JP2008094822A - セルロース結合性ペプチドおよびその製造方法 - Google Patents
セルロース結合性ペプチドおよびその製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008094822A JP2008094822A JP2007043521A JP2007043521A JP2008094822A JP 2008094822 A JP2008094822 A JP 2008094822A JP 2007043521 A JP2007043521 A JP 2007043521A JP 2007043521 A JP2007043521 A JP 2007043521A JP 2008094822 A JP2008094822 A JP 2008094822A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cellulose
- phage
- binding peptide
- amino acid
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【解決手段】アミノ酸残基数が7個であり、少なくとも1個の正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸と、少なくとも1個の側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸とを含む、セルロース結合性ペプチド。また、ファージディスプレイペプチドライブラリーから、該セルロース結合性ペプチドを有するファージの増幅、分離、洗浄、溶出する工程からなるセルロース結合性ペプチドの製造方法。
【選択図】なし
Description
セルロース分解酵素であるセルラーゼは、触媒ドメイン、リンカー部位およびセルロース結合ドメイン(cellulose binding domain:CBD)の三つの領域から構成されており、このうちCBDがセルロースを分解するのに重要であることが知られている。
しかしながら、酵素を用いた可溶化および糖化は分解速度やコストの面で問題がある。
また、非特許文献1に記載されている方法は、ペプチドのアミノ酸残基数が15個であるため、溶液中である種の立体構造(コンファメーション)を採り、それがセルロースとの結合に多少なりとも寄与していると推測されるところ、特定の立体構造を採らないアミノ酸残基数が少ないペプチドの場合は、SWYLシーケンスを有するペプチドであっても、セルロースへの特異的な結合を示すか否かは不明である。
そこで、本発明は、アミノ酸残基数が少なく、かつ、セルロースに特異的に結合するペプチドおよびその製造方法を提供することを課題とする。
(1)少なくとも1個の正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸と少なくとも1個の側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸とを含む、アミノ酸残基数7個のアミノ酸配列を有するセルロース結合性ペプチド。
(2)上記側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸を少なくとも2個含む、上記(1)に記載のセルロース結合性ペプチド。
(3)少なくとも2個の前記側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸のうち、少なくとも2個が連続している、上記(2)に記載のセルロース結合性ペプチド。
(4)HAIYPRH、SHTLSAK、TQMTSPR、YAGPYQH、LPSQTAP、GQTRAPL、QLKTGPA、FQVPRSQ、LRLPPAPからなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するセルロース結合性ペプチド。
(5)前記アミノ酸配列が、ファージディスプレイ法によるファージクローンのうちから、ELISAによるセルロース結合性試験において、ファージライブラリーのセルロース結合定数より大きいセルロース結合定数をもつものとして選択されるファージクローンが提示するアミノ酸配列である上記(1)〜(4)のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
(6)上記選択されたファージクローンのセルロース結合定数が、ファージライブラリーのセルロース結合定数に対する比で1.5以上である上記(5)に記載のセルロース結合性ペプチド。
(7)上記アミノ酸配列のN末端から第1番目および第5番目が、水酸基を有するアミノ酸残基からなる上記(1)〜(6)のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
(8)上記アミノ酸配列のC末端から第1番目が、正電荷を有するアミノ酸残基からなる上記(1)〜(7)のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
その後、放置して、前記ファージディスプレイペプチドライブラリーのうちのセルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を具備する、セルロース結合性ペプチドの製造方法。
(10)前記溶出工程の後に、
溶出した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを大腸菌に感染させて増幅させる増幅工程と、
増幅した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記セルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を含むサイクルを、1回以上具備する、上記(9)に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
