CN102224234A

CN102224234A - α-淀粉酶混合物和使用所述混合物的方法

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Publication number: CN102224234A
Application number: CN2009801471536A
Authority: CN
Inventors: B·A·保尔森; V·夏尔马; J·舍蒂
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2008-09-25
Filing date: 2009-09-11
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2029-09-11
Also published as: EP2337837B1; MX2011003178A; DK2337837T4; US20110244526A1; EP2337837B2; JP2012503484A; CA2738447A1; WO2010036515A1; JP5419303B2; BRPI0920891A2; CA2738447C; CN102224234B; BRPI0920891B1; EP2337837A1; US8507243B2; DK2337837T3

Abstract

本发明涉及α-淀粉酶混合物，包括其中替换了S242位置处的氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)α-淀粉酶(AmyS)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶。本发明也涉及使用α-淀粉酶混合物用于淀粉液化和糖化、乙醇生产和增甜剂生产的方法。

Description

α-淀粉酶混合物和使用所述混合物的方法

相关申请的交互参考

本申请要求2008年9月25日提交的美国临时专利申请系列号61/100,092和2009年9月1日提交的美国临时专利申请系列号61/238,891的优先权，所述每个临时专利申请以其整体引入作为参考。

序列表

本文附带包含SEQ ID NO：1-20的序列表，并将序列表以其整体引入作为参考。

发明领域

本文描述了嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)α-淀粉酶和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶的混合物。本文所描述的α-淀粉酶混合物适合于多种应用例如淀粉液化和糖化、乙醇生产和/或增甜剂生产。

背景技术

α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组催化淀粉及其他线型或分支1，4-糖苷寡糖和多糖水解的酶。

淀粉酶可以商业地用于淀粉加工的初始阶段(液化)中；用于谷物湿磨工艺中；用于醇生产中；用作为洗涤剂基质中的清洁剂；在纺织工业中用于淀粉退浆；用在焙烘应用中；用于饮料工业；用于油田的钻井工艺中；用于再循环纸张的脱墨中和用于动物饲料中。

α-淀粉酶分离自多种多样的细菌、真菌、植物和动物源。许多工业上重要的α-淀粉酶分离自芽孢杆菌属的某些物种(Bacillus sp.)，部分因为芽孢杆菌属分泌淀粉酶到生长培养基中的能力普遍较高。此外，存在α-淀粉酶的混合物或其变体的需要，其可以利用来自至少两种细菌菌株的至少两种α-淀粉酶的最佳特性。

例如，由于快速的黏性降低特性，分离自嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的α-淀粉酶(AmyS)已经在燃料乙醇应用中使用。燃料乙醇工厂在浆液经历喷射蒸煮(jet cooking)步骤前具有20-30分钟的浆化时间，并且必需在这20-30分钟内破坏粘度以使浆液无障碍管流。然而，某些α-淀粉酶或其变体不是热稳定的，因此当随时间降低浆液的粘度时，它们在次级液化中经历了更低的DE斜度(DE slope)和更低的粘度降低，在所述次级液化中浆液可能保持在85-90℃直到90-120分钟。

因此，在工业中存在鉴定和优化淀粉酶和它们的混合物的需要，所述淀粉酶和它们的混合物在多种生产工艺，例如商业化淀粉液化工艺和乙醇生产工艺中是有用的。

低粘度淀粉液化物(starch liquefact)在当前的乙醇生产工艺中是有用的。如果发现了使用优化的α-淀粉酶或其变体的混合物来产生作为发酵原料的该低粘度液化物的方法，那么这对本领域将是非常有用的贡献。此外，如果发现了用来自两种不同细菌物种的α-淀粉酶或其变体的混合物处理全磨谷物以改善淀粉液化的方法，那么这对本领域也将是非常有用的贡献。

在制备发酵原料中另外的挑战是，发现来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，例如在水解线性淀粉酶中不太有效，在酵母发酵条件下造成了退变的不溶性残余淀粉。已经将在酵母发酵肉汤中的高水平残余淀粉认作为是影响蒸发器结垢的主要因素之一，所述蒸发器结垢影响乙醇工艺生产中下游工艺的运行。因此，如果发现了可以使用优化的α-淀粉酶或其变体的混合物来降低发酵肉汤中的残余不可溶性淀粉的方法，那么这对本领域也将是有用的贡献。

发明概述

描述了在发酵工艺中对全磨谷物的液化方法。方法包括将含有全磨谷物的含水浆液与来自至少两种不同细菌物种的淀粉液化α-淀粉酶的混合物接触。

在一个实施方案中，本发明包含α-淀粉酶混合物，所述α-淀粉酶混合物包含：(i)使用在SEQ ID NO：2中所示的氨基酸编号***的，其中替换了S242处氨基酸的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)；和(ii)地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。混合物可以进一步包含植酸酶。

在一个实施方案中，可以使用重量比为大约40％的具有S242替换的AmyS和大约60％的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。以这种方式，每种酶的优良特性，淀粉液化物的快速粘度降低和热稳定性，可以分别在发酵醇的方法中得到充分利用。在另一个优选的实施方案中，具有S242替换的AmyS与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的重量比为10∶90，以在制作增甜剂的方法中充分利用酶的特性。在其他的实施方案中，具S242替换的AmyS与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的重量比可以为5∶95、15∶85、20∶80、25∶75、30∶70、50∶50、60∶40、70∶30、75∶25、80∶20、85∶15、90∶10或者它们的中间值。

在另一个实施方案中，可以使用大约1400AAU/g至大约14000AAU/g的具有S242替换的AmyS和大约8000LU/g至大约19000LU/g地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的活度比率。具有S242替换的AmyS与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的比率可以为1400AAU/g∶14000LU/g、2000AAU/g∶15000LU/g、2100AAU/g∶16000LU/g、1900AAU/g∶17000LU/g或者它们的中间值。在其他实施方案中，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶与具有S242替换的AmyS的比率为大约5.5LU/AAU至大约9.5LU/AAU。地衣芽孢杆菌α-淀粉酶与具有S242替换的AmyS的活度比率在大约0.1LU/AAU至大约9.5LU/AAU的范围内。例如活度比率可以为0.1LU/AAU、0.2LU/AAU、0.3LU/AAU、0.4LU/AAU、0.5LU/AAU、1.0LU/AAU、1.5LU/AAU、2.0LU/AAU、2.5LU/AAU、3.0LU/AAU、4.0LU/AAU、5.0LU/AAU、5.5LU/AAU、6.0LU/AAU、6.5LU/AAU、7.0LU/AAU、7.5LU/AAU、8.0LU/AAU、8.5LU/AAU、9.0LU/AAU、9.5LU/AAU或者它们的中间值。

AmyS可以包含SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2的多肽序列，其中替换了S242残基。在一个优选的实施方案中，AmyS包含在SEQ ID NO：4中所述的氨基酸序列，其与

Xtra(SEQ ID NO：2)比较具有S242Q替换。在本文中，将这种酶命名为“AmyS S242Q”或者仅为“S242Q”。在另一个实施方案中，AmyS可以选自包含SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、15和16的多肽序列的AmyS酶之一，其中替换了S242残基。

S242替换可以是S242A、S242E、S242Q、S242F、S242H或者S242N替换。在一个实施方案中，在S242位置处的氨基酸替换改变了AmyS的热稳定性。具有在S242位置处替换的AmyS与在S242位置处没有替换的AmyS比较，在约80℃至约95℃之间具有更高的热稳定性。

在一个实施方案中，AmyS包含与SEQ ID NO：1的AmyS具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中AmyS具有α-淀粉酶活性。AmyS可以包含使用SEQ ID NO：1用于编号，在氨基酸位置349和428处的半胱氨酸的替换。AmyS也可以包含N193和/或V416的替换。AmyS还可以包含使用SEQ ID NO：1用于编号，在氨基酸位置179和180处的缺失。

AmyS酶与野生型AmyS比较可以具有改变的氨基酸序列，所述AmyS酶改变了一种或多种酶的特性，例如，底物特异性、底物结合、底物剪切模式、热稳定性、pH/活性谱、pH/稳定性谱、对氧化的稳定性、Ca²⁺依赖性和/或比活性。例如，与野生型AmyS比较，改变可能导致酶具有降低的Ca²⁺依赖性和/或改变的pH/活性谱和/或热稳定性。

地衣芽孢杆菌α-淀粉酶可以是纯化的野生型酶。地衣芽孢杆菌α-淀粉酶可以具有对野生型序列的选自M15T、H133Y、N188S和A209V的一个或多个氨基酸替换。在一个优选的实施方案中，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶包含显示于SEQ ID NO：20中的氨基酸序列，其也称为

FRED。在一个实施方案中，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶包含与

FRED(SEQ ID NO：20)具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

本发明进一步涉及编码本发明的酶的DNA构建体，涉及制备和纯化酶的方法，以及涉及酶在多种工业工艺，例如淀粉液化或者增甜剂生产中的用途

在一个方面中，本发明涉及使用α-淀粉酶(AA)活性和植酸水解酶(FTU或者植酸酶)水解可溶性淀粉底物，其中AAU∶FTU的比率为大约1∶15至大约15∶1，优选地从1∶10至大约10∶1。在一个实施方案中，AAU∶FTU的比率为从1∶4至3∶1。在另外的实施方案中，AAU∶FTU的比率为1∶1。植酸酶可以是来自任一来源的野生型酶。植酸水解酶可以是细菌植酸酶或者真菌植酸酶。真菌植酸酶可以是曲霉属(Aspergillus)植酸酶或者布丘氏菌属(Buttiauxella)植酸酶。在一些实施方案中，细菌植酸酶来自大肠杆菌。在一个实施方案中，植酸酶可以包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。

提供了用于液化淀粉的方法，包括将上述淀粉酶混合物添加到包含淀粉的溶液中，并液化包含淀粉的溶液。对于该应用，优选的淀粉酶混合物具有大约40％(按AAU/g DS)的具有S242替换的AmyS和大约60％(按LU/g DS)的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的活度比率。可使用用于该应用的其他比率，例如为15∶85、20∶80、30∶70、50∶50、60∶40、70∶30、80∶20和85∶15。

淀粉底物可以获自玉米、买罗高梁(milo)、黑麦、大麦、小麦、高粱或者燕麦。淀粉的其他来源包括其他谷物、牧草、块茎和根并且更具体是稻、糠、木薯(cassava)、谷子、马铃薯、甘薯和木薯粉(tapioca)。底物可以包括植物材料，例如来自干磨法或湿磨法的颗粒淀粉。该方法可以包括初级和/或次级液化步骤，包括在初级和/或次级液化步骤中添加额外的底物到浆液中。该方法可以包括使用进一步包含植酸水解酶的淀粉酶混合物。

也提供了用于糖化液化的淀粉以获得可发酵糖的方法。在一些实施方案中，该方法还包括在合适的发酵条件下发酵可发酵糖以获得终产物如醇。通过本方法产生的醇包括例如乙醇和丁醇。

在另外的方面中，本发明涉及并不需要添加酸或碱来调节pH的淀粉转化工艺和/或乙醇发酵工艺。一个实施方案涉及无pH调节的液化步骤，其中液化的pH范围为pH4.5至pH5.4，并且并不添加酸中和化学物质到液化工艺步骤中。在另一个实施方案中，液化的pH为pH4.8至pH5.8，并且并不添加酸中和化学物质到液化工艺步骤中。

在一个实施方案中，该方法包括将含有颗粒淀粉的磨碎谷物浆液与植酸水解酶和上述的α-淀粉酶混合物在比淀粉凝胶化温度低0℃至30℃的温度接触，升高温度到凝胶化温度以上，水解凝胶化的淀粉，并获得可发酵底物。

在另一方面，本发明涉及用于产生可发酵糖的方法，包括a)将磨碎的含有淀粉的材料与水和稀釜馏物混合，其中稀釜馏物是10至70％v/v范围，并且获得包含淀粉及具有20至50％w/w干固体(ds)含量的浆液，b)用植酸酶在液化淀粉之前或与之同时处理该浆液，c)液化该淀粉，d)在步骤b)期间和/或与液化步骤同时地添加上述α-淀粉酶混合物至所述淀粉和e)糖化液化的淀粉以获得可发酵糖，其中在步骤a)、b)、c)、d)或e)的任意步骤期间不调节pH。在一些实施方案中，将可发酵糖回收和纯化或异构化。在其他实施方案中，在液化步骤之前添加植酸酶。在另外的实施方案中，α-淀粉酶混合物随植酸酶一起添加。又在另外的实施方案中，在液化步骤期间添加或者在糖化步骤期间添加第二份α-淀粉酶混合物剂量。

在另外的方面，本发明涉及从含有淀粉的材料中产生醇的方法，包括液化和糖化如上所述的淀粉底物以获得可发酵糖，并在合适的发酵条件下进一步发酵可发酵糖以获得醇。在一些实施方案中，糖化和发酵步骤是同时进行的。在一些实施方案中，醇是乙醇或者丁醇。

在另外的实施方案中，上述淀粉酶混合物可以用于转化低粘度液化物成增甜剂例如葡萄糖、高果糖玉米糖浆等。用于该应用的优选的淀粉酶混合物具有大约15％(作为AAU/g DS)的具有S242替换的AmyS和大约85％(作为LU/g DS)地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的活度比率。其他比率可以用于该应用，例如5∶95、10∶90和20∶80以及它们的中间值。

用于产生增甜剂的方法可以包括将淀粉底物与上述淀粉酶混合物接触，液化淀粉底物，并高温温育底物以产生包含葡萄糖的产物。温育步骤可以是次级液化步骤。该温育步骤可以在约90-100℃例如95℃的温度进行。可以进行足够的时间的温育以使产物包含大约2-14DE的葡萄糖。在一个实施方案中，产物包含大约10DE的葡萄糖。用于产生增甜剂的方法进一步可以包括糖化产物以产生富含葡萄糖的溶液。富含葡萄糖的溶液可以包含80-99％的葡萄糖。在一个实施方案中，富含葡萄糖的溶液包含大约93-96％的葡萄糖。糖化可以包括将葡萄糖产物与葡糖淀粉酶或者酶混合物例如包含葡糖淀粉酶和支链淀粉酶的OPTIMAX^TM 4060-VHP接触。

附图简述

图1A-1D显示了通过比对可以发现的在其他亲本

Xtra样α-淀粉酶中相对应的位置。应当指出，SEQ ID NO：4是AmyS S242Q。AmyS S242A、AmyS S242E分别为所述的SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5。

图2显示了pHPLT-AmyS质粒。

图3显示了S242文库变体在95℃热应激30分钟后的残余活性百分比。变体在P、S、W和Y位置处缺失并通过野生型AmyS(“wt”)替代。

Xtra对照标记为“Z”。另一阳性对照，具有Δ179-180缺失和C末端29个氨基酸截短的AmyS(SEQ ID NO：16)也显示了(“$”)。S242A和S242Q比野生型明显显示出更高的残余活性。

图4A-4I显示了SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：14的配对比对。

图5显示在没有钙添加的情况下野生型和淀粉酶变体的热熔融曲线和熔点。

图6显示在有钙的情况下野生型和淀粉酶变体的热熔融曲线和熔点。

图7显示

Xtra和两种变体相对于Liquozyme SC在3个时间点的活性断面图。

图8显示因30μg剂量的α-淀粉酶Liquozyme SC、

Ethyl或

Xtra的作用所致的谷物粉粘度降低。

图9显示因30μg剂量的α-淀粉酶Liquozyme SC或

Xtra或两种变体(S242A和S242Q)之一的作用所致的谷物粉粘度降低。

图10显示因20μg剂量的α-淀粉酶Liquozyme SC或

图11显示用Liquozyme SC、

Xtra或两种变体(S242A和S242Q)之一经过一段时间(0、30、60和90分钟)处理的全磨谷物的DE进展。

图12显示用Liquozyme SC、

Xtra或两种变体(S242A和S242Q)之一经过一段时间(0、30、60和90分钟)处理的全磨谷物的喷射之后粘度。

图13显示用AmyS S242Q(SEQ ID NO：4)和

FRED的混合物以及单独的每种酶在85-90℃经过一段时间(30、60、90和120分钟)在分批液化工艺中处理全磨谷物的DE进展。

图14显示用AmyS S242Q(SEQ ID NO：4)和

FRED的混合物以及单独的每种酶在85-90℃经过一段时间(30、60、90和120分钟)在分批液化工艺中处理全磨谷物的浆液粘度。

图15显示在SEQ ID NO：20中描述的

FRED的氨基酸序列。

图16显示来自使用AmyS S242Q(SEQ ID NO：4)和

FRED的混合物的淀粉底物的DE进展。

发明详述

提供了亲本嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体和来自地衣芽孢杆菌的热稳定性α-淀粉酶的混合物。在一个优选的实施方案中，α-淀粉酶混合物含有按活性为AAU/g DS的至少大约50％的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体酶。优选的范围是按活性为AAU/g DS的大约10％至大约90％的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体酶。在一个尤其优选的实施方案中，将使用大约10％至大约70％(按AAU/g DS)的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶和大约30％至大约90％(按LU/g DS)的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的活度比率，以使每一菌株的优良特性，即淀粉液化物的快速粘度降低和热稳定性，分别得以利用。

