CN114395042B

CN114395042B - 抗il-33人源化抗体及其应用

Info

Publication number: CN114395042B
Application number: CN202210308391.8A
Authority: CN
Inventors: 王双; 王荣娟; 焦莎莎; 张畅; 张锦超
Original assignee: Beijing Konuoxincheng Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Konuoxincheng Technology Co ltd
Priority date: 2022-03-28
Filing date: 2022-03-28
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2042-03-28
Also published as: CN114395042A

Abstract

本发明公开了一种抗人IL‑33抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），其中，所述VH包括抗原决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VL包括抗原决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。本发明的人源化抗IL‑33抗体来自杂交瘤，可以高亲和力地结合人IL‑33，阻断IL‑33与ST2结合，抑制IL‑33对KU812细胞IL5表达的促进作用，为IL‑33相关疾病的治疗提供了候选抗体分子。

Description

抗IL-33人源化抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物药物领域。具体而言，本发明涉及一种新型的经人工设计的抗体，特别是IL-33人源化抗体或抗原结合片段。本发明还涉及这些结合IL-33的抗体的治疗和诊断用途，特别是在治疗、预防和/或诊断IL-33相关疾病，例如炎症中的用途。

背景技术

炎症是具有血管***的活体组织对损伤因子所发生的防御反应。就是平时人们所说的“发炎”，是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛。血管反应是炎症过程的中心环节。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动的防御反应，但是有的时候，炎症也是有害的，例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等。

白细胞介素33（interleukin-33，IL-33）是在2005年发现的一个多功能基因，是炎症反应和免疫偏倚的重要调节因子之一，可作为核内定位的分子发挥转录因子的作用，又可被分泌到胞外起到细胞因子的作用。IL-33是IL-1家族的新成员，受体为ST2（Interleukin 1 like receptor），研究认为，IL-33是在上皮细胞受到损伤之后释放，具有多种功能，包括刺激上皮细胞的重组和促进炎症的发生。IL-33/ST2信号通路是哮喘、特发性皮炎、COPD和慢性阻碍性肺病、慢性鼻窦炎和风湿性关节炎等疾病治疗的潜在靶点。目前有多个针对IL-33和ST2的项目处于临床研究阶段。包括Anaptysbio的etokimab，赛诺菲的SAR-440340，MedImmune的MEDI-3506等。

随着IL-33对炎性疾病发生发展的作用机理日渐清晰，治疗性抗人IL-33抗体吸引了越来越多的关注。目前临床试验进展最快的是赛诺菲和再生元开发的全人源抗IL-33单抗SAR-440340，然而其在哮喘、特异性皮炎、慢性阻塞性肺炎等的临床应用前景方面仍不明朗，此前曾与达必妥联用治疗哮喘，但Ⅱ期临床试验效果不佳。由此，抗IL-33抗体有待进一步研究。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中，IL-33抗体存在与人IL-33受体亲和力不稳定的问题，具体来说，解决IL-33抗体结合活性的技术问题。为此，本发明的一个目的在于制备亲和力更高的IL-33抗体或抗原结合片段。

因而，根据本发明实施例的一个方面，提供了一种抗人IL-33抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），其中，所述VH包括抗原决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VH CDR1包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，所述VH CDR2包含如EIFPGTGTTYYNX₁KFX₂G所示的氨基酸序列，所述VH CDR3包含如SEQID NO：16所示的氨基酸序列；所述VL包括抗原决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，所述VLCDR1包含如X₃ASSSVSYMH所示的氨基酸序列，所述VL CDR2包含如RTSNLX₄S所示的氨基酸序列，所述VL CDR3包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；其中，X1为E或Q；X2为K或Q；X3为S或R；X4位A或Q。

根据本发明实施例的IL-33抗体或抗原结合片段，本发明所得抗体可以与人IL-33结合，且结合人IL-33活性优于对照抗体。其中25D8分子的嵌合抗体ch25D8抑制ST2结合IL-33的活性，明显优于对照抗体，同时其人源化抗体在体外细胞学活性的检测中，也显示出对IL-33的抑制活性优于对照抗体，具有强亲和力。

