KR20110044905A - 치료제에 대한 세포의 반응을 예측하는 방법 및 시스템 - Google Patents

치료제에 대한 세포의 반응을 예측하는 방법 및 시스템 Download PDF

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메리맥 파마슈티컬즈, 인크.
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Abstract

본 발명은 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 치료제를 이용한 치료에 대하여 종양 세포와 같은 세포들의 반응을 예측하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 세포들의 시료내에서, 세포 네트워크의 하나 이상 성분들의 수준을 측정하고 세포 네트워크의 컴퓨터이용 모델을 이용하여 세포에 대한 네트워크 활성화 상태 (NAS) 또는 네트워크 억제 상태 (NIS)를 계산하는 것을 포함한다. 치료에 대한 세포들의 반응은 계산된 NAS 또는 NIS 값에 근거하여 예측된다. 본 발명은 또한 세포의 응답에 대한 예측 방법을 포함하며, 세포(예, 종양 세포)에 대한 NAS 또는 NIS 값의 계산은 통계학적 분류 알고리즘의 사용과 복합된다. ErbB 신호전달 경로내 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 응답을 예측하는 바이오마커도 제공된다.

Description

치료제에 대한 세포의 반응을 예측하는 방법 및 시스템{METHODS AND SYSTEMS FOR PREDICTING RESPONSE OF CELLS TO A THERAPEUTIC AGENT}
암 및 기타 질환의 치료를 위한 표적화된 치료법의 개발은 상당한 진전이 있어왔다. 이와 같은 표적화된 치료법은 종양 세포에서 특이적으로 또는 선호적으로 발현되는 항원에 결합하는 단클론 항체 및 종양 세포에서 활성 신호전달 경로의 개별 성분들을 특이적으로 간섭하는 소분자 약물들을 포함한다. 예를 들면, 세투시맙(Erbitux®)는 적어도 특정 결장 암, 두부 및 목 암에서 발현되는 상피 성장 인자 수용체 (EGFR, ErbB1 또는 HER1으로도 알려져 있음)를 표적으로 하는 단클론 항체이다. 또한 예를 들면, 이마티닙(Gleevec®)는 특정 만성 골수 백혈병에서 발현되어, 발암 인자로 작용하고 양성 세포 단백질의 비정상적 변이체인 BCR-Ab1 티로신 키나아제를 표적으로 하는 소 분자다. 이와 같은 표적화된 치료법은 일부 환자들에게는 효과가 있는 것으로 나타났지만, 반응률은 100%에 미치지 못한다. 예를 들면, 세투시맙 단일요법에 대한 평균 반응률은 종양이 ErbB1 (EGFR)를 발현시키는 것으로 알려진 경우에 조차도 환자들 중 대략 15-20%에 불과하다. 따라서, 종양에서 ErbB1의 발현(세투시맙 항체에 의해 표적화된 항원)이 세투시맙에 대한 응답(responsiveness)을 보장하는 것은 아니다.
따라서, 표적화된 치료법은 매우 전망이 크지만, 이와 같은 치료법에 연루된 부작용에, 이와 같은 치료법이 일반적으로 고비용이라는 점이 복합되어, 이 치료법에 대한 환자들의 다양한 반응률(response rate)은 치료에 어떠한 환자들이 반응할 것인지를 예측하고, 반응할 것으로 예측되는 환자들에게만 치료제를 투여하는 것을 포함하는 방법이 바람직하다는 것을 말한다. 치료에 대한 응답과 관련된 유전자 마커(예, 돌연변이 또는 대립유전자)를 확인하기 위한 시도가 있었다. 이와 같은 방법에서, 치료에 대한 환자의 응답을 암시하는 유전자 마커(들)을 보유하는지를 결정하기 위한 처치를 하기 전에, 환자로부터 얻은 시료의 유전자형을 확인한다. 이행되었던 또 다른 방법은 치료법에 대한 응답과 관련된 단백질 생물시료를 확인하는 노력이다. 상기 방법에서 치료에 대한 환자의 응답을 암시하는 하나 이상의 단백질 바이오마커를 발현시키는지를 결정하기 위한 처치를 받기 전, 환자의 시료내에서 단백질이 발현되는 지가 결정된다.
전술한 두 가지 방법 모두 "직접적인" 마커 접근법으로 간주될 수 있는데, 여기서 직접적으로 측정될 마커(예, BCR-Ab1 또는 ErbB1)의 존재(또는 부재(absence) 또는 발현 수준)는 치료에 대한 응답 또는 무-응답과 관련되는 것으로 설명된다. 더욱이, 이들 두 방법은 환자들로부터 분리되는 시료안에 마커들이 확실하게 측정되거나 정량화될 수 있도록 세포내 충분히 안정적인 마커들의 사용에 의존한다. 환자로부터 시료가 분리되는 시점과 시료에서 마커들이 측정되는 시점 간에 상당한 시차가 있다면, 이와 같이 상기에서 설명된 "직접적" 마커 방법은 시료들이 통상의 프로세싱 및 취급되는 시간 동안 분해 또는 변형되지 않는 유전적 또는 단백질 치료들의 사용을 일반적으로 요구한다. 특정 치료제에 응답을 나타내는 이와 같은 안정적, "직접적" 마커들이 확인되었지만, 모든 치료제에 대해 이와 같은 마커들이 확인될 수 있을지는 불분명하다.
리간드 활성화된 일련의 신호전달 경로에 의해 종양들이 생장되는데, 리간드가 이들의 고유 수용체에 결합하여, 수용체 자체 뿐만 아니라 하류 키나아제들의 포스포랄화반응이 유도되고, 경로의 하류 성분들의 추가 포스포릴화로 이어짐으로써 통상 활성화되는 것으로 생각된다. 이와 같은 키나아제들은 세포 생존 및 증식을 촉발시킨다. 따라서, 신호전달 경로의 활성화는 세포내 성분들의 변화, 특히 단백질 포스포릴화로 이어진다. 종양 조직에서 발현된 수용체의 포스포릴화 표시는 특정 종양의 진행을 이끄는 주요 경로를 확인하는데 도움이 될 수 있다. 그러나, 인단백질은 매우 불안정하여, 조직 시료를 즉각적으로 및 신속하게 냉동(또는 일부 경우에 포르말린 고정)시키지 못하면 처치 후 포스포릴화는 급속하게 분해될 것이다. 더욱이, 특정 종양의 시료에서 하나 이상의 인단백질의 신뢰성있는 측정이 가능할 때 조차도 임의의 특정 치료제에 대한 이 종양의 치료 효과에 대해 임의의 특정 인단백질의 존부의 예측 값은 일반적으로 모른다. 따라서, 인단백질 프로파일은 종양 진행을 이끄는 경로에 대한 중요한 정보를 포함하지만, 이와 같은 인단백질 프로파일은 현재 치료에 대한 응답을 나타내는 바이오마커로 광범위하게 이용되지 않는다.
따라서, 암 치료의 치료요법적 및 비용 효과 측면을 개선시키기 위하여, 다양한 인단백질의 수준을 결정하고, 이와 같은 수준과, 특정 치료물질에 대한 개별 종양들의 응답을 예측하는 기타 종양 세포 특징들을 이용하는 새로운 방법들이 필요하다.
발명의 요약
치료제에 대한 세포의 응답, 특히 종양 세포(예, 양성 종양 세포 또는 악성 종양 세포)와 같은 신생물성 세포들, 종양 세포가 아닌 악성 세포들의 반응성을 예측하는 방법, 및 이와 같은 종양들을 가진 환자들을 치료제로 치료하는 방법들이 제공된다.
한 측면에서, 악성에 대해 환자를 항-신생물성 치료제로 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 환자들로부터 악성 세포 시료를 수득하고, 시료내에 세포의 특정 생화학적 특징들을 결정하고 그 다음 적어도 하나의 항-신생물성 물질을 환자에게 투여하는 것으로 구성된다. 특정 구체예에서, 생화학적 특징들은 적어도 하나의 바이오마커의 수준이 되며; 추가 구체예에서, 다른 좀더 안정적인 생화학적 화합물들의 수준을 측정하고 컴퓨터 모델링 패러다임을 이용하여 관심 바이오마커의 수준을 결정함으로써 바이오마커의 수준은 결정된다. 치료제는 바이오마커의 수준에 기초하여 선택되며; 바이오마커의 특정 수준을 초과할 경우에만 특정 물질들이 투여된다.
특정 구체예에서, 신생물성 종양을 가진 환자를 항-신생물성 치료제로 치료하는 방법들이 제공되는데, 상기 방법은 종양 세포를 포함하는 종양의 시료를 수득하고(예, 생검 시료 또는 잘라낸 시료), 시료내에서 포스포릴화된 ErbB3 (포스포-ErbB3, pErbB3)의 수준을 결정하고 그 다음 적어도 하나의 항-신생물성 치료제를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. pErbB3의 최저 수준이 포함된다고 확인되면 항-ErbB3 치료제가 투여된다; 항-ErbB3 치료제가 아닌 항-신생물성 치료제가 투여되고 적어도 pErbB3의 최저 수준을 포함하지 않는 것으로 나타난 경우 항-ErbB3 치료제를 투여하지 않는다. 바람직한 항-ErbB3 약제학적 물질은 항-ErbB3 항체이다. 상기 방법의 특정 구체예에서, 시료 세포들에 있는 ErbB3의 수준은 다른 좀더 안정적인 생물질표의 수준을 측정하고 컴퓨터 시스템을 이용한 자동화된 방법을 이용하여, 시료 세포들안에서 ErbB3의 수준을 시뮬레이션에 의해 결정하는 네트워크 활성화 상태를 계산하여 추정적으로 결정된다.
하나의 그와 같은 구체예 내에서, 악성 종양을 가진 환자를 치료하는 방법들이 제공되는데, 상기 방법은 종양의 시료를 수득하고, 시료내에서 ErbB3의 수준을 결정하고 시료내에 측정된 pErbB3 수준이 ACHN 신장 암 세포(ATCC No. CRL-1611)를 무혈청 배지(예, RPMI)에서 20-24시간 배양후 배양물에서 측정된 pErbB3의 수준의 50% 미만이 아닌 경우 환자에게 적어도 하나의 항-신생물성 치료제를 투여하고, 그 다음 환자에게 투여된 적어도 하나의 항-신생물성 치료제는 항-ErbB3 항체를 포함하며, 시료내에 측정된 pErbB3 수준이 ACHN 신장 암 세포 배양물에서 측정된 pErbB3의 수준의 50% 미만인 경우, 환자에게 투여된 적어도 하나의 항-신생물성 치료제는 항-ErbB3 항체를 포함하지 않는다.
특정 측면에서, 본 발명은 컴퓨팅 시스템을 이용한 전산화된 방법을 제공하는데, 이 시스템은 입력(input)을 수신하도록 설정된 적어도 하나의 입력 장치와 출력(output)을 제공하도록 구성된 적어도 하나의 출력 장치를 포함하며, 상기 방법은 세포 네트워크내에 성분들을 표적으로 하는 치료제로 처치되는 치료에 대한 세포 네트워크(예, ErbB 신호전달 경로)를 포함하는 세포 (예, 종양 세포)의 반응을 예측하는 것으로, 상기 방법은 (a) 상기 컴퓨팅 시스템 입력 장치를 통하여, 세포 시료내에서 측정된 세포 네트워크내에 있는 하나 이상의 성분들의 수준을 확인하는 입력을 제공받고; (b) 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 입력으로부터 세포에 대한 컴퓨팅 시스템, 네트워크 활성화 상태(NAS) 또는 네트워크 억제 상태(NIS)을 계산하고; (c) 그 다음 상기 출력 장치에서 (b)에서 계산된 NAS 또는 NIS에 적어도 부분적으로 근거하여 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 예측된 반응을 컴퓨팅 시스템으로 생성시키고, 출력 장치에서 예측된 반응이 제공되는 것을 포함한다.
추가 측면에서, 세포에 의해 구성된 세포 네트워크 (예, ErbB 신호전달 경로)내에 성분을 표적하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포 반응을 예측하는 방법들이 제공되는데, 상기 방법은 (a) 세포 시료내에서 세포 네트워크의 하나 이상 성분들의 수준을 측정하고; (b) 컴퓨터-실행되는 방법을 적용하는 것으로 구성되는데, 컴퓨터에 의해 실행되는 방법은 (i) 하나 이상의 측정된 수준으로 세포 네트워크 입력의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 세포에 대한 네트워크 활성화 상태 (NAS) 또는 네트워크 억제 상태 (NIS)을 계산하고; (ⅱ) (i)에서 계산된 NAS 또는 NIS에 적어도 부분적으로 기초하여 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 예측된 반응을 계산하고 산출하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 이와 같은 방법들은 치료제에 대한 세포의 예측된 응답에 근거하여, 세포 또는 세포가 얻어지는 환자를 치료제로 치료하는 것을 더 포함할 수 있다.
또한, 세포 네트워크 (예, ErbB 신호전달 경로)내에 성분을 표적하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포의 반응을 예측하는 방법들도 제공되는데, 상기 방법들은 (a) 시료 세포내에서 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 수준을 측정하고; (b) 컴퓨터에 의해 실행되는 방법을 적용하는 것을 포함하는데, 컴퓨터에 의해 실행되는 방법은 (i) 통계학적 분류 알고리즘을 적용하여 측정된 수준을 입력하고, 이로부터 세포에 대한 NAS 또는 NIS를 계산함으로써, 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 계산하고; (ⅱ) 계산된 NAS 또는 NIS에 적어도 부분적으로 기초하여 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 반응을 예측하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 이와 같은 방법들은 치료제에 대한 세포의 예측된 반응에 근거하여, 세포 또는 세포가 얻어지는 피험자를 치료제로 치료하는 것을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 컴퓨팅 시스템을 이용한 전산화된 방법을 제공하는데, 이 시스템은 입력을 수신하도록 설정된 적어도 하나의 입력 장치와 출력을 제공하도록 구성된 적어도 하나의 출력 장치를 포함하며, 상기 방법은 세포 네트워크내에 성분들을 표적으로 하는 치료제로 처치되는 치료에 대한 세포 네트워크를 포함하는 세포의 반응을 예측하는 것으로, 상기 방법은 (a) 상기 컴퓨팅 시스템 입력 장치를 통하여, 세포 시료내에서 측정된 세포 네트워크내에 있는 하나 이상의 성분들의 수준을 확인하는 입력을 제공받고; (b) 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 입력으로부터 세포에 대한 컴퓨팅 시스템, 네트워크 활성화 상태(NAS) 또는 네트워크 억제 상태(NIS)을 계산하고; (c) 컴퓨팅 시스템과 함께 통계학적 분류 알고리즘을 적용시키고, (d) 통계학적 분류 알고리즘의 출력에 적어도 부분적으로 근거하여 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 예측된 반응을 컴퓨팅 시스템으로 생성하고, 상기 출력 장치에서 제공하는 것을 포함한다.
