KR20220150986A

KR20220150986A - 면역조절을 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20220150986A
Application number: KR1020227036647A
Authority: KR
Inventors: 조르디 마타-핀크; 존 라운드; 노우바 비. 아피얀; 아바크 카비지안
Original assignee: 루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨.
Priority date: 2014-04-01
Filing date: 2015-03-13
Publication date: 2022-11-11
Also published as: US20170020926A1; IL278643B; EP3125927B1; IL248143A0; US11576934B2; JP2017517485A; AU2015241422B2; KR20170005801A; RU2016142671A; JP2019206573A; MA39819A; RU2016142671A3; JP6865253B2; JP2023052281A; JP6735233B2; IL248143B; PT3125927T; US11554141B2; US20180271910A1; AU2019208203B2

Abstract

외인성 항원을 함유하는 세포 및 그의 용도가 제공된다.

Description

면역조절을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMMUNOMODULATION}

본 발명의 분야는 질병 및 장애의 치료를 위한 약제학적 조성물이다.

본 발명은 PCT/US2014/065304(2014.11.12), JP 2017-504568 A(2017.2.9) 등에 우선권으로 주장된 선행문헌들에 의해 그 배경기술이 설명된다.

비정상적인 면역 활성화는 많은 인간 질병 및 질환의 특징이다. 신체의 면역계가 자가 항원을 비-자가로 부적절하게 감지하고, 자신의 신체 조직을 공격하는 경우에 자가면역 질병이 발생한다. 염증 질병 및 알러지는 신체의 면역계가 통상의 음식-유래 또는 환경 항원에 의해 부적절하게 촉발되는 경우에 발생할 수 있다. 다양한 인간 질병을 치료하기 위해 사용되는 폴리펩티드 및 단백질은 마치 그들이 외래 항원인 것처럼 그들에 반응하는 면역 세포에 의해 종종 파괴되거나, 중화되거나, 또는 다르게는 무효하게 된다.

부적절한 면역 활성화의 질병의 현재의 치료는 코르티코스테로이드와 같은 화학적 작용제, 또는 항히스타민, 항체 또는 사이토카인과 같은 염증 매개체의 억제제를 사용한 면역억제를 수반한다(Hartono et al., Cold Spring Harbor Perspectives Med. 3:a015487, 2013). 이들 일반적인 치료는 그들이 면역계를 광범위하게 억제하기 때문에, 유의미한 병적 상태, 예를 들어, 감염에 대한 감수성과 관련이 있다.

일부 중증 알러지에 있어서, 시간에 따라 천천히 증가하는 용량의 문제의 단백질에 대한 노출에 의해 알러지원에 대한 "관용"을 유도하기 위한 임상 시험이 진행 중이다. 지금까지, 이들 치료에는 장기간 효능이 결여되어 있고, 중증 과민증의 위험과 관련이 있다.

이들 질병을 치료하기 위한 신규한 치료제가 필요하다.

요약

특정 양태에서, 본 발명은 항원을 발현하는 단리된 제핵 조혈 세포에 관한 것이다. 제핵 조혈 세포는 본원에서 "EHCs"(또는 그의 단수 형태로: "EHC")로 지칭될 것이다. 일부 구현예에서, 제핵 조혈 세포 또는 EHC에는 핵 물질이 결여되어 있다. 예를 들어, EHC는 적혈구계(erythroid) 세포 또는 혈소판계(thromboid) 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵 물질이 결여된 EHC는 적혈 세포, 적혈구, 망상적혈구 또는 혈소판이다. 일부 구현예에서, 제핵 조혈 세포 또는 EHC는 예를 들어, 그들의 핵 물질을 소실하도록 유도되거나, 기능적으로 제핵되고 복제할 수 없게 된 유핵 전구 적혈구계 세포 또는 전구 혈소판계 세포이다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 순환 세포, 예를 들어, 적혈구이다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 정의된 인자를 사용하여 조혈 전구체로부터 배양된다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 혈소판계 세포, 예를 들어, 혈소판이다. 일부 구현예에서, 혈소판계 세포는 정의된 인자를 사용하여 조혈 전구체로부터 배양된다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 자가 또는 동종이계 이용을 위한, 항원과 접촉되는 환자로부터 단리된 일차 세포이다.

본 발명의 특정 양태는 예를 들어, 외인성 항원-발현 EHC를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 대상체에게 투여되는 경우, 면역 관용을 유도할 수 있는 외인성 항원-발현 EHC에 관한 것이다. EHC에 의해 발현되는 외인성 항원은 특정 질병, 장애 또는 질환에 맞추어질 수 있다. 외인성 항원-발현 EHC는 다수의 방식, 예를 들어, 관심 항원의 표면 디스플레이, 세포내 발현, 세포내 로딩 또는 표면 컨쥬게이션으로 항원을 포함할 수 있다. 외인성 항원-발현 EHC는 비정상적인 면역 활성화의 질병을 기존의 치료보다 더욱 효율적으로 및/또는 더 적은 부작용으로 관리할 수 있다. 예를 들어, 외인성 항원-발현 EHC는 선택적으로 면역계를 조절하면서, 더 넓은 면역계 생리가 실질적으로 교란되지 않게 할 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 항원-특이적 T 및 B 림프구의 파괴, 불활성화 및/또는 아네르기(anergy)를 유도할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 외인성 항원-발현 EHC는 항원-특이적 조절 T 림프구의 증식을 유도할 수 있다.

본 발명의 특정 양태는 자가면역 질병, 예를 들어, 다발경화증, 1형 당뇨병, 류마티스 관절염 및 막성 신장염에서 면역 세포에 의해 인식되는 외인성 항원을 포함하는 외인성 항원-발현 EHC에 관한 것이다.

본 발명의 특정 양태는 염증성 질병, 예를 들어, 크론병, 궤양대장염, 셀리악병 또는 기타 특발성 염증성 장 질병에서 면역 세포에 의해 인식되는 외인성 항원을 포함하는 외인성 항원-발현 EHC에 관한 것이다.

본 발명의 특정 양태는 인간 백혈구 항원(HLA) 불일치-매개의 질병, 예를 들어, 이식편대숙주병 또는 기관 이식 거부에서 면역 세포에 의해 인식되는 외인성 항원을 포함하는 외인성 항원-발현 EHC에 관한 것이다.

본 발명의 특정 양태는 알러지 질병, 예를 들어, 천식, 땅콩 알러지, 갑각류 알러지, 꽃가루 알러지, 유단백질 알러지, 곤충 자상 알러지 및 라텍스 알러지에서 면역 세포에 의해 인식되는 외인성 항원을 포함하는 외인성 항원-발현 EHC에 관한 것이다.

본 발명의 특정 양태는 효능 또는 효력이 면역 세포에 의해 감소되거나 손상되는 치료 단백질, 예를 들어, 혈우병 A에서 응고 인자 VIII, 혈우병 B에서 응고 인자 IX, 류마티스 관절염 및 기타 염증성 질병에서 항-종양 괴사 인자 알파(TNFα) 항체, 고셰병에서 글루코세레브로시다제, 또는 급성 림프모구성 백혈병(ALL)에서 아스파라기나제인 외인성 항원을 포함하는 외인성 항원-발현 EHC에 관한 것이다.

본 발명의 특정 양태는 a) 보체 조절을 매개하거나, b) 면역 복합체, c) 자가면역 항체 또는 d) 병원성 입자의 결합 및 격리를 매개하는 전장, 절두형 및 키메라 융합체의 폴리펩티드를 포함하는 외인성 항원을 포함하는 외인성 항원-발현 EHC에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 외인성 항원은 예를 들어, 폴리펩티드 기질의 절단을 포함하여, 하나의 소분자 기질이 다른 소분자 생성물로 전환되는 것 또는 하나의 폴리펩티드 기질이 제2 폴리펩티드 생성물로 전환되는 것에서, 효소적으로 활성인 전장, 절두형 및 키메라 융합체의 폴리펩티드를 포함한다.

특정 양태에서, 본 발명은 또한 외인성 항원-발현 EHC 및 본원에 제공된 그의 약제학적 조성물을 사용한 질병의 치료 방법을 제공한다.

일부 양태에서, 면역 관용의 유도 방법이 본원에 개시된다. 당해 방법은 자가면역 질병, 장애 또는 질환을 앓고 있거나, 그것이 발생할 위험이 있는 인간 대상체에게 외인성 항원을 발현하는 제핵 조혈 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계로서, 약제학적 조성물이 대상체에서 자가면역 질병, 장애 또는 질환을 매개하는 항원에 대한 면역 관용을 유도하기 위한 유효량으로 투여되는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 자가면역 질병은 다발경화증, 1형 당뇨병 및 표 F에 열거된 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 당해 방법은 자가면역 질병, 장애 또는 질환이 치료되거나, 그의 증상이 감소되도록 약제학적 조성물을 치료 기간에 걸쳐 적어도 2회 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

특정 구현예에서, 당해 방법은 자가면역 질병, 장애 또는 질환이 예방되도록 약제학적 조성물을 치료 기간에 걸쳐 적어도 2회 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

다른 구현예에서, 당해 방법은 항원-특이적 면역 세포의 백분율이 치료 기간 동안 실질적으로 감소되도록 약제학적 조성물을 치료 기간에 걸쳐 충분한 횟수로 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 B 세포이다.

일부 구현예에서, 항원-특이적 면역 세포의 농도의 감소는 대상체로부터 취한 생물학적 시료로부터 유세포계수법에 의해 측정된다.

일부 구현예에서, 생물학적 시료는 림프절 생검, 비장 시료 또는 말초 혈액이다.

일부 구현예에서, 항원-특이적 면역 세포의 농도는 일부 또는 전체의 치료 기간 동안 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99% 또는 99.99% 초과로 감소된다.

다른 구현예에서, 항원-특이적 면역 세포의 농도는 약 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50분 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23시간 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6주의 투여 내에 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99% 또는 99.99% 초과로 감소된다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 항원-특이적 면역 세포의 농도가 적어도 약 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 6개월 초과 동안 실질적으로 감소되도록 치료 기간에 걸쳐 충분한 횟수로 투여된다.

특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 항원-특이적 면역 세포의 농도가 적어도 치료 기간만큼 긴 기간 동안 실질적으로 감소되도록 치료 기간에 걸쳐 충분한 횟수로 투여된다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 순환 중 항원-특이적 항체의 농도가 치료 기간 동안 실질적으로 감소되도록 치료 기간에 걸쳐 충분한 횟수로 투여된다.

일부 구현예에서, 순환 중 항원-특이적 항체의 농도는 ELISA에 의해 측정된다.

일부 구현예에서, 항원-특이적 순환 항체의 농도는 일부 또는 전체의 치료 기간 동안 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99% 또는 99.99% 초과로 감소된다.

일부 구현예에서, 항원-특이적 항체의 농도는 약 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50분 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23시간 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6주의 투여 내에 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99% 또는 99.99% 초과로 감소된다.

특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 항원-특이적 순환 항체의 농도가 적어도 약 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 6개월 초과 동안 실질적으로 감소되도록 치료 기간에 걸쳐 충분한 횟수로 투여된다.

특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 항원-특이적 순환 항체의 농도가 적어도 치료 기간만큼 긴 기간 동안 실질적으로 감소되도록 치료 기간에 걸쳐 충분한 횟수로 투여된다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 항원-특이적 조절 T 세포의 백분율이 치료 기간 동안 실질적으로 감소되도록 치료 기간에 걸쳐 충분한 횟수로 투여된다.

특정 구현예에서, 항원-특이적 조절 T 세포의 농도는 일부 또는 전체의 치료 기간 동안 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99% 또는 99.99% 초과로 증가된다.

특정 구현예에서, 항원-특이적 조절 T 세포의 농도는 약 1, 5, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50분 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23시간 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6주의 투여 내에 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.99% 또는 99.99% 초과로 증가된다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 항원-특이적 조절 T 세포의 농도가 적어도 약 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 6개월 초과 동안 실질적으로 증가되도록 치료 기간에 걸쳐 충분한 횟수로 투여된다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 항원-특이적 조절 T 세포의 농도가 적어도 치료 기간만큼 긴 기간 동안 실질적으로 증가되도록 치료 기간에 걸쳐 충분한 횟수로 투여된다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 자가면역 질병, 장애 또는 질환의 하나 이상의 증상이 예방되거나, 감소되거나, 지연되도록 치료 기간에 걸쳐 충분한 횟수로 투여된다.

일부 구현예에서, 치료 기간은 1년, 6개월, 3개월, 2개월, 1개월, 2주, 1주, 3일, 2일, 1일보다 길지 않다.

특정 구현예에서, 치료 기간 내의 투여 간의 시간 간격은 외인성 항원을 발현하는 제핵 조혈 세포의 수가 투여되는 약제학적 조성물에 존재하는 외인성 항원을 발현하는 제핵 조혈 세포의 수의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 미만으로 감소되는 기간보다 길지 않다.

일부 구현예에서, 투여의 빈도는 항원-특이적 면역 세포의 농도를 자가면역 질병, 장애 또는 질환의 증상과 관련이 있는 수준 미만으로 효율적으로 감소시키기에 충분하다.

특정 구현예에서, 투여의 빈도는 항원-특이적 순환 항체의 농도를 자가면역 질병, 장애 또는 질환의 증상과 관련이 있는 수준 미만으로 효율적으로 감소시키기에 충분하다.

특정 구현예에서, 투여의 빈도는 항원-특이적 조절 T 세포의 농도를 자가면역 질병, 장애 또는 질환의 증상과 관련이 있는 역치 수준 초과로 효율적으로 증가시키기에 충분하다.

일부 구현예에서, 제핵 조혈 세포는 적혈구계 세포, 혈소판계 세포 또는 그의 전구체이다. 일부 구현예에서, 적혈구계 세포는 적혈구 또는 망상적혈구이다. 일부 구현예에서, 혈소판계 세포는 혈소판이다.

일부 구현예에서, 제핵 조혈 세포는 공여자로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 제핵 조혈 세포는 대상체로부터 자가 유래된다. 일부 구현예에서, 제핵 조혈 세포는 동종이계 유래된다. 일부 구현예에서, 제핵 조혈 세포는 이종 유래된다.

일부 구현예에서, 유핵 조혈 세포는 유핵 전구 세포의 핵의 축출을 유도하는 배양-기반의 과정에 의해 유핵 전구 세포로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 제핵 조혈 세포는 유핵 전구 세포의 핵을 제거하도록 화학적으로 또는 물리적으로 조작된 유핵 전구 세포로부터 생성된다.

일부 구현예에서, 제핵 조혈 세포는 유핵 전구 세포의 핵의 방사선조사 또는 화학적 파괴에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 화학적 파괴는 사이토칼라신(Cytochalasin) B로 수행된다. 일부 구현예에서, 방사선조사는 적어도 5 Gy, 7 Gy, 10 Gy, 15 Gy, 25 Gy, 30 Gy, 40 Gy 또는 적어도 50 Gy로 수행된다.

일부 구현예에서, 외인성 항원은 외인성 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드이다.

일부 구현예에서, 외인성 항원은 제핵 조혈 세포의 세포막과 회합된다.

일부 구현예에서, 외인성 항원은 융합체 또는 키메라 폴리펩티드이다.

일부 구현예에서, 융합체 또는 키메라는 S 도메인, A 도메인 또는 U 도메인 중 적어도 하나를 포함하며, S 도메인은 제핵 조혈 세포상의 표면 도메인이고, A 도메인은 세포막 내의 또는 그 상의 앵커(anchor)이고, U 도메인은 제핵 조혈 세포의 세포내 비노출된 측을 향하고, S 도메인, A 도메인 및/또는 U 도메인은 상이한 폴리펩티드 기원의 것이다.

일부 구현예에서, S 도메인 및/또는 A 도메인은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250개 또는 적어도 500개 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, S 도메인 및/또는 A 도메인은 적어도 500, 750 또는 적어도 1,000개 아미노산을 포함한다.

일부 구현예에서, 외인성 항원은 수초 염기성 단백질, 단백지질 단백질, 수초 희소돌기아교세포 당단백질, 췌장 베타 세포 항원, 인슐린 및 표 F, 표 6 및 표 8에 열거된 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 제핵 조혈 세포는 적어도 10 카피, 100 카피, 1,000 카피, 10,000 카피, 25,000 카피, 50,000 카피, 100,000 카피, 500,000 카피, 1,000,000 카피 또는 2,000,000 카피의 외인성 항원을 포함한다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적 활성 작용제를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 당해 방법은 약제학적 활성 작용제를 투여하는 단계로서, 약제학적 활성 작용제가 약제학적 조성물 이전에, 그 이후에 또는 그와 동시에 투여되는 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 정맥내 투여된다.

일부 구현예에서, 약제학적 활성 작용제는 생물학적 작용제, 소분자 작용제 또는 핵산 작용제로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다.

특정 구현예에서, 당해 방법은 치료를 위하여, 혈전성 혈소판감소성 자반증, CAPS, APS, 중증 근무력증, 굿파스쳐 증후군, 막성 신장염, 1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 다발경화증, 크론병 또는 표 F 및 표 G에 열거된 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가면역 질병, 장애 또는 질환을 앓고 있거나, 그 위험이 있는 대상체를 선택하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 양태에서, 외인성 항원을 발현하는 제핵 조혈 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 개시되며, 전술한 청구범위 중 어느 하나의 방법에 의해 투여되는 유효량의 약제학적 조성물의 투여는 자가면역 질병, 장애 또는 질환을 앓고 있거나, 그것이 발생할 위험이 있는 인간 대상체에서 면역 관용을 유도할 수 있다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 외인성 항원을 발현하는 조혈 세포의 모집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 외인성 항원을 발현하는 적어도 1x103개의 조혈 세포를 포함한다.

약제학적 조성물의 특정 구현예에서, 외인성 항원을 발현하는 조혈 세포는 약 10 nl, 100 nl, 1 ㎕, 10 ㎕, 100 ㎕, 1 ㎖, 10 ㎖, 20 ㎖ 또는 50 ㎖의 부피로 제공된다. 약제학적 조성물의 다른 구현예에서, 외인성 항원을 발현하는 조혈 세포는 약 1 ㎖, 10 ㎖, 20 ㎖, 50 ㎖, 100 ㎖, 250 ㎖ 또는 500 ㎖의 부피로 제공된다.

약제학적 조성물의 일부 구현예에서, 조성물은 장기간 보관을 위해 제형화된다. 약제학적 조성물의 일부 구현예에서, 조성물은 동결된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적 활성 작용제를 포함한다.

약제학적 조성물의 특정 구현예에서, 약제학적 활성 작용제는 생물학적 작용제, 소분자 작용제 또는 핵산 작용제로부터 선택된다.

일부 양태에서, 정맥내 주사를 위한 액체 현탁액으로서 제형화된 본원에 기재된 조성물을 포함하는 투여형이 본원에 개시된다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물을 보유하는 용기 및 대상체로의 약제학적 조성물의 정맥내 주사를 위한 애플리케이터(applicator)를 포함하는 의료 장치가 본원에 개시된다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물 및 대상체로의 약제학적 조성물의 정맥내 주사를 위한 의료 장치를 포함하는 의료 키트가 본원에 개시된다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 투여되는 약제학적 조성물의 외인성 항원을 발현하는 조혈 세포가 본원에 개시된다.

일부 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 외인성 항원을 발현하는 조혈 세포의 모집단이 본원에 개시된다.

일부 구현예에서, 외인성 항원을 발현하는 조혈 세포의 모집단은 액체로 제형화된다.

일부 구현예에서, 외인성 항원을 발현하는 조혈 세포의 모집단은 동결된다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 조혈 세포 모집단에 의해 발현되는 단리된 항원이 본원에 개시된다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 외인성 항원을 인코딩하는 외인성 핵산이 본원에 개시된다.

일부 양태에서, S 도메인, A 도메인 또는 U 도메인 중 적어도 하나를 포함하는 외인성 항원을 포함하는 제핵 조혈 세포가 본원에 개시되며, S 도메인은 세포외 표면 도메인이고, A 도메인은 앵커이고, U 도메인은 세포내 국소화되며, 제핵 조혈 세포는 대상체로 투여되는 경우, 면역 관용을 유도할 수 있다.

본원에 개시된 제핵 조혈 세포의 일부 구현예에서, 외인성 항원은 융합체 또는 키메라 폴리펩티드이다.

본원에 개시된 제핵 조혈 세포의 일부 구현예에서, S 도메인, A 도메인 및/또는 U 도메인은 상이한 폴리펩티드 기원의 것이다.

본원에 개시된 제핵 조혈 세포의 특정 구현예에서, S 도메인 및/또는 A 도메인은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 또는 적어도 500개 아미노산을 포함한다.

본원에 개시된 제핵 조혈 세포의 특정 구현예에서, S 도메인 및/또는 A 도메인은 적어도 500, 750 또는 적어도 1,000개 아미노산을 포함한다.

본원에 개시된 제핵 조혈 세포의 일부 구현예에서, 외인성 항원은 수초 염기성 단백질, 단백지질 단백질, 수초 희소돌기아교세포 당단백질, 췌장 베타 세포 항원, 인슐린 및 표 F, 표 6 및 표 8에 열거된 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 제핵 조혈 세포는 적혈구계 세포, 혈소판계 세포 또는 그의 전구체이다. 일부 구현예에서, 적혈구계 세포는 적혈구 또는 망상적혈구이다. 일부 구현예에서, 혈소판계 세포는 혈소판이다.

특정 구현예에서, 제핵 조혈 세포는 유핵 전구 세포의 핵의 축출을 유도하는 배양-기반의 과정에 의해 유핵 전구 세포로부터 유래된다.

특정 구현예에서, 제핵 조혈 세포는 유핵 전구 세포의 핵을 제거하도록 화학적으로 또는 물리적으로 조작된 유핵 전구 세포로부터 생성된다.

특정 구현예에서, 제핵 조혈 세포는 유핵 전구 세포의 핵의 방사선조사 또는 화학적 파괴에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 화학적 파괴는 사이토칼라신 B로 수행된다. 일부 구현예에서, 방사선조사는 적어도 5 Gy, 7 Gy, 10 Gy, 15 Gy, 25 Gy, 30 Gy, 40 Gy 또는 적어도 50 Gy로 수행된다.

본원에 개시된 제핵 조혈 세포의 일부 구현예에서, 외인성 항원은 외인성 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드이다.

본원에 개시된 제핵 조혈 세포의 일부 구현예에서, 세포는 인간 공급원으로부터 유래된다.

본원에 개시된 제핵 조혈 세포의 일부 구현예에서, 세포는 돼지, 침팬지, 마카크(macaque), 비-인간 영장류 및 비-영장류 포유류로 이루어진 군으로부터 선택되는 비-인간 공급원으로부터 유래된다.

본원에 개시된 제핵 조혈 세포의 일부 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 세포내로 국소화된다. 본원에 개시된 제핵 조혈 세포의 일부 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 세포의 표면상에 세포외로 국소화된다. 본원에 개시된 제핵 조혈 세포의 일부 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 내인성 세포 단백질에 융합된다. 본원에 개시된 제핵 조혈 세포의 일부 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 내인성 막횡단 단백질의 세포내 영역에 융합된다. 본원에 개시된 제핵 조혈 세포의 일부 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 내인성 막횡단 단백질의 세포외 영역에 융합된다. 본원에 개시된 제핵 조혈 세포의 일부 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 고정 단백질에 융합된다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 제핵 조혈 세포를 포함하는 조직 배양 뱃치(batch)가 본원에 개시된다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 제핵 조혈 세포의 모집단이 본원에 개시된다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 세포 모집단을 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 개시된다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물을 대상체에서 면역 관용을 유도하기에 충분한 양 및/또는 빈도로 면역 관용의 유도를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 관용의 유도 방법이 본원에 개시된다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물을 면역 활성화 질병을 치료하기에 충분한 양 및/또는 빈도로 면역 활성화 질병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 활성화 질병의 치료 방법이 본원에 개시된다.

일부 구현예에서, 질병은 자가-항체 매개의 질병, 자가면역 질병, 염증성 질병, 알러지 질병, HLA-불일치 매개의 질병 및 면역원성 치료적 단백질에 의해 치료가능한 질병으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 양태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물을 치료적 단백질 치료 섭생법에 대한 반응에서의 면역 활성화를 실질적으로 감소시키거나, 완화시키기에 충분한 양 및/또는 빈도로 치료적 단백질 치료 섭생법에 대한 반응에서의 면역 활성화의 감소 또는 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료적 단백질 치료 섭생법에 대한 반응에서의 면역 활성화를 감소시키거나, 완화시키는 방법이 본원에 개시된다.

일부 구현예에서, 치료적 단백질은 표 I, 표 J 및 표 7에 열거된 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 양태에서, 표 F, 표 G, 표 H, 표 I, 표 J, 표 6, 표 7 및 표 8에 열거된 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외인성 폴리펩티드 항원과 융합된 내인성 적혈구계 세포 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 본원에 개시된다.

일부 양태에서, 표 F, 표 G, 표 H, 표 I, 표 J, 표 6, 표 7 및 표 8에 열거된 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외인성 폴리펩티드 항원과 융합된 내인성 적혈구계 세포 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 메신저 RNA가 본원에 개시된다.

일부 양태에서, 외인성 항원을 발현하는 제핵 조혈 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 알러지원-매개의 질병, 장애 또는 질환을 앓고 있거나, 그것이 발생할 위험이 있는 인간 대상체에게 투여하는 단계로서, 약제학적 조성물이 대상체에서 질병, 장애 또는 질환을 매개하는 알러지원에 대한 면역 관용을 유도하기에 효과적인 양으로 투여되는 단계를 포함하는 면역 관용의 유도 방법이 본원에 개시된다.

특정 구현예에서, 외인성 항원은 Ara h2, 2S 알부민, 히알루로니다제 및 표 H에 열거된 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 알러지원-매개의 질병, 장애 또는 질환은 땅콩 알러지, 견과류 알러지, 곤충 독 알러지 및 표 H에 열거된 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다.

*일부 양태에서, 외인성 항원을 발현하는 제핵 조혈 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 인간 백혈구 항원(HLA) 불일치-매개의 질병, 장애 또는 질환을 앓고 있거나, 그것이 발생할 위험이 있는 인간 대상체에게 투여하는 단계로서, 약제학적 조성물이 대상체에서 질병, 장애 또는 질환을 매개하는 HLA에 대한 면역 관용을 유도하기에 효과적인 양으로 투여되는 단계를 포함하는 면역 관용의 유도 방법이 본원에 개시된다.

일부 양태에서, 외인성 항원을 발현하는 제핵 조혈 세포를 포함하는 약제학적 조성물을 면역원성 치료적 분자에 의해 치료될 수 있는 질병, 장애 또는 질환을 앓고 있거나, 그것이 발생할 위험이 있는 인간 대상체에게 투여하는 단계로서, 약제학적 조성물이 대상체에서 질병, 장애 또는 질환을 치료하기 위해 사용되는 면역원성 치료적 분자에 대한 면역 관용을 유도하기에 효과적인 양으로 투여되는 단계를 포함하는 면역 관용의 유도 방법이 본원에 개시된다.

일부 구현예에서, 치료적 분자는 리컴비넌트(Recombinant)(인자 VIII), 베네픽스(Benefix)(인자 IX), 휴미라(Humira)(항-TNFα) 및 표 I, 표 J 및 표 7에 열거된 것들로 이루어진 군으로부터 선택된다.

도 1은 리포좀 내에 캡슐화된 형광 표지된 IgG와 접촉된 적혈구의 유세포계수법 플롯의 모음이다. 리포좀 없이(좌측), 저용량 리포좀(중앙) 및 고용량 리포좀(좌측)과 함께 인큐베이션된 세포가 나타나 있다. 하측 히스토그램에 형광 세포의 백분율이 나타나 있다.
도 2는 정량적 유세포계수법에 의해 평가되는 세포 표면 발현 수준의 플롯이다. 플롯은 적혈구계 세포 분화 과정 동안 다양한 세포 표면 수용체 - 글리코포린 A(실선 삼각형), cKIT(파선 사각형), 트랜스페린 수용체(점선 마름모) - 및 외인성 표면 전이유전자(transgene)(흰색 원)를 보여준다.
도 3a 내지 도 3c, 도 3f, 도 3i 내지 도 3m, 도 3o 내지 도 3z 및 도 3aa 내지 도 3au는 3가지 세포 유형, 제핵 적혈구계 세포, 유핵 적혈구계 전구 세포 및 적백혈구(erythroleukemic) 세포에서, 융합체로서 그리고 무손상 단백질로서, 표면상의, 세포질에서의 매우 다양한 예시적인 항원의 발현을 입증하는 유세포계수법 플롯 및 웨스턴 블롯의 모음이다.
도 3a 내지 도 3c, 도 3f, 도 3i 내지 도 3m 및 도 3o 내지 도 3s는 배양된 제핵 적혈구계 세포에서의 표면 및 세포질 단백질의 외인성 발현을 보여준다.
도 3a- 동시-번역된 GFP의 발현에 의해 평가되는 세포질 C 말단에 HA 에피토프 태그가 있는 글리코포린 A의 발현.
도 3b- 항-HA 염색에 의해 평가되는 유전자의 리더 서열과 바디(body) 사이의 N 말단에 HA 에피토프 태그가 있는 글리코포린 A의 발현.
도 3c- 항-HA 염색에 의해 평가되는 N 말단에 HA 에피토프 태그가 있는 약 70 kDa의 보체 수용체 1-유래 단편의 발현.
도 3f- 항-HA 염색에 의해 평가되는 글리코포린 A로의 N 말단 융합체로서 항체 scFv의 발현.
도 3i- 항-HA 염색에 의해 평가되는 71개 아미노산의 Kell-유래 단편의 C 말단에 융합된 항체 scFv의 발현.
도 3j- 항-HA 염색에 의해 평가되는 79개 아미노산의 Kell-유래 단편의 C 말단에 융합된 항체 scFv의 발현.
도 3k- 항-HA 염색에 의해 평가되는 리더 서열 후의 세포외 N 말단에 HA 에피토프 태그가 있는 CD55의 발현.
도 3l- 항-HA 염색에 의해 평가되는 리더 서열 후의 세포외 N 말단에 HA 에피토프 태그가 있는 CD59의 발현.
도 3m- 항-HA 웨스턴 블롯에 의해 평가되는 37개 아미노산의 CD55-유래 단편의 N-말단에 융합된 항체 scFv의 발현.
도 3o- 항-HA 웨스턴 블롯에 의해 평가되는 HA 태그에 융합된 아데노신 데아미나제의 세포질 발현. 예상되는 크기 대략 40 kDa.
도 3p- 항-HA 웨스턴 블롯에 의해 평가되는 HA 태그에 융합된 페닐알라닌 하이드록실라제의 세포질 발현. 예상되는 크기 대략 33 kDa.
도 3q- 항-HA 웨스턴 블롯에 의해 평가되는 아데노신 데아미나제 및 HA 태그에 융합된 페닐알라닌 하이드록실라제의 세포질 발현.
도 3r- 항-HA 웨스턴 블롯에 의해 평가되는 글리코포린 A의 세포내 C 말단에 융합된 아데노신 데아미나제의 세포질 발현. 예상되는 크기 대략 55 kDa.
도 3s- 항-HA 웨스턴 블롯에 의해 평가되는 글리코포린 A의 세포내 C 말단에 융합된 페닐알라닌 하이드록실라제의 세포질 발현. 예상되는 크기 대략 50 kDa.
도 3t 내지 도 3ao는 배양된 유핵 적혈구계 전구 세포에서의 표면 및 세포질 단백질의 외인성 발현을 보여준다.
도 3t- 동시-번역된 GFP의 발현에 의해 평가되는 세포질 C 말단에 HA 에피토프 태그가 있는 글리코포린 A의 발현.
도 3u- 항-HA 염색에 의해 평가되는 유전자의 리더 서열과 바디 사이의 N 말단에 HA 에피토프 태그가 있는 글리코포린 A의 발현.
도 3v- 항-CR1 염색에 의해 평가되는 보체 수용체 1의 과발현.
도 3w- 항-HA 염색에 의해 평가되는 N 말단에 HA 에피토프 태그가 있는 약 70 kDa의 보체 수용체 1-유래 단편의 발현.
도 3x- 항-HA 염색에 의해 평가되는 N 말단에 HA 에피토프 태그가 있는 약 210 kDa의 보체 수용체 1-유래 단편의 발현.
도 3y- 항-HA 염색에 의해 평가되는 N 말단에 HA 에피토프 태그가 있는 글리코포린 A의 N 말단에 융합된 약 230 kDa의 보체 수용체 1-유래 단편의 발현.
도 3z- 항-HA 염색에 의해 평가되는 글리코포린 A로의 N 말단 융합체로서의 항체 scFv의 발현.
도 3aa- 항-HA 염색에 의해 평가되는 Kell의 세포외 C 말단에 융합된 항체 scFv의 발현. 예상되는 크기 대략 108 kDa.
도 3ab- 항-HA 염색에 의해 평가되는 Kell의 세포외 C 말단에 융합된 HA 태그의 발현.
도 3ac- 항-HA 염색에 의해 평가되는 C(세포외) 말단에 HA 태그가 있는 71개 아미노산의 Kell-유래 단편의 발현.
도 3ad- 항-HA 염색에 의해 평가되는 C 말단에 HA 태그가 있는 79개 아미노산의 Kell-유래 단편의 발현.
도 3ae- 항-HA 염색에 의해 평가되는 71개 아미노산의 Kell-유래 단편의 C-말단에 융합된 항체 scFv의 발현.
도 3af- 항-HA 염색에 의해 평가되는 79개 아미노산의 Kell-유래 단편의 C-말단에 융합된 항체 scFv의 발현.
도 3ag- 항-HA 염색에 의해 평가되는 리더 서열 후의 세포외 N 말단에 HA 에피토프 태그가 있는 CD55의 발현.
도 3ah- 항-HA 염색에 의해 평가되는 리더 서열 후의 세포외 N 말단에 HA 에피토프 태그가 있는 CD59의 발현.
도 3ai- 항-HA 염색에 의해 평가되는 37개 아미노산의 CD55-유래 단편의 N-말단에 융합된 항체 scFv의 발현.
도 3aj- 항-HA 염색에 의해 평가되는 CD59의 N-말단에 융합된 항체 scFv의 발현.
도 3ak- 항-HA 웨스턴 블롯에 의해 평가되는 HA 태그에 융합된 아데노신 데아미나제의 세포질 발현. 예상되는 크기 대략 40 kDa.
도 3al- 항-HA 웨스턴 블롯에 의해 평가되는 HA 태그에 융합된 페닐알라닌 하이드록실라제의 세포질 발현. 예상되는 크기 대략 33 kDa.
도 3am- 동시-번역된 GFP로부터 형광에 대한 유세포계수법에 의해 평가되는 아데노신 데아미나제 및 HA 태그에 융합된 페닐알라닌 하이드록실라제의 세포질 발현.
도 3an- 항-HA 웨스턴 블롯에 의해 평가되는 글리코포린 A의 세포내 C 말단에 융합된 아데노신 데아미나제의 세포질 발현. 예상되는 크기 대략 55 kDa.
도 3ao- 항-HA 웨스턴 블롯에 의해 평가되는 글리코포린 A의 세포내 C 말단에 융합된 페닐알라닌 하이드록실라제의 세포질 발현. 예상되는 크기 대략 50 kDa.
도 3ap 내지 도 3au는 K562 적백혈구 세포에서의 표면 및 세포질 단백질의 외인성 발현을 보여준다.
도 3ap- 항-CR1 염색에 의해 평가되는 보체 수용체 1의 과발현.
도 3aq- 항-HA 염색에 의해 평가되는 글리코포린 A로의 N 말단 융합체로서의 항체 scFv의 발현.
도 3ar- 항-HA 염색에 의해 평가되는 37개 아미노산의 CD55-유래 단편의 N-말단에 융합된 항체 scFv의 발현.
도 3as- 항-HA 염색에 의해 평가되는 CD59의 N-말단에 융합된 항체 scFv의 발현.
도 3at- 항-HA 웨스턴 블롯에 의해 평가되는 HA 태그에 융합된 아데노신 데아미나제의 세포질 발현. 예상되는 크기 대략 40 kDa.
도 3au- 항-HA 웨스턴 블롯에 의해 평가되는 HA 태그에 융합된 페닐알라닌 하이드록실라제의 세포질 발현. 예상되는 크기 대략 33 kDa.
도 4는 형광 단백질(GFP)을 인코딩하는 mRNA로 트랜스펙션된 일차 혈소판에서 형광을 측정하는 유세포계수법 히스토그램의 모음이다. (도 4a) 비트랜스펙션된 혈소판. (도 4b) 3 ㎍ GFP mRNA로 트랜스펙션된 혈소판. (도 4c) 6.8 ㎍ GFP mRNA로 트랜스펙션된 혈소판.
도 5는 배양 중 트랜스제닉 적혈구계 세포의 단백질 발현 및 효소 활성을 보여준다. (도 5a)는 유핵 전구 세포("Diff I D5")로부터 제핵 적혈구계 세포("Diff III D8")까지, 분화 과정에 걸쳐, 항-HA 항체로 검출된 외인적으로 발현되는 아데노신 데아미나제의 웨스턴 블롯이다. (도 5b)는 무손상 아데노신 데아미나제-발현 293T 세포에 의해 아데노신으로부터 생성된 이노신의 막대 도표이다. (도 5c)는 유핵 전구 세포("Diff I D5")로부터 제핵 적혈구계 세포("Diff III D8")까지, 분화 과정에 걸쳐 다양한 시점에, 항-HA 항체로 검출된 외인적으로 발현되는 페닐알라닌 하이드록실라제의 웨스턴 블롯이다. (도 5d)는 배양된 페닐알라닌 하이드록실라제-발현 제핵 적혈구계 세포의 용해물에 의해 페닐알라닌으로부터 생성된 티로신의 막대 도표이다.
도 6은 보체 수용체 1(CR1)을 과발현하는 배양된 적혈구계 세포에 의한 면역 복합체 포획 및 대식구로의 전달을 보여준다. (도 6의 A)는 CR1을 과발현하는 배양된 적혈구계 세포에 의한 형광 면역 복합체(백색 히스토그램) 및 보체-결핍 면역 복합체(음영 히스토그램)의 포획을 보여주는 유세포계수법 플롯이다. (도 6의 B)는 대식구(좌측 세트) 또는 CR1을 과발현하는 배양된 적혈구계 세포와 함께 인큐베이션되는 대식구(우측 세트)에 의한 형광 면역 복합체(해시 막대), 보체 결핍 면역 복합체(회색 막대) 또는 면역 복합체 부재(흑색 막대)의 흡수를 평가하는 유세포계수법 데이터의 막대 도표이다.
도 7은 배양된 적혈구계 세포의 표면상의 B형 간염 표면 항원(scFv)에 결합하는 항체 scFv의 활성을 보여준다. (도 7a)는 450 nM 항원(백색 히스토그램) 또는 항원 부재(회색 히스토그램)의 결합을 보여주는 유세포계수법 히스토그램이다. (도 7b)는 다양한 항원 농도에 대해 유세포계수법에 의해 평가되는 결합 신호의 적정이다. (도 7c 및 도 7d)는 (도 7c) scFv를 발현하지 않거나, (도 7d) scFv를 발현하는 배양된 적혈구계 세포 및 형광 항원이 주사된 마우스 유래의 혈구의 유세포계수법 플롯이다. y-축은 항원 형광을 나타낸다. x-축은 배양된 세포의 형광을 나타낸다.
도 8은 생체내에서 외인성 항원-발현 EHC에 의해 매개되는 순환 항체의 특이적인 제거를 보여준다. (도 8a)는 그들의 표면 상에 HA 에피토프 태그를 발현하지 않거나(상측), 그를 발현하는(하측) 수여자 마우스로부터 단리된 CFSE-표지된 배양된 인간 적혈구계 세포로의 순환하는 Dylight650-표지된 마우스 항-HA 항체의 결합 부재(상측) 및 결합(하측)을 보여주는 일련의 유세포계수법 플롯이다. x-축은 CFSE 형광을 나타낸다. y-축은 항-HA 항체 Dylight650 형광을 나타낸다. (도 8b)는 항-HA 항체(백색 원, 실선), 항-HA 항체에 이어서 HA 에피토프 태그를 발현하지 않는 배양된 인간 적혈구계 세포(파선) 또는 항-HA 항체에 이어서 HA 에피토프 태그를 발현하는 배양된 인간 적혈구계 세포(점선)가 주사된 마우스로부터 수집된 혈장에서 시간에 따른 항-HA 항체 수준을 비교하는 HA 에피토프 태그 기질 ELISA로부터의 데이터이다. (도 8c)는 그들의 표면상에서 비오틴과 컨쥬게이트되지 않거나(상측) 또는 그와 컨쥬게이트되는(하측) CFSE-표지된 일차 인간 적혈구로의 Dylight650-표지된 마우스 항-비오틴 항체의 결합 부재(상측) 및 결합(하측)을 보여주는 일련의 유세포계수법 플롯이다. x-축은 CFSE 형광을 나타낸다. y-축은 항-비오틴 항체 Dylight650 형광을 나타낸다. (도 8d)는 항-비오틴 항체(백색 원, 실선), 항-비오틴 항체에 이어서 비오틴에 컨쥬게이트되지 않은 배양된 인간 적혈구계 세포(파선) 또는 항-비오틴 항체에 이어서 비오틴에 컨쥬게이트된 배양된 인간 적혈구계 세포(점선)가 주사된 마우스로부터 수집된 혈장에서 시간에 따른 항-비오틴 항체 수준을 비교하는 비오틴 기질 ELISA로부터의 데이터이다.
도 9는 마우스에서의 배양된 인간 적혈구계 세포의 제거율을 보여준다. (도 9a)는 인간 글리코포린 A(y-축) 및 CFSE(x-축)에 대하여 염색된, 채혈된 혈액의 대표적인 유세포계수법 점-플롯이며, 여기서, 인간 배양된 세포는 이중-양성이다. (도 9b)는 NSG 마우스에 인간 적혈구(실선 원), 배양된 제핵 적혈구계 세포(파선 마름모), 세포내 외인성 단백질을 발현하는 배양된 제핵 적혈구계 세포(점선 사각형) 및 표면 외인성 단백질을 발현하는 배양된 제핵 적혈구계 세포(백색 삼각형)를 주사한 후에 남아 있는 이중-양성 세포의 백분율로서 시간에 걸친 제거율의 플롯이다.
도 10은 마우스로의 배양된 인간 적혈구계 세포의 주사 후의 유해 사례의 평가이다. (도 10a 및 도 10b)는 (1) 인간 적혈구, (2) 배양된 인간 적혈구계 세포, (3) 외인성 세포질 단백질을 발현하는 배양된 인간 적혈구계 세포, (4) 외인성 표면 전이유전자를 발현하는 배양된 인간 적혈구계 세포, 또는 (5) 재조합 단백질로의 주사 후 20분(흑색), 6시간(회색) 및 48시간(백색)에 마우스로부터 수집된 혈장에서 ELISA에 의해 평가되는 (도 10a) 피브리노펩티드 A 및 (도 10b) 피브리노펩티드 B의 수준을 보여준다. (도 10c 및 도 10d)는 (도 10c) 배양된 인간 적혈구계 세포 및 (도 10d) 재조합 단백질이 주사된 마우스에 대한 비장의 조직학적으로 염색된 섹션의 현미경 이미지를 보여준다.
도 11은 순환 중 배양된 적혈구계 세포상의 외인성 단백질의 발현을 추적한다. (도 11a)는 시간에 따라 HA-양성인 배양된 인간 적혈구계 세포의 백분율을 보여주는 외인성 표면 단백질을 발현하는 배양된 인간 적혈구계 세포가 주사된 마우스로부터 채혈된 혈액의 유세포계수법 데이터이다. (도 11b)는 2마리의 마우스로부터 채혈된 혈액의 웨스턴 블롯이며, 1마리의 마우스에 외인성 세포질 단백질을 발현하는 배양된 인간 적혈구계 세포를 주사하고, 다른 마우스에는 임의의 세포의 부재 하에 정제된 재조합으로 생성된 외인성 단백질을 주사하였으며, 이는 시간에 따른 혈중 HA-함유 단백질의 수준을 보여준다.
도 12는 배양된 인간 적혈구계 세포의 증량 및 분화의 평가이다. (도 12a)는 전이유전자를 함유하는 시험관내 분화된 적혈구계 세포(파선 및 점선) 및 전이유전자를 함유하지 않는 세포(실선)의 별개의 배양물에 대한 증량비의 플롯이다. (도 12b)는 전이유전자를 함유하지 않거나(좌측), 그를 함유하는(우측) 배양된 인간 적혈구계 세포의 별개의 배양물에 대한 세포 표면 마커 GPA 및 CKIT의 유세포계수법 플롯이다. (도 12c)는 전이유전자를 함유하지 않거나(좌측), 그를 함유하는(우측) 배양된 인간 적혈구계 세포의 유세포계수법 플롯이며, 세포는 DNA 염료 DRAQ5(y-축) 및 항-글리코포린 A(x-축)로 염색되고, 이는 (1) 제핵 세포, (2) 유핵 세포 및 (3) 핵의 별개의 모집단을 확인시켜준다.
도 13a는 항원이 외인성 항원-발현 EHC 내에 국소화될 수 있는 3가지 방식의 개략도이다. 도 13b는 외인성 항원-발현 EHC 내에 또는 그 상에 국소화된 항원이 순환 중 표적에서 작용할 수 있는 3가지 방식의 개략도이다. 도 13c는 SpyTag-SpyCatcher 메커니즘을 사용한 항원으로의 내인성 폴리펩티드 앵커의 자가-촉매 융합의 개략도이다.

상세한 설명

특정 양태에서, 본 발명은 관심 외인성 항원을 함유하도록 조작되거나 변형된 단리된 세포를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명의 단리된 EHC는 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진 하나 이상의 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 전장 단백질이다. 일부 구현예에서, 항원은 전장 단백질 내에 함유된 대략 7개의 아미노산보다 더 큰 임의의 길이의 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진다. 항원을 포함하는 폴리펩티드는 입체형태 에피토프일 수 있거나, 선형 에피토프일 수 있는 하나 이상의 면역학적 에피토프를 포함할 수 있다. 항원은 하나 이상의 상이한 단백질 유래의 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어질 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 EHC는 탄수화물을 포함하거나 이로 이루어진 하나 이상의 항원을 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 EHC는 지질을 포함하거나 이로 이루어진 하나 이상의 항원을 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 EHC는 하나 이상의 폴리펩티드, 지질 및/또는 탄수화물 및 그들의 임의의 조합을 포함하거나 이로 이루어진 하나 이상의 항원을 포함한다. 세포는 순환 세포, 예를 들어, EHC일 수 있다. EHC는 정의된 인자, 예를 들어, 줄기 세포 인자, 사이토카인, 예를 들어, IL-3 및 IL-6, 인슐린, 트랜스페린, 에리트로포이에틴, 하이드로코르티손 및 에스트로겐을 사용하여 조혈 전구체로부터 배양될 수 있다.

본 발명의 양태는 관심 외인성 항원을 포함하도록 EHC를 배양하는 방법에 관한 것이다. 관심 외인성 항원은 수많은 방법, 예를 들어, 세포내 발현, 세포-표면 발현, 내인성 단백질로의 융합, 화학적 또는 효소적 수단에 의한 세포 표면 단백질로의 컨쥬게이션 또는 세포내 공간 내로의 물리적 로딩에 의해 도입될 수 있다. 본 발명의 항원-포함 세포는 치료제로 사용될 수 있다.

본 발명의 양태는 말초 관용의 도입에 의한 면역 활성화의 질병의 치료에서의 이들 항원-포함 세포의 용도에 관한 것이다. 일부 양태에서, 말초 관용의 도입은 항원-특이적 면역 세포, 예를 들어, CD8 T 림프구(CD8 T 세포), CD4 T 림프구(CD4 T 세포), CD4 T 조절 림프구(Treg) 또는 B 림프구(B 세포)의 결실 또는 불활성화를 의미한다. 면역 활성화의 질병은 자가면역 질병, 예를 들어, 다발경화증, 1형 당뇨병, 류마티스 관절염 및 막성 신장염을 포함한다. 면역 활성화의 질병은 또한 염증 질병, 예를 들어, 크론병, 궤양대장염, 셀리악병 또는 기타 특발성 염증성 장 질병도 포함한다. 또한, 면역 활성화의 질병은 알러지 질병, 예를 들어, 천식, 땅콩 알러지, 갑각류 알러지, 꽃가루 알러지, 유단백질 알러지, 곤충 자상 알러지 및 라텍스 알러지도 포함한다. 면역 활성화의 질병은 또한 일차 질병을 치료하기 위해 투여되는 치료적 단백질, 예를 들어, 혈우병 A에서 응고 인자 VIII, 혈우병 B에서 응고 인자 IX, 류마티스 관절염 및 기타 염증성 질병에서 항-종양 괴사 인자 알파(TNFα) 항체, 고셰병에서 글루코세레브로시다제, 또는 급성 림프모구성 백혈병(ALL)에서 아스파라기나제의 효능을 경감시키는 치료적 단백질에 대한 반응에서의 면역 활성화를 포함한다.

면역 관용의 생물학

신체는 집합적으로 면역 관용으로 지칭되는 비정상적인 면역 활성화 및 자가면역 질병의 예방을 위한 정교한 메커니즘을 발달시킨다. 중추 관용은 일차 림프 기관, 예를 들어, 흉선 및 골수에서 발생 동안의 자가반응성 T 세포 및 B 세포의 항원-특이적 결실을 지칭한다. 말초 관용은 일차 림프 기관의 외측의 성숙 T 및 B 림프구의 결실 또는 불활성화를 지칭한다. 말초 관용은 조절 T 세포(Treg)에 의한 자가반응성 림프구의 억제, 또는 동시자극 "위험" 신호의 부재 하에 연속적인 저 용량의 항원으로의 노출에 의한 항원-특이적 이펙터 림프구에서의 아네르기 또는 비반응성의 유도를 포함한다. Treg 활성화 및 림프구 아네르기 둘 모두는 억제 인자, 예를 들어, TGF-베타, IL-10 및 IL-4의 분비에 의해 유도될 수 있다.

항원에 대한 반응에서의 면역 활성화는 종종 미생물 또는 바이러스 병원체로부터 유래된 이차 "위험" 신호, 예를 들어, 톨-유사 수용체 리간드를 종종 필요로 한다(문헌[Matzinger, Annu Rev Immuno 1994]). 그러한 위험 신호는 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 DNA, 지질다당류, 박테리아 지질단백질, 플라젤린, 자이모산 및 기타 등등을 포함한다. 항원 및 위험 신호 둘 모두를 제공받은 항원 제시 세포는 그들의 표면상에 항원 펩티드에 더하여 CD80 및 CD86과 같은 동시자극 분자를 디스플레이한다. 항원 펩티드 및 동시자극 분자 둘 모두를 인식하는 T 세포는 활성화된다. 단지 항원 펩티드 신호만을 제공받은 것들은 아네르기가 된다.

위험 신호의 부재하에 항원 제시를 이용하여 면역 관용을 유도하는 치료 전략이 많은 음식 알러지의 실험 치료를 위해 개발되었다. 연구는 관용을 유도하기 위한 의도로 증가 용량의 알러지원에 대한 연장된 노출의 형태를 채용한다. 2007년도 이래로 13개의 연구에서 이러한 형식으로 땅콩, 밀크 및 계란과 같은 다양한 통상의 음식 알러지원을 시험하였다. 환자의 50 내지 100%가 감작되며, 다시 말하면, 아나필락시스 없이 음식 챌린지를 견뎌낼 수 있다. 그러나, 장기간 관용은 덜 성공적이며, 환자의 오직 25 내지 50%만이 치료를 중단하고 1개월 후에 항원에 관용일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Burks et al., New England Journal of Medicine 2012]을 참조한다.

알러지가 비만 세포 및 호염기구의 활성화와 함께 IgE 매개되는 것으로 생각된다. 저 용량의 알러지원의 경구 투여, 예를 들어, 연속 급식은 항원의 CD11c⁺ 수지상 세포 제시 및 TGF-베타, IL-10 및 IL-4의 분비를 통해 Treg를 유도한다. 고 용량의 경구 투여는 형질세포양 수지상 세포를 통해 항원-특이적 T 세포 결실 및 아네르기를 유도한다. 인간 연구에서, 알러지원의 경구 투여는 IgE, 비만 세포 및 호염기구의 감소, IgG4, TGF-베타, IL-10의 증가 및 치료법의 시작 시에 Treg의 일시적인 약간의 증가를 초래한다. 예를 들어, 문헌[Herzog, Adv Drug Deliv Rev 2013]을 참조한다.

임의의 특정 메커니즘에 제한하고자 하지 않고, 말초 면역학적 관용이 아폽토시스 세포로부터의 자가 항원에 의해 유도될 수 있는 것으로 여겨진다(문헌[Griffith and Ferguson, Immunity 2011]; 문헌[Green et al., Nat Rev Immunol 2009]). 분자적 관점에서 정확한 메커니즘이 완전히 이해되어 있지 않지만, 자가 단백질, 예를 들어, HSP90 및 기타 손상-관련 분자 패턴은 수지상 세포에 의한 흡수를 용이하게 한다. CD205와 같은 수지상 세포 수용체는 이들 신호를 인식하며, 항원을 교차-제시하고, 관용원성 사이토카인을 유도하고, 동시자극 단백질 발현을 억제한다(문헌[Bonifaz, J Exp Med 2002]).

아폽토시스 세포의 관용원성 가능성을 이용하여 말초 면역 관용을 유도하는 치료적 전략은 조사 중이다. 이들 전략은 전형적으로 세포의 표면으로의 관심 항원의 화학적 커플링을 수반한다. 마우스, 랫트 및 기니 피그의 연구에서, 다양한 단백질 항원이 비장세포 및 백혈구의 표면에 화학적으로 부착된다. 예를 들어, 문헌[Miller et al., J Exp Med 1979]; 문헌[Braley-Mullen et al., Cell Immunol 1980]; 문헌[Luo et al., PNAS 2008]; 문헌[Smarr et al., J Immunol 2011]을 참조한다.

인간에서의 최근의 I 단계 임상 연구에서, 다발경화증과 관련된 펩티드 항원의 칵테일을 자가 말초 혈액 단핵 세포에 화학적으로 커플링시키고, 인간 내로 재주입하였다(문헌[Lutterotti and Martin, Sci Trans Med 2013]). 세포는 잘 관용되었고, 항원-특이적 T 세포 반응의 감소의 증거가 존재하였다.

EHC는 사멸 세포의 중요한 공급원이다. 매일 에립토시스(eryptosis)로 지칭되는 아폽토시스-유사 예정 세포사 후에 다수의 적혈구가 제거된다(인간에서 매일 1%, 대략 1 x 10¹¹개 세포 초과). 적혈구 제거의 정확한 촉발이 명확하지 않지만, 에립토시스 적혈구는 아폽토시스 유핵 세포와 유사하게, 포스파티딜세린 비대칭, 막 이질성 및 아넥신-V 결합을 특징으로 한다.

또한, EHC는 신체 내에 잔존한다. 적혈구는 성인에서 최대 120일 동안 순환한다. 그와 같이, 관심 항원을 포함하는 EHC는 숙주에 대한 항원의 지속적인 노출을 가능하게 할 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 정확한 분자적 메커니즘이 완전히 이해되지 않았지만, 항원에 대한 지속적인 노출이 동시자극 신호의 부재하의 항원 제시를 통하여 말초 관용을 유도하여, 조절 T 세포의 증량, 이펙터 T 및 B 세포의 결실 및 아네르기 및 항-염증 및 관용원성 유발 사이토카인의 분비를 야기할 수 있는 것으로 여겨진다.

적혈구를 이용함에 의한 말초 관용의 유도도 또한 실험에 의해 조사되어 왔다. 예비 연구에서, 모델 항원 오브알부민은 적혈구에 비공유 부착되는 경우(문헌[Kontos et al., PNAS 2013]) 또는 삼투압에 의해 적혈구에 로딩되는 경우(문헌[Cremel and Godfrin, Int J Pharm 2013]), 항원-특이적 CD8 T 세포 결실 및 항원-특이적 Treg 유도를 유도하는 것으로 나타났다.

관심 외인성 항원을 포함하는 배양된 본 발명의 EHC는 예를 들어, 폴리펩티드 결합 도메인을 통하여 적혈구에 비공유적으로 부착되는 항원에 비하여 독특한 이점을 가질 수 있다. 하나의 이점은 관심 외인성 항원을 포함하는 EHC의 생체-분포가 표적화 도메인을 갖는 항원의 폴리펩티드 조성물의 것보다 더욱 한정된다는 것일 수 있다. 관심 외인성 항원을 포함하는 EHC는 혈관구조, 및 적혈구가 전형적으로 존재하는 위치, 예를 들어, 비장에 국한될 것이다. 관심 외인성 항원을 포함하는 EHC는 신장 밖으로 여과되거나 말초 조직 내로 방출되지 않을 것이며, 이는 폴리펩티드 항원 조성물이 투여되는 경우 발생할 수 있는 문제이다. EHC마다 외인성 항원의 용량은 폴리펩티드 항원이 혈류 내로 직접 주사되고, 혈류 중 대략 10조개의 적혈구에 걸쳐 분포되는 경우보다 관심 외인성 항원을 포함하는 세포가 배양되는 경우에 유의미하게 더 높을 수 있다. 일부 예에서, 관심 외인성 항원이 EHC의 세포내 구획 내에 한정되는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 항원이 면역원성인 경우, 세포내 국소화가 면역계로부터 면역원성 항원을 감추고, 이에 따라 면역 활성화를 예방하거나 감소시킬 수 있기 때문에, 세포내 국소화가 유리할 수 있다. 이러한 배치는 폴리펩티드 항원 조성물로는 가능하지 않다.

관심 외인성 항원을 발현하는 배양된 EHC는 삼투압에 의해 EHC로 로딩된 항원보다 분명한 이점을 가질 수 있다. 관심 외인성 항원을 포함하는 배양된 EHC는 큰 포어가 세포막 및 세포골격의 무결성을 붕괴시키는 삼투 로딩 절차의 생성물과 대조적으로, 실질적으로 변경되지 않는 세포막 및 세포골격을 가질 것이다. EHC의 형태 및 생물물리학적 특징은 세포의 생체분포, 순환 및 혈관구조 및 면역 세포와의 상호작용의 중요한 결정요인이며(예를 들어, 문헌[Pries et al., Cardiovasc. Res. 1996]), 이에 따라, 세포 무결성의 유지는 유효성을 유지하는데 중요할 수 있다. 예를 들어, 내인성 세포질 단백질로의 직접적인 융합 또는 내인성 막횡단 단백질로의 융합에 의하여 배양된 EHC로 물리적으로 부착되는 외인성 항원은 EHC가 소모될 때까지 세포 밖으로 유출되지 않고, 면역계에 노출될 것이다. 세포가 세포막이 손상될 수 있는 삼투 로딩 절차를 사용하여 항원과 접촉된다면, 누출의 문제가 발생할 수 있다.

관심 항원을 발현하는 배양된 EHC는 항원을 필요로 하는 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 생성물의 제조 동안 항원의 분리 및 정제는 필요하지 않다. 이는 항원이 개별적으로 합성되고 정제된 다음, 세포와 조합되어야 하는 삼투 로딩 생성물과 대조적이며, 생성물의 제조에서 유의미한 비용 및 시간 이점을 제공할 수 있다. 관심 항원을 발현하는 배양된 EHC는 배양 중 증식에 의해 규모가 확대될 수 있다. 세포의 큰 산업 크기 뱃치를 생성하여, 보편적으로 많은 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있는 주어진 항원에 대하여 EHC의 실질적으로 균일한 약제학적 조성물을 생성할 수 있다. 대조적으로, 삼투 로딩은 일반적으로 1-공여자-1-대상체 규모로 제한된다.

세포의 획득

본 발명의 외인성 항원-발현 제핵 조혈 세포는 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 단계는 조혈 줄기 세포로부터 유래된 단리된, 임의로 배양된 세포를 항원과 접촉시키는 단계를 포함한다. 조혈 줄기 세포는 골수(단핵구 및 대식구, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포) 및 림프 계통(T-세포, B-세포, NK-세포)을 포함하는 포유류 혈액에서 관찰되는 모든 혈구 유형이 생기게 한다. 조혈 줄기 세포는 예를 들어, 대퇴골, 엉덩이뼈, 갈비뼈 또는 복장뼈를 포함하는 성인 뼈의 골수로부터 단리될 수 있다. 세포는 예를 들어, 주사바늘 및 주사기를 사용한 흡인을 사용한 골수로부터의 세포의 제거에 의해 엉덩이뼈로부터 직접 수득될 수 있다. 대안적으로, 조혈 줄기 세포는 사이토카인, 예를 들어, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)로의 사전-처리 후에 정상 말초 혈액으로부터 단리될 수 있다. G-CSF는 골수 구획으로부터 말초 순환 내로의 세포의 방출을 동원한다. 다른 조혈 줄기 세포의 공급원은 제대혈 및 태반을 포함한다.

단리된 조혈 줄기 세포를 생체외에서 배양, 증량 및 분화시켜, 다양한 공급 물질을 제공하여, 외인성 항원-발현 EHC를 생성할 수 있다. 예를 들어, 골수, 사이토카인-자극 말초 혈액 또는 제대혈로부터 단리된 조혈 줄기 세포는 생체외에서 증량되고, 성숙 적혈구로 분화될 수 있다(문헌[Giarratana et al., Nature Biotech. 23:69-74 (2005)]; 미국 특허 출원 2007/0218552호). 그와 같이, CD34+ 세포는 예를 들어, 자기 마이크로비드 선택 및 Mini-MACS 컬럼(Miltenyi Biotech)을 사용하여 골수 또는 말초혈 또는 제대혈로부터 단리된다. 일 예에서, 세포를 이후에 1% 소 혈청 알부민(BSA), 120 ㎍/㎖ 철-포화 인간 트랜스페린, 900 ng/㎖ 황산제일철, 90 ng/㎖ 질산제이철 및 10 ㎍/㎖ 인슐린이 보충된 변형된 무혈청 배지에서 배양하고, 공기 중 5% 이산화탄소에서 37℃에서 유지한다. 세포 배양물의 증량 및 분화는 다수의 단계로 발생할 수 있다. 예를 들어, 단리 후의 초기 성장 단계에서, 세포는 예를 들어, 하이드로코르티손, 줄기 세포 인자, IL-3 및 에리트로포이에틴을 포함하는 다수의 성장 인자의 존재하에 본원에 기재된 배지에서 증량될 수 있다. 제2 단계에서, 세포는 임의로 예를 들어, 에리트로포이에틴의 존재하에 부착 기질층에서 동시-배양될 수 있다. 제3 단계에서, 세포는 외인성 인자의 부재하에 배양 배지에서 부착 기질층에서 배양될 수 있다. 부착 기질층은 예를 들어, 쥣과 MS-5 기질 세포일 수 있다. 대안적으로, 부착 기질층은 성인 골수로부터 유래된 중간엽 기질 세포일 수 있다. 부착 기질 세포는 예를 들어, 10% 우태아혈청이 보충된 RPMI에서 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 적혈구계 전구 세포 및 그로부터 유래된 세포 모집단은 비-EHC와, 예를 들어, 부착 기질층과 동시-배양되지 않으며, 즉, 그들은 비-EHC의 부재하에 배양된다. 일부 구현예에서, 항원을 포함하는 EHC는 비-EHC의 부재하에 배양되며, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 초과 또는 98% 초과의 EHC가 제핵되고, 제핵 세포의 모집단이 제핵 세포를 선택하기 위한 농축 단계, 예를 들어, 중력 분리, 자성 또는 형광 분류, 방사선조사, 유핵 세포의 중독 등 없이 수득되도록 분화된다.

일부 예에서, CD34+ 조혈 줄기 세포를 시험관내에서 증량시키고 부분적으로 분화시키고, 성숙 적혈구로의 최종 분화가 생체내에서 발생하도록 하는 것이 바람직할 수 있다(예를 들어, 문헌[Neildez-Nguyen et al., Nature Biotech. 20:467-472 (2002)] 참조). 단리된 CD34+ 조혈 줄기 세포는 예를 들어, Flt3 리간드, 줄기 세포 인자, 트롬보포이에틴, 에리트로포이에틴 및 인슐린 성장 인자를 포함하는 다양한 인자를 함유하는 배지에서 부착 기질 세포층의 부재하에 시험관내에서 증량될 수 있다. 생성된 적혈구계 전구 세포는 CD36 및 GPA의 표면 발현을 특징으로 할 수 있으며, 대상체로 주입되고, 여기서, 성숙 적혈구로의 최종 분화가 발생된다.

일부 구현예에서, EHC 모집단은 제핵 동안 보유되는 항원 폴리펩티드를 포함하는 복수의 제핵 EHC를 포함한다. 항원 폴리펩티드를 포함하는 생성된 단리된 제핵 EHC는 상응하는 단리된, 비변형된, 비배양된 EHC와 실질적으로 동일한 삼투막 취약성을 나타낸다.

일부 구현예에서, EHC 모집단은 실질적으로 동일한 분화 단계 및/또는 세포 주기 단계의 복수의 적혈구 전구 세포를 포함하며, 전구 세포는 항원을 인코딩하는 재조합 핵산을 포함한다. 항원을 인코딩하는 재조합 핵산을 포함하는 적혈구 전구 세포의 대다수는 재조합 핵산을 보유하지 않고, 항원을 보유하는 성숙 적혈구로 분화할 수 있다.

일부 구현예에서, 일차 세포는 정맥천자, 모세혈관 천자 또는 동맥 천자를 통해 수집될 수 있다. 그 다음, 혈장 고갈, 밀도 구배, Hetastarch, PrepaCyte-CB 및 원심분리를 포함하는 기술 중 하나 또는 그의 조합을 이용하여 수집된 전혈 적혈구로부터, 혈소판 또는 다른 세포가 단리될 수 있다.

동종이계/ 및 자가 공급

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC를 생성하는 것은 대상체에 자가 및/또는 동종이계인 단리된, 임의로 배양된 세포를 항원과 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 대상체에 동종이계인 적혈구는 혈액형 특이적 적혈구 중 하나 이상 또는 하나 이상의 보편적인 공여자 적혈구를 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 예를 들어, 대상체에게 자가인 적혈구와 하나 이상의 동종이계 적혈구, 리포좀 및/또는 인공 소포 간의 적혈구의 융합을 통해 생성될 수 있다.

특정 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 자가 주입은 대상체로부터 적혈구, 망상적혈구 또는 조혈 줄기 세포를 단리하는 단계, 본원에 기재된 방법에 의해 세포를 항원과 접촉시킴으로써 적합한 외인성 항원-발현 EHC를 생성하는 단계 및 외인성 항원-발현 EHC를 (예를 들어, 주입에 의해) 동일한 대상체로 투여하는 단계를 포함한다.

특정 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 동종이계 주입은 공여자로부터 적혈구, 망상적혈구 또는 조혈 줄기 세포를 단리하는 단계, 본원에 기재된 방법에 의해 세포를 항원과 접촉시킴으로써 적합한 외인성 항원-발현 EHC를 생성하는 단계 및 외인성 항원-발현 EHC를 (예를 들어, 주입에 의해) 공여자와 상이한 대상체로 투여하는 단계를 포함한다. 동종이계 세포가 주입을 위해 사용되는 경우, 양립가능한 ABO 혈액형을 사용하여 보체 활성화 및 양립불가능한 적혈구의 용해를 특징으로 하는 급성 혈관내 용혈 수혈 반응을 방지하는 것을 주의해야 한다. ABO 혈액형은 혈액형 항원 A 및 B의 존재 또는 부재, 적혈구의 표면상의 당단백질 및 당지질과 회합된 올리고당 쇄의 말단에서 관찰되는 단당류 탄수화물 구조에 기초하여 정의된다(문헌[Liu et al., Nat. Biotech. 25:454-464 (2007)]에 검토). 그룹 O 적혈구에는 이들 항원 단당류 구조 중 어느 하나가 결여되어 있다. 그룹 A 적혈구를 갖는 대상체는 그룹 B 적혈구에 대한 천연 발생 항체를 갖는 한편, 그룹 B 적혈구를 갖는 대상체는 그룹 A 적혈구에 대한 항체를 갖는다. AB형 혈액형 대상체는 어느 항체도 갖지 않으며, O형 혈액형 개체는 둘 모두를 갖는다. 항-A 및/또는 항-B 항체를 갖는 대상체는 상응하는 항원을 함유하는 혈액의 수혈을 받을 수 없다. 그룹 O 적혈구가 A 또는 B 항원 중 어느 것도 함유하지 않기 때문에, 그룹 O 적혈구는 임의의 ABO 혈액형의 수여자, 예를 들어, A, B, AB 또는 O형 수여자로 안전하게 수혈될 수 있다. 그룹 O 적혈구는 보편적이며, 모든 수혈에 사용될 수 있는 것으로 여겨진다. 대조적으로, 그룹 A 적혈구는 A 및 AB형 수여자에게 제공될 수 있으며, 그룹 B 적혈구는 B 및 AB형 수여자에 제공될 수 있고, 그룹 AB 적혈구는 오직 AB 수여자에게만 제공될 수 있다. 적혈구 또는 적혈구의 전구체를 항원과 접촉시킴으로써 외인성 항원-발현 EHC가 생성되는 구현예에서, 공급된 적혈구 또는 적혈구 전구체는 수여자와의 양립가능성을 위해 일치된다.

일부 예에서, 비-그룹 O 적혈구를 포함하는 외인성 항원-발현 EHC를 보편적 혈액형으로 전환시키는 것이 유리할 수 있다. 그룹 A 및 그룹 B 적혈구의 표면상의 면역우성 단당류의 효소적 제거를 사용하여, 그룹 O-유사 외인성 항원-발현 EHC의 모집단을 생성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Liu et al., Nat. Biotech. 25:454-464 (2007)] 참조). 그룹 B 외인성 항원-발현 EHC는 커피 생두(green coffee bean)로부터 유래된 α-갈락토시다제를 사용하여 전환될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 이. 메닌고셉티쿰(E. meningosepticum) 박테리아로부터 유래된 α-N-아세틸갈락토사미니다제 및 α-갈락토시다제 효소 활성을 사용하여 각각 면역우성 A 및 B 항원이 외인성 항원-발현 EHC에 존재한다면 면역우성 A 및 B 항원을 제거할 수 있다(문헌[Liu et al., Nat. Biotech. 25:454-464 (2007)]). 일 예에서, 본원에 기재된 바와 같이 단리된 팩킹된 적혈구를 26℃에서 60분 동안 α-N-아세틸갈락토사미니다제 및 α-갈락토시다제(약 300 ㎍/㎖의 팩킹된 적혈구) 중 어느 하나의 존재하에 200 mM 글리신(pH 6.8) 및 3 mM NaCl에서 인큐베이션시킨다. 처리 후에, 적혈구를 염수 중에서의 3 내지 4회 헹굼과 함께 원심분리에 의해 세척하고, 표준 혈액 은행 기술에 따라 ABO-형으로 분류한다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 외인성 항원-발현 EHC는 하기의 방식으로 생성될 수 있다. 먼저, 적혈구계 전구 세포를 단리한다. 이들 세포는 대안적으로 환자에 대해 자가이거나 실질적으로 보편적인 공여자 혈액으로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, 세포는 ABO형 O형, 레서스 인자 Rh r/r, 더피(Duffy) -/- 및 거대 Kell 항원 K1 음성일 수 있다. 적혈구계 전구 세포로부터 EHC로의 분화 과정에서, 항원을 인코딩하는 재조합 핵산을 도입한다. 항원을 인코딩하는 재조합 핵산은 적혈구계-특이적 프로모터, 예를 들어, GATA-1 프로모터의 제어하에 존재할 수 있다(예를 들어, 문헌[Repik et al., Clin Exp Immunol 2005, 140:230] 참조). 항원을 인코딩하는 재조합 핵산은 해당 분야에 알려져 있는 임의의 방식으로 예를 들어, 플라스미드 DNA, 바이러스 또는 mRNA로서 도입될 수 있다. 핵산 도입은 다양한 표준 방법, 예를 들어, 트랜스펙션, 형질도입 또는 전기천공에 의해 달성될 수 있다.

혈소판 유래 및 성숙

특정 구현예에서, 본원에 기재된 외인성 항원-발현 EHC는 혈소판을 항원과 접촉시킴으로써 생성될 수 있다. 매일 성인은 2×10¹¹개의 적혈구 및 약 절반의 백혈구 및 혈소판을 생성한다. 인간에서, 거의 모든 혈구 생성이 적골수에서 발생하며, 이는 조혈 줄기 세포, 중간 수준 전구체 및 각 계통으로 수임된 성숙 세포로 이루어진 계층적 발생 시스템을 나타낸다.

모든 주요 혈구 유형의 형태가 그들의 초기 발생 단계까지 유사하지만, 혈소판 생성으로 수임된 세포, 거핵구는 대부분의 다른 골수 및 혈구의 직경의 10배의 크기로 성장하고, 정상 염색체 보체의 최대 128배를 함유하여, 아세포 분화 수준을 넘어서는 분명한 구조적 및 기능적 변화에 의해 표시되고, 이들 세포는 혈소판이 생기게 한다. 일련의 정상 세포 분열 후에, 발생 중 거핵구 전구체는 짧은(약 1시간) G1 단계, 전형적인(7시간) S 단계, 매우 짧은(약 45분) G2 단계 이후 핵내 유사분열 단계(중단된 M 단계)를 특징으로 하는 독특한 세포 주기에 진입한다. 일단 세포가 고도의 배수체 핵을 발생하면, 그것은 또한 세포질 분열에 필수적인 경계 막을 발생한다. 이러한 사건은 당단백질 GPIIbIIIa(혈소판 피브리노겐 수용체; 문헌[Papayannopoulou et al., Exp. Hematol., 24: 660-9, 1996]) 및 GPIb(폰빌레브란트 인자 수용체; 문헌[Kaushansky et al., Nature, 369: 568-571, 1994]), ADP, 세로토닌, -트롬보글로불린 및 성숙 혈소판 기능에 결정적인 기타 물질을 함유하는 과립의 발현을 동반한다. 마지막으로, 고도의 배수체 거핵구는 세포질 분할을 겪어, 수천의 혈소판의 방출을 가능하게 한다(문헌[Choi et al., Blood, 85: 402-413, 1995]; 문헌[Cramer et al., Blood, 89: 2336-2346, 1997]).

거핵구는 모든 혈구 전구체와 같이, 광범위하게 자가-재생하거나, 혈액의 모든 요소로 분화하는 능력을 보유하는 만능 골수 줄기 세포로부터 유래된다. 혈소판 생성은 트롬보포이에틴(TPO)과 그의 세포 수용체 TPOR/MPUc-MPL 간의 상호작용에 의해 유도되는 신호전달 메커니즘에 의해 부분적으로 조절된다.

트롬보포이에틴(TPO)은 거핵구형성 및 혈소판 생성의 자극에 수반되는 조혈 성장 인자이다. TPO는 간 및 신장에서 발현되며, 혈소판 요구에 반응하여, 그의 발현은 골수 미세환경에서도 상향조절될 수 있다(문헌[Kato et al., Stem Cells, 16: 322-328, 1998]; 문헌[McCarty et al., Blood, 86:3668-3675, 1995]). TPO 발현이 주로 구성성임에 따라, TPO 수준은 혈소판에 의한 격리에 의해 조절되는 것으로 여겨진다(문헌[Fielder et al., Blood 87: 2154, 1996]).

