KR20150036274A - 항-siglec-15 항체 - Google Patents

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KR20150036274A
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매튜 스튜이블
질 버나드 트렘블리
트라이안 수리
안나 엔. 모라이티스
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Abstract

Siglec-15에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이 본원에 기재된다. 이들 항체 또는 항원 결합 단편은 파골세포의 분화를 억제하는 능력 및/또는 파골세포의 골 재흡수 활성을 억제하는 능력을 가질 수 있다. 항-Siglec-15 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하는 조성물 및 세포가 또한 본원에 개시된다. 항-Siglec-15 항체는 또한 골 손실, 또는 골 질병의 치료에 유용할 수 있다. 골 손실 또는 골-관련 질병의 검출 또는 진단을 위한 방법이 또한 기재된다.

Description

항-SIGLEC-15 항체{ANTI-SIGLEC-15 ANTIBODIES}
발명의 분야
본 발명은 Siglec-15에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 특히 인간으로의 투여에 적합화된 항-Siglec-15 항체 및/또는 인간 IgG1 불변 영역의 아미노산을 포함하는 항-Siglec-15 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질병 또는 질환의 치료 및/또는 진단을 위한 항-Siglec-15 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 항체는, 예를 들어, Siglec-15의 활성 또는 기능을 억제하거나 단백질을 발현하는 세포에 치료제를 전달하기 위해 이용될 수 있다.
발명의 배경
골(bone)은 골의 구조적, 기계적 및 생화학적 온전성 및 인간 신체의 무기질 항상성을 뒷받침하는데 필요한 기능적으로 별개의 세포 집단으로 구성된 동적 결합조직이다. 관련된 주요 세포 유형은 골 형성을 담당하고 골질량을 유지시키는 골모세포, 및 골 재흡수를 담당하는 파골세포를 포함한다. 골모세포 및 파골세포는 골 재형성(bone remodelling)으로 언급되는 동적 과정에서 작용한다. 상기 세포의 프로제니터로부터 상기 세포의 발달 및 증식은 골 미세환경에서 생성된 성장인자 및 사이토카인의 네트워크뿐만 아니라 전신 호르몬에 의해 제어된다. 골 재형성은 개체의 생애에 걸쳐 진행되고, 건강한 골 조직 및 무기질 항상성의 유지에 필요하다. 상기 과정은 주로 평형 상태로 유지되고, 전신 호르몬, 펩티드 및 다운스트림 신호전달 경로 단백질, 국소 전사인자, 사이토카인, 성장인자 및 기질 재형성 유전자의 복잡한 상호작용에 의해 제어된다.
골 재형성 과정에서 발생하는 간섭 또는 불균형은 골질량에서의 순수 감소를 특징으로 하는 가장 흔한 골격 장애인 골격 질병을 발생시킬 수 있다. 골질량에서의 상기 감소의 주요 원인은 파골세포 수 및/또는 활성의 증가이다. 상기 질병의 가장 흔한, 아마도 가장 공지된 질병은 폐경의 발생 후에 여성에서 특히 발생하는 골다공증이다. 사실, 골다공증은 장년기 및 노인 여성에서 골격 골절의 가장 유의한 기초 원인이다. 에스트로겐 결핍이 폐경후 골다공증에서 한 요인으로 강하게 관련되어 있으나, 40년여년 전에 프로스트(Frost)(Frost H.M. 1964)에 의해 처음 기재된 바와 같이 재형성이 골격 전체에 걸쳐 별개의 패킷(packet)으로 발생하는 국소 조절되는 과정이라는 오랜 증거가 존재한다.
골 재형성은 별개의 패킷으로 발생하므로, 국소적으로 생성된 호르몬 및 효소는 골 재흡수의 개시 및 정상 재형성 과정을 위해 전신 호르몬보다 더욱 중요할 수 있다. 이러한 국소 조절은 골모세포 및 파골세포가 작용하는 미세환경에서 골모세포 및 파골세포에 의해 매개된다. 예를 들어, 파골세포는 골 기질에 부착되고, 이들과, 구겨진 형태의 경계면(ruffled border) 주위의 액틴의 고리에 의해 형성된 밀봉 구역에 의해 경계가 정해진 골 표면 사이에, 별개의 구획을 형성한다. 다수의 작은 소포가 골 기질로 효소를 전달하고, 부분적으로 소화된 골 기질을 내재화시킨다. 밀봉 구역 내의 미세환경은 리소솜 효소의 존재가 풍부하며, 신체의 정상 생리학적 pH에 비해 매우 산성이다. 구겨진 형태의 경계면의 막은 또한 RANKL에 대한 수용체인 RANK, 및 대식세포-집락 자극 인자(M-CSF) 수용체뿐만 아니라 파골세포를 신속히 비활성화시킬 수 있는 칼시토닌 수용체를 발현하며, 상기 RANK 및 대식세포-집락 자극 인자(M-CSF) 수용체 둘 모두는 파골세포 분화를 담당한다(Baron, R. 2003).
억제 및 자극의 복잡한 패턴에서, 성장호르몬, 인슐린-유사 성장인자-1, 성 스테로이드, 갑상샘 호르몬, 칼시오트로픽 호르몬(calciotrophic hormone), 예를 들어, PTH 및 프로스타글란딘 E2, 다양한 사이토카인, 예를 들어, 인터루킨-1 베타, 인터루킨-6, 및 종양 괴사 인자-알파, 및 1,25-디하이드록시비타민 D(칼시트리올)가 골 재형성 과정에서 협동적으로 작용한다(Jilka et al. 1992; Poli et al. 1994; Srivastava et al. 1998; de Vemejoul 1996).
따라서, 상기 전문화된 세포에 의해 생성된 독특한 국소 환경은 다른 조직에서 발현되지 않는 독특한 유전적 서열 및/또는 다른 조직에서 발현된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 스플라이스 변이체의 발현으로 인한 것이 당연하다. 파골세포 활성에 특이적인 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 이들의 변이체 및 유도체의 분리 및 확인은 재형성 과정의 더 명백한 이해를 가능케 할 수 있고, 골 재형성과 관련된 질병 상태의 치료를 위해 조직 특이적 치료 표적을 제공한다.
골 재형성과 관련된 많은 질병은 불충분하게 이해되어 있고, 일반적으로 치료가능하지 않거나 단지 제한된 범위로 치료가능하다. 예를 들어, 골관절염은 동통을 경감시키고 병에 걸린 관절이 변형되는 것을 방지하는 것에 대한 치유 및 치료 집중이 이루어지지 않음에 따라 치료하기가 어렵다. 비-스테로이드 항-염증 약물(NSAID)이 일반적으로 동통을 경감시키기 위해 사용된다.
골다공증에 대해 미국에서 사용하기 위해 FDA에 의해 승인된 현재 의약의 또 다른 예는 골 파괴를 방지하는 골흡수억제제(anti-resorptive agent)이다. 에스트로겐 대체 요법이 골흡수억제제의 한 예다. 다른 것으로는 알렌드로네이트(alendronate)(포사맥스(Fosamax) - 비포스포네이트 골흡수억제제), 리세드로네이트(risedronate)(악토넬(Actonel) - 비스포스포네이트 골흡수억제제), 랄록시펜(raloxifene)(에비스타(Evista) - 선택적 에스트로겐 수용체 조정자(SERM)), 칼시토닌(칼시마르(Calcimar) - 호르몬), 및 부갑상샘 호르몬/테리파라타이드(teriparatide)(포르테오(Forteo) - 칼슘 대사를 조절하는 것을 돕는 인간 호르몬, 부갑상샘 호르몬의 합성 형태)를 포함한다.
비스포스포네이트, 예를 들어, 알렌드로네이트 및 리세드로네이트는 골의 표면에 영구적으로 결합하고, 파골세포 활성을 간섭한다. 이는 골모세포가 재흡수 속도를 앞지르도록 한다. 가장 흔한 부작용은 구역, 복통 및 느슨한 장운동이다. 그러나, 알렌드로네이트는 또한 식도의 자극 및 염증, 및 일부 경우에 식도의 궤양을 야기시키는 것으로 보고되어 있다. 리세드로네이트는 알렌드로네이트와 화학적으로 상이하며, 식도 자극을 야기시킬 가능성이 덜하다. 그러나, 특정 음식, 칼슘, 철 보충물, 비타민 및 무기질, 또는 칼슘, 마그네슘 또는 알루미늄을 함유하는 제산제가 리세드로네이트의 흡수를 감소시킴으로써 유효성의 상실을 발생시킬 수 있다.
랄록시펜 및 다른 SERMS(예를 들어, 타목시펜)의 가장 흔한 부작용은 일과성 열감(hot flash)이다. 그러나, 랄록시펜 및 다른 호르몬 대체 요법이 심부정맥혈전증 및 폐 색전증, 심장혈관 질병 및 암을 포함하여 혈병의 위험을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
칼시토닌은 골 밀도를 증가시키고, 골을 강화시키는데 있어서 에스트로겐 및 다른 골흡수억제제만큼 효과적이지 않다. 주사되거나 비내 분무되는 칼시토닌의 흔한 부작용은 구역 및 홍조이다. 환자는 비내 자극, 코감기, 또는 코피가 발생할 수 있다. 주사가능한 칼시토닌은 주사 부위에서의 국소 피부 발적, 피부 발진, 및 홍조를 야기시킬 수 있다.
골 재형성을 수반하는 여러 장애 또는 질병 상태 사이의 연관을 증명하는 상황은 파제트병을 치료하기 위해 FDA에 의해 처음으로 승인된 에티드로네이트(etidronate)(디드로넬(Didronel))의 사용이다. 파제트병은 골 약화 및 동통을 야기시키는 골의 무질서하고 촉진된 재형성을 특징으로 하는 골 질병이다. 디드로넬은 '오프-라벨(off-label)'로 사용되며, 일부 연구에서 확립된 골다공증을 갖는 폐경후 여성에서 골 밀도를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이는 또한 장기 스테로이드 의약(예를 들어, 프레드니손 또는 코르티손)을 필요로 하는 환자에서 골 손실을 예방하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 디드로넬의 고용량 또는 지속적 사용은 골연화증으로 언급되는 또 다른 골 질병을 야기시킬 수 있다. 골다공증과 같이, 골연화증은 약한 골의 골절 위험을 증가시킬 수 있다. 골연화증에 대한 우려 및 골절률의 감소와 관련한 아직까지의 충분한 연구의 결핍으로 인해, 미국 FDA는 골다공증의 치료에 있어서 디드로넬을 아직 승인하지 않았다.
골다공증 요법은 골 손실의 속도를 감소시키는 골흡수억제제에 주로 집중되어 왔으나, 최근의 요법은 단지 골 무기질 밀도를 유지시키거나 골 무기질 밀도의 악화를 늦추는 것 대신에 골 무기질 밀도를 증가시키는데 있어서 가망성을 나타낸다. 골다공증 초기 단계 파이프라인은 주로 새로운 치료 부류 내의 약물 후보, 특히 카텝신 K 억제제, 오스테오프로테게린 및 칼실리틱스(calcilytics) 만 아니라 새로운 비스포스포네이트로 구성된다. 이들 중 일부는 새로운 약물 개발 유전체학 프로그램이 골 생물학의 더 깊은 이해를 기초로 하여 개발되고, 장기적으로 골 장애의 치료의 국면을 변화시킬 잠재성을 갖는 예이다.
본 발명은 특히 인간으로의 투여를 위해 적합화된 항-Siglec-15 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특히 인간 IgG1 불변 영역의 아미노산을 포함하는 항-Siglec-15 항체(예를 들어, 인간화, 키메라 또는 비-인간화 항체를 포함함)에 관한 것이다. 일부 예에서, 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 인간 Siglec-15 단백질 특유의 것이며, 다른 종의 상응하는 Siglec-15 단백질에서는 발견되지 않는(예를 들어, Siglec-15 오쏠로그(ortholog) 또는 추정 오쏠로그에서 발견되지 않음) 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 예에서, 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 인간 Siglec-15 단백질 및 마우스 Siglec-15 단백질에 공통으로 존재하는 에피토프에 결합할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 인간 Siglec-15 및 다른 오쏠로그 또는 추정 오쏠로그에 공통으로 존재하는 에피토프에 결합할 수 있다(예를 들어, Angata et al., 2007 참조).
본 발명은 암 또는 골 손실(예를 들어, 골-관련 질병 또는 파골세포 분화 또는 활성에서의 증가와 관련된 심각하거나 과도한 골 손실)의 진단, 예후, 및 치료(예방을 포함함)를 위한 Siglec-15에 특이적인 항체의 용도를 기재한다. 특히, 본 발명은 파골세포의 분화를 억제하고/하거나 골 재흡수를 억제하기 위한 항-Siglec-15 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 파골세포의 활성이 증가되는 다양한 다른 유형의 질병의 진단, 예방 및 치료를 위한 상기 항체의 용도에 관한 것이다.
시알산-결합 면역글로불린-유사 렉틴(Siglecs)은 시알산과 상호작용하는 능력을 갖는 면역글로불린(Ig) 상과의 일원이다(McMillan and Crocker, 2008; Crocker et al., 2007). 시알산 및 C2-세트 Ig 도메인의 다양한 일원에 결합하는 아미노-말단 V-세트 Ig 도메인을 특히 나타내는 특정 구조적 특징을 모두 공유하는 여러 Siglec 패밀리 일원이 존재한다. 이들 막 수용체는 일반적으로 매우 특이적 방식으로 발현되며, 패밀리 일원 중 많은 일원이 조혈 세포에서 발현된다(McMillan and Crocker, 2008). 이들 단백질은 세포-세포 상호작용을 촉진하고, 신호전달을 매개하고, 글리칸의 인지를 통해 면역 기능을 조절하는 것으로 생각된다(Crocker et al., 2007). 시알산은 세포의 표면 상의 복잡한 당컨쥬게이트의 말단에 통상적으로 위치된 9-탄소 당이다. 이들은 매우 다양한 단백질 및 지질에 부착될 수 있다(McMillan and Crocker, 2008).
Siglec-15는 Siglec-14에 대해 높은 상동성을 갖는 가장 최근에 기재된 Siglec 패밀리 일원 중 하나이다(Angata et al., 2007). 상기 저자는 Siglec-15가 시알릴 Tn 구조에 우선적으로 결합하고, DAP12 및 DAP10과 상호작용하는 것을 보고하였다. 상기 상호작용의 기능적 유의성은 공지되어 있지 않지만, Siglec-15가 활성화 기능을 가질 가능성이 제시되었다(Angata et al., 2007). Siglec-15의 포유동물에서의 잠재적 역할에 대한 상기 예비적 통찰에도 불구하고, 파골세포 분화의 새로운 조절인자를 발견하기 위한 스크린의 일부로서 서열이 확인되어, 상기 단백질의 생물학적 기능의 이해에서의 중요한 진전이 제공되었다(Sooknanan et al. 2007). 이러한 특허 출원에서, 파골세포형성(osteoclastogenesis)의 마우스 모델에서 RNA 간섭에 의한 Siglec-15 전사물의 약화가 RANKL 치료에 반응하여 전구체의 분화의 유의한 감소를 발생시키는 것이 밝혀졌다. 유사한 결과가 인간 파골세포에서 개시되었다. 추가로, 상기 개시에 제시된 연구는 또한 세포막에서의 Siglec-15의 국소화가 파골세포 분화에서의 이의 기능에 필요한 것을 밝혀내었다. 추가로, 최근의 간행물은 표면 당컨쥬게이트의 말단에서의 시알산의 존재가 적절한 파골세포 분화에 필요하고, 파골세포 전구체 세포의 융합에서 중요할 수 있음을 밝혀내었다(Takahata et al., 2007). 상기 마지막 관찰은 파골세포 분화에서 시알산 결합과 Siglec-15의 발현 사이의 직접적인 기능적 연관을 발생시키며, Siglec-15가 파골세포 전구체의 초기 분화 프로그램에서 일정한 역할을 하는 것을 강하게 암시하였다.
따라서, Siglec-15의 발현 프로파일, 파골세포 분화 동안의 이의 강한 유도성, 막의 표면에서의 이의 국소화, 및 이의 구조적 특징이 모두 모노클로날 항체를 이용한 세포 표면에서의 상기 단백질의 표적화의 실행가능성에 기여한다. 파골세포를 표적화하는 모노클로날 항체-기반 요법의 유일한 다른 예는 RANKL에 특이적인 인간 모노클로날 항체인 데노수맙(denosumab)이다(Ellis et al. 2008). 본 발명은 골 손실의 검출 또는 치료에서, 특히 골-관련 질병의 상황 또는 증가된 파골세포 분화 또는 활성의 상황에서 파골세포 분화 및/또는 골 재흡수의 차단제로서의 항-Siglec-15 항체 또는 항원 결합 단편의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암의 검출 또는 치료에서의 항체 또는 항원 결합 단편의 용도에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 골 손실 또는 암의 치료(예방을 포함함), 검출 및 진단에 유용한 항체 및 항원 결합 단편뿐만 아니라 키트에 관한 것이다. 인간화된 항-Siglec-15 항체가 특히 고려된다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 골 손실 또는 골 재흡수의 치료에 유용할 수 있다.
항체 및 항원 결합 단편은 또한 분화된 파골세포 또는 분화를 겪는 파골세포의 검출에 특히 유용할 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편은 추가로 골 손실의 검출 및 진단에 유용할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 골 손실을 치료하는데 유용할 수 있다.
항체 및 항원 결합 단편은 또한 Siglec-15를 발현하는 암 세포 및 특히 Siglec-15의 높은 발현을 갖는 암의 검출 또는 진단에 특히 유용할 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편은 추가로 난소암, 신장암, 중추신경계의 암, 전립선암, 흑색종, 유방암, 폐암 또는 결장암의 검출에 특히 유용할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 추가로 난소암, 신장암, 중추신경계의 암, 전립선암, 흑색종, 유방암, 폐암 또는 결장암을 치료하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 Siglec-15(SEQ ID NO.:2)의 아미노산 20 내지 259 또는 Siglec-15 변이체(예를 들어, SEQ ID NO.:4를 포함하는, 예를 들어, SEQ ID NO.:12와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 변이체)의 상응하는 영역에 결합할 수 있다. 더욱 특히, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 Siglec-15(SEQ ID NO.:2)의 아미노산 49 내지 165 또는 Siglec-15 변이체(예를 들어, SEQ ID NO.:4를 포함하는, 예를 들어, SEQ ID NO.:12와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 변이체)의 상응하는 영역에 결합할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, SEQ ID NO.:2의 위치 99에 위치된 아르기닌(R99)을 포함하는 에피토프를 포함하는, 인간 Siglec-15에 독특한 에피토프에 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다.
항체 또는 항원 결합 단편은 폴리펩티드의 파골세포 분화 활성 및/또는 골 재흡수를 억제할 수 있다.
마우스 Siglec-15에 비해 인간 Siglec-15에 우선적으로 결합하는 항체가 마우스 파골세포보다 인간 파골세포의 분화 또는 활성을 억제하는데 있어서 더욱 효과적일 수 있음이 본원에서 이해되어야 한다. 인간 Siglec-15에서 발견되나 마우스 Siglec-15에서 발견되지 않는, 에피토프에 결합하는 항체는 인간 파골세포의 분화 또는 활성을 억제할 수 있으나, 마우스 파골세포의 분화 또는 활성은 억제하지 않을 수 있다. 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이의 Siglec-15 단백질은 인간 Siglec-15 아미노산의 단백질과 매우 유사하다. 항-Siglec-15 항체의 효능은 따라서 원숭이에서 또는 원숭이로부터 분리된 세포를 이용하여 시험될 수 있다. 따라서, 효능 검정은 항체의 특이성(예를 들어, 인간, 원숭이 및/또는 마우스 Siglec-15에 대한 특이성)에 따라 적합화될 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 항체 또는 항원 결합 단편은 파골세포 분화 및/또는 골 재흡수를 촉진하는 폴리펩티드의 능력을 간섭할 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 항체 또는 항원 결합 단편은 종양 성장을 촉진하는 폴리펩티드의 능력을 간섭할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 분화된 파골세포로의 파골세포 전구체 세포의 분화를 간섭(억제)할 수 있다.
본 발명에 따르면, 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 하이브리드 항체 또는 이의 단편일 수 있다.
본 발명에 의해 포함되는 항체의 특정 예는 인간화 가변 도메인을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 사슬(경쇄 또는 중쇄)을 갖는 항체를 포함하는 한편, 다른 가변 도메인은 인간화되지 않을 수 있어(예를 들어, 마우스 가변 도메인), 하이브리드 항체를 발생시킬 수 있다. 본 발명에 의해 포함되는 항체의 다른 예는 인간화 가변 도메인을 포함하는 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 갖는 항체를 포함한다.
본 발명의 다른 특정 구현예는 비-인간 아미노산(예를 들어, 마우스 항체 대응물로부터의 하나 이상의 아미노산)이 재도입된 인간화 항체를 포함한다.
따라서, 본 발명은 Siglec-15에 특이적으로 결합할 수 있는 비-인간 모 항체(예를 들어, 마우스 항체)의 인간화 항체를 제공한다.
한 구현예에서, 하이브리드 항체 또는 이의 단편은, 예를 들어, 비-인간 항체의 경쇄 가변 영역 및 인간화 항체의 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 하이브리드 항체 또는 이의 단편은, 예를 들어, 비-인간 항체의 중쇄 가변 영역 및 인간화 항체의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 인간화 또는 하이브리드 항체는 비-인간 상보성 결정 영역 아미노산 잔기 및 자연 인간 항체의 인간 프레임워크 영역 아미노산 잔기를 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역 및 상보적 경쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 인간화 또는 하이브리드 항체는 비-인간 상보성 결정 영역 아미노산 잔기 및 자연 인간 항체의 인간 프레임워크 영역 아미노산 잔기를 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 및 상보적 중쇄를 포함할 수 있다.
용어 "하이브리드 항체"는 적어도 하나의 인간화 또는 인간 중쇄 또는 경쇄 가변 영역(Siglec-15에 대한 친화성을 가짐) 및 적어도 하나의 비-인간 중쇄 또는 경쇄 가변 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼로부터 유래됨)을 포함하는 항체를 나타낸다.
비-인간 모 항체의 인간화를 위해 선택되는 자연 인간 항체는 비-인간 모 항체의 (모델화된) 가변 영역의 3차원 구조와 유사한(이와 중첩가능한) 3차원 구조를 갖는 가변 영역을 포함할 수 있다. 이와 같이, 인간화 또는 하이브리드 항체는 비-인간 모 항체의 3차원 구조와 유사한 3차원 구조를 가질 가능성이 더 크다.
본 발명에 따르면, 인간화 또는 하이브리드 항체 경쇄의 인간 프레임워크 영역 아미노산 잔기는 자연 인간 항체 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된다. 인간화 목적을 위해 선택된 자연 인간 항체의 경쇄 프레임워크 영역은, 예를 들어, 비-인간 모 항체의 경쇄 프레임워크 영역과 적어도 70%의 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 인간화 목적을 위해 선택된 자연 인간 항체는 이의 경쇄 상보성 결정 영역 내에 비-인간 모 항체의 경쇄 상보성 결정 영역의 아미노산의 수와 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산의 수를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 인간화 또는 하이브리드 항체 경쇄의 인간 프레임워크 영역 아미노산 잔기는 비-인간 모 항체의 경쇄 프레임워크 영역과 적어도 70, 75, 80, 85%(또는 그 초과)의 동일성을 갖는 자연 인간 항체 경쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된다.
또한, 본 발명에 따르면, 인간화 또는 하이브리드 항체 중쇄의 인간 프레임워크 영역 아미노산 잔기는 비-인간 모 항체의 중쇄 프레임워크 영역과 적어도 70%의 동일성을 갖는 자연 인간 항체 중쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된다. 바람직하게는, 인간화 목적을 위해 선택된 자연 인간 항체는 이의 중쇄 상보성 결정 영역 내에 비-인간 모 항체의 중쇄 상보성 결정 영역의 아미노산의 수와 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산의 수를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 인간화 또는 하이브리드 항체 중쇄의 인간 프레임워크 영역 아미노산 잔기는 비-인간 모 항체의 중쇄 프레임워크 영역과 적어도 70, 75, 80, 85%의 동일성을 갖는 자연 인간 항체 중쇄 프레임워크 영역으로부터 유래된다.
본 발명의 구현예에서, 인간화 또는 하이브리드 항체의 중쇄 가변 영역은 따라서 적어도 하나의 비-인간 상보성 결정 영역을 포함할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 다른 구현예에서, 인간화 또는 하이브리드 항체의 중쇄 가변 영역은 적어도 2개의 비-인간 상보성 결정 영역 또는 심지어 3개의 비-인간 상보성 결정 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 적어도 하나의 비-인간 상보성 결정 영역을 포함할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 또 다른 추가 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 적어도 2개의 비-인간 상보성 결정 영역 또는 심지어 3개의 비-인간 상보성 결정 영역을 포함한다.
따라서, 인간화 항체는 유리하게는 비-인간 항체의 6개 모두의 CDR을 포함할 수 있다. 이가 인간화 항체의 경우에서, 12개 모두의 CDR이 비-인간 항체로부터 유래될 수 있다.
