KR20140148388A - Her3 억제제와 관련된 진단 및 치료 - Google Patents

Abstract

본원은 HER3 억제제, 예컨대 이중특이적 HER3/EGFR 억제제를 사용하여 암 환자를 치료하기 위한 선택 기준으로서의 NRG1 과다발현의 사용, 및 이러한 환자를 치료하는 방법을 기재한다.

Description

HER3 억제제와 관련된 진단 및 치료{DIAGNOSIS AND TREATMENTS RELATING TO HER3 INHIBITORS}

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2012년 3월 27일에 출원된 미국 특허 출원 61/616241을 우선권 주장하며, 이는 그 전문의 내용이 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본원은 암 요법의 분야 및 HER3 억제제를 사용하는 치료를 위한 암 환자를 선택하는 방법에 관한 것이다.

수용체 티로신 키나제의 HER 패밀리는 세포 성장, 분화 및 생존의 중요한 매개자이다. 수용체 패밀리는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR, ErbB1 또는 HER1), HER2 (ErbB2 또는 p185^neu), HER3 (ErbB3) 및 HER4 (ErbB4 또는 tyro2)를 포함하는 4개의 특징적인 구성원을 포함한다.

HER 경로를 표적으로 하는 치료제는 현재 질환, 예컨대 유방암, 비소세포 폐암, 결장직장암, 두경부암 및 췌장암을 치료하는데 사용된다.

EGFR은 6개의 상이한 리간드: 표피 성장인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 암피레귤린, 헤파린 결합 표피 성장인자 (HB-EGF), 베타셀룰린 및 에피레귤린에 결합한다 (문헌 [Groenen et al. Growth Factors, 11:235-257 (1994)]).

뉴레귤린은 Her3 및 Her4 수용체 티로신 키나제에 대한 리간드이다. 뉴레귤린 패밀리의 4가지 기지의 구성원, NRG1, NRG2, NRG3 및 NRG4가 존재한다 (문헌 [Falls, D. L., Ex Cell Res, 284:14-30 (2003); Hirsch and Wu (2007). Expert Reviews, Vol. 7, 147-157]). NRG1 전사체는 광범위한 대안적 스플라이싱을 거쳐 적어도 15가지의 상이한 이소형을 발생시킨다. 모든 활성 이소형은 활성을 위해 필요하고 충분한 EGF-유사 도메인을 공유한다 (문헌 [Holmes, W. E., et al., Science, 256:1205-1210 (1992); Yarden, Y., and Peles, E., Biochemistry 30: 3543-3550(1991)]).

대략 52,140개 새로운 사례의 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)이 진단되었으며, 11,460명의 사람이 작년에 미국에서 이 질환으로 사망한 것으로 추정된다 (1). HNSCC를 위한 치유적 개입은 수술, 방사선 및 조합된 방사선-화학요법을 포함한다. 원발성 HNSCC에 대한 전체 5-년 상대 생존율은 대략 60%이다. 그러나, 5-년 상대 생존율은 전이성 질환으로 진단된 환자의 경우에 단지 35%이다 (2). 진행성 HNSCC를 갖는 환자에서의 좋지 않은 결과는 이러한 집단에 보다 효과적인 요법이 필요하다는 것을 명백하게 나타낸다 (3).

표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 경로를 통한 신호전달은 HNSCC의 주요 구동자이다 (4). EGFR은 모든 HNSCC 중 최대 90%에서 과다발현된다 (5, 6). 비록 선천적 또는 후천적 내성으로 인해 다소 제한된 장기간 임상적 이익이라도 세툭시맙을 사용하는 EGFR 억제는 성공적인 치료 전략으로 입증되었다 (7). EGFR 및/또는 HER2를 표적으로 하는 티로신 키나제 억제제 (TKI), 예컨대 에를로티닙, 게피티닙 및 라파티닙이 HNSCC의 임상 연구에서 연구되었으나, 무작위적인 시험에서 생존 이점을 입증하지는 않았다 (8-10).

NRG1 자가분비 신호전달은 폐 상피 세포 증식을 조절하고 (문헌 [Jinbo, et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 27 : 306-313 (2002)]) 인간 폐 발생에서 역할을 수행하며 (문헌 [Patel, et al., Am. J. Resp Cell Mol Bio, 22: 432-440 (2000)]) NSCLC의 EGFR 억제제에 대한 불감성과 관련있는 것 (문헌 [Zhou, et al., Cancer cell 10:39-50 (2006)])으로 밝혀졌다. 전임상 연구는 NRG1이 HER2 키나제를 동원함으로써 악성종양을 촉진하는 자가분비-신호전달 루프에 의해 특정 암 세포주가 유래된다는 것을 시사하였다. (문헌 [Wilson, et al., Cancer Cell, 20:158-173(2011)]).

본 발명의 한 측면은 환자에게 치료 유효량의 HER3 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 HER3 억제제의 투여 전에 NRG1을 과다발현하는 암으로 진단받은 것인, 환자에서 한 유형의 암을 치료하는 방법을 제공한다. NRG1 과다발현은 HER3 억제제에 대한 대상체에 의한 치료 반응을 나타낸다. 한 실시양태에서, 환자는 암 유형에서의 NRG1 발현에 대한 중간 수준보다 높은 수준에서 NRG1을 발현하는 암으로 진단된다. 특정 실시양태에서, 환자는 암 유형에서의 NRG1 발현에 대해 60번째 백분위수 이상, 75번째 백분위수 이상 또는 80번째 백분위수 이상인 수준에서 NRG1을 발현하는 암으로 진단된다. 한 실시양태에서, 암의 유형은 과다발현 모드 및 과다발현 모드의 결여로 이루어진 이중모드 발현 프로파일을 나타내는 것이다. 한 실시양태에서, 이중모드 발현 프로파일의 변곡점은 선형 스케일 상에서 측정시에 1.5이다. 한 실시양태에서, 암의 유형은 자가분비 뉴레귤린-유도된 신호전달을 나타내는 것, 예컨대 HNSCC이다.

한 실시양태에서, HER3 억제제는 HER3에 대한 NRG1 결합을 억제한다. 한 실시양태에서, HER3 억제제는 항체이다. 한 실시양태에서, HER3 억제제는 이중특이적 HER3/EGFR 억제제이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 억제제는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 1의 중쇄 가변 도메인의 HVR 서열 및 서열 2의 경쇄 가변 도메인 서열의 HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 1의 중쇄 가변 도메인 및 서열 2의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 진단은 환자의 암으로부터의 샘플에서 NRG1의 발현 수준을 결정하는 것 및 샘플에서의 NRG1의 발현 수준을 샘플에서의 AL-137727 및 VPS33B 중 하나 또는 둘 다의 발현 수준에 대해 정량화하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 환자에게 치료 유효량의 이중특이적 HER3/EGFR 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 이중특이적 HER3/EGFR 억제제의 투여 전에 NRG1을 과다발현하는 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)으로 진단받은 것인, 환자에서 HNSCC를 치료하는 방법을 제공한다. NRG1 과다발현은 이중특이적 HER3/EGFR 억제제에 대한 대상체에 의한 치료 반응을 나타낸다. 한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 억제제는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 1의 중쇄 가변 도메인의 HVR 서열 및 서열 2의 경쇄 가변 도메인 서열의 HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 1의 중쇄 가변 도메인 및 서열 2의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 자가분비 뉴레귤린-유도된 신호전달을 나타내는 한 유형의 암을 갖는 환자로부터의 암 샘플에서 뉴레귤린 1 (NRG1) 발현을 결정하는 것 및 암 샘플이 NRG1을 과다발현한다면 요법을 위해 HER3 억제제를 선택하는 것을 포함하는, 상기 환자를 위한 요법을 선택하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 암 샘플은 암 유형에서의 NRG1 발현에 대한 중간 수준보다 높은 수준에서 NRG1을 발현한다. 특정 실시양태에서, 암 샘플은 암 유형에서의 NRG1 발현에 대해 60번째 백분위수 이상, 75번째 백분위수 이상 또는 80번째 백분위수 이상인 수준에서 NRG1을 발현한다. 한 실시양태에서, 암의 유형은 과다발현 모드 및 과다발현 모드의 결여로 이루어진 이중모드 발현 프로파일을 나타내는 것이다. 한 실시양태에서, 이중모드 발현 프로파일의 변곡점은 선형 스케일 상에서 측정시에 1.5이다. 한 실시양태에서, 암 유형은 자가분비 뉴레귤린-유도된 신호전달을 나타내는 것, 예컨대 HNSCC이다. 한 실시양태에서, 방법은 환자에게 치료 유효량의 HER3 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 암 유형은 HNSCC이다. 한 실시양태에서, HER3 억제제는 HER3에 대한 NRG 결합을 억제한다. 한 실시양태에서, HER3 억제제는 항체이다. 한 실시양태에서, HER3 억제제는 이중특이적 HER3/EGFR 억제제이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 억제제는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 1의 중쇄 가변 도메인의 HVR 서열 및 서열 2의 경쇄 가변 도메인 서열의 HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 1의 중쇄 가변 도메인 및 서열 2의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, NRG1 발현의 결정은 환자의 암으로부터의 샘플에서 NRG1의 발현 수준을 결정하는 것 및 샘플에서의 NRG1의 발현 수준을 샘플에서의 AL-137727 및 VPS33B 중 하나 또는 둘 다의 발현 수준에 대해 정량화하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 환자로부터의 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC) 샘플에서 뉴레귤린 1 (NRG1) 발현을 결정하는 것 및 HNSCC 샘플이 NRG1을 과다발현한다면 요법으로서 이중특이적 HER3/EGFR 억제제를 선택하는 것을 포함하는, HNSCC를 갖는 환자를 위한 요법을 선택하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 환자에게 치료 유효량의 이중특이적 HER3/EGFR 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 억제제는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 1의 중쇄 가변 도메인의 HVR 서열 및 서열 2의 경쇄 가변 도메인 서열의 HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 1의 중쇄 가변 도메인 및 서열 2의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, NRG1 발현의 결정은 환자의 암으로부터의 샘플에서 NRG1의 발현 수준을 결정하는 것 및 샘플에서의 NRG1의 발현 수준을 샘플에서의 AL-137727 및 VPS33B 중 하나 또는 둘 다의 발현 수준에 대해 정량화하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 표적 청중에게 한 유형의 암을 갖는 환자 집단을 치료하기 위한 HER3 억제제 또는 제약 조성물의 사용을 프로모션하는 것을 포함하며, 여기서 환자의 암은 NRG1을 과다발현하는 것인, HER3 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 조성물을 광고하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, HER3 억제제는 HER3에 대한 NRG 결합을 억제한다. 한 실시양태에서, HER3 억제제는 항체이다. 한 실시양태에서, HER3 억제제는 이중특이적 HER3/EGFR 억제제이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 억제제는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 1의 중쇄 가변 도메인의 HVR 서열 및 서열 2의 경쇄 가변 도메인 서열의 HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 1의 중쇄 가변 도메인 및 서열 2의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 표적 청중에게 HNSCC를 갖는 환자 집단을 치료하기 위한 이중특이적 HER3/EGFR 억제제 또는 그의 제약 조성물의 사용을 프로모션하는 것을 포함하며, 여기서 환자의 HNSCC는 NRG1을 과다발현하는 것인, 이중특이적 HER3/EGFR 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 조성물을 광고하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 억제제는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 1의 중쇄 가변 도메인의 HVR 서열 및 서열 2의 경쇄 가변 도메인 서열의 HVR 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 서열 1의 중쇄 가변 도메인 및 서열 2의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면은 샘플에서 NRG1의 발현 수준을 결정하는 것, 및 샘플에서의 NRG1의 발현 수준을 샘플에서의 내부 참조 유전자 또는 유전자들의 발현 수준에 대해 정량화하는 것을 포함하는, 암 샘플에서 NRG1 발현 수준을 정량화하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 참조 유전자 또는 유전자들은 AL-137727 및 VPS33B 중 하나 또는 둘 다이다. 한 실시양태에서, 샘플은 자가분비 뉴레귤린-유도된 신호전달을 나타내는 암, 예컨대 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)으로부터의 것이다. 본 발명의 방법의 한 구체적 실시양태에서, NRG1의 발현 수준 및 AL-137727 및 VPS33B 중 하나 또는 둘 다의 발현 수준은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 결정된다. 한 실시양태에서, 방법에 이용된 PCR은 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR)이다. 또 다른 실시양태에서, NRG1의 발현 수준은 면역조직화학 (IHC) 또는 ELISA를 이용하여 결정된다. 또 다른 실시양태에서, NRG1의 발현 수준은 면역조직화학 (IHC) 또는 ELISA를 이용하여 결정된다. 또 다른 실시양태에서, NRG1의 발현 수준은 직접적 RNA 서열분석에 의해 결정된다. 또 다른 실시양태에서, NRG1의 발현 수준은 RNA 계내 혼성화를 이용하여 결정된다.

도 1은 MEHD7945A 항체가 HER3-ECD 및 EGFR-ECD 둘 다에 결합한다는 것을 입증하는 그래프이다.
도 2A 및 B는 MEHD7945A가 EGFR 및 HER2/HER3-의존성 신호전달을 억제한다는 것을 입증하는 그래프이다.
도 3은 MEHD7945A에 의한 FaDu 암 모델에서의 종양 성장 억제를 보여주는 그래프이다.
도 4는 다수의 뮤린 이종이식편 모델에서 세툭시맙 또는 항-HER3과 비교한 MEHD7945A의 종양 성장 억제 효과의 개요이다.
도 5는 qRT-PCR에 의해 결정된 바와 같은 암 유형에서의 NRG1 (a) 및 HER3 (b) 발현 수준을 보여준다.
도 6은 다른 암 유형과 비교하여 HNSCC에서의 NRG1 발현의 이중모드 분포를 보여준다.
도 7은 log₁₀ 스케일 상에 플롯팅된 경우에 HNSCC에서의 NRG1 발현의 이중모드 분포를 보여준다. 점선은 HNSCC에서 NRG1 발현의 과다발현 및 과다발현 모드의 결여 사이의 변곡점을 나타내며, 이는 선형 스케일 상의 대략 1.50에 해당하는 로그 스케일 상의 0.3689로 설정된다.
도 8은 요법 나이브 SCHNN을 갖는 환자로부터의 새로 동결된 종양 시편에서의 pHER3 및 pTyr에 대한 IP-웨스턴 블롯 분석의 결과를 보여준다. MCF7은 음성 대조군이고; MCF7 + NRG 및 PCI6A는 양성 대조군이다. pTyr 블롯에 대한 대조군은 개별적으로 진행되는 반면 pHER3에 대한 대조군은 병행하여 진행된다.
도 9는 높은 NRG1 발현이 23개의 SCHNN 종양에서 HER3 신호전달의 pHER3 차등 활성화와 연관된다는 것을 나타내는 qRT-PCR 검정의 결과를 보여준다 (IP-웨스턴과 18/19 중첩). x-축 아래의 흑색 선은 IP-웨스턴에 의해 검출가능한 pHER3을 갖는 종양을 보여준다.
도 10은 분석에 사용된 환자 및 그의 종양의 병리학적 및 인구통계학적 변수를 요약한 표이다.
도 11은 매치되지 않은 원발성 및 재발성 HNSCC 시편에서 NRG1 발현의 수준을 비교하는 qRT-PCR 분석을 보여준다.
도 12는 매치된 원발성 및 재발성 HNSCC에서 NRG1 발현의 수준을 비교하는 qRT-PCR 분석을 보여준다.
도 13은 매치된 요법-나이브 및 요법후 HNSCC 사이의 비교를 보여주는 표이다.
도 14는 매치된 요법 나이브 및 화학요법후 HNSCC 샘플 사이에서의 NRG1 또는 HER3 발현의 변화 및 자가분비 생물학을 보여주는 표이다. 데피니언스(Definiens) 소프트웨어를 이용하여 대비염색된 핵 내에서의 NRG1 또는 HER3 또는 둘 다의 전사체의 발현을 검출하였다.
도 15는 원발성 및 재발성 SCHNN에서 NRG1 (A) 및 HER3 (B)의 RNA-ISH 및 qRT-PCR의 쌍형성-방식 분석을 보여준다. 스피어만(Spearman) 순위 상관관계 및 p-값이 그래프 상에 제시된다.
도 16은 HNSCC 및 CRC 환자의 NRG1 발현 수준을 보여준다.
도 17은 상 1 연구에서 HNSCC 환자의 NRG1 발현 수준과 비교한 원발성 및 재발성 HNSCC에서의 NRG1 발현 수준을 보여준다.
도 18은 항체 MEHD7945A의 아미노산 서열 (서열 1 및 2)을 보여준다.

I. 정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 업계 용어, 표기 및 다른 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 갖는다. 일부 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어가 그 의미를 명료하게 하고/하거나 용이하게 참조하기 위해 본원에 정의되고, 이러한 정의를 본원에 포함시키는 것이 반드시 당업계에서 일반적으로 이해되고 있는 것과 비교하여 실질적인 차이를 나타내는 것으로 간주되지 않아야 한다. 본원에 기재되거나 참고된 기술 및 절차는 일반적으로, 널리 이해되고 있고, 당업자가 통상의 방법론, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 기재된 광범위하게 활용되는 분자 클로닝 방법론을 이용하여 통상적으로 활용하고 있다. 적절한 경우에, 상업적으로 입수가능한 키트 및 시약의 사용을 포함하는 절차는 일반적으로 달리 나타내지 않는 한 제조업체가 규정한 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 수행한다.

따라서, 본 발명의 방법, 키트 및 용도를 기재하기 이전에, 본 발명은 기재된 특정한 방법론, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 구축물 및 시약 그 자체로 제한되지 않으며, 이들이 또한 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정한 실시양태만을 기재하기 위한 목적을 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니며, 이 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될 것으로 이해되어야 한다.

본원에 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 언급되지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다는 것을 주지해야 한다.

본 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급한 정수 또는 정수 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수 군을 배제하지는 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.

본원의 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체, 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다. 용어 "다중특이적 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 다중에피토프 특이성을 갖는 (즉, 하나의 생물학적 분자 상의 2개 이상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 2개 이상의 상이한 생물학적 분자 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는) 항원 결합 도메인을 포함하는 항체를 포함한다. 항원 결합 도메인의 하나의 특정 예는 중쇄 가변 도메인 (V_H) 및 경쇄 가변 도메인 (V_L)으로 구성된 V_HV_L 단위이다. 이러한 다중특이적 항체로는 전장 항체, 2개 이상의 V_L 및 V_H 도메인을 갖는 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fv, dsFv, scFv, 디아바디, 이중특이적 디아바디 및 트리아바디, 공유결합에 의해 또는 비공유결합에 의해 연결된 항체 단편이 포함되나, 이들로 한정되는 것은 아니다. "이중특이적 항체"는 1개의 생물학적 분자 상의 2개의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 2개의 상이한 생물학적 분자 상의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항원-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 또한 "이중 특이성"을 갖는 것으로 또는 "이중 특이적"인 것으로 본원에서 지칭된다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 그의 표적 HER 또는 HER들에 대해 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10^-8 M 이하, 예를 들어, 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들어, 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.

기본적인 4-쇄 항체 단위는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 이종사량체 당단백질이다 (IgM 항체는 J 쇄라 불리는 추가의 폴리펩티드와 함께 5개의 기본적인 이종사량체 단위로 이루어지며, 따라서 10개의 항원 결합 부위를 함유하는 한편, 분비형 IgA 항체는 중합되어 J 쇄와 함께 기본적인 4-쇄 단위를 2-5개 포함하는 다가 조립체를 형성할 수 있음). IgG의 경우에, 4-쇄 단위는 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 쇄는 1개의 공유 디술피드 결합에 의해 H 쇄에 연결되지만, 2개의 H 쇄는 H 쇄 이소형에 따라 1개 이상의 디술피드 결합에 의해 서로 연결된다. 또한, 각각의 H 및 L 쇄는 일정한 간격을 두고 이격된 쇄내 디술피드 가교를 갖는다. 각각의 H 쇄는 N-말단에 가변 도메인 (V_H)을 가지며, 이어서 α 및 γ 쇄 각각의 경우에 3개의 불변 도메인 (C_H), μ 및 ε 이소형의 경우에 4개의 C_H 도메인을 갖는다. 각 L 쇄는 N-말단에 가변 도메인 (V_L), 이어서 다른쪽 말단에 불변 도메인 (C_L)을 갖는다. V_L은 V_H와 정렬되고, C_L은 중쇄의 제1 불변 도메인 (C_H1)과 정렬된다. 특정한 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 인터페이스를 형성한다고 여겨진다. V_H 및 V_L의 쌍형성은 함께 단일 항원-결합 부위를 형성한다. 상이한 부류의 항체의 구조 및 특성에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6]을 참조한다.

임의의 척추동물 종으로부터의 L 쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파 및 람다라고 불리는 명백하게 특징적인 2종의 유형 중 1종에 배정될 수 있다. 이뮤노글로불린은 중쇄의 불변 도메인 (C_H)의 아미노산 서열에 따라 상이한 부류 또는 이소형으로 배정될 수 있다. 5종의 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 각각 α, δ, γ, ε 및 μ로 지칭되는 중쇄를 갖는다. γ 및 α 부류는 C_H 서열 및 기능에 있어서의 상대적으로 작은 차이점에 기초하여 하위부류로 추가로 분류되며, 예를 들어 인간은 하기 하위부류: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 발현한다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 절편의 서열이 항체마다 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원-결합을 매개하고, 특정한 항체의 그의 특정한 항원에 대한 특이성을 규정한다. 그러나, 가변성이 가변 도메인의 110개 아미노산 범위에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 대신에, V 영역은 가변성이 극도로 높아 "초가변 영역" 또는 HVR이라 불리는 보다 짧은 영역에 의해 분리된, 15-30개의 아미노산의 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 비교적 불변성인 스트레치로 이루어진다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각, 베타-시트 배위를 주로 채택하는 4개의 FR을 포함하고, 이들은 상기 베타-시트 구조를 연결하며 일부 경우에는 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된다. 각 쇄로부터의 초가변 영역은 FR에 의해 서로 근접하게 위치하고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하지는 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체의 참여를 나타낸다.

본원에 사용된 경우에 용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열 내에서 초가변적이고/거나 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 내에 3개 (HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3) 및 VL 내에 3개 (HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서 가장 높은 다양성을 나타내고, 특히 H3은 항체에 정밀한 특이성을 부여하는데 특유의 역할을 수행한다고 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄만으로 이루어진 자연 발생 낙타류 항체는 경쇄의 부재 하에 기능적이고 안정하다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.

HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 가변성이 가장 높고/거나 항원 인식과 관련된다. 다수의 HVR 설명이 사용되고 있고 본원에 포괄된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기반으로 하며, 가장 통상적으로 사용된다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 대신, 코티아는 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM HVR은 카바트 HVR 및 코티아 구조적 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기반으로 한다. 각각의 이러한 HVR로부터의 잔기는 하기 언급된다.

HVR은 하기와 같이 "확장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3) 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 47-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 이들 정의에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.

"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 바와 같은 HVR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 넘버링" 및 그의 변형은 카바트 등의 상기 문헌에서 항체 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이것으로의 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 후에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 후에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 주어진 항체에 대해, 항체 서열을 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 상동성 영역에서 정렬하여 결정할 수 있다.

카바트 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)을 언급하기 위해 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"는 일반적으로 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역의 잔기를 지칭하는 경우에 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 보고된 EU 인덱스). "카바트에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 넘버링을 지칭한다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다 (예를 들어, WO 2006/073941 참조).

"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내인성 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것들을 비롯하여 당업계에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다.

"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 그의 하나 이상의 HVR에 하나 이상의 변경을 갖는 것이다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 특정 절차를 이용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 기재하고 있다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 예를 들어 문헌 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.

항체의 "부류"는 그의 중쇄에 의해 보유되는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5종의 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는, 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터의 항체를 의미한다 (즉, 상기 집단을 구성하는 개별 항체들은, 모노클로날 항체의 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체 (일반적으로 소량으로 존재함)를 제외하고는, 실질적으로 유사하며 동일한 에피토프(들)에 결합한다. 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로, 표적에 결합하는 가변 영역을 포함하는 항체를 포함하며, 상기 항체는 다수의 항체로부터의 항체 선택을 포함하는 과정에 의해 얻어졌다. 예를 들어, 선택 방법은 복수 개의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 특유한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 항체는, 예를 들어 표적에 대한 친화도를 향상시키고, 항체를 인간화하고, 세포 배양에서의 항체 생산을 향상시키고, 생체내 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체를 생성하는 등의 목적을 위해 추가로 변형될 수 있으며, 변형된 가변 영역 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임을 이해해야 한다. 모노클로날 항체 제제는 그의 특이성 이외에도 다른 이뮤노글로불린에 의해 전형적으로 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 특징이 실질적으로 동종의 항체 집단으로부터 수득된 것임을 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생산이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 다양한 기술, 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J.Mol.Biol.340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); 및 Lee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)] 참조) 및 인간 이뮤노글로불린 로커스 또는 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물로부터 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하는 기술 (예를 들어, WO98/24893, WO/9634096, WO/9633735 및 WO/91 10741, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (모두 젠팜(GenPharm)); 5,545,807; WO 97/17852, 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016, 및 [Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); 및 Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)] 참조)에 의해 제조될 수 있다.

"무손상" 항체는 C_L 및 적어도 중쇄 불변 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3 뿐만 아니라 항원-결합 부위를 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 바람직하게는, 무손상 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다.

"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 바람직하게는 무손상 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', F(ab')₂, Fab'-SH; 디아바디; 선형 항체 (미국 특허 번호 5,641,870 (실시예 2); 문헌 [Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)] 참조); 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv)를 포함한다. 본 발명의 설명 및 명세서 전체에 걸쳐 항체 및 항체의 다양한 특성이 언급되는 경우, 동일한 개시 내용은 또한 기능적 항체 단편, 예를 들어 이중 작용 Fab 단편에 적용된다.

"선형 항체"란 표현은 일반적으로, 문헌 [Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)]에 기재된 항체를 나타낸다. 이러한 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원-결합 영역을 형성하는 한 쌍의 직렬식 Fd 세그먼트 (V_H-C_H1-V_H-C_H1)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 단편은 "기능적"이며, 즉 상응하는 무손상 항체가 표적 HER 수용체에 결합하는 능력을 질적으로 유지하고, 무손상 항체가 또한 HER 활성화 또는 기능을 억제한다면 또한 이러한 억제 특성을 질적으로 유지한다. 질적인 보유는 활성이 유형적으로 동일하게 유지된다는 것을 의미하지만, 결합 친화도 및/또는 활성의 정도는 상이할 수 있다.

