KR100891157B1 - 짧은 생물활성 펩티드 및 그것들의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

페닐알라닌, 로이신, 알라닌, 및 리신 잔기를 함유하는 짧은 생물활성 펩티드가 개시된다. 이 펩티드는 항균, 항진균, 항암, 및 다른 생물학적 용도에 사용될 수 있다.
펩티드, 생물활성, 페닐알라닌, 로이신, 알라닌, 리신, 항균, 항암, 상처

Description

짧은 생물활성 펩티드 및 그것들의 사용 방법{SHORT BIOACTIVE PEPTIDES AND METHODS FOR THEIR USE}
본 발명은 그것들의 주 서열에 페닐알라닌, 로이신, 알라닌, 및 리신 아미노산 잔기(F, L, A, 및 K; "FLAK 펩티드")를 함유하는 짧은 길이 펩티드에 관한 것이다. 구체적으로는, 바람직한 항균, 항진균, 항암, 및 다른 생물학적 활성을 갖는 FLAK 펩티드가 개시된다.
다양한 생물활성 펩티드가 과학 문헌 및 발행된 특허에서 보고되었다. 펩티드는 역사적으로 천연 공급원으로부터 분리되었으며, 최근에는 구조-기능 관계 연구의 대상이 되고 있다. 게다가, 천연 펩티드는 합성 펩티드 유사체의 설계를 위한 스타팅 포인트로서 사용된다.
펩티드 항생물질의 리뷰는 1997년 R.E.W. Hancock에 의해 발표되었다(Lancet 349:418-422). 다양한 부류의 펩티드의 구조, 기능, 및 임상 용도가 논의되었다. 양이온성 펩티드 항생물질에 대한 추가 리뷰가 1998년 발표되었다(Hancock, R.E.W. 및 Lehrer, R. Trends Biotechnol. 16:82-88). 펩티드는 전형적으로 12 내지 45개 아미노산 길이의 양이온성 양쪽성 분자이다. 펩티드는 세포막을 투과하여 미생물 작용물질의 제어를 가져온다. 숙주 방어 양이온성 펩티드의 임상적 잠재성이 1999 년 R.E.W. Hancock에 의해 논의되었다(Drugs 57(4):469-473; Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43(6):1317-1323). 그 펩티드 부류의 항박테리아, 항진균, 항바이러스, 항암, 및 상처 치유 특성이 논의되었다.
나선형 항균 펩티드의 구조적 특징, 및 그것들의 추정된 작용 메카니즘에 대한 리뷰가 발표되었다(예를 들어, Dathe, M. 및 Wieprecht, T. Biochimica et Bio-physica Acta 1462:71-87 (1999); Epand, R.M. 및 Vogel H.J. Biochimica et Bio-physica Acta 1462:11-28 (1999) 참조). 활성 및 선택성을 조정할 수 있을 것으로 여겨지는 구조적 파라미터는 헬리시티, 소수성 모멘트, 소수성, 친수성/소수성 나선 표면에 의해 정해진 각, 및 전하를 포함한다.
광범한 천연 발생 알파 나선형 펩티드가 보고되었다. 다음은 본 분야의 많은 참고자료 중 대표적인 것이다.
세크로핀(Cecropin)은 곤충으로부터 분리된 α-나선형 펩티드의 패밀리이다. 세크로핀은 U.S. 특허 No. 4,355,104 및 4,520,016에 설명된 바와 같이, 그것들의 항박테리아 특성으로 유명하다. 세크로핀은 일반적으로 그램-음성 박테리아에 대한 활성을 갖는다고 알려졌으나, 모든 그램-음성 박테리아에 대해서 그런 것은 아니다. 세크로핀은 진핵 세포에 대한 활성은 갖지 않는 것으로 밝혀졌다(Andreu, 등, Biochemistry 24:163-188 (1985); Boman 등, Developmental and Comparative Immunol. 9:551-558(1985); Steiner 등, Nature 292:246-248 (1981)). Drosophila 및 Hyalphora로부터의 세크로핀은 다양한 진균 균주에 대한 활성을 갖는 것으로 나타났다(Ekengren, S. 및 Hultmark, D., Insect Biochem. and Molec. Biol. 29:965- 972 (1999)). 모기 Aedes aegypti로부터의 세크로핀 A는 전하는 바에 의하면 트립토판 및 C-말단 아미드화를 결여한다는 점에서 대부분의 곤충 세크로핀과는 상이하다.
Rana 속 개구리는 그것의 피부에서 광범한 항균 펩티드를 생성한다(Goraya, J. 등, Eur. J. Biochem. 267:894-900 (2000)). 13개 아미노산 정도의 짧은 펩티드가 보고되었고 구조적 패밀리로 분류되었다. 그 서열은 마가이닌(Magainin) 및 더마셉틴(Dermaseptin) 펩티드와 같은, 다른 속의 개구리로부터 분리된 펩티드와의 서열 동일성을 거의 나타내지 않았다.
U.S. 특허 No. 5,962,410는 세크로핀 및 사르코톡신(Sarcotoxin)과 같은 용균 펩티드를 사용한 림프구 및 섬유아세포의 자극 및 진핵 병원체의 억제를 개시했다. 나타낸 다양한 펩티드는 Cecropin B, Cecropin SB-37, Cecropin A, Cecropin D, Shiva-1, Lepidopteran, Sarcotoxin 1A, Sarcotoxin 1B, 및 Sarcotoxin 1C를 포함한다.
Shiva-1 세크로핀 부류 용균 펩티드를 생산하는 트랜스제닉 마우스가 Reed, W.A. 등에 의해 보고되었다(Transgenic Res. 6:337-347 (1997)). 트랜스제닉 마우스를 Brucella abortus로 감염시킨 면역성 검사에서는 비-트랜스제닉 마우스의 감염에 비하여 박테리아의 수가 감소되었다.
마가이닌은 아프리카 개구리 Xenopus laevis의 피부로부터 분리된 α-나선형 23개 아미노산 펩티드이다(Zasloff, M. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 5449-5453 (1987)).
카테린(Cathelin)에 관련된 23 내지 38개 아미노산 α-나선형 펩티드가 양, 사람, 소, 돼지, 마우스, 및 토끼의 혈액 세포에서 발견된다(Zanetti, M. 등, FEBS Lett. 374:1-5 (1995)).
부포린(Buforin) II, 세크로핀 P1, 인돌리시딘(Indolicidin), 마가이닌 II, 니신(Nisin), 및 라날렉신(Ranalexin)의 항균 활성들이 Giacomette, A. 등에 의해 보고되었다(Peptides 20:1265-1273 (1999)). 이 펩티드들은 박테리아 및 효모에 대한 가변 활성을 나타냈다.
다양한 합성 펩티드가 제조되었고 생체외 및 생체내에서 분석되었다.
U. S. 특허 No. 5,861,478는 α-나선형 입체구조를 채택한 약 20 내지 40개 아미노산의 합성 용균 펩티드를 개시했다. 이 펩티드는 미생물 감염, 상처, 및 암의 치료에서 효과적이다. 개시된 펩티드는 Cecropin B, SB-37*, LSB-37, SB-37, Shiva 1 및 10-12, β-피브린 신호 펩티드, Manitou 1-2, Hecate 1-3, Anubis 1-5 및 8, 및 Vishnu 1-3 및 8을 포함한다.
헤케이트(Hecate)는 Baghian, A. 등에 의해 멜리틴(Melittin)의 합성 펩티드 유사체로서 설명되었다(Peptides 18(2):177-183 (1997)). 이 펩티드는 그것들의 전하 분포에 있어 상이하나, 그것들의 양쪽성 알파 나선형 입체구조에 있어서는 그렇지 않다. 헤케이트는 단순포진 바이러스(HSV-1)를 억제했으며, 세포 성장 및 단백질 합성에 대한 부작용은 없었다.
합성 펩티드 D2A21, D4E1, D2A22, D5C, D5C1, D4E, 및 D4B가 Schwab, U. 등, Antimicrob. Agents and Chemotherapy 43(6):1435-1440 (1999)에서 설명되었다. 다양한 박테리아 균주에 대한 활성이 제시되었다.
보고된 바에 의하면 세크로핀과 멜리틴 펩티드로 만들어진 하이브리드 펩티드가 Juvvadi, P. 등에 의해 제조되었고 분석되었다(J. Peptide Res. 53:244-251 (1999)). 하이브리드는 채널 형성 능력 및 항박테리아 활성에 대한 서열, 아미드 결합 방향(나선 쌍극자), 전하, 양쪽성, 및 소수성의 효과를 조사하기 위하여 합성되었다. 서열 및 아미드 결합 방향이 하이브리드의 활성을 위한 중요한 구조적 필요조건인 것으로 암시되었다.
26개 아미노산의 곤충 세크로핀 - 벌 멜리틴 하이브리드, 및 그것의 유사체가 염 내성 연구에서 설명되었다(Friedrich, C. 등, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43(7):1542-1548 (1999)). 두번째 위치의 트립토판 잔기가 활성에 중요한 것으로 밝혀졌다. 크지 않은 서열 변화가 펩티드 특성의 실질적인 변화를 가져오는 것으로 밝혀졌다.
α-나선형 펩티드의 항박테리아 특성에 대한 프롤린 잔기의 효과가 발표되었다(Zhang, L. 등, Biochem. 38:8102-8111 (1999)). 프롤린의 부가가 막 삽입 특성을 변화시킨다고 보고되었으며, 단일 프롤린 대체는 항균 펩티드를 독소로 변화시킬 수 있다.
18 내지 30개 아미노산을 갖는 일련의 펩티드를 제조하여 항박테리아 특성에 대한 서열 및 전하 변화의 효과를 시험하였다(Scott, M.G., 등, Infect. Immun. 67 (4):2005-2009 (1999)). 펩티드의 항균 활성과 길이, 전하, 또는 소수성 사이의 현저한 상관성은 발견되지 않았다. 일반적인 경향은 더 짧은 펩티드는 더 긴 펩티 드보다 활성이 더 적은 것으로 판명되었으나, 저자는 이 효과가 아마도 서열 의존적일 것이라고 표현했다.
합성 펩티드의 한 그룹인 "모델린"(Modellin)이 제조되었고 분석하여 서열 및 구조 관계를 비교하였다(Bessalle, R. 등 J. Med. Chem. 36:1203-1209 (1993)). 소수성 및 친수성의 마주한 면을 갖는 16 및 17개 아미노산의 펩티드는 매우 용혈성이고 항박테리아성이었다. 더 작은 펩티드는 보다 적은 생물학적 활성을 갖는 경향이 있었다.
세크로핀-멜리틴 하이브리드 펩티드 및 아미드화된 가자미목 펩티드는 생체내의 Vibrio anguillarum 감염으로부터 연어를 보호하는 것으로 밝혀졌다(Jia, X. 등, Appl. Environ. Microbiol. 66(5):1928-1932 (2000)). 삼투 펌프를 사용하여 어느 한 펩티드의 연속 용량을 물고기에게 송달했다.