불변 영역 또는 이의 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 및 특히 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래될 수 있다. 더욱 특정한 구현예에서, 불변 영역은 IgG2(예를 들어, 인간 IgG2)로부터 유래될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 불변 영역은 IgG1(예를 들어, 인간 IgG1)으로부터 유래될 수 있다.
경쇄의 불변 영역은 람다 불변 영역 또는 카파 불변 영역일 수 있다.
특히 유용할 수 있는 항원 결합 단편은, 예를 들어, FV (scFv), Fab, Fab' 또는 (Fab')2를 포함한다.
항체 또는 항원 결합 단편은 분리된 포유동물 세포(하이브리도마 세포 제외)에서 또는 이로부터 생성될 수 있거나, 하이브리도마 세포에서 생성될 수 있다. 분리된 포유동물 세포의 예시적 구현예는 인간 세포이다.
본 발명의 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 파골세포 전구체 세포의 분화된 인간 파골세포로의 분화를 간섭(억제)할 수 있다.
예시적 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 일차 인간 파골세포 전구체 세포의 분화된 인간 파골세포로의 분화를 간섭(억제)할 수 있다.
본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 또한 골세포암 및 유방암, 결장암, 폐암, 난소암, 전립선암, 및 신장암 세포뿐만 아니라 흑색종 세포 및 중추신경계의 암세포를 포함하는 Siglec-15를 발현하거나 과발현하는 세포를 일반적으로 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
더욱 특히, 항체 및 항원 결합 단편은 분화를 겪는 파골세포를 표적화하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 이의 한 양태에서 SEQ ID NO:2에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, 분리되거나 실질적으로 정제된 항체 또는 항원 결합 단편)을 제공한다.
이와 같이, 본 발명은 SEQ ID NO:2에 대한 특이성을 갖는 진단 및/또는 치료 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 또한, 본 발명의 항체와 동일한 에피토프 특이성을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편이 본 발명에 의해 포함된다. 후보 항체는, 본원에 기재된 항체가 결합하는 에피토프에 이러한 후보 항체가 결합하는지의 여부를 결정하고/하거나, 에피토프에 결합하는 것으로 공지된 항체 또는 항원 결합 단편과의 경쟁 검정을 수행함으로써 확인될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편과 경쟁할 수 있는 분리된 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 이용한 치료 방법 및 검출 방법을 제공한다.
용어 "항체"는 온전한 항체, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 나타낸다. 용어 "항체"는 또한 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체를 포함한다. 인간 항체는 보통 가변 영역 및 불변 영역을 각각 포함하는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어진다. 경쇄 가변 영역은 프레임워크 영역의 측면에 존재하는 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3로 본원에서 확인된 3개의 CDR을 포함한다. 중쇄 가변 영역은 프레임워크 영역의 측면에 존재하는 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3로 본원에서 확인된 3개의 CDR을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "항원-결합 단편"은 항원(예를 들어, SEQ ID NO:2 또는 이의 변이체)에 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 나타낸다. 항체의 항원-결합 기능은 온전한 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR), 예를 들어, VH CDR3를 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되나, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 일가 분자(단쇄 Fv(scFv)로 공지됨, 예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조)를 형성하는 단일 폴리펩티드 사슬로 제조되는 것을 가능케 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 연결될 수 있다. 상기 단쇄 항체는 또한 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 또한, 항원-결합 단편은, (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩티드에 융합되는 결합 도메인 폴리펩티드(예를 들어, 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 링커 펩티드를 통해 경쇄 가변 영역에 융합된 중쇄 가변 영역), (ii) 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역, 및 (iii) CH2 불변 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역을 포함하는, 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질을 포함한다. 힌지 영역은 하나 이상의 시스테인 잔기를 세린 잔기로 대체하여 이합체화를 방지함으로써 변형될 수 있다. 이러한 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질은 US 2003/0118592호 및 US 2003/0133939호에 추가로 개시되어 있다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 수득되고, 상기 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
통상적인 항원 결합 부위는 경쇄 면역글로불린 및 중쇄 면역글로불린의 쌍형성에 의해 형성된 가변 영역으로 구성된다. 항체 가변 영역의 구조는 매우 일관되며, 매우 유사한 구조를 나타낸다. 이들 가변 영역은 통상적으로 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명된 3개의 과가변 영역 사이에 존재하는 비교적 상동성인 프레임워크 영역(FR)으로 구성된다. 항원 결합 단편의 전체 결합 활성은 종종 CDR의 서열에 의해 지정된다. FR은 종종 최적 항원 결합을 위해 CDR의 3차원의 적절한 위치결정 및 정렬에서 일정한 역할을 한다.
본 발명의 항체 및/또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, 마우스, 래트 또는 임의의 다른 포유동물 또는 다른 공급원으로부터 유래될 수 있고, 예를 들어, 재조합 DNA 기술을 통해 유래될 수 있다.
항체 또는 항원 결합 단편은 골 손실의 치료에서 치료적 용도를 가질 수 있다.
호르몬 차단 요법(Hormone ablative therapy)(특정 호르몬의 생성을 중지시키는 약물을 이용한 치료)은 골 손실로 인한 골절의 위험을 증가시킨다. 유방암을 갖는 여성에 대한 애쥬번트 호르몬 요법은 에스트로겐 억제로 인해 골 손실을 촉진시키고 골절 위험을 증가시키는 것으로 밝혀진 항에스트로겐(예를 들어, 타목시펜) 및 아로마타제 억제제를 수반한다. 추가로, 전립선암을 갖는 많은 남성은 이들의 암이 진행함에 따라 안드로겐 박탈 요법(ADT)(예를 들어, 생식샘자극호르몬-방출 호르몬[GnRH] 효능제)으로 치료된다. GnRH 효능제는 전립선 암세포에 대한 성장인자로서 작용하는 테스토스테론의 생성을 억제한다. 그러나, 이러한 치료는 또한 골 질량을 감소시키고, 이에 따라 골다공증으로 인한 골절의 위험을 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 암 치료와 관련된 골 손실의 치료에서 치료적 용도를 가질 수 있다.
항체 또는 항원 결합 단편은 또한 암의 치료에서 치료적 용도를 가질 수 있다. 예시적 구현예에서, 항체 또는 단편은 암 치료 유도성 골 손실에서 치료적 용도를 가질 수 있다. 또 다른 예시적 구현예에서, 항체 또는 단편은 골 질병, 예를 들어, 파골세포의 골 분해 활성이 증가하는 질환과 관련된 골 손실에서 치료적 용도를 가질 수 있다. 특정 예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO:2를 발현하고 ADCC를 매개함으로써 면역학적 반응을 유도하는 세포와 상호작용할 수 있다. 다른 예에서, 항체 및 단편은 SEQ ID NO:2와 이의 자연 리간드의 상호작용을 차단할 수 있다. 또 다른 예에서, 항체 및 단편은 단백질의 내재화 및/또는 이의 분해를 유도할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 골 손실, 골 재흡수의 치료에 유용하거나, 골 손실 또는 골 재흡수와 관련된 질병의 치료에 유용한 또 다른 약물과 함께 투여(예를 들어, 동시, 순차적 투여)될 수 있다.
골 손실을 억제할 수 있는 항체 및 항원 결합 단편은 2011년 4월 14일에 WO2011/041894호로 공개된 국제 출원 번호 PCT/CA2010/001586호, 및 2007년 2월 13일에 WO2007/093042호로 공개된 PCT/CA2007/000210호에 기재되어 있으며, 상기 국제 출원의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다.
항체 컨쥬게이트
항상 필요한 것은 아니지만, 검출 또는 치료 목적을 위해, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 검출가능한 모이어티(즉, 검출 또는 진단 목적을 위함) 또는 치료 모이어티(치료 목적을 위함)와 컨쥬게이션될 수 있다.
검출 목적을 위해, 컨쥬게이션되지 않은 항체(일차 항체)가 항원으로의 결합에 사용될 수 있고, 검출가능한 모이어티를 갖고 일차 항체에 결합할 수 있는 이차 항체가 첨가될 수 있다. 그러나, 상기 기재된 바와 같이, 항-SIGLEC 15 항체는 검출가능한 표지와 컨쥬게이션될 수 있고, 이와 같이 이차 항체는 필요하지 않을 수 있다.
"검출가능한 모이어티"는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 화학적 및/또는 다른 물리적 수단에 의해 검출가능한 모이어티이다. 검출가능한 모이어티는 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편에 직접적 및/또는 간접적으로 커플링(예를 들어, 결합, 비제한적인 예로, DOTA 또는 NHS 결합을 통함)될 수 있다. 매우 다양한 검출가능한 모이어티가 요구되는 민감성, 컨쥬게이션의 용이성, 안정성 필요조건 및 이용가능한 기계에 따라 신중히 이용될 수 있다. 적합한 검출가능한 모이어티는 형광 표지, 방사성 표지(예를 들어, 비제한적으로, 125I, In111, Tc99, I131 및 PET 스캐너에 대한 양전자 방사 동위원소 등을 포함함), 핵 자기 공명 활성 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 발색단 표지, 효소 표지(예를 들어, 비제한적으로, 호스라디쉬 퍼옥사이드, 알칼리성 포스파타제 등), 양전자점(quantum dot) 및/또는 나노입자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 검출가능한 모이어티는 검출가능한 신호를 야기시키고/시키거나 생성시킬 수 있어, 이에 의해 검출가능한 모이어티로부터의 신호가 검출되는 것을 가능케 한다.
본 발명의 또 다른 예시적 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 치료 모이어티(예를 들어, 약물, 세포독성 모이어티)와 커플링(이로 변형)될 수 있다.
일부 예에서, 치료 목적을 위해, 컨쥬게이션되지 않은 항체는 단독으로 항원을 격리시킬 수 있고, 항원과 또 다른 결합 파트너 사이의 중요한 상호작용을 차단할 수 있고, 효과기 세포를 보충할 수 있고, 그 밖의 작용을 할 수 있다. 그러나, 상기 기재된 바와 같이, 항체는 치료 모이어티와 컨쥬게이션될 수 있다.
예시적 구현예에서, 항체 및 항원 결합 단편은 화학요법제 또는 세포독성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 및 항원 결합 단편은 화학요법제 또는 세포독성제에 컨쥬게이션될 수 있다. 이러한 화학요법제 또는 세포독성제는 이트륨-90, 스칸듐-47, 레늄-186, 요오드-131, 요오드-125, 및 당업자에 의해 인지되는 많은 다른 화학요법제 또는 세포독성제(예를 들어, 루테튬(예를 들어, Lu177), 비스무트(예를 들어, Bi213), 구리(예를 들어, Cu67))를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 예에서, 화학요법제 또는 세포독성제는 당업자에게 공지된 것 중에서 5-플루오로우라실, 아드리아마이신(adriamycin), 이리노테칸(irinotecan), 아우리스타틴(auristatin), 탁산(taxane), 슈도모나스 내독소(pseudomonas endotoxin), 리신(ricin), 칼리케아마이신(calicheamicin) 및 다른 독소로 구성될 수 있다. 예시적 세포독성제는 특히 비-증식 세포를 사멸할 수 있는 작용제를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 특히 DNA를 표적화 하는 작용제와 컨쥬게이션될 수 있다. DNA를 표적화 하는 작용제의 예시적 구현예는, 예를 들어, 알킬화제, 예를 들어, 듀오카르마이신(duocarmycin) 및 듀오카르마이신 유도체, 예를 들어, 아도젤레신(adozelesin), 비젤레신(bizelesin), 카르젤레신(carzelesin) 등을 포함한다. DNA를 표적으로 하는 작용제의 다른 예시적 구현예는, 예를 들어, 칼리케아마이신, 에스페라마이신(esperamicin) 및 유도체를 포함한다(미국 특허 번호 5,264,586호, 5,108,192호, 4,970,198호, 5,037,651호, 5,079,233호, 4,675,187호, 4,539,203호, 4,554,162호, 4,837,206호 및 US2007213511호에 개시된 화합물 참조, 상기 각각의 문헌의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다).
본 발명의 특정 구현예는, 예를 들어, 듀오카르마이신과 컨쥬게이션된 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명의 또 다른 특정 구현예는, 예를 들어, 칼리케아마이신과 컨쥬게이션된 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다.
대안적으로, 본 발명의 방법을 수행하기 위해, 당 분야에 공지된 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편(컨쥬게이션되거나 컨쥬게이션되지 않음)은 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, 요망되는 검출가능한 진단 또는 치료 모이어티를 가질 수 있는 두번째 분자(예를 들어, 이차 항체 등)와 조합하여 이용될 수 있다.
항체의 약학적 조성물 및 이의 용도
항체(컨쥬게이션되거나 컨쥬게이션되지 않음)의 약학적 조성물이 또한 본 발명에 포함된다. 약학적 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함할 수 있고, 또한 약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편 및 담체를 포함할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 골 질병 또는 암의 치료 또는 진단에서의 본원에 기재된 분리된 항체 또는 항원 결합 단편의 용도에 관한 것이다.
활성 성분에 더하여, 약학적 조성물은 물, PBS, 염 용액, 젤라틴, 오일, 알콜, 및 약학적으로 사용될 수 있는 제조물로의 활성 화합물의 가공을 촉진하는 다른 부형제 및 보조제를 포함하는 약학적으로 허용되는 담체체를 함유할 수 있다. 다른 예에서, 상기 제조물은 멸균될 수 있다.
본원에서 사용되는 "약학적 조성물"은 보통 치료적 유효량의 작용제와 함께 약학적으로 허용되는 희석제, 보존제, 용해화제, 유화제, 애쥬번트 및/또는 담체를 포함한다. 본원에서 사용되는 "치료적 유효량"은 제공된 질환 및 투여 요법에 대해 치료적 효과를 제공하는 양을 나타낸다. 이러한 조성물은 액체 또는 동결건조되거나 달리 건조된 제형이며, 다양한 완충제 함량(예를 들어, Tris-HCl., 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도의 희석제, 표면에 대한 흡수를 방지하기 위한 첨가물, 예를 들어, 알부민 또는 젤라틴, 세제(예를 들어, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, 담즙산염)를 포함한다. 용해화제(예를 들어, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리세롤), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이트), 보존제(예를 들어, 티메로살, 벤질 알콜, 파라벤), 벌크화 물질(bulking substance) 또는 긴장성 개질제(예를 들어, 락토스, 만니톨), 중합체의 공유 부착, 예를 들어, 단백질에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 공유 부착, 금속 이온과의 복합체화, 또는 중합체 화합물, 예를 들어, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 하이드로겔 등의 미립자 제조물로의 또는 미립자 제조물 상으로의 물질의 혼입, 또는 리포솜, 마이크로에멀젼, 마이셀(micelle), 단층 또는 다층 소포, 파열적혈구, 또는 스페로플라스트(spheroplast)로의 물질의 혼입. 상기 조성물은 물리적 상태, 용해도, 안정성, 생체내 방출의 속도, 및 생체내 청소의 속도에 영향을 미칠 수 있다. 조절 또는 지속 방출 조성물은 친지질성 데포(depot)(예를 들어, 지방산, 왁스, 오일) 내의 제형을 포함한다. 중합체(예를 들어, 폴록사머 또는 폴록사민)로 코팅된 미립자 조성물이 본 발명에 또한 포함된다. 본 발명의 조성물의 다른 구현예는 비경구, 폐, 코, 경구, 질, 직장 경로를 포함하는 다양한 투여 경로를 위한 미립자 형태 보호 코팅, 프로테아제 억제제 또는 투과 향상제를 포함한다. 한 구현예에서, 약학적 조성물은 비경구, 암주변, 경점막, 경피, 근내, 정맥내, 피내, 피하, 복막내, 뇌실내, 두개내 및 종양내 투여된다.
추가로, 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체" 또는 "약학적 담체"는 당 분야에 공지되어 있으며, 0.01 내지 0.1 M 또는 0.05 M 포스페이트 완충액 또는 0.8% 염수를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 추가로, 이러한 약학적으로 허용되는 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀젼일 수 있다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들어, 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 물, 알콜 용액/수용액, 에멀젼 또는 현탁액, 예를 들어, 염수 및 완충 매질을 포함한다. 비경구 비히클은 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락테이트화 링거 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충물, 전해질 보충물, 예를 들어, 링거 덱스트로스 기반 전해질 보충물 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가물, 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 콜레이팅 작용제(collating agent), 비활성 가스 등이 또한 존재할 수 있다.
임의의 화합물에 대해, 치료적 유효 용량은 먼저 세포 배양 검정 또는 동물 모델, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 또는 돼지에서 먼저 평가될 수 있다. 동물 모델은 또한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 정보는 이후 인간에서의 투여에 유용한 용량 및 경로를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 이들 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 치료적 유효 용량은 증상 또는 질환을 개선시키는 활성 성분의 양을 나타낸다. 치료 효능 및 독성은, 예를 들어, ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량) 및 LD50(집단의 50%에 치사성인 용량) 통계를 계산하고 대조시킴으로써 세포 배양물에서 또는 실험 동물을 이용하여 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 상기 기재된 치료 조성물 중 임의의 치료 조성물이 포유동물, 예를 들어, 개, 고양이, 소, 말, 토끼, 원숭이, 및 인간을 포함하나 이에 제한되지는 않는 상기 요법을 필요로 하는 임의의 피검체에 적용될 수 있다.
본 발명에서 이용되는 약학적 조성물은 경구, 정맥내, 근내, 동맥내, 골수내, 수막강내, 뇌실내, 경피, 피하, 복막내, 비내, 장, 국소, 설하, 또는 직장 수단을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 예를 들어, 비스포스포네이트, 활성 비타민 D3, 칼시토닌 및 이의 유도체, 호르몬 제조물, 예를 들어, 에스트라디올, SERM(선택적 에스트로겐 수용체 조절인자), 이프리플라본(ipriflavone), 비타민 K2(메나테트레논(menatetrenone)), 칼슘 제조물, PTH(부갑상샘 호르모) 제조물, 비스테로이드성 항염증제, 용해성 TNF 수용체 제조물, 항-TNF-알파 항체 또는 항체의 기능성 단편, 항-PTHrP(부갑상샘 호르몬-관련 단백질) 항체 또는 항체의 기능성 단편, IL-1 수용체 길항제, 항-IL-6 수용체 항체 또는 항체의 기능성 단편, 항-RANKL 항체 또는 항체의 기능성 단편 및 OCIF(파골세포형성(osteoclastogenesis) 억제 인자)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 약물 일원을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 개시의 목적을 위한 용어 "치료"는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 수단 둘 모두를 나타내며, 상기 목적은 표적화된 병리 질환 또는 장애를 예방하거나 늦추는(감소시키는) 것이다. 치료를 필요로 하는 사람은 장애를 이미 가진 사람뿐만 아니라 장애를 갖기 쉬운 사람 또는 장애가 예방되어야 하는 사람을 포함한다.
항체 또는 항원 결합 단편은 다양한 골 손실 또는 암의 치료에서 치료적 용도를 가질 수 있다. 예시적 구현예에서, 항체 또는 단편은 골 질병, 예를 들어, 파골세포의 골 분해 활성이 증가하는 질환과 관련된 골 손실에서 치료적 용도를 가질 수 있다.
특정 예에서, 항-Siglec-15 항체 및 단편은 Siglec-15를 발현하는 세포, 예를 들어, 파골세포 또는 파골세포 전구체와 상호작용할 수 있다. 특정 예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO:2를 발현하는 세포와 상호작용할 수 있고, ADCC를 매개함으로써 면역학적 반응을 유도할 수 있다. 다른 예에서, 항체 및 단편은 SEQ ID NO:2와 이의 자연 리간드의 상호작용을 차단할 수 있다.
항-Siglec-15 항체 또는 항원 결합 단편은 골다공증, 골감소증, 골연화증, 부갑상선항진증, 갑상선저하증, 갑상선항진증, 생식선저하증, 갑상샘중독증, 전신비만세포증, 성인 저인산증, 부신피질항진증, 불완전골형성, 파제트병, 쿠싱병/증후군, 터너 증후군, 고쉐병, 엘러스-단로스 증후군, 마르판 증후군, 멘케 증후군, 판코니 증후군, 다발골수종, 고칼슘혈증, 저칼슘혈증, 관절염증, 치주병, 구루병(비타민 D 의존성, 타입 I 및 II, 및 x-연관 저인산혈 구루병을 포함함), 골성 불완전 섬유생성증, 골경화성 장애, 예를 들어, 피크노디소스토시스(pycnodysostosis) 및 대식세포-매개 염증 과정에 의해 야기되는 손상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 골-관련 질병의 상황에서 골 손실의 치료에서 치료적 용도를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체 및 단편은 심각한 골 손실이 만연한 질환, 특히 골에 대한 전이성 암에서 치료적 용도를 갖는다.
항-Siglec-15 항체 및 이의 항원 결합 단편은 다양한 골 재형성 장애에 의해 야기되거나 이와 관련된 암 또는 골 손실의 치료에서 치료적 용도를 가질 수 있다. 특히, 항-Siglec-15 항체 및 이의 면역학적 기능성 단편은 파골세포가 과활성이고 골 표면의 파괴에 기여하는 질환에서 치료적 용도를 갖는다. 특정 예에서, 항-Siglec-15 항체 및 이의 항원 결합 단편은 동일 질환에 대해 제공된 다른 치료와 조합하여 동시에 투여될 수 있다. 이와 같이, 항체는 당업자에게 공지된 골흡수억제제(예를 들어, 비스포스포네이트)와 함께 투여될 수 있다. 추가로, 항체는 유사분열억제제(예를 들어, 탁산), 백금-기반 작용제(예를 들어, 시스플라틴), DNA 손상제(예를 들어, 독소루비신), 및 당업자에게 공지된 다른 세포독성 요법제와 함께 투여될 수 있다. 다른 예에서, 항-Siglec-15 항체 및 이의 면역학적 기능성 단편은 다른 치료 항체와 함께 투여될 수 있다. 이들은 RANKL, EGFR, CD-20, 및 Her2를 표적으로 하는 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 추가 범위, 적용성 및 장점은 이후에 제공되는 비제한적인 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 예시적 구현예를 나타내는 상기 상세한 설명은 수반되는 도면을 참조로 하여 단지 예로서 제공되는 것이 이해되어야 한다.
도면의 간단한 설명
도 1a. 뮤린 25D8 가변 도메인의 분자 모델. CDR 루프는 경쇄에서 L1, L2 및 L3, 및 중쇄에서 H1, H2 및 H3로 화살표로 표시되어 있다.
도 1b. 뮤린 25E9 가변 도메인의 분자 모델. CDR 루프는 경쇄에서 L1, L2 및 L3, 및 중쇄에서 H1, H2 및 H3로 화살표로 표시되어 있다.
도 2a. 25D8 항체의 가변 경쇄(VL) 도메인에 대한 마우스, 인간화 및 선택된 인간 프레임워크 서열의 서열 정렬. CDR은 밝은 회색으로 강조되어 있고, SEQ ID NOs. 53, 54 및 55에 해당한다.
도 2b. 25D8 항체의 가변 중쇄(VH) 도메인에 대한 마우스, 인간화 및 선택된 인간 프레임워크 서열의 서열 정렬. CDR은 밝은 회색으로 강조되어 있고, SEQ ID NOs. 56, 57 및 58에 해당한다.
도 3a. 25E9 항체의 가변 경쇄(VL) 도메인에 대한 마우스, 인간화 및 선택된 인간 프레임워크 서열의 서열 정렬. CDR은 밝은 회색으로 강조되어 있고, SEQ ID NOs. 47, 48 및 49에 해당한다.
도 3b. 25E9 항체의 가변 중쇄(VH) 도메인에 대한 마우스, 인간화 및 선택된 인간 프레임워크 서열의 서열 정렬. CDR은 밝은 회색으로 강조되어 있고, SEQ ID NOs. 50, 51 및 52에 해당한다.
도 4a. 인간화 전장 IgG2 25D8(SEQ ID NOs.:23 및 27) 및 키메라 전장 IgG2(SEQ ID NOs.:21 및 25) 25D8 항체의 어셈블리된 서열.
도 4b. 인간화 전장 IgG2 25E9(SEQ ID NOs.:7 및 29) 및 키메라 전장 IgG2 25E9(SEQ ID NOs.:5 및 30) 항체의 어셈블리된 서열.
도 5a. 마우스 및 인간화 25D8 IgG2 항체의 SPR 크로마토그램.
도 5b. 마우스 및 인간화 25E9 IgG2 항체의 SPR 크로마토그램.
도 6a는 25E9 마우스 경쇄 가변 도메인과 25E9 인간화 경쇄 가변 도메인 변이체 1 사이의 정렬을 예시한다. 정렬은 ClustalW2 프로그램을 이용하여 수행되었고, 여기서 "*"는 상기 컬럼 내의 잔기가 정렬 내의 모든 서열에서 동일한 것을 의미하고, ":"는 보존된 치환이 관찰된 것을 의미하고, "."은 반-보존된 치환이 관찰되는 것을 의미한다(Larkin M.A., et al., (2007) ClustalW and ClustalX version 2. Bioinformatics 2007 23(21): 2947-2948). 이들 정렬은 SEQ ID NOs.: 33, 34 및 35에 기재된 컨센서스 서열을 발생시키기 위해 이용되었다.