亲本嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体和来自地衣芽孢杆菌的热稳定性α-淀粉酶的混合物具有与加工淀粉液化物有关的其他有利的特性，例如DS水平、pH、钙含量、以及液化和蒸煮温度。例如，在某些实施方案中，DS水平的范围可以为大约32％至大约40％，或者更高。在另一方面，淀粉液化物中的pH的范围可以为大约pH5.5至大约pH6.0。钙水平的范围可以多达大约10ppm添加的钙。T_jet的范围可以为大约100℃至大约110℃，而T_hold的范围可以为大约85℃至大约95℃。这些工艺可以包括淀粉液化至产生增甜剂例如葡萄糖糖浆，例如高果糖玉米糖浆。尽管这些工艺更特别地应用于增甜剂的生产，但是在一些实施方案中，该工艺可以应用于发酵原料的生产。因此，如下更详细的说明，产生为发酵原料的液化物可以用于发酵工艺中以产生有用的终产物，包括乙醇和丁醇。

在一些方面，本发明依赖于遗传工程和分子生物学领域中使用的常规技术和方法。以下资源包括对根据本发明有用的一般方法学的描述：Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(第二版，1989)；Kreigler，GENE TRANSFER AND EXPRESSION；A LABORATORY MANUAL(1990)和Ausubel等人编著，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)。这些通用参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。然而，不意图使本发明限于所描述的任何具体方法、方案和试剂，因而这些可以变动。

除非本文另外定义，本文中所用的全部技术术语及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同意义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第2版，John Wiley and Sons，New York(1994)；以及Hale和Markham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)向技术人员提供了本发明中所使用的众多术语的通用字典。

尽管可以在实施或检验本发明中使用与本文中所述的那些方法和材料相似或等同的任意方法和材料，然而描述了优选的方法和材料。

现在本发明将仅通过引用的方式使用以下定义和实施例进行详细的说明。通过引用的方式明确并入全部专利和出版物，包括此类专利和出版物中公开的全部序列，作为参考。

数字范围包括定义该范围的数字在内。

除非另外说明，分别将核酸序列从左至右以5’至3’方向显示；将氨基酸序列从左至右以氨基至羧基方向显示。

本文中提供的标题不限制本发明的多个方面或实施方案，可以将其以整体引入本说明书，作为参考。

定义

如本文中所用，术语“淀粉”指包含植物的复杂多糖碳水化合物的任意物质，其包含具有式(C₆H₁₀O₅)_x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任意数字。具体而言，该术语指来自包括但不限于谷物、牧草、块茎和根并且更具体地来自小麦、大麦、玉米、黑麦、燕麦、高梁、买罗高梁、稻、高粱、糠、木薯(cassava)、谷子、马铃薯、甘薯和木薯粉(tapioca)的任一基于植物物质的直链淀粉和/或支链淀粉。

术语“α-淀粉酶(例如EC 3.2.1.1类)”指催化α-1，4-糖苷键水解的酶。也已经将这些酶描述为在含有1，4-α-连接的D-葡萄糖单位的多糖中实现1，4-α-D糖苷键的外切水解或者内切水解的那些酶。用于描述这种酶的另一术语是“糖原酶”。示例性酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水化酶(alpha-1，4-glucan 4-glucanohydrase)葡聚糖水解酶(glucanohydrolase)。

当涉及细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”指通过导入异源核苷酸或蛋白质或者改变天然核苷酸或蛋白质而被修饰的细胞、核酸、蛋白质或载体，或从如此修饰的细胞衍生的细胞。因而，例如，重组细胞表达在该细胞的天然(非重组)形式中不存在的基因或可以表达本来异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换地使用。本文中使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。

“信号序列”意指与蛋白质的氨基端部分结合的氨基酸序列，所述氨基酸序列促进该蛋白质的成熟形式分泌到细胞外。信号序列的定义是功能性的。胞外蛋白的成熟形式缺少在分泌过程期间被切除的信号序列。

“基因”指参与产生多肽的DNA区段并包括在编码区之前及之后的区域以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

术语“核酸”包括DNA、RNA、它们的单链或双链和化学修饰物。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文可互换地使用。因为遗传密码是简并的，所以多个密码子可以用于编码特定的氨基酸，并且本发明包括编码特定氨基酸序列的多核苷酸。

“载体”指设计的将核酸导入一种或多种细胞类型的核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。

如本文中所用的“表达载体”意指包含与适宜调控序列有效连接的DNA序列的DNA构建体，其中所述的调控序列能够实现该DNA在合适宿主中的表达。此类调控序列可以包括实现转录的启动子、控制转录的任选操纵基因序列、编码mRNA上的合适核糖体结合位点的序列、增强子和控制转录及翻译终止的序列。

“启动子”是参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的调节序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。在本发明中使用的优选的启动子是诱导型启动子里氏木霉(Trichoderma reesei)cbh1。

“在转录调控下”是本领域熟知的术语，指多核苷酸序列通常是DNA序列的转录取决于与其有效连接的元件，所述元件有助于转录的起始或者促进转录。

“在翻译调控下”是本领域熟知的术语，指在mRNA已经形成后发生的调节过程。

如本文中所用，当描述蛋白质和编码它们的基因时，用于该基因的术语一般用斜体(例如，编码amyL(地衣芽孢杆菌AA)的基因可以表示为amyL)。用于蛋白质的术语一般不用斜体并且首字母通常大写(例如，由amyL基因编码的蛋白质可以表示为AmyL或amyL)。

术语“衍生的”包括术语“源自”、“获得”或“从......可获得”和“从......分离”。

术语“有效连接的”指这样的接近，其中诸元件处在允许它们功能性地联系的排列中。例如，如果一个启动子能够控制序列的转录，则该启动子与此编码序列有效连接。

术语“选择标记”指这样的基因，该基因能够在宿主中表达并允许容易地选择含有导入了核酸或载体的那些宿主。选择标记的例子包括但不限于抗微生物物质(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势如营养优势的基因。

多核苷酸或多肽与另一个序列具有某个序列同一性百分数(例如80％、85％、90％、95％或99％)意指当比对时，在比较的这两个序列中碱基或氨基酸残基是相同的时的百分数。可以使用本领域已知的任意合适软件程序例如CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.等人(编著)1987，附录30，第7.7.18部分)中描述的那些软件程序确定这种比对结果和同源性或同一性百分数。优选的程序包括Vector NTI Advance^TM 9.0(Invitrogen Corp.Carlsbad，CA)、GCG Pileup、FASTA (Pearson等人(1988)Proc.Natl，Acad.Sci USA 85：2444-2448)和BLAST(BLAST Manual，Altschul等人，Natl Cent.Biotechnol.Inf.，Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH)，Bethesda，Md.和Altschul等人，(1997)NAR25：3389-3402)程序。另一种优选的比对程序是优选地使用默认参数的ALIGN Plus(Scientific and Educational Software，PA)。可使用的另一种序列软件程序是在序列软件包6.0版(Sequence Software Package Version6.0)(威斯康星州麦迪逊威斯康辛大学Genetics Computer Group)中可获得的TFASTA数据搜索程序。

本领域技术人员会认识到由本发明包括的序列也可以通过严格的杂交条件下与所例举的amyS序列(例如WO 06/002643的SEQ ID NO：5)杂交的能力进行定义。当单链形式的核酸可以在适宜的温度和溶液离子强度条件下与另一种核酸复性时，则该核酸可与另一种核酸序列是可杂交的。杂交和洗涤条件是本领域熟知的(见，例如上文的Sambrook(1989)，尤其第9和11章)。在一些实施方案中，严格条件对应于65℃的Tm和0.1×SSC，0.1％SDS。

“宿主菌株”或“宿主细胞”意指用于表达载体或DNA构建体的合适宿主，所述表达载体或DNA构建体包含编码根据本发明的变体α-淀粉酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是细菌细胞。在本发明的一个优选的实施方案中，“宿主细胞”意指从微生物株特别是芽孢杆菌属的某些物种的细胞产生的细胞和原生质体。

术语“培养”指在合适的条件下在液体或者固体培养基中培育微生物细胞群体。在一个实施方案中，培养指将含有淀粉底物的颗粒淀粉发酵性生物转化成终产物(一般在容器或反应器中)。发酵是由微生物酶促地和厌氧地分解有机物质以产生更简单的有机化合物。尽管发酵在厌氧的条件下进行，然而意图该术语应当不限于严格厌氧条件，因为发酵也在氧存在下发生。

术语“接触”指将分别的酶放置在足够靠近各自的底物的地方以使酶能转化底物成终产物。本领域技术人员将会理解，酶与各自的底物的混合溶液可以实现接触。

术语“酶转化”一般指通过酶作用修饰底物。如本文中所用的该术语也指通过酶的作用修饰淀粉底物。

如本文中所用，术语“糖化”指淀粉经酶转化成葡萄糖或者其他低分子量多糖。

术语“凝胶化”意指增溶淀粉分子，通过蒸煮以形成粘性混悬液。

术语“液化”指淀粉转化中水解凝胶化淀粉以产生低分子量可溶性糊精的阶段。

术语“聚合程度(DP)”指给定糖中脱水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的例子是单糖类，如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖类，如麦芽糖和蔗糖。DP＞3指具有大于3的聚合程度的聚合物。

术语“终产物”或“目的终产物”指从淀粉底物以酶方式转化而来的任一碳源来源的分子产物。

如本文中所用，术语“酶单位”指在测定法的条件下每给定的时间量产生给定的产物量的酶的量。在一些实施方案中，酶单位指在特定的测定法条件下每分钟产生1微摩尔的产物的酶的量。例如，在一个实施方案中，术语“葡糖淀粉酶活性单位”(GAU)定义为在pH 4.2和60℃的测定法条件下每小时从可溶性淀粉底物(4％ds)产生1g葡糖糖所需的酶的量。

α-淀粉酶活性(AAU)通过淀粉水解的速率测定，其反映为分光光度测量的碘着色能力降低的速率。细菌α-淀粉酶活性的一个AAU是在标准条件下每分钟水解10mg的淀粉所需的酶的量。

α-淀粉酶活性也可以测定为可溶性淀粉单位(SSU)，并且基于酶样品的等份试样在pH 4.2、50℃水解可溶性马铃薯淀粉底物(4％DS)的程度。还原糖含量使用如在Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31：426-428中所述的DNS方法测量。

以Liquefon单位(LU)表示的α-淀粉酶活性根据在USP 5,958,739中公开的方法测量。简言之，该测定方法使用对硝基苯麦芽七糖苷作为底物，该底物具有化学封闭的非还原性末端糖。对硝基苯释放的速率与α-淀粉酶活性成比例并在410nm监测释放。对比标准对照计算活性。

如本文中所用，术语“干固体含量”(ds)指基于干重量的以％表示的浆液总固体。术语“浆液”指含有不溶性固体的含水混合物。

术语“残余淀粉”指含淀粉的底物发酵后组合物中留下的任何残留(可溶性或不可溶性)淀粉。

如本文中所用，“再循环步骤”指糖化醪组分的再循环，所述糖化醪组分可以包括残余淀粉、酶和/或微生物至包含淀粉的发酵底物。

术语“糖化醪(mash)”指水中用来产生发酵产物如醇的可发酵碳源(碳水化合物)的混合物。在一些实施方案中，术语“发酵醪(beer)”和“糖化醪”可互换地使用。

术语“釜馏物”意指未发酵的固体与水的混合物，其是从发酵的糖化醪去除醇后的残余物。

术语“蒸馏器干酒糟(distillers dried grain；DDG)”和“具有可溶物的蒸馏器干酒糟(distillers dried grain with solubles；DDGS)”指谷物发酵的有用副产物。

如本文中所用，“产乙醇微生物”指具有将糖或者寡糖转化成乙醇的能力的微生物。产乙醇微生物因其表达单独地或共同将糖转化成乙醇的一种或多种酶的能力而具有产乙醇性。

如本文中所用，“乙醇生产者”或“产乙醇微生物”指能够从己糖或戊糖产生乙醇的任何生物或细胞。通常，产乙醇细胞含有醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。产乙醇微生物的例子包括真菌微生物如酵母。优选的酵母包括酵母属(Saccharomyces)菌株，特别是酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株。

就多核苷酸或蛋白质而言，术语“异源的”指不天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是商业重要的工业用蛋白质。该术语意图包括由天然存在的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。

就多核苷酸或蛋白质而言，术语“内源的”指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

如本文中所用，术语“回收的”、“分离的”和“分开的”指从与其天然关联的至少一种组分中移出的化合物、蛋白质、细胞、核酸或者氨基酸。

如本文中所用，术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”就细胞而言使用时，意指该细胞具有整合到其基因组中作为经多个世代仍保留的附加型质粒的非天然(例如异源的)核酸序列。

如本文中所用，术语“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。

在核酸序列***细胞中的上下文中，术语“导入”意指“转染”、“转化”或“转导”并且包括对核酸序列掺入真核或原核细胞的谈及，其中所述核酸序列可以掺入该细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，被转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。

如本文中所用，术语“比活性”意指一种酶单位，其定义为在特定条件下每单位时间由酶制备物转换成产物的底物的摩尔数。比活性表示为单位(U)/mg的蛋白质。

术语“产量”指使用本发明的方法所产生的终产物或目的终产物的量。在一些优选的实施方案中，该产量大于使用本领域已知方法所产生的产量。在一些实施方案中，该术语指终产物的体积，并且在其他实施方案中，该术语指终产物的浓度。

“ATCC”指位于弗吉尼亚州Manassas 20108的美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

“NRRL”指美国伊利诺伊州皮奥里亚县，国家农业应用研究中心，农业研究培养物保藏中心(并且以前称为USDA北部地区研究实验室)。

“一个”、“一种”和“该”包括复数称谓，除非上下文另外清楚地说明并非如此。

如本文中所用术语“包含”及其关联词以其包含……在内的意义使用；即，等同于术语“包括”及其对应的关联词。

命名

在本说明书和权利要求书中，使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。出于引用方便，本发明的α-淀粉酶变体由以下命名描述：

原始氨基酸：位置：替换的氨基酸

根据这种命名，例如将第242位置处用丙氨酸替换丝氨酸显示为：

Ser242Ala或S242A

将第30位置处的丙氨酸缺失显示为：

Ala30^＊或A30^＊或ΔA30

并且将额外氨基酸残基如赖氨酸的***显示为：

Ala30AlaLys或A30AK

氨基酸残基连续区段(如氨基酸残基30-33)的缺失显示为(30-33)＊或Δ(A30-N33)。

在特定α-淀粉酶与其他α-淀粉酶相比含有“缺失”并且在该位置内产生***的情况下，对于在第36位置***天冬氨酸而言，这表示为

^＊36Asp或^＊36D

多个突变由加号隔开，即：

Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S

代表在30和34位置中将丙氨酸和谷氨酸分别替换为天冬酰胺和丝氨酸的突变。

当可以在一个给定位置***一个或多个备选氨基酸残基时，它表示为：

A30N，E或者，A30N或A30E。

另外，当本文中鉴定到适合修饰的位置而未指出任何具体的修饰时，应当理解任意氨基酸残基可以替换该位置内存在的氨基酸残基。因而，例如，当提到修饰在第30位置处的丙氨酸，但不具体说明时，应当理解该丙氨酸可以缺失或替换为任何其他氨基酸，即，以下任一氨基酸：