양쪽성 펩티드는 상처 치유를 증진시키고 생체내에서 섬유아세포 및 피부세포 성장을 자극할 수 있다고 보고되었다(U.S. 특허 No. 6,001,805 및 5,561,107). 보고된 바에 의하면 유비키틴과의 융합 단백질로서 용균 펩티드를 발현하는 트랜스제닉 식물이 제조되었다(U.S. 특허 No. 6,084,156). 또한, 보고된 바에 의하면 개선된 단백질 가수분해 내성을 나타내는 멜라틴화 리신 부화 용균 펩티드가 제조되었다(U.S. 특허 No. 5,717,064).
다수의 천연 및 합성 펩티드가 존재하는 한편, 개선된 생물활성 펩티드 및 그것들의 사용 방법에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 개요
그것들의 주 서열에 페닐알라닌, 로이신, 알라닌, 및 리신 아미노산 잔기를 함유하는 짧은(즉, 23개 아미노산 길이 이하) 펩티드가 개시된다. 이 펩티드는 바람직한 항박테리아, 항진균, 항암 생물학적 활성을 나타내며, 또한 사람 섬유아세포 및 림프구의 자극 및 증식을 일으킨다.
서열 목록의 설명
다음의 서열 목록은 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 어떤 양태를 더 증명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 나타낸 특정한 구체예들의 상세한 설명과 함께 이들 서열 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
Figure 112003035312056-pct00001
Figure 112003035312056-pct00002
Figure 112003035312056-pct00003
Figure 112003035312056-pct00004
Figure 112003035312056-pct00005
발명의 상세한 설명
본 발명의 일반적으로 바람직한 생물학적 특성을 갖는 펩티드, 및 그것들의 사용에 관한 것이다. 놀랍게도, 이 펩티드들은 본 분야에 설명된 다른 펩티드에 비하여 그것들의 짧은 길이로 인해 효능을 가진다.
펩티드
본 발명의 한 구체예는 페닐알라닌, 로이신, 알라닌, 및 리신 잔기를 포함하는 분리된 펩티드에 관한 것이며, 여기에서 펩티드는 약 5 내지 약 23개 아미노산 길이이다. 펩티드는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 약 18개 아미노산의 최소 길이를 가질 수 있다. 펩티드는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 약 23개 아미노산의 최대 길이를 가질 수 있다. 펩티드는 약 5 내지 약 20개 아미노산 길이일 수 있다. 펩티드는 페닐알라닌, 로이신, 알라닌, 및 리신 잔기로 필수적으로 구성되거나 또는 그것 들로 구성될 수 있다. 펩티드는 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 페닐알라닌, 로이신, 알라닌, 및 리신 잔기의 아미노산 조성 퍼센트를 가질 수 있다. 펩티드는 일반적으로 이들 다양한 가이드라인 내에 속한 기재된 SEQ ID NO 들 중 어느 것일 수 있으며, 더 바람직하게는 SEQ ID NO:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID N0:32, SEQ ID N0:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:55, SEQ ID N0:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:163, SEQ ID NO:164, 및 SEQ ID NO:165이다. 펩티드는 바람직하게는 헤케이트-1, 아누비스(Anubis)-1, 아누비스-2, 아누비스-5, 아누비스-8, 비슈누(Vishnu)-1, 비슈누-2, 비슈누-3, 비슈누-8, 또는 Shiva-10이 아니다.
펩티드는 상기 설명된 펩티드들 중 어느 것과 유사할 수 있으며, 동일성 퍼센트에 의해 측정된 바, 바람직하게는 SEQ ID NO:2(또는 SEQ ID NO:16 또는 SEQ ID NO:126), SEQ ID NO:4(또는 SEQ ID NO:14 또는 SEQ ID NO:17), SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:126, 또는 SEQ ID NO:132와 유사하다. 펩티드들 간의 동일성 퍼센트는 바람직하게는 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 동일성 퍼센트는 상업용 제품 CLUSTALW에 의한 서열 정렬을 사용하여 측정된다. 정렬된 아미노산의 수를 더 짧은 펩티드의 길이로 나누고, 그 결과에 100%를 곱하여 동일성 퍼센트를 결정한다. 만일 더 짧은 펩티드의 길이가 10개 아미노산 미만이라면, 정렬된 아미노산의 수를 10으로 나누고, 그 결과에 100%를 곱하여 동일성 퍼센트를 결정한다.
펩티드는 D- 또는 L-아미노산을 포함할 수 있다. 펩티드는 모든 D-아미노산을 포함할 수 있다. 펩티드는 아미드 C-말단(-CONH2, -CONHR, 또는 -CONR2) 또는 산 C-말단(-CO2H)을 가질 수 있다.
사용 방법
본 발명의 추가의 구체예는 상기 설명된 펩티드를 사용하는 방법에 관한 것 이다. 사용 방법은 바람직하게는 정상 미감염 포유류 세포에 손상을 입히거나 또는 그것을 죽이는 원인이 되지 않는다. 치료적 용량 수준에서 사용 방법은 바람직하게는 정상 미감염 또는 비-신생물성 포유류 세포에 손상을 입히거나 또는 그것을 죽이는 원인이 되지 않는다. 사용 방법은 단일 펩티드의 사용을 포함할 수 있거나, 또는 다수 펩티드의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예는 미생물 세포(미생물)을 억제하거나 또는 죽이기 위한 상기 설명된 펩티드의 사용이다. 미생물은 병원성 미생물로 감염된 박테리아 세포, 진균 세포, 원생동물, 바이러스, 또는 진핵 세포일 수 있다. 이 방법은 일반적으로 미생물과 펩티드의 접촉 단계를 지시한다. 접촉 단계는 생체내, 생체외, 국부적, 경구적, 경피적, 전신적으로, 또는 당업자에게 공지된 어떤 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 접촉 단계는 바람직하게는 미생물을 억제하거나 또는 죽이는데 충분한 농도에서 수행된다. 펩티드의 농도는 적어도 약 0.1μM, 적어도 약 0.5μM, 적어도 약 1μM, 적어도 약 10μM, 적어도 약 20μM, 적어도 약 50μM, 또는 적어도 약 100μM일 수 있다. 사용 방법은 박테리아, 그램 양성 박테리아, 그램 음성 박테리아, 미코박테리아, 효모, 진균, 조류, 원생동물, 바이러스, 및 세포내 유기체와 같은 미생물의 억제 또는 살생에 관한 것일 수 있다. 구체적인 예는 Staphylococcus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Chlamydia, Candida albicans, Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Plasmodium falciparum 또는 Trypanosoma cruzi을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 접촉 단계는 전신 주사, 경구, 피하, IP, IM, IV 주사에 의해, 또는 국부 도포에 의해 수행될 수 있다. 주사용 투약량은 다음 농도들 중 어느 것일 수 있다: 약 1mg/kg, 약 5mg/kg, 약 10mg/kg, 약 25mg/kg, 약 50mg/kg, 약 75mg/kg, 및 약 100mg/kg. 접촉 단계는 포유류, 고양이, 개, 소, 말, 돼지, 새, 닭, 식물, 어류, 또는 사람에 대해 수행될 수 있다.
현재 바람직한 항박테리아 용도의 펩티드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:93, SEQ ID N0:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:162, SEQ ID N0:163, SEQ ID NO:164, 및 SEQ ID N0:165를 포함한다.
현재 바람직한 항진균 용도의 펩티드는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:25, SEQ ID N0:30, SEQ ID N0:35, SEQ ID N0:58, SEQ ID N0:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:84, SEQ ID N0:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:163, 및 SEQ ID NO:165를 포함한다.
본 발명의 추가의 구체예는 암세포를 억제하거나 또는 죽이기 위한 상기 설명된 펩티드들 중 어느 것의 사용이다. 이 방법은 일반적으로 암세포와 펩티드의 접촉 단계를 지시한다. 접촉 단계는 생체내, 생체외, 국부적, 경구적, 경피적, 전신적으로, 또는 당업자에게 공지된 어떤 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 접촉 단계는 바람직하게는 암세포를 억제하거나 또는 죽이는데 충분한 농도에서 수행된다. 펩티드의 농도는 적어도 약 0.1μM, 적어도 약 0.5μM, 적어도 약 1μM, 적어도 약 10μM, 적어도 약 20μM, 적어도 약 50μM, 또는 적어도 약 100μM일 수 있다. 암세포는 일반적으로 어떤 종류의 암세포일 수도 있다. 암세포는 육종, 림프종, 암종, 백혈병, 유방암세포, 결장암세포, 피부암세포, 난소암세포, 경부암세포, 고환암세포, 폐암세포, 전립선암세포, 및 피부암세포일 수 있다. 접촉 단계는 피하, IP 주사, IM 주사, IV 주사, 직접 종양 주사, 또는 국부 도포에 의해 수행될 수 있다. 주사용 투약량은 다음 농도들 중 어느 것일 수 있다: 약 0.1mg/kg, 약 1mg/kg, 약 5mg/kg, 약 10mg/kg, 약 25mg/kg, 약 50mg/kg, 약 75mg/kg, 및 약 100mg/kg. 접촉 단계는 포유류, 고양이, 개, 소, 말, 돼지, 새, 닭, 식물, 어류, 염소, 양, 또는 사람에 대해 수행될 수 있다. 암세포의 억제는 일반적으로 펩티드 치료를 하지 않은 암세포에 비하여 암세포 성장의 어떤 억제일 수 있다. 억제는 바람직하게는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및 이상적으로는 100%의 성장 억제이다. 억제는 암세포의 용균에 의해 또는 다른 수단에 의해 달성될 수 있다. 암 억제 펩티드는 다른 암 화학요법제와 함께 상승적으로 사용될 수 있다.
현재 바람직한 항암 용도의 펩티드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:25, SEQ ID N0:26, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:35, SEQ ID N0:46, SEQ ID NO:51, SEQ ID N0:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:152, 및 SEQ ID NO:162를 포함한다.
본 발명의 추가의 구체예는 세포의 자극 및/또는 증식을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 세포와 조성물을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기에서 조성물은 펩티드를 포함한다. 펩티드는 상기 설명된 펩티드들 중 어느 것일 수 있다. 조성물에서 펩티드의 농도는 약 0.01μM 내지 약 500μM, 약 0.1μM 내지 약 100μM, 약 1μM 내지 약 50μM, 또는 약 1μM 내지 약 10μM일 수 있다. 세포는 일반적으로 모든 종류의 세포이며, 바람직하게는 포유류 세포이고, 구체적으로는 섬유아세포 및 림프구 및 식세포를 포함한 백혈구 세포를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 세포의 대사 자극 및/또는 증식은 바람직하게는 조성물과 접촉되지 않은 동일한 세포에 비해 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 또는 200%까지 증가된다. 조성물은 성장 인자를 더 포함할 수 있다. FLAK 펩티드 중 일부의 자극 및 증식 특성은 피부 관리, 상처 치유, 및 손상된 포유류 면역 시스템에서 그것들의 사용에 대한 전망을 유지한다.
현재 바람직한 자극 및 증식 용도의 펩티드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID N0:20, SEQ ID N0:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID N0:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID N0:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116, SEQ ID N0:126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:162, SEQ ID NO:164, 및 SEQ ID NO:165를 포함한다.