TPO를 인코딩하는 유전자를 클로닝하고 특성화시켰다(문헌[Kuter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11104-11108, 1994]; 문헌[Bartley et al., Cell, 77:1117-1124, 1994]; 문헌[Kaushansky et al., Nature, 369:568-571, 1994]; 문헌[Wendling et al., Nature, 369:571-574, 1994] 및 문헌[de Sauvage et al., Nature, 369:533-538, 1994]). 인간 TPO(hTPO) cDNA는 353개 아미노산-길이 폴리펩티드를 인코딩한다. 신호 펩티드의 절단 후에 포유류 세포로부터 분비되는 전장 hTPO는 332개 아미노산으로 이루어진다. 이러한 단백질의 예측된 분자량이 38 kDa이지만, 혈청 중 또는 재조합 세포 유래의 배양액 중 물질의 측정으로부터 보고된 분자량은 18로부터 85 kD까지 달라진다(당화 및 번역후 단백질분해 과정).

TPO에 대한 세포 표면 수용체(TPOR/MPL/c-MPL)는 원암유전자 c-mpl의 생성물, v-mpl의 유사체, 범골수성 장애를 유도하는 것으로 밝혀진 골수증식성 백혈병 바이러스(MPLV)의 외피 단백질이다(문헌[Wendling, Virol., 149:242-246, 1986]). 인간 c-mpl 유전자는 71 kD의 예측된 분자량을 갖는 635개 아미노산의 단백질을 코딩한다(문헌[Vigon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5640-44, 1992]; 문헌[Mignotte et al., Genomics, 20: 5-12, 1994]).

마우스는 TPO 또는 그의 수용체(TPOR/MPL/c-MPL) 중 어느 하나의 발현에 대하여 효력이 없게 된 마우스는 중증 혈소판감소 표현형을 나타낸다(문헌[Gurney et al., Science, 265: 1445, 1994]; 문헌[Kaushansky et al., J. Clin. Invest., 96: 1683, 1995]; 문헌[de Sauvage et al., J. Exp. Med., 183: 651, 1996]).

다수의 사이토카인(예를 들어, 줄기 세포 인자[SCF], IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, 백혈병 억제 인자[LIF], G-CSF, GM-CSF, M-CSF, 에리트로포이에틴(EPO), 키트 리간드 및 -인터페론)은 혈소판 생성 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

혈소판 활성화

생성된 혈소판은 그들이 혈관 손상 위치와 만나는 경우 신속한 변환을 겪는 작은 디스크-형상의 세포 단편이다. 그들은 더욱 구형이 되고, 위족을 돌출시키고, 그들의 피브리노겐 수용체는 활성화되어, 응고를 야기하고, 그들은 그들의 과립 내용물을 방출시키고, 결국 그들은 일차 지혈을 담당하는 플러그(plug)를 형성한다(문헌[Siess, W., Physiol. Rev. 69: 58-178, 1989]). 혈소판의 활성화는 또한 불안정 협심증, 심근경색 및 뇌졸중의 발병에 연루된다(문헌[Packham, M. A., Can J. Physiol Pharmacol. 72: 278-284]).

몇몇의 생리 물질, 예를 들어, 내피하 표면에 노출되는 콜라겐, 응고 캐스케이드에 의해 생성되는 트롬빈 및 활성화 혈소판으로부터 방출되는 트롬복산 A2(TXA₂) 및 ADP가 혈소판의 활성화에 수반된다. 콜라겐은 인테그린 α2 β1을 포함하는 몇몇의 혈소판 막 단백질에 결합하여, TXA₂ 및 ADP의 방출을 통해 혈소판 활성화를 야기한다(문헌[Shattil, S. J., et al., Curr. Opin. Cell Biol. 6: 695-704, 1994]). 대조적으로, 트롬빈, TXA₂ 및 ADP는 G-단백질 결합된 수용체를 직접 활성화시키고, 혈소판 응집 및 과립 방출을 유도한다(문헌[Hourani, S. M, and Cusack, N. J., Pharmacol. Rev. 43: 243-298, 1991]). 혈소판 활성화에 연루되는 주요 사건은 이노시톨 1,4,5 트리포스페이트 및 디아실글리세롤의 생성을 야기하는 포스포리파제 C(PLC)의 β-아이소형의 활성화의 결과인 것으로 여겨진다. 혈소판은 주로 2개의 아이소형, PLC-β2 및 PLC-β3을 함유한다.

혈소판 부착 및 응집을 매개하는 혈소판 수용체는 2개의 주요 혈소판 표면 당단백질 복합체에 위치한다. 이들 복합체는 폰빌레브란트 인자(vWF)의 결합에 의해 혈소판 부착을 용이하게 하는 당단백질 Ib-IX 복합체 및 피브리노겐으로의 결합에 의해 혈소판을 응집체에 연결시키는 당단백질 IIb-IIIa 복합체이다. 베르나르-술리에 증후군, 선천성 출혈 장애가 있는 환자는 vWF에 결합하는 당단백질 Ib-IX 복합체의 결핍, 경증 혈소판 감소증 및 대형 림프성 혈소판으로 인한 혈소판 부착 결핍을 보인다.

당단백질 V(GPV)는 주요(

12,000개 분자/혈소판) 고도로 글리코실화된 혈소판 막 단백질이다(Mr 82,000). 트롬빈에 대한 혈소판의 노출은 GPVfl로 지칭되는 69 kDa 가용성 단편을 유리시킨다. GPV는 GPIb-IX 복합체, 즉, GPIb(GPIbβ, 24 kDa 단백질과 이황화 결합된 GPIbα, 145 kDa 단백질로 이루어짐)와 GPIX(22 kDa 단백질)의 비공유적 회합에 의해 형성되는 복합체와 비공유적으로 상호작용할 수 있다. GPIb-IX 복합체 상의 폰빌레브란트 인자에 대한 및 트롬빈에 대한 결합 부위는 GPIbα 상에 위치된다. 트롬빈이 트롬빈 수용체(문헌[Vu et. al., Cell 64:1057-1068 (1990)]), G-단백질 결합된 수용체의 절단에 의해 혈소판을 활성화시키는 것으로 알려져 있기 때문에, GPIbα로의 트롬빈 결합의 결과로서 부수적으로 트롬빈이 GPV를 절단하는지 여부 또는 이러한 절단이 생리학적 역할을 갖는지 여부는 알려져 있지 않다. GPIBα, GPIBβ 및 GPIX는 하나 이상의 상동성 24개 아미노산 류신-풍부 도메인을 함유한다. 이들 도메인은 또한 류신-풍부 당단백질(LRG)의 큰 패밀리에서 관찰된다.

GPV는 거핵구 세포 계통에 대한 마커이다. GPV에 특이적인 모노클로널 항체(SW16)는 적혈구, 백혈구 내피 세포 또는 혈소판 거핵구 마커를 발현하는 것으로 알려져 있는 세포주, 예를 들어, HEL 또는 MEG-01에 결합하지 않는다.

성숙 GPV는 단일의 막횡단 도메인, 짧은 세포질 도메인(16개 잔기) 및 8개의 잠재적인 N-글리코실화 부위를 갖는 큰 세포외 도메인을 함유하는 543개 아미노산으로 이루어진다. 세포외 도메인의 분석에 의해, GPIbα와 상동성을 갖는 24개 아미노산의 15개의 류신-풍부 탠덤 반복부의 존재가 드러났으며, 피브리노겐의 Aα 쇄와 상동성을 갖는 C-말단 근처에서 트롬빈에 대한 절단 부위가 확인되었다.

배양 조건

본원에 기재된 외인성 항원-발현 EHC를 생성하기 위한 공급원은 순환 세포, 예를 들어, EHC를 포함한다. 적합한 세포 공급원은 본원에 기재된 대상체로부터 인간-유래의 조혈 또는 적혈계 전구 세포로부터 단리되거나, 불멸화 EHC 세포주로부터 유래되거나 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래되고, 임의로 배양되고 분화될 수 있다. 세포 배양 기술을 사용한 적혈구의 생성 방법은 해당 분야, 예를 들어, 문헌[Giarratana et al., Blood 2011, 118:5071], 문헌[Huang et al., Mol Ther 2013, epub ahead of print September 3] 또는 문헌[Kurita et al., PLOS One 2013, 8:e59890]에 널리 알려져 있다. 프로토콜은 성장 인자, 출발 세포주, 배양 기간 및 생성된 세포를 특성화시키는 형태적 특질에 따라 달라진다. 또한, 공여자 수혈에 대용할 수 있는 혈액 생성을 위한 배양 시스템이 확립되었다(문헌[Fibach et al. 1989 Blood 73:100]). 최근에, CD34+ 세포를 망상적혈구 단계로 분화시킨 다음, 인간 대상체로 성공적으로 주입하였다(문헌[Giarratana et al., Blood 2011, 118:5071]).

EHC 및 EHC로부터 유래된 외인성 항원-발현 EHC에 대한 배양 방법이 본원에 제공된다. EHC는 예를 들어, CD34+ 조혈 전구 세포(문헌[Giarratana et al., Blood 2011, 118:5071]), 유도된 만능 줄기 세포(문헌[Kurita et al., PLOS One 2013, 8:e59890]) 및 배아 줄기 세포(문헌[Hirose et al. 2013 Stem Cell Reports 1:499])를 포함하는 조혈 전구 세포로부터 배양될 수 있다. 전구 세포를 증량시키고 분화시키는데 적합한 성장 및 분화 인자의 칵테일이 해당 분야에 알려져 있다. 적합한 증량 및 분화 인자의 예는 줄기 세포 인자(SCF), 인터류킨(IL), 예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, CSF, G-CSF, 트롬보포이에틴(TPO), GM-CSF, 에리트로포이에틴(EPO), Flt3, Flt2, PIXY 321 및 백혈병 억제 인자(LIF)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

EHC는 전구 세포를 다단계 배양 과정에서 정의된 인자와 접촉시킴으로써 조혈 전구체, 예를 들어, CD34+ 세포로부터 배양될 수 있다. 예를 들어, EHC는 3-단계 과정에서 조혈 전구체로부터 배양될 수 있다.

제1 단계는 배양 중 세포를 1 내지 1000 ng/㎖의 줄기 세포 인자(SCF), 1 내지 100 U/㎖의 에리트로포이에틴(EPO) 및 0.1 내지 100 ng/㎖의 인터류킨-3(IL-3)와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 제1 단계는 임의로 배양 중 세포를 핵 호르몬 수용체, 예를 들어, 글루코코르티코이드 수용체, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체 또는 프레그난 x 수용체에 결합하고 이를 활성화시키는 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 이들 수용체에 대한 리간드는 예를 들어, 코르티코스테로이드, 예를 들어, 10 nM 내지 100 μM의 덱사메타손 또는 10 nM 내지 100 μM의 하이드로코르티손; 에스트로겐, 예를 들어, 10 nM 내지 100 μM의 베타-에스트라디올; 프로게스토겐, 예를 들어, 10 nM 내지 100 μM의 프로게스테론, 10 nM 내지 100 μM의 하이드록시프로게스테론, 10 nM 내지 100 μM의 5a-디하이드로프로게스테론, 10 nM 내지 100 μM의 11-데옥시코르티코스테론 또는 합성 프로게스틴, 예를 들어, 10 nM 내지 100 μM의 클로르마디논 아세테이트; 안드로겐, 예를 들어, 10 nM 내지 100 μM의 테스토스테론, 10 nM 내지 100 μM의 디하이드로테스토스테론 또는 10 nM 내지 100 μM의 안드로스테네디온; 또는 프레그난 x 수용체 리간드, 예를 들어, 10 nM 내지 100 μM의 리팜피신, 10 nM 내지 100 μM의 하이퍼포린, 10 nM 내지 100 μM의 망종화(하이퍼리신) 또는 비타민 E-유사 분자, 예를 들어, 10 nM 내지 100 μM의 토코페롤을 포함한다. 또한, 제1 단계는 임의로 배양 중 세포를 인슐린-유사 분자, 예를 들어, 1 내지 50 ㎍/㎖의 인슐린, 1 내지 50 ㎍/㎖의 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1), 1 내지 50 ㎍/㎖의 인슐린-유사 성장 인자 2(IGF-2) 또는 1 내지 50 ㎍/㎖의 메카노-성장 인자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 제1 단계는 추가로 임의로 배양 중 세포를 0.1 내지 5 ㎎/㎖의 트랜스페린과 포함할 수 있다.

제1 단계는 임의로 배양 중 세포를 하나 이상의 인터류킨(IL) 또는 성장 인자, 예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 대식구 콜로니-자극 인자(M-CSF), 과립구-대식구 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 트롬보포이에틴, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 전환 성장 인자 베타(TGF-B), 종양 괴사 인자 알파(TNF-A), 거핵구 성장 및 발생 인자(MGDF), 백혈병 억제 인자(LIF) 및 Flt3 리간드와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 각 인터류킨 또는 성장 인자는 전형적으로 0.1 내지 100 ng/㎖의 농도로 공급될 수 있다. 또한, 제1 단계는 임의로 배양 중 세포를 혈청 단백질 또는 비-단백질 분자, 예를 들어, 우태아혈청(1 내지 20%), 인간 혈장(1 내지 20%), 플라스마네이트(plasmanate)(1 내지 20%), 인간 혈청(1 내지 20%), 알부민(0.1 내지 100 ㎎/㎖) 또는 헤파린(0.1 내지 10 U/㎖)과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.

제2 단계는 배양 중 세포를 1 내지 1000 ng/㎖의 줄기 세포 인자(SCF) 및 1 내지 100 U/㎖의 에리트로포이에틴(EPO)과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 또한, 제2 단계는 임의로 배양 중 세포를 인슐린-유사 분자, 예를 들어, 1 내지 50 ㎍/㎖의 인슐린, 1 내지 50 ㎍/㎖의 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1), 1 내지 50 ㎍/㎖의 인슐린-유사 성장 인자 2(IGF-2) 또는 1 내지 50 ㎍/㎖의 메카노-성장 인자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 제2 단계는 임의로, 배양 중 세포를 0.1 내지 5 ㎎/㎖의 트랜스페린과 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 제2 단계는 임의로, 배양 중 세포를 혈청 단백질 또는 비-단백질 분자, 예를 들어, 우태아혈청(1 내지 20%), 인간 혈장(1 내지 20%), 플라스마네이트(1 내지 20%), 인간 혈청(1 내지 20%), 알부민(0.1 내지 100 ㎎/㎖) 또는 헤파린(0.1 내지 10 U/㎖)과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.

제3 단계는 배양 중 세포를 1 내지 100 U/㎖의 에리트로포이에틴(EPO)과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 제3 단계는 임의로 배양 중 세포를 1 내지 1000 ng/㎖의 줄기 세포 인자(SCF)와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 제3 단계는 임의로, 배양 중 세포를 인슐린-유사 분자, 예를 들어, 1 내지 50 ㎍/㎖의 인슐린, 1 내지 50 ㎍/㎖의 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1), 1 내지 50 ㎍/㎖의 인슐린-유사 성장 인자 2(IGF-2) 또는 1 내지 50 ㎍/㎖의 메카노-성장 인자와 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 제3 단계는 임의로, 배양 중 세포를 0.1 내지 5 ㎎/㎖의 트랜스페린과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 또한, 제3 단계는 임의로, 배양 중 세포를 혈청 단백질 또는 비-단백질 분자, 예를 들어, 우태아혈청(1 내지 20%), 인간 혈장(1 내지 20%), 플라스마네이트(1 내지 20%), 인간 혈청(1 내지 20%), 알부민(0.1 내지 100 ㎎/㎖) 또는 헤파린(0.1 내지 10 U/㎖)과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.

배양 과정은 임의로 세포를 해당 분양에 알려져 있는 방법에 의해 분자, 예를 들어, DNA 분자, RNA 분자, mRNA, siRNA, 마이크로RNA, lncRNA, shRNA, 호르몬 또는 하나 이상의 유전자를 활성화시키거나 낙다운시키는 소분자와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 표적 유전자는 예를 들어, GATA1, GATA2, CMyc, hTERT, p53, EPO, SCF, 인슐린, EPO-R, SCF-R, 트랜스페린-R, 인슐린-R을 포함하나 이들에 한정되지 않는 전사 인자, 성장 인자 또는 성장 인자 수용체를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, CD34+ 세포는 총 22일 동안 3개의 개별 분화 단계에서 다양한 양의 IMDM, FBS, 글루타민, BSA, 홀로트랜스페린, 인슐린, 덱사메타손, β-에스트라디올, IL-3, SCF 및 에리트로포이에틴을 함유하는 배양 중에 배치된다.

일 구현예에서, CD34+ 세포는 총 14일 동안 3개의 개별 분화 단계에서 다양한 양의 IMDM, FBS, 글루타민, BSA, 홀로트랜스페린, 인슐린, 덱사메타손, β-에스트라디올, IL-3, SCF 및 트롬보포이에틴을 함유하는 배양 중에 배치된다.

일 구현예에서, CD34+ 세포는 총 15일 동안 3개의 개별 분화 단계에서 다양한 양의 IMDM, FBS, 글루타민, BSA, 홀로트랜스페린, 인슐린, 덱사메타손, β-에스트라디올, IL-3, SCF 및 GCSF를 함유하는 배양 중에 배치된다.

특정 구현예에서, 관심 외인성 항원을 포함하는 세포는 표 A에 열거된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는 복수의 순환 세포로 구성되거나, 이로부터 유래될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 순환 세포는 EHC, 예를 들어, 유핵 적혈구, 적혈구 전구체 또는 제핵 적혈구이다. 예를 들어, EHC는 제대혈 줄기 세포, CD34+ 세포, 조혈 줄기 세포(HSC), 비장 콜로니 형성(CFU-S) 세포, 공통 골수계 전구(CMP) 세포, 미분화세포(blastocyte) 콜로니-형성 세포, 버스트 형성 단위-적혈구계(BFU-E), 거핵구-적혈구계 전구(MEP) 세포, 적혈구계 콜로니-형성 단위(CFU-E), 망상적혈구, 적혈구, 유도된 만능 줄기 세포(iPSC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 다염적혈모구, 정염적혈모구, 또는 표 A1에 열거된 것들 또는 그의 조합이다. 일부 구현예에서, EHC는 불멸 또는 불멸화 세포, 예를 들어, CD34+ 조혈 전구 세포의 레트로바이러스 형질도입에 의해 Oct4, Sox2, Klf4, cMyc를 발현하고 TP53을 억제함으로써 생성된 불멸화 적혈모구 세포이다(예를 들어, 문헌[Huang et al., Mol Ther 2013, epub ahead of print September 3]).

적혈구 조성물이 본원에 제공되며, 복수의 적혈구는 관심 외인성 항원 또는 그의 단편을 발현한다. 세포는 환자-유래의 조혈 또는 적혈구계 전구 세포로부터 배양되거나, 불멸화 EHC 세포주로부터 유래되거나, 유도된 만능 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 세포 배양 중 적혈구의 생성 방법은 해당 분야, 예를 들어, 문헌[Giarratana et al., Blood 2011, 118:5071], 문헌[Huang et al., Mol Ther 2013] 또는 문헌[Kurita et al., PLOS One 2013, 8:e59890]에 알려져 있다. 외인성 항원은 단일 또는 다수 카피의 유전자의 트랜스펙션, 바이러스로의 형질도입 또는 DNA 또는 RNA의 존재하의 전기천공법에 의해 도입될 수 있다. 포유류 세포에서의 외인성 단백질의 발현 방법은 해당 분야에 널리 알려져 있다. 예를 들어, 조혈 세포에서의 외인성 인자 IX의 발현은 CD34+ 전구 세포의 바이러스 형질도입에 의해 유도되며, 문헌[Chang et al., Nat Biotechnol 2006, 24:1017]을 참조한다.

본원에 기재된 적혈구 조성물은 하기의 방식으로 생성될 수 있다. 먼저, 적혈구계 전구 세포를 단리한다. 이들 세포는 대안적으로, 환자에 대해 자가이거나 실질적으로 보편적인 공여자 혈액으로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, 세포는 ABO형 O형, 레서스 인자 Rh r/r, 더피 -/- 및 거대 Kell 항원 K1 음성일 수 있다. 적혈구계 전구 세포로부터 EHC로의 분화 과정에서, 외인성 항원을 인코딩하는 핵산을 도입한다. 외인성 항원을 인코딩하는 핵산은 적혈구계-특이적 프로모터, 예를 들어, GATA-1 프로모터의 제어하에 존재할 수 있다(예를 들어, 문헌[Repik et al., Clin Exp Immunol 2005, 140:230] 참조). 외인성 항원을 인코딩하는 핵산은 해당 분야에 알려져 있는 임의의 방식으로 예를 들어, 플라스미드 DNA, 바이러스 또는 mRNA로서 도입될 수 있다. 핵산 도입은 다양한 표준 방법, 예를 들어, 트랜스펙션, 형질도입 또는 전기천공에 의해 달성될 수 있다.

전구 세포의 변형. 관심 항원을 생성하기 위한 핵산, 예를 들어, DNA 발현 벡터 또는 mRNA는 전구 세포로 도입될 수 있으며, 전구 세포는 원래의 공급원으로부터 단리되거나, 본원에 제공된 통상의 재조합 기술을 통해 상기 증량물으로부터 수득될 수 있다. 일부 예에서, 발현 벡터는 그들이 해당 분야에 알려져 있는 방법에 의해 상동성 또는 비-상동성 재조합에 의해 세포의 게놈 내로 혼입될 수 있도록 설계될 수 있다.

일부 예에서, 게놈을 선택적으로 표적화하고 절단할 수 있는 폴리펩티드, 예를 들어, CRISPR/Cas9, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 또는 아연 핑거 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 사용하여, 특정 게놈 위치, 예를 들어, CR1 유전자좌(1q32.2), 헤모글로빈 유전자좌(11p15.4) 또는 표 C에 열거된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는 다른 적혈구계-관련 단백질로의 발현 벡터의 핵산 페이로드의 삽입을 지시한다.

일부 예에서, 핵산은 표적 유전자의 발현을 침묵화시키거나 억제하는 RNA 분자 또는 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 분자이다. 예를 들어, 분자는 작은 간섭 RNA(siRNA), 안티센스 RNA 분자 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 분자일 수 있다.

전구 세포로의 발현 벡터의 전달 방법은 바이러스 매개의 유전자 전달, 리포좀 매개의 전달, 형질전환, 유전자 총, 트랜스펙션 및 형질도입, 예를 들어, 바이러스 매개의 유전자 전달, 예를 들어, DNA 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스, 아데노연관 바이러스 및 헤르페스 바이러스에 기초한 벡터 및 레트로바이러스 기반의 벡터에 기초한 벡터의 이용을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 유전자 전달 방식의 예는 예를 들어, 네이키드(naked) DNA, CaPO4 침전, DEAE 덱스트란, 전기천공법, 원형질체 융합, 리포펙션 및 세포 미세주입을 포함한다.

본원에 기재된 유전학적으로 변형된 전구 세포 중 임의의 것은 성숙 제핵 적혈구로의 분화, 예를 들어, 본원에 기재된 시험관내 배양 과정을 가능하게 하는 적합한 조건하에 배양될 수 있다. 생성된 제핵 적혈구는 표준 방법(예를 들어, 웨스턴 블롯팅 또는 FACS 분석)에 의해 입증되고 정량화될 수 있는 성숙 적혈구와 회합된 단백질, 예를 들어, 헤모글로빈, 글리코포린 A를 디스플레이하고, 이를 발현한다.

외인성 항원 발현을 위한 전략

외인성 항원-발현 EHC에 의해 나타나는 항원이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항원은 표적과 상호작용, 예를 들어, 표적과 회합하거나 이에 결합할 수 있다. 항원은 폴리펩티드를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 소분자 또는 그들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 표적과 상호작용하지 않지만, 외인성 항원-발현 EHC에 의해 세포, 조직 또는 대상체의 체 내의 다른 위치로 전달되는 페이로드로서 작용한다.

항원 폴리펩티드, 키메라 및 융합체

일부 구현예에서, 항원은 폴리펩티드를 포함한다. 리시버(receiver) 폴리펩티드는 크기가 6개 아미노산 내지 3000개 아미노산 범위일 수 있으며, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500개 아미노산을 초과할 수 있다. 리시버 폴리펩티드는 크기가 약 20개 아미노산 내지 약 500개 아미노산, 약 30개 아미노산 내지 약 500개 아미노산 또는 약 40개 아미노산 내지 약 500개 아미노산 범위일 수 있다.

일부 구현예에서, 항원 폴리펩티드는 둘 이상의 별개의 단백질 도메인을 포함할 수 있는 키메라 또는 융합 단백질을 포함한다. 이들 키메라 항원은 다양한 도메인이 상이한 공급원으로부터 유래된다는 점에서 이종 또는 외인성이며, 그와 같이, 천연에서 함께 발견되지 않고, 예를 들어, 재조합 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 항원 폴리펩티드는 다수의 방법에 의해 생성될 수 있으며, 이 중 다수는 해당 분야에 널리 알려져 있고, 또한 본원에 기재된다. 예를 들어, 항원 폴리펩티드는 (예를 들어, 단리된 세포로부터의) 추출에 의해, 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산의 발현에 의해 또는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 항원 폴리펩티드는 예를 들어, 재조합 기술 및 인코딩되는 항원 폴리펩티드의 발현을 위해 (예를 들어, 형질전환 또는 트랜스펙션에 의해) 숙주 세포 내로 도입되는 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 벡터에 의해 생성될 수 있다.

활성 변경 없이 일반적으로 아미노산 서열에 이루어질 수 있는 다양한 보존적 변화가 존재한다. 이들 변화는 보존적 치환 또는 돌연변이로 지칭되며; 즉, 특정 크기, 전하 또는 기타 특징을 갖는 아미노산의 그룹에 속하는 아미노산은 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 아미노산 서열에 대한 치환은 아미노산이 속하는 부류의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌 및 티로신을 포함한다. 중성 극성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 그러한 변경은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 등전점에 의해 결정되는 바와 같은 겉보기 분자량에 실질적으로 영향을 미치는 것으로 예상되지 않는다. 또한, 보존적 치환은 서열의 광학 이성질체를 다른 광학 이성질체로 치환하는 것, 특히 서열의 하나 이상의 잔기에 대한 L 아미노산을 D 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 더욱이, 서열 내의 모든 아미노산은 D로부터 L로의 이성질체 치환을 겪을 수 있다. 예시적인 보존적 치환은 양전하를 유지하기 위한 Arg에서 Lys으로의 치환 및 그의 역; 음전하를 유지하기 위한 Asp에서 Glu으로의 치환 및 그의 역; 유리 ~OH가 유지되도록 Thr에서 Ser으로의 치환; 및 유리 NH2를 유지하기 위한 Asn에서 Gln으로의 치환을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 더욱이, 폴리펩티드 서열 또는 상응하는 핵산 서열의 점 돌연변이, 결실 및 삽입은 일부 경우에, 폴리펩티드 또는 핵산 단편의 기능 소실 없이 이루어질 수 있다. 치환은 예를 들어, 1, 2, 3개 이상의 잔기를 포함할 수 있다. 특정 아미노산 서열 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산의 임의의 교시 또는 그의 명칭의 교시는 폴리펩티드 또는 핵산 단편의 기능 소실 없이 이루어질 수 있는 데이터베이스 내의 단백질 또는 유전자에 대하여 배치된 임의의 서열, 및 그들 폴리펩티드 서열 또는 상응하는 핵산 서열의 점 돌연변이, 결실 및 삽입을 포함한다.

일부 구현예에서, 항원 폴리펩티드는 외인성 항원-발현 EHC의 막과 회합된다. 다른 구현예에서, 항원 폴리펩티드는 외인성 항원-발현 EHC의 막과 회합되지 않는다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC 내의 지질 대 항원의 질량비는 1:1000 미만, 대략 1:1000, 대략 1:500, 대략 1:250, 대략 1:100, 대략 1:50, 대략 1:25, 대략 1:10, 대략 1:9, 대략 1:8, 대략 1:7, 대략 1:6, 대략 1:5, 대략 1:4, 대략 1:3, 대략 1:2, 대략 1:1, 대략 2:1, 대략 3:1, 대략 4:1, 대략 5:1, 대략 6:1, 대략 7:1, 대략 8:1, 대략 9:1, 대략 10:1, 대략 25:1, 대략 50:1, 대략 100:1, 대략 250:1, 대략 500:1, 대략 1000:1, 대략 10,000:1, 대략 100,000:1, 대략 1,000,000:1, 대략 10,000,000:1, 대략 100,000,000:1, 대략 1,000,000,000:1 또는 대략 1,000,000,000:1 초과이다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC 내의 비-외인성 항원 폴리펩티드 대 항원의 질량비는 1:1000 미만, 대략 1:1000, 대략 1:500, 대략 1:250, 대략 1:100, 대략 1:50, 대략 1:25, 대략 1:10, 대략 1:9, 대략 1:8, 대략 1:7, 대략 1:6, 대략 1:5, 대략 1:4, 대략 1:3, 대략 1:2, 대략 1:1, 대략 2:1, 대략 3:1, 대략 4:1, 대략 5:1, 대략 6:1, 대략 7:1, 대략 8:1, 대략 9:1, 대략 10:1, 대략 25:1, 대략 50:1, 대략 100:1, 대략 250:1, 대략 500:1, 대략 1000:1, 대략 10,000:1, 대략 100,000:1, 대략 1,000,000:1, 대략 10,000,000:1, 대략 100,000,000:1, 대략 1,000,000,000:1 또는 대략 1,000,000,000:1 초과이다.

특정 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 표면상에 위치하며, 외인성 항원-발현 EHC 주변의 환경에 노출된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 외인성 항원-발현 EHC 내측에 위치하거나, 그의 비노출 측을 향한다.

특정 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 하기의 도메인, S 도메인(표면), A 도메인(앵커) 및/또는 U 도메인(비노출) 중 적어도 하나를 포함하며, S 도메인은 외인성 항원-발현 EHC 주위의 환경에 노출된 표면 도메인이고, A 도메인은 앵커이고, U 도메인은 외인성 항원-발현 EHC 내에 배치되고/거나 외인성 항원-발현 EHC의 비노출 측을 향한다.

임의로, 항원 폴리펩티드는 i) S' 도메인으로 지칭되는 하나 이상의 추가의 S 도메인 또는 ii) U' 도메인으로 지칭되는 하나 이상의 추가의 U 도메인을 포함한다.

일부 구현예에서, S 도메인 및 A 도메인은 동일한 폴리펩티드 쇄의 부분을 형성한다.

일부 구현예에서, A 도메인 및 U 도메인은 동일한 폴리펩티드 쇄의 부분을 형성한다.

일부 구현예에서, S, A, U 도메인 중 임의의 하나 이상은 외인성 항원-발현 EHC에 외부적으로 부가된다.

일부 구현예에서, S, A, U 도메인 중 임의의 하나 이상은 외인성 항원-발현 EHC 내에서 생성된다.

일부 구현예에서, S, A, U 도메인 중 임의의 하나 이상은 폴리펩티드이다.

일부 구현예에서, S, A, U 도메인 중 임의의 하나 이상은 폴리펩티드가 아니다.

외인성 항원-발현 EHC 내의 또는 그 상의 항원의 예시적인 입체구조의 개략도는 도 13a, 도 13b 및 도 13c에 나타나 있다.

A 도메인

특정 구현예에서, A 도메인은 막 폴리펩티드이다. A 도메인은 예를 들어, 내재 막 폴리펩티드 또는 막 회합 폴리펩티드일 수 있다.

A 도메인은 예를 들어, 하기를 포함하나 이들에 한정되지 않는 하기의 부류 중 하나로부터 선택될 수 있다: 알파-나선 비토픽(bitopic), 알파-나선 폴리토픽(polytopic), 베타-배럴 막횡단(beta-barrel transmembrane), 모두 알파 모노토픽(monotopic)/주변, 모두 베타 모노토픽/주변, 알파/베타 모노토픽/주변, 알파 + 베타 모노토픽/주변, 알파 나선 펩티드, 베타-헤어핀 펩티드, 베타-헬리컬 펩티드, 1형 막횡단 단백질(N-말단 세포외), 2형 막횡단 단백질(N-말단 세포내), 3형 막횡단 단백질, 4A형 막횡단 단백질, 4B형 막횡단 단백질, 지질-고정 단백질, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 고정 단백질, 프레닐 쇄 고정 단백질 또는 비정규 구조의 펩티드.

특정 구현예에서, A 도메인은 내인성이며, 예를 들어, EHC, 혈소판 또는 조혈 세포에 대하여 내인성이다. 일부 구현예에서, A 도메인은 포유류 세포에 대해 내인성이다.

특정 구현예에서, A 도메인은 외인성이며, 예를 들어, EHC, 혈소판 또는 조혈 세포에 대하여 외인성이다. 일부 구현예에서, A 도메인은 포유류 세포에 대해 외인성이다.

A 도메인은 하기를 포함하나 이들에 한정되지 않는 하기의 분자 또는 그의 단편으로부터 선택될 수 있다: CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD12w, CD13, CD14, CD15, CD16, CDw17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42, CD43, CD44, CD45, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD68, CD69, CD71, CD72, CD73, CD74, CD80, CD81, CD82, CD83, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CD95, CD96, CD100, CD103, CD105, CD106, CD107, CD107a, CD107b, CD109, CD117, CD120, CD122, CD123, CD127, CD132, CD133, CD134, CD135, CD138, CD141, CD142, CD143, CD144, CD147, CD151, CD152, CD154, CD155, CD156, CD158, CD163, CD165, CD166, CD168, CD184, CDw186, CD195, CD197, CDw199, CD209, CD202a, CD220, CD221, CD235a, CD271, CD279, CD303, CD304, CD309, CD326, Ras-관련 단백질 1A, 세마포린(semaporin) 7A 전구체, 칼슘 및 인테그린-결합 단백질 1, 55 kDa 적혈구 막 단백질, 플로틸린(Flotillin)-1, 플로틸린-2, 적혈구계 막-관련 단백질, 진핵 번역 개시 인자 2C 2, 사이토크롬 b5 환원효소, 세포 분열 조절 단백질 42 상동체, KIAA1363 단백질, 밴드(band)3, 아넥신(annexin) VII, 아쿠아포린(aquaporin), Ecto-ADP-리보실트랜스퍼라제 4, Kell, LFA-3, 용질 운반 패밀리 2 구성원 1, LGALS3 단백질, 요소 수송체, Rh 혈액 CE 그룹 항원 폴리펩티드, Rh-연관 당단백질, 데마틴(Dematin), ABO 혈액형, 아쿠아포린 3, 우베르거(Aubergers), 밴드 3, 베이시진(Basigin), C41, CD44, 시스(Cis) AB, 콜튼(Colton) 항원, 보체 성분 4, CR1, DAF, 디에고(Diego), 더피, Hh/봄베이(Bombay) 항원, ii 항원, 인디안 혈액형, Kell, Kidd, 루이스(Lewis) 항원, 루더런(Lutheran) 항원, MNS 항원 시스템, 코스트(Cost) 그룹, Er 그룹, 데마틴, 스토마틴(Stomatin), 트로포미오신(Tropomyosin), 글루코스 수송체(Glucose transporter), 아듀신(Adducin), 라브필린(Rabphilin), C1 테트라하이드로폴레이트 신타제, Vel 그룹, Lan 항원, At 항원, Jr 항원, AnWj 항원, Sd 항원, 배티(Batty), 빌케스(Bilkes), 박스(Box), 크리스티안센(Christiansen), HJK, HOFM, JFV, JONEs, 옌센(Jensen), 카타기리(Katagiri), 리베세이(Livesay), 밀네(Milne), 올데이드(Oldeide), 피터스(Peters), 라스무센(Rasmussen), 레이드(Reid), REIT, SARA, 레수스 혈액 D 그룹, 알돌라제(Aldolase), 트로포모듈린(Tropomodulin), 아르기나제(Arginase), 크레아틴 키나제(Creatine kinase), B-Cam 단백질, Rap1A, 베넷-굿스피드(Bennett-Goodspeed), P 항원 시스템, Rh 혈액 그룹Xg 항원 시스템, XK 단백질, Yt/Cartwright 항원 시스템, CD58, Rh, 스시아나(Scianna), 라딘(Radin), DARC(더피), CR1 Knops-McCoy, DAF 크로머(Cromer), 제르비치(Gerbich)(GYPC), CD47, 글리코포린(Glycophorin) A, 밴드 3(AE3), GYPB Ss, C4A, C4B 치도(Chido), 보체의 로저스(Rodgers) C4 성분, HLA Bg HLA 부류 I, RHAG Rh-연관 암모늄 수송, 당단백질, 콜튼(Colton, Co) 워터 채널 단백질(Water channel protein), ACHE Cartwright(Yt) 아세틸콜린에스테라제, 글루타티온 트랜스퍼라제, 글리코포린 C, 아쿠아포린, 적혈모구 연관 막 단백질, CD44, 시냅토브레빈(Synaptobrevin) 2, 리보뉴클레아제(Ribonuclease), 십이지장 사이토크롬 B, ABO 글리코실 트랜스퍼라제, CD59, CD44 인디안(Indian, In), AnWj 부착 수용체, MER2, DOK 돔브록(Dombrock) ADP-리보실트랜스퍼라제, SEMA7A JMH 추정 부착 수용체, UMOD Sda Tamm-Horsfall 단백질(우로모둘린), 디에고(Diego, Di), 라이트(Wright, Wr) 음이온 채널 단백질(밴드 3, AE1), Kidd(Jk) 요소 수송체, FUT3 루이스(Le) 알파(1,3) 푸코실트랜스퍼라제, OK Oka 뉴로텔린(Neurothelin), 추정의 부착 분자, LW 부착 수용체, FUT2 분비형(Secretor, Se) 알파(1,2) 푸코실트랜스퍼라제, FUT1 Hh 알파(1,2) 푸코실트랜스퍼라제, LU 루더런(Lutheran, Lu) 부착 수용체, P1 글리코실트랜스퍼라제, XK Kx 추정의 신경전달물질 수송체, 이전에 PBDX로 지칭되는 XG Xg, MIC2, 헤모글로빈, 안키린(Ankyrin), 스펙트린(Spectrin), KEL Kell(형태 K,k,Kp,Js) 메탈로프로테이나제, 토르킬드센(Torkildsen) 항원, 보조효소 Q10, Rab 35, Ral A 결합 단백질, 조나 펠루시다(Zona pellucida) 결합 단백질, Lyn B 단백질, KIaa1741 단백질, DC38, 칼슘 수송 ATPase, GPIX, GPIba, GPIbb, GPV, GPIb-IX-V, GPVI, GPIa/IIa, GPIIb/IIIa, GPV/IIa.

S 도메인

일부 구현예에서, S 도메인은 단백질 또는 폴리펩티드이다. 다른 구현예에서, S 도메인은 핵산이다. 일부 구현예에서, S 도메인은 화학물질이다. 특정 구현예에서, S 도메인은 소분자이다.

일부 구현예에서, S 도메인은 하기를 포함하나 이들에 한정되지 않는 하기의 부류 중 하나 이상으로부터 선택되거나 그로부터 유래된 폴리펩티드이다: 유연성 링커, 에피토프 태그, 효소, 프로테아제, 뉴클레아제, 항원, 항체-유사 분자, 항체의 리간드, 성장 인자, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 효소 인식 서열, 트랜스펩티다제 인식 서열, 프로테아제 인식 서열, 절단가능한 도메인, 인테인, DNA 결합 단백질 및 RNA 결합 단백질, 보체 조절 분자, 보체 캐스케이드 분자, 응고 캐스케이드 분자, 킬레이터, 보체 조절 도메인, SCR 도메인, CCP 도메인, 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 도메인, 아르마딜로 반복부(armadillo repeat), 류신 지퍼, 사망 이펙터 도메인, 카드헤린 반복부, EF 핸드(hand), 포스포티로신 결합 도메인, 플렉스트린(pleckstrin) 상동성 도메인, SCR 상동성 2 도메인, 아연 핑거 도메인, 사이클릭 펩티드, 세포-투과 펩티드.

일부 구현예에서, S 도메인은 비-폴리펩티드 분자, 예를 들어, 핵산, 탄수화물 또는 소분자이다. 일부 구현예에서, S 도메인은 하기를 포함하나 이들에 한정되지 않는 하기의 부류 중 하나 이상으로부터 선택되는 핵산이다: DNA 압타머, RNA 압타머, siRNA, shRNA, 단일-가닥 RNA 프로브, 단일 가닥 DNA 프로브, mRNA, 화학 변형 올리고뉴클레오티드. 일부 구현예에서, S 도메인은 하기를 포함하나 이들에 한정되지 않는 하기의 부류 중 하나 이상으로부터 선택되는 소분자이다: 킬레이터, DOTA, 방사성핵종, 동위원소, 영상화제, 형광 분자, 화학발광 분자, 기체.

U 도메인

일부 구현예에서, U 도메인은 단백질 또는 폴리펩티드이다. 다른 구현예에서, U 도메인은 핵산이다. 일부 구현예에서, U 도메인은 화학물질이다. 특정 구현예에서, U 도메인은 소분자이다.

일부 구현예에서, U 도메인은 하기를 포함하나 이들에 한정되지 않는 하기의 부류 중 하나 이상으로부터 선택되거나 그로부터 유래된 폴리펩티드이다: 유연성 링커, 에피토프 태그, 효소, 프로테아제, 뉴클레아제, 항원, 항체-유사 분자, 항체의 리간드, 성장 인자, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 효소 인식 서열, 트랜스펩티다제 인식 서열, 프로테아제 인식 서열, 절단가능한 도메인, 인테인, DNA 결합 단백질 및 RNA 결합 단백질, 보체 조절 분자, 보체 캐스케이드 분자, 응고 캐스케이드 분자, 킬레이터, 보체 조절 도메인, SCR 도메인, CCP 도메인, 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 도메인, 아르마딜로 반복부, 류신 지퍼, 사망 이펙터 도메인, 카드헤린 반복부, EF 핸드, 포스포티로신 결합 도메인, 플렉스트린 상동성 도메인, SCR 상동성 2 도메인, 아연 핑거 도메인, 사이클릭 펩티드, 세포-투과 펩티드, 키나제 도메인, 포스파타제 도메인, 세포골격 단백질, 세포골격 단백질과 상호작용하는 단백질, G-단백질 결합 수용체, 티로신 키나제, ITIM 도메인, ITAM 도메인.

일부 구현예에서, U 도메인은 비-폴리펩티드 분자, 예를 들어, 핵산, 탄수화물 또는 소분자이다. 일부 구현예에서, U 도메인은 하기를 포함하나 이들에 한정되지 않는 하기의 부류 중 하나 이상으로부터 선택되는 핵산이다: DNA 압타머, RNA 압타머, siRNA, shRNA, 단일-가닥 RNA 프로브, 단일 가닥 DNA 프로브, mRNA, 화학 변형 올리고뉴클레오티드. 일부 구현예에서, U 도메인은 하기를 포함하나 이들에 한정되지 않는 하기의 부류 중 하나 이상으로부터 선택되는 소분자이다: 킬레이터, DOTA, 방사성핵종, 동위원소, 영상화제, 형광 분자, 화학발광 분자, 기체.

항원 폴리펩티드의 예

항원 폴리펩티드의 예는 다음을 포함한다: 폴리펩티드 항원은 N 말단에 HA 에피토프 태그가 있는 글리코포린 A를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 글리코포린 A의 리더 서열, HA 에피토프 태그 및 글리코포린 A의 바디 서열을 포함하고; 폴리펩티드 항원은 보체 수용체 1(CR1)을 포함하고; 폴리펩티드 항원은 CR1의 리더 서열, HA 에피토프 태그, CR1의 바디 서열을 포함하고; 폴리펩티드 항원은 CR1의 리더 서열, HA 에피토프 태그, CR1의 LHR-A 및 LHR-B의 6개의 SCR 도메인, CR1의 막 근위 2개 SCR 도메인, CR1의 막횡단 영역 및 CR1의 세포내 영역을 포함하고; 폴리펩티드 항원은 CR1의 리더 서열, HA 에피토프 태그, CR1의 LHR-A 및 LHR-B 및 LHR-C의 9개의 SCR 도메인, CR1의 막 근위 2개 SCR 도메인, CR1의 막횡단 영역 및 CR1의 세포내 영역을 포함하고; 폴리펩티드 항원은 CR1의 리더 서열, CR1의 LHR-A, CR1의 LHR-B, CR1의 LHR-C, CR1의 막 근위 2개 SCR 도메인, CR1의 막횡단 영역 및 CR1의 세포내 영역을 포함하고; 폴리펩티드 항원은 CR1의 리더 서열, CR1의 LHR-A, CR1의 LHR-B, CR1의 LHR-C, CR1의 막 근위 2개 SCR 도메인, 글리코포린 A의 막횡단 영역 및 세포내 영역을 포함하고; 폴리펩티드 항원은 글리코포린 A의 리더 서열, B형 간염 표면 항원에 대한 항체 scFv(scFv), (Gly3Ser)2 유연성 링커, HA 에피토프 태그 및 글리코포린 A의 바디를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 Kell, (Gly3Ser)2 유연성 링커, HA 에피토프 태그 및 scFv를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 Kell 및 HA 에피토프 태그를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 Kell의 71-아미노산 N-말단 단편 및 HA 에피토프 태그를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 Kell의 71-아미노산 N-말단 단편, (Gly3Ser)2 유연성 링커 및 HA 에피토프 태그를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 Kell의 79-아미노산 N-말단 단편 및 HA 에피토프 태그를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 Kell의 79-아미노산 N-말단 단편, (Gly3Ser)2 유연성 링커 및 HA 에피토프 태그를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 Kell의 71-아미노산 N-말단 단편, (Gly3Ser)2 유연성 링커, scFv 및 HA 에피토프 태그를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 Kell의 79-아미노산 N-말단 단편, (Gly3Ser)2 유연성 링커, scFv 및 HA 에피토프 태그를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 CD55의 리더 서열, scFv, HA 에피토프 태그 및 CD55의 말단 37개 아미노산을 포함하고; 폴리펩티드 항원은 CD55의 리더 서열, HA 에피토프 태그 및 CD55의 바디를 포함한다. 일 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 CD59의 리더 서열, scFv, HA 에피토프 태그 및 CD59의 바디를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 CD59의 리더 서열 및 HA 에피토프 태그 및 CD59의 바디를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 아데노신 데아미나제 및 HA 에피토프 태그를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 페닐알라닌 하이드록실라제 및 HA 에피토프 태그를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 아데노신 데아미나제, (Gly3Ser)2 유연성 링커, 페닐알라닌 하이드록실라제 및 HA 에피토프 태그를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 글리코포린 A, 세포질 C 말단에 아데노신 데아미나제 및 HA 에피토프 태그를 포함하고; 폴리펩티드 항원은 글리코포린 A, 세포질 C 말단에 페닐알라닌 하이드록실라제 및 HA 에피토프 태그를 포함한다.

특정 구현예에서, 항원은 대식구와 상호작용할 수 있거나 그와 상호작용한다. 항원 폴리펩티드는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 보체 수용체(문헌[Rieu et al., J. Cell Biol. 127:2081-2091 (1994)]), 스캐빈저(scavenger) 수용체(문헌[Brasseur et al., Photochem. Photobiol. 69:345-352 (1999)]), 트랜스페린 수용체(문헌[Dreier et al., Bioconjug. Chem. 9:482-489 (1998)]; 문헌[Hamblin et al., J. Photochem. Photobiol. 26:4556 (1994)]); Fc 수용체(문헌[Rojanasakul et al., Pharm. Res. 11:1+731-1733 (1994)]); 및 만노스 수용체(문헌[Frankel et al., Carbohydr. Res. 300:251-258 (1997)]; 문헌[Chakrabarty et al., J. Protozool. 37:358-364 (1990)]).

대식구와 상호작용할 수 있거나, 그와 상호작용하는 다른 항원은 다음을 포함한다: 저밀도 지질단백질(문헌[Mankertz et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 240:112-115 (1997)]; 문헌[von Baeyer et al., Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. Toxicol. 31:382-386 (1993)]), 초저밀도 지질단백질(문헌[Tabas et al., J. Cell Biol. 115:1547-1560 (1991)]), 만노스 잔기 및 다른 탄수화물 모이어티(문헌[Pittet et al., Nucl. Med. Biol. 22:355-365 (1995)]), 다가-양이온 분자, 예를 들어, 폴리-L-리신(문헌[Hamblin et al., J. Photochem. Photobiol. 26:45-56 (1994)]), 리포좀(문헌[Bakker-Woudenberg et al., J. Drug Target. 2:363-371 (1994)]; 문헌[Betageri et al., J. Pharm. Pharmacol. 45:48-53 (1993)]) 및 2-마크로글로불린(문헌[Chu et al., J. Immunol. 152:1538-1545 (1994)]).

i) 동일한 계통의 고유 EHC에 존재하지 않거나, ii) 항원을 포함하는 EHC에 비하여 감소된 수준 또는 감소된 활성 수준으로 동일한 계통의 고유 EHC에 존재하는 기능적 활성을 갖는 항원을 포함하는 EHC를 함유하는 조성물이 본원에 제공된다. 그러한 기능적 활성은 보체 억제, 면역 복합체 제거, 인공 항원 제시, 응고 캐스케이드의 조절, 산소 운반, 약물 전달, 세포 독소 흡착, 식세포작용의 회피 및 순환 시간의 연장을 포함한다.

일부 구현예에서, EHC는 CR-1 항원을 포함하기 때문에, 동일한 계통의 고유 EHC보다 더 높은 수준의 보체 수용체 폴리펩티드, 예를 들어, CR1을 갖는다. 대안적인 구현예에서, 항원을 포함하는 EHC는 표 6 및 표 8에 열거된 폴리펩티드를 포함하나 이들에 한정되지 않는 동일한 계통의 고유 EHC보다 더 높은 수준의 보체 수용체 효능제 폴리펩티드 또는 보체 관련 폴리펩티드를 갖는다. 보체 수용체 항원 폴리펩티드는 인간 보체 수용체-1(CR1) 폴리펩티드, 그의 변이체 또는 작용성 단편을 포함한다. CR1 항원 폴리펩티드는 CR1의 고유 대립형질, 예를 들어, A 대립형질(F 대립형질 또는 CR1*1 대립형질로도 지칭), B 대립형질(S 대립형질 또는 CR1*2 대립형질로도 지칭), C 대립형질(F' 대립형질 또는 CR1*3 대립형질로도 지칭) 또는 D 대립형질(CR1*4 대립형질로도 지칭) 중 하나 이상으로부터 유래될 수 있다. 이들 고유 형태에 대한 서열 및 데이터베이스 수탁 번호는 표 3에 제공되어 있다. 일부 구현예에서, CR1 항원 폴리펩티드는 CR1 폴리펩티드의 도메인을 함유한다. 예를 들어, CR1 폴리펩티드는 보체 조절 단백질(CCP) 모듈 또는 수시(Sushi) 도메인, 예를 들어, Genbank 수탁 번호 AAV65577.1로도 지칭되는 하나 이상의 짧은 컨센서스 반복(SCR) 도메인을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, CR1 항원 폴리펩티드는 하나 이상의 짧은 컨센서스 반복부(SCR), 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 44개 초과의 SCR을 포함한다. 다른 구현예에서, CR1 항원 폴리펩티드는 CR1의 하나 이상의 긴 상동성 반복(LHR) 단위, 예를 들어, LHR-A, LHR-B, LHR-C 또는 LHR-D, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 6개 초과의 LHR 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, CR1 항원 폴리펩티드는 표 1 및 표 6에 열거된 세포 표면 모이어티를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다른 세포막 단백질, 예를 들어, 글리코포린 A, 글리코포린 B, 글리코포린 C, 글리코포린 D, kell, 밴드 3, 아쿠아포린 1, 글루트(glut) 1, 키드(kidd) 항원 단백질, 레서스 항원에 융합된 CR1의 1개의 또는 1개 초과의 세포외 도메인을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, EHC는 표 8에 열거된 폴리펩티드 및 폴리펩티드에 대한 효능제를 포함하나 이들에 한정되지 않는 보체 수용체 항원 폴리펩티드 또는 대안적으로 또는 조합하여, 보체 수용체 효능제 항원 폴리펩티드 또는 보체 관련 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산을 함유한다. 일부 구현예에서, EHC는 추가로 외인성 붕괴-촉진 인자(CD59, Genbank: CAG46523.1) 폴리펩티드 또는 외인성 막 보조인자(CD46, Genbank: BAA12224.1) 폴리펩티드 또는 그의 변이체 또는 작용성 단편 또는 그의 조합을 추가로 함유한다.

CR1 활성은 C3b-함유 면역 복합체로의 결합 및 순환으로부터 망상내피 시스템의 간 및 비장 대식구로의 이들 면역 복합체의 셔틀링(shuttling)을 포함한다. 면역 복합체는 망상내피 시스템의 세포와 만나면, 식세포작용 세포에 의해 세포내이입(endocytosed)되지만, 적혈구는 남겨져 그의 순환을 계속하게 된다. 면역 복합체의 제거는 때때로 적혈구의 표면으로부터 CR1의 단백질 가수분해 절단을 초래한다. 결합 활성을 측정하기 위하여, EHC와 면역 복합체 간의 시험관내 결합 검정을 수행할 수 있다. EHC의 모면을 측정하기 위하여, 식세포작용 세포 및 면역 복합체-로딩된 EHC를 사용하여 시험관내 식세포작용 검정을 수행할 수 있다. 간으로의 순환하는 면역 복합체의 생체내 제거를 측정하기 위하여, 방사성 표지된 면역 복합체를 사용하여 제거 및 생체분포 검정을 수행할 수 있다.

항원 폴리펩티드를 포함하지 않는 동일한 계통의 조혈 세포의 수준보다 더 높은 수준으로 고유 폴리펩티드를 포함하는 항원을 함유하는 EHC를 함유하는 조성물이 제공된다. 예를 들어, EHC의 모집단은 CR1 항원 폴리펩티드가 결여된 동일한 계통의 상응하는 조혈 세포보다 적어도 약 1.1, 예를 들어, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 또는 100000배 초과하여 더 높은 항원, 예를 들어, 보체 수용체 1 수준을 함유한다. 망상적혈구 및 적혈구에 대한 CR1 수준은 전형적으로 세포당 50 내지 2000개 분자이다(문헌[Lach-Trifilieff, J Immunol 1999, 162:7549]). 세포당 적어도 약 2500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 40000, 50000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000, 1000000개 또는 1000000개 초과의 분자의 CR1 수준을 갖는 EHC의 모집단을 함유하는 조성물이 제공된다. 야생형 및 외인성 항원-발현 EHC에서의 CR1 수준은 예를 들어, CR1에 특이적인 항체를 사용하여 유세포계수법에 의해 측정되고 정량화될 수 있다.

일부 구현예에서, 항원을 포함하는 EHC, 항원을 포함하는 EHC의 모집단 및 항원을 포함하는 EHC의 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항원은 순환 병원체, 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아와 상호작용한다. 일부 구현예에서, EHC는 순환 병원체에 특이적인 항체, scFv 또는 나노바디를 인코딩하는 재조합 유전자를 발현한다. 항체, scFv 또는 나노바디는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 다른 구현예에서, 순환 병원체에 대하여 친화성을 갖는 항체, scFv 또는 나노바디 항원 또는 다른 항원은 EHC 내로 또는 그 상으로 로딩된다. 순환 병원체에 대하여 친화성을 갖는 항체, scFv 또는 나노바디 항원 또는 다른 항원은 세포내로 또는 세포외로 국소화될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스 또는 박테리아 항원, 예를 들어, 표면, 외피 또는 캡시드 항원에 특이적이다.

특정 구현예에서, 항원을 포함하는 EHC, 항원을 포함하는 EHC의 모집단 및 항원을 포함하는 EHC의 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 항원은 독소, 바람직하게는 병원체로부터 또는 다르게는 환경으로부터 유래된 외래 독소와 상호작용한다. 일부 구현예에서, EHC는 지질다당류-결합 단백질(LBP), 살균/투과성-증가 단백질(BPI), 아밀로이드 P 성분 또는 양이온성 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 항원을 인코딩하는 재조합 유전자를 발현한다. 독소-결합 항원은 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 다른 구현예에서, 독소-결합 항원은 EHC 내로 또는 그 상으로 로딩될 수 있다. 독소-결합 항원은 세포내로 또는 세포외로 국소화될 수 있다. 일부 구현예에서, 독소 결합 항원은 박테리아 독소, 예를 들어, 보툴리늄 또는 탄저균에 특이적이다.

추가로, 외인성 항원-발현 EHC는 표적을 격리하는 그의 능력을 증진시킬 수 있는 항원을 발현할 수 있다. 잠재적인 격리 증진 항원은 표 1의 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는 폴리펩티드 수송체를 포함한다.

일 구현예에서, 항원은 케모카인에 대한 더피 항원 수용체(DARC)로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, EHC는 케모카인에 대한 더피 항원 수용체(DARC)로부터 유래된 아미노산 서열을 인코딩하는 재조합 유전자를 발현한다. DARC 항원은 전장 단백질 또는 그의 단편으로서 발현될 수 있다. DARC는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 다른 구현예에서, DARC 단백질은 EHC 내로 또는 그 상으로 로딩된다. 일부 구현예에서, 로딩된 DARC는 추가로 작용화되거나, 다르게 변형된다. DARC 항원 분자는 세포내로 또는 세포외로 국소화될 수 있다.

DARC는 강력한 다중-리간드 케모카인 수용체로서 확인되었다. DARC는 로돕신-유사 7-헬릭스 막횡단 단백질의 과에 속한다. DARC는 적혈구 외에도, 대부분의 조직에서 백혈구 이동의 주요 부위인 후모세혈관정맥 내피 세포에서 발현된다. DARC는 CC 및 CXC 케모카인 둘 모두에 대한 고도로 특이적인 결합 부위를 제공한다. DARC는 ELR 모티프 CXC 케모카인에 대하여 더 높은 친화성을 갖는 것으로 여겨진다. CXC 케모카인은 호중구 화학주성인자이며, 잠재적으로 신생혈관유발성(pro-angiogenic)일 수 있다.

DARC와 CXCL8 간의 상호작용에 의해, 5 nmol/ℓ의 해리 상수(K_d) 및 적혈구당 1000 내지 9000개로 추정되는 수용체 결합 부위가 입증된다(문헌[Hadley, Blood, 1997]). 다른 7-막횡단 케모카인 수용체와 달리, DARC에는 제2 세포질 루프에 위치한 고도로 보존된 G 단백질 커플링 모티프가 결여되어 있다(문헌[Meny, Immunohematology, 2010]). DARC는 G-단백질 결합되지 않으며, 알려져 있는 대안적인 신호전달 메커니즘을 갖지 않는다. DARC의 생물학적 역할은 완전히 이해되어 있지 않다. DARC는 a) 다중-특이적이고; b) 세포내 신호를 개시할 수 없는 것으로 여겨지며, c) 적혈구 표면에 결합된 케모카인은 그들의 정상 표적 염증 세포에 접근불가능한 것으로 여겨진다(문헌[Neote, J Biol Chem, 1993]). 적혈구는 DARC의 존재를 통해 염증 과정의 조절에서 역할을 수행할 수 있다.

염증 신호전달 분자, 예를 들어, 사이토카인은 고농도로 존재하는 경우 국소 및 전신 조직 손상을 촉발할 수 있다. 사이토카인의 버스트는 세균성 패혈증, 류마티스 관절염 및 몇몇의 다른 염증 질병의 발병에 연루된다. 외인적으로 천연 사이토카인 수용체 또는 합성 항체-유사 수용체 모방체를 발현하는 변형된 EHC는 염증성 사이토카인을 격리시킬 수 있다. 예시적인 케모카인 수용체는 DARC이다. DARC를 포함하나 이에 한정되지 않는 사이토카인 수용체 또는 케모카인 수용체인 항원을 포함하는 EHC가 본원에 제공된다. 예를 들어, DARC 항원을 발현하는 EHC(그에 의해, 고유 적혈구에 존재하는 양 증가)를 사용하여 순환 중 및/또는 신체의 말초 조직 내의 케모카인 수준을 조절할 수 있다. DARC 항원을 포함하는 EHC는 파괴를 위해 표지되거나, 천천히 염증 매개체를 순환 내로 다시 방출시킬 수 있지만, 낮고 분산된 농도로 이루어진다. 케모카인 또는 사이토카인 수용체를 포함하는 항원을 포함하는 EHC는 신호 전달 펩티드를 위한 저장소로 작용할 수 있다.

일 구현예에서, 항원은 항체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, EHC는 항체로부터 유래된 아미노산 서열을 인코딩하는 재조합 유전자를 발현한다. 항체 항원은 전장 단백질 또는 그의 단편으로서 발현될 수 있다. 항체는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 다른 구현예에서, 항체 단백질은 EHC 내로 또는 그 상으로 로딩된다. 일부 구현예에서, 로딩된 항체는 추가로 작용화되거나 다르게는 변형된다. 항체 항원은 세포내로 또는 세포외로 국소화될 수 있다. 일 구현예에서, 항원은 요망되는 표적에 특이적인 항체 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 scFv이다. 다른 구현예에서, 항체는 나노바디이다.

특정 구현예에서, EHC는 표적에 특이적이고, 세포 표면상에 위치한 항체 또는 그의 단편을 포함하는 항원을 포함한다. 예를 들어, 보툴리늄 독소 결합에 특이적인 항체의 가변 단편(Fv)은 EHC의 표면상에 발현된다. 보툴리늄 독소 결합 항체는 항체의 Fv 부분의 발현과 같이(문헌[Hoedemaeker, Journ of Bio Chemistry, 1997]), 해당 분야에 알려져 있다(문헌[Amersdorfer, Inf and Immunity, 1997]). 독소는 결합시에 Fv 영역을 통해 EHC에 의해 유지되고, 격리되고, 신체로부터의 제거를 위해 순환계를 통해 간으로 운반된다.

일 구현예에서, 항원은 scFv 항체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, EHC는 scFv 항체로부터 유래된 아미노산 서열을 인코딩하는 재조합 유전자를 발현한다. scFv 항체 항원은 전장 단백질 또는 그의 단편으로서 발현될 수 있다. scFv 항체는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 다른 구현예에서, scFv 단백질은 EHC 내로 또는 그 상으로 로딩된다. EHC에 의해 발현될 수 있는 적합한 scFv 항원 폴리펩티드는 표 6에 열거된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

scFv 항체는 주로 하이브리도마, 면역화 마우스 유래의 비장 세포 및 인간 유래의 B 림프구로부터 작제되어 왔다. 항체의 가변 영역은 V(H) 및 V(L) 도메인의 가변 도메인의 비공유 이종이량체에 의해 형성되며, 이는 이어서 재조합 scFv 항체의 작제에 사용될 수 있다.

scFv의 생성은 해당 분야에 알려져 있으며, mRNA를 먼저 하이브리도마로부터(또는 또한 비장, 림프 세포 및 골수로부터) 단리시키고, 이어서, 항체 유전자 증폭(PCR)을 위한 주형으로 제공하기 위하여 cDNA로 역전사시키는 것을 필요로 한다. 이러한 방법을 이용하여, 다양한 세트의 항체-유래 scFv(scFv가 모델링되는 원래의 항체의 것과 유사한 세트)를 갖는 큰 라이브러리가 생성될 수 있다.

scFv 항원은 표 4의 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 표적 분자에 특이적으로 만들 수 있다.

일 예에서, 탄저병 독소에 특이적인 scFv 항원은 EHC 상에서 발현될 수 있다. 그를 필요로 하는 대상체에게 투여시, 탄저병 독소에 특이적인 항원 분자를 포함하는 유효 용량의 EHC의 모집단을 사용하여 탄저병 독소를 포획하고 격리시킬 수 있다. EHC는 제거가 발생하는 간으로 이동한다.

특정 구현예에서, 적혈구는 세포의 표면상에 발현되는 카멜리드-유래 나노바디를 포함하는 항원을 포함한다. 나노바디는 보통 12 내지 15 kDa이다. 그들은 항체 및 scFv보다 상당히 더 작다. 이에 따라, 나노바디는 트랜스펙션시키기 더 용이할 수 있으며, 나노바디 항원은 더욱 용이하게 발현되고/거나, 번역되고/거나, EHC에서 세포 표면으로 수송될 것이다. 특정 구현예에서, 나노바디 항원을 사용하여 특정 항원에 의해 야기되는 면역원성 효과를 최소화시킨다. 나노바디는 그들의 작은 크기 때문에, 감소된 면역원성 능력을 제공할 것이다. 특정 구현예에서, 항원 나노바디가 EHC의 원형질막의 기계적 및 형태적 거동의 변화를 제한하기 때문에, 항원 나노바디가 사용된다. 이는 EHC가 정상의 순환 적혈구 거동을 나타내게 할 수 있다. 특정 구현예에서, 항원 나노바디가 표준 항체에 비하여 숨겨진 또는 드문 에피토프를 인식하는 능력이 증가되기 때문에, 항원 나노바디가 사용된다. 예를 들어, 그들은 표적의 작은 효소 공동(enzymatic cavity)에 결합하고, 표적의 분자 거동을 조절할 수 있다.

특정 구현예에서, EHC는 인간 보체계 내의 분자의 표적 에피토프에 대해 특이성을 갖는 항원 나노바디를 포함한다. 그러한 EHC는 보체계의 하나 이상의 과다-활성 인자를 선택적으로 고갈시키기 위하여 그를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, C5는 C5의 표적 에피토프에 대하여 특이성을 갖는 항원 나노바디를 포함하는 EHC에 의해 표적화되고, 대상체로의 세포의 투여시에 EHC에 의해 보체계로부터 제거될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 보체 장애, 예를 들어, 발작성야간혈색소뇨증에 대한 치료 효과를 제공하기에 적합하다. 특정 구현예에서, EHC는 표 4에 열거된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는 분자의 표적 에피토프에 대하여 특이성을 갖는 항원 나노바디를 포함한다.

일부 구현예에서, 항원은 프로테아제, 뉴클레아제, 아밀라제, 리아제(수크라제) 또는 하이드롤라제(DNase, 리파제) 중 하나로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 일 구현예에서, EHC는 프로테아제, 뉴클레아제, 아밀라제, 리아제(수크라제) 또는 하이드롤라제(DNase, 리파제) 중 하나로부터 유래된 아미노산 서열을 인코딩하는 재조합 유전자를 발현한다. 항원 프로테아제, 뉴클레아제, 아밀라제, 리아제 및 하이드롤라제는 전장 단백질 또는 그의 단편으로서 발현될 수 있다. 항원 프로테아제, 뉴클레아제, 아밀라제, 리아제 및 하이드롤라제는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 다른 구현예에서, 항원 프로테아제, 뉴클레아제, 아밀라제, 리아제 또는 하이드롤라제는 EHC 내로 또는 그 상으로 로딩된다. 일부 구현예에서, 로딩된 항원 프로테아제, 뉴클레아제, 아밀라제, 리아제 또는 하이드롤라제는 추가로 작용화되거나 다르게 변형된다. 항원 프로테아제, 뉴클레아제, 아밀라제, 리아제 또는 하이드롤라제 항원 분자는 세포내로 또는 세포외로 국소화될 수 있다.

특정 구현예에서, EHC는 프로테아제, 뉴클레아제, 아밀라제, 리아제 또는 하이드롤라제를 포함하는 항원을 포함한다. 프로테아제, 뉴클레아제, 아밀라제, 리아제 또는 하이드롤라제 항원을 포함하는 EHC는 예를 들어, 간 내의 대식구에 의해 순환 제거와 독립적으로 EHC 상의 표적을 분해할 수 있다. 특정 구현예에서, 프로테아제, 뉴클레아제, 아밀라제, 리아제 또는 하이드롤라제를 포함하는 항원을 포함하는 EHC를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하여, 암 세포 성장에 필수적인 대사산물을 선택적으로 분해함으로써 암을 치료할 수 있다. 예를 들어, 아스파라기나제를 사용하여 국소 아스파라긴 수준을 감소시켜, 급성 림프모구성 백혈병 및 급성 골수성 백혈병을 치료한다. 적합한 항원은 예를 들어, 표적 분자, 리아제 및 하이드롤라제를 분해시킬 수 있는 효소의 2가지 주요 부류 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 표 6에 열거된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는 분자를 포함하는 항원을 포함하는 EHC가 제공된다.

특정 구현예에서, 적혈구는 리아제를 포함하는 항원을 포함한다. 일 구현예에서, 리아아제는 발린 데카르복실라제이다. 발린 데카르복실라제 항원은 EHC의 세포내 공간 내에서 발현될 수 있다. 발린 데카르복실라제 항원을 포함하는 EHC를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하여, 혈액 내의 발린 수준을 조절할 수 있다. 발린 데카르복실라제 항원을 포함하는 EHC는 발린혈증, 혈중 아미노산 발린의 수준을 증가시키는 유전 질병을 치료하기에 적합하다. 이환된 개체에는 전형적으로 구토, 성장 장애, 지적 장애 및 피로가 발생된다. 발린혈증은 발린 트랜스아미나제 효소의 결핍에 의해 야기되며, 상염색체 열성 유전 패턴을 갖는다.

특정 구현예에서, 적혈구는 하이드롤라제를 포함하는 항원을 포함한다. 일 구현예에서, 하이드롤라제는 데옥시리보뉴클레아제 I(DNase I)이다. DNase I 항원은 EHC의 표면상에 발현될 수 있다. DNase I 항원을 포함하는 EHC를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하여, 우선적으로 피리미딘 뉴클레오티드에 인접한 포스포디에스테르 결합에서 순환 DNA를 절단시켜, 위치 3'에 유리 하이드록실기가 있는 5'-포스페이트-말단 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 평균적으로, 테트라-뉴클레오티드가 생성된다. DNase I 항원을 포함하는 EHC는 순환 중 높은 면역원성 DNA의 수준에 의해 악화되는 질환, 예를 들어, 전신 홍반 루푸스(SLE)를 치료하는데 적합하다.

특정 구현예에서, 항원은 예를 들어, 리간드로의 결합 또는 자극제와 접촉시에 외부 자극제에 반응할 수 있으며, 반응은 예를 들어, 이동, 재-폴딩, 입체구조 변화, 이량체 형성, 동종이량체 형성, 이종이량체 형성, 다량체 형성, 신호 변환, 검출가능한 형태의 에너지의 방출(예를 들어, 형광), 다른 항원과의 기능적 상호작용, 또는 비-외인성 항원 폴리펩티드와의 기능적 상호작용을 수반한다.

표적

표적과 상호작용할 수 있는 외인성 항원 폴리펩티드를 포함하는 외인성 항원-발현 EHC가 본원에 제공된다. 추가로, 표적과 상호작용할 수 있는 비-폴리펩티드 외인성 항원을 포함하는 외인성 항원-발현 EHC가 본원에 제공된다. 외인성 항원-발현 EHC를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하여, 대상체의 순환계에 존재하는 표적의 양 또는 농도를 조절할 수 있다. 특정 표적과 상호작용하는 적합한 외인성 항원을 선택할 수 있다. 적합한 표적은 특정 질병, 장애 또는 질환과 관련된 엔티티를 포함한다. 그러나, 표적은 또한 특정 질병, 장애 또는 질환과 독립적으로 선택될 수 있다.

일부 구현예에서, 표적은 항체 또는 항체-유사 분자, 예를 들어, 베타-2 당단백질 1에 대한 항체, I/i 항원에 대한 항체, 콜라겐 a3(IV)의 NC1 도메인에 대한 항체, 혈소판 당단백질에 대한 항체, 포스포리파제 A2 수용체에 대한 항체, 적혈구 글리코포린 A, B 또는 C에 대한 항체 또는 적혈구 Rh 항원에 대한 항체를 포함하나 이들에 한정되지 않는 자가면역 또는 자가-항체 또는 외래 항체 또는 치료적 항체이다.

일부 구현예에서, 표적은 보체 캐스케이드의 분자, 예를 들어, C1, C1r, C1s, C1q, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4b, C4a, C3bBb, C3bBb3b, C4b2b, C4b2b3b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, 폴리-C9, 막 공격 복합체.인자 B, 인자 D, 프로페르딘(Properdin), C3, C3a, C3b, iC3b, C3c, C3dg, C3dk, C3e, Bb, 인자 I, C1q, C1r, C1s, C4, C4a, C4b, C2, C4bp, 만노스-결합 렉틴(MBL), MBL-관련 세린 프로테아제 1(MASP1), MBL-관련 세린 프로테아제 2(MASP2), C5, C5a, C6, C7, C8, C9, CR1, CR2, CR3, CR4, C3aR, C3eR, 붕괴-촉진 인자(DAF), 막 보조인자 단백질(MCP), CD59, C3 메타 쇄 수용체, C1 억제제, C4 결합 단백질, 인자 I, 인자 H이다.

일부 구현예에서, 표적은 면역 복합체, 예를 들어, IgG 면역 복합체, IgA 면역 복합체, IgM 면역 복합체이다.

일부 구현예에서, 표적은 아밀로이드 플라크, 예를 들어, 베타 아밀로이드, IAPP(아밀린), 알파-시누클레인, PrPSc, 헌팅틴, 칼시토닌, 심방 나트륨배설 인자, 아포지질단백질 AI, 혈청 아밀로이드 A, 메딘(medin), 프로락틴, 트랜스티레틴, 라이소자임, 베타 2 마이크로글로불린, 겔솔린, 케라토에피텔린, 시스타틴, 면역글로불린 경쇄 AL, S-IBM으로 구성된 플라크이다.

일부 구현예에서, 표적은 박테리아, 예를 들어, 엔테로코커스(Enterococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 또는 마이코박테리아(Mycobacteria), 리케치아(Rickettsia), 마이코플라스마(Mycoplasma), 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitides), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrheoeae), 레지오넬라(Legionella), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 스트렙토콕시(Streptococci), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 코리노박테리아 디프테리아(Corynobacteria diphtheriae), 클로스트리듐(Clostridium) 종, 장독성 에스케리키아 콜라이(Eschericia coli) 및 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)이다. 균혈증이 어느 수준으로 보고된 다른 병원체는 다음을 포함한다: 리케치아, 바르토넬라 헨셀라에(Bartonella henselae), 바르토넬라 퀸타나(Bartonella quintana), 콕시엘라 버르네티이(Coxiella burnetii), 클라미디아(chlamydia), 마이코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 살모넬라(Salmonella); 쉬겔라(shigella); 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica); 예르시니아 슈도투베르큘로시스(Yersinia pseudotuberculosis); 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila); 마이코박테리움 투베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis); 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes); 마이코플라스마(Mycoplasma) 종; 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens); 비브리오 콜레라; 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae); 바실러스 안트라시스; 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum); 레프토스피라(Leptospira); 보렐리아(Borrelia); 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae); 프란시셀라(Francisella); 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis); 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni); 엔테로박터(Enterobacter); 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis); 프로테우스(Proteus); 및 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae).