도 6b는 25E9 마우스 중쇄 가변 도메인과 25E9 인간화 중쇄 가변 도메인 변이체 1 사이의 정렬을 예시한다. 정렬은 ClustalW2 프로그램을 이용하여 수행되었고, 여기서 "*"는 상기 컬럼 내의 잔기가 정렬 내의 모든 서열에서 동일한 것을 의미하고, ":"는 보존된 치환이 관찰된 것을 의미하고, "."은 반-보존된 치환이 관찰되는 것을 의미한다(Larkin M.A., et al., (2007) ClustalW and ClustalX version 2. Bioinformatics 2007 23(21): 2947-2948). 이들 정렬은 SEQ ID NOs.: 36, 37 및 38에 기재된 컨센서스 서열을 발생시키기 위해 이용되었다.
도 7a는 25D8 마우스 경쇄 가변 도메인과 25D8 인간화 경쇄 가변 도메인 사이의 정렬을 예시한다. 정렬은 ClustalW2 프로그램을 이용하여 수행되었고, 여기서 "*"는 상기 컬럼 내의 잔기가 정렬 내의 모든 서열에서 동일한 것을 의미하고, ":"는 보존된 치환이 관찰된 것을 의미하고, "."은 반-보존된 치환이 관찰되는 것을 의미한다(Larkin M.A., et al., (2007) ClustalW and ClustalX version 2. Bioinformatics 2007 23(21): 2947-2948). 이들 정렬은 SEQ ID NOs.: 39, 40 및 41에 기재된 컨센서스 서열을 발생시키기 위해 이용되었다.
도 7b는 25D8 마우스 중쇄 가변 도메인과 25D8 인간화 중쇄 가변 도메인 사이의 정렬을 예시한다. 정렬은 ClustalW2 프로그램을 이용하여 수행되었고, 여기서 "*"는 상기 컬럼 내의 잔기가 정렬 내의 모든 서열에서 동일한 것을 의미하고, ":"는 보존된 치환이 관찰된 것을 의미하고, "."은 반-보존된 치환이 관찰되는 것을 의미한다(Larkin M.A., et al., (2007) ClustalW and ClustalX version 2. Bioinformatics 2007 23(21): 2947-2948). 이들 정렬은 SEQ ID NOs.: 42, 43 및 44에 기재된 컨센서스 서열을 발생시키기 위해 이용되었다.
도 8. 25E9가 농도 의존 방식으로 세포의 표면 상에서 발현된 인간 Siglec-15에 특이적으로 결합하는 것을 나타내는 유세포측정법 결과.
도 9. 인간 파골세포의 분화 및 재흡수 활성을 억제하는 25E9의 능력을 나타내는 이미지.
도 10a. 항-Siglec-15 항체의 존재하에서의 비오티닐화된 Siglec-15의 내재화를 나타내는 웨스턴 블롯.
도 10b. 동일초점 현미경검사법(confocal microscopy)에 의한 Siglec-15 세포내이입의 특성규명.
도 10c. Siglec-15 단백질 수준을 나타내는 웨스턴 블롯.
도 10d. 항-Siglec-15 항체의 존재 또는 부재하에서의 RANKl 자극 후의 RAW264.7에서의 Siglec-15 단백질 발현을 나타내는 웨스턴 블롯.
도 11. Siglec-15 집락화에 의해 유도된 세포 신호전달의 분석. 대조군(C) 또는 분화된(Δ) RAW264.7 세포가 4 C에서 일차 항체(항-Siglec-15 또는 대조군 인간 IgG) 및 이후 37 C에서 지정된 시간 동안 이차 가교 항체로 처리되었다. 전체 용해질이 지정된 항체를 이용한 웨스턴 블로팅에 의해 분석되었다.
도 12. 인간화 25E9 L1H1 IgG1(좌측 패널)과 인간화 25E9 L1H1 IgG2(우측 패널) 사이의 결합 파라미터에서의 차이를 예시하는 SPR 크로마토그램. 정제된 Fc-Siglec-15가 고정(150RU)되었고, 인간화 25E9가 지정된 농도(100 nM, 33.3 nM, 11.1 nM, 3.70 nM 및 1.23 nM)로 주사되었다. 곡선은 1:1의 비로 적합화되었다.
도 13. 파골세포의 분화를 억제하기 위한, 인간화 25E9 IgG2에 비한 인간화 25E9 L1H1 IgG1의 증가된 효능을 나타내는 대표 이미지.
도 14a. 인간화 전장 IgG1 25D8(SEQ ID NOs.:23 및 46) 및 키메라 전장 IgG1 25D8(SEQ ID NO.:21 및 45) 항체의 어셈블리된 서열.
도 14b. 인간화 전장 IgG1 25E9(SEQ ID NOs:7 및 13) 및 키메라 전장 IgG1 25E9(SEQ ID NOs.:5 및 11) 항체의 어셈블리된 서열.
도 15. 25E9-ADC가 컨쥬게이션되지 않은 항체와 매우 유사한 방식으로 세포의 표면에서 발현된 인간 Siglec-15에 특이적으로 결합하는 것을 나타내는 유세포측정법 결과.
도 16. 성숙한 다핵 파골세포에 대한 25E9-ADC의 생존 곡선 도시. 반응은 컨쥬게이션되지 않은 25E9와 매우 상이하며, 생존에 영향을 미치지 않고 파골세포 활성을 강하게 억제한다.
도 17은 성숙한 다핵 파골세포에 대한 25E9-ADC의 세포독성 효과를 예시하는 TRAP 염색된 파골세포의 이미지를 도시한다. 반응은 컨쥬게이션되지 않은 25E9와 매우 상이하며, 생존에 영향을 미치지 않고 파골세포 활성을 강하게 억제한다. 대조군-ADC는 파골세포에 대해 효과가 없다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명에 의해 포함되는 변이체 항체 또는 항원 결합 단편은 삽입, 결실 또는 아미노산 치환(보존성 또는 비-보존성)을 포함할 수 있는 변이체 항체 또는 항원 결합 단편이다. 이들 변이체는 이의 아미노산 서열 중의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고 이 위치에 상이한 잔기가 삽입될 수 있다.
치환성 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 과가변 영역(CDR)을 포함하나, 프레임워크 영역 또는 심지어 불변 영역 내에서의 변형이 또한 고려된다. 보존성 치환은 하기 나열되는 그룹(그룹 1 내지 6) 중 하나로부터의 아미노산(CDR, 가변 도메인, 항체 등의 아미노산)을 동일 그룹의 또 다른 아미노산으로 교환함으로써 제조될 수 있다.
일반적으로, CDR 내의 돌연변이는 프레임워크 영역 내의 돌연변이보다 항체 또는 항원 결합 단편의 항원 결합 활성에 큰 영향을 미칠 수 있다. 프레임워크 영역 내의 돌연변이는 항체의 "인간성"을 증가시키기 위해 수행될 수 있다. 본 발명에 의해 포함되는 변이체 항체 또는 항원 결합 단편은 본원에 제시된 것과 실질적으로 동일(유사하거나, 동일하거나, 약간 덜한 것을 포함함)한 항원 결합 능력을 갖거나, 본원에 제시된 것보다 나은 항원 결합 능력을 갖는 것이다.
보존성 치환의 다른 예시적 구현예가 "바람직한 치환"이라는 표제로 표 1a에 제시된다. 이러한 치환이 원하지 않는 특성을 발생시키는 경우, 표 1a에서 "예시적 치환"으로 명명되거나, 아미노산 부류에 관하여 하기에 추가로 기재되는 바와 같은 더욱 많은 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물이 스크리닝될 수 있다.
변이체가 치환성 돌연변이유발에 의해 발생될 수 있고, 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유할 수 있음은 당 분야에 공지되어 있다. 이들 변이체는 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고, 이 위치에 상이한 잔기가 삽입된다. 예를 들어, 치환성 돌연변이유발을 위한 하나의 관심 부위는 다양한 종으로부터 수득되는 특정 잔기가 동일한 부위를 포함할 수 있다. "보존성 치환"으로 확인된 치환의 예는 표 1a에 제시되어 있다. 상기 치환이 원하지 않는 변화를 발생시키는 경우, 표 1a에서 "예시적 치환"으로 명명되거나, 아미노산 부류에 관하여 본원에서 추가로 기재되는 바와 같은 다른 유형의 치환이 도입되고, 생성물이 스크리닝된다.
기능 또는 면역학적 동일성의 실질적 변형은 (a) 예를 들어, 시트(sheet) 또는 나선형 입체형태로서의 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지시키는 것에 대한 변형의 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 잔기는 공통의 측쇄 특성을 기초로 하여 하기 그룹으로 나뉘어진다:
(그룹 1) 소수성: 노르류신, 메티오닌(Met), 알라닌(Ala), 발린(Val), 류신(Leu), 이소류신(Ile)
(그룹 2) 중성 친수성: 시스테인(Cys), 세린(Ser), 트레오닌(Thr)
(그룹 3) 산성: 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu)
(그룹 4) 염기성: 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 히스티딘(His), 리신(Lys), 아르기닌(Arg)
(그룹 5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: 글리신(Gly), 프롤린(Pro); 및
(그룹 6) 방향족: 트립토판(Trp), 티로신(Tyr), 페닐알라닌(Phe)
비보존성 치환은 상기 부류 중 하나의 일원을 또 다른 부류의 일원으로 교환하는 것을 수반할 것이다.
표 1a. 아미노산 치환
Figure pct00001
변이체 항체 또는 항원 결합 단편의 아미노산 서열에서의 변화는 아미노산 첨가, 결실, 삽입, 치환 등, 하나 이상의 아미노산의 백본 또는 측쇄 내의 하나 이상의 변형, 또는 하나 이상의 아미노산(측쇄 또는 백본)으로의 한 기 또는 또 다른 분자의 첨가를 포함할 수 있다.
변이체 항체 또는 항원 결합 단편은 본래의 항체 또는 항원 결합 단편 아미노산 서열의 서열 유사성 및/또는 서열 동일성과 비교하여 이의 아미노산 서열에서 실질적인 서열 유사성 및/또는 서열 동일성을 가질 수 있다. 2개의 서열 사이의 유사성의 정도는 동일성(동일한 아미노산) 및 보존성 치환의 백분율을 기초로 한다.
일반적으로, 가변 사슬 사이의 유사성 및 동일성의 정도는 디폴트 설정을 이용한 Blast2 서열 프로그램, 즉, blastp 프로그램, BLOSUM62 매트릭스(오픈 갭(open gap) 11 및 연장 갭 페널티(extension gap penalty) 1; gapx 드롭오프(dropoff) 50, 예상치 10.0, 워드 크기(word size) 3) 및 활성화된 필터를 이용하여 본원에서 결정되었다(Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250).
따라서, 동일성 퍼센트는 본래의 펩티드와 비교하여 동일하고, 동일하거나 유사한 위치를 차지할 수 있는 아미노산을 나타낼 수 있다.
유사성 퍼센트는 동일한 아미노산 및 동일하거나 유사한 위치에서 본래의 펩티드와 비교하여 보존성 아미노산 치환으로 대체되는 아미노산을 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명의 변이체(즉, 유사체)(VL 변이체, VH 변이체, CDR 변이체, 항체 변이체, 폴리펩티드 변이체 등을 포함함)는 본래 서열 또는 본래 서열의 일부와 적어도 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가질 수 있는 변이체를 포함한다.
본 발명에 따르면, SEQ ID NO.:2 변이체는 SEQ ID NO.:2의 아미노산 49 내지 165 또는 아미노산 20 내지 259와 적어도 80% 동일한 영역을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. SEQ ID NO.:2의 변이체는 또한 SEQ ID NO.:2와 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. SEQ ID NO.:2의 바람직한 변이체는 파골세포 분화 및/또는 골 재흡수를 억제할 수 있는 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는, 예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서 이의 파골세포 분화 및/또는 골 재흡수 활성을 시험함으로써 확인될 수 있다. Siglec-15 변이체의 활성을 시험하기 위해 사용될 수 있는 방법 또는 검정의 예는 본원에 기재되어 있으며, 국제 출원 번호 PCT/CA2007/001134호에 제공되어 있다. 본원에 기재된 검정을 수행하기 위해 사용된 파골세포는, 예를 들어, 바람직하게는 인간으로부터 유래될 수 있으나, 또한 마우스로부터 유래될 수 있음이 이해되어야 한다. SEQ ID NO.:2의 바람직한 변이체는, 예를 들어, SEQ ID NO.:2의 아르기닌 99(R99)를 포함하는 에피토프가 보존된 변이체를 포함할 수 있다.
변이체의 예시적 구현예는 본원에 기재된 서열과 적어도 81%의 서열 동일성 및 본래의 서열 또는 본래의 서열의 일부와 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 유사성을 갖는 변이체이다.
변이체의 다른 예시적 구현예는 본원에 기재된 서열과 적어도 82%의 서열 동일성 및 본래의 서열 또는 본래의 서열의 일부와 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 유사성을 갖는 변이체이다.
변이체의 추가의 예시적 구현예는 본원에 기재된 서열과 적어도 85%의 서열 동일성 및 본래의 서열 또는 본래의 서열의 일부와 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 유사성을 갖는 변이체이다.
변이체의 다른 예시적 구현예는 본원에 기재된 서열과 적어도 90%의 서열 동일성 및 본래의 서열 또는 본래의 서열의 일부와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 유사성을 갖는 변이체이다.
변이체의 추가의 예시적 구현예는 본원에 기재된 서열과 적어도 95%의 서열 동일성 및 본래의 서열 또는 본래의 서열의 일부와 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 유사성을 갖는 변이체이다.
변이체의 또 다른 추가의 예시적 구현예는 본원에 기재된 서열과 적어도 97%의 서열 동일성 및 본래의 서열 또는 본래의 서열의 일부와 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 유사성을 갖는 변이체이다.
간결함을 위해, 본 출원인은 본 발명에 의해 포함되는 개별적 변이체의 예시적 구현예를 예시하고, 특정 서열 동일성 % 및 서열 유사성 %를 포함하는 표 1b를 본원에 제공한다. 각각의 "X"는 제공된 변이체를 규정하는 것으로 해석되어야 한다.
Figure pct00002
본원에서 사용되는 용어 "동일한"은 서열이 또 다른 서열과 100% 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 동일한"은 서열이 또 다른 서열 또는 또 다른 서열의 일부와 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다.
본 발명은 본원에 기재된 서열과 적어도 70%의 동일성(70% 내지 99% 사이의 임의의 범위를 포함함)을 포함하는 CDR, 경쇄 가변 도메인, 중쇄 가변 도메인, 경쇄, 중쇄, 항체 및/또는 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명은 심각한 골 손실이 파골세포의 증가된 활성으로 인해 관찰되는, 다양한 골 관련 질병에서 발견되는 표적 파골세포에 대한 모노클로날 항체의 용도에 관한 것이다. 파골세포에 대한 항체를 유도하기 위해, 세포의 세포 표면에서 발현되는 파골세포-특이적 항원의 확인이 수행되어야 한다. RANKL로 처리된 분화하는 파골세포에서 세포-특이적 항원을 확인하기 위해 이용가능한 여러 기술 및 Siglec-15를 확인하기 위해 사용된 방법이 존재하며, mRNA의 제거 전사 기반 증폭(Subtractive Transcription-based Amplification)(STAR)으로 언급되는 혁신적 발견의 플랫폼이 공개된 특허 출원 번호 PCT/CA2007/000210호에 기재되어 있다.
인간 파골세포 STAR 라이브러리의 분석은 분비 및 세포 표면 단백질을 인코딩하는 많은 유전자를 발생시켰다. 0326-SL109로 명명된 이들 중 하나는 SEQ ID NO:1에 제시된 뉴클레오티드 서열과의 987개의 염기쌍의 cDNA에 의해 인코딩되는 SEQ ID NO:2에 상응하는 328개의 아미노산의 폴리펩티드를 인코딩하는 개방형 해독틀을 함유하였다. 공적으로 이용가능한 데이터베이스의 검색은 0326-SL109 뉴클레오티드 서열이 CD33 항원-유사 3(CD33L3)로 언급되는 인간 유전자의 뉴클레오티드 서열과 동일한 것을 나타내었다. CD33L3는 시알산 결합 단백질의 Siglec 패밀리의 일원인 것이 이후에 발견되었고, 다른 Siglec에 대한 상동성을 기초로 하여 Siglec-15로 다시 명명되었다(Crocker et al ., 2007). 이러한 정보를 기초로 하여, 마우스 오쏠로그(orthologue)가 분리되었고, 서열 분석되었고, 아미노산 수준에서 인간 서열과 약 85% 동일한 것으로 밝혀졌다. SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:4는 뮤린 Siglec-15의 cDNA 및 폴리펩티드의 서열을 각각 제시한다. 생물정보학 분석은 세포외 구획에 기능적 도메인을 제시하는 타입 I 막-고정 단백질을 예측하였다. 다른 Siglec 서열과 같이, 아미노-말단 신호 펩티드(SEQ ID NO:2의 아미노산 1 내지 19 사이에 위치됨)는 단백질을 세포막으로 표적화시키고, 최종 가공된 단백질은 카르복시-말단에 위치된 단일 막횡단 헬릭스(SEQ ID NO:2의 아미노산 261 내지 283 사이에 위치됨)를 통해 막에 고정된다. V-세트 Ig 도메인은 SEQ ID NO:2의 아미노산 49 내지 165 사이에 위치되는 반면, C2-세트 Ig 도메인은 SEQ ID NO:2의 아미노산 178 내지 244 사이에 위치된다.
이전의 발견(Sooknanan et al. 2007)은 인간 Siglec-15를 인코딩하는 전사물이 RANKL에 반응하여 유의하게 상향조절된 것을 확립하였다. 이러한 결정은 상이한 인간 PBMNC 공여체로부터의 여러 상이한 인간 파골세포 분화 실험으로부터의 스폿화된(spotted) 전체 RNA 샘플을 함유한 RNA 매크로어레이 상에서 수행되었다. 또한, 이들 연구(Sooknanan et al. 2007)는 Siglec-15 전사물이 30개의 인간 정상 조직의 광범위한 패널 중에서 단지 하나의 정상 조직에서 발현된 것을 나타내었고, 이는 Siglec-15 유전자 발현의 매우 높은 파골세포 특이성을 나타낸다. 반정량적 RT-PCR과 같은 더욱 민감한 방법을 이용하여, 많은 파골세포 샘플에서 RANKL 처리 1일 이내에 Siglec-15 mRNA의 발현이 자극되었고, 이는 상기 유전자가 세포 융합의 시작 전에 파골세포 전구체 세포에서 초기에 발현된 것을 나타낸다. 최종적으로, Siglec-15의 조직 발현 프로파일은 반정량적 RT-PCR에 의해 평가되었고, 단일한 정상 인간 조직에서만 발현된 것으로 밝혀졌고, 따라서 이는 문헌[Sooknanan et al.]의 매크로어레이 결과를 확인한다. 종합하면, 이들 발현 결과는 분화하는 파골세포로 매우 제한되는 Siglec-15에 의해 예시되는 바와 같은 표적을 확인하는 능력에서의 본 출원인의 발견 접근법의 장점을 뒷받침한다.
파골세포의 분화의 초기 단계에서의 Siglec-15의 발현, 정상 조직에서의 이의 제한된 발현, 및 파골세포의 활성에서의 Siglec-15에 대한 중요한 생물학적 역할을 기초로 하여, Siglec-15가 골 재흡수 또는 골-관련 질병, 예를 들어, 암-유도성 골 손실, 골다공증, 암 치료와 관련된 골 손실의 검출, 예방, 및 치료를 위한 모노클로날 항체의 개발을 위한 치료적 표적으로 선택되었다.
따라서, Siglec-15를 표적화하기 위한 다양한 항-Siglec-15 항체 및 이의 면역학적 기능성 단편, 예를 들어, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체, 항체 단편, 단쇄 항체, 도메인 항체, 및 항원-결합 영역을 갖는 폴리펩티드가 제공된다.
본 발명에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 특히 파골세포 분화를 억제할 수 있다.
추가로, 본 발명에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 파골세포 형성을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 파골세포 활성을 억제할 수 있다.
추가로, 본 발명에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 골 재흡수(예를 들어, 파골세포의 골 재흡수 활성)을 억제할 수 있다.
따라서, 본 발명은 한 양태에서 SEQ ID NO.:6과 적어도 80% 동일한 경쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO.:12와 적어도 80% 동일한 중쇄 가변 영역을 가질 수 있는 Siglec-15에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 SEQ ID NO.:6 또는 SEQ ID NO.:12와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 또 다른 양태에서 SEQ ID NO.:22와 적어도 80% 동일한 경쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO.:26과 적어도 80% 동일한 중쇄 가변 영역을 가질 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 SEQ ID NO.:22 또는 SEQ ID NO.:26과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 아미노산 치환은 자연 인간 항체 내의 상응하는 위치에서 나타나는 아미노산일 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 아미노산 치환은 상보성 결정 영역(CDR)의 외부에 존재할 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 항체 아미노산 치환은, 예를 들어, 경쇄 가변 영역 내에 위치될 수 있다.
본 발명의 추가 구현예에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 치환은 동일 가변 영역 내에 위치될 수 있거나, 별개의 가변 영역 내에 위치될 수 있다.
추가로, 본 발명에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역 내에 1 내지 25개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 더욱 특히, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 예를 들어, 이의 경쇄 가변 영역 내에 1 내지 22개의 아미노산 치환 및 이의 중쇄 가변 영역 내에 1 내지 25개의 아미노산 치환을 가질 수 있다.
SEQ ID NO.:6의 상보성 결정 영역 및 SEQ ID NO.:12의 상보성 결정 영역을 포함하고, 인간 항체의 프레임워크 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편, 예를 들어, 인간화 항체가 특히 고려된다.
SEQ ID NO.:22의 상보성 결정 영역 및 SEQ ID NO.:26의 상보성 결정 영역을 포함하고, 인간 항체의 프레임워크 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이 특히 고려된다.
본 발명의 예시적 구현예는, 예를 들어, SEQ ID NO.:33에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인(일반명 25E9 경쇄 가변 도메인(컨센서스 1))을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
Figure pct00003
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:6(마우스 VL)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은, 예를 들어, 보존성 또는 비-보존성 치환일 수 있다. 본 발명에 따르면, 아미노산 치환은 보존성 치환일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예시적 구현예는, 예를 들어, SEQ ID NO.:34에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인(일반명 25E9 경쇄 가변 도메인(컨센서스 2))을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
Figure pct00004
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:6(마우스 VL)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고;
Xa1, Xa4, Xa7, Xa8, Xa10 및 Xa11은 각각 독립적으로 SEQIDNO.6과 비교하여 보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xa2, Xa5, Xa6는 각각 독립적으로 SEQIDNO.6과 비교하여 반-보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xa3은 P 또는 L일 수 있고;
Xa9는 A 또는 D일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예시적 구현예는, 예를 들어, SEQ ID NO.:35에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인(일반명 25E9 경쇄 가변 도메인(컨센서스 3))을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
Figure pct00005
여기서, X(Xa1 내지 Xa11을 포함함)에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:6(마우스 VL)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고;
Xa1은 A 또는 S일 수 있고;
Xa2는 A 또는 P일 수 있고;
Xa3는 P 또는 L일 수 있고;
Xa4는 소수성 아미노산(예를 들어, V 또는 L)일 수 있고;
Xa5는 S 또는 P일 수 있고;
Xa6는 소수성 아미노산(예를 들어, V 또는 A)일 수 있고;
Xa7은 방향족 아미노산(예를 들어, F 또는 Y)일 수 있고;
Xa8은 염기성 아미노산(예를 들어, R 또는 K)일 수 있고;
Xa9는 A 또는 D일 수 있고;
Xa10은 염기성 아미노산(예를 들어, R 또는 K)일 수 있고;
Xa11은 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 V)일 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명은, 예를 들어, SEQ ID NO.:36에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인(일반명 25E9 중쇄 가변 도메인(컨센서스 1))을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
Figure pct00006
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:12(마우스 VH)에 기재된 폴리페티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은, 예를 들어, 보존성 또는 비-보존성 치환일 수 있다. 본 발명에 따르면, 아미노산 치환은 보존성 치환일 수 있다.
본 발명의 또 다른 추가 구현예는, 예를 들어, SEQ ID NO.:37에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 도메인(일반명 25E9 중쇄 가변 도메인(컨센서스 2))을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
Figure pct00007
여기서, X(Xb1 내지 Xb21을 포함함)에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:12(마우스 VH)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고;
Xb2, Xb4, Xb5, Xb7, Xb8, Xb9, Xb11, Xb12, Xb13, Xb15, Xb16, Xb17, Xb18, Xb20 및 Xb21은 각각 독립적으로 SEQIDNO.12와 비교하여 보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xb1, Xb6, Xb14는 각각 독립적으로 SEQIDNO.:12(마우스 VH)와 비교하여 반-보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xb3은 V 또는 K일 수 있고;
Xb10은 V 또는 G일 수 있고;
Xb19는 T 또는 R일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예는, 예를 들어, SEQ ID NO.:38에 기재된 중쇄 가변 도메인(일반명 25E9 중쇄 가변 도메인(컨센서스 3))을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다.
