CN102199199A - 膜定位葡萄球菌肠毒素a及其基因序列 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种膜定位葡萄球菌肠毒素A(SEAtm)及其基因序列，该膜定位葡萄球菌肠毒素A一方面能够使表达的SEA有效的锚定与细胞表面，充分发挥超抗原的作用，另一方面可以大大地降低SEA的毒性和免疫耐受现象的出现，提高了其在抗肿瘤中的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种膜定位葡萄球菌肠毒素A及其基因序列。
背景技术
超抗原(superantigen，SAg)是Janice White等在1989年研究了金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin，SE)对T淋巴细胞具有很强的刺激作用后提出的免疫学新概念。目前报道的可用于临床抗肿瘤作用的SAg只有SE，而SE是由金黄色葡萄球菌分泌的一组具有超抗原活性的细菌毒素，SE是目前已知的人淋巴细胞最强的刺激剂和最有力的细胞因子诱生剂。是第一个被发现的超抗原，也是目前研究最多、临床使用最为广泛的SAg。SE主要包括有金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)、金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)、金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)。尽管超抗原具有强大的诱生抗肿瘤效应，但目前只有个别超抗原进入临床试验阶段，主要原因是超抗原对机体的毒副作用较大。仅需极微量(1～10ng/mL)的超抗原就可以激活大量T细胞，分泌多种足量的细胞因子，使机体免疫调节紊乱，导致一些急性和慢性疾病的发生，如毒素中毒综合征(高热、皮疹和休克)、自身免疫性疾病(风湿性关节炎、风湿热、川奇病和非特异性皮炎)等。同时，超抗原诱发的超抗原依赖的细胞介导的细胞毒作用(Superantigen-dependent cell-mediated cytotoxicity，SDCC)对表达MHC II类分子的正常细胞具有很强的杀伤作用。因此不解决SEA对机体的毒副作用，SEA就难以进入临床应用。
发明内容
针对以上提出的问题，本发明的目的在于，构建一种膜定位葡萄球菌肠毒素A(SEAtm)基因，所表达的膜定位葡萄球菌肠毒素A能够有效地定位于细胞膜表面。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
本发明一方面涉及一种膜定位葡萄球菌肠毒素A(SEAtm)，所述膜定位葡萄球菌肠毒素A含有如下氨基酸序列的片段：
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V。
本发明另一方面还涉及一种膜定位葡萄糖菌肠毒素A的基因，其含有如下基因序列：
0 GCCTCGAGATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTT
60 CCACTGGTGACAGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATGAAAAAGATTTGCGAAAAAAGTCTG
120 AATTGCAGGGAACAGCTTTAGGCAATCTTAAACAAATCTATTATTACAATGAAAAAGCTA
180 AAACTGAAAATAAAGAGAGTCACGATCAATTTTTACAGCATACTATATTGTTTAAAGGCT
240 TTTTTACAGATCATTCGTGGTATAACGATTTATTAGTAGATTTTGATTCAAAGGATATTG
300 TTGATAAATATAAAGGGAAAAAAGTAGACTTGTATGGTGCTTATTATGGTTATCAATGTG
360 CGGGTGGTACACCAAACAAAACAGCTTGTATGTATGGTGGTGTAACGTTACATGATAATA
420 ATCGATTGACCGAAGAGAAAAAAGTGCCGATCAATTTATGGCTAGACGGTAAACAAAATA
480 CAGTACCTTTGGAAACGGTTAAAACGAATAAGAAAAATGTAACTGTTCAGGAGTTGGATC
540 TTCAAGCAAGACGTTATTTACAGGAAAAATATAATTTATATAACTCTGATGTTTTTGATG
600 GGAAGGTTCAGAGGGGATTAATCGTGTTTCATACTTCTACAGAACCTTCGGTTAATTACG
660 ATTTATTTGGTGCTCAAGGACAGTATTCAAATACACTATTAAGAATATATAGAGATAATA