일부 구현예에서, 표적은 감염이 세포 표면 수용체로의 결합시에 숙주 세포 내로의 유전 물질의 주입을 수반하는 바이러스, 감염이 세포 표면 수용체에 의해 매개되는 바이러스를 포함하나 이들에 한정되지 않는 바이러스이다. 이들 바이러스의 비제한적인 예는 파라믹소비리대(Paramyxoviridae)(예를 들어, 뉴모바이러스(pneumovirus), 모르빌리바이러스(morbillivirus), 메타뉴모바이러스(metapneumovirus), 레스피로바이러스(respirovirus) 또는 루불라바이러스(rubulavirus)), 아데노비리대(Adenoviridae)(예를 들어, 아데노바이러스(adenovirus)), 아레나비리대(Arenaviridae)(예를 들어, 아레나바이러스(arenavirus), 예를 들어, 림프구성 맥락 뇌막염 바이러스), 아르테리비리대(Arteriviridae)(예를 들어, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 또는 말 동맥염 바이러스), 부니아비리대(Bunyaviridae)(예를 들어, 플레보바이러스(phlebovirus) 또는 한타바이러스(hantavirus)), 칼리시비리대(Caliciviridae)(예를 들어, 노르워크(Norwalk) 바이러스), 코로나비리대(Coronaviridae)(예를 들어, 코로나바이러스(coronavirus) 또는 토로바이러스(torovirus)), 필로비리대(Filoviridae)(예를 들어, 에볼라(Ebola)-유사 바이러스), 플라비비리대(Flaviviridae)(예를 들어, 헤파시바이러스(hepacivirus) 또는 플라비바이러스(flavivirus)), 헤르페스비리대(Herpesviridae)(예를 들어, 심플렉스바이러스(simplexvirus), 바리셀로바이러스(varicellovirus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 로세올로바이러스(roseolovirus) 또는 림포크립토바이러스(lymphocryptovirus)), 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae)(예를 들어, 인플루엔자(influenza) 바이러스 또는 토고토바이러스(thogotovirus)), 파르보비리대(Parvoviridae)(예를 들어, 파르보바이러스(parvovirus)), 피코마비리대(Picomaviridae)(예를 들어, 엔테로바이러스(enterovirus) 또는 헤파토바이러스(hepatovirus)), 폭스비리대(Poxviridae)(예를 들어, 오르토폭스바이러스(orthopoxvirus), 아비폭스바이러스(avipoxvirus) 또는 레포리폭스바이러스(leporipoxvirus)), 레트로비리대(Retroviridae)(예를 들어, 렌티바이러스(lentivirus) 또는 스푸마바이러스(spumavirus)), 레오비리대(Reoviridae)(예를 들어, 로타바이러스(rotavirus)), 랍도비리대(Rhabdoviridae)(예를 들어, 리사바이러스(lyssavirus), 노비랍도바이러스(novirhabdovirus) 또는 베시쿨로바이러스(vesiculovirus)) 및 토가비리대(Togaviridae)(예를 들어, 알파바이러스(alphavirus) 또는 루비바이러스(rubivirus))로부터 선택될 수 있다. 이들 바이러스의 구체적인 예는 인간 호흡기 코로나바이러스, 인플루엔자 바이러스 A 내지 C, A 내지 G형 간염 바이러스 및 단순포진 바이러스 1 내지 9를 포함한다.

일부 구현예에서, 표적은 예를 들어, 장 또는 혈액-감염 기생생물, 원생동물, 파동편모충; 말라리아를 야기할 수 있는 해모프로토조아(haemoprotozoa) 및 기생생물; 태니아 촌충류를 포함하는 장 및 전신 촌충류; 장 콕시디아; 장 편모 원충류; 사상 선충류; 위장 및 전신 선충류 및 구충류를 포함하나 이들에 한정되지 않는 기생생물이다.

일부 구현예에서, 표적은 예를 들어, 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 아스페르길루스(Aspergillus), 티. 글라브라타(T. glabrata), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 씨. 크루세이(C. krusei) 및 씨. 파랍실로시스(C. parapsilosis)를 포함하나 이들에 한정되지 않는 진균류이다.

일부 구현예에서, 표적은 예를 들어, AB 독소, 알파 톡소, 탄저병 독소, 박테리오신(bacteriocin), 보툴리늄 독소, 콜레스테롤-의존성 세포용해소(cytolysin), 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum) C3 독소, 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile) 독소 A, 클로스트리듐 디피실레 독소 B, 클로스트리듐 장독소, 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 알파 독소, 클로스트리듐 퍼프린젠스 베타 독소, 코드 인자(Cord factor), Cry1Ac, 크립토파이신(Cryptophycin), 델타 내독소(Delta endotoxin), 디프테리아 독소, 장독소 B형, 발적 독소, 엑스폴리아틴(exfoliatin), 해모라이신(haemolysin) E, 이열성 장독소, 열-안정성 장독소, 용혈소(hemolysin), 류코시딘(leukocidin), 지질다당류, 리스테리오라이신(Listeriolysin) O, 마이크로신(microcin), 판톤-발렌타인 류코시딘(Panton-Valentine leucocidin), 병원성 유전자균(pathogenicity island), 페놀-용해성 모듈린(modulin), 뉴모라이신(pneumolysin), 포어-형성 독소, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소, RTX 독소, 사카신(sakacin), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 알파 독소, 스타필로코커스 아우레우스 베타 독소, 스타필로코커스 아우레우스 델타 독소, 스트렙토라이신(Streptolysin), 심플로카미드(Symplocamide) A, 탭독소(tabtoxin), 테타노라이신(tetanolysin), 테타노스파스민(tetanospasmin), 티올-활성화 세포용해소, 톨라신(tolaasin), 독성 충격 증후군 독소, 톡소플라빈, 트레할로스 디마이콜레이트, 베로사이토톡신(verocytotoxin) 및 비브리오신(vibriocin)을 포함하나 이들에 한정되지 않는 박테리아 독소이다.

일부 구현예에서, 표적은 예를 들어, PRP, PRPc, PRPsc, PRPres를 포함하나 이들에 한정되지 않는 프리온 단백질이다.

일부 구현예에서, 표적은 예를 들어, 아실화 자극 단백질, 아디포카인(adipokine), 알빈터페론(albinterferon), CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, 콜로니-자극 인자, CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL9, 에리트로포이에틴(erythropoietin), Gc-MAF, 과립구 콜로니-자극 인자, 과립구 대식구 콜로니-자극 인자, 간세포 성장 인자, IL 10 과, IL 17 과, IL1A, IL1B, 인터페론, 인터페론 베타 1a, 인터페론 베타 1b, 인터페론 감마, 인터페론 I형, 인터페론 II형, 인터페론 III형, 인터류킨, 인터류킨 1 과, 인터류킨 1 수용체 길항제, 인터류킨 10, 인터류킨 12, 인터류킨 12 서브유닛 베타, 인터류킨 13, 인터류킨 16, 인터류킨 2, 인터류킨 23, 인터류킨 23 서브유닛 알파, 인터류킨 34, 인터류킨 35, 인터류킨 6, 인터류킨 7, 인터류킨 8, 인터류킨-36, 백혈병 억제 인자, 백혈구-촉진 인자, 림포카인, 림프독소, 림프독소 알파, 림프독소 베타, 대식구 콜로니-자극 인자, 대식구 염증성 단백질, 대식구-활성화 인자, 모노카인(monokine), 마이오카인(myokine), 마이오넥틴(myonectin), 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제, 온코스타틴(oncostatin) M, 오프렐베킨(oprelvekin), 혈소판 인자 4, 전염증성 사이토카인, 프로메가포이에틴(promegapoietin), RANKL, 기질 세포-유래 인자 1, 탈리모겐 라허파렙벡(talimogene laherparepvec), 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자, XCL1, XCL2, XCR1, 안지오포이에틴(angiopoietin), 염기성 섬유모세포 성장 인자, 베타셀룰린(betacellulin), 골형성 단백질, 뇌-유래 신경영양 인자, CCN 세포내 신호전달 단백질, CTGF, 다베포에틴 알파(darbepoetin alfa), 엔도글린(endoglin), 상피 성장 인자, 에포에틴(epoetin) 알파, 에포에틴 베타, 에리트로포이에틴, FGF15, FGF15/19, 섬유아세포 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자 23, 필그라스팀(filgrastim), GLIA 성숙 인자, 과립구 콜로니-자극 인자, 과립구 대식구 콜로니-자극 인자, 성장 분화 인자-9, 헤베르프로트(heberprot)-P, 조혈 성장 인자, 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자, 간세포 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 1, 인슐린-유사 성장 인자 2, 각질세포 성장 인자, 마이오스타틴(myostatin), 신경 성장 인자, 뉴로트로핀(neurotrophin)-3, 뉴로트로핀-4, 온코모듈린(oncomodulin), 골형성촉진제(osteopromotive), 팔리페르민(palifermin), PDGFB, 태반 성장 인자, 혈소판 알파-과립, 혈소판-유래 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자 수용체, 증식 지수, 트롬보포이에틴(thrombopoietin), 형질전환 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자를 포함하나 이들에 한정되지 않는 사이토카인 또는 케모카인 또는 성장 인자이다.

일부 구현예에서, 표적은 예를 들어, 철, 구리, 칼슘, 칼륨, 에탄올, 메탄올, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 시스테인, 셀레노시스테인, 트레오닌, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 히스티딘, 라이신, 아르기닌, 아스파르트산염, 글루탐산염, 아스파라긴, 글루타민을 포함하나 이들에 한정되지 않는 2000 Da 미만, 1000 Da 미만, 500 Da 미만의 소분자, 예를 들어, 화학물질, 아미노산, 원자, 원소, 유기산이다.

일부 구현예에서, 표적은 예를 들어, LDL, VLDL, HDL, HDL2B, 트리글리세리드, LP(a), 콜레스테롤을 포함하나 이들에 한정되지 않는 지질, 지질 복합체, 단백지질 복합체 또는 콜레스테롤이다.

일부 구현예에서, 표적은 예를 들어, 인간 세포, 순환 세포, 면역 세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 림프구, 단핵구, B 세포, T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 감마-델타 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 세포, 자연 살해 T 세포, 대식구, 쿠퍼(Kupffer) 세포, 수지상 세포, 암 세포, 암 줄기 세포, 순환 종양 세포, 다음을 포함하나 이들에 한정되지 않는 하기의 암 중 하나로부터의 암 세포를 포함하나 이들에 한정되지 않는 포유류 세포이다:

급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 항문암, 담도암, 방광암, 골암, 장의 암(bowel cancer), 뇌종양, 유방암, 원발이 알려져 있지 않은 암, 뼈로 전이된 암, 뇌로 전이된 암, 간으로 전이된 암, 폐로 전이된 암, 카르시노이드, 자궁경부암, 융모막암종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 안구암, 담낭암, 위암, 임신융모막 종양(GTT), 모발상 세포 백혈병, 두경부암, 호지킨 림프종, 신장암, 후두암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종 흑색종 피부암, 중피종, 남성의 암, 포상 기태(molar pregnancy), 구강 및 구인두 암, 골수종, 비강암, 비인두암, 비호지킨 림프종(NHL), 식도암, 난소암, 췌장암, 음경암, 전립선암, 희귀암, 직장암, 타액선암, 이차 암, 피부암(비 흑색종), 연조직 육종, 위암, 고환암, 갑상선암, 알려져 있지 않은 원발성 암, 자궁암, 질암 및 외음부암.

항원 발현, 컨쥬게이션, 로딩

특정 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 외인성 항원-발현 EHC 내에서 발현된다. 폴리펩티드 항원은 외인성 항원-발현 EHC의 표면상에 나타나거나 외인성 항원-발현 EHC 내에 존재할 수 있다.

특정 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 외인성 항원-발현 EHC에 컨쥬게이트된다. 폴리펩티드 항원은 보통 외인성 항원-발현 EHC의 표면에 컨쥬게이트된다. 컨쥬게이션은 해당 분야에 알려져 있고, 본원에 기재된 방법에 의해 화학적으로 또는 효소에 의해 달성될 수 있다. 비-폴리펩티드 항원은 또한 외인성 항원-발현 EHC에 컨쥬게이트될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 외인성 항원-발현 EHC에 컨쥬게이트되지 않는다.

특정 구현예에서, 폴리펩티드 항원은 외인성 항원-발현 EHC 내로 로딩된다. 비-폴리펩티드 항원은 또한 외인성 항원-발현 EHC 내에 로딩될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원은 외인성 항원-발현 EHC 내로 또는 그 상으로 로딩되지 않는다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 임의로 재조합 핵산으로부터 발현되는 항원, EHC에 컨쥬게이트되는 항원, EHC 내로 또는 그 상으로 로딩되는 항원 및 그들의 임의의 조합인 항원을 포함한다. 임의로, 외인성 항원-발현 EHC는 치료제 또는 다른 페이로드(payload)를 포함한다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 적합한 단리된 세포, 예를 들어, EHC, 망상적혈구, EHC 전구체, 혈소판 또는 혈소판 전구체를 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산과 접촉시킴으로써 생성된다. 일부 구현예에서, 항원 폴리펩티드는 유핵 적혈구계 전구 세포 또는 유핵 혈소판 전구 세포와 접촉되는 DNA에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 항원 폴리펩티드는 혈소판, 유핵 EHC, 유핵 혈소판 전구 세포 또는 망상적혈구와 접촉되는 RNA에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 항원은 일차 혈소판, 유핵 EHC, 유핵 혈소판 전구 세포, 망상적혈구 또는 적혈구와 접촉되는 폴리펩티드이다.

항원 폴리펩티드는 전기천공법, 화학물질 또는 폴리머 트랜스펙션, 바이러스 형질도입, 기계적 막 파괴 또는 기타 방법에 의해 EHC 내로 도입되는 전이유전자로부터 발현될 수 있고/거나; 전기천공법, 화학물질 또는 폴리머 트랜스펙션, 바이러스 형질도입, 기계적 막 파괴 또는 기타 방법에 의해 세포 내로 도입되는 mRNA로부터 발현되는 항원 폴리펩티드; 외부 인자, 예를 들어, 전사 활성화제, 전사 억제제 또는 분비 경로 증진제의 도입에 의해 고유 유전자좌로부터 과발현되는 항원 폴리펩티드; 및/또는 생성 세포 또는 다른 외부 시스템으로부터 합성되거나 추출되거나 생성되고 EHC 내로 혼입되는 항원 폴리펩티드일 수 있다.

일부 구현예에서, 항원은 전장 단백질이다. 일부 구현예에서, 항원은 대략 7개 아미노산 초과의 임의의 길이의 전장 단백질 내에 함유된 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진다. 예를 들어, 폴리펩티드는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 20개 초과의 아미노산, 예를 들어, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 100개 초과의 아미노산일 수 있다. 항원을 포함하는 폴리펩티드는 입체형태 에피토프이거나 선형 에피토프일 수 있는 하나 이상의 면역학적 에피토프를 포함할 수 있다. 항원은 하나 이상의 상이한 단백질로부터의 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어질 수 있다.

관심 항원은 표 B 및 표 C에 열거된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는 내인성 세포 단백질로의 융합에 의해 순환 세포에서 발현될 수 있다. 천연 분화 및 제핵 과정 동안, EHC가 적혈구생성에 필요하지만 성숙 적혈구 기능에 필요하지 않은 다수의 내인성 단백질, 예를 들어, c-Kit(SCF 수용체) 및 트랜스페린을 방출시키고, 폐기하는 것으로 여겨지기 때문에 내인성 단백질로의 융합은 필수적일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Keerthivasan et al., Stem Cells International 2011]; 문헌[Migliaccio, Haematologica 2010]을 참조한다. 유지되는 단백질은 특정 막 단백질, 예를 들어, 글리코포린 A, 밴드 3 및 아쿠아포린; 특정 세포질 단백질, 예를 들어, 헤모글로빈 알파, 헤모글로빈 베타 및 아데노신 데아미나제; 및 세포골격 단백질을 포함한다.

관심 항원은 전이유전자의 직접적인 발현, 내인성 세포내 단백질, 예를 들어, 헤모글로빈으로의 융합, 내인성 세포 표면 단백질, 예를 들어, 밴드 3, 글리코포린 A, Kell의 세포내 도메인으로의 융합 또는 적혈구계 세포골격의 구조 성분으로의 융합을 포함하는 다수의 방법에 의해 EHC의 세포내 공간에서 발현될 수 있다.

관심 항원은 그것이 막횡단 도메인 또는 다른 막 부착 도메인을 함유한다면 전이유전자의 직접적인 발현, 내인성 적혈구계 막 단백질로의 또는 상기 단백질, 예를 들어, 밴드 3, 글리코포린 A 또는 Kell의 막횡단 도메인으로의 융합; 또는 내인성 적혈구계 GPI-결합 세포 표면 단백질, 예를 들어, 아세틸콜린에스테라제, CD55, CD58 또는 CD59의 GPI-링커 수용 펩티드로의 융합을 포함하는 다수의 방법에 의해 EHC의 세포외 공간상에 발현될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kooyman et al., Science 1995] 참조).

관심 항원은 표 D, 표 D1 및 표 E에 열거된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는 다양한 화학적 및 효소적 수단에 의해 배양된 EHC의 표면에 컨쥬게이트될 수 있다. 이들 방법은 일차 아민기를 환원된 티올기와 연결하기 위한 이작용성 가교제, 예를 들어, NHS 에스테르-말레이미드 헤테로 이작용성 가교제와의 화학적 컨쥬게이션을 포함한다. 또한, 이들 방법은 효소 전략, 예를 들어, 수용 서열 LPXTG 또는 LPXTA를 함유하는 하나의 폴리펩티드를 N-말단 공여 서열 GGG를 함유하는 폴리펩티드와 연결하기 위한 소타아제(sortase) 효소에 의해 매개되는 트랜스펩티다제 반응을 포함하며, 예를 들어, 문헌[Swee et al., PNAS 2013]을 참조한다. 또한, 상기 방법은 조합 방법, 예를 들어, 각각 항원 및 세포상의 클릭 화학 핸들(Click Chemistry handles)(아지드 및 알킨)의 소타아제-매개의 컨쥬게이션에 이어서, 항원을 세포로 화학적으로 결합하기 위한 고리 첨가 반응을 포함하며, 예를 들어, 문헌[Neves et al., Bioconjugate Chemistry, 2013]을 참조한다.

필요에 따라, 촉매적 결합-형성 폴리펩티드 도메인은 세포내로 또는 세포외로 EHC 상에서 또는 그 내에서 발현될 수 있다. Spy0128, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 단리된 단백질로부터 유래된 것들을 포함하는 트랜스펩티다제, 소타아제 및 이소펩티다제를 포함하는 많은 촉매적 결합-형성 폴리펩티드가 존재한다.

Spy0128의 자가촉매 이소펩티드 결합-형성 서브유닛(CnaB2 도메인)의 분할이 서로에 대한 특이성과 함께 촉매 활성을 보유하는 2개의 개별 폴리펩티드를 초래하는 것이 입증되었다. 이러한 시스템에서 폴리펩티드는 SpyTag 및 SpyCatcher로 명명된다. SpyTag 및 SpyCatcher는 혼합시에 SpyTag 상의 Asp117과 SpyCatcher 상의 Lys31 사이에 이소펩티드 결합 형성을 겪는다(문헌[Zakeri and Howarth, JACS 2010, 132:4526]). 반응은 세포 환경과 양립가능하며, 단백질/펩티드 컨쥬게이션에 고도로 특이적이다(문헌[Zakeri, B.]; 문헌[Fierer, J. O.]; 문헌[Celik, E.]; 문헌[Chittock, E. C.]; 문헌[Schwarz-Linek, U.]; 문헌[Moy, V. T.]; 문헌[Howarth, M. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2012, 109, E690-E697]). SpyTag 및 SpyCatcher는 엘라스틴-유사 단백질에서 번역후 토폴로지(topology) 변형을 지시하는 것으로 나타났다. 예를 들어, N-말단에 SpyTag 및 C-말단에 SpyCatcher의 배치는 환형 엘라스틴-유사 단백질의 형성을 지시한다(문헌[Zhang et al, Journal of the American Chemical Society, 2013]).

성분 SpyTag 및 SpyCatcher는 분자 A가 SpyTag에 융합되고, 분자 B가 SpyCatcher에 융합되는 시스템이 분자 A가 SpyCatcher에 융합되고, 분자 B가 SpyTag에 융합되는 시스템과 기능적으로 등가이도록 상호교환될 수 있다. 본 명세서의 목적을 위하여, SpyTag 및 SpyCatcher가 사용되는 경우, 상보적 분자가 그의 위치에서 치환될 수 있음이 이해되어야 한다.

촉매 결합-형성 폴리펩티드, 예를 들어, SpyTag/SpyCatcher 시스템을 사용하여 관심 외인성 항원을 EHC의 표면에 부착시킬 수 있다. SpyTag 폴리펩티드 서열은 EHC의 세포외 표면상에 발현될 수 있다. SpyTag 폴리펩티드는 예를 들어, 1형 또는 3형 막횡단 단백질, 예를 들어, 글리코포린 A의 N 말단에 융합되거나, 2형 막횡단 단백질, 예를 들어, Kell의 C 말단에 융합되거나, 다중-통과 막횡단 단백질, 예를 들어, 밴드 3의 세포외 루프 내에 또는 세포외 말단에 프레임 내에 삽입되거나, GPI-수용 폴리펩티드, 예를 들어, CD55 또는 CD59에 융합되거나, 지질-쇄-고정 폴리펩티드에 융합되거나, 표재성 막 단백질에 융합될 수 있다. SpyTag 융합체를 인코딩하는 핵산 서열은 EHC 내에서 발현될 수 있다. 관심 외인성 항원은 SpyCatcher에 융합될 수 있다. SpyCatcher 융합체를 인코딩하는 핵산 서열은 SpyTag 융합체를 발현하는 동일한 EHC로부터 발현되고 분비될 수 있다. 대안적으로, SpyCatcher 융합체를 인코딩하는 핵산 서열은 예를 들어, 박테리아, 진균, 곤충, 포유류 또는 무세포 생성 시스템에서 외인적으로 생성될 수 있다. SpyTag 및 SpyCatcher 폴리펩티드의 반응시에, 관심 외인성 항원을 EHC의 표면에 부착시키는 공유 결합이 형성될 것이다.

일 구현예에서, SpyTag 폴리펩티드는 EHC에서 Gata1 프로모터의 제어하에 글리코포린 A의 N 말단으로의 융합체로서 발현될 수 있다. SpyCatcher 폴리펩티드 서열에 융합된 관심 외인성 항원, 예를 들어, 표 F, 표 G, 표 H, 표 I 및 표 J에 열거된 외인성 항원은 동일한 EHC에서 Gata1 프로모터의 제어하에 발현될 수 있다. 두 융합 폴리펩티드 모두의 발현시에, SpyTag와 SpyCatcher 폴리펩티드 간에 이소펩티드 결합이 형성되어, EHC 표면과 관심 외인성 항원 간에 공유 결합을 형성할 것이다.

다른 구현예에서, SpyTag 폴리펩티드는 EHC에서 Gata1 프로모터의 제어하에 글리코포린 A의 N 말단으로의 융합체로서 발현될 수 있다. SpyCatcher 폴리펩티드 서열에 융합된 관심 외인성 항원, 예를 들어, 표 F, 표 G, 표 H, 표 I 및 표 J에 열거된 외인성 항원은 적합한 포유류 세포 발현 시스템, 예를 들어, HEK293 세포에서 발현될 수 있다. EHC 상의 SpyTag 융합 폴리펩티드의 발현시에, SpyCatcher 융합 폴리펩티드는 세포와 접촉될 수 있다. 이소펩티드 결합은 적합한 반응 조건하에서, SpyTag와 SpyCatcher 폴리펩티드 사이에 형성되어, EHC 표면과 관심 외인성 항원 사이에 공유 결합을 형성할 것이다.

촉매 결합-형성 폴리펩티드, 예를 들어, SpyTag/SpyCatcher 시스템을 사용하여 관심 외인성 항원을 EHC의 세포내 공간에 고정시킬 수 있다. SpyTag 폴리펩티드 서열은 전이유전자의 직접적인 발현, 내인성 세포내 단백질, 예를 들어, 헤모글로빈으로의 융합, 내인성 세포 표면 단백질, 예를 들어, 밴드 3, 글리코포린 A, Kell의 세포내 도메인으로의 융합 또는 적혈구계 세포골격의 구조 성분으로의 융합을 포함하는 다수의 방법에 의해 EHC의 세포내 공간에서 발현될 수 있다. SpyTag 서열은 폴리펩티드 말단에 제한되지 않으며, 폴리펩티드 번역 및 국소화가 동요되지 않도록 내인성 폴리펩티드의 내부 서열 내에 통합될 수 있다. 관심 외인성 항원은 SpyCatcher에 융합될 수 있다. SpyCatcher 융합체를 인코딩하는 핵산 서열은 SpyTag 융합체를 발현하는 동일한 EHC 내에서 발현될 수 있다. SpyTag 및 SpyCatcher 폴리펩티드의 반응시에, 관심 항원을 EHC의 세포내 공간에 고정시키도록 작용하는 공유 결합이 형성될 것이다.

일 구현예에서, EHC는 헤모글로빈 베타에 융합된 SpyTag를 세포내로 발현할 수 있다. EHC는 헤모글로빈 프로모터, 베타 글로빈 유전자 및 SpyTag 서열을 포함하는 유전자 서열을 사용하여, 번역시에, 세포내 베타 글로빈이 C 말단에서 SpyTag에 융합되도록 유전자 변형될 수 있다. 또한, EHC는 번역시에, 세포내 PAH가 그의 N 말단에서 SpyCatcher에 융합되도록 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 발현을 유도하는 SpyCatcher를 코딩하는 Gata1 프로모터-유도 유전자를 발현한다. 둘 모두의 융합 단백질의 발현시에, SpyTag 결합 베타 글로빈은 이소펩티드 결합을 통해 세포내 공간에서 SpyCatcher 결합된 PAH로 연결되어, PAH가 베타 글로빈에 고정되고 성숙 동안 유지되게 한다.

다른 구현예에서, SpyTag 폴리펩티드는 EHC 내에서 관심 외인성 항원으로의 융합체로서 발현될 수 있다. SpyCatcher 폴리펩티드는 동일한 EHC 내에서 글리코포린 A의 C 말단(세포내)으로의 융합체로서 발현될 수 있다. 둘 모두의 융합 폴리펩티드의 발현시에, SpyTag와 SpyCatcher 폴리펩티드 간에 이소펩티드 결합이 형성되어, 막-고정 내인성 적혈구계 폴리펩티드와 관심 외인성 항원 간에 공유 결합을 형성할 것이다.

다른 예에서, 관심 외인성 항원은 외인성 항원이 EHC 막 내로 도입된 포어를 통해 확산되는 삼투 로딩 또는 저장성-고장성 사이클링(예를 들어, 문헌[Cremel and Godfrin, Int J Pharm 2013] 참조) 및 세포 투과 펩티드, 예를 들어, 박테리아 독소로부터 유래된 것으로의 융합을 포함하는 다수의 방법에 의해 배양된 EHC 내로 (발현되는 것과 대조적으로) 물리적으로 로딩될 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Kwon et al., J Contr Rel 2009]을 참조한다.

관심 외인성 항원은 전기천공법, 화학물질 또는 폴리머 트랜스펙션, 바이러스 형질도입, 기계적 막 파괴 또는 기타 방법에 의해 EHC 내로 도입되는 전이유전자로부터 발현될 수 있고/거나; 전기천공법, 화학물질 또는 폴리머 트랜스펙션, 바이러스 형질도입, 기계적 막 파괴 또는 기타 방법에 의해 세포 내로 도입되는 mRNA로부터 발현되는 외인성 항원; 외부 인자, 예를 들어, 전사 활성화제, 전사 억제제 또는 분비 경로 증진제의 도입에 의해 고유 유전자좌로부터 과발현되는 외인성 항원 폴리펩티드; 생성 세포 또는 다른 외부 시스템으로부터 합성되거나, 추출되거나, 생성되고, EHC 내로 혼입되는 외인성 항원일 수 있다.

본 발명의 EHC에는 물질이 세포의 내부(예를 들어, 세포질)로 전달될 수 있도록, 새포막 내에 동요를 야기하도록 조절된 손상을 소정의 시간 동안 세포에 적용함으로써, 임의로 물질(페이로드), 예를 들어, 펩티드, 단백질, DNA, RNA, siRNA 및 기타 거대분자가 로딩될 수 있다.

바람직한 구현예에서, EHC는 망상적혈구이다. 예를 들어, 망상적혈구에는 조절된 세포 손상에 의해 외인성 항원을 인코딩하는 mRNA가 로딩될 수 있다. mRNA는 요망되는 대로 네이키드이거나 변형될 수 있다. mRNA 안정성을 개선시키고/거나 면역원성을 감소시키는 mRNA 변형은 예를 들어, ARCA: 안티-리버스(anti-reverse) 캡 유사체(m₂ ^7.3'-OGP₃G), GP₃G(비메틸화 캡 유사체), m⁷GP₃G(모노메틸화 캡 유사체), m₃ ^2.2.7GP₃G(트리메틸화 캡 유사체), m5CTP(5'-메틸-시티딘 트리포스페이트), m6ATP(N6-메틸-아데노신-5'-트리포스페이트), s2UTP(2-티오-우리딘 트리포스페이트) 및 ψ(슈도우리딘 트리포스페이트)를 포함한다.

다른 바람직한 구현예에서, EHC는 적혈구이다. 예를 들어, 적혈구는 조절 세포 손상에 의해 외인성 항원이 로딩될 수 있다. 세포 손상은 예를 들어, 기계적 변형 또는 전단력에 의해 유도되는 압력, 변형, 압축, 신속한 연신, 신속한 압축 또는 높은 전단 속도의 펄스로의 세포의 처리에 의해 야기될 수 있다. 조절된 세포 손상은 주변 세포 배지로부터 세포의 세포질 내로의 물질(페이로드)의 흡수를 야기한다.

조절된 세포 변형(예를 들어, 세포가 압축을 통과함에 따른 세포의 기계적 변형)에 기초한 조절된 세포 손상을 사용하여, 엔도시토시스(endocytosis)보다는 확산에 의한 물질(페이로드)의 흡수가 야기된다. 물질(페이로드)은 조절된 손상 시에 세포 흡수 후에 엔도좀보다는 세포질에 존재하여, 물질을 세포에 용이하게 이용가능하게 만든다. 예를 들어, 조절된 변형에 의한 조절된 세포 손상은 세포 생존력을 보존시킨다(예를 들어, 50%, 70% 초과 또는 90% 초과). 특정 구현예에서, 예를 들어, 조절된 변형에 의한 조절된 세포 손상은 세포 분화의 상태 및 활성을 보존시킨다. 요망되는 경우, 병용 치료, 예를 들어, 변형에 의한 조절된 손상 이후의 또는 그 이전의, 예를 들어, 전기천공법 또는 다른 세포막 투과성 증가 방법이 사용된다. 임의로, 계면활성제가 사용될 수 있다.

기계적 변형 방법은 특히, 다른 막 투과성 증가 방법을 잘 용인하지 않는, 예를 들어, 그러한 방법을 수행한 후에 감소된 생존력 또는 상이한 분화 상태를 보이는 세포에 적합하다. 기계적 변형 방법은 또한, 다른 막 투과성 증가 방법을 용인하지 않는 물질(페이로드)에도 적합하다. 대안적으로 또는 추가적으로, 페이로드는 예를 들어, 전하, 소수성 또는 페이로드의 크기 때문에 대안적인 방법을 사용하여 세포 내로 충분히 도입되지 않을 수 있다.

변형에 의한 예시적인 하나의 조절된 손상 방법 및 그러한 방법에 적합한 장치는 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 WO2013059343호 INTRACELLULAR DELIVERY에 기재되어 있다.

특정 구현예에서, 조절된 변형에 의해 조절된 세포 손상으로 처리되는 망상적혈구의 모집단이 제공된다. 세포는 예를 들어, 개별 망상적혈구의 직경 미만의 직경을 갖는 마이크로-채널을 통한 통과에 의해 압축되고 변형되어, 그에 의해, 막이 다공성이 되도록 세포막에 섭동을 야기할 수 있다. 세포는 압력의 적용에 의해 채널 또는 도관을 통해 이동, 예를 들어, 통과된다. 압축 및 변형은 페이로드, 예를 들어, 외인성 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, DNA, RNA, 예를 들어, mRNA)를 포함하는 전달 배지에서 발생한다. 예를 들어, 전달 배지는 표 F, 표 G, 표 H, 표 I 및 표 J에 열거된 외인성 항원 또는 그의 코딩 mRNA를 포함할 수 있다. 망상적혈구는 변형시에 외인성 물질을 흡수하고, 그를 보유한다. 수축, 연신 및/또는 높은 전단 속도의 펄스에 의한 세포로의 조절된 손상 후에, 세포를 임의로 물질(페이로드)을 함유하는 전달 배지에서 인큐베이션시킨다. 세포를 수 분 동안 전달 배지에 유지시켜, 예를 들어, 수축부(constriction)의 통과에 의해 야기되는 손상부를 회복, 예를 들어, 폐쇄할 수 있다. 이는 실온에서 발생할 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은 조절된 세포 손상은 i) 바이러스-매개의 트랜스펙션(예를 들어, 단순 포진 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아(Vaccinia) 바이러스 또는 신드비스(Sindbis) 바이러스), ii) 화학-매개의 트랜스펙션, 예를 들어, 양이온 폴리머, 인산칼슘, 양이온 지질, 폴리머 및 나노입자, 예를 들어, 사이클로덱스트린, 리포좀, 양이온 리포좀, DEAE-덱스트란, 폴리에틸렌이민, 덴드리머, 폴리브렌, 인산칼슘, 리포펙틴, DOTAP, 리포펙타민, CTAB/DOPE, DOTMA; 및 iii) 마이크로-니들, 나노-니들, 펨토시린지(femtosyringe), 원자력 현미경(AFM) 팁, 유전자 총(예를 들어, 골드 나노입자), 아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector), 포토트랜스펙션(phototransfection)(다중-광자 레이저), 임페일펙션(impalefection) 및 마그네토펙션(magnetofection) 및 해당 분야에 알려져 있는 다른 적합한 방법에 의해 예시된 바와 같은 직접 주사, 볼리스틱 입자 전달, 전기천공, 레이저-조사, 소노포레이션(sonoporation), 자성 나노입자 및 조절된 변형(예를 들어, 세포 압착(squeezing))을 포함하는 물리-매개의 트랜스펙션을 포함한다. 임의의 적합한 방법을 사용하여 하나 이상의 요망되는 DNA, RNA(예를 들어, mRNA) 또는 항원을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 본원에 기재된 EHC를 수득할 수 있다.

관심 외인성 항원은 본 발명의 EHC 상에서 검출될 수 있다. 외인성 항원의 존재는 표준 분자 생물학 방법, 예를 들어, 웨스턴 블롯팅 또는 FACS 분석을 사용하여 입증되고, 정량화될 수 있다. 세포내 환경에 존재하는 외인성 항원은 세포 용해시에 또는 형광 검출을 사용하여 정량화될 수 있다.

제조

일부 구현예에서, EHC는 공급원으로서 전구 조혈 세포, 예를 들어, CD34+ 세포, 적혈구, 혈소판, 거핵구 또는 호중구를 사용하여 생성된다. 일부 구현예에서, 전구 조혈 세포를 GMP-준수 과정에 의해 인간 공여자로부터 단리한다. 일부 구현예에서, 출발 세포는 자가 공여자로부터 공급된다. 일부 구현예에서, 출발 세포는 동종이계 공여자로부터 공급된다. 공여자는 혈액 세포 항원 다형성에 대하여 분류될 수 있고/거나 공여자는 혈액 세포 항원에 대하여 유전자 유형이 결정된다. 공여자는 보편적인 혈액 공여자일 수 있다. 일부 구현예에서, 공여자는 봄베이(Bombay) 표현형을 가지며, 다시 말하면, H 항원을 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 공여자는 ABO 혈액형 O형을 가지며, Rh-음성이다.

일부 구현예에서, 출발 물질에 대한 공급원으로서 CD34+ 조혈 전구 세포, 동원된 말초 CD34+ 세포 또는 골수-유래 CD34+ 세포를 사용하여 EHC가 생성된다. 일부 구현예에서, 출발 세포는 제대혈로부터 유래되거나, 유도된 만능 줄기 세포이거나, 배아 줄기 세포이다.

외인성 항원-발현 EHC가 배양될 수 있다. 배양된 EHC는 벤치-탑(bench-top) 규모로부터 생물반응기 규모까지 확대될 수 있다. 예를 들어, EHC는 그들이 포화 밀도, 예를 들어, ㎖당 1x10⁵, 1x10⁶, 1x10⁷ 또는 1x10⁷개 초과의 EHC에 도달할 때까지 배양된다. 임의로, EHC는 포화 밀도에 도달하면, 더 큰 부피의 신선한 배지로 옮겨질 수 있다. 외인성 항원-발현 EHC는 생물반응기, 예를 들어, 웨이브(Wave)-형 생물반응기, 교반-탱크 생물반응기에서 배양될 수 있다. 생물반응기의 다양한 형태는 해당 분야에 알려져 있으며, 적합한 형태가 요망되는 대로 선택될 수 있다. 외인성 항원-발현 EHC의 모집단의 배양 및/또는 증량에 적합한 형태는 과도한 실험 없이 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 생물반응기에는 산소 공급될 수 있다. 생물반응기는 임의로 하나 이상의 임펠러, 재순환 스트림, 배지 유입 스트림 및 제어 구성요소를 함유하여, 배지 및 영양소의 유입을 조절하거나 배지, 영양소 및 폐기물의 유출을 조절할 수 있다.

일부 구현예에서, 생물반응기는 배양 공정의 과정에 걸쳐 그들의 세포내 DNA를 방출하는 외인성 항원을 포함하는 인간 EHC의 모집단을 함유할 수 있다. 예를 들어, 생물반응기는 배양 후에 인간 EHC, 제핵 EHC 및 피레노사이트(pyrenocyte)의 모집단을 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 EHC 및 제핵 EHC는 외인성 항원을 포함하며, 외인성 항원은 제핵 EHC에 의해 보유되는 한편, 외인성 항원을 인코딩하는 재조합 핵산은 제핵 세포에 의해 보유되지 않는다. 특정 구현예에서, 외인성 항원을 포함하는 제핵 EHC는 상응하는 단리된 비변형, 비배양 EHC와 실질적으로 동일한 삼투 막 취약성을 나타낸다.

일 구현예에서, 생물반응기 내의 EHC 또는 EHC 전구체로부터 생성된 외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 14일 이상에 총 20,000배 초과의 증량을 겪는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원은 배양된 또는 신선하게 단리된 EHC 전구체 내로 도입되고, 외인성 항원을 인코딩하는 재조합 핵산의 도입 후에, 생물반응기에서 EHC 전구체로부터 생성된 외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 생물반응기에서 전구 세포로부터 20,000배 초과하여 증량된다.

일부 구현예에서, 생물반응기는 웨이브 생물반응기 또는 임펠러-추진 진탕기이다. 생물반응기는 스파저(sparger)의 수단에 의해 통기될 수 있다. 일 구현예에서, 생물반응기는 일회용이다. 일 구현예에서, 생물반응기는 CIP(제자리에서 세정)이다. 본원에 기재된 바와 같은 생물반응기 환경에서 수득될 수 있는 외인성 항원-발현 EHC의 최종 개수는 10⁹개 초과, 10¹⁰개, 10¹¹개, 10¹²개, 10¹³개 또는 10¹³개 초과의 EHC일 수 있다. 외인성 항원-발현 EHC의 밀도는 혈구계수기 계수에 의해 또는 600 nm에서의 광학 밀도 판독에 의해 세포 밀도를 측정함으로써 배양 동안 모니터링될 수 있다. 임의로 배양 공정을 pH 수준, 산소화, 진탕 속도 및/또는 재순환 속도에 대하여 모니터링한다.

공정 및 특성

외인성 항원-발현 EHC의 아이덴티티는 시험관내 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 외인성 항원-발현 EHC의 아이덴티티는 예를 들어, 현미경 관찰에 의해, 유세포계수법에 의해 또는 혈구계수에 의해 모집단에서 EHC의 수를 계수함으로써 평가된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 외인성 항원-발현 EHC의 아이덴티티는 예를 들어, 유세포계수법, 웨스턴 블롯, 면역침전법, 형광분광법, 화학발광, 질량분광법 또는 흡광 분광법에 의한 EHC의 단백질 내용물의 분석에 의해 평가된다. 일 구현예에서, 검정되는 단백질 내용물은 비-표면 단백질, 예를 들어, 내재 막 단백질, 헤모글로빈, 성인 헤모글로빈, 태아 헤모글로빈, 배아 헤모글로빈, 세포골격 단백질이다. 일 구현예에서, 검정되는 단백질 내용물은 표면 단백질, 예를 들어, 분화 마커, 수용체, 보조-수용체, 수송체, 당단백질이다. 일 구현예에서, 표면 단백질은 글리코포린 A, CKIT, 트랜스페린 수용체, 밴드3, Kell, CD45, CD46, CD47, CD55, CD59, CR1을 포함하나 이들에 한정되지 않는 목록으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 아이덴티티는 예를 들어, 유세포계수법, 웨스턴 블롯, 면역침전, 형광 분광법, 화학발광, 질량 분광법 또는 흡광 분광법에 의한 EHC의 외인성 항원 내용물의 분석에 의해 평가된다. 예를 들어, 외인성 항원-발현 EHC의 아이덴티티는 예를 들어, RT-PCR, 유세포계수법 또는 노던 블롯에 의한 EHC의 mRNA 함량에 의해 평가될 수 있다. 외인성 항원-발현 EHC의 아이덴티티는 예를 들어, 핵 염료 또는 핵산 프로브를 사용한 유세포계수법, 현미경 관찰 또는 서던 블롯에 의한 핵 물질 함량에 의해 평가될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 외인성 항원-발현 EHC의 아이덴티티는 예를 들어, 유세포계수법, 지질 크로마토그래피 또는 질량 분광법에 의한 EHC의 지질 함량에 의해 평가된다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 아이덴티티는 예를 들어, 질량 분광법, 화학발광, 형광 분광법, 흡광 분광법에 의한 EHC의 대사 활성에 의해 평가된다. 대사 활성은 ATP 소모율에 의해 평가될 수 있고/거나 대사 활성은 외인성 항원-발현 EHC 내의 2,3-디포스포글리세레이트(2,3-DPG) 수준을 측정하여 평가된다. 대사 활성은 하기를 포함하나 이들에 한정되지 않는 하기의 것 중 하나의 대사율로서 평가될 수 있다: 아세틸살리실산, N-아세틸시스테인, 4-아미노페놀, 아자티오프린, 부놀롤(Bunolol), 카프토프릴(Captopril), 클로르프로마진(Chlorpromazine), 답손(Dapsone), 다우노루비신(Daunorubicin), 데하이드로에피안드로스테론(Dehydroepiandrosterone), 디다노신(Didanosin), 도파민(Dopamine), 에피네프린(Epinephrine), 에스몰롤(Esmolol), 에스트라디올(Estradiol), 에스트론(Estrone), 에토포시드(Etoposide), 할로페리돌(Haloperidol), 헤로인(Heroin), 인슐린(Insulin), 이소프로테레놀(Isoproterenol), 이소소르비드 디니트레이트(Isosorbide dinitrate), LY 217896, 6-머캅토퓨린, 미소니다졸(Misonidazole), 니트로글리세린(Nitroglycerin), 노르에피네프린(Norepinephrine), 파라-아미노벤조산. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 아이덴티티는 예를 들어, 질량 분광법, 화학발광, 형광 분광법 또는 흡광 분광법에 의해 EHC에 의한 기질의 분배에 의해 평가된다. 기질은 하기를 포함하나 이들에 한정되지 않는 하기의 것 중 하나일 수 있다: 아세타졸라미드(Acetazolamide), 아르부틴(Arbutine), 부메타미드(Bumetamide), 크레아티닌(Creatinine), 다르스틴(Darstine), 데스에틸도르졸라미드(Desethyldorzolamide), 디곡시게닌 디기톡소사이드(Digoxigenin digitoxoside), 디곡신-16'-글루쿠로니드, 에피네프린, 젠타마이신(Gentamycin), 히푸르산(Hippuric acid), 메트포르민(Metformin), 노르에피네프린, p-아미노히푸르산, 파파베린(Papaverine), 페니실린 G, 페놀 레드(Phenol red), 세로토닌(Serotonin), 설포살리실산(Sulfosalicylic acid), 타크롤리무스(Tacrolimus), 테트라사이클린(Tetracycline), 투카레솔(Tucaresol) 및 반코마이신(Vancomycin).

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 전구 세포로부터 분화된다. 이러한 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단의 분화 상태는 시험관내 검정에 의해 평가된다. 시험관내 검정은 증량 속도, 수, 단백질 함량 또는 발현 수준, mRNA 함량 또는 발현 수준, 지질 함량, 기질의 분배, 촉매 활성 또는 대사 활성을 포함하나 이들에 한정되지 않는 EHC의 아이덴티티를 평가하기 위하여 본원에 기재된 것들을 포함한다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC를 배양하고, 배양 공정의 과정에 걸쳐 다수의 시점에 EHC의 분화 상태를 평가한다.

외인성 항원-발현 EHC는 출발 물질을 위한 공급원으로서 망상적혈구를 사용하여 생성될 수 있다. 단리된 망상적혈구의 순도는 망상적혈구가 특정 염료, 예를 들어, 신규한 메틸렌 블루 또는 브릴리언트 크레실 블루(brilliant cresyl blue)를 사용하여 현미경하에서 가시적이 되는 리보좀 RNA의 망상(메쉬-유사) 네트워크를 특징으로 한다는 점에서 현미경을 사용하여 평가될 수 있다. 또한, 트랜스페린 수용체(CD71)의 표면 발현은 망상적혈구에서 더 높고, 감소되며, 그들은 적혈구로 성숙하여, 항-CD71 항체를 사용한 망상적혈구 모집단의 농축 및 분석을 가능하게 한다(예를 들어, 문헌[Miltenyi CD71 microbeads product insert No. 130-046-201] 참조). 대안적으로, 크레아틴 및 헤모글로빈 A1C 함량 및 피루베이트 키나제, 아스파르트산염 아미노트랜스퍼라제 및 포르포빌리노겐 데아미나제 효소 활성의 분석을 사용하여, 성숙 적혈구에 비하여 단리된 망상적혈구의 특성을 평가할 수 있다(예를 들어, 문헌[Brun et al., Blood 76:2397-2403 (1990)] 참조). 예를 들어, 포르포빌리노겐 데아미나제의 활성은 거의 9배 더 높은 한편, 헤모글로빈 A1C 함량은 성숙 적혈구에 비해 망상적혈구에서 거의 10배 더 낮다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC를 생성하기에 적합한 세포는 생체외 및/또는 생체내에서 하나 이상의 줄기 세포로부터 분화된다. 일 구현예에서, 하나 이상의 줄기 세포는 하나 이상의 조혈 줄기 세포이다. 예를 들어, 현미경 관찰, 혈액학, 유세포계수법, 변형성 측정, 효소 활성 및 헤모글로빈 분석 및 기능 특성을 포함하는 다양한 검정을 수행하여, 망상적혈구 및 적혈구로의 배양된 조혈 줄기 세포의 생체외 분화를 확인할 수 있다(문헌[Giarratana et al., Nature Biotech. 23:69-74 (2005)]). 배양된 조혈 줄기 세포의 표현형은 예를 들어, 크레실 브릴리언트 블루를 사용하여 염색된 세포의 현미경 관찰을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 망상적혈구는 이들 염색 조건하에 리보좀 RNA의 망상 네트워크를 나타내는 한편, 적혈구는 염색이 없다. 또한, 제핵 세포는 예를 들어, XE2100 오토맷(automat)(Sysmex, Roche Diagnostics)을 사용하여 평균 적혈구 용적(MCV; 펨토리터(fL)), 평균적혈구혈색소농도(MCHC; %) 및 평균적혈구혈색소량(MCH; pg/세포)을 포함하는 표준 혈액학 변수에 대하여 모니터링될 수 있다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 그들의 기본 물리적 특성, 예를 들어, 크기, 질량, 부피, 직경, 부력, 밀도 및 막 특성, 예를 들어, 점도, 변형성 변동 및 유동성에 대하여 평가된다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 직경은 현미경 관찰에 의해 또는 자동화 계측, 예를 들어, 혈액 분석 기기에 의해 측정된다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 직경은 약 1 내지 20 미크론이다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 직경은 적어도 하나의 치수가 약 1 내지 20 미크론이다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 직경은 약 1 미크론 미만이다. 일 구현예에서, 하나의 치수에서 EHC의 직경은 약 20 미크론보다 더 크다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 직경은 약 1 미크론 내지 약 20 미크론, 약 2 미크론 내지 약 20 미크론, 약 3 미크론 내지 약 20 미크론, 약 4 미크론 내지 약 20 미크론, 약 5 미크론 내지 약 20 미크론, 약 6 미크론 내지 약 20 미크론, 약 5 미크론 내지 약 15 미크론 또는 약 10 미크론 내지 약 30 미크론이다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 평균 적혈구 용적은 혈액 분석 기기를 사용하여 측정된다. 일 구현예에서, EHC의 평균 적혈구 용적의 용적은 10 fL 초과, 20 fL, 30 fL, 40 fL, 50 fL, 60 fL, 70 fL, 80 fL, 90 fL, 100 fL, 110 fL, 120 fL, 130 fL, 140 fL, 150 fL 또는 150 fL 초과이다. 일 구현예에서, EHC의 평균 적혈구 용적은 30 fL 미만, 40 fL, 50 fL, 60 fL, 70 fL, 80 fL, 90 fL, 100 fL, 110 fL, 120 fL, 130 fL, 140 fL, 150 fL, 160 fL, 170 fL, 180 fL, 190 fL, 200 fL 또는 200 fL 미만이다. 일 구현예에서, EHC의 평균 적혈구 용적은 80 내지 100 펨토리터(fL)이다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 평균 부유 질량(pg/세포)을 부유 마이크로채널 공명기 또는 이중 부유 마이크로채널 공명기를 사용하여 측정한다(예를 들어, 문헌[Byun et al PNAS 2013 110(19):7580] 및 문헌[Bryan et al. Lab Chip 2014 14(3):569] 참조).

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 건조 밀도는 H2O-D2O 교환 검정에서 부유 질량에 의해 측정된다(예를 들어, 문헌[Feijo Delgado et al., PLOS One 2013 8(7):e67590] 참조).

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 공간 광 간섭 현미경(SLIM)에 의해 측정시 10 초과, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 100 mrad 초과의 표준 편차의 평균 막 변형성 변동을 갖는다(예를 들어, 문헌[Bhaduri et al., Sci Reports 2014, 4:6211] 참조).

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단의 평균 막 점도는 점도-의존성 양자 수율 형광단과의 인큐베이션 시에 평균 형광을 검출함으로써 측정된다(예를 들어, 문헌[Haidekker et al. Chem & Biol 2001 8(2):123] 참조).

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 막 유동성은 예를 들어, BMG Labtech POLARstar Omega 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)를 사용하여 형광 편광에 의해 측정된다.

예를 들어, 변형성을 측정하기 위하여, 망상적혈구를 예를 들어, 백혈구제거(deleukocyting) 필터(예를 들어, Leucolab LCG2, Macopharma)를 통한 통과에 의하여 배양 제15일에 유핵 세포로부터 분리될 수 있으며, 이후에 엑토시토메트리(ektacytometry)를 사용하여 검정될 수 있다. 제핵 세포를 4% 폴리비닐피롤리돈 용액 중에서 현탁화시킨 다음, 60에서 450 mosM까지의 증가하는 삼투 구배에 노출시킨다. 세포의 레이저 회절 패턴의 변화(변형성 지수)는 세포막의 역학적 변형성을 평가하기 위하여 오스몰 농도의 함수로서 기록된다. 생리학적으로 관련있는 오스몰 농도에서 달성되는 최대 변형성 지수는 적혈구의 평균 표면적과 관련이 있다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 헤모글로불린 함량에 대하여 분석된다. 헤모글로빈의 검정을 사용하여 분화된 세포의 표현형을 평가할 수 있다(문헌[Giarratana et al., Nature Biotech. 23:69-74 (2005)]). 예를 들어, Bio-Rad Variant II Hb 분석기(Bio-Rad Laboratories)를 사용한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여, 다양한 헤모글로빈 분획의 백분율을 평가할 수 있다. 이중-파장 분광광도계(예를 들어, 헤목스(Hemox) 분석기, TCS)를 사용한 연속 방법을 사용하여 산소 평형이 측정될 수 있다. 헤모글로빈의 결합 특성은 섬광 광분해를 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 방법에서 세포내 헤모글로빈 사량체로의 CO의 재결합을 532 nm에서 10 나노초 펄스를 사용한 광분해 후에 436 nm에서 분석한다.

본원에 기재된 외인성 항원-발현 EHC는 필요에 따라 제조 후에 정제될 수 있다. 많은 적합한 정제 방법이 해당 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 외인성 항원-발현 EHC는 원심분리, 자기영동, 방사선조사, 음파영동 및 화학적 또는 물리적 제핵에 의해 정제된다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 예를 들어, 기질 세포 동시-배양과 함께 생체외 성숙에 의해 정제된다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 EHC의 화학적 또는 효소적 처리에 의해, 예를 들어, 탈당화 효소로의 처리에 의해 정제된다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 외인성 항원-발현 EHC의 임의의 잔류 복제력을 불가능하게 함으로써 정제된다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC를 방사선조사, 예를 들어, X선, 감마선, 베타 입자, 알파 입자, 중성자, 양자, 원소 핵, UV 선으로 처리하여, 잔류 복제-컴피턴트(competent) 핵산을 손상시킨다.

이온화 방사선은 X선, 감마선, 베타 입자(고속 전자), 알파 입자(헬륨 원자의 핵), 중성자, 양자 및 기타 중금속 이온, 예를 들어, 아르곤, 질소, 탄소 및 기타 원소의 핵을 통해 전달되는 에너지이다. X선 및 감마선은 광과 같은 전자기파이지만, 그들의 에너지는 광의 에너지보다 훨씬 더 높다(그들의 파장은 훨씬 더 짧다). 자외선(UV) 광은 세포를 손상시킬 수 있는 중간 에너지의 방사선이지만, UV 광은 그것이 원자 또는 분자의 이온화(전자의 소실)를 야기하지 않고, 오히려 여기(전자의 에너지 수준의 변화)를 야기한다는 점에서 상기 언급된 전자기 방사선의 형태와 상이하다. 다른 방사선의 형태--입자--는 음으로 하전되거나(전자), 양으로 하전되거나(양자, 알파선 및 기타 중금속 이온) 또는 전기적으로 중성이다(중성자).

방사선-유도 이온화는 직접적으로 세포 성분 분자에 또는 간접적으로 물 분자에 작용하여, 물-유래 라디칼을 야기할 수 있다. 라디칼은 매우 짧은 시간 내에 근처 분자와 반응하여, 영향을 받은 분자의 화학적 결합의 파괴 또는 산화(산소 원자의 부가)를 초래한다. 세포에서의 주요 효과는 DNA 파단이다. DNA가 상보적 이중 가닥의 쌍으로 이루어져 있기 때문에, 단일의 가닥 또는 둘 모두의 가닥의 파단이 발생할 수 있다. 그러나, 후자가 생물학적으로 훨씬 더 중요한 것으로 여겨진다. 대부분의 단일-가닥 파단은 DNA 분자의 이중-가닥 성질 덕분에 정상적으로 수복될 수 있다(무손상 가닥이 그의 손상된 반대 가닥의 수복을 위한 주형으로 작용할 수 있도록 2개의 가닥은 서로 상보적임). 그러나, 이중-가닥 파단의 경우에, 수복은 더욱 어렵고, 파단된 말단의 잘못된 재결합이 발생할 수 있다. 이들 소위 수복오류(misrepair)는 돌연변이의 도입, 염색체 이상 또는 세포사를 초래한다.

DNA 세그먼트의 결실은 방사선조사를 견뎌내는 세포에서의 주요 형태의 방사선 손상이다. 그것은 (1) 2개의 외측 말단의 연결 및 파단부 사이의 단편의 소실과 함께, DNA 분자 내의 2개의 개별 이중-가닥 파단부의 수복오류 또는 (2) 하나의 이중-가닥 파단부를 수복하기 위한 재연결 이전에 파단된 말단의 세정 과정(뉴클레오티드--DNA의 성분 분자의 효소적 분해)에 의해 야기될 수 있다.

방사선은 그들의 구성성분(전자, 양자, 중성자 등)뿐 아니라 그들의 에너지도 상이하다. 그들의 트랙을 따라 조밀 이온화를 야기하는 방사선(예를 들어, 중성자)은 높은-선-에너지-전달(고-LET) 방사선, 트랙의 단위 길이마다 방출되는 평균 에너지를 기술하기 위한 물리적 파라미터로 지칭된다. (첨부 도면 참조.) 저-LET 방사선은 그들의 트랙을 따라 오직 성기게, 이에 따라, 세포 내에 거의 균질하게 이온화를 생성한다. 방사선량은 생물학적 물질의 단위당 에너지의 양(예를 들어, 세포당 이온화 수)이다. 따라서, 동일 용량에서, 저-LET 방사선이 세포 내에 더욱 성기게 동일한 수의 라디칼을 유도하는 한편, 고-LET 방사선--예를 들어, 중성자 및 알파 입자--이 그들의 대부분의 에너지를 작은 세포의 영역으로 전달하기 때문에, 고-LET 방사선은 저-LET 방사선--예를 들어, X 및 감마선--보다 생물학적 물질에 더욱 파괴적이다. 고-LET 방사선으로부터 조밀 이온화에 의해 야기되는 국소화된 DNA 손상은 저-LET 방사선으로부터 성긴 이온화에 의해 야기되는 분산된 DNA 손상보다 수복되기 더 어렵다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단을 1 초과, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 100 kGy 초과의 조사량을 사용하여 감마선 조사로 처리한다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단을 0.1 초과, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 또는 10000 mSv 초과의 조사선량을 사용하여 X-선 조사로 처리한다.

외인성 항원-발현 EHC의 모집단의 순도는 모집단의 균질성을 측정함으로써 평가될 수 있다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 평균 분포 계수(distribution width)를 혈액 분석 기기에 의해 측정한다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 10 초과, 100, 1000, 10⁴, 10⁵, 10⁶ 또는 10⁶ 초과의 망상적혈구 대 비-망상적혈구 비를 갖는다. 외인성 항원-발현 EHC의 모집단의 균질성은 모집단의 기질 세포 함량을 측정함으로써 평가될 수 있다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 1 ppb 미만의 기질 세포를 갖는다. 대안적으로 또는 추가적으로, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단의 균질성은 모집단의 바이러스 역가 및/또는 박테리아 콜로니 형성능을 측정함으로써 평가된다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단의 균질성은 시험관내 검정에 의해 평가된다. 시험관내 검정은 증량 속도, 수, 단백질 함량 또는 발현 수준, mRNA 함량 또는 발현 수준, 지질 함량, 기질의 분배, 촉매 활성 또는 대사 활성을 포함하나 이들에 한정되지 않는 EHC의 아이덴티티를 평가하기 위하여 본원에 기재된 것들을 포함한다.

외인성 항원-발현 EHC의 생성에 사용하기 위한 성숙 적혈구는 다양한 방법, 예를 들어, 세포 세척기, 연속 유세포 분리기, 밀도 구배 분리, 형광-활성화 세포 분류(FACS), 밀테니이(Miltenyi) 면역자기 고갈(MACS) 또는 이들 방법의 조합을 사용하여 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[van der Berg et al., Clin. Chem. 33:1081-1082 (1987)]; 문헌[Bar-Zvi et al., J. Biol. Chem. 262:17719-17723 (1987)]; 문헌[Goodman et al., Exp. Biol. Med. 232:1470-1476 (2007)] 참조).

적혈구는 단순한 원심분리에 의해 전혈로부터 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[van der Berg et al., Clin. Chem. 33:1081-1082 (1987)] 참조). 예를 들어, EDTA-항응고처리 전혈은 4℃에서 10분 동안 800×g에서 원심분리될 수 있다. 혈소판-풍부 혈장 및 버피 코트(buffy coat)를 제거하고, 적혈구를 등장성 염수 용액(NaCl, 9 g/ℓ)으로 3회 세척한다.

대안적으로, 적혈구는 다양한 분리 매질, 예를 들어, 피콜(Ficoll), 하이파크(Hypaque), 히스토파크(Histopaque), 퍼콜(Percoll), 시그마셀(Sigmacell) 또는 그들의 조합을 사용한 밀도 구배 원심분리를 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 소정의 부피의 히스토파크-1077이 동일 부피의 히스토파크-1119의 상측에 적층된다. 동일 부피의 등장성 염수 용액(NaCl, 9 g/ℓ)에 1:1 희석된 EDTA-항응고처리 전혈을 히스토파크의 상측에 적층하고, 시료를 실온에서 30분 동안 700×g에서 원심분리한다. 이들 조건하에, 과립구는 1077/1119 계면으로 이동하고, 림프구, 다른 단핵 세포 및 혈소판은 혈장/1077 계면에 유지되고, 적혈구는 펠렛화된다. 적혈구를 등장성 염수 용액으로 2회 세척한다.

대안적으로, 적혈구는 퍼콜 단계 구배를 사용하여 원심분리에 의해 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bar-Zvi et al., J. Biol. Chem. 262:17719-17723 (1987)] 참조). 예를 들어, 신선한 혈액을 75 mM 시트르산나트륨 및 38 mM 시트르산을 함유하는 항응고 용액과 혼합하고, 세포를 Hepes-완충 염수에 간단히 세척한다. 백혈구 및 혈소판을 α-셀룰로스 및 시그마셀(1:1)의 혼합물을 사용한 흡수에 의해 제거한다. 적혈구를 소르발(Sorvall) SS34 로터에서 2500 rpm에서 10분 동안 45/75% 퍼콜 단계 구비를 통한 원심분리에 의해 추가로 망상적혈구 및 잔류 백혈구로부터 단리한다. 적혈구를 펠렛에서 회수하는 한편, 망상적혈구 밴드를 45/75% 계면에서, 잔류 백혈구 밴드를 0/45% 계면에서 회수한다. 퍼콜을 Hepes-완충 염수에서의 수회의 세척에 의해 적혈구로부터 제거한다. 적혈구의 단리를 위하여 밀도 구배를 생성하기 위해 사용될 수 있는 다른 물질은 OptiPrep™, 수 중 60% 이오딕사놀 용액을 포함한다(Axis-Shield, Dundee, Scotland).

적혈구는 예를 들어, 유세포계수법을 사용하여 망상적혈구로부터 분리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Goodman el al., Exp. Biol. Med. 232:1470-1476 (2007)] 참조). 이러한 예에서, 전혈을 원심분리하여(550×g, 20분, 25℃), 세포를 혈장으로부터 분리한다. 세포 펠렛을 인산염 완충 염수 용액에서 재현탁화시키고, 예를 들어, 원심분리(400×g, 30분, 25℃)에 의해 피콜-파크(Ficoll-Paque)(1.077 밀도)에서 추가로 분별시켜, 백혈구로부터 적혈구를 분리한다. 생성된 세포 펠렛을 10% 우태아혈청이 보충된 RPMI에서 재현탁화시키고, 크기 및 입상도에 기초하여 FACS 기기, 예를 들어, 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson) FACSCalibur(BD Biosciences, Franklin Lakes, N.J., USA)에서 분리한다.

적혈구는 면역자기 고갈에 의해 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Goodman, el al., (2007) Exp. Biol. Med. 232:1470-1476] 참조). 이러한 예에서, 세포-유형 특이적 항체가 있는 자기 비드를 사용하여 비-적혈구를 제거한다. 예를 들어, 적혈구를 본원에 기재된 바와 같은 밀도 구배에 이어서 임의의 잔류 망상적혈구의 면역자기 고갈을 사용하여 다수의 다른 혈액 성분으로부터 단리한다. 세포를 25℃에서 20분 동안 인간 항체 혈청으로 전처리한 다음, 망상적혈구 특이적 항원, 예를 들어, CD71 및 CD36에 대한 항체로 처리한다. 항체는 자기 비드에 직접 부착되거나 항-PE 항체가 있는 자기 비드가 반응할 PE에 컨쥬게이트될 수 있다. 항체-자기 비드 복합체는 예를 들어, 적혈구 모집단으로부터 선택적으로 잔류 망상적혈구를 추출할 수 있다.

적혈구는 또한 분리반출법을 사용하여 단리될 수 있다. 분리반출법의 과정은 환자 또는 공여자로부터 전혈의 제거, 원심분리 또는 세포 분리를 사용한 혈액 성분의 분리, 분리된 부분 중 하나 이상의 회수 및 잔류 성분을 다시 환자 또는 공여자로 주입하는 것을 수반한다. 다수의 기기, 예를 들어, Baxter(Deerfield, Ill., USA)로부터의 Amicus 및 Alyx 기기, Gambro BCT(Lakewood, Colo., USA)로부터의 Trima Accel 기기 및 Haemonetics(Braintree, Mass., USA)로부터의 MCS+9000 기기가 이러한 목적을 위해 현재 이용 중이다. 적절한 정도의 세포 순도를 달성하기 위하여 추가의 정제 방법이 필요할 수 있다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 생체외에서 및/또는 생체내에서 하나 이상의 망상적혈구로부터 분화된다. 망상적혈구를 사용하여 외인성 항원-발현 EHC를 생성할 수 있다. 망상적혈구는 미성숙 적혈구이며, 인간 체 내의 적혈구의 대략 1%를 구성한다. 망상적혈구는 골수에서 발생하고 성숙한다. 일단 순환으로 방출되면, 망상적혈구는 신속하게 성숙 적혈구로의 최종 분화를 겪는다. 망상적혈구는 성숙 적혈구와 같이 세포 핵을 갖지 않는다. 망상적혈구는 성숙 적혈구와 달리, 단백질 합성을 수행하는 능력을 유지한다. 일부 구현예에서, 외인성 항원을 인코딩하는 재조합 핵산(예를 들어, mRNA)은 망상적혈구로 도입되어, 외인성 항원-발현 EHC를 생성한다.

다양한 연령의 망상적혈구는 망상적혈구가 성숙함에 따른 세포 밀도의 차이에 기초하여 말초 혈액으로부터 단리될 수 있다. 망상적혈구는 다양한 밀도 구배를 통한 분별 원심분리를 사용하여 말초 혈액으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 퍼콜 구배를 사용하여, 망상적혈구를 단리할 수 있다(예를 들어, 문헌[Noble el al., Blood 74:475-481 (1989)] 참조). 농도 1.096 및 1.058 g/㎖의 멸균 등장성 퍼콜 용액은 퍼콜(Sigma-Aldrich, Saint Louis, Mo., USA)을 10 mM 트리에탄올아민, 117 mM NaCl, 5 mM 글루코스 및 1.5 ㎎/㎖ 소 혈청 알부민(BSA)의 최종 농도로 희석시킴으로써 제조된다. 이들 용액은 295 내지 310 mOsm의 오스몰 농도를 갖는다. 예를 들어, 5 밀리리터의 제1 퍼콜 용액(농도 1.096)을 멸균 15 ㎖ 코니컬(conical) 원심분리 튜브에 첨가한다. 예를 들어, 2 밀리리터의 제2 퍼콜 용액(농도 1.058)을 더 높은 농도의 제1 퍼콜 용액 위에 적층한다. 2 내지 4 밀리리터의 전혈을 튜브의 상측에 적층한다. 튜브를 수평(swing-out) 튜브 홀더가 있는 냉장 원심분리기에서 250×g에서 30분 동안 원심분리한다. 망상적혈구 및 일부 백혈구는 2개의 퍼콜 층 사이의 계면으로 이동한다. 계면에 있는 세포를 새로운 튜브로 옮기고, 5 mM 글루코스, 0.03 mM 아지드화나트륨 및 1 ㎎/㎖ BSA가 있는 인산염 완충 염수(PBS)로 2회 세척한다. 잔류 백혈구를 크기 배제 컬럼에서 PBS에서의 크로마토그래피에 의해 제거한다.

대안적으로, 망상적혈구는 면역자기 분리 방법을 사용하여 양성 선택에 의해 단리될 수 있다(예를 들어, 문헌[Brun et al., Blood 76:2397-2403 (1990)] 참조). 이러한 방법은 성숙 이전 적혈구에 비하여 망상적혈구의 표면상에 발현되는 다수의 트랜스페린 수용체를 이용한다. 트랜스페린 수용체에 대한 항체로 코팅된 자기 비드를 사용하여, 혼합된 혈액 세포 모집단으로부터 망상적혈구를 선택적으로 단리할 수 있다. 인간을 포함하는 다양한 포유류 종의 트랜스페린 수용체에 대한 항체는 상업적 공급처로부터 이용가능하다(예를 들어, Affinity BioReagents, Golden, Colo., USA; Sigma-Aldrich, Saint Louis, Mo., USA). 트랜스페린 항체는 자기 비드에 직접 연결될 수 있다. 대안적으로, 트랜스페린 항체는 2차 항체를 통해 자기 비드에 간접 연결될 수 있다. 예를 들어, 인간 트랜스페린에 대한 마우스 모노클로널 항체 10D2(Affinity BioReagents, Golden, Colo., USA)를 양 항-마우스 면역글로불린 G(Dynal/Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA)가 코팅된 면역자기 비드와 혼합시킬 수 있다. 그 다음, 면역자기 비드를 백혈구-고갈 적혈구 분획과 인큐베이션시킨다. 비드 및 적혈구를 60 내지 90분 동안 온건하게 혼합하면서 22℃에서 인큐베이션시킨 후에, 자기장을 사용하여 부착된 망상적혈구가 있는 비드를 단리시킨다. 단리된 망상적혈구를 예를 들어, DETACHaBEAD® 용액(Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA)을 사용하여 자기 비드로부터 제거할 수 있다. 대안적으로, 망상적혈구는 본원에 기재된 방법을 사용하여 CD34+ 조혈 줄기 세포의 시험관내 성장 및 성숙으로부터 단리될 수 있다.

최종-분화된, 제핵 적혈구는 그들의 DNA 함량에 기초하여 다른 세포로부터 분리될 수 있다. 비제한적인 예에서, 세포를 먼저 생체 DNA 염료, 예를 들어, 훼히스트(Hoechst) 33342(Invitrogen Corp.)로 표지한다. 훼히스트 33342는 이중-가닥 DNA에 결합되는 경우 청색 형광을 방출하는 세포-투과성 핵 대조염료이다. 배양 중 미분화 전구 세포, 대식구 또는 다른 유핵 세포는 훼히스트 33342에 의해 염색되는 한편, 제핵 적혈구는 훼히스트-음성이다. 훼히스트-양성 세포는 형광 활성화 세포 분리기 또는 기타 세포 분리 기술을 사용함으로써 제핵 적혈구로부터 분리될 수 있다. 훼히스트 염료는 투석 또는 기타 적합한 방법에 의해 단리된 적혈구로부터 제거될 수 있다.

외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 EHC의 모집단의 핵 물질 함량을 감소시킴으로써 정제될 수 있다. 예를 들어, EHC의 모집단의 제핵 비는 증가되고/거나 제핵 외인성 항원-발현 EHC의 수는 증가되거나 농축된다.

외인성 항원-발현 EHC의 모집단을 소분자, 예를 들어, 액틴 억제제, 예를 들어, 사이토칼라신 A, B, C, D, E, F, H, J와 인큐베이션시킨 다음, 원심분리하여, 핵 물질을 제거할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 점점 더 작은 크기-제한 필터를 통과시켜 핵 물질을 제거함으로써 기계적으로 조작될 수 있다. 또한, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단을 피브로넥틴-코팅된 플라스틱 표면에서 인큐베이션시켜, 핵 물질의 제거를 증가시킬 수 있다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단을 동시-배양물에서 기질 세포, 예를 들어, 대식구와 인큐베이션시켜, 핵 물질의 제거를 증가시킨다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 5% 초과, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 99.9% 초과로 제핵된다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 지지 세포와, 예를 들어, 부착 기질층과 동시-배양되지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 EHC를 외인성 항원과 접촉시키고, EHC를 분화시켜, 외인성 항원을 포함하는 제핵 세포의 모집단을 수득함으로써 생성된다. 제핵 세포에 대하여 선택하기 위한 농축 단계, 예를 들어, 중력 분리, 자기 또는 형광 분리, 방사선조사, 유핵 세포의 중독 등 없이 외인성 항원-발현 EHC의 모집단이 수득된다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 핵 물질을 검출하기 위한 검정, 예를 들어, 본원에 기재된 것들에 의해 평가시, 핵 물질이 결여된 5% 초과, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 99.9% 초과의 외인성 항원-발현 EHC로 구성된다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC에 의해 나타나는 외인성 항원, 예를 들어, 외인성 항원 폴리펩티드의 존재, 생물학적 활성 및/또는 기능이 평가된다. 많은 적합한 검정이 이용가능하며, 해당 분야에 알려져 있다.

일 구현예에서, 외인성 항원은 외인성 항원-발현 EHC의 표면상의 폴리펩티드이다. 외인성 항원의 존재는 유세포계수법, 웨스턴 블롯팅, RT-PCR, 노던 블롯팅, 쿰스 로제팅(Coombs rosetting), 질량 분광법을 포함하나 이들에 한정되지 않는 검정에 의해 평가될 수 있다. 일 구현예에서, 외인성 항원은 외인성 항원-발현 EHC의 내부의 폴리펩티드이다. 외인성 항원의 존재는 웨스턴 블롯팅, RT-PCR, 노던 블롯팅, PCR, 서던 블롯팅, 질량 분광법을 포함하나 이들에 한정되지 않는 검정에 의해 평가될 수 있다.

일 구현예에서, 외인성 항원은 외인성 항원-발현 EHC의 표면상의 핵산이다. 외인성 항원의 존재는 유세포계수법, 상동성 형광 프로브를 사용한 유세포계수법, 서던 블롯팅, 노던 블롯팅, PCR을 포함하나 이들에 한정되지 않는 검정에 의해 평가될 수 있다. 일 구현예에서, 외인성 항원은 외인성 항원-발현 EHC의 내부의 핵산이다. 외인성 항원의 존재는 서던 블롯팅, 노던 블롯팅, PCR을 포함하나 이들에 한정되지 않는 검정에 의해 평가될 수 있다.

일 구현예에서, 외인성 항원은 외인성 항원-발현 EHC의 표면상의 소분자이다. 외인성 항원의 존재는 유세포계수법, 질량분광법을 포함하나 이들에 한정되지 않는 검정에 의해 평가될 수 있다. 일 구현예에서, 외인성 항원은 외인성 항원-발현 EHC의 내부의 소분자이다. 외인성 항원의 존재는 질량분광법, 형광 분광법을 포함하나 이들에 한정되지 않는 검정에 의해 평가될 수 있다.

일 구현예에서, 외인성 항원은 외인성 항원-발현 EHC의 막 내의 지질이다. 외인성 항원의 존재는 질량분광법, 유세포계수법, 막 용해도, 형광 편광, 공간 광 간섭 현미경 관찰을 포함하나 이들에 한정되지 않는 검정에 의해 평가될 수 있다.