R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。

另外，“A30X”意指以下的任一替换：A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y或A30V；或简写为：

A30R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。

如果用于编号的亲本酶已经在该位置处具有建议替换的所讨论氨基酸残基，则使用以下的命名：

在例如一个N或V存在于野生型中的情况下，为“X30N”或“X30N，V”。

因此，其意为其他相应的亲本酶在位置30被替换成“Asn”或“Val”。

氨基酸残基的特征

带电荷的氨基酸：

Asp、Glu、Arg、Lys、His

带负电荷的氨基酸(负电荷最多的残基排在首位)：

Asp、Glu

带正电荷的氨基酸(正电荷最多的残基排在首位)：

Arg、Lys、His

中性氨基酸：

Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Asn、Gln、Ser、Thr、Pro

疏水性氨基酸残基(疏水性最强的残基排在最后)：

Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、Ile、Tyr、Phe、Trp，

亲水性氨基酸(亲水性最强的残基排在最后)：

Thr、Ser、Cys、Gln、Asn。

α-淀粉酶

该淀粉酶混合物包含AmySα-淀粉酶和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。AmyS酶可以包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的多肽序列，其中替换了S242。在一个优选的实施方案中，AmyS包含在SEQ ID NO：4中所述的氨基酸序列，也称为“AmyS S242Q”或“S242Q”，其与

Xtra(SEQ ID NO：2)比较具有S242Q替换。在另一个实施方案中，AmyS可以选自包含SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、15和16的多肽序列的AmyS酶之一，其中替换了S242残基。

S242替换可以是S242A、S242E、S242Q、S242F、S242H或者S242N替换。在一个实施方案中，在S242位置处的氨基酸替换改变了AmyS的热稳定性。具有在S242位置处替换的AmyS与不具有S242替换的AmyS比较，可以具有在大约80℃至大约95℃之间的更高的热稳定性。

在一个实施方案中，AmyS包含具有与SEQ ID NO：1的AmyS至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或者99％序列同一性的氨基酸序列，其中AmyS具有α-淀粉酶活性。使用SEQ ID NO：1用于编号，AmyS可以包含在氨基酸349和428处的半胱氨酸的替换。AmyS也可以包含N193和/或V416的替换。使用SEQ ID NO：1的编号，AmyS也可以包含氨基酸179和180的缺失。

与野生型AmyS比较，具有改变的氨基酸序列的AmyS酶改变了酶的一种或多种特性，例如，底物特异性、底物结合、底物剪切模式、热稳定性、pH/活性谱、pH/稳定性谱、对氧化的稳定性、Ca²⁺依赖性和/或比活性。例如，与野生型AmyS比较，改变可能导致酶具有降低的Ca²⁺依赖性和/或改变的pH/活性谱和/或热稳定性。

由芽孢杆菌属某些物种产生的多种α-淀粉酶在氨基酸水平是高度同源(同一)的。

可以在下表1中找到多种已知芽孢杆菌α-淀粉酶的同一性百分数。

表1同一性百分数

	707	AP1378	BAN	BSG	SP690	SP722	AA560	LAT
									707	100.0	86.4	66.9	66.5	87.6	86.2	95.5	68.1
AP1378	86.4	100.0	67.1	68.1	95.1	86.6	86.0	69.4
									BAN	66.9	67.1	100.0	65.6	67.1	68.8	66.9	80.7
BSG	66.5	68.1	65.6	100.0	67.9	67.1	66.3	65.4
									SP690	87.6	95.1	67.1	67.9	100.0	87.2	87.0	69.2
SP722	86.2	86.6	68.8	67.1	87.2	100.0	86.8	70.8
									AA560	95.5	86.0	66.9	66.3	87.0	86.8	100.0	68.3
LAT	68.1	69.4	80.7	65.4	69.2	70.8	68.3	100.0

例如，已经发现包含显示于SEQ ID NO：7中的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT)与包含显示于SEQ ID NO：9中的氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶约81％同源并且与包含显示于SEQ ID NO：1中的氨基酸序列的嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(BSG)约65％同源。其他同源α-淀粉酶包括WO 95/26397中公开的SP690和SP722，以及由Tsukamoto等人，Biochemical and Biophysical Research Communications，151(1988)，第25-31页描述的SEQ ID NO：6所示从芽孢杆菌属某些物种衍生的#707α-淀粉酶。

KSM AP1378α-淀粉酶在WO 97/00324中公开(来自KAO公司)。

其他同源的α-淀粉酶包括由EP 0252666中描述的地衣芽孢杆菌菌株产生的α-淀粉酶、(ATCC 27811)和在WO 91/00353和WO 94/18314中鉴定的α-淀粉酶。其他商业

Xtra-样α-淀粉酶包含于按以下商品名称出售的产品中：

AA和Ultraphlow(从Danisco US Inc，Genencor Division可获得)和Keistase^TM(从Daiwa可获得)和Liquezyme SC(从丹麦Novozymes可获得)。

由于在这些α-淀粉酶之间发现的实质同源性，认为它们属于同一类α-淀粉酶，即“

Xtra-样α-淀粉酶”类。

因此，在本上下文中，术语“

Xtra-样α-淀粉酶”意图指在氨基酸水平针对本文中具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的α-淀粉酶显示实质同一性的α-淀粉酶，特别地指芽孢杆菌属α-淀粉酶，尤其指嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)α-淀粉酶。从Danisco US Inc的Genencor分公司可商业地获得

Xtra(SEQ ID NO：2)。嗜热脂肪土芽孢杆菌已经在文献中称作嗜热脂肪芽孢杆菌并且这二者可以在本文中互换地使用。

换而言之，具有本文中SEQ ID NO：1、6、7、8、9、10、11、12、15和16所示氨基酸序列的全部以下α-淀粉酶视为“

Xtra-样α-淀粉酶”。其他

Xtra-样α-淀粉酶是这样的α-淀粉酶i)显示出与SEQ ID NO：1、6、7、8、9、10、11、12、15和16中所示氨基酸序列至少之一显示至少60％同源性(同一性)，如至少70％、如至少75％或至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性(同一性)的氨基酸序列和/或由这样的DNA序列编码，其中所述DNA序列与编码以上所述的明显来自WO 06/002643的SEQ ID NO：9(BAN)、5(BSG)、3(SP722)、1(SP690)、7(LAT)、11(AA560)中的α-淀粉酶的DNA序列和本说明书(其编码本文分别在SEQ ID NO：1、6、7、8、9、10、11、12、15和16中所示的氨基酸序列的序列)的那些DNA序列杂交。

另一来自地衣芽孢杆菌的有用的α-淀粉酶是从Danisco US Inc的Genencor分公司可商业地获得的

FRED(SEQ ID NO：20)。这种α-淀粉酶在本文中指

FRED或者“Fred”(SEQ ID NO：20)。

同源性(同一性)

同源性可以作为两个序列之间的同一性程度确定，表示第一序列从第二序列衍生。同源性可以通过本领域已知的计算机程序如在(上文描述的)GCG程序包中提供的GAP确定。因而，可以使用Gap GCG v8，采用同一性的默认评分矩阵和以下默认参数：对于核酸序列比较而言，空位创建罚分5.0和空位延伸罚分0.3，并且对于蛋白质序列比较而言，空位创建罚分3.0和空位延伸罚分0.1。GAP使用Needleman和Wunsch，(1970)，J.Mol.Biol.48：443-453的方法以进行比对并计算同一性。

在

Xtra(SEQ ID NO：2)与例如另一种α-淀粉酶之间的结构性比对可以用来鉴定其他

Xtra-样α-淀粉酶中的等同/对应位置。获得所述结构性比对的一种方法是使用来自GCG软件包的Pile Up程序，利用空位罚分的默认值，即，空位创建罚分3.0和空位延伸罚分0.1。其他结构性比对方法包括疏水簇分析法(Gaboriaud等人，FEBSLETTERS.224：149-155，1987)和反向穿线法(reverse threading)(Huber，T；Torda，AE，Protein Science.7(1)：142-149，1998)。

杂交

在表征以上

Xtra-样α-淀粉酶中使用的寡核苷酸探针可以基于所讨论α-淀粉酶的全部或部分核苷酸或氨基酸序列适宜地制备。

测试杂交的合适条件涉及在5X SSC中预浸泡并在40℃于20％甲酰胺，5X Denhardt溶液，50mM磷酸钠，pH 6.8和50mg超声处理的变性小牛胸腺DNA的溶液中预杂交1小时，随后在40℃于补充有100mMATP的相同溶液中杂交18小时，随后在40℃(低严格性)、优选地在50℃(中等严格性)、更优选地在65℃(高严格性)、甚至更优选地在75℃(非常高严格性)于2X SSC，0.2％SDS中洗涤滤膜3次，30分钟。关于杂交方法的更多细节可以在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989中找到。

在本上下文中，“从......衍生”不仅意图指由所讨论的生物菌株产生或可产生的α-淀粉酶，还指由分离自该菌株的DNA序列编码和在用所述DNA序列转化的宿主生物中产生的α-淀粉酶。最后，该术语意图指由合成和/或cDNA来源的DNA序列编码并具有所讨论α-淀粉酶的鉴别性特征的α-淀粉酶。该术语也意指亲本α-淀粉酶可以是天然存在α-淀粉酶的变体，即这样的变体，它是修饰(***、替换、缺失)天然存在α-淀粉酶的一个或多个氨基酸残基的结果。

改变的特性

以下部分描述突变之间的关系，其中所述突变存在于本文中所述的变体中并且是可以从其产生(相对于亲本Xtra-样α-淀粉酶的那些特性而言)想要的特性改变。

如上所提及，本发明涉及具有改变的特性的

Xtra-样α-淀粉酶。

与经过具体构思的改变特性有关的具体构思的亲本

Xtra-样α-淀粉酶是上述亲本

Xtra-样α-淀粉酶和亲本杂合

Xtra-样α-淀粉酶。

使用嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO：2)作为起点，但是在例如SP722、BLA、BAN、AA560、SP690、KSM AP1378、#707和其他芽孢杆菌属α-淀粉酶中的对应位置也应当理解为是公开的和具体构思的。

在一个方面，本公开涉及了具有如上所述的改变特性的变体。

在第一个方面，亲本嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，该变体在选自(使用例如SEQ ID NO：1用于氨基酸编号的)以下位置的一个或多个位置处包含改变：

P17、D19、T21、N28、S51、G72、V74、A82、Q86、Q89、A93、G95、Q97、W115、D117、P123、S124、D125、N127、I130、G132、Q135、P145、G146、G148、S153、Y159、W166、S169、K171、W187、P209、N224、S242、G256、D269、N271、T278、N281、G302、A304、R308、T321、Q358、P378、S382、K383、T398、H405、T417、E418、P420、G421、P432、W437、G446、G454、S457、T459、T461、S464、G474、R483。

其中

(a)所述改变独立地

(i)***占据该位置的氨基酸下游的氨基酸；

(ii)缺失占据该位置的氨基酸；或

(iii)用不同的氨基酸替换占据该位置的氨基酸，

(b)该变体具有α-淀粉酶活性，并且

(c)每个位置对应于具有SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的亲本嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列的位置。

本文中具体构思了S242A、S242Q、S242N和S242E。

额外地，选择残基R179、G180、I181、G182和K183以探索钙-钠结合区中突变的效果并且因为在α-螺旋中央的脯氨酸是不寻常的，故选择P245。

可以通过如上所述的比对和在图4中比对结果中所示的比对找到其他亲本

Xtra-样α-淀粉酶中的对应位置。因而，在第二个方面，本文中构思了在一个或多个以上列举的位置(使用例如SEQ ID NO：1用于氨基酸编号)处包含改变的亲本

Xtra-样α-淀粉酶的变体。

稳定性

在本文中所述变体的上下文中，就实现改变的稳定性、尤其改善的稳定性(即更高或更低)，在尤其高的温度(即70-120℃)和/或极端pH(即低或高pH，即分别是pH 4-6或pH 8-11)，尤其在低于60ppm的游离(即未结合的，因而在溶液中的)钙浓度而言，重要的突变(包括氨基酸替换和缺失)包括在“改变的特性”部分中所列出的任意突变。可以如下文“方法”部分中所述确定稳定性。

Ca²⁺稳定性

改变的Ca²⁺稳定性意指已经改善酶在Ca²⁺耗竭下的稳定性，即，更高或更低的稳定性。在本文中所述变体的上下文中，就实现改变的Ca²⁺稳定性、尤其改善的Ca²⁺稳定性，即，更高或更低的稳定性，尤其在高pH(即pH 8-10.5)而言，重要的突变(包括氨基酸替换和缺失)包括在“改变的特性”部分中所列出的任意突变。

比活性

在又一方面，就获得变体而言，重要的突变(包括氨基酸替换和缺失)包括在“改变的特性”部分中所列出的任意突变，其中所述的变体展示改变的比活性，尤其提高或降低的比活性，尤其在10-60℃的温度、优选20-50℃、尤其30-40℃。可以如下文“方法”部分中所述确定比活性。

氧化稳定性

与亲本α-淀粉酶相比，所描述的变体可以具有改变的氧化稳定性，尤其是更高的氧化稳定性。提高的氧化稳定性在例如洗涤剂组合物中是有利的，并且降低的氧化稳定性可能在用于淀粉液化的组合物中是有利的。可以如下文“方法”部分中所述确定氧化稳定性。

改变的pH谱

就获得变体而言，重要的位置和突变包括靠近活性中心残基存在的氨基酸残基的突变，其中所述变体具有改变的pH谱，特别地在尤其高的pH(即pH 8-10.5)或低的pH(即pH 4-6)时改善的活性。

优选的特定突变/替换包括上文在“改变的特性”部分中对所讨论位置列出的那些突变/替换。在下文“方法”部分中描述合适的测定法。

洗涤性能

就获得变体而言，重要的位置和突变包括上文在“改变的特性”部分中对所讨论位置列出的特定突变/替换，其中所述变体在尤其高的pH(即pH8.5-11)时具有改善的洗涤性能。可以如下文“方法”部分中所述测试洗涤性能。

本发明变体中的一般突变

在一个实施方案中，除了上文概述的那些修饰之外，本文中所述的变体还可以包含一个或多个修饰。因而，可能有利的是将被修饰的α-淀粉酶变体的部分中存在的一个或多个脯氨酸残基(Pro)替换为非脯氨酸残基，其中所述的非脯氨酸残基可以是可能的、天然存在的非脯氨酸残基中的任一氨基酸残基，并且优选地是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸或亮氨酸。

类似地，在一个实施方案中，可以将亲本α-淀粉酶中存在的一个或多个半胱氨酸残基替换为非半胱氨酸残基，如丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸。

应当理解，本发明包括掺入两个或更多个上文所概述的修饰的变体。

另外，可能有利的是在一个或多个以下位置(使用SEQ ID NO：7用于编号)导入突变：

M15、V128、A111、H133、W138、T149、M197、N188、A209、A210、H405、T412，尤其以下的单一、二重、三重或多重突变：

M15X，尤其M15T，L；

V128X，尤其V128E；

H133X，尤其H133Y；

N188X，尤其N188S，T，P；

M197X，尤其M197T，L；

A209X，尤其A209V；

M197T/W138F；M197T/138Y；M15T/H133Y/N188S；

M15N128E/H133Y/N188S；E119C/S130C；D124C/R127C；H133Y/T149I；

G475R，H133Y/S187D；H133Y/A209V。

在亲本α-淀粉酶具有SEQ ID No.7中所示氨基酸序列的情况下，可以被缺失或替换以改善氧化稳定性的相关氨基酸残基包括SEQ ID NO：2中的单一半胱氨酸残基(C363)和位于M8、M9、M96、M200、M206、M284、M307、M311、M316和M438位置内的甲硫氨酸残基。