(12)前記洗浄工程が、いずれもセロビオースを含有するTween20を含むトリス緩衝液を用いて行われ、前記溶出工程が、いずれもセロビオース水溶液を用いて行われる、上記(10)に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
(13)前記アミノ酸残基数が7個である、上記(9)〜(12)のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
(14)上記(9)〜(13)のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法により得られるセルロース結合性ペプチド。
正のハイドロパシー指標(hydropathy index)を有するアミノ酸は、アラニン(A)、システイン(C)、メチオニン(M)、フェニルアラニン(F)、バリン(V)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)である。中でも、アラニンが好ましい。
本発明において、側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸におけるアミノ基は、イミノ基(>NH)およびアミド(−CONH)を含む。側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸は、リシン(K)、アルギニン(R)、ヒスチジン(H)、アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、スレオニン(T)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)である。中でも、ヒスチジン、グルタミン、アルギニンが好ましい。
中でも、少なくとも2個の側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸のうち、少なくとも2個が連続しているのが好ましい。
アミノ酸残基数は、7〜14個であるのが好ましい。
本発明では、セルロース結合性ペプチドのファージクローンのセルロースに対する結合定数とライブラリーのセルロースに対する結合定数との比は、1.1以上であるのが好ましく、1.3以上であるのがより好ましく、1.5以上であるのが更に好ましい。
なお、本発明の第2の態様に係るセルロース結合性ペプチドには、ファージディスプレイ法により一般的なポリマー親和性ペプチドとして選択されたペプチドのプロリン依存性の傾向は特別みられない。
その後、放置して、前記ファージディスプレイペプチドライブラリーのうちのセルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を具備する、セルロース結合性ペプチドの製造方法である。
ライブラリー溶液には、ファージディスプレイペプチドライブラリーが含まれる。
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、20のn乗(nは、アミノ酸残基数)の多様性を有する。すなわち、20のn乗(nは、アミノ酸残基数)種のペプチドを有するファージのライブラリーである。例えば、アミノ酸残基数が7個であれば、ファージディスプレイペプチドライブラリーは、20n(≒1.28×109)種のペプチドを有するファージを有する。
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、ペプチドのアミノ酸残基数が7個であるのが好ましい態様の一つである。
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、特に限定されないが、例えば、市販のものを用いることができる。
また、ファージディスプレイペプチドライブラリーは、ペプチドのアミノ酸残基数が異なる2種以上のファージを含んでいてもよい。
ライブラリー溶液は、水溶液であるのが好ましい。水溶液中のファージディスプレイペプチドライブラリーの濃度は、1011〜1012virions/mLであるのが好ましい。
混合の方法は、特に限定されず、例えば、室温で1分間〜12時間転倒混和する方法が挙げられる。
混合工程においてセルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとが結合して生成した複合体は、セルロースに特異的に結合しないペプチドを有するファージと比べて重いため、沈殿する。
分離の方法は、沈殿した複合体を系から分離する方法であれば、特に限定されないが、例えば、セルロースに特異的に結合しないペプチドを有するファージを含む溶液を除去して、沈殿を得る方法が挙げられる。
複合体は、上述したように、ライブラリー溶液とセルロースとを混合させた状態から、沈殿により分離されたものである。したがって、ライブラリー溶液中のセルロースに特異的に結合しないペプチドを有するファージが不純物として含まれる。洗浄工程は、そのようなセルロースに特異的に結合しないペプチドを有するファージを除去するために行われる。
TBSTを用いて洗浄する方法の条件は、例えば、pH6〜9であり、0.01〜0.1vol%のTween20を含む500〜1000μLのTBSTを用い、室温から40℃までの温度下で、5〜20回転倒混和し洗浄する方法が挙げられる。
セロビオースを含有するTBSTを用いて洗浄する方法の条件は、例えば、pH6〜9であり、0.1〜50mMのセロビオースを含むTBST500〜1000μLを用い、室温から40℃までの温度下で、5〜20回転倒混和し洗浄する方法が挙げられる。