일 구현예에서, 외인성 항원은 형광이거나, 형광 분자에 융합되거나, 재조합 핵산(예를 들어, 벡터 내)으로부터 GFP와 같은 형광 리포터 단백질과 동시-발현된다. 외인성 항원-발현 EHC 내의 또는 그 상의 외인성 항원의 존재는 유세포계수법, 형광 분광법, 흡광 분광법을 포함하나 이들에 한정되지 않는 검정에 의해 평가될 수 있다.

일 구현예에서, 외인성 항원은 기체상 분자이다. 외인성 항원-발현 EHC 내의 또는 그 상의 외인성 항원의 존재는 화학발광 검정, 질량 분광법을 포함하나 이들에 한정되지 않는 검정에 의해 평가될 수 있다.

외인성 항원-발현 EHC 내의 또는 그 상의 외인성 항원의 존재는 보정 비드, 예를 들어, 상업적으로 입수가능한 세포계수 보정 비드를 사용하여 개별 EHC 상의 외인성 항원의 수를 정량화하여 유세포계수법에 의해 정량적 방식으로 평가될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 외인성 항원-발현 EHC 내의 또는 그 상의 외인성 항원의 존재는 외인성 항원과 동일한 검출 시약을 사용하여 검출가능한 농도가 알려져 있는 표준물질을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 정량적 방식으로 평가될 수 있으며, 이러한 방식으로, 개별 EHC 상의 외인성 항원의 수는 정량화될 수 있다.

일부 구현예에서, 둘 이상의 상이한 외인성 항원의 존재는 동일하거나 상이한 방법에 의해, 동시에, 순차적 방식으로, 또는 병행하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서, 표면상의 외인성 항원은 외인성 항원에 특이적인 항체를 사용하여 유세포계수법에 의해 평가될 수 있으며, 표면상에 존재하지 않는 상이한, 형광인 외인성 항원은 유세포계수법에서 상이한 채널을 사용하여 형광 신호에 의해 평가될 수 있다. 상이한 예에서, 표면상의 외인성 항원은 유세포계수법에 의해 평가될 수 있으며, 표면상에 존재하지 않는 상이한 외인성 항원은 웨스턴 블롯에 의해 평가될 수 있다.

특정 구현예에서, 외인성 항원은 세포 공급원의 최종 분화 후에 외인성 항원-발현 EHC 상에 보유된다. 예를 들어, 외인성 항원-발현 EHC는 배양된 EHC로부터 생성되고, 외인성 항원의 발현 또는 존재는 적합한 방법에 의해, 예를 들어, 유세포계수법, 웨스턴 블롯, 면역침전, 형광 분광법, 화학발광, 서던 블롯, 노던 블롯 또는 흡광 분광법에 의해 세포의 최종 분화 후에 평가된다.

특정 구현예에서, 외인성 항원은 대상체로의 외인성 항원-발현 EHC의 투여 후 생체내에서의 순환 후에 외인성 항원-발현 EHC 상에 보유된다. 외인성 항원-발현 EHC는 실험실 동물 또는 동물 모델, 예를 들어, 마우스 내로 정맥내, 예를 들어, 꼬리 정맥을 통해 주사되거나, 인간 내로 정맥내 주사될 수 있다. 그 다음, 채혈하고, 외인성 항원-발현 EHC 상의 외인성 항원의 존재를 적합한 검정에 의해, 예를 들어, 유세포계수법, 웨스턴 블롯, 면역침전, 형광 분광법, 화학발광, 서던 블롯, 노던 블롯 또는 흡광 분광법에 의해 평가한다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC 내의 또는 그 상의 외인성 항원의 생물학적 활성, EHC의 전체 생물학적 활성 및 EHC의 모집단의 전체 활성은 시험관내 검정에 의해 평가될 수 있다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 활성은 모델 세포주를 사용하여 신속하게 반복된다. 예를 들어, 적합한 외인성 항원의 라이브러리를 모델 세포주, 예를 들어, HEK293T 또는 K562에서 발현시키고, 활성을 적합한 검정을 통해 평가한 다음; 최적의 외인성 항원 후보물질, 예를 들어, 적합한 검정에서 가장 높은 수준으로 발현되는 것 또는 가장 높은 활성을 나타내는 것을 예를 들어, 배양된 EHC에서 발현시켜, 외인성 항원-발현 EHC를 생성한다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 활성은 배양된 마우스 모델을 사용하여 신속하게 반복된다. 예를 들어, 적합한 외인성 항원의 라이브러리를 배양된 마우스 EHC에서 발현시키고; 활성을 평가하기에 적합한 마우스 질병 모델 또는 적합한 마우스 모델계에서 활성을 평가한 다음; 최적의 외인성 항원 후보물질, 예를 들어, 적합한 검정에서 가장 높은 수준으로 발현되는 것 또는 가장 높은 활성을 나타내는 것을 예를 들어, 배양된 EHC에서 발현시켜, 외인성 항원-발현 EHC를 생성한다.

일부 예에서, 외인성 항원은 효소이며, 외인성 항원의 활성은 특정 기질 분자의 소실이 검출되거나 특정 생성물 분자의 출현이 검출되는 효소 검정에 의해 평가될 수 있다. 그러한 검정은 비색 검정, 질량 분광법, HPLC, 형광 검정을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

예를 들어, a) 외인성 항원은 아데노신 데아미나제(ADA)이고, 효소적 검정은 아데노신에서 이노신으로의 전환을 검출하고; b) 외인성 항원은 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)이고, 검정은 페닐알라닌에서 티로신으로의 전환을 검출하고; c) 외인성 항원이 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL)이고, 검정은 페닐알라닌에서 트랜스-신남산으로의 전환을 검출하고; d) 외인성 항원은 티미딘 포스포릴라제(TP)이고, 검정은 티미딘에서 티민 및 2-데옥시-리보스로의 전환을 검출하고; e) 외인성 항원은 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제(PNP)이고, 검정은 이노신에서 하이포크산틴으로의 전환, 아데노신에서 아데닌으로의 전환, 및 구아노신에서 구아닌으로의 전환을 검출하고; f) 외인성 항원은 호모겐티세이트 1,2-디옥시게나제(HDG)이고, 검정은 호모겐티세이트에서 말레일아세토아세테이트로의 전환을 검출하고; g) 외인성 항원은 시스타티오닌 베타 신타제이고, 검정은 세린 및 호모시스테인에서 시스타티오닌으로의 전환을 검출하고; h) 외인성 항원은 옥살레이트 옥시다제이고, 검정은 옥살레이트의 산화를 검출한다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 활성은 질병, 예를 들어, 대사 질병 또는 효소 결핍의 동물 모델, 예를 들어, 마우스 모델 및 면역결핍 마우스 또는 NSG 마우스, 또는 외인성 항원-발현 EHC의 효과를 입증할 수 있는 동물 모델, 예를 들어, 기질이 주사되는 마우스에서 평가되고, 외인성 항원-매개의 전환의 생성물이 측정된다.

일 구현예에서, 외인성 항원은 보체 수용체 1(CR1) 폴리펩티드, 그의 유도체 또는 기능성 단편이다. CR1 외인성 항원의 활성은 예를 들어, CR1 외인성 항원에 의한 면역 복합체의 특이적 포획, 대식구로의 면역 복합체의 효율적인 전달 또는 마우스로부터 면역 복합체의 생체내 제거를 포함하는 몇몇 방법에서 평가될 수 있다.

CR1 외인성 항원을 과발현하는 EHC의 작용성은 하나 이상의 과정에 의해 평가될 수 있다: CR1 외인성 항원을 포함하는 EHC 표면상의 면역 복합체의 포획, CR1 외인성 항원을 포함하는 EHC를 남기면서 대식구로의 면역 복합체의 방출, 및 CR1 외인성 항원을 포함하는 EHC의 적절한 순환. 이들 3가지 파라미터는 시험관내에서 검정될 수 있다. 면역 복합체 포획 검정은 해당 분야, 예를 들어, 문헌[Oudin et al., J Immunol 2000] 및 문헌[Schifferli et al., J Immunol 1991]에 기재되어 있다. 예를 들어, 표지된 면역 복합체를 고유 CR1 또는 CR1 외인성 항원 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현하는 EHC와 인큐베이션시키고, EHC에 의해 포획되는 면역 복합체의 수를 유세포계수법에 의해 검정한다. 대식구 전달 검정은 해당 분야, 예를 들어, 문헌[Kuhn et al., J Immunol 1998]에 기재되어 있다. 예를 들어, 고유 CR1 또는 CR1 외인성 항원 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현하는 적혈구상으로 로딩되는 표지된 면역 복합체를 대식구와 인큐베이션시킨다. 적혈구 표면으로부터 대식구로의 면역 복합체의 전달, 및 대식구에 의한 적혈구의 소모 또는 절약은 유세포계수법에 의해 측정될 수 있다. 적절한 순환은 EHC 형태 및 변형성을 분석함으로써 예측될 수 있다. 고유 CR1 또는 CR1 외인성 항원 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현하는 EHC의 형태는 예를 들어, 문헌[DGiarratana et al., Blood 2011] 및 문헌[Repik et al., Clin Exp Immunol 2005]에 기재된 바와 같은 표준 현미경 관찰 기술을 사용하여 눈으로 평가될 수 있다. 고유 CR1 또는 CR1 외인성 항원 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현하는 EHC의 변형성은 예를 들어, 문헌[Giarratana et al., Blood 2011]에 기재된 바와 같은 레이저-보조 광학 회전 세포 분석(LORCA)으로도 알려져 있는 엑타사이토메트리에 의해 평가될 수 있다.

예를 들어, 외인성 CR1 항원-발현 EHC(EHC는 CR1 폴리펩티드 외인성 항원을 포함함)를 면역 복합체, 예를 들어, 시험관내 생성된 면역 복합체 또는 환자-유래의 면역 복합체와 인큐베이션시킨다. CR1 외인성 항원에 의한 면역 복합체의 포획은 예를 들어, 면역 복합체 내의 형광 마커를 사용한 유세포계수법에 의해, 또는 면역 복합체의 요소에 대한 이차 검출 작용제를 사용한 유세포계수법에 의해 평가된다.

일 구현예에서, 외인성 CR1 항원-발현 EHC를 먼저 면역 복합체와 인큐베이션시킨 다음, 대식구, 예를 들어, 일차 대식구, 일차 단핵구, 배양된 대식구, 배양된 단핵구, U937 세포, PMA-활성화 U937 세포, AA9 세포, RAW 264.7 세포, J774 세포, THP1 세포, KG-1 세포, NR8383 세포, MV-4-11 세포, 3D4/31 세포, MD 세포, Fcwf-4 세포, DH82 세포와 인큐베이션시킨다. 예를 들어, 유세포계수법 또는 라디오그래피(radiography)에 의해 외인성 CR1 항원-발현 EHC에 의해 전달되는 면역 복합체의 존재에 대하여 대식구를 검정한다. 배양된 EHC로부터 대식구로의 포획된 면역 복합체의 전달은 해당 분야에서의 표준 검정이며, 예를 들어, 문헌[Repik et al. 2005 Clin Exp Immunol. 140:230]; 문헌[Li et al. 2010 Infection Immunity 78(7):3129]을 참조한다.

일 구현예에서, 외인성 CR1 항원-발현 EHC의 활성은 동물 모델에서 평가된다. 예를 들어, 적합한 마우스 모델, 예를 들어, 면역결핍 마우스 또는 NSG 마우스가 사용될 수 있다. 마우스 질병 모델은 예를 들어, 면역 복합체 질병, 예를 들어, 루푸스일 수 있다. 마우스 모델은 NZBWF1/J, MRL/MpJ, MRL/MpJ-Fas(lpr), Smn.C3-Fasl/J, NZM2410/Aeg, 129S4-Cd48, Cg-Sle1, NZM-Sle1 Sle2 Sle3/LmoJ 및 BXSB.129P2를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 질병 표현형은 예를 들어, 면역 복합체의 주사에 의해 마우스 내로 도입될 수 있다. 외인성 CR1 항원-발현 EHC를 임의의 적합한 마우스(또는 기타 동물 모델) 내로 주사하여, EHC의 하나 이상의 생물학적 효과, 예를 들어, 외인성 CR1 항원-발현 EHC에 의한 주사된 면역 복합체의 제거를 시험할 수 있다.

일 구현예에서, 외인성 항원은 보체 조절 분자이거나, 보체 조절 활성을 갖는다. 이러한 외인성 항원의 활성은 시험관내 및 생체내 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 외인성 항원의 활성은 시험관내 보체 활성화 검정, 예를 들어, 감작된 양 적혈구의 보체-매개의 용해를 측정하는 CH50 검정 또는 비-감작된 토끼 적혈구의 대안적인 경로 보체-매개의 용해를 측정하는 AH50 검정에서 감소를 측정함으로써 평가될 수 있다. 대안적으로, 외인성 항원의 활성은 예를 들어, 리컴비넌트 C2의 C2a 및 C2b로의 절단, 인자 B의 인자 Ba 및 인자 Bb로의 절단, 인자 C3b의 iC3bH 및 iC3bL로의 절단, C3bBb의 C3b 및 Bb로의 절단, C4bBb의 C4b 및 Bb로의 절단, 또는 인자 C4b의 iC4bH 및 iC4bL로의 절단을 포함하나 이들에 한정되지 않는, 외인성 항원과 인큐베이션된 재조합 보체 성분의, 네오에피토프를 노출시키거나 이를 노출시키지 않을 수 있는 절단 또는 절단의 부재를 검출함으로써 평가될 수 있다. 적합한 재조합체 보체 성분의 절단 또는 절단의 부재는 예를 들어, 크로마토그래피, 겔 전기영동, ELISA 및 웨스턴 블롯팅을 포함하나 이들에 한정되지 않는 해당 분야에 알려져 있는 단백질 분석 방법에 의해 평가될 수 있다. 외인성 항원 활성을 위한 적합한 생체내 검정은 동물, 예를 들어, 마우스 내로의 외인성 항원-발현 EHC의 주사 및 조직 염색에 의한 보체 인자, 예를 들어, 막 공격 복합체의 침적의 시험을 포함한다.

일 구현예에서, 외인성 항원은 표적에 결합하거나 이를 포획할 수 있으며, 외인성 항원의 활성은 외인성 항원 상의 포획된 표적을 시험관내 또는 생체내에서 검출함으로써 평가될 수 있다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC를 시험관내에서 표적과 인큐베이션시키고, 외인성 항원에 의한 표적의 포획은 예를 들어, 유세포계수법, 면역조직화학, 자기 분리, 라디오그래피, 콜로니-형성 검정, 현미경 관찰을 포함하나 이들에 한정되지 않는 시험관내 검정을 사용하여 검출된다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC를 시험관내에서 표적과 인큐베이션시키고, 외인성 항원에 의한 표적의 포획은 예를 들어, 옵소닌 처리 외인성 항원-발현 EHC의 대식구 소모 검정, T 세포 활성화 검정, B 세포 자극 검정, 비만 세포 탈과립화 검정, 감염력 검정을 포함하나 이들에 한정되지 않는 시험관내 동시-배양 검정을 사용하여 검출된다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC를 시험관내에서 표적과 인큐베이션시키고, 포획된 표적의 방출 또는 오프-속도(off-rate)를 예를 들어, 유세포계수법, 면역조직화학, 자기 분리, 라디오그래피, 콜로니-형성 검정, 현미경 관찰을 포함하나 이들에 한정되지 않는 시험관내 검정을 사용하여 측정한다.

외인성 항원-발현 EHC에 의한 표적의 포획은 예를 들어, 표적이 마우스에 천연적으로 존재하는 마우스 질병 모델을 포함하는 동물에서 생체내 검정에서 검정될 수 있다. 적합한 질병은 박테리아 감염, 바이러스 감염, 진균 감염, 면역 복합체 질병, 자가-항체 질병, 고지질혈증, 고혈당증을 포함한다. 다른 마우스 모델에서, 표적은 예를 들어, 주사에 의해 또는 급식에 의해 마우스에게 외부적으로 투여된다. 이들 검정에서, 외인성 항원-발현 EHC에 의한 표적의 포획은 표적의 감소 또는 보유에 대하여 동물, 예를 들어, 혈장, 조직을 시험하거나, 동물로부터, 예를 들어, 혈액으로부터, 혈장으로부터, 조직으로부터 외인성 항원-발현 EHC를 단리하거나 수집하고, 예를 들어, 유세포계수법, 면역조직화학, 자기 분리, 라디오그래피, 콜로니-형성 검정, 현미경 관찰을 포함하나 이들에 한정되지 않는 시험관내 검정을 사용하여 외인성 항원상의 표적의 존재를 검정함으로써 검정된다.

일부 구현예에서, 외인성 항원은 표적에 결합하거나 표적을 포획할 수 있고, 생체내에서 표적의 제거를 실질적으로 증가시키거나, 순환 중 표적의 농도를 실질적으로 감소시킬 수 있다. 외인성 항원-발현 EHC 상의 외인성 항원의 활성은 시험관내 또는 생체내에서 표적의 증가된 제거를 검출함으로써 평가될 수 있다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC를 시험관내에서 표적과 인큐베이션시키고, 외인성 항원에 의한 표적의 포획은 예를 들어, 유세포계수법, 면역조직화학, 자기 분리, 라디오그래피, 콜로니-형성 검정, 현미경 관찰을 포함하나 이들에 한정되지 않는 시험관내 검정을 사용하여 검출된다. 이후에, 외인성 항원-발현 EHC를 동시-배양 검정에서 제거를 증진시키는 것으로 알려져 있는 세포, 예를 들어, 대식구 또는 단핵구와 인큐베이션시키고, 표적 및 외인성 항원-발현 EHC의 제거는 예를 들어, 유세포계수법, 면역조직화학, 자기 분리, 라디오그래피, 콜로니-형성 검정, 현미경 관찰에 의해 평가된다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC를 시험관내에서 표적과 인큐베이션시키고, 외인성 항원에 의한 표적의 포획은 예를 들어, 유세포계수법, 면역조직화학, 자기 분리, 라디오그래피, 콜로니-형성 검정, 현미경 관찰을 포함하나 이들에 한정되지 않는 시험관내 검정을 사용하여 검출된다. 이후에, 외인성 항원-발현 EHC를 생체내 EHC의 제거 메커니즘을 모방하는 물리적 시스템, 예를 들어, 인공 비장, 마이크로채널, 팩킹된 컬럼, 수지, 조직 외식편, 원심분리기에서 인큐베이션시키고, 표적 및 외인성 항원-발현 EHC의 제거는 예를 들어, 유세포계수법, 면역조직화학, 자기 분리, 라디오그래피, 콜로니-형성 검정, 현미경 관찰에 의해 평가된다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC에 의한 표적의 제거는 예를 들어, 표적이 마우스에 천연적으로 존재하는 마우스 질병 모델, 예를 들어, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 진균 감염, 면역 복합체 질병, 자가-항체 질병, 고지질혈증, 고혈당증을 포함하는 동물 또는 예를 들어, 표적이 예를 들어, 주사에 의해 또는 급식에 의해 외부적으로 마우스에게 투여되는 마우스 모델에서 생체내 검정에서 검정된다. 이들 검정에서, 외인성 항원-발현 EHC에 의한 표적의 제거는 표적의 감소에 대하여 동물, 예를 들어, 혈장, 조직을 시험하거나, 또는 동물로부터, 예를 들어, 혈액으로부터, 혈장으로부터, 조직으로부터 외인성 항원-발현 EHC를 단리하거나 수집하고, 예를 들어, 유세포계수법, 면역조직화학, 자기 분리, 라디오그래피, 콜로니-형성 검정, 현미경 관찰을 포함하나 이들에 한정되지 않는 시험관내 검정을 사용하여 외인성 항원상의 표적의 존재를 검정함으로써 검정된다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 적합한 외인성 항원을 특정 하위세포 구획, 예를 들어, 리소좀으로 전달할 수 있다.

예를 들어, 외인성 항원은 표적 세포, 예를 들어, 대식구의 리소좀 구획으로 전달될 수 있다. 표적 세포의 리소좀 구획으로의 외인성 항원의 성공적인 전달은 현미경 관찰 및 형광 외인성 항원 또는 형광 외인성 항원 검출 작용제에 상응하는 반점 스폿(punctate spot)의 검출에 의해 평가된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 표적 세포의 리소좀 구획으로의 외인성 항원의 성공적인 전달은 현미경 관찰 및 형광 외인성 항원 검출 작용제와 알려져 있는 리소좀 마커, 예를 들어, lysotracker, LAMP-1에 대한 형광 검출 작용제의 동시국소화에 의해 평가된다.

일부 구현예에서, 외인성 항원은 리소좀 축적병의 유전자형 또는 표현형을 나타내거나, 리소좀 축적병이 있는 환자로부터 유래된 세포의 리소좀에서 축적되는 독성 성분을 분해할 수 있는 효소이다. 예를 들어, 외인성 항원은 세포에 축적되는 독성 물질을 분해할 수 있고, 세포 표현형을 구제하여, 예를 들어, 세포사를 방지한다.

외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 EHC의 복제 불능, 혈관구조를 통한 안전한 EHC의 순환 능력 및 EHC의 면역원성의 결여에 대하여 평가될 수 있다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단의 안전성은 적합한 시험관내 또는 생체내 검정을 사용하여 EHC의 모집단의 복제력을 측정함으로써 평가된다. 예를 들어, 외인성 항원-발현 EHC의 실질적인 자가-복제 불능에 대한 시험은 a) 면역약화 마우스로 주사되는 경우 실질적인 종양 형성 불능; b) 연한천에서 배양되는 경우 실질적인 콜로니 형성 불능; c) 티미딘 혼입 검정에서 실질적인 티미딘 혼입 불능; d) 형광 리포터를 인코딩하는 DNA로 트랜스펙션시에 양성 신호의 실질적인 결여, 예를 들어, 10% 미만, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 1 ppm, 100 ppb, 10 ppb, 1 ppb, 100 ppt, 10 ppt, 1 ppt 또는 1 ppt 미만의 양성 신호; e) 핵 염료로의 염색시에 실질적인 양성 신호의 결여, 예를 들어, 10% 미만, 1%, 0.1%, 0.01%; 및 0.001%, 1 ppm, 100 ppb, 10 ppb, 1 ppb, 100 ppt, 10 ppt, 1 ppt 또는 1 ppt 미만의 양성 신호; f) 혈액 악성종양의 세포 마커, 예를 들어, CKIT, CD34, EpCam로의 염색 시에 실질적인 양성 신호의 결여, 예를 들어, 10% 미만, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 1 ppm, 100 ppb, 10 ppb, 1 ppb, 100 ppt, 10 ppt, 1 ppt 또는 1 ppt 미만의 양성 신호를 포함한다. 특정 구현예에서, 상당한 양의 복제성 핵산을 함유하지 않는 외인성 항원-발현 EHC가 제공된다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단의 안전성은 투여되는 EHC가 실질적인 혈관 폐색 유발 또는 응고 캐스케이드의 유도 없이 생체내에서(대상체의 순환계에서) 순환하는 능력을 측정함으로써 평가된다. 임의로, 외인성 항원-발현 EHC의 순환 약동학이 평가될 수 있다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 순환 약동학은 동물, 예를 들어, 마우스 내로 EHC를 정맥내 주사함으로써 평가된다. 마우스는 NSG(nod-SCID-감마) 면역결핍 마우스일 수 있다. 마우스는 EHC로의 주사 이전에 예를 들어, 인간 적혈구의 복강내 주사에 의해, 또는 클로드로네이트 리포솜의 정맥내 주사에 의해 대식구가 고갈된다. 외인성 항원-발현 EHC는 형광 염료, 예를 들어, CFSE로 표지될 수 있다. EHC의 주사 후에, 채혈하고, 남아 있는 외인성 항원-발현 EHC의 수를 예를 들어, 유세포계수법, 웨스턴 블롯에 의해 평가하고, 외인성 항원-발현 EHC의 제거율을 이들 데이터로부터 추론한다. 인간 적혈구를 외인성 항원-발현 EHC와 동일한 동물 모델 내로 주사할 수 있으며, EHC 및 인간 적혈구의 제거율을 비교한다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC에 의한 응고 캐스케이드의 활성화 위험은 시험관내 검정으로 평가된다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC를 인간 혈액과 인큐베이션시키고, 응고 캐스케이드 활성화를 카올린, 음으로 하전된 인지질 및 칼슘의 존재하에 응고에 필요한 시간을 측정함으로써(활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 시험)(예를 들어, 문헌[Exner and Rickard, Biomedicine 1977 27(2):62] 참조), 또는 트롬보플라스틴 및 칼슘의 존재하에 응고에 필요한 시간을 측정함으로써(프로트롬빈 시간(PT) 시험)(예를 들어, 문헌[Jaques and Dunlop 1945, Am J Physiol 145:67] 참조) 평가한다. aPTT 시험에 대한 정상 범위는 대략 25 내지 38초이다. PT 시험에 대한 정상 범위는 대략 10 내지 12초이다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC에 의해 유도되는 임의의 유해 사례는 동물 내로 EHC를 정맥내 주사하고, 응고 캐스케이드의 활성화를 평가함으로써 평가된다. 응고 캐스케이드 유도의 수준은 채혈하고, 예를 들어, 웨스턴 블롯 또는 ELISA에 의해 혈장 중 응고 캐스케이드 성분의 수준을 평가함으로써 평가된다. 응고 캐스케이드 성분은 전형적으로 피브리노겐 분해 산물, 예를 들어, 피브리노펩티드 A 및 피브리노펩티드 B이다. 예를 들어, 응고 캐스케이드 유도의 수준은 채혈하고, 혈소판 활성화 검정, 예를 들어, 혈장과 혈소판을 인큐베이션시키고, 유세포계수법, 예를 들어, 활성화의 마커에 대한 염색에 의해, 예를 들어, PAC-1, CD62p 또는 CD40L에 대한 염색에 의해 혈소판의 활성화를 평가하여, 혈장 중 응고 활성의 수준을 평가함으로써 평가된다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC에 의해 유도되는 임의의 유해 사례는 동물 내로 EHC를 정맥내 주사하고, 염증 경로의 활성화를 평가함으로써 평가된다. 염증의 수준은 채혈하고, 예를 들어, 웨스턴 블롯 또는 ELISA에 의해 혈장 중 염증성 사이토카인의 수준을 평가함으로써 평가될 수 있다. 일 구현예에서, 염증성 사이토카인은 인터페론 감마, 종양 괴사 인자 알파 또는 IL-12 단편 p70이다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC에 의해 유도되는 임의의 유해 사례는 동물 내로 EHC를 정맥내 주사하고, 조직, 예를 들어, 간, 비장, 심장, 폐, 뇌, 피부, 신장의 상태를 평가함으로써 평가된다. 조직의 상태는 전체 부검, 조직의 해부, 조직학적 염색 및 현미경 관찰에 의한 영상화에 의해 평가될 수 있다.

일 구현예에서, 실질적인 혈관 폐색 유발 또는 응고 캐스케이드의 활성화 없이 생체내에서 순환하는 외인성 항원-발현 EHC의 능력은 EHC의 변형성을 측정함으로써 평가된다. 외인성 항원-발현 EHC의 변형성은 시험관내 검정을 사용하여 평가된다. 예를 들어, 검정은 삼투 취약성 검정이다. 외인성 항원-발현 EHC의 기계적 취약성은 쿠에트(Couett)-형 전단 시스템에서 전단 응력에 반응하는 구조적 무결성을 측정함으로써 평가될 수 있다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 변형성은 엑타사이토미터를 사용하여 평가된다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 변형성은 정의된 압력에서, 레이저-보조 광학 회전 세포 분석기(LORCA) 기기를 사용하여 레이저 회절에 의해 신장 지수를 측정함으로써 평가된다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 변형성은 미세유체 장치에서, 고정된 압력에서, 정의된 치수의 일련의 미크론-규모 수축부를 통한 이동 시간을 측정함으로써 평가된다. 일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 변형성은 미세유체 장치에서, 고정된 압력에서, 정의된 치수의 일련의 미크론-규모 수축부를 통한 생존율을 측정함으로써 평가된다. 미세유체 장치는 미크론-규모 수축부가 있는 폴리 디메틸 실록산(PDMS) 칩(예를 들어, 문헌[Hoelzle et al. J Vis Exp 2014 91:e51474]); 깔대기 형상 수축부가 있는 칩(예를 들어, 문헌[Guo et al. Lab Chip 2012 12:1143]); 필러(pillar)가 있는 PDMS 칩(예를 들어, 문헌[Zhang et al. PNAS 2012 109(46):18707]); 또는 시험관내 인공 비장 마이크로비드 팩킹된 컬럼(문헌[Guillaume DePlaine et al., Blood 2011, 117(8)])을 포함하나 이들에 한정되지 않는 것들 중 하나로부터 선택될 수 있다.

일 구현예에서, 실질적인 혈관 폐색 유발 또는 응고 캐스케이드의 활성화 없이 생체내에서 순환하는 외인성 항원-발현 EHC의 능력은 EHC의 혈관 폐색을 측정함으로써 평가된다. 외인성 항원-발현 EHC의 혈관 폐색은 시험관내 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 외인성 항원-발현 EHC의 혈관 폐색은 생체외 검정을 사용하여 평가된다. 외인성 항원-발현 EHC는 참조 인간 적혈구와 1:1 비로 인큐베이션되고, 다중-세포 로제트의 유도는 Rh-불일치 혈액을 사용한 참조 검정과 비교하여 광학 현미경에 의해 평가된다. 외인성 항원-발현 EHC의 혈관 폐색은 유동 조건하에 인간 혈관 내피 세포로의 EHC의 부착을 측정함으로써 평가되며, 예를 들어, 문헌[Kaul DK, Finnegan E, and Barabino GA (2009) Microcirculation 16(1):97-111]을 참조한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 혈관 폐색은 랫트 혈관 내피의 생체외 관류 검정에서 말초 저항 단위(PRU) 증가를 측정함으로써 평가되며, 예를 들어, 문헌[Kaul, Fabry and Nagel, PNAS 1989, 86:3356]을 참조한다. 추가로, 혈관 폐색은 생체 현미경에 의해 평가되며, 예를 들어, 문헌[Zennadi et al. 2007 Blood 110(7):2708]을 참조한다. 또한, 혈관 폐색은 시험관내 눈금이 매겨진 높이 유동 챔버에서 유속 및 EHC의 부착을 측정함으로써 평가될 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Zennadi et al 2004, Blood 104(12):3774]을 참조한다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단의 안전성은 적합한 시험관내 또는 생체내 검정을 사용하여 EHC의 모집단의 면역원성을 측정함으로써 평가된다.

예를 들어, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 a) 의도된 수여 대상체로부터의 혈청을 사용하여 쿰스 검정에서 응집을 유도하지 않거나, b) 풀링된 인간 혈청을 사용하여 쿰스 검정에서 응집을 유도하지 않는다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 우세한 혈액형 항원에 대하여 유전자형 분석되고, 수여자의 혈액형 항원 유전자형에 일치되는 전구 세포로부터 유래된다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 인 실리코(in silico) T 세포 에피토프 예측 알고리즘에 의하여 10% 미만, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001% 또는 0.001% 미만의 예측된 T 세포 반응성을 갖는 외인성 항원 또는 다른 외인성 단백질을 포함한다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 시험관내 T 세포 활성화 검정, 예를 들어, Antitope Inc. EpiScreen 검정에서 10% 미만, 1%, 0.1%, 0.01%, 0.001% 또는 0.001% 미만의 반응성을 갖는 외인성 항원 또는 다른 외인성 단백질을 포함한다.

예를 들어, 적혈구로부터 유래된 외인성 항원-발현 EHC는 원심분리되고, 그를 필요로 하는 대상체로의 주입을 위하여 적절한 용액(예를 들어, 표준 AS-3 용액)에 재현탁화될 수 있다. 일 구현예에서, 주입될 외인성 항원-발현 EHC는 주입-관련 면역 반응의 위험을 최소화시키기 위하여, 수여자의 것과 동일한 ABO형을 갖는다. 또한, 외인성 항원-발현 EHC를 전처리하여, 혈액형-특이적 항원을 제거하거나, 다르게는 항원성을 감소시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 방법은 미국 특허 출원 공개 제20010006772호 및 제20030207247호에 기재된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

치료적 조성물

효과적인 수준의 관심 외인성 항원을 갖는 EHC를 함유하는 조성물이 제공된다. 그러한 조성물은 복수의 EHC, 예를 들어, 1x10³개 세포 또는 1x10⁴, 1x10⁵, 1x10⁶, 1x10⁷, 1x10⁸, 1x10⁹, 1x10¹⁰, 1x10¹¹, 1x10¹² 또는 1x10¹²개 초과의 세포를 함유한다. 본 발명의 EHC는 예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 90% 초과의 질량 대 부피 비(m/v%)의 농도로 염수 용액 중 팩킹된 적혈구로서 투여될 수 있다. 환자로의 투여 시간은 10분 내지 4시간 이상의 범위일 수 있다.

본 발명의 배양된 EHC는 적절한 완충제, 예를 들어, FDA-승인 항응고 보존 용액, 예를 들어, 항응고 시트레이트-덱스트로스 A(ACD-A), 시트레이트-포스페이트 덱스트로스(CPD), 시트레이트포스페이트-덱스트로스-덱스트로스(CP2D) 또는 시트레이트-포스페이트-덱스트로스-아데닌(CPDA-1)에 보관될 수 있다. 조성물은 최대 21일 동안 보관될 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 배양된 EHC는 승인된 첨가 용액, 예를 들어, AS-1(Adsol), AS-3(Nutricel), AS-5(Optisol) 또는 AS-7(SOLX)에 보관될 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 배양된 EHC는 글리세롤 동결보호 용액에 보관될 수 있다. 조성물은 동결되고 최대 10년 동안 보관될 수 있다. 동결된 세포는 해동되고, 예를 들어, 사용 전에 0.9% 염화나트륨을 사용한 연속 세척 단계에 의해 글리세롤이 제거될 수 있다.

인간 및 쥣과 적혈구의 수명(각각 120일 및 50일(예를 들어, 문헌[Khandelwal et al., Transfusion 2007] 참조))을 고려하여, 인위적인 적혈구 노화를 자극하여, 항원 제시 세포에 의한 식세포작용을 증가시키는 것이 유리할 수 있다. 순환으로부터 적혈구 제거의 가장 중요한 생리적인 메커니즘은 RBC 세포 표면상의 신규한 항원 부위의 노출, 예를 들어, 각각 칼슘 이오노포어 또는 BS3 화학적 처리로 인공적으로 유도되는 포스파티딜세린 외재화(문헌[Schroit et al., J Biol Chem 1985]) 또는 밴드 3 단백질 클러스터링(문헌[Kay, PNAS 1975]; 문헌[Turrini et al., J Biol Chem 1991]) 후에 면역-매개된다(문헌[Singer et al., PNAS 1986]).

본 발명의 배양된 EHC는 식세포작용-유도제, 예를 들어, 칼슘 이오노포어 또는 BS3으로 처리될 수 있다. 본 발명의 복수의 배양된 EHC는 상이한 기간 동안 식세포작용-유도제, 예를 들어, 칼슘 이오노포어 또는 BS3으로 처리되어, 대상체로 투여시, 본 발명의 복수의 배양된 EHC가 상이한 비로, 예를 들어, 볼루스보다는 1일 또는 수일의 과정에 걸쳐 지속적으로 식세포작용되게 한 EHC를 포함할 수 있다.

관심 외인성 항원을 포함하는 복수의 배양된 EHC를 포함하는 조성물 및 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 조성물 및 약제학적 조성물은 적절한 보관 완충제, 예를 들어, 항응고 시트레이트-덱스트로스 A의 용액을 포함할 수 있다. 괸심 외인성 항원을 포함하는 복수의 배양된 EHC를 포함하는 조성물 및 약제학적 조성물은 추가로 승인된 첨가제, 예를 들어, Adsol을 포함할 수 있다. 관심 외인성 항원을 포함하는 복수의 배양된 EHC를 포함하는 조성물 및 약제학적 조성물은 추가로 동결 보관을 위한 글리세롤 동결보호 용액을 포함할 수 있다.

표 F, 표 G, 표 H, 표 I 및 표 J의 항원, 예를 들어, 수초 염기성 단백질, 단백지질 단백질, 수초 희소돌기아교세포 당단백질, 췌장 베타 세포 항원, 인슐린, 플라젤린, 글루텐, 2S 알부민, 히알루로니다제, 인자 VIII, 인자 IX 및 항-TNFa, 아데노신 데아미나제, L-아스파라기나제, 라스부리카제(rasburicase), 항흉선세포 글로불린, L-아르기나제, L-메티오나제, 프레프로인슐린, 프로인슐린, 인슐린, GAD65, GAD67, IA-2, IA-2β, 티로글로불린, 갑상선 퍼옥시다제, 갑상선 자극 호르몬 수용체, 수초 희소돌기아교세포 당단백질, 단백지질 단백질, 콜라겐 II, 콜라겐 IV, 아세틸콜린 수용체, 기질 금속단백질 1 및 3, 분자 샤페론 열-충격 단백질 47, 피브릴린-1, PDGF 수용체 a, PDGF 수용체 β, 핵 단백질 SS-A, 콘아라킨(conarachin)(Ara h 1), 알레르겐 II(Ara h 2), 땅콩 응집소(Ara h 6), a-락트알부민(ALA), 락토트랜스페린, 글루테인, 저분자량 글루테인, a-글리아딘, γ-글리아딘, 호르데인(hordein), 세칼린(secalin), 아베닌(avenin) 및 그들의 조합 중 하나 이상으로부터 선택되는 관심 외인성 항원을 포함하는 EHC가 본원에 제공된다. 관심 외인성 항원을 포함하는 복수의 EHC는 조성물 또는 약제학적 조성물로서 제공될 수 있다.

임의로, 표 C의 내인성 적혈구계 단백질 중 하나에 융합된 표 F, 표 G, 표 H, 표 I 및 표 J의 하나 이상의 항원, 예를 들어, 수초 염기성 단백질, 단백지질 단백질, 수초 희소돌기아교세포 당단백질, 췌장 베타 세포 항원, 인슐린, 플라젤린, 글루텐, Ara h2, 2S 알부민, 히알루로니다제, 인자 VIII, 인자 IX 및 항-TNFa를 인코딩하는 발현 벡터가 본원에 제공된다.

대상체로의 투여에 적합한 외인성 항원-발현 EHC를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 약제학적 조성물은 일반적으로 외인성 항원-발현 EHC의 모집단 및 대상체로의 투여에 적합한 형태의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 부분적으로 투여되는 특정 조성물뿐 아니라 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단을 포함하는 매우 다양한 약제학적 조성물의 적합한 제형이 존재한다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18th ed. (1990)] 참조). 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균, 실질적으로 등장성으로 제형화되며, 미국 식품의약국의 모든 우수 의약품 제조 관리(GMP) 규정을 완전히 준수한다.

약제학적으로 허용되는 부형제는 수의학 용도뿐 아니라, 인간 약제 용도를 위하여 허용되는 부형제를 포함하는 일반적으로, 안전하고, 비독성이고, 바람직한 부형제를 포함한다. 그러한 부형제는 고체, 액체, 반고체 또는 에어로졸 조성물의 경우에 기체상일 수 있다.

담체 또는 희석제의 예는 물, 염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 5% 인간 혈청 알부민을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 약제학적 활성 물질을 위한 그러한 매질 및 화합물의 이용은 해당 분야에 널리 알려져 있다. 임의의 통상의 매질 또는 화합물은 본원에 기재된 외인성 항원-발현 EHC와 비상용성인 것을 제외하고, 조성물에서 그의 이용이 고려된다. 또한, 보충 치료제도 조성물 내로 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 적합하도록 제형화된다. 외인성 항원-발현 EHC는 비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 피내, 경피, 직장, 두개내, 복강내, 비강내; 근육내 경로에 의해 또는 흡입제로서 투여될 수 있다. 외인성 항원-발현 EHC는 임의로 외인성 항원-발현 EHC가 의도되는 질병, 장애 또는 질환을 치료하는데 적어도 부분적으로 효과적인 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다.

비경구, 피내 또는 피하 응용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기의 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어, 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항균 화합물, 예를 들어, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산 또는 소듐 비설피트; 킬레이트화 화합물, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA); 완충제, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성의 조정을 위한 화합물, 예를 들어, 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예를 들어, 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 앰풀, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이얼에 동봉될 수 있다.

주사가능한 이용에 적합한 약제학적 조성물은 무균 수용액(수용성인 경우에) 또는 분산액, 그리고 무균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균 분말을 포함할 수 있다. 정맥내 투여의 경우에, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균성 물, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, N.J.) 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 사례에서, 조성물은 무균이어야 하고, 그리고 용이한 주사가능성이 존재하는 정도까지 유체이어야 한다. 그것은 제조와 보관의 조건하에 안정되어야 하고, 그리고 미생물, 예를 들면, 박테리아와 진균류의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 담체는 예로서, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그리고 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예로서, 코팅, 예를 들면, 레시틴의 이용에 의해, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균 화합물, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 화합물, 예를 들면, 당, 다가 알코올, 예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 화합물, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 내에 포함함으로써 달성될 수 있다.

무균 주사가능 용액은 외인성 항원-발현 EHC를 필요에 따라 본원에서 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에서 유효량으로 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 외인성 항원-발현 EHC를 기본 분산 매질 및 임의의 요망되는 다른 성분을 함유하는 무균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조된다. 무균 주사가능 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조인데, 이것은 이전에 무균-여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가 요망되는 성분의 분말을 산출한다. 외인성 항원-발현 EHC는 외인성 항원-발현 EHC, 그들의 외인성 항원(들) 및/또는 그들의 임의의 페이로드(들)의 지속적인 또는 박동성 방출을 가능하게 하는 방식으로 제형화될 수 있는 데포 주사제 또는 임플란트 제제의 형태로 투여될 수 있다.

경구 조성물은 일반적으로, 비활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 그들은 젤라틴 캡슐에 동봉되거나 또는 정제 내로 압축될 수 있다. 경구 치료적 투여의 목적으로, 외인성 항원-발현 EHC는 부형제와 함께 혼입되고, 정제, 트로키제, 또는 캡슐의 형태로 이용될 수 있다. 경구 조성물은 또한, 구강세척제로 이용하기 위하여 유체 담체를 이용하여 제조될 수 있고, 여기서 유체 담체내 화합물은 경구로 적용되며, 헹구고, 뱉거나 삼킨다. 약제학적으로 양립가능한 결합 화합물 및/또는 애쥬번트 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키제 등은 다음 성분, 또는 유사한 성격의 화합물 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 결합제, 예를 들면, 미정질 셀룰로스, 트래거캔스 검 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들면, 전분 또는 락토스; 붕해 화합물, 예를 들면, 알긴산, 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들면, 스테아르산마그네슘 또는 스테로테스(Sterotes); 활택제, 예를 들면, 콜로이드성 이산화규소; 감미 화합물, 예를 들면, 수크로스 또는 사카린; 또는 풍미 화합물, 예를 들면, 박하, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 풍미.

흡입에 의한 투여의 경우, 외인성 항원-발현 EHC는 적합한 추진제, 예를 들어, 기체, 예를 들어, 이산화탄소를 함유하는 압력 용기 또는 디스펜서, 또는 네불라이저(nebulizer)로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다.

외인성 항원-발현 EHC를 포함하는 조성물의 전신 투여는 또한, 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과되어야 하는 장벽에 적절한 투과제가 제형에 이용된다. 그러한 투과제는 일반적으로 해당 분야에서 공지되어 있고, 그리고 예를 들어, 경점막 투여의 경우에, 세제, 담즙산염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 이용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여의 경우에, 변형된 적혈구는 당업계에 일반적으로 알려져 있는 바와 같이 연고, 고약, 겔, 또는 크림으로 제형화된다.

외인성 항원-발현 EHC는 또한, 직장 전달을 위한 좌제(예를 들어, 코코아 버터 및 다른 글리세리드와 같은 통상의 좌제 기제 사용) 또는 정체 관장의 형태의 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다.

일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 외인성 항원-발현 EHC가 대상체의 신체로부터 제거되는 속도를 감소시킬 담체를 사용하여 제조된다. 예를 들어, 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 조절 방출형 제형이 적합하다. 생분해성, 생체적합성 폴리머, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드(polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 그러한 제형의 제조 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 물질은 Alza Corporation 및 Nova Pharmaceuticals, Inc.로부터 상업적으로 수득될 수 있다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC를 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적 조성물로 이익을 얻을 대상체에게 정맥내 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 림프계로, 예를 들어, 림프내(intralymphatic) 주사에 의해 또는 림프절내 주사에 의해(예를 들어, 문헌[Senti et al., 2008 PNAS 105(46):17908] 참조), 또는 근육내 주사에 의해, 피하 투여에 의해, 흉선으로의 또는 간으로의 직접적인 주사에 의해 투여된다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC를 포함하는 약제학적 조성물은 액체 현탁액으로서 투여된다. 일 구현예에서, 약제학적 조성물은 투여 후에 데포(depot)를 형성할 수 있는 응고 제형으로서 투여되며, 바람직한 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC를 순환으로 서서히 방출시키거나, 바람직한 구현예에서, 데포 형태에 남아 있다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC를 포함하는 약제학적 조성물은 외인성 항원-발현 EHC의 생존력을 유지할 수 있는 방법 및 완충 조성물을 사용하여 보관된다. 예를 들어, 보관 이전 무산소 상태를 유지하기 위한 탈산소화, pH의 조작, 대사 전구체의 보충, 삼투 균형의 조작, 현탁화 매질의 부피의 증가 및/또는 보호 분자의 첨가에 의한 산화 스트레스의 감소를 사용하여 외인성 항원-발현 EHC의 생존력을 유지시킬 수 있다. 이들 전략의 조합을 사용한 몇몇의 연구에서는 6주를 초과하는 보관의 연장을 가능하게 하는 적혈구의 생존력의 유지를 보고하였다(예를 들어, 문헌[Yoshida and Shevkoplyas, Blood Transfus 2010 8:220] 참조).

약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 사용하여 본원에 기재된 외인성 항원-발현 EHC를 전달할 수 있다. 부형제는 희석제 또는 비히클로 사용되는 비활성 물질을 말한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로, 화합물을 요법 또는 제품에 유용하게 만들기 위하여 화합물과 함께 사용된다. 일반적으로, 임의의 물질에 대하여, 약제학적으로 허용되는 담체는, 대상체로의 전달을 위해 물질과 배합되는 재료이다. 통상의 약제학적 담체, 수성, 분말, 또는 유성 기제, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 일부 경우에, 담체는, 전달에 필수적이며, 예를 들어, 액체 전달을 위해 불용성 화합물을 가용화하거나; 활성을 유지하기 위해 물질의 pH를 제어하기 위한 완충제; 또는 보관 용기 내 물질의 소실을 막기 위한 희석제이다. 그러나 다른 경우, 담체는 편의상 예를 들어, 보다 편리한 투여를 위한 액체이다. 당업자에게 알려져 있는 방법에 따라, 본원에 기재된 화합물의 약제학적으로 허용되는 염을 합성할 수 있다.

전형적으로, 약제학적으로 허용되는 조성물은, 오염물이 없도록 고도로 정제되고, 생체 적합성이며 독성이 없고, 대상체에게 투여하는데 적합하다. 물이 담체의 구성성분인 경우, 물을 고도로 정제하고, 오염물, 예를 들어, 내독소가 없도록 처리한다.

약제학적으로 허용되는 담체는 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 인산칼슘, 알긴산염, 젤라틴, 규산칼슘, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘 및/또는 광유일 수 있다. 약제학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미 증진제, 유화제, 현탁화제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.

효과적인 수준의 외인성 항원을 갖는 외인성 항원-발현 EHC를 함유하는 약제학적 조성물이 제공된다. 그러한 조성물은 복수의 외인성 항원-발현 EHC, 예를 들어, 1x10³개 EHC 또는 1x10⁴, 1x10⁵, 1x10⁶, 1x10⁷, 1x10⁸, 1x10⁹, 1x10¹⁰, 1x10¹¹, 1x10¹²개 또는 1x10¹²개 초과의 EHC를 함유한다. 구체적인 예에서, EHC로부터 생성된 외인성 항원-발현 EHC는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 90% 초과의 질량 대 부피 비(m/v%)의 농도로 염수 용액 중 팩킹된 적혈구로서 투여될 수 있다. 환자로의 투여 시간은 10분 내지 4시간 이상의 범위일 수 있다.

구체적인 예에서, EHC로부터 생성된 외인성 항원-발현 EHC는 적절한 완충제, 예를 들어, FDA-승인 항응고 보존 용액, 예를 들어, 항응고 시트레이트-덱스트로스 A(ACD-A), 시트레이트-포스페이트 덱스트로스(CPD), 시트레이트포스페이트-덱스트로스-덱스트로스(CP2D) 또는 시트레이트-포스페이트-덱스트로스-아데닌(CPDA-1)에 보관될 수 있다. 조성물은 최대 21일 동안 보관될 수 있다.

대안적으로, EHC로부터 생성된 외인성 항원-발현 EHC는 승인된 첨가 용액, 예를 들어, AS-1(Adsol), AS-3(Nutricel), AS-5(Optisol) 또는 AS-7(SOLX)에 보관될 수 있다.

대안적으로, EHC로부터 생성된 외인성 항원-발현 EHC는 글리세롤 동결보호 용액에 보관될 수 있다. 조성물은 동결되고 최대 10년 동안 보관될 수 있다. 동결된 세포는 해동되고, 예를 들어, 사용 전에 0.9% 염화나트륨을 사용한 연속 세척 단계에 의해 글리세롤이 제거될 수 있다.

외인성 항원을 포함하는 복수의 배양된 EHC를 포함하는 조성물 및 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 조성물 및 약제학적 조성물은 적절한 보관 완충제, 예를 들어, 항응고 시트레이트-덱스트로스 A의 용액을 포함할 수 있다. 외인성 항원을 포함하는 복수의 배양된 EHC를 포함하는 조성물 및 약제학적 조성물은 승인된 첨가제, 예를 들어, Adsol을 추가로 포함할 수 있다. 외인성 항원을 포함하는 복수의 배양된 EHC를 포함하는 조성물 및 약제학적 조성물은 추가로 동결 보관을 위한 글리세롤 동결보호 용액을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 다른 외인성 항원-발현 EHC와 다중-복합체 응집물, 예를 들어, 이량체, 삼량체, 다량체를 형성할 수 있다.

일 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 순환계의 성분, 예를 들어, 적혈구, 망상적혈구, 혈소판, 대식구, 림프구, T 세포, B 세포, 비만 세포와 다중-복합체 응집물, 예를 들어, 이량체, 삼량체, 다량체를 형성할 수 있다.

외인성 항원-발현 EHC 및 그의 약제학적 조성물의 투여량 및 투여 빈도는 다양한 인자, 예를 들어, 질병의 중증도, 환자의 연령, 성별 및 식이, 임의의 염증의 중증도, 투여 시간 및 다른 임상 인자에 기초하여 담당의에 의해 결정될 수 있다. 일 예에서, 정맥내 투여는 최소로 유효한 용량으로 개시되며, 용량은 양성 효과가 관찰될 때까지 사전-선택된 시간 경과에 걸쳐 증가된다. 이후에, 투여량의 증분식 증가는 나타날 수 있는 임의의 부작용을 고려하면서 상응하는 효과의 증가를 생성하는 수준으로 제한된다.

적합한 투여량의 비제한적인 예는 예를 들어, 1x10³ 내지 1x10¹⁴개, 1×10³ 내지 1×10⁷개, 1×10⁵ 내지 1×10⁶개, 1×10⁷ 내지 1×10¹¹개, 1×10⁸ 내지 1×10⁹개, 1×10¹⁰ 내지 1×10¹⁴개, 1×10¹¹ 내지 1×10¹³개 또는 5×10¹¹ 내지 5×10¹²개의 외인성 항원-발현 EHC의 범위일 수 있다. 구체적인 예는 약 1×10³, 2×10³, 3×10³, 4×10³, 5×10³, 6×10³, 7×10³, 8×10³, 9×10³, 1×10⁴, 2×10⁴, 3×10⁴, 4×10⁴, 5×10⁴, 6×10⁴, 7×10⁴, 8×10⁴, 9×10⁴, 1×10⁵, 2×10⁵, 3×10⁵, 4×10⁵, 5×10⁵, 6×10⁵, 7×10⁵, 8×10⁵, 9×10⁵, 1×10⁶, 2×10⁶, 3×10⁶, 4×10⁶, 5×10⁶, 6×10⁶, 7×10⁶, 8×10⁶, 9×10⁶, 1×10⁷, 2×10⁷, 3×10⁷, 4×10⁷, 5×10⁷, 6×10⁷, 7×10⁷, 8×10⁷, 9×10⁷, 1×10⁸, 2×10⁸, 3×10⁸, 4×10⁸, 5×10⁸, 6×10⁸, 7×10⁸, 8×10⁸, 9×10⁸, 1×10⁹, 2×10⁹, 3×10⁹, 4×10⁹, 5×10⁹, 6×10⁹, 7×10⁹, 8×10⁹, 9×10⁹, 1×10¹⁰, 2×10¹⁰, 3×10¹⁰, 4×10¹⁰, 5×10¹⁰, 6×10¹⁰, 7×10¹⁰, 8×10¹⁰, 9×10¹⁰, 1×10¹¹, 2×10¹¹, 3×10¹¹, 4×10¹¹, 5×10¹¹, 6×10¹¹, 7×10¹¹, 8×10¹¹, 9×10¹¹, 1×10¹²개 이상의 외인성 항원-발현 EHC를 포함한다. 각 용량의 외인성 항원-발현 EHC는 매일 1회, 주 1회, 주 2회, 개월마다 1회 또는 개월마다 2회와 같은 간격으로 투여될 수 있다. 각 EHC는 다양한 항원 분자, 예를 들어, 약 100 내지 10^7개 또는 약 10^3 내지 10^6개를 발현할 수 있다. 구체적인 예는 EHC마다 약 1000, 3000, 5000, 1x10^4, 3x10^4, 5x10^4, 1x10^5, 3x10^5, 5x10^5, 1x10^6, 3x10^6, 5x10^6, 1x10^7개 이상의 외인성 항원 분자를 포함한다.

"EHC-기반의 비례 투여량"은 순환하는 엔티티의 천연적으로 발생하는 양에 비한, 용량으로 투여되는 외인성 항원-발현 EHC의 개수이다. 순환 엔티티는 세포, 예를 들어, 적혈구, 망상적혈구 또는 림프구 또는 표적, 예를 들어, 항원, 항체, 바이러스, 독소, 사이토카인 등일 수 있다. 단위는 순환하는 엔티티마다 외인성 항원-발현 EHC, 즉, SCMRC/CE로 정의된다. 이러한 투여 단위는 10^-7, 10^-6, 10^-5, 10^-4, 10^-3, 10^-2, 10^-1, 1, 10, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹개를 포함할 수 있다.

본원에 기재된 약제학적 조성물은 외인성 항원-발현 EHC 및 임의로 약제학적 활성 또는 치료제를 포함한다. 치료제는 생물학적 작용제, 소분자 작용제 또는 핵산 작용제일 수 있다.

본원에 기재된 외인성 항원-발현 EHC를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 투여형이 제공된다. 일부 구현예에서, 투여형은 정맥내 주사를 위한 액체 현탁액으로 제형화된다.

본원에 기재된 외인성 항원-발현 EHC를 포함하는 약제학적 조성물을 보유하는 용기 및 약제학적 조성물을 대상체로 정맥내 주사하기 위한 애플리케이터를 포함하는 의료 장치가 제공된다.

본원에 기재된 외인성 항원-발현 EHC를 포함하는 약제학적 조성물 및 약제학적 조성물을 대상체로 정맥내 주사하기 위한 의료 장치를 포함하는 의료 키트가 제공된다.

외인성 항원-발현 EHC의 약제학적으로 허용되는 현탁액은 바람직하게는 대략 10 내지 대략 250 ㎖의 부피로 포장된다. 포장재는 주입에 적합한 주사기 또는 IV 백(bag)일 수 있다. 현탁액의 투여는 예를 들어, 임의로 IV 백으로부터의 점적 등을 사용하여 정맥내 또는 동맥내 주사에 의해 수행된다. 투여는 전형적으로 팔에서 정맥내로 또는 중심 카테터를 통해 수행된다. 50 ㎖ 초과의 투여에 있어서, 점적 이용이 바람직하다.

질병의 치료

면역 관용의 유도 방법이 제공된다. 당해 방법은 본원에 제공되는 관심 외인성 항원을 포함하는 적혈구 세포의 약제학적 조성물을 대상체에서 면역 관용을 유도하기에 충분한 양 및/또는 투여 빈도로 면역 관용의 유도를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 면역 관용을 촉진시키거나 증진시키는데 유용한 관심 외인성 항원을 포함하는 적혈구 세포를 제공한다. 면역 관용을 사용하여 면역 활성화와 관련된 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나, 이를 예방하거나, 이의 중증도를 감소시킬 수 있다.

면역 활성화의 질병은 자가면역 질병, 예를 들어, 다발경화증, 1형 당뇨병, 류마티스 관절염 및 막성 신장염 및 표 F에 열거된 것들을 포함한다. 면역 활성화의 질병은 또한, 염증성 질병, 예를 들어, 크론병, 궤양대장염, 셀리악병 또는 기타 특발성 염증성 장 질병 및 표 G에 열거된 것들을 포함한다. 면역 활성화의 질병은 또한, 알러지 질병, 예를 들어, 천식, 땅콩 알러지, 갑각류 알러지, 꽃가루 알러지, 유단백질 알러지, 곤충 자상 알러지 및 라텍스 알러지, 및 표 H에 열거된 것들을 포함한다. 또한, 면역 활성화의 질병은 치료 단백질, 예를 들어, 혈우병 A에서 응고 인자 VIII, 혈우병 B에서 응고 인자 IX, 류마티스 관절염 및 기타 염증성 질병에서 항-종양 괴사 인자 알파(TNFα) 항체, 고셰병에서 글루코세레브로시다제, 또는 급성 림프모구성 백혈병(ALL)에서 아스파라기나제, 및 표 I, 표 J, 표 5 및 표 7에 열거된 것들의 효능을 경감시키는, 일차 질환을 치료하기 위하여 투여되는 치료 단백질에 반응하는 면역 활성화를 포함한다.

면역 활성화 질병의 치료 방법이 추가로 제공된다. 당해 방법은 본원에 제공되는 관심 외인성 항원을 포함하는 적혈구 세포의 약제학적 조성물을 면역 활성화 질병을 치료하기에 충분한 양으로 치료의 유도를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 면역 활성화 질병, 예를 들어, 자가면역 질병, 염증성 질병 또는 알러지 질병에 걸렸거나, 그에 걸린 것으로 의심되는 대상체는 제공되는 치료 방법으로부터 이익을 얻을 것이다.

일부 구현예에서, 환자는 자가면역 질병 또는 질환 또는 자가-항체 매개의 질병 또는 질환을 앓고 있으며, 여기서, 환자의 면역계는 내인성 분자, 예를 들어, 단백질 항원에 대하여 활성이어서, 면역계가 내인성 분자를 공격하고, 염증을 유도하고, 조직을 손상시키고, 다르게는 자가면역 또는 자가-항체 질병 또는 질환의 증상을 야기하게 한다. 면역 반응은 내인성 분자에 결합하는 항체에 의해 유도되거나, 또는 그것은 내인성 분자를 발현하는 세포를 공격하는 과다활성 T 세포에 의해 유도되거나, 또는 그것은 다른 염증 세포, 예를 들어, 조절 T 세포, NK 세포, NKT 세포 또는 B 세포에 의해 유도될 수 있다. 이들 구현예에서, 항원 단백질 또는 그의 단편은 본 발명의 제핵 조혈 세포에서 발현될 수 있다. 이들 세포의 모집단은 질병 또는 질환을 앓고 있는 환자에게 1회 이상 투여되는 경우, 항원 단백질에 대한 관용을 유도하기에 충분하여, 그것이 더 이상 면역계의 활성화를 유도하지 않고, 이에 따라, 기저 질병 또는 질환의 증상을 치료하거나 개선시킬 것이다.

예를 들어, 후천성 혈전성 혈소판감소성 자반증(TTP)을 앓고 있는 환자는 비정상적인 자가-항체 매개의 질병을 가지며, 여기서, 항체가 내인성 ADAMTS13 단백질에 대하여 생성되어, 내인성 ADAMTS13 단백질이 그의 폰빌레브란트 인자-절단 활성을 수행하는데 무효하게 만들어, 이는 혈관구조의 도처에 미세혈전 형성과 그의 결과로 혈소판감소증을 초래한다. 이러한 구현예에서, ADAMTS13 항원을 제핵 조혈 세포상에서 발현시키고, ADAMTS13에 대하여 관용을 유도하기에 유효한 양으로 TTP를 앓고 있는 환자에게 투여하여, 이에 따라, 순환 중 억제성 항-ADAMTS13 자가-항체의 양을 감소시키고, 폰빌레브란트 인자를 절단하는 신체의 능력을 복구시키고, 이에 따라, 질병의 증상을 감소시킨다. 바람직한 구현예에서, ADAMTS13의 오직 항원 단편만이 제핵 조혈 세포상에서 발현된다. 바람직한 구현예에서, 전장 ADAMTS13이 제핵 조혈 세포상에서 발현된다. 바람직한 구현예에서, 전장 DAMTS13은 제핵 조혈 세포상에서 발현되며, 효소적으로 활성이어서, 투여되는 세포 생성물이 관용을 유도하면서, 폰빌레브란트 인자를 치료적으로 절단할 수 있게 한다.

다른 예에서, 비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS)을 앓고 있는 환자는 내인성 단백질 보체 인자 H(CFH)에 대한 비정상적인 자가-항체 반응을 가져, CFH가 그의 보체 조절 기능을 수행하는 것을 방지한다. 결과적으로, 보체 과다활성화가 혈관구조에서 발생하여, 정맥내 용혈을 야기한다. 이러한 구현예에서, CFH 항원을 제핵 조혈 세포상에서 발현시키고, CFH에 대한 관용을 유도하기에 유효한 양으로 aHUS를 앓고 있는 환자에게 투여하여, 이에 따라, 순환 중 억제성 항-CFH 자가-항체의 양을 감소시키고, 보체를 억제하는 신체의 능력을 복구시켜, 이에 따라 질병의 증상을 감소시킨다. 바람직한 구현예에서, CFH의 오직 항원 단편만이 제핵 조혈 세포상에서 발현된다. 바람직한 구현예에서, 전장 CFH가 제핵 조혈 세포상에서 발현된다. 바람직한 구현예에서, 전장 CFH가 제핵 조혈 세포상에서 발현되며, 치료적으로 활성이어서, 투여되는 세포 생성물이 관용을 유도하고, 보체 조절을 치료적으로 촉진시킬 수 있게 한다.

다른 예에서, 다발경화증(MS)을 앓고 있는 환자는 뉴런을 둘러싸는 폴리펩티드 수초에 대한 자가면역 반응을 갖는다. 결과적으로, T 세포는 수초를 공격하고, 생성된 염증은 신경 섬유의 탈수초화를 야기하며, 신경을 따라 전기 신호를 보내는 능력을 손상시켜, 다발경화증의 증상을 야기한다. 이러한 구현예에서, 수초 항원을 제핵 조혈 세포상에 발현시키고, 수초 항원에 대한 관용을 유도하기에 유효한 양으로 MS를 앓고 있는 환자에게 투여하여, 이에 따라, 항-수초 면역 반응을 감소시키고, 유수 신경 섬유에 전기 임펄스를 보내는 신체의 능력을 복구시켜, 이에 따라, 질병의 증상을 감소시킨다. 바람직한 구현예에서, 수초의 오직 하나 이상의 항원 단편이 제핵 조혈 세포상에서 발현된다. 바람직한 구현예에서, 전장 수초 단백질이 제핵 조혈 세포상에서 발현된다.

다른 예에서, 1형 당뇨병(T1D)을 앓고 있는 환자는 췌장의 베타섬 세포에 대한 자가면역 반응을 갖는다. 결과적으로, T 세포는 베타섬 세포를 사멸시켜, 췌장이 인슐린을 생성하고 분비하는 능력을 감소시키거나 제거하며, 이는 T1D의 증상 및 병적측면을 야기한다. 이러한 구현예에서, 베타 세포 항원을 제핵 조혈 세포 상에서 발현시키고, 베타 세포 항원에 대한 관용을 유도하기에 유효한 양으로 T1D를 앓고 있는 환자에게 투여하여, 이에 따라, 항-베타 세포 면역 반응을 감소시키고, 췌장이 인슐린을 생성하고 분비하는 능력을 복구시켜, 이에 따라, 질병의 증상을 감소시킨다. 바람직한 구현예에서, 베타 세포 항원의 오직 하나 이상의 항원 단편만이 제핵 조혈 세포상에서 발현된다. 바람직한 구현예에서, 전장 베타 세포 단백질이 제핵 조혈 세포상에서 발현된다.

치료적 단백질 치료 섭생법에 대한 반응에서 면역 활성화를 감소시키거나 완화시키는 방법이 추가로 제공된다. 당해 방법은 본원에 제공된 관심 외인성 항원을 포함하는 적혈구 세포의 약제학적 조성물을 치료적 단백질 치료 섭생법에 대한 반응에서의 면역 활성화를 감소시키거나 완화시키기에 충분한 양으로 치료적 단백질 치료 섭생법에 대한 반응에서의 면역 활성화의 감소 또는 완화를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 환자는 치료적 단백질이 질병 또는 질환의 증상을 치료하거나 개선시키기 위해 투여될 수 있지만, 치료적 단백질이 면역원성이어서, 환자가 치료적 단백질에 대한 면역 반응을 야기하게 하여, 그것이 원래의 질병을 치료하거나 개선시키는데 더 이상 효과적이지 않게 하는 질병 또는 질환을 앓고 있다. 예를 들어, 면역원성 치료적 단백질은 비-인간 공급원, 예를 들어, 소, 돼지 또는 비-인간 영장류로부터 또는 비-포유류 공급원, 예를 들어, 박테리아, 진균으로부터 유래되거나 또는 식물-유래이거나, 면역원성 치료적 단백질은 인간 공급원으로부터 유래될 수 있지만, 반복적인 노출 및 투여가 면역원성을 유도하기에 충분할 것이다. 면역 반응은 면역원성 치료적 단백질에 결합하고, 그의 기능을 억제하는 항체(중화 항체) 또는 면역원성 치료적 단백질에 결합하고, 다른 면역 세포에 의한 그의 제거를 촉발시키는 항체(옵소닌화 항체)에 의해 유도될 것이다. 이들 구현예에서, 면역원성 치료적 단백질 또는 그의 항원 단편은 본 발명의 제핵 조혈 세포상에서 발현될 수 있다. 이들 세포의 모집단은 질병을 앓고 있는 환자에게 1회 이상 투여되는 경우, 면역원성 치료적 단백질에 대한 관용을 유도하여, 그것이 더 이상 면역계에 의해 중화되거나 옵소닌화되지 않게 하기에 충분할 것이다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 제핵 조혈 세포의 표면상에 발현되는 면역원성 치료적 단백질은 순환 중 세포상에서 치료적으로 활성이어서, 세포 및 단백질의 조성물이 환자에게 투여되는 경우 관용을 유도하고, 기저 질병 또는 질환의 증상을 치료하거나 개선시킬 수 있게 한다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 제핵 조혈 세포의 표면상에 발현되는 면역원성 치료적 단백질의 항원 단편은 순환 중 세포상에서 치료적으로 활성이 아니어서, 세포 및 단백질의 조성물이 환자에게 투여되는 경우 관용을 유도할 수 있지만, 면역원성 치료적 단백질의 개별 제형을 투여하여, 기저 질병 또는 질환의 증상을 치료하거나 개선시킨다.

예를 들어, 혈우병 A를 앓고 있는 환자는 적절한 응고를 복구시키기 위하여 응고 인자 VIII(FVIII)의 주입을 필요로 한다. 그러나 많은 환자는 인간 유래임에도 불구하고, FVIII에 대한 중화 항체를 발생시키고, 이는 치료제를 무효하게 만들고, 생명을 위협하는 출혈의 위험을 야기한다. 일 구현예에서, 외인성 FVIII 발현 제핵 조혈 세포는 혈우병 A를 앓고 있는 환자에게 투여되어, (1) 순환하는 활성 FVIII의 수준이 증상을 개선시키고, 조절되지 않은 중증 출혈을 예방하는데 필요한 수준으로 복구시키고, (2) FVIII에 대하여 관용이 유도되게 한다.

다른 예에서, 류마티스 관절염을 앓고 있는 환자는 질병과 관련된 염증을 감소시키기 위해 항-TNFa 항체의 주사를 필요로 한다. 그러나 많은 환자는 항-TNFa 항체에 대한 중화 항체를 발생하며, 이는 치료적 항체를 무효하게 만든다. 이러한 예에서, 환자는 전형적으로 증상의 악화를 앓고 있고, 항-TNFa 항체의 용량을 증가시키거나, 상이한 코딩 아미노산 서열을 갖는 상이한 항-TNFa 항체로 전환시켜야 한다. 이러한 구현예에서, 항-TNFa의 항원 단편을 발현하는 제핵 조혈 세포를 항-TNFa 항체에 대한 중화 항체가 발생된 류마티스 관절염이 있는 환자에게 투여한다. 조성물을 항-TNFa 항체에 대한 관용을 유도하기에 충분한 용량으로 투여하여, 항-TNFa의 유효한 투여를 가능하게 하여, 순환하는 TNFa 수준을 감소시켜, 이에 따라, 환자에서 류마티스 관절염의 증상을 감소시킨다.

다른 예에서, 페닐케톤뇨증(PKU)을 앓고 있는 환자는 peg화 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL), 비-인간 효소로 치료된다. 환자는 PAL에 대한 옵소닌화 및 중화 항체를 발생시키며, 이는 치료적 단백질의 투여시에 알러지 반응을 유도한다. 이러한 면역 반응은 PAL을 무효하게 할 뿐 아니라, 환자의 건강을 위협한다. 일 구현예에서, 외인성 PAL을 발현하는 제핵 조혈 세포는 PAL에 대한 관용을 유도하기에 충분한 양으로 PKU를 앓고 있는 환자에게 투여된다. 바람직한 구현예에서, 세포-발현된 PAL은 세포상에서 활성이며, 조성물은 순환하는 페닐알라닌의 수준을 감소시키고, PAL에 대한 위험한 면역 반응을 예방하는 것에 더하여 페닐케톤뇨증의 증상을 치료하거나 개선시킬 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, PAL의 항원 단편은 제핵 조혈 세포상에서 발현되며, 이러한 세포-발현 단편은 치료적으로 활성이 아니어서, PAL의 개별 제형을 환자에게 투여하여, 페닐케톤뇨증의 증상을 치료하거나 개선시킨다. 관용-유도 세포 조성물은 PAL의 치료적 제형을 투여하기 이전에 투여되거나, 관용-유도 세포 조성물은 PAL의 치료적 제형의 투여와 동시에 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 환자는 알러지 질병, 예를 들어, 동물 비듬(animal dander), 블랙 월넛(black walnut), 브라질 넛(brazil nut), 캐슈넛(cashew nut), 밤, 먼지 진드기, 계란(egg), 서양 호두(english walnut), 어류, 개암(hazelnut), 곤충 독, 라텍스, 밀크(milk), 곰팡이(mold), 땅콩, 화분(pollen), 풀(grass), 갑각류, 콩, 견과류 또는 밀에 대한 알러지를 앓고 있다. 알러지를 앓고 있는 환자는 예를 들어, 식이, 피부 접촉, 주사 또는 환경 노출을 통하여 알러지원의 항원 단편과의 접촉시에 면역 반응을 시작할 수 있다. 면역 반응은 IgE 항체, 감작화 비만 세포, 탈과립, 히스타민 방출 및 아나필락시스, 및 T 세포, B 세포, 수지상 세포, T 조절 세포, NK 세포, 호중구 및 NKT 세포와 같은 정규 면역 세포를 수반할 수 있다. 알러지 반응은 불편을 야기하거나, 그것은 충분히 심각하여 사망을 야기할 수 있고, 이에 따라, 환자 및 그의 또는 그녀의 가족 및 간병인 측의 지속적인 경계를 필요로 한다. 이들 구현예에서, 항원 단백질 또는 그의 단편은 본 발명의 제핵 조혈 세포상에서 발현될 수 있다. 이들 세포의 모집단은 알러지 질병 또는 질환을 앓고 있는 환자에게 1회 이상 투여되는 경우, 항원 단백질에 대한 관용을 유도하여, 노출시에 더 이상 면역계의 활성화를 유도하지 않게 하기에 충분할 것이고, 이에 따라, 기저 알러지 질병 또는 질환의 증상을 치료하거나 개선시킬 것이다.

일 예에서, 땅콩 알러지를 앓고 있는 환자는 땅콩 항원 AraH1에 대한 노출 후에 면역 반응을 갖는다. 이러한 구현예에서, AraH1을 제핵 조혈 세포상에 발현시키고, AraH1 항원에 대한 관용을 유도하기에 유효한 양으로 땅콩 알러지를 앓고 있는 환자에게 투여하여, 이에 따라, 알러지 면역 반응을 감소시키고, 개체가 안전하게 땅콩을 섭취하는 능력을 복구시켜, 이에 따라, 질병의 증상을 감소시킨다. 바람직한 구현예에서, AraH1의 오직 하나 이상의 항원 단편이 제핵 조혈 세포상에 발현된다. 바람직한 구현예에서, 전장 AraH1 단백질이 제핵 조혈 세포상에 발현된다.

본 발명의 특정 양태는 인간 백혈구 항원(HLA) 불일치-매개의 질병, 예를 들어, 이식편대 숙주병 또는 기관 이식 거부에서 면역 세포에 의해 인식되는 항원을 포함하는 EHC에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 환자는 인간 백혈구 항원(HLA)-불일치의 질병 또는 질환을 앓고 있으며, 여기서, 면역 세포는 조직상의 HLA 항원에 대하여 활성화되며, 조직을 공격한다. 이것은 완벽히 일치되지 않는 공여자로부터의 기관 또는 조직의 동종이계 이식 후에 흔히 발생하며, 이식 거부의 의학적 질환을 야기하며, 여기서, 환자의 면역계는 외래 조직 또는 기관을 공격하고, 이식된 기관 또는 조직이 죽게 한다. 다른 흔한 HLA-불일치 질환은 이식편대숙주병(GVHD)이며, 환자는 완벽히 일치되지 않는 공여자로부터의 동종이계 골수 이식을 받고, 이식된 면역 세포(이식편)가 활성화되고, 외래로 인식되는 수여자 기관(숙주)을 공격하여, 숙주 조직 및 기관의 손상을 야기하고, 사망을 비롯한 심각한 결과를 야기한다. HLA-불일치 면역 활성화는 전형적으로 T 세포에 의해 매개되지만, 또한 T 조절 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 항체, 수지상 세포, 단핵구, 대식구 및 호중구도 또한 수반할 수 있다. 이들 구현예에서, 항원 HLA 분자 또는 그의 단편은 본 발명의 제핵 조혈 세포상에 발현될 수 있다. 이들 세포의 모집단은 HLA-불일치 질병 또는 질환을 앓고 있는 환자에게 1회 이상 투여되는 경우, 항원 HLA 분자에 대하여 관용을 유도하여, 그것이 더 이상 면역계의 활성화를 유도하지 않고, 이에 따라, 기저 HLA-불일치 질병 또는 질환의 증상을 치료하거나 개선시키기에, 예를 들어, 이식된 기관의 생존 또는 환자의 생존을 야기하기에 충분할 것이다. 바람직한 구현예에서, 세포의 표면상에 발현되는 HLA 분자는 또한 HLA 분자 내로 로딩된 펩티드를 함유한다.

