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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einführung einer GAG-Bindungsstelle in ein Protein, ein modifiziertes GAG-Bindungs-Protein sowie ein isoliertes DNA-Molekül, einen Vektor, eine rekombinante Zelle, eine pharmazeutische Zusammensetzung und die Verwendung dieses modifizierten Proteins.
Die Chemokine, die ursprünglich von chemoattraktorischen Cytokinen stammen, umfassen tatsächlich mehr als 50 Mitglieder und stellen eine Familie kleiner, induzierbarer und sezernierter Proteine mit niedrigem Molekulargewicht (6-12 kDa in ihrer monomeren Form) dar, die eine wesentliche Rolle während der Immunüberwachung und während entzündlicher Prozesse spielen. Je nach ihrer Funktion bei Immunität und Entzündung können sie in zwei Klassen unterteilt werden.
Entzündungs-Chemokine werden von vielen verschiedenen Gewebszellen erzeugt sowie durch einwandernde Leukozyten als Reaktion auf Bakterien-Toxine und Entzündungs-Cytokine, wie IL-1, TNF und Interferone. Ihre Hauptfunktion ist die Rekrutierung von Leukozyten für die Wirtsverteidigung und beim Verlauf der Entzündung. Zielsuchende ("homing") Chemokine werden anderseits konstitutiv in bestimmten Bereichen des Lymphoid-Gewebes exprimiert. Sie lenken den Verkehr und das Zielsuchen (#homing") von Lymphozyten und dendritischen Zellen innerhalb des Immunsystems. Diese Chemokine, wie sie durch BCA-1, SDF-1 oder SLC veranschaulicht sind, steuern die Relokation und Rezirkulation der Lymphozyten im Zusammenhang mit der Reifung, Differenzierung, Aktivierung und gewährleisten ihre korrekte Zielsuche innerhalb sekundärer lymphoider Organe.
Trotz der grossen Anzahl ihrer Vertreter zeigen Chemokine bemerkenswert ähnliche strukturelle Faltungen auf, obwohl die Sequenz-Homologie zwischen 20 bis 70 Prozent variiert. Chemokine bestehen aus ungefähr 70-130 Aminosäuren mit vier konservierten Cystein-Resten. Die Cysteine bilden zwei Disulfid-Brücken (Cys 1 # Cys 3, Cys 2 # Cys 4), die für ihre charakteristische dreidimensionale Struktur verantwortlich sind. Chemotaktische Cytokine bestehen aus einer kurzen Amino-terminalen Domäne (3-10 Aminosäuren), die dem ersten Cystein-Rest vorangeht, einem Kern, der aus #-Strängen und Verbindungsschleifen besteht, die man zwischen dem zweiten und dem vierten Cystein-Rest findet, sowie einer Carboxy-terminalen a-Helix von 20-60 Aminosäuren.
Der Proteinkern hat eine gut geordnete Struktur, wogegen die N- und C-terminalen Teile ungeordnet sind. Als Sekretions-Proteine werden sie mit einer Leader-Sequenz von 20-25 Aminosäuren synthetisiert, die vor der Freisetzung abgespalten wird.
Die Chemokine wurden auf Grund der relativen Position ihrer Cystein-Reste im reifen Protein in vier Familien unterteilt. In der a-Chemokin-Unterfamilie werden die ersten zwei der vier Cysteine durch eine einzige Aminosäure getrennt (CXC), wogegen bei den #-Chemokinen die entsprechenden Cystein-Reste aneinander angrenzen (CC). Die a-Chemokine können weiters unterteilt werden in jene, die die ELR-Sequenz im N-Terminus enthalten, wodurch sie für Neutrophile (z. B. IL-8) chemotaktisch sind, und jene, welchen das ELR-Motiv fehlt und die auf Lymphozyten wirken (z.B.
I-TAC). Gemäss der Struktur können die #-Chemokine in zwei Familien unterteilt werden : Mo- nozyten-chemoattraktorische Protein Eotaxin-Familie, die die fünf Monozyten-chemoattraktorischen Proteine (MCP) und Eotaxin enthält, die zu etwa 65% miteinander identisch sind, und die übrigen #-Chemokine. Wie bei der CXC-Familie sind die N-terminalen Aminosäuren, die den CCResten vorangehen, kritische Komponenten für die biologische Aktivität und LeukozytenSelektivität der Chemokine. Im Allgemeinen wirken die #-Chemokine nicht auf Neutrophile, sondern ziehen Monozyten, Eosinophile, Basophile und Lymphozyten mit variabler Selektivität an.
Nur einige wenige Chemokine passen nicht in die CC- oder CXC-Familie. Lymphotactin ist bisher das einzige Chemokin, das nur zwei anstatt der vier charakteristischen Cysteine in seiner primären Struktur aufweist, und es wird deshalb als y- oder C-Chemokin klassifiziert. Anderseits muss abschliessend in dieser Klassifikation Fraktalkin als der einzige Vertreter der ö- oder CXXXCUnterfamilie mit drei Aminosäuren, die die ersten beiden Cysteine trennen, erwähnt werden. Beide, Lymphotaxin und Fractalkin, induzieren die Chemotaxis von T-Zellen und natürlichen Killer-Zellen.
Chemokine induzieren die Zellmigration und-aktivierung, indem sie an eine spezifische Zelloberfläche binden, sieben Transmembran-überspannende (7TM) G-Protein-gekuppelte Rezeptoren an Zielzellen. Achtzehn Chemokin-Rezeptoren wurden bisher kloniert, einschliesslich sechs CXC-, zehn CC-, einem CX3C- und einem XC-Rezeptor. Chemokin-Rezeptoren werden auf verschiedenen Arten von Leukozyten exprimiert, einige von ihnen sind auf bestimmte Zellen eingeschränkt (z. B. ist CXCR1 auf Neutrophile eingeschränkt), wogegen andere in weiterem Umfang
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exprimiert werden (z. B. wird CCR2 auf Monozyten, T-Zellen, natürlichen Killer-Zellen und Basophilen exprimiert). Ähnlich wie Chemokine können die Rezeptoren konstitutiv auf bestimmten Zellen exprimiert werden, wogegen einige induzierbar sind.
Einige davon können sogar abwärts-reguliert sein, was die Zellen auf ein bestimmtes Chemokin nicht reagieren lässt, auf ein anderes jedoch schon. Die meisten Rezeptoren erkennen mehr als ein Chemokin und umgekehrt, jedoch bleibt die Erkennung auf Chemokine der entsprechenden Unterfamilie beschränkt (vgl. Tabelle 1).
Tabelle 1
EMI2.1
<tb>
<tb> Chemokin <SEP> Rezeptor <SEP> chemotaktisch <SEP> für <SEP> entzündliche <SEP> Erkrankungen
<tb> akutes <SEP> RespiratoryDistress-Syndrom <SEP> [71];
<tb> bakterielle <SEP> Pneumonie
<tb> [72];
<tb> CXC- <SEP> CXCR <SEP> 1 <SEP> rheumatoide <SEP> Arthritis
<tb> Chemokin <SEP> IL-8 <SEP> CXCR <SEP> 2 <SEP> Neutrophile <SEP> [73];
<tb> (+ELR-Motiv) <SEP> CXCR2 <SEP> entzündliche <SEP> Darmerkrankung <SEP> [74]; <SEP> Psoriasis
<tb> [75];
<tb> bakterielle <SEP> Meningitis <SEP> [76]
<tb> Asthma <SEP> [77];
<tb> Basophile; <SEP> Monozyten <SEP> ; <SEP> Glomerulonephritis <SEP> [78] <SEP> ;
<tb> aktivierte <SEP> T-Zellen; <SEP> Atherosklerose <SEP> [79] <SEP> ;
<tb> MCP-1 <SEP> CCR <SEP> 2 <SEP> dendritische <SEP> Zellen;
<SEP> natürliche <SEP> entzündliche <SEP> DarmerKiller-Zellen <SEP> krankung <SEP> [80];
<tb> Psoriasis <SEP> [81];
<tb> bakterielle <SEP> und <SEP> virale
<tb> Meningitis <SEP> [82,83]
<tb> CC-Chemokin <SEP> Eosinophile; <SEP> Monozyten <SEP> ;
<tb> CCR <SEP> 1 <SEP> aktivierte <SEP> T-Zellen;
<tb> dendritische <SEP> Zellen
<tb> Eosinophile; <SEP> Basophile; <SEP> Asthma <SEP> [84];
<tb> RANTES <SEP> CCR <SEP> 3
<tb> dendritische <SEP> Zellen <SEP> Glomerulonephritis <SEP> [85]
<tb> Monozyten <SEP> ; <SEP> aktivierte <SEP> TZellen;
<tb> CCR <SEP> 5 <SEP> dendritische <SEP> Zellen;
<tb> natürliche <SEP> Killer-Zellen
<tb>
Chemokine haben zwei Haupt-Interaktionsstellen mit ihren Rezeptoren, einen in der Aminoterminalen Domäne, und die andere innerhalb einer freigelegten Schleife des Gerüsts, das sich zwischen dem zweiten und dem dritten Cystein-Rest erstreckt.