溶出の方法は、特に限定されず、例えば、グリシン−塩酸緩衝液を用いて溶出する方法、セロビオース水溶液を用いて溶出する方法が挙げられる。
グリシン−塩酸緩衝液を用いて溶出する方法の条件は、例えば、pH1〜3のグリシン−塩酸緩衝液400〜1000μLを用い、室温から40℃までの温度下で、30分間〜2時間転倒混和し、複合体を処理する方法が挙げられる。
セロビオース水溶液を用いて溶出する方法の条件は、例えば、0.05〜0.5Mのセロビオースを含むpH1〜3のグリシン−塩酸緩衝液400〜1000μLを用い、室温下、1時間転倒混和し、複合体を処理する方法が挙げられる。
増幅した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記セルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を含むサイクルを、1回以上具備するのが好ましい。これにより、セルロース結合性ペプチドの得られる効率が高くなる。
増幅の方法の条件は、例えば、LB培地10〜30mLと大腸菌O/N培養液100〜300μLの混合液にファージ溶液50〜200μLを加えて、室温から37℃までの温度で、150〜300rpmで3〜6時間、振盪培養する方法が挙げられる。
混合の方法は、ファージディスプレイペプチドライブラリーを含むライブラリー溶液の代わりに、増幅したセルロース結合性ペプチドを有するファージを用いる以外は、上述した混合工程と同様である。
上記サイクルにおける分離工程は、沈殿した複合体を分離する工程である。
上記サイクルにおける洗浄工程は、分離された複合体を洗浄する工程である。
上記サイクルにおける溶出工程は、洗浄された複合体からセルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる工程である。
これらの沈殿工程、分離工程、洗浄工程および溶出工程は、それぞれ上述した沈殿工程、分離工程、洗浄工程および溶出工程と同様である。
上記サイクルを行う場合は、サイクル前およびサイクルにおける洗浄工程が、いずれもTBSTを用いて行われ、サイクル前およびサイクルにおける溶出工程が、いずれもグリシン−塩酸緩衝液を用いて行われるのが好ましい態様の一つであり、サイクル前およびサイクルにおける洗浄工程が、いずれもセロビオースを含有するTBSTを用いて行われ、サイクル前およびサイクルにおける溶出工程が、いずれもセロビオース水溶液を用いて行われるのが別の好ましい態様の一つである。サイクル前および1回以上のサイクルにおける洗浄工程が、いずれもセロビオースを含有するTBSTを用いて行われる場合、セロビオースの濃度を上げながら行うのが好ましい。例えば、サイクルを4回行うことによりバイオパニングを合計5回行う場合、1mM(バイオパニング1回目)、3mM(同2回目)、10mM(同3回目)、30mM(同4回目)、30mM(同5回目)のようにすることができる。これにより、セルロースに弱く結合する特異性の低いファージを効率よく排除することができる。
この溶出液中に、セルロース結合性ペプチドを有するファージが存在するか否かは、例えば、クローニングをして、ファージクローンを取り出し、Enzyme−linked Immunosorbent Assay(ELISA)により、セルロースに対する結合定数を測定し、ライブラリーのセルロースに対する結合定数との比が1を超える、好ましくは1.5以上であるものが存在するか否かで判断することができる。
本発明の第7の態様のセルロース結合性ペプチドは、上述した本発明のセルロース結合性ペプチドの製造方法により得られ、かつ、セルロースに特異的に結合するものであれば、アミノ酸配列等を特に限定されない。
具体的には、例えば、上述した本発明の第2から第6までの態様のセルロース結合性ペプチドが挙げられる。
したがって、本発明の第1から第7までの態様のセルロース結合性ペプチドを用いてバイオエタノールを製造することが可能になると考えられる。
1.1 実験試料
微結晶セルロースは、Merckより購入したものをそのまま用いた。
ファージディスプレイペプチドライブラリー(以下、単に「ライブラリー」という。)は、Ph.D.−7TM Phage Display Peptide Library(NEW ENGLAND Biolabs,Inc.)を用いた。このライブラリーは、M13系のfdファージの非主要外殻タンパク質であるpIIIのN末端に直鎖7残基のランダムなアミノ酸配列のペプチドが提示されたものであり、ペプチド4残基(GGGS)のスペーサーを介してwild−type pIIIに融合した設計となっている。このライブラリーには、207個(≒1.28×109個)のphage clonesが含まれている。
微結晶セルロースをエタノールに分散させた。静置し微結晶セルロースが沈殿した後、上清を除去した。本操作によりセルロースを滅菌した。
つぎに、TBSに分散させ、静置し微結晶セルロースが沈殿した後、上清を除去した。本操作を3回繰り返すことで微結晶セルロースを洗浄した。
図1に、セルロース結合性ファージのセレクションの概略工程図を示す。
本操作はPh.D.−7TM Phage Display Peptide Library Kitを用いて行い、Kit付属のマニュアルを参考にし、一部改変して行った。
(a)滅菌精製水
超純水をオートクレーブ(121℃、20分間)して調製し、室温で保存した。
(b)Tetracycline(Tet)ストック溶液
テトラサイクリン塩酸塩100mgをエタノール(Spectrum grade)20mLに溶解し、−20℃で遮光保存した。
(c)IPTG/X−Galストック溶液