또한, ErbB 신호전달 경로의 성분을 표적으로 하는 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 반응을 예측하는 방법도 제공된다. 이와 같은 특정 방법들은 (a) 세포의 시료내에서 (i) 헤레굴린(HRG)의 수준, 및 (ⅱ) ErbB1, ErbB2 및 ErbB3으로부터 선택된 적어도 하나의 수용체의 수준을 측정하고; (b) (a)에서 측정된 수준에 근거하여, 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 반응을 컴퓨터를 이용하여 예측하는 것을 포함하고, 이때, 기준에 비교하여 HRG 및 적어도 하나의 수용체의 상승된 수준은 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 반응성을 예측한다. 기타 이와 같은 방법은 (a) 세포들의 시료내에서, 하나 이상의 ErbB1/ErbB3 이종이량체, ErbB2 단량체, ErbB2/ErbB2 동종이량체, 포스포릴화된 ErbB2/ErbB2 동종이량체, ErbB2/ErbB3 이종이량체, 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 및 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체, ErbB2/ErbB4 이종이량체, 포스포릴화된 ErbB2/ErbB4 이종이량체, ErbB3/ErbB4 이종이량체, 포스포릴화된 ErbB3/ErbB4 이종이량체의 수준을 측정하고; (b) (a)에서 측정된 수준에 근거하여 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 반응을 컴퓨터를 이용하여 예측하는 것을 포함하고, 이때 기준과 비교하여, ErbB1/ErbB3 이종이량체, ErbB2 단량체, ErbB2/ErbB2 동종이량체, ErbB2/ErbB3 이종이량체, 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 또는 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준에서 차이는 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 응답을 예측한다. 특정 구체예에서, 이와 같은 방법들은 치료제에 대한 세포의 예측된 응답에 근거하여, 세포 또는 세포가 얻어지는 피험자를 치료제로 치료하는 것을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 컴퓨팅 시스템을 이용한 전산화된 방법을 제공하는데, 이 시스템은 입력을 수신하도록 설정된 적어도 하나의 입력 장치와 출력을 제공하도록 구성된 적어도 하나의 출력 장치를 포함하며, 상기 방법은 ErbB 신호전달 경로의 성분들을 표적으로 하는 치료제로 처치되는 치료에 대한 세포 네트워크를 포함하는 세포의 반응을 예측하는 것이다. 이와 같은 특정 방법은 (a) (i) 헤레굴린(HRG)의 수준, 및 (ⅱ) ErbB1, ErbB2 및 ErbB3으로부터 선택된 적어도 하나의 수용체의 측정된 수준을 확인하는 입력을 계산된 시스템 입력 장치를 통하여 제공받고, 이때 이들 수준은 세포의 시료내에서 측정되며; (b) 측정된 수준에 기초하여, 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 예측된 반응을 컴퓨팅 시스템으로 생성시키고, 그 다음 상기 출력 장치에서 제공하는 것을 포함하고, 이때, 기준에 비교하여 HRG 및 적어도 하나의 수용체의 상승된 수준은 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 응답을 예측한다. 기타 이와 같은 방법들은 (a) 상기 컴퓨팅 시스템 입력 장치를 통하여, 하나 이상의 ErbB1/ErbB3 이종이량체, ErbB2 단량체, ErbB2/ErbB2 동종이량체, ErbB2/ErbB3 이종이량체, 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 및 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 측정된 수준을 확인하는 입력을 제공받고, 이들 수준은 세포들의 시료내에서 측정되며; (b) 측정된 수준에 기초하여, 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 예측된 반응을 컴퓨팅 시스템으로 생성시키고, 제공하는 것을 포함하고, 이때 기준과 비교하여, ErbB1/ErbB3 이종이량체, ErbB2 단량체, ErbB2/ErbB2 동종이량체, ErbB2/ErbB3 이종이량체, 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 또는 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준에서 차이는 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 응답을 예측한다.
다른 측면에서, 세포 네트워크내 성분을 표적하는 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 반응을 예측하기 위한 키트가 제공되는데, 이때 키트는 (a) 세포 네트워크의 하나 이상 성분들의 수준을 탐지하는 분석; 및 (b) 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 세포에 대한 네트워크 활성화 상태 (NAS) 또는 네트워크 억제 상태 (NIS)를 계산하기 위한 명령을 포함한다. 특정 구체예에서, 이와 같은 키트는 (c) 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 반응을 예측하는 키트의 사용 명령을 더 포함한다.
본 발명은 세포 네트워크내에 성분을 표적으로 하는 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 반응을 예측하기 위한 바이오마커를 확인하는 방법을 추가로 제공하는데, 상기 방법은 (a) 세포들의 시료내에서, 세포 네트워크의 하나 이상 성분들의 수준을 측정하고; (b) 컴퓨터에 의해 실행되는 방법을 적용하는 것을 포함하며, 컴퓨터에 의해 실행되는 방법은 (i) 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여, 세포 네트워크의 하나 이상의 추가 성분들의 수준을 계산하고; (ⅱ) 세포 네트워크의 성분의 계산된 수준이 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 반응을 예측하는 성분을 확인하여, 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 반응을 예측하기 위한 바이오마커가 되는 성분을 확인하는 것을 포함한다.
또한, 컴퓨팅 시스템을 이용한 전산화된 방법을 제공하는데, 이 시스템은 입력을 수신하도록 설정된 적어도 하나의 입력 장치와 출력을 제공하도록 구성된 적어도 하나의 출력 장치를 포함하며, 상기 방법은 세포 네트워크내 성분을 표적으로 하는 치료제로 처치되는 치료에 대한 세포 네트워크를 포함하는 세포의 반응을 예측하는 것으로, (a) 컴퓨팅 시스템 입력 장치를 통하여 세포들의 시료내에서 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 측정된 수준을 확인하는 입력을 제공받고; (b) 컴퓨팅 시스템으로, 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 세포 네트워크의 하나 이상의 추가 성분들의 수준을 계산하고; (c) 컴퓨팅 시스템을 이용하여, 세포 네트워크의 성분의 계산된 수준이 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 반응을 예측하는 성분을 확인하고 이에 의해, 치료제를 사용한 치료에 대한 세포의 반응을 예측하기 위한 바이오마커가 되는 성분을 확인하는 것을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 컴퓨터-실행가능한 명령들을 저장하는 하나 이상 컴퓨터 판독가능한 저장 매체를 포함하여, 실행되었을 때, 전술한 임의의 방법들이 실행되는 컴퓨터 프로그램 제품을 제공한다.
도 1a-1d는 Ab #6 항체를 이용한 치료에 의해 이종이식편(xenograft) 종양 성장 억제를 보여주는 그래프이다. 도 1a는 MALME3M 이종이식편 종양 모델에 대한 결과를 나타낸다. 도 1b는 DU145 이종이식편 종양 모델에 대한 결과를 나타낸다. 도 1c는 ADRr 이종이식편 종양 모델에 대한 결과를 나타낸다. 도 1d는 ACHN 이종이식편 종양 모델에 대한 결과를 나타낸다.
도 2는 치료안 된 이종이식편 종양에서 포스포릴화된 ErbB3 (pErbB3)의 농도(pg/㎎ 전체 단백질)에 대해 Ab #6로 치료되었을 때 이종이식편에서 관찰된 성장률 감소(%)를 플롯팅한 그래프이다.
도 3a-3e는 이종이식편 절개후 0분, 10분, 30분 또는 60분에 냉동된 ACHN 이종이식편 종양 시료에서 pErbB3의 수준(도 3a)과 포스포릴화 AKT(pAKT)의 수준, 및 이종이식편 절개후 0분, 10분, 30분 또는 60분에 냉동된 EKVX 이종이식편 종양 시료에서 ErbB1의 수준(도 3c), ErbB2의 수준(도 3d) 및 ErbB3의 수준(도 3e)를 나타낸 막대그래프이다.
도 4a-4d는 신호전달 경로 그림을 컴퓨터에 의한 모델로 전환시키는 프로세스의 개략적 도식을 나타낸다. 도 4a는 상이한 리간드 및 ErbB 수용체들을 포함하는 ErbB 신호경로 그림을 나타낸다. 도 4b는 그림에서 나타낸 단백질의 상호작용을 설명하는 일련의 생화학 반응들을 나타낸다. 도 4c는 일련의 생화학 반응들로부터 유도된 일련의 유동(fluxes)을 나타낸다. 도 4d는 신호 변환 네트워크를 설명하는 질량 작용 역학에 기초한 비-선형 상미분방정식(non-linear ordinary differential equations (ODEs))을 나타낸다.
도 5a-5b는 ADRr 난소 암 세포에서 9가지 상이한 헤레굴린(HRG)의 농도 (도 5a) 또는 베타셀룰린의 농도 (도 5b)로 자극된 세포에서 시간의 경과함에 따른 포스포-ErbB3, 포스포-ErbB2, 포스포-ErbB1 및 포스포-AKT의 수준을 나타내는 그래프이다. 컴퓨터에 의한 모델의 변수들은 실험데이터(점)를 설명하기 위하여 자극 결과(굵은 선)에 대해 조정되었다.
도 6은 ErbB3의 활성화를 위한 주요 마커를 확인하기 위하여 국소 감응성 분석의 결과를 나타내는 막대 그래프이다.
도 7은 MALME3M, DU145, ADRr 및 ACHN 세포계(cell lines)내에서 pErbB3의 계산된 수준을 보여주는 그래프이다.
도 8a-8b는 4가지 연습(training) 세포계 (MALME3M, DU145, ADRr 및 ACHN)로부터 정립된 NAS 역치(threshold value)에 기초하여, Ab #6 치료에 대하여 15가지 세포계의 응답을 예측하기 위하여 NAS 값의 이용을 보여주는 그래프이다. 도 8a는 19가지 세포계에 대해 pErbB3의 시뮬레이션된 수준-최고 수준에서 최저 수준까지-을 플롯팅한 막대그래프이다. 도 8b는 최대 NAS부터 최저 NAS 값으로 19가지 세포계를 순서대로 나열한 그래프로, MALME3M보다 낮은 NAS 값을 가지는 세포계는 비-응답자(NR)으로 분류되고, ADRr 이상의 NAS 값을 가지는 세포계는 응답자(응답자)으로 분류되고 MALME3M 및 ADRr 사이의 NAS 값을 가지는 세포계는 중간(indeterminate)으로 분류된다.
도 9a-9c는 Ab #6 항체에 의한 치료에 의해 이종이식편 종양 억제를 나타내는 그래프이다. 도 9a는 IGROV1 이종이식편 종양 모델에 대한 결과를 나타낸다. 도 9b는 OVCAR8 이종이식편 종양 모델에 대한 결과를 나타낸다. 도 9c는 SKOV3 이종이식편 종양 모델에 대한 결과를 나타낸다.
도 10a-10d는 하나의 ErbB 수용체의 농도의 로그는 하나 이상의 다른 ErbB 수용체의 로그 농도에 대해 플롯된 그래프이다. Ab #6 응답자 또는 무-응답자로 분류된 세포계에 대한 수용체 값들을 나타낸다. 도 10a는 ErbB1에 대해 ErbB2를 플롯한 것이다. 도 10b는 ErbB1에 대해 ErbB3를 플롯한 것이다. 도 10c는 ErbB3에 대해 ErbB2를 플롯한 것이다. 도 10d는 ErbB1 및 ErbB2에 대해 ErbB3를 플롯한 것이다.
도 11은 HRG의 로그 농도는 ErbB1의 로그 농도에 대해 플롯된 그래프이다. 이 그래프에서, 이종이식편에서 테스트된 무-응답자 세포계에 대해 응답자 세포계가 분리된다.
도 12a-12c는 이종이식편 세포계 및 인간 종양 시료내에서 ErbB 신호전달 경로의 상이한 성분들의 로그 표준화된 발현 수준(pg/㎍, ELISA로 측정됨)이 플롯된 그래프이다. 도 12a는 ErbB1에 대해 ErbB2를 플롯한 것이다. 도 12b는 ErbB3에 대해 ErbB4를 플롯한 것이다. 도 12c는 BTC에 대해 HRG-β1를 플롯한 것이다.
도 13a-13d는 이종이식편 세포계 및 인간 종양 시료에 대한 정량적인 면역조직화학(qIHC) 결과를 나타내는 그래프이다. 도 13a는 ErbB1에 대한 세포계 표준 곡선이다. 도 13b, 13c 및 13d는 이종이식편 세포계 (적색 막대들) 및 인간 종양 시료(청색 막대들)에서 차례로 ErbB1, ErbB2 및 ErbB3에 대한 qIHC 수치를 플롯한 막대 그래프이다.
도 14는 8가지 세포계에 대해 계산되고, 통합된 포스포릴화된 ErbB1:3 이종이량체 수준(세포당 시간-통합된 이종이량체의 양)을 나타내는데, 이들 8가지 세포계는 Ab #6 무-응답자 (MALME3M, BT474, IGROV1 및 ADRr) 및 응답자 (OVCAR8, SKOV3, DU145 및 ACHN)로 분리되었다.
도 15a 및 15b는 본 발명의 특정 구체예를 실시하는 동안 실행되는 다양한 기능적 단계 및 작용이 포함된 순서도다.
도 16는 본 발명의 특정 측면들을 실행하는데 이용될 수 있는 계산 환경의 하나의 구체예다.
도 17a-d는 이중특이적 항체 H3×B1D2으로 처리된 세포에 대한 억제 곡선 그래프이다. 도 17a 및 17b는 OVCAR8 세포에서 차례로 pErbB3 수준 및 pAKT 수준에 대한 억제 곡선을 나타낸다. 도 17c 및 17d는 HER2/ErbB2 (OVCAR8-HER2 세포들)로 전이감염된 OVCAR8 세포들에서 차례로 pErbB3 수준 및 pAKT 수준에 대한 억제 곡선을 나타낸다. 직선(solid line)은 컴퓨터에 의한 모델에서 시뮬레이션된 데이터를 나타내고, 원은 실험적으로 결정된 데이터를 나타낸다. 시뮬레이션된 IC50 값(DR50sim) 및 실험적으로 결정된 IC50 값(DR50데이터)도 나타낸다.
