ES2572779T3 - Remodelación y glucopegilación del Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF) - Google Patents

Remodelación y glucopegilación del Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF) Download PDF

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Abstract

Un conjugado de Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF) que comprende: un péptido FGF-20 mutante que comprende un sitio de glucosilación unido a N o unido O recién introducido que no existe en el Factor 20 de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre correspondiente, en donde el Factor 20 de Crecimiento de Fibroblastos mutante tiene una secuencia de aminoácidos del Factor 20 de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre correspondiente que es al menos el 95 % homóloga a la SEQ ID NO: 1; y en donde el sitio de glucosilación unido a N o unido a O recién introducido tiene una separación inferior a 4 aminoácidos de un resto de prolina en el lado C o N terminal del resto de prolina, en donde el resto de prolina se localiza en la posición 3, 28, 29, 34, 35, 52, 81, 175, 192, 197, o 201 de la SEQ ID NO: 1; y un grupo modificador, en donde dicho grupo modificador está ligado de manera covalente a dicho péptido en un resto de glucosilo o de aminoácido preseleccionado de dicho péptido a través de un grupo de unión de glucosilo intacto, concretamente un grupo de unión de glucosilo en que el monómero sacárido que une el grupo modificador con el resto de la molécula no está degradado.

Description

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Las expresiones “ácido nucleico” o “polinucleótido” se refieren a ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o a ácidos ribonucleicos (ARN) y a polímeros de los mismos en forma mono o bicatenaria. A menos que se limite específicamente, las expresiones incluyen ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de una manera similar a la de los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular también incluye implícitamente sus variantes modificadas de manera conservativa (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), alelos, ortólogos, SNP y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados puede realizarse generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más (o todos) codones seleccionados se sustituye con restos mixtos de bases y/o desoxiinosina (Batzer y col., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka y col., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); y Rossolini y col., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)). La expresión ácido nucleico se usa indistintamente con gen, ADNc y ARNm codificado por un gen.
El término “gen”, significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica. Puede incluir regiones delante y detrás de la región codificante (líder y remolque) así como secuencias intercaladas (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).
El término “aislado”, cuando se aplica a un ácido nucleico o a una proteína, significa que el ácido nucleico o la proteína carece esencialmente de otros componentes celulares con los que se asocia en el estado natural. Está preferiblemente en un estado homogéneo aunque puede estar en solución deshidratada o acuosa. La pureza y homogeneidad se determinan típicamente usando técnicas químicas analíticas tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alto rendimiento. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación está sustancialmente purificada. En particular, un gen aislado se separa de las fases de lectura abierta que flanquean el gen y codifican una proteína distinta del gen de interés. El término “purificado” significa que un ácido nucleico o una proteína genera esencialmente una banda en un gel electroforético. Particularmente, significa que el ácido nucleico o la proteína tiene una pureza de al menos 85 %, más preferiblemente una pureza de al menos 95 %, y lo más preferiblemente una pureza de al menos 99 %.
El término “aminoácido” se refiere a aminoácidos de origen natural y sintético, así como a análogos de aminoácido y miméticos de aminoácido que funcionan de un modo similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son los codificados por el código genético, así como los aminoácidos que se modifican después, por ejemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácido se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono α que está unido a un hidrógeno, a un grupo carboxilo, a un grupo amino y a un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos peptídicos modificados, pero conservan la misma estructura química básica que la de un aminoácido de origen natural. Los análogos de aminoácido descritos en las siguientes solicitudes de patente pueden incorporarse en los conjugados peptídicos FGF y secuencias de FGF mutantes de la invención: Solicitud de Patente de Estados Unidos n.º 11/094677 (presentada el 29 de marzo de 2005); 11/094676 (presentada el 29 de marzo de 2005); 11/093798 (presentada el 29 de marzo de 2005); 11/093797 (presentada el 29 de marzo de 2005); 11/093597 (presentada el 29 de marzo de 2005); 10/965218 (presentada el 13 de octubre de 2004); 11/093797 (presentada el 29 de marzo de 2005); 11/009635 (presentada el 10 de diciembre de 2004); 11/016348 (presentada el 16 de diciembre de 2004); 10/825867 (presentada el 16 de abril de 2004); 10/826919 (presentada el 16 de abril de 2004); y 10/686944 (ahora Patente de Estados Unidos n.º 6.927.042, expedida el 9 de agosto de 2005). Los procedimientos descritos en estas solicitudes también pueden usarse para producir los conjugados peptídicos FGF y secuencias FGF mutantes de la invención. “Miméticos de aminoácido” se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente a la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de un modo similar a como lo hace un aminoácido de origen natural.
En la técnica hay diversos procedimientos conocidos que permiten la incorporación de un derivado o análogo de aminoácido no natural en una cadena polipeptídica de una manera específica de sitio, véase, por ejemplo, el documento WO 02/086075.
En la presente memoria, los aminoácidos pueden denominarse por los símbolos de tres letras comúnmente conocidos y por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Del mismo modo, los nucleótidos pueden denominarse por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
Las “variantes modificadas de manera conservativa” se aplican tanto a secuencias de aminoácidos como de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácido nucleico en particular, las “variantes modificadas de manera conservativa” se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en las que el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, con respecto a las secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, todos los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Por tanto, en cada posición donde se especifique una alanina mediante un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son “variaciones silenciosas”, que son una especie de variaciones
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modificadas de manera conservativa. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente memoria que codifica un polipéptido, también describe cualquier posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que en un ácido nucleico, cada codón (excepto AUG, que es habitualmente el único codón de la metionina, y TGG que es habitualmente el único codón del triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.
Al igual que para las secuencias de aminoácidos, un experto en la técnica reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales en una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altere, añada o suprima un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada, es una “variante modificada de manera conservativa”, donde la alteración produce la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. En la técnica se conocen bien las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Dichas variantes modificadas de manera conservativa son, además de y sin excluir las variantes polimórficas, homólogos entre especies, y alelos de la invención.
Cada uno de los siguientes ocho grupos contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:
1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), ácido Glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (I), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M)
(Véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).
En la presente memoria, los aminoácidos pueden denominarse por los símbolos de tres letras comúnmente conocidos y por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Del mismo modo, los nucleótidos pueden denominarse por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados.
