA转录水平显著降低，随着c-MET人源化嵌合抗体的加入，claudin-5和ZO-1蛋白的mRNA转录水平显著升高，超过对照组表达水平。可见c-MET人源化嵌合抗体对氧糖剥夺血管内皮细胞中紧密连接蛋白的mRNA转录水平有显著提高。

图21为本发明实施例19中c-MET人源化嵌合抗体对脑缺血线栓小鼠模型(MCAO)的脑梗死体积作用，图21-a为动物脑组织切面照片，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET人源化嵌合抗体，剂量为1mg/kg；图21-b为统计后的脑梗死体积结果。横坐标为分组情况，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET人源化嵌合抗体，剂量为1mg/kg，纵坐标为脑梗死体积，单位为mm³。结果显示：c-MET人源化嵌合抗体可以显著减少脑缺血线栓小鼠模型(MCAO)的动物脑梗死体积，对SD大鼠脑缺血线栓小鼠模型(MCAO)引起的脑梗有保护作用。

图22为本发明实施例19中c-MET抗体对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型的脑梗死体积作用，其中图22-a为动物脑组织切面照片，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg；图22-b为统计后的脑梗死体积结果。横坐标为分组情况，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg，纵坐标为脑梗死体积，单位为mm³，结果显示：c-MET单克隆抗体可以显著减少光化学损伤后的动物脑梗死体积，对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型引起的脑梗有保护作用。

图23为表明本发明实施例19中c-MET人源化嵌合抗体对小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)的心脏梗死区组织切片Masson染色结果。其中图23-a为Masson染色结果，其中胶原纤维呈绿色，肌纤维呈红色，红细胞呈橘红色；其中对照组为假手术组，损伤组的0mg/kg组为小鼠MI心梗损伤后尾静脉注射等量生理盐水的单独损伤组，损伤组的1mg/kg和3mg/kg组为2组治疗组，分别注射1mg/kg和3mg/kg的c-MET人源化嵌合抗体；图23-b为梗死区的分布比例(胶原纤维/肌纤维)结果，其中横坐标为各组标示，其中对照组为假手术组，损伤组的0mg/kg组为小鼠MI心梗损伤后尾静脉注射等量生理盐水的单独损伤组，损伤组的1mg/kg和3mg/kg组为2组治疗组，分别注射1mg/kg和3mg/kg的c-MET人源化嵌合抗体；纵坐标为小鼠心脏胶原纤维/肌纤维的比值，单位为％。结果显示：对照组几乎无胶原纤维阳性染色，损伤组胶原纤维染色明显，说明MI心梗后导致的心肌纤维化严重；治疗组心肌组织纤维化程度显著减轻，随着c-MET人源化嵌合抗体浓度的增加，纤维化程度减弱的更显著，证明c-MET人源化嵌合抗体对小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)引起的心脏纤维化有抑制作用。

图24为本发明实施例20中c-MET抗体对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型的神经元保护作用，图24-a为脑梗死区域神经元免疫组化染色结果，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg；活化caspase-3是细胞凋亡标志物，NeuN是血神经元细胞标志物，合并指活化caspase-3和NeuN染色的同一视野照片经过合并图像后生成的图片，图24-b为统计后的单视野内凋亡神经元细胞数量结果。横坐标为分组情况，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg，纵坐标为凋亡神经元细胞数量。结果显示：c-MET单克隆抗体可以显著减少光化学损伤后的脑梗死区域神经元细胞损伤，神经元细胞凋亡数量显著降低，对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型引起的脑梗有保护作用。

图25为本发明实施例20中c-MET单克隆抗体对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型的神经功能保护作用，横坐标为分组情况，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg，纵坐标为神经功能评分，评分标准如下：

0分，无神经功能缺损症状；

1分，轻微神经功能缺损，不能完全伸展左侧前爪；

2分，中度局灶性神经功能缺损，行走时向左侧转圈；

3分，重度局灶性神经功能缺损，向左侧倾倒；

4分，不能自发行走，意识水平下降；

结果显示：c-MET单克隆抗体可以显著改善光化学损伤后的动物神经功能，对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型引起的脑梗有保护作用。

图26为本发明实施例20中c-MET人源化嵌合抗体对小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)的心脏功能评价结果，使用心动超声进行评价。其中图26-a为心脏射血分数(EF)结果，其中横坐标为各组标示，其中对照组为假手术组，损伤组的0mg/kg组为小鼠MI心梗损伤后尾静脉注射等量生理盐水的单独损伤组，损伤组的1mg/kg和3mg/kg组为2组治疗组，分别注射1mg/kg和3mg/kg-的c-MET人源化嵌合抗体；纵坐标为小鼠的心脏射血分数(EF)，单位为％。图26-b为左心室短轴缩短指数(FS)结果，横坐标标示同图26-a，纵坐标为左心室短轴缩短指数(FS)，单位为百分数(％)。图26-c为左心室舒张期容积(EDV)结果，横坐标标示同图26-a，纵坐标为左心室短轴缩短指数(FS)，单位为μl。图26-d为左心室收缩期容积(ESV)结果，横坐标标示同图26-a，纵坐标为左心室收缩期容积(ESV)，单位为μl。结果显示：损伤组EF值均低于40％，心梗模型建立成功；经过1mg/kg/3d的c-MET人源化嵌合抗体尾静脉注射后，EF值具有恢复趋势；经过3mg/kg/3d的c-MET人源化嵌合抗体尾静脉注射后，EF值恢复更加明显；FS值、EDV值和ESV值均有类似趋势，表明c-MET人源化嵌合抗体对小鼠MI心梗模型中心脏功能具有保护效应。

具体实施方式

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。特别地，本文所使用术语的含义还可参见中国专利申请201110131029.X。

尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。

另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。

本文使用的术语“可溶性”蛋白是指在生物学相关的温度、pH水平和渗透压下可溶于水溶液的蛋白。在某些实施方案中，本发明的融合蛋白是可溶性蛋白。本文使用的“可溶性融合蛋白”表示该融合蛋白不包含跨膜区和胞内区。

如本文所用，术语“分离的”是指以下物质和/或实体，(1)与起初产生时(在天然环境中和/或在试验设置中)和其相关联的至少一些组分相分离和/或(2)通过人工生产、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可与至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本100％或100％的其初始相关联的其他组分相分离。在某些实施方案中，本发明的融合蛋白是分离的融合蛋白。

术语“部分”和“片段”可互换的指代多肽、核酸或其它分子构建物的一部分。

本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如家养动物(如狗、猫等)，家畜(如牛、羊、猪、马等)或实验动物(如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。

本文使用的术语“一致性”、“百分比一致性”、“同源性”或“同一性”指两个氨基酸序列之间或者核酸序列之间的序列同一性。可以通过比对两个序列来确定百分比一致性，百分比一致性指所比较的序列共有位置相同残基(即氨基酸或核苷酸)的数量。可使用本领域的标准算法(例如Smith和Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch,1970,J.MoI.Biol.48:443；Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:2444)或者通过这些算法的计算机化版本(Wisconsin Genetics Software Package Release7.0,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,WI)进行序列比对和比较，所述计算机化版本公开可用为BLAST和FASTA。另外，通过美国国家卫生研究院(Bethesda MD)可用的ENTREZ可用于序列比较。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各个程序(例如BLASTN，在美国国家生物技术信息中心的因特网站点上可用)的缺省参数。在一个实施方案中，可使用缺口权重为1的GCG来确定两个序列的百分比同一性，使得每个氨基酸缺口给予权重如同它是两个序列间的单氨基酸不匹配。或者，可使用ALIGN程序(2.0版)，其是GCG(Accelrys，SanDiego，CA)序列比对软件包的一部分。

组合物

本发明还提供了一种药物组合物，其含有有效量的本发明的抗体或其功能片段，以及可药用载体。优选地，所述抗体或其功能片段能够结合至c-MET，所述抗体包含重链和轻链，并且

SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11；并且

SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。

优选地，上述突变序列意指与原序列具有至少80％序列同一性、或至少85％序列同一性、或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少97％、98％或99％序列同一性的序列。

如本领域所公知的，术语“同一性百分比”是通过比较序列测定的两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，根据具体情况而定，如通过这些序列串之间的匹配所测定的。“同一性”和“相似性”可通过已知的方法容易地计算，所述方法包括但不限于以下描述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)Oxford UniversityPress，New York(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)Academic Press，New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humana Press，New Jersey(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology(vonHeinje，G.编辑)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)StocktonPress，New York(1991)。测定同一性的优选方法被设计成给出所测序列之间的最佳匹配。测定同一性和相似性的方法被编写成了公共可利用的计算机程序。序列比对和同一性百分比计算可利用序列分析软件(例如LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTARInc.，Madison，WI)的Megalign程序)来进行。

在本发明的药物组合物中，所述抗体包含治疗有效量的范围，例如，所述抗体或其功能片段可以占所述药物组合物重量比的0.000001wt％至50wt％，优选0.00001wt％至20wt％，更优选0.0001wt％至10wt％。特别优选地，所述抗体或其功能片段占所述药物组合物重量比的0.001wt％至5wt％。

本发明的组合物可直接用于促进血管内皮细胞修复增殖，特别是血管损伤性疾病。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。优选地，所述药物组合物还可包含另外一种或多种具有治疗或预防缺血性疾病或血管内皮细胞缺血性损伤的药物活性化合物。

通常，可将本发明的c-MET激动剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-9，较佳地pH约为6-8。

如本文所用，术语"含有"表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语"主要由...组成"和"由...组成"包含在术语"含有"中。如本文所用，术语"有效量"或"有效剂量"是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“可药用的”或“药学上可接受的”成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、剌激和***反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语"可药用载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的组合物含有安全有效量的c-MET抗体以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述的c-MET抗体的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的c-MET抗体的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的c-MET抗体每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-l0mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

作为本发明的优选方式，本发明的抗体是人源化c-MET抗体，当每天以0.1-500mg/kg动物体重给药时，具有较好的效果；优选地每天以0.5-200mg/kg动物体重给药；更优选地每天以1-100mg/kg动物体重给药。

本发明的c-MET抗体的给药方式没有特别的限制，可以是全身的或局部的。例如，本发明的c-MET抗体可通过脑内立体定向注射、腹腔注射、静脉注射、口服、皮下注射、皮内注射等的方式给予动物，较为优选的是静脉注射。