도 18a-d는 이중특이적 항체 H3×B1D2으로 처리된 세포에 대한 억제 곡선 그래프이다. 도 18a 및 18b는 ADrR 세포에서 차례로 pErbB3 수준 및 pAKT 수준에 대한 억제 곡선을 나타낸다. 직선(solid line)은 컴퓨터에 의한 모델에서 시뮬레이션된 데이터를 나타내고, 원은 실험적으로 결정된 데이터를 나타낸다. 시뮬레이션된 IC50 값(DR50sim) 및 실험적으로 결정된 IC50 값(DR50데이터)도 나타낸다. 도 18c 및 18d는 ErbB1 RNAi로 시뮬레이션 치료된 ADrR 세포들에서 차례로 pErbB3 수준 및 pAKT 수준에 대한 억제 곡선을 나타낸다.
도 19a-c는 H3×B1D2로 처리된 이종이식편 모델에서 종양 세포들 패널에서 ErbB2 단량체의 계산된 수준에 대해 생체내에서 측정된 상대적인 성장률(RGR)(도19a), ErbB2:ErbB2 동종이량체의 계산된 수준에 대해 생체내에서 측정된 상대적인 성장률(RGR)(도19b) 및 H3×B1D2 없이 종양 세포 패널에서 ErbB2:ErbB3 이종이량체의 계산된 수준에 대해 생체내에서 측정된 상대적인 성장률(RGR)(도19c)을 나타낸 그래프이다.
도 20a-b는 H3×B1D2로 처리된 이종이식편 모델내 종양 세포 패널에서 ErbB2:ErbB3 이종이량체의 계산된 상대적인 수준에 대해 생체내 측정된 상대적인 성장률(RGR)(도20a), 및 H3×B1D2의 존부에 대해 시뮬레이션된 종양 세포 패널내에서 ErbB1:ErbB3 이종이량체의 상대적인 수준에 대해 생체내 측정된 상대적인 성장률(RGR)(도20b)을 나타낸 그래프이다.
도 21은 실시예 11에서 상세하게 나타낸 바와 같이, HRG 약량에서 ErbB2-과다발현 세포계 BT474-M3으로부터 HRG 유도된 pErbB3 및 pAKT의 예측된(플롯된 라인) 및 실제 신호 데이터(데이터 점들)을 그래프로 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 하나 이상 세포의 신호전달 경로에서 하나 이상의 요소들(예, ErbB3)의 활성 상태를 하나 이상 요소들의 수준을 직접 측정하는 것도보다는 간접적인 마커들을 이용하여 결정하는 방법, 시스템 및 컴퓨터 프로그램 제품을 전반적으로 제공한다. 이와 같은 간접적 측정은 신호전달 경로를 본뜬 컴퓨터 시뮬레이션을 통하여 신호전달 경로에서 요소들의 활성 상태를 결정하는데 이용될 수 있다. 여기에서 설명된 방법들을 이용하여, 이 정보들은 치료제에 대한 세포들의 응답을 예측하고 질환 또는 질병(예, 암)을 가진 환자에 치료요법적 치료를 선택하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 이용을 통하여, 종양 세포들로 된 시료의 대표적인 포스포릴화 기호(signatures)의 확인을 할 수 있다. 환자 시료에서 이와 같은 인단백질의 수준을 직접적으로 측정할 필요없이, 치료제에 대한 응답에 대해 포스포릴화된 세포의 단백질을 바이오마커로 사용할 수 있게 되고, 따라서 인단백질 측정과 관련된 잠재적인 문제점(예, 불안정, 비-신뢰성)을 피할 수 있다. 이와 같이 시뮬레이션에 의해 결정된 포스포릴화 기호는 항-신생물성 치료제에 대한 세포들의 응답을 정확하게 예측하는데 이용될 수 있고, 따라서, 환자의 암 치료에 효과가 없는 항암제를 환자에게 투여하는 일을 피할 수 있다. 더욱이, 개시된 방법들은 세포 네트워크내 기타 불안정한 성분들, 가령, 수용체의 동종이량체 및/또는 이종이량체, 또는 세포 네트워크내 포스포릴화된 동종- 및/또는 이종이량체의 수준을 시뮬레이션할 수 있으며, 이들 성분들은 치료제에 대한 세포의 응답을 예측하는데 이용될 수도 있다. 추가로, 개시된 방법들은 세포 네트워크내 성분들에 대해 치료제의 효과의 시뮬레이션을 허용하고, 이 또한 치료제에 대한 세포의 응답을 예측하는데 이용될 수도 있다.
특정 방법들에서, 세포 네트워크내 하나 이상 안정한 세포의 성분들 (예, 세포 표면 수용체들, 리간드 및 기타 유사한 것들)의 수준은 세포들의 시료내 (예, 종양 생검 또는 절개된 종양내 세포들)에서 측정된다. 이와 같은 측정들에 근거하여, 세포들에 대한 네트워크 활성화 상태(또는 NAS) 또는 네트워크 억제 상태(NIS)는 하나 이상 신호 변환 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델(예, 기계적인 컴퓨터에 의한 모델)을 이용하여 계산된다. 예를 들면, NAS는 세포 네트워크내 포스포릴화된 단백질의 계산된 수준(직접적으로 측정되지 않음)을 나타내는 수치가 될 수 있다. 대안으로, NIS는 치료제의 존재 시뮬레이션에서, 세포 네트워크내 계산된 성분의 수준을 나타내는 수치가 될 수 있다 (치료제 부재 시뮬레이션에서 성분의 수준과 비교하여). 계산된 NAS 또는 NIS를 응답 또는 무-응답에 대한 역치를 나타내는 기준 값에 비교함으로써, 세포들이 치료요법적 치료에 반응할 것인지를 예측할 수 있다.
따라서, 치료에 대한 세포 응답의 "간접적" 마커들의 용도가 개시되는데, "간접적" 마커 (예, 활성화된 신호전달 경로내의 포스포릴화된 단백질 또는 이량체)의 수준은 직접적으로 측정된 것이 아니라, 직접적으로 측정된 기타 세포 성분들의 수준에 근거하여 계산된, 또는 시뮬레이션된 것이다. 이들 방법들은 통계학적 분류 알고리즘, 예를 들면 NAS 또는 NIS 계산과 복합하여 이용되는 것을 포함한다.
본 발명의 내용 및 여기에서 설명된 실시예들에서, ErbB 신호전달 경로의 기계적인 컴퓨터에 의한 모델은 ErbB 세포 네트워크 (또는 NAS)의 활성 마커로써 포스포릴화된 ErbB3 (pErbB3) 수준을 계산하는데 성공적으로 이용되었으며, 시뮬레이션된 pErbB3 수준은 생체내 이종이식편 시스템에서 항-ErbB3 항체, Ab #6를 이용한 치료에 대해 종양 세포계의 응답을 정확하게 예측할 수 있는 것으로 나타났다. 추가적으로, 여기에서 설명된 실시예들에서 추가 개시된 바와 같이, ErbB 신호전달 경로의 기계적인 컴퓨터에 의한 모델은 치료제의 존부 시뮬레이션에서 ErbB 세포 네트워크 (또는 NIS)의 억제 마커로써 ErbB2/ErbB3 이종이량체 및 ErbB1/ErbB3 이종이량체의 상대적인 수준을 계산하는데 성공적으로 이용되었으며, ErbB2/ErbB3 및 ErbB1/ErbB3 이종이량체의 시뮬레이션된 상대적 수준은 생체내 이종이식편 시스템에서 항-ErbB3×항-ErbB2 이중특이적 항체, H3×B1D2를 이용한 치료에 대해 종양 세포계의 응답을 정확하게 예측할 수 있는 것으로 나타났다.
본 발명이 더 잘 이해될 수 있도록, 특정 용어들을 먼저 정의한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료제(therapeutic agent)"은 질환 또는 장애의 증상의 괴로움을 감소 또는 억제시키는, 또는 질환 또는 장애에서 증상이 없는 빈도 및/또는 기간 또는 증상이 감소된 기간을 증가시키는, 또는 질환 또는 장애로 인한 손상 또는 무능을 억제하거나 방지하는, 또는 질환 또는 장애의 진행을 억제 또는 지연시키는, 또는 질환 또는 장애의 개시를 억제 또는 지연시키는, 또는 감염성 질환 또는 장애에서 감염을 억제 또는 방지하는 능력을 가진 임의의 및 모든 화합물을 포함한다, 치료제의 비-제한적인 예로는 작은 유기 분자, 단클론성 항체, 이중특이적 항체, 재조합에 의해 조작된 생물제제, RNAi 화합물들 및 기타 유사한 것들을 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같이, "세포 네트워크내에 성분을 표적하는" 치료제는 치료요법적 활성이 적어도 부분적으로 세포 네트워크내 성분의 활성에 특이적 직간접적 효과를 가지는 물질로 인한 것이 되는 물질을 지칭한다. 세포 네트워크내 성분을 표적으로 하는 치료제의 비-제한적 예로는 ErbB1에 특이적으로 결합하여, ErbB 세포 네트워크내에 ErbB1을 특정하게 표적하는 단클론성 항체 세투시맙, 및 ErbB1의 티로신 키나아제(TK) 도메인을 특이적으로 억제하여, 따라서 ErbB 세포 네트워크내 ErbB1-TK를 특이적으로 표적하는 소분자, 제피티닙(gefitinib)를 포함한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "네트워크 활성화 상태", 즉 "NAS"는 세포 네트워크의 활성화 수준을 반영 또는 이와 일치되는 마커, 일반적으로 수치를 말한다. NAS는 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 일반적으로 계산된다. NAS는 예를 들면, 세포 네트워크내 하나 이상 포스포릴화된 단백질의 시뮬레이션된 수준을 나타낼 수 있다. 하나 이상의 인단백질 수준이 NAS의 바람직한 구체예가 되지만(예, 실시예 7에서 추가 설명되는 것과 같이 pErbB3 수준 또는 포스포릴화된 ErbB 동종이량체 또는 이종이량체 수준, 가령, 실시예 10에서 추가 설명되는 것과 같이, pErbB1/ErbB3 이종이량체 수준, 또는 하류 키나아제, 가령 PI3K의 수준), 활성화된 신호전달 경로내의 세포 성분들은 네트워크 활성화의 마커로 작용하여, 수용체 이량체화(동종이량체 및 이종이량체, ErbB1/ErbB1 또는 ErbB2/ErbB2 동종이량체의 수준, 또는 ErbB1/ErbB2, ErbB1/ErbB3, ErbB1/ErbB4, ErbB2/ErbB3 또는 ErbB2/ErbB4 이종이량체의 수준), 단백질 절단, 전사 인자들의 활성화 및 유전자 발현의 활성화를 포함하나 이에 한정되지 않는 NAS로 이용될 수 있다. 세포, 가령 종양 세포의 네트워크 활성화 상태는 해당 신호전달 경로에 대한 세포의 의존도의 마커가 되어, 특정 신호전달 경로를 표적으로 하는 치료제에 의해 억제될 수 있을 것이다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "네트워크 억제 상태", 즉 "NIS"는 세포 네트워크의 억제 수준을 반영 또는 이와 일치되는 마커, 일반적으로 수치를 말한다. NIS는 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 일반적으로 계산된다. NIS는 치료제 부재 시뮬레이션에서 시뮬레이션된 수준과 비교하여, 치료제 존재 시뮬레이션에서, 세포 네트워크내 하나 이상 성분들의 시뮬레이션된 수준을 나타낸다. 예를 들면, NIS는 치료제의 부재 시뮬레이션에서 이들 하나이상의 성분들의 수준과 치료제 존재 시뮬레이션에서 이들 하나 이상의 성분들의 수준 비율이 될 수 있다. NIS의 비-제한적 예는 치료제 존부재 시뮬레이션에서 계산된 하나 이상 동종- 또는 이종이량체의 계산된 상대적 수준 (ErbB2/3 및 ErbB1/3 이종이량체의 상대적 수준)(예, 치료제 부재 시뮬레이션에서 수준과 비교하여, 치료제 존재 시뮬레이션에서의 수준)이다. 그러나, 치료제에 의해 수준이 조절될 수 있는 신호전달 경로내 기타 세포 성분들도 네트워크 억제의 마커물질로 작용할 수 있고, 따라서, 이들 수준은 NIS의 마커 물질로 이용될 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 세포, 가령, 종양 세포의 NIS 및 NAS는 세포의 신호전달 경로내 성분들에 대한 치료제의 영향을 나타내는 마커들이며, 치료제의 효과에 대한 세포의 예시적인 응답이 될 수 있을 것이다.
"세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델"은 생물학적 경로 도표 또는 그림(예, 암과 연관된 일련의 단백질 상호작용)을 후속적인 시뮬레이션 및 분석으로 해석될 수 있는 컴퓨터 프로그램과 같은 모델을 말한다. 특정 정보(예, 리간드 및/또는 수용체 단백질 농도, 속도 상수)가 모델에 입력되어, 용이하게 측정될 수 없는(예, 인단백질 수준) 추가 정보를 시뮬레이션할 수 있다. 세포 네트워크에 대한 네트워크 활성화 상태 (즉, NAS) 또는 네트워크 억제 상태 (즉, NIS)는 여기에서 설명된 것과 같이, 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 계산될 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "알고리즘(algorithm)"은 방법을 실행하거나 또는 문제를 해결하기 위한 일련의 명령 또는 과정 또는 공식들을 일반적으로 지칭하는 것이다. "통계학적 분류(statistical classification) 알고리즘"은 하나 이상 측정가능한 변수들, 또는 입력(예, 조직 시료내에 측정된 단백질 수준)과 특정 결과, 또는 출력(예, 치료제에 대한 응답) 사이의 통계학적 관계를 정의하여, 분류 또는 예측하는(예, 치료제에 대한 응답자 대 무-응답자) 알고리즘을 말한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "바이오마커(biomarker)"는 세포내에 또는 세포에 의해 발현되는 물질(예, 단백질, mRNA, 대립유전자)이며, 여기서, 바이오마커는 제공된 치료에 대한 질환의 응답과 상관된다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "직접적인 바이오마커"은 세포내에 또는 세포에 의해 발현되는 물질(예, 단백질, mRNA, 대립유전자)이며, 여기서, 바이오마커는 제공된 치료에 대한 질환의 응답과 상관되며, 이 물질의 존재 또는 물질의 수준은 세포내에서 직접 측정되어, 제공된 치료에 대한 질환의 응답을 예측한다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "간접적 바이오마커"는 세포내에 또는 세포에 의해 발현되는 물질(예, 단백질, mRNA, 대립유전자)이며, 여기서, 바이오마커는 제공된 치료에 대한 질환의 응답과 상관되며, 이 물질의 존재 또는 물질의 수준은 세포내에서 직접 측정되지 않고, 간접적 수단 가령, 컴퓨터에 의한 모델을 이용한 시뮬레이션에 의해 결정되어, 제공된 치료에 대한 질환의 응답을 예측한다.