항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편이라고 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 나머지 "Fc" 단편이 생산되는데, 이 명칭은 용이하게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. Fab 단편은 H 쇄의 가변 영역 도메인 (V_H) 및 1개 중쇄의 제1 불변 도메인 (C_H1)과 함께 전체 L 쇄로 이루어진다. 항체의 펩신 처리는 2가 항원-결합 활성을 갖는 2개의 디술피드 연결된 Fab 단편에 대략적으로 상응하며 항원을 여전히 가교할 수 있는 큰 단일 F(ab')₂ 단편을 생성한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 C_H1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 추가된 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다.

Fc 단편은 디술피드에 의해 함께 결합되어 있는 H 쇄 둘 다의 카르복시-말단 부분을 포함한다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역 내의 서열에 의해 결정되고, 이 영역은 또한 특정 유형의 세포 상에서 발견되는 Fc 수용체 (FcR)에 의해 인식되는 부분이다.

"Fv"는 강한 비공유 회합 상태의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들 2개의 도메인이 폴딩되어 6개의 초가변 루프 (H 및 L 쇄로부터 각각 3개의 루프)가 형성되는데, 이는 항원-결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도, 종종 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

"단일-쇄 Fv" ("sFv" 또는 "scFv"로도 약칭됨)는 단일 폴리펩티드 쇄 내로 연결된 V_H 및 V_L 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, sFv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, V_H 및 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 검토를 위해, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995]을 참조한다.

용어 "디아바디"는 V_H 및 V_L 도메인 사이의 짧은 링커 (약 5-10개 잔기)로 sFv 단편 (상기 단락 참조)을 구축함으로써 V 도메인의 쇄내 쌍형성이 아닌 쇄간 쌍형성을 달성하여 2가 단편, 즉 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편을 생성하여 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.

참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하고, 반대로 경쟁 검정에서 참조 항체가 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭한다.

용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 다른 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.

"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 배제된다.

"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시에 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 III이다.

비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화도 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에 없는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되도록 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 임의로, 인간화 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것도 또한 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.

관심 항원에 "결합하는" 본 발명의 항체는, 항체가 단백질 또는 항원을 발현하는 세포 또는 조직의 표적화시에 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 항원에 결합하는 항체이다. 표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련해서, 특정한 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드 표적 상의 에피토프와의 "특이적 결합" 또는 "~에 특이적으로 결합한다" 또는 "~에 대해 특이적"이라는 용어는 비-특이적 상호작용과 측정가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 분자의 결합을 대조군 분자의 결합과 비교하여 결정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자, 예를 들어 과량의 비표지 표적과의 경쟁에 의해 측정할 수 있다. 이 경우, 프로브에 대한 표지된 표적의 결합이 과량의 비-표지된 표적에 의해 경쟁적으로 억제된다면 이는 특이적 결합임을 나타낸다. 한 특정한 실시양태에서, "특이적으로 결합하다"는 항체가 그의 지정된 표적 HER 수용체에에 결합하지만 다른 지정된 비-표적 HER 수용체에는 결합하지 않는다는 것을 지칭한다. 예를 들어, 항체는 EGFR 및 HER3에 특이적으로 결합하지만, HER2 또는 HER4에 특이적으로 결합하지 않거나, 또는 항체는 EGFR 및 HER2에 특이적으로 결합하지만, HER3 또는 HER4에 특이적으로 결합하지 않거나, 또는 항체는 EGFR 및 HER4에 특이적으로 결합하지만, HER2 또는 HER3에 특이적으로 결합하지 않는다.

"HER 수용체"는 HER 수용체 패밀리에 속하는 수용체 단백질 티로신 키나제이고, EGFR (ErbB1, HER1), HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3) 및 HER4 (ErbB4) 수용체를 포함한다. HER 수용체는 일반적으로 HER 리간드에 결합할 수 있고/있거나 또 다른 HER 수용체 분자와 이량체화할 수 있는 세포외 도메인; 친지성 막횡단 도메인; 보존된 세포내 티로신 키나제 도메인; 및 인산화될 수 있는 여러 개의 티로신 잔기를 갖는 카르복실-말단 신호전달 도메인을 포함할 것이다. HER 수용체는 "천연 서열" HER 수용체 또는 그의 "아미노산 서열 변이체"일 수 있다. 바람직하게는 HER 수용체는 천연 서열 인간 HER 수용체이다.

"HER 경로"는 HER 수용체 패밀리에 의해 매개되는 신호전달 네트워크를 지칭한다.

"ErbB1", "HER1", "표피 성장 인자 수용체" 및 "EGFR"은 본원에서 교환가능하게 사용되고, 예를 들어 그의 자연 발생 돌연변이체 형태 (예를 들어, 문헌 [Ullrich et al., Nature (1984) 309:418425 및 Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)]에서와 같은 결실 돌연변이체 EGFR), 뿐만 아니라 그의 변이체, 예컨대 EGFRvIII를 비롯하여 문헌 [Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987)]에 개시되어 있는 바와 같은 EGFR을 지칭한다. 또한, EGFR의 변이체는 결실, 치환 및 삽입 변이체, 예를 들어 문헌 [Lynch et al. (New England Journal of Medicine 2004, 350:2129), Paez et al. (Science 2004, 304:1497), 및 Pao et al. (PNAS 2004, 101:13306)]에 기재된 것들을 포함한다.

본원에서, "EGFR 세포외 도메인" 또는 "EGFR ECD"는 세포막에 고정된 또는 순환 중인, 세포 외부에 있는 EGFR의 도메인을 지칭하고, 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, EGFR의 세포외 도메인은 4개의 도메인: "도메인 I" (아미노산 잔기 약 1-158), "도메인 II" (아미노산 잔기 159-336), "도메인 III" (아미노산 잔기 337-470), 및 "도메인 IV" (아미노산 잔기 471-645)를 포함할 수 있으며, 이때 경계는 대략적이며 약 1-3개의 아미노산 만큼 상이할 수 있다.

표현 "ErbB2" 및 "HER2"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, 예를 들어 문헌 [Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) 및 Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986)]에 기재된 바와 같은 인간 HER2 단백질 (진뱅크(Genebank) 등록 번호 X03363)을 지칭한다. 용어 "erbB2"는 인간 HER2를 코딩하는 유전자를 지칭하고, "neu"는 래트 p185^neu를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 바람직한 HER2는 천연 서열 인간 HER2이다.

본원에서, "HER2 세포외 도메인" 또는 "HER2 ECD"는 세포 막에 고정된 또는 순환 중인, 세포 외부에 있는 HER2의 도메인을 지칭하고, 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, HER2의 세포외 도메인은 4개의 도메인을 포함할 수 있다: "도메인 I" (아미노산 잔기 약 1-195), "도메인 II" (아미노산 잔기 약 196-319), "도메인 III" (아미노산 잔기 약 320-488) 및 "도메인 IV" (아미노산 잔기 약 489-630) (신호 펩티드를 제외한 잔기 넘버링). 문헌 [Garrett et al. Mol. Cell.. 11: 495-505 (2003), Cho et al. Nature 421: 756-760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004), 및 Plowman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993)]을 참조한다.

"ErbB3" 및 "HER3"은 예를 들어 미국 특허 번호 5,183,884 및 5,480,968 뿐만 아니라 문헌 [Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)]에 개시된 바와 같은 수용체 폴리펩티드를 지칭한다.

본원에서, "HER3 세포외 도메인" 또는 "HER3 ECD"는 세포 막에 고정된 또는 순환 중인, 세포 외부에 있는 HER3의 도메인을 지칭하고, 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, HER3의 세포외 도메인은 4개의 도메인: 도메인 I, 도메인 II, 도메인 III 및 도메인 IV를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, HER3 ECD는 아미노산 1-636 (신호 펩티드를 포함하여 넘버링함)을 포함한다. 한 실시양태에서, HER3 도메인 III는 아미노산 328-532 (신호 펩티드를 포함하여 넘버링함)를 포함한다.

본원에서 용어 "ErbB4" 및 "HER4"는 예를 들어 유럽 특허 출원 번호 599,274; 문헌 [Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); 및 Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)]에 개시된 바와 같은 수용체 폴리펩티드 (예를 들어, 1999년 4월 22일에 공개된 WO99/19488에 개시된 것과 같은 그의 이소형 포함)를 지칭한다.

"HER 리간드"는 HER 수용체에 결합하고/하거나 활성화시키는 폴리펩티드를 의미한다. 본원에서 특히 관심 대상인 HER 리간드는 천연 서열 인간 HER 리간드, 예컨대 표피 성장 인자 (EGF) (문헌 [Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)]); 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α) (문헌 [Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)]); 슈반세포종 또는 각질세포 자가분비 성장 인자로도 공지되어 있는 암피레귤린 (문헌 [Shoyab et al. Science 243:1074-1076 (1989); Kimura et al. Nature 348:257-260 (1990); 및 Cook et al. Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557 (1991)]); 베타셀룰린 (문헌 [Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993); 및 Sasada et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)]); 헤파린 결합 표피 성장 인자 (HB-EGF) (문헌 [Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)]); 에피레귤린 (문헌 [Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995); 및 Komurasaki et al. Oncogene 15:2841-2848 (1997)]); 뉴레귤린1 (NRG1), 뉴레귤린-2 (NRG2) (문헌 [Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)]), 뉴레귤린-3 (NRG3) (문헌 [Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:9562-9567 (1997)]), 및 뉴레귤린-4 (NRG4) (문헌 [Harari et al. Oncogene 18:2681-89 (1999)])를 포함하는 뉴레귤린; 및 크립토 (CR-1) (문헌 [Kannan et al. J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335 (1997)])이다. EGFR에 결합하는 HER 리간드는 EGF, TGF-α, 암피레귤린, 베타셀룰린, HB-EGF 및 에피레귤린을 포함한다. HER3에 결합하는 HER 리간드는 NRG1 및 NRG2를 포함한다. HER4에 결합할 수 있는 HER 리간드는 베타셀룰린, 에피레귤린, HB-EGF, NRG1, NRG2, NRG3 및 NRG4를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "NRG"는 달리 나타내지 않는 한 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는, 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 뉴레귤린 (또한, 헤레귤린(HRG)으로 공지됨)을 지칭한다. 용어는 "전장" 비프로세싱된 NRG 뿐만 아니라 자연적 프로세싱으로부터 생성된 임의의 형태의 NRG를 포괄한다. 용어는 또한 NRG의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다. 4가지 공지된 형태의 NRG가 존재한다: NRG1 (문헌 [Holmes, W.E. et al., Science 256:1205-1210 (1992)]); NRG2 (문헌 [Caraway, K.L. et al., Nature 387:512-516 (1997)]); NRG3 (문헌 [Zhang, E. et al., Proc Natl Acad Sci USA 94:9562-9567)]); 및 NRG4 (문헌 [Harari, D. et al., Oncogene 18:2681-2689)]). 대안적 스플라이싱으로 인해, 수용체 결합에 요구되는 NRG1 EGF-유사 도메인의 2가지 활성 이소형 (NRG1알파 (NRG1α) 및 NRG1베타 (NRGβ)로 지칭됨)이 존재한다. 예시적인 인간 NRG1의 서열은 진뱅크 등록 번호 BK000383에 제시된다 (문헌 [Falls, D. L., Ex Cell Res, 284:14-30 (2003)] 및 미국 특허 번호 5,367,060). 한 실시양태에서, NRG1은 스위스 프롯(Swiss Prot) 등록 번호 Q7RTV8의 아미노산 서열 (서열 9)을 포함한다.

본원에서 "HER 이량체"는 2개 이상의 HER 수용체를 포함하는 비공유결합에 의해 회합된 이량체이다. 이러한 복합체는 2개 이상의 HER 수용체를 발현하는 세포가 HER 리간드에 노출되는 경우에 형성될 수 있고, 예를 들어 문헌 [Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)]에 기재된 바와 같이 면역침전에 의해 단리되고 SDS-PAGE에 의해 분석될 수 있다. 다른 단백질, 예를 들어 시토킨 수용체 서브유닛 (예를 들어, gp130)이 이량체와 회합될 수 있다.

본원에서 "HER 이종이량체"는 2개 이상의 상이한 HER 수용체를 포함하는 비공유결합에 의해 회합된 이종이량체, 예컨대 EGFR-HER2, EGFR-HER3, EGFR-HER4, HER2-HER3 또는 HER2-HER4 이종이량체이다.

"HER 억제제"는 HER 활성화 또는 기능을 저해하는 물질이다. HER 억제제의 예는 HER 항체 (예를 들어, EGFR, HER2, HER3 또는 HER4 항체); EGFR-표적화 약물; 소분자 HER 길항제; HER 티로신 키나제 억제제; HER2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 억제제, 예컨대 라파티닙/GW572016; 안티센스 분자 (예를 들어, WO2004/87207 참조); 및/또는 하류 신호전달 분자에 결합하거나 또는 그의 기능을 저해하는 작용제, 예컨대 MAPK 또는 Akt를 포함한다. 한 실시양태에서, HER 억제제는 HER 수용체에 결합하는 항체이다. 한 실시양태에서, HER 억제제는 HER3 억제제이다. 실시양태에서, 억제제는 이중특이적 HER 억제제, 예컨대 HER3 및 EGFR, HER3 및 HER2, 또는 HER3 및 HER4를 둘 다 억제하는 것이다. 한 실시양태에서, HER 억제제는 HER3 및 EGFR 둘 다에 특이적인 이중특이적 항체이다. 이러한 억제제의 한 예는 또한 MEHD7945A로 알려져 있는 이중특이적 항체 DL11f이다.

"HER 이량체화 억제제" 또는 "HDI"는 HER 동종이량체 또는 HER 이종이량체의 형성을 억제하는 작용제이다. 바람직하게는, HER 이량체화 억제제는 항체이다. 그러나, HER 이량체화 억제제는 또한 펩티드 및 비-펩티드 소분자, 및 HER 동종- 또는 이종이량체의 형성을 억제하는 다른 화학 물질을 포함한다.

"HER 이량체화를 억제하는" 항체는 기반이 되는 메카니즘과 관계없이 HER 이량체의 형성을 억제하거나 또는 방해하는 항체이다. 한 실시양태에서, 이러한 항체는 HER2에 그의 이종이량체 결합 부위에서 결합한다. 항체의 이량체화를 억제하는 것의 한 특정한 예는 페르투주맙 (Pmab) 또는 MAb 2C4이다. HER 이량체화 억제제의 다른 예는 EGFR에 결합하여 그의 하나 이상의 다른 HER 수용체와의 이량체화를 억제하는 항체 (예를 들어, 활성화된 또는 "테더링되지 않은" EGFR에 결합하는 EGFR 모노클로날 항체 806, MAb 806; 문헌 [Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)] 참조); HER3에 결합하여 그의 하나 이상의 다른 HER 수용체와의 이량체화를 억제하는 항체; HER4에 결합하여 그의 하나 이상의 다른 HER 수용체와의 이량체화를 억제하는 항체; 펩티드 이량체화 억제제 (미국 특허 번호 6,417,168); 안티센스 이량체화 억제제 등을 포함한다.

본원에 사용된 "EGFR 길항제" 또는 "EGFR 억제제"는 EGFR에 특이적으로 결합하고, 그의 신호전달 활성을 방지하거나 또는 감소시키며, HER2, HER3 또는 HER4에는 특이적으로 결합하지 않는 화합물을 지칭한다. 이러한 작용제의 예는 EGFR에 결합하는 항체 및 소분자를 포함한다. EGFR에 결합하는 항체의 예는 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (미국 특허 번호 4,943, 533 (Mendelsohn et al.) 참조) 및 그의 변이체, 예컨대 키메라화 225 (C225 또는 세툭시맙; 에르비툭스(ERBITUX)®) 및 재형성된 인간 225 (H225) (WO 96/40210 (임클론 시스템즈 인크.(Imclone Systems Inc.)) 참조); IMC-11F8, 완전 인간, EGFR-표적화된 항체 (임클론); 유형 II 돌연변이체 EGFR에 결합하는 항체 (미국 특허 번호 5,212,290); 미국 특허 번호 5,891,996에 기재된 바와 같이 EGFR에 결합하는 인간화 및 키메라 항체; 및 EGFR에 결합하는 인간 항체, 예컨대 ABX-EGF 또는 파니투무맙 (WO98/50433 (아브게닉스(Abgenix)/암젠(Amgen)) 참조); EMD 55900 (문헌 [Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)]); EMD7200 (마투주맙) EGFR 결합에 대해 EGF 및 TGF-알파 둘 다와 경쟁하는 EGFR에 대해 지시된 인간화 EGFR 항체 (EMD/머크(Merck)); 인간 EGFR 항체, 휴맥스-EGFR(HuMax-EGFR) (젠맙(GenMab)); E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 및 E7.6.3로 알려져 있으며 US 6,235,883에 기재된 완전 인간 항체; MDX-447 (메다렉스 인크(Medarex Inc)); 및 mAb 806 또는 인간화 mAb 806 (문헌 [Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)])을 포함한다. 항-EGFR 항체는 세포독성제와 접합될 수 있으며, 이에 따라 면역접합체를 생성한다 (예를 들어, EP659,439A2, 머크 페이턴트 게엠베하(Merck Patent GmbH)). EGFR 길항제는 미국 특허 번호 5,616,582, 5,457,105, 5,475,001, 5,654,307, 5,679,683, 6,084,095, 6,265,410, 6,455,534, 6,521,620, 6,596,726, 6,713,484, 5,770,599, 6,140,332, 5,866,572, 6,399,602, 6,344,459, 6,602,863, 6,391,874, 6,344,455, 5,760,041, 6,002,008 및 5,747,498, 뿐만 아니라 하기 PCT 공보: WO98/14451, WO98/50038, WO99/09016 및 WO99/24037에 기재된 화합물과 같은 소분자를 포함한다. 특정한 소분자 EGFR 길항제는 OSI-774 (CP-358774, 에를로티닙, 타르세바(TARCEVA)®, 제넨테크(Genentech)/OSI 파마슈티칼스(OSI Pharmaceuticals)); PD 183805 (CI 1033, 2-프로펜아미드, N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-6-퀴나졸리닐]-, 디히드로클로라이드, 화이자 인크.(Pfizer Inc.)); ZD1839, 게피티닙 (이레사(IRESSA)®) 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린, 아스트라제네카(AstraZeneca)); ZM 105180 ((6-아미노-4-(3-메틸페닐-아미노)-퀴나졸린, 제네카); BIBX-1382 (N8-(3-클로로-4-플루오로-페닐)-N2-(1-메틸-피페리딘-4-일)-피리미도[5,4-d]피리미딘-2,8-디아민, 베링거 잉겔하임(Boehringer Ingelheim)); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-페닐에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀); (R)-6-(4-히드록시페닐)-4-[(1-페닐에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘); CL-387785 (N-[4-[(3-브로모페닐)아미노]-6-퀴나졸리닐]-2-부틴아미드); EKB-569 (N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-3-시아노-7-에톡시-6-퀴놀리닐]-4-(디메틸아미노)-2-부텐아미드) (와이어쓰(Wyeth)); AG1478 (수젠(Sugen)); 및 AG1571 (SU 5271; 수젠)을 포함한다.

"HER 항체"는 HER 수용체에 결합하는 항체이다. 임의로, HER 항체는 추가로 HER 활성화 또는 기능을 방해한다. 특정한 HER2 항체는 페르투주맙 및 트라스투주맙을 포함한다. 특정 EGFR 항체의 예는 세툭시맙 및 파니투무맙을 포함한다. 예시적인 항-HER3 항체는 WO2011076683 (Mab205.10.1, Mab205.10.2, Mab205.10.3), US7846440; US7705130 및 US5968511에 기재되어 있다.

HER 항체와 관련된 특허 공개는 다음을 포함한다: US 5,677,171, US 5,720,937, US 5,720,954, US 5,725,856, US 5,770,195, US 5,772,997, US 6,165,464, US 6,387,371, US 6,399,063, US2002/0192211A1, US 6,015,567, US 6,333,169, US 4,968,603, US 5,821,337, US 6,054,297, US 6,407,213, US 6,719,971, US 6,800,738, US2004/0236078A1, US 5,648,237, US 6,267,958, US 6,685,940, US 6,821,515, WO98/17797, US 6,333,398, US 6,797,814, US 6,339,142, US 6,417,335, US 6,489,447, WO99/31140, US2003/0147884A1, US2003/0170234A1, US2005/0002928A1, US 6,573,043, US2003/0152987A1, WO99/48527, US2002/0141993A1, WO01/00245, US2003/0086924, US2004/0013667A1, WO00/69460, WO01/00238, WO01/15730, US 6,627,196B1, US 6,632,979B1, WO01/00244, US2002/0090662A1, WO01/89566, US2002/0064785, US2003/0134344, WO 04/24866, US2004/0082047, US2003/0175845A1, WO03/087131, US2003/0228663, WO2004/008099A2, US2004/0106161, WO2004/048525, US2004/0258685A1, US 5,985,553, US 5,747,261, US 4,935,341, US 5,401,638, US 5,604,107, WO 87/07646, WO 89/10412, WO 91/05264, EP 412,116 B1, EP 494,135 B1, US 5,824,311, EP 444,181 B1, EP 1,006,194 A2, US 2002/0155527A1, WO 91/02062, US 5,571,894, US 5,939,531, EP 502,812 B1, WO 93/03741, EP 554,441 B1, EP 656,367 A1, US 5,288,477, US 5,514,554, US 5,587,458, WO 93/12220, WO 93/16185, US 5,877,305, WO 93/21319, WO 93/21232, US 5,856,089, WO 94/22478, US 5,910,486, US 6,028,059, WO 96/07321, US 5,804,396, US 5,846,749, EP 711,565, WO 96/16673, US 5,783,404, US 5,977,322, US 6,512,097, WO 97/00271, US 6,270,765, US 6,395,272, US 5,837,243, WO 96/40789, US 5,783,186, US 6,458,356, WO 97/20858, WO 97/38731, US 6,214,388, US 5,925,519, WO 98/02463, US 5,922,845, WO 98/18489, WO 98/33914, US 5,994,071, WO 98/45479, US 6,358,682 B1, US 2003/0059790, WO 99/55367, WO 01/20033, US 2002/0076695 A1, WO 00/78347, WO 01/09187, WO 01/21192, WO 01/32155, WO 01/53354, WO 01/56604, WO 01/76630, WO02/05791, WO 02/11677, US 6,582,919, US2002/0192652A1, US 2003/0211530A1, WO 02/44413, US 2002/0142328, US 6,602,670 B2, WO 02/45653, WO 02/055106, US 2003/0152572, US 2003/0165840, WO 02/087619, WO 03/006509, WO03/012072, WO 03/028638, US 2003/0068318, WO 03/041736, EP 1,357,132, US 2003/0202973, US 2004/0138160, US 5,705,157, US 6,123,939, EP 616,812 B1, US 2003/0103973, US 2003/0108545, US 6,403,630 B1, WO 00/61145, WO 00/61185, US 6,333,348 B1, WO 01/05425, WO 01/64246, US 2003/0022918, US 2002/0051785 A1, US 6,767,541, WO 01/76586, US 2003/0144252, WO 01/87336, US 2002/0031515 A1, WO 01/87334, WO 02/05791, WO 02/09754, US 2003/0157097, US 2002/0076408, WO 02/055106, WO 02/070008, WO 02/089842, WO 03/86467, WO 2010/108127, 및 WO 2011/076683.

"HER 활성화"는 임의의 하나 이상의 HER 수용체의 활성화 또는 인산화를 지칭한다. 일반적으로, HER 활성화는 신호 전달 (예를 들어, HER 수용체 또는 기질 폴리펩티드 내의 티로신 잔기를 인산화시키는 HER 수용체의 세포내 키나제 도메인에 의해 유도됨)을 발생시킨다. HER 활성화는 관심 HER 수용체를 포함하는 HER 이량체에 대한 HER 리간드 결합에 의해 매개될 수 있다. HER 이량체에 대한 HER 리간드 결합은 이량체 내의 하나 이상의 HER 수용체의 키나제 도메인을 활성화시킬 수 있고, 이에 의해 하나 이상의 HER 수용체 내의 티로신 잔기의 인산화 및/또는 추가의 기질 폴리펩티드(들), 예를 들어, Akt 또는 MAPK 세포내 키나제 내의 티로신 잔기를 인산화시킨다.

"인산화"는 단백질, 예컨대 HER 수용체, 또는 그의 기질에 하나 이상의 포스페이트 기(들)가 부가되는 것을 지칭한다.

HER2 상의 "이종이량체 결합 부위"는 EGFR, HER3 또는 HER4와 이량체를 형성할 때 이들의 세포외 도메인 내의 영역과 접촉하거나 인터페이스를 이루는 HER2의 세포외 도메인 내의 영역을 지칭한다. 상기 영역은 HER2의 도메인 II에서 발견된다. 문헌 [Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)].

HER2의 "이종이량체 결합 부위에 결합하는" HER2 항체는 도메인 II의 잔기에 결합하고 (임의로 또한 HER2 세포외 도메인의 다른 도메인, 예를 들어 도메인 I 및 III의 잔기에도 결합하고), HER2-EGFR, HER2-HER3 또는 HER2-HER4 이종이량체의 형성을 적어도 어느 정도로 입체적으로 방해할 수 있다. 문헌 [Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)]에서는 HER2-페르투주맙 결정 구조 (RCSB 단백질 데이터 뱅크에 기탁됨 (ID Code IS78))를 특성화하여, HER2의 이종이량체 결합 부위에 결합하는 예시적인 항체를 설명한다.

HER2의 "도메인 II에 결합하는" 항체는 도메인 II의 잔기 및 임의로 HER2의 다른 도메인(들), 예를 들어 도메인 I 및 III의 잔기에 결합한다.

본원에 개시된 다양한 항체를 기재하는 데 사용되는 경우 "단리된"은 항체를 발현하는 세포 또는 세포 배양물로부터 확인 및 분리되고/되거나 회수된 항체를 의미한다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 전형적으로 폴리펩티드의 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비-환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질해질 때까지 정제될 것이다. 폴리펩티드 자연 환경의 적어도 한 성분도 존재하지 않을 것이므로, 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 폴리펩티드는 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 항-HER 항체는 단리된 항체이다.

용어 "제어 서열"은 특정한 숙주 유기체 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은 예를 들어 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 공지되어 있다.

핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더의 DNA는 폴리펩티드에 대한 DNA가 상기 폴리펩티드의 분비에 수반되는 프리단백질로서 발현되는 경우에 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고; 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미칠 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이며; 또는 리보솜 결합 부위는 코딩 서열의 번역을 용이하게 하도록 배치될 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 인접하여 위치하고 리딩 상 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 실시에 따라 사용한다.

참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성 퍼센트 달성을 위해 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방식, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 당업자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 ％ 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.

ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다:

X/Y의 분율 x 100

여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 ％ 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 상기 단락에 기재한 바와 같이 수득한다.

혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 실험적으로 계산된다. 일반적으로, 프로브가 길수록 적절한 어닐링을 위해 더 높은 온도가 필요하고, 프로브가 짧으면 보다 낮은 온도가 필요하다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 그의 용융 온도 미만의 환경에 존재할 때 변성 DNA가 재어닐링되는 능력에 따라 결정된다. 프로브와 혼성화 가능 서열 사이의 바람직한 상동성 정도가 클수록 사용될 수 있는 상대적 온도가 더 높다. 그 결과, 보다 높은 상대 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 만들고, 보다 낮은 온도는 덜 엄격하게 만드는 경향이 있다. 혼성화 반응의 엄격도에 대한 추가의 상세한 내용 및 설명에 대해 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)]을 참조한다.

본원에 정의된 바와 같은 "엄격한 조건" 또는 "고 엄격도 조건"은 다음에 의해 확인될 수 있다. (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 5℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 것; (2) 혼성화 동안 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 50％ (v/v) 포름아미드와 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ 피콜(Ficoll)/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5)와 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨을 42℃에서 사용하는 것; 또는 (3) 42℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨)로의 10분 세척에 이어 55℃에서 EDTA 함유 0.1 x SSC로 이루어진 10분의 고-엄격도 세척과 함께, 42℃에서 50％ 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트(Denhardt) 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA (50 μg/ml), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 술페이트를 사용하여 용액 중에서 밤새 혼성화하는 것.

"중간 정도의 엄격한 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인할 수 있고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 세척 용액 및 혼성화 조건 (예를 들어, 온도, 이온 강도 및 ％SDS)을 사용하는 것을 포함한다. 중간 정도의 엄격한 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 변성되고 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 필터를 약 37-50℃에서 1 x SSC로 세척하는 것이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등의 조정 방법을 알 것이다.

항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예컨대, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.

"항체-의존성 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비형 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원을 보유하는 표적 세포에 특이적으로 결합한 후, 상기 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포의 "아암"이고 이러한 사멸에 반드시 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 95:652-656 (1998)]에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 추가로, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것 (감마 수용체)이고, 이러한 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 비롯하여 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하며, 이들은 주로 그의 세포질 도메인에서 차이가 나는 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토되어 있다. 추후로 확인될 것을 포함하여 다른 FcR이 본원에서의 용어 "FcR"에 포괄된다. 이 용어는 모 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 또한 포함한다 (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]).

"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고, ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하며, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.

"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재 하의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 그의 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 하위부류의 항체)에 대한 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.

"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 다른 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

용어 "항암 요법"은 암을 치료하는데 유용한 요법을 지칭한다. 항암 치료제의 예는 예를 들어 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용되는 작용제, 항혈관신생제, 아폽토시스성 작용제, 항-튜불린 작용제, 및 암을 치료하기 위한 기타 작용제, 항-CD20 항체, 혈소판 유래 성장 인자 억제제 (예를 들어, 글리벡(Gleevec)™ (이마티닙 메실레이트)), COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브), 인터페론, 시토카인, 하기 표적 EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 또는 VEGF 수용체(들) 중 하나 이상에 결합하는 길항제 (예를 들어, 중화 항체), TRAIL/Apo2, 및 다른 생물활성제 및 유기 화학 작용제 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 그의 조합이 또한 본 발명에 포함된다.

"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)®); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민 (알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민 포함); 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜키신; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); CDP323, 경구 알파-4 인테그린 억제제; 디네미신 (디네미신 A 포함); 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (아드리아미신(ADRIAMYCIN)®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사(독실(DOXIL)®), 리포솜 독소루비신 TLC D-99 (미오세트(MYOCET)®), PEG화 리포솜 독소루비신 (케릭스(CAELYX)®) 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®), 테가푸르(유프토랄(UFTORAL)®), 카페시타빈(젤로다(XELODA)®), 에포틸론 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠 (JHS Natural Products), 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)®); 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)™), 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 작용제, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 (예를 들어, 엘록사틴(ELOXATIN)®) 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®), 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®), 빈데신 (엘디신®, 필데신®), 및 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®)을 포함하여, 튜불린 중합이 미세관을 형성하는 것을 방지하는 빈카; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 류코보린; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산 (벡사로텐 (탈그레틴(TARGRETIN)®) 포함); 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)®), 알렌드로네이트 (포사맥스(FOSAMAX)®), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)®), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)®), 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)®); 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 관여하는 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것, 예컨대 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 박시드(VAXID)® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, 루르토테칸(LURTOTECAN)®); rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)®); BAY439006 (소라페닙; 바이엘(Bayer)); SU-11248 (수니티닙, 수텐트(SUTENT)®, 화이자); 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테오솜 억제제 (예를 들어, PS341); 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®); CCI-779; 티피파르닙 (R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제, 예컨대 오블리메르센 나트륨 (게나센스(GENASENSE)®); 픽산트론; EGFR 억제제 (하기 정의 참조); 티로신 키나제 억제제 (하기 정의 참조); 세린-트레오닌 키나제 억제제, 예컨대 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)®); 파르네실트랜스퍼라제 억제제, 예컨대 로나파르닙 (SCH 6636, 사라사르(SARASAR)™); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2종 이상의 조합물, 예컨대 CHOP (시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어) 및 FOLFOX (5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴™)을 이용한 치료 요법에 대한 약어)를 포함한다.

본원에 정의된 바와 같은 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항호르몬 작용제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 이들은 혼합된 효능제/길항제 프로파일을 갖는 항에스트로겐, 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)®), 4-히드록시타목시펜, 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)®), 이독시펜, 드롤록시펜, 랄록시펜 (에비스타(EVISTA)®), 트리옥시펜, 케옥시펜, 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예컨대 SERM3; 효능제 특성을 갖지 않는 순수한 항에스트로겐, 예컨대 풀베스트란트 (파슬로덱스(FASLODEX)®) 및 EM800 (이러한 작용제는 에스트로겐 수용체 (ER) 이량체화를 차단하고/거나, DNA 결합을 억제하고/거나, ER 턴오버를 증가시키고/거나 ER 수준을 저해할 수 있음); 아로마타제 억제제, 예를 들어 스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 포르메스탄 및 엑세메스탄 (아로마신(AROMASIN)®), 및 비스테로이드성 아로마타제 억제제, 예컨대 아나스트라졸 (아리미덱스(ARIMIDEX)®), 레트로졸 (페마라(FEMARA)®) 및 아미노글루테티미드, 및 다른 아로마타제 억제제, 예를 들어 보로졸 (리비소르(RIVISOR)®), 메게스트롤 아세테이트 (메가세(MEGASE)®), 파드로졸 및 4(5)-이미다졸; 황체화 호르몬-방출 호르몬 효능제, 예를 들어 류프롤리드 (루프론(LUPRON)® 및 엘리가드(ELIGARD)®), 고세렐린, 부세렐린 및 트립테렐린; 성별 스테로이드, 예를 들어 프로게스틴, 예컨대 메게스트롤 아세테이트 및 메드록시프로게스테론 아세테이트, 에스트로겐, 예컨대 디에틸스틸베스트롤 및 프레마린, 및 안드로겐/레티노이드, 예컨대 플루옥시메스테론, 모든 트랜스레티온산 및 펜레티니드; 오나프리스톤; 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향 조절제 (ERD); 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 2종 이상의 조합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 호르몬 그 자체일 수 있다.

"대상체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 인간, 비-인간 고등 영장류, 영장류, 가축 (예컨대, 소), 스포츠 동물, 애완동물 (예컨대, 고양이, 개 및 말) 및 실험 동물 (예컨대, 마우스 및 래트)이 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

단백질 "발현"은 유전자 내에 코딩된 정보가 메신저 RNA (mRNA)로, 이어서 단백질로 전환되는 것을 지칭한다.

본원에서, 관심 단백질 (예컨대, 뉴레귤린 (예컨대, 뉴레귤린1 (NRG1)) 및/또는 HER3)을 "발현하는" 샘플 또는 세포는 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 단백질 (그의 단편 포함)이 샘플 또는 세포 내에 존재하는 것으로 결정된 것이다.

암의 유형에서 "NRG1 발현에 대한 중간 수준보다 높은 수준에서 NRG1을 발현하는" 샘플, 세포, 종양 또는 암은 NRG1 발현의 수준이 그 암 유형에 대해 당업자가 "높은 NRG1 수준"으로 간주하는 것이다. 이러한 암은 또한 "NRG1을 과다발현하는 것"으로 간주된다. 일반적으로, 이러한 수준은 동일한 암 유형의 샘플, 세포, 종양 또는 암의 집단에서의 NRG1 수준에 비해 약 50% 내지 약 100% 범위일 것이다. 예를 들어, 중간 발현 수준에 도달하도록 사용되는 집단은 일반적으로 HNSCC 샘플, 또는 그의 하위군, 예컨대 화학요법-내성 HNSCC 암, EGFR 억제제-내성 HNSCC 암 뿐만 아니라 진행성, 불응성 또는 재발성 HNSCC 암일 수 있다. 본원에서 실시예는 중간 발현 수준이 결정될 수 있는 방법을 입증한다. 이는 발현의 절대값을 구성할 수 있다. 한 실시양태에서, 높은 NRG1 수준으로 간주되는 NRG1 발현 수준은 60번째 백분위수 이상, 70번째 백분위수 이상, 75번째 백분위수 이상, 80번째 백분위수 이상, 85번째 백분위수 이상, 90번째 백분위수 이상, 95번째 백분위수 이상, 97번째 백분위수 이상, 98번째 백분위수 이상 또는 99번째 백분위수 이상이다. 이러한 값은 명시된 검정 조건 하에 분석, 예컨대 본원에 개시된 qRT-PCR, 가장 바람직하게는 실시예 5에서와 같은 qRT-PCR 검정에서 정량화될 것이다. 한 실시양태에서, NRG1 발현 수준은 참조 유전자로서 AL-137727 (서열 10; 서열 11) 및 VPS33B (서열 12)의 발현 수준의 평균을 이용하는 델타 Ct 방법을 이용하여 계산된다.

특정 암 유형에서, NRG1 발현은 그 암 유형을 앓고 있는 환자 집단에서 이중모드이다. 이중모드 발현 프로파일은 높은 수준의 NRG1 발현을 나타내는 - 과다발현 모드의 - 환자 군 및 보다 낮은 NRG1 발현 수준을 나타내는 - 과다발현 결여 모드의 환자 군으로 이루어진다. 한 실시양태에서, 2가지 모드 사이에 변곡점은 암 유형을 "NRG1을 과다발현하는" 암 (암이 변곡점보다 높은 NRG1 발현 수준을 가짐) 또는 "NRG1의 과다발현이 결여된" 암 (암이 변곡점보다 낮은 NRG1 발현 수준을 가짐)으로 특성화하기 위한 값으로 사용된다. 한 실시양태에서, 2-성분 가우시안(Gaussian) 혼합물 분포를 이용하여 NRG1의 과다발현 및 NRG1 과다발현의 결여 사이의 변곡점을 추정한다. 한 실시양태에서, NRG1 발현 수준은 참조 유전자로서 AL-137727 (서열 10; 서열 11) 및 VPS33B (서열 12)를 사용하여 계산된다.

본원에 사용된 "폴리머라제 연쇄 반응" 또는 "PCR"의 기술은 일반적으로 미량의 핵산, RNA 및/또는 DNA의 특정 조각이 1987년 7월 28일에 허여된 미국 특허 번호 4,683,195에 기재된 바와 같이 증폭되는 절차를 지칭한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 설계될 수 있도록, 관심 영역 말단 또는 그 너머로부터의 서열 정보는 활용될 필요가 있으며; 이러한 프라이머는 증폭시키려는 주형의 대향 가닥에 대한 서열과 동일하거나 유사할 것이다. 2개 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭되는 물질의 말단과 일치할 수 있다. PCR은 특정한 RNA 서열, 전체 게놈 DNA로부터의 특정한 DNA 서열, 및 전체 세포 RNA로부터 전사되는 cDNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열 등을 증폭하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 문헌 [Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)]을 참조한다. 본원에 사용된 PCR은 프라이머로서 공지의 핵산 (DNA 또는 RNA)을 사용하는 것을 포함하는 핵산 시험 샘플을 증폭시키는 핵산 폴리머라제 반응 방법의 하나의 예이지만 유일한 예는 아닌 것으로 간주되고, 핵산 폴리머라제를 활용하여 특정한 소편의 핵산을 증폭 또는 생성하거나 또는 특정한 핵산에 상보성인 특정한 소편의 핵산을 증폭 또는 생성한다.

"정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응" 또는 "qRT-PCR"은 PCR 생성물의 양이 PCR 반응에서 각각의 단계에서 측정되는 PCR의 형태를 지칭한다. 이러한 기술은 문헌 [Cronin et al., Am. J. Pathol. 164(1):35-42 (2004); 및 Ma et al., Cancer Cell 5:607-616 (2004)]을 비롯한 다양한 공개문헌에 기재되어 있다.

용어 "마이크로어레이"는 기판 상의 혼성화가능한 어레이 요소, 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 프로브의 정렬된 배열을 지칭한다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 단수 또는 복수로 사용될 때 일반적으로 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 나타내고, 이는 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 따라서, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 RNA, 단일-가닥 또는 보다 전형적으로는 이중-가닥일 수도 있거나 또는 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함할 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 또한, 본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA와 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 이러한 영역 내 가닥들은 동일한 분자 또는 상이한 분자로부터의 것일 수 있다. 상기 영역은 모두 1개 이상의 분자를 포함할 수 있지만, 보다 전형적으로는 오직 일부 분자의 영역을 포함한다. 삼중-나선 영역의 분자 중 1개는 종종 올리고뉴클레오티드이다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 구체적으로 cDNA를 포함한다. 용어는 1개 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA (cDNA 포함) 및 RNA를 포함한다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유로 인해 변형된 백본을 갖는 DNA 또는 RNA는 본원에서 의도된 용어와 같은 "폴리뉴클레오티드"이다. 또한, 이노신과 같은 비통상적 염기 또는 삼중수소화 염기와 같은 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA가 본원에 정의된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드"에 포함된다. 일반적으로, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 비변형된 폴리뉴클레오티드의 모든 화학적으로, 효소적으로 및/또는 대사적으로 변형된 형태 뿐만 아니라 바이러스 및 세포 (단순 및 복합 세포 포함)의 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다.

용어 "올리고뉴클레오티드"는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오티드, 단일-가닥 또는 이중-가닥 리보뉴클레오티드, RNA:DNA 하이브리드 및 이중-가닥 DNA를 포함하나 이에 제한되지 않는 비교적 짧은 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드, 예컨대 단일-가닥 DNA 프로브 올리고뉴클레오티드는 종종 예를 들어 상업적으로 입수가능한 자동화 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하여 화학적 방법에 의해 합성된다. 그러나, 올리고뉴클레오티드는 시험관내 재조합 DNA-매개 기술을 비롯한 다양한 다른 방법에 의해 및 세포 및 유기체에서 DNA의 발현에 의해 제조될 수 있다.

어구 "유전자 증폭"은 특정한 세포 또는 세포주에서 다중 카피의 유전자 또는 유전자 단편이 형성되는 과정을 지칭한다. 중첩된 영역 (증폭된 DNA의 스트레치)이 종종 "앰플리콘"으로 지칭된다. 대체로, 생산된 메신저 RNA (mRNA)의 양은 또한 발현된 특정한 유전자로 제조된 카피의 수에 비례하여 증가한다.

"천연 서열" 폴리펩티드는 자연 발생 또는 대립유전자 변이체를 포함한, 자연에서 유도되는 폴리펩티드 (예를 들어, HER 수용체 또는 HER 리간드)와 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이다. 이러한 천연 서열 폴리펩티드는 자연으로부터 단리할 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 제조할 수 있다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 자연 발생 인간 폴리펩티드, 뮤린 폴리펩티드, 또는 임의의 다른 포유동물 종으로부터의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본원에서 "환자"는 인간 환자이다. 환자는 "암 환자", 즉 하나 이상의 암의 증상으로 고통받거나 그러한 위험이 있는 환자일 수 있다.

"종양 샘플"은 본원에서 환자의 종양으로부터 유래하는, 또는 환자의 종양으로부터의 종양 세포를 포함하는 샘플이다. 본원에서 종양 샘플의 예는 종양으로부터 유래하거나 종양 유사 특성을 나타내는 종양 생검, 순환 종양 세포, 순환 혈장 단백질, 복수액, 일차 세포 배양액 또는 세포주, 및 보존된 종양 샘플, 예를 들어 포르말린-고정된, 파라핀-포매 종양 샘플 또는 동결된 종양 샘플을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

"고정된" 종양 샘플은 고정제를 사용하여 조직학상 보존된 것이다.

"포르말린-고정된" 종양 샘플은 고정제로서 포름알데히드를 사용하여 보존된 것이다.

"포매" 종양 샘플은 파라핀, 왁스, 셀로이딘 또는 수지와 같은 견고하고 일반적으로 단단한 매질로 둘러싸인 것이다. 포매는 현미경 검사를 위한 또는 조직 마이크로어레이 (TMA)의 생성을 위한 얇은 절편의 절단을 가능하게 한다.

"파라핀-포매" 종양 샘플은 석유 유래의 고체 탄화수소의 정제된 혼합물로 둘러싸인 것이다.

본원에서 "동결된" 종양 샘플은 동결되는 또는 동결된 종양 샘플을 나타낸다.

"HER 발현, 증폭, 또는 활성화를 나타내는" 암 또는 생물학적 샘플은 진단 시험에서 HER 수용체를 발현 (과다발현 포함)하고/하거나, HER 유전자가 증폭되었고/되었거나, 다른 방식으로 HER 수용체의 활성화 또는 인산화를 나타내는 것이다.

"HER 수용체 과발현 또는 증폭"이 있는 암 세포는 동일한 조직 유형의 비암성 세포와 비교하여 HER 수용체 단백질 또는 유전자의 수준이 유의하게 더 높은 것이다. 이러한 과다발현은 유전자 증폭에 의해 또는 증가된 전사 또는 번역에 의해 유발될 수 있다. 세포 표면에 존재하는 증가된 수준의 HER 단백질을 평가함 (예를 들어, 면역조직화학 검정 (IHC)을 통해)으로써 진단 또는 예후 검정에서 HER 수용체 과다발현 또는 증폭이 결정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 예를 들어 형광 계내 혼성화 (FISH; 1998년 10월에 공개된 WO98/45479 참조), 서던 블롯팅 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예컨대 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 통해 세포에서 HER-코딩 핵산의 수준을 측정할 수 있다. 혈청과 같은 생물학적 유체 내의 박리된 항원 (예를 들어, HER 세포외 도메인)을 측정함으로써 HER 수용체 과다발현 또는 증폭을 연구할 수도 있다 (예를 들어, 1990년 6월 12일에 허여된 미국 특허 번호 4,933,294; 1991년 4월 18일에 공개된 WO91/05264; 1995년 3월 28일에 허여된 미국 특허 5,401,638; 및 문헌 [Sias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)] 참조). 상기 검정 이외에도, 숙련된 진료의는 다양한 생체내 검정을 이용할 수 있다. 예를 들어, 환자의 신체 내에서 검출가능한 표지, 예를 들어 방사성 동위원소로 임의로 표지된 항체에 세포를 노출시킬 수 있고, 환자에서 세포에 대한 항체의 결합은, 예를 들어 방사선에 대한 외부 스캔 또는 이전에 항체에 노출된 환자로부터 수득한 생검의 분석에 의해 평가할 수 있다.

반대로, "HER 수용체를 과다발현 또는 증폭하지 않는" 암은 동일한 조직 유형의 비암성 세포에 비해 HER 수용체 단백질 또는 유전자의 정상 수준보다 더 높은 수준을 갖지 않는 것이다. HER 이량체화를 억제하는 항체, 예컨대 페르투주맙은 HER2 수용체를 과다발현 또는 증폭하지 않는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본원에서, "항종양제"는 암을 치료하는데 사용된 약물을 지칭한다. 본원에서 항종양제의 비제한적 예는 화학요법제, HER 억제제, HER 이량체화 억제제, HER 항체, 종양 연관 항원에 대해 지시된 항체, 항호르몬 화합물, 시토카인, EGFR-표적화된 약물, 항혈관신생제, 티로신 키나제 억제제, 성장 억제제 및 항체, 세포독성제, 아폽토시스를 유도하는 항체, COX 억제제, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 태아 종양 단백질 CA 125에 결합하는 항체, HER2 백신, Raf 또는 ras 억제제, 리포솜 독소루비신, 토포테칸, 탁센, 이중 티로신 키나제 억제제, TLK286, EMD-7200, 페르투주맙, 트라스투주맙, 에를로티닙, 및 베바시주맙을 포함한다.

"승인된 항종양제"는 규제 당국, 예컨대 미국 식품 의약품국 (FDA) 또는 그의 동등한 외국 기관에 의해 마케팅 승인을 받은, 암을 치료하기 위해 사용되는 약물이다.

HER3 억제제가 "단일 항종양제"로서 투여되는 경우에, 이는 암을 치료하기 위해 투여되는 유일한 항종양제이고, 즉, 다른 항종양제, 예컨대 화학요법과 조합하여 투여되지 않는다.

"치료 표준"은 본원에서 특정한 형태의 암을 치료하기 위해 통상적으로 사용되는 항종양제(들)를 의도한다.

"성장 억제제"는 본원에서 사용될 때 시험관내에서 또는 생체내에서 세포, 특히 HER 발현 암 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 HER 발현의 비율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 단계에서) 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 전통적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 또한 S기 정지로까지 이어진다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995)] (특히, p. 13)에서 찾아볼 수 있다.

"성장 억제" 항체의 예는 HER에 결합하여 HER을 발현하는 암 세포의 성장을 억제하는 것이다.

"아폽토시스를 유도하는" 항체는 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 세포질 세망의 팽창, 세포 단편화, 및/또는 막 소포 (아폽토시스체로 불림)의 형성에 의해 결정되는 바와 같은 프로그램화된 세포 사멸을 유도하는 것이다. 다양한 방법을 이용하여 아폽토시스와 연관된 세포 사건을 평가할 수 있다. 예를 들어, 포스파티딜 세린 (PS) 전위는 아넥신 결합에 의해 측정할 수 있고; DNA 단편화는 DNA 래더링을 통해 평가할 수 있으며; DNA 단편화와 함께 일어나는 핵/염색질 축합은 저이배체 세포의 임의의 증가에 의해 평가할 수 있다. 바람직하게는, 아폽토시스를 유도하는 항체는 BT474 세포를 사용하는 아넥신 결합 검정에서 비처리 세포에 비해 아넥신 결합의 유도를 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 50배, 가장 바람직하게는 약 10 내지 50배 유발하는 것이다.

"치료"는 치유적 치료, 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 이는 이미 암에 걸린 이 뿐만 아니라 암이 방지되어야 하는 이를 포함한다. 따라서, 본원에서 치료될 환자는 암에 걸린 것으로 진단될 수 있거나, 또는 암에 걸리기 쉽거나 감수성일 수 있다.

용어 "치료 유효량" 또는 "유효량"은 환자에서 암을 치료하기 위해 효과적인 약물의 양을 나타낸다. 유효량의 약물은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고/있거나; 종양 크기를 감소시킬 수 있고/있거나; 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제할 수 있고/있거나 (즉, 이를 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 정지시킴); 종양 전이를 억제할 수 있고/있거나 (즉, 이를 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 정지시킴); 종양 성장을 어느 정도 억제할 수 있고/있거나; 암과 관련된 증상 중 하나 이상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 약물은, 기존 암 세포의 성장을 방지하고/거나 이를 사멸시킬 수 있는 정도까지 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 유효량은 무진행 생존 (예를 들어, 고형 종양에 대한 반응 평가 기준인 RECIST 또는 CA-125 변화로 평가시에)을 연장시키고, 객관적 반응 (부분 반응 PR 또는 완전 반응 CR 포함)을 유도하고, 생존 (전체 생존 및 무진행 생존 포함)을 개선시키고/거나 하나 이상의 암 증상 (예를 들어, FOSI에 의해 평가시에)을 개선시킬 수 있다. 가장 바람직하게는, 치료 유효량의 약물은 무진행 생존 (PFS) 및/또는 전체 생존 (OS)의 개선에 효과적이다.

"생존"은 환자가 계속 살아있는 것을 지칭하고, 전체 생존 뿐만 아니라 무진행 생존을 포함한다.

"전체 생존"은 예를 들어 진단 또는 치료시로부터 소정의 기간, 예컨대 1년, 5년 등의 기간 동안 환자가 계속 살아있는 것을 지칭한다.

"무진행 생존"은 암이 진행되거나 악화되지 않으면서 환자가 계속 살아있는 것을 의미한다.

"생존 연장"은 치료받지 않은 환자에 비해 (즉, HER 억제제, 예컨대 이중특이적 HER3/EGFR 억제제 MEHD7945A를 사용하여 치료받지 않은 환자에 비해) 또는 NRG1을 지정된 수준에서 발현하지 않는 환자에 비해, 및/또는 승인된 항종양제를 사용하여 치료받은 환자에 비해, 치료받은 환자에서의 전체 생존 또는 무진행 생존이 증가하는 것을 의미한다.

"객관적 반응"은 완전 반응 (CR) 또는 부분 반응 (PR)을 포함하여 측정가능한 반응을 의미한다.

"완전 반응" 또는 "CR"은 치료에 반응하여 암의 모든 증상이 사라짐을 의도한다. 이것은 항상 암이 치유되었음을 의미하지는 않는다.

"부분 반응" 또는 "PR"은 치료에 반응하여 하나 이상의 종양 또는 병변의 크기 또는 신체 내의 암 정도가 감소되는 것을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방해하고/거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함)를 포함한다.

"화학요법-내성" 암은 암 환자에서 화학치료 요법을 받는 동안 암이 진행되거나 (즉, 환자가 "화학요법 불응성"임), 또는 환자가 화학치료 요법 완료 후 12개월 내에 (예를 들어, 6개월 내에) 암이 진행됨을 의미한다.

"백금-내성" 암은 암 환자에서 백금-기반 화학요법을 받는 동안 암이 진행되거나 (즉, 환자는 "백금 불응성"임), 또는 환자가 백금-기반 화학치료 요법 완료 후 12개월 내에 (예를 들어, 6개월 내에) 암이 진행됨을 의미한다.

"항혈관신생제"는 혈관 발생을 어느 정도로 차단 또는 방해하는 화합물을 의미한다. 항혈관신생 인자는 예를 들어 혈관신생 촉진에 관여하는 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에 결합하는 소분자 또는 항체일 수 있다. 본원에서 바람직한 항혈관신생 인자는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 결합하는 항체, 예컨대 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)®)이다.