另外，根据本发明上述实施例的抗体或抗原结合片段，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述VH包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，且所述VL包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述VH包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，且所述VL包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。进一步说明的是，该抗体或抗原结合片段的VH和VL序列可以是在SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的基础上进行一个或多个氨基酸的***、删除、突变或修饰等得到的。

根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体。单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。例如，本发明实施例的抗体仅特异性结合IL-33。

根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或人源化抗体。人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，经改造后与人的靶点结合，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体，例如，本发明实施例的抗体或抗原结合片段经人源化后，可以与人的IL-33特异性结合。

根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段是特异性结合人IL-33的抗体片段，且选自Fv、Fab、Fab'、scFv和F(ab')2。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸。根据本发明的实施例，所述分离的多核苷酸编码前述抗人IL-33抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述分离的多核苷酸编码前项所述的IL-33抗体或抗原结合片段。由此，由该多核苷酸编码的多肽可以与IL-33特异性结合。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸。根据本发明的实施例，所述分离的多核苷酸编码抗人IL-33抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或重链可变区，或轻链或重链。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种载体。根据本发明的实施例，所述载体包含前述一种或多种多核苷酸。

根据本发明的实施例，所述载体包含前述两种多核苷酸，且所述载体编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合IL-33。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种载体对。根据本发明的实施例，所述每个载体对包含前述多核苷酸中的一种，其中所述载体对共同编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合IL-33。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种宿主细胞。根据本发明的实施例，所述宿主细胞包含有前述的载体、或前述的载体对。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包含前述抗人IL-33抗体或其抗原结合片段、前述多核苷酸、前述载体、前述载体对，或前述宿主细胞；以及可选的药学上可接受的辅料。由此，该组合物可以与IL-33特异性结合，并且抑制炎症因子的效果好，药效佳。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种制备抗人IL-33抗体或其片段的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1) 在合适的条件下，培养前述的宿主细胞；2) 分离回收抗人IL-33抗体或其抗原结合片段。本发明采用体外细胞培养后分离纯化目的蛋白的方法，得到特异性结合IL-33的抗体。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用途。根据本发明的实施例，所述用途包括：前述抗人IL-33抗体或其片段、前述多核苷酸、前述载体、前述载体对，前述宿主细胞和前述组合物在制备炎症或心血管疾病诊断试剂中的用途。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用途。根据本发明的实施例，所述用途包括：前述抗人IL-33抗体或其片段、前述多核苷酸、前述载体、前述载体对，前述宿主细胞和前述组合物在制备治疗炎症或心血管疾病药物中的用途。

根据本发明的实施例，所述炎症包括哮喘、特发性皮炎、COPD和慢性阻碍性肺病、慢性鼻窦炎和风湿性关节炎。

本发明实施例保护一株来自杂交瘤的人源化抗IL-33抗体。该抗体高亲和力结合人IL-33，阻断IL-33与ST2结合，抑制IL-33对KU812细胞IL5表达的促进作用，解决现有技术中抗人IL-33抗体亲和力和特异性不足和不良反应的缺陷，稳定性高，亲和力强，具有更高的生物学活性，为IL-33相关疾病的治疗提供了候选抗体分子。

为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

术语“特异性”是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在所述蛋白。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。

本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫***细胞(例如，效应细胞)和传统补体***的第一组分(C1q)。

术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。

本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。

本发明的抗原结合片段包括能够特异性结合抗原的那些。抗体结合片段的实例包括例如但不限于Fab、Fab'、F（ab'）₂、Fv片段、单链Fv（scFv）片段和单结构域片段。

Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域（CH1）。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在F（ab'）2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生Fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。Fab和F（ab'）2片段缺乏完整抗体的片段可结晶（Fc）区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合（参见例如，Wahl等人，1983，J. Nucl. Med. 24:316）。