본원에 기재된 방법을 위해 사용되는 외인성 항원을 포함하는 적혈구 세포는 자가, 즉, 동일한 대상체로부터 유래되거나, 동종이계, 즉, 상이한 세포 공여자로부터 유래될 수 있다.

약제학적 조성물은 예를 들어, 정맥내 주입 또는 근육내 주사에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.

기타 구현예

본 발명이 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템에 제한되지 않으며, 이것은 물론 달라질 수 있는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용되는 용어가 오직 특정 양태만을 기술하기 위한 목적을 위한 것이며, 제한하고 하지 않음이 이해되어야 한다.

본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특징은 동일한, 등가의 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 명시적으로 다르게 언급되지 않는 한, 개시된 각 특징은 포괄적인 일련의 등가의 또는 유사한 특징의 오직 일 예일 뿐이다.

일부 구현예에서, CR1 외인성 항원을 포함하는 외인성 항원-발현 EHC는 마우스에서 생성되지 않고/거나 마우스 적혈구계 세포로부터 생성되지 않는다. 일부 구현예에서, CR1 외인성 항원을 포함하는 외인성 항원-발현 EHC는 실험실 동물에서 생성되지 않고/거나 실험실 동물로부터 유래된 적혈구계 세포로부터 생성되지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 거핵구 또는 혈소판으로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 적혈구계 세포, 예를 들어, 적혈구 또는 망상적혈구로부터 생성된다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 호중구, 호산구 또는 호염기구로부터 생성되지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 단핵구 또는 대식구로부터 생성되지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 CD34⁺Thy-1⁺ 조혈 줄기 세포 또는 CD34⁺Lin^- 또는 CD34⁺Thy-1⁺Lin^- 세포가 풍부한 세포 모집단으로부터 생성되지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 HIV 보조수용체의 세포외 도메인을 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 바이러스에 결합할 수 있는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 CD4를 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 HIV 보조수용체를 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 CXCR4, CCR5, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR8, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR6, GPR15, APJ, CMKLR1 또는 CX3CR1 또는 그들의 임의의 조합을 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 아데노신 데아미나제 항원을 인코딩하는 외인성 핵산을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 아데노신 데아미나제(ADA)를 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 원암유전자를 인코딩하는 외인성 핵산을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 원암유전자를 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 cdx1, cdx2 또는 cdx4를 인코딩하는 외인성 핵산을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 cdx1, cdx2 또는 cdx4, 또는 그들의 임의의 조합을 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 리간드 결합 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 리간드에 결합할 수 있는 S 도메인을 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 CD3ζ, CD3η, IL-2 수용체, IL-3 수용체, IL-4 수용체, IL-7 수용체, IL-11 수용체, IL-13 수용체, GM-CSF 수용체, LIF 수용체, CNTF 수용체, 온코스타틴 M 수용체, TGF-β 수용체, EGF 수용체, ATR2/neu, HER2/neu, HER3/c-erbB-3, Xmrk, 인슐린 수용체, IGF-1 수용체, IRR, PDGF 수용체, CSF-1 수용체, c-kit, STK-1/flk-2, FGF 수용체, flg, bek, NGF 수용체, Ror1 및 Ror2 또는 그들의 임의의 조합을 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 인간 파필로마바이러스의 E6 또는 E7 유전자를 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 종양 항원을 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 글루코세레브로시다제를 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 아스파라기나제를 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 아르기닌 데이미나제를 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 i) 외인성 항원과 상이하고/거나 ii) 그와 독립적으로 작용하는 표적 세포로의 외인성 항원-발현 EHC의 융합을 촉진시킬 수 있는 융합 분자를 포함하지 않으며, 여기서, 외인성 항원은 표적과 상호작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 Syncytin-1을 포함하는 외인성 항원을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 감광성 합성 화합물, 예를 들어, 광자 또는 켄칭가능한 화합물에 의해 활성화될 수 있는 화합물을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 검출가능한 반응을 생성할 수 있는 활성화가능한 분자 검출제를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 진단 화합물을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 바이러스 또는 박테리아를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 자가 CD34+ 세포로부터 생성되지 않거나 그를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 적혈구계 세포로부터 생성된 외인성 항원-발현 EHC를 사용한 치료 및 예방 방법은 예를 들어, 적혈구계 세포와 회합된 검출 작용제를 통하여, 생체내에서 적혈구계 세포를 검출하는 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 인간 공여자 만능 조혈 줄기 세포로부터 생성되지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 생물반응기에서 증량되지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 모집단은 증량 및/또는 분화 후에, 단일 종의 분화된 인간 혈액 세포를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 분화된, 성숙 인간 혈액 세포가 아니다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 보편적인 공여자, 예를 들어, 혈액형 O형, Rh 인자 음성으로부터 유래된 혈액 세포로부터 생성되지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 ADA 폴리펩티드 항원-발현 EHC는 중증의 복합 면역 결핍(ADA-SCID)을 치료하기 위해 사용되지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC의 증량 및 분화 방법은 골수증식성 수용체(mpl) 리간드를 포함하는 배지에서 외인성 항원-발현 EHC를 배양하는 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 합성 트리포스포릴화 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 페이로드를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 2',3'-디데옥시시티딘-5'-트리포스페이트(ddCTP) 및/또는 3'-아지도-3'-데옥시티미딘-5'-트리포스페이트(AZT-TP)를 포함하는 페이로드를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 비스포스포네이트를 포함하는 페이로드를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 외인성 항원 및/또는 페이로드를 혼입시키기 위하여 세포를 용해시키고 재밀봉하지 않고, 적혈구계 세포를 외인성 항원 및 임의로 페이로드와 접촉시킴으로써 생성된다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 적혈구계 세포를 외인성 항원 및 임의로 페이로드와 접촉시킴으로써 생성되며, 여기서, 접촉은 저장성 투석을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 적혈구계 세포를 외인성 항원 및 임의로 페이로드와 접촉시킴으로써 생성되며, 여기서, 접촉은 외인성 항원 및/또는 페이로드를 적혈구계 세포 내로 또는 그 상으로 로딩하는 것을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원은 접촉시킬 적혈구계 세포가 아닌 엔티티에서 생성되고/거나 외인성 항원은 접촉시킬 적혈구계 세포를 포함하지 않는 시료로부터 단리된다. 예를 들어, 폴리펩티드 외인성 항원을 위하여, 적합한 엔티티는 세포주, 시험관내 발현 시스템, 박테리아 발현 시스템 등을 포함한다.

일부 구현예에서, EHC에 의해 발현되는 외인성 항원 폴리펩티드는 EHC의 표면상에 존재하지만, EHC의 표면에 비-공유적으로 결합되지 않는다. 일부 구현예에서, EHC의 표면으로의 항원의 비공유적 부착은 항체, 항체-단편, 항체-유사 폴리펩티드 또는 비-항체 폴리펩티드 결합 스캐폴드에 의해 매개되지 않는다. 일부 구현예에서, EHC의 표면으로의 외인성 항원의 비공유적 부착은 적혈구계 세포 항원, 예를 들어, 밴드 3(CD233), 아쿠아포린(aquaporin)-1, Glut-1, Kidd 항원, RhAg/Rh50(CD241), Rh(CD240), Rh30 CE(CD240CE), Rh30D(CD240D), Kx, 글리코포린 B(CD235b), 글리코포린 C(CD235c), 글리코포린 D(CD235d), Kell(CD238), Duffy/DARCi(CD234), CRl(CD35), DAF(CD55), 글로보시드(globoside), CD44, ICAM-4(CD242), Lu/B-CAM(CD239), XGl/XG2(CD99), EMMPRIN/neur. 텔린(thelin)(CD147), JMH, 글리코실트랜스퍼라제, Cartwright, Dombrock, C4A/CAB, Scianna, MER2, 스토마틴(stomatin), BA-l(CD24), GPIV(CD36), CD108, CD139 및 H 항원(CD173) 또는 다른 적혈구-결합 모이어티에 대하여 유도되지 않는다.

일부 구현예에서, 외인성 항원 폴리펩티드는 EHC로부터 따로 생성된 다음 EHC에 컨쥬게이트되지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원 폴리펩티드는 효소에 의해, 예를 들어, 트랜스펩티다제, 소타아제 및/또는 이소펩티다제에 의해 수행되는 것과 같은 자가촉매 이소펩티드 결합-형성 반응을 통해 컨쥬게이트되지 않는다. 일 구현예에서, 외인성 항원 폴리펩티드는 소타아제를 사용하여 효소에 의해 컨쥬게이트되지 않는다.

일부 구현예에서, 외인성 항원 폴리펩티드는 예를 들어, 가교제, 예를 들어, 카보디이미드(소타아제 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 포함)를 통해 화학적으로 컨쥬게이트되지 않는다.

일 구현예에서, 외인성 항원은 EHC로부터 따로 생성된 다음 EHC에 의해 캡슐화되지 않는다. 일 구현예에서, 외인성 항원의 캡슐화는 외인성 항원의 존재하에 EHC의 저장성 투석에 의해 매개되지 않는다.

본원에 기재된 본 발명의 많은 변형 및 기타 구현예는, 앞서 설명 및 관련 도면에 제시된 지침의 혜택을 갖는 본 방법이 속하는 당해기술의 숙련가에게 익숙할 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 구현예에 국한되지 않으며, 변형 및 기타 구현예가 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함됨이 이해되어야 한다. 구체적인 용어들이 본원에서 사용되지만, 일반적으로 설명을 위해서만 사용될 뿐, 제한하기 위해 사용되는 것은 아니다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 문맥에서 명확하게 다르게 언급하지 않는 한 복수의 지시물을 포함한다.

대안(예를 들어, "또는")의 이용은 대안의 하나, 둘 모두 또는 그의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

양, 일시적 기간 등과 같은 측정가능한 값과 관련하여 본원에 사용되는 용어 "약"은, 다음의 차이가 개시된 발명을 수행하기에 적절한 한에 있어서는, 특정 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 더욱 바람직하게는 ±5%, 더더욱 바람직하게는 ±1%, 더더욱 바람직하게는 ±0.1%의 차이를 포함하는 것으로 의미된다.

본원에 사용되는 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는 다르게 지시되지 않는 한, 언급된 범위 및 적절한 경우 그의 분율(예를 들어, 정수의 10분의 1 및 100분의 1) 내의 임의의 정수의 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본원에 사용되는 "구성하다(comprise)", "구성하는(comprising)", "구성한다(comprises)" 및 "로 구성된다(comprised of)"는 "포함하다(include)", "포함하는(including)", "포함한다(includes)" 또는 "함유하다(contain)", "함유하는(containing)", "함유한다(contains)"와 동의어이고, 뒤따르는 것, 예를 들어, 성분의 존재를 구체화하고, 당해 분야에 알려져 있거나 또는 거기에 개시되어 있는 추가적인, 비언급된 성분, 특징부, 요소, 구성원, 단계의 존재를 배제 또는 방지하지 않는, 포괄적 또는 개방단 용어들이다.

본원에 사용되는 용어 "예를 들어", "예컨대" 등은 예시적인 구현예를 언급하고자 하며, 본 개시내용의 범주를 제한하지 않는다.

다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 시험을 위한 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기재된다.

본 명세서에서 모든 간행물 및 특허 출원은 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 자세하게 및 개별적으로 모든 목적을 위하여 참고로 인용되는 것으로 지시되는 것처럼, 모든 목적을 위하여 그 전체가 본원에 참고로 인용된다. 본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 그 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시내용을 예상할 자격이 없음을 인정한 것으로 해석되어서는 안 된다.

정의

"투여", "투여하는" 및 그의 변이형은 조성물, 예를 들어, 외인성 항원-발현 EHC 또는 작용제를 대상체 내로 도입하는 것을 의미하며, 조성물 또는 작용제의 동시의 및 순차적인 도입을 포함한다. 대상체 내로의 조성물 또는 작용제의 도입은 경구, 폐, 비강내, 비경구(정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하), 직장, 림프내 또는 국소를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 이루어진다. 투여는 자가-투여 및 타인에 의한 투여를 포함한다. 적합한 투여 경로는 조성물 또는 작용제가 그의 의도되는 기능을 수행하게 한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내이면, 조성물은 조성물 또는 작용제를 대상체의 정맥 내로 도입함으로써 투여된다. 투여는 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다.

"앵커" 또는 "앵커 도메인" 또는 "A 도메인"은 EHC의 세포막과 접촉되는 융합체 또는 키메라 외인성 항원 폴리펩티드를 포함하는 외인성 항원 폴리펩티드의 부분을 지칭하기 위해 사용된다. 외인성 항원 폴리펩티드는 인지질 테일 삽입, 지질층 구성성분으로의 공유 결합, 이온 결합, 수소 결합을 통해 또는 지질 세포막 층 중 하나 이상을 가로지르는 단일 또는 다중-통과 막횡단 폴리펩티드 도메인을 통해 지질 세포막 층과 상호작용할 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "항체"는 천연이든지, 부분적으로 합성에 의해 생성되든지, 전체적으로 합성에 의해 생성되든지 면역글로불린 및 그의 단편을 포함한다. 또한, 당해 용어는 면역글로불린 결합 도메인과 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 단백질을 포괄한다. 이들 단백질은 천연 공급원으로부터 유래되거나, 부분적으로 또는 전체적으로 합성에 의해 생성될 수 있다. "항체"는 항원에 특이적으로 결합하고 이를 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 그의 단편 유래의 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 용어 항체의 이용은 전체 항체, 폴리클로널, 모노클로널 및 재조합 항체, 그의 단편을 포함하는 의미이며, 단쇄 항체, 인간화 항체; 쥣과 항체; 키메라, 마우스-인간, 마우스-영장류, 영장류-인간 모노클로널 항체, 항-이디오타입 항체, 항체 단편, 예를 들어, scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2, F(ab1)2, Fv, dAb 및 Fd 단편, 디아바디 및 항체-관련 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 항체는 그들이 요망되는 생물학적 활성 또는 작용을 나타내는 한, 이중특이적 항체 및 다중특이적 항체를 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "항원 결합 단편"은 무손상 면역글로불린의 단편, 및 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 항원 결합 영역을 포함하는 폴리펩티드의 임의의 부분을 지칭한다. 예를 들어, 항원 결합 단편은 F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fab 단편, Fv 단편 또는 scFv 단편일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. Fab 단편은 하나의 항원 결합 부위를 가지며, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역, 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 제1 불변 영역 CH1을 함유한다. Fab' 단편은 Fab' 단편이 추가로 중쇄의 힌지 영역을 포함하여, 중쇄 CH1 영역의 C-말단에서 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함한다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab' 단편의 시스테인 잔기가 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결되는 F(ab')2 단편이 생성된다. Fv 단편은 오직 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역만을 갖는 최소 항체 단편이며, Fv 단편을 생성하기 위한 재조합 기술은 해당 분야에 널리 알려져 있다. 2-쇄 Fv 단편은 중쇄 가변 영역이 비-공유 결합에 의해 경쇄 가변 영역에 연결되는 구조를 가질 수 있다. 단쇄 Fv(scFv) 단편은 일반적으로 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커를 통해 경쇄 가변 영역에 공유 결합되거나, 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 그의 C-말단에서 서로 직접 연결되는 2-쇄 Fv 단편에서와 같은 이량체 구조를 가질 수 있다. 항원 결합 단편은 프로테아제를 사용하여 수득될 수 있으며(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 분해하여, Fab 단편을 수득하고, 펩신으로 분해하여 F(ab')2 단편을 수득함), 유전자 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. dAb 단편은 VH 도메인으로 이루어진다. 단쇄 항체 분자는 다수의 개별 분자를 갖는 폴리머, 예를 들어, 이량체, 삼량체 또는 기타 폴리머를 포함할 수 있다.

"애플리케이터"는 대상체에 연결하기 위해 사용되는 임의의 장치를 지칭한다. 이는 예를 들어, 주사바늘, 캐뉼라, 카테터 및 튜빙(tubing)을 포함한다.

다수의 화합물 또는 분자 간의 관계를 기술하기 위해 사용되는 경우, "와 회합된"은 예를 들어, 외인성 항원과 표적 간의 또는 외인성 항원-발현 EHC와 표적 간의 임의의 상호작용을 포함한다. 이것은 효소적 상호작용, 이온 결합, 공유 결합, 비공유 결합, 수소 결합, 런던 힘(London force), 반데르발스 힘, 소수성 상호작용, 친지성 상호작용, 자기적 상호작용, 정전기적 상호작용 등을 포함한다.

표적, 엔티티, 화합물, 작용제 또는 분자와, 질병, 장애, 질환, 증상 또는 표현형 간의 관계를 설명하기 위해 사용되는 경우, "와 관련된"은 질병, 장애, 질환, 증상 또는 표현형의 원인이든지 아니든지 인과적 관련성, 또는 통계적으로 유의미한 관련성, 실험적으로 확립된 관련성, 제안된 관련성을 포함하여, 그들 사이에 타당하게 이루어질 수 있는 임의의 관련성이다.

"자가면역 장애"는 일반적으로 대상체의 면역계가 자신의 신체 세포를 공격하여, 조직 파괴를 야기하는 질환이다. 자가면역 장애는 혈액 시험, 뇌척수액 분석, 근전도(근육 기능 측정) 및 뇌의 자기 공명 영상화를 사용하여 진단될 수 있지만, 자기-항체(또는 자가-항체)에 대한 혈중 항체 시험이 특히 유용하다. 통상, IgG 부류 항체는 자가면역 질병과 관련이 있다.

"결합"은 이온 결합, 정전기적 상호작용, 수소 결합, 런던 힘, 반데르발스 힘, 소수성 상호작용, 친지성 상호작용 등을 포함하는 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 야기되는 화합물 또는 분자 간의, 예를 들어, 외인성 항원과 표적 사이의 또는 외인성 항원-발현 EHC와 표적 사이의 상호작용을 설명한다.

"폴리펩티드의 생물학적 활성"은 폴리펩티드, 예를 들어, 외인성 항원 폴리펩티드에 의해 야기되는 분자 활성 또는 표현형(예를 들어, 결합, 신호 전달, 촉매 등)을 지칭한다.

본원에 사용되는 용어 "생물학적 시료"는 예를 들어, DNA, RNA, 지질, 탄수화물 및 단백질을 포함하는 대상체로부터 단리된 생물학적 기원의 임의의 유형의 물질을 지칭한다. 용어 "생물학적 시료"는 대상체로부터 단리된 조직, 세포 및 생물학적 유체를 포함한다. 생물학적 시료는 예를 들어, 전혈, 혈장, 혈청, 정액, 타액, 눈물, 소변, 대변, 땀, 협측, 피부, 뇌척수액, 골수, 담즙, 모발, 근육 생검, 기관 조직 또는 당업자에게 알려져 있는 다른 생물학적 기원의 물질을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 생물학적 시료는 예를 들어, 내부 장기의 생검으로부터 또는 암으로부터 수득될 수 있다. 생물학적 시료는 진단 또는 연구를 위하여 대상체로부터 수득되거나, 대조군으로서 또는 기본 연구를 위하여 건강한 대상체로부터 수득될 수 있다.

본원에 사용되는 "제거 속도"는 시간이 지남에 따라 대상체의 순환계에 남아 있는 예를 들어, 외인성 항원, 표적-외인성 항원 또는 외인성 항원-발현 EHC의 양 또는 농도를 측정함으로써 계산된다. 예를 들어, 제1 시료에서 검출되는 표적의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%는 여전히 1시간, 5시간, 10시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 2주, 3주, 4주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 2년, 3년, 4년 또는 5년 이후에 취한 제2 시료에서 검출될 수 있다. 제거 속도는 대안적으로 단위 시간마다(예를 들어, 일마다) 엔티티(예를 들어, 표적/외인성 항원)의 수로 표현될 수 있다. 제거 속도의 증가는 치료되지 않은 또는 건강한 적합한 대조군 대상체에서 나타나는 것보다 더 큰 속도이다. 제거 속도의 감소는 치료되지 않은 또는 건강한 적합한 대조군 대상체에서 나타나는 것 미만의 속도이다. 증가 또는 감소는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 500%, 1000%이거나, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 500배 또는 1000배일 수 있다.

본원에 사용되는 "절단"은 표적, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산에 존재하는 결합 상호작용을 파괴하여, 예를 들어, 절단 후에 서로 분리될 수 있는 2개 이상의 엔티티를 생성하는 과정이다. 분리는 예를 들어, 이온 결합, 공유 결합, 극성 공유 결합, 비극성 공유 결합 또는 금속 결합의 파괴를 수반할 수 있다. 절단이 폴리펩티드 표적에 적용됨에 따라, 절단은 하나 이상의 펩티드 결합의 파괴를 포함할 수 있다. 절단이 소분자 표적에 적용됨에 따라, 절단은 하나 이상의 탄소 또는 황화 결합의 파괴를 포함할 수 있다. 절단이 뉴클레오티드 서열에 적용됨에 따라, 절단은 하나 이상의 포스포디에스테르 결합의 파괴를 포함할 수 있다. 절단이 미생물, 예를 들어, 박테리아, 진균류 또는 바이러스에 적용됨에 따라, 절단은 막 또는 캡시드 구조의 용해를 포함할 수 있다. 절단은 효소, 예를 들어, 촉매적 활성 외인성 항원 폴리펩티드에 의해 수행될 수 있다. 외인성 항원은 예를 들어, 엑소뉴클레아제, 엔도뉴클레아제 또는 프로테아제 활성을 포함할 수 있다.

본원에 사용되는 "대상체의 순환계"는 전혈 및 임의로 혈장 및 모든 순환 세포 및 분자를 포함하는 인간의 림프계에 의해 점유되고, 모든 조직의 동맥, 정맥, 모세관 및 림프관의 도처에 분포된 공간을 포함한다. "순환 농도"는 순환계로 정의되는 공간 내의 표적, 예를 들어, 세포, 폴리펩티드(예를 들어, 항체, 병원성 항원 등), 치료제, 소분자, 대사산물 또는 기타 엔티티, 외인성 항원 또는 외인성 항원-발현 EHC의 농도이다. 특정 구현예에서, 농도는 주어진 부피에서의 유리(미결합) 엔티티의 수로 정의될 수 있다. 다른 구현예에서, 농도는 주어진 부피에서 엔티티의 총 개수로 정의될 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "상보성 결정 영역(CDR)"은 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역에서 관찰되는 아미노산 서열을 지칭한다. CDR은 항체의 특이성을 결정하며, 항원의 특정 에피토프로의 결합을 위한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3, 및 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)을 포함할 수 있다. CDR보다 더욱 고도로 보존된 아미노산 서열을 갖는 4개의 프레임워크 영역은 VH 또는 VL에서 CDR 영역을 분리시킨다.

본원에 사용되는 "복합체"는 둘 이상의 엔티티의 회합을 포함한다. 복합체는 하나 이상의 폴리펩티드, 핵산, 지질, 탄수화물, 무기 화합물, 유기 화합물 등을 포함할 수 있다. 복합체는 작용성(멀티유닛 폴리펩티드) 또는 비작용성(예를 들어, 응집물 또는 침전물)일 수 있으며, 유리한 또는 유해한 특성을 가질 수 있다(예를 들어, 면역 복합체). 복합체는 천연 발생이거나, 인공 또는 합성일 수 있다. 합성 복합체는 보다 고차의 엔티티, 예를 들어, 그들이 합성 화합물 또는 분자를 함유한다면, 하위세포 구조 및 세포를 포함한다.

아미노산 서열에 관해서는, 숙련자는 인코딩된 서열 중 단일 아미노산 또는 적은 백분율의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실, 또는 부가가, 그러한 변경을 통해 아미노산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환되는 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 이해할 것이다. 본원에 사용되는 용어 "보존적 아미노산 치환"은 하기의 그룹의 각각 내의 아미노산 간의 치환에 의해 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신, (2) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파르트산염 및 글루탐산염, (5) 글루탐산염 및 아스파르트산염, 및 (6) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘.

치료되는 질병, 장애 또는 질환의 증상의 맥락에서 "감소"는 증상으로 나타나는 질병 또는 질환과 관련된 측정가능한 또는 전달가능한 파라미터의 감소를 지칭한다. 측정가능한 파라미터의 예는 대상체의 체온의 감소, 대상체로부터 취한 시료 중 표적의 농도의 감소, 염증의 세기 또는 염증 영역의 크기의 감소, 침윤 세포의 개수의 감소, 질병, 장애 또는 질환과 관련된 에피소드의 수의 감소, 기관 크기의 증가/감소, 체중 증가/감소 등이다. 전달가능한 파라미터의 예는 예를 들어, 대상체 자신의 웰빙 및 삶의 질의 평가이다. 예를 들어, 자가-항체 매개의 질병에 있어서, 감소는 하기의 파라미터 중 하나 또는 그들의 조합으로 정량화될 수 있다: 감소된 염증, 감소된 급격한 재발(flare-up), 감소된 피로, 감소된 혈액 응고, 감소된 종창, 증가된 에너지 또는 증가된 모발 성장 등. 정량화될 수 있는 파라미터는 치료 중인 특정 질병, 장애 또는 질환을 평가하는데 적절한 것들이다. 치료되는 질병, 장애 또는 질환의 증상의 맥락에서 지연은 다르게는 악화될 관리가능한 건강 질환을 치료를 사용하여 유의미하게 연장시키는 것을 지칭한다.

"분해"는 표적이 직접적으로 또는 간접적으로 감소되거나, 불활성화되거나, 분해되거나, 해체되거나, 융해되거나, 용해되거나, 파괴되거나, 경감되거나, 손상되거나, 약화되거나, 악화되거나, 저하되거나, 또는 분할되는 과정으로 정의된다.

"상이한 폴리펩티드 기원"은 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자 서열, 폴리펩티드 또는 그의 부분이 공급되는 유기체 또는 종을 지칭한다. 특정 구현예에서, 상이한 폴리펩티드 기원의 폴리펩티드를 포함하는 융합체는 인간 아데노신 데아미나제에 대한 유전자 서열 및 크로모박테리움 비올라세움(chromobacterium violaceum) 유래의 페닐알라닌 하이드록실라제에 대한 유전자 서열에 의해 인코딩되는 외인성 항원 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

"도메인"은 일반적으로 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드, 예를 들어, 외인성 항원 폴리펩티드의 부분이며, 별개의 활성, 기능, 예를 들어, 촉매적, 효소적, 구조적 역할 또는 결합 기능을 나타낼 수 있다.

"농축된 세포 모집단"이란, 실질적으로 특정 관심 세포로 구성된 세포의 모집단을 의미한다. 농축된 모집단에서, 모집단 내의 세포의 50% 이상, 예를 들어, 모집단 내의 세포의 50%, 60%, 70%, 통상적으로 80%, 85%, 90%, 더욱 통상적으로 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 때때로 100%가 관심 세포이다. 세포의 복합 혼합물 또는 불균질 배양액으로부터의 관심 세포의 분리는 해당 분야에 알려져 있는 임의의 편리한 수단에 의해, 예를 들어, 친화성 분리 기술, 예를 들어, 친화성 시약으로 코팅된 자기 비드를 사용한 자기적 분리, 친화성 크로마토그래피 또는 고체 매트릭스, 예를 들어, 플레이트에 부착된 친화성 시약과의 "패닝" 또는 기타 편리한 기술에 의해 수행될 수 있다. 정확한 분리를 제공하는 다른 기술은 다양한 정도의 정교성, 예를 들어, 다색 채널, 소각(low angle) 및 둔각 광 산란 검출 채널, 임피던스 채널 등을 가질 수 있는 형광 활성화 세포 분리기를 포함한다. 세포는 죽은 세포와 회힙되는 염료를 사용함으로써 죽은 세포에 대해 선택될 수 있다. 요망되는 세포의 생존력에 과도하게 유해하지 않는 임의의 기술이 이용될 수 있다.

"제핵"은 핵의 불활성화 또는 그의 제거를 통하여 세포가 비-복제 상태가 되게 하는 것이다.

"에피토프"는 항체 또는 기타 리간드 또는 결합 분자가 결합하는 항원 상의 임의의 세그먼트를 포함한다. 에피토프는 분자, 예를 들어, 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적 활성 표면 그루핑(grouping)으로 이루어질 수 있으며, 통상 특정 3차원 구조 특징 및 특정 전하 특징을 갖는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원은 특정 에피토프를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적은 특정 에피토프를 포함한다.

본원에 사용되는 "적혈구계 세포"는 유핵 적혈구, 적혈구 전구체 및 제핵 적혈구 및 표 A1에 열거된 것들을 포함한다. 예를 들어, 적혈구계 세포는 제대혈 줄기 세포, CD34+ 세포, 조혈 줄기 세포(HSC), 비장 콜로니 형성(CFU-S) 세포, 공통 골수계 전구(CMP) 세포, 배반포 콜로니-형성 세포, 버스트 형성 단위-적혈구계(BFU-E), 거핵구-적혈구계 전구(MEP) 세포, 적혈구계 콜로니-형성 단위(CFU-E), 망상적혈구, 적혈구, 유도된 만능 줄기 세포(iPSC), 중간엽 줄기 세포(MSC), 다염적혈모구, 호산성적혈모구 또는 그들의 조합이다. 일부 구현예에서, 적혈구계 세포는 무한증식 또는 무한증식화 세포이다. 예를 들어, 무한증식화 적혈모구 세포는 Oct4, Sox2, Klf4, cMyc를 발현하고, TP53를 억제하기 위한 CD34+ 조혈 전구 세포의 레트로바이러스 형질도입에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Huang et al., Mol Ther 2013, epub ahead of print September 3]에 기재된 바와 같음). 또한, 세포는 자가 이용을 위해 의도되거나 동종이계 주입을 위한 공급원을 제공할 수 있다. 적혈구계 세포를 외인성 항원과 접촉시켜, 외인성 항원-발현 EHC를 생성할 수 있다. 외인성 항원을 포함하는 적혈구계 세포는 외인성 항원-발현 EHC의 일 예이다. 일부 구현예에서, 적혈구계 세포가 배양된다. 일부 구현예에서, 적혈구계 전구 세포를 외인성 항원과 접촉시켜, 외인성 항원-발현 EHC를 생성한다.

본원에 사용되는 용어 "혈소판계 세포"는 예를 들어, 거핵구 및 혈소판을 포함하는 줄기 세포-거핵-혈소판 계통의 세포, 또는 트롬보포이에틴에 의해 분화하도록 유도되는 세포, 또는 이러한 계통과 관련된 표면 마커, 예를 들어, CD41(GP IIb/IIIa), CD42a(GPIX), CD42b(GPIb) 및 CD61(avb3, 비트로넥틴 수용체), PAC-1(활성화된 IIb/IIIa), CD62P(P-셀렉틴), CD31(PECAM) 및 CD63을 발현하는 세포를 지칭한다.

본원에 사용되는 용어 "제핵 조혈 세포"(EHC)는 본원에 정의된 바와 같이 제핵되거나, 제핵되게 만든 인간 또는 비인간 조혈 세포를 지칭한다. 이러한 정의는 본원에 정의된 바와 같은 "적혈구계 세포" 및 "혈소판계 세포" 둘 모두를 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "부형제"는 화합물의 투여를 추가로 용이하게 하기 위하여 약제학적 조성물에 첨가되는 비활성 물질을 지칭한다. 부형제의 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당 및 전분의 유형, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일, 항-응고제 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

본원에 사용되는 용어 "외인성"은 세포 내에서 천연적으로 관찰되지 않는 탄수화물, 다당류, 지질, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 의해 생성되는 세포 성분 또는 기능, 또는 예를 들어, 외인성 폴리펩티드 항원 및 내인성 단백질 또는 그의 작용성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 세포에 내인성인 세포 성분 또는 기능의 증진 또는 조작을 의미한다. 외인성 항원 폴리펩티드를 포함하는 외인성 항원은 "외인성" 또는 "이종"이어서, 이에 따라, 그것은 상이한 폴리펩티드 또는 종 기원의 도메인을 포함하는 융합체 또는 키메라와 같이 천연적으로 존재하지 않거나, 그것은 천연 발생 세포, 예를 들어, 비변형된 적혈구 또는 혈소판에서 천연적으로 발생하지 않거나, 그것은 천연 발생 폴리펩티드와 동일한 방식으로 기능하지 않거나, 예를 들어, 외인성 항원이 비변형 세포에서의 천연 발생 폴리펩티드의 발현에 비하여 과발현되는 구현예에서, 그것은 천연적으로 외인성 항원 폴리펩티드가 발생하는 양으로 발생하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 외인성 항원은 외인성 핵산으로부터 발현된다. 일부 구현예에서, 외인성 항원은 공급원으로부터 단리되고, 외인성 항원-발현 EHC 내로 로딩되거나, 그에 컨쥬게이트된다. 핵산의 맥락에서 사용되는 경우 용어 "외인성"은 전이유전자 및 재조합 핵산을 포함한다.

본원에 사용되는 용어 "발현" 또는 "발현하는"은 전사 및 번역을 포함하는, 폴리펩티드, 예를 들어, 외인성 항원 폴리펩티드의 생성 과정을 지칭한다. 발현은 예를 들어, 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 수의 증가, 유전자의 전사의 증가(예를 들어, 구성성 프로모터의 제어하에 유전자를 배치함으로써), 유전자의 번역의 증가, 경쟁 유전자의 낙아웃 또는 이들 및/또는 다른 방법의 조합을 포함하는 다수의 방법에 의해 증가될 수 있다. 또한, 용어 "발현" 또는 "발현하는"은 EHC에 의해 한때 활발히 발현되지만, 중단 이후로 활발히 발현(전사 및 번역으로 정의)되지 않는 외인성 폴리펩티드를 포함하는 EHC를 포함한다. 예를 들어, 외인성 항원 폴리펩티드는 제핵 사건 이전에 EHC에 의해 활발히 발현(즉, 전사 및 번역)되었으며, 항원 폴리펩티드는 제핵 이후에 EHC에 의해 보유되지만, 예를 들어, 인코딩 핵산의 결여 때문에 더 이상 활발히 발현되지 않는다. 예를 들어, EHC는 외인성 핵산에 의해 인코딩되는 외인성 항원 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 제핵 동안 외인성 항원 폴리펩티드는 EHC에 의해 보유되는 한편, 외인성 핵산은 보유되지 않고, 그러한 EHC는 심지어 항원 폴리펩티드의 활발한 발현(전사 및 번역)이 효율적으로 종료되고/거나 EHC가 상당한 양의 복제성 핵산을 함유하지 않는 사건에서도 "항원-발현" 또는 "항원을 발현하는"이라 칭해진다.

"작용성" 외인성 항원 또는 외인성 항원-발현 EHC는 효소, 촉매 또는 대사 활성, 구조적 무결성, 면역원성 상보성, 표적 결합 및 정확한 국소화를 포함하는 요망되는 또는 특정 활성 또는 특징을 나타내거나, 요망되는 또는 특정 효과 또는 표현형을 촉진시킬 수 있다.

"융합체 또는 키메라"는 천연에서 함께 관찰되지 않는 둘 이상의 서열의 조합으로부터 유래되는 폴리펩티드 서열 또는 상응하는 인코딩 뉴클레오티드 서열이다. 이것은 동일한 게놈 내의 개별 유전자로부터, 또는 명백하게 상이한 종의 게놈으로부터 유래된 이종 유전자로부터 유래된 개별 서열의 조합일 수 있다.

"유전 물질"은 유전자를 인코딩할 수 있는 아데노신, 티민, 우라실, 시토신 및 구아닌의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자를 말한다.

본원에 사용되는 용어 "중쇄"는 항원에 대한 특이성을 결정하는 아미노산 서열을 갖는 가변 영역(VH) 및 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는 불변 영역을 포함하는 전장 중쇄 및 그의 단편을 포함하는 것이 이해된다. 또한, 본원에 사용되는 "경쇄"는 항원에 대한 특이성을 결정하는 아미노산 서열을 갖는 가변 영역(VL) 및 불변 영역(CL)을 포함하는 전장 경쇄 및 그의 단편을 포함하는 것으로 이해된다.

용어 "상동체"는 그들의 일차, 이차 또는 삼차 구조의 상응하는 위치에 동일한 또는 보존된 잔기를 갖는 외인성 항원 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 기능적 상동체는 외인성 항원 및 유사한 기능 및/또는 특이성(예를 들어, 특정 표적에 대한)을 나타내는 다른 폴리펩티드를 포함한다.

천연 발생 무손상 항체 또는 면역글로불린은 4개의 폴리펩티드, 2개의 전장 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 포함하며, 여기서, 각 경쇄는 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결된다. 각 중쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 갖는다. 유사하게, 각 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 갖는다. 5가지 중쇄 부류(아이소형), 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε), 및 추가로 몇몇의 하위부류, 감마 1(γ1), 감마 2(γ2), 감마 3(γ3), 감마 4(γ4), 알파 1(α1) 및 알파 2(α2)가 존재한다. 경쇄 불변 영역은 카파(κ) 또는 람다(λ) 형일 수 있다. 가변 영역은 항체 간에 서열이 상이하며, 특정 항원에 대한 주어진 항체의 결합 및 특이성에 사용된다.

본원에 사용되는 용어 "증가시킨다", "증진시킨다", "자극한다" 및/또는 "유도한다"(및 유사 용어)는 일반적으로, 천연, 예상치 또는 평균에 비하여 또는 대조군 조건에 비하여 농도, 수준, 기능, 활성 또는 거동을 직접적으로 또는 간접적으로 개선시키거나 증가시키는 작용을 말한다.

본원에 사용되는 용어 "억제한다", "저해한다", "감소시킨다", "간섭한다" 및/또는 "줄인다"(및 유사 용어)는 일반적으로, 천연, 예상치 또는 평균에 비하여 또는 대조군 조건에 비하여 농도, 수준, 기능, 활성 또는 거동을 직접적으로 또는 간접적으로 감소시키는 작용을 말한다.

본원에 사용되는 "라이브러리"는 다양한 핵산 서열을 갖는 핵산 분자(예를 들어, DNA, RNA)의 집합, 유전적으로 다양한 클론의 집합, 다양한 폴리펩티드의 집합, 다양한 세포, 예를 들어, EHC의 집합 등을 포함한다.

본원에 사용되는 "포유류 대상체"는 제한 없이, 인간, 가축(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험실 동물(예를 들어, 원숭이, 랫트, 마우스, 토끼, 기니피그 등)을 포함하는 모든 포유류를 포함한다. 용어 "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 본원에 상호교환가능하게 사용되며, 진단, 치료 또는 치료법이 요망되는 임의의 포유류 대상체, 특히 인간을 지칭한다. 본원에 기재된 방법은 인간 치료법 및 수의 응용 둘 모두에 적용가능하다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유류이며, 다른 구현예에서, 대상체는 인간이다.

"의료 장치"는 소정의 용량의 외인성 항원-발현 EHC 및/또는 치료제를 전달하기 위해 사용되는 임의의 장치, 기구 또는 기계를 지칭한다. 이는 용기, 병, 바이얼, 주사기, 백, 카트리지, 카세트, 매거진(magazine), 실린더 또는 통(canister)을 포함한다.

"의료 키트"는 의료 장치 및 애플리케이터, 임의로, 치료제를 포함하는 적절한 투여량의 외인성 항원-발현 EHC, 및 관련 표시 및 설명서를 포함하는 포장된 유닛을 지칭한다.

본원에 사용되는 용어 "조절한다", "조절하는", "변형한다" 및/또는 "변형제"는 일반적으로 특정 농도, 수준, 발현, 기능 또는 거동을 증가시키거나 감소시킴으로써, 예를 들어, 직접적으로 또는 간접적으로 이를 촉진/자극/상향조절하거나, 이를 간섭/억제/하향조절함으로써 변경시키는, 예를 들어, 길항제 또는 효능제로서 작용하는 능력을 지칭한다. 일부 예에서, 조절제는 대조군에 비하여, 또는 일반적으로 예상될 평균 활성 수준에 비하여, 또는 대조군 활성 수준에 비하여 특정 농도, 수준, 활성 또는 기능을 증가 및/또는 감소시킬 수 있다.

본원에 사용되는 "막"은 하나 이상의 생물학적 화합물, 전형적으로, 지질 및 임의로 폴리펩티드를 포함하는 외부 공간으로부터 내부 공간을 분리하는 경계층이다. 막은 지질 이중층일 수 있다. 특정 구현예에서, 막은 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨 또는 포스파티딘산 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 막은 하나 이상의 폴리펩티드, 예를 들어, 안키린(ankyrin) 및 보조효소 Q10을 포함한다. 예를 들어, 인지질 이중층 및 세포막 회합된 폴리펩티드를 포함하는 세포막이 막의 정의에 포함된다.

어구 "핵산 분자"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일 또는 이중-가닥 폴리머를 지칭한다. 그것은 염색체 DNA 및 자가-복제 플라스미드, 벡터, mRNA, tRNA, siRNA 등을 포함하며, 이는 재조합일 수 있으며, 핵산이 세포 내로 도입되는 경우, 이로부터 외인성 폴리펩티드가 발현될 수 있다.

오솔로그는 종분화에 의해 공통의 조상 유전자로부터 발달되는 상이한 종의 유전자로 정의된다.

용어 "약제학적으로 허용되는" 및 그의 문법적 변이형은 조성물의 투여를 금하는 정도로 바람직하지 않은 생리학적 효과를 생성하지 않고, 대상체로 또는 그 상으로 투여될 수 있는 조성물, 담체, 희석제 및 시약을 지칭한다. 예를 들어, "약제학적으로 허용되는 부형제"는 일반적으로 안전하고, 비독성이며, 바람직한, 약제학적 조성물을 제조하는데 유용한 부형제를 포함하며, 수의 용도 및 인간 약제 용도에 허용가능한 부형제를 포함한다. 그러한 부형제는 고체, 액체, 반고체, 또는 에어로졸 조성물의 경우에는 기체상일 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 표준 약제학적 담체, 예를 들어, 인산염 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예를 들어, 유/수 또는 수/유 및 다양한 유형의 습윤제 중 임의의 것을 포함한다. 또한, 당해 용어는 인간을 포함하는 동물에서의 사용에 대하여 미국 연방 정부의 관리 기관에 의해 승인되거나, 미국 약전에 열거된 작용제, 및 대상체에게 유의미한 자극을 야기하지 않고, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 없애지 않는 임의의 담체 또는 희석제 중 임의의 것을 포함한다.

일부 작용제는 예를 들어, 무기 및 유기산으로부터 제조되는 "약제학적으로 허용되는 염"으로서 투여될 수 있다. 무기산으로부터 유래된 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등을 포함한다. 유기산으로부터 유래된 염은 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 석신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델린산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔-설폰산, 살리실산 등을 포함한다. 또한, 염은 무기 및 유기 염기로부터 제조될 수도 있다. 무기 염기로부터 유래되는 염은 오직 예시로, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염을 포함한다. 유기 염기로부터 유래된 염은 일차, 이차 및 삼차 아민의 염을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 당해 분야의 임의의 숙련자는 과도한 실험 없이, 본 발명을 이해하기 위하여 적절한 약제학적으로 허용되는 담체, 그의 약제학적으로 허용되는 염을 선택하는 방법을 알 것이다.

본원에 사용되는 용어 "약제학적 조성물"은 하나 이상의 다른 화학 성분, 예를 들어, 생리학적으로 허용되는 담체 및 부형제와 혼합되거나, 배합되거나, 그 중에 현탁화되는 본원에 기재된 화합물 중 하나 이상, 예를 들어, 외인성 항원-발현 EHC를 지칭한다. 약제학적 조성물의 한 목적은 대상체로의 화합물의 투여를 용이하게 하는 것이다.

특정 구현예는 요망되는 기능 또는 활성과 관련된 서열을 갖는 다양한 폴리펩티드 분자, 예를 들어, 외인성 항원 폴리펩티드를 제공한다. 폴리펩티드는 번역후 변형(예를 들어, 인산화 또는 당화) 및/또는 추가의 폴리펩티드와의 복합체화, 핵산 및/또는 탄수화물 또는 기타 분자와 함께 멀티서브유닛 복합체로의 합성과 관련 없이, 아미노산 잔기의 쇄를 지칭하는 용어이다. 이에 따라, 프로테오글리칸도 또한 본원에서 폴리펩티드로 지칭된다. 특정 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 폴리펩티드 외인성 항원을 포함한다. 특정 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 임의로 막-회합된 하나 이상의 비-외인성 항원 폴리펩티드를 포함한다.

용어 "약제학적 활성 작용제" 또는 "약제학적 작용제"는 대상체로 투여되는 경우, 대상체에서 측정가능한 또는 전달가능한 효과를 갖는 임의의 화합물, 예를 들어, 소분자 약물 또는 생물제제(예를 들어, 폴리펩티드 약물 또는 핵산 약물)로 정의되며, 예를 들어, 그것은 질병, 장애 또는 질환의 증상을 경감시키거나 감소시킨다. 일부 구현예에서, 약제학적 작용제는 외인성 항원-발현 EHC의 전달 이전에, 그와 병용하여, 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 약제학적 활성 작용제는 외인성 항원-발현 EHC와 상승적 치료 효과를 발휘한다. 일부 구현예에서, 약제학적 활성 작용제는 외인성 항원-발현 EHC와 상가적 치료 효과를 발휘한다.

"프로모터"는 작동가능하게 연결된 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 서열의 어레이로 정의된다. 프로모터는 전사 시작 부위 근처의 필수 핵산 서열을 포함한다. 또한, 프로모터는 임의로 원위의 인핸서(enhancer) 또는 리프레서(repressor) 요소를 포함한다. "구성성" 프로모터는 대부분의 환경 및 발생 조건하에서 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경 또는 발생 조절하에 활성인 프로모터이다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이) 및 제2 핵산 서열 간의 기능적 연결을 말하며, 발현 제어 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.

본원에 사용되는 "외인성 항원"은 표적과 상호작용할 수 있는, 예를 들어, 표적과 회합하거나 표적과 결합하기 위한 엔티티이다. 외인성 항원은 폴리펩티드를 포함하거나, 본질적으로 폴리펩티드로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 항원은 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 소분자 또는 그들의 조합을 포함한다. 외인성 항원이 천연 발생 화합물 또는 분자인 구현예에서, 항원은 그것이 EHC에서의 그의 존재에 관하여 외인성 또는 이종 화합물 또는 분자라는 점에서 "외인성"이다. 다른 구현예에서, 항원은 그것이 인공 화합물 또는 분자, 예를 들어, 융합체 또는 키메라, 비-천연 발생 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질 또는 그들의 조합 또는 인공 소분자 또는 기타 치료제라는 점에서 "외인성"이다. 예를 들어, 외인성 항원은 S 도메인, A 도메인 및 U 도메인 중 하나 이상을 포함하는 융합체 또는 키메라를 포함할 수 있다. S 도메인은 EHC 주변의 환경, 예를 들어, 대상체의 순환계에 노출된 표면 도메인이다. A 도메인은 S 도메인을 EHC의 세포막에 부착시키는 앵커 도메인이다. U 도메인은 EHC의 비노출 측을 향하거나, EHC 내에(즉, 그의 세포내 공간 내에) 위치한다. 어떠한 도메인과도 무관하게, 외인성 항원은 외인성 항원-발현 EHC의 표면상에 위치하거나 EHC 내에 위치할 수 있다. 외인성 항원은 외인성 항원-발현 EHC의 막과 회합될 수 있으며, 예를 들어, 외인성 항원은 막에 부착되거나, 막에 컨쥬게이트되거나, 다르게는 막에 결합된다. 일부 구현예에서, 외인성 항원은 화학적 또는 효소적 컨쥬게이션에 의하여 외인성 항원-발현 EHC의 막에 컨쥬게이트될 수 있다. 다른 구현예에서, 외인성 항원은 막에 컨쥬게이트되지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원은 외인성 항원-발현 EHC의 막과 회합되지 않으며, EHC의 막-캡슐화 세포내 공간 내에 위치한다. 일부 구현예에서, EHC의 세포내 공간에 위치한 외인성 항원은 실질적으로 EHC 밖으로 확산되지 않고/거나 막을 투과하지 않을 수 있다. 다른 구현예에서, 외인성 항원은 실질적으로 EHC 밖으로 확산되고/거나 막을 투과할 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 항원은 EHC 내로 로딩, 예를 들어, 도입되거나, EHC 상에 놓여진다. 로딩되는 외인성 항원은 외인성 항원-발현 EHC에 의해 생물학적으로 합성되지 않는다. 로딩에 적합한 외인성 항원은 예를 들어, 세포-기반의 발현 시스템에서 생성되고, 생물학적 시료로부터 단리되고, 화학적으로 또는 효소적으로 합성된 다음, EHC 내로 또는 그 상으로 로딩될 수 있다. 일부 구현예에서, 외인성 항원은 로딩 후에 외인성 항원-발현 EHC에 의해 추가로 변형될 수 있다. 다른 구현예에서, 외인성 항원은 로딩 후에 변형되지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원 폴리펩티드는 EHC 상으로 또는 그 내로 로딩되지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원은 제조되며, 예를 들어, 외인성 항원-발현 EHC에 의해 생물학적으로 합성된다. 전형적으로, 외인성 항원 폴리펩티드는 EHC 내로 도입된 외인성 핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 mRNA)로부터 외인성 항원-발현 EHC에 의해 발현된다. 외인성 항원은 항원이 EHC 상에 발현되는 경우 보유되는 생물학적 기능을 가질 수 있다. 외인성 항원은 표적에 결합하고/거나 표적을 격리시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 외인성 항원은 표적을 향해 촉매 활성을 나타낼 수 있으며, 예를 들어, 외인성 항원은 표적을 전환시키거나 변형시키거나, 또는 표적을 분해할 수 있다. 그 다음, 생성물이 임의로 외인성 항원으로부터 방출될 수 있다.

외인성 항원-발현 EHC의 "체류기간"은 외인성 항원-발현 EHC가 생리학적 위치에서 소모하는 기간을 말한다. 외인성 항원-발현 EHC의 특정 위치는 그의 수명 동안 변화할 수 있고, "체류기간"은 혈관 순환, 말초 조직, 모세관, 소화계, 폐 시스템, 비강 조직, 상피 표면 및 간질 조직을 포함하는 다양한 환경에서 소모한 기간에 적용된다. 특정 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 대상체의 순환계에 체류한다.

"복제성 핵산"은 DNA의 카피수의 증가에 전념하는 효소에 의해 카피될 수 있는 데옥시리보핵산(DNA)을 지칭한다. 통상, DNA 복제는 하나의 원래의 DNA 분자로부터 2개의 동일한 복제물의 생성을 야기한다. DNA 복제는 포스포디에스테르 결합의 생성을 통하여 차례로 주형 가닥에 일치되는 DNA 중합효소에 의한 신장 중인 DNA 가닥으로의 뉴클레오티드의 혼입을 포함한다.

"격리"는 표적의 봉쇄, 폐쇄, 분리, 구분, 은신, 단절 또는 단리로 정의되며, 표적이 그의 환경과 자유롭게 상호작용하지 못하게 한다.

본원에 사용되는 "특이적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 상호작용하는"은 이들 용어가 화학 및 생화학 분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 포화가능하고, 종종 가역적이며, 그래서 경쟁적인 2개의 엔티티(예를 들어, 표적과 외인성 항원, 예를 들어, 항체와 항원, 수용체와 리간드, 효소와 기질, 비오틴과 아비딘 등) 간의 임의의 상호작용을 설명한다. 예를 들어, 생물학적 분자, 예를 들어, 단백질, 펩티드 및 핵산을 수반하는 특이적인 결합은 결합쌍의 하나의 구성원이 하전, 극성 또는 소수성 모이어티의 형상과 분포를 갖는 부위를 갖는 경우에 발생하여, 동족 리간드와 상기 부위의 상호작용이 유리한 에너지학을 특징으로 하게 한다(즉, 음성 결합 자유 에너지). 상호작용의 특이성은 결합 상수(Kd)로 측정되거나 표현될 수 있다. Kd는 pM 범위, μM 범위 및 nM 범위를 포함하는 mM 범위 내지 fM 범위의 범위일 수 있다. 전형적인 Kd 값은 약 10^-6 M 미만, 약 10^-7 M 미만, 약 10^-8 M 미만이고, 일부 구현예에서 약 10^-9 M 미만이다.

본원에 사용되는 용어 "실질적으로" 또는 "실질적인"은 예를 들어, 특정 공간 내의 엔티티의 존재, 수준 또는 농도, 하나의 엔티티에 대한 다른 엔티티의 영향 또는 치료의 효과를 지칭한다. 예를 들어, 엔티티의 활성, 수준 또는 농도는 증가가 기준선에 비하여 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 50배, 100배 또는 1000배이면, 실질적으로 증가된다. 엔티티의 활성, 수준 또는 농도는 또한, 증가가 기준선에 비하여 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200% 또는 500%이면, 실질적으로 증가된다. 엔티티는 그것이 당해 분야에 알려져 있는 방법에 의해 검출될 수 있다면 특정 공간에 실질적으로 존재할 수 있다. 엔티티는 그것이 해당 분야에 알려져 있는 검정 및 방법에 대한 검출 하한 미만의 수준으로 존재한다면, 특정 공간에 실질적으로 존재하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 엔티티는 그것이 거의 검출가능하지 않지만, 표현형을 야기하거나 표현형을 변화시키지 않는 비작용성 양 또는 극미한 양으로만 존재한다면, 특정 공간에 실질적으로 존재하지 않을 수 있다. 다른 구현예에서, 엔티티는 그것이 모집단을 구성하는 소수의 구성성분, 예를 들어, 모집단의 구성성분의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% 2% 미만 또는 1%, 0.5%, 0.1% 미만에서만 존재하고, 검출될 수 있다면, 특정 모집단에 실질적으로 존재하지 않을 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 제핵시에 보유되지 않을 수 있고, 세포는 비-복제가능하게 되고, 제핵 세포는 외인성 핵산에 의해 인코딩되는 외인성 항원 폴리펩티드를 지속적으로 발현시킬 수 없다. 외인성 폴리펩티드를 유의미하게 계속 번역시키는 세포의 능력의 소실은 단백질 발현을 "효율적으로 종결시킨다". 특정 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 자가-복제, 예를 들어, 핵산의 복제가 실질적으로 불가능하다. 예를 들어, 외인성 항원-발현 EHC는 혼입 검정에서 표지된 뉴클레오티드, 예를 들어, 티미딘과 접촉된다면, 뉴클레오시드를 실질적으로 혼입시키지 않는다. 일부 구현예에서, 외인성 항원-발현 EHC는 상당한 양의 자가-복제 핵산을 함유하지 않는다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 서열의 용어 "상당한 동일성"은 폴리뉴클레오티드가 적어도 25% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것을 의미한다. 대안적으로, 동일성 백분율은 25% 내지 100%의 임의의 정수일 수 있다. 더욱 바람직한 구현예는 본원에 기재된 프로그램; 바람직하게는 표준 파라미터를 사용한 BLAST를 사용하여 참조 서열에 비하여 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%를 포함한다.

"합성"은 인공 및 비천연 발생이거나, 또는 그것이 천연 발생한다면, 그것이 천연적으로 존재하지 않을 상황 또는 위치에 존재하거나, 또는 그것이 천연적으로 상기 상황 또는 위치에 존재한다면, 소정의 상태의 순도로 존재하거나, 또는 그것이 천연적으로 상기 상황 또는 위치에 존재하지 않을 양, 농도 또는 수로 존재하는 화합물 또는 분자를 지칭한다. 합성 엔티티는 임의로 그들의 천연 상태, 외인성 핵산, 외인성(이종) 외인성 항원 등으로부터 화학적으로 또는 효소적으로 변형되는 단리된 또는 정제된 화합물일 수 있다. 임의의 엔티티에서의 본원에 정의된 바와 같은 합성 화합물 또는 분자의 존재는 전체 엔티티가 "합성"이 되게 한다. 예를 들어, 외인성 항원을 포함하는 세포는 합성 세포이다.

본원에 사용되는 "표적"은 외인성 항원과 상호작용할 수 있는, 예를 들어, 외인성 항원과 회합하거나, 그에 결합하기 위한 엔티티이다. "표적"은 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 항체-관련 폴리펩티드, 보체 구성성분, 아밀로이드 단백질, 병원체, 독소, 프리온), 분자(예를 들어, 대사산물, 스테로이드, 호르몬, 탄수화물; 올리고당; 화학물질; 다당류, DNA; RNA; 지질, 아미노산, 원소, 독소 또는 병원체), 복합체(예를 들어, 면역 복합체) 또는 세포(예를 들어, 암 세포, 대식구, 박테리아, 진균, 바이러스 또는 기생충)를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 표적은 본원에 제공되는 방법에 의해 검출되거나, 진단되거나, 손상되거나, 파괴되거나 변경(예를 들어, 기능적으로 보완)되는 것으로 의도된다. 특정 표적은 대상체의 순환계 내의 다른 엔티티 없이 발생할 수 있거나 그와 회합된다.

본원에 사용되는 "표적 자가-항체"는 자가면역 질병과 관련된 자가-항체이다. 그러한 자가-항체는 대상체의 항체를 대상체 자신의 조직, 통상 갑상선, 위, 간 및 신장 조직과 접촉시키는 것을 포함하는 항체 결합 시험을 사용하여 검출되고 분석될 수 있다. "자가" 조직에 결합하는 항체(자가-항원 포함)는 자가면역 장애를 나타낸다.

"전이유전자" 또는 "외인성 핵산"은 EHC 내로 도입되는 외래 또는 고유 뉴클레오티드 서열을 말한다. 전이유전자 및 외인성 핵산은 본원에 상호교환가능하게 사용되며, 재조합 핵산을 포함한다.

본원에 사용되는 "치료한다", "치료하는" 및/또는 "치료"는 유리한 또는 요망되는 임상 결과, 약리학적 및/또는 생리적 효과, 예를 들어, 증상의 경감, 상기 증상의 예방 또는 제거를 수득하기 위한 방법이며, 특정 질병, 장애 또는 질환의 치료적 처치 및 예방 또는 예방용 처치 둘 모두를 지칭한다. 유리한 또는 요망되는 임상 결과, 약리학적 및/또는 생리학적 효과는 질병, 장애 또는 질환의 소인이 있을 수 있지만, 아직 질병의 증상을 경험하거나 나타내지 않는(예방적 처치) 대상체에서 질병, 장애 또는 질환이 발생하는 것의 예방, 질병, 장애 또는 질환의 증상의 완화, 질병, 장애 또는 질환의 정도의 감소, 질병, 장애 또는 질환의 안정화(즉, 악화 부재), 질병, 장애 또는 질환의 확산의 방지, 질병, 장애 또는 질환 진행의 지연 또는 감속, 질병, 장애 또는 질환의 개선 또는 경감, 및 그들의 조합, 및 치료를 제공받지 않는 경우 예상되는 생존에 비한 생존의 연장을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

"치료제" 또는 "치료적 분자"는 유효량으로 존재하는 경우, 그를 필요로 하는 대상체에서 요망되는 치료 효과, 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 생성하는 화합물 또는 분자를 포함한다.

용어 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 유리한 또는 요망되는 임상 결과, 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 야기하기에 충분한, 대상체에게 투여되는 작용제의 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 유효량은 전형적으로 병태의 진행을 일시적으로 완화시키거나, 개선시키거나, 안정화시키거나, 역행시키거나, 감속시키거나 지연시키는데 충분하다. 따라서, 유효량은 요망되는 치료적 및/또는 예방적 효과를 합리적으로 달성하는데 충분한 작용제의 양 또는 특정 양의 작용제의 투여 빈도를 말한다. 예를 들어, 그것은 치료되는 질병 또는 장애와 관련된 증상, 예를 들어, 면역 관용이 요망되는 자가면역 반응, 과다활성 면역 활성화 또는 억제성 항체 생성과 관련된 질병 또는 의학적 질환 또는 표적 폴리펩티드와 관련된 질병 또는 의학적 질환의 예방, 그의 치료 또는 그의 감소를 초래하는 양을 포함할 수 있다. 대상체로 투여되는 치료적 조성물의 양은 질병의 유형 및 중증도, 및 개체의 특징, 예를 들어, 일반적 건강, 병리학적 증상, 식이, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 관용에 따라 달라질 것이다. 또한, 그것은 질병의 정도, 중증도 및 유형에 따라 달라질 것이다. 추가로, 유효량은 사용되는 제형 및 투여 방법, 예를 들어, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도 및 반응 감수성에 따라 달라질 것이다. 당업자는 이들 및 기타 인자에 따라 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 또한, 조성물은 하나 이상의 추가의 치료적 화합물과 병용하여 투여될 수 있다 바람직한 약제학적 조성물의 투여량은 성인에 있어서, 약 0.001 내지 100 ㎎/㎏의 범위일 수 있다. 일 예에서, 정맥내 투여는 최소한으로 효과적인 용량으로 개시되고, 용량을 양의 효과가 관찰될 때까지 소정의 시간에 걸쳐 증가시킨다. 결과적으로, 투여량의 증분식 증가는 나타날 수 있는 임의의 유해 효과를 고려하여 상응하는 효과의 증가를 생성하는 수준으로 제한되어 이루어진다. 적합한 투여량의 비제한적인 예는 예를 들어, 1×10¹⁰ 내지 1×10¹⁴, 1×10¹¹ 내지 1×10¹³, 또는 5×10¹¹ 내지 5×10¹²개의 범위의 본 발명의 외인성 항원-발현 EHC일 수 있다. 특정 예는 약 5×10¹⁰, 6×10¹⁰, 7×10¹⁰, 8×10¹⁰, 9×10¹⁰, 1×10¹¹, 2×10¹¹, 3×10¹¹, 4×10¹¹, 5×10¹¹, 6×10¹¹, 7×10¹¹, 8×10¹¹, 9×10¹¹, 1×10¹²개 이상의 본 발명의 외인성 항원-발현 EHC를 포함한다. 각 용량의 외인성 항원-발현 EHC는 매일 1회, 주 1회, 주 2회, 개월마다 1회 또는 개월마다 2회의 간격으로 투여될 수 있다.

"미결합된"은 외인성 항원이 상호작용할 수 있는 표적의 상태를 지칭한다. 미결합 표적은 다른 엔티티 또는 외인성 항원과 회합되지 않는다. 미결합 외인성 항원은 다른 엔티티 또는 표적과 회합되지 않는다. 표적은 일단 표적이 외인성 항원 또는 다른 엔티티와 회합되면, "결합"된 것으로 여겨진다. 미결합 표적은 순환 중 가용성 형태의 표적을 포함한다. 결합 표적은 순환 중 또는 말초 조직 내의 엔티티에 매립되거나, 그와 회합되거나, 그와 연결되거나, 다르게는 그와 상호작용하는 표적을 포함한다. 표적이 상호작용할 수 있는 엔티티는 순환 세포, 말초 내피 조직, 면역 복합체, 당지질, 미생물, 면역글로불린, 혈청 알부민, 응고 인자, 지질단백질 및 전해질을 포함한다.

"변이체"는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 기타 변형에 의해 원래의 단백질과 상이한 폴리펩티드이다. 이들 변형은 원래의 단백질의 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다. 많은 경우에, 변이체는 원래의 단백질의 생물학적 활성의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%를 보유한다. 또한, 변이체의 생물학적 활성은 원래의 단백질의 생물학적 활성보다 더 높을 수 있다. 변이체는 예를 들어, 대립형질 변이 또는 다형성에 의해 천연 발생이거나, 또는 의도적으로 조작될 수 있다.

변이체의 아미노산 서열은 원래의 단백질의 아미노산 서열과 실질적으로 동일하다. 많은 구현예에서, 변이체는 원래의 단백질과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상의 전체 서열 동일성 또는 유사성을 공유한다. 서열 동일성 또는 유사성은 해당 분야에 알려져 있는 다양한 방법, 예를 들어, 기본 국소 정렬 도구(Basic Local Alignment Tool, BLAST), 돗트 매트릭스 분석(dot matrix analysis) 또는 동적 프로그래밍 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일 예에서, 서열 동일성 또는 유사성은 지네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, GCG) 프로그램 GAP(니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘)를 사용함으로써 결정된다. 변이체 및 원래의 단백질의 아미노산 서열은 하나 이상의 영역에서 실질적으로 동일할 수 있지만, 다른 영역에서 다를 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "벡터"는 바람직하게는 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 간에 삽입된 핵산 분자, 예를 들어, 전이유전자 또는 외인성 핵산을 전달 및/또는 복제하는 자기-복제 핵산 분자이다. 그것은 게놈 내로 재조합 DNA의 단편이 삽입되고, EHC 내로 재조합 DNA 또는 전이유전자를 도입하기 위해 사용되는 플라스미드 또는 바이러스 염색체를 포함한다.

실시예

하기의 실시예는 제한하기 위한 것이 아니고, 예시하기 위하여 제공된다.

실시예 1: 이종 유전자 발현이 있는 적혈구계 세포의 배양

CD34 세포를 Mini-MACS 컬럼(Miltenyi Biotec; 94% +/- 3% 순도)의 사용에 의해 초자성(supermagnetic) 마이크로비드 선택에 의해 말초 혈액으로부터 단리한다. 세포를 안정화 글루타민, 330 ㎍/㎖ 홀로(holo)-인간 트랜스페린, 10 ㎍/㎖ 재조합 인간 인슐린, 2 IU/㎖ 헤파린 및 5% 용매/세제 바이러스-불활성화 혈장이 보충된 IMDM에 기초한 적혈구계 분화 배지(EDM)에서 배양한다. 증량 절차는 3 단계를 포함한다. 제1 단계(제0일 내지 제7일)에서, 10^4개/㎖의 CD34 세포를 1 μM 하이드로코르티손, 100 ng/㎖ SCF, 5 ng/㎖ IL-3 및 3 IU/㎖ Epo의 존재하에 EDM에서 배양한다. 제4일에, 1 부피의 세포 배양물을 SCF, IL-3, Epo 및 하이드로코르티손을 함유하는, 4 부피의 신선한 배지에 희석시킨다. 제2 단계(제7일 내지 제11일)에서, 세포를 SCF 및 Epo가 보충된 EDM에서 10^5개/㎖로 재현탁화시킨다. 제3 단계(제11일 내지 제18일)에서, 세포를 단독의 Epo가 보충된 EDM에서 배양한다. 세포 계수를 각각 제11일 및 제15일에 7.5x10^5 내지 1x10^6 및 5-10 x 10^6개 세포/㎖로 조정한다. 제18일을 넘어서, Epo를 함유하는 배양 배지를 주 2회 새로 교체한다. 배양물을 공기 중에 5% CO2에서 37℃에서 유지시킨다.

관심 항원의 코딩 서열은 적혈구계-특이적 프로모터, 예를 들어, GATA-1의 제어하에 배치되고, 폴리-A 테일로 종결되며, 예를 들어, 문헌[Repik et al., Clin Exp Immunol 2005, 140:230]을 참조한다. 이러한 서열은 렌티바이러스 벡터(예를 들어, EF1, System Biosciences, Inc.)에서 인코딩된다. 벡터는 표준 방법에 의해 293T 세포로부터 생성된다. 렌티바이러스 벡터는 제1일 내지 제4일의 배양 동안 예를 들어, 문헌[Chang et al., Nat Biotechnol 2006, 24:1017]에 기재된 바와 같이, 인간 조혈 전구 세포, 예를 들어, CD34+ 세포 또는 무한증식 적혈모구 또는 iPS 세포로 형질도입된다. 이후의 증량 및 분화 단계는 상기 기재된 바와 같이 수행된다.

실시예 2: 저장성/고장성 사이클링에 의한 적혈구계 세포로의 단백질의 로딩

항원, 이 경우에는 OVA를 70%의 적혈구용적률(hematocrit, Hct)을 사용하여 0.5 또는 5 ㎎/㎖의 최종 농도로 RBC 현탁액에 첨가한다. 저장성 투석 과정(50 mOsmol/㎏) 후에, 37C에서 30분 동안 고장성 용액(1900 mOsmol/㎏)을 첨가함으로써 RBC를 재밀봉한다. OVA-로딩된 RBC를 0.9% NaCl + 0.2% 글루코스 용액으로 4회 세척하고, 4C에서, 1000×g에서 10분 동안 원심분리하고, 혈장 또는 완충제를 사용하여 50%의 Hct로 조정한다.

실시예 3: 이종이작용성 가교제를 사용한 세포 표면 표지화

노출된 환원 티올기가 있는 항원(항원-SH)을 5 mM TCEP와의 인큐베이션에 의해 제조한다. 환원제를 컨쥬게이션 전에 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거한다. 세포를 말레이미드-PEG-NHS 가교제, 예를 들어, SM(PEG)x(Thermo Scientific)와 30분 동안 인큐베이션시킨다. NHS 기는 세포 표면 항원 상의 유리 아민기와 반응한다. 반응된 세포를 PBS 중에 세척하여, 과잉의 가교제를 제거한다. 항원-SH 용액을 세포+가교제 용액에 도입하고, 말레이미드-SH 반응이 30분 동안 진행되게 한다. 세포를 펠렛화시키고, 세척하여, 미결합 항원을 제거한다.

실시예 4: 소타아제를 사용한 세포 표면 표지화

소타아제 A 수용 서열, LPXTG를 함유하는 표면 단백질을 발현하는 세포를 37℃에서 4시간 동안 50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂로 이루어진 반응 완충제에서 100 μM 소타아제 A와 인큐베이션시킨다. 10배 몰 과량의 친핵체, GGG-항원을 도입하고, 반응이 실온에서 하룻밤 진행되게 한다. 반응 후에, 과잉의 소타아제 및 미반응 친핵체를 펠렛화 및 세포의 세척에 의해 제거한다.

실시예 5: 클릭 화학을 사용한 세포 표면 표지화

세포를 알킨-NHS 에스테르와 반응시켜, 제조처의 지침(예를 들어, Glen Research)에 따라 세포 표면상의 노출된 일차 아민에 알킨기를 컨쥬게이트시킨다. 과잉의 알킨-NHS 에스테르를 펠렛화 및 세포의 세척에 의해 제거한다. 항원을 아지드-NHS 에스테르와 반응시켜, 제조처의 지침(예를 들어, Thermo Scientific)에 따라 항원상의 노출된 일차 아민에 아지드기를 컨쥬게이트시킨다. 과잉의 아지드-NHS 에스테르를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거한다. 알킨-세포 및 아지드-항원을 실온에서 구리-촉매작용 고리 첨가에 의해 반응시킨다.

실시예 6: 마우스에서의 T 세포 증식의 측정

OTI(CD45.2⁺) 마우스 비장 유래의 CD8⁺ T 세포를 제조처의 지침에 따라 CD8 자기 비드 음성 선택 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 단리한다. 신선하게 단리된 CD8⁺ OTI 세포를 PBS 중에 재현탁화시키고, 실온에서 6분 동안 1 μM CFSE(Invitrogen)로 표지하고, 반응물을 10%(부피/부피) FBS(Gibco)가 있는 동 부피의 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's modified Dulbecco's medium, IMDM)를 사용하여 1분 동안 켄칭시킨다. 세포를 세척하고, 계수하고, 주사 전에 순수한 IMDM 중에 재현탁화시킨다. 총 3 × 10⁶개의 CFSE-표지된 CD8⁺ OTI 세포를 수여자 CD45.1+ 마우스의 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사한다. 단기간 증식 연구를 위하여, OVA-포함 적혈구계 세포를 입양 전달 후 24시간에 주사한다. 비장세포를 항원 투여 후 5일에 수집하고, 유세포계수법에 의한 분석을 위하여 염색한다.

실시예 7: 마우스에서의 OVA 항원 시험접종 모델

총 3 × 10⁵개의 CFSE-표지된 OTI CD8⁺ T 세포를 상기 기재된 바와 같이 CD45.1⁺ 수여자 마우스 내로 주사한다. 입양 전달 후 1일 및 6일에, 마우스에 100 ㎕의 OVA-포함 적혈구계 세포를 꼬리 정맥 내로 정맥내 투여한다. 입양 전달 후 15일에, 마우스에 각 뒷다리 패드 내로 피내 주사되는 25 ㎕의 염수 중 5 ㎍의 OVA 및 25 ng의 초순수 이. 콜라이(E. coli) LPS(InvivoGen)를 시험접종한다(Hock 방법: 총 10 ㎍의 OVA 및 50 ng의 LPS의 용량). 항원 특이적 B 및 T 세포의 정량화 및 혈청 항체 역가는 하기 기재되어 있다.

실시예 8: 마우스에서의 항원 특이적 B 및 T 세포의 정량화

마우스를 상기 기재된 바와 같이 OVA 시험접종 후 4일에 죽이고, 비장 및 배액 림프절 세포를 재자극을 위해 단리한다. 세포내 사이토카인의 유세포계수 분석을 위하여, 세포를 3시간 동안 1 ㎎/㎖ OVA 또는 1 ㎍/㎖ SIINFEKL 펩티드(Genscript)의 존재하에 재자극한다. 브레펠딘(brefeldin)-A(5 ㎍/㎖; Sigma)를 첨가하고, 염색 및 유세포계수 분석 전에 재자극을 추가 3시간 동안 다시 시작한다. 분비된 인자의 ELISA 측정을 위하여, 세포를 4일 동안 100 ㎍/㎖ OVA 또는 1 ㎍/㎖ SIINFEKL 펩티드의 존재하에 재자극시킨다. 세포를 회전시키고, 제조처의 지침에 따른 IFN-γ 및 IL-10 Ready-Set-Go 키트(eBioscience)를 사용한 ELISA 분석을 위해 배지를 수집한다.

실시예 9: 순환 항체 역가의 정량화

OVA-특이적 혈청 IgG를 마우스 혈청을 OVA-코팅 플레이트 상에 다양한 의석으로 인큐베이션시킨 후에, 염소 항-마우스 IgG-HRP(Southern Biotech)를 사용한 최종 인큐베이션에 의해 검출한다.

실시예 10: 세포외 SpyTag-SpyCatcher 관용 유도

Kell 및 SpyTag의 코딩 서열을 함유하는 발현 카세트를 합성하고, 렌티바이러스 벡터 EF1에 삽입한다. CD34+ 세포의 모집단을 벡터로 형질전환시킨다. Kell-SpyTag 융합 단백질의 발현을 FACS에 의해 정량화한다. 그 다음, 세포외로 Kell-SpyTag를 발현하는 세포를 SpyCatcher 서열 및 cMyc 태그에 융합된 Ara h(1-6) 펩티드의 용액에 둔다. 인큐베이션 후에, 세포를 FACS를 사용하여 분리하여, SpyCatcher-ArahX-cMyc로의 Kell-SpyTag의 공유적 이소펩티드 컨쥬게이션을 정량화한다. 또한, 세포를 저장성으로 용해시키고, Kell-SpyTag-SpyCatcher-ArahX-cMyc의 존재를 웨스턴 블롯에 의해 정량화한다.