Figure pct00008
여기서, X(Xb1 내지 Xb21을 포함함)에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:12(마우스 VH)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고;
Xb1은 소수성 아미노산(예를 들어, V 또는 A)일 수 있고;
Xb2는 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 V)일 수 있고;
Xb3는 V 또는 K일 수 있고;
Xb4는 염기성 아미노산(예를 들어, R 또는 K)일 수 있고;
Xb5는 A 또는 S일 수 있고;
Xb6는 T 또는 K일 수 있고;
Xb7은 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 V)일 수 있고;
Xb8은 염기성 아미노산(예를 들어, K 또는 R)일 수 있고;
Xb9는 T 또는 A일 수 있고;
Xb10은 V 또는 G일 수 있고;
Xb11은 염기성 아미노산(예를 들어, H 또는 Q)일 수 있고;
Xb12는 소수성 아미노산(예를 들어, I 또는 M)일 수 있고;
Xb13은 염기성 아미노산(예를 들어, K 또는 R)일 수 있고;
Xb14는 소수성 아미노산(예를 들어, A 또는 V)일 수 있고;
Xb15는 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 I)일 수 있고;
Xb16은 염기성 아미노산(예를 들어, R 또는 K)일 수 있고;
Xb17은 중성 친수성 아미노산(예를 들어, S 또는 T)일 수 있고;
Xb18은 중성 친수성 아미노산(예를 들어, T 또는 S)일 수 있고;
Xb19는 T 또는 R일 수 있고;
Xb20은 중성 친수성 아미노산(예를 들어, S 또는 T)일 수 있고;
Xb21은 A 또는 S일 수 있다.
본 발명의 다른 예시적 구현예는, 예를 들어, SEQ ID NO.:39에 기재된 경쇄 가변 도메인(일반명 25D8 경쇄 가변 도메인(컨센서스 1))을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
Figure pct00009
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:22(마우스 VL)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은, 예를 들어, 보존성 또는 비-보존성 치환일 수 있다. 본 발명에 따르면, 아미노산 치환은 보존성 치환일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예시적 구현예는, 예를 들어, SEQ ID NO.:40에 기재된 경쇄 가변 도메인(일반명 25D8 경쇄 가변 도메인(컨센서스 2))을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
Figure pct00010
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:22(마우스 VL)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고;
Xc1, Xc3, Xc9 및 Xc10은 각각 독립적으로 SEQ ID NO.:22와 비교하여 보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xc2, Xc7, Xc8은 각각 독립적으로 SEQ ID NO.:22와 비교하여 반-보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xc4는 N 또는 L일 수 있고;
Xc5는 L 또는 P일 수 있고;
Xc6는 T 또는 E일 수 있다.
본 발명의 추가 구현예는, 예를 들어, SEQ ID NO.:41에 기재된 경쇄 가변 도메인(일반명 25D8 경쇄 가변 도메인(컨센서스 3))을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
Figure pct00011
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:22(마우스 VL)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고;
Xc1은 A 또는 T일 수 있고;
Xc2는 A 또는 P일 수 있고;
Xc3는 F 또는 L일 수 있고;
Xc4는 N 또는 L일 수 있고;
Xc5는 L 또는 P일 수 있고;
Xc6는 T 또는 E일 수 있고;
Xc7은 S 또는 P일 수 있고;
Xc8은 S 또는 G일 수 있고;
Xc9는 염기성 아미노산(예를 들어, R 또는 K)일 수 있고;
Xc10은 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 V)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 추가 구현예는, 예를 들어, SEQ ID NO.:42에 기재된 중쇄 가변 도메인(일반명 25D8 중쇄 가변 도메인(컨센서스 1))을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
Figure pct00012
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:26(마우스 VH)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은, 예를 들어, 보존성 또는 비-보존성 치환일 수 있다. 본 발명에 따르면, 아미노산 치환은 보존성 치환일 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명은, 예를 들어, SEQ ID NO.:43에 기재된 중쇄 가변 도메인(일반명 25D8 중쇄 가변 도메인(컨센서스 2))을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
Figure pct00013
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:26(마우스 VH)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고;
Xd1, Xd3, Xd5, Xd6, Xd7, Xd9, Xd10, Xd12, Xd14, Xd15, Xd17, Xd18은 각각 독립적으로 SEQ ID NO.:26와 비교하여 보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xd2, Xd11, Xd13은 각각 독립적으로 SEQ ID NO.:26와 비교하여 반-보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xd4는 V 또는 K일 수 있고;
Xd8은 R 또는 A일 수 있고;
Xd16은 T 또는 R일 수 있다.
또 다른 추가 구현예에서, 본 발명은, 예를 들어, SEQ ID NO.:44에 기재된 중쇄 가변 도메인(일반명 25D8 중쇄 가변 도메인(컨센서스 3))을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
Figure pct00014
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:26(마우스 VH)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고;
Xd1은 소수성 아미노산(예를 들어, V 또는 L)일 수 있고;
Xd2는 P 또는 S일 수 있고;
Xd3는 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 V)일 수 있고;
Xd4는 V 또는 K일 수 있고;
Xd5는 A 또는 S일 수 있고;
Xd6는 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 V)일 수 있고;
Xd7은 염기성 아미노산(예를 들어, K 또는 R)일 수 있고;
Xd8은 R 또는 A일 수 있고;
Xd9는 소수성 아미노산(예를 들어, I 또는 M)일 수 있고;
Xd10은 염기성 아미노산(예를 들어, K 또는 R)일 수 있고;
Xd11은 소수성 아미노산(예를 들어, A 또는 V)일 수 있고;
Xd12는 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 I)일 수 있고;
Xd13은 소수성 아미노산(V 또는 A)일 수 있고;
Xd14는 중성 친수성 아미노산(예를 들어, S 또는 T)일 수 있고;
Xd15는 Q 또는 E일 수 있고;
Xd16은 T 또는 R일 수 있고;
Xd17은 중성 친수성 아미노산(예를 들어, S 또는 T)일 수 있고;
Xd18은 소수성 아미노산(L 또는 V)일 수 있다.
용어 "인간화 항체"는 완전 인간화 항체(즉, 프레임워크가 100% 인간화됨) 및 부분적 인간화 항체(예를 들어, 적어도 하나의 가변 도메인은 인간 항체로부터의 하나 이상의 아미노산을 함유하는 한편, 다른 아미노산은 비-인간 모 항체의 아미노산임)를 포함한다. 통상적으로, "인간화 항체"는 비-인간 모 항체(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류 등)의 CDR 및 자연 인간 항체 또는 인간 항체 컨센서스의 것과 동일한 프레임워크를 함유한다. 이러한 예에서, 상기 "인간화 항체"는 완전 인간화된 것을 특징으로 한다. "인간화 항체"는 또한 인간 항체 또는 인간 항체 컨센서스의 것과 일치하지 않는 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 이러한 치환은, 예를 들어, 항체 특징(예를 들어, 친화성, 특이성 등)을 보존할 수 있는 역-돌연변이(예를 들어, 비-인간 아미노산의 재도입)를 포함한다. 이러한 치환은 보통 프레임워크 영역 내에 존재한다. "인간화 항체"는 또한 통상적으로 인간 항체의 것인 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 선택적으로 포함한다. 통상적으로, "인간화 항체"의 불변 영역은 인간 항체의 것과 동일하다.
물론, 본원에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 임의의 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 항체 일부(경쇄 또는 중쇄 가변 영역)는 인간화 기술, 하이브리도마 기술, 트랜스제닉 마우스 기술 또는 그 밖의 것을 통해 수득되는지의 여부와 관계 없이 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항체의 프레임워크 아미노산이 자연 인간 항체의 프레임워크 아미노산과 80% 내지 100%(예를 들어, 85 내지 100%; 90 내지 100%, 95 내지 100%) 동일할 수 있음이 본원에서 이해되어야 한다. 보통, 프레임워크 아미노산이 자연 항체의 상응하는 아미노산과 동일하지 않은 경우, 이러한 아미노산은 본래의 아미노산(예를 들어, 마우스 아미노산)과 동일하게 남아 있을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "1 내지 25"는 모든 개별적 값 및 범위, 예를 들어, 1, 2, 3, 및 25 이하; 1 내지 25; 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19; 1 내지 18; 1 내지 17; 1 내지 16; 1 내지 15 등; 2 내지 25, 2 내지 24, 2 내지 23, 2 내지 22, 2 내지 21, 2 내지 20; 2 내지 19; 2 내지 18; 2 내지 17 등; 3 내지 25, 3 내지 24, 3 내지 23, 3 내지 22, 3 내지 21, 3 내지 20; 3 내지 19; 3 내지 18 등; 4 내지 25, 4 내지 24, 4 내지 23, 4 내지 22, 4 내지 21, 4 내지 20; 4 내지 19; 4 내지 18; 4 내지 17; 4 내지 16 등; 5 내지 25, 5 내지 24, 5 내지 23, 5 내지 22, 5 내지 21, 5 내지 20; 5 내지 19; 5 내지 18; 5 내지 17 등을 포함한다.
마찬가지로, 다른 범위, 예를 들어, "1 내지 22"는 모든 개별적 값 및 범위, 예를 들어, 1, 2, 3, 및 22 이하; 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15; 1 내지 14; 1 내지 13; 1 내지 12; 1 내지 11; 1 내지 10 등; 2 내지 22, 2 내지 21, 2 내지 20, 2 내지 19, 2 내지 18, 2 내지 17, 2 내지 16, 2 내지 15; 2 내지 14; 2 내지 13; 2 내지 12 등; 3 내지 22, 3 내지 21, 3 내지 20, 3 내지 19, 3 내지 18, 3 내지 17, 3 내지 16, 3 내지 15; 3 내지 14; 3 내지 13 등; 4 내지 22, 4 내지 21, 4 내지 20, 4 내지 19, 4 내지 18, 4 내지 17, 4 내지 16, 4 내지 15; 4 내지 14; 4 내지 13; 4 내지 12; 4 내지 11 등; 5 내지 22, 5 내지 21, 5 내지 20, 5 내지 19, 5 내지 18, 5 내지 17, 5 내지 16, 5 내지 15; 5 내지 14; 5 내지 13; 5 내지 12 등을 포함한다.
본 발명의 한 더욱 특정한 구현예에서, SEQ ID NO.:6으로부터 유래된 경쇄 가변 영역에서 이루어질 수 있는 아미노산 치환의 수는, 예를 들어, 1 내지 11개의 아미노산 치환일 수 있다.
본 발명의 또 다른 더욱 특정한 구현예에서, SEQ ID NO.:12로부터 유래된 중쇄 가변 영역에서 이루어질 수 있는 아미노산 치환의 수는, 예를 들어, 1 내지 21개의 아미노산 치환일 수 있다. 일부 예에서, SEQ ID NO.:12를 고려하는 경우, 적어도 3개의 아미노산 치환을 갖는 것이 유용할 수 있다.
본 발명의 추가의 더욱 특정한 구현예에서, SEQ ID NO.:22로부터 유래된 경쇄 가변 영역에서 이루어질 수 있는 아미노산 치환의 수는, 예를 들어, 1 내지 10개의 아미노산 치환일 수 있다.
본 발명의 또 다른 추가의 더욱 특정한 구현예에서, SEQ ID NO.:26의 중쇄 가변 영역에서 이루어질 수 있는 아미노산 치환의 수는, 예를 들어, 1 내지 18개의 아미노산 치환일 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 산 치환은, 예를 들어, 경쇄 가변 영역에 존재할 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 아미노산 치환은, 예를 들어, 중쇄 가변 영역에 존재할 수 있다.
따라서, 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO.:6 또는 SEQ ID NO.:22와 비교하여 22개 이하의 아미노산 치환을 갖는 경쇄 가변 영역을 가질 수 있고, SEQ ID NO.:12 또는 SEQ ID NO.:26와 비교하여 25개 이하의 아미노산 치환을 갖는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편이 2개의 경쇄 가변 영역 및 2개의 중쇄 가변 영역을 갖는 경우, 경쇄 가변 영역의 각각의 하나는 독립적으로 20개 이하의 아미노산 치환을 가질 수 있고, 중쇄 가변 영역의 각각의 하나는 20개 이하의 아미노산 치환을 가질 수 있음이 본원에서 이해되어야 한다.
본원에서 논의된 바와 같이, 아미노산 치환은 보존성 또는 비보존성 치환일 수 있다. 예시적 구현예에서, 아미노산 치환은 보존성 치환일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 요망되는 경우 SEQ ID NO.:6, SEQ ID NO.:12, SEQ ID NO.:22 및/또는 SEQ ID NO.:26과 비교하여 결실을 나타내는 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있는 것이 본원에서 이해되어야 한다. 상기 결실은, 예를 들어, 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역의 아미노-말단 또는 카르복시-말단에서 발견될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 또 다른 예시적 구현예는, 예를 들어, SEQ ID NO.:33, SEQ ID NO.:34, SEQ ID NO.:35, SEQ ID NO.:8 또는 SEQ ID NO.:10 중 임의의 것의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "SEQ ID NO.:33의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 또한 용어 "적어도 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개, 또는 적어도 112개의 연속적 아미노산"을 포함한다. 용어 "SEQ ID NO.:33의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 SEQ ID NO.:33에서 발견되는 적어도 90개의 연속적 아미노산의 임의의 가능한 서열 및 특히 SEQ ID NO.:33의 3개의 CDR을 포함하는 서열, 예를 들어, SEQ ID NO.:33의 아미노산 6 내지 108, 5 내지 109, 13 내지 103, 14 내지 111을 포함하는 서열 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "SEQ ID NO.:34의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 또한 용어 "적어도 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개, 또는 적어도 112개의 연속적 아미노산"을 포함한다. 용어 "SEQ ID NO.:34의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 SEQ ID NO.:34에서 발견되는 적어도 90개의 연속적 아미노산의 임의의 가능한 서열 및 특히 SEQ ID NO.:34의 3개의 CDR을 포함하는 서열, 예를 들어, SEQ ID NO.:34의 아미노산 7 내지 109, 12 내지 104, 22 내지 112, 18 내지 112를 포함하는 서열 등을 포함한다.
용어 "SEQ ID NO.:35의 적어도 90개의 연속적 아미노산", "SEQ ID NO.:8의 적어도 90개의 연속적 아미노산" 또는 "SEQ ID NO.:10의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 유사한 의미를 갖는다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, SEQ ID NO.:8 또는 SEQ ID NO.:10에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, SEQ ID NO.:36, 37, 38, 14, 16, 18 또는 20 중 임의의 것의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역을 포함한다(또는 이를 추가로 포함한다).
본원에서 사용되는 용어 "SEQ ID NO.:36의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 또한 용어 "적어도 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개 또는 적어도 123개의 연속적 아미노산"을 포함한다. 용어 "SEQ ID NO.:36의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 SEQ ID NO.:36에서 발견되는 적어도 90개의 연속적 아미노산의 임의의 가능한 서열, 및 특히 SEQ ID NO.:36의 3개의 CDR을 포함하는 서열, 예를 들어, SEQ ID NO.:36의 아미노산 1 내지 106, 2 내지 112, 11 내지 113, 7 내지 102를 포함하는 서열 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "SEQ ID NO.:37의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 또한 용어 "적어도 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개, 112개, 113개, 114개, 115개, 116개, 117개, 118개, 119개, 120개, 121개, 122개 또는 적어도 123개의 연속적 아미노산"을 포함한다. 용어 "SEQ ID NO.:37의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 SEQ ID NO.:37에서 발견되는 적어도 90개의 연속적 아미노산의 임의의 가능한 서열, 및 특히 SEQ ID NO.:37의 3개의 CDR을 포함하는 서열, 예를 들어, SEQ ID NO.:37의 아미노산 6 내지 109, 8 내지 113, 1 내지 102, 2 내지 105를 포함하는 서열 등을 포함한다.
용어 "SEQ ID NO.:38의 적어도 90개의 연속적 아미노산", "SEQ ID NO.:14의 적어도 90개의 연속적 아미노산", "SEQ ID NO.:16의 적어도 90개의 연속적 아미노산", "SEQ ID NO.:18의 적어도 90개의 연속적 아미노산" 또는 "SEQ ID NO.:20의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 유사한 의미를 갖는다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, SEQ ID NO.:14, 16, 18 또는 20에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
본 발명에 따르면, 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, 하기를 포함할 수 있다:
a) SEQ ID NO.:33의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO.:36, SEQ ID NO.:37, SEQ ID NO.:38, SEQ ID NO.:14, SEQ ID NO.:16, SEQ ID NO.:18 또는 SEQ ID NO.:20 중 임의의 것의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역;
b) SEQ ID NO.:34의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO.:36, SEQ ID NO.:37, SEQ ID NO.:38, SEQ ID NO.:14, SEQ ID NO.:16, SEQ ID NO.:18 또는 SEQ ID NO.:20 중 임의의 것의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역;
c) SEQ ID NO.:35의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO.:36, SEQ ID NO.:37, SEQ ID NO.:38, SEQ ID NO.:14, SEQ ID NO.:16, SEQ ID NO.:18 또는 SEQ ID NO.:20 중 임의의 것의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역;
d) SEQ ID NO.:8의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO.:36, SEQ ID NO.:37, SEQ ID NO.:38, SEQ ID NO.:14, SEQ ID NO.:16, SEQ ID NO.:18 또는 SEQ ID NO.:20 중 임의의 것의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역; 또는
e) SEQ ID NO.:10의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO.:36, SEQ ID NO.:37, SEQ ID NO.:38, SEQ ID NO.:14, SEQ ID NO.:16, SEQ ID NO.:18 또는 SEQ ID NO.:20 중 임의의 것의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역.
본 발명의 더욱 특정한 구현예에 따르면, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO.:8 또는 10의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO.:14, 16, 18 또는 20의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 더욱 더 특정한 구현예에 따르면, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO.:8 또는 10에 기재된 바와 같을 수 있고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO.:14, 16, 18 또는 20에 기재된 바와 같을 수 있다.
더욱 특히, SEQ ID NO.:8에 기재된 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO.:14에 기재된 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체가 고려된다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 다른 예시적 구현예는 SEQ ID Nos. 39, 40, 41, 또는 24 중 임의의 것의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있는 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "SEQ ID NO.:39의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 또한 용어 "적어도 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개 또는 적어도 112개의 연속적 아미노산"을 포함한다. 용어 "SEQ ID NO.:39의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 SEQ ID NO.:39에서 발견되는 적어도 90개의 연속적 아미노산의 임의의 가능한 서열, 및 특히 SEQ ID NO.:39의 3개의 CDR을 포함하는 서열, 예를 들어, SEQ ID NO.:39의 아미노산 6 내지 102, 11 내지 106, 1 내지 106, 3 내지 95, 5 내지 95을 포함하는 서열 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "SEQ ID NO.:40의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 또한 용어 "적어도 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개 또는 적어도 112개의 연속적 아미노산"을 포함한다. 용어 "SEQ ID NO.:40의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 SEQ ID NO.:40에서 발견되는 적어도 90개의 연속적 아미노산의 임의의 가능한 서열, 및 특히 SEQ ID NO.:40의 3개의 CDR을 포함하는 서열, 예를 들어, SEQ ID NO.:40의 아미노산 9 내지 106, 10 내지 101, 1 내지 98, 3 내지 99, 7 내지 107를 포함하는 서열 등을 포함한다.
용어 "SEQ ID NO.:41의 적어도 90개의 연속적 아미노산" 또는 "SEQ ID NO.:24의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 유사한 의미를 갖는다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, SEQ ID NO.:24에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, SEQ ID NO.:42, 43, 44 또는 26 중 임의의 것의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역을 포함한다(또는 이를 추가로 포함한다).
본원에서 사용되는 용어 "SEQ ID NO.:42의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 또한 용어 "적어도 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개, 112개, 113개, 114개, 115개, 116개, 117개 또는 적어도 118개의 연속적 아미노산"을 포함한다. 용어 "SEQ ID NO.:42의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 SEQ ID NO.:42에서 발견되는 적어도 90개의 연속적 아미노산의 임의의 가능한 서열, 및 특히 SEQ ID NO.:42의 3개의 CDR을 포함하는 서열, 예를 들어, SEQ ID NO.:42의 아미노산 6 내지 111, 1 내지 106, 2 내지 104, 5 내지 106, 10 내지 107을 포함하는 서열 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "SEQ ID NO.:43의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 또한 용어 "적어도 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개, 112개, 113개, 114개, 115개, 116개, 117개 또는 적어도 118개의 연속적 아미노산"을 포함한다. 용어 "SEQ ID NO.:43의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 SEQ ID NO.:43에서 발견되는 적어도 90개의 연속적 아미노산의 임의의 가능한 서열, 및 특히 SEQ ID NO.:43의 3개의 CDR을 포함하는 서열, 예를 들어, SEQ ID NO.:43의 아미노산 3 내지 107, 1 내지 115, 1 내지 110, 22 내지 116, 20 내지 115를 포함하는 서열 등을 포함한다.
용어 "SEQ ID NO.:44의 적어도 90개의 연속적 아미노산" 또는 "SEQ ID NO.:26의 적어도 90개의 연속적 아미노산"은 유사한 의미를 갖는다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, SEQ ID NO.:26에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역을 가질 수 있다.
본 발명에 따르면, 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, 하기를 포함할 수 있다:
a) SEQ ID NO.:39의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO.:42, SEQ ID NO.:43, SEQ ID NO.:44 또는 SEQ ID NO.:26 중 임의의 것의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역;
b) SEQ ID NO.:40의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO.:42, SEQ ID NO.:43, SEQ ID NO.:44 또는 SEQ ID NO.:26 중 임의의 것의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역;
c) SEQ ID NO.:41의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO.:42, SEQ ID NO.:43, SEQ ID NO.:44 또는 SEQ ID NO.:26 중 임의의 것의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역; 또는
d) SEQ ID NO.:24의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO.:42, SEQ ID NO.:43, SEQ ID NO.:44 또는 SEQ ID NO.:26 중 임의의 것의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함할 수 있는 중쇄 가변 영역.
본 발명의 더욱 특정한 구현예에 따르면, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO.:24의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 가질 수 있고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO.:26의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 가질 수 있다.
본 발명의 더욱 더 특정한 구현예에 따르면, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO.:24에 기재된 바와 같을 수 있고, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO.:26에 기재된 바와 같을 수 있다.
본 발명의 구현예는 더욱 특히 하기로 구성되는 그룹으로부터 선택된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다:
a. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:13에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
b. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:15에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
c. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:17에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
d. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:19에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
e. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:29에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
f. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:59에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
g. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:60에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
h. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:61에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
i. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:13에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
j. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:15에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
k. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:17에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
l. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:19에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
m. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:29에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
n. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:59에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
o. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:60에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
p. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:61에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
q. SEQ ID NO.:23에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:27에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
r. SEQ ID NO.:23에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:46에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
본 발명의 다른 구현예는 하기로 구성되는 그룹으로부터 선택된 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다:
a. SEQ ID NO.:5에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:13에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
b. SEQ ID NO.:5에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:15에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
c. SEQ ID NO.:5에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:17에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
d. SEQ ID NO.:5에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:19에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
e. SEQ ID NO.:5에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:29에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
f. SEQ ID NO.:5에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:59에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
g. SEQ ID NO.:5에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:60에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
h. SEQ ID NO.:5에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:61에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
i. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:11에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
j. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:30에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
k. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:11에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및
l. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:30에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 상기 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 가질 수 있고, 불변 영역의 아미노산, 예를 들어, 인간 항체의 불변 영역의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.
예시적 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, 인간 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상응하는 IgG2 서브타입*또는 다른 서브타입)과 비교하여 적어도 10배의 활성에서의 증가를 갖는 IgG1 서브타입의 항-Siglec-15 항체가 특히 고려된다.
적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 95배, 100배 또는 그 초과의 IgG1-기반 항-Siglec-15 항체의 효능에서의 증가 또는 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 95배, 100배 또는 그 초과의 이의 친화성에서의 증가가 특히 유용할 수 있다.
효능 또는 친화성에서의 증가는 동일하거나 실질적으로 동일한 CDR 또는 가변 영역을 갖는 상이한 항체 서브타입과 비교하여 파골세포 분화 또는 파골세포 활성을 억제하는 IgG1-기반 항-Siglec-15 항체의 능력에 의해 측정될 수 있다. 일부 환경에서, 시험관내에서 파골세포 분화 및/또는 골 재흡수를 억제하기 위한 시도를 위해 10 ng/㎖ 또는 100ng/㎖만큼 낮은 IgG1 항체 농도 이용을 고려하는 것이 가능할 수 있다. 예를 들어, 상응하는 IgG2-기반 항-Siglec-15와 비교하는 경우 IgG1-기반 항-Siglec-15 항체의 낮은 투여량이 요망되는 치료 효과를 달성할 수 있는 것이 본원에서 이해될 수 있다.
특히 고려되는 항체는 카파 경쇄 불변 영역 및 IgG1 중쇄 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다.