就提高α-淀粉酶变体相对于其亲本α-淀粉酶的热稳定性而言，似乎特别希望在SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列中缺失至少一个并且优选地缺失2个或甚至3个下列氨基酸残基：F178、R179、G180、I181、G182和K183。

特别感兴趣地，这种类型的成对缺失是R179^＊+G180^＊；和I181^＊+G182^＊(分别是SEQ ID No.16或15)(或在满足本公开上下文中亲本α-淀粉酶要求的另一个α-淀粉酶中这些成对缺失的等同物)。

其他目的残基包括SEQ ID No.2中所示氨基酸序列中的N193F和V416G。

制备α-淀粉酶变体的方法

用于导入突变至基因中的几种方法是本领域已知的。在简要讨论克隆α-淀粉酶编码DNA序列后，将讨论用于在α-淀粉酶编码序列内部特定位点处产生突变的方法。

克隆编码α-淀粉酶的DNA序列

编码亲本α-淀粉酶的DNA序列可以使用本领域熟知的多种方法从产生所讨论α-淀粉酶的任意细胞或微生物分离。首先，应当使用来自产生待研究α-淀粉酶的生物的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。然后，如果该α-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，则可以合成并使用同源的标记寡核苷酸探针以从基因组文库鉴定编码α-淀粉酶的克隆，其中所述的基因组文库从所讨论生物制备。备选地，可以使用含有与已知α-淀粉酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针作为探针来鉴定编码α-淀粉酶的克隆，使用低严格性的杂交和洗涤条件。

用于鉴定编码α-淀粉酶的克隆的另一种方法是涉及将基因组DNA片段***表达载体如质粒，用所得基因组DNA文库转化α-淀粉酶阴性细菌然后将转化的细菌涂布在含有α-淀粉酶底物的琼脂上，因而允许鉴定表达α-淀粉酶的克隆。

备选地，编码所述酶的DNA序列可以通过已建立的标准方法合成地制备，例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)描述的亚磷酰胺法或Matthes等人(1984)描述的方法。在亚磷酰胺方法中，将寡核苷酸合成，例如在自动DNA合成仪中，纯化、复性、连接和在适宜载体中克隆。

最后，DNA序列可以是混合基因组和合成来源的、混合合成和cDNA来源的或混合基因组和cDNA来源的，其根据标准技术，通过连接合成的、基因组的或cDNA来源的片段(根据需要，与整个DNA序列的多个部分相对应的片段)制备。DNA序列也可以通过使用特异性引物的聚合酶链反应(PCR)，例如如美国专利号4,683,202或R.K.Saiki等人(1988)中所述的PCR制备。

定点诱变

一旦已经分离编码α-淀粉酶的DNA序列并鉴定了用于突变的所需位点，则可以使用合成的寡核苷酸导入突变。这些寡核苷酸含有在所需突变位点侧翼的核苷酸序列；将突变核苷酸在寡核苷酸合成期间***。在一个具体方法中，在携带α-淀粉酶基因的载体中产生跨接编码α-淀粉酶的序列的DNA单链缺口。随后，携带所需突变的合成性核苷酸与单链DNA的同源部分复性。仍存在的缺口随后用DNA聚合酶I(克列诺片段)补平并使用T4连接酶连接构建体。这种方法的具体例子在Morinaga等人(1984)中描述。美国专利号4,760,025公开了通过实施表达盒的微小改变而导入编码多重突变的寡核苷酸。然而，可以通过Morinaga方法在任一时间导入甚至更多种类的突变，原因在于可以导入长度各异的许多寡核苷酸。

在Nelson和Long(1989)中描述了将突变导入编码α-淀粉酶的DNA序列的另一种方法。该方法涉及含有所需突变的PCR片段的3-步骤生成，其中所需突变通过使用化学合成的DNA链作为PCR反应中的引物之一导入。携带突变的DNA片段可以从PCR生成的片段通过用限制性核酸内切酶切割进行分离并重新***表达质粒。

用于提供本发明的变体的备选方法包括基因改组，例如，如WO95/22625(来自Affymax Technologies N.V.)或WO 96/00343(来自NovoNordisk A/S)中所述，或产生包含所讨论突变例如替换和/或缺失的杂合酶的其他相应技术。

α-淀粉酶变体的表达

根据本发明，可以使用表达载体以酶形式表达编码由上文所述方法或由本领域已知的任意备选方法产生的变体的DNA序列，其中所述表达载体一般包括编码启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号和任选地阻遏基因或多种激活基因的调控序列。

携带编码本发明α-淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是任意载体，其可以便利地实施重组DNA过程，并且载体的选择经常取决于待导入该载体的宿主细胞。因而，载体可以是自主复制型载体，即作为其复制不依赖染色体复制的染色体外实体存在的载体，例如，质粒、噬菌体、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。备选地，载体可以是这样的载体，当载体导入到宿主细胞中时，其可以整合到宿主细胞基因组中并随已经整合有该载体的染色体一起复制。

在载体中，所述DNA序列应当有效连接于合适的启动子序列。该启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任意DNA序列并可以从编码与该宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因衍生。用于指导编码本发明的α-淀粉酶变体的DNA序列转录、尤其在细菌宿主中转录的合适启动子的例子是大肠杆菌lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪土芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于真菌宿主中的转录，有用启动子的例子是从编码米曲霉(A.oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸三糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因衍生的那些启动子。

用于本发明中的表达载体也可以包含合适的转录终止子和在真核生物中与编码本发明α-淀粉酶变体的DNA序列有效连接的多腺苷酸化序列。终止序列和多腺苷酸化序列可以适宜地从与启动子相同的来源衍生。

载体可以还包含能够使该载体在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的例子是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

载体也可以包含选择标记，例如其产物弥补宿主细胞中缺陷的基因，如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。另外，该载体可以包含曲霉属选择标记如amdS、argB、niaD和sC、产生潮霉素抗性的标记，或可以通过共转化实现选择，例如，如WO 91/17243中所述。

尽管胞内表达可以在一些方面是有利的，例如当使用某些细菌作为宿主细胞时，然而通常优选表达是胞外的。通常，本文中提到的芽孢杆菌属α-淀粉酶包含允许所表达的蛋白酶分泌到培养基中的前区域(preregion)。根据需要，这种前区域可以被不同的前区域或信号序列替换，便利地通过替换编码各自前区域的DNA序列实现。

本领域技术人员熟知用来连接分别编码α-淀粉酶变体、启动子、终止子和其他元件的本发明DNA构建体并将它们***含有复制必需信息的合适载体的方法(参见例如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，1989)。

本发明的细胞，包含如上文定义的本发明的DNA构建体或表达载体的细胞，在重组产生本发明的α-淀粉酶变体中用作为宿主细胞是有利的。细胞可以用编码变体的本发明DNA构建体转化，便利地通过在宿主染色体中整合(一个或多个拷贝的)DNA构建体。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列更有可能稳定地维持于细胞中。可以根据常规方法例如通过同源或异源重组将DNA构建体整合到宿主染色体中。备选地，细胞可以用与不同类型宿主细胞有关的如上所述表达载体转化。

本发明的细胞可以是高等生物如哺乳动物或昆虫的细胞，但优选地是微生物细胞，例如细菌细胞或真菌(包括酵母)细胞。

合适细菌的例子是***，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪土芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝固芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环形芽孢杆菌(Bacillus circulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)或变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰色链霉菌(Streptomyces murinus)；或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。细菌的转化可以例如通过原生质体转化或通过使用感受态细胞以本身已知的方式实现。

酵母可以有利地选自酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。丝状真菌可以有利地属于曲霉属物种，例如米曲霉或黑曲霉。真菌细胞可以通过涉及原生质体形成和原生质体转化随后细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023中描述。

在又一方面，本公开涉及产生本发明的α-淀粉酶变体的方法，所述方法包括在促进变体产生的条件下培育如上文所述的宿主细胞并从细胞和/或培养基回收该变体。

用来培育细胞的培养基可以是适于生长所讨论的宿主细胞并获得本发明的α-淀粉酶变体表达的任何常规培养基。合适的培养基是从商业供应商可获得的或可以根据公开(例如，如美国典型培养物保藏中心的目录中所述)的配方制备。

从宿主细胞分泌的α-淀粉酶变体可以通过熟知方法从培养基方便地回收，所述的熟知方法包括通过离心或过滤将细胞与培养基分离并借助盐(如硫酸铵)沉淀培养基的蛋白质组分，随后使用层析方法如离子交换层析、亲和层析等。

植酸酶

本发明中有用的植酸酶包括能够在温育和液化步骤的定义条件下水解植酸的酶。在一些实施方案中，植酸酶能够从肌醇六磷酸(植酸)释放至少一个无机磷酸盐。植酸酶可以根据它们对植酸分子上磷酸酯基团的特定位置起始水解的偏好性分类(例如作为3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或作为6-植酸酶(EC 3.1.3.26))。植酸酶的常见例子是肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶。

植酸酶可以从微生物如真菌生物和细菌生物获得。这些微生物中的一些微生物包括例如曲霉属(例如黑曲霉、土曲霉(A.terreus)、无花果曲霉(A.ficum)和烟曲霉(A.fumigatus))、毁丝霉属(嗜热毁丝霉(M.thermophila))、踝节菌属(Talaromyces)(嗜热踝节菌(T.thermophilus))、木霉属某些物种(里氏木霉)和嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(WO 99/49740)。植酸酶也可从青霉属物种获得，例如大麦青霉(P.hordei)(ATCC No.22053)、桧状青霉(P.piceum)(ATCC No.10519)或短密青霉(P.brevicompactum)(ATCC No.48944)。参见，例如USP 6,475,762。另外，从芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌)、假单胞菌属、隔孢伏革属(Peniophora)、大肠杆菌、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterbacter)和布丘氏菌属(Buttiauxella)(参见例如WO2006/043178)可获得植酸酶。

商业植酸酶是可获得的，如NATUPHOS(BASF)、RONOZYME P (Novozymes A/S)、PHZYME(Danisco A/S，Diversa)和FINASE(AB Enzymes)。用于确定微生物植酸酶活性的方法和植酸酶单位的定义已经由Engelen等人(1994)J.of AOAC International 77：760-764公布。植酸酶可以是野生型植酸酶、其变体或片段。

在一个实施方案中，本发明中有用的植酸酶从布丘氏菌属(Buttiauxiella spp.)细菌衍生。布丘氏菌属包括乡间布丘氏菌(B.agrestis)、布里纳氏布丘氏菌(B.brennerase)、费拉格布丘氏菌(B.ferragutiae)、伽瓦尼布丘氏菌(B.gaviniae)、伊查德氏布丘氏菌(B.izardii)、诺基亚布丘氏菌(B.noackiae)，和瓦姆波德布丘氏菌(B.warmboldiae)。布丘氏菌物种的菌株从德国国家生物材料资源中心DSMZ(Inhoffenstrabe 7B，38124Braunschweig，德国)可获得。在保藏号NCIMB 41248下保藏的布丘氏菌菌株P1-29是可以从中获得并根据本发明使用的植酸酶的特别有用的菌株的例子。在一些实施方案中，植酸酶是BP-野生型、在WO 06/043178中公开的其变体(如BP-11)或如2007年3月6日提交的美国专利申请11/714,487号中公开的变体。例如，BP-野生型及其变体在WO 06/043178的表1中公开，其中编号参考了已公布的PCT申请的SEQ ID NO：3。

在一个优选实施方案中，在本发明中有用的植酸酶是与表2中显示的SEQ ID NO：19(BP-17)和其变体中所述的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少88％、至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％序列同一性的一种植酸酶。更优选地，该植酸酶将与SEQ ID NO：19或其变体中所述的氨基酸序列具有至少95％至99％序列同一性。在一些实施方案中，该植酸酶包含或由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成。

表2

衍生自布丘氏菌的已知为BP-17植酸酶的植酸酶的成熟蛋白质序列(SEQ ID NO：19)

NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP

EWPVKLGYIT

PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWAD

VDQRTLKTGE

AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT

QVQQAVEKEA

QTPIDNLNQH YIPFLALMNT TLNFSTSAWC QKHSADKSCD

LGLSMPSKLS

IKDNGNKVAL DGAIGLSSTL AEIFLLEYAQ GMPQAAWGNI

HSEQEWASLL

KLHNVQFDLM ARTPYIARHN GTPLLQAISN ALNPNATESK

LPDISPDNKI

LFIAGHDTNI ANIAGMLNMR WTLPGQPDNT PPGGALVFER

LADKSGKQYV

SVSMVYQTLE QLRSQTPLSL NQPAGSVQLK IPGCNDQTAE

GYCPLSTFTR

VVSQSVEPGC QLQ

在一些实施方案中，温育和/或液化工艺中使用的植酸酶的量(剂量)在约0.001至50FTU/g ds的范围内(例如在约0.01至25FTU/g ds、约0.01至15FTU/g ds、约0.01至10FTU/g ds、约0.05至15FTU/g ds和约0.05至5.0FTU/g ds的范围内)。

工业应用

本文中呈现的α-淀粉酶混合物具有允许多种工业应用的有价值特性。具体而言，该淀粉酶混合物可以用于淀粉加工，特别是淀粉转化，尤其是淀粉的液化(参见例如美国专利号3,912,590、EP专利申请号252,730和63,909、WO 99/19467和WO 96/28567，全部参考文献在此引入作为参考)。也构思了进一步包含葡糖淀粉酶、支链淀粉酶和/或另一α-淀粉酶的淀粉酶混合物。

另外，该淀粉酶混合物特别用于从淀粉或完整谷物产生增甜剂和醇，例如乙醇或丁醇(参见例如在此引入作为参考的美国专利号5,231,017)。

该淀粉酶混合物也可以用于纺织品、织物或服装退浆(参见例如在此引入作为参考的WO 95/21247、美国专利号4,643,736、EP 119,920)、发酵醪制备或酿造、用于纸浆和纸张生产中。

淀粉转化

例如在美国专利号3,912,590和EP专利公开号252,730和63,909中描述了常规的淀粉转化过程，如液化过程和糖化过程，所述每篇专利在此引入作为参考。

在一个实施方案中，降解淀粉成低分子量碳水化合物组分如糖或脂肪替换物的淀粉转化过程包括脱支步骤。

淀粉至糖的转化

在将淀粉转化成糖的情况下，使淀粉解聚。代表性的解聚过程包括预处理步骤和2个或3个连续工艺步骤，经过液化过程、糖化过程及根据目的终产物任选的异构化过程。

天然淀粉的预处理

天然淀粉由室温下在水中不溶解的微小颗粒组成。当加热含水淀粉浆液时，所述颗粒溶胀并最终破裂，淀粉分子分散在溶液中。在这个“凝胶化”过程期间，存在粘度的剧烈增加。由于在常见工业过程中固体水平是30-40％，故不得不将淀粉稀薄化或“液化”，从而可以处理它。这种粘度降低现在主要由酶降解获得。

液化

在液化步骤期间，长链淀粉由α-淀粉酶降解成支链和直链的更短单位。产物可以包括葡萄糖(a/k/a DP1)，以及麦芽糖糊精和其他短链寡糖(DP2+)。液化过程在105-110℃实施5至10分钟，随后在95℃实施1-2小时。pH通常在5.5与6.2之间。为确保在这些条件下的最佳酶稳定性，添加1mM钙(以提供40ppm游离钙离子)。在如此处理后，液化的淀粉将具有10-15的“右旋糖当量”(DE)。

糖化

在液化过程后，通过添加葡糖淀粉酶(例如，

L-400)和脱支酶如异淀粉酶(美国专利号4,335,208)或支链淀粉酶，将可溶性糊精和短链寡糖转化成可发酵糖如葡萄糖和麦芽糖。在该步骤前，将pH降低至4.5以下的值，维持高温(高于95℃)，以使液化α-淀粉酶失活以减少称作“4-α-葡糖基麦芽糖前体”的短寡糖形成，所述短寡糖不能被脱支酶正确水解。

