DE102004054536A1

DE102004054536A1 - Multimodal veränderte Zellen als zellulare Darreichungsformen für aktive Substanzen und als diagnostische Zellpartikel

Info

Publication number: DE102004054536A1
Application number: DE102004054536A
Authority: DE
Inventors: Andreas Dr. Voigt; Hans Dr. Bäumler
Original assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin; Capsulution Nanoscience AG
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin; Capsulution Nanoscience AG
Priority date: 2004-11-06
Filing date: 2004-11-06
Publication date: 2006-05-11
Also published as: US20060270030A1; WO2006048321A1

Abstract

In der vorliegenden Anmeldung wird gezeigt, dass sowohl aktive Substanzen als auch diagnostisch wirksame Substanzen simultan in biologische Zellen und deren Oberflächen eingebracht werden können. Diese multimodal veränderten Zellen lassen sich mit modernen bildgebenden Verfahren in vivo und in vitro wieder finden. Zusätzlich zu dem diagnostischen und Wirkstoffträgerprinzip können sie als zielgenaue Darreichungsform der aktiven Substanzen dienen.

Description

Detailierte Beschreibung
Aktueller Stand
In den letzten Jahren hat die räumliche und zeitliche Auflösung Bild gebender diagnostischer Verfahren sehr große Fortschritte gemacht. An der Spitze dieser Verfahren stehen tomographische Verfahren wie Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) sowie Positronemissionstomographie (PET). Es gelingt mit diesen Verfahren, Krankheitsherde im Organismus mit hoher Genauigkeit nachzuweisen und zu lokalisieren. Die pharmakologischen Wirkstoffe werden jedoch im Allgemeinen immer noch systemisch und nicht zielgenau dargereicht. Einer der Gründe dafür besteht darin, dass die diagnostischen Prinzipien und die Prinzipen der Darreichung der Wirkstoffe auf völlig unabhängigen Verfahren und verschiedenartigen Substanzen basieren. [Bildgebende Systeme für die medizinische Diagnostik, Heinz Morneburg, Wiley-VCH Verlag 1995; CT, EBT, MRT und Angiographie, Roland C. Bittner, u. a. Urban & Fischer 2003; Drug Delivery Systems (Pharmacology and Toxicology: Basic and Clinical Aspects), Vasant V. Ranade, Mannfred A. Hollinger CRC Press 2003]

Es gibt eine Fülle von Untersuchungen, aktive Substanzen in biologische Zellen, z.B. Erythrozyten einzuschließen [Red Blood Cells as Carriers for Drugs, J.R. DeLoach und U. Sprandel (Herausgeber), Bibliotheca Haematologica No. 51, S. Karger, Basel, 1985; Red Blood Cells as Carriers for Drugs, C.Ropars, M. Chassaigne und C. Nicolau (Herausgeber), Advances in the Biosciences, Volume 67, Pergamon Press, Oxford, New York, 1987; Drug, enzyme and peptide delivery using erythrocytes as carriers, C. Gutiérrez Millán et al., Journal of Controlled Release, 95/1, 2004, 27-49]. Die Wirkstoffaufnahme kann dabei so gestaltet werden, dass ein hoher Anteil der Zellen überlebt. Damit ist die Zurückführbarkeit der Zellen in das biologische System gewährleistet. Zu den bisher eingekapselten aktiven Substanzen zählen auch solche, die man heute zu diagnostischen Zwecken verwenden könnte. In der vorliegenden Anwendung konnte gezeigt werden, dass sowohl Wirkstoffe als auch diagnostisch wirksame Substanzen simultan in die Zellen eingebracht werden können. Überraschenderweise konnten diese multimodal veränderten Zellen mit modernen Bild gebenden Verfahren wieder gefunden werden. Damit konnte die der Erfindung zu Grunde liegende Idee realisiert werden, das diagnostische und das Darreichungsprinzip miteinander zu verknüpfen und dieses nachzuweisen. Zusätzlich zu dem diagnostischen und Wirkstoffträgerprinzip lassen sich die Zellen für eine zielgenaue Darreichung der aktiven Substanzen modifizieren.

