KR20130036993A

KR20130036993A - ｃ-Ｍｅｔ의 ＳＥＭＡ 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체

Info

Publication number: KR20130036993A
Application number: KR1020110101292A
Authority: KR
Inventors: 정광호; 김경아; 송윤정; 송호영; 오영미; 이승현; 정수연
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2011-10-05
Filing date: 2011-10-05
Publication date: 2013-04-15
Also published as: CN103987730A; CA2851220C; AU2012319286B2; IL231952A; EP2764026B1; JP2017212974A; WO2013051878A3; IL231952A0; JP2014531217A; BR112014008382A2; US20130089557A1; AU2012319286A1; CN103987730B; EP2764026A4; WO2013051878A2; EP2764026A2; JP6694850B2; US9394367B2; CA2851220A1

Abstract

c-Met의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암 진단용 키트에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 c-Met의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 의하면, 암을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

ｃ-Ｍｅｔ의 ＳＥＭＡ 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체{Antibodies specifically binding to epitope in SEMA domain of c-Met}

c-Met의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암 진단용 키트에 관한 것이다.

c-Met은 간세포 성장 인자 (hepatocyte growth factor, HGF)의 수용체이며, HGF는 c-Met 수용체 티로신 키나제의 세포외 부위에 결합하여 다양한 정상세포와 종 양세포에서 분열, 운동, 형태발생, 혈관형성을 유발하는 사이토카인의 일종이다. c-Met은 세포 표면에 존재하는 대표적인 수용체 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase)로 그 자체가 암유발 유전자이며 때로는 리간드인 HGF와 상관 없이도 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침습, 신생혈관 생성 등과 같은 종양과 관련된 여러 가지 기작에 관여하기 때문에 최근 항암 타겟으로 주목받는 단백질이다.

특히 c-Met은 기존에 알려진 항암제의 작용 기작에서 약물 내성에 관여됨이 알려지면서 더욱 더 개인맞춤형 치료에 중요성이 인식되고 있다. EGFR (ERBB1)을 표적으로 하는 대표적인 항암 치료제인 얼비툭스(Erbitux) 또는 타세바(Tarceva)와 같은 약물은 암 발생 기작과 관련된 신호 전달을 차단함으로써 작동한다. 또한 유방암 치료제로 잘 알려진 허셉틴(Herceptin)은 ERBB2 (HER2)를 표적으로 세포의 증식에 필요한 신호 전달을 차단함으로써 작동한다. 그러나 상기 약물에 대한 내성이 있는 환자 중, c-Met 단백질의 과발현 등으로 항암제의 작동을 피해 세포의 증식을 유도하는 다른 신호 전달 기작이 활성화된다는 연구들이 최근 발표되고 있다. 이러한 이유로 인해, c-Met은 항암제와 관련하여 다수의 제약사들이 주목하고 있는 표적 분자가 되고 있다.

관련 기술은 c-Met의 작용을 저해하는 항체 치료제를 개시하고 있다. 그러나, 상기 관련 기술은, 항체가 원래의 구조를 가진 경우 c-Met 분자들이 이량체화(dimerization)가 되도록 유발함으로써, 암을 유발하는 문제점이 발견되었다.

c-Met의 작용을 저해하는 항체 치료제를 개시하는 다른 관련 기술은 c-Met의 리간드인 HGF c-Met에 결합하지 못하도록 저해하는 기능은 있으나, 항체 자체의 결합에 의해 리간드와 상관없이 c-Met을 이량체화시켜 오히려 암을 유발하는 신호가 전달되도록 하는 효능제(agonist)로 작용하는 부작용이 발견이 되었다.

또 다른 관련 기술은 c-Met의 이량체화를 방지하기 위해 원래는 효능제 (agonist)인 양팔 항체 (two-armed antibody)를 유전자 재조합 방식으로 변형시킨 c-Met에 대한 한팔 길항(one-armed antagonistic) 항체를 개시하고 있으며, 현재 이에 대한 임상시험 단계의 제품 개발이 진행되고 있다. 그러나 상기 관련 기술에서도 상기 항체는 화학요법과 병용치료일 경우에만 효과를 보이며, 항체를 단독으로 처리하는 경우에는 항암 효과가 크지 않은 것으로 확인되었다.

따라서, 종래 기술에 의하더라도, c-Met의 작용을 저해하는 새로운 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개발하기 위하여 c-Met 상의 타겟 부분을 연구할 필요성이 있다.

일 양상은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.

다른 양상은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

다른 양상은 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.

용어, "c-Met" 또는 "c-Met 단백질"은 간세포 성장 인자와 결합하는 수용체 티로신 키나제를 의미한다. 상기 단백질은 예를 들면, GenBank Aceession Number NM_000245에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드, 또는 GenBank Aceession Number NM_000236에 제공된 폴리펩티드 서열에 의해 암호화된 단백질, 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이, 암세포 이동, 암세포 침투, 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.

HGF(Hepatocyte growth factor)의 수용체인 c-Met은 세포외 부위, 막투과 부위, 세포내 부위의 세 부분으로 구분되며, 세포외 부위의 경우, 이황화 결합에 의해 α-소단위체와 β-소단위체가 연결된 형태로 HGF 결합 도메인인 SEMA 도메인, PSI 도메인(plexin-semaphorins-integrin homology domain) 및 IPT 도메인(immunoglobulin-like fold shared by plexins and transcriptional factors domain)으로 이루어진다. 즉, c-Met 단백질의 SEMA 도메인은 c-Met의 세포외 부위에 존재하는 도메인으로서, HGF가 결합하는 부위에 해당한다. 특히, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 중 2번과 3번 프로펠러 도메인 사이의 루프(loop) 부위에 해당한다.

용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 폴리펩티드 역시 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내에 존재하는 에피토프이다.