본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은, 예를 들어, 본원에 기재된 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체를 포함한다. 본원에서 확인된 아미노산 서열을 갖는 인간 및 인간화 항체가 특히 고려된다.
a) SEQ ID NO.:6에 기재된 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO.:12에 기재된 중쇄 가변 영역, 또는 b) SEQ ID NO.:22에 기재된 경쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO.:26에 기재된 중쇄 가변 영역으로 구성된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 서열이 마우스 기원(즉, 비-인간 항체)인 것으로 간주되는 것이 본원에서 이해되어야 한다.
본원에 기재된 바와 같이, 비-인간 항체의 인간화는, 예를 들어, 프레임워크 아미노산의 자연 인간 항체의 상응하는 아미노산으로의 치환에 의해 수행될 수 있다. 치환은 보통 항원 결합에 부정적으로 영향을 미치지 않는 방식으로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 예시적 구현예에 따르면, 항원 결합 단편은, 예를 들어, scFv, Fab, Fab' 또는 (Fab')2일 수 있다.
실시예
재조합 Siglec-15에 대한 결합 검정 및 인간 파골세포의 분화 및 활성을 억제하는 이들의 능력의 평가를 기초로 하여, 후보 선도 항체 25D8 및 25E9를 인간화를 위해 선택하였다. 본 실험 레포트는 인 실리코(in silico) 인간화 절차 및 생성되는 항체의 인간화 형태를 기재한다.
실시예 1. 마우스 25 D8 및 25 E9 모노클로날 항체의 가변 영역의 3D 모델링 .
본 작업을 상동성 모델링에 의해 달성하였다. 뮤린 25D8(SEQ ID NO.:22 및 SEQ ID NO.:26) 및 25E9(SEQ ID NO.:6 및 SEQ ID NO.:12) 가변 서열에 대해 가장 유사한 주형 구조를 PDB에 대한 blast 검색에 의해 확인하였다. 마우스 25D8 가변 영역의 최초 모델을 제조하기 위해, 다음 주형 구조를 이용하였다(PDB 코드): 경쇄에 대해 3CFC, 및 중쇄에 대해 1NGQ. 마우스 25E9 가변 영역의 최초 모델을 제조하기 위해, 다음 주형 구조를 이용하였다: 경쇄에 대해 1AE6, 및 중쇄에 대해 1NMC. 뮤린 25D8 및 25E9 서열에 따른 상기 주형 구조에 대해 돌연변이화를 수행하였다: 3CFC 경쇄 내의 3개의 돌연변이(모두 CDR 내), 1NGQ 중쇄 내의 17개의 돌연변이(프레임워크 내 3개, CDR 내 14개), 1AE6 경쇄 내의 7개의 돌연변이(프레임워크 내 4개, CDR 내 3개), 및 1NMC 중쇄 내의 34개의 돌연변이(프레임워크 내 17개, CDR 내 17개). 각각의 항체 내의 CDR-H3 루프(1NGQ로부터 25D8까지 2-잔기 결실이 이루어지고, 1NMC로부터 25E9까지 1-잔기 삽입이 이루어짐)를 제외하고는 CDR 루프는 길이에 있어서 어떠한 조정도 필요로 하는 것을 나타내지 않았다. 뮤린 25D8 및 25E9 가변 도메인의 중쇄 및 경쇄에 해당하는 돌연변이화된 구조를 각각의 주형 구조의 중쇄 및 경쇄를 중첩시킴으로써 2-사슬 항체 구조로 실질적으로 어셈블리시켰다. AMBER 역장(AMBER force-field)을 이용한 에너지 최소화 및 처음 완화된 CDR 루프로부터 마지막 단계에서 오직 완전히 완화된 프레임워크 영역의 백본 중원자 범위의 압박의 단계적 해방에 의해 어셈블리된 25D8 및 25E9 가변 도메인의 생성된 구조를 먼저 상세화시켰다. 이후, 각각의 항체 가변 도메인 구조 내의 CDR-H3 루프를 몬테-카를로-최소화(MCM) 입체형태 샘플링(Monte-Carlo-minimization (MCM) conformational sampling)에 의해 상세화시켰고, 여기서 CDR-H3 영역 내의 이면각이 각각의 MCM 주기 후, CDR-H3 루프의 최초 입체형태 주위에 10Å로 펼쳐진 소정의 영역의 에너지 최소화에 의해 샘플링되었다.
마우스 25D8 및 25E9 항체의 모델화된 가변 영역의 대표도가 도 1a 및 도 1b에 각각 제공된다. 마우스 25D8(도 1a) 및 마우스 25E9(도 1b) 항체의 가변 영역의 상동성 3D-모델. CDR을 표지하였다(경쇄 내의 L1, L2, L3, 및 중쇄 내의 H1, H2, H3). 인간 프레임워크 잔기에 의해 대체된 마우스 프레임워크 잔기가 청색 구체 모델로 표시된다. 25E9 중쇄 내의 유지된 마우스 잔기는 적색 구체 모델로 제시되며, 표지된다.
25D8 및 25E9 가변 서열 각각과 가장 유사한 인간 또는 인간화 가변 서열의 구조를 또한 PDB로부터 확인한 후, 뮤린 25D8 및 25E9 가변 도메인의 모델화된 구조 상에 중첩시켰다. 이는 모델화된 뮤린 3D-구조로부터 시작하여 인간화 3D-구조를 제조하기 위해 프레임워크 영역 내의 측쇄 돌연변이화의 모델링을 도왔다.
실시예 2. 마우스 25 D8 및 25 E9 아미노산 서열 및 모델화된 구조의 특성규명.
본 단계를 인간성 지표, 항원 접촉 경향 지표를 평가하고, CDR, 정준 잔기, 사슬간 패킹(VH/VL 경계면 잔기), 가변-/불변-영역 패킹(VH/CH 및 VL/CL 경계면 잔기), 비정상적 프레임워크 잔기, 잠재적 N- 및 O-당화 부위, 매몰 잔기, 베르니어 구역(Vernier zone) 잔기, 및 CDR에 대한 근접성을 기재하기 위해 수행하였다. 상기 특성을 평가하기 위해 인터넷-이용가능 리소스 및 로컬 소프트웨어를 이용하였다.
실시예 3. 마우스 CDR 에 대한 최적 인간 경쇄 및 중쇄 프레임워크의 선택.
본 실시예를 인간 점라인 데이터베이스의 로컬 카피(VBASE), 및 다른 서열 라이브러리(Genbank 및 SwissProt)에 대한 표준 서열 상동성 비교, 뿐만 아니라 인간 프레임워크 컨센서스 서열의 세트에 의해 수행하였다. BLAST 검색을 CDR 루프의 길이를 매칭시키면서 오직 프레임워크 내(따라서 CDR을 제외함)에서 가장 높은 상동성을 갖는 서열 매치를 검색하기 위해 수행하였다. 중쇄 및 경쇄에 대해 확인된 인간 프레임워크는 25D8 및 25E9 항체 둘 모두에 대해 각각 k2 및 h1 클래스에 해당한다. 돌연변이화를 위한 후보 위치에서 아미노산 변이성을 평가할 뿐만 아니라 인간화시 친화성 손실의 경우에서의 백업으로서 적합한 프레임워크 서열의 풀(pool)을 제공하기 위해 여러 매우 유사한 인간 프레임워크 서열을 유지시켰다.
이들 상동성 인간 프레임워크 서열이 도 2 및 3의 뮤린 25D8 및 25E9 서열에 각각 정렬된다. 케이뱃(Kabat) 넘버링 및 항원 접촉 경향 스코어가 상단에 제시된다. CDR은 회색으로 강조된다. 역돌연변이화를 위한 후보 잔기가 CDR에 대한 근접성, 표면 노출, 및 쌍을 이룬 가변 도메인과의 접촉에 따라 서열 정렬 아래에서 강조된다. 역돌연변이화를 위한 일차 후보 위치가 화살표에 의해 표시된다.
실시예 4. 입체형태 및 항원 결합에 영향을 미칠 수 있는 마우스 프레임워크 잔기 확인.
본 실시예는 특히 신중히 상응하는 인간 서열로 돌연변이화되어야 하는 아미노산 잔기를 플래깅(flagging)시키기는 중요한 단계이다. 이들 잔기는 친화성 손실의 경우 마우스 서열로의 역돌연변이화를 위한 일차 후보이다. 이는 특히 항체-항원 복합체의 실험 구조의 부재하에서 설계에 의한 인간화의 가장 어렵고 예측불가능한 단계이다. 이는 다음 카테고리 중 하나 이상에서의 잔기의 확인에 의존한다: 정준, CDR-H3, 베르니어 구역, 비정상, CDR-근접(5Å 이내), 사슬간 패킹, 및 당화-부위 잔기. 상기 잔기는 항원-결합 부위 및 친화성에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미칠 수 있다. 항원 접촉 경향 지표뿐만 아니라 각각의 위치에서의 인간 점라인 데이터베이스에서의 아미노산 발생이 또한 특정 잔기가 마우스 서열로부터 인간 서열로 안전하게 돌연변이될 수 있는지의 여부를 결정하는데 매우 중요하다. 25D8 및 25E9 경쇄 및 중쇄 가변 서열의 제안된 인간화 서열이 도 2 및 3에 각각 제시된다. 각각의 인간화 서열 및 이들의 공여자 마우스 서열 및 여러 정렬된 후보 수용자 인간 서열 사이의 프레임워크 돌연변이의 수가 또한 나열된다(괄호 내에 프레임워크의 백분율로 제공됨). 돌연변이화된 잔기 및 역돌연변이에 대한 후보 잔기가 또한 도 1, 2 및 3에 표시된다. 관찰될 수 있는 바와 같이, 25D8 및 25E9 항체의 경쇄는 이들의 각각의 제안된 인간화 프레임워크에 대해 각각 9 및 11개의 돌연변이를 필요로 하는 것으로 보인다. 이는 경쇄에 대한 100% 프레임워크 인간화 시도이다. 각각의 항체의 중쇄는 25D8의 경우 18개 및 25E9의 경우 17개와 같이 인간화를 위해 이들의 경쇄보다 실질적으로 더 많은 돌연변이를 필요로 하는 것으로 보인다. 또한, 중쇄에 대한 인간화 서열은 인간 프레임워크 서열에 대해 완전히(100%) 상응하지 않는다. 특히, 25E9 중쇄의 경우, 제안된 프레임워크 인간화의 가장 높은 수준은 처음 시도에서 94%이며, 이는 가장 가까운 인간 프레임워크 서열로부터의 인간화 서열에서 5개의 잔기가 상이한 것으로 해석된다. 25E9 마우스 서열로부터 상기 잔기 중 4개를 유지시키는 결정은, 돌연변이가 GluH1, IleH2, ThrH93, 및 SerH94의 위치에 도입되는 경우 항원-결합 CDR에 대한 근접으로 인해 항원-결합 친화성을 변경시킬 높은 가능성을 나타낸 신중한 구조적 및 비교 서열 분석을 기초로 하였다(도 1b 참조). Glu가 인간 프레임워크 서열 내의 H1 위치에서 발견된 흔한 잔기임이 인지되어야 한다(도 3 참조). 가장 가까운 인간 프레임워크로부터의 인간화 서열 내에서 상이한 다섯번째 잔기는 마우스 서열 내의 HisH43이며, 이는 인간화 서열에서 GlnH43으로 돌연변이화되었다(Gln은 상기 위치에서 흔한 한편, His는 드물다). 25D8 가변 중쇄 프레임워크의 인간화의 경우, 인간화는 99%에 도달했고, 즉, 가장 가까운 인간 프레임워크 서열과 비교하여 제안된 인간화 서열의 프레임워크에서 1개의 잔기 차이가 있었고, 인간화 서열 내의 GluH81이 가장 가까운 인간 프레임워크에서 보이는 AspH81 대신 마우스 서열의 GlnH81을 대체하였다. 위치 H81에서 Asp 대신 Glu로 돌연변이화시키는 결정은 인간 프레임워크에서의 상기 2개의 가능한 치환의 상대적 발생을 기초로 하였다(도 2 참조). 종합적으로, 25D8 항체의 인간화가 25E9 항체의 인간화보다 용이한 것으로 결론내려질 수 있다.
실시예 5. 추가 구조 분석
재조합 발현을 위한 인간화 서열을 제공하기 전, 추가 구조 분석은 신호 펩티드의 선택, 아이소형의 선택, 및 가변-/불변-영역 접합부에서의 구조적 적합성의 분석을 포함하였다. 또한, 마우스 항체와 인간화 항체 사이의 사슬간 패킹 및 가변-/불변-영역 패킹의 비교 분석은 25D8 및 25E9 인간화의 경우, 경쇄/중쇄 쌍형성으로서 인간화 및 키메라(마우스 가변 영역) 사슬을 조합시키는 하이브리드 항체, 즉, 마우스/마우스(M/M), 마우스/인간화(M/H), 인간화/마우스(H/M) 및 인간화/인간화(H/H)를 발생시키는 것이 실행가능할 수 있음을 나타내었다. 25D8 및 25E9 전장 IgG2 항체에 대한 어셈블리된 인간화 및 키메라 서열은 각각 도 4a 및 도 4b에 제시된다. 25D8 및 25E9 전장 IgG1 항체에 대한 어셈블리된 인간화 및 키메라 서열은 각각 도 12a 및 도 12b에 제시된다.
항체의 다른 예시적 구현예는, 예를 들어, 본원에 개시된 경쇄 각각과 본원에 개시된 중쇄 변이체 각각을 혼합시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체는 25E9 경쇄 인간화 변이체 2 변이성 도메인(SEQIDNO.:10) 및 25E9 중쇄 인간화 가변 도메인 변이체 1, 2, 3 또는 4(SEQ IDNO.:14, 16, 18 또는 20)를 각각 포함하는 경쇄 및 중쇄의 회합에 의해 생성될 수 있다. 25E9 경쇄 인간화 변이체 1 가변 도메인(SEQIDNO.:8) 및 25E9 중쇄 인간화 가변 도메인 변이체 1, 2, 3 또는 4(SEQ ID NO.:14, 16, 18 또는 20)를 각각 포함하는 경쇄 및 중쇄의 회합에 의해 생성된 항체가 특히 고려된다. 경쇄 인간화 변이체 1 가변 도메인(SEQIDNO.:8) 및 중쇄 인간화 가변 도메인 변이체 1(SEQ ID NO.:14)(별칭으로, L1H1 IgG2 변이체(SEQ ID NOs.:7 및 29) 또는 L1H1 IgG1 변이체(SEQ ID NOs.:7 및 13))를 포함하는 인간화 25E9 항체가 추가 실험을 위해 선택되었다. 그러나, 본원에 개시된 실험을 기초로 하여, 카파 경쇄 불변 영역 및 IgG1 중쇄 불변 영역을 갖는 항체가 흥미로운 특징을 갖는 것으로 보인다(예를 들어, L1H1 IgG1 변이체(SEQ ID NOs. 7 및 13)).
SEQ ID NO.:7의 경쇄와 SEQ ID NOs. 13, 15, 17, 19, 29, 59, 60 또는 61에 기재된 중쇄 중 임의의 중쇄의 회합, 또는 SEQ ID NO.:9의 경쇄와 SEQ ID NOs. 13, 15, 17, 19, 29, 59, 60, 또는 61에 기재된 중쇄 중 임의의 중쇄의 회합에 의해 제조된 항체 또는 항원 결합 단편이 고려된다.
실시예 6. 인간화 Siglec -15 항체의 결합 파라미터의 분석.
마우스 및 선택된 인간화 또는 키메라 25D8 IgG2 및 인간화 25E9(L1H1 IgG2, L1H1 IgG1, L1H2 IgG1, L1H3 IgG 및 L1H1 IgG1 변이체) 항체의 작은 로트(lot)를 일시적 트랜스펙션에 의해 생성시키고, 정제시켜, 일부 비교 분석이 수행되도록 하였다. 재조합 Siglec-15와 다양한 항체의 직접 결합을 측정하기 위해 표면 플라즈몬 공명(SPR) 방법을 이용하였다. ELISA 방법에서와 같이, SPR 실험에서 사용된 Siglec-15를 293-6E 세포에서 Fc-Siglec-15 융합 단백질로 발현시켰다. Fc 컨쥬게이트로서, 상기 단백질이 Fc 영역에서의 동종이합체 상호작용에 의해 이합체로 발현될 수 있음이 인지되어야 한다. 이러한 발생은 결합 동안 친화 상수의 직접적인 결정을 가능케 하지 않는 결합 효과를 발생시킬 수 있다. 또한, 항체 및 Siglec-15 단백질 둘 모두에서의 Fc 영역의 존재는 직접적인 친화성 결정을 허용하지 않는다. 따라서, 각각의 항체 샘플의 결합 결과는 단지 서로 관련하여 제시된다.
연구를 수행하기 위해, 키메라(마우스 가변 영역) 25D8 IgG2, 키메라 25E9 IgG2, 인간화 25D8 IgG2 또는 인간화 25E9 L1H1 IgG2 변이체로부터의 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 직접 사용하였다. 비교를 위해, 완전 마우스 항체의 정제된 제조물을 또한 시험하였다. 항체의 정제된 배치(batch)의 경우, 크기-배제 크로마토그래피를 모든 단백질 샘플에 적용시켜 제조물 내에서의 응집의 비율을 감소시켰다. SPR을 위해, Fc-Siglec-15를 센서 칩 상에 고정시키고, 항체 희석액을 칩 상에 주입(유동)시켰다. 25D8 및 25E9 항체에 대한 대표적 스캔이 도 5a 및 도 5b에 각각 제시된다.
25D8 항체에 대해, 항체의 마우스, 키메라 및 인간화 형태 사이에서 스캔은 매우 유사하였다. 이는 동적 파라미터가 상기 항체의 인간화 동안 유의하게 변경되지 않은 것을 나타내었다. 크로마토그램 사이에 약간의 차이가 존재하지만, 이는 비교가 정제된 항체와 세포 상층액 사이에 이루어졌다는 사실을 가정하여 예상된 것이었다.
25E9 항체의 경우, 키메라 및 마우스 항체에 대한 크로마토그램은 매우 유사하였다. 인간화 25E9 L1H1 IgG2 변이체에 대해, 결합 속도 및 분리 속도는 다른 형태에 비해 약간 상이한 것으로 보였다. 이는 세포 상층액으로부터의 간섭으로 인한 것이었을 수 있다. 상기 차이에도 불구하고, 인간화 25E9 L1H1 IgG2 변이체의 실제 친화 상수는 마우스 항체의 친화 상수와 매우 유사한 것으로 예상되었다.
본 발명자는 배양된 세포의 표면 상에서 발현된 인간 Siglec-15와 상호작용하는 인간화 항체의 능력을 시험하였다. 인간 293-6E 세포를 약 1.5 x 106개의 세포/㎖의 세포 밀도로 성장시키고, 전체 인간 Siglec-15 cDNA를 인코딩하는 발현 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 24시간 후, 세포를 수거하고, 계수하고, 1 x 105개의 세포를 4 C에서 1시간 동안, 증가하는 농도의 25E9의 인간화된 IgG1 변이체와 함께 인큐베이션시켰다. 저온 PBS를 이용한 세척 단계 후, 결합된 25E9를 FITC에 컨쥬게이션된 항-인간 카파 경쇄 IgG로 검출하였다. 형광 표지된 세포를 유세포측정기에 주입하여 온전한 세포의 표면 상에서의 형광 신호를 측정하였다. 도 8에 제시된 바와 같이, 인간화 25E9 L1H1 IgG1 변이체는 농도 의존 방식으로 인간 Siglec-15를 발현하는 세포에 결합한다. 평균 KD는 낮은 나노몰 범위 내였다. 또한, 결합 파라미터는 CHO 세포 또는 293 세포에서 생성된 인간화 25E9 L1H1 IgG1 변이체의 존재하에서 매우 유사하였다. 대조군으로서, PBS, 대조군 IgG 또는 트랜스펙션되지 않은 293 세포와 함께 인큐베이션된 트랜스펙션된 세포는 Siglec-15와 인간화 25E9 L1H1 IgG1 변이체 사이의 상호작용의 특이성을 나타내는 형광 신호를 발생시키지 않았다. 다른 25E9 인간화 IgG1 항체 변이체(L1H2 IgG1, L1H3 IgG1, L1H4 IgG1 및 L1H1 IgG2) 또는 인간화 25D8 IgG2 항체로 유사한 결과가 수득되었다.
실시예 7. 항체 시험
세포 배양
파골세포 분화를 유도하기 위해, 10% 소태아혈청(Gibco) 및 1 mM 소듐 피루베이트를 함유하는 DMEM에서 성장시킨 마우스 RAW264.7 세포(ATCC, Manassas, VA)를 스크레이핑(scraping)시키고, PBS에 재현탁시켰다. 세포를 100 ng/㎖ 마우스 RANKL(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 함유하는 배지에 2x104개의 세포/㎠로 플레이팅하였다. 세포를 3일(면역형광 현미경검사법을 위함) 또는 4일(모든 다른 실험을 위함) 동안 분화시켰다. 인간 파골세포 전구체(CD14+ 말초 혈액 단핵 세포(PBMC))를 제조업체의 설명서에 따라 CD14 마이크로비드 및 MS 컬럼(Miltenyi Biotec, Cologne, Germany)을 이용하여 정상 인간 PBMC(AllCells, Emeryville, CA)로부터 분리시켰다. 세포를 10% 소태아혈청(HyClone), 1 mM 소듐 피루베이트(HyClone), 25 ng/㎖ 인간 MCSF 및 30 ng/㎖ 인간 RANKL(R&D Systems)을 함유하는 Alpha-MEM(Gibco) 중에 3.1x105개의 세포/㎠로 플레이팅하였다. 세포를 7일 동안 분화시켰고, 배지의 절반을 4일째에 대체하였다.
세포 자극
단일 항체를 이용한 세포 자극을 위해, 분화 배지를 다양한 시간에서 세포를 용해시키기 전에 표시된 항체 농도를 함유하는 신선한 성장 배지(RANKL이 없음)로 대체하였다. 일차 및 이차(가교) 항체를 이용한 자극을 위해, 분화 배지를 10 ㎍/㎖로 일차 항체를 함유하는 저온 성장 배지로 대체하고, 세포를 4 C에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 배지를 염소 항-인간 IgG 폴리클로날 항체(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)를 함유하는 가온 성장 배지로 대체하고, 세포를 용해 전에 37 C에서 표시된 시간 동안 인큐베이션하였다.
파골세포 TRAP 염색 및 시험관내 기능 검정
파골세포 분화 및 기능에 대한 항체의 효과를 시험하기 위해, 세포를 표시된 농도의 항체를 함유하는 배지에서 상기 기재된 바와 같이 분화하도록 유도시켰다. 파골세포를 TRAP 염색에 의해 배양 4일 후에 시각화시켰고, 간단히, 세포를 3.7% 포름알데하이드 중에 고정시키고, 0.2% Triton X-100/PBS로 투과화시키고, 37 C에서 약 30분 동안 TRAP 염색 완충액(100 mM 소듐 아세테이트, pH 5.2, 50 mM 소듐 타르트레이트, 0.01% Naphthol ASMX 및 0.06% Fast Red Violet)에서 인큐베이션하였다. TRAP 효소는 파골세포에서 적색 반응 생성물을 발생시킨다. 파골세포 재흡수 활성을 시험하기 위해, 세포를 칼슘 포스페이트 기질(Osteologic, BD BioSciences 또는 OsteoAssay, Corning)로 코팅된 웰에 시딩하고, 상기와 같이 분화하도록 유도하였다. 7일 후, 웰을 표백제로 처리하여 세포를 분리시키고, 기질 재흡수의 영역을 광학현미경검사법에 의해 관찰하였다. Siglec-15의 활성을 차단할 수 있는 항체(파골세포 또는 파골세포 전구체 세포 내에서)는, 예를 들어, 더 적은 TRAP-양성 다핵 세포를 나타낼 수 있거나, TRAP-양성 다핵 세포의 변경된 형태를 발생시킬 수 있다. 이는 도 9에 예시되어 있다. 상단 패널에 제시된 바와 같이, 1 ㎍/㎖의 인간화 25E9 항체(L1H1 IgG1 변이체)에 노출된 인간 파골세포(상단 우측 패널)는 성숙 다핵 파골세포를 적절하게 형성시킬 수 없었다. 대조적으로, 동등한 양의 대조군 항체로 처리된 인간 파골세포는 정상적으로 분화되었다(상단 중간 패널). 파골세포가 활발히 무기질화 기질을 분해함에 따라, Siglec-15의 활성을 차단할 수 있는 항체(파골세포 또는 파골세포 전구체 세포 내)는, 예를 들어, 대조군(예를 들어, Siglec-15에 결합하지 않는 항체, 항체의 부재 등)과 비교하여 더 적은, 칼슘 기질이 분해된 영역(박탈된 영역(denuded area))을 나타낼 수 있다. 인간 파골세포가 골-유사 표면으로 작용하는 칼슘 포스페이트 기질 상에서 분화된 경우(도 9 참조), 대조군 항체로 처리된 세포(하단 중간 패널)는 파골세포가 재흡수 활성을 보였음을 나타내는 더 큰 영역의 박탈된 칼슘 포스페이트를 발생시켰다. 대조적으로, 1 ㎍/㎖ 25E9(L1H1 IgG1 변이체)로 처리된 세포(하단 우측 패널)는 기질을 재흡수할 수 없었다. 이는 분화되지 않은 전구체 세포(하단 좌측 패널)과 동등하다.
