CN109810992A

CN109810992A - 一种编码牙鲆胞外ATP水解酶CD39的cDNA全长序列及其应用

Info

Publication number: CN109810992A
Application number: CN201910101788.8A
Authority: CN
Inventors: 李硕; 孙金生; 陈晓丽; 李佳芳
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin University; Tianjin Normal University
Priority date: 2019-02-01
Filing date: 2019-02-01
Publication date: 2019-05-28

Abstract

本发明公开了牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因的检测方法及其对鱼类天然免疫的调节作用。本发明通过以不同物种CD39基因编码区序列的保守区设计简并引物，经反转录及PCR扩增，结合RACE技术最终得到牙鲆CD39的全长cDNA序列。牙鲆CD39蛋白是一种重要的胞外ATP水解酶，其通过控制细胞外ATP浓度，对鱼类胞外ATP介导的天然免疫应答起重要调节作用。本研究为鱼类天然免疫调控的分子机制研究提供了新的证据，亦可为针对鱼类CD39蛋白的免疫功能调节剂研发奠定重要基础。

Description

一种编码牙鲆胞外ATP水解酶CD39的cDNA全长序列及其应用

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体是牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因全长cDNA序列及其编码的蛋白，以及该基因的克隆和应用。

背景技术

近年来，随着人民生活水平的日益提高，鱼类作为一种高蛋白低脂肪的食物受到人们越来越多的亲睐。由于水产养殖规模在世界范围内不断扩大，国内外水产品贸易及水产苗种跨区域交流的日益频繁，水产养殖动物病原传播的机会大大增加。此外，由于现代水产养殖业的高度集约化和高密度生产特点，导致渔业水域环境恶化和水体细菌大量繁殖，引发养殖动物应激反应，导致机体免疫***受到抑制。上述内外因素的相互作用，导致世界范围内水产养殖动物疾病爆发趋于频繁，流行范围趋于广泛，从而给养殖业带来了极大的经济损失。通过运用现代生物学技术作为水产养殖的技术支撑，对经济动物病害进行免疫防治是水产动物疾病防治的重要手段。因此，近年来鱼类免疫学研究在国际上受到了越来越多的重视。

鱼类和哺乳动物的免疫***具有一定的保守性。为了适应水体环境，鱼类演化出自身特有的免疫特性，具有天然免疫和获得性免疫应答两个***，但其获得性免疫***并不完善，因此，天然（先天）免疫在鱼类免疫***中扮演着更重要的作用。

研究表明，机械损伤、免疫刺激、细胞坏死、细胞凋亡及病原侵染等条件下，细胞可通过胞吐、离子通道的方式将ATP从细胞内迅速释放到细胞外。胞外ATP是一种可以激活宿主天然免疫应答的强效促炎症信号分子，其通过作用于细胞膜表面P2嘌呤受体或ATP激活的离子通道，触发不同的下游信号（如Ca²⁺信号、环腺苷酸信号和蛋白激酶信号等），形成嘌呤免疫信号通路，广泛参与了机体的天然免疫应答调控。然而，过高的胞外ATP浓度可以诱导细胞产生过度的天然免疫反应，对机体产生不利影响。因此，胞外ATP的浓度必须受到严格控制。通过胞外核苷酸酶水解胞外ATP，从而降低胞外ATP的可利用浓度，将胞外ATP的促炎症效应维持在适度水平，是维持机体免疫稳态的重要途径。

胞外二三磷酸核苷酸水解酶I（ecto-nucleoside triphosphatediphosphohydrolase，e-NTPDase），亦称为CD39，是一种广泛分布于植物、动物等真核生物中，分子量约为70~100kD、定位于细胞膜上的糖蛋白。CD39是嘌呤免疫信号通路的重要组成成员，其主要作用是水解ATP和ADP，形成AMP，后者再由5'胞外核苷酸酶（CD73）水解为腺苷，进而将胞外ATP的促炎症效应转化为抗炎症效应，以维持机体适度、有效的免疫应答。 CD39对机体天然免疫应答起重要调节作用。研究表明，CD39可以调节胞外ATP受体P2X7介导的细胞凋亡及促炎性细胞因子IL-1β和IL-8的释放；CD39还可以将TLR受体诱导释放的胞外ATP迅速水解为腺苷，进而减弱巨噬细胞的活化程度；此外，过表达CD39有助于呼吸道上皮细胞抵抗绿脓假单胞菌侵染。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）属碟形目、牙鲆科、牙鲆属，俗称“比目鱼”、“左口”，是我国以及东亚地区主要的海水养殖鱼类，具有较高的经济价值。随着近年来养殖规模的不断扩大，病毒、细菌等病原体导致的流行性病害在集约化养殖条件下爆发日趋频繁，对牙鲆养殖业造成了严重的经济损失，严重制约了牙鲆养殖业的健康可持续发展。目前，由于对于牙鲆免疫调控分子机理了解较少，致使相关免疫防治技术的开发与应用受到严重的制约。

细胞外ATP是一种重要的、具有强效免疫刺激功能的内源性信号分子，其在活化鱼天然免疫应答过程中起着重要作用。虽然适度的免疫应答对于病原清除和维持机体稳态具有重要作用，但过度的天然免疫应答则会造成机体损伤、坏死，甚至导致个体死亡。因此，分离鉴定具有调节鱼类天然免疫应答强度的功能基因，有助于深入理解和控制胞外ATP在鱼类天然免疫中的作用。

胞外二三磷酸核苷水解酶1（CD39）是胞外ATP免疫信号通路上游的关键调节基因，与机体内的许多炎症反应与免疫反应有着密切的关系，可以在一定程度上反映鱼类的免疫能力。分离鉴定牙鲆胞外CD39基因，有助于深入解析CD39结构与功能的关系及其与鱼类免疫应答的关联，加深人们对鱼类精细而复杂的免疫应答过程的全面认识，从而为寻找诊断、预防和治疗鱼类流行性疾病提供新的策略，并为鱼类分子抗病育种设计、抗病性转基因鱼的设计、鱼类基因疫苗设计等提供重要的理论基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种牙鲆胞外核苷酸酶CD39的cDNA序列及克隆方法。该牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因cDNA序列，基因cDNA全长1685bp，含有1494bp的开放阅读框，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其编码497个氨基酸，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明还公开了用于检测牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因cDNA序列的特异性引物，其特征在于：