Ausführungsbeispiele

(1) Beladung der Erythrozyten mit Magnetit – MRT
Blut vom Mensch oder Tier wird mit einem Antikoagulanz versetzt. Danach werden die Erythrozyten von den übrigen Blutbestandteilen durch Zentrifugation getrennt. Das Plasma und die übrigen Blutbestandteile werden entfernt. Die Erythrozyten werden in physiologischer Salzlösung. gewaschen. Die Erythrozyten werden in eine die Magnetitpartikel enthaltende hypotone und gekühlte Lösung resuspendiert. Diese Suspension wird ca. 1 Stunde moderat auf einem Rollschüttler bewegt. Nach der Inkubation der Erythrozyten in der Magnetitlösung wird die Suspension zentrifugiert, um die Erythrozyten von der Suspensionslösung zu trennen. Diese wird entfernt und die Erythrozyten werden in physiologischer Lösung bei Raumtemperatur gewaschen. Die Menge des Magnetits, welches sich in den Erythrozyten befindet kann mittels MRT oder über eine chemische Eisenbestimmung quantifiziert werden. Die mit Magnetit beladenen Erythrozyten können in die Blutbahn des Spenders zurückgegeben werden, wenn unter sterilen Bedingungen gearbeitet wurde.
(2) Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen (Antikörper) – Nachweis mittels Durchflusszytometer
Blutzellen, wie z.B. Erythrozyten, werden, wie im Ausführungsbeispiel (1) beschrieben, gewaschen. Anschließend werden die Erythrozyten in eine Salzlösung resuspendiert, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Polymere enthält. Diese Polymere adsorbieren an die Erythrozytenoberfläche. Anschließend wird eine geringe Menge dieser Suspension in den Messkanal eines geeigneten Durchflusszytometers eingebracht, so dass jede einzelne Zelle aufgrund der durch die Laserstrahlung angeregten Fluoreszenz detektiert werden kann. Nichterythrozytäre Bestandteile der Suspension werden auf Grund des fehlenden Fluoroszenzsignals als solche erkannt. Das Ausführungsbeispiel (2) kann mit Ausführungsbeispiel (1) kombiniert werden.
(3) Beladung der Erythrozyten mit Endoxan – Nachweis mittels Phagozytose
Erythrozyten, aufbereitet wie im Ausführungsbeispiel (1) beschrieben, werden in eine, z.B. die aktive Substanz Endoxan enthaltende, hypotone und gekühlte Lösung resuspendiert. Diese Suspension wird ca. 1 Stunde moderat auf einem Rollschüttler bewegt. Nach Inkubation der Erythrozyten in dieser Lösung wird die Suspension zentrifugiert, um die Erythrozyten von der Suspensionslösung zu trennen. Diese wird entfernt und die Erythrozyten werden in physiologischer Lösung bei Raumtemperatur gewaschen. Anschließend werden die mit Endoxan beladenen Erythrozyten in eine Blutzellkultur gegeben. Die in dieser Kultur befindlichen Monozyten und Granulozyten erkennen die behandelten Erythrozyten und phagozytieren diese. Die Menge der phagozytierten Zellen kann mit Hilfe eines Testes erfolgen, der es gestattet, die lebenden Mono- und Granulozyten von den abgestorbenen zu unterscheiden.
Das Ausführungsbeispiel (3) kann mit den Ausführungsbeispielen (1) und (2) kombiniert werden.
Insbesondere können simultan Magnetit und aktive Substanz, z.B. Endoxan, in einem Präparationsverlauf in die Erythrozyten eingeschlossen werden. Die Präparation der Ausführungsbeispiele (1) und (3) sind bis auf die einzuschließende Substanz identisch. Das gilt selbstverständlich nur für miteinander verträgliche Substanzen.
(4) Beschichtung von Erythrozyten mit Polymeren
Die Beschichtung nativer Erythrozyten mit geeigneten Polymeren kann unter Nutzung reiner Adsorption oder unter Nutzung der elektrostatischen Wechselwirkung der Polymere mit der Oberfläche der Erythrozyten erfolgen. Welcher Prozess dominiert, hängt von der Art der verwendeten Polymere ab. Erythrozyten, behandelt wie in den Ausführungsbeispielen (1) oder (3), werden in eine Polymere enthaltende Salzlösung gebracht. Da die Erythrozyten empfindlich auf pH – Änderungen und Salzkonzentrationsänderungen reagieren, was zur Zerstörung derselben führen kann, sind Bedingungen einzuhalten, die von den physiologischen Bedingungen nicht zu stark abweichen. Bei Raumtemperatur werden die Erythrozyten in der Suspension unter moderater Bewegung ca. 30 min inkubiert. Anschließend werden sie zentrifugiert und die Suspensionslösung von den Erythrozyten getrennt. Vorsichtiges mehrmaliges Waschen der Erythrozyten in geeigneten Salzlösungen entfernt nicht gebundene Polymere. Diesem Schritt können weitere Beschichtungsschritte nach der gleichen Vorgehensweise folgen. Der Erfolg der Beschichtung kann dadurch festgestellt werden, dass z.B. das veränderte Zetapotential der Erythrozyten bestimmt wird. Ausführungsbeispiel (4) kann mit den Ausführungsbeispielen (1), (2), und (3) kombiniert werden.