在得知了所述的c-MET抗体的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的c-MET抗体或其编码基因、或其药物组合物给药于动物或者人体。优选地，可将c-MET抗体的重组蛋白质通过注射等方法给药于对象。另一方面，也可以通过将携带该c-MET抗体基因的表达载体(比如病毒或质粒等)递送到靶器官上，并在体内表达c-MET抗体蛋白，达到基因治疗的目的。

本文使用的术语“药物组合物”、“组合药物”和“药物组合”可互换地使用，其表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分(例如根据本发明的抗体、核酸分子、核酸分子组合和/或缀合物)可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。

可利用本领域公知的任何方法将本发明的药物组合物递送至所期望的部位。可使用的递送装置的实例包括但不限于导管(例如球囊导管、输注导管、管心针(Stilettocatheter)、针、无针注射器、支架、输注套管、网、心脏缚具(cardiacharness)、分流器、心脏起搏器、植入式除颤器、缝合线、钉、血管周围套(perivascularwrap)、可与创伤部位的轮廓基本上一致的柔软薄片或膜、管道装置、移植物和泵。递送HGF同工型的方法的具体实例包括但不限于通过置于流入冠状窦(例如心大静脉、心中静脉、左心室后静脉、前室间静脉或任何其他分枝)的静脉中的球囊导管；通过通往一条或更多条冠状动脉(例如右冠状动脉或左冠状动脉)的腔的导管，其中HGF同工型被包被在在该部位膨胀的球囊上或者从导管尖端注射；在心内直视手术或心脏移植过程中通过针递送(例如递送至左心房或右心房或者左心室或右心室中)；通过心内直视手术或微介入手术利用内部入口通过左心房、右心室或左心室递送至心包腔或者利用外部入口递送至心包区，或者通过注射、导管***、用激光引起形成灌注通道、套管***、利用粒子枪或利用泵形成的经皮入口递送至心包区；从置于将血液递送至组织的管道内的导管通过顺行灌注进行递送，或者从置于从组织接收血液的管道中的导管通过逆行灌注来递送；或者通过用于维持血管通畅性的腔内装置或血管内假体(例如支架、移植物、支架-移植物、腔静脉滤器)来递送。在一个实施方案中，所述装置是可生物降解的，因此，无需在不再需要后将其移出。在某些实施方案中，利用支架递送所述两种HGF同工型。在又一个实施方案中，所述支架选自不基于聚合物的不锈钢支架、基于聚合物的不锈钢支架、不基于聚合物的钴铬支架和基于聚合物的钴铬支架。

根据本发明的药物组合物可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。

本文使用的术语“治疗剂”表示能够起到治疗作用(例如治疗、预防、缓解或抑制任何疾病和/或病症)的任何物质或实体(entity)，其包括但不限于：化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、热治疗剂(thermally therapeutic agent)等。

本文使用的“CDR区”或“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高变区，如Kabat etal.所定义(Kabat et al.,Sequences of proteins of immunological interest,5thEd.,U.S.Department of HealthandHuman Services,NIH,1991,以及以后版本)。存在三个重链CDR和三个轻链CDR。根据情况，本文所用术语CDR或CDRs是为了指示这些区域之一、或者这些区域的几个或者甚至全部，所述区域包含通过抗体对抗原或其识别表位的亲和力而负责结合的大部分氨基酸残基。

对本发明来说，两种核酸或者氨基酸序列间的“一致性”、“同一性”或“相似性”是指，在最佳比对(最优比对)后所获得的、待比较的两序列之间相同核苷酸或相同氨基酸残基的百分数，该百分数是纯粹统计学的并且两种序列间的差异随机分布并覆盖其全长。两种核酸或者氨基酸序列之间的序列比较通常是在以最优方式使它们匹配以后，通过比较这些序列而进行，所述比较能够通过区段或者通过“比较窗”实施。除了能够手工实施外，用于比较序列的最优比对，还能够通过Smith和Waterman(1981)[Ad.App.Math.2:482]的局部同源性算法、通过Neddleman和Wunsch的(1970)[J.MoI.Biol.48:443]局部同源性算法、通过Pearson和Lipman的(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444)相似性搜索方法、通过使用这些算法的计算机软件实施(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA inthe Wisconsin GeneticsSoftware Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI,或者通过BLAST N or BLAST P比较软件)。

本文使用的“治疗有效量”或“有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。

本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如野生动物(如苍鹭、鹳、鹤等)，家畜(如鸭、鹅等)或实验动物(如猩猩、猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、土拨鼠、地松鼠等)。

术语“抗体”系指完整抗体和其任何抗原结合片段(“抗原结合部分”)或单链。“全长抗体”系指包含通过二硫键而互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白。每条重链包含一重链可变区(缩写为VH)和一重链恒定区。该重链恒定区包含三个域(domain)，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含一轻链可变区(缩写为VL)和一轻链恒定区。该轻链恒定区包含一个域，CL。VH和VL区域还可再细分为具有高可变性的多个区，被称为互补决定区(CDR)，其间散布有更为保守的被称为框架区(FR)的多个区域。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基端至羧基端排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的这些可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主的组织或因子结合，包括免疫***的各种细胞(如效应细胞)和经典补体***的第一成分(Clq)。嵌合或人源化抗体也涵盖在根据本发明的抗体中。

术语“人源化抗体”是指一种抗体，其包含来源于非人源抗体的CDR区、并且该抗体分子的其他部分来源于一种(或几种)人抗体。而且，为了保留结合亲和力，可以修饰骨架(称为FR)区段的一些残基(Jones et al.,Nature,321:522-525,1986；Verhoeyenet al.,Science,239:1534-1536,1988；Riechmann et al.,Nature,332:323-327,1988)。通过本领域技术人员已知的技术可以制备根据本发明的人源化抗体或其片段(例如，描述于文件Singer et al.,J.Immun.150:2844-2857,1992；Mountainet al.,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.,10:1-142,1992；或Bebbingtonet al.,Bio/Technology,10:169-175,1992)。

术语“嵌合抗体”系指以下抗体，其中的可变区序列来自一物种而恒定区序列来自另一物种，例如可变区序列来自小鼠抗体而恒定区序列来自人抗体的抗体。通过使用基因重组技术可以制备根据本发明的嵌合抗体或其片段。例如，所述嵌合抗体可以通过克隆重组DNA来生产，所述重组DNA包含启动子和编码根据本发明的非人尤其是鼠单克隆抗体可变区的序列、以及编码人抗体恒定区的序列。由这种重组基因编码的本发明嵌合抗体将是，例如，鼠-人嵌合体，该抗体的特异性由来源于鼠DNA的可变区确定，并且其同种型由来源于人DNA的恒定区来确定。对于制备嵌合抗体的方法，例如，可以参考文件Verhoeynet al.(BioEssays,8:74,1988)。

术语“单克隆抗体”系指具有单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物显示出对于特定表位的单一结合特异性和亲和性。

术语“衍生物”指在N端、C端、主链、肽键和/或侧链残基对氨基酸/氨基酸链的(化学)修饰。该术语并不意图指氨基酸链中氨基酸的任意增加、置换或缺失。来自这样的L-氨基酸或L-对映体氨基酸的(化学)衍生物通常包括这些氨基酸的任意天然或非天然存在衍生物——包括但不限于此：如上所定义的氨基酸包含翻译后修饰或合成修饰，包括乙酰化作用(在(多)肽序列的N端，在赖氨酸残基处等)、脱乙酰作用、烷化如甲基化、乙基化等(优选地在(多)肽序列中的赖氨酸或精氨酸残基处)、脱烷基化如脱甲基化、脱乙基作用等、酰胺化(优选地在(多)肽序列的C端)、甲酰化、γ-羧化作用、谷氨酰化(glutamylation)、糖基化(优选地在(多)肽序列中的天冬酰胺、赖氨酸、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基处等)、血红素或血红素部分的增加、羟基化、碘化作用、异戊二烯化增加类异戊二烯部分如法尼基或牻牛儿基牻牛儿醇(geranylgeraniol)等)、硫辛酰化(lipoylation)(硫辛酸官能团的连接)如异戊二烯化、GPI锚的形成，包括豆蔻酰化、法尼基化、牻牛儿基忙牻儿基化(geranylgernaylation)等、氧化、磷酸化(例如，到(多)肽序列中的丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸部分等)、硫酸化作用(例如，酪氨酸的硫酸化作用)、硒化(selenoylation)、硫酸化作用等。施用

本发明中的融合蛋白可以单独施用，但优选地作为药物组合物施用，其通常包括根据施用的计划方式所选的适合的药物赋形剂、稀释剂或载体。融合蛋白可以通过任何适合的方式适用于需要治疗的患者。精确的计量将取决于多个因素，包括该融合蛋白精确的性质。

一些合适的使用方式包括(但不限于)口服、直肠、鼻部、局部(包括口腔和舌下)、皮下、***或胃肠外的(包括皮下、肌肉、静脉、皮内、鞘内和硬脑膜外)施用。

对于静脉注射和在病痛位置的注射，活性成分将为一种胃肠外接受的水溶液形式，其不含热源并具有合适的pH值、等张性和稳定性。

本领域中相关技术人员可使用适当的溶剂或制剂配制融合蛋白，例如：等张赋形剂如氯化钠注射液、林格氏注射液，乳酸林格氏注射液。根据要求，可以加入防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它一些添加剂。口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂或口服液等形式。片剂可以包括固体载体，如明胶或辅剂。液体药物组合物通常包括液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。也可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

以上所提到的技术和方案的例子以及其它一些根据本发明所使用的技术和方案可以在Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Oslo,A.(ed),1980.中找到。

本发明中的c-MET抗体可以是天然存在的，例如其可被分离或纯化自人或哺乳动物的B淋巴细胞或浆细胞。所述的c-MET抗体也可以人工制备获得，例如可以通过c-MET抗原免疫动物，并通过杂交瘤技术获得单克隆抗体。