본 발명의 추가의 구체예는 정상적인 노화, 질환, 손상에 의해, 또는 수술 또는 다른 의학적 과정에 의해 손상된 피부 또는 안구 및 체내 조직의 상처 치유를 촉진하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 동물의 상처에 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기에서 조성물은 상기 설명된 펩티드들 중 어느 것을 포함한다. 조성물에서 펩티드의 농도는 약 0.01μM 내지 약 500μM, 약 0.1μM 내지 약 100μM, 약 1μM 내지 약 50μM, 또는 약 1μM 내지 약 10μM일 수 있다. 조성물은 상처에 국부적으로 또는 전신 송달에 의해 투여될 수 있다. 동물은 일반적으로 어떤 종류의 동물일 수도 있으며, 바람직하게는 포유류이고, 더 바람직하게는 사람, 소, 말, 고양이, 개, 돼지, 염소, 또는 양이다. 상처 치유의 촉진은 바람직하게는 조성물과 접촉되지 않은 동일한 상처에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 또는 200%이다.
현재 바람직한 상처 치유 용도의 펩티드는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID N0:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID N0:61, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:162, 및 SEQ ID NO:164를 포함한다.
본 발명의 더 이상의 구체예는 치료제의 활성을 부가적 또는 상승적으로 증 진시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기에서 조성물은 펩티드 및 치료제를 포함한다. 또는 달리, 이 방법은 다른 치료제와 함께 사용된 펩티드(또는 펩티드들)를 사용한 공-요법 치료를 포함할 수 있다. 펩티드는 상기 설명된 펩티드들 중 어느 것일 수 있다. 치료제는 일반적으로 어떤 치료제일 수도 있으며, 바람직하게는 항생물질, 항균제, 성장 인자, 화학요법제, 항균제, 리소짐, 킬레이트제, 또는 EDTA이다. 바람직하게, 조성물의 활성은 치료제는 함유하지만 펩티드는 결여한 동일한 조성물의 활성보다 더 높다. 조성물 또는 공-요법은 생체외, 생체내, 국부, 경구, IV, IM, IP, 및 경피적 용도에서 사용될 수 있다. 치료제 및 펩티드를 함유하는 조성물의 활성 증진은 바람직하게는 치료제만의 활성에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 또는 200%이다.
일반적으로, 표적에 대항하는 단일 가닥 기초에 대해 활성인 어떤 펩티드는 그 표적에 대항하는 다른 치료제의 활성을 부가적으로 또는 상승적으로 증가시키는데 바람직하게 사용된다. 만일 몇 가지 펩티드가 주어진 상승작용 용도의 후보라면, 보다 적은 독성의 펩티드가 더 호의적으로 고려될 것이다.
본 발명의 더 이상의 추가의 구체예는 낭성섬유증(CF)로 진단된 환자의 치료 방법에 관한 것이다. CF는 다른 효과들 중에서도 폐에서 염증 및 감염을 일으킨다. 본 발명의 상기 설명된 펩티드는 주로 P. aeruginosa에 의해 야기되는 그러한 폐 감염을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드는 항염 특성을 지닐 수 있으며, 이로써 그것들은 CF 환자에서 폐 감염의 치료에 더욱 유용하게 된다. 펩 티드는 흡입 또는 전신 송달을 포함한 어떤 허용되는 방법에 의해 CF 환자에게 투여될 수 있다. 펩티드는 단일 용량으로, 다수 용량으로, 또는 연속 송달로서 투여될 수 있다.
본 발명의 추가의 구체예는 성감염 질환(STD)을 치료하는 방법에 관한 것이다. STD의 원인인 진균 종들의 대부분은 상기 설명된 본 발명의 펩티드에 의해 억제되거나 또는 죽게 된다. 그러한 종들의 예는 C. albicans, C. glabrata, 및 C. tropicalis를 포함한다. 추가적으로, 본 발명의 펩티드는 바이러스 및 박테리아를 포함하는 STD의 원인인 다른 작용물질에 대항하여 사용될 수 있다. 펩티드는 국부, 경구, 또는 전신 송달과 같은 어떤 허용되는 방법에 의해 STD 환자에게 투여될 수 있다. 펩티드는 단일 용량으로, 다수 용량으로, 또는 연속 송달로서 투여될 수 있다. 펩티드는 크림, 젤, 또는 액체와 같은 어떤 허용되는 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 더 이상의 추가의 구체예는 여드름의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드는 여드름 종기로부터 분리된 박테리아, Propionibacterium acnes에 대한 활성을 가지며, 더 이상으로 항염 특성을 가질 수 있다. 펩티드는 임상 치료용 조성물 또는 기능성 화장품 조성물로 존재할 수 있다. 펩티드는 크림, 젤, 또는 액체와 같은 어떤 허용되는 형태로 투여될 수 있다. 펩티드는 국부 도포와 같은 어떤 허용되는 방식으로 투여될 수 있다. 펩티드는 치료 방법에서 사용될 수 있거나, 또는 예방식으로 사용되어 앞으로의 여드름 발생을 감소 또는 제거할 수 있다.
더 이상의 구체예는 화장품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드는 콜라겐 및 섬유아세포를 자극하고 상처 치유를 촉진하는 것으로 나타났다. 화장품 제제에 본 발명의 펩티드의 포함은 노화 방지 및 레쥬비네이션(rejuvination) 시장에서 유용할 수 있다.
본 발명의 추가의 구체예는 상처 치유를 촉진하는데 있어서 펩티드의 사용에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드는 상처 감염에 가장 많이 관련된 박테리아: S. aureus, S. pyogenes, 및 P. aeruginosa에 대한 높은 효능을 가진다. 또한, 펩티드는 상처 치유 및 염증 감소를 촉진한다. 펩티드는 크림, 젤, 또는 액체와 같은 어떤 허용되는 형태로 투여될 수 있다. 펩티드는 국부 투여 또는 전신 투여와 같은 어떤 허용되는 방식으로 투여될 수 있다.
다음의 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예들을 증명하기 위해 포함된다. 다음의 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능할 수 있는 본 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내며, 따라서 그것의 실시를 위한 바람직한 방식으로 구성되도록 고려될 수 있다는 것이 당업자에게 인정되어야 한다. 그러나, 본 명세서에 비추어 당업자는 개시된 특정한 구체예에서 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않는 많은 변화가 만들어지고 유사한 결과가 얻어질 수 있다는 것을 인정하여야 한다.
실시예 1
미생물 균주
다음의 표는 실시예 전체에서 사용된 다양한 미생물을 기재하고 있다.
Figure 112003035312056-pct00006
실시예 2
항균 분석 I
다음의 펩티드 항균 분석에 대한 데이타를 펩티드를 첨가한 것 및 첨가하지 않은 것의 생체외 세포 배양 실험에서 OD를 측정하여 얻었다. 사용된 프로토콜은 다음과 같다.
Staphylococcus aureus ATCC 6538 또는 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 또는 27853를 셀라인은 포함했다. Antibiotic Medium 3(Difco), Antibiotic Medium 2(Difco), 및 0.85% 식염수를 배지로 사용했다. 대조표준은 생리식염수, 및 50, 25, 10, 5, 1, 및 0.1ppm의 겐타마이신을 사용했다.
모든 배지, 스톡 용액, 및 희석물은 무균 작업대에서 제조하여 오염을 방지했다. 박테리아 세포를 Antibiotic Medium 2 아가 슬랜트(25℃에서 pH 7.0) 상에서 신선하게 성장시켰다. 박테리아를 약 104cfu/ml로 Antibiotic Medium 3 중에 현탁 및 희석하여 접종물로서 사용했다. 샘플 용액(100㎕/웰)을 첨가하여 플레이트 레이아웃에 따라 평판했다. 접종물(100㎕/웰)을 첨가하여 5x103cfu/ml의 최종 농도를 달성했다. 음성 대조표준은 100㎕ 식염수 및 100㎕ 성장 배지를 받았다. 양성 대조표준은 100㎕ 식염수 및 100㎕ 접종물을 받았다. 박테리아 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 했다.
흔들어서 세포를 다시 현탁시킨 후 620nm에서 흡광도를 읽었다. 시험 유기체의 성장을 완전히 억제하는 펩티드의 최저 농도를 최소억제농도(MIC)로 정의했다.
효모 분석을 RPMI 1640 배지(25℃에서 pH 7.0)에서 수행했다.
상기 프로토콜을 사용하여 표 3에 나타낸 데이타를 얻었다. 그러나, 표 4의 데이타는 변형 프로토콜을 사용하여 얻었으며, 여기에서 배지는 Tryptic Soy Broth였으며, 접종물 강도는 ml 당 대략 104CFU, 측정된 값은 최소살균농도(MBC) 또는 최소살진균농도(MFC)였다.
다음의 표 3은 ㎍/ml의 MIC 또는 MFC 값으로서 측정된 펩티드의 항균 특성을 설명한다. staph6538은 Staphylococcus aureus ATCC 승인번호 6538; paerug9027은 Pseudomonas aeruginosa ATCC 승인번호 9027; 효모는 Saccharomyces cerevisiae이다.
Figure 112003035312056-pct00007
Figure 112003035312056-pct00008
Figure 112003035312056-pct00009
다음의 표 4는 최소 살균 또는 최소 살진균(Candida) 농도로서 측정된 펩티드의 항균 특성을 설명한다. MBC 또는 MFC 값은 ㎍/ml이다. 여기에서, E. coli는 Escherichia coli ATCC 승인번호 25922; P. aerug는 Pseudomonas aeruginosa ATCC 승인번호 27853; S. aur.은 Stapholococcus aureus ATCC 승인번호 25923; Candida는 Candida albicans ATCC 승인번호 10231이다.
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실시예 3
항균 분석 II
보다 광범한 병원균(임상 균주를 포함)에 대항하는 항균 활성을 실시예 2에서 시험했다. 실시예 2 및 실시예 3에서 분석을 위해 다소 상이한 프로토콜이 사용되었음을 주목해야 한다.
이 실시예에서는 이전에 설명되었던 NCCLS(National Committee for Clinical Laboratory Standards) Broth microdilution 법(Steinberg 등, AAC 41:1738, 1997)의 약간 변형된 버전을 사용하여 MIC를 측정했다. 간단히 말해서, 항균제를 가장 적합한 용매 중에서 10x 농축물로서 제조했다. 펩티드에 대해서, 캐리어 단백질로서 0.2% 소혈청 알부민을 함유하는 0.01% 아세트산을 사용했다. BAP로부터의 콜로니를 배지 중에 현탁하고, 0.5 McFarland 표준과 매치되도록 현탁액을 조정하여 접종물을 제조했다. 현탁액을 신선한 배지로 희석하여(유기체에 대한 NCCLS의 권고에 따라) 박테리아 2x105 내지 7x105CFU/ml 또는 Candida 2x103 내지 7x103CFU/ml를 얻었다. 미생물 현탁액을 100㎕ 알리쿼트씩 96-웰 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 분배한 후, 시험 화합물 11㎕를 첨가했다. MIC는 35℃에서 16 내지 20시간(박테리아) 또는 46 내지 50시간(Candida) 후 가시적인 탁도를 방지했던 약물의 최저 농도로서 정의했다. 통성혐기성균은 7% 이산화탄소에서, 절대혐기성균은 표준 혐기성 "jar"를 사용하여 유지된 산소 무함유 환경에서 인큐베이션을 수행했다. 모든 MIC를 3번 수행했고, 평균값을 측정했다.