상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 2번과 3번 프로펠러 구조의 도메인 사이의 루프 부위 중 가장 바깥으로 위치한 부위에 해당하며, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 에피토프는 일 구체예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편이 가장 특이적으로 결합하는 부위이다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 단일클론 항체 또는 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항원 결합 단편인 것일 수 있다.

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 c-Met은 인간, 원숭이, 마우스, 및 래트로 이루어진 군으로부터 선택되는 c-Met으로부터 유래된 것일 수 있다.

다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편의 약학적 유효량; 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.

상기 조성물이 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 제조되는 경우, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데, 또는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

상기 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 한편, 상기 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 c-Met 단백질의 길항제(antagonist) 작용을 하는 것일 수 있다.

용어 "길항제(antagonist)"는 표적물 (예를 들어, c-Met)의 생물학적 활성 중 하나 이상을 부분적으로나 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 포함하는 개념으로 해석된다. 예를 들어, "길항제" 항체는 항체가 결합하는 항원 (예를 들어, c-Met)의 생물학적 활성을 억제시키거나 감소시키는 항체를 의미한다. 길항제는 리간드에 대한 수용체의 결합에 의해, 수용체 인산화(phosphorylation)를 감소시키거나, 리간드에 의해 활성화되었던 세포를 무능력화시키거나, 또는 사멸시키는 작용을 할 수 있다. 또한, 길항제는 수용체-리간드 사이의 상호 작용을 완전히 단절시키거나, 수용체의 3차 구조의 변화, 또는 감소 조절(down regulation)에 의해 상기 상호 작용을 실질적으로 감소시킬 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 일 구체예에 따르면, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또 다른 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편의 약학적 유효량; 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.

상기 암 치료 방법에 사용되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

한편, 상기 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 투여할 수 있는 개체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 인간 또는 개, 고양이, 마우스와 같은 인간을 제외한 동물일 수 있다.

다른 양상은 다음의 단계를 포함하는 암의 진단, 예방 또는 치료용 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다:

(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 에피토프 및 시료의 결합 여부를 확인하는 단계; 상기 에피토프 및 시료가 1 pM 내지 10 nM 범위의 결합력을 보이는 경우에는 상기 시료를 암의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단한다.

상기 스크리닝 방법에 따르면, 우선 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 일 구체예에 따르면, 상기 c-Met은 인간, 원숭이, 마우스, 및 래트로 이루어진 군으로부터 선택되는 c-Met으로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 상기 스크리닝 방법에서 용어, "시료(sample)"는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프와 결합하는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 예를 들어, 항체, 항원 결합 단편과 같은 폴리펩티드, 화학물질, 폴리뉴클레오티드, 안티센스-RNA, shRNA(short hairpin RNA), siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이어, 분석하고자 하는 시료가 처리된 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 상기 시료가 결합되었는지 여부를 측정한다. 상기 결합력의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 결합력은 Biacore 장치를 사용하여 측정할 수 있다. 일반적으로, 치료용 약품으로서 상기 결합력이 인정되는 범위는 결합 상수인 K_D값이 10 nM 이하로 정의될 수 있다. 즉, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프와 분석하고자 하는 시료(예를 들어, 항체)의 결합력은 Biacore 장치와 같은 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance) 방법으로 측정하였을 때, 1 pM 내지 10 nM, 또는 10 pM 내지 10 nM, 또는 100 pM 내지 10 nM인 경우, 상기 시료(예를 들어, 항체)를 암의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단할 수 있다.

한편, 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 즉, 상기 스크리닝 방법에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프 대신에 상기 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 사용하는 경우에도, 상기와 동일한 스크리닝 결과를 얻을 수 있다.

다른 양상은 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 암은 예를 들어, 폐암 또는 난소암일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 일부 폐암 환자 또는 난소암 환자에서 상기 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내에서 서열번호 3으로 표시되는 에피토프 가운데 168번째 아미노산인 Glu가 Asp로 변이가 일어난 것으로 알려져 있다 (M.Sattler, et al., Ther. Adv. Med. Oncol. 2011, 3(4):171-184).

상기 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은, 생물학적 시료에 적용되어 암의 발생 여부를 진단할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 예를 들어, 암이 의심되는 환자의 조직, 세포 또는 전혈일 수 있으나. 이에 한정하지는 않는다.

일 구체예에 따른 상기 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 상기 서열번호 3으로 표시되는 에피토프에 대한 결합력이 높으며, 상기 변이가 발생한 c-Met 단백질의 에피토프(서열번호 47)에 대한 결합력은 낮으므로, 암이 의심되는 환자로부터 유래한 생물학적 시료와 접촉시켜 서열번호 3으로 표시되는 에피토프와 항원-항체 복합체가 형성되고, 서열번호 47로 표시되는 에피토프와 항원-항체 복합체가 형성되지 않으면 암으로 진단할 수 있다.

상기한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 또는 섬광계수법(scintillation counting method)으로 검출할 수 있다.

상기 용어, "검출"은 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용하여 실시할 수 있다. 표지체의 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 또는 방사성 동위원소를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.

검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 및 β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu³⁺, Eu³⁺킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르 및 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금 및 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 ⁵⁷Co, ³H, ¹²⁵I 및 ¹²⁵I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함할 수 있다.