En la presente solicitud, los restos de aminoácido se numeran según sus posiciones relativas desde el resto más N terminal, que se numera como 1, en una secuencia polipeptídica de tipo silvestre no modificada.
“Próximo a un resto de prolina”, como se emplea en esta memoria, se refiere a un aminoácido que tiene una separación de menos de aproximadamente 10 aminoácidos de un resto de prolina, preferiblemente, una separación de menos de aproximadamente 9, 8, 7, 6 o 5 aminoácidos de un resto de prolina, más preferiblemente, una separación de menos de aproximadamente 4, 3, 2 o 1 resto de prolina. El aminoácido “próximo a un resto de prolina” puede estar en el lado C o N terminal del resto de prolina.
En la presente memoria, “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan indistintamente para referirse a un polímero donde los monómeros son aminoácidos y se unen mediante enlaces amida, denominados como alternativa, polipéptido. Adicionalmente, también se incluyen aminoácidos no naturales, por ejemplo, β-alanina, fenilglicina y homoarginina. Los aminoácidos que no están codificados por genes también pueden usarse en la presente invención. Además, los aminoácidos que se han modificado para incluir grupos reactivos, sitios de glucosilación, polímeros, residuos terapéuticos, biomoléculas y similares también pueden usarse en la invención. Todos los aminoácidos empleados en la presente invención pueden ser el isómero D o el isómero L. Generalmente se prefiere el isómero L. Además, también son útiles otros peptidomiméticos en la presente invención. Como se emplea en esta memoria, “péptido” se refiere a péptidos tanto glucosilados como no glucosilados. También se incluyen péptidos que están incompletamente glucosilados por un sistema que expresa el péptido. Para una revisión general, véase, Spatola, A. F., en CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, Nueva York, p. 267 (1983).
La expresión “conjugado peptídico” se refiere a especies de la invención en las que un péptido está conjugado con un azúcar modificado como se expone en la memoria.
El término “FGF” o la expresión “Factor de Crecimiento de Fibroblastos” se refieren a cualquiera de la familia de los veinticinco péptidos de tipo silvestre conocidos. El término o la expresión también se refieren a las secuencias de aminoácidos con los mismos aminoácidos, con menos aminoácidos o con aminoácidos adicionales, en comparación con las secuencias de tipo silvestre. Los aminoácidos adicionales, que pueden ser naturales o no naturales, pueden insertarse en el inicio, en el centro o en el extremo de la secuencia de aminoácidos.
El término “mutar” o “mutación”, como se usa en el contexto de introducir uno o más sitios de glucosilación unidos a N o unidos a O adicionales en un Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre, se refiere a la deleción, inserción o sustitución de cualquier nucleótido o resto de aminoácido, por medios químicos, enzimáticos o por cualquier otro medio, en una secuencia de polinucleótidos que codifica un Factor de Crecimiento de Fibroblastos de
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tipo silvestre o en la secuencia de aminoácidos de un Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre, respectivamente, de tal manera que la secuencia de aminoácidos del Factor de Crecimiento de Fibroblastos resultante comprende al menos un sitio de glucosilación unido a N o unido a O que no existe en el Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre correspondiente. En el caso de sustitución de aminoácidos, pueden usarse sustituciones tanto conservativas como no conservativas para crear un mutante FGF que contenga un nuevo sitio de glucosilación unido a N o unido a O.
El sitio para una mutación introduciendo un nuevo sitio de glucosilación unido a N o unido a O tiene una separación inferior a 4 aminoácidos de un resto prolina en el lado C o N terminal del resto prolina, en donde el resto prolina se localiza en la posición 3, 28, 29, 34, 35, 52, 81, 175, 192, 197, o 201 de la SEQ ID NO: 1. Ejemplos de secuencias de aminoácidos para mutantes del Factor de Crecimiento de Fibroblastos se representan en las SEQ ID NO: 9-14, 18-22, 23-45, 48-65, 69-109, 112-145, y 338-360. Por tanto, un “Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante” de la presente invención comprende al menos una sustitución, una inserción de aminoácido o un resto de aminoácido mutado. Por otro lado, en esta solicitud, el Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre, cuya secuencia codificante se modifica para generar un Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante, puede denominarse “Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre correspondiente” o simplemente “péptido de tipo silvestre”. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos del Factor 20 de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre correspondiente para Factores de Crecimiento de Fibroblastos mutantes que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 9-14, 18-22, 23-45, 48-65, 69-109, 112-145 y 338-360. Del mismo modo, la SEQ ID NO: 146 es la secuencia de aminoácidos del Factor-21 de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre correspondiente para los Factores de Crecimiento de Fibroblastos mutantes que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 161-214,220-320 y 323-337. Un "péptido FGF mutante" se refiere a un péptido FGF-20 mutante.
Las expresiones “cantidad eficaz” o “una cantidad eficaz para” o una “cantidad terapéuticamente eficaz” o cualquier expresión gramaticalmente equivalente significa la cantidad que produce los efectos terapéuticos para los cuales se administra una sustancia. Los efectos incluyen la prevención, corrección, o inhibición de la progresión de los síntomas de una enfermedad/afección y complicaciones relacionadas a cualquier grado detectable. La cantidad exacta dependerá de la finalidad del tratamiento y la determinará un experto en la técnica usando técnicas conocidas (véase, p. ej., Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3,1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); y Pickar, Dosage Calculations (1999)).
Como se emplea en esta memoria, la expresión “azúcar modificado”, se refiere a un hidrato de carbono de origen natural o de origen no natural, que se añade enzimáticamente en un resto de aminoácido o de glucosilo de un péptido en un procedimiento de la invención. El azúcar modificado se selecciona de diversos sustratos enzimáticos entre los que se incluyen, pero no se limitan a, nucleótidos de azúcar (mono-, di-y trifosfatos), azúcares activados (por ejemplo, haluros de glucosilo, mesilatos de glucosilo) y azúcares que ni están activados ni son nucleótidos. El “azúcar modificado” se funcionaliza de manera covalente con un “grupo modificador”. Los grupos modificadores útiles incluyen, pero no se limitan a, polímeros solubles en agua (residuos de PEG), residuos terapéuticos, residuos de diagnóstico, biomoléculas y similares. El grupo modificador no es preferiblemente un hidrato de carbono de origen natural ni uno no modificado. El lugar de funcionalización con el grupo modificador se selecciona de forma que no impida que el “azúcar modificado” se añada enzimáticamente a un péptido.