正向引物：5’－CCTTCCGACTCTACGGTAATGAC-3’ SEQ ID NO.3

反向引物：5’- GGATCTGATATGGATACTGGACCT-3’ SEQ ID NO.4。

本发明更加详细的描述如下：

本发明采用的技术方案是通过以不同物种CD39基因的CDS序列保守区设计简并引物，通过RT-PCR反转录及PCR扩增，结合RACE技术获得牙鲆CD39基因cDNA的全长表达序列；牙鲆CD39基因全长cDNA共1685bp，包括开放阅读框为1494bp，共编码497个氨基酸，含有114bp的5'非翻译区，77bp的3'非翻译区及poly(A)尾巴。这些基因结构特征可以说明所得的cDNA序列为牙鲆CD39基因的全长cDNA序列。牙鲆CD39基因编码的蛋白质分子量为55.3KDa，等电点为8.58,与其它物种的CD39蛋白有82%-99%的序列相似性。

本发明进一步公开了牙鲆胞外核苷酸酶CD39基因序列在作为牙鲆疾病防治靶标基因方面的应用，以及在作为牙鲆疾病实时荧光RT-PCR检测方面的应用，还有其对牙鲆天然免疫调控方面的应用。

本发明更进一步公开了牙鲆胞外核苷酸酶CD39基因cDNA序列克隆方法，其特征是包括如下主要步骤：

（1）健康牙鲆解剖分离头肾组织：

选取健康牙鲆,于水族箱中暂养3天后处死,解剖分离头肾组织。

（2）总RNA的提取和纯化：

采用Trizol法从牙鲆头肾中提取得到牙鲆头肾总RNA。总RNA纯化采用DNA酶处理法。

(3) 牙鲆CD39基因cDNA中间片段的克隆测序：

(3.1)cDNA第一链的合成

以纯化的牙鲆头肾总RNA作为模板，以Oligo(dT)₁₆作为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到cDNA第一链，作为下述PCR扩增的cDNA模板。

(3.2)PCR扩增

采用巢式PCR方法进行扩增反应。以前述所得的cDNA第一链为模板，利用下述第一引物进行PCR扩增：

正向引物：5’－GSGATTGTYRYCHTGGTRWC-3’

反向引物：5’-AARAYMCCRTTGAADGARCA-3’

扩增得到牙鲆胞外核苷酸酶CD39基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。

本步骤中，扩增体系可优选如下：

扩增程序参数可优选为：

94℃ 4min；

94℃ 30sec，52℃ 30sec，72℃ 1min（30个循环）；

72℃ 5min；12℃保温。

(4)牙鲆CD39基因cDNA 3'端的克隆测序：

根据上述步骤（3）得到的中间片段，设计并合成用于3'端巢式PCR的正向引物以及通用性反向引物AP，分别为：

正向引物：CD39-3'-F1: 5' –CCAGGGAGCTCCTGCCACCT- 3'

通用性反向引物AP： 5' - TCGAATTCGGATCCGAGCTC- 3'

以前述步骤（3）纯化的牙鲆头肾总RNA为模板，以Oligo(dT)₁₆AP：5' –TCGAATTCGGATCCGAGCTCV(T)₁₆- 3'为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为3'端巢式PCR扩增的cDNA模板。以CD39-3'-F1和AP为正反向引物进行PCR扩增（扩增体系及程序参数同中间片段扩增）。

(5) 牙鲆CD39基因cDNA 5'端克隆测序：

(5.1)合成5'端的cDNA第一链

使用CloneTech公司的5'RACE试剂盒中自带的5'反转录引物，进行反转录。反转录产物使用RNase H消化残余RNA，得到cDNA第一链。

(5.2)PCR扩增

根据上述步骤（3）得到的中间片段序列，使用Primer 5软件设计特异性反向引物，用于5'端巢式PCR。

CD39-5’-R1：5' –CTGCCAGTGTTGTTATCTTT - 3'

首先以通用正向引物UPM和特异性反向引物CD39-5'-R1为引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物为模板，以通用性正向引物NUP和特异性反向引物CD39-5'-R1为引物进行第二轮PCR扩增（扩增体系同中间片段扩增）。

扩增程序参数可优选为：

94℃ 4min；

94℃ 30sec，65℃ 1min，72℃ 2min（30个循环）；

72℃ 5min；12℃保温。

(6)将上述步骤（3）所得中间片段序列、步骤（4）所得3'端序列、和步骤（5）所得5'端序列用软件进行拼接，获得牙鲆CD39基因的全长cDNA序列，如SEQ ID No.1所述，并由基因序列推导出对应的氨基酸序列，如SEQ ID No.2所述。

牙鲆CD39基因全长cDNA共1685bp，包括开放阅读框为1494bp，共编码497个氨基酸，含有114bp的5'非翻译区，77bp的3'非翻译区及poly(A)尾巴。这些基因结构特征可以说明所得的cDNA序列为牙鲆CD39基因的全长cDNA序列。牙鲆CD39基因编码的蛋白质分子量为55.3KDa，等电点为8.58,与其它物种的CD39蛋白有82%-99%的序列相似性。

氨基酸序列如下：

M S A Q R E M K E K N P W H T P V T I I F T V I G V I A I V A L V T V A VL Q N R P L P Q K Y K Y G I V L D A G S S H T A L Y I Y E W P A E K D N N T GR V E Q T H S C K V K G P G I S S Y A S V P R K A G E S L S E C M Q E A R Q RV P E K R H S E T P L Y L G A T A G M R L L N L E N S L A S D K V F Q A V E EA L Q K F P F S F Q G A R I L S G Q E E G A F G W V T V N Y L D D R L K Q S LE T R G A L D L G G A S T Q I S F V S D D F D G S E S P D N G V A F R L Y G ND Y N L Y T H S F L C Y G K D Q A L R M T L A K Q T Q S G P V S I S D P C F NP G Y I E T K N Y S I V Y D S P C V S N M K P Q G A P A T F T H T G K G N F SQ C Q E V V K R N F N F K Q C K Y S Q C S F N G V F Q P R L Q G P F G A F S AY Y F V M N F L N L A D T S I P L E A V T E K L S R Y C A T P W N Q I K Q Q HP G V K L K Y L A E Y C F S G T Y I I T L L T E G Y N F T S Q N Y P N I K F IK K I K G S D A G W T L G Y M L N L T N M I P A E A P D S P P L P H A G Y V SI V T V I A I L L F V L F I L S L R P L W P R C S K Q P Q I I

本发明公开的牙鲆胞外ATP水解酶CD39 的cDNA序列及克隆方法所具有的有益效果是：

(1)本发明来源于牙鲆胞外ATP水解酶CD39的基因序列是一种新的CD39基因序列，在鱼中少有研究，使人们对CD39基因的研究对象从哺乳动物拓展到牙鲆等鱼类。

(2)本基因的获得不仅为研究鱼类CD39基因表达的调控机理以及CD39蛋白与鱼类抗病力的关系奠定基础，而且通过基因序列可以人工合成或转基因生物合成具有生物活性的纯蛋白，为进一步研究CD39的蛋白结构和免疫学功能奠定理论基础。本基因还可为鱼类种群遗传学以及进化遗传学研究提供分子水平材料，同时可以进行抗病相关性及抗病辅助育种的研究。