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다음의 표들은 대표적인 펩티드 샘플의 항진균 및 항박테리아 특성을 비교한다.
Figure 112003035312056-pct00022
Figure 112003035312056-pct00023
개시된 FLAK 펩티드들의 대부분은 광범한 미생물에 대항하여 활성을 가진다. 다음의 표들은 대표적인 펩티드 샘플에 대한 이들 특성을 예시한다.
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Figure 112003035312056-pct00025
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FLAK 펩티드는 일반적으로 일련의 미생물 표적에 대하여 활성이지만, 모든 펩티드가 모든 미생물에 대하여 동일하게 효과적인 것은 아니다. 다음의 표들은 펩티드가 나쁜 활성을 갖는 것으로 관찰된 펩티드와 미생물의 어떤 조합을 나타낸다.
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실시예 4
항암 분석
상기 설명된 항균 분석과 유사한 방식으로 암세포 분석을 수행했는데, 단 분석 과정은 MTT 염료 프로토콜을 사용했다. 세포의 생육력을 염료 반응에 의해 측정한다. 다음 과정에서, 웰 당 대략 1.5x104 세포를 첨가하고 세미-컨플루언트 상태의 세포를 사용하여 생육력을 측정했다. 분석은 96-웰 플레이트에서 수행했다. 펩티드 첨가 후, 플레이트를 24시간 동안 방치했다. 펩티드로 처리되지 않은 양성 대조표준 웰을 포함하여 각 웰에 MTT(페놀 레드 무함유 RPMI-1640 중에 5mg/ml, 20㎕)를 첨가했다. 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션했다. 각 웰의 액체 내용물을 제거하고, 0.1M HCl를 갖는 이소프로판올(100㎕)을 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 파라핀으로 밀봉해서 이소프로판올의 증발을 방지했다. 플레이트를 5-10분 동안 그대로 두어 침전물을 용해시켰다. 정제수(100㎕)를 각 웰에 첨가했다. ELLISA 리더 기기에서 흡광도를 측정했다. 540nm에서 색의 강도는 세포의 생육력에 비례한다. 각 펩티드 농도에 대한 결과를 미처리 대조표준에 관해 플롯팅하고, 그 그래프로부터 LD50 값을 측정했다.
WI38(ATCC No. CCL75)는 폐 이배체세포의 정상 섬유아세포계, MCF7(ATCC No. HTB22)는 유방선암종 종양 셀라인, SW480(ATCC No. CCL228)는 결장선암종 종양 셀라인, BMKC는 Bowes 흑색종계 HMCB(ATCC No. CRL9607)로부터 유래된 클론된 흑생종계, H1299(ATCC No. CRL5803)는 폐 대세포암종 종양계, HeLaS3(ATCC No. CCL2.2)는 경부 상피암종 종양 셀라인, PC3(ATCC No. CRL1435)는 전립선 선암종 종양 셀라인 이다. 수치는 LD50 값(㎍/ml)이다. 6개 표적에 대한 데이타를 다음의 표 16 및 17에 나타낸다.
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면역성 검사된 모든 표적이 하나 이상의 펩티드에 의해 허용되는 범위(즉, 50㎍/ml 미만의 LD50)까지 억제되었다는 것을 표 16 및 17로부터 볼 수 있다. 하기 표 18은 시험된 150개의 펩티드 중 44개(29%)는 50 이하의 어떤 LD50 값으로 활성이었고; 펩티드 중 26개는 25 이하의 LD50 값으로 어떤 표적에 대해 활성이었고; 펩티드 중 16개는 10 이하의 LD50 값으로 하나 이상의 표적 균주에 대해 매우 활성이었다는 것을 나타낸다.
하기 표 19는 다양한 활성 펩티드의 6개 암세포 종류에 대항하는 광범한 활 성을 나타낸다.
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실시예 5
6개 암세포 표적에 대항하는 FLAK 펩티드의 활성 및 특이성
상이한 농도의 상이한 펩티드의 존재하에서 사람 백혈구 세포의 생체외 생육력을 Alamar Blue 프로토콜에 의해 측정했다. Alamar Blue(Promega, 위스콘신 매디슨)는 세포의 증식 및 세포독성을 정량적으로 측정하기 위해 제조된 지시제 염료이다. 이 염료는 세포 대사 활성에 반응하여 색채계 변화 및 형광 신호를 제공하는 산화-환원(리독스) 지시제로 구성된다.
분석 프로토콜:
50세 남자의 혈액을 뽑아서 실온에서 1500rpm에서 15분간 원심분리했다. 혈장-적혈구 계면에 있는 연층(buffy coat) 세포를 흡인했다. 다음에, 연층 세포(주로 림프구 세포)를 5ml의 RPMI-1640 배지+10% 태아소혈청(Gibco, 뉴욕 그랜드아일 랜드)를 함유하는 15ml 원심분리 튜브로 옮겼다. 추가 배지를 튜브에 첨가하여 부피를 10ml로 만들었다. 다음에, 연층 현탁액을 5ml의 Histopaque(Sigma Chemical Co., 미주리 세인트루이스) 위에 주의 깊게 층으로 만들고, 실온에서 1500rpm에서 30분간 원심분리했다. 대부분 PBMC(말초단핵세포)인 계면을 흡인하여 15ml 원뿔형 원심분리 튜브로 옮긴 후, 냉 RPMI-1640 2ml 중에 재현탁하고 냉 RPMI-1640 배지로 15ml로 만들었다. 세포를 1500rpm에서 10분간 원심분리했다. 다음에, 상청액을 흡인하여 버렸다. 세포 펠릿을 1ml의 냉 RPMI-1640 중에 재현탁하고 RPMI 배지로 15ml로 만들었다. 이 단계를 2번 반복했는데, 단 마지막 단계에서 세포를 1ml의 냉 RPMI-1640 배지로 재현탁하고, Sigma 세포 배양 카탈로그에 따라 혈구계수기를 사용하여 세포 계수를 행했다.
포크우드 미토겐을 양성 및 음성 대조표준과 함께 대조표준으로서 사용했다. 음성 대조표준 세포는 70% 메탄올로 죽였다. 양성(+) 대조표준 세포는 RPMI 배지(미처리) 중에서 인큐베이션했다. Alamar Blue 20ml를 세포에 첨가하고, 형광계(들뜸 544/전달 590nm)를 사용하여 24시간, 48시간, 72시간, 및 96시간 후 판독했다.
다음 식을 사용하여 계산했다. 펩티드 처리된 샘플 및 양성 대조표준은 음성 대조표준에 대해 조정했다.
Figure 112003035312056-pct00042
바로 위에 설명된 프로토콜을 사용하여, 약 10-150개의 펩티드를 미처리 양성 대조표준 세포의 성장과 비교하여 사람 백혈구("WBC") 세포의 성장에 대한 그것 들의 자극성 및/또는 억제성 작용에 대해 스크린했다. 하기 표 20의 데이타는 다양한 선택된 FLAK 펩티드가 저농도(0.1 내지 1.0㎍/ml)에서 자극성이며, 어떤 펩티드는 고농도에서 억제성(세포사를 일으킴)으로 된다는 것을 나타낸다. 몇몇 펩티드(즉, SEQ ID NO:5, 143, 및 160)는 500㎍/ml까지 모든 농도에서 자극성이었다.
프로토콜에 사용된 Alamar Blue 염료는 세포 및 핵막을 모두 투과하며, 미토콘드리아에서 대사되어 색 변화를 일으킨다. 따라서, 결과의 형광계 반응은 세포 자극 및/또는 유사분열(세포 증식)에 의해 야기된 총 미토콘드리아 활성의 결과이다. 인큐베이션 시간의 증가(120시간 대 48시간)에 따른 값의 증가(처리된 세포에 대해, 미처리 세포 값에 대한 퍼센트로서)는 펩티드에 의해 야기된 세포 대사 활성의 자극에 더하여 증가된 세포 증식 때문이다.
표 20은 선택된 FLAK 펩티드의 존재하에서 사람 백혈구("WBC")에 대한, 미처리 양성 대조표준에 대한 퍼센트로서 펩티드 처리된 세포의 자극/증식을 나타낸다. 또한, 이 표는 사람 적혈구(RBC) 및 사람 섬유아세포(WI38)에 대한 이들 펩티드 각각의 독성(LD50 값)을 나타낸다. 또한, 낮은 펩티드 농도(즉, 10㎍/ml 미만)에서 WBC에 대해 자극성이며 더 높은 농도에서는 WBC에 대해 억제성 또는 독성인 어떤 펩티드들은, 심지어 500㎍/ml 정도의 고동도에서 WBC 성장에 대해 자극성이며 억제성이지 않은 펩티드들보다, RBC 및 섬유아세포에 상대적으로 더 독성이다.
상기 설명된 Alamar Blue 프로토콜 이외의 다른 것을 사용한 제한된 실험에서, 백혈구의 자극 및 증식을 일으키는 펩티드들은 포유류 림프 시스템의 대식세포 및 림프구 세포 성분에 대해서도 활성임이 정성적으로 측정되었다. 이와 같이, 치 료적 용량 수준에서 포유류 세포에 대해 상대적으로 비-독성인 어떤 자극성 FLAK 펩티드들을 손상된 면역 시스템을 갖는 사람 또는 다른 포유류를 치료하기 위한 면역조정제로서 사용될 수 있다. 그러한 치료는 생체내로 전신적으로 또는 전혈 또는 혈액 성분의 체외 치료 후 제공자에게 재주입함에 의해 투여될 수 있다. 이러한 요법은 노화, 질환, 또는 화학요법으로 인한 면역저하 환자에서 면역결핍을 상쇄시키고, 자연적 면역반응을 자극하여 병원성 감염 및 어떤 암 셀라인의 성장을 예방하거나 또는 그와 싸우거나, 또는 림프 시스템에 연루된 상처 치유 과정을 증진시키기 위해서 사용된다. 표 21은 그것들이 백혈구의 자극, 증식, 및 억제를 초래함에 따른 농도와 시간의 관계를 나타내는 현상의 더 상세한 예(1개 펩티드, SEQ ID NO:10을 사용)이다.
Figure 112003035312056-pct00043
Figure 112003035312056-pct00044
Figure 112003035312056-pct00045
실시예 6
섬유아세포의 자극 및 증식
cyQUANT 세포 증식 분석은 배양물에서의 세포 밀도를 측정하는 편리하고 빠르며 민감한 과정을 제공한다. 이 분석은 단일 염료 농도를 사용하여 200㎕ 부피에서 50 이하에서 적어도 50,000 세포까지의 선형 검출 범위를 가진다. 이 분석은 세포 증식 연구 뿐만 아니라 루틴 세포 계수에 이상적이며, 표면에 대한 세포 부착을 모니터하는데 사용될 수 있다.