Claims

Menschliche oder tierische Zelle verändert durch • Beladung mit mindestens einer aktiven Substanz und • Beladung mit mindestens einer diagnostischen Substanz und nach der Veränderung erfolgende gerichtete Zurückführung der veränderten Zelle in den menschlichen oder tierischen Körper als zelluläre Darreichungsform für die aktiven Substanzen und als diagnostisches Zellpartikel.
Veränderte Zellen nach Anspruch 1 zusätzlich in der Oberfläche modifiziert zum Zwecke der spezifischen Wechselwirkung mit dem biologischen Milieu des Zielorganismus oder zum Zwecke der Markierung mit fluoreszenten oder optischen oder magnetischen oder enzymatischen oder diagnostischen Markern.
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1 und 2 sind Blutzellen, wie z.B. Erythrozyten, Thrombozyten, neutrophile, eosinophile und basophile Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten, hämatopoetische Stamm- und Progenitorzellen.
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1 und 2 sind außerdem Zellen anderer Organe des menschlichen und tierischen Organismus.
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1 bis 4 sind ebenfalls genetisch transformierte Zellen.
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1-5 als Darreichungsform enthaltend die aktiven Substanzen in Form von • Molekülen • Nanopartikeln • Kolloiden • Mizellen • Molekülkomplexen und -aggregaten • Emulsionen • Liposomen und Vesikeln • Layer-by-Layer-Partikeln • Zellbestandteilen
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1-6 als Darreichungsform enthaltend die Substanzen in einer Form, die durch Wechselwirkung mit körpereigenen Substraten aktiviert wird.
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1-7 als Darreichungsform enthaltend radioaktive Substanzen.
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1-8 als Darreichungsform enthaltend magnetisierbare oder superparamagnetisierbare nanopartikuläre Substanzen.
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1-8 als Darreichungsform enthaltend aktive Substanzen, die freigesetzt werden durch • passive Vorgänge wie z.B. Diffusion, Permeation, Osmose • getriggerte Vorgänge, die z.B. eine Veränderung der Permeabilität, eine Lysis, ein Erwärmung, eine mechanische Zerstörung, einen Resonanzvorgang bewirken • Einwirkung von Ultraschall, Laserlicht, magnetischen Feldern, magnetischen Feldpulsen, elektrischen Feldern, elektrischen Feldpulsen • Wechselwirkung mit anderen Zellen wie z.B. Phagozytose oder Endozytose, Aktivierungsmechanismen
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1-10 als diagnostische Partikel enthaltend Substanzen, die nachweisbar sind mittels • Kernspinresonanz bzw. Kernspintomographie (MRT) • Röntgenstrahlen bzw. Röntgencomputertomographie (CT) • Positronemissionstomographie (PET) • Fluoreszenzmesstechniken • Lasertechniken • Ultraschalltechniken • Infrarottechniken • Weiterer bildgebender Verfahren
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1-11 als diagnostische Partikel enthaltend diagnostizierbare Substanzen wie z.B. • dreiwertige Kationen • mehrwertige Ionen • Lumineszenz- bzw. Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzfarbstoffe • IR-Absorber • Magnetische und paramagnetische Substanzen wie z.B. Magnetit • Polariserbare Substanzen • Röntgenkontrastmittel • Ultraschallkontrastmittel
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1-12 zusätzlich in der Oberfläche modifiziert durch • PEGylierung • Kovalente Anbindung von Peptiden, Oligonukleotiden, Oligosacchariden und hybride Formen derselben • Adsorption von Mono- und Multischichten, wie Polyelektrolytmultischichten • Antikörper und Antigene • Inkorporation von Zellmembranbestandteilen und Zellvesikeln • Veränderung der Lipidmatrix • Änderung ihrer mechanischen Eigenschaften • Adsorption von ionischen und molekularen Substanzen • Immobilisierung von Enzymen • Einbau von Rezeptoren • Substanzen, die eine Veränderung der Permeabilitäts- und Stoffaustauscheigenschaften bewirken
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1-13 als Darreichungsform für die aktiven Substanzen und als diagnostische Zellpartikel in isolierten Organen und Organsystemen
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1-13 als Darreichungsform für die aktiven Substanzen und als diagnostische Zellpartikel in Zellkulturen
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1-13 als Darreichungsform für die aktiven Substanzen und als diagnostische Zellpartikel in Bioreaktoren.
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1-13 als Darreichungsform für die aktiven Substanzen und als diagnostische Zellpartikel für in vitro Untersuchungen
Veränderte Zellen nach den Ansprüchen 1 bis 17 als Darreichungsform für die aktiven Substanzen und als diagnostische Zellpartikel hergestellt gemäß der jeweils geltenden Regeln und Auflagen der guten Labor- und Herstellungspraxis (GLP, GMP) in den Gebieten der Pharmazie, Medizin, Biotechnologie und Technik