所述c-MET抗原可以是c-MET全长蛋白、重组片段或多肽，或其组合。所述的动物可以是常用的实验动物，例如通过免疫小鼠获得鼠抗c-MET抗体，再通过抗体工程技术进行抗体的人源化改造，使之成为适合成药的单克隆抗体。c-MET抗体也可以通过免疫注射携带人免疫球蛋白基因的转基因动物获得，通过杂交瘤技术直接获得全人源的单克隆抗体。另一方面，c-MET抗体也可以通过筛选B淋巴细胞抗体文库获得，最为常用的技术是利用噬菌体抗体展示技术获得全人源抗体，也可以通过其他展示技术，例如核糖体展示技术、DNA抗体展示技术、酵母抗体展示技术等。本发明利用重组c-MET蛋白免疫动物获得单克隆抗体。所述的c-MET蛋白的氨基酸序列可以根据GenBank序号AAI30421.1所示的序列获得。

本发明通过杂交瘤技术，结合蛋白质和细胞水平的筛选平台获得了一个激动型c-MET抗体，并利用基因克隆获得了该抗体的氨基酸序列，具体方法见实施例2。用于制备所述激动型c-MET抗体所述的杂交瘤细胞系存放于中国典型培养物保藏中心，登记号为CCTCCNO.C2017124。所述c-MET抗体的CDR区氨基酸序列见序列SEQ ID NO:9至SEQ ID NO:14。

值得指出的是，该序列中如果有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加，可能仍然保持抗体的功能。该c-MET抗体或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸或片段是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子对抗原的结合、激活或抑制活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种抗体的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性，因此这些抗体的变体不包含在本发明之中。

任何一种c-MET抗体的功能性片段(生物活性片段)都可以应用到本发明中。在这里，c-MET抗体的功能性片段的含义是指经过基因工程改造的抗体片段，其仍然能保持全长的c-MET抗体的全部或部分功能。通常情况下，所述的功能性片段至少保持50％的全长c-MET抗体的活性。在更优选的条件下，所述功能性片段能够保持全长c-MET抗体的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的c-MET抗体，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的c-MET抗体。

本发明也可采用包含了其他种属同源性片段的c-MET嵌合抗体或改型抗体，比如，可采用为了降低人类异源性加以改良的c-MET人源化抗体。

经过修饰或改良的c-MET抗体可以是与天然存在的c-MET抗体具有较小的共同点，但也能促进受损血管内皮细胞修复和增殖，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响c-MET抗体的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

作为本发明的优选方式，所述的c-MET抗体包括(但不限于):人源化抗体、CDR经过改造的嵌合抗体、FR经过改造的嵌合抗体、Fc经过改造的嵌合抗体。

根据c-MET抗体的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。

作为本发明的优选方式，所述的c-MET抗体包括(但不限于):在转入细胞后可表达(优选过表达)c-MET抗体的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码c-MET抗体的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的洁性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

本发明中，c-MET抗体序列可括入到重组表达载体中。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含c-MET抗体的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。转化载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

作为本发明的一种实施方式，可将所述的c-MET抗体进行重组表达，实现大规模生产。为了达到生产的目的，可将编码c-MET抗体的基因通过分子生物学方法克隆到适当的载体(如常规原核或真核表达质粒或病毒等)中，将所述的载体导入到可表达所述c-MET抗体的细胞中，使所述的细胞表达c-MET抗体，实现c-MET抗体的表达。表达用细胞有多种，可以是真核细胞，也可以是原核细胞。为了使该抗体具有最佳的生物学活性，以用哺乳动物细胞表达为佳，最为优选的是CHO细胞。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

第一部分：激动型c-MET抗体的筛选和制备

本发明首先通过杂交瘤技术获得c-MET抗体单克隆抗体，并进一步对其进行人源化改造成为嵌合抗体。利用c-MET抗体与靶标的结合能力以及促c-MET磷酸化活性筛选激动型c-MET抗体。

实施例1.c-MET抗原的克隆和表达

c-MET胞外区作为配体识别部位识别并结合肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)，对后续发生的一系列生物调节效应具有重要作用，因此抗原选用c-MET胞外区。根据GenBank中人c-MET的基因序列(序列号:NM_001127500.1)设计PCR引物，上游引物P1(5’-3’)：TATACCGGTCGCCACCATGAAGGC CCCCGCTGTGCTTGCACCTG(SEQ ID NO:1)，下游引物P2(5’-3’)：CGCGTCGACCTAGTGATGGTGATGATGGTGTG TGAAATTCTG ATCTGGTTG ACATA(SEQ ID NO：2)，扩增得到约2800bp的c-MET胞外区片段。得到的DNA片段用AgeⅠ和SalⅠ这两个酶切位点***到慢病毒表达载体pRRL-CMV中，进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1a所示。图1a中泳道1为DNAmarker，泳道2为慢病毒穿梭载体pRRL-CMV-ED使用AgeⅠ和SalⅠ双酶切样品，酶切结果显示:获得7500bp的载体条带和2700bp的目的基因条带，证明人MET胞外区ED片段的慢病毒表达质粒pRRL-CMV-ED构建成功。表达质粒与包装质粒共转染HEK293T细胞，将细胞表达上清经镍柱纯化，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图1b所示。图1b中泳道1:表达上清原液(1:5稀释)；泳道2:柱穿过液(1:5稀释)；泳道3:20mM咪唑洗脱组分；泳道4-5:50mM咪唑洗脱组分；泳道6-9:200mM咪唑洗脱组分；M:蛋白分子量标准品。其中泳道5-9中105KDa的条带大小与目的条带预期大小一致，证明MET胞外区ED融合蛋白成功表达和纯化获得。

纯化后c-MET胞外区蛋白用于免疫或筛选。

克隆所表达的DNA序列为编码人c-MET细胞外区域DNA的序列，用SEQ ID NO:3表示；其氨基酸序列用SEQ ID NO:4表示。

实施例2.c-MET单克隆抗体的制备

将重组表达的c-MET胞外区用PBS(Hyclone，CatNo.:SH30256.01B)稀释至1mg/ml,与弗氏佐剂(首次免疫用完全弗氏佐剂,加强免疫用不完全弗氏佐剂)乳化后,皮下注射接种Balb/C小鼠(每组5只),每只小鼠接种100μg抗原,间隔两周加强免疫。从第一次加强免疫开始，每次加强免疫后的7至10天内采集小鼠血清用ELISA测定效价。

选择免疫后血清效价高于1:10000的小鼠进行细胞融合。分别无菌制备小鼠B细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14，中国科学院细胞库)并计数,将两种细胞按照SP2/0:B细胞＝1:5的比例进行混合后离心(1000r/min，10min),弃上请加入1ml50％聚乙二醇(Roche，REF:10783641001),之后用20ml无血清RPMI1640(hyclone，Cat No.:SH30809.01)终止,离心10min,弃上清,用含血清(BI，REF:04-001-1ACS)和HAT(Gibco，REF:21060-017)的RPMI1640重悬沉淀,按照每孔10⁵个B细胞的标准铺板,每孔200μ1,之后每孔加入10⁵个小鼠腹腔巨噬细胞，置37℃细胞培养箱中培养，7天后更换含HT(Gibco，REF:11067-030),血清(BI，REF:04-001-1ACS)的RPMI1640，每孔200μ1，7至10天后ELISA检测阳性克隆，结果如图2所示，其中横坐标为c-MET抗体杂交瘤上清的上样体积，单位μl，纵坐标为波长450nm下的吸光值。结果显示有相当数量的杂交瘤克隆上清可以与c-MET蛋白特异性结合，随着加入上清体积的增加，ELISA结合信号也随之增强，表现出较好的量效关系。

实施例3.c-MET单克隆抗体对靶标的结合实验(ELISA)

为检测本发明c-MET抗体对靶点c-MET的识别和结合能力，采用酶联免疫吸附的方法检验抗体(包括杂交瘤上清或重组表达的单克隆抗体等)在体外对抗原的亲和力。

实验步骤:用包被液(CBS)(0.05MCarbonate-Bicarbonate,pH9.6)稀释抗原(c-MET胞外区，实施例1)至2μg/ml，加入100μl/孔于96孔酶标板(Costar 9018，CatNo.:03113024),4℃孵育过夜。次日将包被有抗原的96孔酶标板恢复至室温,洗涤液PBS+0.05％Tween20(Sigma，Cat No.:P1379)洗涤两次。随后加入200μ1/孔封闭液(PBS+1％BSA(sigma，Cat No.:V900933)，37℃孵育2小时。洗涤液洗涤三次。加入待测c-MET抗体于96孔酶标板,室温孵育2小时。洗涤液洗涤三次。加入封闭液5000倍稀释二抗(Goatanti-MouseIgG(H+L)(HRP)(杭州华安,货号:HA1006)100μ1/孔至96孔酶标板,室温孵育1小时。洗涤液洗涤三次。加入100μ1/孔显色液TMB(碧云天，货号:P0209)至96孔酶标板。加入50μl/孔终止液(2MH2SO4)至96孔酶标板。使用酶标仪(Bio-Rad，iMark)450nm读板。

结果如图3所示，其中横坐标为c-MET抗体的浓度，单位ng/ml，纵坐标为波长450nm下的吸光值。结果显示:c-MET抗体可以与MET胞外区ED融合蛋白特异性结合，随着加入浓度的增加，信号增强，在该体系条件下，c-MET单克隆抗体的最低检测浓度为0.06ng/ml，证明c-MET抗体1H9D6与MET胞外区ED融合蛋白结合能力强。

实施例4.c-MET单克隆抗体序列克隆

将实施例3中得到的活性好的单细胞株c-MET抗体1H9D6进行cDNA序列克隆，然后重组表达出单克隆抗体并进行各项活性检测。本发明用逆转录PCR扩增抗体基因的重链和轻链可变区，连接到载体测序得到单克隆抗体轻重链序列。首先TRIzol法从分泌c-MET的杂交瘤细胞株c-MET抗体中提取细胞总RNA，并逆转录为cDNA。随后以合成的cDNA为模板，利用全套鼠源抗体重链、轻链基因调取兼并引物扩增鼠单抗c-MET抗体的重、轻链可变区VH和VL基因。重链上游引物VH-F：SAR GTR MAG CTG MAG SAG TC(SEQ ID NO:5)，下游引物：MouseIgG1 R:AATTTTCTTGTCCACCTTGGTGCTGCT(SEQ ID NO:6)，轻链上游引物Mouse Vκ-F:GAYATT GTD MTS ACM CAR WCT(SEQ ID NO:7)，下游引物Mouse Cκ-R:GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCC(SEQ ID NO:8)电泳结果见图4，其中泳道1为DNA marker，泳道2为VH基因的PCR产物，泳道3为VL基因的PCR产物，电泳结果显示:鼠源VH和VL基因的PCR产物分别可见约351和336bp的特异性条带，证明鼠源VH和VL基因成功调取。