예를 들어, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출 표지를 갖지 않을 경우는 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 포획할 수 있고 검출 표지를 갖는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

일 구체예에 따른 c-Met의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 의하면, 암을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 마우스 항체 AbF46의 전장 c-Met에 대한 인지력을 확인한 결과이다.
도 2는 마우스 항체 AbF46의 SEMA 도메인에 대한 인지력을 확인한 결과이다.
도 3은 huAbF46 항체의 에피토프 맵핑(mapping)을 위한 ELISA 결과이다.
도 4는 SEMA 도메인 상의 huAbF46 항체의 에피토프 위치를 확인한 그림이다.
도 5는 BrdU assay를 통해 인간화 항체 huAbF46의 작용성 부작용 정도를 확인한 결과이다.
도 6은 Akt 인산화를 통해 인간화 항체 huAbF46의 작용성 부작용 정도를 확인한 결과이다.
도 7은 인간화 항체 huAbF46의 인 비트로 세포증식 분석을 수행한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 마우스 항체 AbF46 및 키메릭 항체 chAbF46 항체의 인 비보 항암 효능 분석을 이종 이식 위암 마우스 동물 모델을 대상으로 수행한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 마우스 항체 AbF46 및 인간화 항체 huAbF46의 인 비보 항암 효능 분석을 이종 이식 폐암 마우스 동물 모델을 대상으로 수행한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: c-Met에 대한 마우스 항체 AbF46의 생산

(1) 마우스의 면역화

하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 쥐에 한마리당 100 ㎍의 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 항원(먼저 주사한 양의 절반)을 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)와 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 c-Met을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 세포융합과정을 수행하였다.

(2) 세포 융합 및 하이브리도마의 제조

세포융합 실험 3일 전에 50 ㎍의 PBS에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질 혼합물을 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양배지(DMEM)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1 x 10⁸개와 골수종세포(Sp2/0) 1 x 10⁸개를 혼합한 다음 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양배지(DMEM)에 들어있는 45 % 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(1 ㎖)을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리배지(HAT 배지)에 1~2×10⁵/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37 ℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.

(3) c-Met 단백질에 대한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별

상기 (2)에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 c-Met 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질과 인간의 Fc 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.

마이크로타이터 플레이트에 인간의 c-Met/Fc 융합 단백질을 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ug/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. c-Met이 아닌 Fc에 결합되는 항체를 선별하여 제외시키기 위하여 인간의 Fc 단백질을 위와 동일한 방법으로 플레이트 표면에 부착시켰다. 하이브리도마 세포의 배양액을 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응정도는 엘리자 해독기(ELISA Reader)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 인간의 Fc에는 결합되지 않고, 인간의 c-Met 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 1개의 클론을 최종적으로 얻었다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 한국 세포주 은행에 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00220를 부여받았다.

(4) 단일클론 항체의 생산 및 정제

상기 (3)에서 얻은 하이브리도마 세포를 무혈청 배지에서 배양하고 배양액으로부터 단일클론 항체를 생산 정제하였다.

먼저 10% FBS이 포함된 배양배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서 배양배지(DMEM) 배지 50 ㎖을 세포 침전물에 재현탁시킨 후 3일 동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 이후 원심분리를 통해 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여 4℃에 보관하거나 바로 모아서 50 ㎖ 내지 300 ㎖의 배양액으로부터 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Health)를 이용하여 항체를 순수 정제한 후 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실험에 사용하였다.

실시예 2: c-Met에 대한 키메릭 항체 chAbF46의 제작

일반적으로 마우스 항체는 치료 목적으로 인간에게 주입되었을 때 면역거부반응(immunogenicity)을 보일 가능성이 높으므로, 이를 해결하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작된 마우스 항체 AbF46으로부터, 항원 결합에 관련된 변이 영역(variable region)을 제외한 불변 영역(constant region)을 인간 IgG1 항체의 서열로 치환하는 키메릭 chAbF46을 제작하였다.

중쇄에 해당하는 염기 서열은 'EcoRI-signal sequence-VH-NheI-CH-TGA-XhoI'(서열번호 12)로, 경쇄에 해당하는 염기 서열은 'EcoRI-signal sequence-VL-BsiWI-CL-TGA-XhoI'(서열번호 13)로 구성되도록 각각 디자인하여 유전자를 합성하였다. 이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit(Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 12)을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit(Cat no. 8300-01)에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(서열번호 13)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 키메릭 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 구축된 벡터는 각각 Qiagen Maxiprep kit (Cat no. 12662)을 이용하여 증폭되었으며, 상기 중쇄를 포함하는 벡터 및 경쇄를 포함하는 벡터는 4:1의 비율(80 ug:20 ug)로 293T 세포(2.5 x 10⁷)에 2M CaCl₂를 360 ul 첨가하여 트랜스펙션(transfection)하였다. 이후, 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 5시간 동안 배양한 다음, FBS가 첨가되지 않은 DMEM 배지로 48시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 키메릭 항체 AbF46(이하, chAbF46로 명명함)을 정제하였다.

실시예 3: 키메릭 항체 chAbF46으로부터 인간화 항체 huAbF46의 제작

(1) 중쇄의 인간화(Heavy chain humanization)

H1-heavy 및 H3-heavy 2종의 디자인을 위하여, 우선 Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 AbF46의 VH 유전자와 가장 상동성이 높은 인간의 생식선(germline) 유전자를 분석하였다. 그 결과, VH3-71이 아미노산 레벨에서 83%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR 부분이 VH3-71의 골격(framework)에 도입되도록 디자인하였다. 이때, 30번(S→T), 48번(V→L), 73번(D→N), 78번(T→L) 아미노산은 원래 마우스 AbF46 항체의 아미노산 서열로 back-mutation 하였다. 이후, H1은 추가로 83번(R→K)과 84번(A→T) 아미노산에 돌연변이를 주어 최종적으로 H1-heavy(서열번호 14)와 H3-heavy(서열번호 15)를 구축하였다.

H4-heavy의 디자인을 위하여 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, AbF46 항체의 마우스 골격 서열과 서열이 매우 유사함과 동시에, 기존의 가장 안정하다고 알려진 VH3 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3를 도입하였다. 이를 통하여 H4-heavy (서열번호 16)를 구축하였다.

(2) 경쇄의 인간화(Light chain humanization)

H1-light(서열번호 17) 및 H2-light(서열번호 18) 2종의 디자인을 위하여, Ig Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여, 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석하였다. 그 결과, VK4-1이 아미노산 레벨에서 75%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H1-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하였으며, H2-light는 49번 아미노산(Y→I) 1개만을 back-mutation 하여 구축하였다.