Beide Stellen werden durch die Disulfid-Brücken nahe beieinander gehalten. Der Rezeptor erkennt zuerst die Bindungsstelle
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innerhalb der Schleifen-Region, die als Andock-Domäne zu wirken scheint. Diese Interaktion schränkt die Mobilität des Chemokins ein und erleichtert somit die korrekte Orientierung der Aminoterminalen Domäne. Es wurden Untersuchungen mit mutierten Chemokinen durchgeführt, die noch immer wirksam an ihre Rezeptoren banden, jedoch kein Signal aussendeten. Diese Mutanten wurden durch Aminosäure-Deletion oder-Modifikation innerhalb der N-Termini von beispielsweise IL-8, RANTES und MCP-1 erhalten.
Nach der Rezeptor-Aktivierung erscheinen als Ergebnis der Chemokin-Bindung mehrere intrazelluläre Signalisierungsbahnen. Chemokine interagieren auch mit zwei Arten von nichtsignalisierenden Molekülen. Eines ist der DARC-Rezeptor, der auf Erythrozyten und auf Endothelzellen exprimiert wird und CC- sowie CXC-Chemokine bindet, um sie an der Zirkulation zu hindern. Die zweite Art sind Heparansulfat-Glycosaminoglykane (GAGs), die Teil der Proteoglykane sind und als Co-Rezeptoren von Chemokinen dienen. Sie fangen Chemokine ein und präsentieren sie an der Oberfläche des zielsuchenden Gewebes (z.B. Endothelzellen), um einen lokalen Konzentrationsgradienten zu erstellen.
Bei einer entzündlichen Reaktion, wie bei rheumatoider Arthritis, werden Leukozyten, die auf dem Endothel in einem durch Selektin vermittelten Prozess rollen, in Kontakt mit den durch die Proteoglykane an der Zelloberfläche präsentierten Chemokine gebracht.
Dadurch werden Leukozyten-Integrine aktiviert, was zu einem festen Anhaften und einer Extravasation führt. Die rekrutierten Leukozyten werden durch lokale entzündliche Zytokine aktiviert und können wegen der hohen lokalen Konzentration an Chemokinen für weitere ChemokinSignalisierung desensibilisiert werden. Zur Aufrechterhaltung eines Gewebe-Blutstrom-ChemokinGradienten fungiert der DARC-Rezeptor als ein Auffangbecken für überschüssige Chemokine.
Heparansulfat(HS)-Proteoglykane, die aus einem Kernprotein mit covalent befestigten Glycosaminoglykan-Seitenketten (GAGs) bestehen, findet man bei den meisten Säugerzellen und -geweben. Während der Proteinteil die Lokalisation des Proteoglykans in der Zellmembran oder in der extrazellulären Matrix bestimmt, vermittelt die Glykosaminoglykan-Komponente Interaktionen mit einer Vielfalt extrazellulärer Liganden, wie Wachstumsfaktoren, Chemokine und Adhäsionsmoleküle. Über die Biosynthese von Proteoglykanen wurde schon früher ein umfangreicher Überblick gegeben. Hauptgruppen der Zelloberflächen-Proteoglykane sind die Syndecan-Familie der Transmembran-Proteine (vier Mitglieder bei Säugern) und die Glypican-Familie der Proteine, die an der Zellmembran durch einen Glykosylphosphatidylinosit(GPI)-Schwanz hängen (sechs Mitglieder bei Säugern).
Während die Glypikane im Nervensystem, in der Niere in grossem Umfang und in geringerem Ausmass in Skelettmuskeln und in der glatten Muskulatur exprimiert werden, ist Syndecan-1 das Haupt-HSPG in Epithelzellen, herrscht Syndecan-2 bei Fibroblasten und Endothelzellen vor, ist Syndecan-3 in neuronalen Zellen zahlreich vorhanden und wird Syndecan-4 in grossem Umfang exprimiert. Die Mehrzahl der GAG-Ketten, die den Syndecan-Kern-Proteinen durch eine Tetrasaccharid-Bindungsregion auf bestimmten Serinen hinzugefügt werden, sind HS-Ketten. Obwohl die Aminosäuresequenzen der extrazellulären Domänen bestimmter Syndecan-Typen, im Gegensatz zu den Transmembran- und Zytoplasma-Domänen, bei verschiedenen Spezies nicht konserviert sind, sind die Anzahl und die Positionen der GAG-Ketten sehr konserviert.
Die Struktur der GAGs ist jedoch Spezies-spezifisch und hängt ausserdem vom Wesen des HSPG-exprimierenden Gewebes ab.
Heparansulfat (HS) ist das am zahlreichsten vorkommende Mitglied der Glykosaminoglykan(GAG)-Familie linearer Polysaccharide, die auch Heparin, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat und Keratansulfat inkludiert. Natürlich vorkommendes HS ist durch eine lineare Kette von 20-100 Disaccharid-Einheiten bestehend aus N-Acetyl-D-Glucosamin (GIcNAc) und D-Glukuronsäure (GIcA) gekennzeichnet, welche modifiziert werden können, um N- und O-Sulfatierung mit zu umfassen (6-0- und 3-0-Sulfatierung des Glucosamins und 2-0-Sulfatierung der Uronsäure) sowie Epimerisierung der #-D-Gluronsäure zu a-L-Iduronsäure (IdoA).
Mann nimmt an, dass Cluster von N- und O-sulfatierten Zuckerresten, die durch Bereiche mit niedriger Sulfatierung getrennt sind, hauptsächlich verantwortlich sind für die zahlreichen Proteinbindungs- und regulierenden Eigenschaften von HS. Man glaubt, dass ausser den elektrostatischen Interaktionen der HS-Sulfat-Gruppen mit basischen Aminosäuren auch van der Waals- und hydrophobe Wechselwirkungen an der Proteinbindung beteiligt sind. Weiters scheint das Vorliegen der komformationsmässig flexiblen Iduronat-Reste die GAG-Bindung an Proteine zu begünstigen.
Andere Faktoren, wie der Abstand zwischen den Proteinbindungsstellen, spielen auch eine kriti-
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sche Rolle bei den Protein-GAG-Bindungs-Interaktionen: Beispielsweise erfordert die durch HS induzierte y-Interferon-Dimerisierung GAG-Ketten mit zwei Protein-Bindungssequenzen, die durch eine 7 kDa-Region mit geringer Sulfatierung getrennt sind. Zusätzliche Sequenzen sind manchmal für die volle biologische Aktivität einiger Liganden notwendig : die FGF-2-Signal-Transduktion zu unterstützen, muss HS sowohl die minimale Bindungssequenz sowie zusätzliche Reste aufweisen, von welchen man annimmt, dass sie mit dem FGF-Rezeptor interagieren.
Die Heparin-Bindungsproteine enthalten oft Consensus-Sequenzen, die aus Clustern basischer Aminosäure-Reste bestehen. Lysin, Arginin, Asparagin, Histidin und Glutamin sind häufig an elektrostatischen Kontakten mit den Sulfat- und Carboxyl-Gruppen am GAG beteiligt. Man vermutet, dass der Abstand der basischen Aminosäuren, der manchmal durch die 3-D-Struktur der Proteine bestimmt ist, die GAG-Bindungsspezifität und -affinität steuert. Die biologische Aktivität des Liganden kann auch durch die Kinetik der HS-Protein-Wechselwirkung beeinflusst werden.
Eine Verringerung der Dimension der Wachstumsfaktor-Diffusion ist eine der vorgeschlagenen HSPG-Funktionen, für die der lange, repetitive Charakter der GAG-Ketten sowie ihre relativ raschen Ein- und Aus-Geschwindigkeiten der Protein-Bindung ideal passen. In einigen Fällen treibt eher die Kinetik als die Thermodynamik die physiologische Funktion der HS-Protein-Bindung. Die meisten HS-Liganden benötigen GAG-Sequenzen einer genau bestimmten Länge und Struktur.