파골세포를 억제하는 25D8 항체의 능력이 또한 인간화 후에 보존되었으나, 이의 효능은 항상 25E9 항체(인간화 25E9이거나 키메라 25E9이건 간에)의 효능보다 낮게 유지되었다.
또 다른 기술은 파골세포로 분화되고, 소 피질골 슬라이스 상에 플레이팅되는 CD14+ PBMC를 포함한다(분화는 플레이팅 전, 플레이팅 시 또는 플레이팅 후에 수행될 수 있다). 항-Siglec-15가 첨가되고, 골 슬라이스 표면 상에서 생성된 재흡수 피트(pit)가 반사경 현미경(reflected light microscopy)에 의해 관찰된다. Siglec-15의 활성을 차단할 수 있는 항체(파골세포 또는 파골세포 전구체 세포 내)는, 예를 들어, 더 적거나 더 작은 재흡수 피트를 발생시킬 수 있다.
본 실시예의 결과는 항-Siglec-15 인간화 항체가 파골세포 분화 및/또는 골 재흡수를 억제할 수 있는 것을 나타낸다.
내재화 검정
세포-표면 단백질을 비오티닐화시키기 위해, 분화된 RAW264.7-유래 파골세포를 1 mM CaCl2 및 1 mM MgCl2(PBS/Ca/Mg, HyClone)를 함유하는 저온 PBS로 2회 헹구고, 4 C에서 1시간 동안 PBS/Ca/Mg 중에서 1 ㎎/㎖로 희석된 비오티닐화 시약 sulfo-NHS-SS-비오틴(Pierce)과 함께 인큐베이션하였다. 글리신(PBS/Ca/Mg 중 100 mM)을 이용하여 미반응된 비오티닐화 시약을 켄칭시킴으로써 반응을 중지시켰다. Siglec-15 내재화를 유도하기 위해, 세포를 상기 "세포 자극"에 기재된 바와 같이 항-Siglec-15 항체 또는 대조군 인간 IgG 단독으로 또는 이차 가교 항체와 조합하여 처리하였다. 항체 처리 후, 세포를 저온 NT 완충액(20 mM Tris/HCl, pH 8.6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 0.2% BSA)으로 2회 헹구고, 저온 NT 완충액 중에서 25 mM로 제조된 소듐-2-머캅토에탄 설포네이트(MesNa)와 함께 2x25분 인큐베이션하여 sulfo-NHS-SS-비오틴의 이황화 결합을 감소시킴으로써, 임의의 남아있는 세포-표면 비오틴을 제거하였다. 최대 가능한 수준의 Siglec-15 비오티닐화를 측정하기 위해, 하나의 대조군에 대해 상기 MesNa 처리를 생략하였다(이들 대조군 세포를 NT 완충액 단독과 함께 2x25분 인큐베이션하였다). 이후, 남아있는 MesNa를 아이오도아세트아미드로 켄칭시키고, 15분 동안 PBS/Ca/Mg 중에 5 ㎎/㎖로 희석시켰다.
파골세포에 의해 내재화된 비오티닐화된 Siglec-15의 양을 평가하기 위해, 세포를 mRIPA 중에서 용해시켰다. 비오티닐화된 단백질을 스트렙타비딘 풀-다운(pull-down)에 의해 수거하였고, 250 ㎍의 용해질을 4 C에서 회전시키면서 50 ㎕의 Dynal MyOne 스트렙타비딘 비드(Invitrogen)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 광범위한 세척 후, Siglec-15를 웨스턴 블로팅에 의해 침전된 물질 중에서 검출하였다.
Siglec-15는 항체 라이게이션 후에 내재화되고 분해된다.
결합된 리간드 및 항체의 세포내이입을 매개하는 능력이 Siglec 패밀리의 일부 일원에 대해 입증되었고, 실제로, 치료 항체의 세포 흡수는 CD22 및 CD33 Siglec을 표적으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트의 작용 메커니즘의 중요한 양태이다(O'Reilly and Paulson, 2009). 흥미롭게도, Siglec-15는 또한 이의 세포질 도메인 내에 Yxxφ 서열을 함유하고(이러한 티로신, Y309는 또한 추정 ITIM 모티프의 일부임), Yxxf 모티프는 수용체 내재화를 조절하기 위해 클라트린 어댑터 AP-2와 상호작용할 수 있다(Angata et al., 2007; Bonifacino and Traub, 2003). 따라서, 본 발명자는 파골세포에서의 Siglec-15 세포내이입에 대한 항체 라이게이션의 효과를 연구하였다.
본 발명자는 먼저 단독이거나 이차 가교 항체와 조합된 Siglec-15 항체가 RAW264.7-유래 파골세포의 표면으로부터 비오틴으로 표지된 Siglec-15의 내재화를 유도할 수 있는지의 여부를 시험하였다. 항체 자극 후, 임의의 남아있는 세포-표면 비오틴을 환원제를 이용한 처리에 의해 방출시켰다. 이후, 세포를 용해시키고, 내재화시키고, 비오티닐화된 단백질을 스트렙타비딘 비드를 이용하여 수거하였다. Siglec-15를 웨스턴 블로팅에 의해 침전된 물질에서 검출하였다. 흥미롭게도, 본 발명자는 Siglec-15 항체 단독을 이용한 처리가 대조군 인간 IgG에 비해 많은 내재화를 유도한 한편(도 10a, 란세스(lances) 7 및 8 비교), 수용체 집락화를 유도하기 위한 이차 항체의 첨가는 단일 항체보다 효과가 덜한 것(도 10a, 레인 5)을 발견하였다.
본 발명자는 계속하여 면역형광 현미경검사법에 의해 Siglec-15의 항체-유도 세포내이입을 특정규명하였다. 유리 커버슬립 상에서 성장하는 RAW264.7-유래 파골세포를 4 C에서 정상 성장 배지에서 희석된 항-Siglec-15로 "저온-로딩(cold-loaded)"시켰고, 상기 조건은 항체 결합을 허용하나, 세포내이입은 허용하지 않는 조건이다. 이후, 세포를 즉시 고정시키거나, 고정 전에 다양한 시간 동안 항체-비함유 가온 배지에서 인큐베이션하였다. 고정된, 투과화된 파골세포, 온전한 파골세포에서의 Siglec-15의 분포를 기초로 하여 예상된 바와 같이, 저온-로딩된 Siglec-15 항체는 세포 표면에 강하게 결합하였다. 37 C에서 10분 인큐베이션 후, 염색 패턴이 명백히 변경되었고, Siglec-15 항체는 엔도솜인 것으로 보이는 내부 점(internal punctae)에 존재하였다(도 10b, 중간 패널). 10분 후, Siglec-15 신호는 여전히 형질막 근처에 존재한 반면, 45분 후, 이는 대부분 핵주위에 존재하였고, 이는 통상적인 리소솜 염색 패턴이다(Toyomura et al., 2003). 이는 리소솜 마커 LAMP-2에 대해 상기 세포를 공동 염색시킴으로써 확인하였다. 실제로, 45분에서, 핵주위 영역 내에서 Siglec-15 및 LAMP-2의 많은 공동국소화가 있는 반면, 초기 시점에서 염색 패턴은 명백히 서로 달랐다(도 10b).
리소솜은 세포내이입 후의 수용체 분해의 주요 부위이다. 이것이 Siglec-15의 운명인지의 여부를 결정하기 위해, 본 발명자는 연장된 시간 경과에 걸쳐 항체로 RAW264.7-유래 파골세포를 처리하고, 웨스턴 블로팅에 의해 전체 단백질 추출물을 분석하였다. 본 결과는 항-Siglec-15의 첨가 3시간 이내에 시작하여 Siglec-15 단백질 수준에서 명백한 감소가 있는 것을 나타낸다(도 10c, 레인 4 및 6). 대조적으로, 대조군 IgG를 이용한 파골세포의 노출은 신호에 있어서 상기 감소를 야기시키지 않았다. 특히, Siglec-15 단백질 수준에서의 유사한 감소를 항-Siglec-15의 존재하에서 RANKL를 이용하여 분화(4 d 동안)된 RAW264.7 세포에서 검출하였다(도 10d). 종합하면, 이들 결과는 이가 항-Siglec-15 항체가 수용체의 신속한 내재화를 유도하고, 이후에 분해를 위해 리소솜으로 표적화되는 것을 입증하였다.
실시예 8
세포 용해질의 제조 및 면역침전
세포 용해질을 프로테아제 및 포스파타제 억제제(50 mM NaF, 1 mM NaVO4 및 1x Roche 완전 EDTA-비함유 포스파타제 억제제)를 함유하는 mRIPA 용해 완충액(50 mM Tris/HCl pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% 데옥시콜레이트, 150 mM NaCl)을 이용하여 제조하였다. 용해질 단백질 농도를 BCA 검정(Pierce)에 의해 측정하였다. 전체 세포 용해질의 웨스턴 블로팅을 위해, 동등량의 단백질(10 내지 15 ㎍)을 β-머캅토에탄올을 함유하는 SDS 샘플 완충액에서 열 변성시키고, 10 또는 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분리시키고, PVDF로 옮기고, 지정된 항체로 프로빙하였다. 면역침전을 위해, 2 ㎎ 또는 1 ㎎의 전체 용해질을 4 C에서 회전시키면서 4시간 동안 4 ㎍의 항체 및 15 ㎕의 단백질 G-세파로스 비드와 함께 인큐베이션하였다. mRIPA를 이용하여 비드를 4회 세척한 후, 침전된 물질의 절반을 상기 기재된 바와 같이 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다.
Siglec-15와 DAP12 사이의 상호작용 및 Siglec-15의 다합체화
최근의 연구는 293T 세포에서의 Siglec-15 및 DAP12의 에피토프-태깅된 형태의 공동-과발현시, K273의 존재에 따라 복합체가 검출될 수 있는 것을 입증하였다(Angata et al., 2007). 본 발명자는 또한 유사한 과발현 조건하에서 상기 복합체를 검출할 수 있었고(데이터는 제시되지 않음), 본 발명자는 계속하여 복합체가 또한 파골세포에서 내생성 발현 수준으로 존재하는지의 여부를 결정하였다. 단백질 용해질을 분화된 RAW264.7-유래 파골세포뿐만 아니라 분화되지 않은 대조군 세포로부터 제조하고, Siglec-15 및 DAP12 항체를 이용하여 면역침전을 수행하였다. DAP12는 항-Siglec-15로 침전된 단백질 복합체에서 용이하게 검출되었고, 마찬가지로, 항-DAP12는 풍부한 Siglec-15를 침전시켰다. 예상된 바와 같이, Siglec-15 단백질 발현 수준을 기초로 하여, 상기 복합체는 매우 파골세포 특이적이었고, 분화되지 않은 세포에서 검출되지 않았다. 특히, DAP12 발현은 RAW264.7 파골세포 분화 동안 극적으로 변화되지 않았다.
이전 연구는 ITAM 모티프 상에서 인산화되는 경우, DAP12가 PI3K-Akt, PLCg 및 Grb2-Ras-Erk 캐스케이드를 포함하는 다수의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있는 것을 밝혀냈다(Turnbull and Colonna, 2007). 그러나, 특정 상황에서의 DAP12의 신호전달 결과는 이의 회합된 수용체에 크게 좌우된다(Turnbull and Colonna, 2007). Siglec-15에 대한 확인된 자연 리간드 또는 분자 파트너의 부재하에서, 본 발명자는 세포내 신호전달을 활성화시키는 Siglec-15의 능력을 평가하기 위해 항체 가교 접근법을 이용하였다. 먼저, 본 발명자는 RAW-유래 파골세포를 30분 이하의 다수의 시점 동안 항-Siglec-15로 처리하였으나, Akt, PLCg, 또는 Erk의 어떠한 활성화도 관찰하는데 실패하였다(데이터는 제시되지 않음). 그러나, 여러 다른 DAP12-회합된 수용체에 대해, 이가 항체-유도 이합체화가 아닌 수용체의 고차 집락화(higher-order clustering)가 ITAM-의존성 신호전달을 유도하는데 필요하다(Turnbull and Colonna, 2007; Underhill and Goodridge, 2007). 다합체화를 유도하기 위해, 본 발명자는 세포를 일차 Siglec-15 항체로 처리한 후, 이차 가교 항체로 처리하였다. 상기 조건하에서, 본 발명자는 신호전달 효과를 관찰하였고(도 11, 레인 5, 8 및 11), Akt는 이차 항체 가교의 수분 이내에 강하게 인산화되었다. Akt의 최대 인산화는 항-Siglec-15를 이용한 처리 5분 후에 달성되었다(도 11, 레인 8). 대조적으로, phospho-Erk(도 11) 및 phospho-PLCg(제시되지 않음)는 조절되지 않았다. Siglec-15의 발현의 결핍과 일치하게, 동일 조건하에서 분화되지 않은 RAW264.7 세포에서 Akt의 활성화가 없었다. 마찬가지로, 대조군 인간 IgG를 이용한 일차 Siglec-15 항체의 치환은 신호전달 반응을 제거하였다(도 11, 레인 3, 6, 9 및 12 참조). 이들 결과는 Siglec-15 가교가 DAP12의 일반적으로 다운스트림의 2개의 다른 경로인 Erk 또는 PLCg에 영향을 미치지 않고 Akt를 특이적으로 활성화시키는 것을 입증하였다(Turnbull and Colonna, 2007; Underhill and Goodridge, 2007).
Siglec-15에 의한 세포 신호전달의 유도가 DAP12 ITAM 모티프에 좌우되는 경우, DAP12의 티로신 인산화가 Siglec-15 집락화시에 검출가능해야 한다. 이를 시험하기 위해, 본 발명자는 DAP12를 면역침전시키고, 웨스턴 블로팅에 의해 이의 인산화를 평가하였다. Siglec-15를 가교(상기 기재된 바와 같음)시키기 위해 일차/이차 항체로 자극된 RAW264.7-유래 파골세포에서, 본 발명자는 12 kDa에서 티로신-인산화된 밴드를 검출하였고, 이는 DAP12일 개연성이 매우 높다. 동일 방식으로 처리된 분화되지 않은 세포 또는 대조군 인간 IgG로 처리된 파골세포에서, DAP12 인산화가 거의 검출되지 않거나 검출되지 않았다. 특히, 풍부한 Siglec-15가 분화된 파골세포로부터 DAP12와 함께 공동침전(예상된 바와 같음)되었으나, 포스포티로신 신호가 이의 분자량(37 kDa)에서 검출되지 않았고, 이는 추정 ITIM 모티프의 일부인 Siglec-15의 세포질 티로신 잔기의 인산화가 신호전달 반응과 관련되지 않은 것을 나타낸다(데이터는 제시되지 않음). 따라서, 본 결과는 Siglec-15에 대한 신호전달 분자로서 작용하는 DAP12와 일치하며, DAP12는 Siglec-15 집락화 후에 인산화되고, ITAM 모티프로의 신호전달 분자의 보충 및 Akt 경로의 활성화를 발생시킬 가능성이 있다.
따라서, Siglec-15의 이합체화 또는 다합체화를 억제할 수 있는 항-Siglec-15 항체는 파골세포 또는 파골세포 전구체에서 Siglec-15 활성을 억제할 수 있다. 예를 들어, Siglec-15의 이합체화 또는 다합체화를 억제하는 항체의 능력을 결정하기 위해, DAP12(예를 들어, DAP12 인산화) 및/또는 이의 다운스트림 효과기(Akt 경로)의 활성화의 수준이 시험될 수 있다.
실시예 9
IgG1 및 IgG2 항체 변이체의 비교
본 발명자는 계속하여 인간화된 항-Siglec-15 IgG1 항체 변이체와, 상응하는 인간화 항-Siglec-15 IgG2 항체 변이체(즉, 항체는 동일한 가변 도메인을 갖지만, 중쇄의 인간 불변 영역은 상이함)를 비교하였고, 하기 기재되는 시험관내 실험에서, IgG1이 상응하는 IgG2보다 훨씬 더 활성이 있는 것을 발견하였다.
더욱 특히, 본 발명자는 SPR을 이용하여 인간화 25E9 L1H1 IgG1(L1H1 IgG1 변이체)와 인간화 25E9 L1H1 IgG2(L1H1 IgG2 변이체)의 결합 활성을 비교하였다. 상기 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 분석을 수행하였다(실시예 6 참조). 이러한 예에서, Fc-Siglec-15를 칩 상에 고정시키고, 감소하는 농도의 25E9 항체 변이체를 주사하였다(100 nM, 33.3 nM, 11.1 nM, 3.70 nM 및 1.23 nM). 결과는 Siglec-15에 대한 인간화 25E9 L1H1 IgG1 변이체의 친화성이 인간화 25E9 L1H1 IgG2 변이체보다 거의 10배 더 높았고, 비교 KD 값이 각각 0.164 nM 및 1.26 nM인 것을 나타내었다(도 12 참조). 결합에서의 차이는 대부분 IgG2에 비해 IgG1의 더 느린 분리 속도(kd)에 의해 기인된 것이었다.
인간화된 25E9 L1H1 IgG1 변이체(L1H1 IgG1 변이체) 및 IgG2(L1H1 IgG2 변이체)의 인간 파골세포 분화를 억제하는 능력을 또한 시험하였다. 인간 파골세포 전구체 세포를, 증가하는 농도의 항체의 존재하에서 상기 기재된 바와 같이 농축시키고 분화시켰다(도 13 참조). 인간화 25E9 L1H1 IgG1 변이체의 존재하에서, 본 검정에서 파골세포의 분화를 완전히 억제하기 위해 100 ng/㎖ 미만의 항체가 필요하다. 대조적으로, 동일 정도의 억제를 달성하기 위해 10 ㎍/㎖의 인간화 25E9 L1H1 IgG2 변이체가 필요하다. 이는 인간화 25E9 L1H1 IgG1 변이체 대 상응하는 IgG2 변이체의 효능에 있어서 거의 100배 차이를 나타낸다. 대조군 샘플에서, 10 ㎍/㎖의 비히클 또는 대조군 IgG에 노출된 파골세포의 분화는 영향을 받지 않았다. IgG1-기반 항체의 효능에서의 증가가 L1H1 변이체에 대해 입증되었으나, 상기 증가는 또한 다른 25E9 인간화 변이체, 하이브리드 또는 마우스 항체에 대해 예상된다.
사실, 본 발명자는 또한 또 다른 Siglec-15 인간화 항체 25D8의 효능이 IgG1 대 IgG2로서 크게 증가된 것을 관찰하였다. 다른 항-Siglec-15 항체가 다른 유형의 불변 영역 대신 인간 IgG1 불변 영역을 갖는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 항체는 Siglec-15를 발현하는 세포 또는 재조합 Siglec-15에 대한 IgG1-기반 항-Siglec-15 항체의 친화성에서의 증가를 측정하거나, 파골세포 분화 또는 활성을 억제하는 IgG1-기반 항체의 능력을 시험(시험관내 또는 생체내)함으로써 확인될 수 있다.
상기 결과를 기초로 하여, 인간 IgG1-기반 항-Siglec-15 항체는 유리하게는 인간에서 더 적은 투여량으로 투여될 수 있다.
실시예 10
Siglec-15를 표적으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)
본 출원인은 파골세포의 표면 상에서 발현된 Siglec-15에 대한 항체의 결합이 효과적으로 내재화되고 분해되는 것을 입증하였다. 추가 연구는 또한 내재화 후에 엔도솜 경로가 후속되고, Siglec-15/항체 복합체가 후기-엔도솜/리소솜의 마커인 LAMP2와 공동 국소화될 수 있는 것을 나타내었다. ADC를 이용한 Siglec-15-발현 세포 표적화의 실행가능성을 시험하기 위한 실험을 수행하였다. 인간화 25E9 L1H1 IgG1 변이체를 증식 세포뿐만 아니라 비-증식 또는 완전 분화 세포, 특히 파골세포에 독성인 페이로드(payload)에 컨쥬게이션시켰다. 인간화 25E9 L1H1 IgG1 컨쥬게이션된 항체를 25E9-ADC로 명명하였다. 컨쥬게이션은 자연 Siglec-15와 상호작용하는 25E9의 능력에 영향을 미칠 수 있으므로, Siglec-15 발현 세포로의 25E9-ADC의 결합을 측정하기 위해 유세포측정법을 수행하였다. 인간 Siglec-15를 인코딩하는 cDNA로 트랜스펙션된 293-6E 세포를 이용하여 상기 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. 도 15에 예시된 바와 같이, 컨쥬게이션되지 않은 25E9 및 25E9-ADC는 매우 유사한 친화성으로 Siglec-15-트랜스펙션된 세포와 상호작용하였다(흑색 곡선 참조, h-Siglec-15). 이는 컨쥬게이션 반응이 Siglec-15에 결합하는 25E9-ADC의 능력을 변경시키지 않은 것을 나타내었다. 대조군으로서, Siglec-15 cDNA를 함유하지 않는 플라스미드로 트랜스펙션된 세포(도 15 회색 곡선 참조, 벡터)는 25E9에 결합하지 않았고, 이는 항체가 세포에 비특이적으로 결합하지 않은 것을 나타낸다.
항체의 세포독성 활성을 다음으로 시험하였다. 인간 파골세포 전구체 세포를 분리시키고, 이전에 기재된 것과 유사한 방식으로 M-SCF 및 RANKL의 존재하에서 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 파골세포를 완전 성숙 다핵 TRAP-양성 파골세포가 되도록 하기 위해 7일 동안 분화시켰다. 분화 후, 세포를 4일 동안 컨쥬게이션되지 않은 25E9, 25E9-ADC 또는 대조군-ADC로 처리하였다. 남아있는 세포 수(생존%)를 표준 비색 방법을 이용하여 결정하였다. 예상된 바와 같이, 컨쥬게이션되지 않은 25E9는 인간 파골세포의 생존에 영향을 미치지 않았다(도 16 참조). 이러한 결과는 25E9에 의한 파골세포 분화의 효능있는 억제에도 불구하고 항체가 세포를 사멸시키지 않는 것을 나타내는 이전의 결과와 일치하였다. 대조적으로, 25E9-ADC는 전달된 독소의 세포독성과 일치하는 결과인 생존 세포의 수에서의 용량-의존적 감소를 나타내었다(도 16). 이러한 세포독성의 IC50 값은 나노몰 미만 범위 내였다. 인간 Siglec-15에 결합하지 않는 대조군 ADC는 본 검정에서 가벼운 비특이적 활성을 나타내었다. 연구 종료시, 세포를 고정시키고, 파골세포에 대한 항체의 효과를 시각적으로 조사하기 위해 실시예 7에 기재된 방법을 이용하여 TRAP 활성에 대해 염색하였다. 도 17에 제시된 바와 같이, 컨쥬게이션되지 않은 25E9를 이용한 처리(상단 패널)는 본 발명자가 이전에 밝혀낸 바와 같은 비-기능적이고 재흡수 활성이 완전히 결여된, 작으며 진하게-TRAP 염색된 세포를 발생시키는 파골세포의 형태에 강한 영향을 미쳤다(도 9 참조). 25E9-ADC를 이용한 처리는 파골세포의 사멸을 발생시켰고, 실질적으로 모든 세포가 1 ㎍/㎖에서 사멸되었고(도 17 참조, 중간 패널), 이러한 결과는 도 16에 제시된 세포수 결정과 일치하였다. 최종적으로, 대조군-ADC는 10 ㎍/㎖에서도 파골세포의 성숙(도 17 참조, 하단 패널) 및 파골세포의 수에 대한 어떠한 독성 효과도 나타내지 않았고, 이는 미처리된 세포로 관찰된 수와 유사하였다. 이들 결과는 25E9-ADC로 관찰된 세포독성이 Siglec-15-양성 파골세포에 특이적임을 나타낸다.
종합하면, 이들 결과는 파골세포의 표면 상에서 발현된 Siglec-15를 표적으로 하는 ADC가 세포독성 활성을 갖는 것을 나타낸다.
실시예 11
생체내 기능 검정-마우스
생체내 효능의 평가를 골이 빠르게 성장하는 매우 어린 마우스를 이용하여 문헌[Schenk (Muhlbauer et al., 1991)]에 기재된 방법으로부터 적합화시켰다. 간단히, 3 내지 4주령 수컷 마우스(5마리의 동물/그룹)를 PBS, 대조군 마우스 IgG 또는 마우스 Siglec-15에 결합할 수 있는 항-Siglec-15 항체로 처리하였다. 항체를 26G 바늘을 이용하여 4주 동안 주 당 2회 복막내 투여하였다. 마우스를 희생시키고, 골을 절개하고, 24시간 동안 4% 파라포름알데하이드에서 고정시켰다. PBS 중에서의 세척 후, 대퇴골, 경골 및 추골의 골 무기질 밀도(BMD)를 결정하기 위해 PIXImus 밀도계(GE Medical Systems)를 이용하여 골을 스캐닝하였다. 골의 3차원 이미지를 SkyScan 고해상도 microCT(SkyScan Inc., Kontich, Belgium)로 생성시켰다.