H3-light(서열번호 19)의 디자인을 위하여, Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)를 통하여 마우스 항체 AbF46의 VL 유전자와 가장 상동성이 높은 인간 생식선 유전자를 분석한 결과 중, 상기 VK4-1 이외에 VK2-40을 선정하였다. 마우스 항체 AbF46 VL과 VK2-40은 아미노산 레벨에서 61%의 상동성을 가짐을 확인하였으며, 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 Kabat numbering으로 정의하고, 마우스 항체 AbF46의 CDR부분이 VK4-1의 골격에 도입되도록 디자인하였다. 이때, H3-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 back-mutation 하여 구축하였다.

H4-light(서열번호 20)의 디자인을 위하여, 인간항체의 골격(framework) 서열을 찾아 본 결과, 기존의 가장 안정하다고 알려진 Vk1 subtype을 사용하여 Kabat numbering으로 정의된 마우스 항체 AbF46의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3를 도입하였다. 이때, H4-light는 36번(Y→H), 46번(L→M), 49번(Y→I) 3개의 아미노산을 추가로 back-mutation 하여 구축하였다.

이후, Invitrogen 사의 OptiCHO^TM Antibody Express Kit (Cat no. 12762-019)에 포함되어 있는 pOptiVEC^TM-TOPO TA Cloning Kit에 상기 중쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(H1-heavy; 서열번호 21, H3-heavy; 서열번호 22, H4-heavy; 서열번호 23)을, pcDNA^TM3.3-TOPOTA Cloning Kit에 상기 경쇄에 해당하는 염기서열을 갖는 DNA 절편(H1-light; 서열번호 24, H2-light; 서열번호 25, H3-light; 서열번호 26, H4-light; 서열번호 27)을 각각 EcoRI(NEB, R0101S)과 XhoI(NEB, R0146S) 제한 효소를 사용하여, 클로닝함으로써, 인간화 항체의 발현을 위한 벡터를 구축하였다.

상기 배양된 세포를 원심분리하여 상등액 각 100 ml을 취하고, AKTA Prime (GE healthcare)를 이용하여 정제하였다. AKTA Prime에 Protein A 컬럼(GE healthcare, 17-0405-03)을 설치하고 배양액을 5 ml/min의 유속으로 흘려준 후, IgG elution buffer(Thermo Scientific, 21004)로 용출하였다. 이를 PBS buffer로 교환하여 최종적으로 인간화 항체 AbF46(이하, huAbF46로 명명함)을 정제하였다. 한편, 이후 실시예에서 사용한 인간화 항체 huAbF46의 중쇄, 경쇄 조합은 H4-heavy 및 H4-light이었다.

실시예 4: 마우스 항체 AbF46의 전장 c-Met에 대한 인지력 확인

c-Met의 세포외 도메인(extracellular domain)을 포함하는 단백질에 대한 마우스 항체 AbF46의 인지력을 확인하기 위하여, c-Met을 발현시키기 위한 폴리뉴클레오티드(서열번호 28)를 pcDNA5 벡터(Invitrogen)에 클로닝하고, in vitro transcription and translation kit(TnTt kit, Promega, Madison, USA)를 사용하여 293T 세포(한국 세포주 은행)에서 발현시켰다. 이후, 마우스 항체 AbF46을 protein G-conjugated agarose bead(Invitrogen)와 혼합하고, 합성된 c-Met 단백질을 포함하는 293T 세포 용해물 또는 in vitro transcription and translation kit로부터의 반응에 의해 만들어진 c-Met을 첨가하고, 면역 침강법(immunoprecipitation)을 수행하였다. 상기 면역 침강된 결과물을 SDS-PAGE를 통해 전기영동한 후, Western blot 방법을 사용하여 분석하였다.

도 1에서 보는 바와 같이, 마우스 항체 AbF46는 전장 c-Met 항원을 정확히 인지하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 마우스 항체 AbF46의 SEMA 도메인에 대한 인지력 확인

마우스 항체 AbF46가 c-Met의 세포외 도메인(extracellular domain) 중 어느 부위에 결합하는지 여부를 확인하기 위하여, 먼저, c-Met의 세포외 도메인을 세 부분으로 나누어 각각의 부분을 코딩하는 DNA 절편을 pcDNA5 벡터에 클로닝하였다. 상기 세 부분은 각각 SEMA 도메인(서열번호 29), PSI-IPT 도메인(서열번호 30), TyrKc 도메인(서열번호 31)이며, pcDNA5 벡터에 클로닝하기 위한 각각의 도메인을 코딩하는 DNA 절편을 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34에 나타내었다.

상기 벡터에 클로닝한 후, 각각을 in vitro transcription and translation kit(TnTt kit, Promega, Madison, USA)를 사용하여 293T 세포(한국 세포주 은행)에서 발현시켰다. 이후, 마우스 항체 AbF46을 protein G-conjugated agarose bead(Invitrogen)와 혼합하고, 합성된 c-Met 단백질을 포함하는 293T 세포 용해물 또는 in vitro transcription and translation kit로부터의 반응에 의해 만들어진 c-Met을 첨가하고, 면역 침강법 (immunoprecipitation)을 수행하였다. 상기 면역 침강된 결과물을 SDS-PAGE를 통해 전기영동한 후, Western blot 방법을 사용하여 분석하였다.

도 2에서 보는 바와 같이, 마우스 AbF46 항체는 c-Met의 SEMA 도메인에 결합되는 것을 확인할 수 있었다. 음성 대조군으로는 마우스의 IgG를 사용하였으며, 양성 대조군으로는 5D5 항체(ATCC Cat. # HB11895 하이브리도마 세포에서 분리 정제)를 사용하였다. 한편, 도 2에서 Input은 면역 침강을 수행하지 않고 합성된 모든 결과물을 젤에 로딩한 것으로, 이로부터, 항체의 결합 여부와 상관없이 합성된 전체 c-Met이 문제가 없음을 확인할 수 있다.