如本领域通常理解的，“Fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体的片段可结晶恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域（分别为CH2和CH3结构域）。IgM和IgE Fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域（CH2、CH3和CH4结构域）。

术语“结合亲和力”在本文中用作为两个分子(例如，抗体或其片段，和抗原)之间非共价相互作用强度的度量。术语“结合亲和力”用于描述单价相互作用(内在活性)。经由单价相互作用的两个分子(例如，抗体或其片段，和抗原)之间的结合亲和力，可通过测定解离常数(KD)来定量测定。继而，可通过对复合物形成和解离动力学的测量，例如通过SPR方法，来测定KD。对应于单价复合物缔合和解离的速率常数，被分别称为缔合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。KD通过等式KD = kd / ka与ka和kd相联系。根据以上定义，与不同分子相互作用相关的结合亲和力，例如不同抗体对于给定的抗原的结合亲和力的比较，可通过比较各个抗体/抗原复合物的KD值进行比较。类似地，可通过测定，并比较感兴趣的相互作用(例如抗体和抗原之间的特异性相互作用)的KD值与不感兴趣的相互作用的KD值，来评价相互作用的特异性。通过众所周知的方法可直接测定该解离常数的值，例如，通过评价配体(例如抗体)对靶的结合能力的标准测定是本领域已知的，并包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析。通过本领域已知的标准测定，例如SPR，还可评价抗体的结合动力学和结合亲和力。可进行竞争性结合测定，其中，将抗体与靶的结合，和该靶的另外的配体(例如另外的抗体)与该靶结合，进行比较。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1显示了根据本发明一个实施例的IL-33/ST2重组蛋白结合阻断试验；

图2显示了根据本发明一个实施例的抗IL-33抗体抑制IL-33促KU812-IL5生成活性。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

抗人IL-33抗体和其抗原结合片段

本发明提供了特异性结合IL-33的抗体及其抗原结合片段。根据本发明实施例的抗人IL-33抗体或其抗原结合片段能异性结合人IL-33或鼠IL-33蛋白，降低患者血清中促炎症细胞因子的水平，减少嗜酸性粒细胞的生长，降低炎症反应。

本发明实施例提供了抗IL-33抗体，包括小鼠抗体25D8，及其人源化抗体和嵌合抗体。这些嵌合抗体具有来自小鼠抗体的VH和VL。然而，这些嵌合抗体的恒定结构域来自人抗体（例如，人IgG1、人IgG2、人IgG3、或人IgG4），嵌合抗体被标记为ch25D8。此外，本发明实施例还提供了人源化的抗体h25D8H1L1。

一些公开的抗体的CDR序列（Kabat定义）、重轻链可变区、重轻链恒定区的序列在下表1中所示。

表1

Ab	VH-CDR1	VH-CDR2	VH-CDR3	VL-CDR1	VL-CDR2	VL-CDR3	VH	VL	CH	CL
											25D8	14	15	16	11	12	13	4	3	-	-
ch25D8	14	15	16	11	12	13	4	3	10	9
											h25D8H1L1	14	23	16	21	22	13	8	7	10	9

本发明实施例还提供了人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。由于存在使小鼠抗体人源化的不同方式（例如，可以用不同的氨基酸取代来修饰序列），抗体的重链和轻链可以具有一个以上形式的人源化序列。人源化抗体h25D8H1L1的重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO: 8所示。人源化抗体h25D8H1L1的轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO: 7所示。

在一些实施方案中，抗体可以具有重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），所述VH包含互补决定区CDR1、2、3，其中CDR1区包含与选定的VH CDR1氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR2区包含与选定的VH CDR2氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列或由其组成，并且CDR3区包含与选定的VHCDR3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列或由其组成；所述VL包含CDR 1、2、3，其中CDR1区包含与选定的VL CDR1氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列或由其组成，CDR2区包含与选定的VL CDR2氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列或由其组成，并且CDR3区包含与选定的VL CDR3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%同一性的氨基酸序列或由其组成。