最后扩增得到的PCR产物克隆到PCR-Blunt载体，测序。通过IMGT数据库比对，本发明中鼠源的CDR序列如表1所述:

表1:鼠源的CDR序列

实施例5.c-MET人源化嵌合抗体的构建

将c-MET抗体重链、轻链可变区通过重叠延伸PCR分别与人IgG1重链恒定区基因Cγ1和人轻链恒定区基因Cκ相连，构建c-MET抗体嵌合抗体。1.5％琼脂糖凝胶结果显示，鼠源VH和VL基因的PCR产物分别可见约351和336bp的特异性条带，人源Cγ1和Cκ基因的PCR产物可见约1000和350bp的特异性条带，大小均与理论值相符。将SOE-PCR产物用AgeⅠ和SalⅠ双酶切连入慢病毒表达载体pRRL-CMV中，电泳结果见图5。其中泳道1为DNAmarker，泳道2为慢病毒穿梭载体pRRL-CMV-重链使用AgeⅠ和SalⅠ双酶切样品，泳道3为慢病毒穿梭载体pRRL-CMV-轻链使用AgeⅠ和SalⅠ双酶切样品，酶切结果显示:获得7500bp的载体条带和1400bp(重链)及700bp(轻链)的目的基因条带，证明c-MET人源化嵌合抗体的轻、重链慢病毒表达质粒构建成功。

实施例6.c-MET人源化嵌合抗体靶向性检测

为检测本发明人源化嵌合抗体是否对靶点c-MET具有靶向性和特异性，采用c-MET天然配体HGF进行竞争性结合实验。

实验步骤:用包被液(CBS)(0.05MCarbonate-Bicarbonate,pH 9.6)稀释抗原(c-MET胞外区，实施例1)至2μg/ml，加入100μl/孔于96孔酶标板(Costar 9018，CatNo.:03113024),4℃孵育过夜。次日将包被有抗原的96孔酶标板恢复至室温,洗涤液(PBS+0.05％Tween20(Sigma，Cat No.:P1379)洗涤两次。随后加入200μ1/孔封闭液(PBS+1％BSA(sigma，Cat No.:V900933)，37℃孵育2小时。洗涤液洗涤三次。加入待测c-MET人源化嵌合抗体于96孔酶标板,室温孵育1.5小时。洗涤液洗涤三次。加入封闭液稀释的终浓度为15ng/ml的HGF(RD，294-HG)，100μl/孔，37℃孵育2小时。洗涤液洗涤三次。加入封闭液2000倍稀释HGF抗体(RD，AF276)100μ1/孔至96孔酶标板,室温孵育1小时。洗涤液洗涤三次。加入封闭液2000倍稀释链霉亲和素-HRP酶标二抗(CST，#3999)100μ1/孔至96孔酶标板,室温孵育0.5小时。洗涤液洗涤三次。加入100μ1/孔显色液TMB(碧云天，货号:P0209)至96孔酶标板。加入50μl/孔终止液(2M H2SO4)至96孔酶标板。使用酶标仪(Bio-Rad，iMark)450nm读板。

HGF对c-MET人源化嵌合抗体的竞争性结合如图6所示，其中横坐标为c-MET人源化嵌合抗体的浓度，单位ng/ml，纵坐标为波长450nm下的吸光值。结果显示:c-MET人源化嵌合抗体可以阻断HGF/MET特异性结合，随着加入浓度的增加，阻断效应增强，在该体系条件下，c-MET人源化嵌合抗体对HGF/c-MET特异性结合的最大阻断率为79.7％。可见HGF能够有效抑制c-MET嵌合抗体对抗原的结合，说明嵌合c-MET抗体对靶点c-MET具有靶向性。

实施例7.c-MET人源化嵌合抗体对靶标二聚化和磷酸化活性验证

为检测本发明c-MET抗体尤其是人源化嵌合抗体对靶点c-MET的激活能力，采用western blot的方法检验抗体对靶点酪氨酸激酶区二聚化后自身磷酸化的作用。

实验步骤:用不含FBS的培养基孵育Bend.3细胞24h，然后加入20μg/ml的c-MET人源化嵌合抗体，37℃下分别孵育1min，5min，10min，30min，60min和120min，用SDS裂解液破碎细胞，采用Western Blot检测裂解液中的Tyr1234磷酸化MET。

结果如图7所示，c-MET人源化嵌合抗体能够激活c-MET的磷酸化，在作用5min时磷酸化激活效应开始出现，30min时效应达到最大，效应持续到120min没有出现衰减，说明c-MET人源化嵌合抗体为激活型抗体。

第二部分：筛选具有促血管内皮***重建和修复活性c-MET抗体

血管内皮细胞的损伤是众多疾病病理过程中的重要环节，筛选能够增强其生物学活性的物质可以获得在血管损伤条件下促进新血管形成以及保护损伤血管潜力的药物先导物。研究发现，c-MET在血管内皮细胞中具有较高的表达水平，在血管内皮细胞损伤引起的疾病中被证明是有效的靶点。因此本发明利用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为模型对c-MET抗体进行筛选，评估其潜在治疗能力。

实施例8.c-MET人源化嵌合抗体靶细胞结合活性检测

为检测本发明抗体对靶细胞是否具有结合活性，采用细胞ELISA检测其与c-MET高表达细胞HUVEC的表面结合能力。

实验步骤:取对数生长期的HUVEC细胞，消化计数，细胞按照20000细胞/孔的密度铺板预先包被多聚鸟氨酸(PRON)的96孔细胞培养板，次日PBS洗涤1次，4％多聚甲醛固定，室温30min，PBS洗涤后，室温封闭60min(封闭液:1％FBS/PBS(v/v))，之后加入8个浓度(20μg/ml起5倍浓度梯度稀释)的c-MET人源化嵌合抗体至对应的孔中,最终体积为100μl,室温孵育1小时。PBS洗涤,重复三次。每孔加入100μ1稀释5000倍的二抗(Goat anti-Mouse IgG(H+L)(HRP)(杭州华安,货号:HA1006),在室温孵育1小时，PBS洗涤三次。加入100μ1/孔显色液TMB(KPLCatalog No.53-00-01)至96孔酶标板。加入50μl/孔终止液(2M H2SO4)至96孔酶标板。使用酶标仪(Bio-Rad，iMark)450nm读板。

c-MET人源化嵌合抗体与HUVEC表面c-MET抗原结合如图8所示，其中横坐标为c-MET抗体的上样浓度，单位ng/ml，纵坐标为波长450nm下的吸光值。结果显示:c-MET单克隆抗体可以与HUVEC细胞表面的c-MET蛋白特异性结合，随着加入浓度的增加，信号增强。可见人源化抗体能够与HUVEC显著结合。上述结果说明，c-MET抗体具有与活细胞表面抗原靶标的结合能力。

实施例9.c-MET单克隆抗体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的作用

为检测本发明c-MET单克隆抗体的功能，用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为模型对c-MET单克隆抗体的促内皮细胞增殖作用进行评估。

实验原理:c-MET抗体与c-MET结合能促进c-MET分子的二聚化及酪氨酸磷酸化，并进一步激活c-MET下游信号通路，从而促进血管内皮细胞的增殖。

实验步骤:人脐静脉内皮细胞(HUVEC)1×10⁵个细胞/mL，50μ1/孔加至96孔细胞培养板(costar，#3799),培养基为HUVEC基础培养液(Allcells，Cat No.:H004B)+1％胎牛血清(FBS)(BI，REF:04-001-1ACS)。细胞培养24h后加入50μ1/孔c-MET待测抗体，37℃培养箱(Thermo，3111)中培养3天。使用细胞增殖检测试剂盒(CCK8)(DOJINDO，CK04),按试剂盒说明书方法检测细胞增殖情况。使用酶标仪(Bio-Rad，iMark)450nm读板，进行细胞计数。

细胞计数结果如图9所示，其中:横坐标为c-MET单克隆抗体的浓度，单位ng/ml，纵坐标为波长450nm下的吸光值。结果显示:c-MET单克隆抗体可以促进HUVEC细胞的增殖效应，随着加入浓度的增加，效应更显著。可见HUVEC在c-MET抗体作用下增殖更为显著。上述结果说明，c-MET单克隆抗体能够引起血管内皮细胞增殖，具有保护血管的潜在能力。

实施例10.c-MET单克隆抗体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移的作用

为检测本发明c-MET抗体促进血管形成的功能，用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为模型对c-MET抗体的促内皮细胞迁移作用进行评估。

实验原理:c-MET抗体与c-MET结合能促进c-MET分子的二聚化及酪氨酸磷酸化，并进一步激活c-MET下游信号通路，从而促进血管内皮细胞的迁移。

实验步骤:人脐静脉内皮细胞(HUVEC)2×10⁵个细胞/mL，500μl/孔加至transwell小室(BD，353097)上室，下室加入含不同浓度待测抗体的培养基750μl，培养基为HUVEC基础培养液(Allcells，Cat No.:H004B)+1％胎牛血清(FBS)(BI，REF:04-001-1ACS)。细胞培养16h后进行结晶紫染色，并在镜下对下室细胞进行计数。

细胞计数结果如图10所示，其中横坐标为c-MET单克隆抗体的浓度，单位ng/ml，纵坐标为transwell小室下表面的细胞数量。结果显示:c-MET单克隆抗体可以促进HUVEC细胞的迁移效应，随着加入浓度的增加，效应更显著。可见HUVEC在c-MET抗体作用下迁移更为显著。上述结果说明，c-MET单克隆抗体能够引起血管内皮细胞迁移形成血管内皮组织，具有保护血管的潜在能力。

实施例11.c-MET单克隆抗体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形成微管的作用

为检测本发明c-MET抗体促进血管形成的功能，用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为模型对c-MET抗体的促内皮细胞形成微管的作用进行评估。