将温度降低至60℃，并添加葡糖淀粉酶和脱支酶。糖化过程进行24-72小时。

通常地，当在液化步骤后变性α-淀粉酶时，约0.2-0.5％的糖化产物是不能被支链淀粉酶降解的支化三糖Glc pα1-6Glc pα1-4Glc(4-α-葡糖基麦芽糖)。如果来自液化步骤的活性淀粉酶在糖化期间仍存在(即，没有变性)，则该水平可以高达1-2％，这是极不希望的，因为这明显地降低糖化产率。

异构化

当所需的糖终产物例如是高果糖糖浆时，可以将右旋糖糖浆转化成果糖。在糖化过程后，提高pH至6-8范围内的值，优选地至pH 7.5，并通过离子交换法去除钙。随后，使用例如固定化的葡萄糖异构酶(如

IGI-HF)将右旋糖糖浆转化成高果糖糖浆。

乙醇生产

通常，来自全谷物的醇生产(乙醇)可以是分成4个主要步骤：研磨、液化、糖化、发酵。

研磨

研磨谷粒以打开结构并允许进一步加工。所用两种方法是湿磨法或干磨法。在干磨法中，研磨完整籽粒并用于该方法的其余部分中。湿磨法引起胚芽和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好地分离并且在平行地生产糖浆的场所使用，除少数例外之外。

制备含有淀粉材料的浆液

含有研磨淀粉的材料与水和再循环的稀釜馏物合并，从而产生含水浆液。该浆液包含15至55％ds w/w(例如20至50％，25至50％，25至45％，25至40％，和20至35％ds)。在一些实施方案中，再循环的稀釜馏物在约10至70％v/v的范围内(如，10至60％、10至50％、10至40％、10至30％、10至20％、20至60％、20至50％、20至40％并且也在20至30％)。

一旦含有研磨淀粉的材料与水和稀釜馏物合并，不调节浆液中的pH。另外，在添加植酸酶和任选地添加α-淀粉酶至浆液后，不调节pH。在一个优选的实施方案中，浆液的pH将在pH 4.5至小于6.0的范围(例如，pH4.5至5.8、pH 4.5至5.6、pH 4.8至5.8、pH 5.0至5.8、pH 5.0至5.4、pH5.2至5.5)。浆液的pH可以在pH 4.5与5.2之间，这取决于添加至浆液的稀釜馏物的量和包含稀釜馏物的材料的类型。例如，稀釜馏物的pH可以在pH 3.8与pH 4.5之间。作为又一个例子，下表3展示在155F搅拌2小时后随增加量的稀釜馏物添加至全磨谷物浆液(32％ds)而发生的pH变化。

表3

应当注意，在乙醇生产期间，可以添加酸以降低发酵醪井中的pH以降低蒸馏前微生物污染的风险。

在一些实施方案中，除了α-淀粉酶混合物之外，还添加植酸酶至浆液。在一些实施方案中，将植酸酶和α-淀粉酶混合物依次添加至浆液，并且在其他实施方案中，同时添加植酸酶和α-淀粉酶混合物。在一些实施方案中，将包含α-淀粉酶混合物和任选地包含植酸酶的浆液温育(预处理)5分钟至8小时的时间(例如，5分钟至6小时、5分钟至4小时、5分钟至2小时和15分钟至4小时)。在其他实施方案中，浆液在40至115℃(例如45至80℃、50至70℃、50至75℃、60至110℃、60至95℃、70至110℃、70至85℃)的温度范围内温育。

在其他实施方案中，浆液在含淀粉材料的淀粉凝胶化温度以下0至30℃(例如0至25℃、0至20℃、0至15℃、0至10℃和0至5℃)的温度温育。在一些实施方案中，该温度是68℃以下、65℃以下、62℃以下、60℃以下和55℃以下。在一些实施方案中，该温度是45℃以上、50℃以上、55℃以上和60℃以上。在一些实施方案中，在低于淀粉凝胶化温度的温度温育包含α-淀粉酶混合物和任选地包含植酸酶的浆液被称作初级(1°)液化。

在一个实施方案中，含有研磨淀粉的材料是谷物或买罗高梁。该浆液包含25至40％ds，pH在4.8至5.2范围内并且该浆液在60至75℃的温度范围与α-淀粉酶混合物和任选地植酸酶温育5分钟至2小时。

在进一步的液化步骤中，含有温育过或预处理的淀粉的材料在约4.0至5.5的pH暴露于温度升高，如在含淀粉材料的淀粉凝胶化温度以上0至45℃(例如70℃至120℃、70℃至110℃和70℃至90℃)持续2分钟至6小时的时间段(例如2分钟至4小时)，更优选地在1小时至2小时之间。温度可以通过常规高温喷射蒸煮***提高一段短暂时间，例如1至15分钟。随后，淀粉可以在范围从75℃至95℃(例如80℃至90℃和80℃至85℃)的温度进一步水解15至150分钟(例如30至120分钟)时间。在一个优选的实施方案中，在这些过程步骤期间不调节pH并且液化的糖化醪的pH在pH 4.0至pH 5.8(例如pH 4.5至5.8、pH 4.8至5.4和pH 5.0至5.2)的范围内。在一些实施方案中，将第二剂量的热稳定α-淀粉酶混合物添加至次级液化步骤，但是在其他实施方案中，不额外添加α-淀粉酶混合物。

根据本发明的温育和液化步骤可以后续本领域熟知的糖化和发酵步骤。

液化

在液化过程中，淀粉颗粒因水解成大部分具有高于4的DP的麦芽糖糊精而增溶。水解可以通过酸处理或由α-淀粉酶以酶方式实施。有限地使用酸水解。原料可以是研磨的完整谷物或来自淀粉加工的侧线馏分。

酶液化一般作为一个3步骤热浆液过程实施。将浆液加热至60-95℃之间，优选地80-85℃，并添加酶。浆液随后在95-140℃、优选在105-125℃之间进行喷射蒸煮，冷却至60-95℃并添加更多的酶以获得最终水解。液化过程在pH 4.5-6.5、一般在5和6之间的pH处实施。研磨和液化的谷物也称作糖化醪(mash)。

发酵

将一般来自酵母属某些物种的酵母加入糖化醪并进行发酵24-96小时，例如一般35-60小时。温度在26-34℃之间，一般在约32℃，并且pH是从pH 3-6，优选地是大约pH 4-5。

应当注意，最广泛使用的过程是同时糖化和发酵(SSF)过程，其中不存在糖化的持续阶段，意味着一同添加酵母和酶。当进行SSF时，通常仅在发酵前，在50℃以上温度引入预糖化步骤。

糖化和发酵

含有液化淀粉的材料在糖化酶如葡糖淀粉酶存在下糖化。糖化过程可以持续12小时至120小时(例如12至90小时、12至60小时和12至48小时)。然而，常见在30至65℃温度范围并且一般在约60℃实施一个预糖化步骤约30分钟至2小时(例如30至90分钟)，随后是在发酵期间称作同时糖化和发酵(SSF)的完全糖化。pH通常在4.2-4.8之间，优选地是pH4.5。

获自谷物包括全磨谷物和淀粉包括谷物淀粉(例如糊精、单糖，尤其葡萄糖)的可发酵糖从酶促糖化产生。可以将这些可发酵糖进一步纯化和/或转化成有用的糖产物。此外，获自全磨谷物的糖可以用作微生物发酵过程中的发酵原料以产生终产物，如醇(例如乙醇和丁醇)、有机酸(例如丁二酸、柠檬酸和乳酸)、糖醇(例如甘油)、抗坏血酸中间体(例如葡萄糖酸、2-酮-D-葡萄糖酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸和2-酮-L-古洛糖酸)、氨基酸(例如赖氨酸、谷氨酸和谷氨酸盐如，例如谷氨酸单钠)、蛋白质(例如抗体及其片段)。

在一个优选的实施方案中，使用在液化过程步骤期间获得的可发酵糖来产生醇并尤其产生乙醇。在乙醇生产中，通常使用其中一同添加糖化酶和发酵生物(例如酵母)的SSF过程并随后在30℃至40℃的温度实施。

发酵中所用的生物将取决于所需的终产物。一般而言，如果乙醇是想要的终产物，将使用酵母作为发酵生物。在一些优选的实施方案中，产乙醇微生物是酵母和特别地是酵母属酵母如酿酒酵母菌株(美国专利号4,316,956)。多种酿酒酵母可商业地获得并且这些酿酒酵母包括但不限于FALI(Fleischmann’s Yeast)、SUPERSTART(Alltech)、FERMIOL(DSM Specialties)、RED STAR(Lesaffre)和Angel醇酵母(Angel酵母公司，中国)。在该方法中所用起子酵母的量是有效在合适的时间量内产生乙醇的商业显著量的量(例如有效在少于72小时内从具有25-40％之间DS的底物产生至少10％乙醇的量)。酵母细胞一般以每毫升发酵肉汤10⁴至10¹²个和优选地从约10⁷至约10¹⁰个活酵母计数的量供应。除了发酵微生物(例如酵母)，发酵还包括养分、任选地包括额外的酶，包括但不限于植酸酶。酵母在发酵中的用途是熟知的并参考The Alcohol Textbook，K.Jacques等人编著，1999，Nottingham University Press，UK。

在其他实施方案中，如本领域已知的，通过适宜发酵微生物的使用可以产生发酵终产物，包括但不限于甘油、1，3-丙二醇、葡萄糖酸、2-酮-D-葡萄糖酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸、2-酮-L-古洛糖酸、丁二酸、乳酸、氨基酸、及它们的衍生物。更具体地，当乳酸是目的终产物时，可以使用乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1，3-丙二醇是目的终产物时，可以使用大肠杆菌；并且当2-酮-D-葡萄糖酸、2，5-二酮-D-葡萄糖酸和2-酮-L-古洛糖酸是目的终产物时，可以使用柠檬泛菌(Pantoea citrea)作为发酵微生物。上文例举的名单仅是例子并且本领域技术人员会知道可适合用来产生目的终产物的多种发酵微生物。

蒸馏

任选地，在发酵后，可以通过例如蒸馏和任选地一个或多个工艺步骤提取醇(例如乙醇或丁醇)。

在一些实施方案中，由本发明中所包括的方法产生的乙醇或丁醇的产率是至少8％、至少10％、至少12％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％和至少18％(v/v)和至少23％v/v。根据本发明的方法获得的乙醇可以用作例如，燃料乙醇、饮用乙醇即可饮用的中度酒，或工业用乙醇。

副产物

来自发酵的谷物副产物一般以液体或干燥形式用于动物饲料。如果淀粉是湿研磨的，那么非淀粉副产物包括粗蛋白质、油和纤维例如谷物蛋白粉(corn gluten meal)。如果淀粉是干研磨的，那么副产物可以包括动物饲料联产品，例如蒸馏器干酒糟(DDG)和蒸馏器干酒糟及可溶物(DDGS)。然而，当谷物是干研磨的并在液化和糖化前在浆液中混合时，没有谷物剩下作为副产物。

关于如何实施液化、糖化、发酵、蒸馏和醇回收的其他细节是技术人员熟知的。

根据本发明的方法，可以同时或分别地实施糖化和发酵。

葡糖淀粉酶和支链淀粉酶

有用的葡糖淀粉酶包括那些纯化自黑曲霉(例如，在Boel等人(1984)，“Glucoamylases G1 and G2 from Aspergillus niger are synthesized from two different but closely related mRNAs”，EMBO J.3(5)，第1097-1102页中公开的G1或G2黑曲霉AMG)的葡糖淀粉酶或者它们的变体，特别是在WO 00/04136或WO 01/04273中公开的变体或者是在WO 99/28448中公开的埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)AMG或者雷氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶(参见WO 06/060062)。

在一个实施方案中，本发明的组合物也包含支链淀粉酶，例如芽孢杆菌属支链淀粉酶。参见，例如WO 99/45124。

方法

α-淀粉酶变体的发酵和纯化

携带相关表达质粒的枯草芽孢杆菌菌株可以如下发酵和纯化：将菌株从-80℃贮藏物划线于含有10μg/ml卡那霉素的LB-琼脂平板上并在37℃过夜生长。将菌落转移至500mL摇瓶中补充有10μg/ml氯霉素的100mLPS-1培养基(下文)。培养物在37℃以270转/分钟振摇5日。

PS-1培养基的组成

通过以4500转/分钟离心20-25分钟从发酵肉汤除去细胞和细胞碎片。此后，过滤上清液以获得完全清亮的溶液。将滤液浓缩并在UF-滤器(10000截止值膜)上洗涤并且将缓冲液换成20mM乙酸盐pH 5.5。在S-SEPHAROSE F.F.上施加UF-滤液并通过逐步洗脱法用相同缓冲液中的0.2M NaCl实施洗脱。洗脱液对pH 9.0的10mM Tris透析并施加在Q-SEPHAROSE F.F.上并且用从0-0.3M NaCl的线型梯度经6个柱体积洗脱。汇集含有(由PHADEBAS测定法测量的)活性的级分，将pH调节至pH 7.5并且通过用0.5％w/v活性碳处理5分钟除去剩余颜色。

比活性测定

使用

测定法(Pharmacia)，测定比活性为活性/mg酶。遵循制造商说明书实施(也见下文“α-淀粉酶活性测定法”)。

稳定性的确定

可以使用如下方法测量淀粉酶稳定性：

在相关条件下温育酶。样品在多个时间点取得，例如在0、5、10、15和30分钟后，并在测试缓冲液(50mM Britton缓冲液，pH 7.3)中稀释25倍(相同稀释度用于全部取得的样品)并使用Phadebas测定法(Pharmacia)在标准条件pH 7.3，37℃下测量活性。

α-淀粉酶活性测定法

1.Phadebas测定法

α-淀粉酶活性由使用

小片作为底物的方法确定。Phadebas小片(

淀粉酶试验，由Pharmacia Diagnostic供应)含有交联的不溶性蓝颜色淀粉聚合物，该聚合物已经与牛血清白蛋白和缓冲物质混合并造片。

对于每个单一测量，将一个小片悬浮在含有5mL的50mMBritton-Robinson缓冲液(50mM乙酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0.1mMCaCl₂，用NaOH调节pH至目的值)的管中。试验在目的温度的水浴中进行。在50mM Britton-Robinson缓冲液若干毫升中稀释待测试的α-淀粉酶。将1毫升这种α-淀粉酶溶液添加至5mL的50mM Britton-Robinson缓冲液。淀粉被α-淀粉酶水解，产生可溶性蓝色碎片。以分光光度方式在620nm测量的所得蓝色溶液的吸光度是α-淀粉酶活性的函数。

重要的是在温育10或15分钟(测试时间)后测量的620nm吸光度在620nm处的0.2至2.0吸光度单位范围内。在这个吸光度范围内，活性与吸光度之间存在线性关系(Lambert-Beer定律)。因而必须调整酶的稀释度以符合这个标准。在指定的条件集合(温度、pH、反应时间、缓冲液条件)下，1mg给定的α-淀粉酶会水解某个量的底物，并且蓝颜色会产生。在620nm测量颜色强度。测量的吸光度与给定条件集合下所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg纯α-淀粉酶蛋白)直接成比例。

2.备选方法

α-淀粉酶活性由使用PNP-G₇底物的方法确定。作为对硝基苯基-α，D-麦芽庚糖苷缩写的PNP-G₇是可以被内切淀粉酶切割的嵌段低聚糖。切割后，该试剂盒中包含的α-葡糖苷酶消化此底物以释放具有黄颜色并因而可以通过可见光分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)测量的游离PNP分子。含有PNP-G₇底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Boehringer-Mannheim制造(目录号1054635)。

为制备试剂溶液，如制造商推荐，将10mL底物/缓冲液添加至50mL酶/缓冲液。通过转移20微升样品至96孔微量滴定平板并在25℃温育实施该测定法。添加预平衡至25℃的200μL试剂溶液。将溶液混合并预温育1分钟并且在ELISA读数仪中在OD 405nm在4分钟范围内每隔30秒测量吸收。