(3)CD39是一种重要的胞外核苷酸水解酶，直接参与了对胞外ATP介导的天然免疫应答的调控。在多种炎症病理状态下，CD39的表达上调，并影响参与机体天然免疫的炎症性介质和细胞因子的合成与释放，参与机体的免疫反应和炎症反应。CD39参与鱼类免疫调节，在一定程度上反映了鱼类的免疫能力，因此，CD39基因的表达水平可以用来指示鱼类的免疫力，通过检测CD39的mRNA丰度，可以对于鱼类免疫***的活化程度进行评价，作为鱼类疾病防治过程中免疫检测的指标，并作为牙鲆疾病防治靶标基因等方面发挥作用。

附图说明

图1为牙鲆CD39基因中间片段电泳检测结果：其中Maker条带从下而上依次为：2000、1000、750、500bp;

图2为牙鲆CD39基因3’端电泳检测结果：其中Marker条带从下而上依次为：1kb、750、500bp；

图3为牙鲆CD39基因5’端电泳检测结果：其中Marker条带从下而上依次为1kb、750、500、250、100bp；

图4为牙鲆CD39基因实时荧光RT-PCR产物电泳结果：牙鲆CD39产物长度127bp；其中Maker条带从下而上依次为：100、250、500、750、1000、2000bp；

图5为牙鲆内对照基因β-actin实时荧光RT-PCR产物电泳结果：β-actin产物长度150bp；其中Maker条带从下而上依次为：100、250、500、750、1000、2000bp；

图6 细菌脂多糖刺激牙鲆头肾细胞可以使牙鲆CD39表达迅速显著上调；

图7 爱德华氏菌感染可以使牙鲆CD39基因表达迅速显著上调；

图8 抑制CD39酶活性可以降低胞外ATP诱导的牙鲆促炎症细胞因子IL-1β基因表达；

图9 抑制CD39酶活性可以降低胞外ATP诱导的牙鲆细胞活性氧生成。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为本发明的范围内，本发明的范围和实质都有权利要求来限定；其中所述试剂均由市售。

实施例1

牙鲆头肾组织分离：

市场上购买的健康牙鲆（20g左右）与水族箱内25℃暂养三天，于超净台上解剖并分离头肾组织。以上步骤全为无菌操作。

实施例2

总RNA提取和纯化：

（1）取牙鲆头肾组织100mg，加入匀浆器中，并向其中加入1000µLTrizol试剂（Invitrogen公司），彻底研磨。如果是细胞，则在培养孔中加1000µL Trizol，反复吹打，以裂解细胞。然后将其转移到1.5mL无RNase的离心管中；

(2) 4℃、12000×g离心10min；

(3)取上清，加入新的离心管中，静止几分钟，使核蛋白完全裂解；

(4)向上清液中加入200µL氯仿，剧烈震荡15 s后，室温静止2-3min；

(5)4℃、12000×g、离心15min。离心后产物分成三层：下层相主要是蛋白质等，中间相主要是DNA，上层相是RNA；

(6)抽取上层相部分（宁少勿多，不要碰到中间相和下层相）于一个新的离心管中，向其中加入500µL异丙醇溶液（RNA：异丙醇体积比≈1:1），轻轻混匀，室温下静置15min以沉淀RNA；

(7)4℃、12000×g离心10min，弃去上清部分，再将离心管倒置于滤纸上，控干离心管；

(8)向离心管中加入1mL 75%乙醇，轻柔吹打，洗涤沉淀；

(9)4℃、7500×g离心6min，弃去上清清部分，将离心管于滤纸上倒置控干；

(10)向离心管中加入适量的RNase free H2O，溶解RNA；

(11)将RNA溶液放入恒温水浴锅中，55℃水浴5min以加速溶解。所得的溶液即总RNA， -80℃保存。

(12)提取的总RNA可用DNaseI酶（Invitrogen公司）进一步纯化，以出去RNA中残存的DNA，具体方法如下：在200µL无RNase离心管中，加入1µL 10×DNase Reaction Buffer、1µL DNase I（1U/µL）、2µg RNA、DEPC水补至10µL体积。室温放置15min，加1µL EDTA后混匀，65℃ 10min。即可得到纯化的总RNA。

实施例3：

牙鲆CD39 cDNA中间片段的克隆与测序：

引物设计：

首先从NCBI中下载不同生物CD39的全长cDNA序列以及氨基酸序列，根据生物学分类选取生物为人、小鼠、大鼠、斑马鱼、罗非鱼、东方红鳍豚、非洲爪蟾。用Clustal W软件对序列的保守性进行分析,在上述物种CD39基因的保守区采用Primer 5引物设计软件，设计简并引物用于PCR扩增牙鲆CD39 cDNA中间片段序列。

正向引物：5’- GSGATTGTYRYCHTGGTRWC -3’

反向引物：5’- AARAYMCCRTTGAADGARCA -3’

cDNA第一链合成：

以实施例2所述纯化的牙鲆头肾总RNA为模板，使用Promega公司的GoScriptTMReverse Transcription System试剂盒，反转录引物使用试剂盒所提供的Random Primer或Oligo(dT)₁₅ Primer，以牙鲆头肾组织或细胞的总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20µL。

PCR扩增：

用上述反转录产物做模板PCR扩增CD39的中间序列。PCR体系见下表：

PCR反应循环参数如下：

94℃ 4min；

94℃ 30sec，52℃ 30sec，72℃ 1min（30个循环）；

72℃ 5min；12℃保温。

取所得扩增产物5μL经1.5%非变性琼脂糖凝胶90V电泳30min，EB染色后紫外线检测扩增片段，检测结果如图1所示。

克隆测序：

目的片段的回收与纯化：将扩增出来的特异条带用干净刀片在紫外光下从琼脂糖中挖出，置于1.5mL离心管中，用上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，按照试剂盒推荐方法回收胶中的DNA片段。

重组连接：使用宝生物公司的T-载体PCR产物克隆试剂盒，将回收的DNA片段克隆与pMD18-T载体中。连接反应体系总体积10μL，16℃连接12h。

感受态细胞的制备：①从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于3mLLB液体培养基中，37℃、200r/min振荡培养12h左右，至对数生长期；将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于1mL LB培养基中，37℃振荡培养2-3h至对数期。②将培养液转移至离心管中，3000r/min离心3min。③用冷的0.05mol/L的CaCl₂溶液100μL轻轻悬浮细胞，冰上放置3h，即成感受态细胞悬液。