실시예 6: huAbF46 항체의 에피토프 맵핑(mapping)을 위한 펩티드 제작

c-Met의 SEMA 도메인을 포함하는 543개의 아미노산 서열 및 구조는 PDB (Protein Database) ID: 1UZY 에 나타나 있으며, 이들 아미노산 서열을 기초로 CLIPS (Chemically Linked Peptides on Scaffolds) 기술을 이용하여 구조적 에피토프(conformational eptitope)와 불연속적 에피토프(discontinuous epitope)를 만들 수 있는 6063개의 다른 서열들이 디자인되고 합성이 되었다 (Timmerman et al., 2007 Functional reconstruction and synthetic mimicry of a conformational epitope using CLIPS^TM technology. J. Mol. Recognit. 20: 283-00). Peptide array 제작 과정을 자세히 설명하면, CLIPS 기술은 기존의 전형적인 방법인 약 15개의 아미노산 길이를 갖는 선형 펩티드 이외에 CLIPS(Chemically Linked Peptides on Scaffolds)라 불리는 'PepScan'사 고유의 구조를 갖는 펩티드를 제작하는 방법으로, huAbF46 항체를 대상으로 선형 펩티드 및 CLIPS 펩티드 모두에 대하여 결합력을 측정하였다. CLIPS 펩티드 중 T2 CLIPS 펩티드는 2개의 시스테인이 루프(loop)를 형성하여 인위적으로 펩티드에 구조를 부여하며, T3 CLIPS 펩티드는 3개의 시스테인이 루프를 형성하여 펩티드에 구조를 부여한다. 또한, T2T3 또는 T2T2와 같은 결합형 펩티드를 제작할 수도 있다.

에피토프 멥핑을 위해 총 6063개의 펩티드를 제작하였으며(Peptide array의 제작은 PepScan에 의뢰함), 1 내지 529번 펩티드는 전형적인 선형 펩티드로서, 일부 영역이 오버래핑(overlapping) 되도록 15개의 아미노산 길이로 제작되었다. 530 내지 1058번 펩티드는 T2 CLIPS 펩티드에 1 내지 529번 펩티드들을 도입하여 제작하였다. 1059 내지 2014번 펩티드는 T3 CLIPS 펩티드에 15개의 아미노산을 가지는 펩티드 2개를 연결하여 총 956개를 제작하였다. 2015 내지 6063번 펩티드는 8 내지 35개의 아미노산 잔기를 가지는 펩티드 그룹간의 결합을 통하여 선형 및 비연속적인 구조를 가지는 에피토프를 찾기 위한 펩티드로서 총 4048개가 제작되었다.

예를 들어, T2 CLIPS 펩티드를 포함하는 펩티드 어레이는 다음과 같은 방법으로 제작한다. 0.5 mM의 T2 CLIPS 펩티드가 포함된 1,3-비스 (브로모메틸) 벤젠 용액을 암모늄 비카르보네이트 (20 mM, pH 7.9)/아세톤니트릴 (1:1(v/v)에 용해시키고, 상기 결과물 용액을 펩티드 어레이에 첨가하였다. 상기 CLIPS 주형은 펩티드 어레이(3 ul의 웰을 갖는 455개의 웰 플레이트)의 고체-상 결합된 펩티드 내에 존재하는 2개의 시스테인 곁사슬에 결합된다. 상기 용액이 완전하게 덮히도록 30분 내지 60분 동안 상기 용액 내에서 펩티드 어레이를 천천히 흔들어 주었다. 마지막으로, 상기 펩티드 어레이를 과량의 물로 충분히 세척하고, PBS (pH 7.2) 내에 1% SDS/0.1% 베타-머캅토에탄올이 포함된 파쇄-완충액에서 30분 동안 70℃의 온도 조건으로 초음파 분쇄한 다음, 45분 동안 물에서 추가적으로 초음파 분쇄를 하였다. T3 CLIPS 펩티드는 상기 방법과 동일하나, 3개의 시스테인 곁사슬에 결합되도록 한다.

상기 펩티드를 사용하여 ELISA를 통해 에피토프 맵핑을 수행한 결과, huAbF46의 핵심 에피토프는 c-Met 단백질의 168번째 아미노산에서 171번째 아미노산으로 이루어진 펩티드인 EEPSQ(서열번호 3)임을 확인할 수 있었다.

실시예 7: huAbF46 항체의 에피토프 맵핑(mapping)을 위한 ELISA 분석

에피토프 맵핑을 위하여 총 529개의 선형 펩티드 및 CLIPS 펩티드를 사용하여 PEPSCAN-기반의 ELISA 분석을 수행하였다. 상기 펩티드들은 5% 블로킹 용액(4% 오브알부민(ovalbumin), 5% 말 혈청(horse serum) 및 1% Tween 80)을 이용하여 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 이후, 1% Tween 80이 첨가된 PBS에서 4℃로 밤샘 반응시킨 1 내지 100 ug/ml 범위의 huAbF46 항체를 상기 펩티드들에 반응시킨 후, 세척하였다. 이후, rabbit-anti-sheep antibody(SIGMA)를 처리하고, PBS로 세척한 후, 퍼옥시다제가 부착된 swine-anti-rabbit antibody(SIGMA)를 처리하고, PBS로 세척하였다. 이후, 3% H₂O₂에 2 ul/ml의 퍼옥시다제 2,2'-azino-di-3-ethylbenzthiazoline sulfonate (ABTS)(SIGMA)를 처리하고, 1시간 후에 발색 반응을 측정하였다.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 선형 펩티드 및 CLIPS 펩티드 모두에서 'EEPSQ' 서열(서열번호 3)을 포함하는 펩티드에서만 특이적인 ELISA 양성 반응을 보였으며, 이에 따라, 상기 huAbF46은 c-Met의 선형 에피토프 및 구조 에피토프(conformational epitope)를 모두 인지하는 항체임을 확인할 수 있었다.