La expresión “soluble en agua” se refiere a residuos que tienen algún grado detectable de solubilidad en agua. En la técnica son muy conocidos los procedimientos para detectar y/o cuantificar la solubilidad en agua. Los ejemplos de polímeros solubles en agua incluyen péptidos, sacáridos, poli(éteres), poli(aminas), poli(ácidos carboxílicos) y similares. Los péptidos pueden tener secuencias mixtas o estar compuestos de un solo aminoácido, p. ej., poli(lisina). Un ejemplo de polisacárido es el ácido(poli siálico). Un ejemplo de poli(éter) es poli(etilenglicol), p. ej., m-PEG. La poli(etilenimina) es una poliamina a modo de ejemplo y el ácido poli(acrílico) es un ácido(poli carboxílico) representativo.
La estructura polimérica del polímero soluble en agua puede ser poli(etilenglicol) (es decir PEG). Sin embargo, debe entenderse que también son adecuados otros polímeros relacionados para su uso en la práctica de la presente invención y que el uso de la expresión PEG o poli(etilenglicol) pretende ser inclusivo y no exclusivo a este respecto. La expresión PEG incluye poli(etilenglicol) en cualquiera de sus formas, incluyendo alcoxi PEG, PEG disfuncional, PEG de brazos múltiples, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG colgante (es decir, PEG o polímeros relacionados que tienen uno o más grupos funcionales colgantes en la estructura polimérica) o PEG con enlaces degradables en su interior.
La estructura polimérica puede ser lineal o ramificada. Las estructuras poliméricas ramificadas se conocen en general en la técnica. Típicamente, un polímero ramificado tiene un residuo núcleo ramificado central y una pluralidad de cadenas poliméricas lineales ligadas al núcleo ramificado central. Normalmente, el PEG se usa en formas ramificadas que pueden producirse con la adición de óxido de etileno a diversos polioles, tales como glicerol, pentaeritritol y sorbitol. El residuo ramificado central también puede proceder de diversos aminoácidos, tales como lisina. El poli(etilenglicol) ramificado puede estar representado en forma general como R(-PEG-OX)m donde R representa el residuo núcleo, tal como glicerol o pentaeritritol, X representa un grupo protector con capuchón (cap) o un grupo terminal, y representando m el número de brazos. Las moléculas de PEG de brazos múltiples, tales como
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las descritas en la Patente de Estados Unidos n.º 5.932.462 también pueden usarse como la estructura polimérica.
Muchos otros polímeros también son adecuados para la invención. Las estructuras poliméricas que son no peptídicas y solubles en agua, con de 2 a aproximadamente 300 términos, son particularmente útiles en la presente invención. Los ejemplos de polímeros adecuados incluyen, pero no se limitan a, otros poli(alquilenglicoles), tales como poli(propilenglicol) (“PPG”), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol y similares, poliol(polioxietilado), alcohol(poli olefínico), poli(vinilpirrolidona), poli(hidroxipropilmetacrilamida), poli (α-hidroxiácido), alcohol(poli vinílico), polifosfaceno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina), como se describe en la Patente de Estados Unidos n.º
5.629.384 y copolímeros, terpolímeros y mezclas de los mismos. Aunque el peso molecular de cada cadena de la estructura polimérica puede variar, esta está típicamente en el intervalo de aproximadamente 100 Da a aproximadamente 100.000 Da, a menudo de aproximadamente 6.000 Da a aproximadamente 80.000 Da.
La expresión “ácido siálico” o “sialilo” se refiere a cualquier miembro de una familia de azúcares carboxilados de nueve carbonos. El miembro más común de la familia del ácido siálico es el ácido N-acetilneuramínico (ácido 2-ceto5-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-1-ónico) (abreviado a menudo como Neu5Ac, NeuAc, o NANA). Un segundo miembro de la familia es el ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5Gc o NeuGc), donde el grupo Nacetilo de NeuAc está hidroxilado. Un tercer miembro de la familia del ácido siálico es el ácido 2-ceto-3-desoxinonulosónico (KDN) (Nadano y col. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori y col., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)). También se incluyen ácidos siálicos sustituidos en 9, tales como 9-O-acil C1-C6-Neu5Ac como 9-O-lactil-Neu5Ac o 9-O-acetil-Neu5Ac, 9-desoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-desoxi-Neu5Ac. Para una revisión de la familia del ácido siálico, véase, p. ej., Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, Nueva York (1992)). En la solicitud internacional WO 92/16640, publicada el 1 de octubre de 1992 se describe la síntesis y el uso de compuestos de ácido siálico en un procedimiento de sialilación.
El “área bajo la curva” o ABC”, como se emplea en esta memoria en el contexto de administrar un fármaco de péptido a un paciente, se define como el área total bajo la curva que describe la concentración de fármaco en la circulación sistémica en el paciente en función del tiempo de cero a infinito.
Al término “semivida” o “t½”, como se emplea en esta memoria en el contexto de administrar un fármaco de péptido a un paciente, se define como el tiempo requerido para que la concentración en plasma de un fármaco en un paciente se reduzca a la mitad. Puede haber más de una semivida asociada al fármaco de péptido dependiendo de múltiples mecanismos de eliminación, redistribución y otros mecanismos muy conocidos en la técnica. Normalmente, las semividas alfa y beta se definen de forma que la fase alfa está asociada con la redistribución y la fase beta está asociada con la eliminación. Sin embargo, con fármacos de proteína que, en general, están confinados en la corriente sanguínea, puede haber al menos dos semividas de eliminación. Para algunos péptidos glucosilados, la rápida eliminación de la fase beta puede estar mediada por receptores sobre macrófagos, o por células endoteliales que reconocen galactosa terminal, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, manosa o fucosa. La eliminación de fase beta más lenta puede producirse mediante filtración glomerular renal para moléculas con un radio eficaz < 2 nm (aproximadamente 68 kD) y/o captación y metabolismo específico o inespecífico en tejidos. La glucoPEGilación puede proteger azúcares terminales (p. ej., galactosa o N-acetilgalactosamina) y así bloquear la rápida eliminación de la fase alfa mediante receptores que reconocen estos azúcares. También puede conferir un radio eficaz más grande y así disminuir el volumen de distribución y captación tisular, prolongando así la fase beta tardía. Por tanto, el impacto exacto de la glucoPEGilación sobre las semividas de fase alfa y beta variará dependiendo del tamaño, del estado de glucosilación y de otros parámetros, como se sabe bien en la técnica. En Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin and RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Ámsterdam, págs. 101-120) se amplía la explicación de “semivida”.