Isopropyl−1−thio−β−D−garactopyranoside(IPTG)0.25g、5−Bromo−4−chloro−3−indolyl−β−D−galactopyranoside(X−Gal) 0.2gをN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)(Spectrum grade) 5.0mLに溶解させ、1.7mLチューブに1mLずつ分注し−20℃で遮光保存した。
(d)LB培地
500mL広口メディウム瓶にBacto−Tryptone 5g、Yeast Extract 2.5g、塩化ナトリウム5gを採取し、超純水500mLおよび4M水酸化ナトリウム水溶液125μLを加えてオートクレーブ処理を行った後、室温で保存した。
(e)LB plate−Tetracycline
250mL広口メディウム瓶にLB培地200mLを採取しBacto Agar 3.0gを加えてオートクレーブ処理を行った後、50℃以下まで冷却し、Tetストック溶液800μLを加えシャーレ20枚に分注し、固化させた後4℃で遮光保存した。
Tris(hydroxymethyl)aminomethane 30.3g,塩化ナトリウム43.8gを400mLの超純水に溶解させ、6M塩酸および0.01M塩酸でpH7.5に調整した。超純水で500mLにメスアップし、オートクレーブ処理を行った後、室温で保存した。
(g)PEG/NaCl
polyethylene glycol(PEG#6000) 100.0g、塩化ナトリウム73.0gを超純水330mLに溶解させ、超純水で500mLにメスアップし、オートクレーブ処理を行った後、室温で保存した。
(h)TBS/gelatin
ゼラチン0.1gを10×TBS 10mLおよび超純水90mLに溶解させ、オートクレーブ処理を行った後、渦を巻くように撹拌してゼラチンを均一溶解させ、室温で保存した。
(i)5%NaN3ストック溶液
アジ化ナトリウム50mgを15mLチューブに採取し、滅菌精製水950μLに溶解させ4℃で保存した。
(j)0.02%NaN3/TBS
上記(i)で調製した5%NaN3ストック溶液100μLをTBS 25mLに溶解させ、0.22μmフィルター(Millex,Millipore)でろ過滅菌を行った後、室温で保存した。
Tris(hydroxymethyl)aminomethane 30.3gを超純水200mLに溶解させ、6M塩酸および0.01M塩酸でpH9.1に調整し、超純水で250mLにメスアップし、オートクレーブ処理を行った後、4℃で保存した。
(l)Agarose Top
250mL広口メディウム瓶にBacto−Tryptone 2g、Yeast Extract 1g、塩化ナトリウム1g、Bacto Agar 1.4g、塩化マグネシウム六水和物0.1gを採取し、超純水200mLおよび4M水酸化ナトリウム水溶液50μLを加えてオートクレーブ処理を行った後、室温で保存した。
(m)5M NaCl水溶液
250mL広口メディウム瓶に塩化ナトリウム73.1gを採取し、超純水250mLに溶解させ、オートクレーブ処理を行った後、室温で保存した。
(n)Elution buffer(pH2.2、Glycine−HCl、0.1mg/mL BSA)
Glycine 3.75gを超純水50mLに溶解させ、6M塩酸でpH2.2に調整した後、超純水で100mLにメスアップ後、0.22μmフィルターでろ過滅菌を行った。ウシ血清アルブミン(Bovine Serum Albumin:BSA、018−15154、Lot.CER0068、Wako)10mg、フェノールレッド1mgを加えて溶解させ、0.22μmフィルターでろ過滅菌を行った後、4℃で保存した。
(o)1×TBS containing 0.05vol% Tween20
10×TBS 4mL、Tween20(polyoxyethylene sorbitan monolaurate) 20μLを滅菌精製水で40mLにメスアップし、0.22μmフィルターでろ過滅菌を行った後、室温で保存した。
LB培地499μLにE.coli ER2738 1μLを加え、LB−tet plateに100μLをプレーティングし、37℃で12時間培養し、4℃で保存した。マスタープレートは調製後1箇月以内に使用した。また、1箇月以内にコロニーから新たなLB−tet plateに線画培養することで植菌し、E.coli菌体を保存した。
LB培地20mLにE.coli O/N培養液200μLを加え、300mLバッフル付三角フラスコに移し、ついでライブラリー1μLを加えて、37℃、200rpmの条件で5時間振盪培養した。これによりライブラリーを増幅した。
その後、培養液を50mLチューブに移して2380g(3500rpm、TOMY EX−126、TS−38LB rotor)、4℃の条件で10分間遠心することで菌体を分離した。
つぎに、新たな50mLチューブにPEG/NaCl 3.3mLを採取し、これに上記遠心分離により得られた上清のファージ溶液を加え、穏やかに100回転倒混和した後、4℃で12時間静置した(PEG沈殿精製)。その後、2380g(3500rpm)、4℃の条件で10分間遠心し上清を除去した。得られたファージペレットをTBS 1mLに再溶解させ、1.7mLチューブに移した。12303g(13000rpm、BECKMAN CS15R、F2402H rotor)、4℃の条件で10分間遠心し、上清を新たな1.7mLチューブに採取したPEG/NaCl 150μLに加え、穏やかに100回転倒混和した後、4℃で1時間以上静置した(PEG沈殿精製)。12303g(13000rpm)、4℃の条件で10分間遠心し上清を除去し、得られたファージペレットを0.02%NaN3/TBS 200μLを加えて溶解させ、新たな0.6mLチューブに移して、ライブラリー溶液とし、4℃で保存した。
バイオパニングは、以下のRun1〜3の3通りの方法で行った。
(i)Run1