이들 실험을 위해, 3 내지 4주령 마우스를 4주 동안 항-Siglec-15 항체로 처리하고, 장골 및 추골에 대한 상기 처리의 효가를 평가하였다. 어린 마우스는 이 연령에서 골이 신속하게 성장하므로, 골흡수억제제에 의한 파골세포 활성의 교란은 비교적 짧은 기간 내에 골 무기질 밀도(BMD)에서의 신속한 극적 증가를 발생시킬 수 있다. 처리 기간 후, 동물을 안락사시키고, 골을 절개하고, BMD를 계산하기 위해 밀도측정에 의해 스캐닝하였다. 대조군 마우스 IgG와 비교하여, 항-Siglec-15 모노클로날 항체를 이용한 처리는 상기 마우스의 대퇴골, 경골 및 추골에서 BMD에서의 상당한 용량-의존적 증가를 발생시켰다. BMD에서의 변화를 추가로 시험하기 위해, 선택된 골 샘플을 이들의 미세구조를 분석하기 위해 X-선 마이크로단층촬영술(MicroCT)을 이용하여 스캐닝하였다. 밀도측정 결과와 일치하게, 본 발명자는 대조군 IgG-처리된 마우스 및 L5 추골과 비교하여 항-Siglec-15 항체로 처리된 마우스의 대퇴골 및 추골에서 섬유주 부피(trabecular volume)에서의 현저한 증가를 관찰하였다. 상기 정성적 관철과 일치하게, microCT 스캔의 정량적 측정은 Siglec-15 항체로 처리된 동물에서 골 무기질 밀도에서의 증가를 확인하였다. 특히, 골 부피, 골 표면, 섬유주 수 및 연결도 밀도에서의 통계적으로 유의한 증가가 있었다. 역으로, 섬유주 분리가 유의하게 감소되었고, 이러한 변화는 섬유주 구조의 증가된 밀도와 일치하였다.
하기 연구의 목적은 래트 난소절제술(OVX) 모델에서 Siglec-15를 표적으로 하는 항체의 효과를 결정하는 것이었다.
32마리의 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트를 모의 수술하거나 난소 절제하고, 12주 후에 PBS(q28d), Siglec-15 항체(항-마우스 Siglec-15 항체, 10 ㎎/㎏, q28d) 또는 졸레드론산(ZOL, 0.1 ㎎/㎏, 단일 주사)으로 처리하였다. 12주 처리 후, 골을 밀도측정, microCT, 조직형태계측법, 3점 굽힘(대퇴골) 및 축성압박(LV4)에 의해 분석하고, 혈청을 TRAP 5b 및 ALP 수준에 대해 분석하였다.
예상된 바와 같이, 골 무기질 밀도(BMD)는 모의 수술된 동물에 비해 OVX-PBS 그룹에서 극적으로 감소된 한편, ZOL 처리는 BMD를 증가시켰다. 25B2의 투여는 모든 부위에서 BMD에서 유의한 증가를 야기시켰다. 이들 변화를 microCT 분석에 의해 확인하였고, 이는 골 부피, 섬유주(Tb) 수에서의 유의한 증가 및 대조군에 비한 Tb 분리에서의 상응하는 감소를 나타내었다. 상응하게, 항-마우스 Siglec-15 항체로 처리된 동물에서 골 강도에서의 개선이 생물역학적 분석에 의해 관찰되었고, 최대 로드(load), 강직성 및 기능상실까지의 에너지(energy-to-failure) 파라미터가 모두 증가되었다. 경골 섹션의 시험은 파골세포의 수가 항-마우스 Siglec-15 항체 처리에 의해 유의하게 증가되었으나, TRAP-양성 세포가 더 작고 더욱 진하게 염색된 것을 나타내었다. 혈청 TRAP 5b가 파골세포에 의한 상기 효소의 분비에서의 감소와 일치하게 항-마우스 Siglec-15 항체 그룹에서 감소되었다. 흥미롭게도, ALP의 혈청 수준 및 조직학적 염색은 항체-처리된 동물에서 변화되지 않았다. 이는 ALP 염색에서 유의한 감소를 야기시킨 ZOL 처리의 효과와 대조적이다. 이중-칼세인 표지를 이용한 동적 조직형태계측법 분석은 내골 무기질 침착률이 비히클 및 ZOL 처리된 그룹 둘 모두에 비해 항체-처리된 그룹에서 더 큰 것을 나타내었고, 이는 항-Siglec-15 항체에 의한 새로운 골 형성의 자극을 암시한다.
종합하면, 본 결과는 병리학적 골 손실 모델에서 모노클로날 항체를 이용하여 Siglec-15를 표적화하는 것이 골 특성 및 강도를 개선시키며, 이는 파골세포 기능의 억제 및 골모세포 활성의 유지의 조합으로 인한 것일 수 있음을 나타낸다.
생체내 기능 검정-원숭이
영장류에서의 골 생물표지자에 대한 Siglec-15 억제의 효과를 조사하기 위해, 본 발명자는 에스트로겐-결핍성 암컷 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이에 Siglec-15를 표적화하는 인간화 모노클로날 항체 25E9를 투여하였다.
10 ㎎/㎏의 비히클(PBS) 또는 25E9의 2개의 정맥내 주사를 6개월의 추적검사 기간과 함께 8주 간격으로 2개의 그룹에 투여하였다. 25E9를 투여하기 3개월 전에 시작하고 추적검사 기간 전체에 걸쳐 4주마다의 생식샘자극호르몬-방출 호르몬 효능제의 반복된 피하 투여에 의해 에스트로겐 결핍을 유도시켰다. 골 재흡수 및 형성 생물표지자를 평가하고, AB-25E9의 PK 프로파일을 결정하고, 항체-약물 항체(ADA)의 존재에 대해 모니터하기 위해 혈청 및 소변 샘플을 매주 수거하였다.
25E9를 이용한 처리는 골 재흡수 생물표지자(소변 NTx, 혈청 CTx 및 TRAP5b)를 30% 내지 45%까지 신속하게 감소시켰고, 이는 25E9의 골흡수억제 특성을 입증한다. 명백하게, 골 형성 생물표지자(오스테오칼신 및 BSAP)는 신속하게 감소되지 않았고, 최소로 영향을 받았다. 골 재흡수 생물표지자의 수준에서의 감소는 ADA의 출현과 일치하게 약 6주에서 약화되기 시작하였다. 흥미롭게도, 이러한 약화는 ADA가 거의 검출되지 않거나 검출되지 않은 동물에서는 20주 전에 관찰되지 않았다. 이러한 발견과 일치하게, AB-25E9 혈청 농도에서의 감소는 ADA가 검출된 동물에서 더 신속하였다. ADA에 대해 음성인 원숭이에서, 25E9의 말기 제거 반감기는 5 내지 12일 사이의 범위였다.
종합하면, 본원에 제공된 생물표지자 프로파일은 25E9가 골흡수억제 활성을 갖고, 골 형성 에스트로겐-결핍성 시노몰구스 원숭이를 유지시키는 것을 나타낸다. 이들 결과는 25E9의 작용의 신규한 메커니즘을 뒷받침하며, 골-관련 질병의 파골세포-표적화 요법에 대한 이의 잠재성을 강조한다.
마우스 또는 원숭이에서의 본 실험은 또한 30 ㎎/㎏의 항-Siglec-15 항체로 처리된 그룹을 포함하였다. 놀랍게도, 투여량에서의 이러한 증가는 추가 이점과 관련되지 않았다. 반대로, 일부 예에서, 10 ㎎/㎏의 투여량에 비해 상기 용량에서 항체의 효과에서의 감소가 있었다.
참고문헌
본 출원에 나열된 참고문헌의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
서열
주: 밑줄 친 서열은 불변 영역을 나타내고, 이중선의 서열은 신호 서열을 나타내고, 굵은 글씨의 서열은 상보성 결정 영역을 나타낸다.
SEQ ID NO:1 (인간 Siglec-15 cDNA)
Figure pct00018
SEQ ID NO:2 (인간 Siglec-15 폴리펩티드: 1-328)
Figure pct00019
SEQ ID NO:3 (마우스 Siglec-15 cDNA)
Figure pct00020
SEQ ID NO:4 (마우스 Siglec-15 폴리펩티드)
Figure pct00021
SEQIDNo.:5
25E9 경쇄(카파) 키메라 (마우스 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00022
SEQIDNo.:6
25E9 경쇄 마우스 가변 도메인(신호 서열 없이 예시됨: CDR은 굵은 글씨로 표시됨)
Figure pct00023
SEQIDNO.:7
25E9 경쇄(카파) 인간화 변이체 1(별칭: L1)(인간화 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00024
SEQIDNO.:8
25E9 경쇄 인간화 변이체 1 가변 도메인(별칭: VL1)(신호 서열 없이 예시됨)
Figure pct00025
SEQIDNO.:9
25E9 경쇄(카파) 인간화 변이체 2(별칭: L2)(인간화 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00026
SEQIDNO.:10
25E9 경쇄 인간화 변이체 2 가변 도메인(별칭: VL2)(신호 서열 없이 예시됨)
Figure pct00027
SEQIDNO.:11
25E9 중쇄(Igg1) 키메라(마우스 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00028
SEQIDNO.:12
25E9 중쇄 마우스 가변 도메인(신호 서열 없이 예시됨: CDR은 굵은 글씨로 표시됨)
Figure pct00029
SEQIDNO.:13
25E9 중쇄(Igg1) 인간화 변이체 1(별칭: H1)(인간화 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00030
SEQIDNO.:14
25E9 중쇄 인간화 변이체 1 가변 도메인(별칭, VH1)(신호 서열 없이 예시됨)
Figure pct00031
SEQIDNO.:15
25E9 중쇄(Igg1) 인간화 변이체 2(별칭: H2)(인간화 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00032
SEQIDNO.:16
25E9 중쇄 인간화 변이체 2 가변 도메인(별칭, VH2)(신호 서열 없이 예시됨)
Figure pct00033
SEQIDNO.:17
25E9 중쇄(Igg1) 인간화 변이체 3(별칭:H3)(인간화 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00034
SEQIDNO.:18
25E9 중쇄 인간화 변이체 3 가변 도메인(별칭:VH3)(신호 서열 없이 예시됨)
Figure pct00035
SEQIDNO.:19
25E9 중쇄(Igg1) 인간화 변이체 4(별칭:H4)(인간화 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00036
SEQIDNO.:20
25E9 중쇄 인간화 변이체 4 가변 도메인(별칭:VH4)(신호 서열 없이 예시됨)
Figure pct00037
SEQIDNO.:21
키메라 25D8 경쇄(카파)(마우스 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00038
SEQIDNO.:22
25D8 경쇄 마우스 가변 도메인(신호 서열 없이 예시됨)
Figure pct00039
SEQIDNO.:23
인간화 25D8 경쇄(카파)(인간화 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00040
SEQIDNO.:24
인간화 25D8 경쇄 가변 도메인(신호 서열 없이 예시됨)
Figure pct00041
SEQIDNO.:25
키메라 25D8 중쇄(Igg2)(마우스 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00042
SEQIDNO.:26
25D8 중쇄 마우스 가변 도메인(신호 서열 없이 예시됨)
Figure pct00043
SEQIDNO.:27
인간화 25D8 중쇄(Igg2)(인간화 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00044
SEQIDNO.:28
인간화 25D8 중쇄 가변 도메인(신호 서열 없이 예시됨)
Figure pct00045
SEQIDNO.29
25E9 중쇄(Igg2) 인간화 변이체 1(인간화 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00046
SEQIDNo.:30
25E9 중쇄(Igg2) 키메라(마우스 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00047
SEQIDNO.:31(인간 IgG1 불변 영역)
Figure pct00048
SEQIDNO.:32(인간 IgG2 불변 영역)
Figure pct00049
SEQIDNo.33 일반명 25E9 경쇄 가변 도메인(컨센서스 1)
Figure pct00050
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:6(마우스 VL)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은, 예를 들어, 보존성 또는 비보존성 치환일 수 있다. 본 발명에 따르면, 아미노산 치환은 보존성 치환일 수 있다.
SEQIDNo.34 일반명 25E9 경쇄 가변 도메인(컨센서스 2)
Figure pct00051
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:6(마우스 VL)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고, Xa1, Xa4, Xa7, Xa8, Xa10 및 Xa11은 각각 독립적으로 SEQIDNO.6과 비교하여 보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xa2, Xa5, Xa6는 각각 독립적으로 SEQIDNO.6과 비교하여 반-보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xa3는 P 또는 L일 수 있고;
Xa9는 A 또는 D일 수 있다.
SEQIDNO.35 일반명 25E9 경쇄 가변 도메인(컨센서스 3)
Figure pct00052
여기서, X(Xa1 내지 Xa11을 포함함)에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:6(마우스 VL)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고;
Xa1은 A 또는 S일 수 있고;
Xa2는 A 또는 P일 수 있고;
Xa3는 P 또는 L일 수 있고;
Xa4는 소수성 아미노산(예를 들어, V 또는 L)일 수 있고;
Xa5는 S 또는 P일 수 있고;
Xa6는 소수성 아미노산(예를 들어, V 또는 A)일 수 있고;
Xa7은 방향족 아미노산(예를 들어, F 또는 Y)일 수 있고;
Xa8은 염기성 아미노산(예를 들어, R 또는 K)일 수 있고;
Xa9는 A 또는 D일 수 있고;
Xa10은 염기성 아미노산(예를 들어, R 또는 K)일 수 있고;
Xa11은 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 V)일 수 있다.
SEQIDNO.36 일반명 25E9 중쇄 가변 도메인(컨센서스 1)
Figure pct00053
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:12(마우스 VH)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은, 예를 들어, 보존성 또는 비-보존성 치환일 수 있다. 본 발명에 따르면, 아미노산 치환은 보존성 치환일 수 있다.
SEQIDNO.37 일반명 25E9 중쇄 가변 도메인(컨센서스 2)
Figure pct00054
여기서, X(Xb1 내지 Xb21을 포함함)에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:12(마우스 VH)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고;
Xb2, Xb4, Xb5, Xb7, Xb8, Xb9, Xb11, Xb12, Xb13, Xb15, Xb16, Xb17, Xb18, Xb20 및 Xb21은 각각 독립적으로 SEQIDNO.12와 비교하여 보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xb1, Xb6, Xb14는 각각 독립적으로 SEQIDNO.:12(마우스 VH)와 비교하여 반-보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xb3은 V 또는 K일 수 있고;
Xb10은 V 또는 G일 수 있고;
Xb19는 T 또는 R일 수 있다.
SEQIDNO.38 일반명 25E9 중쇄 가변 도메인(컨센서스 3)
Figure pct00055
여기서, X(Xb1 내지 Xb21을 포함함)에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:12(마우스 VH)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고;
Xb1은 소수성 아미노산(예를 들어, V 또는 A)일 수 있고;
Xb2는 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 V)일 수 있고;
Xb3는 V 또는 K일 수 있고;
Xb4는 염기성 아미노산(예를 들어, R 또는 K)일 수 있고;
Xb5는 A 또는 S일 수 있고;
Xb6는 T 또는 K일 수 있고;
Xb7은 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 V)일 수 있고;
Xb8은 염기성 아미노산(예를 들어, K 또는 R)일 수 있고;
Xb9는 T 또는 A일 수 있고;
Xb10은 V 또는 G일 수 있고;
Xb11은 염기성 아미노산(예를 들어, H 또는 Q)일 수 있고;
Xb12는 소수성 아미노산(예를 들어, I 또는 M)일 수 있고;
Xb13은 염기성 아미노산(예를 들어, K 또는 R)일 수 있고;
Xb14는 소수성 아미노산(예를 들어, A 또는 V)일 수 있고;
Xb15는 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 I)일 수 있고;
Xb16은 염기성 아미노산(예를 들어, R 또는 K)일 수 있고;
Xb17은 중성 친수성 아미노산(예를 들어, S 또는 T)일 수 있고;
Xb18은 중성 친수성 아미노산(예를 들어, T 또는 S)일 수 있고;
Xb19는 T 또는 R일 수 있고;
Xb20은 중성 친수성 아미노산(예를 들어, S 또는 T)일 수 있고;
Xb21은 A 또는 S일 수 있다.
SEQ ID No.:39 일반명 25D8 경쇄 가변 도메인(컨센서스 1)
Figure pct00056
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:22(마우스 VL)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은, 예를 들어, 보존성 또는 비-보존성 치환일 수 있다. 본 발명에 따르면, 아미노산 치환은 보존성 치환일 수 있다.
SEQ ID NO.:40 일반명 25D8 경쇄 가변 도메인(컨센서스 2)
Figure pct00057
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:22(마우스 VL)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고;
Xc1, Xc3, Xc9 및 Xc10은 각각 독립적으로 SEQ ID NO.:22와 비교하여 보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xc2, Xc7, Xc8은 각각 독립적으로 SEQ ID NO.:22와 비교하여 반-보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xc4는 N 또는 L일 수 있고;
Xc5는 L 또는 P일 수 있고;
Xc6는 T 또는 E일 수 있다.
SEQIDNO.:41 일반명 25D8 경쇄 가변 도메인(컨센서스 3)
Figure pct00058
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:22(마우스 VL)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고;
Xc1은 A 또는 T일 수 있고;
Xc2는 A 또는 P일 수 있고;
Xc3는 F 또는 L일 수 있고;
Xc4는 N 또는 L일 수 있고;
Xc5는 L 또는 P일 수 있고;
Xc6는 T 또는 E일 수 있고;
Xc7은 S 또는 P일 수 있고;
Xc8은 S 또는 G일 수 있고;
Xc9는 염기성 아미노산(예를 들어, R 또는 K)일 수 있고;
Xc10은 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 V)일 수 있다.
SEQ ID NO.:42 일반명 25D8 중쇄 가변 도메인(컨센서스 1)
Figure pct00059
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:26(마우스 VH)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은, 예를 들어, 보존성 또는 비-보존성 치환일 수 있다. 본 발명에 따르면, 아미노산 치환은 보존성 치환일 수 있다.
SEQ ID NO.:43 일반명 25D8 중쇄 가변 도메인(컨센서스 2)
Figure pct00060
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:26(마우스 VH)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고;
Xd1, Xd3, Xd5, Xd6, Xd7, Xd9, Xd10, Xd12, Xd14, Xd15, Xd17, Xd18은 각각 독립적으로 SEQ ID NO.:26과 비교하여 보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xd2, Xd11, Xd13은 각각 독립적으로 SEQ ID NO.:26과 비교하여 반-보존성 아미노산 치환일 수 있고;
Xd4는 V 또는 K일 수 있고;
Xd8은 R 또는 A일 수 있고;
Xd16은 T 또는 R일 수 있다.
SEQ ID NO.:44 일반명 25D8 중쇄 가변 도메인(컨센서스 3)
Figure pct00061
여기서, X에 의해 확인된 아미노산 중 적어도 하나는 SEQ ID NO.:26(마우스 VH)에 기재된 폴리펩티드 내의 상응하는 아미노산과 비교하여 아미노산 치환일 수 있고;
Xd1은 소수성 아미노산(예를 들어, V 또는 L)일 수 있고;
Xd2는 P 또는 S일 수 있고;
Xd3은 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 V)일 수 있고;
Xd4는 V 또는 K일 수 있고;
Xd5는 A 또는 S일 수 있고;
Xd6은 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 V)일 수 있고;
Xd7은 염기성 아미노산(예를 들어, K 또는 R)일 수 있고;
Xd8은 R 또는 A일 수 있고;
Xd9는 소수성 아미노산(예를 들어, I 또는 M)일 수 있고;
Xd10은 염기성 아미노산(예를 들어, K 또는 R)일 수 있고;
Xd11은 소수성 아미노산(예를 들어, A 또는 V)일 수 있고;
Xd12는 소수성 아미노산(예를 들어, L 또는 I)일 수 있고;
Xd13은 소수성 아미노산(V 또는 A)일 수 있고;
Xd14는 중성 친수성 아미노산(예를 들어, S 또는 T)일 수 있고;
Xd15는 Q 또는 E일 수 있고;
Xd16은 T 또는 R일 수 있고;
Xd17은 중성 친수성 아미노산(예를 들어, S 또는 T)일 수 있고;
Xd18은 소수성 아미노산(L 또는 V)일 수 있다.