또한 상기 'EEPSQ'(서열번호 3) 에피토프 가운데 일부 폐암 환자 또는 난소암 환자에서 발견되는 것으로 알려진 c-Met SEMA 부위의 대표적인 돌연변이인 E168D 변이가 형성된 폴리펩티드를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 ELISA를 수행한 결과, 하기 표 1과 같은 결과를 얻었다.

Core 펩티드 서열	합성된 펩티드 서열	ELISA 값 (huAbF46의 항체 결합)
EEPSQ(서열번호 3)	FAPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVL(서열번호 41)	2063
	CSPQIEEPSQC(서열번호 42)	1306
	CPQIEEPSQAC(서열번호 43)	2157
	CQIEEPSQAPC(서열번호 44)	2744
	CIEEPSQAPDC(서열번호 45)	2239
	CEEPSQAPDAC(서열번호 46)	2829
EDPSQ(서열번호 47)	FSPQIEDPSQCPDCVVSALGAKVL(서열번호 48)	172
	CSPQIEDPSQC(서열번호 49)	121
	CPQIEDPSQAC(서열번호 50)	138
	CQIEDPSQAPC(서열번호 51)	172
	CIEDPSQAPDC(서열번호 52)	128
	CEDPSQAPDAC(서열번호 53)	132

상기 결과로부터 huAbF46 항체는 E168D 변이를 가진 c-Met SEMA에는 결합하지 못하며, 따라서, 상기 항체는 암 발병 정보를 제공하기 위한 진단 방법에 이용될 수 있음을 의미한다.

실시예 8: huAbF46 항체의 에피토프 맵핑 결과 분석

상기 실시예 6 및 실시예 7로부터, huAbF46 항체는 c-Met 단백질의 168번째 아미노산에서 171번째 아미노산으로 이루어진 펩티드인 'EEPSQ' 서열을 포함하는 선형 펩티드 및 CLIPS 펩티드 모두에서 비특이적 반응없이 특이적인 결합 반응을 보였다. 이는 huAbF46 항체가 c-Met 단백질 중 선형 에피토프 및 구조적 에피토프(conformational epitope) 모두에 결합함을 의미하며, 이를 분자구조 측면에서 확인하면(PyMOL 1.4.1 (www.pymol.org), Cn3D 4.1 (NCBI)), 도 4에 나타낸 바와 같이, huAbF46 항체의 에피토프는 SEMA 도메인에 위치하며, HGF의 결합 부위에서도, 직접적인 결합 부위와 가까운 쪽의 루프(loop)에 해당하는 위치임을 확인할 수 있었다.

실시예 9: Full Positional Scanning 결과 분석

EEPSQ 서열의 각 아미노산 부위를 원래의 아미노산이 아닌 다른 20종의 아미노산으로 치환하고, 이들 각각의 펩티드가 huAbF46 항체와의 결합력에 어떤 변화가 생기게 되는지를 7종의 펩티드 어레이를 통하여 상세 분석하였다.

분석 결과, EEPSQ의 아미노산 서열 중 어떠한 아미노산이 상기 항체의 결합에 중요한지 여부를 확인하였으며, 특히 앞 부분의 EEP 서열이 항체의 결합에 매우 중요한 요소임을 확인할 수 있었다.

실시예 10: SEMA 도메인의 돌연변이에 의한 huAbF46 항체의 결합력 분석

EEPSQ 서열의 각 아미노산 부위 또는 5개 아미노산 전체를 원래의 아미노산이 아닌 알라닌으로 치환하고, 이들 각각의 펩티드('AAAAA', 'AEPSQ', 'EAPSQ', 'EEASQ', 'EEPSQ', 'EEPSA', 서열번호 35 내지 서열번호 40)와 huAbF46 항체의 결합력을 Biacore(GE healthcare)를 사용하여 측정하였다. CM5 칩 상에 huAbF46 항체를 약 80~110 RU만큼 고정시킨 후, 항원인 상기 서열번호 37 내지 서열번호 42의 펩티드를 100 nM부터 0.39 nM까지의 농도 범위 내에서 서로 다른 9개의 농도로 30 ul/min의 속도로 주입하여, 하기 표 2와 같이 k_on 값과 k_off 값을 구하고, 이로부터 K_D 값을 계산하였다. 그 결과, 아미노산이 치환된 펩티드에는 huAbF46 항체가 결합하지 못하였으며, 이러한 결과를 통해서 'EEPSQ' 서열이 huAbF46 항체의 필수적인 에피토프임을 확인할 수 있었다.

항체	항원	k_off(1/Ms)	k_on(1/s)	K_D(nM)
huAbF46	EEPSQ(서열번호 3)	4.30 x 10⁵	7.05 x 10^-4	1.64
huAbF46	AAAAA(서열번호 35)	결합하지 않음
huAbF46	AEPSQ(서열번호 36)	결합하지 않음
huAbF46	EAPSQ(서열번호 37)	결합하지 않음
huAbF46	EEASQ(서열번호 38)	결합하지 않음
huAbF46	EEPAQ(서열번호 39)	4.32 x 10⁵	6.16 x 10^-4	1.43
huAbF46	EEPSA(서열번호 40)	결합하지 않음

실시예 11: huAbF46 항체의 작용성(agonism) 부작용 정도의 비교 확인 - BrdU assay

huAbF46 항체에 대한 작용성(agonism) 정도를 비교하기 위하여, NCI-H441 세포를 사용하여, BrdU assay를 수행하였다. 인간 폐암 세포인 NCI-H441를 RPMI 1640 배지(Gibco)에 2 x 10⁵ 세포/ml로 현탁하여 현탁액을 100 ul씩 96-well tissue culture plate (Corning, Lowell, MA) 에 분주하였다. 24시간 동안 37℃에서 5% CO₂의 조건으로 배양하고, 배지를 완전히 제거한 후에 항체를 희석한 RPMI 1640 배지로 교체하였다. 21시간 동안 37℃에서 5% CO₂의 조건으로 배양한 후, 5-브로모-2'-디옥시우리딘(5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)을 첨가하고 3시간을 추가로 배양한 뒤에 BrdU assay (Roche, Indianapolis, IN)를 수행하였다. 세포를 플레이트 상에서 denaturation/fixation한 후에 항-BrdU 항체를 넣고 1시간 후에 기질을 첨가하여 370 nm에서 ELISA spectraMax reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 발색반응을 측정하였다. 비교 대상은 마우스 AbF46 항체의 작용성을 기준으로 하였다. 음성 대조군으로는 마우스의 IgG를 사용하였으며, 작용제(agonist)로 잘 알려진 5D5 항체를 양성 대조군으로 사용하였다.