Heparin, das von Mast-Zellen erzeugt wird, ist dem Heparansulfat strukturmässig sehr ähnlich, doch ist es durch grössere Mengen an nach der Polymerisation auftretenden Modifikationen gekennzeichnet, die zu einem einheitlichen Sulfatierungsgrad mit einer relativ geringgradigen Unterschiedlichkeit in der Struktur führen. So werden die stark modifizierten Blöcke in Heparansulfat manchmal als "Heparin-artig" bezeichnet. Aus diesem Grund kann Heparin als perfektes HS-Analog für biophysikalische Protein-Studien verwendet werden, da es ausserdem in grösseren Mengen verfügbar und daher weniger teuer als HS ist. Es zeigte sich, dass verschiedene Zelltypen Proteoglykane mit verschiedener Glykosaminoglykan-Struktur synthetisieren, die sich während der Pathogenese, während der Entwicklung oder als Reaktion auf extrazelluläre Signale, wie Wachstumsfaktoren, verändert.
Diese strukturelle Diversität der HSPGs führt zu einer grossen Bindungsvielseitigkeit, was die grosse Bedeutung der Proteoglykane unterstreicht.
Seit dem Nachweis, dass Heparansulfat-Proteoglykane für die FGF-Signalgebung kritisch sind, wurden mehrere Untersuchungen durchgeführt, die die Bedeutung der Chemokin-GAG-Bindung zur Förderung der Chemokin-Aktivität zeigen. Erstens scheinen fast alle bisher untersuchten Chemokine HS in vitro zu binden, was darauf schliessen lässt, dass dies eine fundamentale Eigenschaft dieser Proteine darstellt. Zweitens zeigt die Feststellung, dass T-Lymphozyten in vivo CCChemokine als Komplex mit Glykosaminoglykanen sezernieren, an, dass diese Form der Wechselwirkung physiologisch relevant ist. Weiters ist bekannt, dass die Assoziierung von Chemokinen mit HS mithilft, Konzentrationsgradienten quer über die Endothel-Oberfläche zu stabilisieren und dadurch eine Richtungs-Information für wandernde Leukozyten vorzusehen.
Man nimmt auch an, dass HS Chemokine gegen proteolytischen Abbau schützt und ihre Oligomerisierung induziert und so örtliche hohe Konzentrationen in der Nähe der G-gekoppelten Signalisierungsrezeptoren fördert.
Die funktionelle Relevanz der Oligomerisierung bleibt jedoch umstritten, obwohl alle Chemokine eine eindeutige strukturelle Basis für eine Multimerisierung aufweisen. Eine Dimerisierung durch Assoziierung der #-Blätter wird für alle Chemokine der CXC-Familie (z. B. IL-8) beobachtet, im Gegensatz zu den meisten Mitgliedern der CC-Chemokin-Familie (z. B. RANTES), welche über ihre N-terminalen Stränge dimerisieren.
Umfangreiche Daten haben sich angesammelt über die Hemmung der Interaktion von Chemokinen und ihrer hoch-affinen Rezeptoren an Leukozyten durch Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht. Bei der therapeutischen Behandlung entzündlicher Erkrankungen über diesen Ansatz gab es jedoch keinen Durchbruch.
Interleukin-8 (IL-8) ist ein Schlüsselmolekül, das bei der Anziehung von Neutrophilen bei einer chronischen und akuten Entzündung eine Rolle spielt. Bisher gab es mehrere Ansätze, um die Wirkung von IL-8 zu blockieren, angefangen von der Hemmung der IL-8-Produktion beispielsweise durch Glukokortikoide, Vitamin D3, Cyclosporin A, Transformieren des Wachstumsfaktors #, Interferone, usw., die alle die IL-8-Aktivität auf der Produktionsebene der IL-8-mRNA hemmen. Ein weiterer, zuvor verwendeter Ansatz ist die Hemmung der Bindung von IL-8 an seine Rezeptoren durch Verwendung spezifischer Antikörper entweder gegen den Rezeptor am Leukozyten oder
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gegen IL-8 selbst, damit sie als spezifische Antagonisten fungieren und daher die IL-8-Aktivität hemmen.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Erzeugung neuer GAGBindungs-Proteine sowie alternative GAG-Bindungsproteine vorzusehen, die eine hohe Affinität für einen GAG-Co-Rezeptor aufweisen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist das Vorsehen modifizierter GAG-Bindungsproteine, die als Konkurrenten für Wildtyp-GAG-Bindungsproteine fungieren und die die Aktivität des Wildtyp-GAG-Bindungsproteins hemmen oder nach unten regulieren können, jedoch ohne die Nebenwirkungen, die bei den bekannten, im Stand der Technik verwendeten rekombinanten Proteine auftreten, und die daher die oben erwähnten Nachteile nicht haben.
Ein weiteres Ziel ist die Schaffung eines modifizierten GAG-Bindungsproteins, das bei Arzneistoffen für verschiedene therapeutische Verwendungen verwendbar ist, insbesondere - im Fall der Chemokine - für die Behandlung entzündlicher Erkrankungen ohne die bekannten Nachteile, die bei rekombinanten Chemokinen, die im Stand der Technik bekannt sind, auftreten.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung wird mit einem Verfahren zur Einführung einer GAGBindungsstelle in ein Protein erreicht, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Schritte umfasst : - Identifizieren einer Region in einem Protein, die für die Beibehaltung der Struktur nicht wesent- lich ist, - Einführen mindestens einer basischen Aminosäure in diese Stelle und/oder Deletion mindestens einer sperrigen und/oder sauren Aminosäure an dieser Stelle, wobei diese GAG-Bindungsstelle eine GAG-Bindungsaffinität von Kd # 10 uM, vorzugsweise # 1 uM, noch mehr bevorzugt s 0,1 uM, hat. Durch Einführen mindestens einer basischen Aminosäure und/oder Deletion mindestens einer sperrigen und/oder sauren Aminosäure in diesen Bereich wird eine neue "künstliche" GAG-Bindungsstelle in das Protein eingeführt.
Dies umfasst die neue, vollständige Einführung einer GAG-Bindungsstelle in ein Protein, welches vor der Modifikation keine GAG-Bindungsaktivität aufwies. Es umfasst auch die Einführung einer GAG-Bindungsstelle in ein Protein, welches bereits eine GAG-Bindungsaktivität aufwies. Die neue GAG-Bindungsstelle kann in einen Bereich des Proteins eingeführt werden, der keine GAG-Bindungsaffinität aufwies, sowie einen Bereich, der eine GAG-Bindungsaffinität aufwies. Mit dieser Modifizierung wird jedoch die GAG-Bindungsaffinität des modifizierten Proteins im Vergleich zum WildtypProtein gesteigert.
Der Ausdruck "Einführen mindestens einer basischen Aminosäure" bezieht sich auf das Einführen zusätzlicher Aminosäuren sowie auf die Substitution von Aminosäuren. Der Hauptzweck ist, die relative Menge basischer Aminosäuren, vorzugsweise Arg, Lys, His, Asn und/oder Gin, im Vergleich zur Gesamtmenge an Aminosäuren an dieser Stelle zu erhöhen, wobei die resultierende GAG-Bindungsstelle vorzugsweise mindestens 3 basische Aminosäuren, noch mehr bevorzugt 4, am meisten bevorzugt 5 Aminosäuren umfassen sollte.
Die GAG-Bindungsstelle befindet sich vorzugsweise an einer einem Lösungsmittel exponierten Stelle, z. B. an einer Schleife. Dies gewährleistet eine wirksame Modifikation.
Ob ein Bereich eines Proteins für die Beibehaltung der Struktur wesentlich ist oder nicht, kann z. B. durch Rechenmethoden mit spezifischen Programmen, die dem Fachmann bekannt sind, getestet werden. Nach der Modifikation des Proteins wird die Konformations-Stabilität vorzugsweise in silico getestet.
Der Ausdruck "sperrige Aminosäure" bezieht sich auf Aminosäuren mit langen oder sterisch behindernden Seitenketten ; sind insbesondere Trp, IIe, Leu, Phe, Tyr. Saure Aminosäuren sind insbesondere Glu und Asp. Vorzugsweise ist die resultierende GAG-Bindungsstelle frei von sperrigen und sauren Aminosäuren, was bedeutet, dass alle sperrigen und sauren Aminosäuren entfernt sind.