용어 "시토카인"은 세포간 매개자로서 또 다른 세포에 대해 작용하는, 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반 용어이다. 이러한 시토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 통상적인 폴리펩티드 호르몬이다. 이러한 시토카인에 포함되는 것은 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체화 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮬러-억제 물질; 마우스 고나도트로핀-연관 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예컨대 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터류킨 (IL), 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β; 및 다른 폴리펩티드 인자 (LIF 및 kit 리간드 (KL) 포함)이다. 본원에 사용된 용어 시토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 시토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.

"티로신 키나제 억제제"는 티로신 키나제, 예컨대 HER 수용체의 티로신 키나제 활성을 억제하는 분자이다. 이러한 억제제의 예는 이전 단락에 언급된 EGFR-표적화된 약물; 소분자 HER2 티로신 키나제 억제제, 예컨대 TAK165 (다케다(Takeda)로부터 이용가능함); ErbB2 수용체 티로신 키나제의 경구 선택적 억제제인 CP-724,714 (화이자 및 OSI); EGFR에 우선적으로 결합하나 HER2 및 EGFR-과다발현 세포를 둘 다 억제하는 이중-HER 억제제, 예컨대 EKB-569 (와이어쓰로부터 이용가능함); GW572016 (글락소(Glaxo)로부터 이용가능함), 경구 HER2 및 EGFR 티로신 키나제 억제제; PKI-166 (노파르티스(Novartis)로부터 이용가능함); 범용-HER 억제제, 예컨대 카네르티닙 (CI-1033; 파마시아(Pharmacia)); Raf-1 신호전달을 억제하는 Raf-1 억제제, 예컨대 안티센스 작용제 ISIS-5132 (ISIS 파마슈티칼스(ISIS Pharmaceuticals)로부터 이용가능함); 비-HER 표적화된 TK 억제제, 예컨대 이마티닙 메실레이트 (글리벡(Gleevac)™) (글락소로부터 이용가능함); MAPK 세포외 조절된 키나제 I 억제제 CI-1040 (파마시아로부터 이용가능함); 퀴나졸린, 예컨대 PD 153035, 4-(3-클로로아닐리노) 퀴나졸린; 피리도피리미딘; 피리미도피리미딘; 피롤로피리미딘, 예컨대 CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706; 피라졸로피리미딘, 4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘; 쿠르쿠민 (디페룰로일 메탄, 4,5-비스 (4-플루오로아닐리노)프탈이미드); 니트로티오펜 모이어티 함유 트리포스틴; PD-0183805 (워너-램버트(Warner-Lambert)); 안티센스 분자 (예를 들어, HER-코딩 핵산에 결합하는 것); 퀴녹살린 (미국 특허 번호 5,804,396); 트리포스틴 (미국 특허 번호 5,804,396); ZD6474 (아스트라제네카); PTK-787 (노파르티스/쉐링 AG(Schering AG)); 범용-HER 억제제, 예컨대 CI-1033 (화이자); 아피니탁(Affinitac) (ISIS 3521; Isis/릴리(Lilly)); 아미티닙 메실레이트 (글리벡; 노파르티스); PKI 166 (노파르티스); GW2016 (글락소 스미스클라인(Glaxo SmithKline)); CI-1033 (화이자); EKB-569 (와이어쓰); 세막시닙 (수젠); ZD6474 (아스트라제네카); PTK-787 (노파르티스/쉐링 AG); INC-1C11 (임클론); 또는 하기 특허 공개: 미국 특허 번호 5,804,396; WO99/09016 (아메리칸 시아나미드); WO98/43960 (아메리칸 시아나미드); WO97/38983 (워너 램버트); WO99/06378 (워너 램버트); WO99/06396 (워너 램버트); WO96/30347 (화이자, 인크); WO96/33978 (제네카); WO96/3397 (제네카); 및 WO96/33980 (제네카) 중 어느 것에 기재된 바와 같은 것을 포함한다.

본원에서 치료제의 "고정" 또는 "균일" 용량은 환자의 체중 (WT) 또는 체표면적 (BSA)을 고려하지 않고 인간 환자에게 투여되는 용량을 의미한다. 따라서, 고정 또는 균일 용량은 mg/kg 용량 또는 mg/m² 용량으로서 제공되지 않고, 그보다는 치료제의 절대량으로서 제공된다.

일반적으로 본원에서의 "부하" 용량은 환자에게 투여되는 치료제의 초기 용량을 포함하고, 그의 1회 이상의 유지 용량(들)이 이어진다. 일반적으로, 단일 부하 용량이 투여되지만, 다중 부하 용량이 본원에서 고려된다. 일반적으로, 투여되는 부하 용량(들)의 양은 투여되는 유지 용량(들)의 양을 초과하고/하거나, 부하 용량(들)이 유지 용량(들)보다 더욱 빈번하게 투여되어, 유지 용량(들)으로 달성될 수 있는 것보다 더 이전에 치료제의 원하는 항정 상태 농도가 달성된다.

본원에서의 "유지" 용량은 치료 기간에 걸쳐 환자에게 투여되는 치료제의 1회 이상의 용량을 지칭한다. 통상적으로, 유지 용량은 치료 시간 간격을 두고 투여되며, 예컨대 대략 매주, 대략 2주마다, 대략 3주마다, 또는 대략 4주마다 투여된다.

"의약"은 암을 치료하기 위한 활성 약물, 예컨대 HER3 억제제, 예컨대 이중특이적 HER3/EGFR 억제제 (예컨대, MEHD7945A)이다.

"표적 청중"은, 마케팅 또는 광고에 의해서와 같이, 특히 특정한 용도, 치료 또는 적응증을 위한 특정한 의약이 프로모션되고 있거나 프로모션되도록 의도되는 일군의 사람들 또는 기관, 예컨대 개별 환자, 환자 집단, 신문, 의학 문헌 및 잡지의 구독자, 텔레비젼 또는 인터넷 시청자, 라디오 또는 인터넷 청취자, 의사, 제약 회사 등이다.

"포장 삽입물"은, 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기, 포장된 제품과 조합되는 기타 치료 제품, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고 등에 관한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업용 패키지에 관례상 포함되는 지침서를 지칭하기 위해 사용된다.

II . 조성물 및 방법

A. 예시적인 HER3 억제제

한 측면에서, 본 발명은 부분적으로 환자의 암에서 NRG1의 발현 수준에 기초하여 한 유형의 암을 갖는 환자를 위한 요법을 선택하는 것에 기초한다. 한 실시양태에서, HER3 억제제는 환자의 암이 NRG1을 과다발현한다면 환자를 위한 요법으로 선택된다. 한 실시양태에서, HER3 억제제는 환자의 암에서의 NRG1 수준이 그 암 유형에서의 일반적인 NRG1 수준보다 높은 경우에 환자를 위한 요법으로 선택된다. 이어서, 환자는 이러한 요법이 특정 실시양태에서 선택되는 경우에 HER3 억제제를 사용하여 치료된다.

HER3 억제제는 항체 또는 다른 항원-결합 단백질, 소분자, 핵산 (예컨대, siRNA), 또는 임의의 다른 이러한 분자일 수 있다. HER3 억제제는 본 발명의 구체적 실시양태에서 HER3에 대한 NRG1 결합을 억제한다.

한 실시양태에서, HER3 억제제는 항체이다. 예시적인 항-HER3 항체는 WO2011076683 (Mab205.10.1, Mab205.10.2, Mab205.10.3), US7846440; US7705130 및 US5968511에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, HER3 억제제는 이중특이적 HER3/EGFR 억제제이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 억제제는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 억제제는 HER3 및 EGFR 둘 다에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. 한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 억제제는 2개의 동일한 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이며, 이들은 각각 HER3 및 EGFR 둘 다에 특이적으로 결합한다. 이러한 항체는 WO2010108127, US20100255010 및 문헌 [Schaefer et al., Cancer Cell, 20: 472-486 (2011)]에 기재되어 있다. HER3 및 EGFR 둘 다에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 한 이러한 특정한 이중특이적 HER3/EGFR 억제제는 MEHD7945A이다.

한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 항체는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하며, 여기서 항체는 서열 1의 아미노산 서열의 HVR 중 1, 2 및/또는 3개를 포함하는 V_H를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 항체는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하며, 여기서 항체는 서열 1의 아미노산 서열의 HVR 중 1, 2 및/또는 3개를 포함하는 V_H 및 서열 2의 아미노산 서열의 HVR 중 1, 2 및/또는 3개를 포함하는 V_L을 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 항체는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하며, 여기서 항체는 서열 1의 아미노산 서열의 모든 3개의 HVR을 포함하는 V_H 및 서열 2의 아미노산 서열의 모든 3개의 HVR을 포함하는 V_L을 포함한다. 일부 실시양태에서, HVR은 확장된 HVR이다. 한 구체적 실시양태에서, HVR-H1은 아미노산 서열 LSGDWIH (서열 3)를 포함하고, HVR-H2는 아미노산 서열 VGEISAAGGYTD (서열 4)를 포함하고, HVR-H3은 아미노산 서열 ARESRVSFEAAMDY (서열 5)를 포함하고, HVR-L1은 아미노산 서열 NIATDVA (서열 6)를 포함하고, HVR-L2는 아미노산 서열 SASF (서열 7)를 포함하고, HVR-L3은 아미노산 서열 SEPEPYT (서열 8)를 포함한다.

한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 항체는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하며, 여기서 항체는 서열 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 V_H를 포함한다. 한 구체적 실시양태에서, 서열 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 V_H를 포함하는 이중특이적 HER3/EGFR은 아미노산 서열 LSGDWIH (서열 3)를 포함하는 HVR-H1, 아미노산 서열 VGEISAAGGYTD (서열 4)를 포함하는 HVR-H2, 및 아미노산 서열 ARESRVSFEAAMDY (서열 5)를 포함하는 HVR-H3을 포함한다.

한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 항체는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하며, 여기서 항체는 서열 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 V_L을 포함한다. 한 구체적 실시양태에서, 서열 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 V_L을 포함하는 이중특이적 HER3/EGFR은 아미노산 서열 NIATDVA (서열 6)를 포함하는 HVR-L1, 아미노산 서열 SASF (서열 7)를 포함하는 HVR-L2, 및 아미노산 서열 SEPEPYT (서열 8)를 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 항체는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하며, 여기서 항체는 서열 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 V_H 및 서열 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 V_L을 포함한다. 한 실시양태에서, 서열 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 V_H 및 서열 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 V_L을 포함하는 이중특이적 HER3/EGFR 항체는 아미노산 서열 LSGDWIH (서열 3)를 포함하는 HVR-H1, 아미노산 서열 VGEISAAGGYTD (서열 4)를 포함하는 HVR-H2, 및 아미노산 서열 ARESRVSFEAAMDY (서열 5)를 포함하는 HVR-H3, 아미노산 서열 NIATDVA (서열 6)를 포함하는 HVR-L1, 아미노산 서열 SASF (서열 7)를 포함하는 HVR-L2, 및 아미노산 서열 SEPEPYT (서열 8)를 포함하는 HVR-L3을 포함한다.

한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 항체는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하며, 여기서 항체는 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 V_H를 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 항체는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하며, 여기서 항체는 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 V_L을 포함한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 HER3/EGFR 항체는 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하며, 여기서 항체는 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 V_H 및 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 V_L을 포함한다.

1. 항체 친화도

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10^-8 M 이하, 예를 들어 10^-8 M 내지 10^-13 M, 예를 들어 10^-9 M 내지 10^-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.

한 실시양태에서, Kd는 하기 검정에 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (¹²⁵I)-표지된 항원과 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중의 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단하였다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [¹²⁵I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만; 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 시간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈(TWEEN)-20®)으로 8회 세척하였다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드)로 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁 결합 검정에 사용한다.

또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 예를 들어 ~10 반응 단위 (RU)로 고정화된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIACORE)®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주사한다. 항원 주사 후, 미반응 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민을 주입한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제를 갖는 PBS (PBST) 내에 주사한다. 간단한 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅시켜 회합률 (k_on) 및 해리율 (k_off)을 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 k_off/k_on의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면-플라즈몬 공명 검정에 의한 회합률이 10⁶ M^-1 s^-1을 초과하는 경우, 회합률은 분광측정계, 예컨대 정지-유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(SLM-AMINCO)™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 대역-통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 이용하여 결정할 수 있다.

2. 항체 단편

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')₂ 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.

디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.

단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).

항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.

3. 키메라 및 인간화 항체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 부모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 스위칭" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.

특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 부모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 일부)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 일부)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.

인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (SDR (a-CDR) 그라프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("리서페이싱" 기재); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.

인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

4. 인간 항체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 다양한 당업계의 공지된 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.

인간 항체는 항원 접종에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조할 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 로커스를 대체하거나 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체로 무작위적으로 통합된 인간 이뮤노글로불린 로커스의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 로커스는 일반적으로 불활성화된다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술 기재); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 기재); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술 기재), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.

인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 또한, 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.

인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기 기재된다.

5. 라이브러리-유래 항체

본 발명의 항체는 원하는 활성을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대하여 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에서 검토되고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.

특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위적으로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공보는 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다.

인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다.

6. 다중특이적 항체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 각각 특징적인 표적에 대해 특이적인 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 종래의 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 HER3에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 HER3의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 HER3을 발현하는 세포에 세포독성제를 국재화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.

다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983))], WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀(knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 사용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다.

"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).

본원의 항체 또는 단편은 또한 HER3 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조). 이러한 이중특이적 HER3/EGFR 억제제의 예는 본원에 기재되어 있으며, 예시적인 MEHD7945A 항체를 포함한다.

7. 항체 변이체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유하도록, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.

a) 치환, 삽입 및 결실 변이체

특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 표제 하에 표 1에 제시된다. 보다 더 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하의 표 1에 아미노산 측쇄 부류에 관하여 하기 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입되고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.

아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:

(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성: Asp, Glu;

(4) 염기성: His, Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.

치환 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 부모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 상승된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 부모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기가 돌연변이화되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.

변경 (예를 들어, 치환)은 예를 들어 항체 친화도를 개선하기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR) 동안 결합 친화도에 대해 시험된 생성된 변이체 VH 또는 VL로 높은 빈도에서 돌연변이화를 수행하는 코돈에 의해 코딩되는 잔기에서 이루어질 수 있다. 이차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서에서, 다양성은 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정된 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자로 도입된다. 이어서, 이차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하게 위해 라이브러리를 스크리닝한다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 HVR-유도된 접근법과 연관되며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개 잔기)가 랜덤화된다. 항원 결합과 연관된 HVR 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 이용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.

특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.

문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 지칭된다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항체와 항원과의 상호작용에 영향을 미치는지의 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보로 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 원하는 특성을 함유하는지의 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.

아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.

b) 글리코실화 변이체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.

항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.

한 실시양태에서, Fc 영역에 (직접 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조물)의 합에 비해 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균적인 양을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타내지만; Asn297은 또한 항체의 부가적 서열 변이에 의해 위치 297의 약 ± 3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 대한 문헌의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al., 특히 실시예 11)), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.

이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되는데, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 푸코실화가 감소될 수 있고/거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.

c) Fc 영역 변이체

특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능은 아니지만, 몇몇 이펙터 기능을 보유하고 있으므로, 생체내에서의 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정의 이펙터 기능 (예컨대, 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 많은 적용 분야에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결핍되어 있지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 결핍될 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예가 미국 특허 번호 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 결핍되었는지를 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거율/반감기 결정은 또한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).

감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).

FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조.)

특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.

일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 나타내는 변경들이 Fc 영역에서 만들어진다.

증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).

Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해서는 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.

d) 시스테인 조작된 항체 변이체

특정 실시양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되게 되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재한 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 1개 이상의 하기 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.

e) 항체 유도체

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되고 쉽게 입수가능한 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착될 경우, 중합체들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (문헌 [Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

B. 재조합 방법 및 조성물

항체는 재조합 방법 및 조성물을 이용하여, 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-HER3 항체 (이중특이적 항체 포함)를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 한 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질감염됨). 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기에 제공된 바와 같은 항-HER3 항체 (이중특이적 항체 포함)를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것, 및 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 임의로 회수하는 것을 포함하는, 상기 항체를 제조하는 방법이 제공된다.

항-HER3 항체 (이중특이적 항체 포함)의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함).

항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기재되어 있는 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] 참조.) 발현 후에, 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 항체를 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.

원핵생물 뿐만 아니라, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 항체를 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴으로 생산되게 하는, 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.

글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 것으로 확인되어 있다.

식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술을 기재함)를 참조한다.

척추동물 세포를 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR^- CHO 세포 (문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.

III . 진단 방법

본 발명의 한 측면은 암을 갖는 환자로부터의 암 샘플에서 뉴레귤린 1 (NRG1) 발현을 결정하는 것 및 암이 NRG1을 과다발현한다면 요법을 위해 HER3 억제제를 선택하는 것을 포함하는, 암을 갖는 환자를 위한 요법을 선택하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 암을 갖는 환자로부터의 암 샘플에서 뉴레귤린 1 (NRG1) 발현을 결정하는 겻 및 샘플이 NRG1을 과다발현한다면 요법으로서 이중특이적 HER3/EGFR 억제제를 선택하는 것을 포함하는, 암을 갖는 환자를 위한 요법을 선택하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 환자의 암은 암 유형에서의 NRG1 발현에 대한 중간 수준보다 높은 수준에서 NRG1을 발현한다. 한 실시양태에서, 높은 NRG1 수준으로 간주되는 NRG1 발현 수준은 60번째 백분위수 이상, 70번째 백분위수 이상, 75번째 백분위수 이상, 80번째 백분위수 이상, 85번째 백분위수 이상, 90번째 백분위수 이상, 95번째 백분위수 이상, 또는 그 초과 (97번째 백분위수 이상) 등이다. 중간 또는 백분위수 발현 수준은 NRG1 발현 측정과 본질적으로 동시에 결정될 수 있거나 또는 이전에 결정되었을 수 있다.

특정 암 유형에서, NRG1 발현은 그 암 유형을 앓고 있는 환자 집단에서 이중모드이다. 이중모드 발현 프로파일은 높은 수준의 NRG1 발현을 나타내는 - 과다발현 모드의 - 환자 군 및 보다 낮은 NRG1 발현 수준을 나타내는 - 과다발현 모드 결여의 환자 군으로 이루어진다. 한 실시양태에서, 2가지 모드 사이에 변곡점은 암 유형을 NRG1을 과다발현하는 암 또는 NRG1의 과다발현이 결여된 암으로 특성화하기 위한 값으로 사용된다. 변곡점보다 높은 NRG1 발현 수준을 갖는 암은 NRG1을 과다발현하는 한 유형의 암으로 특성화될 것이다. 변곡점보다 낮은 NRG1 발현 수준을 갖는 암은 NRG1의 과다발현이 결여된 암 유형으로 특성화될 것이다.

실시예 4는 환자 집단에서 NRG1 발현의 분포를 결정하기 위한 검정을 제공한다. 한 실시양태에서, 2-성분 가우시안 혼합물 분포는 NRG1의 과다발현 및 NRG1의 과다발현 결여 사이의 변곡점을 추정하는데 사용된다.

이중모드 NRG1 발현 프로파일을 나타내는 것으로 본원에서 밝혀진 암의 한 예는 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)이다. 실시예 4에서 논의된 바와 같이, HNSCC 암의 집단은 NRG1 과다발현을 갖는 암 및 NRG1 과다발현이 결여된 암의 가우시안 이중모드 분포 프로파일을 나타낸다. 분포 분석에 의해 제공된 변곡점은 선형 규모 상의 대략 1.50에 해당하는 로그 스케일 상의 대략 0.3689이다.

한 실시양태에서, NRG1을 과다발현하는 암은 또한 뉴레귤린-유도된 자가분비 신호전달을 나타낸다. 뉴레귤린-유도된 자가분비 신호전달을 나타내는 암은 암 세포에서 NRG1 및 HER3의 공발현의 존재에 의해 확인될 수 있다. NRG1 및 HER3의 공발현은 예를 들어 RNA 계내 혼성화 절차에 의해 측정될 수 있다.

또한, 암 샘플에서 NRG1의 발현 수준을 결정하는 것, 및 샘플에서의 NRG1의 발현 수준을 샘플에서의 하나 이상의 참조 유전자의 발현 수준에 대해 정량화하는 것을 포함하는, 암 샘플에서 NRG1 발현 수준을 정량화하는 방법이 본원에 제공된다. 적합한 참조 유전자는 AL-137727, VPS33B, GAPDH, SDHA, SP2, GUSB 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 암 샘플에서 NRG1 발현 수준을 정량화하는 방법은 샘플에서 NRG1의 발현 수준을 결정하는 것, 및 샘플에서의 NRG1의 발현 수준을 샘플에서의 AL-137727 (서열 10, 서열 11) 및 VPS33B (서열 12) 중 하나 또는 둘 다의 발현 수준에 대해 정량화하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 샘플에서의 NRG1의 발현 수준은 AL-137727의 발현 수준에 대해 정량화된다. 한 실시양태에서, 샘플에서의 NRG1의 발현 수준은 VPS33B의 발현 수준에 대해 정량화된다. 한 실시양태에서, 샘플에서의 NRG1의 발현 수준은 샘플에서의 AL-137727 및 VPS33B 둘 다의 발현 수준에 대해 정량화된다. 한 실시양태에서, NRG1 발현 수준은 AL-137727 및 VPS33B의 발현 수준의 평균을 사용하여 델타 Ct 방법을 이용하여 계산된다. NRG1 발현을 정량화하는 이러한 방법은 환자를 위한 요법을 선택하는 목적을 위해 또는 요법에 대한 환자의 반응을 예측하기 위해 NRG1 발현을 비교하는 신뢰할만한 표준을 제공한다.

하기 기재된 치료 방법 전에, 환자의 암에서의 NRG1 발현 수준(들)이 평가된다. 일반적으로, 생물학적 샘플은 요법을 필요로 하는 환자로부터 수득하고, 이 샘플은 하나 이상의 진단 검정(들), 일반적으로 적어도 하나의 시험관내 진단 (IVD) 검정에 적용된다. 그러나, NRG1 발현에 대한 다른 형태의 평가, 예컨대 생체내 진단이 본원에서 명백하게 고려된다.

생물학적 샘플은 예를 들어 종양 샘플, 혈액 샘플, 객담 샘플, 요 샘플, 또는 환자로부터 조사한 다른 조직 또는 체액이다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 고정된 샘플, 예를 들어 포르말린 고정된, 파라핀-포매 (FFPE) 샘플, 또는 동결된 샘플이다. 특정 실시양태에서, NRG1의 발현 수준은 제자리에서 결정된다.

mRNA 또는 단백질의 발현을 결정하기 위한 다양한 방법은 유전자 발현 프로파일링, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 예를 들어 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR), 마이크로어레이 분석, 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE), 매스어레이(MassARRAY), 대규모 병행 시그너처 서열분석 (MPSS)에 의한 유전자 발현 분석, 단백질체학, 면역조직화학 (IHC), 직접적 RNA 서열분석, 질량 분광측정법, ELISA 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 mRNA가 정량화된다. 이러한 mRNA 분석은 바람직하게는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용하여, 또는 마이크로어레이 분석에 의해 수행된다. PCR을 이용하는 경우, 바람직한 형태의 PCR은 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)이다. 바람직한 qRT-PCR 분석은 하기 실시예 1에서 기재된 바와 같은 것이다.

mRNA 단리, 정제, 프라이머 연장 및 증폭을 포함하는, RNA 공급원으로서 고정된 파라핀-포매 조직을 사용하여 유전자 발현을 프로파일링하기 위한 대표적인 프로토콜의 단계가 발표된 다양한 학회지 논문에 제시되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)]). 간략하게, 대표적인 방법은 파라핀-포매 종양 조직 샘플을 약 10 마이크로그램 두께의 절편으로 절단하는 것으로 출발한다. 이어서, RNA를 추출하고, 단백질 및 DNA를 제거한다. RNA의 농도 분석 후에, 필요한 경우에 RNA 복구 및/또는 증폭 단계가 포함될 수 있고, RNA는 유전자 특이적 프로모터를 사용하여 역전사되고, 이어서 PCR을 수행한다. 최종적으로, 조사된 종양 샘플에서 확인된 특징적인 유전자 발현 패턴을 기초로 하여 환자에게 이용가능한 최상의 치료 옵션(들)을 확인하기 위해 데이터를 분석한다.

유전자 발현을 결정하기 위한 다양한 예시적인 방법을 이제 보다 상세히 기재될 것이다.

(i) 유전자 발현 프로파일링

일반적으로, 유전자 발현 프로파일링의 방법은 2개의 큰 군, 즉 폴리뉴클레오티드의 혼성화 분석에 기초하는 방법 및 폴리뉴클레오티드의 서열분석에 기초하는 방법으로 분류될 수 있다. 샘플 내의 mRNA 발현의 정량화를 위해 가장 일반적으로 사용되는 당업계에 공지된 방법은 노던 블롯팅 및 계내 혼성화 (문헌 [Parker &Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)]); RNAse 보호 검정 (문헌 [Hod, Biotechniques 13:852- 854 (1992)]); 및 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) (문헌 [Weis et al., Trends in Genetics 8:263-264 (1992)])을 포함한다. 대안적으로, DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스, 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 포함한 구체적 듀플렉스를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 서열분석-기반 유전자 발현 분석을 위한 대표적인 방법은 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE), 및 대규모 병행 시그너처 서열분석 (MPSS)에 의한 유전자 발현 분석 및 RNA의 직접적 서열분석을 포함한다.

(ii) 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)

상기 열거된 기술 중에서, 민감하고 탄력적인 정량적 방법은 PCR이고, 이것은 상이한 샘플 집단에서, 정상 및 종양 조직에서, 약물 치료와 함께 또는 없이 mRNA 수준을 비교하여, 유전자 발현 패턴을 특성화하고, 밀접하게 관련된 mRNA를 서로 구별하고, RNA 구조를 분석하기 위해서 사용될 수 있다.