과정:
상이한 셀라인을 ATCC에 따라서 상이한 배지를 사용하여 유지했다. 세포를 트립신(0.25%, Fisher, 팬실베니아 피츠버그) 8ml로 트립신화했다. 세포 현탁액을 100rpm에서 10분간 원심분리했다. 펠릿이 흐트러지지 않게 상청액을 꺼내서 버렸다. 농축 세포 현탁액을 배지 1.0ml 중에서 제조하여 약 105 내지 106세포/ml의 밀도를 얻었다. Trypan Blue법으로 혈구계수기를 사용하여 세포를 계수하여 실제 세포 밀도를 측정했다. 세포수를 조정하여 200㎕ 부피 당 동일한 세포수를 얻었다. 세포를 0% FBS, 2% FBS, 3% FBS 및 5% FBS를 사용하여 평판했다. 플레이트를 37℃에서 세포의 부착을 허용하는 충분한 시간 동안 인큐베이션했다. 장기간의 증식 연구에서, 각 웰로부터 배지 100㎕씩을 매일 제거하고 신선한 배지로 교체했다.
원하는 시간에서 96-웰 플레이트에서 부착 세포로부터 배지를 제거했다. 이들 세포는 시험 제제로 이미 처리된 것이다. 세포를 플레이트에서 -70℃에서 30분간 냉동했다. 세포를 실온에서 해동했다. 각 샘플 세포에 CyQuant GR 건조/세포 용균 완충액(200㎕)을 첨가했다. 세포를 빛으로부터 보호하면서 실온에서 15분간 인큐베이션했다.
상기 CyQuant 프로토콜을 사용하여 섬유아세포의 가능한 펩티드 자극 및/또는 증식을 시험했다. 다음의 표 22는 사람 섬유아세포(WI38)에 대한 선택된 펩티드의 효과를 증명하는 데이타를 나타낸다. 표에서, 선택된 펩티드의 실질적인 자극성 및/또는 증식성 특성이 농도의 함수로서 증명된다. 표 23은 어떤 펩티드에 대해 섬유아세포 자극 및/또는 증식 효과가 다른 성장 인자의 존재하에서 증진된 것을 나타낸다. 이것은 배지에 태아소혈청(FBS)을 첨가함에 의해 알게된 것이다. 표 22 및 23에 나타낸 수치는 대조표준(미처리 세포)에 대한 퍼센트로서 표현된 세포 자극/증식 활성이다. 대조표준 세포 및 펩티드 처리된 세포는 지시된 대로 배지 및 FBS를 사용한다. 100%(대조표준) 이하의 값은, 특히 10㎍/ml 이상의 농도에서 펩티드의 억제성 작용을 나타낸다.
Figure 112003035312056-pct00046
Figure 112003035312056-pct00047
Figure 112003035312056-pct00048
실시예 7
독성 분석 - 적혈구(RBC) 용혈, 및 백혈구(WBC) 및 섬유아세포(WI38) 억제
하기 표 24는 전형적인 FLAK 펩티드에 대한 RBC, WBC, 및 WI38 독성 데이타를 요약하고 있다. 이 세 가지 RBC, WBC, 및 WI38 값(LD50)은 일반적으로 펩티드 독성의 일치된 직접 지시제이다. 주어진 징후의 가능한 치료를 위한 펩티드를 선택하는데 있어, 펩티드의 치료적 활성 및 특이성과 그것의 가능한 독성 특성을 매치시키는 것이 중요하다. SEQ ID NO:5 펩티드는 FLAK 펩티드가 아니며, 오히려 그것은 Cecropin B의 가까운 유사체인 SB-37이다. 그것은 항박테리아제로서 FLAK 펩티드 만큼 활성은 아니지만, 상처 치유 특성을 지닌다는 것이 이미 알려졌으며, 이는 래트 모델에서 생체내적으로 증명되었다. 이것은 아마도 포유류 백혈구 및 섬유아세포에 대한 그것의 자극성 및 증식성 효과에 기인하는 것 같다.
WBC 및 WI38 자극에 대한 프로토콜은 상기 논의되었다. RBC 프로토콜이 표 24에 이어진다.
Figure 112003035312056-pct00049
RBC 프로토콜을 다음과 같다. 각 희석물 및 미처리 대조표준의 웰 위치를 96-웰 플레이트의 뚜껑에 기록한다. 세포가 컨플루언트되었을 때, 배지를 제거하고 200㎕의 최종 부피로 새로 제조된 샘플 희석물로 교체한다. 시험 제제를 디자인된 96-웰 플레이트의 웰들에 첨가했다. 신선한 배지 200㎕를 양성 대조표준 웰에, 70% 에탄올 200㎕를 음성 대조표준 웰에 첨가했다. 플레이트를 37℃, 5% CO2 및 최소 90% 습도 중에서 하룻밤 인큐베이션했다. 실온 Alamar Blue 용액(20㎕)을 모든 웰에 첨가했다. 플레이트를 형광분광계로 읽었다(들뜸 544nm, 방출 590nm). 플레이트를 37℃, 5% CO2 및 최소 90% 습도 중에서 3시간 동안 인큐베이션했다. 플레이트를 3시간 및 24시간 인큐베이션에서 다시 읽었다. 50% 지점에서 x-축을 따른 농도에 대해 용량 반응 곡선을 둘로 나눈 판독 그래프로부터 LD50 종말점을 측정했다. 단일 시험 제제 부류 내에서 시험 제제들의 LD50 값은 그것들의 상대적 독성의 순위를 매기거나, 또는 생체내 데이타와 상호관련시키는데 사용될 수 있다.
이 용혈 분석은 Journal of Peptide Research 53:8290 (1999)에 제시된 것을 기초로 한다. 모든 배질, 스톡 용액 및 희석물은 무균 작업대에서 제조하여 오염을 최소화 또는 방지했다. 사람 체액의 취급 및 폐기에 부속된 모든 과정은 안전한 프로토콜에 따라서 수행했다.
적혈구(RBC)를 PBS(35mM 인산 완충액 0.15M NaCl, pH 7.0)로 3번 세척했다. RBC를 PBS(0.4%(v/v); 15개 펩티드 당 약 10ml) 중에 현탁했다. 현탁액(100㎕)을 각 샘플 및 대조표준 튜브에 나눠었다. 연속 희석된 펩티드 용액(100㎕)을 피펫으로 샘플 튜브에 넣었다. 음성 대조표준 튜브는 100㎕ PBS를, 양성 대조표준 튜브는 100㎕의 1% Triton-X100 세제를 함유했다. 모든 튜브를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션했다. 인큐베이터에서 튜브를 꺼내어 5분간 1000g에서 원심분리했다. 상청액(100㎕)을 피펫으로 96-웰 염화폴리비닐 플레이트에 넣었다. 414nm에서 흡광도(A414)를 측정했고, 다음 식에 따라서 용혈 퍼센트를 계산했다.
Figure 112003035312056-pct00050
용혈 퍼센트를 펩티드 농도, 및 50% 용혈이 측정된 농도(LD50)에 대해 플롯팅한다. 다음의 표 25는 본원에서 논의된 펩티드를 사용한 용혈 분석 결과를 상세히 나타낸다.
Figure 112003035312056-pct00051
Figure 112003035312056-pct00052
Figure 112003035312056-pct00053
Figure 112003035312056-pct00054
Figure 112003035312056-pct00055
실시예 8
발린 치환 효과
펩티드 서열 변화(여기서는, 첫번째 아미노산이 발린이다), 특히 첫번째 아미노산을 페닐알라닌에서 발린으로 변화시키는 경우 바람직한 특성을 가져올 수 있다. 적혈구 및 섬유아세포(WI38) 독성은 감소되는 반면 다른 바람직한 특성의 감소는 현저하지 않을 수 있다. 하기 표 26은 펩티드의 표시된 독성을 감소시키는 많은 예들(14)을 나타내는데, 이는 펩티드로 처리되었을 때 적혈구 및 섬유아세포의 생육력의 증가에서 보이는 대로이다. LD50 값은 ㎍/ml이다.
Figure 112003035312056-pct00056
Figure 112003035312056-pct00057
발린 치환에 의한 포유류 세포에 대한 독성 감소 효과는 미생물 병원균 및 암세포에 대항하는 치료적 활성의 크지 않은 감소를 동반하지만, 어떤 경우에는 발린 치환이 치료적 활성의 바람직한 증가를 가져오기도 한다. 이것은 다음의 표 27에서 볼 수 있는데, 여기서는 어떤 경우 발린 치환이 Pseudomonas 그램 음성 박테리아에 대항하는 펩티드의 활성을 증가시킨 것을 나타낸다.
LD50 값으로 용혈 및 WI38 값을 표시한다. Pseudomonas aeruginosa ATCC 승인번호 9027에 대항하는 MIC 값(㎍/ml)으로 P. aerug 값을 표시한다.
Figure 112003035312056-pct00058
실시예 9
티로신 치환 효과
펩티드 서열 변화(여기서는, 두번째 아미노산이 티로신이다)는 바람직한 특성을 가져올 수 있다. FLAK98(P-146, SEQ ID NO:108)은 두번째 위치에 있는 티로신(Y)의 존재로 인해 비정형 FLAK 펩티드이다. 이런 변형 및 이 펩티드의 전체 서열의 중요성은 생성된 구조가 중성 pH에서 알파-나선으로 쉽게 접힐 것 같다는 데 있다(Montserret 등, Biochemistry 39:8362-8373, 2000). 중성 pH에서 알파-나선형 구조를 취하는 능력은 이 펩티드에서 보이는 효능 및 광범한 활성을 설명한다. 이들과 같은 서열은 소수성에 의해서 뿐만 아나라 정전기력에 의해서 접히게 된다는 것을 Montserret 등은 증명했다. FLAK 펩티드에서 아미노산의 티로신 치환은 일반적으로 개선된 특성을 가져올 수 있다.
실시예 10
현재 바람직한 펩티드
바람직한 펩티드를 상기 설명된 실험 데이타로부터 선택할 수 있다. 그램 양성 또는 그램 음성 박테리아에 대한 바람직한 항균 펩티드는 약 10㎍/ml 이하의 MIC 값을 가지거나, 또는 약 25㎍/ml 이하의 MBC 값을 갖는 것을 선택할 수 있다. 바람직한 항진균 펩티드는 약 25㎍/ml 이하의 MIC 또는 MBC 값을 갖는 것을 선택할 수 있다. 바람직한 항암 펩티드는 약 25㎍/ml 이하의 LD50 값을 갖는 것을 선택할 수 있다.
다음의 표 28은 대표적인 현재 바람직한 펩티드를 기재하며, 여기에서 "X"는 펩티드가 그 칼럼의 특성에 대해 바람직한 펩티드임을 나타낸다. 펩티드의 "길이"는 서열의 아미노산 잔기 수이다.