El término “glucoconjugación”, como se emplea en esta memoria, se refiere a la conjugación, mediada con enzimas de una especie de azúcar modificada, con un resto de aminoácido o un glucosilo de un polipéptido, p. ej., un Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante de la presente invención. Un subgénero de “glucoconjugación” es la “glucoPEGilación” donde el grupo modificador del azúcar modificado es poli(etilenglicol), un derivado alquilo de PEG (por ejemplo, m-PEG) o un derivado reactivo de PEG (por ejemplo, H2N-PEG, HOOC-PEG) del mismo.
Las expresiones “a gran escala” y “a escala industrial” se usan indistintamente y se refieren a un ciclo de reacción que produce al menos aproximadamente 250 mg, preferiblemente al menos aproximadamente 500 mg y más preferiblemente al menos aproximadamente 1 gramo de glucoconjugado al final de un solo ciclo de reacción.
La expresión “grupo de unión a glucosilo”, como se emplea en esta memoria, se refiere a un residuo de glucosilo al cual se une un grupo modificador (por ejemplo, residuo de PEG, residuo terapéutico, biomolécula) de manera covalente; el grupo de unión a glucosilo conecta el grupo modificador con el resto del conjugado. En los procedimientos de la invención, el “grupo de unión a glucosilo” llega a conectarse de manera covalente a un péptido glucosilado o no glucosilado, de modo que une el agente a un resto de aminoácido y/o de glucosilo en el péptido. Un “grupo de unión a glucosilo” generalmente procede de un “azúcar modificado” mediante la conexión enzimática del “azúcar modificado” con un resto de aminoácido y/o de glucosilo del péptido. El grupo de unión a glucosilo puede ser una estructura derivada de sacárido que se degrada durante la formación del casete grupo modificador-azúcar modificado (p. ej., oxidación→formación de base de Schiff→reducción), o el grupo de unión a glucosilo puede estar
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intacto. Un “grupo de unión a glucosilo intacto” se refiere a un grupo de unión que procede de un residuo de glucosilo donde el monómero sacárido que se une al grupo modificador y al resto del conjugado no se degrada, por ejemplo, se oxida, p. ej., con metaperyodato sódico. Los “grupos de unión a glucosilo intactos” de la invención pueden proceder de un oligosacárido de origen natural mediante la adición de una o más unidades de glucosilo o la eliminación de una o más unidades de glucosilo de una estructura de sacárido parental.
La expresión, “grupo modificador no glucosídico”, como se emplea en esta memoria, se refiere a grupos modificadores que no incluyen un azúcar de origen natural unido directamente al grupo de unión a glucosilo.
Como se emplea en esta memoria, un “agente radiactivo” incluye cualquier radioisótopo que sea eficaz en el diagnóstico o destrucción de un tumor. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, indio 111 y cobalto 60. Además, elementos radiactivos de origen natural, tales como uranio, radio y torio, que normalmente representan mezclas de radioisótopos, son ejemplos adecuados de un agente radiactivo. Los iones metálicos están típicamente quelados con un residuo quelante orgánico.
En la técnica se conocen muchos grupos quelantes, éteres de corona, criptandos y similares útiles y pueden incorporarse en los compuestos de la invención (por ejemplo, EDTA, DTPA, DOTA, NTA, HDTA, etc. y sus análogos de fosfonato tales como DTPP, EDTP, HDTP, NTP, etc.). Véanse, por ejemplo, Pitt y col., “The Design of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload”, In, INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY AND MEDICINE; Martell, Ed.; American Chemical Society, Washington, D. C., 1980, págs. 279-312; Lindoy, THE CHEMISTRY OF MACROCYCLIC LIGAND COMPLEXES; Cambridge University Press, Cambridge, 1989; Dugas, BIOORGANIC CHEMISTRY; Springer-Verlag, Nueva York, 1989, y referencias en su interior.
Además, los expertos en la técnica disponen de una serie de vías que permiten la unión de agentes quelantes, éteres de corona y ciclodextrinas a otras moléculas. Véase, por ejemplo, Meares y col., “Properties of In Vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides”. In, MODIFICATION OF PROTEINS: FOOD, NUTRITIONAL, AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS”; Feeney, y col., Eds., American Chemical Society, Washington, D. C., 1982, págs. 370-387; Kasina y col., Bioconjugate Chem., 9: 108-117 (1998); Song y col., Bioconjugate Chem., 8: 249-255 (1997).
Como se emplea en esta memoria, un “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye cualquier material, que cuando se combina con el conjugado, conserva la actividad del conjugado y no es reactivo con el sistema inmunitario del sujeto. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquier vehículo farmacéutico convencional tal como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua y varios tipos de agentes humectantes. Otros vehículos pueden incluir también disoluciones estériles, comprimidos, incluidos los comprimidos recubiertos y cápsulas. Típicamente, dichos vehículos contienen excipientes, tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales de los mismos, estearato de magnesio o de calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles, u otros excipientes conocidos. Dichos vehículos pueden incluir también aditivos aromatizantes y colorantes u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden dichos vehículos se formulan mediante procedimientos convencionales bien conocidos.
Como se emplea en esta memoria, “administración”, significa administración oral, inhalación, administración como un supositorio, contacto tópico, administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intralesional, intranasal o subcutánea, o el implante al sujeto de un dispositivo de liberación lenta, p. ej., una minibomba osmótica. La administración es mediante cualquier vía, incluyendo la vía parenteral y transmucosa (p. ej., oral, nasal, vaginal, rectal o transdérmica). La administración parenteral incluye, por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, intra-arteriolar, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular e intracraneal. Además, cuando la inyección es para tratar un tumor, p. ej., inducir apoptosis, la administración puede ser directamente en el tumor y/o en tejidos que rodean el tumor. Otros modos de liberación incluyen, pero no se limitan a, el uso de formulaciones liposomales, infusiones intravenosas, parches transdérmicos, etc.