제1 단계는 표적 샘플로부터의 mRNA 단리이다. 출발 물질은 전형적으로 각각 인간 종양 또는 종양 세포주, 및 상응하는 정상 조직 또는 세포주로부터 단리된 전체 RNA이다. 따라서, RNA는 건강한 공여자로부터 모은 DNA를 갖는, 유방, 폐, 결장, 전립선, 뇌, 간, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 고환, 난소, 자궁 등의 종양을 비롯한 다양한 원발성 종양 또는 종양 세포주으로부터 단리될 수 있다. mRNA의 공급원이 원발성 종양인 경우에, mRNA는 예를 들어, 동결 또는 보존된 파라핀-포매 및 고정된 (예를 들어, 포르말린-고정된) 조직 샘플로부터 추출될 수 있다. mRNA 추출을 위한 일반적 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)]을 비롯한 분자 생물학의 표준 교과서에 개시되어 있다. 파라핀 포매 조직으로부터의 RNA 추출을 위한 방법은 예를 들어 문헌 [Rupp and Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987), 및 De Andres et al., BioTechniques 18:42044 (1995)]에 개시되어 있다. 특히, RNA 단리는 상업적인 제조업체, 예컨대 퀴아젠(Qiagen)으로부터의 정제 키트, 완충제 세트 및 프로테아제를 제조업체의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 배양액 중 세포로부터의 전체 RNA는 퀴아젠 RNeasy 미니-칼럼을 이용하여 단리될 수 있다. 다른 상업적으로 입수가능한 RNA 단리 키트는 마스터퓨어(MASTERPURE)® 완전 DNA 및 RNA 정제 키트 (에피센트레(EPICENTRE)®, 위스콘신주 매디슨)) 및 파라핀 블록 RNA 단리 키트 (암비온, 인크.(Ambion, Inc.))를 포함한다. 조직 샘플로부터의 전체 RNA는 RNA Stat-60 (텔-테스트(Tel-Test))을 이용하여 단리할 수 있다. 종양으로부터 제조된 RNA는, 예를 들어 세슘 클로라이드 밀도 구배 원심분리에 의해 단리할 수 있다.

RNA가 PCR을 위한 주형으로서 기능할 수 없기 때문에, PCR에 의한 유전자 발현 프로파일링의 제1 단계는 RNA 주형의 cDNA로의 역전사, 이어서 PCR 반응에서 그의 기하급수적 증폭이다. 2개의 가장 흔히 사용되는 역전사효소는 조류 골수아세포증 바이러스 역전사효소 (AMV-RT) 및 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV-RT)이다. 역전사 단계는 전형적으로 주위환경 및 발현 프로파일링의 목적에 따라 특이적 프라이머, 랜덤 육량체 또는 올리고-dT 프라이머를 사용하여 프라이밍한다. 예를 들어, 추출된 RNA는 진앰프(GENEAMP)™ RNA PCR 키트 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 캘리포니아주)를 제조업체의 지시에 따라 사용하여 역전사될 수 있다. 이어서, 유도된 cDNA를 후속적인 PCR 반응에서 주형으로 사용할 수 있다. PCR 단계는 다양한 내열성 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 이용할 수 있지만, 전형적으로 5'-3' 뉴클레아제 활성을 갖지만 3'-5' 프루프리딩 엔도뉴클레아제 활성은 결핍된 Taq DNA 폴리머라제를 이용한다. 따라서, 택맨(TAQMAN)® PCR은 전형적으로 그의 표적 앰플리콘에 결합된 혼성화 프로브를 가수분해하기 위해 Taq 또는 Tth 폴리머라제의 5'-뉴클레아제 활성을 이용하지만, 동등한 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 임의의 효소를 사용할 수 있다. PCR 반응에서 전형적인 앰플리콘을 생성하기 위해 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한다. 제3 올리고뉴클레오티드 또는 프로브는 2개의 PCR 프라이머 사이에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위해 설계된다. 프로브는 Taq DNA 폴리머라제 효소에 의해 연장불가능하고, 리포터 형광 염료 및 켄처 형광 염료로 표지된다. 2가지 염료가 프로브 상에 있을 때 함께 근접하게 위치하는 경우에는, 리포터 염료로부터의 임의의 레이저-유도 방출을 켄칭 염료에 의해 켄칭시킨다. 증폭 반응 동안, Taq DNA 폴리머라제 효소는 프로브를 주형-의존성 방식으로 절단한다. 생성된 프로브 단편은 용액 내에서 분리되고, 방출된 리포터 염료로부터의 신호는 제2 형광단의 켄칭 효과에 영향을 받지 않는다. 리포터 염료 중 1개의 분자가 합성된 각각의 새로운 분자에 대해 유리되고, 켄칭되지 않은 리포터 염료의 검출은 데이터의 정량적 해석을 위한 기반을 제공한다.

택맨® PCR은 상업적으로 입수가능한 기기, 예컨대 예를 들어, ABI 프리즘(PRISM) 7700® 서열 검출 시스템® (퍼킨-엘머-어플라이드 바이오시스템즈(Perkin-Elmer-Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티) 또는 라이트사이클러(Lightcycler) (로슈 몰레큘라 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals), 독일 만하임)를 이용하여 수행할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 5' 뉴클레아제 절차는 실시간 정량적 PCR 장치, 예컨대 ABI 프리즘 7700® 서열 검출 시스템에서 실시된다. 이 시스템은 열순환기, 레이저, 전하-커플링 소자 (CCD), 카메라 및 컴퓨터로 이루어진다. 이 시스템은 열순환기 상 96-웰 포맷에서 샘플을 증폭시킨다. 증폭 동안, 레이저-유도된 형광 신호는 모든 96개의 웰에 대해 광섬유 케이블을 통해 실시간으로 수집되고, CCD에서 검출된다. 이 시스템은 기기를 실행하고 데이터를 분석하기 위한 소프트웨어를 포함한다.

5'-뉴클레아제 검정 데이터는 초기에 Ct, 또는 역치 주기로서 표현된다. 상기 논의된 바와 같이, 형광 값은 모든 주기 동안 기록되고, 증폭 반응에서 그 지점까지 증폭된 생성물의 양을 나타낸다. 형광 신호가 처음 통계상 유의한 것으로 기록될 때의 시점이 역치 주기 (Ct)이다.

오류 및 샘플-대-샘플 편차의 영향을 최소화하기 위해, PCR은 일반적으로 내부 표준을 사용하여 수행된다. 이상적인 내부 표준물은 상이한 조직들 사이에서 일정한 수준에서 발현되고, 실험 처리에 의해 영향을 받지 않는다. 유전자 발현 패턴을 정규화하기 위해 가장 빈번하게 사용되는 RNA는 하우스키핑 유전자 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제 (GAPDH) 및 P-액틴에 대한 mRNA이다.

PCR 기술에 대한 보다 최근의 변형법은 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)이고, 이것은 이중-표지된 형광 프로브 (즉, 택맨® 프로브)를 통해 PCR 생성물 축적을 측정한다. 실시간 PCR은 각각의 표적 서열에 대한 내부 경쟁자가 정규화를 위해 사용되는 정량적 경쟁적 PCR, 및 샘플 내에 함유된 정규화 유전자 또는 PCR을 위한 하우스키핑 유전자를 사용하는 정량적 비교 PCR 모두와 상용성이다. 보다 상세한 내용에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996)]을 참조한다.

mRNA 단리, 정제, 프라이머 연장 및 증폭을 포함하는, RNA 공급원으로서의 고정된 파라핀-포매 조직을 사용하여 유전자 발현을 프로파일링하기 위한 대표적인 프로토콜의 단계는 발표된 다양한 학술지 논문에 제시되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Godfrey et al., J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)] 참조). 간략하게, 대표적인 방법은 파라핀-포매 종양 조직 샘플을 약 10 마이크로그램 두께의 절편으로 절단하는 것으로 출발한다. 이어서, RNA를 추출하고, 단백질 및 DNA를 제거한다. RNA의 농도 분석 후에, 필요한 경우에 RNA 복구 및/또는 증폭 단계가 포함될 수 있고, RNA는 유전자 특이적 프로모터를 사용하여 역전사되고, 이어서 PCR을 수행한다.

본 발명의 한 측면에 따르면, PCR 프라이머 및 프로브는 증폭되는 유전자에 존재하는 인트론 서열을 기초로 하여 설계된다. 이러한 실시양태에서, 프라이머/프로브 설계의 제1 단계는 유전자 내의 인트론 서열의 서술이다. 이것은 공개적으로 이용가능한 소프트웨어, 예컨대 문헌 [Kent, W., Genome Res. 12(4):656-64 (2002)]에서 개발된 DNA BLAT 소프트웨어, 또는 그의 변형을 포함하는 BLAST 소프트웨어에 의해 수행될 수 있다. 후속 단계는 PCR 프라이머 및 프로브 설계의 널리 확립된 방법에 따른다.

비특이적 신호를 피하기 위해, 프라이머 및 프로브를 설계할 때 인트론 내에 반복 서열을 차폐하는 것이 중요하다. 이것은, DNA 서열을 반복 요소의 라이브러리에 대해 스크리닝하고 반복 요소가 차폐된 질의 서열로 되돌아가는, 베일러 의과대학(Baylor College of Medicine)을 통해 온-라인으로 이용가능한 리피트 마스커(Repeat Masker) 프로그램을 사용하여 용이하게 달성될 수 있다. 이어서, 차폐된 인트론 서열을 사용하여, 임의의 상업적으로 또는 다르게는 공개적으로 입수가능한 프라이머/프로브 설계 패키지, 예컨대 프라이머 익스프레스(Primer Express) (어플라이드 바이오시스템즈); MGB 어세이-바이-디자인 (어플라이드 바이오시스템즈); 프라이머3 (문헌 [Rozen and Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J., pp 365-386])을 이용하여 프라이머 및 프로브 서열을 설계할 수 있다.

PCR 프라이머 설계에 고려되는 요인은 프라이머 길이, 용융 온도 (Tm), 및 G/C 함량, 특이성, 상보적 프라이머 서열, 및 3'-말단 서열을 포함한다. 일반적으로, 최적 PCR 프라이머는 길이가 일반적으로 17-30개 염기이고, 약 20-80%, 예컨대 예를 들어 약 50-60%의 G+C 염기를 함유한다. 50 내지 80℃, 예를 들어 약 50 내지 70℃의 Tm이 전형적으로 바람직하다.

PCR 프라이머 및 프로브 설계에 대한 추가의 안내에 대해, 예를 들어 그 전체 개시내용이 본원에 명백하게 참조로 포함된 문헌 [Dieffenbach et al., "General Concepts for PCR Primer Design" in PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155; Innis and Gelfand, "Optimization of PCRs" in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11; 및 Plasterer, T. N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70:520- 527 (1997)]을 참조한다.

바람직한 조건, 프라이머, 프로브, 및 내부 참조물 (G6PDH)은 하기 실시예 1에 기재되어 있다.

(iii) 마이크로어레이

차등 유전자 발현은 또한 마이크로어레이 기술을 이용하여 확인 또는 확증될 수 있다. 따라서, 유방암-연관 유전자의 발현 프로파일은 마이크로어레이 기술을 이용하여 신선한 또는 파라핀-포매 종양 조직 중 하나에서 측정될 수 있다. 이 방법에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열 (cDNA 및 올리고뉴클레오티드 포함)을 마이크로칩 기판 상에 플레이팅 또는 배열한다. 이어서, 배열된 서열을 관심 세포 또는 조직으로부터의 특이적 DNA 프로브와 혼성화시킨다. PCR 방법에서와 같이, mRNA의 공급원은 전형적으로 인간 종양 또는 종양 세포주, 및 상응하는 정상 조직 또는 세포주로부터 단리된 전체 RNA이다. 따라서, RNA는 다양한 원발성 종양 또는 종양 세포주로부터 단리될 수 있다. mRNA의 공급원이 원발성 종양인 경우에, mRNA는, 통상적으로 제조되고 일상적인 임상 실시 하에 보존된, 예를 들어 냉동된 또는 보관된 파라핀-포매 및 고정된 (예를 들어, 포르말린-고정된) 조직 샘플로부터 추출될 수 있다.

마이크로어레이 기술의 구체적 실시양태에서, cDNA 클론의 PCR 증폭된 삽입물은 조밀한 어레이로 배열된 기판에 적용된다. 바람직하게는, 적어도 10,000개의 뉴클레오티드 서열이 기판에 적용된다. 각각 10,000개 요소로 마이크로칩 상에 고정화시킨, 마이크로어레이된 유전자가 엄격한 조건 하의 혼성화에 적합하다. 형광 표지된 cDNA 프로브를 관심 조직으로부터 추출된 RNA의 역전사에 의한 형광 뉴클레오티드의 혼입을 통해 생성할 수 있다. 칩에 적용된 표지된 cDNA 프로브는 어레이 상 DNA의 각 스팟에 대해 특이성을 갖고 혼성화된다. 비특이적으로 결합된 프로브를 제거하기 위한 엄격한 세척 후에, 칩을 공초점 레이저 현미경검사에 의해 또는 또 다른 검출 방법, 예컨대 CCD 카메라에 의해 스캐닝한다. 각각의 어레이된 요소의 혼성화에 대한 정량화는 상응하는 mRNA 존재비에 대한 평가를 허용한다. 이중 색상 형광과 함께, RNA의 2개의 공급원으로부터 생성된 별개로 표지된 cDNA 프로브는 어레이에 쌍으로 혼성화된다. 이에 따라, 각각의 지정된 유전자에 상응하는 2개의 공급원으로부터의 전사체의 상대적인 존재비가 동시에 결정된다. 소형화된 규모의 혼성화는 매우 많은 유전자에 대한 발현 패턴의 간편하고 신속한 평가를 제공한다. 이러한 방법은 세포당 적은 카피로 발현되는 희귀 전사체를 검출하기 위해, 및 발현 수준에서 적어도 대략 2배의 차이를 재현가능하게 검출하기 위해 필요한 감수성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(2):106-149 (1996)]). 마이크로어레이 분석은 제조업체의 프로토콜에 따라 상업적으로 입수가능한 장비에 의해, 예컨대 아피메트릭스(Affymetrix) 진칩(GENCHIP)™ 기술, 또는 인사이트(Incyte)의 마이크로어레이 기술을 이용하여 수행할 수 있다.

유전자 발현의 대규모 분석을 위한 마이크로어레이 방법의 개발은 암 분류, 및 다양한 종양 유형에서의 결과 예측을 위한 분자 마커를 시스템적으로 탐색하는 것을 가능하게 한다.

(iv) 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE)

유전자 발현 연속 분석 (SAGE)은 각각의 전사체에 대한 개별 혼성화 프로브를 제공할 필요없이 다수의 유전자 전사체의 동시 및 정량 분석을 허용하는 방법이다. 먼저, 전사체를 특유하게 확인하기에 충분한 정보를 함유하는 짧은 서열 태그 (약 10-14 bp)를 생성하는데, 단 태그는 각각의 전사체 내의 특유한 위치로부터 얻는다. 이어서, 많은 전사체를 함께 연결하여 긴 연속 분자를 형성하고, 이를 서열분석하여, 다수의 태그의 동일성을 동시에 밝힐 수 있다. 개별 태그의 존재비를 결정하고, 각각의 태그에 상응하는 유전자를 확인함으로써 임의의 집단의 전사체의 발현 패턴을 정량적으로 평가할 수 있다. 보다 상세한 내용에 대해, 예를 들어 문헌 [Velculescu et al., Science 270:484-487 (1995); 및 Velculescu et al., Cell 88:243-51 (1997)]을 참조한다.

(v) 매스어레이 기술

매스어레이 (시쿼놈(Sequenom), 캘리포니아주 샌디에고) 기술은 검출을 위해 질량 분광측정법 (MS)을 이용하는, 유전자 발현 분석의 자동화된 고처리량 방법이다. 이 방법에 따르면, RNA의 단리, 역전사 및 PCR 증폭 후에, cDNA는 프라이머 연장에 적용된다. cDNA-유도 프라이머 연장 생성물을 정제하고, MALTI-TOF MS 샘플 제조에 필요한 성분이 예비 부하된 칩 어레이 상에 분배한다. 반응물 내에 존재하는 다양한 cDNA는 얻어진 질량 스펙트럼에서 피크 영역을 분석함으로써 정량화된다.

(vi) 대규모 병행 시그너처 서열분석 (MPSS)에 의한 유전자 발현 분석

문헌 [Brenner et al., Nature Biotechnology 18:630-634 (2000)]에 기재된 이 방법은 비-겔-기반 시그너처 서열분석을 개별 5 마이크로그램 직경의 마이크로비드 상에서 수백만개의 주형의 시험관내 클로닝과 조합하는 서열분석 방법이다. 먼저, DNA 주형의 마이크로비드 라이브러리를 시험관내 클로닝에 의해 구축한다. 이어서, 고밀도 (전형적으로 3x106개 마이크로비드/cm2 초과)의 유동 세포에서 주형-함유 마이크로비드의 평면 어레이의 조립을 수행한다. DNA 단편 분리를 요구하지 않는 형광-기반 시그너처 서열분석 방법을 이용하여, 각각의 마이크로비드 상의 클로닝된 주형의 유리 말단을 동시에 분석한다. 이러한 방법은 단일 작업으로 효모 cDNA 라이브러리로부터 수십만개의 유전자 시그너처 서열을 동시에 정확하게 제공하는 것으로 나타났다.

(vii) 면역조직화학

면역조직화학 방법은 또한 본 발명의 예후 마커의 발현 수준 검출에 적합하다. 따라서, 각각의 마커에 대해 특이적인 항체 또는 항혈청, 바람직하게는 폴리클로날 항혈청, 가장 바람직하게는 모노클로날 항체가 발현을 검출하기 위해 사용된다. 항체는, 예를 들어 방사성 표지, 형광 표지, 합텐 표지, 예컨대 비오틴, 또는 효소, 예컨대 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 사용하는 항체 자체의 직접적인 표지에 의해 검출할 수 있다. 대안적으로, 비표지된 1차 항체를 1차 항체에 특이적인 항혈청, 폴리클로날 항혈청 또는 모노클로날 항체를 포함하는 표지된 2차 항체와 함께 사용한다. 면역조직화학 프로토콜 및 키트는 당업계에 널리 공지되어 있고 상업적으로 입수가능하다.

(viii) 단백질체학

용어 "단백질체"는 특정 시점에서 샘플 (예를 들어, 조직, 유기체, 또는 세포 배양물)에 존재하는 단백질의 총체로서 규정된다. 단백질체학은 특히 샘플에서 단백질 발현의 전반적인 변화에 대한 연구를 포함한다 ("발현 단백질체학"으로도 지칭됨). 단백질체학은 전형적으로 다음 단계를 포함한다: (1) 2-D 겔 전기영동 (2-D PAGE)에 의해 샘플 중의 개별 단백질을 분리하는 단계; (2) 예를 들어 질량 분광측정법 또는 N-말단 서열분석에 의해, 겔로부터 회수된 개별 단백질을 확인하는 단계, 및 (3) 생물정보학을 이용하여 데이터를 분석하는 단계. 단백질체학 방법은 다른 유전자 발현 프로파일링 방법에 대한 유용한 보완법이고, 본 발명의 예후 마커의 생성물을 검출하기 위해 단독으로 또는 다른 방법과 조합하여 이용할 수 있다.

(ix) 직접적 RNA 서열분석

직접적 RNA 서열분석 (DSR)은 cDNA의 사전 합성 또는 라이게이션/증폭 단계에 대한 필요 없이 직접적으로 RNA 분자의 대규모 병행 서열분석을 허용한다. 문헌 [Ozsolak, et al., Nature 461:814-818 (2009); Ozsolak F, and Milos PM., WIREs RNA, 2: 565-570 (2011), Ozsolak F, and Milos PM., Experimental Medicine 28: 2574-2580]. 이러한 기술은 포르말린-고정된 및 파라핀 포매된 것을 비롯한 RNA 샘플의 정량화 및 특성화를 허용한다.

일반적으로, 단리된 전체 RNA 또는 세포 용해물은 t폴리(dT)-코팅된 유동 세포에 첨가되고, 이는 폴리A RNA 종의 포획 및 서열분석을 가능하게 한다. 폴리A 폴리머라제를 사용하여 폴리A 고리를 생성한 후에 처연 폴리A 꼬리를 함유하지 않는 RNA 종에 대한 서열분석을 위해 유동 세포에 샘플을 부하한다.

(x) RNA 계내 혼성화

RNA 계내 혼성화 (RISH)는 조직 샘플에서 mRNA 발현의 조사를 위해 이용되는 기술이다. 문헌 [Veeck J and Dahl E., Methods Mol Biol., 664:135-50 (2010); Nuovo GJ., Methods, 44:39-46 (2008); Yamada H., Cytometry A., 77:1032-7 2010].

일반적으로, 관심 RNA에 특이적인 프로브는 검출가능한 표지, 예컨대 방사성 태그, 효소 프로브, 화학 염료 또는 형광 화합물로 표지된다. 관심 조직 샘플은 프로브의 세포에서 상보적 RNA 서열에 대한 혼성화를 허용하는 조건 하에 단일-가닥 표지된 프로브의 용액과 접촉된다. 임의의 혼성화되지 않은 프로브가 제거되고, 혼성화된 프로브는 적절한 방법에 의해 검출된다.

(xi) mRNA 단리, 정제 및 증폭의 일반적 설명

mRNA 단리, 정제, 프라이머 연장 및 증폭을 포함하는, RNA 공급원으로서 고정된 파라핀-포매 조직을 사용하여 유전자 발현을 프로파일링하기 위한 대표적인 프로토콜의 단계가 발표된 다양한 학술지 논문에 제시되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000)]; [Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)]). 간략하게, 대표적인 방법은 파라핀-포매 종양 조직 샘플을 약 10 마이크로그램 두께의 절편으로 절단하는 것으로 출발한다. 이어서, RNA를 추출하고, 단백질 및 DNA를 제거한다. RNA의 농도 분석 후에, 필요한 경우에 RNA 복구 및/또는 증폭 단계가 포함될 수 있고, RNA는 유전자 특이적 프로모터를 사용하여 역전사되고, 이어서 PCR을 수행한다. 최종적으로, 조사된 종양 샘플에서 확인된 특징적인 유전자 발현 패턴을 기초로 하여 환자에게 이용가능한 최상의 치료 옵션(들)을 확인하기 위해 데이터를 분석한다.

NRG1 발현은 또한 생체내 진단 검정을 이용하여, 예를 들어 검출하려는 분자에 결합하고 검출가능한 표지 (예를 들어, 방사성 동위원소)로 태그 부착된 분자 (예컨대, 항체)를 투여하고 표지의 국재화에 대해 환자를 외부에서 스캐닝함으로써 평가될 수 있다.

IV . 제약 제제

본 발명에 따라 사용되는 HER3 억제제, 예컨대 이중특이적 HER3/EGFR 억제제의 치료 제제는 일반적으로 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로, 원하는 정도의 순도를 갖는 항체를 임의적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 저장용으로 제조된다. 항체 결정이 또한 고려된다 (미국 특허 출원 2002/0136719 참조). 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체 (예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다. WO 97/04801 (명백하게 본원에 참조로 포함됨)에 동결 건조 항체 제제가 기재되어 있다.

본원의 제제는 또한 치료할 특정한 적응증에 필요한, 바람직하게는 서로 유해 효과를 내지 않는 보완적 활성을 갖는, 하나 초과의 활성 화합물을 함유할 수 있다. HER3 억제제와 조합될 수 있는 다양한 약물은 아래 치료 섹션에서 기재된다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.

활성 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로구체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.

따라서, HER3 억제제, 예컨대 이중특이적 HER3/EGFR 억제제, (예컨대, MEHD7945A), 또는 그의 제약 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 상기 억제제 또는 제약 조성물, 및 상기 억제제 또는 제약 조성물이 억제제에 반응할 수 있는 한 유형의 암 (예를 들어, HNSCC)을 갖는 환자를 치료하기 위해 지시된다는 것을 언급한 라벨을 포장물 내에 합하는 것을 포함하고, 여기서 환자의 암은 암 유형에서의 NRG1 발현에 대한 중간 수준보다 높은 수준에서 NRG1을 발현한다.

또한, 화학요법제 또는 그의 제약 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 화학요법제 억제제 또는 제약 조성물, 및 화학요법제 또는 제약 조성물이 한 유형의 암을 갖는 환자를 치료하기 위해 지시된다는 것을 언급한 라벨을 포장물 내에 합하는 것을 포함하고, 여기서 환자의 암은 암 유형에서의 NRG1 발현에 대한 중간 수준보다 높은 수준에서 NRG1을 발현한다.

V. HER3 억제제를 사용하는 치료

본 발명은 암 환자에게 치료 유효량의 HER3 억제제, 예컨대 이중특이적 HER3/EGFR 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 HER3 억제제의 투여전에 NRG1을 과다발현하는 한 유형의 암으로 진단받은 것인, 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, NRG1의 과다발현의 진단은 환자의 암이 암 유형에서의 NRG1 발현에 대한 중간 수준보다 높은 수준에서 NRG1을 발현한다는 결정에 기초하였다. 특정 실시양태에서, 환자의 암은 암 유형에서의 NRG1 발현에 대해 60번째, 65번째, 70번째, 75번째, 80번째, 85번째, 90번째, 95번째, 97번째 백분위수 이상인 수준에서 NRG1을 발현한다.

특정 암 유형에서, NRG1 발현은 그 암 유형을 앓고 있는 환자 집단에서 이중모드이다. 이중모드 발현 프로파일은 높은 수준의 NRG1 발현을 나타내는 - 과다발현 모드의 - 환자 군 및 보다 낮은 NRG1 발현 수준을 나타내는 - 과다발현 모드 결여의 환자 군으로 이루어진다. 한 실시양태에서, 2가지 모드 사이에 변곡점은 암 유형을 NRG1을 과다발현하는 암 또는 NRG1의 과다발현이 결여된 암으로 특성화하기 위한 값으로 사용된다. 변곡점보다 높은 NRG1 발현 수준을 갖는 암은 NRG1을 과다발현하는 한 유형의 암으로 특성화될 것이다. 변곡점보다 낮은 NRG1 발현 수준을 갖는 암은 NRG1의 과다발현이 결여된 암 유형으로 특성화될 것이다. 따라서, 한 실시양태에서, NRG1의 과다발현의 진단은 환자의 암이 이중모드 NRG1 발현 프로파일의 과다발현 모드에 포함된다는 결정에 기초하였다.

실시예 4는 환자 집단에서 NRG1 발현의 분포를 결정하기 위한 검정을 제공한다. 한 실시양태에서, 2-성분 가우시안 혼합물 분포는 NRG1의 과다발현 및 NRG1의 과다발현 결여 사이의 변곡점을 추정하는데 사용된다.

한 실시양태에서, 치료할 암은 이중모드 NRG1 발현 프로파일을 나타낸다. 이러한 암의 한 예는 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)이다. 실시예 4에서 논의된 바와 같이, HNSCC 암의 집단은 NRG1 과다발현을 갖는 암 및 NRG1 과다발현이 결여된 암의 가우시안 이중모드 분포 프로파일을 나타낸다. 분포 분석에 의해 제공된 변곡점은 선형 규모 상의 대략 1.50에 해당하는 로그 스케일 상의 대략 0.3689이다.