여기에서 설명된 것과 같이, "항체"는 면역글로블린 유전자들 또는 면역글로블린 유전자들의 단편들에 의해 실질적으로 인코드되는 하나 이상의 폴리펩티드로 구성된 단백질이며, 여기서 단백질은 항원에 면역특이적으로 결합한다. 인지된 면역글로블린 유전자들은 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 입실론 및 뮤(mu) 불변 부분 유전자들 뿐만 아니라 무수한 면역글로블린 가변 부분 유전자들을 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 입실론으로 분류되며, 이는 다시 차례로 면역글로블린 종류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 정의된다. 전형적인 면역글로블린 구조 단위는 사량체(tetramer)로써 두 개의 동일한 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 이들 각 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kD)와 하나의 "중쇄"(약 50-70 kD)를 가진다. "VL" 및"VH"는 각각 경쇄 및 중쇄를 나타낸다.
항체는 고유의 면역글로블린 뿐만 아니라 이의 항원 결합 단편들을 포함하는데, 이들 단편들은 다양한 펩티다제로 절단하여 생성되거나 또는 화학적으로 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 새로 합성될 수 있다. 이들 단편들은 예를 들면, F(ab)2 이량체 및 Fab 단량체를 포함한다. 바람직한 항체들은 단일 쇄 항체(단일 폴리펩티드 쇄로 존재하는 항체들), 좀더 바람직하게는 단일 쇄 Fv 항체들(scFv)를 포함하는데, 이때 VH 및 VL 쇄는 서로 결합되어(직접적으로 또는 펩티드 링커를 통하여) 연속 폴리펩티드를 형성한다. 5,132,405 및 4,956,778.
"면역특이적" 또는 "면역특이적으로"는 관심 단백질의 하나 이상의 에피토프에 면역글로블린 유전자들 또는 면역글로블린 유전자들의 단편에 의해 실질적으로 인코드된 도메인을 통하여 결합하지만, 항원 분자의 혼합된 집단이 포함된 시료내에 다른 분자들을 실질적으로 인지하여 이들 분자에 결합하지 않는 항체들을 지칭한다. 일반적으로, 표면 플라즈몬 공명 분석(surface plasmon resonance assay) 또는 세포 결합 분석에 의해 측정되었을 때 항체는 고유 항원에 적어도 50nM의 Kd로 결합한다. 이들 분석을 이용하는 것은 본 기술 분야에 공지된 것이며, 여기에서 실시예 13에서 예시적으로 설명되고 있다.
"항-ErbB3 항체"는 ErbB3의 엑토도메인에 면역특이적으로 결합하는 분리된 항체이다. 표면 플라즈몬 공명 분석 또는 세포 결합 분석에 의해 측정되었을 때, ErbB3에 이와 같은 결합은 적어도 50nM의 Kd를 나타낸다. ErbB3의 EGF-유사 리간드 매개된 포스포릴화를 억제하는 항-ErbB3 항체들이 바람직하다. EGF-유사 리간드는 EGF, TGFα, 베타셀룰린, 헤파린 결합 상피 성장 인자, 비레굴린, 에피겐, 에피레굴린, 및 암피레굴린을 포함하며, ErbB1에 일반적으로 결합하고, ErbB1과 ErbB3의 이종이량체를 유도한다.
여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "이중특이적(bispecific)"는 두 개의 항원 결합 부위를 포함하는 단백질을 말하는 것으로, 여기서 제1결합 부위는 제1항원 또는 에피토프에 친화력을 가지며, 제1 항원 또는 에피토프와는 구별되는 제2항원 또는 에피토프에 결합 특이성을 가지는 제2결합 부위가 된다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "피험자" 또는 "환자"는 질환 또는 장애를 가지는 임의의 인간 또는 인간이 아닌 동물이 포함되며, 본 발명의 방법들을 이용하여 종양을 가진 피험자 또는 환자에서 치료제를 이용한 치료에 대한 반응이 예측될 수 있다. "인간이 아닌 동물"은 모든 척추동물, 가령, 포유류 및 비-포유류 가령, 인간이 아닌 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭 등이 포함된다.
본 발명의 많은 구체예는 하나 이상 컴퓨팅 시스템을 포함하는데, 다양한 컴퓨터 하드웨어 가령, 입력 장치, 출력 장치, 프로세서, 저장 매체 및 기타 대응 컴퓨터 성분들을 포함하는 가령, 특정 용도 및 일반적인 용도의 컴퓨터가 된다.
본 발명의 많은 구체예는 저장매체상에 보관된 컴퓨터-실행가능한 명령 또는 데이터 구조를 가지는 컴퓨터 판독가능한 저장매체도 포함하며(여기에서 정의된 명령 및 데이터 구조들을 포함하며, 예를 들면, 기계적인 컴퓨터에 의한 모델, 측정된 단백질 및 바이오마커 수준, 분류 알고리즘, 돌연변이 상태 및 기타 등등), 및 여기에서 설명되고, 청구되는 프로세스를 실행하도록 특별히 설정되어 있다. 이와 같은 컴퓨터 판독가능한 저장 매체는 일반 용도의 또는 특수 용도의 컴퓨터에 의해 접근가능한 임의의 이용가능한 매체가 될 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 컴퓨터 판독가능한 저장 매체는 RAM, ROM, EEPROM, CD-ROM 또는 기타 광 디스크 저장 장치, 자기 디스크 저장 장치 또는 기타 자기 저장 장치 또는 원하는 프로그램 코드 수단, 모듈을 저장하는데 이용될 수 있는 임의의 다른 매체와, 컴퓨터-실행가능한 명령 또는 데이터 구조형태의 소프트웨어로 일반 용도 또는 특수 용도 컴퓨터에 의해 접근가능한 소프트웨어를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 전송 매체(transmission media)는 컴퓨터-실행가능한 명령을 실행하는데 이용될 수 있어, 본 발명은 어플리케이션, 시스템 및 여기에서 설명된 하나 이상의 프로세스를 이행하도록 실행되는 컴퓨터-실행가능한 명령을 운반하는 전송 매체가 결합된 기타 구체예까지 확장될 수 있다. 정보가 네트워크 또는 다른 통신 접속(하드웨어 내장된, 무선 또는 하드웨어 내장과 무선의 복합)을 통하여 컴퓨터로 전송 또는 제공될 때, 컴퓨터는 컴퓨터 판독가능한 전송 매체로써 접속(connection)을 적절하게 조사한다.
다음 용어들 "컴퓨터-실행가능한 명령", "실행가능한 명령", "모듈(modules)" 및 "계산 모듈(computing modules)"은 컴퓨터 코드, 데이터 구조 및 본 내용에서 설명되고, 청구범위에서 재인용된 것과 같이, 본 발명의 특정 프로세스를 실행하기 위하여 하나 이상의 계산 프로세스 및 하나 이상의 컴퓨팅 시스템의 프로세싱 성분들에 의해 접근되며 실행되는 소프트웨어 관련하여 호환되어 사용될 수 있다.
본 내용에서 전술한 및 다양한 추가적인 측면은 다음의 하위 단락들에서 더욱 상세하게 설명된다.
I. 기계적인 컴퓨터에 의한 모델
기계적인 컴퓨터에 의한 모델은 단백질 네트워크내에 분자 상호작용의 예상되는 수학적 설명으로 볼 수 있다. 적어도 특정 구체예에서, 치료제에 대한 반응을 예측하기 위하여 여기에서 제공되는 방법들은 기계적인 컴퓨터에 의한 모델을 이용하는 것을 포함한다. 기계적인 컴퓨터에 의한 모델들은 생물학적 경로 도표 또는 그림( 가령, 암과 관련된 경로와 같은 신호 변환 경로와 함께 발생되는 일련의 단백질 상호작용)을 후속 시뮬레이션 및 분석에 적용할 수 있는 일련의 수학식으로 바꾼다. 따라서, 모델 구축에서 첫 단계는 경로에 관련된 상관 단백질 및 분자들을 포함하는 생물학적 경로를 나타내는 상세한 도표 또는 그림을 만드는 것이다. 어떤 단백질 및 분자들이 포함되어야 할 지, 뿐만 아니라 어떤 생물학적 반응을 여기에 연결시키는지에 대해 중대한 결정이 있어야 한다. 어떤 단백질 및 분자들이 경로에 관여하는지, 및 이들을 연결하는 생물학적 반응에 대한 이용가능한 정보는 과학 논문에서 수집하고, 생물학적 경로의 대표 그림을 만드는데 이용한다.
일단 생물학적 경로의 대표 그림을 만든 후, 정보는 단백질-단백질 경로내 단백질-단백질 상호작용(세포 네트워크라고도 함)을 나타내는 시스템 방정식으로 변환된다. 신호 변환 네트워크의 생화학적 반응 네트워크를 나타내는 컴퓨터에 의한 모델들은 예를 들면, 비-선형 상미분방정식(ODEs), 추계학 모델, 연산자 또는 퍼지 로직 모델 또는 페트리 네트에 기초한다. 이들은 실험적으로 측정되거나 추정되어야만 하는 두 가지 타입의 변수를 요구하는 차등 방정식(differential equations)으로 구성된다: 초기 종 번호(i th 종에 대한 c 0 ,i ) 및 속도 상수( j th 속도에 대한 k j ). 도 4a-d에서 컴퓨터에 의한 모델을 만드는 프로세스의 도식을 나타내고 있는데, ErbB 신호전달 경로의 그림(도 4a), 이 경로는 일련의 생화학적 반응 및 유동의 해석 (도 4b 및 4c), 및 상이한 일련의 방정식에 의한 단백질-단백질 상호작용의 설명(도 4d)이 제공된다.
컴퓨터에 의한 모델은 일반적으로 컴퓨터 스크립팅 언어, 예를 들면, 예를 들면 MATLAB 소프트웨어 Simbiology (The MathWorks, Natick, MA)와 선택적으로 MATLAB에 대한 The Systems Biology Toolbox 2(SBtoolbox2.org), 또는 JACOBIAN 모델링 소프트웨어(Numerica Technology, Cambridge, MA)을 이용하여 구축된다. 그러나, 본 발명의 범위는 MATLAB 또는 JACOBIAN 소프트웨어 및 인터페이스로 구축된 것이외의 소프트웨어 및 인터페이스로 구축된 컴퓨터에 의한 모델의 개발 및 이용까지 확장된다는 것을 인지할 것이다. 본 발명은 또한 제3 소스에 의해 미리 구축되고, 본 발명의 기타 측면을 실행하는 컴퓨팅 시스템으로 다운로드된 컴퓨터에 의한 모델을 이용하는 구체예까지 확장된다.
모델 교정(calibration)전에, 가능한 많은 변수들에 대한 값은 과학 문헌으로부터 얻은 정보 가령, 단백질 수준, 결합 친화력, 리간드가 이들 고유 수용체에 결합하는 속도 상수와 같은 정보에 근거하여 특정화시키고 컴퓨팅 시스템에 입력한다. 과학 문헌에서 얻지 못한 변수 값들은 실험적으로 얻을 수 있다.
훈련을 실행하는 컴퓨팅 시스템으로 입력된 실험에 의해 수득된 데이터에 대해 이의 출력을 최적화시킴으로써 모델은 "훈련("trained")된다. 실험 데이터를 모델에 피팅(fitting)함으로써 최적의 일련의 모델 변수들이 선택된다. 모델 교정 프로세스는 추정 및 변수 평가의 변형을 포함한다. 모델을 교정하기 위하여, 리간드 자극이 하류 신호생성 과정으로 바뀌는데 생물학적으로 특히 중요한 단백질 및 변수 서브세트를 우선 확인해야만 한다. 이 프로세스는 감응도 분석(sensitivity analysis)이라고 하는데, 좀더 정확하게, 경로내에 단백질 농도 및 역학 변수들의 변화에 반응하여 기질 포스포릴화와 같은 출력에서 변화를 측정하는 수학적 도구이다. j th 속도 상수(k j )에 대해 i th 관측가능한 c i (t)의 완전히 표준화된 감응도(s ij (t))는 다음의 식으로 나타낸다:
Figure pct00001
모델 교정은 감응도 분석에서 확인된 변수 및 초기 단백질 농도를 변화시킴으로써 실험 데이터 및 시뮬레이션 결과 사이의 거리를 최소화하는 지역적 및 전체적 최적화 방법들(예, Genetic Algorithms, 시뮬레이션된 어닐링, Levenberg-Marquardt 최적화 및 기타 등등)을 이용하여 컴퓨팅 시스템에 의해 실행된다. 컴퓨팅 시스템은 교정되는 동안 변수들을 자동적으로 바꾸거나 또는 증분적으로 추가된 사용자 입력에만 반응하여 변수를 바꾸도록 설정될 수 있다.
다양한 신호전달 경로에 대한 다수의 컴퓨터에 의한 모델이 과학 문헌들에서 설명되어 왔다(예, Kholodenko, B.N. etal .(1999) J. Biol . Chem .274:30169-30181; Schoeberl , B. etal .(2002) Nat . Biotech. 20:370-375; Hayakeyama , M. etal .(2003) Biochem . J. 373:451-463; Nielsen , U.B. and Schoeberl, B.(2005) IDrugs 8:822-826; Schoeberl , B. et al .(2006) Conf . Proc . IEEEEng . Med . Biol. Soc . 1:53-54; Schoeberl , B. et al .(2006) IBM J. Res . Dev . 50:645; Fitzgerald , J.B. et al.(2006) Nat . Chem . Biol . 2:458-466; Kholodenko , B.N.(2007) Nat . Cell . Biol . 9:324-330; Birtwistle, M.R. et al .(2007) Molecular Systems Biology 3:144; Hinow , P. et al .(2007) Theoretical Biology and Medical Modelling 4:14). 추가적으로, 컴퓨터에 의한 모델의 구축 및 사용은 Kholodenko , R.N. (2006) Nature Reviews : Mol Cell . Biol . 7:165-176 및 Kumar , N.etal.(2006) Drug Discovery Today 11:806-811에서 검토되고 있다.