Figure 112003035312056-pct00059
Figure 112003035312056-pct00060
또한, 자극 및 증식에 바람직한 펩티드를 선택할 수 있다. 다음의 표 29는 대표적인 바람직한 펩티드를 기재하며, 여기에서 'X'는 펩티드가 그 칼럼의 특성에 대해 바람직한 펩티드임을 나타낸다. 0.1㎍/ml 내지 1.0㎍/ml 농도에서 백혈구에 대해 자극성인 펩티드가 바람직한데, 그것은 이 농도에서는 펩티드가 적혈구, WI38 섬유아세포, 또는 사람 백혈구에 대해 독성이 아니기 때문이다. 0.1㎍/ml 내지 1.0㎍/ml 농도에서 섬유아세포에 대해 자극성인 펩티드가 바람직한데, 그것은 이 농도에서는 펩티드가 독성이 아니기 때문이다.
표 29에 펩티드 P146(SEQ 108)(길이=13) 및 P97(SEQ 165)(길이=13)을 부가한다. 이들 펩티드는 모두 백혈구 및 섬유아세포 칼럼에서 X를 가져야 한다.
Figure 112003035312056-pct00061
Figure 112003035312056-pct00062
실시예 11
리소짐과의 상승작용 효과
용균 펩티드와 리소짐 간 상승작용을 분석했다. 멸균 밀크를 박테리아와 함께 ml 당 5x105까지 인큐베이션했다. 펩티드 Shiva-10(SEQ ID NO:4)를 10㎍/ml까지 첨가하고 닭의 리소짐을 1mg/ml까지 첨가했다. 박테리아 살생 퍼센트를 측정했다.
Figure 112003035312056-pct00063
Pseudomonas syringae pv. tabaci(PSPT), Pseudomonas solanacearum(PS), Erwinia caratovora subsp. carotova(EC), 및 Xanthomonas campestris pv. campestris(XC)에 대항하는 Cecropin SB-37(SEQ ID NO:5)와 리소짐 간의 상승작용을 측정했다. LD50(μM) 값을 측정했다.
Figure 112003035312056-pct00064
Shiva-1과 리소짐 간 상승작용을 측정했다. Pseudomonas aeruginosa의 생육력 퍼센트를 블랭크 대조표준에 상대적으로 측정했다. 리소짐은 펩티드와 동일한 몰농도로 사용했다.
Figure 112003035312056-pct00065
Shiva-1과 리소짐 간 상승작용을 측정했다.
그램 양성 S. intermedius 19930, S. intermedius 20034, 및 S. aureus의 생육력 퍼센트를 블랭크 대조표준에 상대적으로 측정했다. 리소짐은 펩티드의 몰농도의 10배로 사용했다.
Figure 112003035312056-pct00066
Figure 112003035312056-pct00067
Figure 112003035312056-pct00068
또한, 상승작용 실험은 펩티드를 부가적 또는 상승적으로 증강시키는 EDTA의 존재하에서 펩티드를 사용하여 수행할 수 있다.
실시예 12
항생물질과의 상승작용 효과
Escherichia coli 25922에 대항하는 펩티드 Shiva-10(SEQ ID NO:4)과 다양한 항균제 간의 상승작용을 조사했다. 다음의 표는 펩티드와 이 제제들을 조합했을 때의 이로운 효과를 예시하며, 여기서 수치는 최소살균농도(MBC; ㎍/ml)이다.
Figure 112003035312056-pct00069
Staph. aureus 29213에 대항하는 펩티드 Shiva-10(SEQ ID NO:4)과 다양한 항균제 간의 상승작용을 조사했다. 다음의 표는 펩티드와 이 제제를 조합했을 때의 이로운 효과를 예시하며, 여기서 수치는 최소살균농도(MBC; ㎍/ml)이다.
Figure 112003035312056-pct00070
Staph. aureus 29213 MBC에 대항하는 펩티드 FLAK 26AM(P35; SEQ ID NO:17)과 다양한 항균제 간의 상승작용을 조사했다. 다음의 표는 펩티드와 이 제제를 조합했을 때의 이로운 효과를 예시하며, 여기서 수치는 최소살균농도(MBC; ㎍/ml)이다. 이 실험에서는 항균제 부재하에서, 또는 표시된 농도의 항균제 존재하에서 펩티드 MBC를 측정했다.
Figure 112003035312056-pct00071
P. aeruginosa 27853에 대항하는 독사시클린과 다양한 펩티드 간의 상승작용을 조사했다. 다음의 표는 독사시클린과 펩티드들을 조합했을 때의 이로운 효과를 예시하며, 여기서 수치는 최소살균농도(MBC; ㎍/ml)이다. 펩티드와 조합할 때 독사시클린의 농도는 10ppm으로 고정했다.
Figure 112003035312056-pct00072
Escherichia coli 25922 MBC에 대항하는 테트라시클린과 다양한 펩티드 간의 상승작용을 조사했다. 다음의 표는 테트라시클린과 펩티드들을 조합했을 때의 이로운 효과를 예시하며, 여기에서 수치는 최소살균농도(MBC; ㎍/ml)이다. 펩티드와 조합할 때 테트라시클린의 농도는 1.5ppm으로 고정했다.
Figure 112003035312056-pct00073
실시예 13
화학요법제와의 상승작용 효과
다른 연구자들은 암세포에 억제성인 용균 펩티드가 종래의 암 화학요법 약물과 상승적으로 작용한다는 것을 보고했다. FLAK 펩티드는 예외가 없다. 하기 표 41은, 예를 들어 선택된 FLAK 펩티드가 MCF7계의 유방암세포를 억제하는데 있어 타목시펜(Tamoxifen)과 상승작용한다는 것을 증명한다. 표 42는 타목시펜 또는 다른 암요법 약물과의 상승작용 용도를 위한 다른 더 활성인 항암 펩티드 후보제를 기재한다.
또한, 표 41 및 42는 RBC, WBC, 및 WI38 세포에 대항하는 선택된 펩티드들의 독성을 나타낸다. 매우 낮은 비-독성 수준으로 사용했을 때, 선택된 항암 펩티드들은 다른 화학요법제를 상승적으로 증강시켜 실질적으로 더 낮은 용량 수준에서 결과적으로 더 적은 부작용을 갖는 그것들의 효과적인 사용을 허락할 수 있다.
Figure 112003035312056-pct00074
Figure 112003035312056-pct00075
실시예 14
성장 인자와의 상승작용 효과
어떤 FLAK 펩티드는 그 펩티드의 자극성 및/또는 증식성 특성에 있어 다른 미토겐 또는 성장 인자와 상승작용한다는 것이 상기 실시예 17 및 표 23에서 보여졌다.
실시예 15
날리딕스산 및 클로람페니콜과의 상승작용 효과
Pseudomonas aeruginosa의 유출 돌연변이에 대항하여 본 발명의 펩티드와 클로람페니콜 또는 날리딕스산의 상승작용 효과를 조사했다. 베이스라인으로서 MIC 값을 날리딕스산 또는 클로람페니콜 만에 대해 측정했다. 펩티드를 1/4 MIC 농도로 첨가했고, MIC에 도달하기 위한 날리딕스산 또는 클로람페니콜의 농도를 측정했다. 표 43은 P. aeruginosa H374에 대항하는 날리딕스산과 펩티드의 상승작용 효과를 나타내며, 표 44는 P. aeruginosa H774에 대항하는 날리딕스산과 펩티드의 상승작용 효과를 나타내고, 표 45는 P. aeruginosa H374에 대항하는 클로람페니콜과 펩티드의 상승작용 효과를 나타낸다. 단편적 억제농도(FIC) 지수를 사용하여 펩티드와 항생물질 간의 상승작용을 측정했다. 항생물질의 2배 연속 희석물을 1/4 펩티드 MIC와 동일한 일정량의 펩티드 존재하에 시험했다. FIC 지수는 다음과 같이 측정했다:
FIC = 0.25 + MIC 조합된 항생물질 / MIC 항생물질 단독
0.5 미만의 FIC 지수가 상승작용으로 고려된다.
Figure 112003035312056-pct00076
Figure 112003035312056-pct00077
Figure 112003035312056-pct00078
Figure 112003035312056-pct00079
Figure 112003035312056-pct00080
Figure 112003035312056-pct00081
실시예 16
약물 내성 균주에 대항하는 활성
토브라마이신 민감성 및 내성 균주에 대항하는 활성에 대해 펩티드를 분석했다. 다음의 표 46에 나타낸 대로, 펩티드 P56(SEQ ID NO:36), P74(SEQ ID NO:50), 및 P125(SEQ ID NO:87)는 토브라마이신 민감성(ts) Pseudomonas ATCC 27853에 대해 서 보다 토브라마이신 내성(tr) Pseudomonas ATCC 13096에 대항하여 더 큰 활성을 나타냈다. 동일한 3개 펩티드는 임상 토브라마이신 내성 균주 960890198-3c에 대항하여 더 큰 활성을 나타냈다(표 46).
Figure 112003035312056-pct00082
Figure 112003035312056-pct00083
실시예 17
상처 치유
본 발명의 펩티드는 상처 치유 용도에서 국부 또는 전신 송달을 위한 조성물에 사용할 수 있다. 조성물은 액체, 크림, 페이스트, 또는 다른 약학적으로 허용되는 제제일 수 있다. 조성물은 다른 생물학적 활성제를 함유할 수 있다. 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다.
FLAK 펩티드는 상처 감염에 가장 많이 관련된 박테리아, S. aureus, S. pyogenes 및 P. aeruginosa에 대항하여 높은 효능을 나타냈다(예를 들어, 표 5, 6, 및 7). 또한, 펩티드는 상처의 치유를 도와서 아마도 염증을 감소시키는 능력을 나타냈다. 이들 펩티드는 모두 상처 및 상처감염 치료 제품의 필수적 속성이다.
현재 상처 치유에 바람직한 펩티드들은, 하기 표 48에 나타낸, 백혈구 또는 섬유아세포 중 어느 하나 또는 양쪽에 대해, 그리고 항균 특성에 대해 바람직했던 펩티드이다.
Figure 112003035312056-pct00084
실시예 18
생체내에서 증명된 FLAK 펩티드를 사용한 상처 치유
U.S. 특허 No. 5,861,478는 래트 모델에서 생체내 상처 치유를 개시했으며, 여기에서 치유제는 펩티드 LSB-37이었다. LSB-37은 본원에서 SEQ. NO. 150(펩티드 P306)과 동일하며, 본 발명의 대상인 더 작은 FLAK 펩티드와 비교하는 식으로 평가한다. 실시예 17에 제시된 대로, 광범한 생체외 분석에 기초하여, FLAK 펩티드는 상처 치유제로서의 전망을 제공한다. 이것은 이 목적을 위해 개발된 작은 동물의 국부 상처 치유 모델에서, 선택된 FLAK(및 다른) 펩티드의 생체내 시험에서 증명되 었다.
연구의 목적은 (i) 상처 폐쇄 속도, (ii) 염증 반응, 및 (iii) 화학적으로 유발된 피부 화상 상처에서 표피 비후화에 대한 어떤 선택된 펩티드의 효과를 평가하는 것이었다. 털 없는 래트를 적합한 시험 모델로서 선택했다. 100-150g 중량의 8-12 주령된 암컷 털 없는 래트를 연구에 사용했다.