720 AAACGATTAACTCTGAAAACATGCATATTGATATATATTTATATACAAGTGGATCCGGTG
780 GAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCCT
840 GGGCCATTACCTTAATCTCAGTAAATGGAATTTTTGTGATATGCTGCCTGACCTACTGCT
900 TTGCCCCAAGATGCAGAGAGAGAAGGAGGAATGAGAGATTGAGAAGGGAAAGTGTACGCC
960 CTGTATAAAGATCTGC
本发明另外一方面还涉及一种载体或质粒，其特征在于上述基因片段。
本发明还涉及上述载体或质粒在细菌、生物体内所表达的产物。
本发明另外一方面还涉及构建构建载体的方法，其特征在于包括如下步骤：
1、扩增葡萄糖菌肠毒素A基因全长片段；
2、扩增CD80基因；
3、使用中性linker将SEA和CD80跨膜区序列融合；
4、将融合的片段克隆到载体中。
在本发明的一个优选实施例中，上述载体构建方法所使用的中性linker片段为：GGGGSGGGGSGGGGS。
在本发明的一个优选实施例中，上述序列融合优选采用重叠引物进行融合。
在本发明的一个优选实施例中，融合时所使用的重叠引物为：
SEA-Forward：
GCTCTAGAGCATGAAAAAAACAGCAT TTAC；
SEA-Reverse：
GGGATCCACTTGTATATAAATATATATCAAT；
CD80-Reverse：
CCGCTCGAGTTATACAGGGCGTACACT；
CD80-Forward1：
GGTGG CTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCC；
CD80-Forward2：
CGGGATCCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT。
本发明还涉及膜定位葡萄糖菌肠毒素A和/或其基因片段在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的膜定位葡萄球菌肠毒素A具有以下优点：SEAtm一方面能够使表达的SEA有效的锚定与细胞表面，充分发挥超抗原的作用，另一方面可以大大地降低SEA的毒性和免疫耐受现象的出现。转染的pIRES2-SEAtm质粒能够在293T细胞中高效表达，同时利用免疫荧光技术检测到SEAtm，能够定位到细胞表面。
附图说明
图1：左侧图：免疫荧光技术检SEAtm，显示其特意的定位于细胞表面；中间图：转染到细胞中的pIRES2-EGFP-SEAtm中绿色荧光蛋白发出的荧光，证明细胞中本质粒成功转染；右侧图：使用染核的染料复染细胞，并将不同激发波长下的图片重叠，即可看到膜定位的SEAtm，复染的细胞核，以及细胞整体发出的EGFP绿色荧光。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
1.SEA基因的克隆及表达载体的构建
用酚-氯仿抽提法提取产SEA标准葡萄球菌FRI 100的基因组DNA，采用SEA全长引物进行PCR反应，根据gene bank的SEA序列设计SEA(D227A)的引物，引物序列为上游：5’-CGGGATCCAAGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATGAAAAAG-3’；下游：5’-CGGAATTCTTAACTTGTATATAAATATATATCAATATG-3’。引物分别包括了BamH I和EcoR I酶切位点，其中下游引物长度38个碱基，包含终止码，其中下游引物，包含一个使SEA全长基因的752位碱基由A突变为C的点突变，从而使SEA蛋白的227位氨基酸残基由D变为A。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s；50℃退火30s；68℃延伸1min，进行30个循环。目的片段克隆到载体T-easy中，进行电泳和测序。电泳结果显示从标准葡萄球菌FRI 100中克隆出了长度为700bp的SEA基因全长片段，其测序结果与GenBank公布的SEA序列完全相同。
2.CD80基因的克隆及表达载体的构建
根据gene bank中CD80基因cDNA序列设计CD80上下游引物CD80-F：GCCATGGGCCACACACGGAGGCAGGGAACATC，CD80-R：ACCCGGGTTATACAGGGCGTACACTTTCCCTTG，引物中横线引入NcoI和SmaI酶切位点。用酚P氯仿抽提法提取的人肝癌cDNA为模板，Taq酶为聚合酶用相应引物扩增，PCR反应条件为：94℃预变性5min，(94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min)共30个循环，然后72℃延伸10min，4℃保存。目的片段克隆到载体T-easy中，进行电泳和测序，电泳结果显示从人肝癌cDNA中克隆出了长度为815bp的CD80基因全长片段，其测序结果与GenBank公布的人CD80基因cDNA序列完全相同。