여기에서 제시되는 특정 방법들에 이용된 컴퓨터에 의한 모델중 하나는 ErbB 신호전달 경로 모델이다. ErbB 신호전달 경로의 대표적인 컴퓨터에 의한 모델 구축은 실시예 4에서 상세하게 설명된다. 여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "ErbB 신호전달 경로"는 ErbB 패밀리 수용체와 리간드의 상호작용을 통하여 개시되는 신호 변환 경로들을 포함한다. ErbB 신호전달 경로내에 성분들은 다음을 포함할 수 있다: (i) 하나 이상의 리간드, 예를 들면, HRG, 베타셀룰린 (BTC), 상피 성장 인자 (EGF), 헤파린 결합 상피 성장 인자 (HB-EGF), 변환 성장 인자 알파(TGFα), 암피레굴린 (AR), 에피겐 (EPG) 및 에피레굴린 (EPR)를 포함하며; (ⅱ) 하나 이상의 수용체, 예를 들면, ErbB1, ErbB2, ErbB3 및 ErbB4를 포함하며; (ⅲ) 세포내 키나아제, 포스파타제 및 기질들, 예를 들면, 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 (PI3K), 포스파티딜이노시톨 바이포스페이트 (PIP2), 포스파티딜이노시톨 트리포스페이트 (PIP3), 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN), 피루베이트 데하이드로게나제 키나아제 이소자임 1 (PDK1), AKT, RAS, RAF, MEK, 세포외 신호-조절된 키나아제 (ERK), 단백질 포스파타제 2A (PP2A) 및 SRC 단백질 티로신 키나아제를 포함한다.
여기에서 제공된 특정 방법들에 이용된 또 다른 컴퓨터에 의한 모델은 IGF1R 신호전달 경로 모델이다. 여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "IGF1R 신호전달 경로"는 인슐린 성장 인자 1 패밀리의 수용체와 리간드의 상호작용을 통하여 개시되는 신호 변환 경로들을 포함한다. IGF1R 신호전달 경로내의 성분들은 다음을 포함할 수 있다: (i) 하나 이상의 리간드, 예를 들면, 인슐린 성장 인자 1 (IGF1)를 포함하고; (ⅱ) 하나 이상의 수용체, 예를 들면, IGF1R 및 인슐린 수용체를 포함하고; (ⅲ) 하나 이상의 IGF 결합 단백질들, 및 (iv) 세포내 키나아제 및 기질들, 예를 들면, 인슐린 수용체 기질 2 (IRS2), PI3K, AKT, Bcl-2 관련된 관련된 단백질 BAD, RAS, RAF, MEK 및 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 (MAPK)을 포함한다.
여기에서 제공된 특정 방법들에 이용된 또 다른 컴퓨터에 의한 모델은 c-Met 신호전달 경로 모델이다. 여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "c-Met 신호전달 경로"는 c-Met 수용체 단백질 티로신 키나아제와 리간드의 상호작용을 통하여 개시되는 신호 변환 경로들을 포함한다. c-Met 신호전달 경로내의 성분들은 다음을 포함할 수 있다: (i) 하나 이상의 리간드, 예를 들면, 간세포 성장 인자 (HGF)를 포함하고; (ⅱ) 하나 이상의 수용체, 예를 들면, c-Met 수용체 단백질 티로신 키나아제를 포함하고; (ⅲ) 세포내 키나아제 및 기질들, 예를 들면 PI3K, 성장 인자 수용체 결합된 단백질 2 (GRB2), Src 상동성 및 콜라겐 단백질 (SHC), SRC 단백질 티로신 키나아제 및 GAB1 비계(scaffolding) 단백질, 뿐만 아니라 RAS, RAF, MEK 및 미토겐-활성화된 단백질 키나아제 (MAPK)를 포함한다.
여기에서 제공된 특정 방법들에 이용된 또 다른 컴퓨터에 의한 모델은 두 개 이상의 성장 인자 신호전달 경로, 가령, IGR1R 및 ErbB 수용체 신호전달 경로, ErbB 수용체 신호전달 경로 및 c-Met 신호경로 또는 IGF1-R, ErbB 및 c-Met 신호전달 경로의 복합과 같은 임의의 복합을 포함하는 모델이다.
전술한 실시예들의 특이성에도 불구하고, 기타 컴퓨터에 의한 모델들 (예, TNF, IL-2, PDGF, FGF, TRAIL, 인테그린, 사이토킨 및 실질적으로 임의의 다른 경로와 같은 신호전달 경로)이 본 발명의 구체예에 통합되고 이용될 수도 있다는 것을 인지할 것이다.
특정 구체예에서, 하나 이상의 치료제 존재는 컴퓨터에 의한 모델에서 시뮬레이션될 수 있다. 치료제들의 컴퓨터에 의한 제시(presentation)는 물질이 이의 세포 표적에 결합을 설명하는 또는 그렇지 않으면 모델이 되는 세포 경로상에 물질의 효과를 설명하는 질량-작용 반응식(mass-action reaction equations)을 이용하여 이루어질 수 있다. 결합 사건 또는 다른 생물학적 효과들에 대한 변수들은 직접적인 실험적 측정에 의해 수득될 뿐만 아니라 세포상에 치료제의 효과에 대한 데이터에 대등하도록 모델을 훈련시킴으로써 수득될 수도 있다. 예를 들면, 항체 물질들의 경우, 항체가 이들 표적 항원에 결합에 대한 on-rate 및 off-rate는 표준 방법들(예, BIACore 또는 KinExA 기술)에 의해 실험적으로 결정될 수 있으며, 이들 변수들은 컴퓨터에 의한 모델에 통합될 수 있다. 추가적으로, 예를 들면, 이중특이적 물질의 경우, 이중특이적 물질의 개별 각 표적에 결합된 이중특이적 분자의 수 또는 이중특이적 물질의 두 가지 표적 모두에 결합된 분자의 수의 척도로써 교차-연결 변수는 컴퓨터에 의한 모델에 훈련 변수로 이용될 수 있다. 교차-연결 변수는 전체적으로 관찰된 결합 친화력 (표준 FACS 분석에 의해 결정됨)을 얻고, 이를 표준 로직 결합 반응식에 대입하여 얻을 수 있다. 전술한 것에 추가하여, 특정 치료제에 약리학적으로 관련될 수 있어, 따라서 컴퓨터에 의한 모델에서 제시될 수 있는 추가적인 변수들은 본 기술 분야의 업자들에게 알려져 있다.
치료제의 효과가 컴퓨터에 의한 모델에서 제시되면, 단일 물질을 나타내거나 또는 다중 물질들을 복합하여 나타내어, 세포 반응에 대해 복합 요법의 효과를 시뮬레이션할 수 있다. 예를 들면, 하나의 구체예에서, 컴퓨터에 의한 모델에서 상이한 표적 항원에 각각 결합하는 두 개 항체가 제시될 수 있다. 다른 구체예에서, 특정 신호전달 경로 (예, ErbB 경로)를 표적으로 하는 항체와 동일한 신호전달 경로 (예, ErbB 경로)의 소분자 억제제가 동시에 컴퓨터에 의한 모델에 제시되어 세포에서 신호전달 경로의 이와 같은 복합 요법의 효과를 평가할 수 있다.
Ⅱ . 통계학적 분류 알고리즘
적어도 특정 구체예에서, 치료제에 대한 반응을 예측하기 위하여 여기에서 제시된 방법(예, 컴퓨터로 치료제에 대한 예측된 반응 생성) 및 악성 종양을 가진 환자를 치료하는 방법들은 하나 이상 통계학적 분류 알고리즘의 이용을 포함한다.
통계학적 모델의 하나의 목적은 조직 시료에서 측정된 단백질 뿐만 아니라 생화학적 모델에 의해 계산된 활성화 수준 (예, 네트워크 활성화 상태 또는 "NAS") 또는 억제 수준 (예, 네트워크 억제 상태 또는 "NIS")과 치료제에 대한 환자의 반응 사이의 상관 관계를 알아보는 것이다. 따라서, 통계학적 분류 알고리즘은 하나 이상의 측정가능한 변수들, 또는 입력, (예, 조직 시료에서 측정된 단백질 수준, 계산된 NAS 또는 NIS 값들)과 특정 결과 또는 출력(예, 치료제에 대한 응답) 사이에 통계학적 상관 관계를 정의하여, 분류, 또는 예측이 이루어질 수 있다(예, 치료제에 대한 응답자 대 무-응답자). 따라서, 통계학적 모델은 응답자와 무-응답자를 나누는 역치를 확인하는데 도움이 되며, 또한 정의된 역치 주변에 불확실성을 한정하는데 도움이 될 수 있다.
다양한 형태의 통계학적 분류자 시스템들이 본 기술 분야에 설명되어 있으며, 본 발명의 방법들에 사용하기에 적절할 수 있는데, 비-제한적인 실시예는 주요 성분 분석 (PCA), 부분 최소 제곱 회귀(PLSR), 삼선 PLSR, Fuzzy logic 및 Bayesian 추론, 랜덤 포레스트(RF), 분류 및 회귀 트리(C&RT), 부스트된(boosted) 트리, 신경 네트워크 (NN), 서포트 벡터 기계(SVM), 일반적인 카이-제곱 자동화된 쌍방향 탐지 모델, 쌍방향 트리, 다중적응성 회귀 스프라인, 기계 학습 분리기 및 이의 복합을 포함한다. 예를 들면 PCT 공개 WO 2007/109571 참고.
통계학적 분류 알고리즘을 연습하기 위하여, 바람직하나의 구체예에서, 본 기술 분야의 용어들을 사용하기 위하여: "기계" 또는 "컴퓨팅 시스템" (예, 컴퓨터)은 "분류기"(통계학적 알고리즘)에 의해 컴퓨터로 입력되는 "훈련" 실시예의 수를 검사함으로써 실제 환자 반응(예, 응답자, 무-응답자)과 네트워크 활성화 상태(NAS)의 상관 관계를 "학습(learn)"한다. 이와 같은 프로세스는 "감독된 학습(supervised learning)"으로 알려져 있는데, 그 이유는 입력 (측정된 및 계산된 단백질 수준) 및 출력 (예, 치료제에 대한 반응) 모두 연역적(a priori)으로 알려진 시료 수집이 있기 때문이다. 통계학적 분류 알고리즘을 적용시키는 필수 부분은 정보를 제공하는 특징들의 선별(임의의 측정된 또는 계산된 단백질 수준 또는 단백질 활성화 수준이 되는 특징) 뿐만 아니라 알고리즘에 의해 생성되는 수치에 대한 최적의 역치 결정이다.
출력이 공지된, 그러나 분류기에 드러내지 않은 시료의 별도 "테스트 세트"에 통계학적 분류 알고리즘을 확인하는 것이 일반적으로 바람직하다. 결과를 알고 있는 예측과 비교함으로써, 해당 실행이 측정될 수 있다. 시료의 수가 작다면, 예측될 수 없을 수도 있고, 이와 같은 요구사항을 받아들이기 위한 확립된 기술들이 있다. 이들 가운데 주요한 것은 하기에서 추가 논의되는 교차 검증(cross-validation)이다. 분류자의 출력은 필요하다면 분류 예측으로 바뀔 수 있는 점수(score)가 된다. 일반적으로, 분류자를 훈련시키는 프로세스는 또한 최적의 역치를 결정하는 방법들을 포함한다.
예측하는 능력을 테스트하기 위하여, 교차 검증의 전반적인 과정은 데이터의 일부 (시료의 분취)를 ‘훈련 데이터(training data)’또는 ‘훈련 (데이터) 세트’로 비축시키고; 나머지 데이터는 ‘테스트 (데이터) 세트’라고 한다. 일반적으로, 이 과정을 여러 차례 반복하는데, 매번 훈련 및 테스트를 위하여 데이터의 다른 분취량을 이용한다. 더 큰 훈련 세트가 분명히 유익하지만(예시가 많을수록 더 우수한 분류자가 된다), 큰 테스트 세트도 그러하다(증명되는 예측이 많을수록, 미래 예측에 대하여 더 높은 확신을 가진다). 시료 크기가 작을 경우, 이 과정은 수정되어, 단일 시료가 테스트 데이터로 비축되고, 분류자는 모든 남아있는 시료를 이용하여 훈련된다. 하나의 남겨진(left-out) 시료에서 예측이 이루어진다. 이를 "하나 남기기 교차-검증(leave-one-out cross-validation)(LOOCV)"이라고 부르며, 본 기술 분야에서 확립된 것이다. 이 과정은 다시 각 남겨진(left-out) 시료에 대해 반복된다. 모든 예측이 이루어졌다면, 실행이 평가된다.
본 발명의 방법에서 이용된 통계학적 분류 알고리즘에서, 다양한 변수들, 정보를 제공하는 특징들 또는 정보 조각들이 입력 데이터로 이용될 수도 있다. 입력 데이터의 비-제한적인 예로는 세포 시료로부터 수득된 세포 네트워크의 하나이상의 성분들의 단백질 수준, 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 계산된 네트워크 활성화 상태 (NAS) 또는 네트워크 억제 상태 (NIS), 세포 시료내에서 하나 이상의 단백질의 돌연변이 상태, 치료에 대한 응답이 조사되는 피험자의 나이, 및 치료에 대한 응답이 조사되는 피험자의 성별을 포함한다.
Ⅲ . 세포 시료에서 세포 성분들의 수준 측정
치료제를 사용한 치료에 대한 예측된 응답을 생성시키고, 악성 종양을 가진 환자를 치료하기 위하여 여기에서 제공된 방법들에 있어서, 한 과정은 세포 시료내에서 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 수준을 측정하거나, 또는 대안으로 세포 시료에서 취한 수득된 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 측정된 수준을 컴퓨팅 시스템에 입력하는 것을 일반적으로 포함한다. 예를 들면, 종양 시료는 종양을 가진 환자로부터 표준 방법에 의해 수득될 수 있고, 종양 시료내에서 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 수준이 측정될 수 있다.