时间依赖性吸收曲线的斜率与给定条件集合下所讨论的α-淀粉酶的活性直接成比例。

植酸酶活性(FTU)的确定

通过无机磷酸盐的释放测量植酸酶活性(FTU)。无机磷酸盐与酸性钼酸盐/钒酸盐试剂形成黄色复合物，并且在分光光度计中在415nm波长处测量这种黄色复合物，并且用磷酸盐标准曲线量化释放的无机磷酸盐。1单位植酸酶(FTU)是在欧洲标准(CEN/TC 327，2005-TC327WI 003270XX)中给定的反应条件下每分钟从植酸释放1微摩尔无机磷酸盐的酶量。

植酸含量的确定

植酸含量：通过调节5％浆液(如果它是干样品)的pH至pH 10从样品提取植酸并随后通过使用离子交换柱的HPLC方法确定植酸。使用NaOH梯度***从该柱子洗脱植酸。随后通过与植酸标准物的比较计算液体中的植酸含量。

本发明在后续实施例中包括进一步细节，所述实施例不意图以任何方式限制所要求的范围。所附附图意图理解为本发明的说明书和描述的必要部分。所引用的全部参考文献通过引用方式在本文中对其中所述的全部那些内容特别地并入作为参考。因而提供了以下实施例以说明，但不用于限制所要求保护的发明。

实施例

在下面的公开和实验部分中，使用以下缩写：wt％(重量百分数)；℃(摄氏度)；H₂O(水)；dH₂O(去离子水)；dIH₂O(Milli-Q过滤的去离子水)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；μl(微升)；mL和ml(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒钟)；min(分钟)；hr(小时)；DO(溶解氧)；W/V(重量比体积)；W/W(重量比重量)；V/V(体积比体积)；IKA(北卡莱罗纳州威尔明顿SE North Chase公园大街2635号IKA Works Inc；Ncm(牛顿厘米)和ETOH(乙醇)。eq(当量)；N(正常)；ds或DS(干固体含量)，AAU(α-淀粉酶单位)，LU(Liquefon单位)，SAPU(分光光度酸性蛋白酶单位，其中1SAPU是在测定法的条件下每分钟从酪蛋白底物中释放1微摩尔酪氨酸的蛋白酶酶活性的量)和GAU(葡糖淀粉酶单位，其定义为在pH 4.2和60℃每小时从可溶性淀粉底物产生1g计算为葡萄糖的还原性糖的酶的量)。

实施例1-变体的构建

使用位点定向方法构建在AmyS的成熟序列第S242位置处的变异。

用于诱变的模板是来自New England Biolabs(马萨诸塞州)的使用dam甲基化酶的甲基化pHPLT-AmyS(见图2)。在Operon(Huntsville，AL)合成简并引物(S242F(正向)和S242R(反向，下文中给出)并稀释至10μM，互补性正向和反向序列均含有用于反应中连接的5’磷酸酯基团。所附的亲本α-淀粉酶的序列是SEQ ID NO：2。使用在靶位置处以NN(G/C)随机化的寡核苷酸引物，以Stratagene Quik-Change^TM多位点试剂盒(Stratagene，La Jolla CA)创建文库。所选择的氨基酸(即S242)随机地用全部19种可能备选物替换。

用于诱变的S242引物：

S242F：

5’[Phos]GTCAAGCATATTAAGTTCNNSTTTTTTCCTGATTGGT TG 3’SEQ ID NO：17

S242R：

5’[Phos]CAACCAATCAGGAAAAAASNNGAACTTAATATGCTTGAC 3’SEQ ID NO：18

反应如下进行：

Quik-Change反应：

该反应由18μL无菌蒸馏水、2.5μL来自该试剂盒的10x缓冲液、1μL来自该试剂盒的dNTP、1.25μL正向引物(10μM母液)、1.25μL反向引物(10μM母液)、1μL pHPLT-AmyS质粒DNA作为模板(约70ng)和1μL来自该试剂盒的酶掺合物组成，总计26.5μL。

循环条件：

循环条件是95℃1分钟，进行一次，随后95℃1分钟、55℃1分钟、65℃10分钟，25个循环。

将1微升Dpn I(10U/μL)添加至Multi-Site Quik-Change反应混合物并在37℃温育18小时，并随后添加另一份0.5μL Dpn I温育额外3小时。

使用1微升DpnI消化的反应物作为采用Templiphi扩增试剂盒(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)实施滚环复制的模板并且根据Amersham方案进行反应。将1微升滚环DNA转化至100μL枯草芽孢杆菌感受态细胞(2种蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌株(ΔaprE，ΔnprE，amyE::xylRPxylAcomK-phleo))并在37℃振摇1小时。随后将全部转化物涂布在LA+10ppm新霉素+1％不溶性淀粉平板(一个平板上涂布25μL，另一个平板上涂布75μL)并在37℃温育过夜。将96个转化体挑入微量滴定平板中150μL的LB+10ppm Neo内并在37℃培育过夜。用96针复制工具将过夜平板印在一个大的LA+10ppm Neo+1％不溶性淀粉平板上并提交至Quintara Biosciences(Berkeley，CA)用于菌落PCR和测序。

在确定变体序列后，将变体挑入含有125μL LB+10ppm Neo的96孔微量滴定平板，将所述变体排列成带对照的一式四份形式(quad format)。排列的微量滴定平板在37℃和250转/分钟培育6小时。利用复制器(荷兰莱顿Enzyscreen)，使用微量滴定培养平板来接种含有150μl用于蛋白质表达的MBD培养基(G.Vogtentanz等人，产生大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂的枯草芽孢杆菌融合蛋白***(A Bacillus subtilis fusion protein system to produce soybean Bowman-Birk protease inhibitor)，Prot.Expr.&Purif.55(2007)40-52)并补充有用于蛋白质表达的5mM CaCl₂的一个新微量滴定平板(微量滴定平板和平板盖来自荷兰莱顿Enzyscreen)。将表达平板在37℃、250转/分钟和70％湿度培育64小时。随后，表达培养物经微滤板(0.22μm，Millipore，Billerica，MA)过滤并筛选改善的热稳定性(见实施例3)。

实施例2-变体的表达、纯化和表征

将菌落从实施例1的微量滴定平板划线并置于具有10ppm新霉素的淀粉平板上。平板在37℃温育过夜并挑取单菌落并用来接种含有培养基(见下文)和20ppm新霉素的摇瓶(250mL摇瓶，具有25mL培养基)。培养物在37℃，275转/分钟培育约8小时(至达到OD(600nm)2.0)。将培养物肉汤与50％甘油以2∶1比率混合，置入分别标记的培养小瓶并冷冻于-80℃。随后从这些甘油贮藏物产生所选择的α-淀粉酶。

淀粉酶发酵在500mL摇瓶内37℃培育含有1％(w/v)大豆胨的极限MOPS培养基(Neidhardt等人，J.Bacteriol.119(3)：736-747，1974)60小时实施。使用疏水相互作用层析从发酵肉汤纯化酶。简而言之，将肉汤浓缩10倍，随后用含有1M硫酸铵的50mM MES，2mM CaCl₂，pH 6.8稀释复原至其原始体积，并使用玻璃纤维滤器无菌过滤。样品随后上载到用同一种缓冲液预平衡的苯基SEPHAROSE FF高密度柱(20x95mm；Amersham，GE Healthcare Bio-Sciences，Sweden)上。用10个柱体积的无硫酸铵的相同缓冲液，随后用5个柱体积的水洗去非淀粉酶蛋白质。最后，用含有40％丙二醇的50mM MES，2mM CaCl₂，pH 6.8洗脱目的酶。

用标准定量SDS PAGE凝胶光密度测定法；或者使用来自Megazyme (Wicklow，Ireland)的标准淀粉酶测定试剂盒利用活性测定法来确定蛋白质浓度。利用纯化淀粉酶(芽孢杆菌属707淀粉酶；SEQ ID NO：6)生成的标准曲线来转化测定法。

实施例3-确定改变的特性：热应激

本实施例显示本文中所述的变体可以相对于亲本α-淀粉酶具有改变的特性。实施嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)变体的高通量热稳定性筛选。

如下研究和选择热应激条件，使得初始野生型酶在热应激后大致显示40％非应激活性(即，热应激后活性/热应激前活性大致是0.4)。一式四份筛选突变体文库并且将潜在胜出者鉴定为热应激后显示比初始野生型酶的平均残余活性高至少2个标准差的残余活性的那些突变体。

在表达平板的培养上清液中淀粉酶表达是大约100ppm。在37℃于加湿摇床(250转/分钟和70％相对湿度)中生长60-65小时后，使用滤板澄清培养上清液以除去细胞物质。将澄清的上清液10倍稀释到含有50mMNaOAc/2.6mM CaCl₂/0.002％Tween-20，pH 5.8的缓冲液中，至终浓度大约10ppm。将上清液的一个等份试样进一步稀释成0.02ppm，并使用荧光标记的谷物淀粉底物如下文所述确定酶变体的活性。上清液的第二等份试样在热循环仪中经历95℃热应激30分钟，随后在50mM NaOAc/2.6mM CaCl₂/0.002％Tween-20，pH 5.8中稀释成0.02ppm，并使用下文所述荧光底物和测定法测定残余活性。

使用淀粉酶EnzCheck测定基本上如制造商(Invitrogen，San Diego CA)所述确定淀粉酶活性。该测定法中淀粉酶的终浓度是大约0.02ppm。测试缓冲液是50mM NaOAc/2.6mM CaCl₂/0.002％Tween-20，pH 5.8。底物是BODIPY荧光染料缀合的来自谷物的100μg/mL DQ^TM淀粉(Invitrogen，Eugene，OR)。使用SpectraMAX M2(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测量指示淀粉酶活性的增加的荧光。用记录动态模式的仪器在室温监测反应5分钟。激发波长是485nm；用515nm的截止滤光片在520nm监测发射。

野生型AmyS(Xtra)在经历95℃热应激30分钟后显示33-43％残余活性。AmyS变体S242A和S242Q在相同热应激条件后仍分别保留55-65％和70-80％残余活性。见图3和表4。这些残余活性量值表明这两种变体比野生型α-淀粉酶更热稳定。在表4中，列出了每种变体样品的残余活性百分数。文库中缺失的一些变体通过将该位置处的字母划出表示。在变体的位置，使用野生型(

Xtra)，显示为术语“WT”。每块平板包括

Ethyl(标记为“$”)和

Xtra(标记为“Z”)作为对照。

表4

实施例4-确定改变的特性：DSC

使用疏水相互作用层析法从摇瓶发酵肉汤(见实施例2)纯化

Xtra、S242A和S242Q。使用含有40％丙二醇和2mM CaCl₂的50mM MES，pH 6.8从该柱以纯化的形式洗脱蛋白质。

使用超敏感扫描高通量微量量热器VP-Cap DSC(MicroCal，Inc.，Northampton，MA)测量过量热容量功能(excess heat capacity functions)。之前已经公开了DSC测量的标准方法和该技术的理论(Freire，E.(1995)，差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry)，Methods.Mol.Biol.41，191-218)。在30-120℃温度范围扫描大约500μL的0.5mg/ml野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或变体S242S和S242Q(在2mM氯化钙不存在和存在时)。随后再扫描相同样品以检查该过程的可逆性。对于α-淀粉酶，热解折叠过程是不可逆的。使用的缓冲液是10mM乙酸钠，pH 5.5。使用200℃/小时扫描速率来使本来可能因聚集引起的任何人造物最小化。使用DSC曲线的热中点(Tm)作为热稳定性的指示。表5显示所测试淀粉酶蛋白质的热熔点。图5中显示野生型和淀粉酶变体的热熔融曲线和熔点。

与野生型的熔点相比时，淀粉酶变体S242A和S242Q在2mM氯化钙不存在和存在下的热解折叠过程显示变体的熔点明显提高。在不存在添加的氯化钙的情况下，野生型淀粉酶具有100.8℃热熔点，而S242A和S242Q的Tm分别是106.5℃和110.1℃。因而，S242替换为A引起Tm提高5.7℃，并且S242替换为Q引起Tm提高9.3℃。

在2mM氯化钙存在下，野生型淀粉酶显示106.8℃的热熔点，而S242A和S242Q的Tm分别是111.8℃和113.8℃。因而，在2mM氯化钙存在下，全部3种蛋白质显示提高的Tm值。野生型和S242A变体的Tm提高分别是6℃和5.3℃。S242Q变体的Tm提高是3.7℃。这提示S242Q变体更少地被钙稳定化，或就稳定性而言，该变体更少依赖于钙。在氯化钙存在下S242A和S242Q相对于野生型的Tm提高分别是5℃和3℃。这提示所述变体的热动力学特性不同于

Xtra的那些热动力学特性，并与应用研究中其增强的性能相一致(见实施例5)。

表5

实施例5-活性特征

该实施例显示所测试变体不仅相对于亲本α-淀粉酶，还相对于工业标准酶具有改变的活性特征。在纯化样品或平板样品上进行蛋白质确定。以相等蛋白质浓度剂量测定所有实验的变体和标准α-淀粉酶。

使用pH 5.6苹果酸缓冲液，将平板变体或纯化变体稀释成大约20ppm。底物由相同50mM苹果酸缓冲液，pH 5.6中的15％谷物淀粉组成。将400微升淀粉混悬液平衡至70℃持续2.5分钟。将7μL稀释的酶迅速添加至平衡的淀粉(蛋白质终浓度约0.36ppm)。反应混合物随后置入预热至85℃的振摇加热器并以300转/分钟混合。反应用50μL的125mMNaOH在预定时间间隔猝灭。将反应管离心并将上清液10倍稀释到10mMNaOH中，以通过HPAEC-PAD分析DP谱。

在4、10和20分钟建立反应。将从DP2至HPLC运行结束的总面积集成并将面积除以总蛋白质和反应时间。

4分钟反应提供酶如何快速地开始分解底物的指示；10分钟反应提供酶热活性的指示，并且20分钟反应提供酶热稳定性的指示。结果在图6和图7中提供。

实施例6-粘度计中的液化

该实施例显示实施例3的S242A和S242Q变体也相对于亲本α-淀粉酶具有改变的性能，其中所述的变体相对野生型亲本显示改变的残余活性。在该应用中测试之前，将实施例2的变体α-淀粉酶纯化并表征总蛋白和比活性。

使用HAAKE粘度计550仪监测谷物粉因α-淀粉酶作用所致的粘度降低。用30％谷物粉干固体以分批模式每日新鲜制备底物浆液。使用硫酸调节pH至5.8。称量出50g浆液(15g干固体)并预温育10分钟以加温至70℃，伴以搅拌。添加α-淀粉酶后，将温度立即从70℃跃升至85℃，转速为75。一旦浆液和酶混合物的温度达到85℃，维持温度恒定，并额外监测粘度30分钟。在整个运行期间测量粘度并以μNm报告。以相等的蛋白质浓度(20或30μg/50g谷物粉浆液)剂量测定野生型AmyS、S242A和S242Q。

粘度计应用测试显示AmyS变体S242A和S242Q二者均比基准α-淀粉酶Liquozyme SC、Ethyl和Xtra具有更好的性能。两种变体均展示作为Xtra特征的低峰粘度以及作为Liquozyme SC与Ethyl特征的低终末粘度。当以较低的蛋白质浓度(20μg总蛋白)上载时，进一步增加了变体的较低峰粘度与Liquozyme SC的峰粘度比较的差异。见图8、9和10。

实施例7-喷射蒸煮锅中的液化

通过对稀釜馏物使用70∶30比率的水，将全磨谷物制成32％(干固体谷物)浆液。用10N NaOH调节浆液pH至pH 5.8。使用水和蒸汽在夹层锅中加热浆液至70℃(158°F)。添加液化酶(

Xtra，LiquozymeSC或S242Q)并将浆液加热至85℃(185°F)持续大约10分钟。将浆液在85℃温育额外10分钟后，使用大的实验装置喷射蒸煮锅(配备来自Hydro-Thermal Corp.，Waukesha，Wisconsin的M103水热器)，将浆液通过维持于107℃(225°F)的喷射蒸煮锅，维持时间为3分钟。从喷射蒸煮锅收集液化物并置于85℃水浴中。喷射后，添加第二剂量的液化酶。连续搅拌液化物并在85℃维持90分钟。在0、30、60和90分钟收集样品。对全部样品喷射后测试DE(使用Schoorls法；在要求后可获得方法)和粘度(Brookfield型粘度计(Lab-Line Instruments Inc.，Melrose Park，Illinois)，以20转/分钟转动锭子3)。喷射之前和之后液化酶的投入量在后续图中显示为“X+Y”，其中X代表喷射之前添加的酶的单位数并且Y代表在液化物通过喷射蒸煮锅后添加至液化物的单位数。结果在图11和12中显示。