上記(3)で増幅したライブラリー溶液を1.0×1010pfuになるようにTBSで希釈し、10mgの微結晶セルロースを懸濁させた。室温で1時間転倒混和し、放置した後、上清のファージ溶液を除去した。得られた微結晶セルロース/ファージ複合体を、0.05vol% Tween20を含むトリス緩衝液(TBST)600μLで、5回洗浄した。
ついで、グリシン−塩酸緩衝液(pH2.2)500μLでファージを溶出した。
得られた溶出液を回収し、1M Tris−HCl(pH9.1)を188μL加えて中和した後、限外濾過膜(分画分子量100kDa)に移しTBSで約1mLにメスアップした。
2380g(3500rpm)、4℃の条件で2分間遠心し、約50μLまでファージ溶液を濃縮した。再度、TBSで約1mLにメスアップし遠心する操作を2回繰り返すことで(計3回)、バッファー交換と同時にファージ溶液を濃縮した後、TBSで約200μLにメスアップし、4℃で保存した。
洗浄において、0.05vol% Tween20を含むトリス緩衝液(TBST)600μLの代わりに、1mMのセロビオースを含むTBST 600μLを用い、溶出において、グリシン−塩酸緩衝液(pH2.2)500μLの代わりに0.1Mセロビオースを含むTBS 500μLを用い、限外ろ過膜に移す前に中和を行わなかった以外は、Run1と同様の方法により、バイオパニングを行った。
溶出において、グリシン−塩酸緩衝液(pH2.2)500μLの代わりに50%EtOHを含むTBS 500μLを用いた以外は、Run1と同様の方法により、バイオパニングを行ったが、溶出時にファージが消失したため以降の操作は行わなかった。
LB培地20mL、E.coli ER2738 O/N培養液200μLを加え300mLバッフル付三角フラスコに移し、上記(4)で得たファージ溶液100μLを加えて37℃、200rpmの条件で5時間振盪培養した。これによりファージプールを増幅した。
その後、培養液を50mLチューブに移して2380g(3500rpm)、4℃の条件で10分間遠心することで菌体を分離した。
つぎに、新たな50mLチューブにPEG/NaCl 3.3mLを採取し、これに上記遠心分離により得られた上清のファージ溶液を加え、穏やかに100回転倒混和した後4℃で一晩静置し、ファージを沈殿させた。その後、2380g(3500rpm)、4℃の条件で10分間遠心し上清を除去した。得られたファージペレットをTBS 1mLに再溶解させ、1.7mLチューブに移した。12303g(13000rpm)、4℃の条件で10分間遠心し、上清を新たな1.7mLチューブに採取したPEG/NaCl 150μLに加え、穏やかに100回転倒混和した後4℃で1時間静置し、ファージを沈殿させた。さらに、12303g(13000rpm)、4℃の条件で10分間遠心し上清を除去し、得られたファージペレットを0.02%NaN3/TBS 200μLを加えて溶解させ、新たな0.6mLチューブに上清を移して4℃で保存した。
なお、Run2においては、洗浄に用いたセロビオースを含むTBSTにおけるセロビオースの濃度を、バイオパニング2回目は3mM、3回目は10mM、4回目および5回目は30mMとした。
測定モード:Absorbance、レスポンス:Fast、バンド幅:2.0nm、走査速度:400nm/min、開始波長:340nm、終了波長:200nm、データ取込間隔:1.0nm
LB培地5mLにマスタープレートからピックアップしたシングルコロニーを加え、OD600=0.5になるまで37℃、200rpmの条件で振盪培養した後(最大5時間)、ファージ溶液をTBS/gelatinで所定の濃度に系列希釈し、これを分注した大腸菌懸濁液に10μLずつ加えて数分間インキュベートした。Agarose Topを電子レンジで溶解し、3mLずつ分注し、これにファージプール希釈液とインキュベートした大腸菌懸濁液を加えてよく混合した後、あらかじめ37℃に温めたLB/IPTG/X−galプレートに注いで均一に広げ5分間静置した。培地の固化を確認した後、37℃で一晩培養した。プレート上の青いプラークの個数を数え、希釈率を考慮し調製したファージ溶液の濃度を算出した。
0.1mgの微結晶セルロースを所定濃度のファージ/PBS溶液(スキムミルク不含)に20℃下懸濁させ、1時間静置した。PBSTおよびPBSをこの順に用いて洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼラベル化した抗M13ファージ抗体溶液に懸濁させた。上清を除去した後、基質(2,2′−azino−bis(3−ethylbenzothiazoline−6−sulfonic acid)diammonium salt)溶液に懸濁させ、405nmの吸収によりファージの結合量を求めた。
ファージ濃度を変化させて得られた吸収の濃度依存性から以下のLangmuir式を仮定することにより、ファージの見掛けの結合定数(Kapp)を求めた。
2.1 ファージプールの結合定数
図2に、バイオパニングの回数とファージの回収率との関係を示す。図2に示されるように、ファージの回収率は、バイオパニングの回数の増加に従って増加する傾向にあった。このことは、ライブラリーにおいてランダムであったペプチドのうち、セルロースと特異的に結合するペプチドが、バイオパニングの繰り返しにより、ファージプールに濃縮されてきたことを示唆している。
得られたクローンが提示しているペプチドのアミノ酸配列、アミノ酸配列ごとの頻度、ELISAの繰り返し回数(n)、ELISAにより求めたファージの見掛けの結合定数(Kapp)およびそのライブラリーの結合定数に対する比(Kapp比)を、表1(Run1)および表2(Run2)に示す。
なお、ELISAの繰り返し回数(n)は、1日3回のELISAをn=1とするものである。したがってn=3での結合定数(Kapp)は、合計9回のELISAの平均値である。