컴퓨팅 시스템에 수작업으로 입력이 될 수 있다. 일부 경우에, 컴퓨팅 시스템으로 자동적으로 입력이 입력되거나 다운로드될 수 있는데, 가령, 본 발명의 특징을 실행하기 위하여 입력을 수용하고 이용하는 컴퓨팅 시스템에 자동화된 측정 장치가 연결되어 있을 때 이루어진다. 이에 대해 임의의 측정 정보 및 이의의 상태 정보(예, 돌연변이 상태 정보) 뿐만 아니라 본 서류에서 설명된 임의의 기타 조직/환자 데이터는 본 발명의 설명된 프로세스를 실행하기 위하여, 데이터를 이용하는 하나 이상의 기타 컴퓨팅 시스템에서 측정 및 상태 정보를 자동적으로 수득하고, 다운로드하는 전산화된 장치를 이용하여 수득될 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 성분의 "수준"은 시료내에 존재하는 해당 성분의 양 또는 농도를 말한다. 성분 수준은 공지된 다양한 기술중 임의의 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 수준은 일반적으로 단백질 수준을 측정함으로써 결정되지만, 대안으로, 일부 경우 mRNA 수준 측정에 이어서 mRNA 수준을 예측된 단백질 수준으로 전환시켜 결정될 수 있다. 단백질의 수준(예, 단량체, 동종이량체, 또는 이종이량체)는 본 기술 분야에 공지된 하나 이상의 기술을 이용하여 측정될 수 있는데, 비-제한적 예로는 정량적 형광 활성화된 세포 분류(qFACS), 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA, Luminex), 면역조직화학(IHC), 정량적인 면역조직화학(qIHC), 근접 기반법(예, Forster 공명 에너지 전달 기반법, 생분자 형광 상보법(BiFC), VeraTag™ 또는 DNA-Programmed Chemistry™ (DPC™)), 질량 분석법, Western (면역블랏) 분석 및 공면역침전법을 포함한다. 단백질 수준은 pg/㎍(탐지된 단백질/전체 단백질)로 나타낼 수 있을 것이다.
단백질 또는 mRNA 수준은 세포 용해물에서 결정될 수 있다. 예를 들면, 세포 용해물은 실시예 2에서 설명된 것과 같이 준비될 수 있다. 더욱이, 단백질 수준을 결정하기 위한 ELISA를 사용하는 대표적 예들이 실시예 2 및 4에서 설명되고 있으며, 단백질 수준을 결정하기 위하여 qFACS를 사용하는 대표적 실시예가 실시예 4에서 설명되고 있으며, mRNA 수준을 측정하고, 이를 단백질 수준으로 전환시키는 대표적인 실시예가 실시예 4 (HRG-β1에 대해)에서 설명되고 있다.
종양 시료는 예를 들면, 새로운 세포 시료, 새로운 냉동 시료 또는 고정된 조직 시료가 될 수 있다. 환자의 조직 시료의 경우, 보관된 조직 블록은 새로 냉동된 시료보다는 더 용이하게 접근할 수 있을 것이다. 따라서, 바람직하나의 구체예에서, 포르말린-고정된 파라핀에 박힌(FFPE) 조직 시료가 이용되며, 성분들 (예, 리간드, 수용체)의 수준은 반-정량적 면역조직화학(IHC) (실시예 9에서 추가 설명됨)에 의해 결정될 수 있을 것이다. 반-정량적 IHC 정보를 컴퓨터에 의한 모델에 입력으로 적용할 수 있는 농도로 전환시키기 위하여, 세포 플러그 또는 공지의 수용체 및/또는 리간드 발현 수준을 가진 이종이식편을 포함하는 기준 슬라이드가 환자 시료와 비교될 수 있다. 더욱이, BTC 및 HRG 발현 수준에 대해 실시예 4에서 상세하게 설명된 것과 같이, 무한 단위로 수득된 발현 수준(예, 단백질 또는 mRNA 양)을 컴퓨터에 의한 모델에 입력이 될 수 있는 농도 수준으로 전환시키기 위해 전환 인자들이 결정될 수 있다.
리간드 mRNA 및 리간드 단백질 수준은 일반적으로 당연히 연관된다. 따라서, qRT-PCR를 이용하여 종양 세포계의 세포 용해물 및 FFPE의 이종이식편에서 mRNA 발현 수준을 결정할 수 있을 것이다.
IV . 치료제에 대한 반응을 예측하는 방법
특정 측면에서, 본 발명은 세포 네트워크내 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포의 반응을 예측하는 방법을 제공한다. 이와 같은 방법들은 예측 방법들 1-5에서 나타낸 요소들을 일반적으로 포함한다.
예측 방법 1
(a) 세포들의 시료내에 존재하는 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들을 측정함으로써 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 수준 측량을 얻고;
(b) 컴퓨터에 의해 실행되는 방법에 적용하는데, 상기 방법은:
(i) 측량과 컴퓨터에 의한 모델 세포 네트워크 입력을 이용하여 세포들에 대한 네트워크 활성화 상태(NAS) 또는 네트워크 억제 상태 (NIS)를 계산하고;
(ⅱ) (i)에서 계산된 NAS 또는 NIS에 부분적으로 기초하여 치료제를 이용한 치료에 세포들의 예측된 반응을 계산하고, 출력하는 것을 포함한다.
예측 방법 2
(a) 세포들의 시료내에서, 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 수준을 측정하고;
(b) 컴퓨터에 의해 실행되는 방법을 적용하고, 상기 방법은 :
(i) 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 세포에 대한 네트워크 활성화 상태 (NAS) 또는 네트워크 억제 상태 (NIS)을 계산하고;
(ⅱ) 통계학적 분류 알고리즘을 적용하고;
(ⅲ) 통계학적 분류 알고리즘의 출력에 일부 근거하여 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하는 것을 포함한다.
예측 방법 3
a) 컴퓨팅 시스템은 입력 장치를 통하여 세포들의 시료내에서 측정된 세포 네트워크내 하나 이상의 성분들의 수준을 확인하는 입력을 수용하고;
b) 컴퓨팅 시스템은 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 세포에 대한 네트워크 활성화 상태 (NAS) 또는 네트워크 억제 상태 (NIS)을 계산하고;
c) 컴퓨팅 시스템은 b)에서 계산된 NAS 또는 NIS에 일부 근거하여 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 예측된 반응을 생성하고, 출력 장치로 제공한다.
예측 방법 4
a) 세포들의 시료내에서, 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 수준을 측정하고;
b) 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 세포들에 대한 네트워크 활성화 상태 (NAS) 또는 네트워크 억제 상태 (NIS)을 계산하고;
c) 통계학적 분류 알고리즘을 적용시키고;
d) 통계학적 분류 알고리즘의 출력에 일부 근거하여 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측한다.
예측 방법 5
a) 컴퓨팅 시스템은 입력 장치를 통하여, 세포들의 시료내에서 측정된 세포 네트워크내 하나 이상의 성분들의 수준을 확인하는 입력을 제공받고;
b) 컴퓨팅 시스템은 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 세포들에 대한 네트워크 활성화 상태 (NAS) 또는 네트워크 억제 상태 (NIS)를 계산하고;
c) 컴퓨팅 시스템은 통계학적 분류 알고리즘을 적용시키고;
d) 컴퓨팅 시스템은 통계학적 분류 알고리즘에 일부 근거하여 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 예측된 반응을 만들고, 출력 장치로 제공한다.
상기 방법들은 세포 또는 세포들이 수득되는 환자를 치료제에 대한 세포들의 예측된 응답에 근거하여, 치료하는 방법을 더 포함할 수 있지만, 반드시 포함할 필요는 없다.
다양한 측면에서, 탐지된 성분들의 수준은 하나 이상 특이적 치료제의 예측된 효과를 나타낸다. 많은 경우에, 이들 성분들이 사전-결정된 컷-오프 수준 또는 비율 이상(또는 일부 경우에 이하)의 기준에 맞는 수준(또는 다른 명시된 성분들에 비교하여 특정 농도 비율)에서 탐지된다면, 주어진 치료제는 환자에게 효과적인 것으로 예측되고 환자에 투여될 수 있다는 의미이며, 이들 성분들이 사전-결정된 컷-오프 수준 또는 비율 이상(또는 일부 경우에 이하)의 기준에 맞지 않는 수준(또는 다른 명시된 성분들에 비교하여 특정 농도 비율)에서 탐지된다면,이 치료제는 환자에게 투여되지 않는다. 적절한 컷-오프 수준은 통상의 실험을 이용하여, 및 여기에서 설명된 것에 따라 설정될 수 있다.
세포들의 반응을 예측하기 위하여, 전형적으로 NAS 또는 NIS 값은 치료제에 대해 공지의 다수 응답 세포들 및 무응답 세포들에 대해 계산되고 공지의 응답 세포들 및 무응답 세포들에 대한 이들 값은 NAS 또는 NIS 역치를 설정하는데 이용되고, 역치는 치료제에 대한 응답 또는 무-응답을 나타낸다(실시예 7 및 10에서 추가 설명됨). 따라서, 생성된 및/또는 예측된 세포들의 치료에 대한 반응 은 치료제에 대한 응답 또는 무-응답을 나타내는 NAS 또는 NIS의 역치와 b)에서 계산된 NAS 또는 NIS를 비교함으로써 c)에서 수득될 수 있다.
통계학적 분류 알고리즘을 적용하기 위하여, 하나 이상의 정보는 알고리즘으로 입력되거나 또는 컴퓨팅 시스템은 하나 이상의 정보를 알고리즘에 통합한다. 예를 들면, 이 과정은 (i) 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 수준 (ⅱ) 계산된 NAS 또는 NIS; (ⅲ) 세포들의 시료내에서 하나 이상의 유전자들의 돌연변이 상태; (iv) 치료제로 치료될 피험자의 나이; (v) 치료제로 치료될 피험자의 성별; (vi) 세포상에 에스트로겐 수용체 (ER)의 존부; (vⅱ) 세포상에 프로게스테론 수용체의 존부; 및 (vⅲ) 세포상에 안드로겐 수용체의 존부에서 선택된 하나 이상의 정보를 알고리즘으로 입력하는 것을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안으로, 통계학적 분류 알고리즘의 적용은 상기 (i)-(vⅲ)에서 제시한 하나 이상의 정보를 입력한 후 알고리즘을 계산하는 컴퓨팅 시스템을 포함할 수 있다. 통계학적 분류 알고리즘은 입력 정보와 치료에 대한 세포들 (예, 종양 세포들)의 응답 사이에 통계학적 상관 관계로 정의되기 때문에, 치료에 대한 세포들의 반응 예측은 통계학적 분류 알고리즘의 출력에 기반을 둘 수 있을 것이다.
여기에서 제시하는 예측 방법들 및 기타 방법들에서, 바람직한 세포 네트워크는 ErbB 신호전달 경로를 포함한다. 하나의 구체예에서, 방법의 컴퓨팅 시스템으로 측정되고, 입력된 하나 이상의 성분들은 ErbB 신호전달 경로에 관련된 하나 이상의 리간드를 포함할 수 있다. 이와 같은 리간드의 비-제한적인 예로는 HRG (HRG-β1, HRG-β2, HRG-α, HRG-3 및 HRG-4을 포함), BTC, EGF, HB-EGF, TGFα, AR, EPG 및 EPR을 포함한다. 추가적으로 또는 대안으로, 방법에서 측정된 하나 이상의 성분들은 ErbB 신호전달 경로에 관련된 하나 이상의 수용체들을 포함한다. 이와 같은 수용체의 비-제한적인 예로는 ErbB1, ErbB2, ErbB3 및 ErbB4 (본 기술 분야에서는 차례로 HER1, HER2, HER3 및 HER4으로도 공지됨). 이와 같은 수용체들은 개별 엔터티로 분석될 수 있으며(이들이 단량체, 동종이량체 또는 이종이량체로 생성되는지), 및 특정 구체예에서, 각 동종이량체 및 이종이량체는 별개의 성분으로 측정될 수 있고, 컴퓨팅 시스템으로 입력될 수 있다. 예를 들면, 측정된 성분들은 ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4, HRG, 및 BTC (예, ErbB1 및 HRG; 또는 ErbB1, ErbB2 및 ErbB3)에서 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 또는 그 이상의 수용체, 리간드, 또는 이들 두 가지 모두 다 될 수 있다. 예를 들면, 일부 방법에서, 계산된 NAS는 치료제 없이 ErbB2/ErbB2 동종이량체 또는 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준을 시뮬레이션한다. 이와 같은 다른 방법들에서, 계산된 NIS는 치료제 부재하에 ErbB2/ErbB3 이종이량체 또는 ErbB1/ErbB3 이종이량체의 수준과 비교하여, 치료제 존재하에 ErbB2/ErbB3 이종이량체 또는 ErbB1/ErbB3 이종이량체의 수준을 시뮬레이션한다.
상기 방법들에서, 계산된 NAS는 ErbB3 신호전달 경로에서 하나 이상의 포스포릴화된 단백질의 수준을 시뮬레이션한다. 예를 들면, 계산된 NAS는 세포들의 시료내에서 pErbB3 수준을 시뮬레이션할 수 있다. 대안적 구체예에서, 계산된 NAS는 세포들의 시료내에서 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 또는 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준을 시뮬레이션할 수 있다.
하나의 구체예에서, 치료제는 항-EGFR (항-ErbB1) 항체를 포함하는데, 이의 대표적인 예는 항-ErbB1 항체 세투시맙 (Erbitux®, ImClone Systems)이다. 항-ErbB1 항체의 또 다른 예로는 마투주맙(matuzumab), 파니투무마브(panitumumab); 니무투주맙(nimotuzumab) 및 mAb 806 (Mishima , K. et al .(2001) Cancer Res .61:5349-5354)를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 치료제는 항-ErbB2 항체를 포함하며, 대표적인 예는 트라스투주맙(trastuzumab)이다. (Herceptin®, Genentech)
또 다른 구체예에서, 치료제는 항-ErbB3 항체를 포함한다. 바람직하나의 구체예에서, 항-ErbB3 항체는 현재 임상 시험 단계 1에 있는 MM-121다. 바람직하나의 구체예에서, 항-ErbB3 항체는 Ab #6를 포함하는데, 이는 WO 2008/100624에서 설명되고 있으며, 차례로 서열 번호: 1 및 2의 서열을 가진 VH 및 VL을 가진다. 또 다른 구체예에서, 항-ErbB3 항체는 차례로 서열 번호: 7-9(VH CDR1, 2, 3) 및 10-12(VL CDR 1, 2, 3)의 서열의 Ab # 6 VH 및 VL CDR을 포함하는 항체이다. 항-ErbB3 항체의 다른 예로는 Ab #3, Ab #14, Ab #17 및 Ab #19을 포함하는데, WO 2008/100624에서 설명되고 있으며, 이들은 차례로 서열 번호: 3 및 4, 5 및 6, 25 및 26, 및 33 및 34의 VH 와 VL을 가진다. 또 다른 구체예에서, 항-ErbB3 항체는 Ab#3 (차례로 서열 번호: 13-15 및 16-18)의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체이거나 또는 Ab #14(차례로 서열 번호: 19-21 및 22-24)의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체 또는 Ab #17 (차례로 서열 번호: 27-29 및 30-32)의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체 또는 Ab#19 (차례로 서열 번호: 35-37 및 38-40)의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체를 포함한다.