La expresión “mejora” o “mejoría” se refiere a cualquier señal de éxito en el tratamiento de una patología o afección, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo, tal como supresión, remisión o disminución de los síntomas o una mejoría en el bienestar físico o mental del paciente. La mejoría de los síntomas puede basarse en parámetros objetivos o subjetivos; incluyendo los resultados de una exploración física y/o una evaluación psiquiátrica.
La expresión “terapia” se refiere a “tratamiento” o “tratar” una enfermedad o afección, incluyendo la prevención de la aparición de la enfermedad o afección en un animal que puede estar predispuesto a la enfermedad, pero que aún no padece o presenta los síntomas de la enfermedad (tratamiento profiláctico), la inhibición de la enfermedad (ralentizando o deteniendo su desarrollo), proporcionar alivio de los síntomas o efectos secundarios de la enfermedad (incluyendo tratamiento paliativo) y alivio de la enfermedad (causar la regresión de la enfermedad).
El término “aislado” se refiere a un material que carece sustancial o esencialmente de componentes que se usan para producir el material. Para los conjugados peptídicos de la invención, el término “aislado” se refiere a material que carece sustancial o esencialmente de componentes, que normalmente acompañan al material en la mezcla que se utiliza para producir el conjugado peptídico. Los términos “aislado” y “puro” se usan de manera indistinta. Típicamente, los conjugados peptídicos aislados de la invención tienen un nivel de pureza que se expresa preferiblemente como un intervalo. El extremo inferior del intervalo de pureza para los conjugados peptídicos es de
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Como alternativa, puede aislarse una secuencia de ácido nucleico que codifica un Factor de Crecimiento de Fibroblastos de una biblioteca de ADN genómico o de ADNc humano usando técnicas de clonación convencionales tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR), donde los cebadores basados en homología a menudo pueden proceder de una secuencia de ácido nucleico conocida que codifica un Factor de Crecimiento de Fibroblastos. Las técnicas más habitualmente utilizadas para este fin se describen en textos convencionales, por ejemplo, Sambrook y Russell, citados anteriormente.
Las bibliotecas de ADNc adecuadas para obtener una secuencia codificante para un Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre pueden adquirirse en el comercio o pueden construirse. Se conocen bien procedimientos generales de aislamiento de ARNm, de preparación de ADNc por transcripción inversa, de ligamiento de ADNc en un vector recombinante, de transfección en un hospedador recombinante para su propagación, de exploración y clonación (véase, p. ej., Gubler y Hoffman, Gene, 25: 263-269 (1983); Ausubel y col., citados anteriormente). Después de obtener un segmento amplificado de una secuencia de nucleótidos por PCR, el segmento puede usarse adicionalmente como una sonda para aislar la secuencia de polinucleótidos de longitud completa que codifica el Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre de la biblioteca de ADNc. En Sambrook y Russell, citados anteriormente, puede encontrarse una descripción general de procedimientos apropiados.
Para obtener una secuencia de longitud completa que codifique un Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre, por ejemplo, uno cualquiera de los n.º de registro del GenBank mencionados anteriormente, de una genoteca humana, se puede seguir un procedimiento similar. Las genotecas humanas pueden obtenerse en el comercio o construirse según los diversos procedimientos reconocidos en la técnica. En general, para construir una genoteca, primero se extrae el ADN de un tejido donde es probable que se encuentra el Factor de Crecimiento de Fibroblastos. Después, el ADN se corta mecánicamente o se somete a digestión enzimática para producir fragmentos de aproximadamente 12-20 kb de longitud. Posteriormente, los fragmentos se separan, por centrifugación en gradiente, de los fragmentos polinucleotídicos de tamaños no deseados y se insertan en vectores de bacteriófago λ. Estos vectores y fagos se empaquetan in vitro. Los fagos recombinantes se analizan mediante hibridación en placas como se describe en Benton y Davis, Science, 196: 180-182 (1977). La hibridación de colonias se realiza como describen Grunstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961-3965 (1975).
Basándose en la homología de secuencias, pueden diseñarse oligonucleótidos degenerados como conjuntos de cebadores y la PCR puede realizarse en condiciones adecuadas (véase, por ejemplo, White y col., PCR Protocols: Current Methods and Applications, 1993; Griffin y Griffin, PCR Technology, CRC Press Inc. 1994) para amplificar un segmento de secuencias de nucleótidos de una biblioteca de ADNc o genómica. Usando el segmento amplificado como una sonda, se obtiene el ácido nucleico de longitud completa que codifica un Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre.
Después de adquirir una secuencia de ácido nucleico que codifica un Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre, la secuencia codificante puede subclonarse en un vector, por ejemplo, un vector de expresión, de tal manera que puede producirse un Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre recombinante a partir de la construcción resultante. Posteriormente, para alterar las características de la molécula, pueden realizarse modificaciones adicionales a la secuencia codificante del Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre, por ejemplo, sustituciones de nucleótidos.
Introducción de mutaciones en una secuencia del FGF
A partir de una secuencia de polinucleótidos codificante, puede determinarse la secuencia de aminoácidos de un Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 146. Posteriormente, esta secuencia de aminoácidos puede modificarse para alterar el patrón de glucosilación de la proteína, introduciendo uno o más sitios de glucosilación adicionales en diversos lugares en la secuencia de aminoácidos.
En la técnica se conocen bien diversos tipos de sitios de glucosilación de proteínas. Por ejemplo, en eucariotas, la glucosilación unida a N se produce en la asparagina de la secuencia consenso Asn-Xaa-Ser/Thr, en la cual Xaa es cualquier aminoácido excepto prolina (Kornfeld y col., Ann Rev Biochem 54: 631-664 (1985); Kukuruzinska y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2145-2149 (1987); Herscovics y col., FASEB J 7: 540-550 (1993); y Orlean, Saccharomyces Vol. 3 (1996)). La glucosilación unida a O tiene lugar en restos de serina o de treonina (Tanner y col., Biochim. Biophys. Acta. 906: 81-91 (1987); y Hounsell y col., Glycoconj. J. 13: 19-26 (1996)). Otros patrones de glucosilación se forman uniendo glucosilfosfatidilinositol con el grupo carboxilo del extremo carboxilo de la proteína (Takeda y col., Trends Biochem. Sci. 20: 367-371 (1995); y Udenfriend y col., Ann. Rev. Biochem. 64: 593-591 (1995). Por tanto, en base a este conocimiento, pueden introducirse mutaciones adecuadas en una secuencia del Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre para formar nuevos sitios de glucosilación.