Die GAG-Bindungsaffinität wird - für den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung - über die Dissoziationskonstante Kd bestimmt. Eine Möglichkeit ist, die Dissoziationskonstanten(Kd)-Werte eines beliebigen Proteins durch die strukturelle Veränderung bei der Liganden-Bindung zu bestimmen. Dem Fachmann sind verschiedene Techniken wohl bekannt, z.B. isothermische FluoreszenzTitrationen, isothermische Titrationskalorimetrie, Oberflächen-Plasmon-Resonanz, Gel-MobilitätsTest und indirekt, durch Konkurrenz-Versuche mit radioaktiv markierten GAG-Liganden. Eine weitere Möglichkeit ist, Bindungsbereiche durch Berechnung mit Rechenmethoden, die ebenfalls
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dem Fachmann bekannt sind, vorauszusagen, wobei mehrere Programme verwendet werden können.
Ein Protokoll zum Einführen einer GAG-Bindungsstelle in ein Protein ist beispielsweise wie folgt: - Identifizieren eines Bereichs des Proteins, welcher für die Beibehaltung der Gesamt-Struktur nicht wesentlich ist und der für eine GAG-Bindung geeignet sein könnte, - Entwerfen einer neuen GAG-Bindungsstelle durch Einführen (Ersetzen oder Insertion) basischer Arg, Lys, His, Asp und Gin-Reste an irgendeiner Position, oder durch Deletion von Aminosäuren, die eine GAG-Bindung stören, - Überprüfen der Konformationsstabilität des resultierenden mutierten Proteins in silico, - Klonieren der Wildtyp-Protein-cDNA (alternativ Kaufen der cDNA), - Verwenden derselben als Matrize für eine PCR-unterstützte Mutagenese zum Einführen der oben genannten Veränderungen in die Aminosäuresequenz,
- Subklonieren des mutierten Gens in ein geeignetes Expressionssystem (prokaryontisch oder eukaryontisch, abhängig von den biologisch erforderlichen post-translationalen Modifikationen), - Exprimieren, Reinigen und Charakterisieren des mutierten Proteins in vitro, - Kriterium für eine eingeführte GAG-Bindungsaffinität: KdGAG (Mutante) < 10 uM.
Beispiele für diese konstruierten Proteine mit neuen GAG-Bindungsstellen sind z. B. der Fc-Teil von IgG sowie die Komplement-Faktoren C3 und C4, die wie folgt, modifiziert sind:
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C4 : (1)MLDAERLK(8) # MKKAKRLK
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Protein, das mit dem erfindungsgemä- #en Verfahren, wie oben beschrieben, erhältlich ist. Das erfindungsgemässe Protein umfasst daher eine - im Vergleich zum Wildtyp-Protein - neue GAG-Bindungsstelle, wie oben definiert, und fungiert daher als Konkurrent mit natürlichen GAG-Bindungsproteinen, insbesondere da die GAGBindungsaffinität des erfindungsgemässen Proteins sehr hoch ist, beispielsweise Kd # 10 uM.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein modifiziertes GAG-Bindungsprotein, wobei eine GAG-Bindungsregion in diesem Protein durch Substitution, Insertion und/oder Deletion mindestens einer Aminosäure modifiziert ist, um die relative Menge der basischen Aminosäuren in dieser GAG-Bindungsregion zu erhöhen und/oder die Menge der sperrigen und/oder sauren Aminosäuren in der GAG-Bindungsregion zu verringern, vorzugsweise an einer für ein Lösungsmittel freiliegenden Position, und dass die GAG-Bindungsaffinität des Proteins im Vergleich zur GAGBindungsaffinität eines entsprechenden Wildtyp-Proteins erhöht ist.
Es zeigte sich überraschender Weise, dass durch Steigerung der relativen Menge basischer Aminosäuren, insbesondere Arg, Lys, His, Asn und Gin, in der GAG-Bindungsregion das modifizierte GAG-Bindungsprotein eine erhöhte GAG-Bindungsaffinität im Vergleich zu den WildtypProteinen aufweist, insbesondere wenn die relative Menge der basischen Aminosäuren an einer einem Lösungsmittel ausgesetzten Stelle erhöht ist, da es sich zeigte, dass eine positiv geladene Fläche an der Protein-Oberfläche die Bindungsaffinität verstärkt. Vorzugsweise sind mindestens 3, noch mehr bevorzugt 4, am meisten bevorzugt 5 basische Aminosäuren in der GAGBindungsregion vorhanden.
Der Ausdruck "GAG-Bindungsprotein" bezieht sich auf jedes Protein, das an einen GAG-CoRezeptor bindet. Ob ein Protein an einen GAG-Co-Rezeptor bindet oder nicht, kann mit Hilfe bekannter Protokolle, wie oben erwähnt, getestet werden.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung ist der Ausdruck "GAG-Bindungsregion" als eine Region definiert, die an GAG mit einer Dissoziationskonstante (Kd-Wert) von unter 100 uM, vorzugsweise unter 50 uM, noch mehr bevorzugt, unter 20 uM, bindet, wie mittels isothermischer Fluorezenz-Titration bestimmt (vgl. nachstehende Beispiele).
Jegliche in der vorliegenden Anmeldung erwähnten Modifikationen können mittels bekannter biochemischer Methoden, beispielsweise stellengerichteter Mutagenese, durchgeführt werden.
Die GAG-Bindungsregion kann durch Substitution, Insertion und/oder Deletion modifiziert sein.
Dies bedeutet, dass eine nicht-basische Aminosäure durch eine basische Aminosäure ersetzt werden kann, eine basische Aminosäure in eine GAG-Bindungsregion insertiert werden kann, oder eine nicht-basische Aminosäure deletiert werden kann. Weiters wird eine Aminosäure, die GAG
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stört, vorzugsweise werden alle störenden Aminosäuren, deletiert. Solche Aminosäuren sind insbesondere sperrige Aminosäuren, wie oben beschrieben, sowie saure Aminosäuren, beispielsweise Glu und Asp. Ob eine Aminosäure eine GAG-Bindung stört oder nicht, kann beispielsweise mit mathematischen oder Rechenmethoden untersucht werden.
Das Ergebnis jeder dieser Modifikationen ist. dass die relative Menge der basischen Aminosäuren in der GAG-Bindungsregion erhöht wird, wobei "relativ" die Menge der basischen Aminosäuren in der GAG-Bindungsregion im Vergleich zur Anzahl aller Aminosäuren in der GAG-Bindungsregion bedeutet. Weiters werden Aminosäuren, die die GAG-Bindung sterisch oder elektrostatisch stören, deletiert.
Ob eine Aminosäure in einer einem Lösungsmittel ausgesetzten Position vorhanden ist oder nicht kann beispielsweise mit Hilfe der bekannten dreidimensionalen Struktur des Proteins oder mit Hilfe von Rechenmethoden, wie oben erwähnt, bestimmt werden.
Ob die GAG-Bindungsaffinität des modifizierten Proteins im Vergleich zur GAG-Bindungsaffinität des entsprechenden Wildtyp-Proteins erhöht ist, kann, wie oben erwähnt, beispielsweise mit Hilfe von Fluoreszenz-Titrationsversuchen festgestellt werden, die die Dissoziationskonstanten bestimmen. Das Kriterium für eine verbesserte GAG-Bindungsaffinität ist Kd (Mutante) < Kd (Wildtyp) um einen Faktor von mindestens 5, vorzugsweise mindestens 10, noch mehr bevorzugt mindestens 100. Die gesteigerte GAG-Bindungsaffinität wird daher vorzugsweise eine Kd von unter 10 uM, bevorzugt unter 1 uM, noch mehr bevorzugt unter 0,1 uM aufweisen.
Durch Steigerung der GAG-Bindungsaffinität wird das modifizierte Protein als spezifischer Antagonist wirken und mit dem Wildtyp-GAG-Bindungsprotein um die GAG-Bindung konkurrieren.
Vorzugsweise wird mindestens eine basische Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arg, Lys und His, in die GAG-Bindungsregion insertiert. Diese Aminosäuren sind leicht in die GAG-Bindungsregion insertiert, wobei sich der Ausdruck "insertiert" auf eine Insertion wie auch das Substituieren jeglicher nicht-basischer Aminosäure mit Arginin, Lysin oder Histidin, bezieht.
Natürlich ist es möglich, mehr als eine basische Aminosäure zu insertieren, wobei dieselbe basische Aminosäure oder auch eine Kombination von zwei oder drei der oben erwähnten Aminosäuren insertiert werden kann.