氨基酸序列的“同一性百分数(%)”是指将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与本说明书中所示的具体氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数。在一些实施方案中，本发明考虑本发明抗体分子的变体，所述变体相对于在本文中具体公开的抗体分子及其序列而言具有相当程度的同一性，例如同一性为至少80%、85%、90%、95%或99%或更高。所述变体可以包含保守性改变。

在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可以含有重、轻链可变区，所述重、轻链可变区含有选自以下的CDR中的一个、两个或三个：在选定的CDR的一个、两个、或三个上具有零个、一个或两个氨基酸***、缺失或取代的SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23.

本发明实施例还提供了结合IL-33的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段具有VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3。在一些实施方案中，基于本领域已知的各种CDR定义，例如Kabat定义、Chothia定义、或IMGT定义来确定VHCDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3的序列。VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、和VL CDR3的序列由表1所示。

核酸、载体和细胞

本发明实施例还提供了包含编码多肽的多核苷酸的核酸，所述多肽包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链。免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链包含如在表1所示的CDR，或具有如表1所示的序列。当多肽与相应的多肽（例如，相应的重链可变区或相应的轻链可变区）配对时，所述配对的多肽结合IL-33（例如，人IL-33）。

本发明实施例还提供了包括本文公开的分离的多核苷酸（例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸）的载体、引入了重组载体的宿主细胞（即，使得所述宿主细胞含有多核苷酸和/或含多核苷酸的载体）、以及通过重组技术产生重组抗体多肽或其片段。

如本文所用，“载体”是当载体被引入宿主细胞时能够将一个或多个目标多核苷酸递送至所述宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够在已引入表达载体的宿主细胞中递送和表达一个或多个目标多核苷酸作为编码的多肽。因此，在表达载体中，目标多核苷酸通过与调控元件诸如启动子、增强子和/或多聚腺苷酸尾可操作地连接而定位于载体中表达，所述调控元件位于载体内或宿主细胞的基因组中的目标多核苷酸的整合位点处或所述整合位点附近或所述整合位点两侧，使得目标多核苷酸将在引入了所述表达载体的宿主细胞中得以翻译。

可以通过本领域已知的方法，例如电穿孔、化学转染（例如DEAE-葡聚糖）、转化、转染以及感染和/或转导（例如用重组病毒）将载体引入到宿主细胞中。因此，载体的非限制性实施例包括病毒载体（可用于产生重组病毒）、裸DNA或RNA、质粒、粘粒、噬菌体载体以及与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体。

本发明实施例提供了用上文描述的载体转化的宿主细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞。优选的原核宿主细胞是大肠杆菌（Escherichia coli）。优选地，真核细胞选自：原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于CHO和COS细胞。优选的真菌细胞是酿酒酵母。

制备抗IL-33抗体的方法

可以使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术，将人IL-33的分离片段用作免疫原以产生抗体。可以通过多次注射（例如皮下或腹腔注射）抗原肽或蛋白质而在动物中产生多克隆抗体。在一些实施方案中，将抗原肽或蛋白质与至少一种佐剂一起注射。在一些实施方案中，可以将抗原肽或蛋白质与待免疫物种中具有免疫原性的药剂缀合。可以多次向动物注射抗原肽或蛋白质。

免疫原通常用于通过免疫合适的受试者（例如表达至少一个人免疫球蛋白基因座的人或转基因动物）来制备抗体。合适的免疫原性制剂可以含有例如重组表达的多肽或化学合成的多肽（例如人IL-33的片段）。制剂可以进一步包含佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂、或类似的免疫刺激剂。

药物组合物和用途及治疗方法

本发明实施例还提供了含有本发明实施例所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种（例如，一种、两种、三种或四种）的药物组合物。本文所述的任何抗体或抗原结合片段中的两种或更多种（例如，两种、三种或四种）可以以任何组合存在于药物组合物中。可以以本领域已知的任何方式配制药物组合物。