Aunque la modificación directa de un resto de aminoácido dentro de una secuencia polipeptídica del Factor de Crecimiento de Fibroblastos puede ser adecuada para introducir un nuevo sitio de glucosilación unido a N o unido O, más frecuentemente, la introducción de un nuevo sitio de glucosilación se realiza mutando la secuencia de polinucleótidos que codifica un Factor de Crecimiento de Fibroblastos. Esto puede realizarse usando cualquiera de
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los procedimientos de mutagénesis conocidos, algunos de los cuales se analizan más adelante. Las modificaciones ejemplares en el Factor de Crecimiento de Fibroblastos incluyen las ilustradas en las SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO:
87.
En la técnica se han establecido y descrito diversos protocolos de generación de mutaciones. Véase, por ejemplo, Zhang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4504-4509 (1997); y Stemmer, Nature, 370: 389-391 (1994). Los procedimientos pueden usarse individualmente o en combinación para producir variantes de un conjunto de ácidos nucleicos, y por tanto variantes de polipéptidos codificados. En el comercio se dispone de kits para mutagénesis, construcción de bibliotecas y de otros procedimientos de generación de diversidad.
Los procedimientos mutacionales de generación de diversidad incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida a sitio (Botstein y Shortle, Science, 229: 1193-1201 (1985)), mutagénesis usando moldes que contienen uracilo (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492 (1985)), mutagénesis dirigida a oligonucleótidos (Zoller y Smith, Nucl. Acids Res.,10: 6487-6500 (1982)), mutagénesis de ADN modificado con fosforotioato (Taylor y col., Nucl. Acids Res., 13: 8749-8764 y 8765-8787 (1985)), y mutagénesis utilizando ADN bicatenario abierto (Kramer y col., Nucl. Acids Res.,
12: 9441-9456 (1984)).
Otros posibles procedimientos para generar mutaciones incluyen reparación de emparejamiento puntual (Kramer y col., Cell, 38: 879-887 (1984)), mutagénesis usando cepas hospedadoras deficientes en reparación (Carter y col., Nucl. Acids Res., 13: 4431-4443 (1985)), mutagénesis por deleción (Eghtedarzadeh y Henikoff, Nucl. Acids Res., 14: 5115 (1986)), selección-restricción y purificación-restricción (Wells y col., Phil. Trans. R. Soc. Lond. A, 317: 415-423 (1986)), mutagénesis por síntesis génica total (Nambiar y col., Science, 223: 1299-1301 (1984)), reparación de rotura de cadena doble (Mandecki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181 (1986)), mutagénesis por el procedimiento de terminación de cadena polinucleotídica (Patente de Estados Unidos n.º 5.965.408) y PCR propensa a error (Leung y col., Biotechniques, 1: 11-15 (1989)).
Modificación de ácidos nucleicos para el uso de codones preferidos en un organismo hospedador
La secuencia de polinucleótidos que codifica un Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante puede alterarse adicionalmente para que coincida con el uso de codones preferidos de un hospedador particular. Por ejemplo, puede emplearse el uso de codones preferido de una cepa de células bacterianas para obtener un polinucleótido que codifique un Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante de la invención e incluye los codones preferidos por esta cepa. La frecuencia de uso de codones preferido mostrada por una célula hospedadora puede calcularse estableciendo el promedio de frecuencia del uso de codones preferido en una gran cantidad de genes expresados por la célula hospedadora (por ejemplo, el servicio de cálculo disponible en el sitio web del Instituto de Investigación de ADN de Kazusa, Japón). Este análisis está preferiblemente limitado a genes que la célula hospedadora expresa a altos niveles. La Patente de Estados Unidos n.º 5.824.864, por ejemplo, proporciona la frecuencia del uso de codones por genes expresados a altos niveles mostrada por plantas dicotiledóneas y plantas monocotiledóneas.
Al final de la modificación, el Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante que codifica las secuencias se verifica por secuenciación y después se subclona en un vector de expresión apropiado para la producción recombinante de la misma manera que los Factores de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre.
Expresión y purificación del FGF mutante
Después de la verificación de la secuencia, el Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante de la presente invención puede producirse usando técnicas habituales en el campo de genética recombinante, basándose en las secuencias de polinucleótidos que codifican el polipéptido descrito en la presente memoria.
Sistemas de expresión
Para obtener un alto nivel de expresión de un ácido nucleico que codifica un Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante de la presente invención, típicamente se subclona un polinucleótido que codifica el Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante en un vector de expresión que contiene un promotor fuerte para dirigir la transcripción, un terminador de la transcripción/traducción y un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción. En la técnica se conocen bien promotores bacterianos adecuados y se describen, por ejemplo, en Sambrook y Russell, citados anteriormente y en Ausubel y col., citados anteriormente. Los sistemas de expresión bacterianos para expresar el Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre mutante se encuentran disponibles, por ejemplo, en E. coli, Bacillus sp., Salmonella y Caulobacter. En el comercio se dispone de kits para dichos sistemas de expresión. En la técnica se conocen bien y también se encuentran disponibles sistemas de expresión eucariotas para células de mamífero, de levadura y de insecto. En una realización, el vector de expresión eucariota es un vector de adenovirus, un vector adenoasociado o un vector de retrovirus.
El promotor que se usa para dirigir la expresión de un ácido nucleico heterólogo depende de la aplicación particular. Opcionalmente, el promotor se coloca aproximadamente a la misma distancia del sitio de inicio de la transcripción heterólogo del que lo está del sitio de inicio de la transcripción en su entorno natural. Sin embargo, como se sabe en la técnica, puede ajustarse alguna variación en esta distancia sin pérdida de la función del promotor.
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Además del promotor, el vector de expresión incluye típicamente una unidad de transcripción o un casete de expresión que contiene todos los elementos adicionales necesarios para la expresión del Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante en células hospedadoras. Un casete de expresión típico por tanto contiene un promotor unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante y señales necesarias para la poliadenilación eficaz del transcrito, sitios de unión al ribosoma y terminación de la traducción. La secuencia de ácido nucleico que codifica el Factor de Crecimiento de Fibroblastos está típicamente unida a una secuencia de péptido señal escindible que promueve la secreción del Factor de Crecimiento de Fibroblastos por la célula transformada. Dichos péptidos señal incluyen, entre otras cosas, péptidos señal del activador de plasminógeno tisular, insulina y factor de crecimiento neuronal, y esterasa de la hormona juvenil de Heliothis virescens. Elementos adicionales del casete pueden incluir potenciadores y, si se usa ADN genómico como el gen estructural, intrones con sitios donadores y aceptores de corte y empalme funcionales.