도 5에서 보는 바와 같이, huAbF46 항체는 5D5 항체와 유사한 정도의 작용성의 부작용을 감소시키는 것으로 확인되었다.

실시예 12: huAbF46 항체의 작용성(agonism) 부작용 정도의 비교 확인 - Akt 인산화

huAbF46 항체에 대한 작용성 정도를 비교하기 위하여, Caki-1 세포(한국 세포주 은행)를 사용하여, c-Met의 하류 신호 전달 및 세포 증식에 관계되는 지표인 Akt 단백질의 인산화 정도를 확인하였다. 음성 대조군으로는 마우스의 IgG를 사용하였으며, 작용제(agonist)로 잘 알려진 5D5 항체를 양성 대조군으로 사용하였다.

2 x 10⁵ 세포/ml 의 Caki-1 세포를 96-웰 플레이트에 분주한 후, 24시간 후에 무혈청 상태에서 각각 5 ug/ml의 항체를 30분 동안 처리하였다. 항체가 처리된 세포를 용해(lysis)시키고 PathScan phospho-AKT1 (Ser473) chemiluminescent Sandwich ELISA kit (Cell Signaling, cat.no　#7134S)를 이용하여 Akt 인산화 정도를 측정한 후 분석하였다.

도 6에서 보는 바와 같이, huAbF46 항체에서 Akt의 인산화 정도가 30% 미만으로 나타나는 것으로 보아, 상기 사용된 huAbF46 항체는 작용성의 부작용이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 13: huAbF46 항체의 인 비트로 항암 효능 분석

huAbF46 항체의 암세포 증식 억제에 의한 항암 효과를 확인하기 위하여, c-Met 분자를 세포 표면에 발현하는 MKN45 위암 세포(일본 암연구 세포주 은행, Japanese Cancer Research Bank, JCRB, Tokyo, Japan)를 이용한 인 비트로(in vitro) 세포증식 분석법을 수행하였다.

96-웰 플레이트에 웰당 1 x 10⁴개의 MKN45 세포를 50 ㎕의 5% FBS/DMEM 배양액과 분주하고, huAbF46 항체를 처리하지 않거나, 0.008, 0.04, 0.2 또는 1 ㎍/㎖을 처리한 후, 72시간 동안 배양한 다음, CellTiter-Glo^? Luminescent Cell Viability Assay Kit (Promega, G7570)를 사용하여 leuminometer (PerkinElmer, 2104 Multilabel reader)로 세포의 수를 정량하였다.

도 7에 나타난 바와 같이, 음성 대조군으로 사용된 마우스 IgG는 암세포의 증식을 억제하는 효능이 전혀 없는 반면, huAbF46 항체는 암세포의 증식을 억제하는 효능이 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 14: 마우스 항체 AbF46 , chAbF46 및 huAbF46 의 항암 효능 확인

상기 실시예에서 제작된 AbF46의 마우스 항체, 키메릭 항체 및 인간화 항체의 항암 효능을 확인하기 위하여, 위암 세포주 MKN45 세포(일본 암연구 세포주 은행, Japanese Cancer Research Bank, JCRB, Tokyo, Japan)또는 폐암 세포주 NCI-H441 세포(ATCC Cat.# HTB-174)를 투여한 이종 이식 마우스 동물 모델을 대상으로 인 비보(in vivo)에서 상기 항체들의 투여에 의하여 종양의 크기가 감소되는지 여부를 확인하였다. 상기 3종의 항체는 모두 동일한 CDR (complimentarity determining region)을 가지고 있어 c-Met의 동일한 에피토프에 결합될 것으로 예상되는 항체들이다.

마우스 동물 모델은 3 x 10⁶개의 위암 세포주 MKN45 세포 또는 폐암 세포주 NCI-H441 세포 50 ㎕를 6주령의 웅성 BALB/C 누드 마우스(㈜ 오리엔트 바이오)에 피하주사하여 1주 경과 후에 암이 발생되는 마우스를 각 그룹당 12마리씩을 무작위 선별하여 실험에 사용하였다. 상기 3종의 항체는 암세포가 생성되고 정맥주사에 의해 10 mg/kg의 농도만큼 주 1회 마우스에 투여하였다. 또한, 대조군으로 마우스 AbF46항체는 복강주사에 의해 10 mg/kg과 20 mg/kg의 농도로 주 2회 투여하였다.

도 8에서 보는 바와 같이, 위암 세포주 MKN45 이종 이식 마우스 그룹에서 시간에 따른 종양 크기를 측정해 보았을 때, 마우스 항체 AbF46 및 chAbF46 항체는 현저한 항암 효능이 있음을 확인하였다. 실험군(마우스 항체 AbF46 및 chAbF46)과 대조군(vehicle)의 각 그룹당 마우스는 12마리이며, 각 그룹의 평균과 SEM을 표시하였다. Repeated measures ANOVA로 두 실험군과 대조군을 비교한 p-value를 별(*)표로 표시하였다 (*: p<0.05, **: p<0.01, ****: p<0.0001).