한 실시양태에서, 치료할 암은 뉴레귤린-유도된 자가분비 신호전달을 나타낸다. 이러한 암은 암 세포에서 NRG1 및 HER3의 공발현의 존재에 의해 확인될 수 있다. NRG1 및 HER3의 공발현은 예를 들어 RNA 계내 혼성화 절차에 의해 측정될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 암을 갖는 환자에게 치료 유효량의 MEHD7945A를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 MEHD7945A의 투여 전에 NRG1을 과다발현하는 한 유형의 암으로 진단받은 것인, 암을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 암은 뉴레귤린-유도된 자가분비 신호전달을 나타낸다. 한 실시양태에서, 암은 이중모드 NRG1 발현 프로파일을 나타낸다.

한 실시양태에서, 본 발명은 편평 세포 암종을 갖는 환자에게 치료 유효량의 MEHD7945A를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 MEHD7945A의 투여 전에 NRG1을 과다발현하는 한 유형의 암으로 진단받은 것인, 편평 세포 암종을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 편평 세포 암종은 뉴레귤린-유도된 자가분비 신호전달을 나타낸다. 한 실시양태에서, 편평 세포 암종은 이중모드 NRG1 발현 프로파일을 나타낸다.

한 실시양태에서, 본 발명은 HNSCC를 갖는 환자에게 치료 유효량의 MEHD7945A를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 MEHD7945A의 투여 전에 NRG1을 과다발현하는 한 유형의 HNSCC로 진단받은 것인, HNSCC를 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

HER3 억제제, 예컨대 이중특이적 HER3/EGFR 억제제를 사용하는 요법은 바람직하게는 무진행 생존 (PFS) 및/또는 전체 생존 (OS)을 비롯한 생존을 연장시킨다. 한 실시양태에서, HER3 억제제, 예컨대 이중특이적 HER3/EGFR 억제제를 사용하는 요법은 치료하는 암에 대해 승인된 항종양제, 또는 치료 표준을 투여하여 달성한 생존보다 적어도 약 20% 더 생존을 연장시킨다.

환자는 진행성, 불을성, 재발성, 화학요법-내성 및/또는 EGFR 억제제-내성 암을 가질 수 있다. 환자에 대한 MEHD7945A (HER3 억제제)의 투여는 예를 들어 이러한 환자에게 EGFR 억제제를 투여하여 달성한 생존보다 적어도 약 20% 더 생존을 연장시킬 수 있다.

HER3 억제제, 예컨대 이중특이적 HER3/EGFR 억제제는 공지된 방법에 따라, 예컨대 정맥내 투여, 예를 들어 볼루스로서 또는 일정 시간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의해 인간 환자에게 투여된다. 항체를 정맥내 투여하는 것이 바람직하다.

암의 예방 또는 치료를 위해, HER3 억제제, 예컨대 이중특이적 HER3/EGFR 억제제의 용량은 상기 정의된 바와 같은 치료할 암의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 약물에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다.

한 실시양태에서, 고정 용량의 억제제가 투여된다. 고정 용량은 적합하게는 환자에게 1회에 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여된다. 고정 용량이 투여되는 경우에, 바람직하게는 이는 약 20 mg 내지 약 2000 mg 범위의 억제제이다. 예를 들어, 고정 용량은 대략 420 mg, 대략 525 mg, 대략 840 mg, 또는 대략 1050 mg의 억제제일 수 있다.

일련의 용량이 투여되는 경우에, 이들은 예를 들어 대략 매주, 대략 2주 마다, 대략 3주 마다, 또는 대략 4주 마다 투여될 수 있지만, 바람직하게는 대략 3주 마다 투여된다. 고정 용량은 예를 들어 질환 진행, 유해 사례, 또는 의사가 결정하는 다른 시간까지 계속 투여될 수 있다. 예를 들어 약 2, 3 또는 4 내지 약 17회 이상의 고정 용량이 투여될 수 있다.

한 실시양태에서, 항체의 하나 이상의 부하 용량(들)이 투여된 후, 항체의 하나 이상의 유지 용량(들)이 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 다수의 동일한 용량이 환자에게 투여된다.

HER3 억제제, 예컨대 이중특이적 HER3/EGFR 억제제가 단일 항종양제로서 투여될 수 있는 반면, 환자는 임의로 억제제 (또는 화학요법제) 및 하나 이상의 (추가의) 화학요법제(들)의 조합을 사용하여 치료된다. 본원에서 예시적인 화학요법제는 이리노테칸, 겜시타빈, 카르보플라틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 토포테칸 및/또는 리포솜 독소루비신을 포함한다. 조합 투여는 개별 제제 또는 단일 제약 제제를 사용하여 공투여 또는 동시 투여하는 것과, 어느 한 순서로 연속 투여하는 것을 포함하며, 바람직하게는 양쪽 (또는 모든) 활성제가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 기간이 존재한다. 따라서, 항대사물 화학요법제는 억제제의 투여 전에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 항대사물 화학요법제의 적어도 하나의 투여와 억제제의 적어도 하나의 투여 사이의 시간 간격은 바람직하게는 대략 1개월 이내, 가장 바람직하게는 대략 2주 이내이다. 대안적으로, 항대사물 화학요법제 및 억제제는 단일 제제 또는 개별 제제로 환자에게 공동으로 투여된다. 화학요법제 및 억제제의 조합을 사용하는 치료는 환자에게 상승작용적인, 또는 부가적인 것보다 큰 치료 이익을 줄 수 있다.

항대사물 화학요법제는 투여되는 경우에 대체로 그에 대해 공지된 용량으로 투여되거나, 약물의 조합 작용 또는 항대사물 화학요법제의 투여에 의한 부정적인 부작용 때문에 선택적으로 감소된다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투여 스케줄은 제조업체의 지침에 따라 또는 숙련된 진료의가 경험적으로 결정하는 바에 따라 이용될 수 있다. 항대사물 화학치료제가 겜시타빈인 경우, 이것은 바람직하게는 예를 들어 3주 사이클의 제1일 및 제8일에 약 600mg/m² 내지 1250mg/m² (예를 들어, 대략 1000mg/m²)의 투여량으로 투여된다.

억제제 및 항대사물 화학요법제 이외에, 다른 치료 요법이 또한 그와 조합될 수 있다. 예를 들어, 제2 (제3, 제4 등)의 화학요법제(들)를 투여할 수 있고, 여기서 제2 화학요법제는 다른 상이한 항대사물 화학요법제, 또는 항대사물이 아닌 화학요법제이다. 예를 들어, 제2 화학요법제는 탁산 (예컨대, 파클리탁셀 또는 도세탁셀), 카페시타빈, 또는 백금-기반 화학요법제 (예컨대, 카르보플라틴, 시스플라틴, 또는 옥살리플라틴), 안트라시클린 (예컨대, 독소루비신, 예를 들어 리포좀 독소루비신), 토포테칸, 페메트렉세드, 빈카 알칼로이드 (예컨대, 비노렐빈) 및 TLK 286일 수 있다. 상이한 화학요법제의 "칵테일"을 투여할 수 있다.

억제제 및/또는 화학요법제와 조합될 수 있는 다른 치료제는 다음 중 어느 하나 이상을 포함한다: 제2의 상이한 HER 억제제, HER 이량화체 억제제 (예를 들어, 성장 억제 HER2 항체, 예컨대 트라스투주맙, 또는 HER2-과다발현 세포의 아폽토시스를 유도하는 HER2 항체, 예컨대 7C2, 7F3 또는 그의 인간화 변이체); 상이한 종양 연관 항원, 예컨대 EGFR, HER3, HER4에 대해 지시된 항체; 항호르몬 화합물, 예를 들어 항에스트로겐 화합물, 예컨대 타목시펜, 또는 아로마타제 억제제; 심장보호제 (요법과 연관된 임의의 심근 기능장애를 방지하거나 감소시킴); 시토카인; EGFR-표적화된 약물 (예컨대, 타르세바®, 이레사® 또는 세툭시맙); 항혈관신생제 (특히 상표명 아바스틴™ 하에 제넨테크에 의해 시판되는 베바시주맙); 티로신 키나제 억제제; COX 억제제 (예를 들어, COX-1 또는 COX-2 억제제); 비-스테로이드성 항염증 약물, 셀레콕시브 (셀레브렉스(CELEBREX)®); 파르네실 트랜스퍼라제 억제제 (예를 들어, 티피파르닙/자르네스트라(ZARNESTRA)® R115777 (존슨 앤 존슨(Johnson and Johnson)으로부터 이용가능함) 또는 로나파르닙 SCH66336 (쉐링-플라우(Schering-Plough)로부터 이용가능함)); 종양태아성 단백질 CA 125에 결합하는 항체, 예컨대 오레고보맙 (MoAb B43.13); HER2 백신 (예컨대, HER2 AutoVac 백신 (파르멕시아(Pharmexia)), 또는 APC8024 단백질 백신 (덴드레온(Dendreon)), 또는 HER2 펩티드 백신 (GSK/코릭사(Corixa)); 또 다른 HER 표적화 요법 (예를 들어, 트라스투주맙, 세툭시맙, ABX-EGF, EMD7200, 게피티닙, 에를로티닙, CP724714, CI1033, GW572016, IMC-11F8, TAK165 등); Raf 및/또는 ras 억제제 (예를 들어, WO 2003/86467 참조); 독소루비신 HCl 리포솜 주사 (독실(DOXIL)®); 토포이소머라제 I 억제제, 예컨대 토포테칸; 탁산; HER2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 억제제, 예컨대 라파티닙/GW572016; TLK286 (텔시타(TELCYTA)®); EMD-7200; 오심을 치료하는 의약, 예컨대 세로토닌 길항제, 스테로이드 또는 벤조디아제핀; 피부 발진을 예방 또는 치료하는 의약 또는 표준 여드름 요법 (국소 또는 경구 항생제 포함); 설사를 치료 또는 예방하는 의약; 체온-감소 의약, 예컨대 아세트아미노펜, 디펜히드라민 또는 메페리딘; 조혈 성장 인자 등.

임의의 상기 공투여된 작용제에 대한 적합한 투여량은 현재 사용되는 양이고, 작용제와 억제제의 조합 작용 (상승작용)으로 인해 감소시킬 수 있다.

상기 치료 뿐만 아니라, 환자에게 암 세포의 외과적 제거 및/또는 방사선 요법을 실시할 수 있다.

억제제가 항체인 경우에, 바람직하게는 투여되는 항체는 네이키드 항체이다. 그러나, 투여되는 억제제는 세포독성제와 접합될 수 있다. 바람직하게는, 그가 결합하는 접합된 억제제 및/또는 항원은 세포에 의해 내재화되어, 그가 결합하는 암 세포를 사멸시키는 접합체의 치료 효능을 증가시킨다. 바람직한 실시양태에서, 세포독성제는 암 세포 내의 핵산을 표적으로 하거나 방해한다. 이러한 세포독성제의 예는 메이탄시노이드, 칼리케아미신, 리보뉴클라아제 및 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한다.

본원은 유전자 요법에 의한 억제제의 투여를 고려한다. 세포내 항체를 생성하기 위한 유전자 요법의 사용에 대해 예를 들어, 1996년 3월 14일에 공개된 WO96/07321을 참조한다.

핵산 (임의로 벡터에 함유된 것)을 생체내 및 생체외에서 환자의 세포에 도입하기 위한 2가지 주요 접근법이 존재한다. 생체내 전달의 경우, 핵산은 통상적으로 항체가 필요한 부위에서 환자에게 직접 주사된다. 생체외 치료의 경우, 환자의 세포를 분리하고, 핵산을 이들 단리된 세포에 도입하고, 변형된 세포를 직접 또는 예를 들어 환자에게 이식되는 다공성 막 내에 포획시켜 환자에게 투여한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,892,538 및 5,283,187 참조). 핵산을 생존 세포에 도입하는 다양한 기술이 이용가능하다. 이러한 기술은 핵산이 배양된 세포로 시험관내 전달되는지 또는 의도된 숙주의 세포로 생체내 전달되는지에 따라 달라진다. 핵산을 포유동물 세포로 시험관내 전달하는데 적합한 기술은 리포솜, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 방법 등의 이용을 포함한다. 유전자의 생체외 전달을 위해 일반적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.

현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터 (예컨대, 아데노바이러스, 제I형 단순 헤르페스 바이러스 또는 아데노-연관 바이러스) 및 지질-기반 시스템 (유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)을 사용한 형질감염을 포함한다. 일부 상황에서는, 표적 세포를 표적화하는 작용제, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜이 사용될 경우, 표적화 및/또는 흡수 촉진을 위해 세포내이입과 연관된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질, 예를 들어 특정한 세포 유형에 대해 작용하는 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 세포 주기에서 내재화를 하는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국재화를 표적화하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질을 이용할 수 있다. 수용체-매개된 세포내이입 기술은, 예를 들어 문헌 [Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987); 및 Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 현재 공지된 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜에 관한 검토는 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)]을 참조한다. 또한 WO 93/25673 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조한다.

VI . 제조품

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 질환 또는 병태의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조품을 제공한다. 제조품은 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 연관된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 선택된 질환 또는 상태를 치료하기 위해 효과적인 조성물을 보유하거나 함유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물에서 적어도 하나의 활성제는 HER3 억제제, 예컨대 이중특이적 HER3/EGFR 억제제, 예컨대 MEHD7945A이다.

제조품은 제약상 허용되는 희석제, 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트 및 제조품은 또한 조성물이 환자의 암이 NRG1을 약물에 따라 규정된 수준에서 발현하는 암을 치료하기 위해 사용되는 것을 나타내는 정보를, 예를 들어 포장 삽입물 또는 라벨의 형태로 포함한다. 삽입물 또는 라벨은 임의의 형태, 예를 들어 종이 또는 전자 매체, 예컨대 자기 기록 매체 (예를 들어, 플로피 디스크) 또는 CD-ROM에 존재할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 또한 키트 또는 제조품 내의 제약 조성물 및 투여 형태에 관한 다른 정보를 포함할 수도 있다.

일반적으로, 이러한 정보는 환자 및 의사가 동봉된 제약 조성물 및 투여 형태를 효과적이고 안전하게 사용하는 것을 돕는다. 예를 들어, HER3 억제제에 관한 다음의 정보가 삽입물에 제공될 수 있다: 약동학, 약역학, 임상 연구, 효능 파라미터, 적응증 및 용법, 금기, 경고, 주의, 유해 반응, 과량 투여, 적당한 투여량 및 투여, 공급 방법, 적합한 저장 조건, 참고 문헌 및 특허 정보.

본 발명의 구체적 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체 중에 HER3 억제제, 예컨대 이중특이적 HER3/EGFR 억제제를 포함하는 제약 조성물 및 상기 억제제 또는 제약 조성물이 HER3 억제제, 예컨대 이중특이적 HER3/EGFR 억제제에 반응할 수 있는 한 유형의 암을 갖는 환자를 치료에 사용되도록 지시되었음을 언급하는 라벨 (여기서, 환자의 암은 암 유형에서의 NRG1 발현에 대한 중간 수준보다 높은 수준에서 NRG1을 발현함)을 함께 포장하여 포함한 제조품이 제공된다.

이러한 본 발명의 측면의 임의의 실시양태에서, 본원의 제조품은 제2 의약을 포함하는 용기를 추가로 포함하며, 여기서 HER3 억제제는 제1 의약이고, 이 제조품은 유효량의 제2 의약을 사용하여 환자를 치료하기 위한 포장 삽입물 상의 지침을 추가로 포함한다. 제2 의약은 상기 기재된 것 중 어느 하나일 수 있으며, 예시적인 제2 의약은 또 다른 HER 항체 또는 화학요법제이다.

포장 삽입물은 용기 상에 존재하거나 용기와 연관된다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 암 유형을 치료하기 위해 효과적인 조성물을 보유하거나 함유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물에서 적어도 하나의 활성제는 HER 억제제이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 억제제 및 임의의 다른 의약의 투약 양 및 간격에 관한 특정한 지침이 제공되면 조성물이 치료에 적합한 대상에서 암을 치료하기 위해 사용되는 것을 나타낸다. 제조품은 제약상 허용되는 희석제, 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및/또는 덱스트로스 용액을 포함하는 추가의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.

예를 들어 본 발명에 관련된 기술 영역에서 이용가능한 다수의 우수한 매뉴얼 및 교과서 (예를 들어, 문헌 [Using Antibodies, A Laboratory Manual, edited by Harlow, E. and Lane, D., 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (예를 들어, ISBN 0-87969-544-7); Roe B. A. et al. 1996, DNA Isolation and Sequencing (Essential Techniques Series), John Wiley & Sons. (예를 들어, ISBN 0-471-97324-0); Methods in Enzymology: Chimeric Genes and Proteins, 2000, ed. J. Abelson, M. Simon, S. Emr, J. Thomer. Academic Press; Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001, 3rd Edition, by Joseph Sambrook and Peter MacCallum, (이전에, Maniatis Cloning manual) (예를 들어, ISBN 0-87969-577-3); Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Fred M. Ausubel, et al. John Wiley & Sons (예를 들어, ISBN 0-471-50338-X); Current Protocols in Protein Science, Ed. John E. Coligan, John Wiley & Sons (예를 들어, ISBN 0-471-11184-8); 및 Methods in Enzymology: Guide to protein Purification, 1990, Vol. 182, Ed. Deutscher, M.P., Acedemic Press, Inc. (예를 들어, ISBN 0-12-213585-7)])에 기재된 바와 같은 또는 분자 생물학에서 실험 방법을 기재하는 것을 다루는 다수의 대학 및 상업적 웹사이트에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 다수의 대안적인 실험 방법이 본 발명의 실시에서 본원에 구체적으로 기재된 것을 성공적으로 대체할 수 있다.

VII . 광고 방법

본원의 발명은 또한 표적 청중에게 한 유형의 암 (예컨대, HNSCC)을 갖는 환자를 치료하기 위한 HER3 억제제, 예컨대 이중특이적 HER3/EGFR 억제제 (예를 들어, MEHD7945A) 또는 그의 제약상 허용되는 조성물의 사용을 프로모션하는 것을 포함하며, 여기서 환자의 암은 NRG1을 과다발현하는 것인, 상기 억제제 또는 그의 제약 조성물을 광고하는 방법을 포괄한다.

광고는 일반적으로 광고주가 확인되고 메시지가 제어된, 비-개인적인 매체를 통한 유료 커뮤니케이션이다. 본원의 목적을 위한 광고는 선전, 홍보, 간접 광고, 후원, 인수 및 판촉을 포함한다. 이러한 용어는 또한 본원에서 본 발명을 구입하거나 지지하거나 승인하는 유리한 패턴으로 설득하거나 정보를 제공하거나 프로모션하거나 동기부여하거나 또는 다르게는 행동을 변형시키기 위해 대중에게 호소하도록 고안된 인쇄 커뮤니케이션 매체들 중 임의의 것으로 나타나는, 후원받은 정보성 공시를 또한 포함한다.

본원에서의 진단 방법의 광고 프로모션은 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 이러한 메시지를 전달하기 위해 사용되는 광고 매체의 예는 방송 매체에서 메시지를 나타내는, 텔레비젼, 라디오, 영화, 잡지, 신문, 인터넷 및 광고판 (광고방송 포함)를 포함한다. 광고는 또한 식품점 카트의 시트, 공항 보도의 벽 및 버스 측면 상의 것들, 통화중 대기 메시지 또는 점포내 PA 시스템에서 들리는 것들, 시각적 또는 청각적 커뮤니케이션이 존재할 수 있는 어디에서든지 있는 것들을 포함한다.

프로모션 또는 광고 수단의 보다 구체적 예는 텔레비전, 라디오, 영화, 인터넷, 예컨대 웹 캐스트 및 웨비나, 동시 사용자들에게 도달하도록 의도된 쌍방향 컴퓨터 네트워크, 고정형 또는 전자식 광고판 및 기타 공공 간판, 포스터, 전통적인 또는 전자식 인쇄물, 예컨대 잡지 및 신문, 기타 매스컴, 프레젠테이션 또는 개인적인 접촉 (예를 들어, 이메일, 전화, 인스턴트 메시지, 우편, 택배, 대중, 또는 배달 우편, 개인 방문 등에 의한 접촉)을 포함한다.

사용되는 광고의 유형은 많은 요인, 예를 들어 도달하려는 표적 청중의 성질, 예를 들어 병원, 보험 회사, 진료소, 의사, 간호사 및 환자, 뿐만 아니라 비용 고려사항, 및 의약 및 진단 광고를 규제하는 관련 관할 법률 및 규칙에 따라 결정될 것이다. 광고는 서비스 상호작용에 의해 정의되는 사용자 특성화 및/또는 기타 데이터, 예컨대 사용자 통계 및 지리적 위치를 기초로 하여 개별화 또는 주문제작될 수 있다.

본 발명의 추가 상세내용은 하기의 비제한적 실시예에 의해 예시된다. 본 명세서 내의 모든 인용문헌의 개시내용은 명백히 본원에 참고로 포함된다.

실시예 1

MEHD7945A 는 HER3 및 EGFR 둘 다에 특이적이다

MEHD7945A (또한 DL11f로 알려짐)는 EGFR 및 HER3 둘 다에 대해 결합 특이성을 갖는 항원-결합 도메인을 포함하는 항체이다. WO 2010/108127 및 문헌 [Schaefer, et al. Cancer Cell, 20: 472-486 (2011)]. 전형적으로, 이중표적화제는 2개의 특징적인 항원-결합 모듈을 연결하여 구축하며, 각각의 모듈은 오직 1개의 항원에 결합할 수 있다. 대조적으로, MEHD7945A에서, 각각의 모듈 (Fab)은 2개의 항원 중 어느 하나에 결합할 수 있으며, 이에 따라 결합력 효과로부터 증진된 결합 친화도를 도출할 잠재력을 갖는다. MEHD7945A의 2개의 동일한 Fab가 각각 EGFR 또는 HER3에 결합할 수 있는지 확인하기 위해, 경쟁적 결합 검정을 수행하였다. 고정화된 HER3-ECD에 대한 MEHD7945A 결합을 증가하는 양의 EGFR-ECD를 사용하여 용량-의존성 방식으로 감소시켰다. 반대로, MEHD7945A는 가용성 HER3-ECD 단백질에 의해 고정화된 EGFR-ECD로부터 경쟁하였다. 예상한 바와 같이, 주어진 그의 상대 결합 상수에서, 보다 높은 농도의 가용성 EGFR-ECD가 고정화된 HER3-ECD에 대한 MEHD7945A의 결합과 경쟁하는데 필요하였다 (도 1). 도 1에서의 결과는 MEHD7945A 농도 대 OD로 표현하였다. 검정은 지시된 가용성 경쟁자: 1x = 0.02 μg/ml, 10x = 0.2 μg/ml, 100x = 2 μg/ml, 1000x = 20 μg/ml의 존재 하에 지시된 바와 같이 고정화된 HER3-ECD 또는 EGFR-ECD에 대한 MEHD7945A의 결합을 조사하였다. 도 1의 결과는 MEHD7945A 농도 대 OD로서 표현하였다.

실시예 2

MEHD7945A 는 EGFR 및 HER2 / HER3 -의존성 신호전달을 억제한다

세포 신호전달 검정에서 MEHD7945A의 이중 활성을 결정하였다. HER3 상의 억제 기능을 평가하기 위해, NRG 처리가 HER2/HER3 경로를 강력하게 활성화시키는 MCF-7 세포를 사용하였다. NRG 자극 이전의 MEHD7945A로의 처리는 HER3의 인산화를 용량-의존성 방식으로 강력하게 억제하였으며, AKT 및 ERK1/2의 인산화를 현저하게 감소시켰다 (도 2A). MEHD7945A는 HER3의 인산화를 0.05 μg/ml의 IC50으로, AKT의 인산화를 0.19 μg/ml의 IC50 값으로, ERK1/2의 인산화를 1.13 μg/ml의 IC50 값으로 억제하였다. HER3에 대해 대등한 결합 친화도를 갖는 HER3에 대한 단일특이적 항체인 항-HER3로의 처리는 유사한 결과를 달성하였다. 항-HER3은 HER3의 인산화를 0.12 μg/ml의 IC50으로, AKT의 인산화를 0.74 μg/ml의 IC50 값으로, ERK1/2의 인산화를 1.83 μg/ml의 IC50 값으로 억제하였다. EGFR-NR6 세포를 리간드 자극 전에 MEHD7945A로 예비처리하였으며, MEHD7945A가 EGFR 및 ERK1/2의 인산화를 각각 0.03 및 0.16 μg/ml의 IC50 값으로 억제하는 것으로 결정되었다 (도 2B). 단일특이적 EGFR 항체 세툭시맙은 EGFR 및 하류 신호전달 분자의 인산화를 억제하는데 보다 더 효과적이었으며, 이는 아마도 EGFR에 대한 보다 높은 결합 친화도로 인한 것일 것이다. 또한, 베타셀룰린- 및 암피레귤린-유도된 EGFR 인산화는 또한 MEHD7945A에 의해 억제되었다. MEHD7945A는 A431 및 BxPC3 세포에서 항-HER3 및 세툭시맙의 조합만큼 강력하게 ERK1/2 및 AKT 경로를 억제하였다.

검정을 다음과 같이 수행하였다. 지시된 농도의 MEHD7945A 또는 항-HER3으로 처리된 MCF-7 세포를 0.5 nM NRG로 10분 동안 자극하였다. 세포 용해물을 이뮤노블롯팅하여 pHER3 (Tyr1289), pAKT (Ser473), pERK1/2 (Thr202/Tyr204) 및 전체 HER3을 검출하였다. 도 2A. EGFR-NR6 세포를 지시된 농도의 MEHD7945A 또는 세툭시맙으로 1시간 동안 처리한 후에 5 nM TGF-α로 10분 동안 자극하였다. 세포 용해물을 이뮤노블롯팅에 적용하여 pERK1/2 (Thr202/Tyr204), 전체 EGFR 및 인산화된 EGFR을 검출하였다. EGFR-NR6 세포가 오직 EGFR을 발현하므로 EGFR의 모든 잠재적 인산화 부위를 pTyr 항체를 이용하여 검출하였다.

도 2 B.

실시예 3

MEHD7945A 는 다수의 암 모델에서 활성이다

Fadu 이종이식편 모델, 두경부 편평 세포 암종 모델에서의 생체내 활성

MEHD7945A, 상업적으로 입수가능한 항-EGFR 항체, 및 항-HER3 항체를 Fadu 세포 (ATCC HTB-43, 버지니아주 마나사스)로부터 유래된 확립된 종양을 갖는 마우스에서 시험하였다. 5x10⁶개 FaDu 세포를 CB17 SCID 마우스에 피하로 접종하였다. 유사한 크기의 종양을 갖는 동물을 다음과 같이 처리 코호트 (n=9/군)로 무작위로 분류하였다: 비히클 (MEHD7945A 제제 완충제), 항-EGFR 항체 (25 mg/kg), 항-HER3 항체 (50 mg/kg) 및 MEHD7945A (25 mg/kg). 처리는 무작위 분류 당일에 2x 부하 용량 (각각 50 또는 100 mg/kg)으로 시작하여 복강내로 투여하고, 총 4회 처리에 대해 매주 지속하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, MEHD7945A는 FaDu 두경부 암 모델에서 활성이고, 항-EGFR 특이적 또는 항-HER3 특이적 항체보다는 종양 성장을 억제하는데 보다 효과적이다.