Además de una secuencia promotora, el casete de expresión también debe contener una región de terminación de la transcripción aguas abajo del gen estructural para proporcionar una terminación eficaz. La región de terminación puede obtenerse del mismo gen que el de la secuencia promotora o puede obtenerse de genes diferentes.
El vector de expresión particular usado para transportar la información genética en la célula no es particularmente crítico. Puede usarse cualquiera de los vectores convencionales empleados para la expresión en células eucariotas
o procariotas. Los vectores de expresión bacterianos convencionales incluyen plásmidos tales como plásmidos basados en pBR322, pSKF, pET23D y sistemas de expresión de fusión tales como GST y LacZ. También pueden añadirse etiquetas epitópicas, p. ej., c-myc, a proteínas recombinantes para proporcionar procedimientos de aislamiento convenientes.
Los vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucariotas se usan típicamente en vectores de expresión eucariotas, por ejemplo, vectores SV40, vectores del virus del papiloma, y vectores procedentes del virus de Epstein-Barr. Otros ejemplos de vectores eucariotas incluyen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, baculovirus pDSVE, y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano de SV40, del promotor tardío de SV40, del promotor de metalotioneína, del promotor del virus del tumor mamario murino, del promotor del virus del sarcoma de Rous, del promotor de la polihedrina u otros promotores que muestran ser eficaces para la expresión en células eucariotas.
Algunos sistemas de expresión tienen marcadores que proporcionan amplificación génica tales como timidina quinasa, higromicina B fosfotransferasa y dihidrofolato reductasa. Como alternativa, también son adecuados sistemas de expresión a alto rendimiento que no implican amplificación génica, tales como un vector de baculovirus en células de insecto, con una secuencia de polinucleótidos que codifica el Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante bajo la dirección del promotor de la polihedrina u otros promotores fuertes de baculovirus.
Los elementos que típicamente se incluyen en los vectores de expresión también incluyen un replicón que funciona en E. coli, un gen que codifica resistencia a antibióticos para permitir la selección de bacterias que alojan plásmidos recombinantes, y sitios de restricción únicos en regiones no esenciales del plásmido para permitir la inserción de secuencias eucariotas. El gen de resistencia a antibióticos particular seleccionado no es crítico, cualquiera de los muchos genes de resistencia conocidos en la técnica son adecuados. Las secuencias procariotas se seleccionan opcionalmente de tal manera que no interfieran con la replicación del ADN en las células eucariotas, si fuera necesario. De manera similar a los marcadores de resistencia a antibióticos, también pueden usarse marcadores de selección metabólicos, que se basan en rutas metabólicas conocidas, como un medio para seleccionar células hospedadoras transformadas.
Cuando se desea la expresión periplasmática de una proteína recombinante (por ejemplo, un mutante de FGF de la presente invención), el vector de expresión comprende adicionalmente una secuencia que codifica una señal de secreción, tal como la señal de secreción OppA (Proteína Periplasmática de Unión a Oligopéptidos) de E. coli o una versión modificada de la misma, que se conecta directamente al extremo 5’ de la secuencia codificante de la proteína que va a expresarse. Esta secuencia señal dirige la proteína recombinante producida en el citoplasma a través de la membrana celular al interior del espacio periplasmático. Adicionalmente el vector de expresión puede comprender una secuencia codificante para la peptidasa 1 señal, que es capaz de escindir enzimáticamente la secuencia señal cuando la proteína recombinante está entrando en el espacio periplasmático. Puede encontrarse una descripción más detallada de la producción periplasmática de una proteína recombinante, p. ej., en Gray y col., Gene 39: 247-254 (1985), Patentes de Estados Unidos n.º 6.160.089 y 6.436.674.
Como se ha analizado anteriormente, un experto en la técnica reconocerá que pueden realizarse diversas sustituciones conservativas en cualquier Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre mutante o en su secuencia codificante conservando al mismo tiempo la actividad biológica del Factor de Crecimiento de Fibroblastos. Además, también pueden realizarse modificaciones de una secuencia codificante de polinucleótidos para adaptar un uso de codones preferido en un hospedador de expresión particular sin alterar la secuencia de aminoácidos resultante.
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membrana con un límite de peso molecular mayor que el peso molecular de la proteína de interés. La proteína recombinante atravesará la membrana en el material filtrado. Después, el material filtrado puede cromatografiarse como se describe más adelante.
Cromatografía en columna
Las proteínas de interés (tal como el Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante de la presente invención) también pueden separarse de otras proteínas en función de su tamaño, carga superficial neta, hidrofobicidad o afinidad por los ligandos. Además, los anticuerpos suscitados contra el Factor de Crecimiento de Fibroblastos pueden conjugarse con matrices de columna y el Factor de Crecimiento de Fibroblastos inmunopurificado. Todos estos procedimientos son muy conocidos en la técnica.
Para un experto será obvio que las técnicas de cromatografía pueden realizarse a cualquier escala y usando equipos de muchos fabricantes diferentes (p. ej., Pharmacia Biotech).
Inmunoensayos para la detección de la expresión del FGF mutante
Para confirmar la producción de un Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante recombinante, los ensayos inmunológicos pueden ser útiles para detectar en una muestra la expresión del polipéptido. Los ensayos inmunológicos son también útiles para cuantificar el nivel de expresión de la hormona recombinante. Para llevar a cabo estos ensayos inmunológicos se requieren anticuerpos contra un Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante.
Producción de anticuerpos contra el FGF mutante
Los expertos en la técnica conocen procedimientos de producción de anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan específicamente con un inmunógeno de interés (véase, p. ej., Coligan, Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY, 1991; Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY, 1989; Stites y col. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y referencias citadas en su interior; Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.) Academic Press, Nueva York, NY, 1986; y Kohler y Milstein Nature 256: 495-497, 1975). Dichas técnicas incluyen la preparación de anticuerpos por selección de los mismos de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en vectores de fagos o similares (véase, Huse y col., Science 246: 1275-1281, 1989; y Ward y col., Nature 341: 544-546, 1989).