药物组合物还可以含有药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。药学可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加抗体的贮存期限或效力。

在一个方面，本发明提供了前述的抗人IL-33抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗炎症或心血管疾病。根据本发明的实施例，所述炎症包括哮喘、特发性皮炎、COPD和慢性阻碍性肺病、慢性鼻窦炎和风湿性关节炎。

本发明提供了一种或多种抗体或其抗原结合片段可以用于多种治疗目的。在一个方面，本公开提供了用于治疗受试者炎症的方法、降低炎症加重的风险的方法。在一些实施方案中，治疗可以停止、减慢、延缓或抑制炎症的进展。在一些实施方案中，治疗可导致受试者炎症的一个或多个症状的数量、严重程度和/或持续时间减少。

在一个方面，本公开的特征在于如下方法，所述方法包括向有需要的受试者（例如，患有、或鉴定为患有或诊断为患有炎症或心血管疾病的受试者）施用治疗有效剂量的本文公开的抗体或其抗原结合片段，所述炎症是例如哮喘、特发性皮炎、COPD和慢性阻碍性肺病、慢性鼻窦炎和风湿性关节炎。

在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗有炎症风险的患者。可以用本领域已知的多种方法来鉴定患有炎症的患者。

试剂盒

本发明实施例还提供了含有本发明实施例所述的IL-33抗体或抗原结合片段中的至少一种（例如，一种、两种、三种或四种）的试剂盒。本文所述的任何抗体或抗原结合片段中的两种或更多种（例如，两种、三种或四种）可以以任何组合存在于试剂盒中。可以以本领域已知的任何方式制备试剂盒。

剂盒还可以含有：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液，在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水；（7）酶反应终止液，常用的HRP反应终止液为硫酸。

本发明提供了前述的抗人IL-33抗体或其抗原结合片段试剂盒在检测试剂中的用途。根据本发明的实施例，所述检测包括RT-PCR、Northern blot、Dot blot、Real time RTPCR、芯片分析、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等检测实验。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1. 抗IL-33杂交瘤鼠嵌合抗体的制备

对照抗体的制备

根据专利WO2015106080A2公开的APE4909序列，合成对照抗体ANB020的抗体序列，轻、重链可变区序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。将轻重链序列分别克隆至含有人IgG1轻重链恒定区的真核瞬时表达载体中，获得对照抗体轻链和重链表达质粒，转入大肠杆菌扩增，分离获得大量含对照抗体轻链和重链的质粒，利用这些质粒，并根据转染试剂293fectin（Cat:12347019，Gibco）的操作说明，分别将对照抗体的轻、重链质粒转入HEK293细胞中重组表达。细胞转染后5-6天，取培养上清，利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得对照抗体ANB020。

SEQ ID NO.1 ANB020-VL

DIQLTQSPSFLSASVGDRVTLTCKASQDVGTAVAWTQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQAKTYPFTFGSGTKLEIK

SEQ ID NO.2 ANB020-VH

QVQLMQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGTIYPRNSNTDYNQKFKARVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARPLYYYLTSPPTLFWGQGTLVTVSS

鼠杂交瘤抗体制备

采用人IL-33重组蛋白（序列号：NP_001300973.1 aa112-aa270）免疫Balb/c小鼠，并进行细胞融合和杂交瘤制备。ELISA对杂交瘤培养上清进行分析，挑选特异性阳性克隆，获得特异性阳性克隆25D8和25H12，TRIzol试剂盒（Cat:15596026，Invitrogen）提取杂交瘤细胞细胞总RNA；利用M-MuLV反转录酶（Cat:M0253S，NEB）将杂交瘤细胞总RNA反转录成cDNA；使用简并引物和Phusion试剂盒（Cat:E0553L，NEB）扩增抗体轻链可变区IgVL(κ)和重链可变区V_H序列；利用胶回收试剂盒（Cat: AP-GX-250，Axygen）纯化PCR扩增产物；按照T载体克隆试剂盒（Cat:ZC205，庄盟生物）说明书将扩增PCR产物连接至T载体并转化大肠杆菌感受态细胞，菌株扩增、抽提质粒后进行DNA测序获得单克隆抗体可变区序列。