实验原理:c-MET抗体与c-MET结合能促进c-MET分子的二聚化及酪氨酸磷酸化，并进一步激活c-MET下游信号通路，从而促进血管内皮细胞分化及形成微管。该过程是损伤血管重建和修复的重要环节。

实验步骤:人脐静脉内皮细胞(HUVEC)2×10⁵个细胞/mL，100μl/孔加至预包被poly-D-lysine(sigma，P7280)的96孔细胞培养板(costar，#3799)，培养基为HUVEC完全培养液(Allcells，Cat No.:H004)。细胞培养24h后加入50μl/孔matrigel(BD，354234)，37℃孵育30min后，加入200μl/孔c-MET待测抗体，培养基为HUVEC基础培养液(Allcells，CatNo.:H004B)。37℃度培养箱(Thermo，3111)中培养3天，分别在24h，48h和72h观察微管生成情况，根据微管数量评价待测抗体对HUVEC细胞的微管形成活性。

微管形成的结果如图11所示，其中:图11-A为铺胶0小时后的对照组细胞照片，11-B为铺胶0小时后的c-MET单克隆抗体加药组细胞成像，其中c-MET单克隆抗体的浓度为1μg/ml；图11-C为铺胶72小时后的对照组细胞照片，图11-D为铺胶72小时后的c-MET单克隆抗体加药组细胞照片，其中c-MET单克隆抗体的浓度为1μg/ml。A和B比较显示:初始细胞状态一致，C和D比较显示:在c-MET单克隆抗体(1μg/ml)作用72小时后，HUVEC细胞的微管形成数量显著增加，证明c-MET单克隆抗体可以促进HUVEC细胞的微管生成。

可见HUVEC在c-MET抗体作用下形成微管的数量更为显著。上述结果说明，c-MET单克隆抗体能够引起血管内皮细胞分化形成微管，具有在血管损伤条件下保护或形成新血管的潜在能力。

第三部分：c－MET抗体对内皮细胞损伤及凋亡的保护作用

血脑内皮细胞氧化是损伤的主要病理因素，其中脑微血管内皮细胞的缺血再灌会引起表面紧密连接蛋白表达变化，直接导致血脑屏障通透性增加，加剧脑缺血的危害性。本发明研究了c-MET激动剂对血管内皮细胞损伤的保护作用，采用缺血-再灌注(I-R)引起的脑血管内皮细胞凋亡及损伤作为模型评估了c－MET抗体对损伤内皮细胞的保护作用。

实施例12.血管内皮细胞氧糖剥夺模型(I-R)的建立

血管内皮细胞(Bend.3)培养基为DMEM基础培养液(hyclone，SH30243.01)+10％胎牛血清(FBS)(BI，REF:04-001-1ACS)。细胞培养24h后更换DMEM基础培养液，加入不同浓度的c-MET人源化嵌合抗体，37℃培养箱(Thermo，3111)中培养16h。之后在厌氧罐(三菱化学，C31)内利用厌氧袋(三菱化学，C1)制造低氧环境，进行无氧无糖损伤6h，培养基为DMEM无糖培养液(Gibco，11966-025)，加入不同浓度的c-MET人源化嵌合抗体。之后更换DMEM基础培养液，加入不同浓度的c-MET人源化抗体，37度培养箱(Thermo，3111)中培养1.5h。

实施例13.c-MET人源化嵌合抗体对内皮细胞损伤后细胞活性的保护作用检测。

如实施例12所述建立Bend.3糖氧剥夺模型。8×10⁴个细胞/mL，100μ1/孔加至细胞培养板(costar，#3799),使用96孔板进行分组处理后，使用细胞增殖检测试剂盒(CCK8)(DOJINDO，CK04),按试剂盒说明书方法检测细胞活力。使用酶标仪(Bio-Rad，iMark)450nm读板。

c-MET人源化嵌合抗体对氧糖剥夺血管内皮细胞(Bend.3)保护作用细胞计数结果如图12所示，其中横坐标为样品信息，其中对照组为未进行氧糖剥夺处理的样品，损伤组为进行氧糖剥夺处理的样品；保护组数值为c-MET人源化嵌合抗体的浓度，单位ng/ml，纵坐标为波长450nm下的吸光值。结果显示:c-MET人源化嵌合抗体对氧糖剥夺后的血管内皮细胞(Bend.3)有保护效应，随着加入浓度的增加，效应更显著。可见c-MET人源化嵌合抗体对糖氧剥夺血管内皮细胞具有保护作用。

实施例14.c-MET人源化嵌合抗体对内皮细胞凋亡的保护作用检测。

如实施例12所述建立Bend.3糖氧剥夺模型。血管内皮细胞(Bend.3)1x10⁵个细胞/mL，2ml加至含盖玻片的35mm细胞培养皿内，进行细胞爬片，进行分组处理后，对玻片上的血管内皮细胞(Bend.3)进行TUNEL细胞凋亡试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，A112-01)检测，根据凋亡细胞数量评价待测抗体对氧糖剥夺处理后血管内皮细胞(Bend.3)凋亡的作用。

对照组：未进行氧糖剥夺处理的细胞样品；

损伤组：进行氧糖剥夺处理的细胞样品；

保护组：数值为抗c-MET人源化抗体的浓度，单位ng/ml。

细胞凋亡照片结果如图13-a所示，凋亡细胞数量统计结果如图13-b所示，结果显示：血管内皮细胞(Bend.3)经氧糖剥夺处理后，凋亡细胞数量显著增加，随着抗c-MET人源化抗体的加入，凋亡细胞数量减少，证明抗c-MET人源化抗体对氧糖剥夺后血管内皮细胞(Bend.3)凋亡有保护效应，随着抗c-MET人源化抗体加入浓度的增加，保护效应更显著。

实施例15.c-MET人源化嵌合抗体对内皮细胞死亡指标LDH的影响。

血管内皮细胞(Bend.3)8×10⁴个细胞/mL，0.1ml/孔加至96孔细胞培养板内，如实施例12所述建立Bend.3糖氧剥夺模型。对血管内皮细胞(Bend.3)上清进行LDH检测试剂盒(南京建成，A020-2)检测。

对照组：未进行氧糖剥夺处理的细胞样品；

损伤组：进行氧糖剥夺处理的细胞样品；

保护组：数值为抗c-MET人源化抗体的浓度，单位ng/ml。

细胞上清LDH浓度结果如图14所示，结果显示：血管内皮细胞(Bend.3)经氧糖剥夺处理后，LDH浓度显著增加，随着c-MET人源嵌合化抗体的加入，LDH浓度减少，证明抗c-MET人源化抗体对氧糖剥夺血管内皮细胞(Bend.3)LDH浓度有降低效应，随着c-MET人源化嵌合抗体加入浓度的增加，降低效应更显著。表面c-MET抗体能够显著减少I/R环境下内皮细胞的死亡率。

第四部分：c-MET抗体对各类缺血性疾病的效果

为进一步验证c-MET抗体在病理条件下对内皮细胞的保护作用以及相关病理进程的作用，本发明采用细胞和整体两个水平的病理模型，研究脑缺血(脑梗塞)、心肌缺血(心肌梗塞)中c-MET抗体的药学效果、并阐述c-MET抗体对内皮细胞损伤引起的血脑屏障通透性变化及其继发性的神经元凋亡等病理过程的影响。

实施例16.缺血性损伤的体外模型的建立

1)冷光源光化学诱导局灶性脑梗死大鼠模型：

该模型的基本原理是当光敏物质玫瑰红通过静脉注射并利用循环***达到微血管后，在特定强度光源的照射下发生光化学反应,在大脑的照射局部产生脑水肿和血小板微血栓形成局灶性脑梗死。该模型早期即可出现血脑屏障开放、严重的血管源性脑水肿及微血管血栓形成,因此可用于脑梗死后微血管损伤及血脑屏障改变后的病理生理研究,能够较好的模拟缺血半暗带的病理特点。

实验步骤:用10％水合氯醛将实验动物按3mL/kg体质量腹腔麻醉，麻醉成功后，尾静脉缓慢注射5％玫瑰红B 1.5mL/kg。将实验动物固定于大鼠立体定位仪上，剪去头部毛发，常规碘酒酒精消毒，取双眼连线中点后5mm至双耳连线中点前5mm正中切口，剪开皮肤、皮下，小心剥除右侧骨膜，电凝止血。暴露部分右侧颅骨，暴露前囟，即矢状缝与冠状缝交点。磨除前囟门后2.0mm、右2.0mm处直径约5mm范围颅骨骨质，保留完整硬膜。激光仪距脑组织约1cm，覆盖带孔直径约4mm的避光纸，光强度为10～12KLUX，照射时间为5min。术毕缝合头部皮肤。照射过程中用体温仪维持体温，大鼠生命体征平稳。

假手术组:进行手术不照射。

治疗组:照射20min后尾静脉注射c-MET抗体1mg/kg。

损伤组:尾静脉注射等量生理盐水。

2)小鼠脑缺血MCAO模型

右侧大脑中动脉闭塞(middle cerebralartery occlusion，MCAO)模型。小鼠称重，用体积分数为10％水合氯醛溶液(质量分数为300mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定。行颈正中切口，游离右颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。将3-0尼龙线由颈外动脉切口处***，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，阻塞大脑中动脉，导致局灶性脑缺血。1.5h后，拔出尼龙线再灌注24h。

假手术组:进行手术不***尼龙线。

治疗组:***尼龙线后尾静脉注射c-MET抗体1mg/kg。

损伤组:尾静脉注射等量生理盐水。

3)小鼠心肌梗塞模型

小鼠称重，按照50mg/kg腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定。鹅颈灯下插气管插管，在第二第三根肋骨间横向剪开皮肤，挑起斜向的胸大肌，拉断内侧纵向的胸小肌，暴露胸腔。切开第二第三肋骨间的肌肉，挑起，放入肋骨撑开器，避免碰到肺，暴露心脏。用尖镊子撕掉心脏包膜，左手固定心脏，暴露心耳，右手持持针器，用8-0的尼龙线在心耳下缘3-5mm LAD处进行结扎，观察左心室结扎处下面的颜色变化以及跳动情况。用5-0的缝合线缝合肋骨，肌肉和皮肤，观察小鼠状态，直到能恢复自主呼吸为止，拔出呼吸导管。