3.CD80穿膜区的构建：
采用重叠引物设计法，设计了两条上游引物，在CD80跨膜区序列的上游，引入中性linker(GGGGSGGGGSGGGGS)，将SEA与CD80tm连接通过linker将SEA和人的CD80跨膜区序列融合，构建了能够表达在细胞膜表面的跨膜型SEA(SEAtm)。所使用的引物序列如下：
SEA-Forward：
GCTCTAGAGCATGAAAAAAACAGCAT TTAC；
SEA-Reverse：
GGGATCCACTTGTATATAAATATATATCAAT；
CD80-Reverse：
CCGCTCGAGTTATACAGGGCGTACACT；
CD80-Forward1：
GGTGG
CTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCC；
CD80-Forward2：
CGGGATCCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGG
T。
采用Reverse引物先后与Forward1和Forward2引物进行PCR反应，以携带SEA和CD80cDNA的质粒为模板，分别进行PCR扩增SEA基因和linker-CD80tm。扩增SEA基因时，采用的退火温度和延伸温度分别为50℃和68℃，反应体系在94℃变性5min后，再进行30个循环的扩增，条件为94℃30s，50℃50s及68℃1min，最后再于72℃延伸7min。扩增CD80TM时，将延伸时间缩短为30s，其余的条件不变。所有PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳分离后，切下含目的片段的凝胶，按试剂盒说明书回收DNA产物。采用将2个基因片段分别进行双酶切，克隆到pLXSN的Xho I和Bgl II位点，转化感受态菌DH5α，在含有氨苄青霉素(100mg/L)、X-gal(20g/L)和IPTG(200g/L)的LB平板上，于37℃培养15h，再挑去克隆进行鉴定。
4.膜定位SEA序列的构建
根据GeneBank中免疫球蛋白Lambda链引导序列及标准金黄色葡萄球菌FRI1000的SEA基因序列，分别设计上、下游引物：
tmSEA-F01：
GCCTCGAGATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAG；
tmSEA-F02：
GCAGATCTTTATACAGGGCGTACACTTTCCC TTCTC；
tmSEA-R：
GCAGATCTTTATACAGGGCGTACACTTTCCCTTC TC，
分别包含XhoI和Bgl II酶切位点。
以KS-tmSEA作为模板，首先采用tmSEA-F01和SEA-R引物克隆SEA片段。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环，然后72℃延伸10min，4℃保存。在基因序列的5’端加入kappa链的leading sequence：
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTT，将获得的片段采用Xho I和Bgl II双酶切，克隆到pIRES2-EGFP的Xho I和BamH I位点。
5.SEAtm表达的免疫荧光检测
将清洁、灭菌处理的盖玻片铺于12孔板的底部，接种有融合基因转录的肿瘤细胞。20～24h待细胞长成单层后，取出盖玻片，用0.01mol/LPBS冲洗两遍，再以40g/L多聚甲醛固定30min，用间接免疫荧光法进行细胞染色，一抗为小鼠抗SEAmAb(Sigma公司)，二抗为Cy3标记的羊抗鼠IgG(Invitrogen公司)。采用Hoechst 33258衬染细胞核，以500mL/L缓冲甘油封片，于荧光显微镜下观察并照相，确定膜定位SEA(SEAtm)的细胞定位。结果发现SEA能够定位到细胞表面，荧光检测见过见附图1。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种膜定位葡萄糖菌肠毒素A，其特征在于其含有如下氨基酸序列的片段：
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2.一种膜定位葡萄糖菌肠毒素A的基因片段，其特征在于其含有如下基因序列：
0 GCCTCGAGATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTT
60 CCACTGGTGACAGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATGAAAAAGATTTGCGAAAAAAGTCTG