図3に示されるように、ファージ濃度の増加とともに吸収(結合量)が飽和することから、Langmuir式への仮定が妥当であることが示唆された。図3から、クローン(Run2系)の結合量がライブラリーの結合量よりも多いことが明らかになった。
表1に示すとおり、Run1の系では、パニング数が5回に達すると、顕著なセルロース特異的結合性を示すペプチドが得られにくくなっており、4回のパニング数で充分であると考えられる。
なお、Run1およびRun2のいずれにおいても、アミノ酸配列HPERATLを有するクローン(Run1での1−4c01および1−5c02、Run2での2−5c05)の頻度が極めて高かったが、このクローンの結合定数はライブラリーと比べて小さいか同等程度である。したがって、このクローンは、セルロースに特異的に結合するペプチドではなく、バイオパニングの際に単に増幅効率がよいクローンであると推測される。
表3に示される9種のセルロース結合性ペプチド(ライブラリーに対する結合定数の比>1.5)のアミノ酸配列におけるアミノ酸の出現頻度を表4に示す。
Claims (14)
- 少なくとも1個の正のハイドロパシー指標を有するアミノ酸と少なくとも1個の側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸とを含む、アミノ酸残基数7個のアミノ酸配列を有するセルロース結合性ペプチド。
- 前記側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸を少なくとも2個含む、請求項1に記載のセルロース結合性ペプチド。
- 少なくとも2個の前記側鎖にヒドロキシ基またはアミノ基を有するアミノ酸のうち、少なくとも2個が連続している、請求項2に記載のセルロース結合性ペプチド。
- HAIYPRH、SHTLSAK、TQMTSPR、YAGPYQH、LPSQTAP、GQTRAPL、QLKTGPA、FQVPRSQ、LRLPPAPからなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するセルロース結合性ペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、ファージディスプレイ法によるファージクローンのうちから、ELISAによるセルロース結合性試験において、ファージライブラリーのセルロース結合定数より大きいセルロース結合定数をもつものとして選択されるファージクローンが提示するアミノ酸配列である請求項1〜4のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
- 前記選択されたファージクローンのセルロース結合定数が、ファージライブラリーのセルロース結合定数に対する比で1.5以上である請求項5に記載のセルロース結合性ペプチド。
- 前記アミノ酸配列のN末端から第1番目および第5番目が、水酸基を有するアミノ酸残基からなる請求項1〜6のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
- 前記アミノ酸配列のC末端から第1番目が、正電荷を有するアミノ酸残基からなる請求項1〜7のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチド。
- アミノ酸残基数が2〜14個のペプチドのファージディスプレイペプチドライブラリーを含むライブラリー溶液と、セルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記ファージディスプレイペプチドライブラリーのうちのセルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を具備する、セルロース結合性ペプチドの製造方法。 - 前記溶出工程の後に、
溶出した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを大腸菌に感染させて増幅させる増幅工程と、
増幅した前記セルロース結合性ペプチドを有するファージとセルロースとを混合させる混合工程と、
その後、放置して、前記セルロース結合性ペプチドを有するファージと前記セルロースとの複合体を沈殿させる沈殿工程と、
沈殿した前記複合体を分離する分離工程と、
分離された前記複合体を洗浄する洗浄工程と、
洗浄された前記複合体から前記セルロース結合性ペプチドを有するファージを溶出させる溶出工程と
を含むサイクルを、1回以上具備する、請求項9に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。 - 前記洗浄工程が、いずれもTween20を含むトリス緩衝液を用いて行われ、前記溶出工程が、いずれもグリシン−塩酸緩衝液を用いて行われる、請求項10に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
- 前記洗浄工程が、いずれもセロビオースを含有するTween20を含むトリス緩衝液を用いて行われ、前記溶出工程が、いずれもセロビオース水溶液を用いて行われる、請求項10に記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
- 前記アミノ酸残基数が7個である、請求項9〜12のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法。
- 請求項9〜13のいずれかに記載のセルロース結合性ペプチドの製造方法により得られるセルロース結合性ペプチド。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007043521A JP2008094822A (ja) | 2006-09-15 | 2007-02-23 | セルロース結合性ペプチドおよびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006250945 | 2006-09-15 | ||