Para producir antisueros que contengan anticuerpos con especificidad deseada, el polipéptido de interés (p. ej., un Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante de la presente invención) o un fragmento antigénico del mismo, puede usarse para inmunizar animales adecuados, p. ej., ratones, conejos o primates). Puede usarse un adyuvante convencional, tal como adyuvante de Freund, según un protocolo de inmunización convencional. Como alternativa, puede conjugarse un péptido antigénico sintético derivado de un polipéptido particular con una proteína transportadora y posteriormente usarse como un inmunógeno.
La respuesta inmunitaria del animal contra la preparación inmunogénica se controla con análisis de sangre y determinando el título de reactividad contra el antígeno de interés. Cuando se obtienen títulos apropiadamente altos de anticuerpos contra el antígeno, se extrae sangre del animal y se preparan antisueros. Después, puede realizarse un fraccionamiento adicional de los antisueros para enriquecer anticuerpos específicamente reactivos contra el antígeno y la purificación de los anticuerpos, véase, Harlow y Lane, citados anteriormente, y las descripciones generales de purificación de proteínas proporcionadas anteriormente.
Los anticuerpos monoclonales se obtienen usando diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia. Típicamente, los esplenocitos de un animal inmunizado con un antígeno deseado, se inmortalizan normalmente mediante fusión con una célula de mieloma (véase, Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976). Los procedimientos alternativos de inmortalización incluyen, p. ej., la transformación con el Virus del Epstein Barr, oncogenes o retrovirus u otros procedimientos bien conocidos en la técnica. Las colonias que surgen de las células inmortalizadas sencillas se exploran con respecto a la producción de anticuerpos con especificidad y afinidad deseadas para el antígeno, y el rendimiento de los anticuerpos monoclonales producidos por dichas células puede potenciarse mediante diversas técnicas, incluyendo inyección en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado.
Adicionalmente, los anticuerpos monoclonales también pueden producirse de manera recombinante después de la identificación de las secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo con especificidad deseada, o un fragmento de unión de dicho anticuerpo, explorando una biblioteca de ADNc de linfocitos B humanos según el protocolo general diseñado por Huse y col., citados anteriormente. Los principios y procedimientos generales de la producción de polipéptidos recombinantes analizados anteriormente pueden aplicarse para la producción de anticuerpos mediante procedimientos recombinantes.
Cuando se desee, los anticuerpos que pueden reconocer específicamente un Factor de Crecimiento de Fibroblastos mutante de la presente invención, pueden ensayarse con respecto a su reactividad cruzada contra el Factor de Crecimiento de Fibroblastos de tipo silvestre y por tanto diferenciarse de los anticuerpos contra la proteína de tipo silvestre. Por ejemplo, los antisueros obtenidos de un animal inmunizado con un Factor de Crecimiento de
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Puede utilizarse cualquier residuo sacarilo como el residuo donante de azúcar del azúcar modificado. El residuo sacarilo puede ser un azúcar conocido, tal como manosa, galactosa o glucosa, o una especie que tiene la estereoquímica de un azúcar conocido. Las fórmulas generales de estos azúcares modificados son:
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Otros residuos sacarilo que son útiles en la formación de las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, fucosa y ácido siálico, así como aminoazúcares tales como glucosamina, galactosamina, manosamina, el análogo 5-amina de ácido siálico, y similares. El residuo sacarilo puede ser una estructura encontrada en la naturaleza o puede modificarse para proporcionar un sitio para conjugar el grupo de modificación. Por ejemplo, en una realización, el azúcar modificado proporciona un derivado de ácido siálico, en el que el residuo 9-hidroxi se reemplaza con una amina. La amina se deriva fácilmente con un análogo activado de un grupo de modificación seleccionado.
Los ejemplos de azúcares modificados de uso en la invención se describen en la Solicitud de Patente PCT n.º PCT/US05/002522.
En una realización ejemplar adicional, la invención utiliza azúcares modificados en los que la posición de 6-hidroxilo se convierte en el residuo amina correspondiente, que lleva un casete de un grupo de modificación de enlazador tal como se ha expuesto anteriormente. Los grupos glucosilo ejemplares que pueden usarse como el núcleo de estos azúcares modificados incluyen Gal, GalNAc, Glc, GlcNAc, Fuc, Xilo, Man, y similares. Un azúcar modificado representativo de acuerdo con esta realización tiene la fórmula:
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en la que R11-R14 son miembros independientemente seleccionados de H, OH, C(O)CH3, NH, y NH C(O)CH3, R10 es un enlace a otro resto glucosilo (-O-glicosilo) o a un aminoácido del péptido de Factor VII y/o Factor VIIa (-NH(Factor VII y/o Factor VIIa)). R14 es OR1, NHR1 o NH-L-R1. R1 y NH-L-R1 son como se ha descrito anteriormente.
Grupos de unión a glucosilo
En una realización ejemplar, la invención proporciona un conjugado peptídico formado entre un azúcar modificado de la invención y un péptido FGF. En esta realización, el residuo donante de azúcar (tal como el residuo sacarilo y el grupo de modificación) del azúcar modificado se convierte en un "grupos de unión a glucosilo". Como alternativa, el "grupo de unión a glucosilo" puede referirse al residuo glucosilo que se interpone entre el péptido y el grupo de modificación.
Debido a la versatilidad de los procedimientos disponibles para añadir y/o modificar restos glucosilo en un péptido, los grupos de unión a glucosilo pueden tener sustancialmente cualquier estructura. En el análisis a continuación, la invención se ilustra por referencia al uso de derivados seleccionado de furanosa y piranosa. Los expertos en la técnica reconocerán que el foco del análisis tiene fines de claridad de ilustración y que las estructuras y composiciones que se exponen pueden aplicarse generalmente a todo el género de grupos de unión a glucosilo y azúcares modificados. El grupo de unión a glucosilo puede comprender virtualmente cualquier mono-u oligosacárido. Los grupos de unión a glucosilo pueden unirse a un aminoácido a través de la cadena lateral o a través de la estructura del péptido. Como alternativa, los grupos de unión a glucosilo pueden unirse al péptido a través de un residuo sacarilo. Este residuo sacarilo puede ser una porción de una estructura de glicano unida a O o unida a N en el péptido.
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