测序结果显示25D8鼠抗体轻链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.3，重链可变区序列见SEQ ID NO.4。25H12鼠抗体轻链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.5，重链可变区序列见SEQ ID NO.6。

SEQ ID NO.3 25D8VL

Qivltqspaimsaspgekvtitcsasssvsymhwfqqkpgtspklwiyrtsnlasgvpdrfsgsgsgtsysltisrmeaedaatyyclqrstylfmfgagtklelk

SEQ ID NO.4 25D8VH

qvqlqqsgtelvkpgasvklscktsgytftsywiqwvkqrpgqglgwigeifpgtgttyynekfkgkatlttdtssttaymqlssltsedsavyfcarrirdyygsnyfdywgqgttltvss

SEQ ID NO.5 25H12VL

qivltqspaimsaspgekvtitcsasssvsymhwfqqkpgtspklwiyrtsnlasgvpdrfsgsgsgtsysltisrmeaedaatyycqqrssylfmfgagtklelk

SEQ ID NO.6 25H12VH

evqlqqsgaelvkpgasvklsctasgfnikdtyihwvkqrpeqglewigridptadntkyhpkfqgkatltadtssntaylqlssltsedtavyfcargssyaldywgqgtsvtvss

嵌合抗体鉴定

将该轻链可变区和重链可变区基因通过PCR引入酶切位点，分别克隆至装有人-kappa轻链恒定区（SEQ ID NO.9）和人IgG1重链恒定区（SEQ ID NO.10）编码基因上游的真核瞬时表达载体中，获得人-鼠嵌合轻链（pKN019-25D8L，pKN019-25H12L）和人-鼠嵌合重链（pKN032-25D8H，pKN032-25H12H）表达质粒，并根据转染试剂293fectin（Cat:12347019，Gibco）的操作说明，将嵌合抗体的轻、重链质粒分别转入HEK293细胞中重组表达。细胞转染后5-6天，取培养上清，利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得ch25D8和ch25H12蛋白样品。

采用fortebio对嵌合抗体ch25D8和ch25H12的亲和力进行测定。具体地，采用抗人抗体 Fc 段的捕获抗体（AHC）生物探针捕获抗体Fc段的方法测定抗体亲和力。测定时将抗体用PBS缓冲液稀释至4µg/mL，流经AHC探针（Cat:18-0015，PALL）表面，时间为120s。人IL33-his重组蛋白（序列号：NP_001300973.1 aa112-aa270）作为流动相， IL33-his浓度分别为15、30、45和60nM。结合时间为100s，解离时间为300s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行 1：1 Langmuir 结合模式拟合，抗原抗体结合的动力学常数如下表2所示。

SEQ ID NO.9 人-kappa轻链恒定区

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.10 人IgG1重链恒定区

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

表2 嵌合抗体亲和力测定

Sample ID	KD (M)	kon(1/Ms)	kdis(1/s)
				ch25D8	9.00E-10	8.36E+04	7.53E-05
ch25H12	7.77E-08	7.97E+03	6.19E-04
				ANB020	6.70E-09	6.25E+04	4.19E-04