MEHD7945A 는 추가의 암 유형에서 활성이다

도 4는 MEHD7945A가 그 암 유형에 대한 세툭시맙 또는 단일특이적 항-HER3 항체의 활성 뿐만 아니라 상대 활성을 나타내는 추가의 암 유형 중 일부의 개요를 제공한다. 이러한 개요를 생성하는데 이용된 검정의 상세내용은 WO 2010/108127에 제공된다. 간략하게, 마우스를 25mg/kg MEHD7945A, 25 mg/kg 세툭시맙, 50 mg/kg 항-HER3 또는 25mg/kg 세툭시맙 플러스 50 mg/kg 항-HER3의 조합으로 1주 1회 4 사이클 동안 처리하였다. MAXF449, OVXF550 및 LX983을 30 mg/kg MEHD7945A, 30 mg/kg 세툭시맙, 60 mg/kg 항-HER3 또는 30 mg/kg 세툭시맙 플러스 60 mg/kg 항-HER3의 조합으로 1주 1회 4 사이클 동안 처리하였다. 초기 용량은 모든 처리의 경우에 2x 부하 용량이었다. 종양 성장 억제 (TGI)의 퍼센트는 대부분의 마우스가 비히클 군에 남아있는 연구 마지막 날에 기초하여 각각의 연구에 대해 계산하였다. 25% 미만의 TGI는 -로 표시하고, 25-50%의 TGI는 +로 표시하고, 51-75%의 TGI는 ++로 표시하고, 76% 이상의 TGI는 +++로 표시한다. NSCLC= 비-소세포 폐암, HNSSC= 두경부 편평 세포 암종, CRC= 결장직장암, n/a= 적용가능하지 않음. OVXF550, MAXF449 및 LXF983 모델은 인간 환자 유래된 이식 모델이다.

실시예 4

HNSCC 종양은 NRG1 의 이중모드 발현을 나타낸다

물질 및 방법

면역침전 및 이뮤노블롯팅: 종양 조직의 면역침전을 위해, 종양 함량을 최소 50% 종양 (대부분의 샘플은 >75% 종양 조직을 가짐)을 필요로 하는 H&E에 의해 검증하였다. 종양을 드라이 아이스 상에서 잘게 자른 후에, 포스파타제 및 프로테아제 억제제 (시그마(Sigma), P5726-5ML, 로슈(Roche), 13146100)가 보충된 냉각된 용해 완충제 (바이오월드(BioWorld), 22040045-2)에서 균질화시켰다. 25 ul 항-HER3 항체 (산타 크루즈(Santa Cruz), sc-285-G) 및 15 ul 디나비드(Dynabead) (인비트로젠(Invitrogen), 100.07D)를 면역침전당 1-2 mg 가용성 단백질에 첨가하였다. 이어서, 샘플을 4℃에서 밤새 회전시켰다. 이어서, 비드를 자석을 사용하여 분리하고, 용해 완충제 중에서 3회 세척하였다. 단백질을 95℃에서 5분 동안 비등시켜 샘플 완충제 (인비트로젠, NP0007 및 NP0009)에서 용리시켰다. 웨스턴 블롯팅을 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 샘플당 15 μl의 용리된 단백질을 부하하고, pHER3 (Y1289; #4791) 또는 범용 p-Tyr (클론(Clone) PY20, EMD)을 사용하여 면역검출을 수행하였다.

조직 시편: 총 755개의 종양 시편이 이 연구에 사용되었다: 127개 HNSCC (모든 병기, 원발성 및 재발성), 117개 수술에 의해 절제된 NSCLC (병기 I-IV), 치료받지 않은 전이성 질환을 갖는 환자 (병기 III-IV)로부터의 102개 NSCLC, 1차 표준-관리에 계속 실패하였으나 궁극적으로 2L 요법을 받은 환자 (병기 III-IV)로부터의 82개 NSCLC, 29개 전이성 백금 불응성 난소암, 149개 요법-나이브 전이성 결장직장암, 44개 원발성 및 전이성 흑색종, 및 3중-음성 유방암을 갖는 환자 (병기 I-IV)로부터의 29개 샘플. 20개의 새로 동결된 HNSCC의 개별 코호트를 사용하여 IP-웨스턴에 의한 포스포르-HER3 수준을 NRG1 전사체와 상관시켰다. 또한, 재발성 HNSCC를 갖는 28명 환자의 코호트로부터의 매치된 샘플의 개별 연속물 (초기 진단으로부터 및 1차 재발의 시점에서의 생검)을 수득하였다. (이들 2개의 마지막 코호트는 도 5에 포함되지 않았다) 이러한 환자 및 그의 종양의 이용가능한 병리학적 및 인구통계학적 변수를 요약한 표가 도 10 및 14에 제시된다. 모든 샘플은 IRB 승인 및 사전 동의를 받고 수득하였다.

핵산에 대한 조직 처리: RNA 추출 조직 절편을 300 μl RLT 완충제 (퀴아젠)에 침지시키고, 젠틀맥스 옥토 디소시에이터(gentleMACS Octo Dissociator) (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))를 이용하여 균질화시켰다. 이어서, 샘플을 제조업체의 지침에 따라 DNA 정제용 (DNAeasy, 퀴아젠) 및 RNA 정제용 (트리졸(TriZol), 인비트로젠)으로 반씩 나누었다.

플루이다임(Fluidigm) 발현 분석: 유전자 발현 분석을 바이오마크(BioMark) 96 x 96 유전자 발현 플랫폼 (플루이다임)을 이용하여 세포주 및 포르말린-고정된 파라핀 포매 종양 샘플 상에서 수행하였다. 종양에 대해, 2 μl의 전체 RNA를 cDNA로 역전사시키고, 슈퍼스크립트(Superscript) III/플래티넘 택(Platinum Taq) (인비트로젠) 및 예비-증폭 반응 믹스 (인비트로젠)를 사용하여 단일 반응에서 예비-증폭시켰다. 예비-증폭 반응은 0.05x 본래 택맨 검정 농도의 최종 희석 (어플라이드 바이오시스템즈)으로 수행하였다. 열순환 조건은 다음과 같다: 15분 동안 50℃의 1 사이클, 2분 동안 70℃의 1 사이클, 이어서 15초 동안 95℃ 및 4분 동안 60℃의 14 사이클.

예비-증폭된 cDNA를 1.94배로 희석한 후에, 제조업체의 지침에 따라 바이오마크 BMK-M-96.96 플랫폼 (플루이다임) 상에서 택맨 유니버설 PCR 마스터믹스(Taqman Universal PCR MasterMix) (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 증폭시켰다. 모든 샘플을 삼중으로 검정하였다. 다중 세포주, 새로운 동결 조직 샘플, 및 FFPE 조직 샘플에 걸친 그의 발현 안정성에 대해 이전에 평가된 2개의 맞춤-설계된 참조 유전자, AL-1377271 및 VPS-33B를 발현 패널에 포함시켰다. 2개의 참조 유전자에 대한 Ct 값의 평균을 각각의 샘플에 대해 계산하였고, NRG1 및 HER3의 발현 수준을 다음과 같이 델타 Ct (dCt) 방법을 이용하여 결정하였다: 평균 Ct (표적 유전자) - 평균 Ct (참조 유전자).

AL137727 (NM_144568 (서열 10); NM_001100814 (서열 11) (각각의 서열은 AL137727의 스플라이스 변이체를 나타냄))에 대한 프라이머/프로브 서열은 다음과 같다:

VPS-33B (NM_018668 9(서열 12))에 대한 프라이머/프로브 서열은 다음과 같다:

NRG1 발현의 분포의 분석 및 컷-오프 결정: HNSCC에서 log₁₀ (NRG1)의 이중모드 분포는 2개의 정규 분포의 혼합물의 핏팅을 자극하며, 여기서 이 중 하나는 과다발현의 결여에 상응하고 다른 하나는 과다발현에 상응한다. x_i는 i번째 샘플 (i = 1,...,n)에 대한 log₁₀ NRG1 발현을 나타낸다. 혼합물 모델에 대한 가능성은 다음과 같다:

여기서,

는 k번째 성분의 정규 밀도 함수이고, (

,

)는 상응하는 평균 및 분산 파라미터를 나타낸다. 모델 파라미터의 최대 가능성 추정치는 EM 알고리즘 (16)을 통해 수득하였다. 간략하게, E-단계는 i번째 샘플이 혼합물의 k번째 성분에 속할 조건부 확률을 컴퓨터로 계산하여 현재 파라미터 추정치를 제공한다. M-단계는 혼합 비율, 평균 및 분산을 컴퓨터로 계산하여 현재 확률을 제공한다. 이어서, 이 프로세스를 수렴을 위해 반복한다. 성분 멤버쉽의 사후 확률을 각각에 샘플에 대해 컴퓨터로 계산하고, 컷오프를 2개의 성분에 대한 사후 확률이 동일한 값에서 선택하였다. 모델 핏팅은 R 패키지 믹스툴을 이용하여 수행하였다 (17).

이중 색 색원체성 RNA-ISH: 이중 색 RNA 계내 혼성화를 어드밴스드 셀 디아그노스틱스(Advanced Cell Diagnostics) (캘리포니아주, 프레몬트)에 의해 수행하였다. NRG1 프로브 세트는 전사체 NM_013964의 nt 1082-3001을 포함하는 31개의 올리고 쌍 (총 62개)을 갖는다. ERBB3 프로브 세트는 본질적으로 모든 전사체 변이체를 함께 포함하는 2개의 프로브 세트의 풀이다: NM_001982의 nt 1962-2945를 포함하는 20개 올리고 쌍 (총 40개). NM_001005915의 nt 108-899를 포함하는 14개의 올리고 쌍 (총 28개). 시클로필린 B (PPIB; 양성) 및 박테리아 유전자 디히드로디피콜리네이트 리덕타제 (DapB; 음성)에 대해 설계된 프로브를 대조군으로 사용하였다. 영상을 40x 배율 및 8 비트 카메라를 이용하여 나노주머(Nanozoomer) 소프트웨어를 실행하는 하마마츠 나노주머 디지털 슬라이드(Hamamatsu Nanozoomer Digital Slide) 스캐너에 의해 스캐닝하였다 (15, 18). MatLab (매스웍스(MathWorks), 매사추세츠주 나티크) 스코어링 알고리즘은 하기 단계로 이루어진다: 최대 75% 종양 세포를 갖는 관심 영역을 각각의 구역에 대해 병리학자에 의해 수동으로 규정한 후에, 헤마톡실린 마스크를 생성하여 핵을 확인하고, 이어서 청색 마스크 (NRG1) 및 적색 마스크 (HER3)를 적용하였다. 개별 "세포"를 청색 또는 적색 점 카운트를 각각의 세포에 대해 표로 만들 때 세포를 명백하게 분리하게 의해 헤마톡실린 마스크에 의해 규정하였다.

스캐닝된 영상을 또한 RGB (적색, 녹색 및 청색) 스펙트럼을 이용하여, 데피니언스 현상제 (뮌헨, 아게(Munich, AG))를 사용하여 분석하였다. 동일한 관심 영역을 MATLAB 방법에서와 같이 분석에 사용하였다. 영역을 대략 300 um 높이 및 폭의 타일드 영역으로 세분하고, 전해상도에서 분석하였다. 색 강도 (적색, 녹색 및 청색 강도 값의 균형) 및 물체 크기를 둘 다 배경으로부터 세포 핵, NRG1 및 HER3을 구별하기 위한 기준으로 이용하였다. 스펙트럼 상에서 분리하기 불가능하게 매우 중첩된 핵은 편견을 방지하기 위해 분석으로부터 제외하였다.

두 방법을 이용하여 각각 하기 군의 세포를 유래시켰다: HER3+/NRG+, HER3+/NRG-, HER3-/NRG+, 및 HER3-/NRG-. 자가분비 신호는 (HER3+/NRG+) / ((HER3+/NRG+) + (HER3+/NRG-) + (HER3-/NRG+))로 정의하였다.

HNSCC는 조사된 모든 다른 종양 유형에 비해 가장 높은 중간 수준의 NRG1을 발현하였다 (도 5a; 도 6). 또한, 이러한 HNSCC의 유의한 하위세트 (대략 40%)는 임의의 다른 종양 유형보다 높은 수준의 NRG1을 발현하였다 (만-휘트니(Mann-Whitney) 검정 p < 0.0001; 도 6). 또한, NRG1 발현은 log₁₀ 스케일 상에 플롯팅된 경우에 HNSCC에서 이중모드 분포를 나타내었다 (도 7, 도 6). 2-성분 가우시안 혼합물 분포를 이용하여 NRG1의 과다발현 및 NRG1의 과다발현의 결여 사이의 변곡점을 추정하였으며, 이는 선형 스케일 상의 대략 1.50에 상응하는 로그 스케일 상의 0.3689인 것으로 밝혀졌다. 이러한 분포에 기초하여 과다발현 대 과다발현의 결여를 규정하기 위한 감수성 및 특이성은 각각 90.8% 및 93.4%였다.

높은 NRG1 과다발현이 활성화된 HER3을 갖는 HNSCC와 연관되는지 결정하기 위해, NRG1에 대한 qRT-PCR 및 전체 HER3의 면역침전을 수행한 후에 요법 나이브 SCHNN을 갖는 환자로부터의 새로 동결된 종양 시편에서 pHER3 및 p-티로신에 대한 웨스턴 블롯을 수행하였다 (도 8; 도 9; 도 10). 높은 NRG1 발현 (이중모드 분포 내의 저점 또는 그 근처)을 갖는 모든 종양은 IP-웨스턴에 의해 pHER3에 대해 양성이었으며; 반대로 NRG1의 가장 낮은 발현을 갖는 5/7개 종양은 pHER3에 대해 음성이었다 (양측 신호 검정, P = 0.0386).

높은 NRG1 발현을 보이는 종양을 갖는 HNSCC 환자 집단을 추가로 특성화하기 위해, 종양 샘플을 수술에 의해 절제가능한 HNSCC를 갖는 환자로부터 수득하였을 뿐만 아니라 재발성 질환을 갖는 환자로부터 종양 샘플을 수득하였다. NRG1 발현은 원발성 절제가능한 질환에 비해 재발성 환경에서 더 높았다 (도 11). 이러한 발견은 기점의 부위, HPV 상태 또는 임의의 다른 이용가능한 임상병리학적 정보의 차이에 의해 설명될 수 없었다.

NRG1 발현이 원발성 대 재발성 질환에서 상이할 수 있다는 발견은 NRG1 발현이 이전 요법의 결과로서, 또는 높은 NRG1 발현이 HNSCC를 갖는 환자에서 증가된 재발 가능성과 연관된 예후 인자이기 때문에 증가한다는 것을 시사한다. 이러한 의문을 추가로 연구하기 위해, 일련의 환자 매치된 원발성 종양 및 재발 시편을 수득하고, 양쪽 코호트에서의 NRG1 발현을 qRT-PCR에 의해 비교하였다. 도 12; 도 13; 도 14에 나타난 바와 같이, NRG1 발현은 매치된 환자 시편에서의 원발성 질환에 비해 재발성 환경에서 유의하게 더 높다 (윌콕슨(Wilcoxon) 부호 순위 검정; P = 0.002).

최근 보고로부터의 전임상 데이터는 자가분비 생물학을 갖는 종양을 확인하는 것이 HER 패밀리 수용체를 표적화하는 작용제에 대한 반응을 예측하는데 중요할 수 있음을 시사하였다 (11). HNSCC에서 HER3 및 NRG1 발현의 자가분비 대 주변분비 발현의 정도를 결정하기 위해, 임상적으로 관련된 FFPE에서 HER3 및 NRG1 전사체 위치 및 존재비를 평가하기 위해 설계된 이중-색 색원체성 RNA 계내 혼성화 검정을 이용하였다.

양성 편평 상피의 정성적 조사는 NRG1의 발현이 기저층으로 제한되는 반면, HER3 발현은 오직 정상 중층 편평 상피에서 집중적으로 보인다는 것을 시사하였다. 대조적으로, 돌기 층에서, 오직 HER3 발현이 관찰되었다. 유사한 발현 패턴이 거짓중층 상기도 상피의 상부 층에서 나타났으며, 여기서 NRG1 발현은 기저층으로 제한되고, HER3 발현은 상피의 하부 층으로 한정되었다. NRG1의 공급원이 부재한 양성 조직에서의 단일 세포 수준에서, 대부분의 세포 및 조직은 상대적으로 일관된 수준의 HER3을 발현하는 반면, NRG1의 존재 하에, 세포가 NRG1의 공급원으로부터 멀수록 증가하는 HER3 발현의 구배가 존재한다. 보다 일반적으로, 개별 세포의 수준에서 HER3 및 NRG1 둘 다의 발현 사이에서 뿐만 아니라 이들 2가지 전사체 중 어느 하나를 발현하는 세포의 공간적 배향에서 역전 관계가 존재한다.

일부 잘-분화된 두경부 편평 세포 암종에서 NRG1 및 HER3의 주변분비 발현의 명확한 증거가 발견되었으며, 이는 정상 조직에서 보이는 발현 패턴을 요약한 것이다. 본원에 사용된 자가분비는 동일한 세포에서의 NRG1 및 HER3의 공동-발현으로 정의되는 반면, 주변분비 발현은 인접한 세포에서의 NRG1 또는 HER3의 상호 배타적 발현으로 정의된다.

보다 잘-분화되지 않은 다른 편평 세포 암종에서, NRG1의 기저 세포 특이적 발현 및 HER3의 돌기 세포 특이적 발현 사이의 관계가 상실되었으며, 이는 자가분비 및 주변분비 발현 패턴 둘 다에 대한 증거로, 보다 무질서한 구조와 일치한다. 최종적으로, 대부분의 HER3/NRG1 발현 세포가 자가분비성인 것으로 보이는 경우가 확인되었다.

높은 NRG1 발현이 자가분비 또는 주변분비 발현과 특이적으로 연관되는지 결정하고, 1차 치료 나이브 시편 및 그의 대응하는 치료후 섹션 사이에서 관찰되는 NRG1 발현의 증가가 종양 유래되는 것인지 확실하게 하기 위해, qRTPCR을 도 12에 나타낸 동일한 샘플에서의 NRG1 및 HER3에 대한 RNA-ISH와 비교하였다. 전반적으로, NRG1의 경우에 qRTPCR 및 RNA-ISH 사이에 강하고 유의한 양성 스피어만 상관관계가 존재하였으며 (r = 0.4; p = 0.002), HER3의 경우에는 qRTPCR 및 RNA-ISH 사이에 보다 낮고 유의한 것에 가까운 양성 상관관계가 존재하였다 (ρ = 0.2; p = 0.051) (도 15A & B).

3가지 상이한 정량적 영상화 알고리즘을 이용하여 자가분비 세포를 확인하였다 (상기 본 실시예에 기재된 바와 같음). 각각의 방법은 각각의 종양에 대한 자가분비 성분의 상태 비율은 상이하지만, 이 방법들은 MatLab 및 각각의 데피니언스-기반 접근법 사이에서 유사하게 상이한 종양의 순위를 매긴다 (스피어만 r: 모든 쌍형성-방식 조합의 경우에 ~0.75 - 0.96, 모든 경우에서 p<0.0001). 이는 알고리즘이 비록 잠재적으로 상이한 감수성을 가질지라도 유사한 방식으로 자가분비 및 주변분비 표현형을 구별한다는 것을 시사한다. NRG1 발현과 달리, 요법 나이브 및 화학요법후 시편 사이에서는 자가분비 발현의 상대적 기여에 차이가 없었다 (도 13; 도 14). 또한, 화학요법 전에 또는 후에 종양 내에서의 qRTPCR 또는 RNA-ISH에 의한 NRG1 발현의 수준 및 NRG1 및 HER3의 자가분비 발현을 갖는 세포의 비율 사이에는 연관성이 거의 없었다 (스피어만 r: 각각 0.26 (p = 0.22), 0.03 (p=0.91)).

이러한 데이터는 HNSCC의 실질적인 하위세트가 조사된 모든 다른 종양 유형에 비해 유의하게 보다 높은 수준의 NRG1을 발현한다는 것을 보여준다. NRG1 발현은 HNSCC에서 특유의 이중모드 분포를 가지며, HNSCC 종양의 대략 40%가 모든 다른 종양 유형보다 보다 높은 수준의 NRG1을 발현한다. 이러한 발현 패턴은 유방암에서 HER2 발현을 연상시키며, 여기서 HER2 발현 수준은 다른 유형의 유방암에 비해 HER2 양성 유방암에서 적어도 10배 더 높다. 그러나, 유방암 및 위암에서의 HER2와 달리, NRG1 과다발현이 유전자 증폭의 기능인 것으로 보이지는 않는다 (20, 21).

추가로, 높은 NRG1 발현은 pHER3과 연관되며, 이는 아마도 이들 특정한 HNSCC 종양에서의 활성 HER3 신호전달을 나타낼 것이다. pHER3은 NRG1이 HNSCC 환자에서 이중모드 분포의 저점에서 또는 그 근처에서 발현되는 모든 경우에 검출가능하였다. 일부 경우에 pHER3은 분포의 저점보다 어느 정도 아래에 있는 NRG1 수준을 갖는 샘플에서 검출되었다. 이중모드 분포의 저점은 다중 독립적 데이터 세트에서 유사하였으며, 이는 잠재적으로 HNSCC 환자의 생물학적으로 특징적인 집단을 반영하고, HER3-지시된 치료적 개입으로부터 이익을 얻을 수 있는 HNSCC를 갖는 환자를 확인하기 위한 커-오프를 제공할 것이다.

중요하게는, 최저 NRG1 발현 종양 중 2개가 또한 검출가능한 pHER3을 가졌다. HER3의 NRG-비의존성 인산화는 EGFR 또는 다른 RTK, 예컨대 c-Met와의 이종이량체화를 통해 일어날 수 있는 것으로 밝혀졌다 (1). HER3의 NRG-비의존성 활성화를 나타내는 종양을 갖는 환자는 HER3 지시된 요법으로부터 이익을 얻을 가능성이 없으며, 따라서 예측 마커로서 NRG1을 사용하는 것이 이러한 환자 집단을 효과적으로 배제시킬 것임에 주목하는 것이 중요하다 (12).

또한, NRG1 발현은 매치된 및 매치되지 않은 원발성 종양에 비해 재발성 종양 시편에서 더 높다. 이러한 발견은 상기 데이터와 함께 NRG1 발현이 HER3 억제제에 대한 반응 및 HNSCC의 재발에 대한 예후를 둘 다 예측할 수 있음을 시사한다.

따라서, NRG1 발현 수준은 HNSCC 환자의 통계학적으로 및 생물학적으로 구별가능한 하위세트를 정의한다. NRG1의 고수준 발현은 HNSCC에서 HER3의 구성적 활성화와 연관되며, 이에 따라 이러한 중요한 종양유전자를 억제하는 약물에 대한 작용가능한 바이오마커를 규정한다.

실시예 5

뉴레귤린 1 발현은 MEHD7945A 의 상 I 연구에서 등록된 환자에서의 치료에 대한 반응을 예측한다

임상 데이터의 개요

MEHD7945A를 처음에 개방-표지 다중중심 상 I 연구 (DAF4873g)에서 연구하여, 불응성 또는 재발성 상피 종양을 갖는 환자에서 2주마다 (q2w) IV 주입에 의해 투여되는 경우에 그의 안정성 및 허용성, 약동학, 약역학 및/또는 항-종양 활성을 평가하였다. 연구는 용량-제한 독성 (DLT)을 평가하기 위한 28-일 윈도우를 갖는 3 + 3 용량-상승 코호트 뿐만 아니라 제안된 상 II 용량에서의 다중 확장 코호트의 등록으로 이루어진다.

이 연구에 등록한 환자가 나타내는 암 유형은 HNSCC, 결장직장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 난소암과 간/담도암을 포함하였다.

1 내지 30 mg/kg 범위의 용량 수준을 평가하였다. 약물 클리어런스 용량 > 10 mg/kg에서 선형성에 접근하면서 용량-의존성 방식으로 감소하였으며, 이는 MEHD7945A가 단일특이적 항-EGFR 항체에서 보여진 것과 유사한 표적-매개 클리어런스에 대한 대상임을 시사한다. q2w 스케줄 상의 1100 mg의 용량은 환자의 > 95%에서 이종이식편 모델에서 결정된 매주 효과적인 노출을 제공할 것으로 예상된다.

14 mg/kg q2w로 MEHD7945A로 처리된 HNSCC를 갖는 2명의 환자는 10.7 및 3.9주의 지속 기간을 갖는 진행 중인 부분 반응을 갖는다. 66명의 환자 중 13명이 그의 최고 반응으로서 안정한 질환을 경험하였으며, 이 안정한 질환은 이전에 FOLFIRI + 세툭시맙에 대해 불응성이었던 KRAS 야생형 mCRC를 갖는 1명의 환자를 포함한 3명의 환자에서 ≥ 4개월 동안 유지되었다.

종양-연관 약역학적 효과가 10 내지 30 mg/kg의 용량에서 총 15명의 환자에서 관찰되었으며, 이들 중 11명은 이전에 EGFR-표적화 요법을 받았다. 종양 S6, PRAS40 및 ERK의 감소된 인산화가 평가가능한 조직 샘플을 갖는 17명의 환자 중 6명으로부터의 일련의 생검에서 관찰되었으며, 대사 반응 (양전자 방출 단층촬영 [PET] 스캔에 의한 플루오로데옥시글루코스 [FDG] 흡수의 ≥ 20% 감소)이 기준선에서 PET-아비드 질환을 갖는 56명의 환자 중 10명에서 관찰되었다. 이러한 변화가 관찰되는 종양 유형은 CRC, NSCLC, HNSCC, 및 난소, 유방 및 항문 암을 포함한다.

환자로부터의 샘플을 NRG1 발현에 대해 분석하였다.

상기 언급된 바와 같이, 이러한 상 I 연구에서 HNSCC를 갖는 2명의 환자는 MEHD7945A 이중특이적 항체로의 처리에 대해 부분 반응을 나타내었다. 환자 1은 2007년에 후두의 HNSCC로 진단되었고, 사전 요법은 화학방사선요법, 3x 세툭시맙 ± 화학요법 (SD의 최고 반응과 함께)을 포함한다.