质粒DNA的转化：①无菌条件下将10μL连接液加入感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min。②42℃水浴热击90s，后冰浴2-3min。③加入800μL无Amp的LB液体培养基，混匀后，37℃，500r/min摇床振荡培养45min。④将菌液3000r/min，5min离心后，弃上清，留100μL菌液涂板。⑤将菌体重悬后涂布在含Amp（100μL/mL），X-gal和IPTG的平板上，正置培养30min，带菌液完全被培养基吸收后，倒置培养。37℃，14h，随后筛选阳性克隆。⑥用灭菌的牙签挑取白色单菌落，放入含Amp（100μg/mL）的500μL LB培养基中，37℃振荡培养6-8h。

重组质粒验证：①去2μL菌液为模板，用原来的上下游引物进行PCR扩增，PCR扩增体系和扩增条件均同前，用1%的非变性琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如果产物为预期大小的目的条带时，此重组菌落为阳性克隆，否则为阴性。同时加设不加菌液模板的阴性对照。②取已经鉴定为阳性克隆的菌悬液50μL加入1mL含Amp（100μg/mL）LB培养基中，180r/min，37℃振荡培养至对数期后，加入200μL灭菌甘油，混匀后，-20℃保存。③菌液测序委托北京六合华大基因科技股份有限公司进行，所得序列在NCBI上的Blastx进行比对分析，验证克隆片段是否为CD39同源序列。

牙鲆CD39 cDNA中间片段序列如下：

GGGATTGTTGTCATGGTGTCGGTAGCAGTTTTGCAGAACAGGCCTCTCCCTCAAAAGTACAAGTATGGAATCGTGCTGGACGCTGGATCCTCCCACACAGCTCTGTATATCTACGAGTGGCCGGCAGAGAAAGATAACAACACTGGCAGAGTTGAACAGACGCATTCCTGCAAAGTCAAAGGCCCAGGTATTTCCAGCTACGCGTCTGTTCCTAGGAAAGCCGGGGAGTCTCTGAGTGAGTGCATGCAGGAGGCCAGGCAGCGAGTCCCTGAAAAGAGACACAGCGAGACCCCTCTTTACCTGGGTGCTACTGCGGGGATGAGATTACTTAATTTAGAGAACAGCTTGGCGTCAGACAAGGTCTTTCAGGCTGTGGAGGAAGCGCTGCAAAAGTTCCCCTTTTCCTTTCAGGGAGCGAGAATCCTCAGCGGCCAGGAAGAGGGTGCCTTCGGATGGGTTACGGCCAACTACTTGGATGATCGCCTCAAACAGAGCTTGGAAACCAGAGGCGCCCTCGACCTTGGTGGGGCCTCCACTCAAATTAGCTTTGTGTCAGACGATTTTGACGGCTCCGAGTCCCCCGACAACGGCGTCGCCTTCCGACTCTACGGTAATGACTACAACCTGTACACTCACAGCTTCCTGTGTTACGGGAAAGACCAAGTATTACGGATGACGCTGGCAAAACAGACTCAGTCAGGTCCAGTATCCATATCAGATCCCTGTTTCAACCCTGGTTACATCGAGACAAAGAACTACTCCATCGTCTATGACAGCCCCTGCGTGTCCAACATGAAACCCCAGGGAGCTCCTGCCACCTTCACTCACACAGGGAAAGGAAACTTCTCTCAGTGCCAAGAAGTCGTCAAACGCAACTTCAACTTCAAACAGTGCAAATACAGCCAGTGCTCCTTCAATGGTGTC

实施例4

牙鲆CD39 cDNA 3’端的克隆测序：

引物设计：

根据得到的牙鲆CD39 cDNA中间片段序列，使用Primer 5引物设计软件，设计并合成正向引物，以及通用反向引物AP用于3’端巢式PCR。

CD39-3’-F2: 5' –CCAGGGAGCTCCTGCCACCT - 3'

AP： 5'-TCGAATTCGGATCCGAGCTC- 3'

Oligo(dT)₁₆ AP：5'–TCGAATTCGGATCCGAGCTC(T)₁₆- 3'

PCR扩增：

以实施例2所述纯化的牙鲆头肾总RNA为模板，以Oligo(dT)₁₆AP：5' –TCGAATTCGGATCCGAGCTC(T)₁₆- 3'为反转录引物，进行cDNA第一链合成，得到的cDNA第一链，作为3’端巢式PCR扩增的模板，以CD39-3’-F2和AP为上下游引物进行PCR扩增（扩增体系及程序参数同中间片段扩增）。

取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。

克隆测序及重组质粒验证：

克隆测序及重组质粒验证参照实施例3所述中间片段的测序方法。

牙鲆CD39基因cDNA的3’端序列如下：

CCAGGGAGCTCCTGCCACCTTCACTCACACAGGGAAAGGAAACTTCTCTCAGTGCCAAGAAGTCGTCAAACGCAACTTCAACTTCAAACAGTGCAAATACAGCCAGTGCTCTTTCAATGGGGTCTTCCAGCCACGGTTGCAGGGGCCATTTGGGGCCTTCTCTGCATACTACTTTGTGATGAACTTCCTCAATCTGACAGACACATCCATCCCTCTTGAAGCTGTCACTGAGAAGCTATCACGCTACTGTGCTACCCCTTGGAACCAGATAAAGCAGCAGCATCCAGGAGTGAAACTAAAATATCTGGCCGAGTATTGTTTCTCTGGCACGTACATCATCACCCTGCTGACAGAAGGATACAACTTCACATCACAGAACTACCCCAACATAAAATTCATCAAGAAGATAAAAGGCAGTGACGCAGGCTGGACGCTGGGCTACATGTTGAACCTGACCAACATGATTCCAGCCGAGGCCCCTGACTCCCCGCCTCTGCCCCACGCTGGCTACGTCTCTATTGTCACTGTCATCGCAATACTGCTCTTCGTCCTCTTCATCCTCAGCCTGCGTCCCCTCTGGCCCCGGTGCTCCAAACAACCACAGATCATATAAAATATACGCACACACACAAACATATATGATGTATGTTTGAGTAAAGTTGGTGAAGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

实施例5

牙鲆CD39基因 cDNA5’端的克隆测序：

引物设计：

根据得到的CD39中间片段序列，使用Primer 5 引物设计软件，设计反向引物CD39-5’-R1,使用Clontech 5’RACE反转录试剂盒提供的反转录引物进行反转录，使用试剂盒配备的5’端上游引物进行5’端巢式PCR。