假手术组：进行手术，不进行结扎。

治疗组：尾静脉注射c-MET单克隆抗体1mg/kg和3mg/kg，共2组，每3天注射1次，持续30天，共给药10次。

损伤组：尾静脉注射等量生理盐水作为对照。

实施例17.c-MET抗体在缺血环境中对内皮细胞保护作用

1)c-MET单克隆抗体对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型的脑血管内皮细胞体内保护作用

为检测本发明c-MET抗体在体内结合c-MET以后是否对血管内皮细胞产生实质性的保护作用，下述各组老鼠局灶性缺血部位进行免疫组化检测，评估其血管损伤及修复情况。

如实施例16述方式建立大鼠局灶性脑缺血光化学模型，进行分组、造模、给药，麻醉动物后，先用37℃的PBS通过心脏灌流，然后用4℃的4％PFA(多聚甲醛)灌流固定，最后取出脑组织；组织快用OCT(冰冻切片包埋剂)包埋，然后冰冻切片，切片厚度一般为12-16μm；冰冻切片用5％的普通羊血清室温封闭1小时，随即加入用5％普通羊血清稀释好的一抗，4℃过夜，第二天PBS洗3次后，就如对应的荧光二抗在暗处孵育1小时，PBS洗3次后，用封片剂固定后都荧光显微镜下观察。

脑微血管内皮细胞染色结果如图15所示，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg；VWF是血管内皮细胞标志物，DAPI是细胞核染色标志物，合并指VWF和DAPI染色的同一视野照片经过合并图像后生成的图片。

结果显示:c-MET单克隆抗体可以显著减少光化学损伤后的脑血管内皮细胞损伤，血管完整性好，对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型引起的脑梗有保护作用。

可见c-MET单克隆抗体组微血管损伤程度低于对照组。上述结果说明c-MET单克隆抗体能够有效保护脑血管内皮***。

2)c-MET人源化嵌合抗体对脑缺血线栓小鼠模型(MCAO)的脑血管内皮细胞体内保护作用

如实施例16述方式建立血线栓小鼠模型(MCAO)，进行分组、造模、给药，麻醉动物后，先用37℃的PBS通过心脏灌流，然后用4℃的4％PFA(多聚甲醛)灌流固定，最后取出脑组织；组织快用OCT(冰冻切片包埋剂)包埋，然后冰冻切片，切片厚度一般为12-16μm；冰冻切片用5％的普通羊血清室温封闭1小时，随即加入用5％普通羊血清稀释好的一抗，4℃过夜，第二天PBS洗3次后，就如对应的荧光二抗在暗处孵育1小时，PBS洗3次后，用封片剂固定后都荧光显微镜下观察。

脑微血管内皮细胞染色结果如图16-a所示，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET人源化嵌合抗体，剂量为1mg/kg；VWF(内皮细胞标记物)抗体和抗ZO-1(紧密连接蛋白)抗体,合并指VWF和ZO-1染色的同一视野照片经过合并图像后生成的图片。ZO-1在损伤部位的表达western blot结果如图16-b所示。

结果显示:c-MET人源化嵌合抗体可以显著减少光MCAO的脑血管内皮细胞损伤，血管完整性好，对MCAO模型引起的内皮***损伤有保护作用。

可见c-MET人源化嵌合抗体组微血管损伤程度低于对照组。上述结果说明c-MET人源化嵌合抗体能够有效保护脑血管内皮***。

3)c-MET人源化嵌合抗体对小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)的血管内皮细胞保护作用

如实施例16所述，建立小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)，并进行分组。快速取出心脏，置于4％多聚甲醛中固定后石蜡包埋，取LAD结扎处下沿3mm位置切片，切片厚度为3mm，进行VWF染色，首先使用VWF抗体对切片进行孵育，抗体稀释度为1:50，室温孵育120分钟，PBS冲洗3次，加入HRP标记抗兔二抗，抗体稀释度为1:500，室温孵育30分钟，PBS冲洗3次，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液，显微镜下观察5分钟，0.1％HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后显微镜观察。

评价指标：VWF是血管内皮细胞标志物，可以通过对VWF进行免疫组化来观察血管内皮细胞的分布和状态，反映血管的完整性，评价c-MET人源化嵌合抗体对小鼠MI心梗模型心脏微血管的影响。

结果：心脏切片VWF染色结果如图17所示，其中损伤组注射等量生理盐水，治疗组注射c-MET人源化嵌合抗体3mg/kg。对照组为假手术组。结果显示：对照组VWF染色清楚，血管结构清晰完整，损伤组VWF染色清楚，血管部位结构破损严重，说明MI心梗后导致的血管损伤严重；治疗组VWF染色清楚，血管结构仍然保持较完整；证明抗c-MET人源化抗体对小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)引起的心脏微血管损伤有保护作用。

实施例18.c-MET抗体对缺血引起的血脑屏障渗透的保护作用研究

血脑屏障的渗透性增加是脑血管内皮细胞损伤后重要的病理环节，可导致脑组织继发性损伤。因此本发明利用各类模型对c-MET抗体保护血脑屏障的功能进行了验证。

1)对糖氧剥夺后单层Bend.3血脑屏障模型的作用

血管内皮细胞(Bend.3)4x10⁴个细胞/mL，500μ1/孔加至transwell小室(BD，353097)上室，下室加入培养基750μ1，培养基为DMEM基础培养液(hyclone，SH30243.01)+10％胎牛血清(FBS)(BI，REF:04-001-1ACS)。细胞培养72h后更换DMEM基础培养液，加入不同浓度的c-Met人源化抗体，37度培养箱(Thermo，3111)中培养16h。之后在厌氧罐(三菱化学，C31)内利用厌氧袋(三菱化学，C1)制造低氧环境，进行无氧无糖损伤6h，培养基为DMEM无糖培养液(Gibco，11966-025)，治疗组可加入不同浓度的c-MET人源化嵌合抗体。之后更换DMEM完全培养液，为DMEM基础培养液(hyclone，SH30243.01)+10％胎牛血清(FBS)(BI，REF:04-001-1ACS)。加入不同浓度的c-MET人源化嵌合抗体，在上室加入1x10⁶个小鼠外周血淋巴细胞/孔，37度培养箱(Thermo，3111)中培养24h。对小室下室底部的进行小鼠外周血淋巴细胞进行结晶紫染色，根据细胞数量评价待测抗体对血管内皮细胞(Bend.3)血脑屏障体外模型的作用。

对照组:未进行氧糖剥夺处理的细胞样品；

损伤组:进行进行氧糖剥夺处理的细胞样品；

治疗组：不同浓度的c-MET人源化嵌合抗体在氧糖剥夺条件下处理的细胞样品。

计数结果如图18所示，结果显示：血管内皮细胞(Bend.3)经氧糖剥夺处理后，细胞层完整性受损，透过细胞层的小鼠外周血淋巴细胞数量显著增加，c-MET人源化嵌合抗体对氧糖剥夺后的血脑屏障体外模型有保护效应，透过的小鼠外周血淋巴细胞数量减少，随着加入浓度的增加，效应更显著。

2)c-MET单克隆抗体对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型的血脑屏障通透性保护作用

为检测本发明c-MET抗体在体内结合c-MET以后是否对血脑屏障产生实质性的保护作用，如实施例16所述建立冷光源光化学诱导局灶性脑梗死大鼠模型，分组并对各组老鼠血脑屏障通透性进行检测，评估其对维持血脑屏障的作用。

如实施例16所述建立冷光源光化学诱导局灶性脑梗死大鼠模型，分组、给药，伊文思蓝渗出观察血脑屏障破坏情况于相应时间点处死试验动物前1h尾静脉注入2％伊文思蓝生理盐水溶液(4mL/kg体质量)。开胸灌注，待右心耳流出液体基本清亮时，断头取脑，取梗死侧大脑半球，称量后放入3mL甲酰胺溶液中，于50℃恒温水浴箱中孵育72h，离心20min(4000r/min)，取上清液用酶标仪(波长632nm)测吸光度值，根据EB绘制的标准曲线计算出EB含量，结果以μg/g脑组织表示。

EB渗入脑组织情况如图19所示，其中图19-a为动物脑组织照片，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg；图19-b为统计后的伊文斯蓝含量结果。横坐标为分组情况，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg，纵坐标为伊文斯蓝含量，单位为μg/g脑组织；

结果显示:c-MET单克隆抗体可以显著减少光化学损伤后动物脑组织中的伊文斯蓝含量，对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型引起的血脑屏障通透性增加有修复作用。

可见c-MET单克隆抗体组EB渗入情况明显低于对照组。上述结果说明c-MET单克隆抗体能够保护血脑屏障。

3)c-MET抗体对内皮细胞损伤后紧密连接蛋白表达的影响

体外检测

如实施例12所述建立体外氧糖剥夺模型，之后弃掉细胞上清，细胞提取总RNA，使用不同紧密连接蛋白的引物对目的基因进行荧光定量PCR分析，获得各组样品中目的基因的mRNA转录水平。

对照组：未进行氧糖剥夺处理的细胞样品。

损伤组：进行进行氧糖剥夺处理，未加入c-MET人源化嵌合抗体的细胞样品。

治疗组：进行进行氧糖剥夺处理，加入c-MET人源化嵌合抗体(浓度为10000ng/ml)的细胞样品。

荧光定量PCR结果如图20-a和20-b所示，其中横坐标为样品信息，纵坐标为各基因的mRNA相对转录水平结果，以对照组目的基因的mRNA转录水平为1.0。其中图20-a为紧密连接蛋白ZO-1的结果，图20-b为紧密连接蛋白claudin-5的结果。结果显示：氧糖剥夺后的血管内皮细胞(Bend.3)的claudin-5和ZO-1蛋白的mRNA转录水平显著降低，随着c-MET人源化嵌合抗体的加入，claudin-5和ZO-1蛋白的mRNA转录水平显著升高，超过对照组表达水平。可见c-MET人源化嵌合抗体对氧糖剥夺血管内皮细胞中紧密连接蛋白的mRNA转录水平有显著提高。