SEQ ID NO.:45 키메라 25D8 중쇄(Igg1)(마우스 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00062
SEQ ID NO.:46 인간화 25D8 중쇄(Igg1)(인간화 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00063
SEQ ID NO.:47 25E9 경쇄 마우스 가변 도메인의 CDR1
Figure pct00064
SEQ ID NO.:48 25E9 경쇄 마우스 가변 도메인의 CDR2
Figure pct00065
SEQ ID NO.:49 25E9 경쇄 마우스 가변 도메인의 CDR3
Figure pct00066
SEQ ID NO.:50 25E9 중쇄 마우스 가변 도메인의 CDR1
Figure pct00067
SEQ ID NO.:51 25E9 중쇄 마우스 가변 도메인의 CDR2
Figure pct00068
SEQ ID NO.:52 25E9 중쇄 마우스 가변 도메인의 CDR3
Figure pct00069
SEQ ID NO.:53 25D8 경쇄 마우스 가변 도메인의 CDR1
Figure pct00070
SEQ ID NO.:54 25D8 경쇄 마우스 가변 도메인의 CDR2
Figure pct00071
SEQ ID NO.:55 25D8 경쇄 마우스 가변 도메인의 CDR3
Figure pct00072
SEQ ID NO.:56 25D8 중쇄 마우스 가변 도메인의 CDR1
Figure pct00073
SEQ ID NO.:57 25D8 중쇄 마우스 가변 도메인의 CDR2
Figure pct00074
SEQ ID NO.:58 25D8 중쇄 마우스 가변 도메인의 CDR3
Figure pct00075
SEQIDNO.:59
25E9 중쇄(Igg2) 인간화 변이체 2(별칭: H2)(인간화 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00076
SEQIDNO.:60
25E9 중쇄(Igg2) 인간화 변이체 3(별칭:H3)(인간화 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00077
SEQIDNO.:61
25E9 중쇄(Igg2) 인간화 변이체 4(별칭:H4)(인간화 가변 도메인 및 인간 불변 영역)
Figure pct00078
SEQ ID No.:62(25E9 경쇄 마우스 가변 도메인의 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00079
SEQ ID NO:63(25E9 중쇄 마우스 가변 도메인의 뉴클레오티드 서열)
Figure pct00080
SEQ ID NO.:64(인간화 25E9 경쇄 가변 도메인-변이체 1의 뉴클레오티드 서열 - 신호 서열을 코딩하는 부분이 없이 예시됨)
Figure pct00081
SEQ ID NO.:65(인간화 25E9 중쇄 가변 도메인-변이체 1의 뉴클레오티드 서열 - 신호 서열을 코딩하는 부분이 없이 예시됨)
Figure pct00082
SEQ ID NO.:66: 25D8 경쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00083
SEQ ID NO.:67: 25D8 경쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00084
SEQ ID NO.:68: 25D8 경쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00085
SEQ ID NO.:69: 25D8 경쇄 가변 도메인에 대한 인간 모델
Figure pct00086
SEQ ID NO.:70: 25D8 경쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00087
SEQ ID NO.:71: 25D8 경쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00088
SEQ ID NO.:72: 25D8 경쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00089
SEQ ID NO.:73: 25D8 중쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00090
SEQ ID NO.:74: 25D8 중쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00091
SEQ ID NO.:75: 25D8 중쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00092
SEQ ID NO.:76: 25D8 중쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00093
SEQ ID NO.:77: 25D8 중쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00094
SEQ ID NO.:78: 25D8 중쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00095
SEQ ID NO.:79: 25D8 중쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00096
SEQ ID NO.:80: 25D8 중쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00097
SEQ ID NO.:81: 25E9 경쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00098
SEQ ID NO.:82: 25E9 경쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00099
SEQ ID NO.:83: 25E9 경쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00100
SEQ ID NO.:84: 25E9 경쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00101
SEQ ID NO.:85: 25E9 경쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00102
SEQ ID NO.:86: 25E9 중쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00103
SEQ ID NO.:87: 25E9 중쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00104
SEQ ID NO.:88: 25E9 중쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00105
SEQ ID NO.:89: 25E9 중쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00106
SEQ ID NO.:90: 25E9 중쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00107
SEQ ID NO.:91: 25E9 중쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00108
SEQ ID NO.:92: 25E9 중쇄 가변 도메인에 대한 후보 인간 모델
Figure pct00109
SEQUENCE LISTING <110> ALETHIA BIOTHERAPEUTICS INC. NATIONAL RESEARCH COUNCIL OF CANADA <120> ANTI-SIGLEC-15 ANTIBODIES <130> 11504-141 <140> PCT/CA2013/000646 <141> 2013-07-17 <150> US61/673,442 <151> 2012-07-19 <150> US61/677,049 <151> 2013-03-12 <150> US61/810,415 <151> 2013-04-10 <160> 92 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 987 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggaaaagt ccatctggct gctggcctgc ttggcgtggg ttctcccgac aggctcattt 60 gtgagaacta aaatagatac tacggagaac ttgctcaaca cagaggtgca cagctcgcca 120 gcgcagcgct ggtccatgca ggtgccaccc gaggtgagcg cggaggcagg cgacgcggca 180 gtgctgccct gcaccttcac gcacccgcac cgccactacg acgggccgct gacggccatc 240 tggcgcgcgg gcgagcccta tgcgggcccg caggtgttcc gctgcgctgc ggcgcggggc 300 agcgagctct gccagacggc gctgagcctg cacggccgct tccggctgct gggcaacccg 360 cgccgcaacg acctctcgct gcgcgtcgag cgcctcgccc tggctgacga ccgccgctac 420 ttctgccgcg tcgagttcgc cggcgacgtc catgaccgct acgagagccg ccacggcgtc 480 cggctgcacg tgacagccgc gccgcggatc gtcaacatct cggtgctgcc cagtccggct 540 cacgccttcc gcgcgctctg cactgccgaa ggggagccgc cgcccgccct cgcctggtcc 600 ggcccggccc tgggcaacag cttggcagcc gtgcggagcc cgcgtgaggg tcacggccac 660 ctagtgaccg ccgaactgcc cgcactgacc catgacggcc gctacacgtg tacggccgcc 720 aacagcctgg gccgctccga ggccagcgtc tacctgttcc gcttccatgg cgccagcggg 780 gcctcgacgg tcgccctcct gctcggcgct ctcggcttca aggcgctgct gctgctcggg 840 gtcctggccg cccgcgctgc ccgccgccgc ccagagcatc tggacacccc ggacacccca 900 ccacggtccc aggcccagga gtccaattat gaaaatttga gccagatgaa cccccggagc 960 ccaccagcca ccatgtgctc accgtga 987 <210> 2 <211> 328 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Lys Ser Ile Trp Leu Leu Ala Cys Leu Ala Trp Val Leu Pro 1 5 10 15 Thr Gly Ser Phe Val Arg Thr Lys Ile Asp Thr Thr Glu Asn Leu Leu 20 25 30 Asn Thr Glu Val His Ser Ser Pro Ala Gln Arg Trp Ser Met Gln Val 35 40 45 Pro Pro Glu Val Ser Ala Glu Ala Gly Asp Ala Ala Val Leu Pro Cys 50 55 60 Thr Phe Thr His Pro His Arg His Tyr Asp Gly Pro Leu Thr Ala Ile 65 70 75 80 Trp Arg Ala Gly Glu Pro Tyr Ala Gly Pro Gln Val Phe Arg Cys Ala 85 90 95 Ala Ala Arg Gly Ser Glu Leu Cys Gln Thr Ala Leu Ser Leu His Gly 100 105 110 Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asn Pro Arg Arg Asn Asp Leu Ser Leu Arg 115 120 125 Val Glu Arg Leu Ala Leu Ala Asp Asp Arg Arg Tyr Phe Cys Arg Val 130 135 140 Glu Phe Ala Gly Asp Val His Asp Arg Tyr Glu Ser Arg His Gly Val 145 150 155 160 Arg Leu His Val Thr Ala Ala Pro Arg Ile Val Asn Ile Ser Val Leu 165 170 175 Pro Ser Pro Ala His Ala Phe Arg Ala Leu Cys Thr Ala Glu Gly Glu 180 185 190 Pro Pro Pro Ala Leu Ala Trp Ser Gly Pro Ala Leu Gly Asn Ser Leu 195 200 205 Ala Ala Val Arg Ser Pro Arg Glu Gly His Gly His Leu Val Thr Ala 210 215 220 Glu Leu Pro Ala Leu Thr His Asp Gly Arg Tyr Thr Cys Thr Ala Ala 225 230 235 240 Asn Ser Leu Gly Arg Ser Glu Ala Ser Val Tyr Leu Phe Arg Phe His 245 250 255 Gly Ala Ser Gly Ala Ser Thr Val Ala Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gly 260 265 270 Phe Lys Ala Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Ala Arg Ala Ala Arg 275 280 285 Arg Arg Pro Glu His Leu Asp Thr Pro Asp Thr Pro Pro Arg Ser Gln 290 295 300 Ala Gln Glu Ser Asn Tyr Glu Asn Leu Ser Gln Met Asn Pro Arg Ser 305 310 315 320 Pro Pro Ala Thr Met Cys Ser Pro 325 <210> 3 <211> 1029 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 atggaggggt ccctccaact cctggcctgc ttggcctgtg tgctccagat gggatccctt 60 gtgaaaacta gaagagacgc ttcgggggat ctgctcaaca cagaggcgca cagtgccccg 120 gcgcagcgct ggtccatgca ggtgcccgcg gaggtgaacg cggaggctgg cgacgcggcg 180 gtgctgccct gcaccttcac gcacccgcac cgccactacg acgggccgct gacggccatc 240 tggcgctcgg gcgagccgta cgcgggcccg caggtgttcc gctgcaccgc ggcgccgggc 300 agcgagctgt gccagacggc gctgagcctg cacggccgct tccgcctgct gggcaacccg 360 cgccgcaacg acctgtccct gcgcgtcgag cgcctcgccc tggcggacag cggccgctac 420 ttctgccgcg tggagttcac cggcgacgcc cacgatcgct atgagagtcg ccatggggtc 480 cgtctgcgcg tgactgcagc tgcgccgcgg atcgtcaaca tctcggtgct gccgggcccc 540 gcgcacgcct tccgcgcgct ctgcaccgcc gagggggagc ccccgcccgc cctcgcctgg 600 tcgggtcccg ccccaggcaa cagctccgct gccctgcagg gccagggtca cggctaccag 660 gtgaccgccg agttgcccgc gctgacccgc gacggccgct acacgtgcac ggcggccaat 720 agcctgggcc gcgccgaggc cagcgtctac ctgttccgct tccacggcgc ccccggaacc 780 tcgaccctag cgctcctgct gggcgcgctg ggcctcaagg ccttgctgct gcttggcatt 840 ctgggagcgc gtgccacccg acgccgacta gatcacctgg tcccccagga cacccctcca 900 cggtctcagg ctcaggagtc caattatgaa aatttgagcc agatgagtcc tccaggccac 960 cagctgccac gtgtttgctg tgaggaactc ctcagccatc accatctagt cattcaccat 1020 gagaaataa 1029 <210> 4 <211> 342 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Glu Gly Ser Leu Gln Leu Leu Ala Cys Leu Ala Cys Val Leu Gln 1 5 10 15 Met Gly Ser Leu Val Lys Thr Arg Arg Asp Ala Ser Gly Asp Leu Leu 20 25 30 Asn Thr Glu Ala His Ser Ala Pro Ala Gln Arg Trp Ser Met Gln Val 35 40 45 Pro Ala Glu Val Asn Ala Glu Ala Gly Asp Ala Ala Val Leu Pro Cys 50 55 60 Thr Phe Thr His Pro His Arg His Tyr Asp Gly Pro Leu Thr Ala Ile 65 70 75 80 Trp Arg Ser Gly Glu Pro Tyr Ala Gly Pro Gln Val Phe Arg Cys Thr 85 90 95 Ala Ala Pro Gly Ser Glu Leu Cys Gln Thr Ala Leu Ser Leu His Gly 100 105 110 Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asn Pro Arg Arg Asn Asp Leu Ser Leu Arg 115 120 125 Val Glu Arg Leu Ala Leu Ala Asp Ser Gly Arg Tyr Phe Cys Arg Val 130 135 140 Glu Phe Thr Gly Asp Ala His Asp Arg Tyr Glu Ser Arg His Gly Val 145 150 155 160 Arg Leu Arg Val Thr Ala Ala Ala Pro Arg Ile Val Asn Ile Ser Val 165 170 175 Leu Pro Gly Pro Ala His Ala Phe Arg Ala Leu Cys Thr Ala Glu Gly 180 185 190 Glu Pro Pro Pro Ala Leu Ala Trp Ser Gly Pro Ala Pro Gly Asn Ser 195 200 205 Ser Ala Ala Leu Gln Gly Gln Gly His Gly Tyr Gln Val Thr Ala Glu 210 215 220 Leu Pro Ala Leu Thr Arg Asp Gly Arg Tyr Thr Cys Thr Ala Ala Asn 225 230 235 240 Ser Leu Gly Arg Ala Glu Ala Ser Val Tyr Leu Phe Arg Phe His Gly 245 250 255 Ala Pro Gly Thr Ser Thr Leu Ala Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gly Leu 260 265 270 Lys Ala Leu Leu Leu Leu Gly Ile Leu Gly Ala Arg Ala Thr Arg Arg 275 280 285 Arg Leu Asp His Leu Val Pro Gln Asp Thr Pro Pro Arg Ser Gln Ala 290 295 300 Gln Glu Ser Asn Tyr Glu Asn Leu Ser Gln Met Ser Pro Pro Gly His 305 310 315 320 Gln Leu Pro Arg Val Cys Cys Glu Glu Leu Leu Ser His His His Leu 325 330 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MISC_FEATURE <222> (109)..(109) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:6 <400> 33 Asp Ile Val Met Thr Gln Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Xaa Xaa Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Xaa Leu Gln Xaa Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Phe Thr Leu Xaa Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 34 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic 25E9 light chain variable domain (consensus 2) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa may be a semi-conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be P or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa may be a semi-conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa may be a semi-conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> Xaa may be A or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:6 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (109)..(109) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:6 <400> 34 Asp Ile Val Met Thr Gln Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Xaa Xaa Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Xaa Leu Gln Xaa Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Phe Thr Leu Xaa Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 35 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic 25E9 light chain variable domain (consensus 3) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa may be A or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be P or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa may be S or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41) <223> Xaa may be an aromatic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (44)..(44) <223> Xaa may be a basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> Xaa may be A or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> Xaa may be a basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (109)..(109) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <400> 35 Asp Ile Val Met Thr Gln Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Xaa Xaa Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Xaa Leu Gln Xaa Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Phe Thr Leu Xaa Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 36 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic 25E9 heavy chain variable domain (consensus 1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (123)..(123) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <400> 36 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Pro Gly Xaa 1 5 10 15 Ser Val Xaa Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Xaa Xaa Gly Leu Glu Trp Xaa 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Xaa Xaa Thr Xaa Thr Ala Asp Xaa Ser Xaa Xaa Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Xaa Ser Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ser Phe Tyr Tyr Thr Tyr Ser Asn Tyr Asp Val Gly Phe Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Xaa 115 120 <210> 37 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic 25E9 heavy chain variable domain (consensus 2) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be a semi-conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa may be V or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa may be a semi-conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa may be V or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa may be a semi-conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa may be T or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (123)..(123) <223> Xaa may be a conservative amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:12 <400> 37 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Pro Gly Xaa 1 5 10 15 Ser Val Xaa Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Xaa Xaa Gly Leu Glu Trp Xaa 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Xaa Xaa Thr Xaa Thr Ala Asp Xaa Ser Xaa Xaa Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Xaa Ser Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ser Phe Tyr Tyr Thr Tyr Ser Asn Tyr Asp Val Gly Phe Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Xaa 115 120 <210> 38 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic 25E9 heavy chain variable domain (consensus 3) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa may be V or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa may be a basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa may be A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19) <223> Xaa may be T or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa may be a basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa may be T or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42) <223> Xaa may be V or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(43) <223> Xaa may be a basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> Xaa may be a basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74) <223> Xaa may be a basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> Xaa may be a neutral hydrophilic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77) <223> Xaa may be a neutral hydrophilic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa may be T or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa may be a neutral hydrophilic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (123)..(123) <223> Xaa may be A or S <400> 38 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Pro Gly Xaa 1 5 10 15 Ser Val Xaa Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Xaa Xaa Gly Leu Glu Trp Xaa 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Xaa Xaa Thr Xaa Thr Ala Asp Xaa Ser Xaa Xaa Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Xaa Ser Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ser Phe Tyr Tyr Thr Tyr Ser Asn Tyr Asp Val Gly Phe Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Xaa 115 120 <210> 39 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic 25D8 light chain variable domain (consensus 1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (109)..(109) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <400> 39 Asp Ile Val Met Thr Gln Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Pro Val Thr Xaa Gly 1 5 10 15 Xaa Xaa Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Xaa Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Xaa Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 40 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic 25D8 light chain variable domain (consensus 2) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa may be a semi-conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be N or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa may be L or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa may be T or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa may be a semi-conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> Xaa may be a semi-conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (109)..(109) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:22 <400> 40 Asp Ile Val Met Thr Gln Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Pro Val Thr Xaa Gly 1 5 10 15 Xaa Xaa Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Xaa Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Xaa Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 41 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic 25D8 light chain variable domain (consensus 3) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be A or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa may be A or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa may be F or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be N or L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa may be L or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa may be T or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Xaa may be S or P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69) <223> Xaa may be S or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (79)..(79) <223> Xaa may be a basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (109)..(109) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <400> 41 Asp Ile Val Met Thr Gln Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Pro Val Thr Xaa Gly 1 5 10 15 Xaa Xaa Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Xaa Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Xaa Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 42 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic 25D8 heavy chain variable domain (consensus 1) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (82)..(82) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (114)..(114) <223> Xaa may be an amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <400> 42 Gln Val Gln Xaa Gln Gln Xaa Gly Ala Glu Xaa Xaa Lys Pro Gly Xaa 1 5 10 15 Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Xaa 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Ala Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Asn Thr Xaa Xaa Thr Xaa Thr Xaa Asp Lys Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Xaa Leu Ser Ser Leu Xaa Ser Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asp Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Xaa Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic 25D8 heavy chain variable domain (consensus 2) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be a semi-conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa may be V or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa may be R or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa may be a semi-conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> Xaa may be a semi-conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (82)..(82) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa may be T or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (114)..(114) <223> Xaa may be a conservartive amino acid substitution in comparison with SEQ ID NO.:26 <400> 43 Gln Val Gln Xaa Gln Gln Xaa Gly Ala Glu Xaa Xaa Lys Pro Gly Xaa 1 5 10 15 Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Xaa 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Ala Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Asn Thr Xaa Xaa Thr Xaa Thr Xaa Asp Lys Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Xaa Leu Ser Ser Leu Xaa Ser Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asp Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Xaa Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic 25D8 heavy chain variable domain (consensus 3) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa may be P or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa may be V or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa may be A or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38) <223> Xaa may be a basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40) <223> Xaa may be R or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (48)..(48) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67) <223> Xaa may be a basic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (70)..(70) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> Xaa may be a neutral hydrophilic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (82)..(82) <223> Xaa may be Q or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (87)..(87) <223> Xaa may be T or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91) <223> Xaa may be a neutral hydrophilic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (114)..(114) <223> Xaa may be a hydrophobic amino acid <400> 44 Gln Val Gln Xaa Gln Gln Xaa Gly Ala Glu Xaa Xaa Lys Pro Gly Xaa 1 5 10 15 Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Xaa 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Ala Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Asn Thr Xaa Xaa Thr Xaa Thr Xaa Asp Lys Ser Xaa Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Xaa Leu Ser Ser Leu Xaa Ser Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asp Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Xaa Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric 25D8 heavy chain (IgG1) <400> 45 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala Gln Val Gln Val Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Ala Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Asn Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 46 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 25D8 heavy chain (IgG1) <400> 46 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Ser Asn Ala Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Asn Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 130 135 140 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 145 150 155 160 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 165 170 175 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 180 185 190 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 195 200 205 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 210 215 220 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp 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His 1 5 10 <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of the 25E9 heavy chain mouse variable domain <400> 51 Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 52 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of the 25E9 heavy chain mouse variable domain <400> 52 Phe Tyr Tyr Thr Tyr Ser Asn Tyr Asp Val Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 53 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of the 25D8 light chain mouse variable domain <400> 53 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of the 25D8 light chain mouse variable domain <400> 54 Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly 1 5 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of the 25D8 light chain mouse variable domain <400> 55 Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of the 25D8 heavy chain mouse variable domain <400> 56 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His 1 5 10 <210> 57 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of the 25D8 heavy chain mouse variable domain <400> 57 Leu Ile Asn Pro Ser Asn Ala Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Asn 1 5 10 15 Thr <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of the 25D8 heavy chain mouse variable domain <400> 58 Gly Gly Asp Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 59 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 25E9 heavy chain (IgG2) humanized variant 2 <400> 59 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Thr Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr 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Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 305 310 315 320 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 60 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 25E9 heavy chain (IgG2) humanized variant 3 <400> 60 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 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caagctggaa ataaaa 336 <210> 63 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 25E9 heavy chain mouse variable domain <400> 63 gagatccagc tgcagcagtc tggagttgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacgctg 60 tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgaca tgcactgggt gaagcagaca 120 cctgttcatg gcctggaatg gattggaact attgatcctg aaactggtgg tactgcctac 180 aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcggaca gatcctccac cacagcctac 240 atggagctca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac aagtttctac 300 tatacttact ctaattacga cgtggggttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact 360 gtctctgca 369 <210> 64 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized 25E9 light chain variable domain variant 1 <400> 64 gacatcgtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgcctgtga cacctggcga gcccgcctcc 60 atctcctgcc ggtccaccaa gtccctgctg cactccaacg gcaacaccta cctgtactgg 120 tatctgcaga agcccggcca gtcccctcag ctgctgatct accggatgtc caacctggcc 180 tccggcgtgc ccgacagatt ctccggctct ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgggtgg aagccgagga 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25D8 heavy chain variable domain <400> 77 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asp Gly Tyr Ile Gln Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 78 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> candidate human model for the 25D8 heavy chain variable domain <400> 78 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala 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Artificial Sequence <220> <223> candidate human model for the 25E9 light chain variable domain <220> <221> misc_feature <222> (101)..(101) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 85 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Pro Arg Xaa Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 86 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> candidate human model for the 25E9 heavy chain variable domain <400> 86 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ser Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Leu Leu Gly Val Ala Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Tyr Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 87 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> candidate human model for the 25E9 heavy chain variable domain <400> 87 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Asp Asp Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 88 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> candidate human model for the 25E9 heavy chain variable domain <400> 88 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Ser Ser Arg 20 25 30 Pro Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Arg Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Met Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Leu Arg Gly Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Thr Arg Met Lys Ile Thr Val Phe Ala Ser Thr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 89 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> candidate human model for the 25E9 heavy chain variable domain <400> 89 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 <210> 90 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> candidate human model for the 25E9 heavy chain variable domain <400> 90 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 <210> 91 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> candidate human model for the 25E9 heavy chain variable domain <400> 91 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr <210> 92 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> candidate human model for the 25E9 heavy chain variable domain <220> <221> misc_feature <222> (109)..(109) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 92 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Pro Gly Tyr Gly Ser Arg Gly Asp Tyr Xaa Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (68)

  1. Siglec-15에 특이적으로 결합할 수 있고,
    a. SEQ ID NO.:6과 적어도 80% 동일한 경쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO.:12와 적어도 80% 동일한 중쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 SEQ ID NO.:6 또는 SEQ ID NO.:12와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환이 상보성 결정 영역(CDR)의 외부에 존재하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및
    b. SEQ ID NO.:22와 적어도 80% 동일한 경쇄 가변 영역 및/또는 SEQ ID NO.:26과 적어도 80% 동일한 중쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 SEQ ID NO.:22 또는 SEQ ID NO.:26과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환이 상보성 결정 영역(CDR)의 외부에 존재하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 아미노산 치환이 경쇄 가변 영역 내에 존재하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 적어도 3개의 아미노산 치환을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역 내에 1 내지 25개의 아미노산 치환을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 아미노산 치환이 경쇄 가변 영역 내에 존재하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  6. 제4항에 있어서, 아미노산 치환이 중쇄 가변 영역 내에 존재하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 보존성 아미노산 치환인 항체 또는 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:33의 적어도 90개의 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:34의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  10. 제9항에 있에서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:35의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:8 또는 10의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:8 또는 SEQ ID NO.:10에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:36의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:37의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  15. 제14항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:38의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  16. 제15항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:14, SEQ ID NO.:16, SEQ ID NO.:18 또는 SEQ ID NO.:20의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  17. 제15항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:14, SEQ ID NO.:16, SEQ ID NO.:18 또는 SEQ ID NO.:20에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편.
  18. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:33의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:36의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  19. 제18항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:34의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:37의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  20. 제19항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:35의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:38의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  21. 제20항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:8 또는 SEQ ID NO.:10의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:14, SEQ ID NO.:16, SEQ ID NO.:18 또는 SEQ ID NO.:20의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  22. 제21항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:8 또는 SEQ ID NO.:10에 기재된 바와 같고, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:14, SEQ ID NO.:16, SEQ ID NO.:18 또는 SEQ ID NO.:20에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편.
  23. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:39의 적어도 90개의 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  24. 제23항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:40의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  25. 제24항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:41의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  26. 제25항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:24의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  27. 제26항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:24에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편.
  28. 제1항 내지 제7항 또는 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:42의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  29. 제28항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:43의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  30. 제29항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:44의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  31. 제30항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:26의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  32. 제31항에 있어서, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:26에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편.
  33. 제1항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:39의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:42의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  34. 제33항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:40의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:43의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  35. 제34항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:41의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:44의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  36. 제35항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:24의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하고, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:26의 적어도 90개의 연속적 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  37. 제36항에 있어서, 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:24에 기재된 바와 같고, 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO.:26에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 불변 영역의 아미노산을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  39. 제38항에 있어서, 불변 영역의 아미노산이 인간 항체로부터 유래되는 항체 또는 항원 결합 단편.
  40. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  41. 제1항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO.:23에 기재된 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  42. 제1항 또는 제41항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO.:27에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  43. 제1항 또는 제41항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO.:46에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  44. 제1항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  45. 제1항 또는 제44항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO.:29에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  46. 제45항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO.:13에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  47. 제1항에 있어서, 상기 항체가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 항원 결합 단편:
    a. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:13에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    b. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:15에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    c. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:17에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    d. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:19에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    e. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:29에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    f. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:59에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    g. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:60에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    h. SEQ ID NO.:7에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:61에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    i. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:13에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    j. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:15에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    k. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:17에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    l. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:19에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    m. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:29에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    n. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:59에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    o. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:60에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    p. SEQ ID NO.:9에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:61에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    q. SEQ ID NO.:23에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:27에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편;
    r. SEQ ID NO.:23에 기재된 경쇄 및 SEQ ID NO.:46에 기재된 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단편이 scFv, Fab, Fab' 또는 (Fab')2인 항체 또는 항원 결합 단편.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 세포독성 모이어티와 컨쥬게이션된 항체 또는 항원 결합 단편.
  50. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 모이어티와 컨쥬게이션된 항체 또는 항원 결합 단편.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 골 손실의 치료에 사용하기 위한 항체 또는 항원 결합 단편.
  52. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편과 경쟁할 수 있는 분리된 항체 또는 항원 결합 단편.
  53. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편의 경쇄 가변 도메인 및/또는 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산.
  54. 제53항의 핵산을 포함하는 벡터.
  55. 제54항에 있어서, 상기 벡터가 발현 벡터인 벡터.
  56. 제53항의 핵산을 포함하는 분리된 세포.
  57. 제56항에 있어서, 상기 세포가 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하는 분리된 세포.
  58. 제57항에 있어서, 상기 세포가 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키고/시키거나, 어셈블리시키고/시키거나, 분비할 수 있는 분리된 세포.
  59. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하거나 발현하는 분리된 세포.
  60. 제59항에 있어서, 상기 세포가 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 포함하는 분리된 세포.
  61. 제60항에 있어서, 상기 세포가 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현하고/하거나, 어셈블리시키고/시키거나, 분비할 수 있는 분리된 세포.
  62. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  63. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편, 및 담체를 포함하는 조성물.
  64. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하는 골 손실을 치료하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 골 손실이 암, 암 치료, 골다공증, 골감소증, 골연화증, 부갑상선항진증, 갑상선저하증, 갑상선항진증, 생식선저하증, 갑상샘중독증, 전신비만세포증, 성인 저인산증, 부신피질항진증, 불완전골형성, 파제트병, 쿠싱병/증후군, 터너 증후군, 고쉐병, 엘러스-단로스 증후군, 마르판 증후군, 멘케 증후군, 판코니 증후군, 다발골수종, 고칼슘혈증, 저칼슘혈증, 관절염증, 치주병, 구루병(비타민 D 의존성, 타입 I 및 II, 및 x-연관 저인산혈 구루병을 포함함), 골성 불완전 섬유생성증, 골경화성 장애, 예를 들어, 피크노디소스토시스(pycnodysostosis) 또는 대식세포-매개 염증성 과정 골에 의해 야기되는 손상과 관련된 방법.
  66. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 키트.
  67. 골 손실의 치료를 위한 약제의 제조에서의 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편의 용도.
  68. 제67항에 있어서, 골 손실이 암, 암 치료, 골다공증, 골감소증, 골연화증, 부갑상선항진증, 갑상선저하증, 갑상선항진증, 생식선저하증, 갑상샘중독증, 전신비만세포증, 성인 저인산증, 부신피질항진증, 불완전골형성, 파제트병, 쿠싱병/증후군, 터너 증후군, 고쉐병, 엘러스-단로스 증후군, 마르판 증후군, 멘케 증후군, 판코니 증후군, 다발골수종, 고칼슘혈증, 저칼슘혈증, 관절염증, 치주병, 구루병(비타민 D 의존성, 타입 I 및 II, 및 x-연관 저인산혈 구루병을 포함함), 골성 불완전 섬유생성증, 골경화성 장애, 예를 들어, 피크노디소스토시스 또는 대식세포-매개 염증성 과정에 의해 야기되는 손상과 관련된 용도.
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