由表2看出，嵌合抗体ch25D8和ch25H12的亲和力均优于对照抗体ANB020，结合活性强，药效佳。

实施例2 IL-33/ST2重组蛋白结合阻断试验

利用重组的IL-33-his-biotin和ST2-ECD-hFc蛋白（序列号：NP_003847.2 aa1-aa328）结合试验评价IL-33抗体ch25D8和ch25H12的阻断活性。具体地，将人ST2胞外区重组蛋白（ST2-hFc），用PBS稀释至0.5μg/mL，100µl/孔，包被酶联板，4℃包被过夜；5%BSA封闭液37℃恒温培养箱封闭120min，PBST洗板3次；将待测抗体ch25D8和ch25H12从30µg起始，3倍梯度稀释8个梯度，与0.15µg/ml的IL-33-Biotin混合后加入ELSIA板中，每个浓度点设置复孔，混匀后，37℃反应60min，PBST洗板4次；加入1:5000稀释的HRP-anti- Streptavidin(Jackson Immuno Research)反应15min，PBST洗板4次；最后加入TMB底物显色，37℃恒温培养箱反应15min，2M HCl终止反应，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度。实验结果如图1所示，ch25D8能够剂量依赖地抑制IL-33和ST2的结合。

实施例3.抗IL-33抗体人源化

对ch25D8进行人源化，合成该人源化抗体可变区基因，按照实施例1中的方法构建人源化抗体重组表达载体，并进行抗体的表达纯化制备，人源化抗体h25D8H1L1的轻、重链可变区序列如下SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示。Foretibo测定抗体的亲和力如表3所示。

SEQ ID NO. 7 hzVL1:

DIQLTQSPSSMSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWFQQKPGKAPKLWIYRTSNLQSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCLQRSTYLFMFGQGTKLELK

SEQ ID NO. 8 hzVH1:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKTSGYTFTSYWIQWVRQAPGQGLEWIGEIFPGTGTTYYNQKFQGRATLTTDTSTTTAYMELSSLRSEDTAVYFCARRIRDYYGSNYFDYWGQGTTLTVSS

表3. 人源化抗体亲和力测定

Sample	KD (M)	kon(1/Ms)	kdis(1/s)
				ch25D8	6.17E-10	7.66E+05	4.72E-04
h25D8H1L1	6.10E-10	6.00E+05	3.66E-04

实验数据证明，人源化抗体保持了和嵌合抗体相当的亲和力。

实施例4. IL-33刺激的KU812细胞IL-5生成抑制实验

IL-33可以刺激肥大细胞KU812（中国科学院细胞库，cat. TCHu189）表达IL-5分泌（Human IL-5 DuoSet ELISA 试剂盒（R&D，cat.DY205-05， lot.P151330），利用该试验评估抗IL-33抗体对IL-33生物学活性的抑制作用。具体地，hIL-33WT终浓度为20ng/ml，待测抗体h25D8H1L1和对照抗体ANB020浓度为160µg/ml，4倍稀释8个点，使用中间10列孔。KU812细胞按照100000个/孔，100µl体系，孵育24h。提前一天包被捕捉抗体（240µg/ml储液），PBS稀释工作液到2µg/ml，4度包被过夜，50µl/孔。封闭液封闭1h，洗涤三次。标准液120ng/ml，400倍稀释液稀释到300pg/ml(1µl加到400µl)，然后2倍稀释7个点(200µl加到200µl)。吸取50µl细胞培养上清和稀释好的标准液，加入到ELISA孔板中，双复孔，孵育2h。洗涤三次，加入待测抗体（7.5µg/ml储液），稀释（1% BSA 的PBS）到125ng/ml工作液，50µl/孔，孵育2h，洗涤三次。40倍稀释（1% BSA 的PBS）工作液到125ng/ml得到SA-HRP，50µl/孔，孵育20~30min。加入50µl/孔显色液，闭光显色5~10min，加入100µl/孔2M HCl终止。

试验结果如图2所示，h25D8H1L1能够剂量依赖抑制IL-33对KU812细胞表达IL-5的刺激作用。IC50数据见表4，h25D8H1L1明显优于对照抗体ANB020。

表4. h25D8H1L1抑制IL-33促KU812-IL5生成活性（IC50：µg/ml）

	h25D8H1L1	ANB020
			IC50（µg/ml）	0.677	5.824

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 北京科诺信诚科技有限公司

<120> 抗IL-33人源化抗体及其应用

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Thr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Lys Thr Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 2