CD39-5’-R1：5' －CTGCCAGTGTTGTTATCTTT－ 3'

cDNA第一链合成：

以实施例2所述纯化的牙鲆头肾总RNA作为模板，使用试剂盒提供的反转录引物进行反转录合成cDNA第一链，反转录产物使用RNase H消化残余RNA，得到5’端的cDNA第一链。

PCR扩增：

首先以试剂盒提供的引物UPM和CD39-5’-R1为上下游引物进行第一轮PCR扩增；然后以第一轮PCR扩增产物为模板，以试剂盒提供的引物NUP和CD39-5’-R1为上下游引物进行第二轮PCR扩增。

扩增体系及程序参数如下：

PCR体系见下表：

PCR反应循环参数如下：

94℃ 4min；

94℃ 30sec，72℃ 3min（5个循环）；

94℃ 30sec，65℃ 30sec，72℃ 3min（5个循环）；

94℃ 30sec，63℃ 30sec，72℃ 3min（25个循环）；

72℃ 5min；12℃保温。

取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。

克隆测序及重组质粒验证：

牙鲆CD39 基因cDNA的5’端序列如下：

TGAGAGAGTGAAAGAGGGGGAGACAGAAAGAGAGAGAGCGAGAGAGAGGGGGGGCAAAGAATAGAAAGAGCATTGTGTTGCTGCTGAGAAAGAACCCATGTCCGCACAAAGAGAGATGAAAGAGAAGAACCCCTGGCACACGCCAGTGACCATCATCTTCACTGTGATTGGTGTCATAGCGATTGTTGCCTTGGTGACGGTAGCAGTTTTGCAGAACAGGCCTCTCCCCCAAAAGTACAAGTATGGAATCGTGCTGGACGCTGGATCCTCCCACACAGCTCTGTATATCTACGAGTGGCCGGCAGAGAAAGATAACAACACTGGCAG

实施例6：

牙鲆CD39全长cDNA序列：

使用DNAStar软件包中的EditSeq软件编辑得到牙鲆CD39全长cDNA序列，寻找开放阅读框，翻译成氨基酸序列，如SEQ No.2所述。牙鲆CD39 cDNA编码的蛋白质分子量为55.3KDa，等电点为8.58。

牙鲆CD39基因全长cDNA共1685bp，包括开放阅读框为1494bp，共编码497个氨基酸，含有114bp的5'非翻译区，77bp的3'非翻译区及poly(A)尾巴。这些基因结构特征可以说明所得的cDNA序列为牙鲆CD39基因的全长cDNA序列,序列如下：

TGAGAGAGTGAAAGAGGGGGAGACAGAAAGAGAGAGAGCGAGAGAGAGGGGGGGCAAAGAATAGAAAGAGCATTGTGTTGCTGCTGAGAAAGAACCCATGTCCGCACAAAGAGAGATGAAAGAGAAGAACCCCTGGCACACGCCAGTGACCATCATCTTCACTGTGATTGGTGTCATAGCGATTGTTGCCTTGGTGACGGTAGCAGTTTTGCAGAACAGGCCTCTCCCCCAAAAGTACAAGTATGGAATCGTGCTGGACGCTGGATCCTCCCACACAGCTCTGTATATCTACGAGTGGCCGGCAGAGAAAGATAACAACACTGGCAGAGTTGAACAGACGCATTCCTGCAAAGTCAAAGGCCCAGGTATTTCCAGCTACGCGTCTGTTCCTAGGAAAGCCGGGGAGTCTCTGAGTGAGTGCATGCAGGAGGCCAGGCAGCGAGTCCCTGAAAAGAGACACAGCGAGACCCCTCTTTACCTGGGTGCTACTGCGGGGATGAGATTACTTAATTTAGAGAACAGCTTGGCGTCAGACAAGGTCTTTCAGGCTGTGGAGGAAGCGCTGCAAAAGTTCCCCTTTTCCTTTCAGGGAGCGAGAATCCTCAGCGGCCAGGAAGAGGGTGCCTTCGGATGGGTTACGGTCAACTACTTGGATGATCGCCTCAAACAGAGCTTGGAAACCAGAGGCGCCCTCGACCTTGGTGGGGCCTCCACTCAAATTAGCTTTGTGTCAGACGATTTTGACGGCTCCGAGTCCCCCGACAACGGCGTCGCCTTCCGACTCTACGGTAATGACTACAACCTGTACACTCACAGCTTCCTGTGTTACGGGAAAGACCAAGCATTACGGATGACGCTGGCAAAACAGACTCAGTCAGGTCCAGTATCCATATCAGATCCCTGTTTCAACCCTGGTTACATCGAGACAAAGAACTACTCCATCGTCTATGACAGCCCCTGCGTGTCCAACATGAAACCCCAGGGAGCTCCTGCCACCTTCACTCACACAGGGAAAGGAAACTTCTCTCAGTGCCAAGAAGTCGTCAAACGCAACTTCAACTTCAAACAGTGCAAATACAGCCAGTGCTCTTTCAATGGGGTCTTCCAGCCACGGTTGCAGGGGCCATTTGGGGCCTTCTCTGCATACTACTTTGTGATGAACTTCCTCAATCTGGCAGACACATCCATCCCTCTTGAAGCTGTCACTGAGAAGCTATCACGCTACTGTGCTACCCCTTGGAACCAGATAAAGCAGCAGCATCCAGGAGTGAAACTAAAATATCTGGCCGAGTATTGTTTCTCTGGCACGTACATCATCACCCTGCTGACAGAAGGATACAACTTCACATCACAGAACTACCCCAACATAAAATTCATCAAGAAGATAAAAGGCAGTGACGCAGGCTGGACGCTGGGCTACATGTTGAACCTGACCAACATGATTCCAGCCGAGGCCCCTGACTCCCCGCCTCTGCCCCACGCTGGCTACGTCTCTATTGTCACTGTCATCGCAATACTGCTCTTCGTCCTCTTCATCCTCAGCCTGCGTCCCCTCTGGCCCCGGTGCTCCAAACAACCACAGATCATATAAAATATACGCACACACACAAACATATATGATGTATGTTTGAGTAAAGTTGGTGAAGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

应用实例：

实施例1

牙鲆胞外ATP水解酶CD39 cDNA序列在制备作为实时荧光RT-PCR检测牙鲆疾病防治方面的应用。主要是采用牙鲆CD39 cDNA序列的实时荧光RT-PCR检测：

(1)引物设计：

根据SEQ ID No.1所述牙鲆CD39的全长cDNA序列，使用Primer 5软件设计适用实时荧光RT-PCR检测的特异性引物，引物序列如下：

CD39-q-F: 5' －CCTTCCGACTCTACGGTAATGAC－ 3'