항-ErbB3 항체의 또 다른 예로는 항체 1B4C3 및 2D1D12 (U3, Pharma AG)을 포함하는데, 이둘은 US 공개 No. 2004/0197332에서 설명되어 있고 단클론성 항체(이의 인간화 형태를 포함), 가령 8B8은 U.S. 특허 5,968,511에서 설명된다.
또 다른 구체예에서, 항-ErbB3 항체는 이중특이적 항체(예, 융합 단백질)로써, 제2 항체(예, 항-ErbB2 항체)에 링크된 항-ErbB3 항체를 포함한다. 이와 같은 이중특이적 항체의 바람직한 예는 H3×B1D2으로써, 이의 아미노산 서열은 서열 번호: 41에 제시되고 있다. 이와 같은 이중특이적 항체에서, ErbB3에 결합하는 단일 쇄 항체, H3 (차례로, 서열 번호: 42-44 및 45-47에 나타낸 VH 및 VL CDR 서열을 가짐)는 ErbB2에 결합하는 단일 쇄 항체, B1D2 (차례로 SEQ ID NOs: 48-50 및 51-53에 나타낸 VH 및 VL CDR을 가짐)에 링크된다. 이중특이적 항체 H3×B1D2의 항체 성분들은 U.S. 특허 7,332,585 및 7,332,580, 뿐만 아니라 PCT 출원 PCT/US2006/023479 (WO 2007/084181으로 공개됨) 및 PCT 출원 PCT/US2007/024287 (WO 2008/140493으로 공개됨)에 구체적으로 설명된다.
또 다른 구체예에서, 치료제는 두 개 이상의 항-ErbB3 항체를 포함하는데, 이들 각각은 ErbB3 상의 상이한 에피토프에 결합한다. 바람직하게는, 치료제는 세 개의 항-ErbB3 항체를 포함하는데, 이들 각각은 ErbB3 상의 상이한 에피토프에 결합한다.
또 다른 구체예에서, 치료제는 항-ErbB4 항체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 치료제는 팬(pan)-ErbB 억제제 또는 HER 이량체화 억제제를 포함한다. HER 이량체화 억제제의 예는 항체 페르투주맙(pertuzumab) (2C4 항체로도 공지됨)가 되며, 이는 Agus , D.B. et al .(2005)J. Clin . Oncol . 23 :2534-2543에 추가 설명된다.
또 다른 구체예에서, 치료제는 ErbB 신호전달 경로의 하나 이상의 소분자 억제제를 포함하는데, 이의 대표적인 예로는 이의 대표적인 예로는 제피티닙 (Iressa®)-AstraZeneca 및 Teva에서 시판되는 것을 이용할 수 있으며- 및 라파티닙(lapatinib)(Tykerb®)-GlaxoSmithKline에서 시판되는 것을 이용할 수 있음-을 포함한다. ErbB 신호전달 경로의 소본자 억제제의 또 다른 예로는 CI-1033 (PD 183805; Pfizer), 에르로티닙(erlotinib) HCL (OSI-774; Tarceva®; OSI Pharma); PKI-166 (Novartis); PD-158780; EKB-569; 및 Tyrphostin AG 1478 (4-(3-클로로아닐리노)-6,7-디메톡시퀴나졸린)을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 세포 네트워크는 c-Met (간엽 상피 전이 인자-mesenchymal epithelial transition factor) 신호전달 경로를 포함한다. 하나의 구체예에서, a)에서 측정된 및/또는 입력된 하나 이상 성분들은 c-Met 신호전달 경로에 관련된 하나 이상의 리간드를 포함할 수 있다. 이와 같은 리간드의 비-제한적인 예는 간세포 성장 인자 (HGF)이다. 추가적으로 또는 대안으로, a)에서 측정된 및/또는 입력된 하나 이상 성분들은 c-Met 신호전달 경로에 관련된 하나 이상의 수용체를 포함할 수 있다. 이와 같은 수용체의 비-제한적인 예는 c-Met 수용체 단백질 티로신 키나아제다.
상기의 관점에서, 여기에서 제공되는 예측 방법들은 c-Met 신호전달 경로내 성분들을 표적으로 하는 치료제에 대한 종양의 컴퓨터에 의해 생성된 예측과 같은 세포의 반응을 예측하게 한다. 치료제는 예를 들면, c-Met에 결합하는 항체(예, 단클론성 항체)를 포함할 수 있다. 이와 같은 항-cMet 항체의 예는 AV299 (AVEO); AMG102 (A㎎en) 및 5D5 (OA-5D5; Genentech) 항체를 포함한다. c-Met 신호전달 경로를 표적으로 하는 바람직한 치료제는 항-cMet 항체에 링크된 항-ErbB1 항체를 포함하는, 이중특이적 단클론성 항체를 포함한다. 이와 같은 이중특이적 항체의 예는 PCT 공개 WO 2005/117973 및 WO 2006/091209에서 더 설명된다. 또 다른 구체예에서, 치료제는 c-Met 신호 생성의 소분자 억제제이며, 이의 예로는 ARQ 197 (ArQule) 및 PHA665752을 포함한다(Christensen , J.G. et al .(2003) Cancer Res . 63 :7345-7355).
또 다른 구체예에서, 세포 네트워크는 인슐린 성장 인자 1 수용체 (IGF1R) 신호전달 경로를 포함한다. 하나의 구체예에서, a)에서 측정된 하나 이상 성분들은 IGF1R 신호전달 경로에 관련된 하나 이상의 리간드를 포함한다. 이와 같은 리간드의 비-제한적인 예는 인슐린 성장 인자 1 (IGF1)이다. 추가적으로 또는 대안으로, a)에서 측정된 하나 이상 성분들은 IGF1R 신호전달 경로에 관련된 하나 이상의 수용체이다. 이와 같은 수용체의 비-제한적인 예는 IGF1R 수용체이다.
상기의 관점에서, 본 발명의 예측 방법들 IGF1R 신호전달 경로내 성분들을 표적으로 하는 치료제에 대한 종양의 컴퓨터에 의해 생성된 예측과 같은 세포의 반응을 예측하게 한다. 바람직하나의 구체예에서, 치료제는 항체 that binds to IGF1R에 결합하는 항체가 되며, 이 항체의 예로는 mAb391 (Hailey, J. et al .(2002) Mol . Cancer . Ther . 1 :1349-1353); IMC-A12 (Imclone Systems , Inc .), 19D12 (Schering Plough), H7C10 (Goetsch , L. et al .(2005) Int . J. Cancer 113 :316-328), CP751,871 (Pfizer), SCV/FC (ImmunoGen , Inc .) 및 EM/164 (ImmunoGen , Inc .)을 포함한다. 바람직하나의 구체예에서, 치료제는 항-ErbB3 항체에 링크된 항-IGF1R 항체를 포함하는 이중특이적 항체이다. 이와 같은 이중특이적 항체들은 PCT 공개 WO 2005/117973 및 WO 2006/091209에 더 설명되고 있다. 다른 구체예에서, 치료제는 IGF1R의 소분자 억제제(예, 티로신 키나아제 억제제)이며, 이의 예로는 NVP-AEW541 (Novartis); NVP-ADW742 (Novartis); NVP-TAE226 (Novartis); BMS-536,924 (Bristol-Myers Squibb); BMS-554,417 (Bristol - Myers Squibb); 피크로포도필린(PPP)과 같은 사이클로리그난 (Menu , E. et al .(2006) Blood 107 :655-660); 및 PQ401 (Gable , K. L. et al .(2006) Mol . Cancer Ther . 5 :1079-1086)을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 치료제는 치료제 복합물을 포함하는데, 여기서 복합물은 ErbB 신호전달 경로내 성분을 표적하는 적어도 하나의 물질을 포함하는데, 이와 같은 물질의 복합물은 상기에서 설명한 ErbB 경로 물질들중 적어도 하나를 포함한다. 예를 들면, 복합 물질은 ErbB 신호전달 경로내 성분들을 표적하는 두 가지 이상의 물질을 포함할 수 있다. 대안으로, 복합 물질은 ErbB 신호전달 경로내 성분을 표적으로 하는 적어도 하나의 물질과, 또 다른 신호전달 경로, 가령 c-Met 또는 IGF1R 신호전달 경로내 성분을 표적으로 하는 적어도 하나의 물질을 포함할 수 있다.
다양한 다른 구체예들에서, 세포 네트워크는 두 가지 이상의 신호전달 경로, 예를 들면, ErbB 신호전달 경로와 c-Met 신호전달 경로의 복합 또는 ErbB 신호전달 경로와 IGF1R 신호전달 경로의 복합을 포함한다.
여기에서 제공되는 예측 방법들의 또 다른 구체예에서, 이와 같은 방법들은 세포들내에 하나 이상의 유전자들의 돌연변이 상태를 세포들의 시료내에서 결정하는 과정을 더 포함할 수 있다. 바람직하게, KRAS (Kirsten 쥐 육종 바이러스 온코진 동족체), PI3K 및 PTEN에서 선택된 적어도 하나 이상의 유전자의 돌연변이 상태를 결정한다. 추가적으로 또는 대안으로, 상기 방법은 세포들에서 하나 이상의 유전자들의 돌연변이 상태를 확인하는, 예를 들면, KRAS, PI3K 및 PTEN으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 돌연변이 상태를 확인하는 입력을 수용하는 컴퓨터 시스템을 포함할 수 있다.
예측 방법들의 또 다른 구체예에서, 세포 네트워크는 ErbB 신호전달 경로를 포함하고 a) BTC 및 AR의 측정된 수준을 측정하고 및/또는 입력하는 것을 포함하고, 상기 방법은 KRAS 유전자의 돌연변이 상태를 결정하거나 돌연변이 상태를 입력하는 것을 더 포함한다. 또 다른 구체예에서, 세포 네트워크는 ErbB 신호전달 경로를 포함하고 a) ErbB1, ErbB2, ErbB3, HRG, BTC, AR, HB-EGF, EGF, TGFα, EPG 및 EPR의 측정된 수준을 측정하고 및/또는 입력하는 것을 포함하고, 상기 방법은 KRAS 유전자의 돌연변이 상태를 결정하거나 돌연변이 상태를 입력하는 것을 더 포함한다. 이들 구체예에서 바람직하게는 b)에서 계산된 NAS는 ErbB 신호전달 경로에서 하나 이상의 포스포릴화된 단백질의 수준을 시뮬레이션한다. 또 다른 바람직하나의 구체예에서, b)에서 계산된 NAS는 환자 종양 시료에서 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체의 수준을 시뮬레이션한다. 또 다른 바람직하나의 구체예에서, b)에서 계산된 NAS는 환자 종양 시료에서 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준을 시뮬레이션한다.
상기에서 설명된 특정 방법내에서, 치료제에 대한 다수의 공지의 응답 세포들 및 무응답 세포들에 대한 각각의 계산된 NAS 또는 NIS 값은 치료제에 대한 응답 또는 무-응답을 나타내는 NAS 또는 NIS 역치를 설정하는데 이용된다. 다른 방법에서, 치료에 대한 세포들의 반응은 (b)에서 계산된 NAS 또는 NIS를 치료제에 대한 응답 또는 무-응답을 나타내는 NAS 또는 NIS 역치 값과 비교함으로써 예측된다.
V. ErbB 경로 억제제에 대한 반응을 예측하기 위한 바이오마커 및 방법들
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포 네트워크(예, ErbB 신호전달 경로)의 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들(예, 종양 세포들)의 응답을 예측하는 직접적인 바이오마커를 제공한다. 이와 같은 바이오마커는 여기에서 제공되는 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 확인될 수 있다. 이와 같은 바이오마커를 확인하는 방법은 일반적으로 (a) 세포들의 시료내에서 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 수준을 측정하고; (b) 컴퓨터에 의해 실행되는 방법을 적용하는 것을 포함하며, 이때 컴퓨터에 의해 실행되는 방법은 (i) 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 세포 네트워크의 하나 이상의 추가 성분들의 수준을 계산하고; (ⅱ) 세포 네트워크의 성분을 확인하고, 성분들의 계산된 수준은 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하여, 따라서 치료제를 이용한 치료에 대하여 세포들의 반응을 예측하기 위한 바이오마커로써의 성분을 확인하는 것을 포함한다.
세포 네트워크내 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포 반응을 예측하는 바이오마커를 확인하는 특정 방법들은 하기를 포함한다:
a) 입력 장치를 통하여 세포들의 시료내에서 측정된 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 측정된 수준을 확인하는 입력을 수용하는 컴퓨팅 시스템;
b) 컴퓨팅 시스템은 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 세포 네트워크의 하나 이상의 추가 성분들의 수준을 계산하고;
c) 컴퓨팅 시스템은 세포 네트워크의 성분의 계산된 수준이 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하는 세포 네트워크 성분을 확인하고, 따라서 치료제를 이용한 치료에 대한 세포 반응을 예측하는 바이오마커로써 성분을 확인한다.
예를 들면, 실시예 10에서 설명된 것과 같이, 컴퓨터에 의한 모델은 하나 이상의 NAS 값(세포 네트워크의 활성화 측량치로써)을 수득하기 위하여 세포 네트워크 (예, ErbB 신호전달 경로)의 하나 이상의 성분들의 수준을 계산하는데 이용되며, 치료제에 대한 세포 응답과 NAS의 상관관계가 결정될 수 있다. 세포 네트워크 성분들의 계산된 수준에 의해 시료를 응답자와 무-응답자로 분리되게 만드는 성분들은 특히 이들 성분들이 직접적인 수단에 의해 바로 측정가능할 경우, 치료에 대한 응답을 예측하는 직접적인 바이오마커로 이용될 수도 있을 것이다. 즉, 여기에서 설명되는 컴퓨터에 의한 모델/NAS 방식은 치료제를 이용한 치료에 대한 세포 반응을 예측하는 (계산된) 성분들의 확인하는데 이용될 수 있을 것이며, 일단 성분들이 확인되면, 응답을 예측하기 위한 직접적인 바이오마커로써 직접적으로 측정될 수 있을 것이다. 예를 들면, 여기에서 설명된 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 ErbB 신호전달 경로의 동종 및 이종이량체의 수준을 계산하고 시료를 응답자 및 무-응답자로 분리시키는 이들 이량체들은 종양 치료에 대한 응답을 예측하기 위한 직접적인 바이오마커로써 직접적으로 측정될 수 있을 것이다.