体内检测：

如实施例16所述建立小鼠脑缺血MCAO模型分组处理后将老鼠脑取出，间隔1mm切片，然后将脑切片进行间接免疫荧光双染，分别加入抗VWF(内皮细胞标记物)抗体和抗ZO-1(紧密连接蛋白)抗体，对脑梗死缺血区半暗带微血管进行染色，以评估c-MET人源化嵌合抗体对血脑屏障完整性的影响，以及紧密连接蛋白ZO-1的表达水平影响。染色结果如图16-a所示，可见c-MET人源化嵌合抗体组的脑梗死缺血区半暗带微血管完整性比损伤组好，ZO-1的表达丰度也比损伤组高，证明血脑屏障破坏较小。

将老鼠脑取出，脑梗死区域进行取材，液氮研磨，制备样品，进行ZO-1蛋白的WB分析。WB结果如图16-b所示，损伤组ZO-1蛋白的表达水平显著降低，而c-MET人源化嵌合抗体组ZO-1蛋白表达水平与假手术组基本一致，证明ZO-1蛋白在小鼠MCAO模型中有显著下降，c-MET人源化嵌合抗体能显著提高ZO-1蛋白的表达水平，使其表达水平接近假手术组。

实施例19.c-MET抗体对缺血模型组织梗死的影响

为检测本发明c-MET抗体在体内结合c-MET以后是否对梗死病灶部位产生实质性的保护作用，对实施例12所述各组老鼠局灶性缺血部位进行脑梗死体积评估。

1)c-MET人源化嵌合抗体对脑缺血线栓小鼠模型(MCAO)的脑梗保护作用

如实施例16所述，建立脑缺血线栓小鼠模型(MCAO)模型，并进行分组。处理完毕将老鼠脑取出，间隔2mm切片，然后将脑切片在2％2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC，在0.9％生理盐水中)染色以确定梗死区域的大小。

脑梗死体积如图21所示，其中图21-a为动物脑组织切面照片，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET人源化嵌合抗体，剂量为1mg/kg；图21-b为统计后的脑梗死体积结果。横坐标为分组情况，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET人源化嵌合抗体，剂量为1mg/kg，纵坐标为脑梗死体积，单位为mm³；结果显示:c-MET人源化嵌合抗体可以显著减少脑缺血线栓小鼠模型(MCAO)的动物脑梗死体积，对SD大鼠脑缺血线栓小鼠模型(MCAO)引起的脑梗有保护作用。

可见c-MET人源化嵌合抗体组脑梗死体积明显小于对照组。上述结果说明c-MET人源化嵌合抗体能够降低脑梗死组织损伤。

2)c-MET单克隆抗体对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型的脑组织保护作用

如实施例16所述方式建立光化学脑梗模型并分组处理，术后将老鼠脑取出，间隔2mm切片，然后将脑切片在2％的2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC，在0.9％生理盐水中)染色以确定梗死区域的大小。

脑梗死体积如图22所示，其中:图22-a为动物脑组织切面照片，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg；图22-b为统计后的脑梗死体积结果。横坐标为分组情况，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg，纵坐标为脑梗死体积，单位为mm3；结果显示:c-MET单克隆抗体可以显著减少光化学损伤后的动物脑梗死体积，对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型引起的脑梗有保护作用。

上述结果说明c-MET单克隆抗体能够降低脑梗死组织损伤。

3)c-MET人源化嵌合抗体对小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)心肌纤维化的保护作用

如实施例16所述方式建立小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)并分组处理后，快速取出心脏，置于4％多聚甲醛中固定后石蜡包埋，取LAD结扎处下沿3mm位置切片，切片厚度为3mm，进行Masson染色，首先使用Masson复合染色液染色5分钟，0.2％醋酸水溶液浸洗1次；之后使用5％磷钨酸处理5～10分钟，0.2％醋酸水溶液浸洗2次；之后使用亮绿染色液染色5分钟，0.2％醋酸水溶液浸洗2次；无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

评价指标：Masson染色法评价心脏梗死区纤维化水平，观察c-MET抗体对小鼠MI心梗模型的心肌纤维化病变的影响。

结果：心脏切片Masson染色结果如图23所示，其中图23-a为Masson染色结果，图23-b为梗死区的分布比例(胶原纤维/肌纤维)结果，其中损伤组注射等量生理盐水，治疗组共2组，分别注射c-MET人源化嵌合抗体1mg/kg和3mg/kg。对照组为假手术组。结果显示：对照组几乎无胶原纤维阳性染色，损伤组胶原纤维染色明显，说明MI心梗后导致的心肌纤维化严重；治疗组心肌组织纤维化程度显著减轻，随着c-MET人源化嵌合抗体浓度的增加，纤维化程度减弱的更显著，证明c-MET人源化嵌合抗体对小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)引起的心肌组织纤维化有抑制作用。

实施例20.c-MET抗体对缺血模型生理功能的影响

1)c-MET单克隆抗体对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型的神经元保护作用

为检测本发明c-MET抗体在体内结合c-MET以后是否对神经元产生实质性的保护作用，对实施例8所述各组老鼠梗死区周围神经元进行免疫组化检测，评估其对神经元的保护作用。

如实施例16所述方式建立大鼠局灶性脑缺血光化学模型进行分组、给药，麻醉动物后，先用37℃的PBS通过心脏灌流，然后用4℃的4％PFA(多聚甲醛)灌流固定，最后取出脑组织；组织快用OCT(冰冻切片包埋剂)包埋，然后冰冻切片，切片厚度一般为12-16μm；冰冻切片用5％的普通羊血清室温封闭1小时，随即加入用5％普通羊血清稀释好的一抗，4℃过夜，第二天PBS洗3次后，就如对应的荧光二抗在暗处孵育1小时，PBS洗3次后，用封片剂固定后都荧光显微镜下观察。

神经元染色结果如图24所示，其中图24-a为脑梗死区域神经元免疫组化染色结果，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg；活化caspase-3是细胞凋亡标志物，NeuN是血神经元细胞标志物，合并指活化caspase-3和NeuN染色的同一视野照片经过合并图像后生成的图片。图24-b为统计后的单视野内凋亡神经元细胞数量结果。横坐标为分组情况，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg，纵坐标为凋亡神经元细胞数量；

结果显示:c-MET单克隆抗体可以显著减少光化学损伤后的脑梗死区域神经元细胞损伤，神经元细胞凋亡数量显著降低，对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型引起的脑梗有保护作用。可见c-MET单克隆抗体组神经元损伤程度低于对照组。上述结果说明c-MET单克隆抗体能够保护神经元。

2)c-MET单克隆抗体对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型的行为学症状的作用

为检测c-MET抗体对大鼠脑梗死后的神经保护作用，对实施例16所述各组老鼠神经功能及行为学评估。参照Longa等的5级4分法标准，于小鼠清醒后进行神经功能评分。

打分依据如下:

0分，无神经功能缺损症状；

1分，轻微神经功能缺损，不能完全伸展左侧前爪；

2分，中度局灶性神经功能缺损，行走时向左侧转圈；

3分，重度局灶性神经功能缺损，向左侧倾倒；

4分，不能自发行走，意识水平下降；

行为学评价结果如图25所示，其中:横坐标为分组情况，其中损伤组注射生理盐水，治疗组注射c-MET单克隆抗体，剂量为1mg/kg，纵坐标为神经功能评分，结果显示:c-MET单克隆抗体可以显著改善光化学损伤后的动物神经功能，对SD大鼠局灶性脑缺血光化学模型引起的脑梗死症状有保护作用。

可见c-MET单克隆抗体组行动能力明显优于对照组。上述结果说明c-MET单克隆抗体能够改善脑梗死临床症状。

3)c-MET人源化嵌合抗体对小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)的心脏功能保护作用

如实施例16所述，建立小鼠心力衰竭模型(MI心梗模型)，并进行分组。评价指标：心动超声评价心脏功能指标，观察c-MET人源化嵌合抗体对小鼠MI心梗模型的心脏功能的保护效应。

结果：心动超声评价结果如图26所示，其中图26-a为心脏射血分数(EF)结果，图26-b为左心室短轴缩短指数(FS)结果，图26-c为左心室舒张期容积(EDV)结果，图26-d为左心室收缩期容积(ESV)结果，其中损伤组注射等量生理盐水，治疗组共2组，分别注射c-MET人源化嵌合抗体1mg/kg和3mg/kg。结果显示：损伤组EF值均低于40％，心梗模型建立成功；经过1mg/kg/3d的c-MET人源化嵌合抗体尾静脉注射后，EF值具有恢复趋势；经过3mg/kg/3d的c-MET人源化嵌合抗体尾静脉注射后，EF值恢复更加明显；FS值、EDV值和ESV值均有类似趋势，表明c-MET人源化嵌合抗体对小鼠MI心梗模型中心脏功能具有保护效应。

本发明中的序列：

SEQ ID NO:1(上游引物P1)

TATACCGGTCGCCACCATGAAGGCCCCCGCTGTGCTTGCACCTG

SEQ ID NO：2(下游引物P2)