실시예 11: 유전자 어셈블리

하기의 유전자 - 글리코포린 A(Uniprot ID P02724), Kell(Uniprot ID P23276), B형 간염 표면 항원에 대한 항체 scFv(문헌[Bose et al. 2003 Mol Immunol 40(9):617], GenBank ID AJ549501.1), 아데노신 데아미나제(Uniprot ID P00813), 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum) 유래의 페닐알라닌 하이드록실라제(GenBank ID AF146711.1), 보체 수용체 1(Uniprot ID P17927), CD46(GenBank: BAA12224.1), CD55(Uniprot ID P08174), CD59(Uniprot ID P13987), 녹색 형광 단백질(Uniprot ID P42212), 티미딘 포스포릴라제(Uniprot ID P19971), 글루코세레브로시다제(Uniprot ID P04062), 베타2 당단백질 1(Uniprot ID P02749), 포스포리파제 a2 수용체(Uniprot ID Q13018), 콜라겐 알파-3(IV)(Uniprot ID Q01955), 혈청 아밀로이드 P(Uniprot ID P02743), 지질단백질 리파제(Uniprot ID P06858), 아스파라기나제(Uniprot ID P00805), 인자 IX(Uniprot ID F2RM35), ADAMTS13(Uniprot ID Q76LX8)을 인코딩하는 DNA를 Dharmacon(GE Life Sciences)으로부터 cDNA로서 구입하거나 DNA2.0 및 Genscript에 의해 새로이 합성하였다.

1. 단일 유전자 클로닝(CR1)

유전자를 해당 분야에 알려져 있는 표준 분자 생물학 방법에 의해 발현 벡터 내로 어셈블시켰다. 보체 수용체 1(CR1)에 대한 유전자는 상업적 판매사(DNA2.0)에 의해 합성되고, 이는 표준 클로닝 벡터(pJ 시리즈)에서 공급되었다. 유전자를 비상동성 말단 서열이 있는 올리고를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 pJ 벡터 밖으로 증폭시켜, 포유류 발현 벡터(System Biosciences, pM 시리즈) 내로의 삽입을 위해 제조한다: 업스트림 올리고는 업스트림 pM 삽입 부위에 상동성인 25 nt 및 CR1의 시작에 상동성인 25 nt로 이루어지며; 다운스트림 올리고는 다운스트림 pM 삽입 부위에 상동성인 25 nt 및 CR1의 말단에 상동성인 25 nt로 이루어졌다. 증폭된 생성물을 겔 전기영동(Qiagen)에 의해 정제하였다. pM 벡터를 업스트림 및 다운스트림 삽입 부위에 상동성인 꼬리-대-꼬리 올리고를 사용한 PCR에 의해 선형화시키고, PCR 정제(Qiagen)에 의해 정제하였다. CR1 앰플리콘을 문헌[Gibson 2011, Methods Enzymology Vol 498, p. 394]에 상세히 기재된 Gibson 어셈블리에 의해 선형화된 pM 벡터 내로 라이게이션시켰다. 서열을 Sanger 시퀀싱에 의해 확인하였다.

2. 2개의 유전자의 융합(막 Kell-scFv)

Kell에 대한 유전자를 cDNA로 구입하였으며, 이는 표준 클로닝 벡터(pJ 시리즈)에서 공급되었다. B형 간염 표면 항원에 특이적인 항체 scFv에 대한 유전자(scFv, 문헌[Bose 2003, Molecular Immunology 40:617]에 기재)는 상업적 판매사(DNA2.0)에 의해 합성되고, 이는 표준 클로닝 벡터(pJ 시리즈)에서 공급되었다. 유전자를 비상동성 말단 서열이 있는 올리고를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 pJ 벡터 밖으로 증폭시켜, 포유류 발현 벡터(System Biosciences, pM 시리즈) 내로의 삽입을 위해 제조한다. Kell을 업스트림 pM 삽입 부위에 상동성인 25 nt 및 Kell의 5' 말단에 상동성인 25 nt로 이루어진 업스트림 올리고, 및 scFv의 5' 말단에 상동성인 25 nt 및 Kell의 3' 말단에 상동성인 25 nt로 이루어진 다운스트림 올리고로 증폭시켰다. scFv를 Kell 삽입 부위의 3' 말단에 상동성인 25 nt 및 scFv의 5' 말단에 상동성인 25 nt로 이루어진 업스트림 올리고, 및 다운스트림 pM 삽입 부위에 상동성인 25 nt 및 scFv의 3' 말단에 상동성인 25 nt로 이루어진 다운스트림 올리고로 증폭시켰다. 증폭된 생성물을 겔 전기영동(Qiagen)에 의해 정제하였다. pM 벡터를 업스트림 및 다운스트림 삽입 부위에 상동성인 꼬리-대-꼬리 올리고를 사용한 PCR에 의해 선형화시키고, PCR 정제(Qiagen)에 의해 정제하였다. Kell 및 scFv 앰플리콘을 문헌[Gibson 2011, Methods Enzymology Vol 498, p. 394]에 상세히 기재된 1-포트(one-pot) Gibson 어셈블리에 의해 선형화된 pM 벡터 내로 라이게이션시켰다. 서열을 Sanger 시퀀싱에 의해 확인하였다.

3. 유전자 간의 링커-어셈블리(Kell-scfv)

Kell에 대한 유전자를 cDNA로 구입하였으며, 이는 표준 클로닝 벡터(pJ 시리즈)에서 공급된다. B형 간염 표면 항원에 특이적인 항체 scFv에 대한 유전자(scFv, 문헌[Bose 2003, Molecular Immunology 40:617]에 기재)는 상업적 판매사(DNA2.0)에 의해 합성되고, 이는 표준 클로닝 벡터(pJ 시리즈)에서 공급되었다. 유전자를 비상동성 말단 서열이 있는 올리고를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 pJ 벡터 밖으로 증폭시켜, 포유류 발현 벡터(System Biosciences, pM 시리즈) 내로의 삽입을 위해 제조한다. Kell을 업스트림 pM 삽입 부위에 상동성인 25 nt 및 Kell의 5' 말단에 상동성인 25 nt로 이루어진 업스트림 올리고; 및 scFv의 5' 말단에 상동성인 25 nt, (GlyGlyGlySer)x2 스페이서를 인코딩하는 24 nt 및 Kell의 3' 말단에 상동성인 25 nt로 이루어진 다운스트림 올리고로 증폭시켰다. scFv를 Kell 삽입 부위의 3' 말단에 상동성인 25 nt, (GlyGlyGlySer)x2 스페이서를 인코딩하는 24 nt 및 scFv의 5' 말단에 상동성인 25 nt로 이루어진 업스트림 올리고; 및 다운스트림 pM 삽입 부위에 상동성인 25 nt 및 scFv의 3' 말단에 상동성인 25 nt로 이루어진 다운스트림 올리고로 증폭시켰다. 증폭된 생성물을 겔 전기영동(Qiagen)에 의해 정제하였다. pM 벡터를 업스트림 및 다운스트림 삽입 부위에 상동성인 꼬리-대-꼬리 올리고를 사용한 PCR에 의해 선형화시키고, PCR 정제(Qiagen)에 의해 정제하였다. Kell 및 scFv 앰플리콘을 문헌[Gibson 2011, Methods Enzymology Vol 498, p. 394]에 상세히 기재된 1-포트 Gibson 어셈블리에 의해 선형화된 pM 벡터 내로 라이게이션시켰다. 서열을 Sanger 시퀀싱에 의해 확인하였다.

4. 에피토프 태그 부착(Kell-scFv)

Kell에 대한 유전자를 cDNA로 구입하였으며, 이는 표준 클로닝 벡터(pJ 시리즈)에서 공급되었다. B형 간염 표면 항원에 특이적인 항체 scFv에 대한 유전자(scFv, 문헌[Bose 2003, Molecular Immunology 40:617]에 기재)는 상업적 판매사(DNA2.0)에 의해 합성되고, 이는 표준 클로닝 벡터(pJ 시리즈)에서 공급되었다. 유전자를 비상동성 말단 서열이 있는 올리고를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 pJ 벡터 밖으로 증폭시켜, 포유류 발현 벡터(System Biosciences, pM 시리즈) 내로의 삽입을 위해 제조한다. Kell을 업스트림 pM 삽입 부위에 상동성인 25 nt 및 Kell의 5' 말단에 상동성인 25 nt로 이루어진 업스트림 올리고; 및 scFv의 5' 말단에 상동성인 25 nt, (GlyGlyGlySer)x2 스페이서를 인코딩하는 24 nt 및 Kell의 3' 말단에 상동성인 25 nt로 이루어진 다운스트림 올리고로 증폭시켰다. scFv를 Kell 삽입 부위의 3' 말단에 상동성인 25 nt, (GlyGlyGlySer)x2 스페이서를 인코딩하는 24 nt 및 scFv의 5' 말단에 상동성인 25 nt로 이루어진 업스트림 올리고; 및 다운스트림 pM 삽입 부위에 상동성인 25 nt, HA 에피토프 태그를 인코딩하는 27 nt 서열 tacccctatgacgtgcccgactatgcc(Seq. ID No. 8) 및 scFv의 3' 말단에 상동성인 25 nt로 이루어진 다운스트림 올리고로 증폭시켰다. 증폭된 생성물을 겔 전기영동(Qiagen)에 의해 정제하였다. pM 벡터를 업스트림 및 다운스트림 삽입 부위에 상동성인 꼬리-대-꼬리 올리고를 사용한 PCR에 의해 선형화시켰다. 다운스트림 프라이머는 추가로 HA 에피토프 태그를 인코딩하는 27 nt 서열 tacccctatgacgtgcccgactatgcc(Seq. ID No. 8)를 함유하였다. 선형화된 벡터를 PCR 정제(Qiagen)에 의해 정제하였다. Kell 및 scFv 앰플리콘을 문헌[Gibson 2011, Methods Enzymology Vol 498, p. 394]에 상세히 기재된 1-포트 Gibson 어셈블리에 의해 선형화된 pM 벡터 내로 라이게이션시켰다. 서열을 Sanger 시퀀싱에 의해 확인하였다.

5. 2개의 유전자의 융합(리포터 어셈블리)(GPA-HA)

보체 수용체 1(CR1) 및 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 유전자는 상업적 판매사(DNA2.0)에 의해 합성되고, 이는 표준 클로닝 벡터(pJ 시리즈)에서 공급되었다. CR1 유전자를 비상동성 말단 서열이 있는 올리고를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 pJ 벡터 밖으로 증폭시켜, 포유류 발현 벡터(System Biosciences, pM 시리즈) 내로의 삽입을 위해 제조한다: 업스트림 올리고는 업스트림 pM 삽입 부위에 상동성인 25 nt 및 CR1의 시작에 상동성인 25 nt로 이루어지며; 다운스트림 올리고는 바이러스-유래 T2A 서열에 상동성인 54 nt gagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggsgsstcccggccct(Seq. ID No. 7)로 이루어졌다. GFP 유전자를 비상동성 말단 서열이 있는 올리고를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 pJ 벡터 밖으로 증폭시켜, 포유류 발현 벡터(System Biosciences, pM 시리즈) 내로의 삽입을 위해 제조하였다: 업스트림 올리고는 바이러스-유래 T2A 서열에 상동성인 54 nt gagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggsgsstcccggccct(Seq. ID No. 7) 및 GFP의 시작에 상동성인 25 nt로 이루어지며; 다운스트림 올리고는 다운스트림 pM 삽입 부위에 상동성인 25 nt 및 GFP의 말단에 상동성인 25 nt로 이루어졌다. 증폭된 생성물을 겔 전기영동(Qiagen)에 의해 정제하였다. pM 벡터를 업스트림 및 다운스트림 삽입 부위에 상동성인 꼬리-대-꼬리 올리고를 사용한 PCR에 의해 선형화시키고, PCR 정제(Qiagen)에 의해 정제하였다. CR1 및 GFP 앰플리콘을 문헌[Gibson 2011, Methods Enzymology Vol 498, p. 394]에 상세히 기재된 Gibson 어셈블리에 의해 선형화된 pM 벡터 내로 함께 라이게이션시켰다. 서열을 Sanger 시퀀싱에 의해 확인하였다.

실시예 12: mRNA 어셈블리

관심 유전자를 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 pSP64 벡터(Promega)의 다중 클로닝 부위 내로 클로닝한다. 벡터를 EcoRI(NEB)으로 분해하여, SP6 프로모터, 관심 유전자 및 30 뉴클레오티드 길이 폴리-A 테일을 함유하는 선형화된 dsDNA 벡터를 생성한다. mRNA를 권고된 농도의 5' 캡 유사체(ARCA)를 포함하여, 제조처의 지침에 따라 SP6 RNA 중합효소(Promega)를 사용한 반응에 의해 합성하여, 캡핑된 mRNA 전사물을 합성한다. 그 다음, 반응 혼합물을 DNAse로 처리하여, 주형 벡터를 분해하고(Promega로부터의 Riboprobe), mRNA를 EZNA MicroElute RNA Clean-Up 키트(Omega)를 사용하여 정제한다.

실시예 13: 세포 배양

1. 인간 적혈구(RBC)

CD34 세포를 Mini-MACS 컬럼(Miltenyi Biotec; 94% +/- 3% 순도)의 사용에 의해 초자성 마이크로비드 선택에 의해 말초 혈액으로부터 단리한다. 세포를 안정화 글루타민, 330 ㎍/㎖ 홀로-인간 트랜스페린, 10 ㎍/㎖ 재조합 인간 인슐린, 2 IU/㎖ 헤파린 및 5% 용매/세제 바이러스-불활성화 혈장이 보충된 IMDM에 기초한 적혈구계 분화 배지(EDM)에서 배양한다. 증량 절차는 3 단계를 포함한다. 제1 단계(제0일 내지 제7일)에서, 10^4개/㎖의 CD34+ 세포를 1 μM 하이드로코르티손, 100 ng/㎖ SCF, 5 ng/㎖ IL-3 및 3 IU/㎖ Epo의 존재하에 EDM에서 배양한다. 제4일에, 1 부피의 세포 배양물을 SCF, IL-3, Epo 및 하이드로코르티손을 함유하는, 4 부피의 신선한 배지에 희석시킨다. 제2 단계(제7일 내지 제11일)에서, 세포를 SCF 및 EPO가 보충된 EDM에서 10^5개/㎖로 재현탁화시킨다. 제3 단계(제11일 내지 제18일)에서, 세포를 단독의 EPO가 보충된 EDM에서 배양한다. 세포 계수를 각각 제11일 및 제15일에 7.5x10^5 내지 1x10^6 및 5-10 x 10^6개 세포/㎖로 조정한다. 제18일을 넘어서, EPO를 함유하는 배양 배지를 주 2회 새로 교체한다. 배양물을 공기 중에 5% CO2에서 37℃에서 유지시킨다.

2. 마우스 적혈구

마우스 태아 간 적혈구계 전구체로부터의 마우스 적혈구계 세포의 배양 방법은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Shi et al. 2014, PNAS 2014 111(28):10131]을 참조한다.

마우스 적혈구계 전구체를 태아 간으로부터 단리한다. 태아 간을 Charles River Labs로부터 구입한다. 간을 얼음에서 1 ㎖ PBS에 넣는다. 위 아래로 피펫팅하여, 단일-세포 현탁 용액을 얻고, 70 ㎛ 스트레이너(strainer)(BD Falcon 35-2235)에 의해 통과시킨다. 메시(mesh)를 1 ㎖ PBS로 헹군다. 통과액(배아마다 1 ㎖)을 합한다. 세포를 1.5k RPM에서 5분 동안 펠렛화시키고, 적혈구 용해 완충제(Stemcell로부터의 염화암모늄 용액)를 사용하여 재현탁화시키고, 얼음에서 10분 동안 인큐베이션시킨다. 세포를 1.5k RPM에서 5분 동안 펠렛화시키고, 용해 완충제를 제거하고, 10 ㎖ PBS-2% FBS로 재현탁화시킨다. 크롬퓨어(chromPure) 랫트 IgG(Jackson ImmunoResearch, #012-000-003)를 50 ㎕/마우스로 첨가하고, 4C에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 비오티닐화 항-마우스 TER119(BD Pharmingen, #553672)를 (1 ㎕/1*10^6개 세포)로 첨가하고, 4C에서 15분 동안 인큐베이션시킨다. Ms 리니지 패널(Lineage Panel)(Fisher Scientific(Thermo Fisher Scientific) # BDB559971)을 (2 ㎕/1*10^6개 세포)로 세포에 첨가하고, 4C에서 15분 동안 인큐베이션시킨다. 10배 부피의 PBS/로 1회 세척하고, 세포를 1.5k RPM을 사용하여 4℃에서 5분 동안 회전시킨다. 스트렙트아비딘 입자 플러스(Streptavidin Particles Plus) - DM(자기 비드)(BD Pharmigen , #557812)(5 ㎕/1*10^6개 세포)을 첨가하고, 4C에서 30분 동안 인큐베이션시킨다. 자기 홀더에서 2 내지 4개의 FACS 튜브를 준비한다. 2 ㎖ 세포를 각 튜브(총 4 ㎖)에 분취하고, 세포를 튜브 밖으로 조심히 꺼내고, 다른 측에 있는 다른 튜브에 넣어, 자기 스틱 비드의 중단을 피한다. 동일한 절차를 반복하고, Ter119 음성 및 연결 음성 세포를 새로운 튜브로 취한다. 세포를 농축시키고, 세포를 50 내지 100 ㎕ PBS(2% FBS)로 재현탁화시킨다.

정제된 적혈구계 전구체를 (40 ㎖에 있어서) IMDM : 29 ㎖, FBS(Stem Cell): 6 ㎖(최종 15%), IMDM 중 10% BSA(Stem Cell): 4 ㎖(최종 1%), 10 ㎎/㎖ 홀로-트랜스페린: 2000 ㎕(최종: 500 ㎍/㎖), 100*L-글루타민: 400 ㎕, 100* 페니실린 스트렙토마이신: 400 ㎕, 10U/㎕ Epo: 2 ㎕(최종: 0.5 U/㎖), 10 ㎎/㎖ 인슐린: 40 ㎕(최종: 10 ㎍/ml)를 포함하는 분화 배지에서 배양한다. 2*10^5개 세포/㎖을 24 웰 플레이트에서 37℃에서 분화 배지에서 배양한다. 총 44 내지 48시간의 배양 후에, 분석을 예를 들어, 본원에 수행된 바와 같은 유세포계수법에 의해 수행한다. 제핵 적혈구를 분화 프로파일 분석을 위하여 (훼히스트 염색)을 사용하여 게이팅 아웃시킨다. 성공적인 배양은 16배 증가를 제공할 것이다.

3. 혈소판

공여된 CD34+ 세포를 프레드 허친슨(Fred Hutchinson) 암 연구 센터로부터 수집한다. CD34+ 풍부 세포를 2-4 × 10^4개 세포/㎖로 무혈청 배지에 플레이팅하고, 동 부피의 배지를 첨가함으로써 배지 보충을 제4일에 행한다. 제6일에, 세포를 계수하고 분석한다: 1.5 × 10^5개 세포를 세척하고, TPO 30 ng/㎖, SCF 1 ng/㎖, 인터류킨(IL)-6 7.5 ng/㎖ 및 IL-9 13.5 ng/㎖]로 이루어진 사이토카인 칵테일이 보충된 동일한 배지 1 ㎖에 두어, 거핵구 분화를 유도한다. 제10일에, 현탁 배양물의 1/2 내지 1/4을 신선한 배지로 대체한다. 모든 사이토카인을 펩프로테크(Peprotech)로부터 구입한다. 배양물을 가습 분위기(10% CO2)에서 39℃에서 처음 6일의 배양 동안 그리고 37℃에서 마지막 8일 동안 인큐베이션시킨다. 생존가능한 유핵 세포를 혈구계수기로 계수한다(0.4% 트립판 블루; Invitrogen, Burlington, ON, Canada).

클론형성 전구 세포(CPC)를 제조처의 지침(StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada)에 따라, 골수 CPC에 대하여 MethoCult H4436, 및 콜로니-형성 단위-거핵구(CFU-Mk)에 대하여 MegaCult-C를 사용하여 검정한다. 분화를 평가하기 위하여, 세포를 FACS-Calibur(Becton Dickinson)를 사용하여 유세포계수법에 의해 CD61m CD42b, CD41, CD61 및 CD49b에 대한 항체로 염색한다. 세포 주기 분석을 위하여, 세포를 인산염-완충 염수(PBS)로 헹구고, 포름알데히드 2%(Sigma, St Louis, MO, USA)로 5분 동안 고정시키고, 0.1%의 트리톤(Triton) X-100(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 투과가능하게 한다. 그 다음, 세포를 mAb-Ki-67-FITC(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)로 표지하고, 세척하고, 제조처의 지침(BD Biosciences)에 따라 0.5 ㎖ PBS-1% 우태아혈청(FBS)-0.01% 아지드 7-아미노-액티노마이신 D(7-AAD) 중에 재현탁화시킨다.

실시예 14: 세포 단리

1. 일차 RBC

전혈을 저분자량 헤파린, 달테파린(dalteparin) 나트륨(9 유닛/㎖ 혈액)을 함유하는 튜브에 무균 기술을 사용하여 수집한다. 혈액을 5000 xg에서 5분 동안 원심분리하고, 혈장 및 버피 코트의 제거 후에(둘 모두는 이후의 이용을 위해 유지될 있음), 적혈구를 원심분리와 함께 냉(4C) 인산염 완충 염수(PBS)에 2회 세척한다. 생성된 적혈구 모집단을 장기간 보존을 위하여 CPDA-1 항응고제 또는 글리세롤 용액 중에 4C에 보관한다.

2. 일차 혈소판

전혈(40 ㎖)을 적절한 IRB 프로토콜 하에 건강한 개체로부터 3.8% 시트르산나트륨(혈액에 대하여 1:9 시트르산염 부피/부피) 중에 수집한다. 혈액을 200 g에서 15분 동안 원심분리시켜, 혈소판-풍부 혈장(PRP)을 단리한다. 그 다음, 혈소판을 1 μM 프로스타글란딘 I2의 존재하에 변형된 타이로드(Tyrode)의 완충제(138 mM NaCl, 5.5 mM 덱스트로스, 12 mM NaHCO3, 0.8 mM CaCl2, 0.4 mM MgCl2, 2.9 mM KCl2, 0.36 mM Na2HPO4 및 20 mM Hepes, pH 7.4 함유)에서 세척하고, 동일한 완충제에 재현탁화시킨다.

실시예 15: 일차 또는 배양 세포의 방사선조사

외인성 항원-발현 EHC의 모집단의 방사선조사를 수행하여, 그들이 복제할 수 없는 것을 보장할 수 있다. 그러한 프로토콜은 세포, 예를 들어, 일차 적혈구를 방사선조사하기 위해 해당 분야에 알려져 있는 것들과 유사하다. 약술하면, 1 유닛(350 ㎖)의 전혈을 취하고, 각각 175 ㎖의 2개의 분취액으로 나누고, 이에 따라, 그러한 10개 유닛을 20개 분취액으로 나눈다. 혈액의 각 유닛으로부터 1개의 분취액(175 ㎖)을 자가-함유 감마 세포 방사선조사기(GammaCell 1000, Theratronics)에 의해 50 Gy를 넘지 않는 25 Gy의 감마선 조사로 처리한다. 그 다음, 혈액을 통상의 혈액 은행 조건하에 4C에 보관한다. 제0일, 제7일, 제14일 및 제21일에, 시료추출 위치 커플러(sampling site coupler)(Fenwal, USA)의 도움으로, 이들 10개의 방사선조사된 및 10개의 비-방사선조사된 혈액 백으로부터 시료추출을 행한다. 임의의 유사분열능을 정량화하기 위한 티미딘 혼입 검정을 포함하는 세포 증식을 위한 시험을 행한다. 상층액을 흡광 분광법에 의해 유리 헤모글로빈에 대하여, 그리고 비색 검정(Pierce)에 의해 유리 락트산염 데하이드로게나제에 대하여 검정하여, 세포 용해의 수준을 평가한다.

실시예 16: 적혈구계 세포의 제핵

적혈구계 세포를 100 유닛/㎖의 페니실린 및 100 유닛/㎖의 스트렙토마이신이 보충된 IMDM 배지에 콜라겐이 코팅된 12-mm 직경 커버슬립 상에 세미컨플루언스(semiconfluence)(1 내지 4 X 10^4개 세포/cm2)까지 성장시킨다. 콜라겐은 원심분리 동안 모든 세포가 커버슬립에서 떨어지는 것을 방지하기 위해 필요하다. 세포를 10% 소 혈청이 있는 동일한 배지 또는 둘베코 변형 이글스 배지에서 커버슬립상에 단층(5 X 104개 세포/cm2)으로 성장시킨다. 세포 커버슬립을 콜라겐으로 코팅하는 것은 필요하지 않다. 세포를 제핵시키기 위하여, 커버슬립을 역위시키고(세포 측을 아래로), ㎖당 10 g의 사이토칼라신 B와 함께 2 내지 5 ㎖의 배지를 함유하는 15-㎖ Corex 원심분리 튜브의 하측에 둔다. 헤드가 제자리에 있는 (SS 34) 로터를 10,000 rpm에서 약 1시간 동안 회전시킴으로써 커버슬립이 있는 원심분리 튜브를 37℃로 가온된 Sorvall RC-2 원심분리기에 바로 둔다(온도 조절기 37 내지 39°로 설정). 원심분리의 시간 및 속도는 성공적인 제핵에 결정적인 인자이다. 세포를 37 ± 20에서 9000 rpm에서 1시간 동안 회전시키고, 세포를 37 ±- 20에서 6500 rpm에서 50분 동안 회전시킨다. 원심분리 후에, 커버슬립을 원심분리기로부터 제거하고, 사이토칼라신 B 없이 3 ㎖의 배지를 함유하는 35-㎜(Falcon) 조직 배양 접시(Biolquest) 내로 세포 측을 위로 배치한다. 370에서 30 내지 60분 내에, 세포는 형태적으로 정상이며, 90 내지 99%에는 핵이 결여되어 있다. 제핵 세포를 트립신-EDTA(Grand Island Biological Co.)로의 처리에 의해 커버슬립으로부터 제거하고, 세포를 통상의 배지에 현탁화시킨다. 그 다음, 제핵 세포를 35-㎜ 조직 배양 접시에서 유지시킨 22-mm2 커버슬립에 작은 용적으로 재플레이팅하고, 인큐베이터에 둔다. 재플레이팅 후의 시간 간격에, 커버슬립을 슬라이드 위에 봉입하고(12), 제핵물에 대한 관찰은 자이스(Zeiss) 위상차, 편광 및 노마스키(Nomarski) 광학으로 이루어진다.

실시예 17: 세포의 접촉

1. 핵산 - 트랜스펙션

관심 핵산의 규모를 확대시켜, 로딩되는 10^5개의 EHC, 예를 들어, 세포, 예컨대 적혈구계 세포, 혈소판 또는 조혈 전구 세포마다 대략 5 ㎍ 핵산을 제공한다. 핵산을 1 ㎍ 대 50 ㎕ 배지의 비로 Opti-MEM 배지(Life Technologies) 중에 희석한다. 그 다음, 희석된 핵산을 1:1 부피비로, 트랜스펙션 시약(DNA에 대해서는 Trans-IT, mRNA에 대해서는 Trans-IT mRNA, siRNA에 대해서는 Trans-IT siRNA, Mirus Bio)과 합하고, 실온에서 5분 동안 복합체가 형성되게 한다. 핵산 복합체를 12 내지 24시간 동안 세포에 첨가한다. 임의로, 이러한 기간 후에, 배지를 신선한 배지로 교체하여, 트랜스펙션 시약이 더 이상 존재하지 않게 할 수 있다.

2. 핵산 - 바이러스 형질도입

관심 유전자를 System Biosciences사의 MSCV 프로모터 서열이 있는 렌티바이러스 벡터 pCDH의 다중 클로닝 부위 내로 클로닝한다.

세포를 리포펙타민으로 트랜스펙션시킴으로써 렌티바이러스를 293T 세포에서 생성한다. 5x10^6개의 293T 세포(Lenti-X 293T 세포주, Clontech 카탈로그 #632180)를 트랜스펙션 전날에 P10 페트리 접시(petri dish)에 플레이팅한다. 세포 컨플루언시는 대략 70%여야 한다. 작제물마다 하나의 플레이트를 트랜스펙션시킨다. 20 ㎕(10 ㎍)의 pPACKH1(System Biosciences) 플라스미드 믹스 + 2 ㎍ 렌티 작제물 + 20 ㎕ 플러스(Plus) 시약(LifeTechnologies, 카탈로그 # 11514-015)을 400 ㎕의 Optimem에서 합하고, 실온에서 15분 인큐베이션시킨다. 30 ㎕의 LF2000(LifeTechnologies, 카탈로그 # 11668-019)을 400 ㎕ Optimem 내로 희석시키고, DNA 믹스에 적가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시킨다. DNA 믹스를 세포에 첨가한다(세포는 9 ㎖의 Optimem에 존재함). 세포를 6시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 배지를 DMEM/10% FBS로 교환한다. 바이러스 상층액을 1,500 rpm에서 5분 동안의 원심분리에 의해 트랜스펙션 후 48시간에 수집한다. 상층액을 수집하고, -80℃에서 1 ㎖ 분취액에서 동결시킨다.

표적 세포를 본원에 기재된 3일 내지 7일의 배양 과정에 형질도입한다. 5x10^5개의 배양된 세포를 24-웰 플레이트에 20 ㎍/㎖ 폴리브렌을 함유하는 500 ㎕의 배지에 플레이팅한다. 각 바이러스에 대하여, 세포를 3벌의 웰에서 형질도입한다. 바이러스 상층액을 다른 500 ㎕의 배지에 첨가하고, 시료를 피펫팅에 의해 혼합한다. 감염은 플레이트를 2000 rpm에서 90분 동안 실온에서 회전시켜, 회전접종(spinoculation)에 의해 달성된다. 회전접종 후에, 세포를 37C에서 하룻밤 인큐베이션시키고, 다음날, 적절한 사이토카인이 있는 1 ㎖의 신선한 IMDM 배지를 첨가한다.

3. 핵산 - 양이온성 폴리머

관심 전이유전자를 인코딩하고, 업스트림 프로모터 서열 및 다운스트림 폴리 A 테일을 포함하는 mRNA를 다수의 상업적 판매처(예를 들어, IDT-DNA, Coralville IA)로부터 구입할 수 있다. RNA 트랜스펙션을 RNAIMax(Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 또는 TRANSIT-mRNA(Mims Bio, Madison, Wis.) 양이온성 지질 전달 비히클을 사용하여 수행한다. RNA 및 시약을 먼저 Opti-MEM 기본 배지(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)에 희석시킨다. 100 ng/㎕의 RNA를 5배 희석하고, RNA ㎍당 5 ㎕의 RNAIMax를 10배 희석시킨다. 희석된 성분을 풀링하고, 그들을 배양 배지에 분배하기 전에 실온에서 15분 인큐베이션시킨다. TRANSIT-mRNA 트랜스펙션을 위하여, 100 ng/㎕ RNA를 Opti-MEM에서 10배 희석하고, BOOST 시약을 첨가하고(RNA ㎍당 2 ㎕의 농도), TRANSIT-mRNA를 첨가한 다음(RNA ㎍당 2 ㎕의 농도), RNA-지질 복합체를 실온에서 2분 인큐베이션 후에 배양 배지로 전달한다. RNA 트랜스펙션을 뉴트리스템(Nutristem) 이종부재(xenofree) hES 배지(STEMGENT®, Cambridge, Mass.) 또는 Opti-MEM + 2% FBS에서 수행한다. 숙주 세포 내로의 mRNA 전사물의 성공적인 도입은 다양한 알려져 있는 방법, 예를 들어, 형광 표지 또는 리포터 단백질, 예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP)을 사용하여 모니터링될 수 있다. 또한, 변형된 mRNA의 성공적인 트랜스펙션은 예를 들어, 웨스턴 블롯팅 또는 면역세포화학에 의해 표적 폴리펩티드의 단백질 발현 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 유사한 방법을 유사한 RNA-지질 복합체 비에 따라, 다수-리터(5 내지 10,000 ℓ) 배양 형식으로의 큰 부피의 규모 확대를 위해 따를 수 있다.

4. 핵산 - 전기천공법

관심 전이유전자를 인코딩하고, 업스트림 프로모터 서열 및 다운스트림 폴리 A 테일을 포함하는 mRNA를 다수의 상업적 판매처(예를 들어, IDT-DNA, Coralville IA)로부터 구입할 수 있다. 적혈구계 계통 세포를 mRNA 전사물로 트랜스펙션시키고, 외인성 전사물을 특이적으로 검출하기 위해 설계되는 프라이머를 사용하는 정량적 RT-PCR에 의해 트랜스펙션 효율을 측정함으로써 전기천공 파라미터를 최적화시킨다. 특정 세포 제제에 있어서, 2 ㎜ 갭이 있는 표준 전기천공법 큐벳에서 50 ㎕의 Opti-MEM(Invitrogen, Carlsbad, Calif.) 중 현탁화된 2.5×10^6개의 세포 내로의 150 μF 커패시터의 방출은 높은 생존력(>70%)을 유지하면서 표준 곡선 방법을 사용하여 결정시, 세포마다 10,000 카피 과잉의 변형된 mRNA 전사물의 반복 전달에 충분하다. 세포 밀도는 1×10^6개 세포/50 ㎕ 내지 2.5×10^6개 세포/500의 밀도까지 달라질 수 있으며, 세포마다 전사물 카피로 측정되는 유사한 효율로 세포를 트랜스펙션시키는데 110V 내지 145V를 필요로 한다. 상기 기재된 제약과 함께 기재된 방법과 유사한 큰 부피의 유동 전기천공법 전략과 유사한 다수-리터(5 내지 10,000 ℓ) 전기천공법이 수행될 수 있다(문헌[Li et al., 2002]; 문헌[Geng et al., 2010]).

5. 폴리펩티드 - 리포좀

일차 최종-분화 세포, 예를 들어, 적혈구를 포함하는 세포를 그들의 표면상에서, 그리고 그들의 세포질 내에서 외인성 단백질로 로딩할 수 있다. 단백질의 로딩은 리포좀을 사용하여 수행될 수 있다.

유기 용매 중 지질(Pro-Ject 시약, Pierce)을 유리 신틸레이션 바이얼에서 질소하에 박막으로 건조시켰다. 10^5개 세포당 대략 2 ㎕의 지질을 사용하였다. 폴리클로널 마우스 IgG(Abcam)를 제조처의 지침에 따라 Dylight-650(Pierce)으로 표지하였다. PBS 중 0.1 ㎎/㎖의 단백질 용액을 건조 지질 혼합물에 첨가하였다. 용액을 수회 피펫팅하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시킨 다음, 격렬하게 와류시켜, 캡슐화 리포좀을 생성하였다. 무혈청 배지를 첨가하여, 총 부피를 10^5개 세포마다 500 ㎕가 되게 하였다. 그 다음, 리포좀 혼합물을 37C에서 3 내지 4시간 동안 세포와 인큐베이션시켰다.

도 1은 리포좀을 사용한 일차 적혈구로의 외인성 단백질, 이 경우에는 형광-표지된 IgG의 로딩을 보여준다. 로딩은 유세포계수법에 의해 측정된다. 세포의 0.06%가 리포좀 없이 형광이고, 세포의 약 60%가 낮은 리포좀 용량에서 형광이고, 세포의 약 85%가 높은 리포좀 용량에서 형광임에 따라, 로딩은 용량-의존적이다. 도 1의 데이터는 외인성 단백질이 리포좀을 사용하여 적혈구계 세포 내로 로딩될 수 있다는 강력한 증거이다.

6. 폴리펩티드 - 기계적 파괴

세포를 일시적으로 천공시키는 1 ㎛, 2 ㎛, 3 ㎛, 4 ㎛, 5 ㎛, 10 ㎛ 너비 채널을 포함하는 미세유체 장치를 사용하여 로딩시켜, 세포가 시스템을 통과하도록 가압되는 경우 페이로드가 유입되게 할 수 있다.

실리콘-기반의 장치를 사진평판 및 딥(deep) 반응성 이온 에칭 기술을 사용하여 매사추세츠 기술 미세제작 시설 기관에서 제작한다. 이러한 과정에서 450-㎛ 두께를 갖는 6" 실리콘 웨이퍼를 헥사메틸디실라잔으로 처리하고, 3,000 rpm에서 60초 동안 감광제(OCG934; FujiFilm)로 회전 코팅시키고, 수축부 채널 설계와 함께 크롬 마스크(chrome mask)를 통해 UV 광(EV1; EVG)에 노출시키고, AZ405(AZ Electronic Materials) 용액에서 100초 동안 발색시킨다. 90℃에서의 20분의 베이킹 후에, 웨이퍼를 딥 반응성 이온 에칭(SPTS Technologies)에 의해 요망되는 두께(전형적으로 15 ㎛)로 에칭시킨다. 당해 과정을 접근 홀 패턴을 함유하는 상이한 마스크를 사용하여, 그리고 더 농후한 감광제 AZ9260(AZ Electronic Materials)을 사용하여 웨이퍼의 반대 측(즉, 에칭된 채널을 함유하지 않는 것)에서 반복한다. 그 다음, 웨이퍼를 피렉스(Pyrex) 웨이퍼에 양극 방식으로 결합시키고, 개별 장치로 다이싱(dicing)하기 전에, 습식 산화를 사용하여, 100 내지 200 nm의 산화규소를 축적시킨다. 각 실험 이전에, 장치를 육안으로 검사하고, 유입 및 유출 저장소와 함께 홀더에 장착한다(모두 실험실 내에서 설계되고, Firstcut에 의해 생성됨). 이들 저장소를 Buna-N O-고리(McMaster-Carr)를 사용하여 장치와 접속시켜, 적절한 밀봉을 제공한다. 유입 저장소를 테플론 튜빙(Teflon tubing)을 사용하여 홈-메이드 압력 조절 시스템(home-made pressure regulator system)에 연결시켜, 물질이 장치를 통과하는데 필요한 추진력을 제공한다. 적혈구계 세포의 모집단을 먼저 요망되는 전달 완충제[성장 배지, PBS, 또는 3% FBS 및 1% F-68 플루로닉스(Pluronics)가 보충된 PBS(Sigma)]에 현탁화시키고, 요망되는 전달 물질과 혼합하고, 장치의 유입 저장소에 배치한다. 이러한 저장소를 조절기에 의해 제어되는 압축 공기 라인에 연결시키고, 선택된 압력(0 내지 70 psi)을 사용하여 유체가 장치를 통과하게 한다. 그 다음, 처리된 세포를 유출 저장소로부터 수집한다. 세포를 처리 후에 5 내지 20분 동안 전달 용액에서 실온에서 인큐베이션시켜, 임의의 추가의 처리로 처리하기 전에 홀 폐쇄를 보장한다. 형광 표지된 페닐알라닌 암모니아 하이드록실라제(PAH)를 전달하기 위하여, 실험을 상기 기재된 바와 같이 행하여, 전달 완충제가 0.1 내지 0.3 ㎎/㎖ PAH를 함유하게 한다. GFP 낙다운은 미처리 대조군에 비한 세포 모집단의 평균 형광 세기의 감소 백분율로서 측정된다.

7. 폴리펩티드 - 표면 컨쥬게이션

세포 표면을 트라우트 시약(Traut's reagent)(2-이미노티올란 HCl, Pierce)으로 처리하여, 일차 아민을 티올화시킨다. 트라우트 시약을 EDTA가 있는 트리스(Tris) 완충제 pH 8 중에 용해시켜, 설프하이드릴의 산화를 방지한다. 대략 1 pmol 트라우트 시약을 사용하여, 10^6개 세포를 처리한다. 트라우트 시약을 실온에서 1시간 동안 세포와 인큐베이션시킨다. 과잉의 또는 미반응 시약을 원심분리 및 세포의 세척에 의해 제거한다. 이용가능한 설프하이드릴기의 수는 엘만 시약(Ellman's Reagent)을 사용하여 측정될 수 있다. 그 동안, 적합한 외인성 항원 폴리펩티드를 제조처의 지침에 따라 아민-대-설프하이드릴 가교제, 예를 들어, SMCC(Pierce)로 처리한다. 과잉의 가교 시약을 탈염에 의해 제거한다. 그 다음, 말레이미드-작용화 단백질을 수 시간 동안 티올화 세포와 인큐베이션시킨다. 미반응 단백질을 원심분리 및 세척에 의해 컨쥬게이트된 세포로부터 분리한다.

8. 폴리펩티드 - 비공유 표면 부착

B형 간염 표면 항원에 대한 항체 scFv에 대한 유전자(scFv, 문헌[Bose 2003, Molecular Immunology 40:617]에 기재)를 포유류 발현 벡터(Genlantis)에서 6-히스티딘 친화성 태그 및 마우스 글리코포린 A에 결합하는 폴리펩티드 서열, HWMVLPWLPGTLDGGSGCRG를 인코딩하는 유전자에 융합시킨다. 전체 융합 단백질은 표준 방법을 사용하여 HEK-293T 세포의 일시적 트랜스펙션에 의해 생성되고, 제조처의 지침에 따라 Ni-NTA 친화성 수지(Pierce) 상에서 정제된다. 정제된 융합 단백질을 100 nM 초과의 농도에서 마우스 적혈구와 인큐베이션시켜, 신속한 평형화 및 글리코포린 A로의 펩티드의 결합을 가능하게 한다.

9. 폴리펩티드 - 막 내로의 지질 삽입

트라우트 시약(Thermo Fisher)을 사용하여 제조처의 프로토콜에 따라 아민-함유 적합한 외인성 항원 폴리펩티드 분자 상에 설프하이드릴기를 생성한다. 반응 혼합물을 진탕기에서 실온(RT)에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 제조처의 지침에 따라 회전 탈염 컬럼(Zeba, MWCO 7K, Thermo Scientific)을 통과시켜 세척하여, 미반응 트라우트 시약을 제거한다. 변형된 폴리펩티드 상의 설프하이드릴기의 생성은 제조처의 프로토콜에 기초하여 엘만 시약(Pierce)을 사용하여 정량화된다.

DSPE-PEG₃₄₀₀-mal(PBS 중 1 × 10^-3 M, 4 ㎕, 몰비 지질:폴리펩티드 = 1:1)(모든 지질은 Avanti Polar Lipids로부터 구입하고, -20C에서 아르곤 하에 클로로포름 용액으로 보관)을 탈염 폴리펩티드 용액에 첨가하고, 실온에서 진탕기에서 인큐베이션시킨다. 1시간 후에, 시료 용액을 4℃에서 15분 동안 14 000 g에서 원심분리 필터 장치(Microcon, Millipore Co.)를 사용하여 여과하여, 소분자를 제거하고, 600 ㎕ PBS 중에 현탁화시킨다(1 ㎎/㎖ 폴리펩티드).

200 ㎕의 전혈을 1000 ㎕의 PBS 중에 현탁화시키고, 1500 g에서 30초 동안 회전시키고, 4회 반복한다. 마지막으로, RBC를 800 ㎕의 PBS 중에 현탁화시킨다. 상기 RBC 현탁액 및 다양한 양의 DSPE-PEG-폴리펩티드 용액(㎖당 1 ㎎)을 혼합한 후에, 37℃에서 15 내지 30분 동안 인큐베이션시킴으로써 RBC/DSPE-PEG-폴리펩티드의 컨쥬게이션을 제조한다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 유지시킨 다음, PBS 중에 3회 세척하고, ㎖당 5 × 10^8개의 최종 RBC 농도로 재현탁화시킨다. 자동화 세포 계수기(Countess, Invitrogen)를 사용하여 세포 농도를 측정한다.

10. 폴리펩티드 - 저장성 로딩

적합한 외인성 항원 폴리펩티드, 이러한 예에서, 마우스 IgG를 Abcam으로부터 구입하고, 70%의 적혈구용적률(Hct)로, 등장성 용액 중 RBC 현탁액에 0.25 ㎎/㎖로 첨가하였다. 현탁액을 10 mM 인산나트륨 pH 7.4, 10 mM 중탄산나트륨 및 20 mM 글루코스를 함유하는 저장성 용액 250 ㎖ 중에서 투석하고, 4C에서 1시간 동안 15 rpm에서 교반하였다. 그 다음, 5 mM 아데닌, 100 mM 이노신, 100 mM 피루브산나트륨, 100 mM 인산나트륨, 100 mM 글루코스, 12%(w/v) NaCl, pH 7.4를 함유하는 1/10 부피의 재밀봉 용액을 첨가함으로써 세포를 등장성으로 재밀봉하였다. 세포를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다.

11. 폴리펩티드 - 세포-투과성 펩티드

프로타민-컨쥬게이트된 폴리펩티드의 제작은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Kwon et al. 2009 J Contr Rel 139(3):182]을 참조한다. 50 mM HEPES 완충제(pH 8) 중 5 ㎎/㎖의 저분자량 프로타민(LMWP)을 DMSO 중에 1:10 몰비로 이종이작용성 가교제 3-(2-피리딜디티오)프로피온산 N-하이드록시석신이미드(SPDP, Sigma-Aldrich)와 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 진탕시킨다. 그 다음, 반응 혼합물을 50 mM 디티오트레이톨(DTT, Sigma-Aldrich)로 처리하고, 티올화 LMWP를 헤파린 친화성 컬럼 상의 HPLC에 의해 정제한다. 생성물을 한외여과에 의해 수집하고, 동결건조시키고, 추가의 이용까지 -20℃에서 보관한다.

컨쥬게이션을 위하여, 5 ㎎/㎖의 적합한 외인성 항원 폴리펩티드를 인산염 완충액 중 SPDP(에탄올 중 0.1 M SPDP 40 ㎕ 대 1 ㎖의 단백질 용액)와 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 교반한다. 미반응 SPDP를 신속한 탈염 및 0.1 M 인산염 완충제(pH 7.4)를 사용한 FPLC에 의한 완충제 교환에 의해 제거한다. 그 다음, 활성화된 폴리펩티드를 4℃에서 24시간 동안 10배 몰 과량의 상기 제조된 LMWP-SH와 컨쥬게이션시킨다. LMWP-폴리펩티드 컨쥬게이트를 헤파린 친화성 컬럼을 사용한 이온-교환 크로마토그래피에 이어서 5회의 원심분리 여과(분자량 컷-오프: 5,000 Da)에 의해 단리한다. 풀링된 LMWP-폴리펩티드 컨쥬게이트를 농축시키고, 컨쥬게이션 정도를 MALDI-TOF 질량분광법에 의해 결정한다.

흡수 실험을 위하여, 신선한 양 적혈구(MP Biomedicals, Solon, OH)를 5×10^8개 세포/㎖의 농도로 행크스 평형 염 용액(Hank's balanced salt solution, HBSS) 중에 현탁화시킨 다음, 온건한 진탕 하에서 LMWP-폴리펩티드 컨쥬게이트의 0.5 ㎎/㎖ 용액과 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨다. 그 다음, RBC를 HBSS로 세척하고, 2 내지 8℃에서 보관한다.

12. 폴리펩티드 - 화학적 투과성

*3 × 10^8개의 RBC를 링거 용액 중 200 μM에서 클로르프로마진(Sigma Aldrich)을 사용하여 30분 동안 사전인큐베이션시켰다. 이후에, 적합한 외인성 항원 폴리펩티드를 400 ㎕의 최종 부피로 링커 용액(1 내지 4 μM)에 첨가하고, 온건한 진탕하에 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 세포를 2회 세척하고, 링거 중에 재현탁화시키고, 분석을 위해 수집하였다.

13. 폴리펩티드 - 효소적 컨쥬게이션

소타아제를 사용한 세포 표면 효소적 컨쥬게이션은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Shi et al PNAS 2014 111(28):10131]을 참조한다. GPA N 말단을 폴리펩티드로 표지하기 위하여, 30 ㎕의 500 μM 에스 아우레우스(S aureus) 소타아제 및 C 말단에 LPETGG가 있는 1 mM 폴리펩티드를 얼음 상에서 50 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl에서 15분 동안 사전인큐베이션시키고, DMEM 중 5x10^7개 RBC에 첨가한다. 소타아제 및 세포 혼합물을 간헐적으로 온건하게 혼합하면서 30분 동안 얼음에서 인큐베이션시킨 다음, 4C에서 2분 동안 500 xg에서 회전시켜, 완충제/DMEM을 제거한 다음, 1 ㎖의 빙냉 PBS로 3회 세척한다.

실시예 18: 폴리펩티드 존재의 평가

1. 형광 전이유전자

적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하였다. 개재 바이러스 T2A 펩티드와 함께 GFP에 융합된 C-말단 상에 HA 태그를 갖는 글리코포린 A를 인코딩하는 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같은 깁슨 어셈블리에 의해 작제하였다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 형질도입에 의해 적혈구계 세포 내로 도입하였다. 형질도입 후 2일에, 세포를 수집하고, PBS 완충제에서 세척하고, 유세포계수기에서 분석하였다(Attune, Life Technologies). 형질도입 효율을 모집단 내의 GFP-양성 세포의 백분율로서 평가하였다.

2. 세포 표면 단백질

세포 표면 단백질을 위하여, 단백질 발현의 수준은 단백질에 또는 동시-발현 에피토프 태그에 특이적인 항체를 사용한 유세포계수법에 의해 트랜스펙션 후 2일만큼 조기에 검출될 수 있다. 적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하였다. N-말단에 HA 태그가 있는 글리코포린 A를 인코딩하는 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같은 깁슨 어셈블리에 의해 작제하였다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 형질도입에 의해 적혈구계 세포 내로 도입하였다. 형질 도입 후 2일에, 세포를 수집하고, PBS 완충제에서 세척하고, 마우스 항-HA 항체(Abcam)의 1:50 희석액으로 1시간 동안 염색하였다. 세포를 세척한 다음, 얼음 상에서 알렉사(alexa) 488-표지 염소 항-마우스 이차 항체(Life Technologies)의 1:100 희석액으로 30분 동안 염색하였다. 세포를 세척하고, 유세포계수기(Attune, Life Technologies)에서 분석하였다. 형질도입 효율을 모집단 내의 알렉사 488-양성 세포의 백분율로서 평가하였다.

3. 세포내 단백질

세포내 단백질에 있어서, 단백질 발현의 수준은 웨스턴 블롯에 의해 트랜스펙션 후 8 내지 12시간만큼 조기에 검출될 수 있다. 적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하였다. C-말단에 HA 태그가 있는 아데노신 데아미나제를 인코딩하는 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같은 깁슨 어셈블리에 의해 작제하였다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 형질도입에 의해 적혈구계 세포 내로 도입하였다. 형질도입 2일 후에, 세포를 수집하고, PBS 완충제에 세척하고, RIPA 세포 용해 완충제(Pierce)에 용해시켰다. 세포 용해물을 100 mM DTT에서 비등시켜 변성시킨 다음, NuPage SDS-PAGE 프리-캐스트(pre-cast) 겔 상으로 로딩하였다. 전기영동 및 니트로셀룰로스 멤브레인으로의 전달 후에, 단백질 밴드를 마우스 항-HA 항체(Abcam)의 1:5000 희석액에 이어서, 염소 항-마우스 HRP(Pierce)의 1:5000 희석액으로의 염색 및 HRP 기질(SuperSignal, Pierce)로의 이후의 처리에 의해 발색시켰다. Amersham 영상기(GE healthcare)를 사용하여 영상을 캡쳐하였다.

실시예 19: 세포와 화학적 변형제의 접촉

항원-제시 세포 식세포작용을 증가시키기 위하여, 그리고 간 표적화를 촉진시키기 위하여, 본원에 기재된 세포 조성물을 30분 동안 37C에서 0.15 μM의 칼슘 이오노포어 A23187(Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) 또는 실온(RT)에서 5 mM의 BS3(Fischer Bioblock Scientific, Illkirch, France)으로 처리한다. 처리 후에, 최종 생성물을 적합한 완충제에서 2 내지 8C에서 보관한다.

실시예 20: 발현 및 활성의 평가

배양된 세포 내에서 그리고 그 상에서의 외인성 단백질의 발현은 유세포계수법(단백질이 표면상에 발현된다면)에 의해 또는 웨스턴 블롯(세포질에서 발현되는 단백질에 대하여)에 의해 정량적으로 평가될 수 있다.

1. 정량적 유세포계수법

항-마우스 Fc-결합 정량적 유세포계수 비드(Simply Cellular Calibration)를 Bangs Labs로부터 구입하였다. 관련 세포 표면 수용체 - 글리코포린 A, Ckit 및 트랜스페린 수용체 - 에 대한 형광 표지된 마우스 항체를 BioLegend로부터 구입하였다. HA 에피토프 태그에 대한 형광 표지된 마우스 항체를 Life Technologies로부터 구입하였다. 적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하였다. N-말단에 HA 태그를 갖는 글리코포린 A를 인코딩하는 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리에 의해 작제하였다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스 형질도입에 의해 적혈구계 세포 내로 도입하였다. 형질도입 후 적어도 2일에, 2x10^5개의 세포를 수집하고, PBS 완충제 중에 세척하고, 상기 열거된 항체 중 하나의 1:100 희석액으로 1시간 동안 염색하였다. 세포를 세척하고, 유세포계수기(Attune, Life Technologies)에서 분석하였다. 프로토콜을 상기 열거된 4개의 항체의 각각에 대하여 반복하였다. 정량화를 제조처의 지침에 따라 수행하였다. 약술하면, 5개의 비드 시료 각각 1 방울을 상기 열거된 항체 1:100 희석액과 인큐베이션시켰다. 비드를 1시간 동안 인큐베이션시키고, PBS에서 세척하고, 유세포계수기(Attune, Life Technologies)에서 분석하였다. 프로토콜을 상기 열거된 4개의 항체의 각각에 대하여 반복하였다. 제조처의 제공되는 엑셀 스프레드시트를 사용하여 교정 곡선을 핏팅시키고, 이로부터 세포-기반의 신호에 대한 형광 세기의 정량화를 도출하였다.

2. 정량적 웨스턴 블롯

적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하였다. C-말단에 HA 태그가 있는 아데노신 데아미나제를 인코딩하는 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리에 의해 작제하였다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이, 렌티바이러스 형질도입에 의해 적혈구계 세포 내로 도입하였다. 형질도입 후 2일에, 세포를 수집하고, PBS 완충제에서 세척하고, RIPA 세포 용해 완충제(Pierce)에서 용해시켰다.

전이유전자를 리포펙타민 2000(Life technologies)을 사용하여 일시적 트랜스펙션에 의해 HEK293T 세포 내로 도입하였다. 세포를 1주 동안 배양하고, 상층액을 수집하였다. 재조합 단백질을 제조처의 지침에 따라 HA 친화성 컬럼(Pierce)에서 정제하였다. 단백질 농도를 280 nm에서의 흡광도에 의해 평가하였다.

웨스턴 블롯팅을 본원에 기재된 바와 같이 수행하였다. 세포 용해물 시료에 더하여, 알려져 있는 양의 재조합 아데노신 데아미나제를 동일한 겔에서 전개시켰다. 영상 수집 후에, 재조합 밴드의 세기를 사용하여 표준 곡선을 생성하여, 세포 시료에 존재하는 단백질의 양을 정량화하였다.

높은 수준의 강력한 전이유전자의 발현은 최종 세포 모집단의 치료능에 대하여 밀접한 관계를 갖는다. 도 2는 정량적 유세포계수법에 의하여 분화를 나타내는 3개의 표면 단백질 및 하나의 외인성 전이유전자의 발현을 정량화하며, 전이유전자가 높은 수준으로 강력하게 발현됨을 입증한다.

배양물 중 적혈구계 세포를 4-단계 시험관내 분화 과정 동안 7개의 시점에 수집하였다. 처음의 시점("Expand D6")에, 세포는 유핵 조혈 전구체이다. 최종 시점("Diff 3 D8")에, 세포는 대개 제핵 적혈구계 세포이다. GPA(흑색 삼각형), 적혈구계 세포의 표준 마커는 전구 세포에서 낮게 시작하고, 세포마다 1x10^6 카피 초과에 신속하게 도달한다. CKIT(파선 원), 줄기 세포 인자에 대한 수용체는 높게 시작한 다음, 분화가 발생함에 따라 세포마다 1x10^4 카피 미만으로 감소된다. 적혈구계 세포로의 철의 수송에 필수적인 TR(점선 마름모)은 초기에 증가된 다음, 세포마다 1x10^5 카피 미만으로 점차 감소된다. 전이유전자(백색 원)는 제2 분화 단계("Diff 1")의 마지막에 도입되고, 분화 내내 세포마다 대략 1x10^5 카피로 안정적으로 발현된다. 상기 데이터는 전이유전자가 배양된 세포에서 강력하게 발현되는 것을 입증한다.

배양된 세포 내의 또는 그 상의 외인성 단백질의 발현은 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해(단백질이 표면상에 발현된다면) 또는 본원에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯에 의해(세포질에서 발현되는 단백질에 대하여) 평가될 수 있다. 외인성 유전자가 다운스트림 형광 리포터 단백질을 함유하는 단일-전사물 작제물로 존재하는 경우에, 리포터 단백질의 형광은 업스트림 유전자의 발현에 대한 대리물로서 사용되고, 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해 평가될 수 있다.

도 3a 내지 도 3s는 배양된 제핵 적혈구계 세포 상의 표면 및 세포질 단백질의 외인성 발현을 보여준다. 상기 데이터는 다수의 단백질 부류 - 과발현 및 새로이 발현된 세포질, 표면, 무손상, I형 막 단백질로의 융합체, II형 막 단백질로의 융합체, GPI-연결 막 단백질로의 융합체, 세포내 융합체 포함 - 가 배양된 제핵 적혈구계 세포, 배양된 유핵 적혈구계 전구 세포 및 K562 적백혈병 세포를 포함하는 다수의 세포 유형에서 발현될 수 있음을 결정적으로 보여준다.

도 3b 및 도 3f는 배양된 제핵 세포에서의 2개의 외인성 단백질의 동시의 발현을 보여준다.

도 3b에서, 적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하였다. 글리코포린 A 신호 서열, HA 에피토프 태그, 글리코포린 A 코딩 서열, 바이러스 T2A 절단가능한 서열 및 GFP를 인코딩하는 전이유전자 작제물을 본원에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리에 의해 어셈블시켰다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 형질도입에 의해 적혈구계 세포 내로 도입하였다. 세포를 본원에 기재된 바와 같이 최종 분화까지 배양하였다. 세포를 형광 항-HA 항체 및 GFP 형광을 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해 분석하여, 전이유전자 둘 모두의 발현을 검출하였다.

도 3f에서, 적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하였다. 글리코포린 A 신호 서열, B형 간염 표면 항원에 특이적인 항체 scFv, HA 에피토프 태그, 글리코포린 A 코딩 서열, 바이러스 T2A 절단가능한 서열 및 GFP를 인코딩하는 전이유전자 작제물을 본원에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리에 의해 어셈블시켰다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 형질도입에 의해 적혈구계 세포 내로 도입하였다. 세포를 본원에 기재된 바와 같이 최종 분화까지 배양하였다. 세포를 형광 항-HA 항체 및 GFP 형광을 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해 분석하여, 전이유전자 둘 모두의 발현을 검출하였다.

실시예 21: 혈소판에서 mRNA로부터 단백질의 발현

외인성 트랜스펙션된 mRNA로부터 번역되는 외인성 단백질의 혈소판에서의 발현을 유세포계수법에 의해 측정하였다. 약술하면, 혈소판-풍부 혈청을 190 g에서 15분 동안 원심분리시켜, 적혈구 및 백혈구를 제거하였다. 그 다음, 상층액을 2500 g에서 추가 5분 동안 회전시켜, 혈소판을 펠렛화시켰다. 혈소판을 1 μM 프로스타글란딘이 있는 티로드 완충제 5 ㎖에 재현탁화시키고, 세척하고, 1 μM 프로스타글란딘이 있는 티로드 완충제 750 ㎕에 재현탁화시켰다. 관심 유전자, 이러한 예에서, GFP를 인코딩하는 mRNA를 1:1 ㎎/㎖ 비로 리포펙타민과 혼합하였다. 혼합물을 5분 동안 인큐베이션시킨 다음, 세척된 혈소판 모집단에 첨가하였다. 조합물을 천천히 로킹(rocking)시키면서 실온에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 전이유전자의 혈소판 발현은 GFP 형광을 측정하는 유세포계수법에 의해 검정될 수 있다. 또한, 표면 단백질도 유세포계수법에 의해 검정될 수 있다. 세포질 또는 기타 세포내-발현 단백질은 또한 웨스턴 블롯에 의해 검정될 수 있다.

외인성 단백질을 혈소판 내로 또는 그 상으로 도입하는 것에 대한 치료적 타당성이 존재한다. 혈소판이 핵 또는 RNA 전사 기구를 갖지 않기 때문에, DNA 트랜스펙션은 혈소판에서 외인성 단백질 발현을 유도하는 실행가능한 수단이 아니다. 그러나, mRNA 트랜스펙션 및 번역은 세포 내로 외인성 단백질을 도입하는 하나의 방식이다. 혈소판이 mRNA 번역 기구를 함유하는 것으로 여겨지지만, 지금까지 그들이 외인성 mRNA를 허용하고, 그를 단백질로 번역할 수 있는지는 알려져 있지 않다.

도 4는 혈소판에 의한, 전이유전자, 이 경우에는 GFP를 인코딩하는 외인성 mRNA의 번역을 입증하는 유세포계수법 플롯의 모음이다. GFP는 488 nm 레이저를 사용한 여기 후에 FL1 채널에서의 형광에 의해 검출된다. (4a) 비트랜스펙션된 혈소판(1.7% GFP+). (4b) 3 ㎍ GFP mRNA로 트랜스펙션된 혈소판(8.6% GFP+). (4c) 6.8 ㎍ GFP mRNA로 트랜스펙션된 혈소판(3.3% GFP+).

데이터는 결정적으로 혈소판에 의한 외인성 단백질로의 외인성 mRNA의 번역을 처음으로 입증한다.

*실시예 22: 효소의 활성

도 5는 적혈구계 세포상에 함유된 효소에 대한 활성을 보여준다. 세포질 효소의 생화학적 활성을 분화의 과정에 걸친 단백질의 보유에 대하여 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다. 세포질 효소의 생물학적 활성을 시험관내 효소적 활성 검정에 의해 평가하였다.

도 5는 배양된 적혈구계 세포에서 발현되는 2개의 상이한 세포내 효소의 활성을 보여준다.

1. 아데노신 데아미나제.

C-말단에 HA 태그가 있는 아데노신 데아미나제를 인코딩하는 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리에 의해 작제하였다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 리포펙타민 트랜스펙션(Life Technologies)에 의해 HEK-293T 세포 내로 도입하였다. 효소적 활성을 문헌[Helenius 2012, Biochim Biophys Acta 1823(10):1967]으로부터 유래된 프로토콜을 사용하여 검정하며, 여기서, 특정 효소의 혼합물은 퓨린을 요산 및 H2O2로 전환시킨 후 생성된 H2O2를 형광 검출한다. 약술하면, 트랜스펙션 후 2일에, 세포를 수집하고, 배지를 흡인하고, 크렙스 링거(Krebs Ringer) 인산염 글루코스(KRPG; 145 mM NaCl, 5.7 mM 인산나트륨, 4.86 mM KCl, 0.54 mM CaCl2, 1.22 mM MgSO4 및 5.5 mM 글루코스 포함; pH 7.35)를 2x10^5개 세포/㎖로 세포에 첨가하였다. 아데노신을 50 μM로 첨가하였다. 6시간 동안의 반응 후에, 상층액을 수집하고, 60C에서 5분 동안 열 불활성화시켰다. 상층액의 분취액을 0.25 U/㎖ 박테리아 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제(PNP) 및 0.15 U/㎖ 미생물 잔틴 산화효소(XO)(둘 모두 Sigma사 제품)를 함유하는 백색 96-웰 마이크로플레이트 내의 웰로 옮겼다. 실온에서 20분 인큐베이션 후에, HRP(최종 농도 1 U/㎖, Sigma) 및 Amplex Red 시약(60 μM, Invitrogen, Molecular Probes)을 함유하는 30 ㎕의 H2O2-검출 혼합물을 마이크로웰에 첨가한 다음, 각각 545 및 590 nm의 방출 및 여기 파장(Tecan Infinite M200)에서 형광 세기를 측정하였다.

2. 페닐알라닌 하이드록실라제

적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하였다. C-말단에 HA 태그가 있는 페닐알라닌 하이드록실라제를 인코딩하는 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리에 의해 작제하였다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 형질도입에 의해 적혈구계 세포 내로 도입하였다. 형질도입 후 2일에, 세포를 수집하고, PBS 완충제에서 세척하고, RIPA 세포 용해 완충제(Pierce)에서 용해시켰다. 세포 용해물(총 64 ㎍ 단백질)을 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 4 mM DTT, 4 mM 페닐알라닌, 33 ㎍ 카탈라제 및 0.4 mM DMPH4(모두 Sigma사 제품)를 함유하는 1 ㎖ 반응 완충제에 첨가하였다. 반응을 37C에서 하룻밤 진행시켰다. 인큐베이션 후에, 시료를 3700 rpm에서 10분 동안 회전하는 아미콘(Amicon) 울트라(Ultra)-4 원심분리 필터 10 KD(Millipore UFC801024)에서 원심분리 여과에 의해 단백질 제거하였다. 시료를 수집하고, 540 nm에서의 흡광도에 의해 티로신 농도에 대하여 검정하였다.

이들 외인성 단백질 둘 모두는 최종 분화의 마지막까지 보유되었으며, 적혈구계 세포가 기본 기능에 필요하지 않는 단백질의 엄격한 제거 프로그램을 겪는 것이 해당 분야에 잘 알려져 있는 것을 고려하여, 중대한 성과이다(문헌[Liu J et al. (2010) Blood 115(10):2021-2027], 문헌[Lodish HF et al. (1975) Developmental Biology 47(1):59]). 도 5a에서, 외인적으로 과발현된 단백질 아데노신 데아미나제를 유핵 전구 세포("Diff I D5")로부터 제핵 적혈구계 세포("Diff III D8")까지 분화 과정에 걸쳐 다양한 시점에 항-HA 웨스턴 블롯에 의해 검출한다. 도 5c에서, 외인적으로 발현된 미생물 단백질 페닐알라닌 하이드록실라제를 유핵 전구 세포("Diff I D5")로부터 제핵 적혈구계 세포("Diff III D8")까지 분화 과정에 걸쳐 다양한 시점에 항-HA 웨스턴 블롯에 의해 검출한다.

또한, 이들 효소 둘 모두는 기질을 생성물로 효소적으로 전환시키는 그들의 능력을 유지한다. 도 5b는 무손상 아데노신 데아미나제-발현 293T 세포에 의한 아데노신에서 이노신으로의 효소적 전환을 보여준다. 도 5d는 배양된 페닐알라닌 하이드록실라제-발현 제핵 적혈구계 세포의 용해물에 의한 페닐알라닌에서 티로신으로의 효소적 전환을 보여준다.

이들 데이터는 외인성 효소가 배양 과정 내내 적혈구계 세포 상에 보유되고, 그들이 적혈구계 세포에서 효소적으로 활성이며, 이것이 엄청난 치료적 결과를 갖는 것을 결정적으로 보여준다.

실시예 23: CR1의 활성

도 6은 배양된 적혈구계 세포의 표면상에 과발현된 보체 수용체 1(CR1)에 대한 생화학적 및 생물학적 활성 둘 모두를 보여준다. CR1의 생화학적 활성을 면역 복합체로의 결합에 대하여 유세포계수법에 의해 평가하였다. CR1의 생물학적 활성을 동시-배양 검정에서 대식구로의 면역 복합체의 전달에 의해 평가하였다.

1. CR1-발현 세포의 면역 복합체 결합

적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하였다. 보체 수용체 1(CR1)을 인코딩하는 전이유전자 작제물을 본원에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리에 의해 작제하였다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 형질도입에 의해 적혈구계 세포 내로 도입하였다. 전이유전자 발현 수준을 항-CR1 항체(Abcam)를 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해 측정하였다. 세포를 본원에 기재된 바와 같이 최종 분화까지 배양하였다.

Dylight 650-표지된 소 혈청 알부민(BSA-650)을 실온에서 30분 동안 과잉의 항체에서 폴리클로널 토끼 항-BSA(Abcam)와 인큐베이션시켰다. 그 다음, 복합체를 37C에서 30분 동안 1:1 부피비로 인간 혈청과 혼합하였다. 대조군 복합체를 인간 혈청과 혼합하지 않거나, 열-불활성화된 인간 혈청과 혼합하였다.

복합체를 37C에서 30분 동안 CR1-발현 세포와 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, Dylight 650 형광을 검출함으로써 면역 복합체 포획에 대하여 유세포계수법에 의해 분석하였다.

2. 대식구로의 면역 복합체 전달

배양된 U937 단핵구를 37℃에서 24시간 동안의 100 nM 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)와의 인큐베이션에 의해 활성화시켰다. 면역 복합체로 코팅된 세포(상기 참조)를 37C에서 30분 동안 활성화된 U937 대식구와 인큐베이션시켰다. 동시-배양물을 유세포계수법에 의해 분석하였다. 대식구를 FSC/SSC 게이팅에 의해 확인하였다. 대식구 상의 면역 복합체의 존재를 대식구 모집단에서 Dylight 650 형광을 검출함으로써 분석하였다.

도 6은 배양된 적혈구계 세포상에 외인적으로 과발현된 보체 수용체 1(CR1)의 생화학적 및 생물학적 활성을 보여준다.

도 6의 A는 시험관 내에서의 면역 복합체의 포획으로 정의되는 CR1의 생화학적 활성을 보여준다. 흑색 히스토그램은 배양된 적혈구계 세포상에 과발현된 CR1에 의한 BSA-기반의 면역 복합체의 포획을 보여준다. 음영 히스토그램은 인간 보체가 결여된 IgG 및 BSA의 복합체로의 최소의 백그라운드 결합을 보여주어, 결합 사건이 CR1-매개임을 입증시켜 준다.

도 6의 B는 배양된 적혈구계 세포로부터 대식구로의 포획된 면역 복합체의 전달로 정의되는 CR1의 생물학적 활성을 보여준다. 이것은 해당 분야의 표준 검정이며, 문헌[Repik et al. 2005 Clin Exp Immunol. 140:230]; 문헌[Li et al. 2010 Infection Immunity 78(7):3129]을 참조한다. 전달을 유세포계수법에 의해 평가하고, 대식구 상의 표지된 면역 복합체-유래 형광의 세기로서 측정한다. 이러한 검정에서, 면역 복합체와 인큐베이션되지 않은 대식구(흑색 막대)는 형광이 되지 않는다. 보체가 결여된(이에 따라 CR1에 결합하지 않는) BSA 및 IgG의 복합체와 인큐베이션시킨 대식구는 배양된 CR1-과발현 적혈구계 세포의 존재와 독립적으로 오직 소량의 면역 복합체(회색 막대)만을 흡수한다. 이러한 흡수는 아마도 IgG 분자의 Fc 영역과 상호작용하는 U937 세포상의 Fc-감마 수용체 때문일 것이다. CR1-과발현 세포의 부재하에(해시 막대, 좌측) 면역 복합체(BSA + IgG + 보체)와 인큐베이션시킨 대식구는 아마도 동일한 Fc-감마 매개의 방법에 의해 보체의 부재에서와 동일한 양의 면역 복합체를 흡수한다. 그러나, CR1-과발현 세포의 존재하에 면역 복합체와 인큐베이션시킨 대식구(해시 막대, 우측)는 형광으로 측정시 거의 2배의 수의 면역 복합체를 흡수한다.

이들 데이터는 배양된 적혈구계 세포상의 CR1 과발현이 상기 적혈구계 세포상의 면역 복합체의 포획을 가능하게 하고, 적혈구계 세포로부터 대식구로의 면역 복합체의 전달을 용이하게 하며, 대식구에 의해 흡수되는 면역 복합체의 비와 수를 유의미하게 증가시키 것을 결정적으로 보여준다.

실시예 24: scFv의 활성

도 7은 막횡단 단백질 GPA로의 융합체로서 배양된 적혈구계 세포의 표면상에 외인적으로 발현되는 항체 scFv의 생화학적 및 생물학적 활성을 보여준다.

적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하였다. 글리코포린 A의 리더 서열, B형 간염 표면 항원에 특이적인 항체 scFv(scFv, 문헌[Bose 2003, Molecular Immunology 40:617]에 기재), HA 에피토프 태그, [Gly-3-Ser]2 유연성 링커 및 글리코포린 A의 바디를 인코딩하는 전이유전자 작제물을 본원에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리에 의해 어셈블시켰다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 형질도입에 의해 적혈구계 세포 내로 도입하였다. 전이유전자 발현을 항-HA 항체(Abcam)를 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해 평가하였다. 세포를 본원에 기재된 바와 같이 최종 분화까지 배양하였다. 표적 단백질, 이러한 경우에, B형 간염 표면 항원(HBsAg)으로의 결합에 대한 항체 scFv의 생화학적 활성을 유세포계수법에 의해 평가하였다. 재조합 HBsAg 단백질(Abcam)을 Dylight-650 형광단(Pierce)으로 표지하였다. scFv-발현 세포를 100 nM 표지된 단백질과 인큐베이션시키고, PBS에서 세척하고, 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해 Dylight 650 형광에 대하여 분석하였다.

항체 scFv의 생물학적 활성을 유세포계수법에 의해 검출되는 HBsAg의 생체내 포획에 의해 평가하였다. 재조합 HBsAg 단백질(Abcam)을 Dylight-650 형광단(Pierce)으로 표지하였다. scFv-발현 세포를 CFSE(Sigma)로 형광 표지하였다. 면역손상 NSG 마우스(Jackson labs)에 약 400 pmol의 표지된 HBsAg를 꼬리 정맥 내로 주사하였다. 수 분 후에, 동일한 마우스에, 2x10^7개의 scFv-발현 세포를 주사하였다. 혈액을 EDTA-함유 튜브에 규칙적인 간격으로 턱밑 천공에 의해 수집하였다. 수집된 혈액 세포를 세척하고, 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해 분석하였다. 인간 세포를 CFSE 양성인 것으로 확인하였다. HBsAg의 포획을 인간 세포상의 Dylight 650 형광으로 검출하였다.

도 7a 및 도 7b는 그의 동족 항원, B형 간염 표면 항원(HBsAg)의 결합으로 정의되는 항체 scFv의 생화학적 활성을 보여준다. 도 7a에서, 항체 scFv를 발현하거나(흑색) 발현하지 않는(회색 음영) 세포를 450 nM HBsAg와 인큐베이션시키고, 비오티닐화 항-HBsAg 항체 및 형광 스트렙트아비딘으로 염색한다. 항체 scFv를 발현하는 세포(이러한 배양에서 세포의 약 45%)는 항원에 결합한다. 도 7b에서, 항체 scFv를 발현하는 세포를 다양한 농도의 HBsAg와 인큐베이션시키고, 상기와 같이 염색시켜, 결합 사건이 용량-의존적이며, 친화성이 대략 10 nM임을 보여준다.