Mehr bevorzugt ist das Protein ein Chemokin, vorzugsweise IL-8, RANTES oder MCP-1. Von den Chemokinen weiss man, dass sie eine Stelle der Interaktion mit Co-Rezeptor GAG aufweisen, wobei diese Chemokin-Bindung oft eine Bedingung für eine weitere Rezeptor-Aktivierung, wie oben erwähnt, ist. Da man Chemokine häufig bei entzündlichen Erkrankungen findet, ist man sehr daran interessiert, die Chemokin-Rezeptor-Aktivierung zu blockieren. Solche Chemokine sind vorzugsweise IL-8, RANTES oder MCP-1, die gut charakterisierte Moleküle sind und von welchen die GAG-Bindungsregionen gut bekannt sind (vgl. z. B. Lortat-Jacob et al., PNAS 99 (3) (2002), 1229-1234).
Durch Erhöhen der Menge an basischen Aminosäuren in der GAG-Bindungsregion dieser Chemokine wird ihre Bindungsaffinität erhöht, und daher werden die Wildtyp-Chemokine weniger häufig oder gar nicht binden, je nach der Konzentration des modifizierten Proteins in Bezug auf die Konzentration des Wildtyp-Proteins.
Gemäss einem vorteilhaften Aspekt ist die GAG-Bindungsregion eine C-terminale a-Helix. Ein typisches chemisches Monomer ist um ein dreisträngiges antiparalleles #-Blatt organisiert, das von einer C-terminalen a-Helix überlagert ist. Es zeigte sich, dass diese C-terminale a-Helix bei Chemokinen ein wesentlicher Teil ist, der an der GAG-Bindung beteiligt ist, so dass eine Modifikation in dieser C-terminalen a-Helix zur Steigerung der Menge basischer Aminosäuren zu einem modifizierten Chemokin mit einer erhöhten GAG-Bindungsaffinität führt.
Vorteilhaft sind die Positionen 17, 21, 70 und/oder 71 in IL-8 durch Arg, Lys, His, Asn und/oder Gin substituiert. Dabei ist es möglich, dass nur eine dieser zuvor erwähnten Stellen modifiziert ist.
Es können jedoch auch mehr als eine sowie auch alle dieser Stellen modifiziert sein, wobei alle Modifikationen entweder Arg oder Lys oder His oder Asn oder Gin oder eine Mischung derselben sein können. Bei IL-8 zeigte es sich, dass diese Positionen die GAG-Bindungsaffinität von IL-8 stark erhöhen, und daher sind diese Positionen für Modifikationen besonders geeignet.
Vorzugsweise ist die verstärkte Bindungsaffinität eine verstärkte Bindungsaffinität zu Heparansulfat und/oder Heparin. Heparansulfat ist das am reichlichsten vorhandene Mitglied der GAGFamilie der linearen Polysaccharide, die auch Heparin inkludiert. Heparin ist strukturell Heparansulfat sehr ähnlich, durch grössere Mengen von Nachpolymerisations-Modifikationen gekennzeichnet, die zu einem gleichmässig hohen Sulfatierungsgrad mit einer relativ geringgradigen strukturellen
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Unterschiedlichkeit führen. Daher werden die stark modifizierten Blöcke in Heparansulfat manchmal als Heparin-artig bezeichnet und kann Heparin als Heparansulfat-Analog für biophysikalische Protein-Untersuchungen verwendet werden. In jedem Fall sind sowohl Heparansulfat als auch Heparin besonders geeignet.
Noch mehr bevorzugt wird eine weitere biologisch aktive Region modifiziert, wodurch eine weitere biologische Aktivität dieses Proteins inhibiert oder nach unten reguliert wird. Diese weitere biologische Aktivität ist für die meisten GAG-Bindungs-Proteine bekannt, beispielsweise für Chemokine. Dies wird die Bindungsregion zu einem Rezeptor sein, beispielsweise zum 7TM-Rezeptor.
Der Ausdruck "weitere" definiert eine biologisch aktive Region, die nicht die GAG-Bindungsregion ist, die jedoch an andere Moleküle, Zellen oder Rezeptoren bindet und/oder sie aktiviert. Durch Modifizieren dieser weiteren biologisch aktiven Region wird die weitere biologische Aktivität dieses Proteins inhibiert oder nach unten reguliert und dadurch ein modifiziertes Protein vorgesehen, welches ein starker Antagonist zum Wildtyp-Protein ist. Diese bedeutet, dass einerseits die GAGBindungsaffinität höher als im Wildtyp-GAG-Bindungsprotein ist, so dass das modifizierte Protein in grossem Ausmass an GAG binden wird anstatt an das Wildtyp-Protein.
Anderseits ist die weitere Aktivität des Wildtyp-Proteins, die hauptsächlich auftritt, wenn das Protein an GAG gebunden ist, inhibiert oder nach unten reguliert, da das modifizierte Protein diese spezifische Aktivität nicht ausführen wird oder diese Aktivität in geringerem Masse ausführt. Mit diesem modifizierten Protein ist ein wirksamer Antagonist für Wildtyp-GAG-Bindungsproteine vorgesehen, der die von anderen rekombinanten Proteinen bekannten Nebenwirkungen, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind, nicht aufweist.
Diese weitere biologisch aktive Region kann beispielsweise in vitro durch Rezeptor-Konkurrenz-Tests bestimmt werden (unter Verwendung von fluoreszierend markierten wt-Chemokinen, Calcium-Einströmung und Zellmigration (durchgeführt an nativen Leukozyten oder an mit 7TM stabil transfizierten Zelllinien)). Beispiele für solche weitere biologisch aktive Regionen sind zusätzlich zu weiteren Rezeptorbindungsstellen (wie bei der Wachstumsfaktor-Familie) enzymatische Stellen (wie bei Hydrolasen, Lyasen, Sulfotransferasen, N-Deacetylasen und Copolymerasen), Protein-Interaktionsstellen (wie bei Antithrombin III), und Membran-Bindungsdomänen (wie beim Herpes simplex-Virus gD-Protein).
Noch mehr bevorzugt wird diese weitere biologisch aktive Region durch Deletion, Insertion und/oder Substitution, vorzugsweise mit Alanin, einem sterisch und/oder elektrostatisch ähnlichem Rest, modifiziert. Es ist natürlich möglich, mindestens eine Aminosäure in dieser weiteren biologisch aktiven Region entweder zu deletieren oder zu insertieren oder zu substituieren. Es ist jedoch auch möglich, eine Kombination von mindestens zwei dieser Modifikationen oder von allen Dreien davon vorzusehen. Durch Substituieren einer bestimmten Aminosäure mit Alanin oder einem sterisch/elektrostatisch ähnlichem Rest - wobei "ähnlich" heisst, ähnlich der Aminosäure, die substituiert wird - wird das modifizierte Protein nicht oder nur in geringerem Ausmass sterisch/ elektrostatisch modifiziert.
Dies ist besonders vorteilhaft, da andere Aktivitäten des modifizierten Proteins, insbesondere die Affinität zur GAG-Bindungsregion, nicht verändert werden.
Vorteilhaft ist dieses Protein ein Chemokin und die weitere biologische Aktivität eine Leukozyten-Aktivierung. Wie oben erwähnt, sind Chemokine an der Leukozytenattraktion während einer chronischen und akuten Entzündung beteiligt. Daher wird durch Inhibierung oder AbwärtsRegulieren der Leukozyten-Aktivierung die Entzündung vermindert oder gehemmt, was dieses besondere modifizierte Protein zu einem wichtigen Werkzeug für die Untersuchung, Diagnostizierung und Behandlung entzündlicher Erkrankungen macht.
Gemäss einem vorteilhaften Aspekt ist dieses Protein IL-8 und befindet sich die weitere biologisch aktive Region innerhalb der ersten 10 N-terminalen Aminosäuren. Die ersten N-terminalen Aminosäuren sind an der Leukozyten-Aktivierung beteiligt, wobei insbesondere Glu-4, Leu-5 und Arg-6 als wesentlich für die Rezeptor-Bindung und-Aktivierung identifiziert wurden. Daher können entweder diese drei oder sogar alle ersten 10 N-terminalen Aminosäuren substituiert oder deletiert werden, um die Rezeptor-Bindung und-Aktivierung zu inhibieren oder nach unten zu regulieren.
Ein weiteres vorteilhaftes Protein ist eine IL-8-Mutante, bei welcher die ersten 6 N-terminalen Aminosäuren deletiert sind. Wie oben erwähnt, wird diese Mutante nicht oder nur in geringerem Ausmass Leukozyten binden und aktivieren, so dass sie für die Untersuchung, Diagnostizierung und Behandlung entzündlicher Erkrankungen besonders geeignet ist.