CD39-q-R: 5' －GGATCTGATATGGATACTGGACCT－3'

牙鲆CD39的PCR产物预计长度为127bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光RT-PCR检测：琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示。

同时根据NCBI里提供的牙鲆β-actin的cds序列（EU090804）设计用于实时荧光RT-PCR内对照的引物，引物序列如下：

β-actin-F: 5' －AGGTTCCGTTGTCCCG －3'

β-actin-R: 5' －TGGTTCCTCCAGATAGCAC －3'

β-actin的PCR产物预计长度为150bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光RT-PCR检测时作为内对照扩增。琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示。

实施例2：

采用上述方法检测体外脂多糖(LPS)免疫刺激对牙鲆头肾原代细胞CD39基因表达影响的实验：

（1）近期未施用过疫苗的健康牙鲆（体长45cm-50cm）3尾，于水族箱中暂养后处死，解剖分离头肾组织，经机械分散成单个细胞后进行原代培养，培养过夜后使用20µg/ml LPS刺激细胞，于不同时间段裂解细胞。

（2）总RNA提取与纯化：同实施例2

（3）cDNA第一链合成：使用Promega公司的GoScriptTM Reverse TranscriptionSystem试剂盒，反转录引物使用试剂盒所提供的Random Primer或Oligo (dT)15 Primer，以牙鲆头肾组织或细胞的总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20µL。

（4）实时荧光RT-PCR：荧光RT-PCR采用宝生物公司的SYBR@ Premix Ex TaqTM II试剂盒进行。以上述（2）中合成的cDNA第一链为模板，以引物设计中的CD39-q-F和CD39-q-R、β-actin-F和β-actin-R为特异引物，进行荧光RT-PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值（即每个反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数）取平均数。

荧光RT-PCR扩增反应体系设置如下：

荧光RT-PCR扩增参数设置如下：

95℃ 30 sec；

95℃ 5 sec，60℃ 30 sec （40个循环）；

55℃—95℃ 30 sec（溶解曲线）。

（5）LPS免疫刺激后牙鲆头肾原代细胞中CD39基因的相对表达量计算：

荧光RT-PCR完成后，根据Ct值计算免疫刺激后牙鲆头肾细胞各时间段下的△Ct、2^-(△Ct)、2^-(△△Ct)值，计算方式如下：

△Ct = Ct - Ct内参照（β-actin）

△△Ct = △Ct - △Ct（0时未处理细胞）

以2^-(△Ct)数值表示牙鲆头肾中CD39基因相对于β-actin基因的表达量；以2^-(△△Ct)数值表示牙鲆头肾中CD39基因相对于未处理牙鲆头肾细胞CD39基因的表达量。

2^-(△Ct)数值代表了CD39基因相对于β-actin基因的表达倍数。2^-(△△Ct)数值代表了CD39基因相对于未刺激牙鲆细胞CD39基因的表达倍数。β-actin基因是管家基因，在所有类型的细胞中都进行表达，管家基因的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制的调节，受环境因素影响很小，表达水平较为恒定。因此，管家基因常被用作测定目标基因表达量时的参照基因。本实验中当2^-(△Ct)或2^-(△△Ct)数值越大，表明CD39基因的表达量越高。

图6为细菌脂多糖LPS刺激牙鲆头肾原代细胞后CD39基因的表达变化。LPS刺激8h后，牙鲆CD39基因表达量迅速上调，是未刺激细胞的3.2倍。结果提示头肾原代细胞在受到病原体相关分子模式分子刺激时，CD39基因相对表达量发生变化所需时间较短且差异显著，可能参与了牙鲆的先天免疫应答。

结论：

（1）细菌脂多糖LPS刺激牙鲆头肾原代细胞可以使CD39基因表达显著上调。

（2）CD39基因参与了牙鲆的先天免疫应答。

实施例3

采用上述方法检测牙鲆活体细菌感染实验

（1）近期未使用过疫苗的健康牙鲆（体长8-10cm）50尾，培养于水族箱内，每尾腹腔注射活菌20µL（1x10⁶个爱德华氏菌）继续培养，于不同时间段处死牙鲆解剖分离腮组织。

（2）总RNA提取与纯化：同实施例2。

（3）cDNA第一链合成：同应用实例1。

（4）实时荧光RT-PCR：同应用实例1。

（5）感染牙鲆的头肾组织中CD39基因的相对表达量计算：同应用实例1

图7为腹腔注射爱德华氏菌后牙鲆腮组织中CD39基因的相对表达量。从图中看出爱德华氏菌感染4h后牙鲆腮组织中CD39基因表达量仅为健康牙鲆的0.07倍，远远低于健康牙鲆（即0h的表达量），结果提示CD39基因参与了细菌感染下的牙鲆早期免疫应答，当CD39基因相对表达量降低时，牙鲆可能处于病原感染状态，此时虽然不能从肉眼上观察到牙鲆有任何感染病症。因此CD39基因的表达量在一定程度上反映牙鲆的免疫***活度，可以通过监测牙鲆腮组织CD39基因表达量的变化，初步判断牙鲆是否感染病原，提早采取预防治疗措施，避免事态严重发展造成不可挽回的损失。

实施例4

采用上述方法检测CD39对牙鲆头肾巨噬细胞胞外ATP诱导的细胞免疫因子IL-1β基因表达的调节：

（1）根据NCBI上提供的牙鲆IL-1β（基因序列号BAM66989），设计用于实时荧光RT-PCR的引物。设计引物如下：

IL-1βF：5' －CCTGTCGTTCTGGGCATCAA -3'

IL-1βR：5' -CACCCCGCTGTCCTGCTT -3'

（2）牙鲆头肾巨噬细胞制备过程如下：

1)近期未施用过疫苗的健康牙鲆（体长45cm-50cm）3尾，于水族箱中暂养后处死，解剖分离头肾组织，经机械分散成单个细胞后进行原代培养。

2)将头肾置于灭菌处理的200目不锈钢筛网（约80μm孔径）上，筛网套置于无菌玻璃平皿上，加入5 ml RPMI 1640培养基，用灭菌的杵棒垂直方向轻轻研磨，待组织匀浆滤下，吸取组织研磨液并重新反复研磨至组织匀浆均匀。

3)在15ml离心管中加入4ml 51%的Percoll溶液，缓慢加入稀释3倍的头肾细胞4ml，最后缓慢加入4ml 34%的Percoll溶液。配平离心管，在4℃、3000rpm离心30 min。