120 AATTGCAGGGAACAGCTTTAGGCAATCTTAAACAAATCTATTATTACAATGAAAAAGCTA
180 AAACTGAAAATAAAGAGAGTCACGATCAATTTTTACAGCATACTATATTGTTTAAAGGCT
240 TTTTTACAGATCATTCGTGGTATAACGATTTATTAGTAGATTTTGATTCAAAGGATATTG
300 TTGATAAATATAAAGGGAAAAAAGTAGACTTGTATGGTGCTTATTATGGTTATCAATGTG
360 CGGGTGGTACACCAAACAAAACAGCTTGTATGTATGGTGGTGTAACGTTACATGATAATA
420 ATCGATTGACCGAAGAGAAAAAAGTGCCGATCAATTTATGGCTAGACGGTAAACAAAATA
480 CAGTACCTTTGGAAACGGTTAAAACGAATAAGAAAAATGTAACTGTTCAGGAGTTGGATC
540 TTCAAGCAAGACGTTATTTACAGGAAAAATATAATTTATATAACTCTGATGTTTTTGATG
600 GGAAGGTTCAGAGGGGATTAATCGTGTTTCATACTTCTACAGAACCTTCGGTTAATTACG
660 ATTTATTTGGTGCTCAAGGACAGTATTCAAATACACTATTAAGAATATATAGAGATAATA
720 AAACGATTAACTCTGAAAACATGCATATTGATATATATTTATATACAAGTGGATCCGGTG
780 GAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCCT
840 GGGCCATTACCTTAATCTCAGTAAATGGAATTTTTGTGATATGCTGCCTGACCTACTGCT
900 TTGCCCCAAGATGCAGAGAGAGAAGGAGGAATGAGAGATTGAGAAGGGAAAGTGTACGCC
960 CTGTATAAAGATCTGC
3.一种载体或质粒，其特征在于含有如权利要求2所述的基因片段。
4.权利要求3所述载体或质粒在细菌、生物体内所表达的产物。
5.构建权利要求3所述载体的方法，其特征在于包括如下步骤：
扩增葡萄糖菌肠毒素A基因全长片段；
扩增CD80基因；
使用中性linker将SEA和CD80跨膜区序列融合；
将融合的片段克隆到载体中。
6.根据权利要求5所述的载体构建方法，其特征在于所述的中性linker片段为：GGGGSGGGGSGGGGS。
7.根据权利要求5或6所述的载体构建方法，其特征在于：采用重叠引物进行融合。
8.根据权利要求7所述的载体构建方法，其特征在于重叠引物为：
SEA-Forward：
GCTCTAGAGCATGAAAAAAACAGCATTTAC；
SEA-Reverse：
GGGATCCACTTGTATATAAATATATATCAAT；
CD80-Reverse：
CCGCTCGAGTTATACAGGGCGTACACT；
CD80-Forward1：
GGTGG CTCTGGCGGTGGCGGATCGGATAACCTGCTCCCATCC；
CD80-Forward2：
CGGGATCCGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT。
9.权利要求1所述的膜定位葡萄糖菌肠毒素A在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.权利要求2所述的膜定位葡萄糖菌肠毒素A的基因片段在制备抗肿瘤药物中的应用。
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|---|---|---|---|
| CN2011100845606A CN102199199A (zh) | 2011-04-06 | 2011-04-06 | 膜定位葡萄球菌肠毒素a及其基因序列 |
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Publications (1)
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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- 2011-04-06 CN CN2011100845606A patent/CN102199199A/zh active Pending
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
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Application publication date: 20110928 |