Vorzugsweise ist das Protein eine IL-8-Mutante ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
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de16F17RE70KN71 R, del6F17RE70RN71K und de16E70KN71 K. Diese Mutanten erwiesen sich als besonders vorteilhaft, da die Deletion der ersten 6 N-terminalen Aminosäuren die RezeptorBindung und-Aktivierung besonders inhibiert oder nach unten reguliert. Weiters zeigte es sich, dass die beiden Phenylalanine in Position 17 und 21 zuerst in Kontakt mit dem Rezeptor an seiner N-terminalen extrazellulären Domäne treten, um die spätere Aktivierung des Rezeptors zu erleichtern.
Um jeglichen Neutrophilen-Kontakt zu verhindern, werden diese beiden Aminosäuren 17 und 21 ausgetauscht, wobei sie zu basischen Aminosäuren umgetauscht werden, da sie sehr nahe beim GAG-Bindungs-Motiv der C-terminalen a-Helix sind, wie man an einem dreidimensionalen Modell eines Proteins sehen kann. Durch Austauschen der Positionen 17 und/oder 21 entweder gegen Arginin oder gegen Lysin, wird die GAG-Bindungs-Affinität daher gesteigert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Polynukleinsäuremolekül, das für das erfindungsgemässe Protein, wie oben beschrieben, kodiert. Die Polynukleinsäure kann eine DNA oder RNA sein. Dabei werden die Modifikationen, die zum erfindungsgemäss modifizierten Protein führen, auf DNA- oder RNA-Ebene durchgeführt. Dieses erfindungsgemässe isolierte Polynukleinsäuremolekül ist für diagnostische Verfahren sowie auch zur Gentherapie und zur Herstellung des erfindungsgemäss modifizierten Proteins in grosstechnischem Massstab geeignet.
Noch mehr bevorzugt hybridisiert das isolierte Polynukleinsäuremolekül mit dem oben definierten erfindungsgemässen Polynukleinsäuremolekül unter stringenten Bedingungen. Je nach den Hybridisierungsbedingungen bilden sich komplementäre Duplexe zwischen den beiden DNA- oder RNA-Molekülen, indem sie entweder perfekt zusammenpassen oder auch nicht zusammenpassende Basen umfassen (vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989). Sonden, die mehr als etwa 50 Nukleotide lang sind, können bis zu 25 bis 30% nicht zusammenpassende Basen enthalten. Kleinere Sonden enthalten weniger Fehlpaarungen.
Die Neigung eines Targets und einer Sonde zur Bildung von Duplexen, die fehlerhafte Basenpaarungen enthalten, wird durch die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen gesteuert, die selbst von Faktoren, wie der Konzentration von Salz oder Formamid im Hybriddisierungspuffer, der Temperatur der Hybridisierung und den Nach-Hybridisierungs-Waschbedingungen, abhängig ist. Durch die Anwendung wohl bekannter Prinzipien, die bei der Bildung von Hybrid-Duplexen auftreten, können Bedingungen, die die gewünschte Stringenz aufweisen, vom Fachmann durch eine Auswahl aus einer Vielfalt von Hybridisierungspuffern, Temperaturen und Waschbedingungen erreicht werden. So können Bedingungen gewählt werden, die die Detektion von entweder perfekt zusammenpassenden oder teilweise fehlerhaft zusammenpassenden Hybrid-Duplexen ermöglichen.
Die Schmelztemperatur (Tm) eines Duplexes ist für die Auswahl passender Hybridisierungsbedingungen nützlich. Zu stringenten Hybridisierungsbedingungen für Polynukleotidmoleküle mit einer Länge von mehr als 200 Nukleotiden zählt typischer Weise die Hybridisierung bei einer Temperatur von 15-25 C unter der Schmelztemperatur des erwarteten Duplexes. Für Oligonukleotid-Sonden mit über 30 Nukleotiden, die weniger stabile Duplexe bilden als längere Sonden, wird eine stringente Hybridisierung üblicherweise durch Hybridisieren bei 5 bis 10 C unter der Tm erreicht. Die Tm eines Nukleinsäure-Duplexes kann unter Verwendung einer Formel auf Basis der in den Nukleinsäuren enthaltenen Prozent G+C, welche die Kettenlängen berücksichtigt, berechnet werden, wie die Formel Tm = 81,5-16,6 (log [Na+]) + 0,41 (% G+C) - (600/N), worin N = Kettenlänge.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, welcher ein isoliertes DNA-Molekül gemäss der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, umfasst. Der Vektor umfasst alle regulierenden Elemente, die für eine effiziente Transfektion sowie für eine effiziente Expression von Proteinen notwendig sind. Solche Vektoren sind auf dem Gebiet wohl bekannt, und jeder geeignete Vektor kann zu diesem Zweck ausgewählt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine rekombinante Zelle, die mit einem erfindungsgemässen Vektor, wie oben beschrieben, stabil transfiziert ist. Eine solche rekombinante Zelle sowie jegliche davon abstammende Zelle umfasst den Vektor. Dabei wird eine Zelllinie vorgesehen, die, je nach dem Vektor, das modifizierte Protein entweder kontinuierlich oder bei Aktivierung exprimiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Protein, eine Polynukleinsäure oder einen Vektor gemäss der vorliegenden Erfindung, wie oben definiert, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst. Natürlich kann
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die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzliche Substanzen, die üblicherweise in pharmazeutischen Zusammensetzungen vorhanden sind, aufweisen, wie Salze, Puffer, Emulgatoren, Farbstoffe etc.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des modifizierten Proteins, einer Polynukleinsäure oder eines Vektors gemäss der vorliegenden Erfindung, wie oben definiert, bei einem Verfahren zur Inhibierung oder Unterdrückung der biologischen Aktivität des entsprechenden Wildtyp-Proteins. Wie oben erwähnt, wirkt das modifizierte Protein als Antagonist, wobei die Nebenwirkungen, die bei bekannten rekombinanten Proteinen auftreten, beim erfindungsgemässen modifizierten Protein nicht auftreten. Im Fall von Chemokinen ist dies insbesondere die biologische Aktivität, die bei entzündlichen Reaktionen eine Rolle spielt.
Daher liegt eine weitere Verwendung des modifizierten Proteins, der Polynukleinsäure oder des Vektors gemäss der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer entzündlichen Erkrankung. Insbesondere wenn das modifizierte Protein ein Chemokin ist, wirkt es als Antagonist ohne Nebenwirkungen und ist für die Behandlung einer entzündlichen Erkrankung besonders geeignet. Daher ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren zur Behandlung einer entzündlichen Erkrankung, wobei ein modifiziertes Protein gemäss der vorliegenden Erfindung, das isolierte Polynukleinsäuremolekül oder der Vektor gemäss der vorliegenden Erfindung oder eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung einem Patienten verabreicht wird.
Vorzugsweise ist die entzündliche Erkrankung ausgewählt aus einer Gruppe umfassend rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Osteoarthritis, Asthma, Alzheimer-Krankheit und Multiple Sklerose. Da die Aktivierung durch Chemokine mit einem modifizierten Protein gemäss der vorliegenden Erfindung inhibiert werden kann, können entzündliche Reaktionen inhibiert oder nach unten reguliert werden, wobei die oben erwähnten entzündlichen Erkrankungen verhindert oder behandelt werden können.
Die vorliegende Erfindung ist mit Hilfe der folgenden Beispiele und Figuren, auf welche die Erfindung jedoch nicht eingeschränkt ist, näher beschrieben, worin
Fig. 1 ein CD-Spektrum ist;
Fig. 2 den Sekundär-Struktur-Gehalt verschiedener Mutanten zeigt;
Fig. 3 und 4 graphische Darstellungen der Ergebnisse von Fluoreszenz-Anisotropie-Tests verschiedener Mutanten zeigen;
Fig. 5 die graphische Darstellung der Ergebnisse von isothermischen Fluoreszenz-Titrationen zeigt ;
Fig. 6 die graphische Darstellung der Ergebnisse von Entfaltungs-Versuchen verschiedener Mutanten zeigt,
Fig. 7 Chemokine und ihre GAG-Bindungsregionen zeigt, und
Fig. 8 Proteine mit ihren GAG-Bindungsregionen zeigt.