CGCGTCGACCTAGTGATGGTGATGATGGTGTGTGAAATTCTG

ATCTGGTTG ACATA

SEQ ID NO:3(人c-MET细胞外区域DNA序列)

atgaaggcccccgctgtgcttgcacctggcatcctcgtgctcctgtttaccttggtgcagaggagcaatggggagtgtaaagaggcactagcaaagtccgagatgaatgtgaatatgaagtatcagcttcccaacttcaccgcggaaacacccatccagaatgtcattctacatgagcatcacattttccttggtgccactaactacatttatgttttaaatgaggaagaccttcagaaggttgctgagtacaagactgggcctgtgctggaacacccagattgtttcccatgtcaggactgcagcagcaaagccaatttatcaggaggtgtttggaaagataacatcaacatggctctagttgtcgacacctactatgatgatcaactcattagctgtggcagcgtcaacagagggacctgccagcgacatgtctttccccacaatcatactgctgacatacagtcggaggttcactgcatattctccccacagatagaagagcccagccagtgtcctgactgtgtggtgagcgccctgggagccaaagtcctttcatctgtaaaggaccggttcatcaacttctttgtaggcaataccataaattcttcttatttcccagatcatccattgcattcgatatcagtgagaaggctaaaggaaacgaaagatggttttatgtttttgacggaccagtcctacattgatgttttacctgagttcagagattcttaccccattaagtatgtccatgcctttgaaagcaacaattttatttacttcttgacggtccaaagggaaactctagatgctcagacttttcacacaagaataatcaggttctgttccataaactctggattgcattcctacatggaaatgcctctggagtgtattctcacagaaaagagaaaaaagagatccacaaagaaggaagtgtttaatatacttcaggctgcgtatgtcagcaagcctggggcccagcttgctagacaaataggagccagcctgaatgatgacattcttttcggggtgttcgcacaaagcaagccagattctgccgaaccaatggatcgatctgccatgtgtgcattccctatcaaatatgtcaacgacttcttcaacaagatcgtcaacaaaaacaatgtgagatgtctccagcatttttacggacccaatcatgagcactgctttaataggacacttctgagaaattcatcaggctgtgaagcgcgccgtgatgaatatcgaacagagtttaccacagctttgcagcgcgttgacttattcatgggtcaattcagcgaagtcctcttaacatctatatccaccttcattaaaggagacctcaccatagctaatcttgggacatcagagggtcgcttcatgcaggttgtggtttctcgatcaggaccatcaacccctcatgtgaattttctcctggactcccatccagtgtctccagaagtgattgtggagcatacattaaaccaaaatggctacacactggttatcactgggaagaagatcacgaagatcccattgaatggcttgggctgcagacatttccagtcctgcagtcaatgcctctctgccccaccctttgttcagtgtggctggtgccacgacaaatgtgtgcgatcggaggaatgcctgagcgggacatggactcaacagatctgtctgcctgcaatctacaaggttttcccaaatagtgcaccccttgaaggagggacaaggctgaccatatgtggctgggactttggatttcggaggaataataaatttgatttaaagaaaactagagttctccttggaaatgagagctgcaccttgactttaagtgagagcacgatgaatacattgaaatgcacagttggtcctgccatgaataagcatttcaatatgtccataattatttcaaatggccacgggacaacacaatacagtacattctcctatgtggatcctgtaataacaagtatttcgccgaaatacggtcctatggctggtggcactttacttactttaactggaaattacctaaacagtgggaattctagacacatttcaattggtggaaaaacatgtactttaaaaagtgtgtcaaacagtattcttgaatgttataccccagcccaaaccatttcaactgagttt gctgttaaattgaaaattgacttagccaaccgagagacaagcatcttcagttaccgtgaagatcccattgtctatgaaattcatccaaccaaatcttttattagtggtgggagcacaataacaggtgttgggaaaaacctgaattcagttagtgtcccgagaatggtcataaatgtgcatgaagcaggaaggaactttacagtggcatgtcaacatcgctctaattcagagataatctgttgtaccactccttccctgcaacagctgaatctgcaactccccctgaaaaccaaagcctttttcatgttagatgggatcctttccaaatactttgatctcatttatgtacataatcctgtgtttaagccttttgaaaagccagtgatgatctcaatgggcaatgaaaatgtactggaaattaagggaaatgatattgaccctgaagcagttaaaggtgaagtgttaaaagttggaaataagagctgtgagaatatacacttacattctgaagccgttttatgcacggtccccaatgacctgctgaaattgaacagcgagctaaatatagagtggaagcaagcaatttcttcaaccgtccttggaaaagtaatagttcaaccagatcagaatttcaca

SEQ ID NO:4(人c-MET细胞外区域氨基酸序列)

MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNGECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFT

SEQ ID NO:5(重链上游引物)

SARGTRMAGCTGMAGSAGTC

其中：S为G或C；R为A或G；M为A或C。

SEQ ID NO:6(重链下游引物)

AATTTTCTTGTCCACCTTGGTGCTGCT

SEQ ID NO:7(轻链上游引物)

GAYATTGTDMTSACMCARWCT

其中：Y为C或T；D为G或A或T；M为A或C；S为G或C；R为A或G；W为A或T。

SEQ ID NO:8(轻链下游引物)

GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCC

SEQ ID NO:9(c-MET抗体重链CDR1氨基酸序列)

GYSFTSYW

SEQ ID NO:10(c-MET抗体重链CDR2氨基酸序列)

IDPSDSES

SEQ ID NO:11(c-MET抗体重链CDR3氨基酸序列)

ARSGYHGTSYWYFDV

SEQ ID NO:12(c-MET抗体轻链CDR1氨基酸序列)

KSLLHSDGITY

SEQ ID NO:13(c-MET抗体轻链CDR2氨基酸序列)

QMS

SEQ ID NO:14(c-MET抗体轻链CDR3氨基酸序列)

AQNLELPPT。

序列表

<110> 同济大学苏州研究院

房健民

<120> c-MET激动剂及其用途

<130> MP1717345

<160> 14

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Artifical sequence

<220>

<221> primer

<222> (1)..(44)

<400> 1

tataccggtc gccaccatga aggcccccgc tgtgcttgca cctg 44

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Artifical sequence

<220>

<221> primer

<222> (1)..(56)

<400> 2

cgcgtcgacc tagtgatggt gatgatggtg tgtgaaattc tgatctggtt gacata 56

<210> 3

<211> 2796

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> gene

<222> (1)..(2796)

<400> 3

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60

aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120

tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180

cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240

gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300

tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360

gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420

tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480

atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540

ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600

ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660

gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720

ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780

ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840

ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900

acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960

tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020

attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080

gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140

aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200

acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260

accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320

tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380

cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440

ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500

tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560

agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620

tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680

tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740

ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800

actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860

acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920

tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 1980

agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040

tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100

agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160

gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220

gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata 2280

acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340

gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt 2400

tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460

ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520

tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580

aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640

agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700

ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760

ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcaca 2796

<210> 4

<211> 932

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(932)

<400> 4

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys

20 25 30

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

35 40 45

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu

50 55 60

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys

65 70 75 80

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe

85 90 95

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

100 105 110

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

115 120 125

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

130 135 140

Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145 150 155 160

Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val

165 170 175

Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe

180 185 190

Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp

195 200 205

His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp

210 215 220

Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu

225 230 235 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn

245 250 255

Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln

260 265 270

Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu

275 280 285

His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg

290 295 300

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala

305 310 315 320

Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser

325 330 335

Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp

340 345 350

Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys

355 360 365

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

370 375 380

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385 390 395 400

Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr

405 410 415

Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly

420 425 430

Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly

435 440 445

Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln

450 455 460

Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu

465 470 475 480

Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu

485 490 495

Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys

500 505 510

Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln

515 520 525

Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys

530 535 540

Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

545 550 555 560

Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu

565 570 575

Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg

580 585 590

Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu

595 600 605

Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys

610 615 620

Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile

625 630 635 640

Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp

645 650 655

Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly

660 665 670

Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg

675 680 685

His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn

690 695 700

Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe

705 710 715 720

Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe

725 730 735

Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser

740 745 750

Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn

755 760 765

Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg

770 775 780

Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys

785 790 795 800

Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys

805 810 815

Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp

820 825 830

Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val

835 840 845

Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp

850 855 860

Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys

865 870 875 880

Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val

885 890 895

Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys

900 905 910

Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp

915 920 925

Gln Asn Phe Thr

930

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Artifical sequence

<220>

<221> primer

<222> (1)..(20)

<400> 5

sargtrmagc tgmagsagtc 20

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> artifical sequence

<220>

<221> primer

<222> (1)..(27)

<400> 6

aattttcttg tccaccttgg tgctgct 27

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial sequence

<220>

<221> primer

<222> (1)..(21)

<400> 7

gayattgtdm tsacmcarwc t 21

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> artificial sequence

<220>

<221> primer

<222> (1)..(26)

<400> 8

ggatacagtt ggtgcagcat cagccc 26

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> artificial sequence

<220>

<221> peptide

<222> (1)..(8)

<400> 9

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> artifical sequence

<220>

<221> peptide

<222> (1)..(8)

<400> 10

Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Ser

1 5

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> artifical sequence

<220>

<221> peptide

<222> (1)..(15)

<400> 11

Ala Arg Ser Gly Tyr His Gly Thr Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10 15

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> artificial sequence

<220>

<221> peptide

<222> (1)..(11)

<400> 12

Lys Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Ile Thr Tyr

1 5 10

<210> 13

<211> 3

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> artificial sequence

<220>

<221> peptide

<222> (1)..(3)

<400> 13

Gln Met Ser

1

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> artificial sequence

<220>

<221> peptide

<222> (1)..(9)

<400> 14

Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Pro Thr

1 5

Claims

1.c-MET激动型抗体在制备用于治疗或预防血管内皮细胞损伤性疾病的药物中的用途，所述c-MET激动型抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11所示，所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述血管内皮细胞损伤性疾病是缺血性疾病或血脑屏障损伤性疾病。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述缺血性疾病是脑梗塞或心肌梗塞。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述治疗或预防脑梗塞是通过降低血脑屏障通透性和/或通过保护和修复脑血管和/或通过减少脑梗塞体积来实现的。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中所述c-MET激动型抗体为经过基因工程改造但仍保持激动活性的抗体化合物，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11所示，所述轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述c-MET激动型抗体为FR和/或Fc片段经过人源化改造的抗体。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述c-MET激动型抗体为全人源化抗体。

8.抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段能够结合至c-MET，所述抗体或其功能片段包含重链和轻链，并且

所述重链的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO: 9，SEQ ID NO: 10和SEQID NO:11所示；并且

所述轻链的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和SEQID NO: 14所示。

9.药物组合物，其包含权利要求8所述的抗体或其功能片段，以及可药用载体。

10.根据权利要求9的药物组合物，其为静脉注射剂。

11.根据权利要求9所述的药物组合物，其还包含另外一种或多种具有治疗或预防血管内皮细胞损伤性疾病的药物活性化合物。

12.根据权利要求9所述的药物组合物，其为用于依次使用的组合产品，还包含IRF5抑制剂、降脂药或血管发生抑制剂及其组合。

13.根据权利要求9所述的药物组合物，其为用于依次使用的组合产品，还包含紫杉醇。

14.权利要求8所述的抗体或其功能片段用于制备诊断试剂盒的用途，所述诊断试剂盒用于从对象中体外诊断血管内皮细胞损伤性疾病。

15.抗体-药物缀合物，其包含权利要求8所述的抗体或其功能片段。