4)取出离心管，水平静置，用注射器缓慢吸出51% Percoll溶液和34% Percoll溶液两相界面间的白色细胞悬液，转移至一个新的15ml离心管中；将悬液于4℃、3000rpm 离心5 min，弃上清，加入5ml 无血清的RPMI 1640培养基，将细胞重新悬浮漂洗。

5)4℃、3000rpm 离心5min，弃上清，收集细胞。漂洗数次，至细胞清洗干净。此时获得的细胞即牙鲆头肾巨噬细胞（head kidney macrophages，HKMs）。

6)将获得的HKMs细胞悬浮于RPMI 1640培养基（10% FBS+1% p/s），用血球计数板估算细胞密度，稀释调整至每毫升10⁷个细胞。

7)将HKMs细胞悬液接种于24孔细胞培养板，每孔含5×10⁶个细胞/500μl，于21℃培养箱过夜。

（3）培养过夜后分别使用200μM或1000μM ATP刺激巨噬细胞2h，或同时使用胞外核苷酸酶抑制剂ARL 67156处理细胞，检测细胞因子IL-1β基因表达水平的变化。总RNA提取与纯化：同实施例2。

（4）cDNA第一链合成：同应用实例1。

（5）实时荧光RT-PCR：同应用实例1。

（6）刺激后牙鲆的头肾巨噬细胞中IL-1β基因的相对表达量计算：

荧光RT-PCR完成后，根据Ct值计算牙鲆头肾细胞不同处理下的△Ct、2^-(△Ct)、2^-(△△Ct)值，计算方式如下：

内参照（β-actin）

（0时未处理牙鲆头肾巨噬细胞）

以数值表示牙鲆头肾巨噬细胞中IL-1β基因相对于β-actin基因的表达量；

以数值表示牙鲆头肾巨噬细胞中IL-1β基因相对于未处理牙鲆头肾巨噬细胞IL-1β基因的表达量。

数值代表了IL-1β基因相对于β-actin基因的表达倍数。数值代表了IL-1β基因相对于正常牙鲆头肾巨噬细胞IL-1β基因的表达倍数。β-actin基因是管家基因，在所有类型的细胞中都进行表达，管家基因的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制的调节，受环境因素影响很小，表达水平较为恒定。因此，管家基因常被用作测定目标基因表达量时的参照基因。本实验中当数值越大，表明IL-1β基因的表达量越高。

图8为CD39抑制剂ARL 67156处理牙鲆头肾巨噬细胞对胞外ATP诱导的IL-1β基因表达的相对变化，从图中看出，与未刺激的正常细胞相比，不同浓度ATP 刺激牙鲆头肾巨噬细胞均可导致IL-1β基因表达量上调；当CD39酶活性被其特异抑制剂ARL 67156抑制时，胞外ATP诱导的IL-1β基因表达量显著升高。结果提示，牙鲆胞外ATP水解酶CD39对胞外ATP诱导的促炎症细胞因子IL-1β基因表达具有重要负调控作用，是一个可用于牙鲆疾病防治的重要潜在靶标基因。

结论：

（1）牙鲆CD39被其抑制剂ARL 67156抑制时，可以导致胞外ATP诱导的细胞因子IL1-1β基因表达显著上调。

实施例5

采用上述方法检测牙鲆CD39对胞外ATP诱导的牙鲆头肾巨噬细胞活性氧（ROS）生成的调节作用：

（1）牙鲆头肾巨噬细胞制备过程同实施例4。

（2）采用CD39抑制剂ARL 67156处理牙鲆头肾巨噬细胞2h，以抑制牙鲆CD39酶活性，此后，用1000μM ATP刺激头肾巨噬细胞，分别于ATP刺激5min、10min、20min、30min后测定细胞ROS生成变化。

（3）ROS测定具体步骤如下：

1)实验前，将所有细胞全部转移至EP管中，1000g离心5min，弃上清。

2)将配置好的新鲜培养基加入到细胞中，轻轻吹打混匀，对照组每毫升培养基加50μM DCFH，实验组每毫升培养基中加入50μM DCFH和ATP（最终浓度为1000μM），于培养箱中孵育。

3)处理相应的时间后，1000g离心5min，弃上清。

4)细胞用PBS洗涤三次，每次1000g离心5min。

5)用PBS重悬细胞，在激发波长500nm条件下，测定发射波长530nm处的荧光强度。

如图9所示，1000μM ATP刺激牙鲆头肾巨噬细胞可以显著诱导细胞产生ROS；当牙鲆CD39酶活性被ARL 67156抑制，ATP刺激15min后，ATP+ARL 67156实验组比ATP刺激组细胞的ROS产量明显升高。因此，ATP刺激条件下、抑制CD39酶活性能够显著促进牙鲆头肾巨噬细胞胞外ATP 诱导的ROS产生。

结论：

（1）ARL 67156抑制牙鲆CD39酶活性，可以导致牙鲆头肾巨噬细胞胞外ATP诱导的活性氧生成显著升高。

（2）牙鲆胞外核苷酸酶CD39对牙鲆促炎症细胞因子基因表达、先天免疫因子的合成具有重要调节作用，是一个可用于牙鲆疾病防治的重要潜在靶标基因。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津师范大学

<120> 一种编码牙鲆胞外ATP水解酶CD39 的cDNA全长序列及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1668

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgagagagtg aaagaggggg agacagaaag agagagagcg agagagaggg ggggcaaaga 60