BEISPIELE
Beispiel 1: Erzeugung rekombinanter IL-8-Gene und Klonierung der Mutanten
Die Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Technik wurde zur Erzeugung der gewünschten cDNAs für die Mutanten verwendet, indem die Mutationen unter Verwendung von sense- und antisenseMutagenese-Primern eingeführt wurden. Ein synthetisches Plasmid, das die cDNA für wtlL-8 enthielt, wurde als Matrize verwendet, Clontech Advantage 2 Polymerase Mix als DNAPolymerase aufgetragen, und die PCR-Reaktion unter Verwendung eines Mastergradient Cycler von Eppendorf durchgeführt.
Die verwendeten Mutagenese-Primer sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst, beginnend mit den vorwärts-Sequenzen (5' nach 3'): # CACC ATG TGT CAG TGT ATA AAG ACA TAC TCC (Primer für die Mutation A6) # CACC ATG TGT CAG TGT ATA AAG ACA TAC TCC AAA CCT AGG CAC CCC AAA AGG ATA (Primer für die Mutation A6 F17R F21 R) Die rückwärts-Sequenzen sind (5' nach 3'):
# TTA TGA ATT CCT AGC CCT CTT (Primer für die Mutation E70R) # TTA TGA ATT CTT AGC CCT CTT (Primer für die Mutation E70K) # TTA TGA CTT CTC AGC CCT CTT (Primer für die Mutation N71 K)
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# TTA TGA CTT CTT AGC CCT CTT (Primer für die Mutation E70K N71 K) # TTA TGA CTT CCT AGC CCT CTT (Primer für die Mutation E70R N71 K) # TTA TGA CCT CTT AGC CCT CTT (Primer für die Mutation E70K N71 R) # TTA TGA CCT CCT AGC CCT CTT (Primer für die Mutation E70R N71 R)
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und in TOP10F-kompetente E. coli (Invitrogen) transformiert.
Als nächster Schritt wurde eine Bestätigung der Sequenz durch Doppelstrang-DNA-Sequenzierung unter Verwendung eines ABI PRISM CE1-Sequencer durchgeführt.
Beispiel 2 : Expression und Reinigung der rekombinanten Proteine
Sobald die Sequenzen bestätigt waren, wurden die Konstrukte in Calcium-kompetente BL21(DE3) E. coli zwecks Expression transformiert. Zellen wurden unter Schütteln in 1 I Lennox Broth (Sigma), enthaltend 100 g/ml Ampicillin bei 37 C gezüchtet, bis eine OD600 von etwa 0,8 erreicht worden war. Die Induktion der Protein-Expression erfolgte durch Zugabe von Isopropyl-#- D-thiogalactopyranosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM. Vier Stunden später wurden die Zellen durch 20minütiges Zentrifugieren bei 6000 g geerntet. Das Zell-Pellet wurde danach in einem Puffer, der 20 mM TRIS/HCI, 50 mM NaCI, pH 8, enthielt, resuspendiert, bei 100 Watt 5x20 s lang mit Ultraschall behandelt und schliesslich wiederum 20 min lang bei 10. 000 g zentrifugiert.
Da man die Hauptfraktion der rekombinanten IL-8-Proteine in Einschlusskörpern fand, wurden für die weitere Reinigung denaturierende Bedingungen gewählt. Daher wurde das ZellPellet in einem Puffer aus 6 M Gua/HCI und 50 mM MES, pH 6,5, resuspendiert. Die Suspension wurde dann bei 4 C 4 h lang gerührt, gefolgt von einem Dialyse-Schritt gegen 50 mM MES, pH 6,5.
Die resultierende Suspension wurde dann zentrifugiert und filtriert, um auf eine starke KationenAustauscher-Säule (SP Sepharose von Pharmacia Biotech) geladen zu werden. Die Elution wurde mit einem linearen Gradienten von OM-1M NaCI in einem 50 mM MES-Puffer, pH 6,5, während 60 min vorgenommen. Nach dem Lyophilisieren der das gewünschte Protein enthaltenden Fraktionen wurde ein zweiter Reinigungsschritt durch reverse-Phasen-HPLC unter Verwendung einer C18-Säule durchgeführt. In diesem Fall wurde ein nicht-linearer Gradient von 10%-90% Acetonitril gewählt, um das gewünschte Protein zu eluieren. Eine erneute Faltung des denaturierten Proteins wurde schliesslich durch dieselbe Kationen-Austauscher-Säule unter den selben Bedingungen, wie oben beschrieben, erreicht.
Das Protein wurde dann auf Reinheit und Identität mittels Silberfärbungs-Analyse im ersten Fall und Western Blot-Analyse unter Verwendung eines spezifischen monoklonalen Antikörpers gegen wtlL-8 im zweiten Fall überprüft. Die erneute Faltung der Proteine wurde ebenfalls durch Circulardichroismus (CD)-Messungen bestätigt.
Beispiel 3 : Biophysische Charakterisierung der Mutanten
3.1 Circulardichroismus-Messungen und Analyse
Um Sekundär-Struktur-Veränderungen des mutierten Proteins in Anwesenheit und Abwesenheit von Heparansulfat (HS) zu untersuchen, wurde eine CD-Spektroskopie durchgeführt. Die Messungen wurden auf einem Jasco J-710-Spektropolarimeter über einen Bereich von 195-250 nm aufgezeichnet, und eine Zelle mit 0,1 cm Weglänge wurde verwendet. Die Spektren der Proteinlösungen mit einer Konzentration von 5 uM wurden mit einer Reaktionszeit von 1 s, Schritt-Auflösung von 0,2 nm, Geschwindigkeit von 50 nm/min, Bandbreite von 1 nm und einer Empfindlichkeit von 20 mdeg aufgezeichnet. Drei Scans wurden gemittelt, um glatte Spektren zu ergeben. Die Protein-Spektren wurden dann auf den Hintergrund korrigiert in Bezug auf das CDSignal entweder des Puffers selbst oder von Puffer/HS.
Die Sekundär-Struktur-Analyse des Proteins in Anwesenheit und Abwesenheit von HS wurde schliesslich unter Verwendung des Programms SELCON vorgenommen.
Da viele Aminosäuren bei einigen neuen Kombinationen verändert waren, versuchte man die Grössen der resultierenden Sekundär-Struktur-Veränderungen durch CirculardichroismusMethoden herauszufinden.
Je nach den eingeführten Mutationen wurden verschiedene Strukturen erhalten. Abgesehen von einer exprimierten Mutante (A6 F17R F21 R E70K N71 R), welche keinerlei Struktur aufwies,
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zeigten alle Mutanten messbare a-Helices, #-Blätter und Schleifen. Im Vergleich zu IL-8wt, zeigte nur eine Mutante (#6 E70R) eine nahezu ähnliche Struktur, wogegen sich die anderen hauptsächlich in ihrer a-Helix unterschieden, welche im Bereich von 17,2% bis 45,2% der Gesamtstruktur lag. Trotzdem legt diese Tatsache nahe, dass die Gesamtstruktur von IL-8wt trotz der vielen Veränderungen innerhalb der Proteinsequenz erhalten blieb. Dies war zuvor nicht vorhersehbar.
Nachdem man bereits festgestellt hatte, dass nur Heparansulfat-Oligosaccharide - und nicht Heparin - die IL-8wt-Sekundär-Struktur beeinflussen konnte, richtete man das Hauptaugenmerk auf die von nicht-fraktioniertem Heparansulfat induzierten Wirkungen. Alle untersuchten Mutanten wiesen Strukturveränderungen nach HS-Bindung auf, was als Beweis für eine Komplexbildung angesehen werden kann.
Um die Strukturveränderungen nach Einführung von Mutationen und Zusatz von Heparansulfat zu demonstrieren, sind einige der erhaltenen Daten in den voranstehenden graphischen Darstellungen und nachstehend zusammengefasst.
3. 2 Fluoreszenz-Messungen
Zur Untersuchung von Konzentrations- und Liganden-abhängigen quaternären Strukturveränderungen wurde eine Fluoreszenz-Spektroskopie durchgeführt. Infolge ihrer hochgradigen Empfindlichkeit, bei welcher nur Nanogramm-Mengen an Protein notwendig sind, war die FluoreszenzTechnik die Methode der Wahl für die Durchführung der gewünschten Untersuchungen. Die Messungen wurden unter Verwendung eines Perkin-Elmer (Beaconsfield, England) LS50B-Fluorometers vorgenommen.