도 7c 및 도 7d는 마우스에서 순환 중인 동안 동족 항원 HBsAg의 포획으로 정의되는 항체 scFv의 생물학적 활성을 보여준다. 이러한 실험에서, 면역손상 NSG 마우스(Jackson labs)에 약 400 pmol의 형광 표지된 HBsAg를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 5분 후에, 배양된 제핵 적혈구계 세포(7c) 또는 외인성 항체 scFv를 발현하는 배양된 제핵 적혈구계 세포(7d)를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 주사 전에, 모든 배양된 세포를 CFSE 형광 염료로 표지하였다. 혈액을 6시간 후에 수집하고, 유세포계수기에서 분석하고, CFSE+ 인간 세포에서 게이팅시켰다. 빈 배양된 세포는 HBsAg에 결합하지 않는 한편(7c), 항체 scFv-발현 세포는 HBsAg에 결합한다(7d). 생화학적 활성 실험과 일관되게, 이러한 배양에서 세포의 대략 45%가 항체-scFv를 발현한다.

이들 데이터는 항체 scFv가 배양된 적혈구계 세포의 표면상에 발현되는 경우 생화학적으로 활성이며, 적혈구계 세포상의 항체 scFv가 순환 중에 있는 경우 생체내에서 그의 표적에 결합할 수 있음을 입증한다. 이들은 순환 중 물질의 포획, 격리 및 제거가 요망되는 치료 방법에 대한 밀접한 관계를 갖는다.

실시예 25: 활성 - 순환 제거

도 8은 표적의 순환 제거를 위해 사용되는 표면 분자 포획 작용제에 대한 생화학적 및 생물학적 활성 둘 모두를 보여준다.

포획 작용제, 이 경우에는 HA 폴리펩티드 및 비오틴의 생화학적 활성을 표적 단백질, 이 경우에는 항-HA 항체 및 항-비오틴 항체로의 결합에 대해 유세포계수법에 의해 평가하였다. 포획 작용제의 생물학적 활성을 유세포계수법 및 혈장 단백질 정량화에 의해 결정되는 바와 같은 생체내 표적 단백질의 포획 및 제거에 의해 평가하였다.

1. 화학적으로 변형된 세포에 의한 항-비오틴 항체의 포획

정상 인간 공여자 유래의 적혈구를 구입하였다(Research Blood Components). 세포를 37℃에서 20분 동안 제조처의 지침에 따라 CFSE(Sigma)로 표지하였다. 그 다음, 세포를 실온에서 30분 동안 0.02 부피의 2 mM 스톡 비오틴 시약을 사용하여 제조처의 지침에 따라 NHS-비오틴(Sigma)으로 비오티닐화시켰다. 항-비오틴 항체(Abcam)를 Dylight 650(Pierce)으로 형광 표지하였다. 세포의 표지 효율을 검출 마커로서 표지된 항-비오틴 항체 및 CFSE 형광을 사용하여 유세포계수법에 의해 평가하였다. 250 ㎍의 표지된 항체를 꼬리 정맥을 통해 NSG 마우스(Jackson Labs) 내로 정맥내 주사하였다. 4시간 후에, 1x10^8개의 비오티닐화 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 혈액을 EDTA-함유 튜브에 규칙적인 간격으로 턱밑 천공에 의해 수집하였다. 수집된 혈액 세포를 세척하고, 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해 분석하였다. 인간 세포를 CFSE 양성인 것으로 확인하였다. 항-비오틴 항체의 포획을 인간 세포상의 Dylight 650 형광으로 검출하였다. 채혈로부터 혈장을 제조처의 지침에 따라 비오틴-코팅된 마이크로플레이트(Pierce)를 사용하여 ELISA에 의해 분석하여, 순환 중 항체의 수준을 검출하였다.

2. 트랜스제닉 배양 세포에 의한 항-HA 항체의 포획

적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하였다. 글리코포린 A 신호 서열, HA 에피토프 태그, 글리코포린 A 코딩 서열, 바이러스 T2A 절단가능한 서열 및 GFP를 인코딩하는 전이유전자 작제물을 본원에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리에 의해 어셈블시켰다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 형질도입에 의해 적혈구계 세포 내로 도입하였다. 세포를 본원에 기재된 바와 같이 최종 분화까지 배양하였다. 세포를 본원에 기재된 바와 같이 Dylight 650(Pierce)으로 형광 표지된 항-HA 항체(Life Technologies) 및 GFP 형광을 사용하여, 유세포계수법에 의해 분석하여, 전이유전자 둘 모두의 발현을 검출하였다. 250 ㎍의 표지된 항-HA 항체를 NSG 마우스(Jackson Labs) 내로 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 4시간 후에, 1x10^8개의 배양된 세포를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 혈액을 EDTA-함유 튜브에 규칙적인 간격으로 턱밑 천공에 의해 수집하였다. 수집된 혈액 세포를 세척하고, 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해 분석하였다. 인간 세포를 CFSE 양성인 것으로 확인하였다. 항-HA 항체의 포획을 인간 세포상에서 Dylight 650 형광으로 검출하였다. 채혈로부터 혈장을 제조처의 지침에 따라 비오틴-코팅된 마이크로플레이트(Pierce)를 사용하여 ELISA에 의해 분석하여, 순환 중 항체의 수준을 검출하였다.

도 8은 (8a 및 8b) GPA로의 융합체로서 배양된 적혈구계 세포의 표면상에 발현된 폴리펩티드 HA의, 및 (8c 및 8d) 일차 적혈구의 표면에 화학적으로 컨쥬게이트된 비오틴의 생화학적 및 생물학적 활성을 보여준다. 생화학적 활성은 시험관내에서의 표적 단백질의 포획으로서 정의된다. 생물학적 활성은 시험관내에서의 표적 단백질의 증진된 제거로서 정의된다.

도 8a에서, GPA의 N 말단으로의 융합체로서 발현되는 HA 폴리펩티드는 생체내에서 마우스 항-HA 항체를 포획한다. NSG 마우스에 형광-표지된 마우스 항-HA 항체를 주사한 다음, GPA로의 융합체로서 그들의 표면상에 HA 에피토프 태그를 발현하지 않거나(상측), 이를 발현하는(하측) 배양된 인간 적혈구계 세포를 주사하였다. 채혈하고, 세포를 유세포계수기에서 분석하였다. x-축은 CFSE 형광을 나타낸다. y-축은 항-HA 항체 Dylight 650 형광을 나타낸다. 배양된 CFSE-양성 인간 적혈구를 둘 모두의 시료에서 관찰하나, HA 에피토프 태그를 발현하는 세포만이 순환하는 항-HA 항체를 포획할 수 있다.

도 8b에서, 마우스에 항-HA 항체에 이어서, 임의로, GPA로의 융합체로서 그들의 표면상에 HA 펩티드를 발현하지 않거나, 이를 발현하는 배양된 인간 적혈구계 세포를 주사하였다. 혈장을 다수의 시점에 수집하고, 혈장 중 항-HA 항체의 수준을 기판으로서 HA 펩티드-코팅된 플레이트를 사용하여 ELISA에 의해 평가하였다. 단독의 항-HA 항체(백색 원, 실선 - 이러한 마우스는 처리와 무관한 원인으로 120분 후에 사망) 또는 항-HA 항체에 이어서 그들의 표면상에 HA 펩티드를 발현하지 않는 세포(파선)를 주사한 마우스는 세포의 주사 후 24시간까지 유의미한 순환 중 항체를 갖는다. 대조적으로, 항-HA 항체에 이어서 그들의 표면 상에 HA 펩티드를 발현하는 세포를 주사한 마우스는 수 분 내에 표적 항체가 고갈된다. 이러한 데이터는 표적 항체가 그들의 표면 상에 외인성 항원 폴리펩티드를 발현하는 배양된 적혈구계 세포에 의해 신속하고, 특이적으로 순환으로부터 제거되는 것을 결정적으로 보여준다.

도 8c에서, 아민 관능화 화학물질에 의해 적혈구계 세포의 표면에 컨쥬게이트된 비오틴 분자는 마우스 항-비오틴 항체를 포획한다. 이들 경우 둘 모두에서, 포획을 유세포계수법에 의해 평가하였다. CFSE 표지되고, 비오티닐화된 세포는 형광 항-비오틴 항체로 염색되는 경우, 이중 양성으로 나타난 한편(하측 점도표), 비오티닐화되지 않은 CFSE-표지 세포는 오직 단일의 양성으로 나타났다(상측 점도표).

도 8d에서, 마우스에 항-비오틴 항체를 주사한 다음 임의로, 그들의 표면상의 비오틴에 컨쥬게이트되지 않거나, 이에 컨쥬게이트된 배양된 인간 적혈구계 세포를 주사하였다. 혈장을 다양한 시점에 수집하고, 혈장 중 항-비오틴 항체의 수준을 기판으로서 비오틴-코팅 플레이트를 사용하여 ELISA에 의해 평가하였다. 마우스에 단독의 항-비오틴 항체(백색 원, 실선) 또는 항-비오틴 항체에 이어서 그들의 표면상의 비오틴에 컨쥬게이트되지 않은 세포(파선)를 주사한 마우스는 세포의 주사 후 24시간까지 유의미한 순환 중 항체를 갖는다. 대조적으로, 항-비오틴 항체에 이어서 그들의 표면상의 비오틴에 컨쥬게이트된 세포를 주사한 마우스는 수 분 내에 표적 항체가 고갈된다. 이러한 데이터는 표적 항체가 그들의 표면상에 외인성 항원 폴리펩티드를 함유하는 배양된 적혈구계 세포에 의해 신속하고, 특이적으로 순환으로부터 제거되는 것을 결정적으로 보여준다.

데이터는 함께, 외인성 항원-발현 EHC상의 적합한 외인성 항원이 생체내에서 그들의 표적 분자에 결합할 수 있으며, 순환 중인 경우, 표적 분자의 신속한 순환 제거를 매개할 수 있음을 결정적으로 보여주며, 이는 밀접한 치료적 연루를 갖는다.

실시예 26: 보체 조절제의 활성

외인성 항원-발현 EHC의 보체 조절 활성을 해당 분야에 알려져 있는 표준 CH50 및 AH50 검정에 의해 평가한다(예를 들어, 문헌[Kabat et al. 1961 Exp Immunochem pp. 133-239] 및 문헌[Platts-Mills et al. 1974 J Immunol 113:348] 참조).

약술하면, CH50 검정은 표적 세포로서 양 적혈구(SRBC)를 사용한다. 약술하면, 1 × 10^9개 SRBC/㎖을 함유하는 현탁액을 GVB(2+) 완충제(Ca2+ 및 Mg2+가 있는 젤라틴/베로날(Veronal)-완충 염수), pH 7.35에서 제조한다. 용혈소(토끼 항-양 항혈청)를 적정하여, SRBC를 감작시키기 위한 최적의 희석률을 결정한다. 희석된 용혈소(1:800)를 동일 부피의 SRBC(1 × 109개 SRBC/㎖)와 혼합하고, 전체를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션시킨다. 이는 5 × 10^8개/㎖ 항체-코팅된 적혈구(EA)를 초래한다. EA(100 ㎕)를 정상 인간 혈청(NHS)의 5개의 단계 2배 희석액(1:20, 1:40, 1:80, 1:160 및 1:320) 또는 NHS 및 외인성 항원-발현 EHC의 혼합물의 유사 희석액 100 ㎕와 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. GVB2+ 완충제와 인큐베이션시킨 NHS를 대조군으로 사용한다. EA를 단독의 완충제(혈청을 첨가하지 않음)와 인큐베이션시킴으로써 백그라운드 대조군을 수득하고, 증류수를 EA에 첨가함으로써 완전한 용해(100% 용혈)를 결정한다. 1.2 ㎖의 빙냉 0.15 M NaCl을 사용하여, 반응을 중단시키고, 혼합물을 회전시켜, 용해되지 않은 세포를 펠렛화시키고, 상층액의 광학 밀도를 분광광도법에 의해 결정한다(412 nm). 용혈의 백분율을 100% 용해 대조군에 비하여 결정한다. 검정 혼합물에서 세포의 50%를 용해시키는데 필요한 혈청 희석률을 결정함으로써 보체 활성을 정량화시킨다. 결과는 CH50 유닛/㎖(혈청)으로 이러한 희석률의 역수로서 표현된다.

약술하면, AH50 검정은 대안적인 경로의 활성화에 의해 인간 혈청에 의한 비감작 토끼 적혈구(Erab)의 용해에 의존한다. 칼슘-의존성 고전 경로의 활성화를 검정 완충제로의 칼슘 킬레이터 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA)의 첨가에 의해 방지하고, 둘 모두의 경로에 필수적인 마그네슘을 완충제에 첨가한다. 약술하면, 토끼 RBC(2 × 10^8개 세포/㎖)의 세포 현탁액을 GVB-Mg2+-EGTA 완충제에서 제조한다. 일련의 1.5배 희석률(1:4, 1:6, 1:9, 1:13.5 및 1:20.25)의 통상의 인간 혈청(NHS) 또는 유사한 희석률의 NHS 및 외인성 항원-발현 EHC의 혼합물을 GVB-Mg2+-EGTA 완충제에서 제조하고, 각 혈청 희석액 100 ㎕를 50 ㎕의 표준화 Erab에 첨가한다. GVB-Mg2+-EGTA 완충제와 인큐베이션시킨 NHS를 대조군으로 사용한다. 그 다음, 혼합물을 진탕 수조에서, 37℃에서 60분 인큐베이션시켜, 세포를 현탁액 중에 유지시키고, 1.2 ㎖의 빙냉 NaCl(0.15 M)을 사용하여 반응을 중단시킨다. 튜브를 1250 g에서 4℃에서 10분 동안 회전시켜, 세포를 펠렛화시키고, 상층액의 광학 밀도를 분광광도법에 의해 결정한다(412 nm). 백그라운드 대조군은 100 ㎕의 GVB-Mg2+-EGTA 완충제 및 50 ㎕의 Erab를 가지며, 전체 용해가 10%를 초과하지 않는다. 전체 용해 대조군 튜브에서, 100 ㎕의 증류수를 50 ㎕의 Erab 현탁액에 첨가하고, 용혈 백분율을 100% 용해 대조군에 비하여 결정한다. 검정의 결과를 계산하고, 검정 혼합물에서 세포의 50%를 용해시키는데 필요한 혈청 희석률을 결정함으로써 보체 활성을 정량화한다. 결과는 AH50 유닛/㎖(혈청)의 이러한 희석률의 역수로서 표현된다.

실시예 27: 혈소판-로딩 티미딘 포스포릴라제의 활성

C-말단에 HA 태그가 있는 티미딘 포스포릴라제를 인코딩하는 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리에 의해 작제한다. 혈소판을 본원에 기재된 바와 같이 전구 세포로부터 배양한다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 형질도입에 의해 배양된 혈소판 전구 세포 내로 도입한다. 배양된 혈소판 내의 티미딘 포스포릴라제의 발현을 본원에 기재된 바와 같이 항-HA 검출 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 평가한다.

티미딘에서 티민으로의 전환율을 정량화함으로써 티미딘 포스포릴라제 활성을 혈소판 시료에서 결정한다. 예비 실험을 행하여, 시간 및 효소 희석에 관한 선형 대사산물 형성 동력학을 결정하며; 당해 방법은 4.0 내지 719 nmol/분/㎖(10 내지 9088의 시료 희석 범위에 상응)의 티민 포스포릴라제 범위에 걸쳐, 최대 16분 동안 선형인 것으로 보인다. 해동된 시료를 125 mM Tris-HCl, pH 7.4로 1:710 희석시킴으로써 사전-투석 시료 배양된 혈소판 및 대조군 혈소판 시료의 용해물을 제조한다. 그 다음, 25 ㎕의 혈소판 용해물을 100 ㎕의 인산나트륨 완충제(100 mM, pH 6.5) 및 25 ㎕의 표준 티미딘(10 mM)에 첨가하고, 혼합하고, 37C에서 10분 동안 인큐베이션시킨다. 반응을 25 ㎕의 40% TCA로 종결시킨다. 혈소판 용해물을 첨가하기 이전에 TCA를 인산나트륨 완충제/티미딘 인큐베이션 혼합물에 첨가함으로써 검정 블랭크(blank)를 준비한다. 시료를 13,400 × g에서 2분 동안 원심분리하고, 상층액을 진탕기에서 2분 동안 수-포화 디에틸 에테르로 2회 세척하여 TCA를 추출한다. 에테르가 HPLC 분리를 간섭하는 것을 피하기 위하여, 매트릭스를 공기에 5분 동안 노출시켜, 에테르의 증발을 가능하게 함으로써 효율적인 제거를 달성한다. 10 ㎕의 시료 부피를 HPLC 내로 주입한다.

Waters Alliance HPLC 2795 시스템을 사용하여 등용매 용리를 사용한 역상 크로마토그래피를 사용하여 기질 및 생성물의 크로마토그래피 분리를 달성한다. 사전-팩킹된 C18 컬럼(Spherisorb ODS 125 mm × 4.6 mm ID, 5 ㎛ 입자 크기, Waters)을 고정상으로 사용한다. HCl로 pH 2.70으로 조정되고, 1.0 ㎖/분의 유량으로 전달되는 이온쌍 형성제 테트라부틸 암모늄 수소 설페이트(5 mM)가 있는 암모늄 아세테이트(40 mM)의 이동상을 사용하고, 8분의 전개 시간을 사용하여, 분석물을 용리시킨다. UV 검출은 254 nm 및 0.1 흡광 단위 풀 스케일(full scale)에서 이루어진다. 스펙트럼을 순수 표준물질과 비교함으로써 대사산물을 확인한다.

실시예 28: 혈소판-디스플레이된 굿파스쳐 항원의 활성

개재 HA 태그가 있는 CD42b(GP1B, genbank AAH27955.1)의 N 말단에 융합된 콜라겐 알파-3(IV)(COL4A3) NC1 도메인 항원을 인코딩하는 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리에 의해 작제한다. 혈소판을 본원에 기재된 바와 같이 전구 세포로부터 배양한다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 형질도입에 의해 배양된 혈소판 전구 세포 내로 도입한다. 배양된 혈소판 상의 외인성 항원의 발현을 본원에 기재된 바와 같이 항-HA 검출 항체를 사용하여 유세포계수법에 의해 평가한다.

혈청을 굿파스쳐 증후군을 앓고 있는 환자로부터 수집하고, 혈청을 상용의 ELISA(MyBioSource COL4A3 ELISA 키트)에 의해 항-COL4A3 항체에 대하여 시험한다. 항원-발현 혈소판의 결합능을 일차 검출 항체로서 이러한 항-COL4A3 혈청을 이용하고, 이차 검출 항체로서 형광 항-인간 IgG를 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 유세포계수법에 의해 평가한다.

생체내에서의 혈소판-촉진된 순환 항원의 제거를 항원-발현 혈소판을 사용하여 마우스에서 모델링한다. NSG 마우스에 Dylight 650 염료로 형광 표지된 마우스 항-인간 COL4A3 항체(Creative BioMart) 100 ㎕를 주사한다. 그 다음, 외인성 항원을 발현하는 CFSE-표지된 배양된 혈소판(마우스마다 10^8개)을 꼬리 정맥을 통해 주사한다. 10분, 30분, 2시간, 12시간 및 24시간에 턱밑 위치로부터 채혈한다. 혈액을 원심분리하여 혈소판-풍부 분획을 수집하고, 이어서 본원에 기재된 바와 같이 염색하고, 유세포계수법으로 분석한다. CFSE-Dylight 650 이중 양성 모집단을 추적함으로써 혈소판에 의한 항체 포획을 결정한다.

실시예 29: 생체내 활성(마우스)

마우스 적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양한다. 적혈구계 전구 세포를 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 렌티바이러스를 사용하여 보체 수용체 1(CR1)을 인코딩하는 적합한 외인성 항원 폴리펩티드 전이유전자로 형질도입한다. 세포를 본원에 기재된 바와 같이 최종 분화까지 배양한다. 세포에서의 외인성 단백질의 존재를 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해 평가한다. 세포를 제조처의 지침에 따라 형광 염료, 예를 들어, CFSE(Sigma Aldrich)로 표지하여, 그들의 검출을 보조한다. 세포를 NZBWF1/J 루푸스 마우스 모델 또는 적합한 외인성 항원 폴리펩티드에 해당하는 다른 적절한 질병 또는 활성 모델 내로 주사하는데, 대략 1x10^8개 세포를 정맥 꼬리를 통해 주사한다. 혈액을 턱밑 천공에 의해 다수의 시점에 수집한다. 혈장 중 면역 복합체 수준을 Raji 세포 검정에 의해 검출하며, 예를 들어, 문헌[Theofilopoulos et al. 976, J Clin Invest 57(1):169]을 참조한다. 채혈된 혈액 시료에서의 CFSE 형광 세포의 백분율을 추적함으로써 배양된 세포의 약동학을 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해 평가한다. 전반적인 마우스 건강을 면역 복합체 침착 및 염증-매개의 손상의 감소를 추적하기 위한 신장 조직의 조직학을 포함하는 전체 부검에 의해 평가한다.

실시예 30: 신속한 스크리닝

세포주, 예를 들어, 293T 및 K562는 배양된 적혈구계 세포(수 일 내지 수 주)에 비하여 더 짧은 발현 및 배양 주기(약 1일)를 갖는다. 이들 세포주를 사용하여 적합한 외인성 항원 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자 라이브러리를 통해 신속하게 반복하여, 발현 또는 활성이 가장 높은 외인성 항원 폴리펩티드를 확인할 수 있다.

적합한 외인성 항원 폴리펩티드 전이유전자의 라이브러리, 예를 들어, 보체 수용체 1(CR1)의 전장 및 보다 짧은 변이형을 본원에 기재된 바와 같이 중합효소 연쇄 반응 및 깁슨 어셈블리에 의해 작제한다. 전이유전자의 라이브러리를 본원에 기재된 바와 같이 리포펙타민을 사용하여 마이크로타이터 플레이트에서 병렬 방식으로 HEK293T 세포 내로 트랜스펙션시키고, 본원에 기재된 바와 같이 렌티바이러스를 사용하여 K562 세포 내로 형질도입한다. 외인성 항원의 발현을 24 내지 48시간 후에 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해 평가한다. 라이브러리에서 외인성 항원 각각의 활성을 본원에 기재된 바와 같은 유세포계수법으로 검출되는 형광 면역 복합체의 포획에 의해, 또는 본원에 기재되는 바와 같은 유세포계수법으로 검출되는, 배양된 단핵구로의 형광 면역 복합체의 전달에 의해 평가한다. 그 다음, 가장 작용성인, 예를 들어, 가장 크게 발현되거나, 대부분의 면역 복합체를 포획하거나, 면역 복합체를 단핵구로 최적으로 전달하는 라이브러리로부터의 외인성 항원을 본원에 기재된 바와 같은 렌티바이러스를 사용하여, 본원에 기재된 바와 같은 병렬 적혈구계 세포 배양물 내로 개별적으로 형질도입한다. 배양된 적혈구계 세포상의 각 외인성 항원의 발현을 본원에 기재된 바와 같은 유세포계수법에 의해 평가한다. 배양된 적혈구계 세포상의 각 외인성 항원의 활성을 본원에 기재된 바와 같은 유세포계수법으로 검출되는 형광 면역 복합체의 포획에 의해, 그리고, 본원에 기재된 바와 같은 유세포계수법으로 검출되는, 배양된 단핵구로의 형광 면역 복합체의 전달에 의해 평가한다.

실시예 31: 생체내에서의 RBC의 제거율의 평가

적혈구계 세포의 제거율을 면역손상 마우스 모델에서 생체내에서 평가하였다. NSG 마우스를 제-1일에 100 ㎕의 클로드로네이트 리포좀(Clodrosomes.com) 용액으로 처리하여, 대식구를 선택적으로 고갈시켰다. 세포를 형광 태그 CFSE로 표지하고, 대략 1x10^8개 세포를 꼬리 정맥을 통해 각 마우스 내로 주사하였다. 규칙적인 간격으로, 혈액을 턱밑 천공에 의해 수집하고, 혈액 세포를 수집하였다. 세포를 항-인간 GPA 항체로 동시-염색시키고, 유세포계수법에 의해 분석하였다. 인간 적혈구계 세포는 CFSE 신호 및 인간 GPA 신호에 의해 마우스 적혈구계 세포와 구별되었다.

치료적 응용을 위하여, 배양된 적혈구계 세포, 및 세포내에서 또는 표면상에서 외인성 단백질을 함유하는 배양된 적혈구계 세포가 생체내에서 정상적으로 순환하는 것이 중요하다. 이것은 표준 면역손상 마우스 모델을 사용하여 도 9에 나타나 있다. 도 9a에서, 주사한 마우스로부터 수집된 혈액을 유세포계수기에서 분석한다. CFSE 및 인간-GPA에 대하여 이중-양성인 배양된 인간 적혈구계 세포를 플롯의 오른쪽 상측 사분면에서 확인한다. 도 9b에서, 마우스에 인간 적혈구(실선 원), 배양된 제핵 적혈구계 세포(파선 마름모), 세포내 외인성 단백질을 발현하는 배양된 제핵 적혈구계 세포(점선 사각형) 및 표면 외인성 단백질을 발현하는 배양된 제핵 적혈구계 세포(백색 삼각형)를 주사하였다. 인간 세포의 제거율은 시간이 지남에 따라 남아 있는 CFSE+ 세포의 백분율로 측정되고, 초기 시점으로 스케일된다(주사 후 20분). 4개의 시료 간의 제거율에 유의미한 차이가 존재하지 않는다.

이들 데이터는 배양된 제핵 적혈구계 세포가 정상의 인간 적혈구와 실질적으로 유사한 순환을 갖는 것을 명백하게 보여준다. 추가로, 세포내 공간에서 또는 세포의 표면상에 발현되는 외인성 단백질은 이들 세포의 순환 거동에 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 이것은 기술의 치료적 변형에 대한 중요한 결과이다.

실시예 32: 순환 유해 사례의 평가

순환 중 배양된 적혈구계 세포에 의해 야기되는 유해 사례의 발생률을 배양된 적혈구계 세포가 주사된 동물에서 혈중 피브리노겐 분해 생성물의 검출 및 조직학에 의해 평가하였다.

피브리노겐 분해 생성물의 검출. 마우스에 본원에 기재된 바와 같은 배양된 적혈구계 세포를 주사하였다. 혈액을 EDTA-함유 튜브에 턱밑 천공에 의해 마우스로부터 수집하였다. 세포를 원심분리에 의해 분리하고 혈장을 수집하였다. 피브리노겐 분해 생성물 피브리노펩티드 A 및 피브리노펩티드 B의 수준을 제조처의 지침에 따라 ELISA(MyBiosource)에 의해 마우스 혈장에서 측정하였다.

조직학. 동일한 마우스로부터의 조직 시료를 부검 후에 수집하였다. 조직을 트리밍시키고, 파라핀 왁스에 포매시키고, 섹션화하였다. 조직 섹션을 H&E 염색 및 트리크롬(trichrome) 염색에 의해 염색하였다. 현미경 이미지를 10배 및 20배 배율에서 취하였다.

치료적 응용을 위하여, 배양된 적혈구계 세포 및 외인성 단백질을 함유하는(세포내로 또는 표면상에) 배양된 적혈구계 세포가 유해 사례, 예를 들어, 응고 캐스케이드의 활성화 및 조직 혈전 형성을 유도하지 않는 것이 중요하다.

도 10a 및 도 10b는 (1) 인간 적혈구, (2) 배양된 제핵 적혈구계 세포, (3) 세포내 외인성 단백질을 발현하는 배양된 제핵 적혈구계 세포, (4) 표면 외인성 단백질을 발현하는 배양된 제핵 적혈구계 세포 및 (5) 단독의 재조합 단백질을 주사한 마우스에 대한 마우스 혈장에서의 피브리노펩티드 A 및 B의 수준을 보여준다. 피브리노펩티드 A 및 B, 피브리노겐 분해 및 응고 캐스케이드의 활성화의 마커의 수준은 모든 시료에 대하여 실질적으로 유사하다.

도 10c 및 도 10d는 배양된 제핵 적혈구계 세포(10c) 및 재조합 단백질(10d)을 주사한 마우스에 대한 비장의 조직학적으로 염색된 섹션을 보여준다. 조직 간에 실질적인 차이가 존재하지 않으며, 비장, 간, 폐, 뇌, 심장 및 신장에서 확인가능한 조직 손상이 시료 중 어느 것 사이에도 관찰되지 않았다.

이들 데이터는 외인성 단백질이 있는 또는 이것이 없는 배양된 제핵 세포가 마우스의 순환 중에 있는 동안 임의의 유해 사례를 유도하지 않는 것을 결정적으로 보여준다.

실시예 33: 순환 중 외인성 단백질 보유의 평가

배양된 제핵 적혈구계 세포 내의 또는 그 상의 외인성 단백질의 보유를 유세포계수법 및 웨스턴 블롯팅에 의해 평가하였다.

1. 유세포계수법에 의해 평가되는 외인성 단백질의 보유

적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하였다. 글리코포린 A 신호 서열, B형 간염 표면 항원에 특이적인 항체 scFv, HA 에피토프 태그 및 글리코포린 A 코딩 서열을 인코딩하는 전이유전자 작제물을 본원에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리에 의해 어셈블시켰다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 형질도입에 의해 적혈구계 세포 내로 도입하였다. 세포를 본원에 기재된 바와 같이 최종 분화까지 배양하였다. 세포를 CFSE로 형광 표지하고, 꼬리 정맥을 통해 면역손상 NSG 마우스(Jackson Labs) 내로 주사하였다(1 x 10^8개 세포/마우스). 규칙적인 간격으로, 혈액을 턱밑 천공에 의해 수집하였다. 수집된 세포를 형광 항-HA 항체(Abcam)로 염색하고, 유세포계수법에 의해 분석하였다. 인간 세포는 CFSE+ 세포로 확인되었으며, 외인성 단백질 보유를 에피토프 태그에 대해서도 양성으로 염색된 CFSE+ 세포의 분율에 의해 평가하였다.

2. 웨스턴 블롯에 의해 평가되는 외인성 단백질의 보유

적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하였다. 아데노신 데아미나제 및 HA 에피토프 태그를 인코딩하는 전이유전자 작제물을 본원에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리에 의해 어셈블시켰다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 형질도입에 의해 적혈구계 세포 내로 도입하였다. 세포를 본원에 기재된 바와 같이 최종 분화까지 배양하였다. 세포를 CFSE로 형광 표지하고, 꼬리 정맥을 통해 면역손상 NSG 마우스(Jackson Labs) 내로 주사하였다(1 x 10^8개 세포/마우스). 규칙적인 간격으로, 혈액을 턱밑 천공에 의해 수집하였다. 수집된 세포를 세척하고, 용해시키고, HA 에피토프 태그에 대한 검출 항체를 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.

치료적 응용을 위하여, 세포내에 또는 표면상에 외인성 단백질을 함유하는 배양된 적혈구계 세포가 순환 중에 있는 동안 이들 전이유전자를 보유하는 것이 중요하다. 이러한 성과는 적혈구계 세포가 그들이 성숙함에 따라 순환 중에 있는 경우, 기본 기능에 필요하지 않은 단백질의 제거 및 엄격한 성숙 프로그램을 겪는다는 것이 해당 분야에 널리 가정된다는 점에서 중대하다(문헌[Liu J et al. (2010) Blood 115(10):2021-2027], 문헌[Lodish HF et al. (1975) Developmental Biology 47(1):59]).

도 11은 배양된 제핵 적혈구계 세포 내에서 또는 그 상에서 발현되는 외인성 단백질이 순환에 보유되었음을 보여준다. 도 11a에서, 그들의 표면상에 항체 scFv를 발현하는 배양된 제핵 적혈구계 세포를 마우스에 주사하였다. 항체 scFv-양성 세포의 백분율은 다수-일 순환 연구의 기간 동안 대략 50%에서 시작하고, 안정적으로 유지된다. 도 11b에서, HA 태그가 있는 세포질 효소를 발현하는 배양된 제핵 적혈구계 세포 또는 HA 태그가 있는 재조합 효소를 마우스에 주사하였다. 웨스턴 블롯에 의해 분석되는 경우, 효소가 실험 기간 동안 배양된 세포 내에 보유되는 것이 명백하다. 밴드 세기의 감소는 상기 세포로부터의 외인성 효소의 제거로부터가 아닌, 실험 동안의 세포의 제거에 기인한다.

데이터는 배양된 제핵 적혈구계 세포 내에서 또는 그 상에서 발현되는 외인성 단백질이 순환 중 세포 내에 또는 그 상에 보유되며, 이것은 치료적 관련성에 대하여 대단하고 이례적인 영향을 갖는 것을 명백하게 보여준다.

실시예 34: 생체 내에서의 반감기 연장의 평가

적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하였다. 아데노신 데아미나제 및 HA 에피토프 태그를 인코딩하는 전이유전자 작제물을 본원에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리에 의해 어셈블시켰다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 렌티바이러스 형질도입에 의해 적혈구계 세포 내로 도입하였다. 세포를 본원에 기재된 바와 같이, 최종 분화까지 배양하였다. 세포를 CFSE로 형광 표지하고, 꼬리 정맥을 통해 면역손상 NSG 마우스(Jackson Labs) 내로 주사하였다(1 x 10^8개 세포/마우스). 규칙적인 간격으로, 혈액을 턱밑 천공에 의해 수집하였다. 수집된 세포를 세척하고, 용해시키고, HA 에피토프 태그에 대한 검출 항체를 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.

C-말단에 HA 태그가 있는 아데노신 데아미나제를 인코딩하는 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 깁슨 어셈블리에 의해 작제하였다. 전이유전자를 본원에 기재된 바와 같이 리포펙타민 트랜스펙션(Life Technologies)에 의해 HEK-293T 세포 내로 도입하였다. 단백질을 제조처의 지침에 따라 HA 친화성 수지(Pierce)를 사용하여 7일 후에 세포 배양 상층액으로부터 정제하였다. 단백질 농도를 280 nm에서의 광의 흡광도에 의해 평가하였다. 단백질(40 ㎍)을 꼬리 정맥을 통해 면역손상 NSG 마우스(Jackson Labs) 내로 주사하였다. 정기적인 간격으로, 혈액을 턱밑 천공에 의해 수집하였다. 혈장을 HA 에피토프 태그에 대한 검출 항체를 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.

도 11b에서, HA 태그가 있는 세포질 효소를 발현하는 배양된 제핵 적혈구계 세포, 또는 HA 태그가 있는 재조합 효소를 마우스에 주사하였다. 웨스턴 블롯에 의해 분석되는 경우, 효소의 순환 반감기가 가용성 형태로 주사되는 경우에 비하여 순환 세포 내에서 발현되는 경우 유의미하게 연장되는 것이 명백하다.

실시예 35: 생체내에서의 제거율의 평가 - 혈소판

외인성 티미딘 포스포릴라제 발현 혈소판의 모집단을 본원에 상세화된 절차를 사용하여 배양하고, CFSE로 표지하고, 꼬리 정맥을 통해 NSG 마우스 내로 주사한다. 고유 인간-공급 혈소판의 모집단을 유사하게 CFSE로 표지하고, 다른 마우스 내로 주사한다. 시료를 10분, 1시간, 4시간, 8시간, 24시간 및 48시간에 둘 모두의 마우스로부터 취하고, 유세포계수법을 사용하여, 혈소판 순환 수준을 정량화한다. 천연 혈소판 대 배양된 혈소판의 반감기를 비교한다.

실시예 36: 순환 유해 사례의 평가 - 혈소판

치료적 응용을 위하여, 배양된 혈소판 및 외인성 단백질을 함유하는(세포내로 또는 표면상에) 배양된 혈소판이 유해 사례, 예를 들어, 응고 캐스케이드의 활성화 및 조직 혈전 형성을 유도하지 않는 것이 중요하다. 꼬리 정맥을 통한 NSG 마우스 내로의 배양된 혈소판의 주사 시에, 피브리노겐 분해 생성물 피브리노펩티드 A 및 피브리노펩티드 B는 제조처의 프로토콜(MyBiosource)에 따라 ELISA에 의해 마우스 혈장에서 검출된다. NSG 마우스로부터의 조직 시료를 부검 후에 수집한다. 조직을 트리밍시키고, 파라핀 왁스에 포매시키고, 섹션화시킨다. 조직 섹션을 H&E 염색 및 트리크롬 염색에 의해 염색한다. 현미경 이미지를 10배 및 20배 배율에서 취하고, 이는 임의의 발병 특징에 대하여 훈련된 병리학자에 의해 평가된다.

실시예 37: 순환 중 외인성 단백질 보유의 평가 - 혈소판

배양된 혈소판 내의 및 그 상의 외인성 단백질의 보유를 유세포계수법 및 웨스턴 블롯팅에 의해 평가한다.

세포내 외인성 단백질을 함유하는 CFSE 표지된 혈소판을 꼬리 정맥을 통해 마우스 내로 주사한다. 규칙적인 간격으로, 혈액을 턱밑 천공에 의해 수집한다. 혈액을 원심분리하여, 혈소판-풍부 혈장을 단리하고, 이를 이어서 용해시키고, 외인성 단백질 상에 존재하는 에피토프 태그에 대한 염색을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석한다.

실시예 38: 생성을 위한 공여자 세포의 획득

사전 동의를 얻은 후에, 말초 혈액 줄기 세포 동원을 위하여, 건강한 CD34+ 줄기 세포 공여자에게 rhG-CSF(그라노사이트(Granocyte) 또는 뉴포젠(Neupogen))를 5일 동안 10 ㎍/㎏/일로 피하로 제공한 다음, 연속 2일 동안 분리반출법을 겪게 하여, 동원된 CD34+ HSC를 수집한다. 단핵 세포(MNC)를 피콜(Ficoll) 밀도 구배 원심분리에 의해 동원된 말초 혈액으로부터 단리하고, 2개 부분으로 나눈다. 1개 부분을 사용하여 밀테니이(Miltenyi) 프로토콜에 관하여, 항-CD34-코팅된 자기 비드(Miltenyi Biotec, Inc., Germany)를 사용함으로써 CD34+ 세포를 정제한다. CD34+ 분획의 순도를 조절한다. 그 다음, CD34+-풍부 HSC를 즉시 2-단계 배양 방법에서 사용하거나 1-단계 배양 방법에 사용할 때까지 동결시킨다.

사용되는 완전 배지(CM)는 2 mM L-글루타민 및 100 IU/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Grand Island, NY, USA) 및 10% 열-불활성화 FBS(Gibco)가 보충된 RPMI 1640(Eurobio, France)이다. 10% 열-불활성화 FBS가 보충된 IMDM(Gibco)을 증량을 위해 사용한다. 재조합 인간 줄기 세포 인자(rhSCF), 트롬보포이에틴(TPO), 태아 간 티로신 키나제 3 리간드(Flt-3L), GM-CSF 및 TNF-알파를 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입한다.

실시예 39: 생성을 위한 규모 확대

적혈구계 세포를 점차 부피 규모를 확대하여, 정적 배양에서 1x10^5개 내지 2x10^6개 세포/㎖의 밀도로 세포를 유지한다. 증량 단계는 10^5개/㎖로 씨딩되고, 3 내지 7회의 점진적 부피 전달을 포함한다; 100 ㎖, 500 ㎖, 1 ℓ, 10 ℓ, 50 ℓ, 100 ℓ, 100 ℓ. 생성 과정 동안, 세포 배지는 IMDM, FBS, BSA, 홀로트랜스페린, 인슐린, 글루타민, 덱사메타손, 베타 에스트라디올, IL-3, SCF 및 에리트로포이에틴의 조합을 포함한다. 세포가 생성 생물반응기에 씨딩하기에 적절한 부피에 도달한 경우, 그들을 최종 규모 확대 및 분화를 위해 생성 생물반응기로 옮긴다.

실시예 40: 생물반응기(Wave)에서의 세포의 배양

WAVE 생물반응기 2/10 시스템을 오퍼레이터 매뉴얼에 따라 설치한다. 약술하면, 셀백(Cellbag)을 로킹 유닛에서 어셈블시키고, 이를 관류 모듈에 배치한다. 백을 공기로 부풀린 후에, 중량을 0으로 설정한다. 이후에, 백을 적절한 양의 배양 배지로 채우고, 적어도 2시간 동안 인큐베이션시켜, 배지가 37C에 도달하게 한다. 배지 및 세포를 전달 플라스크, 2개의 포트를 갖는 특별 설계된 DURAN 유리병을 통해 백으로 전달한다. 플라스크의 상측 부분에서, 필터를 포트에 연결한다. 플라스크의 하측 옆의 다른 포트에서, 튜브를 어셈블시킨다. 전달 플라스크상의 튜브를 셀백 상의 공급 연결부와 연결시킨다. 전달 플라스크를 LAF 후드에서 유지하여, 오염의 위험을 줄인다.

관류를 시작하기 전에, 수집 및 공급을 위한 튜빙 및 용기를 셀백에 연결한다. 튜빙을 하기와 같이 준비한다: 각각 3.2, 6.4 mm의 내경 및 외경을 갖는 50 또는 70 ㎝ 길이 Saniflex ASTP-ELP 실리콘 튜빙(Gore/Saniflex AB)을 양 말단에서 수(male) 루어락(luer lock) 연결부를 장착한다. 실리콘 튜빙을 암 루어락을 통해 C-Flex 튜브의 하나의 말단에 연결한다. C-Flex 튜브의 다른 말단에, 수 루어락을 조립하고, 그 후에, 튜빙을 오토클레이브시킨다. 루어락을 모든 튜브에서 집-타이( zip tie)로 제자리에 유지시킨다. 관류 이전에, 공급 및 수집 둘 모두를 위하여, 실리콘 부분을 셀백에 연결시키고, C-Flex 부분을 5 ℓ 용기(Hyclone Labtainer)에 연결시킨다. 모든 연결을 층류 캐비넷에서 수행한다.

환경 및 대사 인자의 조절은 배양 중 적혈구계 세포의 전사 인자 및 유전자 조절 단백질의 발현 또는 활성을 변경시킬 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Csaszar et al., 2009 Biotechnol Bioeng 103(2):402]; 문헌[Csaszar et al. 2012 Cell Stem Cell 10(2):218]을 참조한다. 반응기에서 유입 및 유출에 대한 조절을 제공하기 위하여, 미세-부피 전달 시스템을 생성하며, 그의 주요 구성요소는 100 ㎛의 내경을 갖는 60 내지 80 ㎝ 길이 용융 실리카 모세관(#TSP100375, Polymicro Technologies)이다. 유입 말단에서, PEEK 루어를 통해 MicroTight 어댑터(#P-662, Upchurch Scientific)에 연결된 루어-락 팁 스톡 주사기(#309585 BD)로 모세관에 공급한다. 스톡 주사기를 4C의 냉장고에 유지시킨 모델(Model) 33 트윈 주사기 펌프(Twin Syringe Pump)(#553333, Harvard Apparatus)상에 로딩한다. 유출 말단에서, 모세관은 생물반응기에 유입되고; 2-포트 FEP 세포 배양 백(#2PF-0002, VueLife)을 5% CO2와 함께 37C에서 세포 배양 인큐베이터에서 오비탈(orbital) 진탕기에 배치한다. 모세관을 니들을 사용하여 자가-밀봉 고무 격벽(#B-IIS, InterLink)을 통해 생물반응기의 중간 지점 내로 공급한다. 생물반응기 상의 반대편 연결기를 추가의 자가-밀봉 고무 격벽으로 대체한다. 스톡 주사기 및 전달 모세관을 10% 우태아혈청이 있는 PBS의 용액과 함께 사용하기 이전에 하룻밤 블로킹시켜, 주사기 및 모세관 벽으로의 단백질 부착을 방지한다.

국내 기기 LabVIEW 7.1을 사용하여 주사기 펌프의 주사를 제어하기 위한 프로그램을 생성한다. 프로그램의 기본 투여 전략은 농도 L1까지의 초기 주사에 이어서, 대기 시간 t1 및 각각 농도 L2까지의 이후의 주사에 이어서, 대기 시간 t2이며 n회 반복한다. 사용자는 유속, 스톡 농도, 초기 배양 부피, 주사 후의 요망되는 농도, 주사 사이의 시간 및 총 주사 횟수를 입력한다.

실시예 41: 면역원성 및 관용 유도의 평가

1. 마우스에서의 관용 유도

마우스에서, 항원 단백질, 이러한 예에서, 오브알부민(OVA)을 포함하는 본 발명의 세포 조성물을 사용한 3회의 연속 정맥내 주사에 의해 관용이 유도될 수 있다. 나이브(naive) 마우스를 제-7일, 제-3일 및 제-1일에 유리 OVA 또는 본 발명의 세포 조성물 내에서 발현되는 OVA(세포-OVA)를 주사한다. 그 다음, 폴리 I:C 애쥬번트(Invivogen, San Diego, CA)와 혼합된 항원의 2회의 주사에 의해 마우스를 OVA로 면역화시켜, 강력한 면역 반응을 유도한다.

2. 항체 역가의 평가

마우스 혈청에서의 IgG 수준을 표준 ELISA에 의해 평가한다. 약술하면, 혈청을 항원 단백질, 예를 들어, 오브알부민(OVA)를 포함하는 본 발명의 세포 조성물이 주사된 마우스의 혈액 시료로부터, 그리고 유리 또는 재조합 OVA가 주사된 마우스로부터 다양한 시점에 수득한다. 검정 플레이트 상으로 흡수되는 항원(50 mM 탄산염 완충제 중 1 ㎍/㎖, pH 9.7)으로서 OVA를 사용하여 표준 ELISA 검정을 사용한다. 혈청 시료를 사전-처리 또는 미-처리 혈청에 대하여 1:50 내지 1:200 범위로, 그리고 처리 후 혈청에 대하여 1:400 내지 1:500,000 범위로 단계 희석하고, 2벌로 시험한다. 흡착된 재조합 OVA로의 혈청 중 항-OVA 항체의 결합을 서양고추냉이 퍼옥시다제에 컨쥬게이트된 이차 항-마우스 면역글로불린을 사용하여 비색에 의해 검출한 다음, 발색 기질로 처리한다.

3. T 세포 반응의 분석

관용을 본원에 기재된 바와 같이 항원 단백질 OVA에 대하여 유도한다. 마우스를 OVA의 면역화 단계 주사의 2차 투여 후 7일에 안락사시키고, 그들의 비장을 수집한다. 기관을 0.8% 염화암모늄 용액(Stem-Cell Technologies, Grenoble, France)을 사용한 RBC 용해 후에, 70 미크론 세포 스트레이너(strainer)를 통해 거름으로써 비장 세포 현탁액을 수득한다. 모든 시료를 항-Fc 수용체 항체(정제된 항-CD16/32, Ozyme, San Diego, CA)와 인큐베이션시켜, 분석을 위한 항체를 사용한 인큐베이션 이전에 비특이적인 결합을 방지한다. 하기의 모노클로널 항체(Ab)를 비장 세포 염색을 위해 사용한다: Biolegend로부터 구입한 PC5-항-CD62L(MEL14) 및 PC7-항-CD8. OVA 펩티드-MHC 테트라머(PE-Kb-SIINFEKL 테트라머)를 Beckmann Coulter로부터 구입한다. OVA-특이적 T 세포는 유세포계수법에 의해 항-CD8 및 OVA 펩티드-MCH 테트라머를 사용한 염색에 의해 이중 양성인 세포로서 확인된다. 이러한 세포 모집단 중에, 활성화된 OVA-특이적 CD8 T 세포의 백분율을 항-CD62L 항체 염색에 의해 양성인 세포의 분율에 의해 결정한다.

4. 생체내 T 세포 용해 검정

나이브 비장 세포를 37C에서 1시간 동안 10 마이크로그램/㎖의 SIINFEKL 펩티드(Genscript, Piscataway, NJ)로 펄싱시킨 다음, 0.4 μM CFSE(CFSE 저농도)로 표지한다. 미처리 비장세포의 대조군 모집단을 4 μM CFSE(CFSE 고농도)로 표지한다. CFSE 저농도 및 CFSE 고농도 세포를 1:1의 비로 조합하고, 마우스당 1E7개 세포를 정맥내 경로에 의해, 본원에 기재된 바와 같이 이전에 OVA 항원에 관용화된 마우스에 또는 본원에 기재된 바와 같이 OVA 항원으로 면역화된 마우스에 주사한다. 16시간 후에, 비장 단일-세포 현탁액을 본원에 기재된 바와 같이 제조하고, 유세포계수법을 사용하여 분석하여, CFSE 저농도/CFSE 고농도 세포 비를 결정한다.

실시예 42: 배양된 적혈구계 세포의 증량 및 분화의 평가

시험관내 분화된 세포에서 증량, 분화 및 제핵을 평가하여, 전이유전자의 도입이 배양 중 세포의 질에 부정적으로 영향을 미치지 않는 것을 보장하는 것이 중요하다. 증량을 세포 계수에 의해 평가한다. 분화를 유세포계수법, 웨스턴 블롯 및 RT-PCR에 의해 평가한다. 제핵을 유세포계수법에 의해 평가한다.

세포 계수에 의한 증량비의 평가. 적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양한다. 다양한 시점에, 세포를 수집하고, PBS로 세척하고, 카운테스(Countess) 자동 세포 계수 기기(Life Technologies)를 사용하여 계수한다. 세포의 증량비를 시간에 따른 세포의 개수의 증가에 의해 결정한다.

유세포계수법에 의한 분화의 평가. 적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양한다. 다양한 시점에 세포를 수집하고, PBS로 세척하고, Life Technologies로부터 구입한 세포 표면 마커 GPA(CD235a), CKIT(CD117) 및 TR(CD71)에 대한 형광 항체의 1:100 희석액으로 염색한다. 표지된 세포를 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해 분석하였다.

웨스턴 블롯에 의한 분화의 평가. 적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양한다. 다양한 시점에 세포를 수집하고, PBS로 세척하고, RIPA 완충제로 용해시키고, 분화 마커 GATA1, GATA2, Band3, CD44 및 액틴(Abcam)에 대한 항체를 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯에 의해 분석한다.

유세포계수법에 의한 제핵의 평가. 적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양한다. 다양한 시점에 세포를 수집하고, PBS로 세척하고, 제조처 권고된 희석률로 글리코포린 A(Life Technologies)에 대한 형광 항체 및 핵산 착색제 DRAQ5(Pierce)로 염색하고, 본원에 기재된 바와 같이 Attune 유세포계수기에서 분석한다.

현미경 관찰에 의한 제핵의 평가(벤지딘-김사(Giemsa)). 적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하였다. 다양한 시점에, 세포를 수집하고, PBS로 세척하고, Cytospin(Thermo Scientific)을 사용하여 슬라이드 상에서 회전시킨다. 세포는 실온에서 2분 동안 -20C 메탄올을 사용한 사이토스핀(cytospin) 후에 고정된 세포였으며, 이를 물로 헹구고, 공기 건조시켰다. 벤지딘 정제(Sigma#D5905)를 10 ㎖의 PBS로 용해시키고, 이에 10 ㎕의 H2O2를 첨가하였다. 용액을 0.22 ㎛ 주사기 필터로 여과하였다. 슬라이드 상의 세포 스폿을 300 내지 500 ㎕의 벤지딘 용액으로 덮고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 물로 세척하였다. 김사 착색제를 물로 1:20 희석한다(Sigma#GS500). 슬라이드 상의 세포 스폿을 300 내지 500 ㎕ 김사 용액으로 덮고, 실온에서 40분 동안 인큐베이션시키고, 물로 세척하고, 공기-건조시켰다. 그 다음, 현미경에서의 영상화 이전에, 슬라이드를 봉입하고, 밀봉한다.

도 12a는 전이유전자를 함유하는 세포(파선 및 점선) 및 전이유전자를 함유하지 않는 세포(실선)에 대한 7일의 증량 및 분화 기간 동안 배양에서의 적혈구계 세포의 증량비를 보여준다. 중요한 것은, 전이유전자를 함유하는 배양된 세포의 증량비가 전이유전자를 함유하지 않는 세포의 증량비와 구별가능하지 않다는 것이다.

도 12b는 세포 표면 분화 마커 GPA 및 CKIT에 대한 항체로 염색된 세포에 대한 유세포계수법 플롯의 모음이다. 이러한 특정 분화 단계에서, 세포가 최종 성숙에 접근함에 따라, 배양물은 그의 CKIT 발현을 소실하고, 그의 GPA 발현을 증가시킨다. 중요한 것은, 전이유전자를 함유하는 배양된 세포가 이러한 분화의 측정 기준에 의해 전이유전자를 함유하지 않는 것들로부터 구별가능하지 않다는 것이다.

도 12c는 표면 마커 GPA에 대한 항체 및 형광 DNA 착색제로 염색된 세포에 대한 유세포계수법 플롯의 모음이다. 3개의 세포 모집단이 명확하다: (1) 제핵 적혈구계 세포를 포함하는 GPA-고농도 및 DNA-저농도인 세포; (2) 여전히 유전 물질을 함유하는 적혈구계 세포를 포함하는 GPA-고농도 및 DNA-고농도인 세포; 및 (3) 제핵 세포로부터의 막-캡슐화 배출 핵 또는 피레노사이트를 포함하는 GPA-저농도 및 DNA-고농도인 세포. 중요한 것은, 전이유전자를 함유하는 배양된 세포가 이러한 제핵의 측정 기준에 의해 전이유전자를 함유하지 않는 것들로부터 구별가능하지 않다는 것이다.

세포 배양물로의 전이유전자의 도입은 배양 중 세포의 증량비, 분화 또는 제핵비에 현저하게 영향을 미치지 않는다.

실시예 43: 헤모글로빈 함량의 평가

1. 총 헤모글로빈

적혈구 헤모글로빈 함량을 제조처의 지침에 따라, 드라브킨(Drabkin) 시약(Sigma-Aldrich, 제품 D5941)에 의해 결정하였다. 약술하면, 혈액 세포를 수성 완충제에서 시약과 조합하고, 완전히 혼합하고, 540 nm의 파장에서의 광의 흡광도를 표준 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 가용성 헤모글로빈 표준 곡선을 사용하여 세포 중 헤모글로빈 함량을 정량화하였다.

2. RT-PCR에 의한 헤모글로빈 유형분석

세포를 용해시키고, 총 RNA를 수집한다. 제조처의 프로토콜에 따라 RT-PCR을 위한 SuperScript First-Strand Synthesis System(Life Technologies)을 사용하여 역 전사를 수행하였다. 약술하면, 총 RNA(5 ㎍)를 65C에서 5분 동안 이후에 얼음에서 1분 동안 10 ㎕ H2O 중 150 ng 무작위 헥사머 프라이머 및 10 nmol dNTP 믹스와 인큐베이션시켰다. 반응 마스터 혼합물을 2 ㎕ 10x RT 완충제, 4 ㎕의 25 mM MgCl2, 2 ㎕의 0.1 M DTT 및 1 ㎕의 RNAseOUT로 제조하였다. 반응 혼합물을 RNA/프라이머 혼합물에 첨가하고, 간단히 혼합한 다음, 실온에서 2분 동안 두었다. 1 ㎕(50 유닛)의 SuperScript II RT를 각 튜브에 첨가하고, 혼합하고, 25C에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 반응물을 42C에서 50분 동안 인큐베이션시키고, 70C에서 15분 동안 열 불활성화시킨 다음, 얼음에 보관하였다. 1 ㎕의 RNase H를 첨가하고, 37C에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 이러한 반응 생성물, 제1 가닥 cDNA를 RT-PCR 반응을 위해 필요할 때까지 -20C에서 보관하였다.

상이한 헤모글로빈 유전자 및 대조군 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머를 IDT-DNA로부터 구입하였다. 프라이머는 하기와 같았다: hHBB_F - tcctgaggagaagtctgccgt(Seq. ID No. 9); hHBB_R - ggagtggacagatccccaaag(Seq. ID No. 10); hHBA_F1 - tctcctgccgacaagaccaa(Seq. ID No. 11); hHBA_R1 - gcagtggcttagcttgaagttg(Seq. ID No. 12); hHBA_F2 - caacttcaagctaagccactgc(Seq. ID No. 13); hHBA_R2 - cggtgctcacagaagccag(Seq. ID No. 14); hHBD_F - gactgctgtcaatgccctgt(Seq. ID No. 15); hHBD_R - aaaggcacctagcaccttctt(Seq. ID No. 16); hHBG2_F - cactggagctacagacaagaaggtg(Seq. ID No. 17); hHBG2_R - tctcccaccatagaagataccagg(Seq. ID No. 18); hHBE_F - aagagcctcaggatccagcac(Seq. ID No. 19); hHBE_R - tcagcagtgatggatggacac(Seq. ID No. 20); h18S-RNA-F - cgcagctaggaataatggaatagg(Seq. ID No. 21); h18S-RNA-R - catggcctcagttccgaaa(Seq. ID No. 22).

RT PCR 반응 믹스를 총 50 ㎕ H2O의 부피에서, 25 ㎕ SYBR Green Mix(2x)(Applied Biosystems), 0.5 ㎕ 제1 가닥 cDNA, 2 ㎕ 정방향/역방향 프라이머쌍 믹스(각 프라이머 5 pmol/㎕)를 사용하여 제조하였다. 반응을 하기의 증폭 사이클을 사용하여 ABI Prism SDS 7000 기기(applied biosystems)에서 시행하였다: 50C 2분, 1 사이클; 95C 10분, 1 사이클; 95C 15초 -> 60C 30초 -> 72C 30초, 40 사이클; 72C 10분, 1 사이클. 해리 곡선 분석 및 RT-PCR 결과를 SDS 7000 기기를 사용하여 수행하였다.

실시예 44: 배양된 혈소판의 분화 평가 - FACS

배양 중 혈소판의 분화 상태를 유세포계수법에 의해 평가할 수 있다. 거핵구(MK)는 최종 혈소판 분화에 선행하는 별개의 세포 형태를 나타낸다. MK를 향한 성숙의 정도를 결정하기 위하여, 1 × 10^6개의 배양된 세포(LAMA-84 및 CD34+ 세포)를 세척한 다음, (a) 항-CD41-FITC(GpIIb/IIIa; BD Bioscience, San Jose, CA, USA) 또는 항-CD71-FITC 또는 (b) 항-CD33-FITC, 항-CD41-PE, 항-CD45-PerCp 및 CD34-APC(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)로 표지하고, 생성된 CD41 세포의 백분율에 대하여 분석한다.

배수체의 양을 결정하기 위하여, 분화된 LAMA-84 세포를 4℃에서 75% 에탄올에서 하룻밤 고정시키고, 요오드화프로피디움(PI, 50 ㎍/㎖)으로 표지하고, FACScalibur(Becton Dickinson)를 사용하여 분석하는 한편, 제14일 분화된 CD34+ 세포를 May-Grunwald/김사를 사용하여 세포당 핵의 수 및 MK의 특정 형태를 정량화함으로써 May-Grunwald/김사 염색 후에 현미경 하에서 정량적으로 분석한다. MK 형태를 갖는 세포만을 분석한다. 사이토스핀 제제에서의 다핵 세포의 존재는 배수체 MK의 존재를 나타낸다. 분화된 CD34+ 세포를 형태에 의해 다핵 성숙 MK의 존재에 대하여 평가한다.

실시예 45: 배양된 혈소판의 분화 평가 - qPCR

배양 중 혈소판의 분화 상태를 정량적 PCR에 의해 평가할 수 있다. 혈소판 RNA를 추출하여, 배양된 세포를 추가로 특성화시킨다. 총 RNA를 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 추출한다. 각 혈소판 제제의 순도를 혈소판(GPIIIa) 및 백혈구(CD45) 마커의 PCR 분석에 의해 평가한다. 혈소판 RNA의 무결성을 추가의 분석 이전에 Bioanalyzer 2100(Agilent)을 사용하여 평가한다.

총 RNA를 세포 용해물로부터 수집하고, cDNA 라이브러리를 상용의 합성 키트(Clontech)를 사용하여 생성한다. 표지된 cDNA를 Quant-iT PicoGreen dsDNA 키트(Invitrogen)로 정량화시키고, 단일 레인으로의 로딩 및 Illumina 1G 게놈 분석기(Solexa)에서의 시퀀싱을 위하여 3 pM로 희석시킨다.

미가공 서열을 일련의 품질 제어 기준을 통해 필터링한다. 먼저, 3' Solexa 어댑터의 적어도 6개 뉴클레오티드의 존재를 확인한다. 이러한 기준을 따르지 않았던 서열 판독물을 폐기하는 한편, 다른 것들을 트리밍시켜, 3' 말단에 부착된 어댑터 서열을 제거한다. 남아 있는 태그를 그들의 길이(10개 뉴클레오티드 초과), 카피수(4 초과의 판독) 및 판독가능성(9개 미만의 미-확인 뉴클레오티드, N으로 표기)에 관하여 추가로 필터링한다. 그 후에, 모든 그들 기준을 따르는 판독물을 이용가능한 판독물로 정의한다.

모든 이용가능한 판독물을 miRBase 데이터베이스로부터 추출된 프레-마이크로RNA에 정렬시킨다. 1개 초과의 전구체에 완벽하게 일치되는 서열 태그를 그들 간에 동일하게 분포시킨다. Drosha 및 Dicer 불완전 절단을 설명하기 위하여, 참조 성숙 마이크로RNA 위치에 비하여 최대 4개 뉴클레오티드 이동을 가능하게 하여, 성숙 마이크로RNA 영역에서 프레-마이크로RNA와 완벽히 일치되는 임의의 서열 태그를 성숙 마이크로RNA로 고려한다. 마이크로RNA 발현 수준을 작은 RNA의 전체 수가 변치 않음을 고려하여, 이용가능한 총 판독물의 수에 대해 정규화된 각 성숙 마이크로RNA를 맵핑하는 판독물의 수로 정의한다. 각 마이크로RNA의 상대적 존재비는 성숙 마이크로RNA를 맵핑하는 총 판독물의 수에 비하여 각 마이크로RNA를 맵핑하는 판독물의 수로 정의된다.

실시예 46: 원심분리에 의한 정제

배양된 세포 분획을 정제하고, 원심분리를 통해 핵 및 오염성 교체-밀도 세포 유형으로부터 분리할 수 있다. 세포를 200 g에서 15분 동안 원심분리시켜, 적혈구 및 망상적혈구 풍부 분획을 단리한다. 상층액을 피펫팅시킨 다음, 바람직한 세포 분획을 1 μM 프로스타글란딘 I2의 존재하에 변형된 티로드 완충제(138 mM NaCl, 5.5 mM 덱스트로스, 12 mM NaHCO3, 0.8 mM CaCl2, 0.4 mM MgCl2, 2.9 mM KCl2, 0.36 mM Na2HPO4 및 20 mM Hepes, pH 7.4 함유)에서 세척하고, 동일한 완충제에 재현탁화시킨다.

실시예 47: 화학적 제핵에 의한 정제

배양된 세포의 제핵을 배양물에 대한 화학적 첨가제에 의해 자극할 수 있으며, 당해 화학적 첨가제는 정제 이전에 세포의 제핵 분율의 증가를 도울 수 있다. 적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양한다. 수집 48시간 전에, 세포를 210 mM Me2SO와 인큐베이션시킨다. 그 다음, 세포를 실온에서 350 xg에서 5분 동안의 원심분리에 의해 수집하고, 210 mM Me2SO 및 5 ㎍/㎖의 사이토칼라신 B(또는 기타 액틴 또는 핵 조작 분자, 즉, p38 MAPK, 소랄렌)를 함유하는 신선한 배지에서 ㎖당 3 X 105개 세포의 수준으로 재현탁화시키고, 37C에서 인큐베이션시킨다. 핵이 없는 세포의 비율을 핵산 착색제로서 DRAQ5 및 적혈구계 분화 표면 마커로서 글리코포린 A에 대한 항체를 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해 평가한다.

실시예 48: 음파영동(Acoustophoresis)에 의한 정제

몇몇의 기계적 분리 시스템을 사용하여 균일한 세포 모집단을 수득할 수 있다. 자유 유동 음파영동은 하나의 기계적 분리 방법을 나타낸다(문헌[Petersson 2007, American Chemical Society]). CsCl(0.22 g/㎖)을 포함하는 영양소 첨가제와 함께 염수 용액(0.9 ㎎/㎖) 중 현탁화되는 동안, 염수 용액에 첨가된다. 배양된 적혈구계 세포를 함유하는 시료 현탁액을 2개의 활성 유출구(유출구마다 유량 0.10 ㎖/분)가 있는 음파영동 칩(Cell-Care)을 사용하여 처리한다.

주사기 펌프(WPI SP260P, World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL)를 사용하여 칩에서 유량을 제어한다. 모든 유출구를 테플론 튜빙을 사용하여 인젝터를 통해 고정밀 유리 주사기(1005 TLL 및 1010 TLL, Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Switzerland)에 개별적으로 연결하여, 유출구 유량의 독립적인 제어를 가능하게 한다. 깨끗한 유체 유입구를 주사기 펌프에 연결하고, 세포 현탁액 유입구를 50-mm-길이 테플론 튜빙 피스(0.3-mm 내경)에 연결하는데, 그의 타단은 비커에 침지되어 있고, 이로부터 순 유출 유동과 깨끗한 유체 유입 유동 간의 차이에 의해 정의되는 속도로 시료 현탁액이 흡인된다.

분리 채널의 벽 사이에 정재파를 유도하기 위해 사용되는 초음파를 칩의 배면에 부착된 20x20 mm 압전 세라믹(Pz26, Ferroperm Piezoceramics AS, Kvistgard, Denmark)을 사용하여 생성한다. 초음파 겔(Aquasonic Clear, Parker Laboratories Inc., Fairfield, NJ)은 둘 사이의 우수한 음향 결합을 보장한다. 압전 세라믹을 함수 발생기(HP 3325A, Hewlett-Packard Inc., Palo Alto, CA)에 연결된 파워 증폭기(모델 75A250, Amplifier Research, Souderton, PA)를 통해 작동시킨다. 음파가 배면으로부터 칩에 유입되더라도, 결정 구조의 3개의 축을 따른 기계적 진동의 결합의 결과로서 분리 채널의 측벽 사이에 정재파가 유도된다.

표준 현미경 및 전력계(43 Thruline Wattmeter, Bird Electronic Corp., Cleveland, OH)를 사용하여 분리 과정을 모니터링한다. 당해 과정은 이후에 신호 빈도, 작동 힘 및 유량의 조율에 의해 제어될 수 있다.

시료에서 세포 크기 분포를 Coulter 계수기(Multisizer 3, Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA)를 사용하여 분석한다. 각 시료를 전해질(Isoton II, Beckman Coulter Inc.)과 혼합하고, 100-㎛ 개구를 사용하여 분석한다. 용혈 수준, 즉, 손상된 적혈구로부터의 유리 헤모글로빈의 농도를 광도계(Plasma/low HB Photometer, HemoCue AB, Angelholm, Sweden)를 사용하여 측정한다.

실시예 49: 생체외 성숙에 의한 정제

완전히 성숙하지 않은 적혈구계 세포는 천연 생체내 성숙 촉발을 모방하는 시스템에서의 생체외 인큐베이션에 의해 성숙되게 추진될 수 있다.

1. 기질 세포와의 동시-배양

최종 배양 단계에서, 적혈구계 세포를 사이토카인이 없는 신선한 배지에서 부착성 기질 층 상에서 배양한다. 배양물을 37C에서 5% CO2에서 공기 중에 유지시킨다. 부착 세포층은 10% 우태아혈청이 보충된 RPMI(Invitrogen) 중 전체 정상 성인 골수(문헌[Prockop, DJ (1997) Science 276:71] 참조)로부터 확립된 중간엽 기질 세포(MSC) 또는 MS-5 간질 세포주로 이루어져 있다. 부착 MSC를 증량시키고, 동시-배양에서의 사용 전에 적어도 2회의 연속 통과를 통해 정제한다.

2. 피브로넥틴-코팅 플레이트에서의 배양

최종 배양 단계에서, 적혈구계 세포를 인간 피브로넥틴이 흡수된 플레이트에서 배양한다. 이들 플레이트를 생성하기 위하여, 피브로넥틴(Sigma Aldrich)을 1 ㎖ 멸균 H2O/㎎(단백질)을 사용하여 재구성하고, 37℃에서 적어도 30분 동안 용해되게 한다. 소량의 미용해 물질이 남아 있을 수 있다. 이것은 생성물 성능에 영향을 미치지 않을 것이다. 피브로넥틴 용액을 멸균 평형 염 용액에 100배 희석하고, 최소 부피로 배양 표면에 첨가한다. 배양 표면을 실온에서 적어도 45분 동안 공기 건조되게 한다. 과잉의 피브로넥틴을 흡인에 의해 제거한다.

실시예 50: 자기영동(Magnetophoresis)에 의한 정제

자기영동에 의해 적혈구계 세포를 분리, 농축 및/또는 정제하기 위한 전략은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Zborowski et al., 2003, Biophys J 84(4) 2638] 및 문헌[Jin & Chalmers 2012, PLOS One 2012 7(8):e39491]을 참조한다. 상용의 자기 분리 시스템(4개의 MidiMACS™ 분리 유닛 및 LD 컬럼을 조합한 QuadroMACS™ 분리기, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)을 HSC-유래 적혈구 배양물로부터의 적혈구 자기 농축을 위해 사용한다. 세포를 질소(Medipure™ 질소, 농도 >99%, Praxair, Inc., Danbury, CT)가 채워진 Glove-Bag™ 팽창식 글러브 챔버(Cole Parmer, Vernon Hills, IL)에서 산소 제거한다. 탈산소화 이전에, 분리 시스템을 포함한 모든 물질 및 장비, 가스제거된 멸균 완충제(PBS +2 mM EDTA +0.5% BSA) 및 멸균 수집 튜브를 글러브 백에 둔 다음, 이를 기밀 밀봉한다. 산소 제거된 배양물을 MACS® LD 컬럼 내로 직접 로딩하고, 이를 N2 기체로 채워진 팽창식 글러브 챔버의 내측에서 무산소 조건하에 유지시킨 QuadroMACS™ 분리기에 배치하였다. 자석 내에 포함된 컬럼을 통과하는 세포를 음성 분획으로 표지하며, 이들은 최종 성숙 이전의 HSC 및 적혈구계 세포를 포함하여, "비-자성"인 것으로 예상된다. 분리 컬럼 내에 보유된 세포를 양성 분획으로 표지하며, 이들은 "자성"이고, 거의 기능성 헤모글로빈으로 가득 찬 성숙하는 RBC-유사 세포로 이루어진다. 그들을 자석으로부터의 그의 제거 후에 LD 컬럼으로부터 용리시킨다. 일단 분리가 완료되면, 수집된 세포를 공기에 노출시킴으로써 산소화된 세포를 가역적으로 회수한다.

실시예 51: FACS에 의한 정제

배양된 적혈구계 세포의 모집단을 Becton-Dickinson Aria IIu 세포 분리기를 사용하여 분리시킨다. 분리 이전에, 세포를 수집하고, PBS로 세척하고, 제조처-권고 희석률로 글리코포린 A에 대한 형광 항체(Life Technologies) 및 핵산 착색제 DRAQ5(Pierce)로 염색한다. 28,000개 점적/초의 점적 추진 빈도와 함께 100 ㎛ 노즐을 사용한다. 시료 역치 속도는 대략 4000개 사건/초이다. 온도 제어 옵션을 사용하여 전체 분리 기간 동안 시료 및 수집 튜브를 4℃로 유지한다. 또한, 시료 진탕 특성을 200 rpm에서 사용하여, 분리 내내 시료가 침강되지 않게 한다. 시료를 주사기로부터 분배된 대략 750 ㎕의 분취액에 분리한다. 한편, 이들 휴지 동안, 수집 튜브를 4℃로 유지하고, 광으로부터 보호하며, 분리를 재개하기 전에 온건하게 혼합한다. 분리된 시료를 10% FCS가 보충된 250 ㎕ DMEM을 함유하는 12x75mm 붕규산 유리 수집 튜브 내로 수집한다.

실시예 51: 세포의 효소적 처리에 의한 정제

동종이계 적혈구 공급은 A 및 B형 항원 제거로부터 이익을 얻어, 보편적 상용성 제품을 생성할 수 있다. 이것은 갈락토스 기를 선택적으로 절단할 수 있는 일련의 효소에 의해 용이하게 되어, 적혈구계 세포가 면역원성적으로 더욱 바람직하게 할 수 있다.

원래 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)로부터 확인된 엔도-β-갈락토시다제의 2가지 유형의 재조합 단백질을 표준 클로닝 방법을 사용하여 이. 콜라이 BL-21에서 생성한다. ABase를 A/B Ag를 방출시키기 위해 제조하고, 엔도-β-갈락토시다제 C(EndoGalC)를 Galα1-3Galβ1-4GlcNAc(Gal Ag)를 방출시키기 위해 제조하며, Galα1-3Galβ1-4GlcNAc(Gal Ag)는 이종이식에서 고도로 면역원성인 것으로 알려져 있고, A/B Ag와 유사한 탄수화물 구조를 갖는다. ABase는 A형 혈액형[GalNAcα1-3(Fucα1-2) Galβ1-4GlcNAc] 및 B형 혈액형[Galα1-3(Fucα1-2) Galβ1-4GlcNAc]에서 Galβ1-4GlcNAc 결합을 절단시킨다.

약술하면, ABase의 클로닝 후에, C-말단 His 태그가 있는 발현 플라스미드를 신호 펩티드 없이 pET-15b 벡터 eabC에서 작제한다. 이러한 외인성 유전자를 이. 콜라이 BL-21 세포 내로 형질전환시킨다. 가용성 단백질 분획으로서 세포 내에서 생성된 효소를 니켈-니트릴로트리아세트산 컬럼(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)에서 정제한다. 마지막으로, 5 ㎖의 정제된 재조합 ABase를 1500 U/㎎의 비활성과 함께 3.6 ㎎/㎖의 농도로 수득한다. 1 유닛의 효소 활성은 분당 1 μmol의 기질을 가수분해시키는데 필요한 효소의 양으로 정의된다.

Ag 존재, Ab 결합 및 보체 활성화에 대한 ABase 처리의 효과를 시험한다. 인간 A/B RBC를 ABase로 분해하고, 교차-반응성(항-A 또는 항-B 또는 항-A 및 B 함유; 각각 B형, A형 또는 O형) 인간 혈청과의 인큐베이션 후에 유세포계수 분석으로 처리한다. 평균 형광 세기(MFI)를 사용하여 혈액형 A형, B형 및 Gal Ag의 발현 수준을 정량화한다. 분해 수준은 ABase의 부재하의 인큐베이션 후에, RBC상에 발현되는 혈액형 A 또는 B Ag의 백분율로서 표현된다.

신선한 혈액형 O형 혈청을 3명의 건강한 인간 지원자로부터 풀링하고, -80℃에서 동결시켜, 사용될 때까지 내인성 보체 활성을 보존시킨다. 열-불활성화(56℃에서 30분 동안) 혈청을 Ab 결합의 분석을 위해 사용한다. 효소(ABase) 분해가 있는, 그리고 이것이 없는 RBC를 37℃에서 30분 동안 0.2% 소 혈청 알부민을 함유하는 인산염-완충 염수(PBS/BSA)로 희석된 50% 혈액형 O형 혈청(100 ㎕)과 인큐베이션시킨다. 세척 후에, RBC를 4℃에서 30분 동안 FITC-표지된 항-인간 IgG/IgM(DAKO, Glostrup, Denmark)(× 30, 100 ㎕)과 반응시킨 다음, 유세포계수 분석으로 처리한다.