문헌에서 및 사적으로 보고된 페놀 기초 피부 박피술은 전신적 독성으로 이 연구에서 사용되며, 여기에서 > 2 평방인치의 총표면적을 갖는 6개의 개별 시험 패치(껍질)가 한 동물에서 유발되었다. 대안으로서, 70% 에탄올에 용해된 70% 트리클로로아세트산(TCA)를 사용하여 진피가 진무른 패치를 얻었다. 30분에 걸친 껍질 교합은 표피 및 진피가 완전히 진무른 3도 화상을 가져왔다. 화학적 화상제로서 TCA 처리는 페놀 모델에서 일어났던 것보다 훨씬 더 적은 외상 및 사망율을 래트에서 일으켰다.
실험 프로토콜 과정 단계는 다음과 같다:
1. 동물을 마취시켰다(40mg/kg 페노바르비톨).
2. 각 처리 전에 그리고 그후 매일 동물의 등(6개의 개별 껍질)을 칼라 사진으로 찍었다.
3. 래트 피부 표면을 70% 에탄올로 씻어서 준비했다. 원반형 여과지(1.1cm 직경)를 70% TCA/에탄올에서 소킹했다.
4. 여과지를 30분간 털 없는 래트의 등에 두었다[6개의 여과지 중 2개는 대조표준(펩티드 미처리) 여과지이고 4개는 펩티드 처리된 박피용 여과지이다].
5. 30분간 화상을 입힌 후 여과지를 제거했다. 24시간 후, 상이한 펩티드 용액(식염수 중 1500ppm)을 4개의 껍질에 도포하고, 식염수를 2개의 대조표준 껍질에 도포했다.
6. 그후 매일 펩티드 용액(및 대조표준용 식염수)을 부드러운 솔로 6개의 상처에 도포했다.
7. 상처를 대략 1개월 치유했고(안정된 표피를 갖는 완전한 피부 폐쇄), 그 후 동물을 죽였다.
8. 치료된 피부를 채취하여 3색으로 절편을 염색하고 슬라이드에 위에 올렸다.
각 껍질(6개 부위)에 대한 상처 폐쇄 퍼센트를 동물을 죽일 때까지 매일 측정했다. 폐쇄 퍼센트는 동물 사진에서 화상 후 초기 딱지 면적에 대하여 남아 있는 딱지 면적을 측정하여 결정했다. 이들 측정치는 Sigma Plot ProScan 4 프로그램을 사용하여 껍질을 디지탈화하여 분석함에 의해 만들었다.
충분한 상처 폐쇄 후, 각 껍질의 일부는 여전히 붉은 염증 면적을 가졌으며, 이것은 총 치유된 딱지에 대한 퍼센트로서 동물 사진의 Sigma Plot 분석에 의해 정량되었다. 이것은 각 껍질 부위에서 염증 반응의 TCA 화상 후 치료에 대한 측정을 제공했다.
또한, 각 부위에서 표피 비후화(각화과다증) 정도를 다양한 상처 면적 및 그 껍질 주변의 정상 미처리 피부(대조표준)의 염색 절편 슬라이드에 Sigma Plot 프로그램을 적용하여 측정함에 의해 결정했다. 100x 내지 320x로 확대한 칼라 슬라이 드의 현미경 사진은 각 껍질에서 명백한 각화과다증의 정도를 정량하는 강력한 도구를 제공했다.
선택적 염색된 절편 슬라이드의 처리는 상처 면적에 백혈구 및 섬유아세포가 존재한다는 확인가능한 증거를 제시했다. 또한, 이것은 Sigma Plot 프로그램에 의해 정량되었다. 이것은 백혈구 자극/증식 및 섬유아세포 자극/증식 및 생체내 상처 치유에서 펩티드의 화학주성 효과를 포함하여, 상이한 펩티드가 상처 치유 과정에 영향을 미치는 메카니즘을 생체내에서 측정하는데 있어서 유용한 도구임이 판명되었다.
상기 설명된 동물 모델 및 프로토콜을 상처 치유에 바람직한 FLAK 펩티드로서 표 48에 기재된 대략 20개의 펩티드(및 비교를 위한 다른 펩티드)를 시험하는데 사용했다. 예를 들어, 한 동물에서 평가된 4개 펩티드를 사용한 실험의 결과를 표 49에 나타낸다. 이들 펩티드는 SEQ ID NO:66(P102), SEQ ID NO:71(P107), SEQ ID NO:115(P153), 및 SEQ ID NO:119(P157)이다. 펩티드 SEQ ID NO:71(P107)은 FLAK 펩티드가 아니라 LSB-37(SEQ ID NO:150; P06)의 유도체이다. 초기 실험에서, 이들 2개 펩티드는 매우 유사한 생체내 상처 치유 특성을 갖는 것으로 나타났다. 비교 펩티드인 SEQ ID NO:119(P157)는 문헌에 보고된 비-FLAK 펩티드이다.
표 49는 상처 후 치료에 대해 평가된 몇몇 펩티드가 TCA 화상 후 염증 반응을 제한하는 능력을 나타냈다는 결론을 지지한다. SEQ ID NO:71 및 SEQ ID NO:115는 이런 점에서 더 우수했으며, 또한 각화과다증(표피 비후화)의 최저 증거를 나타냈다. 실험 26일째에 충분한 상처 폐쇄에 이르렀으므로, 이들 같은 2개 펩티드는 다른 펩티드에 비해 상처 폐쇄 속도에서 적은 이점을 나타냈으며, 상처 후 치료에서의 이점은 없었다.
또한, 이들 2개 펩티드는 TCA 화상 미처리 대조표준과 비교하여 실질적으로 각화과다증을 나타내지 않았다. 종합하여, 최상의 상처 치유 활성은 상기 인용된 2개 펩티드에 의해 나타났다. 그러나, 실험은 실생활의 동물 상처 상황에서는 보통 일어날 수 없는 멸균 조건하에서 수행되었다. 그러한 국부적 상처는 감염되기 쉽기 때문에, SEQ ID NO:66(P102) 및 SEQ ID NO:115(P153)의 더 우수한 항균 특성이 그것들을 상처 치유용의 논리적인 후보로 만든다는 것을 고려하여야 한다.
Figure 112003035312056-pct00085
실시예 19
낭성섬유증(CF)의 치료
CF는 북미에서 가장 흔한 상염색체 열성 유전병으로, 미국에서 연간 30,000명의 아동의 폐에서 염증 및 감염을 일으킨다. P. aeruginosa에 의해 CF 폐감염의 90% 이상이 일어나며, 이들 환자 중 95% 이상이 폐손상으로 죽게 된다. 어떤 FLAK 펩티드는 다중-약물 내성 균주 Pseudomonas aeruginosa 및 CF 환자로부터의 임상 분리물에 대항하여 활성이다(표 9, 43 및 44). 이것들은 이 상태를 위해 현재 선택되는 약물인 TOBI 내성 균주를 포함한다. 게다가, 이들과 같은 펩티드(알파-나선형 펩티드)는 항염 특성을 갖는 것으로 이미 알려졌으며(Scott 등, J. Immunol. 165: 3358-3365,2000), 따라서 FLAK 펩티드가 이런 특성을 또한 나타내는 경우도 놀라운 일은 아니다. 항염 및 항감염 역할의 조합은 이들 펩티드를 CF 폐를 위한 신규 치료제로서 아주 우수한 후보로 만든다.
실시예 20
성감염 질환(STD)의 치료
성감염 질환(STD)은 북미에서 상당한 문제로 치료 비용으로 연간 100억불이 든다. 중요한 문제 중 하나는 항진균, 주로 플루코나졸 내성 균주인 C. albicans, C. glabrata 및 C. tropicalis와 같은 종을 포함하는 Candida에 의한 발생률이 증가한다는 것이다. 어떤 FLAK 펩티드는 이들 3가지 종들 모두에 대항하여 현저한 활성을 나타내며(표 13 및 10), 광범한 진균 질환을 방지할 수 있는 국부적 항진균제의 개발을 위한 매우 실행가능한 기회를 제시한다. FLAK 펩티드가 또한 바이러스 및 박테리아를 포함한 다른 STD 작용물질에 대항하는 활성을 가질 수 있다는 것을 암시하는 증거가 문헌에 있으며, 이것은 또한 광범한 응용이 가능할 수 있음을 시사한다.
실시예 21
여드름의 치료
여드름은 감염과 염증의 조합에 의해 일어나며 조직 손상 및 흉터를 가져온다. FLAK 펩티드는 여드름 종기로부터 분리된 주요 박테리아, Propionibacterium acne에 대항하여 활성을 나타내며, 또한 항염 활성을 나타낼 것 같다(Scott 등, J. Immunol. 165: 3358-3365,2000). 게다가, FLAK 펩티드는 또한 상처 치유의 속도 및 효능을 증가시키고, 섬유아세포의 증식을 증가시키고, 콜라겐 및 라미닌 생성을 증가시키는 성향을 나타낸다. 이들 속성은 모두 임상 치료제 또는 기능성 화장품으로서 여드름의 치료에 FLAK 펩티드를 사용하는 것에 대한 설득력 있는 증거를 제공한다.
실시예 22
화장품 용도
콜라겐 자극, 섬유아세포 자극 및 상처 치유와 같은 FLAK 펩티드의 속성은 노화 방지 및 레쥬비네이션 제품과 같은 화장품에 그러한 펩티드를 사용하는데 대한 잠재성을 매우 매력적으로 만든다.
실시예 23
식품 산업에서 FLAK 펩티드의 사용
Salmonella typhimurium 및 Escherichia coli와 같은 그램-음성 박테리아가 식품 산업에 관련된 질환의 주요 원인이다. 다수의 FLAK 펩티드는 이들 유기체에 대항하는 특이적 활성을 나타냈다(표 7 및 12). 따라서, 식중독의 치료 및 또한 예방에 그러한 펩티드의 사용은 매력적인 용도이다. 예를 들어, 조리 표면의 오염 제거를 위한 그러한 펩티드의 사용은 특이적이며 잠재적인 신규 용도이다.
실시예 24
혈청에서 펩티드의 전신적 용도
일련의 펩티드를 1280ug/ml로 양의 혈청에 도입하고 37℃에서 30분간 또는 2시간 동안 인큐베이션했다(표 50). 이어서, Pseudomonas aeruginosa에 대항하는 혈청 MIC를 수행하여 펩티드의 혈청 불활성도를 측정했다. 시험된 펩티드들 중 2개(P153 및 P508)는 1280ug/ml에서 70% 혈청 중에 가용성이었고, 그것들의 활성은 혈청에의 노출에 의해 단지 약간 감소되었다. 이것은 P153 및 P508이 혈청에서 기능할 수 있으며, 전신적 용도를 위한 우수한 후보라는 것을 암시한다.