atagaaagag cattgtgttg ctgctgagaa agaacccatg tccgcacaaa gagagatgaa 120

agagaagaac ccctggcaca cgccagtgac catcatcttc actgtgattg gtgtcatagc 180

gattgttgcc ttggtgacgg tagcagtttt gcagaacagg cctctccccc aaaagtacaa 240

gtatggaatc gtgctggacg ctggatcctc ccacacagct ctgtatatct acgagtggcc 300

ggcagagaaa gataacaaca ctggcagagt tgaacagacg cattcctgca aagtcaaagg 360

cccaggtatt tccagctacg cgtctgttcc taggaaagcc ggggagtctc tgagtgagtg 420

catgcaggag gccaggcagc gagtccctga aaagagacac agcgagaccc ctctttacct 480

gggtgctact gcggggatga gattacttaa tttagagaac agcttggcgt cagacaaggt 540

ctttcaggct gtggaggaag cgctgcaaaa gttccccttt tcctttcagg gagcgagaat 600

cctcagcggc caggaagagg gtgccttcgg atgggttacg gtcaactact tggatgatcg 660

cctcaaacag agcttggaaa ccagaggcgc cctcgacctt ggtggggcct ccactcaaat 720

tagctttgtg tcagacgatt ttgacggctc cgagtccccc gacaacggcg tcgccttccg 780

actctacggt aatgactaca acctgtacac tcacagcttc ctgtgttacg ggaaagacca 840

agcattacgg atgacgctgg caaaacagac tcagtcaggt ccagtatcca tatcagatcc 900

ctgtttcaac cctggttaca tcgagacaaa gaactactcc atcgtctatg acagcccctg 960

cgtgtccaac atgaaacccc agggagctcc tgccaccttc actcacacag ggaaaggaaa 1020

cttctctcag tgccaagaag tcgtcaaacg caacttcaac ttcaaacagt gcaaatacag 1080

ccagtgctct ttcaatgggg tcttccagcc acggttgcag gggccatttg gggccttctc 1140

tgcatactac tttgtgatga acttcctcaa tctggcagac acatccatcc ctcttgaagc 1200

tgtcactgag aagctatcac gctactgtgc taccccttgg aaccagataa agcagcagca 1260

tccaggagtg aaactaaaat atctggccga gtattgtttc tctggcacgt acatcatcac 1320

cctgctgaca gaaggataca acttcacatc acagaactac cccaacataa aattcatcaa 1380

gaagataaaa ggcagtgacg caggctggac gctgggctac atgttgaacc tgaccaacat 1440

gattccagcc gaggcccctg actccccgcc tctgccccac gctggctacg tctctattgt 1500

cactgtcatc gcaatactgc tcttcgtcct cttcatcctc agcctgcgtc ccctctggcc 1560

ccggtgctcc aaacaaccac agatcatata aaatatacgc acacacacaa acatatatga 1620

tgtatgtttg agtaaagttg gtgaagggaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1668

<210> 2

<211> 497

<212> PRT

<213> 牙鲆CD39氨基酸序列

<400> 2

Met Ser Ala Gln Arg Glu Met Lys Glu Lys Asn Pro Trp His Thr Pro

1 5 10 15

Val Thr Ile Ile Phe Thr Val Ile Gly Val Ile Ala Ile Val Ala Leu

20 25 30

Val Thr Val Ala Val Leu Gln Asn Arg Pro Leu Pro Gln Lys Tyr Lys

35 40 45

Tyr Gly Ile Val Leu Asp Ala Gly Ser Ser His Thr Ala Leu Tyr Ile

50 55 60

Tyr Glu Trp Pro Ala Glu Lys Asp Asn Asn Thr Gly Arg Val Glu Gln

65 70 75 80

Thr His Ser Cys Lys Val Lys Gly Pro Gly Ile Ser Ser Tyr Ala Ser

85 90 95

Val Pro Arg Lys Ala Gly Glu Ser Leu Ser Glu Cys Met Gln Glu Ala

100 105 110

Arg Gln Arg Val Pro Glu Lys Arg His Ser Glu Thr Pro Leu Tyr Leu

115 120 125

Gly Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu Asn Leu Glu Asn Ser Leu Ala

130 135 140

Ser Asp Lys Val Phe Gln Ala Val Glu Glu Ala Leu Gln Lys Phe Pro

145 150 155 160

Phe Ser Phe Gln Gly Ala Arg Ile Leu Ser Gly Gln Glu Glu Gly Ala

165 170 175

Phe Gly Trp Val Thr Val Asn Tyr Leu Asp Asp Arg Leu Lys Gln Ser

180 185 190

Leu Glu Thr Arg Gly Ala Leu Asp Leu Gly Gly Ala Ser Thr Gln Ile

195 200 205

Ser Phe Val Ser Asp Asp Phe Asp Gly Ser Glu Ser Pro Asp Asn Gly

210 215 220

Val Ala Phe Arg Leu Tyr Gly Asn Asp Tyr Asn Leu Tyr Thr His Ser

225 230 235 240

Phe Leu Cys Tyr Gly Lys Asp Gln Ala Leu Arg Met Thr Leu Ala Lys

245 250 255

Gln Thr Gln Ser Gly Pro Val Ser Ile Ser Asp Pro Cys Phe Asn Pro

260 265 270

Gly Tyr Ile Glu Thr Lys Asn Tyr Ser Ile Val Tyr Asp Ser Pro Cys

275 280 285

Val Ser Asn Met Lys Pro Gln Gly Ala Pro Ala Thr Phe Thr His Thr

290 295 300

Gly Lys Gly Asn Phe Ser Gln Cys Gln Glu Val Val Lys Arg Asn Phe

305 310 315 320

Asn Phe Lys Gln Cys Lys Tyr Ser Gln Cys Ser Phe Asn Gly Val Phe

325 330 335

Gln Pro Arg Leu Gln Gly Pro Phe Gly Ala Phe Ser Ala Tyr Tyr Phe

340 345 350

Val Met Asn Phe Leu Asn Leu Ala Asp Thr Ser Ile Pro Leu Glu Ala

355 360 365

Val Thr Glu Lys Leu Ser Arg Tyr Cys Ala Thr Pro Trp Asn Gln Ile

370 375 380

Lys Gln Gln His Pro Gly Val Lys Leu Lys Tyr Leu Ala Glu Tyr Cys

385 390 395 400

Phe Ser Gly Thr Tyr Ile Ile Thr Leu Leu Thr Glu Gly Tyr Asn Phe

405 410 415

Thr Ser Gln Asn Tyr Pro Asn Ile Lys Phe Ile Lys Lys Ile Lys Gly

420 425 430

Ser Asp Ala Gly Trp Thr Leu Gly Tyr Met Leu Asn Leu Thr Asn Met

435 440 445

Ile Pro Ala Glu Ala Pro Asp Ser Pro Pro Leu Pro His Ala Gly Tyr

450 455 460

Val Ser Ile Val Thr Val Ile Ala Ile Leu Leu Phe Val Leu Phe Ile

465 470 475 480

Leu Ser Leu Arg Pro Leu Trp Pro Arg Cys Ser Lys Gln Pro Gln Ile

485 490 495

Ile

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccttccgact ctacggtaat gac 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggatctgata tggatactgg acct 24

Claims

1.牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因cDNA序列，该基因cDNA全长1685bp，含有1494bp的开放阅读框，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；其编码497个氨基酸，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因序列在制备作为牙鲆疾病防治靶标基因方面的应用。

3.权利要求1所述牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因序列在制备作为牙鲆疾病实时荧光RT-PCR检测方面的应用。

4.权利要求1所述牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因序列在制备作为牙鲆疾病防治方面的应用。

5.用于检测牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因cDNA序列的特异性引物，其特征在于：

正向引物：5’－CCTTCCGACTCTACGGTAATGAC-3’ SEQ ID NO.3

反向引物：5’- GGATCTGATATGGATACTGGACCT-3’ SEQ ID NO.4。