JP2007043521A JP2008094822A (ja) | 2006-09-15 | 2007-02-23 | セルロース結合性ペプチドおよびその製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008094822A true JP2008094822A (ja) | 2008-04-24 |
Family
ID=39378040
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007043521A Pending JP2008094822A (ja) | 2006-09-15 | 2007-02-23 | セルロース結合性ペプチドおよびその製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2008094822A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7989160B2 (en) | 2006-02-13 | 2011-08-02 | Alethia Biotherapeutics Inc. | Polynucleotides and polypeptide sequences involved in the process of bone remodeling |
US8168181B2 (en) | 2006-02-13 | 2012-05-01 | Alethia Biotherapeutics, Inc. | Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15 |
US9493562B2 (en) | 2012-07-19 | 2016-11-15 | Alethia Biotherapeutics Inc. | Anti-Siglec-15 antibodies |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001120280A (ja) * | 1999-11-01 | 2001-05-08 | Meiji Seika Kaisha Ltd | β−1,3−グルカナーゼおよびβ−1,3−グルカン結合ペプチド、ならびにそれらの遺伝子 |
-
2007
- 2007-02-23 JP JP2007043521A patent/JP2008094822A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001120280A (ja) * | 1999-11-01 | 2001-05-08 | Meiji Seika Kaisha Ltd | β−1,3−グルカナーゼおよびβ−1,3−グルカン結合ペプチド、ならびにそれらの遺伝子 |
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9040246B2 (en) | 2006-02-13 | 2015-05-26 | Alethia Biotherapeutics Inc. | Methods of making antibodies that bind polypeptides involved in the process of bone remodeling |
US8168181B2 (en) | 2006-02-13 | 2012-05-01 | Alethia Biotherapeutics, Inc. | Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15 |
US8431126B2 (en) | 2006-02-13 | 2013-04-30 | Alethia Biotherapeutics Inc. | Antibodies that bind polypeptides involved in the process of bone remodeling |
US8540988B2 (en) | 2006-02-13 | 2013-09-24 | Alethia Biotherapeutics Inc. | Antibodies that bind polypeptides involved in the process of bone remodeling |
US7989160B2 (en) | 2006-02-13 | 2011-08-02 | Alethia Biotherapeutics Inc. | Polynucleotides and polypeptide sequences involved in the process of bone remodeling |
US9067984B2 (en) | 2006-02-13 | 2015-06-30 | Alethia Biotherapeutics Inc. | Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind Siglec-15 |
US9695419B2 (en) | 2006-02-13 | 2017-07-04 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Polynucleotides and polypeptide sequences involved in the process of bone remodeling |