또한, 도 9에서 보는 바와 같이, 폐암 세포주 NCI-H441 이종 이식 마우스 그룹에서 시간에 따른 종양 크기를 측정해 보았을 때, 마우스 항체 AbF46 및 huAbF46 항체는 현저한 항암 효능이 있음을 확인하였다. 실험군(마우스 항체 AbF46 및 huAbF46)과 대조군(vehicle)의 각 그룹당 마우스는 15마리이며, 각 그룹의 평균과 SEM을 표시하였다. Repeated measures ANOVA로 두 실험군과 대조군을 비교한 p-value를 별(*)표로 표시하였다(*: p<0.05, ****: p<0.0001).

실시예 15: 키메릭 , 인간화 항체 chAbF46 , huAbF46 의 CDR 서열

키메릭, 인간화 항체 chAbF46, huAbF46의 중쇄 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열을 표 3에 나타내었다.

	CDR1	CDR2	CDR3
AbF46 중쇄 CDR 서열	DYYMS(서열번호 4)	FIRNKANGYTTEYSASVKG(서열번호 5)	DNWFAY (서열번호 6)
AbF46 경쇄 CDR 서열	KSSQSLLASGNQNNYLA(서열번호 7)	WASTRVS(서열번호 8)	QQSYSAPLT (서열번호 9)

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Antibodies specifically binding to epitope in SEMA domain of c-Met <130> PN094589 <160> 53 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope in SEMA domain of c-Met <400> 1 Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val 1 5 10 15 Ser Ala Leu <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope in SEMA domain of c-Met <400> 2 Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro 1 5 10 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope in SEMA domain of c-Met <400> 3 Glu Glu Pro Ser Gln 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR1 of AbF46 <400> 4 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR2 of AbF46 <400> 5 Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain CDR3 of AbF46 <400> 6 Asp Asn Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR1 of AbF46 <400> 7 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR2 of AbF46 <400> 8 Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain CDR3 of AbF46 <400> 9 Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr 1 5 <210> 10 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable region of AbF46 <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain variable region of AbF46 <400> 11 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ala Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Asn Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Met Leu Ile Ile Trp Ala Ser Thr Arg Val Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Ser Tyr Ser Ala Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 12 <211> 1416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of heavy chain of chAbF46 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_feature <222> (7)..(66) <223> signal sequence <220> <221> misc_feature <222> (67)..(417) <223> VH - heavy chain variable region <220> <221> misc_feature <222> (418)..(423) <223> NdeI restriction site <220> <221> misc_feature <222> (418)..(1407) <223> CH - heavy chain constant region <220> <221> misc_feature <222> (1408)..(1410) <223> TGA - stop sodon <220> <221> misc_feature <222> (1411)..(1416) <223> XhoI restriction site <400> 12 gaattcgccg ccaccatgga atggagctgg gtttttctcg taacactttt aaatggtatc 60 cagtgtgagg tgaagctggt ggagtctgga ggaggcttgg tacagcctgg gggttctctg 120 agactctcct gtgcaacttc tgggttcacc ttcactgatt actacatgag ctgggtccgc 180 cagcctccag gaaaggcact tgagtggttg ggttttatta gaaacaaagc taatggttac 240 acaacagagt acagtgcatc tgtgaagggt cggttcacca tctccagaga taattcccaa 300 agcatcctct atcttcaaat ggacaccctg agagctgagg acagtgccac ttattactgt 360 gcaagagata actggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagct 420 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 720 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga ctcgag 1416 <210> 13 <211> 759 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of light chain of chAbF46 <220> <221> misc_difference <222> (1)..(6) <223> EcoRI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (7)..(90) <223> signal sequence <220> <221> misc_difference <222> (91)..(432) <223> VL - light chain variable region <220> <221> misc_difference <222> (430)..(435) <223> BsiWI restriction site <220> <221> misc_difference <222> (433)..(750) <223> CL - light chain constant region <220> <221> misc_difference <222> (751)..(753) <223> stop codon <220> <221> misc_difference <222> (754)..(759) <223> XhoI restriction site <400> 13 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga gacattttga tgacccagtc tccatcctcc 120 ctgactgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca agtccagtca gagtctttta 180 gctagtggca accaaaataa ctacttggcc tggcaccagc agaaaccagg acgatctcct 240 aaaatgctga taatttgggc atccactagg gtatctggag tccctgatcg cttcataggc 300 agtggatctg ggacggattt cactctgacc atcaacagtg tgcaggctga agatctggct 360 gtttattact gtcagcagtc ctacagcgct ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 420 gagctgaaac gtacggtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tgactcgag 759 <210> 14 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of H1-heavy <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 15 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of H3-heavy <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 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<220> <223> synthetic polypeptide including core target sequence 'EDPSQ' <400> 51 Cys Gln Ile Glu Asp Pro Ser Gln Ala Pro Cys 1 5 10 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide including core target sequence 'EDPSQ' <400> 52 Cys Ile Glu Asp Pro Ser Gln Ala Pro Asp Cys 1 5 10 <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polypeptide including core target sequence 'EDPSQ' <400> 53 Cys Glu Asp Pro Ser Gln Ala Pro Asp Ala Cys 1 5 10

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
제3항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 단일클론 항체 또는 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항원 결합 단편인 것인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 c-Met 단백질은 인간, 원숭이, 마우스, 및 래트로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질로부터 유래된 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편의 약학적 유효량; 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것인 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 c-Met 단백질의 길항제(antagonist) 작용을 하는 것인 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 제3항 또는 제4항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 약학적 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편의 약학적 유효량; 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
다음의 단계를 포함하는 암의 진단, 예방 또는 치료용 후보 물질을 스크리닝하는 방법:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 c-Met 단백질의 SEMA 도메인 내의 에피토프에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 에피토프 및 시료의 결합 여부를 확인하는 단계; 상기 에피토프 및 시료가 1 pM 내지 10 nM 범위의 결합력을 보이는 경우에는 상기 시료를 암의 예방 또는 치료용 후보 물질로 판단한다.
제13항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 키트.
제15항에 있어서, 상기 암은 폐암 또는 난소암인 것인 키트.