환자 1은 MEHD7945A (14 mg/kg IV)로의 처리 후에 확인된 부분 반응을 가졌다. 부분 반응은 CT 분석에 기초하고 고형 종양에서의 반응 평가 기준 (RECIST) 가이드라인에 의해 제공된 적용가능한 기준을 이용하여 종양 크기의 감소에 의해 나타난다. 환자 1은 또한 임상적 개선 (경감된 통증, 개선된 발성)을 나타내었다. 환자 2는 1994년에 혀의 HNSCC로 진단되었으며, 최근에 폐로 전이되었다. 사전 요법은 다중 수술 및 화학방사선 요법을 포함한다. 환자 2는 MEHD7945A (14 mg/kg IV q2w)로의 처리 후에 CT 분석에 기초하여 종양 크기의 감소에 의해 나타난 확인된 부분 반응을 가졌으며, 임상적 개선 (삼키는 능력을 다시 얻음)을 나타내었다.

이러한 2명의 환자는 연구군 중에서 최고 수준의 NRG1을 나타내는 암을 가졌다. (도 16). 또한, 재발성 HNSCC에서의 NRG1 발현 수준은 원발성 HNSCC에서의 NRG1 발현 수준보다 높은 것으로 결정되었다. 도 17은 이러한 검정의 결과를 보여주고, 상 1 시험으로부터 환자 1의 NRG1 발현 수준을 비교한다.

참고문헌

SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. et al. <120> DIAGNOSIS AND TREATMENTS RELATING TO HER3 INHIBITORS <130> P4884R1WO <150> 61/616241 <151> 2012-03-27 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable Region <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Gly Asp 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Glu Ile Ser Ala Ala Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Arg Val Ser Phe Glu Ala Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain Variable Region <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Ala Thr Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Pro Glu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H1 <400> 3 Leu Ser Gly Asp Trp Ile His 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H2 <400> 4 Val Gly Glu Ile Ser Ala Ala Gly Gly Tyr Thr Asp 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-H3 <400> 5 Ala Arg Glu Ser Arg Val Ser Phe Glu Ala Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L1 <400> 6 Asn Ile Ala Thr Asp Val Ala 1 5 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L2 <400> 7 Ser Ala Ser Phe 1 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR-L3 <400> 8 Ser Glu Pro Glu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 9 <211> 640 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ser Glu Arg Lys Glu Gly Arg Gly Lys Gly Lys Gly Lys Lys Lys 1 5 10 15 Glu Arg Gly Ser Gly Lys Lys Pro Glu Ser Ala Ala Gly Ser Gln Ser 20 25 30 Pro Ala Leu Pro Pro Arg Leu Lys Glu Met Lys Ser Gln Glu Ser Ala 35 40 45 Ala Gly Ser Lys Leu Val Leu Arg Cys Glu Thr Ser Ser Glu Tyr Ser 50 55 60 Ser Leu Arg Phe Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Asn Arg Lys 65 70 75 80 Asn Lys Pro Gln Asn Ile Lys Ile Gln Lys Lys Pro Gly Lys Ser Glu 85 90 95 Leu Arg Ile Asn Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met Cys 100 105 110 Lys Val Ile Ser Lys Leu Gly Asn Asp Ser Ala Ser Ala Asn Ile Thr 115 120 125 Ile Val Glu Ser Asn Glu Ile Ile Thr Gly Met Pro Ala Ser Thr Glu 130 135 140 Gly Ala Tyr Val Ser Ser Glu Ser Pro Ile Arg Ile Ser Val Ser Thr 145 150 155 160 Glu Gly Ala Asn Thr Ser Ser Ser Thr Ser Thr Ser Thr Thr Gly Thr 165 170 175 Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn 180 185 190 Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr 195 200 205 Leu Cys Lys Cys Gln Pro Gly Phe Thr Gly Ala Arg Cys Thr Glu Asn 210 215 220 Val Pro Met Lys Val Gln Asn Gln Glu Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln 225 230 235 240 Lys Arg Val Leu Thr Ile Thr Gly Ile Cys Ile Ala Leu Leu Val Val 245 250 255 Gly Ile Met Cys Val Val Ala Tyr Cys Lys Thr Lys Lys Gln Arg Lys 260 265 270 Lys Leu His Asp Arg Leu Arg Gln Ser Leu Arg Ser Glu Arg Asn Asn 275 280 285 Thr Met Asn Ile Ala Asn Gly Pro His His Pro Asn Pro Pro Pro Glu 290 295 300 Asn Val Gln Leu Val Asn Gln Tyr Val Ser Lys Asn Val Ile Ser Ser 305 310 315 320 Glu His Ile Val Glu Arg Glu Ala Glu Thr Ser Phe Ser Thr Ser His 325 330 335 Tyr Thr Ser Thr Ala His His Ser Thr Thr Val Thr Gln Thr Pro Ser 340 345 350 His Ser Trp Ser Asn Gly His Thr Glu Ser Ile Leu Ser Glu Ser His 355 360 365 Ser Val Ile Val Met Ser Ser Val Glu Asn Ser Arg His Ser Ser Pro 370 375 380 Thr Gly Gly Pro Arg Gly Arg Leu Asn Gly Thr Gly Gly Pro Arg Glu 385 390 395 400 Cys Asn Ser Phe Leu Arg His Ala Arg Glu Thr Pro Asp Ser Tyr Arg 405 410 415 Asp Ser Pro His Ser Glu Arg Tyr Val Ser Ala Met Thr Thr Pro Ala 420 425 430 Arg Met Ser Pro Val Asp Phe His Thr Pro Ser Ser Pro Lys Ser Pro 435 440 445 Pro Ser Glu Met Ser Pro Pro Val Ser Ser Met Thr Val Ser Met Pro 450 455 460 Ser Met Ala Val Ser Pro Phe Met Glu Glu Glu Arg Pro Leu Leu Leu 465 470 475 480 Val Thr Pro Pro Arg Leu Arg Glu Lys Lys Phe Asp His His Pro Gln 485 490 495 Gln Phe Ser Ser Phe His His Asn Pro Ala His Asp Ser Asn Ser Leu 500 505 510 Pro Ala Ser Pro Leu Arg Ile Val Glu Asp Glu Glu Tyr Glu Thr Thr 515 520 525 Gln Glu Tyr Glu Pro Ala Gln Glu Pro Val Lys Lys Leu Ala Asn Ser 530 535 540 Arg Arg Ala Lys Arg Thr Lys Pro Asn Gly His Ile Ala Asn Arg Leu 545 550 555 560 Glu Val Asp Ser Asn Thr Ser Ser Gln Ser Ser Asn Ser Glu Ser Glu 565 570 575 Thr Glu Asp Glu Arg Val Gly Glu Asp Thr Pro Phe Leu Gly Ile Gln 580 585 590 Asn Pro Leu Ala Ala Ser Leu Glu Ala Thr Pro Ala Phe Arg Leu Ala 595 600 605 Asp Ser Arg Thr Asn Pro Ala Gly Arg Phe Ser Thr Gln Glu Glu Ile 610 615 620 Gln Ala Arg Leu Ser Ser Val Ile Ala Asn Gln Asp Pro Ile Ala Val 625 630 635 640 <210> 10 <211> 1709 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cactggttgc ggagtgagct gggcgcgcgg cgcgcaggcg ccctggggac ccggtagcgg 60 cggtggcggt ggcggcggtg gcggtggctg cggcgacggc agaggcgaag ggagccggat 120 cgccgacctg agcgggaggc ggcggtggcg gccatggcgg cagatggaga gcgttccccg 180 ctgctgtctg agcccatcga cggtggcgcg ggcggcaacg gtttagtggg gcccggcggg 240 agtggggctg ggcccggggg aggcctgacc ccctccgcac caccgtacgg agccgcattt 300 cccccgtttc ccgaggggca tccagccgtg ttgcctgggg aggacccacc cccctattca 360 cccttaacta gcccggacag tgggagtgcc cctatgatca cctgccgagt ctgccaatct 420 ctcatcaacg tggaaggcaa gatgcatcag catgtagtca aatgtggtgt ctgcaatgaa 480 gccaccccaa tcaagaatgc acccccaggg aaaaaatatg ttcgatgccc ctgtaactgt 540 ctccttatct gcaaagtgac atcccaacgg attgcatgcc ctcggcccta ctgcaaaaga 600 atcatcaacc tggggcctgt gcatcccgga cctctgagtc cagaacccca acccatgggt 660 gtcagggtta tctgtggaca ttgcaagaat acttttctgt ggacagagtt cacagaccgc 720 actttggcac gttgtcctca ctgcaggaaa gtgtcatcta ttgggcgcag atacccacgt 780 aagagatgta tctgctgctt cttgcttggc ttgcttttgg cagtcactgc cactggcctt 840 gcctttggca catggaagca tgcacggcga tatggaggca tctatgcagc ctgggcattt 900 gtcatcctgt tggctgtgct gtgtttgggc cgggctcttt attgggcctg tatgaaggtc 960 agccaccctg tccagaactt ctcctgagcc tgatgaccca cagactgtgc ctggcccctc 1020 cctggtgggg acagtgacac tacgaaggga gctggggtag ttaaaggctc ccggggcttc 1080 tagaaggaag ccaagcagct gccttccttt tccctgggga gaggtaggaa ggaaccaggc 1140 cctcacttag gtttggaggg gcagataaga gcactgctga ccatctgctt tcctccaagg 1200 gttgctgtgt ctagggtgaa gtaggcaaaa cgttgccctt aaaactgggc cctgaagacg 1260 gttccagcct tgtccttcct gtgtgctccc tgagagccat tcctgtccct tacacattcc 1320 agggcagggt gggggtgggt agccctgggg gttcccctcc ctcttgtgca ccattaggac 1380 tttgctgctg ctattgcact tcaccagagg ttggctctgg cctcagtacc ctcagtctcc 1440 tctccccaca ttgtgtcctg tgggggtggg gtcagccgct gctctgtaca gaaccacagg 1500 aactgatgtg tatataacta tttaatgtgg gatatgttcc cctattcctg tatttccctt 1560 aattcctcct cccgaccttt tttacccccc cagttgcagt atttaactgg gctgggtagg 1620 gttgctcagt ctttggggga ggttagggac ttatcctgtg cttgtaaata aataaggtca 1680 tgactctacg cttaaaaaaa aaaaaaaaa 1709 <210> 11 <211> 1730 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cactggttgc ggagtgagct gggcgcgcgg cgcgcaggcg ccctggggac ccggtagcgg 60 cggtggcggt ggcggcggtg gcggtggctg cggcgacggc agaggcgaag ggagccggat 120 cgccgacctg agcgggaggc ggcggtggcg gccatggcgg cagatggaga gcgttccccg 180 ctgctgtctg agcccatcga cggtggcgcg ggcggcaacg gtttagtggg gcccggcggg 240 agtggggctg ggcccggggg aggcctgacc ccctccgcac caccgtacgg agccggtaaa 300 catgccccgc cccaggcatt tcccccgttt cccgaggggc atccagccgt gttgcctggg 360 gaggacccac ccccctattc acccttaact agcccggaca gtgggagtgc ccctatgatc 420 acctgccgag tctgccaatc tctcatcaac gtggaaggca agatgcatca gcatgtagtc 480 aaatgtggtg tctgcaatga agccacccca atcaagaatg cacccccagg gaaaaaatat 540 gttcgatgcc cctgtaactg tctccttatc tgcaaagtga catcccaacg gattgcatgc 600 cctcggccct actgcaaaag aatcatcaac ctggggcctg tgcatcccgg acctctgagt 660 ccagaacccc aacccatggg tgtcagggtt atctgtggac attgcaagaa tacttttctg 720 tggacagagt tcacagaccg cactttggca cgttgtcctc actgcaggaa agtgtcatct 780 attgggcgca gatacccacg taagagatgt atctgctgct tcttgcttgg cttgcttttg 840 gcagtcactg ccactggcct tgcctttggc acatggaagc atgcacggcg atatggaggc 900 atctatgcag cctgggcatt tgtcatcctg ttggctgtgc tgtgtttggg ccgggctctt 960 tattgggcct gtatgaaggt cagccaccct gtccagaact tctcctgagc ctgatgaccc 1020 acagactgtg cctggcccct ccctggtggg gacagtgaca ctacgaaggg agctggggta 1080 gttaaaggct cccggggctt ctagaaggaa gccaagcagc tgccttcctt ttccctgggg 1140 agaggtagga aggaaccagg ccctcactta ggtttggagg ggcagataag agcactgctg 1200 accatctgct ttcctccaag ggttgctgtg tctagggtga agtaggcaaa acgttgccct 1260 taaaactggg ccctgaagac ggttccagcc ttgtccttcc tgtgtgctcc ctgagagcca 1320 ttcctgtccc ttacacattc cagggcaggg tgggggtggg tagccctggg ggttcccctc 1380 cctcttgtgc accattagga ctttgctgct gctattgcac ttcaccagag gttggctctg 1440 gcctcagtac cctcagtctc ctctccccac attgtgtcct gtgggggtgg ggtcagccgc 1500 tgctctgtac agaaccacag gaactgatgt gtatataact atttaatgtg ggatatgttc 1560 ccctattcct gtatttccct taattcctcc tcccgacctt ttttaccccc ccagttgcag 1620 tatttaactg ggctgggtag ggttgctcag tctttggggg aggttaggga cttatcctgt 1680 gcttgtaaat aaataaggtc atgactctac gcttaaaaaa aaaaaaaaaa 1730 <210> 12 <211> 2639 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 gagatctagg aagtcgcttc tttttctggt agaaggcggg gttctcctcg tacgctgcgg 60 agtctctgcg gggtgtagac cggaatcctg ctgacgggca gagtggatca gggagggagg 120 gtcgagacac ggtggctgca ggtctgagac aaggctgctc cgaggtagta gctctcttgc 180 ctggaggtgg ccattcattc ctggagtgct gctgaggagc gagggcccat ctggggtctc 240 tggaagtcgg tgcccaggcc tgaaggatag ccccccttgc gcttccctgg gctgcggccg 300 gccttctcag aacgaagggc gtccttccac cccgcggcgc aggtgaccgc tgccatggct 360 tttccccatc ggccggacgc ccctgagctg cctgacttct ccatgctgaa gaggctggct 420 cgagaccagc tcatctatct gctggagcag cttcctggaa aaaaggattt attcattgag 480 gcagatctca tgagcccttt ggatcgaatt gccaatgtct ccatcctgaa gcaacacgaa 540 gtagacaagc tatacaaggt ggagaacaag ccagccctca gctccaatga acaattgtgc 600 ttcttggtca gaccccgcat caagaatatg cgatacattg ccagtcttgt caatgctgac 660 aaattggctg gccgaactcg caaatacaaa gtgatcttca gccctcaaaa gttctatgcg 720 tgtgagatgg tgcttgagga agagggaatc tatggagatg tgagctgtga tgaatgggcc 780 ttctctttgc tgcctcttga tgtggatctg ctgagcatgg aactaccaga atttttcagg 840 gattactttc tggaaggaga tcagcgttgg atcaacactg tagctcaggc cttacacctt 900 ctcagcactc tctatggacc ctttccaaac tgctatggaa ttggcaggtg cgccaagatg 960 gcatatgaat tgtggaggaa cctggaggag gaggaggatg gcgaaaccaa gggccgaagg 1020 ccagagattg gacatatctt tctcttggac agagatgtgg actttgtgac agcactttgc 1080 tcccaagtgg tttatgaggg cctagtagat gacaccttcc gcatcaagtg tgggagtgtc 1140 gactttggcc cagaagtcac atcctctgac aagagcctga aggtgctact caatgccgag 1200 gacaaggtgt ttaatgagat tcggaacgag cacttctcca atgtctttgg cttcttgagc 1260 cagaaggccc ggaacttgca ggcccagtat gatcgccgga gaggcatgga cattaagcag 1320 atgaagaatt tcgtgtccca ggagctcaag ggcctgaaac aggagcaccg cctgctgagt 1380 ctccatattg gggcctgtga atccatcatg aagaagaaaa ccaagcagga tttccaggag 1440 ctaatcaaga ctgagcatgc actgctagag gggttcaaca tccgggagag caccagctac 1500 attgaggaac acatagaccg gcaggtgtcg cctatagaaa gcctgcgcct catgtgcctt 1560 ttgtccatca ctgagaatgg tttgatcccc aaggattacc gatctctgaa aacacagtat 1620 ctgcagagct atggccctga gcacctgcta accttctcca atctgcgaag agctgggctc 1680 ctaacggagc aggcccccgg ggacaccctc acagccgtgg agagtaaagt gagcaagctg 1740 gtgaccgaca aggctgcagg aaagattact gatgccttca gttctctggc caagaggagc 1800 aattttcgtg ccatcagcaa aaagctgaat ttgatcccac gtgtggacgg cgagtatgat 1860 ctgaaagtgc cccgagacat ggcttacgtc ttcggtggtg cttatgtgcc cctgagctgc 1920 cgaatcattg agcaggtgct agagcggcga agctggcagg gccttgatga ggtggtacgg 1980 ctgctcaact gcagtgactt tgcattcaca gatatgacta aggaagacaa ggcttccagt 2040 gagtccctgc gcctcatctt ggtggtgttc ttgggtggtt gtacattctc tgagatctca 2100 gccctccggt tcctgggcag agagaaaggc tacaggttca ttttcctgac gacagcagtc 2160 acaaacagcg ctcgccttat ggaggccatg agtgaggtga aagcctgatg tttttcccgg 2220 ccagtgttga catcttccct gaacacattc ctcagtgaga tgcaggcatc tggcacccag 2280 ctgctataac caagtgtcca ccaactacct gctaagagcc gggagcatgg aacgtgttgg 2340 gatttagaga acattatctg agaaaagagt tcacttcctg ctcccaggat atttctcttt 2400 tctgtttatg aagtacaacc catgctgcta agatgcgagc aggaagaggc atcctttgct 2460 aaatcctgtt tgaatgtcat tgtaaataaa gcctctgctc tcagatgtaa tacgttggtc 2520 gttctggaca cgcacttcca tctttattag tgaaagccca ttggagcttg ctacaggggc 2580 ttcctgtgct tcttggcctg gactttgtag tggctccagg cctggtctgg ttcttccct 2639 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 13 ggcctcagta ccctcagtct 20 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 agagcagcgg ctgacc 16 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 15 ccccacagga cacaat 16 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 16 ggctcgagac cagctcatct a 21 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 17 gagatctgcc tcaatgaata aatcc 25 <210> 18 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 18 tggagcagct tcct 14

Claims (48)

1. 환자에게 치료 유효량의 HER3 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 HER3 억제제의 투여 전에 NRG1을 과다발현하는 암으로 진단받은 것인, 환자에서 한 유형의 암을 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 환자가 암 유형에서의 NRG1 발현에 대한 중간 수준보다 높은 수준에서 NRG1을 발현하는 암으로 진단받은 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 환자가 암 유형에서의 NRG1 발현에 대해 60번째 백분위수 이상인 수준에서 NRG1을 발현하는 암으로 진단받은 것인 방법.
4. 제2항에 있어서, 환자가 암 유형에서의 NRG1 발현에 대해 75번째 백분위수 이상인 수준에서 NRG1을 발현하는 암으로 진단받은 것인 방법.
5. 제2항에 있어서, 환자가 암 유형에서의 NRG1 발현에 대해 80번째 백분위수 이상인 수준에서 NRG1을 발현하는 암으로 진단받은 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 암의 유형이 과다발현 모드 및 과다발현 모드의 결여로 이루어진 이중모드 발현 프로파일을 나타내는 것인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 유형이 자가분비 뉴레귤린-유도된 신호전달을 나타내는 것인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 유형이 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, HER3 억제제가 HER3에 대한 NRG1 결합을 억제하는 것인 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, HER3 억제제가 항체인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, HER3 억제제가 이중특이적 HER3/EGFR 억제제인 방법.
12. 제11항에 있어서, 이중특이적 HER3/EGFR 억제제가 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체인 방법.
13. 제12항에 있어서, HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인이
    아미노산 서열 LSGDWIH (서열 3)를 포함하는 HVR-H1,
    아미노산 서열 VGEISAAGGYTD (서열 4)를 포함하는 HVR-H2,
    아미노산 서열 ARESRVSFEAAMDY (서열 5)를 포함하는 HVR-H3,
    및
    아미노산 서열 NIATDVA (서열 6)를 포함하는 HVR-L1,
    아미노산 서열 SASF (서열 7)를 포함하는 HVR-L2, 및
    아미노산 서열 SEPEPYT (서열 8)를 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 것인 방법.
14. 제13항에 있어서, HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인이 서열 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 방법.
15. 제12항에 있어서, HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인이 서열 1의 중쇄 가변 도메인 및 서열 2의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 진단이 환자의 암으로부터의 샘플에서 NRG1의 발현 수준을 결정하는 것 및 샘플에서의 NRG1의 발현 수준을 샘플에서의 AL-137727 및 VPS33B 중 하나 또는 둘 다의 발현 수준에 대해 정량화하는 것을 포함하는 것인 방법.
17. 환자에게 치료 유효량의 이중특이적 HER3/EGFR 억제제를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 환자는 이중특이적 HER3/EGFR 억제제의 투여 전에 NRG1을 과다발현하는 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)으로 진단받은 것인, 환자에서 HNSCC를 치료하는 방법.
18. 제17항에 있어서, 이중특이적 HER3/EGFR 억제제가 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체인 방법.
19. 제17항에 있어서, HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인이
    아미노산 서열 LSGDWIH (서열 3)를 포함하는 HVR-H1,
    아미노산 서열 VGEISAAGGYTD (서열 4)를 포함하는 HVR-H2, 및
    아미노산 서열 ARESRVSFEAAMDY (서열 5)를 포함하는 HVR-H3,
    및
    아미노산 서열 NIATDVA (서열 6)를 포함하는 HVR-L1,
    아미노산 서열 SASF (서열 7)를 포함하는 HVR-L2, 및
    아미노산 서열 SEPEPYT (서열 8)를 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 것인 방법.
20. 제19항에 있어서, HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인이 서열 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 방법.
21. 제18항에 있어서, HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인이 서열 1의 중쇄 가변 도메인 및 서열 2의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 것인 방법.
22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 진단이 환자의 HNSCC로부터의 샘플에서 NRG1의 발현 수준을 결정하는 것 및 샘플에서의 NRG1의 발현 수준을 샘플에서의 AL-137727 및 VPS33B 중 하나 또는 둘 다의 발현 수준에 대해 정량화하는 것을 포함하는 것인 방법.
23. 자가분비 뉴레귤린-유도된 신호전달을 나타내는 한 유형의 암을 갖는 환자로부터의 암 샘플에서 뉴레귤린 1 (NRG1) 발현을 결정하는 것 및 암 샘플이 NRG1을 과다발현한다면 요법을 위해 HER3 억제제를 선택하는 것을 포함하는, 상기 환자를 위한 요법을 선택하는 방법.
24. 제23항에 있어서, 암 샘플이 암 유형에서의 NRG1 발현에 대한 중간 수준보다 높은 수준에서 NRG1을 발현하는 것인 방법.
25. 제24항에 있어서, 암 샘플이 암 유형에서의 NRG1 발현에 대해 60번째 백분위수 이상인 수준에서 NRG1을 발현하는 것인 방법.
26. 제24항에 있어서, 암 샘플이 암 유형에서의 NRG1 발현에 대해 75번째 백분위수 이상인 수준에서 NRG1을 발현하는 것인 방법.
27. 제24항에 있어서, 암 샘플이 암 유형에서의 NRG1 발현에 대해 80번째 백분위수 이상인 수준에서 NRG1을 발현하는 것인 방법.
28. 제23항에 있어서, 암의 유형이 과다발현 모드 및 과다발현 모드의 결여로 이루어진 이중모드 발현 프로파일을 나타내는 것인 방법.
29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 유형이 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)인 방법.
30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, HER3 억제제가 HER3에 대한 NRG1 결합을 억제하는 것인 방법.
31. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, HER3 억제제가 항체인 방법.
32. 제31항에 있어서, HER3 억제제가 이중특이적 HER3/EGFR 억제제인 방법.
33. 제32항에 있어서, 이중특이적 HER3/EGFR 억제제가 HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체인 방법.
34. 제33항에 있어서, HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인이
    아미노산 서열 LSGDWIH (서열 3)를 포함하는 HVR-H1,
    아미노산 서열 VGEISAAGGYTD (서열 4)를 포함하는 HVR-H2, 및
    아미노산 서열 ARESRVSFEAAMDY (서열 5)를 포함하는 HVR-H3,
    및
    아미노산 서열 NIATDVA (서열 6)를 포함하는 HVR-L1,
    아미노산 서열 SASF (서열 7)를 포함하는 HVR-L2, 및
    아미노산 서열 SEPEPYT (서열 8)를 포함하는 HVR-L3
    을 포함하는 것인 방법.
35. 제34항에 있어서, HER3 및 EGFR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인이 서열 1의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 서열 2의 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 방법.
36. 제33항에 있어서, 이중특이적 항체가 서열 1의 중쇄 가변 도메인 및 서열 2의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 것인 방법.
37. 제23항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, NRG1 발현이 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 결정된 것인 방법.
38. 제37항에 있어서, PCR이 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR)인 방법.
39. 제23항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, NRG1 발현이 IHC를 이용하여 결정된 것인 방법.
40. 제23항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, HNSCC 샘플에서 NRG1 발현을 결정하는 것이 샘플에서 NRG1의 발현 수준을 결정하는 것 및 샘플에서의 NRG1의 발현 수준을 샘플에서의 AL-137727 및 VPS33B 중 하나 또는 둘 다의 발현 수준에 대해 정량화하는 것을 포함하는 것인 방법.
41. 제23항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 치료 유효량의 HER3 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
42. 샘플에서 NRG1의 발현 수준을 결정하는 것, 및
    샘플에서의 NRG1의 발현 수준을 샘플에서의 AL-137727 및 VPS33B 중 하나 또는 둘 다의 발현 수준에 대해 정량화하는 것
    을 포함하는, 암 샘플에서 NRG1 발현 수준을 정량화하는 방법.
43. 제42항에 있어서, 암이 자가분비 뉴레귤린-유도된 신호전달을 나타내는 것인 방법.
44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 암이 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)인 방법.
45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, NRG1의 발현 수준 및 AL-137727 및 VPS33B 중 하나 또는 둘 다의 발현 수준을 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 결정하는 것인 방법.
46. 제45항에 있어서, PCR이 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR)인 방법.
47. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, NRG1의 발현 수준 및 AL-137727 및 VPS33B 중 하나 또는 둘 다의 발현 수준을 면역조직화학 (IHC)을 이용하여 결정하는 것인 방법.
48. NRG1을 과다발현하는 한 유형의 암의 치료에 사용하기 위한 HER3 억제제.

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