Figure 112003035312056-pct00086
실시예 25
FLAK 펩티드에 의한 콜라겐 및 라미닌 자극
섬유아세포계를 표준 조건하에서 배양하고, Panvera(위스콘신 매디슨)에 의해 제조된 ELISA 시스템을 사용하여 콜라겐 및 라미닌에 대해 분석했다. 콜라겐 및 라미닌에 대한 항생물질은 Takara Shuzo Co., Ltd(일본)에 의해 제조된 것이다. 하기 표 51은 4개 펩티드들 중 하나가 콜라겐 및 라미닌 생성의 현저한 자극을 나타냈다는 것을 나타낸다. 시험된 나머지 3개 펩티드는 생성을 자극하지도 억제하지도 않았다(즉, 어떤 효과도 관찰되지 않았다).
Figure 112003035312056-pct00087
본원에 개시 및 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 명세서에 비추어 과도한 실험 없이 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구체예에 관하여 설명되었지만, 본원에 설명된 조성물 및/또는 방법, 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에, 본 발명의 개념, 정신 및 범위를 벗어나지 않는 변형이 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 분명할 것이다. 더 구체적으로는, 화학적 및 생리학적으로 관련된 어떤 제제는 동일한 또는 유사한 결과가 달성되는 본원에 설명된 제제로 치환될 수 있다는 것이 분명할 거싱다. 당업자에게 분명한 모든 그러한 유사한 치환물 및 변형은 본 발명의 정신, 범위 및 개념 내에 속한 것으로 간주한다.
<110> Helix Biomedix, Inc. <120> SHORT BIOACTIVE PEPTIDES AND METHODS FOR THEIR USE <150> US 09/820,053 <151> 2001-03-28 <150> US 60/279,505 <151> 2001-03-28 <160> 165 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <400> 1 Phe Ala Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Lys Ala Leu Lys Lys Leu Lys 1 5 10 15 Lys Ala Leu Lys Lys Ala Leu 20 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (23) <223> AMIDATION <400> 2 Phe Ala Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Lys Ala Leu Lys Lys Leu Lys 1 5 10 15 Lys Ala Leu Lys Lys Ala Leu 20 <210> 3 <211> 38 <212> PRT <213> SYNTHETIC <400> 3 Met Pro Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn 1 5 10 15 Ile Arg Asn Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Leu Gly 20 25 30 Glu Ala Lys Ala Leu Gly 35 <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (23) <223> AMIDATION <400> 4 Phe Ala Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ala Lys Leu Ala Leu Ala Leu 20 <210> 5 <211> 38 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (38) <223> AMIDATION <400> 5 Met Pro Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn 1 5 10 15 Ile Arg Asn Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Leu Gly 20 25 30 Glu Ala Lys Ala Leu Gly 35 <210> 6 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <400> 6 Phe Ala Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ala Lys Leu Ala Leu Ala Leu 20 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (23) <223> AMIDATION <400> 7 Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe 1 5 10 15 Val Gly Gly Ile Met Asn Ser 20 <210> 8 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (23) <223> AMIDATION <400> 8 Phe Ala Leu Ala Ala Lys Ala Leu Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu Lys 1 5 10 15 Lys Leu Ala Lys Lys Ala Leu 20 <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (23) <223> AMIDATION <400> 9 Phe Ala Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Lys 1 5 10 15 Lys Leu Ala Lys 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Leu Lys Ala Leu 20 25 30 <210> 64 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <400> 64 Phe Ala Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ile Gly Ala Val Leu Lys Val 20 <210> 65 <211> 13 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> AMIDATION <400> 65 Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Ala Leu Lys Leu Lys Leu 1 5 10 <210> 66 <211> 13 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> AMIDATION <400> 66 Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Ala Leu Lys Lys Ala Leu 1 5 10 <210> 67 <211> 12 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (12) <223> AMIDATION <400> 67 Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Ala Leu Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 68 <211> 20 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (20) <223> AMIDATION <400> 68 Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ala Leu Lys Lys Leu Lys Lys Ala Leu 1 5 10 15 Lys Lys Ala Leu 20 <210> 69 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (23) <223> AMIDATION <400> 69 Lys Ile Ala Lys Val Ala Leu Ala Lys Leu Gly Ile Gly 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Ser 20 <210> 147 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (23) <223> AMIDATION <400> 147 Phe Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe 1 5 10 15 Ala Lys Phe Ala Phe Ala Phe 20 <210> 148 <211> 10 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> AMIDATION <400> 148 Lys Lys Val Val Phe Lys Val Lys Phe Lys 1 5 10 <210> 149 <211> 10 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> AMIDATION <400> 149 Phe Lys Val Lys Phe Lys Val Lys Val Lys 1 5 10 <210> 150 <211> 38 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (38) <223> AMIDATION <400> 150 Leu Pro Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn 1 5 10 15 Ile Arg Asn Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Leu Gly 20 25 30 Glu Ala Lys Ala Leu Gly 35 <210> 151 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (23) <223> AMIDATION <400> 151 Phe Ala Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu 20 <210> 152 <211> 15 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (15) <223> AMIDATION <400> 152 Val Ala Lys Ala Leu Lys Ala Leu Leu Lys Ala Leu Lys Ala Leu 1 5 10 15 <210> 153 <211> 13 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> AMIDATION <400> 153 Val Ala Lys Phe Leu Ala Lys Phe Leu Lys Lys Ala Leu 1 5 10 <210> 154 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (23) <223> AMIDATION <400> 154 Val Ala Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe Lys Lys Phe Ala Lys Lys Phe 1 5 10 15 Ala Lys Phe Ala Phe Ala Phe 20 <210> 155 <211> 19 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (19) <223> AMIDATION <400> 155 Val Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu <210> 156 <211> 15 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (15) <223> AMIDATION <400> 156 Val Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 <210> 157 <211> 13 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> AMIDATION <400> 157 Val Ala Lys Leu Leu Ala Lys Ala Leu Lys Lys Leu Leu 1 5 10 <210> 158 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (23) <223> AMIDATION <400> 158 Val Ala Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Lys Ala Leu Lys Lys Leu Lys 1 5 10 15 Lys Ala Leu Lys Lys Ala Leu 20 <210> 159 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <400> 159 Val Ala Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Lys Ala Leu Lys Lys Leu Lys 1 5 10 15 Lys Ala Leu Lys Lys Ala Leu 20 <210> 160 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (23) <223> AMIDATION <400> 160 Val Ala Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu Lys 1 5 10 15 Lys Leu Ala Lys Lys Ala Leu 20 <210> 161 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (23) <223> AMIDATION <400> 161 Val Ala Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Lys 1 5 10 15 Lys Leu Ala Lys Lys Ala Leu 20 <210> 162 <211> 23 <212> PRT <213> SYNTHETIC <400> 162 Phe Ala Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ala Lys Leu Ala Leu Ala Leu 20 <210> 163 <211> 30 <212> PRT <213> SYNTHETIC <400> 163 Phe Ala Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ala Lys Leu Ala Leu Ala Leu Lys Ala Leu Ala Leu Lys Ala 20 25 30 <210> 164 <211> 18 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (18) <223> AMIDATION <400> 164 Phe Ala Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Leu Ala Lys Lys Leu 1 5 10 15 Ala Lys <210> 165 <211> 13 <212> PRT <213> SYNTHETIC <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> AMIDATION <400> 165 Phe Ala Lys Leu Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala Leu 1 5 10

Claims (23)

  1. 페닐알라닌, 로이신, 알라닌 및 리신 잔기를 포함하는 분리된 펩티드로서, 상기 펩티드는, 5 내지 22개의 아미노산 길이이고, 아미노산 서열이 SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID N0:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID N0:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID N0:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID N0:54, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID N0:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:128, SEQ ID N0:129, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:153, SEQ ID NO:164, 또는 SEQ ID NO:165인 분리된 펩티드.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 펩티드의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:43인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID N0:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID N0:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID N0:54, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:164, 또는 SEQ ID NO:165인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  6. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:37, SEQ ID N0:38, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:82, SEQ ID N0:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:127, SEQ ID N0:129, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:114, 또는 SEQ ID NO:153인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  7. 페닐알라닌, 로이신, 알라닌, 및 리신 잔기를 포함하는 23개 아미노산 길이의 분리된 펩티드로서, SEQ ID NO:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:64, SEQ ID N0:15, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO:159, SEQ ID NO:160, 또는 SEQ ID NO:161인 펩티드.
  8. 페닐알라닌, 로이신, 알라닌 및 리신으로 구성된 군으로부터의 적어도 3개의 상이한 잔기를 포함하는 분리된 펩티드로서, 상기 펩티드는 5 내지 22개의 아미노산 길이이고, 첫번째 아미노산은 발린이고, 상기 펩티드의 아미노산 잔기의 적어도 80%는 페닐알라닌, 로이신, 알라닌 및 리신으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 펩티드의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:30, SEQ ID N0:32, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:152, SEQ ID NO:155, SEQ ID NO:156 또는 SEQ ID N0:157인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  9. 삭제
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 펩티드의 아미노산 서열이 SEQ ID NO:129인 것을 특징으로 하는 펩티드.
  11. 페닐알라닌, 로이신, 알라닌, 및 리신으로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 3개의 잔기를 포함하는 4개 아미노산 길이의 분리된 펩티드로서, SEQ ID NO:144인 펩티드.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 시험관내(in vitro)에서 암세포 또는 미생물 세포를 죽이거나, 또는 그 성장을 억제하는 방법으로서, 상기 암세포 또는 미생물 세포와 제 1 항, 제 3 항, 제 5 항 내지 제 8 항, 제 10 항 또는 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 생체외적으로 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 미생물 세포는 그램 양성 박테리아, 그램 음성 박테리아, 미코박테리아, Staphylococcus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia 또는 Escherichia 세포를 포함하는 박테리아 세포; Candida, Candida albicans, Saccharomyces pombe 세포와 같은 진균 세포; Trypanosoma cruzi 또는 Plasmodium falciparum과 같은 원생동물; 세포내 유기체 또는 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 시험관내(in vitro)에서 세포 자극 및/또는 증식을 촉진시키기 위한 방법으로서, 포유류 세포 또는 림프구 세포와 제 1 항, 제 3 항, 제 5 항 내지 제 8 항, 제 10 항 또는 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 포함하는 조성물을 생체외적으로 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 조성물은 성장 인자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 시험관내(in vitro)에서 치료제의 활성을 증진시키는 방법으로서, 제 1 항, 제 3 항, 제 5 항 내지 제 8 항, 제 10 항 또는 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 및 치료제를 포함하는 조성물을 시험관내(in vitro)에서 제조하는 단계를 포함하며, 여기서 조성물의 활성은 치료제는 함유하지만 펩티드는 함유하지 않는 동일한 조성물의 활성보다 더 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 치료제는 항생물질, 성장 인자, 화학요법제, 항균제, 리소짐, 킬레이트제, 또는 EDTA인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 조성물에서 펩티드의 농도는 0.01μM 내지 500μM인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항, 제 3 항, 제 5 항 내지 제 8 항, 제 10 항 또는 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 미생물 감염, 암, 상처, 낭성섬유증(CF), 성감염 질환(STD) 또는 여드름 치료용 조성물.
  23. 제 1 항, 제 3 항, 제 5 항 내지 제 8 항, 제 10 항 또는 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 피부 상처, 여드름 또는 미생물의 피부 감염 치료용 조성물.
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