实施例8-使用α-淀粉酶AmyS S242Q和FRED的混合物分批液化

使用来自Lader’s feed mill(Tiffany，Wisconsin)的全磨谷物。使用

FRED实验室标准(活性17,662AAUs/g)和AmyS S242Q实验室标准(活性14,234AAUs/g)。

用含有30％v/v稀釜馏物的水(获自United Ethanol，Milton，Wisconsin)以32％DS制备3种相同的全磨谷物浆液(700g)。使用6NNaOH将样品调节至pH 5.8。将浆液搅拌下维持于85℃水浴中，并分别向每一浆液中加入AmyS S242Q(4AAUs/g ds谷物)，Fred(20LUs/g ds谷物)以及AmyS S242Q和Fred的混合物(2.8AAUs/g ds谷物和6LUs/gds谷物)。当浆液温度达到85℃时开始计时。在30、60、90和120分钟时取出样品测试DE(通过Schoorls)、°Brix和粘度(通过Brookfield)。DE进展和粘度数据汇总于图13和图14中。

如在图13和图14中所示，AmyS S242Q/Fred混合物在30分钟内令人满意的降低浆液粘度至1923cP。此外，含有AmyS S242Q/Fred混合物的样品维持了高的DE进展斜度120分钟，这表明好的热稳定性。关于粘度降低，图14显示，仅AmyS S242Q在30分钟内快速地降低粘度至1584cP，而仅Fred在30分钟抽样时得到了12,000cP的非常高的粘度。尽管仅Fred通过90分钟的液化时间的确减低粘度至少于2000cP，但是如上所述，该时间长度在目前实施的乙醇生产中并没有用。

总而言之，用AmyS S242Q/Fred混合物处理的研磨谷物浆液显示出了有效乙醇生产所需的关键特性，即快速降低浆液粘度至2000cP以下(在约30分钟内)，这适合于乙醇生产，并且在整个120分钟的液化时间，所述研磨谷物浆液也显示出了高DE进展斜度，这显示了热稳定性。因此，在这些活性水平的AmyS S242Q和Fred组合产生了比任一单独的酶明显更好的特性。

实施例9-使用α-淀粉酶AmyS S242Q和

FRED混合物的葡萄糖糖浆生产

葡萄糖糖浆备自淀粉底物。通过在反渗水(R.O)中悬浮干谷物淀粉，将底物制备为含有38％ds谷物淀粉固体的浆液。视情况而定，使用SO₂或碳酸钠将pH调节至5.8。将5LU的

FRED和0.6AAU的AmyS S242Q加入该浆液中。将浆液用HydroHeater Brand蒸汽注射型喷射蒸煮锅在108℃液化，持续时间为5分钟。该初级液化后，将液化的浆液闪蒸至大气压并在95℃维持120分钟或者直到达到10DE。DE进展显示于图16中。通过用HCl调节pH至3.5并在95℃维持20分钟来终止α-淀粉酶活性。

将液化的淀粉冷却至60℃，并使用20％的碳酸钠溶液将pH调节至4.5。通过在pH 4.5用OPTIMAX^TM 4060牌糖化酶混合物以0.16GAU/g的干物质的剂量处理液化淀粉来进行糖化。葡萄糖随时间的产生显示于表6中。

表6

通过在2500转/分钟离心100ml 10分钟测试最终糖化的葡萄糖糖浆的沉淀。该糖浆含有少于1.5％的沉淀。移出两滴该离心沉淀物并重悬在5mlRO水中。将该溶液在冰浴中冷却至约10℃，并加入0.5ml的0.02N碘溶液。颜色维持不变并判断为对碘染色阴性。

在以上说明书中提到的全部出版物和专利在此引入作为参考。本发明所述方法和***的多种修改和变化对于本领域技术人员是显而易见的，并不违背本发明的范围和精神。尽管本发明已经与具体的优选实施方案联系加以描述，然而应当理解要求专利保护的本发明不应当过度地限于此类具体的实施方案。实际上，对于本领域技术人员是显而易见的用于实施本发明所述方法的多种修改被包含于后续权利要求书的范围内。

序列表

SEQ ID NO：1-15

1 50

SEQ ID No 1 (1) -AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKG

SEQ ID No 2 (1) -AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKG

SEQ ID No 3 (1) -AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKG

SEQ ID No 4 (1) -AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKG

SEQ ID No 5 (1) -AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKG

SEQ ID No 6 (1) HHNGTNGTMMQYFEWYLPNDGNHWNRLNSDASNLKSKGITAVWIPPAWKG

SEQ ID No 7 (1) --ANLNGTLMQYFEWYMPNDGQHWKRLQNDSAYLAEHGITAVWIPPAYKG

SEQ ID No 8 (1) --ANLNGTLMQYFEWYMPNDGQHWRRLQNDSAYLAEHGITAVWIPPAYKG

SEQ ID No 9 (1) ----VNGTLMQYFEWYTPNDGQHWKRLQNDAEHLSDIGITAVWIPPAYKG

SEQ ID No 10(1) HHNGTNGTMMQYFEWYLPNDGNHWNRLRSDASNLKDKGISAVWIPPAWKG

SEQ ID No 11(1) HHNGTNGTMMQYFEWHLPNDGNHWNRLRDDASNLRNRGITAIWIPPAWKG

SEQ ID No 12(1) HHNGTNGTMMQYFEWHLPNDGNHWNRLRDDAANLKSKGITAVWIPPAWKG

SEQ ID No 13(1) --DGLNGTMMQYYEWHLENDGQHWNRLHDDAAALSDAGITAIWIPPAYKG

SEQ ID No 14(1) --DGLNGTMMQYYEWHLENDGQHWNRLHDDAEALSNAGITAIWIPPAYKG

SEQ ID No 15(1) -AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKG

共有序列 (1) A NGTMMQYFEWYLPNDGQHW RL NDA NLSS GITALWIPPAYKG

51 100

SEQ ID No 1 (50) TSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVY

SEQ ID No 2 (50) TSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVY

SEQ ID No 3 (50) TSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVY

SEQ ID No 4 (50) TSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVY

SEQ ID No 5 (50) TSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVY

SEQ ID No 6 (51) ASQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTRSQLQAAVTSLKNNGIQVY

SEQ ID No 7 (49) TSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKYGTKGELQSAIKSLHSRDINVY

SEQ ID No 8 (49) TSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKYGTKGELQSAIKSLHSRDINVY

SEQ ID No 9 (47) LSQSDNGYGPYDLYDLGEFQQKGTVRTKYGTKSELQDAIGSLHSRNVQVY

SEQ ID No 10 (51) ASQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTIRTKYGTRNQLQAAVNALKSNGIQVY

SEQ ID No 11 (51) TSQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTRSQLESAIHALKNNGVQVY

SEQ ID No 12 (51) TSQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTRSQLQGAVTSLKNNGIQVY

SEQ ID No 13 (49) NSQADVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQLERAIGSLKSNDINVY

SEQ ID No 14 (49) NSQADVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQLERAIGSLKSNDINVY

SEQ ID No 15 (50) TSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVY

共有序列 (51) TSQSDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQL AI ALHA GIQVY

101 150

SEQ ID No 1 (100) ADVVFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGN

SEQ ID No 2 (100) ADVVFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGN

SEQ ID No 3 (100) ADVVFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGN

SEQ ID No 4 (100) ADVVFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGN

SEQ ID No 5 (100) ADVVFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGN

SEQ ID No 6 (101) GDVVMNHKGGADATEMVRAVEVNPNNRNQEVTGEYTIEAWTRFDFPGRGN

SEQ ID No 7 (99) GDVVINHKGGADATEDVTAVEVDPADRNRVISGEHLIKAWTHFHFPGRGS

SEQ ID No 8 (99) GDVVINHKGGADATEDVTAVEVDPADRNRVISGEHLIKAWTHFHFPGRGS

SEQ ID No 9 (97) GDVVLNHKAGADATEDVTAVEVNPANRNQETSEEYQIKAWTDFRFPGRGN

SEQ ID No 10 (101) GDVVMNHKGGADATEMVRAVEVNPNNRNQEVSGEYTIEAWTKFDFPGRGN

SEQ ID No 11 (101) GDVVMNHKGGADATENVLAVEVNPNNRNQEISGDYTIEAWTKFDFPGRGN

SEQ ID No 12 (101) GDVVMNHKGGADGTEMVNAVEVNRSNRNQEISGEYTIEAWTKFDFPGRGN

SEQ ID No 13 (99) GDVVMNHKMGADFTEAVQAVQVNPTNRWQDISGAYTIDAWTGFDFSGRNN

SEQ ID No 14 (99) GDVVMNHKLGADFTEAVQAVQVNPSNRWQDISGVYTIDAWTGFDFPGRNN

SEQ ID No 15 (100) ADVVFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGN

共有序列 (101) GDVVMNHKGGADGTE V AVEVNPSDRNQEISG Y I AWTKFDFPGRGN

151 200

SEQ ID No 1 (150)TYSSFKWRWYHFDGVDWDESRKLS-RIYKFRGIGKAWDWEVDTENGNYDY

SEQ ID No 2 (150)TYSSFKWRWYHFDGVDWDESRKLS-RIYKFRGIGKAWDWEVDTENGNYDY

SEQ ID No 3 (150)TYSSFKWRWYHFDGVDWDESRKLS-RIYKFRGIGKAWDWEVDTENGNYDY

SEQ ID No 4 (150)TYSSFKWRWYHFDGVDWDESRKLS-RIYKFRGIGKAWDWEVDTENGNYDY

SEQ ID No 5 (150)TYSSFKWRWYHFDGVDWDESRKLS-RIYKFRGIGKAWDWEVDTENGNYDY

SEQ ID No 6 (151)THSSFKWRWYHFDGVDWDQSRRLNNRIYKFRGHGKAWDWEVDTENGNYDY

SEQ ID No 7 (149)TYSDFKWHWYHFDGTDWDESRKLN-RIYKFQG--KAWDWEVSNENGNYDY

SEQ ID No 8 (149)TYSDFKWHWYHFDGTDWDESRKLN-RIYKFQG--KAWDWEVSNENGNYDY

SEQ ID No 9 (147)TYSDFKWHWYHFDGADWDESRKIS-RIFKFRGEGKAWDWEVSSENGNYDY

SEQ ID No 10(151)THSNFKWRWYHFDGVDWDQSRKLNNRIYKFRGDGKGWDWEVDTENGNYDY

SEQ ID No 11(151)TYSDFKWRWYHFDGVDWDQSRQFQNRIYKFRGDGKAWDWEVDSENGNYDY

SEQ ID No 12(151)THSNFKWRWYHFDGTDWDQSRQLQNKIYKFRGTGKAWDWEVDIENGNYDY

SEQ ID No 13(149)AYSDFKWRWFHFNGVDWDQRYQEN-HIFRFAN--TNWNWRVDEENGNYDY

SEQ ID No 14(149)AYSDFKWRWFHFNGVDWDQRYQEN-HLFRFAN--TNWNWRVDEENGNYDY

SEQ ID No 15(150)TYSSFKWRWYHFDGVDWDESRKLS-RIYKFRG--KAWDWEVDTEFGNYDY

共有序列 (151)TYS FKWRWYHFDGVDWDESRKLN RIYKFRG GKAWDWEVDTENGNYDY

201 250

SEQ ID No 1 (199)LMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFSFFPDWL

SEQ ID No 2 (199)LMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFSFFPDWL

SEQ ID No 3 (199)LMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFAFFPDWL

SEQ ID No 4 (199)LMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFQFFPDWL

SEQ ID No 5 (199)LMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFEFFPDWL

SEQ ID No 6 (201)LMYADIDMDHPEVVNELRNWGVWYTNTLGLDGFRIDAVKHIKYSFTRDWI

SEQ ID No 7 (196)LMYADIDYDHPDVAAEIKRWGTWYANELQLDGFRLDAVKHIKFSFLRDWV

SEQ ID No 8 (196)LMYADIDYDHPDVAAEIKRWGTWYANELQLDGFRLDAVKHIKFSFLRDWV

SEQ ID No 9 (196)LMYADVDYDHPDVVAETKKWGIWYANELSLDGFRIDAAKHIKFSFLRDWV

SEQ ID No 10 (201)LMYADIDMDHPEVVNELRNWGVWYTNTLGLDGFRIDAVKHIKYSFTRDWI

SEQ ID No 11 (201)LMYADVDMDHPEVVNELRRWGEWYTNTLNLDGFRIDAVKHIKYSFTRDWL

SEQ ID No 12 (201)LMYADIDMDHPEVINELRNWGVWYTNTLNLDGFRIDAVKHIKYSYTRDWL

SEQ ID No 13 (196)LLGSNIDFSHPEVQDELKDWGSWFTDELDLDGYRLDAIKHIPFWYTSDWV

SEQ ID No 14 (196)LLGSNIDFSHPEVQEELKDWGSWFTDELDLDGYRLDAIKHIPFWYTSDWV

SEQ ID No 15 (197)LMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFSFFPDWL

共有序列 (201)LMYADIDMDHPEVV ELKNWG WY NTLNLDGFRLDAVKHIKFSF DWL

251 300

SEQ ID No 1 (249)SYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTA

SEQ ID No 2 (249)SYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTA

SEQ ID No 3 (249)SYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTA

SEQ ID No 4 (249)SYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTA

SEQ ID No 5 (249)SYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTA

SEQ ID No 6 (251)NHVRSATGKNMFAVAEFWKNDLGAIENYLQKTNWNHSVFDVPLHYNLYNA

SEQ ID No 7 (246)NHVREKTGKEMFTVAEYWQNDLGALENYLNKTNFNHSVFDVPLHYQFHAA

SEQ ID No 8 (246)NHVREKTGKEMFTVAEYWQNDLGALENYLNKTNFNHSVFDVPLHYQFHAA

SEQ ID No 9 (246)QAVRQATGKEMFTVAEYWQNNAGKLENYLNKTSFNQSVFDVPLHFNLQAA

SEQ ID No 10(251)NHVRSATGKNMFAVAEFWKNDLGAIENYLNKTNWNHSVFDVPLHYNLYNA

SEQ ID No 11(251)THVRNATGKEMFAVAEFWKNDLGALENYLNKTNWNHSVFDVPLHYNLYNA

SEQ ID No 12(251)THVRNTTGKPMFAVAEFWKNDLAAIENYLNKTSWNHSVFDVPLHYNLYNA

SEQ ID No 13(246)RHQRNEADQDLFVVGEYWKDDVGALEFYLDEMNWEMSLFDVPLNYNFYRA

SEQ ID No 14(246)RHQRSEADQDLFVVGEYWKDDVGALEFYLDEMNWEMSLFDVPLNYNFYRA

SEQ ID No 15(247)SYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTNGTMSLFDAPLHNKFYTA

共有序列 (251)SHVRS TGK LFTVGEYW DIGALENYL KTNW MSLFDVPLHYNFY A

301 350

SEQ ID No 1 (299)SKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKP

SEQ ID No 2 (299)SKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKP

SEQ ID No 3 (299)SKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKP

SEQ ID No 4 (299)SKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKP

SEQ ID No 5 (299)SKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKP

SEQ ID No 6 (301)SKSGGNYDMRNIFNGTVVQRHPSHAVTFVDNHDSQPEEALESFVEEWFKP

SEQ ID No 7 (296)STQGGGYDMRKLLNGTVVSKHPLKSVTFVDNHDTQPGQSLESTVQTWFKP

SEQ ID No 8 (296)STQGGGYDMRKLLNGTVVSKHPLKSVTFVDNHDTQPGQSLESTVQTWFKP

SEQ ID No 9 (296)SSQGGGYDMRRLLDGTVVSRHPEKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQTWFKP

SEQ ID No 10(301)SKSGGNYDMRQIFNGTVVQRHPMHAVTFVDNHDSQPEEALESFVEEWFKP

SEQ ID No 11(301)SNSGGNYDMAKLLNGTVVQKHPMHAVTFVDNHDSQPGESLESFVQEWFKP

SEQ ID No 12(301)SNSGGYFDMRNILNGSVVQKHPIHAVTFVDNHDSQPGEALESFVQSWFKP

SEQ ID No 13(296)SQQGGSYDMRNILRGSLVEAHPMHAVTFVDNHDTQPGESLESWVADWFKP

SEQ ID No 14(296)SKQGGSYDMRNILRGSLVEAHPIHAVTFVDNHDTQPGESLESWVADWFKP

SEQ ID No 15(297)SKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKP

共有序列 (301)SKSGGAYDMR LL GTLV HP AVTFVDNHDTQPGQALESWVD WFKP

351 400

SEQ ID No 1 (349)LAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYN---IPSLKSKIDPLLIARRDYA

SEQ ID No 2 (349)LAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYN---IPSLKSKIDPLLIARRDYA

SEQ ID No 3 (349)LAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYN---IPSLKSKIDPLLIARRDYA

SEQ ID No 4 (349)LAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYN---IPSLKSKIDPLLIARRDYA

SEQ ID No 5 (349)LAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYN---IPSLKSKIDPLLIARRDYA

SEQ ID No 6 (351)LAYALTLTREQGYPSVFYGDYYGIPTHG---VPAMRSKIDPILEARQKYA

SEQ ID No 7 (346)LAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGDSQREIPALKHKIEPILKARKQYA

SEQ ID No 8 (346)LAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGDSQREIPALKHKIEPILKARKQYA

SEQ ID No 9 (346)LAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGTSPKEIPSLKDNIEPILKARKEYA

SEQ ID No 10(351)LAYALTLTREQGYPSVFYGDYYGIPTHG---VPAMKSKIDPILEARQKYA

SEQ ID No 11(351)LAYALILTREQGYPSVFYGDYYGIPTHS---VPAMKAKIDPILEARQNFA

SEQ ID No 12(351)LAYALILTREQGYPSVFYGDYYGIPTHG---VPSMKSKIDPLLQARQTYA

SEQ ID No 13(346)LAYATILTREGGYPNVFYGDYYGIPNDN---ISAKKDMIDELLDARQNYA

SEQ ID No 14(346)LAYATILTREGGYPNVFYGDYYGIPNDN---ISAKKDMIDELLDARQNYA

SEQ ID No 15(347)LAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYN---IPSLKSKIDPLLIARRDYA

共有序列 (351)LAYAFILTRE GYP VFYGDYYGIPQYN IPSLKSKIDPLL ARR YA

401 450

SEQ ID No 1 (396)YGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHA

SEQ ID No 2 (396)YGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHA

SEQ ID No 3 (396)YGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHA

SEQ ID No 4 (396)YGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHA

SEQ ID No 5 (396)YGTQHDYLDHSDIIGWTREGVTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHA

SEQ ID No 6 (398)YGKQNDYLDHHNIIGWTREGNTAHPNSGLATIMSDGAGGSKWMFVGRNKA

SEQ ID No 7 (396)YGAQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVANSGLAALITDGPGGAKRMYVGRQNA

SEQ ID No 8 (396)YGAQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVANSGLAALITDGPGGAKRMYVGRQNA

SEQ ID No 9 (396)YGPQHDYIDHPDVIGWTREGDSSAAKSGLAALITDGPGGSKRMYAGLKNA

SEQ ID No 10(398)YGRQNDYLDHHNIIGWTREGNTAHPNSGLATIMSDGAGGNKWMFVGRNKA

SEQ ID No 11(398)YGTQHDYFDHHNIIGWTREGNTTHPNSGLATIMSDGPGGEKWMYVGQNKA

SEQ ID No 12(398)YGTQHDYFDHHDIIGWTREGDSSHPNSGLATIMSDGPGGNKWMYVGKHKA

SEQ ID No 13(393)YGTQHDYFDHWDVVGWTREGSSSRPNSGLATIMSNGPGGSKWMYVGRQNA

SEQ ID No 14(393)YGTQHDYFDHWDIVGWTREGTSSRPNSGLATIMSNGPGGSKWMYVGQQHA

SEQ ID No 15(394)YGTQHDYLDHSDIIGWTREGGTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHA

共有序列 (401)YGTQHDYLDH DIIGWTREG TSKPNSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQ A

451 500

SEQ ID No 1(446) GKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTTVSTIARPIT

SEQ ID No 2(446) GKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTT---------

SEQ ID No 3(446) GKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTTVSTIARPIT

SEQ ID No 4(446) GKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTTVSTIARPIT

SEQ ID No 5(446) GKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTTVSTIARPIT

SEQ ID No 6(448) GQVWSDITGNRTGTVTINADGWGNFSVNGGSVSIWVNK------------

SEQ ID No 7(446) GETWHDITGNRSEPVVINSEGWGEFHVNGGSVSIYVQR------------

SEQ ID No 8(446) GETWHDITGNRSEPVVINSEGWGEFHVNGGSVSIYVQR------------

SEQ ID No 9(446) GETWYDITGNRSDTVKIGSDGWGEFHVNDGSVSIYVQK------------

SEQ ID No 10(448)GQVWTDITGNRAGTVTINADGWGNFSVNGGSVSIWVNK------------

SEQ ID No 11(448)GQVWHDITGNKPGTVTINADGWANFSVNGGSVSIWVKR------------

SEQ ID No 12(448)GQVWRDITGNRSGTVTINADGWGNFTVNGGAVSVWVKQ------------

SEQ ID No 13(443)GQTWTDLTGNNGASVTINGDGWGEFFTNGGSVSVYVNQ------------

SEQ ID No 14(443)GQTWTDLTGNHAASVTINGDGWGEFFTNGGSVSVYVNQ------------

SEQ ID No 15(444)GKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTTVS-------

共有序列 (451)G VWYDLTGNRSDTVTINSDGWGEF VNGGSVSVWV R

501 520

SEQ ID No 1 (496)TRPWTGEFVRWTEPRLVAWP

SEQ ID No 2 (487)--------------------

SEQ ID No 3 (496)TRPWTGEFVRWTEPRLVAWP

SEQ ID No 4 (496)TRPWTGEFVRWTEPRLVAWP

SEQ ID No 5 (496)TRPWTGEFVRWTEPRLVAWP

SEQ ID No 6 (486)--------------------

SEQ ID No 7 (484)--------------------

SEQ ID No 8 (484)--------------------

SEQ ID No 9 (484)--------------------

SEQ ID No 10(486)--------------------

SEQ ID No 11(486)--------------------

SEQ ID No 12(486)--------------------

SEQ ID No 13(481)--------------------

SEQ ID No 14(481)--------------------

SEQ ID No 15(487)--------------------

共有序列(501)

SEQ ID NO：16：截短的嗜热脂肪土芽孢杆菌

α-淀粉酶(AmyS、a/k/a“Ethyl3”)蛋白质序列。信号序列显示为粗体。

1

AAPFNGTMMQY FEWYL

51 PDDGTLWTKV ANEANNLSSL GITALWLPPA YKGTSRSDVGYGVYDLYDLG

101 EFNQKGTVRT KYGTKAQYLQ AIQAAHAAGM QVYADVVFDHKGGADGTEWV

151 DAVEVNPSDR NQEISGTYQI QAWTKFDFPG RGNTYSSFKWRWYH FDGVDW

201 DESRKLSRIY KFIGKAWDWE VDTENGNYDY LMYADLDMDHPEVVTELKNW

251 GKWYVNTTNI DGFRLDAVKH IKFSFFPDWL SYVRSQTGKPLFTVGEYWSY

301 DINKLHNYIT KTNGTMSLFD APLHNKFYTA SKSGGAFDMRTLMTNTLMKD

351 QPTLAVTFVD NHDTEPGQAL QSWVDPWFKP LAYAFILTRQEGYPCVFYGD

401 YYGIPQYNIP SLKSKIDPLL IARRDYAYGT QHDYLDHSDIIGWTREGVTE

451 KPGSGLAALI TDGPGGSKWM YVGKQHAGKV FYDLTGNRSDTVTINSDGWG

501 EFKVNGGSVS VWVPRKTT

SEQ ID NO：17：用于诱变的S242引物：

S242F：5’[Phos]GTCAAGCATATTAAGTTCNNSTTTTTTCCTGATTGGTTG 3’

SEQ ID NO：18：用于诱变的S242引物：

S242R：5’[Phos]CAACCAATCAGGAAAAAASNNGAACTTAATATGCTTGAC3’

SEQ ID NO：19：布丘氏菌属BP-17植酸酶的成熟蛋白质序列

NDTPASGYQV EKVVILSRHG VRAPTKMTQT MRDVTPNTWP

EWPVKLGYIT

PRGEHLISLM GGFYRQKFQQ QGILSQGSCP TPNSIYVWAD

VDQRTLKTGE

AFLAGLAPQC GLTIHHQQNL EKADPLFHPV KAGTCSMDKT

QVQQAVEKEA

QTPIDNLNQH YIPFLALMNT TLNFSTSAWC QKHSADKSCD

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SEQ ID NO：20：

FREDα-淀粉酶氨基酸序列。

1 ANLNGTLMQY FEWYTPNDGQ HWKRLQNDSA YLAEHGITAVWIPPAYKGTS

51 QADVGYGAYD LYDLGEFHQK GTVRTKYGTK GELQSAIKSLHSRDINVYGD

101 VVINHKGGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS GEYLIKAWTHFHFPGRGSTY

151 SDFKWHWYHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK AWDWEVSSENGNYDYLMYAD

201 IDYDHPDVVA EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSFLRDWVNHVRE

251 KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL ENYLNKTNFN HSVFDVPLHYQFHAASTQGG

301 GYDMRKLLNG TVVSKHPLKS VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQTWFKPLAYAF

351 ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL KHKIEPILKARKQYAYGAQH

401 DYFDHHDIVG WTREGDSSVA NSGLAALITD GPGGAKRMYVGRQNAGETWH

451 DITGNRSEPV VINSEGWGEF HVNGGSVSIY VQR

Claims

1.α-淀粉酶混合物，其包含：

(i)嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)α-淀粉酶(AmyS)，其使用在SEQ ID NO：2中所示的氨基酸编号***，其中替换了S242位置处的氨基酸；和

(ii)地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)α-淀粉酶。

2.权利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其进一步包含植酸酶。

3.权利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述混合物包含重量比为大约40％的具有S242替换的AmyS和大约60％的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。

4.权利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中具有S242替换的AmyS与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的重量比为10∶90。

5.权利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，进一步地其包含大约1400AAU/g至大约14000AAU/g的具有S242替换的AmyS和大约8000LU/g至大约19000LU/g地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的活度比率。

6.权利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述AmyS包含SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的多肽序列。

7.权利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述AmyS包含SEQ IDNO：4的多肽序列。

8.权利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述AmyS选自包含SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、15和16的多肽序列的AmyS酶之一。

9.权利要求1、6、7或8中任一项所述的α-淀粉酶混合物，其中所述S242替换是S242A、S242E、S242Q、S242F、S242H或S242N替换。

10.权利要求1、6、7或8中任一项所述的α-淀粉酶混合物，其中所述具有在S242位置处替换的AmyS与在S242位置处没有替换的AmyS比较在约80℃至约95℃之间具有更高的热稳定性。

11.权利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述AmyS包含与SEQID NO：1的AmyS具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且其中所述AmyS具有α-淀粉酶活性。

12.权利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述地衣芽孢杆菌α-淀粉酶包含纯化的野生型酶。

13.权利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述地衣芽孢杆菌α-淀粉酶包含野生型序列的选自M15T、H133Y、N188S和A209V的一个或多个氨基酸替换。

14.权利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述地衣芽孢杆菌α-淀粉酶包含在SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列。

15.权利要求1中所述的α-淀粉酶混合物，其中所述地衣芽孢杆菌α-淀粉酶包含与SEQ ID NO：20具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。

16.用于液化淀粉的方法，其包括：

添加权利要求1所述的淀粉酶混合物到包含淀粉的溶液中，并液化包含淀粉的溶液以形成浆液。

17.权利要求16所述的方法，其中所述淀粉酶混合物具有大约40％(作为AAU/g DS)的具有S242替换的AmyS和大约60％(作为LU/g DS)的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的活度比率。

18.权利要求16所述的方法，其中所述淀粉获自植物材料、谷物、买罗高梁、黑麦、大麦、小麦、高粱、燕麦、稻、糠、木薯、谷子、马铃薯、甘薯或木薯粉。

19.权利要求18所述的方法，其中所述淀粉是来自干磨法或湿磨法的颗粒淀粉。

20.权利要求16所述的方法，其进一步包括初级和/或次级液化步骤，包括在初级和/或次级液化步骤中添加额外的底物到浆液中。

21.权利要求16所述的方法，其进一步包括添加植酸水解酶。

22.权利要求16所述的方法，其进一步包括糖化所述液化的淀粉以获得可发酵糖。

23.权利要求22所述的方法，其进一步包括在合适的发酵条件下发酵可发酵糖以获得醇终产物。

24.权利要求23所述的方法，其中所述醇终产物是乙醇或丁醇。

25.权利要求16所述的方法，其中所述液化的pH范围为pH4.5至pH5.4，并且不添加酸中和化学物质到该液化工艺步骤中。

26.权利要求16所述的方法，其中所述液化的pH范围为pH4.8至pH5.8，并且不添加酸中和化学物质到该液化工艺步骤中。

27.获得可发酵底物的方法，包括：

将含有颗粒淀粉的磨碎谷物浆液与植酸水解酶和权利要求1所述的α-淀粉酶混合物在比淀粉凝胶化温度低0℃至30℃的温度接触，升高温度高于凝胶化温度，水解凝胶化的淀粉，和获得可发酵底物。

28.生产可发酵糖的方法，包括

(a)将磨碎的含有淀粉的材料与水和稀釜馏物混合，其中所述稀釜馏物是在10至70％v/v范围，和获得包含淀粉及具有20至50％w/w干固体(ds)含量的浆液，

(b)用植酸酶在液化淀粉之前或在液化淀粉的同时处理所述浆液，

(c)液化所述淀粉，

(d)在步骤(b)期间和/或与液化步骤同时地添加权利要求1所述的α-淀粉酶混合物至所述淀粉，和

(e)糖化所述液化的淀粉以获得可发酵糖，其中在步骤(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的任一步骤期间不调节pH。

29.权利要求28所述的方法，其中所述可发酵糖是回收的和纯化的或异构化的。

30.权利要求28所述的方法，其中在液化步骤之前添加所述植酸酶。

31.权利要求28所述的方法，其中将所述α-淀粉酶混合物随所述植酸酶一起添加。

32.权利要求28所述的方法，其中在液化步骤期间添加或者在糖化步骤期间添加第二份α-淀粉酶混合物剂量。

33.用于生产葡萄糖的方法，包括：

将淀粉底物与权利要求1所述的淀粉酶混合物接触，液化所述淀粉底物，和高温温育所述底物以产生包含葡萄糖的产物。

34.权利要求33所述的方法，其中所述温育步骤是次级液化步骤。

35.权利要求33所述的方法，其中所述温育步骤在大约90-100℃的温度进行。

36.权利要求33所述的方法，其中进行足够时间的温育以使产物包含大约2-14DE的葡萄糖。

37.权利要求36所述的方法，其中进行足够时间的温育以使产物包含大约10DE的葡萄糖。

38.权利要求33所述的方法，进一步包括糖化所述产物以产生富含葡萄糖的溶液。

39.权利要求38所述的方法，其中所述富含葡萄糖的溶液包含80-99％的葡萄糖。

40.权利要求39所述的方法，其中所述富含葡萄糖的溶液包含约93-96％的葡萄糖。

41.权利要求38所述的方法，其中所述糖化包括将所述葡萄糖产物与葡糖淀粉酶或者包含葡糖淀粉酶和支链淀粉酶的酶混合物接触。