US8741289B2 (en) | 2009-10-06 | 2014-06-03 | Alethia Biotherapeutics Inc. | Siglec 15 antibodies in treating bone loss-related disease |
US8900579B2 (en) | 2009-10-06 | 2014-12-02 | Alethia Biotherapuetics Inc. | Siglec-15 antibodies in treating bone loss-related disease |
US9388242B2 (en) | 2009-10-06 | 2016-07-12 | Alethia Biotherapeutics Inc. | Nucleic acids encoding anti-Siglec-15 antibodies |
US9617337B2 (en) | 2009-10-06 | 2017-04-11 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Siglec-15 antibodies in treating bone loss-related disease |
USRE47672E1 (en) | 2009-10-06 | 2019-10-29 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15 |
US9493562B2 (en) | 2012-07-19 | 2016-11-15 | Alethia Biotherapeutics Inc. | Anti-Siglec-15 antibodies |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7203800B2 (ja) | ヌクレオチド・ライブラリー | |
US9469670B2 (en) | Polypeptide libraries with a predetermined scaffold | |
JP2014528906A5 (ja) | ||
JP2009507503A5 (ja) | ||
RU2016149596A (ru) | Новые полипептиды со специфическим связыванием и пути их применения | |
Li et al. | Functional consequences of retro-inverso isomerization of a miniature protein inhibitor of the p53–MDM2 interaction | |
WO2014103203A1 (ja) | 微小タンパク質の骨格構造に基づく分子ライブラリ | |
WO2022115715A1 (en) | Compositions and methods for selective depletion of target molecules | |
JP2008094822A (ja) | セルロース結合性ペプチドおよびその製造方法 | |
EP2573103B1 (en) | Peptide domains that bind small molecules of industrial significance | |
JP5718574B2 (ja) | ペプチドのスクリーニング方法 | |
JP2022502070A (ja) | プロテアーゼバリアントのスクリーニング方法および得られたプロテアーゼバリアント | |
KR102204315B1 (ko) | 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 그의 용도 | |
CN108699551B (zh) | 多肽文库 | |
US20100029499A1 (en) | Artificial Protein Scaffolds | |
JP5297734B2 (ja) | スギ花粉アレルゲンへの結合能を有するペプチド | |
CN107827961B (zh) | 用于金黄色葡萄球菌Staphopain B蛋白检测的B细胞抗原表位肽及其试剂盒 | |
JP2011024429A (ja) | セルロース結合性ペプチドを使用する方法及びその生成物 | |
CA3183027A1 (en) | Human il23 receptor binding polypeptides | |
Johansson | Proteomic peptide phage display of syntenin-1 and scribble | |
WO2017159655A1 (ja) | IgG結合性ペプチド | |
JP5897178B2 (ja) | Stx1毒性阻害4価ペプチドおよびこれを含む疾患治療薬 | |
CN102875656B (zh) | 一种IgE特异性结合多肽及其医药用途 | |
CN115960217A (zh) | 一种新型冠状病毒中和活性纳米抗体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20080717 |
|
A621 | Written request for application examination |
Effective date: 20100222 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20120529 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
A521 | Written amendment |
Effective date: 20120727 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120814 |