3. 3 Fluoreszenz-Anisotropie
Durch Aufzeichnung der Konzentrations-abhängigen Fluoreszenz-Anisotropie des Chemokins, welche sich aus dem extrinsischen Chromophor bisANS ergab, zielte man darauf ab, die Dimerisations-Konstante der Mutanten herauszufinden. Die Messungen wurden in PBS durchgeführt, wobei man mit hohen Konzentrationen (bis zu 4 uM Protein) begann, gefolgt von einer stufenweisen Verdünnung. Für jeden Datenpunkt wurde das bei 507 nm aufgezeichnete Anisotropie-Signal (r) während 60 sec gemittelt.
Es wurde berichtet, dass die IL-8-Oligomerisation die GAG-Bindungseigenschaften der Proteine relevant beeinflusst. Auf eine monomere Konzentration eingestellt, band IL-8 grössenmässig definierte Oligosaccharide 1000-fach stärker als bei dimerer Konzentration. Daher wurden die Oligomerisationseigenschaften der IL-8-Mutanten durch Fluoreszenz-Anisotropie untersucht. Da das intrinsische IL-8-Fluorophor (Trp57) nicht empfindlich genug für alle Mutanten war, wurde das extrinsische Fluorophor bis-ANS für diese Messungen verwendet. Wiederum zeigte, wie schon bei der Sekundär-Struktur bemerkt worden war, die Mutante A6 E70R eine starke Ähnlichkeit auch bei
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E70RN71 K.
Frühere Untersuchungen identifizierten die #-Blätter als die hauptsächlich am Dimerisationsprozess beteiligten, eine Tatsache, die mit den vorliegenden Ergebnissen für die SekundärStruktur für diese Mutante korreliert, welche einen sehr geringen Anteil an #-Blatt von nur 11,4% aufwies. Es zeigte sich, dass die Mutante mit der geringsten koligo (koligo=147nM) A6 F17RF21R E70K war, welches wiederum von allen untersuchten Mutanten den höchsten Anteil an #-Blatt- Struktur aufwies (29,8%). Auch die Auswirkung des Heparansulfat-Zusatzes wurde beobachtet.
Wie bei IL-8wt, wo das Heparansulfat eine Verschiebung der Oligomerisations-Konstanten auf viel höhere Werte (koligo=1,075 M) bewirkte, zeigte sich dies auch für die untersuchten IL-8-Mutanten.
A6 F17RF21R E70K verschob sich von 0,147uM zu 1,162uM, und die Mutante A6 E70R von 0,350uM zu 1,505 M in Anwesenheit von Heparansulfat. Einige der erzielten Resultate sind in den Fig. 3 und 4 dargestellt, wobei Fig. 3 die Abhängigkeit der Fluoreszenz-Anisotropie der IL-8Mutanten in PBS von der Chemokin-Konzentration zeigt, und Fig. 4 die Abhängigkeit der Fluoreszenz-Anisotropie von A6 F17RF21 R E70K in PBS von der Chemokin-Konzentration in Anwesenheit (zehnfacher Überschuss) und Abwesenheit von HS ((pc = 10 xy Überschuss) Proteinkonzentration).
3. 4 Isotherme Fluoreszenz-Titrations(IFT)-Versuche
Dissoziationskonstanten (Kd-Werte) sind ein Mass für die Bindungsaffinität eines Liganden zu einem Protein, und daher wurde eine konzentrationsabhängige Veränderung der FluoreszenzEmissionseigenschaften des Proteins (Fluoreszenz-"Quenching") nach Ligandenbindung für die
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Bestimmung von Kd verwendet. Da diese Mutanten ein intrinsisches Tryptophan-Chromophor enthalten, welches sich an oder nahe der vorgeschlagenen GAG-Bindungsstelle befindet und daher für Strukturveränderungen nach Ligandenbindung empfindlich sein sollte, schienen sich die IFT-Versuche für diese Art von Untersuchung zu eignen. Die Fluoreszenz-Intensitäts-Titration wurde in PBS durchgeführt, wobei eine Proteinkonzentration von 700 nM verwendet wurde.
Die Emission der Proteinlösung nach Anregung bei 282 nm wurde über einen Bereich von 300-400 nm nach der Zugabe eines Aliquots des entsprechenden GAG-Liganden und einem Equilibrierungszeitraum von 60 sec aufgezeichnet.
Die Bindung an nicht fraktioniertes Heparin und Heparansulfat wurde untersucht. Die Mutanten wurden auf eine dimere Konzentration eingestellt, um eine ausreichende Empfindlichkeit zu gewährleisten. Ein Quenchen der Trp57-Fluoreszenz-Intensität nach GAG-Bindung wurde in einem Bereich von 25-35% registriert. Es wurde eine signifikante Verbesserung der Ligandenbindung beobachtet, insbesondere für die Heparinbindung. A6 F17RN71 R E70K (Kd=14nM) und A6 F17RF21 R N71 K (Kd=14,6nM) zeigten eine 2600fach bessere Bindung, und A6 E70K N71 K (Kd=74nM) eine 1760fach bessere Bindung im Vergleich zu IL-8wt (Kd=37 M). Gute Ergebnisse wurden auch für die Heparansulfatbindung erzielt.
Für A6 F17RN71 R E70K fand man eine Kd von 107nM, für A6 F17RF21 R N71 K war die Kd 95nM, und die Mutante A6 E70K N71 K zeigte eine Kd von 34nM. Da IL-8wt mit einer Kd von 4,2uM bindet, stellen die für die Mutanten gefundenen KdS eine ausserordentliche Verbesserung der Bindung dar, vgl. Fig. 5.
3. 5 Entfaltungsversuche
Um eine Information über die Proteinstabilität und ob diese Stabilität nach GAG-LigandenBindung verändert würde, zu erhalten, wurden Entfaltungsversuche unternommen. Wie oben erwähnt, sind die Fluoreszenz-Techniken für die Beobachtung quaternärer Strukturveränderungen sehr empfindlich und sind daher auch die Methode der Wahl für die Untersuchung thermischer Strukturveränderungen des Proteins. Die Messungen wurden, wie für die IFT beschrieben, durchgeführt, bei welcher nicht die Ligandenkonzentration verändert wurde, sondern die Temperatur. Die Proteinstruktur wurde bei einer Konzentration von 0,7uM ab Temperaturen von 15 - 85 C in Abwesenheit und Anwesenheit eines 10fachen Überschusses von Heparansulfat oder Heparin beobachtet.
Das Emissionsmaximum der Proteine reichte von 340 nm bis 357 nm, Werte, die für einen einem Lösungsmittel ausgesetzten Tryptophan-Rest typisch sind. Bei einem Beginn der Entfaltungsversuche bei 15 C variierte das Emissionsmaximum der Mutanten zwischen 340 nm - 351 nm. Im Vergleich zu IL-8wt, dessen Emissionsmaximum bei 340 nm beobachtet wurde, bedeutet dies etwas höhere Werte. Nach einer Erhöhung der Temperatur nahm die Intensität des Emissionsmaximums ab, begleitet von einer Verschiebung des Maximums entweder zu einer höheren oder zu einer niedrigeren Wellenlänge.
Das Emissionsmaximum von A6 E70R und A6 E70K N71 K verschob sich von 352,5nm-357nm und 343nm-345nm, was für eine weitere Einwirkung von Lösungsmittel auf den Trp57-Rest durch die Temperatursteigerung typisch ist, doch interessanterweise zeigten die Mutanten A6 F17RN71 R E70K und #6 F17RF21 R E70R N71 K eine Blauverschiebung im Bereich von 350nm - 343nm und weniger ausgeprägt von 350nm - 348nm (vgl. Fig. 6).
Durch langsame Verringerung der Temperatur war der Prozess der Entfaltung teilweise reversibel in Bezug auf sowohl die Wellenlängenverschiebung als auch die Intensitätsveränderungen. Die Zugabe eines 5fachen Überschusses von Heparansulfat führte zu einer Erhöhung der Stabilität des Proteins, vermutlich durch Komplexbildung. Dies konnte einerseits durch eine Verschiebung des Schmelzpunkts auf eine höhere Temperatur, und anderseits durch eine signifikant weniger ausgeprägte Verschiebung des Emissionsmaximums bei Temperatursteigerung beobachtet werden.
Beispiel 4 : Proteine mit GAG-Bindungs-Regionen
Mit Bioinformatik- und proteomischen Mitteln wurden GAG-Bindungsproteine gemeinsam mit ihren GAG-Bindungsregionen charakterisiert. In Fig. 7 sind Chemokine mit ihren GAG-Bindungsregionen gezeigt, und in Fig. 8 sind Beispiele für andere Proteine, ebenfalls mit ihren GAGBindungsregionen, angegeben.