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Met Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Arg Asn Ser Asn Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ala Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Leu Tyr Tyr Tyr Leu Thr Ser Pro Pro Thr Leu Phe Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg Ser Thr Tyr Leu Phe Met

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gly Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Gly Thr Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ile Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Leu Phe Met

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 6

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Thr Ala Asp Asn Thr Lys Tyr His Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Arg Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg Ser Thr Tyr Leu Phe Met

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 8

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Gly Thr Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Ile Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 10

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Leu Gln Arg Ser Thr Tyr Leu Phe Met

1 5

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Ser Tyr Trp Ile Gln

1 5

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Glu Ile Phe Pro Gly Thr Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Arg Ile Arg Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Leu Phe Met

1 5

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Asp Thr Tyr Ile His

1 5

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Arg Ile Asp Pro Thr Ala Asp Asn Thr Lys Tyr His Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Gly Ser Ser Tyr Ala Leu Asp Tyr

1 5

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Arg Thr Ser Asn Leu Gln Ser

1 5

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Glu Ile Phe Pro Gly Thr Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

Claims

1. 一种抗人IL-33抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），其中，所述VH包括抗原决定区VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，所述VL包括抗原决定区VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列以及所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列是以下之一：

（1）所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NOs: 14、15、16所示，并且所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NOs: 11、12、13所示；

（2）所述VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NOs: 14、23、16所示，并且所述VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NOs: 21、22、13所示。

2.如权利要求1所述抗人IL-33抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述VH包括如SEQID NO：4所示的氨基酸序列，且所述VL包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

3. 如权利要求1所述抗人IL-33抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述VH包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，且所述VL包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1所述抗人IL-33抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。

5.如权利要求4所述抗人IL-33抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体。

6.如权利要求5所述抗人IL-33抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段是特异性结合人IL-33的抗体片段，且选自Fv、Fab、Fab'、scFv和F(ab')₂。

7.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-6中任一项所述抗人IL-33抗体或其抗原结合片段。

8.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-6中任一项所述抗人IL-33抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和重链可变区，或轻链和重链。

9.一种载体，其包含权利要求7或8所述的一种或多种多核苷酸。

10.根据权利要求9所述的载体，其特征在于，所述载体包含权利要求7或8所述的两种多核苷酸，且所述载体编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合IL-33。

11.一种载体对，其特征在于，每个载体对包含如权利要求7或8所述的多核苷酸中的一种，其中所述载体对共同编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合IL-33。

12.一种宿主细胞，其包含权利要求7或8所述的多核苷酸或权利要求9或10所述的载体、或权利要求11所述的载体对。

13. 一种组合物，其包含：

1)权利要求1-6中任一项所述抗人IL-33抗体或其抗原结合片段、权利要求7或8所述多核苷酸、权利要求9或10所述载体、权利要求11所述的载体对，或权利要求12所述宿主细胞；以及

2)可选的药学上可接受的辅料。

14.一种制备抗人IL-33抗体或其抗原结合片段的方法，包括：

1)在合适的条件下，培养权利要求12所述的宿主细胞；

2)分离回收抗人IL-33抗体或其抗原结合片段。

15.权利要求1-6中任一项所述抗人IL-33抗体或其抗原结合片段、权利要求7或8所述多核苷酸、权利要求9或10所述载体、权利要求11所述的载体对、权利要求12所述宿主细胞，或权利要求13所述组合物在制备炎症或心血管疾病诊断试剂中的用途。

16.权利要求1-6中任一项所述抗人IL-33抗体或其抗原结合片段、权利要求7或8所述多核苷酸、权利要求9或10所述载体、权利要求11所述的载体对、权利要求12所述宿主细胞，或权利要求13所述组合物在制备治疗炎症或心血管疾病药物中的用途。

17.如权利要求15或16所述的用途，其特征在于，所述炎症包括哮喘、特发性皮炎、COPD和慢性阻碍性肺病、慢性鼻窦炎和风湿性关节炎。