또한, 보체 활성화에 대한 효소 처리의 억제 효과를 C3d의 침적의 변화에 의해 평가한다. RBC를 37℃에서 15분 동안 보체 활성의 존재하에 50% 인간 혈청과 인큐베이션시킨 후에, RBC를 4℃에서 30분 동안 FITC-표지된 토끼 항-인간 C3d Ab(DAKO, Glostrup, Denmark)(× 100, 100 ㎕)와 반응시킨 다음, 유세포계수 분석에 적용한다. 대조군 수준(효소의 부재)의 백분율을 MFI에 기초하여 계산하여, Ab 결합 및 C3d 침적에 대한 효소 처리의 억제 효과를 평가한다.

실시예 52: 원심분리에 의한 혈소판의 정제

혈소판은 원심분리에 의해 혼합된 세포 현탁액으로부터 정제될 수 있다. 일부 40 ㎖의 전혈을 항응고제로서 사용되는 3.2%의 시트르산나트륨이 있는 혈액 수집 튜브에 분배한다. 튜브를 400×g에서 10분 동안 원심분리한다. 이러한 단계 후에, 3층이 명백하게 구별된다: 혈장, 적혈구 및 중간 구역. 혈장은 혈소판과 함께 상측에 존재하고, 적혈구는 그들의 더 무거운 밀도 때문에 하측에 존재하고; 미세한 희끄무레한 중간 구역은 더 큰 혈소판 및 백혈구로 이루어져 있으며, 버피 코트로 지칭된다. Jelco 18G 주사바늘을 사용하여, 혈소판이 있는 혈장의 상측 부분을 빼내고, 버피 코트를 첨가제가 없는 2개의 다른 튜브에 두고: 하나의 튜브는 혈장을 생성하기 위한 것이고(P 튜브), 다른 튜브는 트롬빈을 생성하기 위한 것이다(T 튜브). 오직 1.5 ㎖의 혈장을 사용하여 트롬빈을 생성하고, 이에, 10%의 글루콘산칼슘 0.5 ㎖을 첨가하고, 37℃에서 더블 보일러(double boiler)에 15분 둔다. 그 다음, 2개의 튜브를 다시 원심분리하는데, 이때는 800×g에서 동일한 기간(T=10분) 동안 원심분리한다. 이러한 최종 원심분리 후에, T 튜브는 트롬빈-풍부 액체를 함유하는 한편, P 튜브는 혈소판 침강 및 일부 적혈구(적혈구-혈소판 클럼프)를 함유한다. 총 혈장 부피의 2/3를 제거함으로써 이 단계에서 부피를 감소시킨다. 제거되는 부분은 혈소판이 빈약한 한편, 침강된 혈소판(교반에 의해 용이하게 분산가능)이 있는 나머지 부분은 혈소판이 풍부하다.

실시예 53: 티미딘 혼입

세포 모집단의 자가-복제능은 해당 분야에 알려져 있는 티미딘 혼입 검정을 사용하여 평가될 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Harkonen et al. 1991 Exp Cell Res 186L288] 및 문헌[Tanaka et al. 1992 PNAS 89:8928]을 참조한다.

약술하면, 균일하게 13C- 및 15N-풍부한 티미딘[U-13C, 15N-TdR]을 Martek Biosciences(Columbia, MD)로부터 수득하고, 3 H-TdR(80 Ci/mmol)을 ICN Radiochemicals(Irvine, CA)로부터 구입한다. 배지 및 완충제를 Fisher Scientific(Pittsburgh, PA)으로부터 수득한다. 포스포디에스테라제를 제외한 모든 효소는 Boehinger Mannheim(Indianapolis, IN)사 제품이다. 포스포디에스테라제 II를 Worthington Biochemical Corporation(Lakewood, NJ)로부터 수득한다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 용매는 EM Science(Gibbstown, NJ)사 제품이며, 0.1 ppm 미만의 증발 잔류물을 함유하였다.

적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양한다. 배양 후에, 세포를 티미딘 혼입 검정에서의 사용을 위해 수집한다.

세포를 비농축 티미딘의 첨가와 함께 1.6 ㎍/㎖의 [U-13C, 15N]-TdR로 18시간 동안 표지하여, 1 μM의 최종 티미딘 농도를 달성한다. 그들을 인산염-완충 염수로 세척한 후에, 3 H-TdR을 다른 18시간 인큐베이션 동안 표기된 농도(0.1 내지 10 μCi/㎖)로 첨가하기 전에 세포를 6시간 이상 동안 보충된 DMEM에서 배양한다. 비표지된 티미딘을 시료에 첨가하여, 최종 티미딘 농도가 0.13 μM이 되게 하고, 이는 10 μCi 방사성표지/㎖을 제공받는 시료에서의 3 H-TdR의 농도와 동등하다. 3 H-TdR의 제거 후에, 세포를 DNA의 단리 전 추가 6 내지 54시간 동안 보충된 DMEM에서 인큐베이션시킨다.

DNA를 변형된 Puregene DNA 단리 키트(Gentra Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 추출한다. 시료 중 세포의 개수에 기초하여, 규모 확대/규모 축소 절차를 사용하여, 첨가되는 시약 부피를 결정한다. 예를 들어, 1 × 10^7개 세포가 사용되는 경우, 328 ㎍의 프로테이나제 K를 함유하는 21 ㎕를 3 ㎖의 세포 용해 용액에 첨가한다. 혼합 후에, 시료를 하룻밤 실온에 둔다. 다음 날, 10 ㎍의 RNase를 첨가하고, 시료를 혼합하고, 37C에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다. 단백질 침전 용액(1 ㎖)을 첨가하고, 시료를 얼음에서 5분 동안 인큐베이션시킨다. 2000 g에서 10분 동안의 원심분리 후에, DNA를 함유하는 상층액을 3 ㎖의 100% 2-프로판올과 혼합하고, 온건하게 50회 또는 백색 DNA 가닥이 눈에 보일 때까지 역위시킨다. 그 다음, 시료를 2000 g에서 5분 동안 원심분리한다. 생성된 DNA 펠렛을 5분 동안 건조시킨 후에, 70% 에탄올 3 ㎖로 세척하고, 2000 g에서 5분 동안 다시 원심분리한다. 최종 펠렛을 공기 건조시킨 다음, 탈이온 H2O에서 재수화시키고, 260 nm에서의 흡광도에 의해 정량화시킨다. 동일한 절차를 복제 능력에 대한 대조군으로서 CD34+ 줄기 세포에 적용한다.

임의의 DNA를 3분 동안의 비등에 의해 변성시킨 다음, 얼음 위에서 신속하게 냉각시킨다. 효소 가수분해 절차를 0.5 ㎎/㎖의 DNA 농도로 수행한다. 하기의 프로토콜에는 DNA 용액 밀리리터당 첨가되는 시약의 부피가 기재되어 있다. DNA를 45℃에서 2시간 동안 200 mM MgCl2, 100 mM ZnCl2 및 1 M Tris, pH 7.2를 함유하는 10 ㎕의 완충제에서 10 ㎕의 뉴클레아제 P1(0.5 U/㎕) 및 5 ㎕의 DNase I(4 U/㎕)을 사용하여 가수분해시킨 다음, 20 ㎕ 포스포디에스테라제(4 mU/㎕)를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 추가 인큐베이션시킨다. 최종적으로, 5 ㎕의 10 M 아세트산암모늄(pH 9.0) 및 10 ㎕의 알칼리성 포스파타제(1 U/㎕)를 첨가하고, 시료를 37℃에서 다시 2시간 동안 인큐베이션시킨다.

분해된 DNA 시료를 0.22-㎛ 나일론 필터로 여과한다. 이러한 시료를 4.6 × 250 mm Supelcosil LC-18-S HPLC 컬럼(Supelco, Bellefonte, PA)을 사용하여 HPLC/CRI/IRMS 시스템으로 분석한다. 동일한 용매계를 1 ㎖/분 및 15분 내에 5%에서 25% B의 선형 구배로 사용한다.

HPLC에 의한 분리 후에, 데옥시뉴클레오시드를 화학 반응 인터페이스 질량분광법(CRIMS)을 사용하여 분석한다. 이러한 과정에서, 데옥시뉴클레오시드는 헬륨의 스트림에 의해 추진되는 분무 및 용매제거(desolvation) 시스템으로 유동되고, 여기서, 그들은 건식 입자빔으로 나타난다. 이러한 인-라인 생성된 CO2로부터의 13CO2/12CO2 존재비를 Finnigan/MAT Delta S 동위원소비 질량분광법(ThermoFinnigan, San Jose, CA) 및 그의 수반하는 Isodat 데이터 시스템으로 결정한다. 5-플루오로데옥시우리딘(Sigma)을 내부 동위원소비 표준으로 사용한다.

3개의 뉴클레오시드에 대한 동위원소 비(하기의 식에서 IR)를 각 시료로부터 수득한다: T, dA 및 dG. 각 DNA-유래 데옥시뉴클레오시드로부터 발생된 CO2의 농축을 식 (13)CO2(mil 당) = 1000 × (실험적 IR - 표준 IR)/IRstd에 의해 계산한다. 가장 높은 수준의 내부 일관성을 유지하고, 임의의 실험간 편차를 피하기 위하여, dG에 대한 동위원소 비를 모든 실험에 걸쳐 T에 대한 동위원소 비로부터 제한다. 안정적인-동위원소 표지 기간의 마지막(제0일)으로부터 세척의 마지막(제3일)까지의 데이터를 평가한다.

실시예 54: 핵 물질의 정량화

DNA를 함유하는 혼합된 모집단 내의 세포의 개수를 DNA 착색제 DRAQ5(Pierce)를 사용하여 유세포계수법에 의해 평가한다. 세포를 제조처의 지침에 따라 착색제와 인큐베이션시키고, 유세포계수기, 예를 들어, Attune 세포계수기(Life Technologies)에서 분석한다. 핵 물질 함량의 소정의 역치를 초과하는 세포의 백분율을 정량화한다.

실시예 55: 시험관내에서의 종양형성능(tumorigenicity) 검정

세포의 복제능을 평가하기 위하여, 연한천 콜로니 형성 검정을 수행할 수 있다. 약술하면, 모든 성분이 40C로 가온된 0.5% 한천 + 1x RPMI + 10% FCS 용액을 제조하고, 35 ㎜ 페트리 접시에 1.5 ㎖의 용액을 첨가함으로써 베이스 한천 층을 만든다. 사용 전에 실온에서 30분 동안 한천이 고형화되게 한다.

0.7% 아가로스를 마이크로파에서 용융시키고, 40C로 냉각시킴으로써 상측 아가로스 층을 제조한다. 2x RPMI + 20% FCS 용액을 40C로 가열한다. 세포를 계수하고, ㎖당 200,000개 세포의 밀도로, 플레이트당 5000개 세포로 플레이팅시키기 위하여 제조한다. 0.1 ㎖의 세포 현탁액을 10 ㎖ 튜브에 첨가한 다음, 3 ㎖의 가온된 0.7% 아가로스 및 3 ㎖의 가온된 RPMI/FCS 용액을 첨가한다. 용액을 와류에 의해 온건하게 혼합하고, 3 또는 4개의 반복검증 베이스 한천 플레이트의 각각에 첨가한다(1.5 ㎖).

플레이트를 37C에서 10 내지 30일 동안 가습 인큐베이터에서 인큐베이션시킨다. 세포에 세포 배양 배지, 0.75 ㎖/플레이트를 주 1 내지 2회 공급한다.

콜로니 형성을 평가하기 위하여, 플레이트를 1시간 초과 동안 0.5 ㎖의 0.005% 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet)으로 염색한다. 해부 현미경을 사용하여 콜로니를 계수한다.

실시예 56: 생체내에서의 종양형성능 검정

최종 분화된 배양된 적혈구계 세포를 다양한 동물 모델에 이식하여, 종양형성능을 평가한다. 몇몇의 조직을 다양한 모델로부터 수집하고, 조직학적, 면역화학적 및 형광 검정으로 분석하여, 종양형성능을 정량화한다.

동물에 이식 전 2일에 시작하여 CsA(10 ㎎/㎏, Sandimmune, Novatis Pharma, Nurnberg)의 매일의 복강내 주사를 제공한다. NK 세포의 고갈을 위하여, 몇몇 랫트에게 모노클로널 항체(mAb)의 CsA 복강내 주사에 더하여, 항-NKR-P1A(클론 10/78, 마우스 IgG1, BD Biosciences, Heidelberg, Germany) 또는 각각의 아이소형 대조군(클론 PPV-06, 마우스 IgG₁, Exbio, Prague, Czech Republic)을 제공한다. mAb(클론 3.2.3)와 동일한 에피토프에 대한 항-NKR-P1A mAb(클론 10/78)가 유도된다. 1 ㎎의 각각의 항체를 적혈구계 세포의 주사 전 1일에 제공한 후, 세포 이식 후 제4일에 0.5 mg을 제공한다.

이들 실험을 시작하기 전에, 적혈구계 세포 이식 후 0일 및 4일 및 부검(제92일) 시에 혈액 시료를 취하여, 유세포계수법에 의해 혈중 NK 세포의 비율을 결정한다. 피하 종양 성장의 분석을 위하여, 적혈구계 세포를 동물의 옆구리 내로 100 ㎕의 인산염-완충 염수(PBS)에서 주사한다. 종양 성장을 촉진에 의해 격일로 모니터링하고, 크기를 선형 캘리퍼(linear caliper)를 사용하여 기록한다. 마우스에서 1 ㎤ 및 랫트에서 5 ㎤의 종양 부피에 도달하는 경우, 10% 초과의 체중 소실이 발생하는 경우, 또는 통증 또는 고통의 임의의 거동 징후가 관찰가능한 경우, 동물을 제100일 이전에 희생시킨다. 모든 동물의 부검을 수행한다.

주사 부위 근처의 쥣과 조직을 액체 질소에서 즉시 동결시키거나, 인산염-완충 4% 포르말린에 16시간 동안 둔 다음, 파라핀에 포매시킨다. 비장 및 림프절을 이후의 면역학적 분석을 위해 제거한다. 단독 6-OHDA-병변 랫트의 선조체 내로의 적혈구계 세포의 이식을 수행한다. 이들 동물을 이식 후 6주에 희생시킨다.

동물 조직을 유세포계수법에 의해 분석한다. CD133, CD3, CD, CD16, CD19, CD20, CD56, CD44, CD24 및 CD133의 확립된 암 세포 바이오마커에 대한 적절한 형광 및 PE-컨쥬게이트된 항체를 절제된 조직 시료에 첨가하고, 이를 분석하여, 종양형성능을 정량화한다.

실시예 57: EKTA에 의한 변형성

본원에 기재된 바와 같이 배양된 적혈구계 세포를 엑타사이토메트리를 통해 천연 적혈구 시료에 비한 변형성 특징에 대하여 평가한다.

엑타사이토미터는 2개의 실린더 사이에 점성 유체 중에 현탁화된 적혈구의 회절상을 생성하기 위해 사용되는 헬륨-네온 레이저와 조합된 쿠에트(Couette)-형 점도계로 이루어진다. 점도계가 회전하는 경우, 정상의 적혈구는 전단 필드에서 신장되어, 회절상이 타원형이 되게 한다. 회절 패턴의 장축(A) 및 단축(B)을 따라 광 세기를 정량화하고, 이를 비 (A - B)/(A + B), 변형성 지수(DI) 또는 신장 지수(EI)로 표현함으로써 상의 타원율을 측정한다. 가장 밀집한 적혈구계 세포의 내부 점도보다 더 크도록 배지의 점도를 선택한다. 증류수 중 K2HP04 및 KH2P04로 이루어진 0.04 M의 인산염 완충제 중 폴리비닐피롤리돈(PVP), mw = 360,000의 31 g/ℓ 용액은 25℃에서 0.20 푸아즈 및 37C에서 12 푸아즈의 점도를 제공한다.

오스몰농도를 NaCl을 사용하여 요망되는 수준으로 조정하고, Roebling 빙점 삼투압계에서 측정한다. 최종 pH는 NaOH 및 HCI의 1-M 용액의 적은 첨가를 사용함으로써 달라지며, 이를 Technicon BG I1 혈액 기체 분석기에서 측정한다. 아지드화나트륨을 보존제로서 스톡 용액에 첨가하여, 0.4 g/ℓ를 수득한다.

엑타사이토미터는 적혈구계 세포 시료로부터 3가지 주요 측정 기준을 수집하고, 그들을 고유 적혈구와 비교한다; 최소 오스몰농도(O_min), 변형성 지수(Di_max) 및 DI가 그의 최대 값의 절반에 도달하는 오스몰농도(O_hyp).

O_min은 세포의 표면적 대 부피비와 관련이 있으며, 통상의 삼투 취약성 시험에서 50% 용혈점과 동일한 것으로 관찰되었다.

Di_max는 정상적으로 290 mosmol(생리학적 오스몰농도 값)에 도달되는 변형성 지수의 최대값이다. 이는 전단 응력 하의 세포의 최대 변형성을 나타내며, 다수의 인자, 예를 들어, 표면적, 부피, 내부 점도 및 세포막의 기계적 특성과 관련이 있다.

O_hyp는 DI가 그의 최대 값의 절반에 도달하는 오스몰농도이다. 이것은 세포의 내부 점도, 및 막의 기계적 특성, 예를 들어, 그것이 강제로 어떻게 구부러지는 지(강성)와 관련이 있는 곡선의 고장성 부분의 위치의 표시를 제공한다.

배양된 적혈구계 세포에 대하여 수득되는 파라미터를 일차 적혈구계 세포에 대한 동일한 값과 비교한다.

실시예 58: LORCA에 의한 변형성

정제된 cRBC 모집단의 변형성을 레이저 회절 기술(LORCA, 레이저-보조 광학 회전 세포 분석기, R&R Mechanotrics)에 의해 측정한다. 약술하면, 세포의 고도로 희석된 현탁액을 2개의 실린더 사이에 0.3 ㎜ 갭이 있는 쿠에트 시스템에서 전단시키며, 2개의 실린더 중 하나를 회전시켜, 전단 응력을 유도할 수 있다. 레이저 빔을 현탁액을 통과시키고, 회절 패턴을 37℃에서 측정한다. 낮은 전단 응력에서, 세포는 원반인 한편, 높은 전단 응력에서, 세포는 타원형이 된다. 세포 변형성을 신장 지수(EI)에 관하여 표현하는데, 신장 지수는 변형 세포의 타원율에 좌우된다. 12.5 ㎕의 펠렛화된 RBC 펠렛을 함유하는 분취액을 5 ㎖의 폴리비닐피롤리돈 용액(분자량 360 000)에 희석시킨다. 다양한 전단 응력에서의 시료 간의 용이한 비교를 위하여, 30 Pa(EImax로 지칭) 및 3 Pa에서의 EI 값을 대표적인 변형성의 값으로 선택한다.

실시예 59: 혈관 폐색의 평가 - 생체외 랫트 혈관구조

적혈구계 세포의 혈관 폐색 가능성은 당업계에 알려져 있는 방법을 사용하여 단리된 인공 관류 랫트 혈관구조로 평가될 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Kaul et al. 1983, J Clin Invest 72:22]을 참조한다. 약술하면, 마취된(나트륨 펜타바르비톨 30 ㎎/㎏) Wistar 계통 랫트, 120 내지 150 g에서, 우측 회결장동맥 및 정맥을 회결장 연결부로부터 3 ㎝ 이격된 부위에 헤파린처리된(100 ㎕/㎖) 실라스틱(silastic) 튜빙의 캐뉼라 삽입을 행한다. 1% 소 혈청 알부민을 함유하는 링거액을 사용한 항정-상태 관류 하에, 상행 결장 및 돌창자 말단(각각 3 ㎝)을 타이(tie) 사이에서 섹션화시킨다. 모든 혈관 연결의 지혈 타이를 달성한 후에, 조직을 단리한다. 단리된 충수간막을 현미경 스테이지에서 광학적으로 투명한 루사이트(Lucite) 블록(block)에 온건하게 스프레딩시킨다. 캐뉼라의 유출구 및 현미경 대물렌즈를 제외하고, 전체 제제를 플라스틱 사란 랩(saran wrap)으로 덮는다.

대조군 동맥 관류압(Ppa) 및 정맥류압(Pv)을 각각 80 및 3.8 mmHg로 일정하게 유지하고, Statham-Gould P-50 압력 변환기(Stathan Instruments Inc, Oxnard CA)를 통해 모니터링한다. 정맥류(Fv) 속도를 광전 드롭카운터(dropcounter)를 사용하여 모니터링하고, ㎖/분으로 표현한다. 조직 평형화 및 Fv의 안정화를 위하여 10 내지 12분의 경과를 허용한다. 숙주 혈구가 없고, 4.6 +/- 0.5(평균 +/- SD)의 항정 Fv가 있는 충수간막 미소혈관계를 나타내는 제제만을 사용한다. 실험을 37C에서 행한다.

적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 단리한다. Ppa 및 Fv의 대조군 측정 후에, 적혈구계 세포(0.2 ㎖, Hct 30%)를 동맥관삽입 부위에 15 ㎝ 이격된 주사 포트를 통하여 온건하게 전달하고, Ppa 및 Fv의 변화를 그래스 다원기록법(Grass polygraph)(Grass Instrument Co, Quincy MA)의 스트립 차트(strip chart)에 기록한다. 조직 제제를 링거 용액을 사용한 시료의 주입 이전 10 내지 15분 동안 관류시켜, 조직의 안정화를 가능하게 하고, 숙주 동물의 나머지 혈액 세포의 혈관구조를 깨끗하게 한다. 세포의 주입 후에 생성된 폐색은 깨끗하게 될 수 있으며, 혈관구조를 고압에서(100 mmHg) 완전-산소화 링거 용액으로 간단히(2 내지 3분) 관류시킴으로써 유동을 복구시킨다.

각 실험의 마지막에, 전체 조직 제제(캐뉼라 및 관강내 내용물 부재)를 칭량한다. 말초 저항 단위(PRU)를 계산하고, PRU = ΔP/Q = mmHg/㎖/(분-g)로 표현하며, 여기서, ΔP(mmHg)는 동정맥압 차이이고, Q(㎖/분-g)는 조직 그램당 정맥류의 속도이다.

각 실험에서, 압력-유동 회복 시간(Tpf)을 시료의 볼루스 주입 이후 결정한다. Tpf는 주어진 시료의 전달 후 Ppa 및 Fv가 그들의 기준선 수준으로 복귀하는데 필요한 시간(초)으로 정의되며, 그것은 충수간막 혈관구조를 통한 총 체류 시간을 나타낸다. 배양된 적혈구계 세포에 대하여 수득되는 파라미터 값을 일차 적혈구계 세포에 대하여 수득된 값과 비교한다.

실시예 60: 혈관 폐색의 평가 - 시험관내 유동 챔버

시험관내 눈금 높이 유동 챔버를 사용한 적혈구계 세포의 혈관 폐색의 평가 방법은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Zennadi et al 2004, Blood 104(12):3774]을 참조한다.

약술하면, 눈금 높이 유동 챔버를 사용하여, 내피 세포(EC)로의 적혈구계 세포의 부착을 정량화한다. EC로 코팅된 슬라이드를 이전에 37℃로 가온된 1.26 mM Ca2+, 0.9 mM Mg2+(Gibco, Grand Island, NY)가 있는 행크스(Hanks) 평형 염수 용액(HBSS)으로 세척한 다음, 가변 높이 유동 챔버에 핏팅시킨다. 유동 챔버를 37℃로 설정된 써모플레이트(thermoplate)(Tokai Hit, Fujinomiya-shi, Japan)에 연결된 도립 위상차 현미경(Diaphot; Nikon, Melville, NY)의 스테이지에 고정시킨다. 세포를 현미경에 부착되고, Macintosh G4 컴퓨터(Apple, Cupertino, CA)에 연결된 비디오 카메라(RS Photometrics, Tucson, AZ)를 사용하여 관찰한다. 적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양하고, 제조처의 지침에 따라 형광 염료 PKH 26 적색 형광 세포 링커 키트(Sigma)로 표지한다. Ca2+, Mg2+가 있는 HBSS 중에 0.2%(부피/부피)로 현탁화된 세포(3 ㎖)를 유동 챔버 내로 주입하고, 유동 없이 15분 동안 슬라이드에 부착되게 한다. 유동에 노출시키기 이전에, 장래의 유동에 수직 지향된 라인을 따라 7개의 상이한 위치 각각에서 최소 3개의 필드를 총 형광 세포 개수에 대하여 시험한다. 그 다음, 눈금이 있는 주사기 펌프를 사용하여 유체 유동(Ca2+, Mg2+가 있는 HBSS)을 시작한다. 유동에 노출시킨 후에, 필드를 다시 시험하고, 부착 세포의 개수를 계수한다. 부착 세포의 분율은 하기와 같이 제시된다: 유동에 노출시킨 후 부착된 세포의 개수/유동 이전의 필드당 존재하는 세포. 벽 전단 응력은 하기와 같이 계산된다: τw = (6μQ)/(wH [x]2), 여기서, τw는 벽 전단 응력(dyne/cm2); Q는 부피 유속(cm3/s); μ는 매질 점도; w는 유동 채널의 폭; 및 H(x)는 현미경 슬라이드를 따른 위치의 함수로서 유동 챔버의 높이를 나타낸다.

실시예 61: 혈관 폐색의 평가 - 생체 현미경

생체 현미경을 사용한 적혈구계 세포의 혈관 폐색의 평가 방법은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Zennadi et al. 2007 Blood 110(7):2708]을 참조한다.

약술하면, 100 ㎎/㎏ 케타민(Abbott Laboratory, Chicago, IL) 및 10 ㎎/㎏ 자일라진(Bayer, Shawnee Mission, KS)의 복강내 주사에 의해 시험 동물의 전신 마취를 달성한다. 양면 티타늄 프레임 윈도우 챔버를 층류 후드를 사용하여 멸균 조건하에 등쪽 피부 주름(fold) 내로 외과적으로 이식한다. 외과술은 등쪽 피부 주름의 한 측의 상피 및 진피 층을 조심히 제거하고, 반대쪽 피부 주름의 횡문근에 인접한 피하 조직의 혈관을 노출시킨 다음, 스테인리스 강 스크류와 봉합을 사용하여 챔버의 2개의 측을 피부에 고정하는 것을 수반한다. 유리 윈도우를 챔버에 두어, 노출된 조직을 커버하고, 스냅 링(snap ring)으로 고정한다. 이후에, 생체내 연구를 외과술 3일 후에 수행할 때까지 동물을 32℃ 내지 34℃에서 유지한다.

윈도우 챔버가 있는 마취된 동물을 Axoplan 현미경(Carl Zeiss, Thornwood, NY)의 스테이지에 두고; 온도를 자동 온도 장치로 조절되는 가열 패드를 사용하여 37℃로 유지한다. 모든 주입은 등쪽 꼬리 정맥을 통해 이루어진다. 적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양한다. 그 다음, 세포를 제조처의 지침에 따라 Dil 또는 DiO(Molecular Probes, Eugene, OR) 염료로 표지한다. 표지된 세포(300 ㎕; Ca2+ 및 Mg2+가 있는 PBS 중 적혈구용적률[Hct] 0.50[50%])를 주입하고, RBC 부착 및 혈류 역학을 LD Achroplan 20×/0.40 Korr 및 Fluar 5×/0.25 대물렌즈를 사용하여 적어도 30분 동안 피하 혈관에서 관찰한다. 미소순환 사건 및 세포 부착을 트리니트론(Trinitron) 컬러 비디오 모니터(PVM-1353 MD; Sony, Tokyo, Japan) 및 디지털 비디오 카메라 C2400(Hamamatsu Photonics KK, Hamamatsu City, Japan)에 연결된 JVC 비디오 카세트 기록기(BR-S3784; VCR King, Durham, NC)를 사용하여 동시에 기록한다. 30개의 세정맥 분절을 각 조건 세트에 대하여 시험한다. 소동맥은 (1) 수렴 유동과 대조적인 분기 유동의 관찰; (2) 투과조명을 사용한, 세동맥 혈관 평활근의 특징인 혈관벽의 복굴절 외양; 및 (3) 만곡부(tortuosity)의 증거 없이 상대적으로 직선형의 혈관 궤도에 기초하여 세정맥과 구별된다.

적혈구 유동 및 부착의 측정을 20배 배율을 사용하여 생성된 비디오테이프를 시험함으로써 수행한다. 1분 동안 혈관벽에 부착된, 이동가능하지 않은 세포를 고려함으로써 세포 부착을 정량화한다. SS RBC에 의해 점유되는 최대 25 ㎛ 또는 25 ㎛ 초과의 직경을 갖는 혈관의 길이의 백분율을 하기와 같이 정량화한다: SS RBC에 의해 점유되는 세정맥 길이% = (부착 세포가 있는 혈관벽의 길이/분석되는 혈관 절편의 총 길이) × 100. RBC 유동의 변화를 다음과 같이 계산한다: 유동 = 직경 50 ㎛ 미만의 혈관 상에 표시된 단일의 점을 가로지르는 순환 형광 인간 RBC의 분당 개수.

실시예 62: 혈관 폐색의 평가 - 혈소판

인간 혈관 내피 세포(HUVEC)를 사용한 혈소판의 혈관 폐색의 평가 방법은 적혈구에 대한 유사한 방법으로부터 조정될 수 있다. 약술하면, 2-㎖ 부피의 0.05% 적혈구용적률 현탁액을 조직 배양 페트리 접시 상의 컨플루트 HUVEC에 첨가한다. 원뿔-및-평판 장치를 혈소판의 첨가 후 1분 내에 어셈블시키고, Nikon Diaphot-TMD 도립-위상차 현미경(Southern Micro Instruments, Atlanta, GA)에 둔다. 모터를 작동시켜, 원뿔을 돌리고, 부착을 0.1 또는 1 dyne/cm2 전단 응력에서 30분 동안 지속적으로 모니터링한다. 부착 장치상에 취입하는 에어 커튼(air curtain) 인큐베이터(Nicholson Precision Instruments, Inc., Bethesda, MD)에 의해 온도를 37℃로 일정하게 유지시킨다. 각 시점에 필드마다 20초 동안 8개의 상이한 시야에 초점을 맞춤으로써 혈소판 부착을 5분마다 가시화시키고 기록한다. 전체 실험을 CCD-72 시리즈 카메라(Dage-MTI, Inc., Michigan City, IN)를 통해 총 400배 배율하에 관찰하고, SVO 2000 비디오 카세트 녹화기(Sony Electronics, San Jose, CA)를 사용하여 비디오테이프에 기록한다. 각 실험의 마지막에 기록된 비디오 영상의 수동의 재생 동안 개별 부착 세포를 계수함으로써 부착을 오프-라인으로 정량화한다. 각 시점에 대하여 8개 필드에서의 세포 계수의 평균을 내고, 내피 제곱 밀리미터당 부착 적혈구로 정규화시킨다.

실시예 63: 공명기를 사용한 질량/부피/밀도의 평가

문헌[Bryan et al, LabChip, 2014]에 기초하여, 이중 부유 마이크로채널 공명기(SMR) 시스템을 사용하여 최종-분화 적혈구계 세포의 모집단의 질량, 부피 및 밀도를 특성화시킨다. 세포 밀도 측정의 시작 시에, 시스템을 먼저 여과된 퍼콜 매질로 씻어내고, 이를 고 밀도 유체로 제공한다. 다음으로, 시료 우회로를 희석 세포 시료로 채우고, 제1 SMR 내로의 유체 유동을 유도하도록 시료 유입구 및 유출구에서 바이얼 높이를 조정한다. 고밀도 유체 유입구에서의 압력을 사용하여 유체 2의 밀도를 설정하고, 폐기물 유출구에서의 압력은 장치에서 전반적인 유속을 제어한다. 시료 바이얼 또는 튜빙의 하측에 침강된 더 무거운 세포로 인한 크기 편향 가능성을 최소화하기 위하여, 시료 우회 채널을 씻어 냄으로써 신선한 시료를 규칙적인 간격으로 도입한다. 데이터를 LabVIEW를 통해 획득하고, MATLAB로 처리한다.

세포 농도를 쿨터 계수기를 사용하여 모니터링한다. 5 × 10^5 내지 1 × 10^6개 세포/㎖로 성장시킨 배양물에서 세포 측정을 수행한다. 제2 SMR에서의 측정을 위해 도입된 고밀도 유체를 50%(v/v) 퍼콜(Sigma), 1.38%(w/v) 분말화 L15 매질(Sigma), 0.4%(w/v) 글루코스, 100 IU 페니실린 및 100 ㎍㎖- 1 스트렙토마이신의 용액으로 제형화한다. 배지 pH를 7.2로 조정한다. 이러한 퍼콜 매질을 4℃에 보관하고, 이중 SMR에 사용하기 직전에 여과한다.

실시예 64: 아넥신 V에 의한 포스파티딜 세린 함량의 평가

적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양한다. 50 ㎕의 세포 현탁액을 5 mM CaCl₂를 함유하는 링거 용액에 세척한 다음, 광으로부터의 보호하에, 37℃에서 20분 동안 이러한 용액에서 아넥신-V-FITC(1:200 희석; ImmunoTools, Friesoythe, Germany)로 염색한다. 세포를 세척하고, 본원에 기재된 바와 같이 유세포계수법에 의해 염색하고, 아넥신-V 형광 세기를 488 nm의 여기 파장 및 530 nm의 방출 파장으로 측정한다. 상대적 포스파티딜 세린 노출을 아넥신-V 형광으로부터 평가한다.

실시예 65: 크로마토그래피에 의한 지질 함량의 평가

지질을 항산화제 BHT(Sigma Aldrich)의 존재하에 실온에서 메탄올-클로로포름 1:1을 사용한 3회의 추출에 의해 세척된 외인성 항원-발현 EHC로부터 추출한다. 풀링된 추출물을 문헌[Folch, Lees and Sloane Stanley1957, J Biol Chem 226:497]의 방법에서 0.05 M KCl로 세척한다. 약술하면, 제1 추출을 위하여, 0.05 ㎎/㎖ BHT를 함유하는 15 ㎖ 메탄올을 원심분리 튜브에서 세척된 복합체에 첨가하고, 간헐적으로 교반하여 침강되지 않게 하면서 30분 동안 놔둔다. 그 다음, 15 ㎖의 클로로포름을 첨가하고, 혼합물을 간헐적으로 교반하여 클럼프를 분해하면서 30분 동안 놔둔다. 튜브를 1500 g에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액 분획을 테플론 멈춤 꼭지가 장착된 분리 깔때기로 경사 분리한다. 추출물을 각 첨가 후에 간헐적으로 교반시키면서 오직 10분만 놔두는 것을 제외하고, 제2 및 제3 추출을 잔류물에 첨가되는 15 ㎖의 메탄올-BHT에 이어서 15 ㎖의 클로로포름을 사용하여 유사하게 수행한다. 원심분리 후에, 상층액 분획을 분리 깔때기에서 풀링한 다음, 48 ㎖의 클로로포름 및 28 ㎖의 0.05 M KCl을 첨가하고, 혼합한다. 혼합물을 상 분리를 위하여 4C에서 암 중에서 하룻밤 놔둔다. 실온으로 재가온시킨 후에, 2개의 투명한 상 중 하부의 상을 수집하고, 회전식 진공 증발기에서 40C에서 진공하에 건조될 때가지 증발시킨다. 지질을 클로로포름이 있는 10 ㎖ 부피 플라스크로 정량적으로 옮기고 -22C에 보관한다.

지질 추출물 중 유리 콜레스테롤의 농도를 하기와 같이 결정한다. 지질 추출물을 헥산-디에틸 에테르-빙초산 80 : 20 : 1에 0.5 mm 층의 실리카 겔 HR(Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, N.Y.)에서 크로마토그래피하고, 2,7-디클로로플루오레세인 용액으로 분무함으로써 TLC 플레이트를 염색하고(하기 참조), 유리 콜레스테롤 스폿을 코니컬(conical) 원심분리 튜브 내로 긁어 넣고, 2.0 ㎖로 1회, 그리고 1.0 ㎖의 클로로포름으로 3회 추출하고, 추출물을 회전식 진공 증발기에서 40℃에서 진공하에 건조될 때까지 증발시키고, 콜레스테롤을 비누화 없이 문헌[Mann 1961 Clin Chem 7:275]의 염화제2철 방법에 의해 추산한다. 디브로마이드 유도체를 통한 단리에 의해 상용의 보증된 시약 등급 물질로부터 제조되는 유리 콜레스테롤 표준물질(예를 들어, 문헌[Fieser J Amer Chem Soc 1953 75:5421] 참조)을 크로마토그래피 절차를 통해 취하고, 각 세트의 결정으로 추산한다. 유리 콜레스테롤에 대한 값을 평균이 95%인 표준물질의 회수에 대하여 각 결정에서 보정한다. TLC는 BHT를 제거하는데 필요하며, BHT는 다르게는 560 nm에서 흡광되는 갈색 생성물을 생성함으로써 염화제2철 방법을 방해한다.

BHT를 50 ㎎/100 ㎖의 농도로 첨가하여 크로마토그래피 동안 자동산화를 방지하는 클로로포름-메탄올-빙초산-물 25 : 15 : 4 : 2 중 실리카 겔 HR, 0.5 mm 두께에서 4℃에서 총 지질 추출물의 분취액의 TLC에 의해 인지질 분포를 3벌로 결정하고; TLC 플레이트를 물을 사용하여 제조한다("중성" 플레이트). 플레이트의 기원에 지질 시료를 적용하기 위한 "웨지형-팁(wedged-tip) 기술"의 사용(예를 들어, 문헌[Stahl 1965 Thin-Layer Chromatography, Academic Press Inc.] 참조)은 뛰어난 개별 인지질의 분리를 초래한다. 특히, 당해 방법은 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티딜 세린(PS), 레시틴 및 스핑고마이엘린 간의 완전한 분리를 제공하며; 별개의 스폿은 PS와 포스파티딜 이노시톨(PI)로 확인된 레시틴 사이를 이동한다. 2,7-디클로로플루오레세인(33.3 ㎎/100 ㎖의 수성 2 mM NaOH)의 용액으로 분무한 다음, 직접 Kramer-Gittleman 튜브로 긁어 넣고, 여기서, 인지질이 1.0 ㎖의 70% 과염소산으로 60분 동안 190℃에서 분해시킴으로써, 스폿이 UV 광에서 가시적이 된다. 발색 후에 실리카 겔을 3000 g에서 5분 동안의 원심분리에 의해 제거하고, 흡광도를 투명한 상층액 용액에서 결정하는 것을 제외하고, 나머지 절차를 상기 기재된 바와 같이 수행한다. 블랭크 레인의 상응하는 영역의 흡광도에 대하여 보정을 행한다.

기체-액체 크로마토그래피를 Gas-Chrom P, 100-120 메시(Applied Science Laboratories Inc.) 상의 EGSS-X(실리콘과 조합된 에틸렌 글리콜 석시네이트 폴리에스테르) 8%의 쌍을 이룬 8-ft 컬럼 및 이중 불꽃 이온화 검출기가 장착된 Barber-Colman 기기, 모델 5000을 사용하여 헥산-용해된 시료에서 수행한다. 질소 유량은 유입구에서 50 ㎖/분이다. 시료의 주입 후에, 컬럼 온도를 165OC에서 10분 동안 유지한 다음, 2 C/분으로 200℃까지 증가시킨다.

실시예 66: 막 점도의 평가

세포의 모집단의 막 점도는 형광 광탈색 검정에 의해 평가될 수 있다. 적혈구계 세포의 0.5-㎖ 시료를 수집하고, HEPES-완충 염수(132 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.0 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 20 mM HEPES, pH 7.4로 조정)에서 1회 세척한다. 그 다음, 팩킹된 세포를 145 mM NaCl - 10 mM NaHCO3, pH 9.5로 1회 세척하고, 1 ㎎/㎖ DTAF(Research Organics로부터 수득, Cleveland, Ohio)가 있는 동일한 완충제에서 재현탁화시킨다. 세포를 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 50 mM 글리신 - 95 mM NaCl - 10 mM NaHCO3, pH 9.5에서 2회 세척하여, 단백질에 공유 결합되지 않은 임의의 염료를 제거한다. 마지막으로, 세포를 2회 세척하고, 1 ㎎/㎖ 소 혈청 알부민이 있는 HEPES-완충 염수에서 -2% 적혈구용적률로 재현탁화시킨다. 동일한 처리를 대조군 고유 적혈구에 적용한다.

유동 챔버를 입사광 형광 현미경 관찰을 위해 장비된 Leitz Diavert(Rockleigh, NJ) 도립 현미경의 스테이지에 고정시킨다. 색선별 거울 및 여기/방출 필터는 450 내지 490 nm 범위의 여기 파장과 함께 플루오레세인 염료(Leitz 지정 12)와 함께 사용하기 위한 표준 조합이다. 대물렌즈는 100배 배율 및 1.25 개구수를 갖는 오일 침지형이다. 적절한 전원 공급 및 하우싱(housing)(Oriel, Stamford, CT)이 있는 100 와트 고압 수은 아크등(Osram, Munich)을 형광 여기원으로 제공한다.

컴퓨터-제어된 전자식 셔터(Vincent Associates, Rochester, NY)는 노출 기간을 제한하고, 형광 세기를 측정하기 위한 광자-계수 전자 시스템과 동기화된다. 입사광 조명기의 필드 다이어프램을 사용하여 여기를 직경 20 내지 40 ㎛의 원형 영역에 제한한다. 규칙적인 간격으로, 컴퓨터로부터의 출력 펄스는 전형적인 20 ms의 기간 동안 셔터를 개방시킨다. 짧은 형광 이미지로부터의 광을 일련의 프리즘으로 분할하여, 광의 절반이 저조도 SIT 비디오 카메라(모델 66-SIT, Dage-MTI, Michigan City, IN)로 지향되고, 절반이 주위 온도 하우싱에 둘러싸인 광전자증배관(모델 8850, RCA, Harrison, NJ)으로 지향되게 한다. 전자식 셔터가 개방되는 시간 동안, 형광 이미지를 획득하기 위하여 비디오 이미지 처리기(모델 794, Hughes Aircraft, Carlsbad, CA)를 작동시켜, 비디오 스냅샷을 제공하고, 이는 대상체가 초점에 맞춰 있고, 외래 대상이 시야에 들어가지 않게 보장하기 위하여 모니터링될 수 있다. 비디오 스크린상의 거리를 비디오 캘리퍼로 측정하고, 스테이지 마이크로미터(stage micrometer)의 비디오 이미지와의 비교에 의해 보정한다. 또한, 셔터가 개방되어 있는 시간 동안, 광전자증배기 신호를 광자-계수 기술로 처리한다. 증폭기/선별기(모델 AD6, Pacific Instruments, Concord, CA)는 주어진 세기를 초과하는 각 신호 펄스에 대한 디지털 논리 펄스를 생성하며, 그들 디지털 펄스를 100-MHz 게이트형 계수기(모델 770, EG&G Ortec, Oak Ridge, TN)에서 계수한다. 마이크로컴퓨터는 게이팅, 재설정 및 광자 계수의 기록을 제어한다.

전형적인 실험은 짧은(20 ms) 펄스의 여기광 동안 이루어지는 다수의 예비 형광 측정에 이어서, 시료 세포가 탈색되는 연장된 조명 기간(전형적으로 30초)에 이어서, 형광이 그의 회복을 완료하는 것으로 나타날 때까지 15 내지 30초마다의 다른 일련의 짧은 노출로 이루어진다.

배양된 적혈구계 세포에 대하여 수득되는 회복 시간 및 다른 파라미터 값을 일차 적혈구계 세포에 대하여 수득되는 동일한 값과 비교한다.

실시예 67: Advia 혈액 분석기를 사용한 평균적혈구용적의 평가

배양된 적혈구계 세포의 평균적혈구용적(MCV)을 Advia 120 혈액 분석기(Siemens Healthcare)에서 전기 임피던스를 사용하여 측정한다. 결과를 천연 인간 적혈구의 결과와 비교한다.

실시예 68: 배양된 적혈구계 세포의 병원체 시험

RT-PCR을 사용하여, 배양된 적혈구계 세포 모집단에서 우연한 바이러스 존재를 정량화하고, 비-오염을 확인한다(검정 번호 003000.BSV, BioReliance). 적혈구계 모집단을 각각 호기성 및 혐기성 박테리아의 성장을 뒷받침하는 2개의 상이한 유형의 배지로 직접 접종함으로써 미처리 및 최종 벌크, 최종 바이얼, 프리뱅킹(prebanking) 세포, 및 세포 및 바이러스 은행의 무균성 시험을 수행한다. 시료를 14일 동안 인큐베이션시킨 후에, BioReliance 무균성 시험 프로토콜 USP 71에 따라 미생물 오염물에 대하여 시험한다.

실시예 69: 삼투 취약성의 평가

*삼투 취약성을 평가하여, 저장성 용액에 노출되는 경우 용해에 대한 적혈구계 세포의 저항을 측정한다. 수 중 NaCl의 용액을 0% 내지 1%에 걸쳐 있는 농도로 제조한다. 세포를 각 염 용액에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 시료를 원심분리시켜, 무손상 세포를 펠렛화시켰다. 상층액을 분광광도계를 사용하여 540 nm의 광의 흡광에 의해 헤모글로빈 함량에 대하여 검정하였다. 50% 용혈이 발생하는 점을 계산하고, 일차 적혈구에 대하여 수득되는 것과 비교한다.

실시예 70: 로제팅/면역원성의 평가

Coombs 시험으로도 알려져 있는 직접적인 항글로불린 시험은 혈청 유래의 폴리클로널 항체를 세포상의 표면 항원에 결합시킴으로써 야기되는 적혈구계 세포의 응집 또는 로제팅을 평가한다. 그것은 전반적인 동종이계 면역원성 평가를 위하여 풀링된 인간 혈청을 사용하여 또는 구체적인 면역원성 예측을 위해 의도된 수여자로부터의 혈청을 사용하여 수행될 수 있다.

약술하면, EDTA 튜브에 보관된 1 내지 2 방울의 세포를 반응 튜브에 첨가한다. 이러한 튜브를 등장성 염수로 3회 세척한다. 제3 세척 후에, 세척된 세포로부터 3% 현탁액을 제조한다. 2개의 튜브를 A 및 B로 표지한다. 1 방울의 세척된 3% 현탁액을 각 튜브에 첨가한다. 이들 튜브를 1회 이상 세척한다. 경사분리하는 경우, 세포 하측이 위에 있도록 튜브를 배치한다. 이것은 세척 과정에서 너무 많은 세포가 소실되는 것을 막을 것이다. 웰을 배액시키고, 바이오와이프(biowipe)로 흡수하여 건조시킨다. 바로 1 방울의 인간 시험 혈청을 둘 모두의 튜브에 첨가하고, 진탕시켜 혼합한다. B 튜브가 실온에서 5분 동안 인큐베이션되게 한다. A 튜브를 원심분리기에서 Coombs 회전에 대하여 보정된 시간 동안 원심분리한다. 바로 온건하게 재현탁화시키고, 조명 응집 뷰어(lighted agglutination viewer)(Beckton Dickinson)를 사용하여 응집에 대하여 시험한다. A 튜브가 양성이면, B 튜브를 판독하는 것이 필요하지 않거나, A 튜브를 현미경으로 시험하는 것이 필요하다. 조명 응집 뷰어에 의해 A 튜브가 음성이면, 현미경 하에 응집에 대하여 시험한다. 현미경 판독 내내 A 튜브가 음성이면, B 튜브를 그의 인큐베이션 기간 후에 원심분리하고, B 튜브 시료를 사용하여 단계를 2 내지 4회 반복한다. B 튜브도 또한 음성이면, 1 방울의 IgG-코팅된 Coombs 대조군 세포(체크 세포(Check Cells))를 튜브에 첨가하고, 원심분리한다. 응집에 대하여 시험한다. 응집이 이러한 단계에서 존재하거나, 시험은 무효이다.

체크 세포(check cell, ccc)의 첨가 이전의 단계 중 임의의 단계에 응집이 존재하지 않는다면, 시험은 음성으로 해석된다. 응집이 체크 세포의 첨가 이전 단계 중 임의의 단계에서 관찰된다면, 시험은 양성으로 해석된다.

실시예 71: 산소-결합 능력의 평가

37℃에서 평형 산소 결합 곡선을 1-cm 경로 길이 큐벳에 연결된 토노미터(tonometer)에서 결정한다. 스펙트럼 측정을 분광광도계(Cary 50; Variant Inc)를 사용하여 수행하고, 온도를 Peltier 모듈로 제어한다. 분석을 140 mM NaCl 및 2 mM 글루코스를 함유하는 50 mM bis-Tris 완충제(pH 7.2)에서 수행한다. 질소하에서의 완전한 산소제거 후에, Hamilton 주사기를 사용하여 고무 캡을 통해 알려져 있는 부피의 순수 산소를 토노미터로 주입함으로써 상이한 산소 분압에서 적혈구 현탁액을 평형화시킨다. 최소 제곱 회귀에 의한 RBC 현탁액의 완전한 산소제거 및 산소화된 스펙트럼의 선형 조합으로서 가시 영역 및 소렛(Soret) 영역의 흡수 스펙트럼의 모의실험에 의해 포화 분율을 추산한다.

실시예 72: 세포의 대사 상태의 평가

적혈구계 세포 모집단을 다양한 상이한 효소 기반의 검정을 사용하여 대사적으로 활성인 것으로 입증하여, 중요한 대사 최종 생성물을 정량화할 수 있다. 활성 해당과정은 평가하기 위한 중요한 대사 경로이며, 하기의 검정으로 측정될 수 있다(해당과정 세포-기반의 검정 키트, Cayman Chemical, Item 600450).

450 ㎕의 검정 완충제에 이어서 50 ㎕의 L-락트산 표준물질을 시험 튜브 내로 분취하고, 완전히 혼합한다. 1 mM 희석액으로 시작하여, 락트산 농도 표준물질을 사용하여 적정 곡선을 구축한다.

세포를 96 웰 플레이트에 첨가하고, 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리한다. 100 ㎕의 표준물질을 개별 96 웰 플레이트로 옮긴다. 그 다음, 90 ㎕의 검정 완충제를 각 웰에 첨가한다. 그 다음, 각 세포 웰에서 10 ㎕의 상층액을 상응하는 신규한 웰로 옮긴다. 100 ㎕의 반응 용액을 반복 피펫터(pipettor)를 사용하여 각 웰에 첨가한다. 그 다음, 플레이트를 실온에서 30분 동안 오비탈 진탕기에서 인큐베이션시킨다. 흡광도를 플레이트 판독기를 사용하여 490 nm에서 판독한다. 결과를 천연 세포와 비교하여 임의의 대사 차이를 확인한다.

실시예 73: 혈소판 응집의 평가

배양된 또는 일차 공급 혈소판의 응집 경향을 모니터링할 수 있다. 혈소판을 광원 앞에서 진탕시킴으로써 혈소판을 와류 분석하고, 결과는 복굴절의 존재 또는 부재로 표현된다. 50 내지 70 ㎖의 부피로 생성된 소정의 단위의 혈소판 농축물을 1시간 동안 놔두고, 22 ± 2℃(71.6 ± 3.6℉)의 제어된 온도에서 70 rpm에서 선형 진탕기(C-Mar®)에 둔다.

혈소판 농축물의 시험(혈소판 계수, 혈소판 응집 및 pH)을 처리 후 제1일, 제3일 및 제5일에 수행하고; 백혈구 계수를 오직 제1일에만 수행하고, 미생물 제어를 보관 제5일에만 수행한다. 혈소판 농축물의 시료로부터 분취액을 수득하기 위하여, 무균 연결(Haemonetics®)을 사용하여, 환경의 무결성을 보장한다. 혈액 수집 4시간 내에 이중-채널 Chronolog(Crono-Log Corporation®)를 사용하는 탁도계 응집측정(turbidimetric aggregometry) 기술을 사용하여 혈소판 응집을 달성한다. 이를 위하여, 세포를 1000 rpm에서 5분 동안의 가벼운 원심분리를 통해 초기에 수득한 다음, 3000 rpm에서 15분 동안 원심분리한다(Eppendorf®). 시료를 자동 계수기(Human Count®)에서 혈소판 계수로 처리한다.

혈소판 농도를 조정한 후에, 상이한 농도의 유도 효능제를 사용하여 응집을 평가한다: 콜라겐 2.0 ㎍/㎖ 및 ADP 7.0 ㎍/㎖(Crono-Log Corporation®). 각 시험을 위하여, 400 ㎕의 PRP 및 400 ㎕의 PPP를 사용하고, 각각의 것은 자발적 응집을 위한 대기 후에 상이한 큐벳에 존재한다. 5분의 유도 효능제에 의한 자극 후에 응집 곡선을 관찰하고, 직후에, 응집을 측정하고, 시험 동안 형성되는 곡선에 따라 백분율로 표현한다. 시험의 결과는 통상 시험 용액을 투과하는 광의 양에 의해 응집의 백분율로 표현되며; 응집은 정상, 저수준 또는 고수준으로 분류된다.

실시예 74: 자가 배양 과정

자가 공급 전구 CD34+ 세포를 사용한 적혈구계 세포의 배양을 행하여 환자에 대한 세포 면역적합성을 최적화시킨다. 골수 유래의 CD34+ 세포를 본원에 기재된 바와 같은 GM-CSF를 사용하여 환자 내의 주변부로 동원시킨다. 10^6 내지 10^8개 CD34+ 세포를 정의된 배지를 사용하여 전술된 22일 프로토콜을 사용하여 수집하고 배양한다. 제4일 동안, 세포를 치료제의 발현을 코딩하는 유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 트랜스펙션시킨다. 배양 프로토콜의 완료시에, 세포를 정제하고, 순환 생존력, 면역원성, 복제능, 순도 및 치료 용량과 상관되는 물리적 특성을 포함하는 몇몇 품질 제어 측정 기준에 걸쳐 평가한다. 그 다음, 세포를 적절한 안정화 용액에 보관하고, 주사기 또는 적절한 전달 비히클에서 제형화한다. 그 다음, 세포를 초기 CD34+ 세포를 공여한 동일한 환자 내로 주입한다.

실시예 75: 자가 로딩 과정

적합한 외인성 항원이 로딩된 치료적 적혈구계 세포의 제조를 위하여, 자가 공급 적혈구를 사용하여, 환자를 위해 세포 면역적합성을 최적화시킬 수 있다. 환자로부터 채혈하고, 5000 g에서 20분 동안 원심분리한다. 버피 코트를 제거하고, 나머지 적혈구를 10^8개 세포/㎖의 밀도로 항응고 완충제에 재현탁화시켜, 총 10^10개의 세포를 제공한다. 상기 기재된 방법 중 하나에 의해 치료적 외인성 관심 항원을 세포에 로딩한다. 로딩 프로토콜의 완료 시에, 세포를 정제하고, 순환 생존력, 면역원성, 복제능, 순도 및 치료 용량과 상관되는 물리적 특성을 포함하는 몇몇 품질 제어 측정 기준에 걸쳐 평가한다. 그 다음, 세포를 적절한 안정화 용액에 보관하고, 주사기 또는 적절한 전달 비히클에서 제형화한다. 세포를 초기 적혈구를 공여한 동일한 환자 내로 주입한다.

실시예 76: 동종이계 배양 과정

확장가능한, 보편적인 치료제를 생성하기 위하여, 적혈구계 세포를 동종이계 공급원으로부터 배양할 수 있다. 동종이계 공급 전구 CD34+ 세포를 사용한 적혈구계 세포의 배양을 행하여, 과정을 간소화하고, 소정의 규모로 환자를 치료할 수 있는 소정의 부피의 치료물질을 배양한다. 공여자를 A, B, Rh를 포함하는 주요 혈액 항원에 대하여 혈액형 분석하여, 보편적 공여자(예를 들어, O Rh- 또는 Bombay Rh-)를 확인한다. 골수 유래의 CD34+ 세포를 본원에 기재된 바와 같은 GM-CSF를 사용하여 적절한 공여자 내의 주변부로 동원시킨다. 10^6 내지 10^8개 CD34+ 세포를 정의된 배지를 사용하여 전술된 22일 프로토콜을 사용하여 수집하고 배양한다. 제4일 동안, 세포를 치료제의 발현을 코딩하는 유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터로 트랜스펙션시킨다. 배양 프로토콜의 완료시에, 세포를 정제하고, 순환 생존력, 면역원성, 복제능, 순도 및 치료 용량과 상관되는 물리적 특성을 포함하는 몇몇 품질 제어 측정 기준에 걸쳐 평가한다. 그 다음, 세포를 적절한 안정화 용액에 보관하고, 주사기 또는 적절한 전달 비히클에서 제형화한다. 그 다음, 세포를 그들의 주요 혈액형과 관련 없이 환자 내로 주입한다.

실시예 77: 동종이계 로딩 과정

동종이계 공급 전구 CD34+ 세포를 사용한 적혈구계 세포의 배양을 행하여, 소정의 규모로 환자를 치료할 수 있는 더 큰 부피의 치료 세포를 제조하기 위한 과정을 간소화시킨다. 공여자를 A, B, Rh를 포함하는 주요 혈액 항원에 대하여 혈액형 분석하여, 보편적 공여자(예를 들어, O Rh- 또는 Bombay Rh-)를 확인한다. 세포에 상기 기재된 바와 같은 방법 중 하나에 의해 치료적 외인성 관심 항원을 로딩한다. 로딩 프로토콜의 완료 시에, 세포를 정제하고, 순환 생존력, 면역원성, 복제능, 순도 및 치료 용량과 상관되는 물리적 특성을 포함하는 몇몇 품질 제어 측정 기준에 걸쳐 평가한다. 그 다음, 세포를 적절한 안정화 용액에 보관하고, 주사기 또는 적절한 전달 비히클에서 제형화한다. 그 다음, 세포를 그들의 주요 혈액형과 관련 없이 환자 내로 주입한다.

실시예 78: 보관

1. 냉장 완충 용액에서의 보관

적혈구의 보관을 위한 표준 프로토콜은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Meryman and Hornblower 1986, Transfusion 26(6):500]을 참조한다. 적혈구의 보관(최대 42일 동안)을 위한 표준 프로토콜은 항응고 용액(시트레이트-덱스트로스-포스페이트)으로 혈액을 수집하는 것이다. 적혈구계 세포를 본원에 기재된 바와 같이 배양한다. 적혈구 농축물을 원심분리에 의한 혈장의 제거에 의해 제조한다. 세포를 약간 고장성의 첨가제 용액, SAGM(나트륨, 아데닌, 글루코스, 만니톨, 376 mOsm/ℓ)에서 4 ± 2℃에 보관한다.

2. 동결 완충 용액에서의 보관

적혈구계 세포의 글리세롤처리, 동결 및 해동 방법은 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Meryman and Hornblower 1977 Transfusion 17(5):4348]을 참조한다. 시트레이트 포스페이트 덱스트로스 중 인간 혈액을 글리세롤 처리하고, 수집 4일 내에 동결시킨다. 글리세롤 처리된 RBC를 제조하기 위하여, 대략 10 ㎖의 전혈을 먼저 1,400 g에서 10 내지 15분 동안 원심분리하고, 혈장을 제거한다. 그 다음, 생성된 팩킹된 세포를 하기의 조성을 갖는 글리세롤 수용액을 사용하여 2 단계로 글리세롤 처리한다: 6.8.42의 pH로 조정된, 100 ㎖의 총 부피 중 57.1 g의 글리세롤, 0.03 g의 염화칼륨, 0.085 g의 염화마그네슘 6수화물, 0.08 g의 디소듐 포스페이트 및 1.6 g의 락트산나트륨. 제1 단계에서, 1.5 ㎖의 이러한 글리세롤 용액을 3분의 기간에 걸쳐 온건하게 진탕시키면서, 팩킹된 세포에 적가한다. 그 다음, 혼합물을 적어도 5분 동안 손대지 않고, 평형화되게 한다. 제2 글리세롤 처리 단계에서, 5 ㎖의 글리세롤 용액을 적가하면서, 혼합물을 3분 기간에 걸쳐 온건하게 진탕시켜, 약 40% w/v의 최종 글리세롤 조성물을 제공한다. 전체 글리세롤 처리 과정을 실온에서 수행한다. 그 다음, 글리세롤 처리된 RBC를 초저온 바이얼에 0.6 내지 1.1 ㎖의 분취액으로 나누고, NalgeneVR Cryo "Mr. Frosty" 동결 용기(Thermo Scientific, NC)에 두고, 적어도 12시간 및 최대 10년 동안 -80C 동결기에 보관한다. 초저온 바이얼을 1분 동안 37C 수조에 배치함으로써 동결된 RBC를 해동시킨다. 모든 글리세롤 처리된 혈액 시료를 해동 2시간 내에 탈글리세롤화(deglycerolization) 실험에 사용한다.

3. 주사기로서의 제형

세포 모집단을 주사기를 통해 정맥내 투여할 수 있다. 치료적 세포를 37℃에서 표준 염수 완충제를 사용하여 10^7개 세포/㎖의 밀도로 희석하여, 100 ㎖의 부피 또는 10^9개의 세포가 전달되게 한다. 세포 용액을 150 ㏄ 주사기, 20 게이지 주사바늘 내로 로딩하고, 환자 내로 자쪽피부정맥을 통해 5 ㏄/분으로 주사한다. 주사 동안, 환자의 활력을 임의의 면역원성 또는 응고 반응에 대하여 모니터링한다.

4. 백으로서의 제형

세포 모집단을 백 및 드립 챔버(즉, 정맥내 드립)에 연결된 주사기를 통해 정맥내 투여할 수 있다. 치료적 세포를 37C에서 표준 염수 완충제를 사용하여 10^7개 세포/㎖의 밀도로 희석하여, 100 ㎖의 부피 또는 10^9개의 세포가 전달되게 한다. 세포 용액을 카테터에 연결된 1 ℓ 플라스틱 백 내로 로딩하고, 중력을 통해 환자 내로 자쪽피부정맥을 통해 배액되게 한다. 주입 동안, 환자의 활력을 임의의 면역원성 또는 응고 반응에 대하여 모니터링한다.

실시예 79: 질병의 치료

1. 혈우병

혈우병 A를 앓고 있는 환자가 진단된다. 외인성 FVIII 발현 제핵 조혈 세포의 조성물을 본원에 기재된 바와 같이 제조한다. 10^9개의 세포를 환자에게 정맥내 투여한다. 응고 속도를 당업계에 알려져 있는 표준 시험관내 응고 시간 검정으로 평가한다. FVIII에 대한 순환 항체를 본원에 기재된 바와 같이 혈청에서 검출한다. 순환 항체의 수준을 평가하여, 면역 관용 유도의 효율성을 추적한다. 응고 캐스케이드 활성이 건강한 응고를 보장하기에 충분하지 않다면, 재조합 또는 단리된 FVIII를 동시에 정맥내로 투여하여, 혈우병 A의 증상을 감소시킨다.

2. 비정형 용혈성 요독 증후군

비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS)을 앓고 있는 환자가 진단된다. 외인성 CFH 발현 제핵 조혈 세포의 조성물을 본원에 기재된 바와 같이 제조한다. 10^9개의 세포를 환자에게 정맥내 투여한다. 증상성 용혈비를 당업계에 알려져 있는 표준 소변 용혈 검정으로 평가한다. CFH에 대한 순환 항체를 본원에 기재된 바와 같이 혈청에서 검출한다. 순환 항체의 수준을 평가하여, 면역 관용 유도의 효율성을 추적한다. 본원에 기재된 검정을 사용하여 질병의 증상이 개선하는 것으로 보일 때까지, 환자에서 치료를 시행한다.

3. 다발경화증

다발경화증(MS)이 있는 개체에, 본원에 기재된 바와 같이 생성되고 제형화된, 항원 폴리펩티드 수초 염기성 단백질(MBP)을 발현하는 1x10^9개의 항원 발현 제핵 조혈 세포의 단일의 주입을 제공한다. 연구 약물 투여 일에, 환자를 단계 1 입원환자 시설에서 24시간 동안 모니터링한다. 일차 결과의 측정을 제3개월에 수행하고, 연속 임상, MRI 및 일반 신체 검사, 및 유래 사례를 평가하고 MS 질병 활성을 모니터링하기 위한 임상 및 실험실 분석을 사용하여 추가의 안전성 추적을 제6개월까지 수행한다. MS의 증상이 개체에서 개선되도록 관용이 유도될 때까지 절차를 반복한다. 예를 들어, 문헌[Andreas Lutterotti et al. Sci Transl Med 5, 188ra75 (2013)]을 참조한다.

상이한 세포 서브셋의 빈도를 하기의 항체 패널을 사용한 유세포계수법에 의해 전혈(EDTA 튜브)에서 분석한다: 면역 세포 서브셋(과립구, 호산구, 단핵구, 및 B, T, NK 및 NK T 세포)에 대하여 - 항-CD45(PE-Cy7, eBioscience), 항-CD16(APC-Cy7, BioLegend), 항-CD19[플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), BD], 항-CD14(V450, BD), 항-CD3[페리디닌 클로로필 단백질(PerCP), BD] 및 항-CD56[피코에리트린(PE), eBioscience]; CD4+, FoxP3+ Treg, 조절 CD8+CD57+ILT2+ 및 전염증성 CD8+CD161high T 세포를 포함하는 T 세포 서브셋에 대하여 - 항-CD3(PE-Cy7, eBioscience), 항-CD4(APC, eBioscience), 항-CD8[퍼시픽 블루(Pacific Blue, PB), Dako-Biozol], 항-FoxP3(PE, Miltenyi), 항-CD25(APC, eBioscience), 항-CD57(FITC, BD), 항-ILT2(PE, Beckman) 및 항-CD161(APC, Miltenyi). 상응하는 아이소형 대조군을 모든 염색에 포함시킨다. 세포를 LSR-II 유세포계수기(BD) 및 FACSDiva 소프트웨어(BD)를 사용하여 분석한다.

말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 피콜 밀도 구배 원심분리(PAA)에 의해 단리하고, T 세포의 기능적 표현형을 하기와 같은 세포내 사이토카인 염색에 의해 평가한다: 5 × 10^5개의 신선하게 단리된 PBMC를 멸균 FACS 튜브에서 200 ㎖의 X-VIVO 15(Lonza)에서 하룻밤 인큐베이션시킨다. 다음날, 세포를 브레펠딘(brefeldin) A(10 ㎎/㎖, eBioscience)의 존재하에 5시간 동안 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(50 ng/㎖, Sigma) 및 아이오노마이신(1 ㎎/㎖, Sigma)으로 자극한다. 인산염-완충 염수를 사용한 세척 후에, 세포를 LiveDead 키트(AmCyan, Invitrogen)로 염색하고, 고정시키고, 투과화시키고, 상이한 항체로 염색한다: 항-IL-17(Alexa Fluor 647; eBioscience), 항-IL-4(PE-Cy7, BioLegend), 항-IFN-g(FITC, BioLegend), 항-IL-10(PE; BioLegend), 항-CD3(PE, DakoCytomation), 항-CD4(PB, DakoCytomation) 및 항-CD8(PB, BioLegend) 또는 상응하는 아이소형 대조군.

연구에 사용되는 수초 펩티드에 대한 항원-특이적 T 세포 반응을 관용유도 절차 이전 및 3개월 후에 신선하게 단리된 PBMC에서 측정한다. 항원-특이적 T 세포 반응을 티미딘 혼입을 사용한 증식 검정에 의해 분석한다. 약술하면, 단리된 PBMC를 1 mM의 펩티드와 함께 X-VIVO 15 배지(Lonza)에서 웰마다 1.5 × 10^5개의 PBMC로 96-웰 플레이트에 씨딩한다. 항원마다 48개의 웰을 씨딩하고, 각 플레이트에서 6개의 웰에 음성 대조군으로서 배지만이 존재한다. TTx(5 ㎎/㎖)(Novartis Behring)를 양성 대조군으로 사용한다. 제7일에, 플레이트를 15시간 동안 1mCi의 [3H]티미딘(Hartmann Analytic)과 인큐베이션시킨다. [3H] 티미딘-펄싱 플레이트를 섬광 b 계수기(Wallac 1450, PerkinElmer)로 분석한다. 각 웰의 섬광 계수(CPM)를 측정한다. 비자극 웰의 평균 + 3 SD보다 더 큰 CPM을 보이는 웰은 양성으로 간주된다.

본원에 제시된 본 발명의 여러 변형 및 기타 구현예는, 전술된 설명 및 관련 도면에 제시된 지침의 혜택을 갖는 이들 발명이 관련된 당해 기술의 숙련가에게 익숙할 것이다. 따라서, 본 발명이 개시된 특정 구현예에 국한되지 않으며, 변형 및 기타 구현예가 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함됨이 이해될 것이다. 구체적인 용어들이 본원에서 사용되지만, 일반적으로 설명을 위해서만 사용될 뿐, 제한하기 위해 사용되는 것은 아니다.

본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속한 당해 기술의 숙련가의 수준을 시사한다. 모든 간행물과 특허 출원은, 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되었음이 시사되는 것과 같은 수준으로, 본원에 참조로 포함된다.

표 A 내지 표 J

[표 A]

[표 A1]

[표 B]

[표 C]

[표 C1]

[표 C2]

[표 C3]

[표 D]

[표 D1]

[표 E]

[표 F]

[표 G]

[표 H]

[표 I]

[표 J]

표 1 내지 표 8

[표 1]

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 5]

[표 6]

[표 7]

[표 8]

Claims

외인성 항원(exogenous antigen)을 포함하는 외인성 폴리펩티드(exogenous polypeptide)를 포함하는 제핵 적혈구계 세포(enucleated erythroid cell)를 포함하는, 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 외인성 항원은 제핵 적혈구계 세포의 표면 상에 세포외(extracellular)에 위치하는 것인, 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 외인성 폴리펩티드는 막횡단 영역(transmembrane region) 및 표면 도메인(surface domain)을 포함하는 융합 폴리펩티드(fusion polypeptide)이고, 여기서 표면 도메인은 외인성 항원을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 외인성 폴리펩티드는 제핵 적혈구계 세포의 세포질에 존재하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
외인성 폴리펩타이드는 막횡단 영역(transmembrane region) 및 외인성 항원을 포함하는 융합 폴리펩타이드이고, 여기서 상기 외인성 항원은 세포 내(intracellular)에 국소화되는 (localized) 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제핵 적혈구계 세포가 1,000 카피 이상의 외인성 항원을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제핵 적혈구계 세포가 10,000카피 이상의 외인성 항원을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 외인성 항원은 수초 염기성 단백질(myelin basic protein), 단백지질 단백질(proteolipid protein), 수초 희소돌기아교세포 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein), 포스포리파제 A2 수용체(phospholipase A2 receptor), 베타-2 당단백질 1(beta-2 glycoprotein 1), 표 F-J 또는 표 6-8에 열거된 항원, 또는 이의 항원 단편으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 외인성 항원은 수초 염기성 단백질(myelin basic protein), 단백지질 단백질(proteolipid protein), 수초 희소돌기아교세포 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein) 또는 이의 항원 단편인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제핵 적혈구계 세포는 적혈구(erythrocyte)인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제핵 적혈구계 세포는 망상적혈구(reticulocyte)인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제핵 적혈구계 세포는 인간 세포인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제핵 적혈구계 세포는
외인성 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 유핵 적혈구계 세포 (nucleated erythroid cell) 또는 이의 전구체에 도입하는 단계; 및
유핵 적혈구계 세포 또는 이의 전구체를 배양하는 단계;
를 포함하는 방법에 의해 생산되고, 여기서 상기 배양은 유핵 적혈구계 세포 또는 이의 전구체의 제핵 및 외인성 폴리펩타이드의 생산을 초래하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 정맥내 주사용 액체 현탁액으로 제형화되는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 외인성 항원-특이적 면역 세포(antigen-specific immune cell)의 백분율이 치료 기간 동안 인간 대상체에서 실질적으로 감소되도록 치료 기간에 걸쳐 충분한 횟수로 투여되도록 제형화되는 것인, 약학적 조성물.
제1항의 약학적 조성물을 생산하는 방법으로, 상기 방법은
외인성 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 유핵 적혈구계 세포 또는 이의 전구체에 도입하는 단계; 및
유핵 적혈구계 세포 또는 이의 전구체를 배양하는 단계; 를 포함하고, 여기서 배양은 유핵 적혈구계 세포 또는 이의 전구체의 제핵 및 융합 폴리펩타이드의 생산을 초래하는 것인, 방법.
외인성 항원을 포함하는 외인성 폴리펩티드를 포함하는 제핵 적혈구계 세포를 포함하는, 제1형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제17항에 있어서,
상기 외인성 항원은 제핵 적혈구계 세포의 표면 상에 세포외에 위치하는 것인, 약학적 조성물.
제18항에 있어서,
상기 외인성 폴리펩티드는 막횡단 영역 및 표면 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이고, 여기서 표면 도메인은 외인성 항원을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
제17항에 있어서,
상기 외인성 폴리펩티드는 제핵 적혈구계 세포의 세포질에 존재하는 것인, 약학적 조성물.
제17항에 있어서,
상기 외인성 폴리펩티드는 막횡단 영역 및 외인성 항원을 포함하는 융합 폴리펩티드이고, 여기서 상기 외인성 항원은 세포내 국소화되는 것인, 약학적 조성물.
제17항에 있어서,
상기 제핵 적혈구계 세포는 1,000카피 이상의 외인성 항원을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
제17항에 있어서,
상기 제핵 적혈구계 세포는 10,000카피 이상의 외인성 항원을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
제17항에 있어서,
상기 외인성 항원은 프리프로인슐린(preproinsulin), 프로인슐린(proinsulin) 및 인슐린으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
제17항에 있어서,
상기 제핵 적혈구계 세포는 적혈구인, 약학적 조성물.
제17항에 있어서,
상기 제핵 적혈구계 세포는 망상적혈구인, 약학적 조성물.
제17항에 있어서, 상기 제핵 적혈구계 세포는 인간 세포인, 약학적 조성물.
제17항에 있어서,
상기 제핵 적혈구계 세포는
외인성 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 유핵 적혈구계 세포 또는 이의 전구체에 도입하는 단계; 및
유핵 적혈구계 세포 또는 이의 전구체를 배양하는 단계;
를 포함하는 방법에 의해 생산되고, 상기 배양은 유핵 적혈구계 세포 또는 이의 전구체의 제핵 및 외인성 폴리펩타이드의 생산을 초래하는 것인, 약학적 조성물.
제17항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 정맥내 주사용 액체 현탁액으로 제형화되는 것인, 약학적 조성물.
제17항에 있어서,
상기 외인성 항원-특이적 면역 세포의 백분율이 치료 기간 동안 인간 대상체에서 실질적으로 감소되도록 치료 기간에 걸쳐 충분한 횟수로 투여되도록 제형화되는 것인, 약학적 조성물.
제17항의 약학적 조성물을 생산하는 방법으로, 상기 방법은
외인성 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산을 유핵 적혈구계 세포 또는 이의 전구체에 도입하는 단계; 및
유핵 적혈구계 세포 또는 이의 전구체를 배양하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 배양은 유핵 적혈구계 세포 또는 이의 전구체의 제핵 및 융합 폴리펩타이드의 생산을 초래하는 것인, 방법.