더욱이, 실시예 8에서 더 설명되는 것과 같이, 종양 시료에서 (i) HRG 및 (ⅱ) 적어도 하나의 ErbB 패밀리 수용체 (예, ErbB1, ErbB2 및 ErbB3)의 수준의 복합 측정은 ErbB 신호전달 경로의 성분을 표적으로 하는 치료제, 가령, 항-ErbB3 항체(예, Ab #6)에 대한 치료에 대한 응답에 대해 종양을 효과적으로 응답자 및 무-응답자로 분리시킨다는 것이 설명되었다. 더욱이, 실시예 10에서 더 설명되는 것과 같이, ErbB1/ErbB3 이종이량체의 수준 또는 포스포릴화된 ErbB1/ErB3 이종이량체의 수준은 ErbB 신호전달 경로의 성분을 표적으로 하는 치료제, 가령, 항-ErbB3 항체 (예, Ab #6)을 이용한 치료에 대한 응답의 직접적 마커으로 작용할 수 있다. 더욱이, 실시예 12에서 더 설명되는 것과 같이, ErbB2 단량체, ErbB2/ErbB2 동종이량체 및 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준은 ErbB 신호전달 경로의 성분을 표적으로 하는 치료제, 가령, 항-ErbB3×항-ErbB2 이중특이적 항체 (예, H3×B1D2)에 대한 치료에 대한 응답에 대해 종양을 효과적으로 응답자 및 무-응답자로 분리시킨다.
상기에서 명시한 바와 같이, 본 발명은 ErbB 신호전달 경로의 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포 반응을 예측하는 방법을 제공한다. 이와 같은 특정 방법들은 하기를 포함한다:
(a) 세포들의 시료내에서 (i) HRG 및 (ⅱ) ErbB1, ErbB2 및 ErbB3으로부터 선택된 적어도 하나의 수용체의 수준을 측정하고;
(b) 컴퓨터를 이용하여, (a)에서 측정된 수준에 근거하여 치료제를 이용한 치료에 대한 세포 반응을 예측하고, 이때, 기준과 비교하였을 때, HRG 및 적어도 하나의 수용체의 수준이 상승된 경우, 치료제를 이용한 치료에 대한 응답으로 예측된다.
특정 상황에서, HRG 및 ErbB1의 수준이 측정된다. 다른 경우에서, HRG 및ErbB2의 수준이 측정되거나 또는 HRG 및 ErbB3의 수준이 측정된다. 다른 상황에서, HRG 및 ErbB1, ErbB2 및 ErbB3으로부터 선택된 적어도 두 가지 수용체의 수준이 측정되거나 또는 HRG, ErbB1, ErbB2 및 ErbB3의 수준이 측정된다. 특정 상황에서, 다음을 포함하는 방법을 이용하여 컴퓨터에 의해 예측될 수 있다:
(a) 입력 장치를 통하여 (i) HRG 및 (ⅱ) ErbB1, ErbB2 및 ErbB3으로부터 선택된 적어도 하나의 수용체의 측정된 수준을 확인하는 입력을 제공받는 컴퓨팅 시스템, 이때 수준은 세포들의 시료내에서 측정되었으며;
(b) 컴퓨팅 시스템은 측정된 수준에 근거하여 치료제를 이용한 치료에 대한 세포의 예측된 반응을 생성시키고, 출력 장치에서 예측된 반응을 제공하며, 이때 기준과 비교하였을 때, HRG 및 적어도 하나의 수용체의 수준이 상승된 경우, 치료제를 이용한 치료에 대한 응답으로 예측된다.
응답이 예측되는 바람직한 치료물질은 항-ErbB3 항체, 좀더 바람직하게는 Ab #6 (차례로 서열 번호: 1 및 2의 VH 및 VL 서열을 가지는) Ab#6의 VH 및 VL CDR(차례로 서열 번호: 7-9 (VH CDR 1, 2, 3) 및 10-12(VL CDR 1, 2, 3)에 나타낸 서열)을 포함하는 항-ErbB3 항체를 포함한다.
ErbB 신호전달 경로의 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포 반응을 예측하는 다른 방법은 하기를 포함한다:
(a) 세포들의 시료내에서 하나 이상의 ErbB1/ErbB3 이종이량체, ErbB2 단량체, ErbB2 동종이량체, ErbB2/ErbB3 이종이량체, 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 및 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준을 측정하고;
(b) 컴퓨터를 이용하여 (a)에서 측정된 수준에 근거하여 치료제를 이용한 치료에 대한 세포 반응을 예측하는 것을 포함하고, 여기서, 기준과 비교하였을 때, ErbB1/ErbB3 이종이량체, ErbB2 단량체, ErbB2/ErbB2 동종이량체, ErbB2/ErbB3 이종이량체, 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 또는 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준의 차이는 치료제를 이용한 치료에 대한 응답을 예측한다.
다음을 포함하는 방법을 이용하여 컴퓨터로 예측이 실행될 수 있다:
(i) 입력 장치를 통하여 하나 이상의 ErbB1/ErbB3 이종이량체, ErbB2 단량체, ErbB2/ErbB2 동종이량체, ErbB2/ErbB3 이종이량체, 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 및 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 측정된 수준을 확인하는 입력을 제공받는 컴퓨팅 시스템, 이때 수준은 세포들의 시료내에서 측정되었으며;
(ⅱ) 컴퓨팅 시스템은 측정된 수준에 근거하여 치료제를 이용한 치료에 대한 세포의 예측된 반응을 생성시키고, 출력 장치에서 예측된 반응을 제공하며, 이때 기준과 비교하였을 때, ErbB1/ErbB3 이종이량체, ErbB2 단량체, ErbB2/ErbB2 동종이량체, ErbB2/ErbB3 이종이량체, 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 또는 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준이 상승된 경우, 치료제를 이용한 치료에 대한 응답으로 예측된다.
상기 방법들의 특정 구체예에서, 측정된 수준은 통계학적 분류 알고리즘으로 입력되고 알고리즘의 출력에 근거하여 치료에 대한 세포들의 반응이 예측된다. 이와 같은 추가 방법에서, 네트워크 활성화 상태 (NAS) 또는 네트워크 억제 상태 (NIS)는 ErbB 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 측정된 수준에 근거하여 계산되고; 바람직하게는 계산된 NAS 또는 NIS 값에 근거하여, 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응이 예측된다.
특정 구체예에서, 측정된 수준은 ErbB2 단량체, ErbB2:ErbB2 동종이량체 및/또는 ErbB2:ErbB3 이종이량체의 수준이며, 치료제는 상기에서 설명된 것과 같이, 항-ErbB2 항체에 링크된 항-ErbB3 항체를 포함하는 이중특이적 항체이다.
상기 방법들에서 이용하는데 바람직한 세포들은 상기에서 언급된 것을 포함한 종양 세포들이다. 시료는 종양 조직, 미세 바늘 흡인물, 젖꼭지 흡인물, 전혈, 혈청, 혈장, 림프, 타액 및 뇨 또는 이들로부터 분리된 떨어진(shed) 또는 순환 종양 세포들을 포함한다.
상기에서 명시된 바와 같이, 측정된 수준은 단백질 수준 (예, 단량체, 동종이량체 또는 이종이량체) 또는 mRNA 수준이며, 상기에서 설명된 바와 같이 일반적으로 결정될 수 있다.
상기 방법들중 임의의 것은 치료에 대한 세포의 예측 반응에 근거하여 치료 계획(예, 치료물질에 대한 치료 계획)을 선택하는 것을 더 포함할 수 있지만, 반드시 필요한 것은 아니며;/또는 예측된 반응에 근거하여 사용될 치료제를 준비하는 과정을 더 포함할 수 있다.
바람직하나의 구체예에서, 기준과 비교하여, 수준에서 차이는 상승된 수준이다. 상기 방법들은, 치료제에 대한 세포의 예측된 응답에 근거하여, 세포 또는 세포를 수득한 피험자(환자)를 치료제로 치료하는 것을 더 포함할 수 있지만, 반드시 필요한 것은 아니다.
ErbB1/ErbB3 이종이량체 및/또는 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체의 수준이 측정된 구체예에서, 응답이 예측되는 바람직한 치료제는 항-ErbB3 항체, 좀더 바람직하게는 Ab #6 (차례로 서열 번호: 1 및 2에 나타난 것과 같은 VH 및 VL 서열을 가짐) 또는 Ab #6의 VH 및 VL CDR 서열(차례로 서열 번호: 7-9(VH CDR 1, 2, 3) 및 10-12(VL CDR 1, 2, 3에서 제시된 것과 같은)을 포함하는 항-ErbB3 항체이다.
ErbB2 단량체, ErbB2/ErbB2 동종이량체 및/또는 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준이 측정된 구체예에서, 응답이 예측되는 바람직한 치료제는 항-ErbB3×항-ErbB2 이중특이적 항체, 좀더 바람직하게는 이중특이적 항체 H3×B1D2 (서열 번호: 41에 나타낸 아미노산 서열을 가짐) 또는 B1D2의 CDR (서열 번호: 48-50 및 51-53)을 포함하는 항-ErbB2 항체에 링크된, H3의 CDR (서열 번호: 42-44 및 45-47)을 포함하는 항-ErbB3 항체를 포함하는 이중특이적 항체가 된다.
수용체 동종- 또는 이종이량체의 수준 또는 포스포릴화된 수용체 동종- 또는 이종이량체의 수준은 본 기술 분야에 공지된 방법들을 이용하여 세포들의 시료내에서 측정될 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 동종- 또는 이종이량체는 U.S. 특허 No. 7,105,308, U.S. 특허 No. 7,255,999, U.S. 공개 No. 20040229380 및 U.S. 공개 No. 20080187948에서 설명된 것과 같은 이량체화 탐지 방법들을 이용하여 측정될 수 있다. 이들 방법들은 태그된(tagged) 프로브와 절단(cleaving) 프로브의 한 쌍의 프로브(예, 항체들)를 이용하는데, 이때 각 프로브는 이량체의 한 성분에 특이적으로 결합한다. 이량체에 두 개 프로브의 결합으로 이량체 복합물로부터 분자 태그가 절단되고, 방출되어, 이량체 복합물의 형성 양을 제공한다. 이와 같은 분석은 근접 기반법(proximity based methods)으로 불리는데, 이의 시판되는 이용가능한 예로는 VeraTag™ 시스템 (Monogram Biosciences)가 있다. 대안으로, 이량체 수준을 정량하는 본 기술 분야에 공지된 기타 방법들은 이량체내 성분들의 공동-면역침전, Forster 공명 에너지 전달 기반법, 생분자 형광 상보법(BiFC) (예를 들면, Tao, R.H. and Maruyama , I.N. (2008) J. Cell Sci . 121 :3207-3217)와 같은 기타 근접 기반법의 이용을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 직접적인 바이오마커 방법의 하나의 구체예에서, a)에서 측정된 수준은 컴퓨팅 시스템에 저장된 통계학적 분류 알고리즘으로 입력되고 알고리즘과 측정된 수준을 이용하여 컴퓨팅 시스템에서 데이터의 계산 및 변환에 근거한 알고리즘의 출력에 기초하여 치료에 대한 세포들의 반응이 예측된다. 또 다른 구체예에서, 네트워크 활성화 상태 (NAS) 또는 네트워크 억제 상태 (NIS)는 ErbB 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 a)에서 측정된 수준에 근거하여 계산된다. 치료제를 이용한 치료에 대한 세포 반응은 계산된 NAS 또는 NIS 값에 일부 근거하여 예측될 수 있다.
다양하나의 구체예에서, 치료제는 항-ErbB3 항체, 항-ErbB1 항체, 항-ErbB2 항체, 항-ErbB4 항체, 팬(pan)-ErbB 억제제, HER 이량체화 억제제, 및 ErbB 신호경로 소분자 억제제의 임의의 복합을 포함하며, 이들 각각은 상기에서 설명되고, 예시화되었다.
VI . 치료에 있어서 방법들의 용도
본 발명의 방법들은 다양한 광범위한 질환에 대한 치료 효과를 예측하는데 이용될 수 있는데, 이때 질환과 관련된 세포 네트워크의 하나이상의 성분들을 표적으로 하는 치료제를 이용할 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법들은 질환을 앓고 있는 피험자를 위한 치료 섭생을 선택하는데 이용될 수 있는데, 이때 방법들은 선택된 치료 섭생에 따라 피험자에게 하나 이상의 치료제를 투여하는 것을 포함하는 피험자 치료 방법을 더 포함할 수 있다. 질환의 비-제한적인 예는 암, 자가면역 질환 및 염증 질환을 포함한다.
본 발명의 방법들은 치료제를 이용한 치료에 대한 종양의 반응을 예측, 특히 컴퓨터에 의한 예측, 가령, 치료제로 치료하는데 있어서 종양을 가진 환자의 응답을 예측하는데 특히 유용하다. 예측 방법들은 방법에서 모델로 하고 있는 신호전달 경로에 의존적인 임의의 종양에 이용될 수 있다. 예를 들면, 하나의 구체예에서, 상기 방법은 ErbB 신호전달 경로 (예, ErbB3 신호전달 경로)에 의존적인 종양에 이용된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 c-Met 또는 IGF1R 신호전달 경로에 의존적인 종양에 이용된다. 바람직하나의 구체예에서, 종양은 결장암 종양이다. 또 다른 바람직하나의 구체예에서, 종양은 비-소세포 폐암(NSCLC) 종양이다. 또 다른 구체예에서, 종양은 충실성(solid) 종양이다. 또 다른 구체예에서, 종양은 비-충실성(non-solid) 종양, 예를 들면, 이와 같은 투명 세포 육종이다. 다양한 다른 구체예에서, 종양은 폐, 결장, 직장, 담낭, 뇌, 척수, 유방, 신장, 췌장, 위, 간, 뼈, 피부, 비장, 난소, 고환, 전립선, 머리 및 목, 갑상선 및 근육으로부터 선택된 조직의 종양이 될 수 있다. 다른 구체예에서, 종양은 위(gastric) 종양, 위(stomach) 종양 또는 구강/인두 종양이다.
예측 방법을 실행하기 위하여, 세포 시료, 가령, 종양 세포를 환자로부터 얻는다. 예를 들면, 종양의 바람직한 시료는 종양 조직의 시료다. 종양 조직 시료는 표준 방법들, 예를 들면, 종양의 생검 또는 종양의 외과적 절개 등의 방법에 의해 수득될 수 있다. 종양 조직의 새로 냉동된 시료가 이용되거나 또는 대안으로, 포르말린-고정된, 파라핀에 박힌 (FFPE) 조직 시료 또한 사용하기에 적합하다. 종양 조직의 또 다른 형태의 시료도 상기 방법에 사용될 수 있을 것이며, 이때 시료는 종양의 세포들 및/또는 종양에서 분비되는 세포의 성분들을 포함한다. 종양의 다른 형태의 시료의 비-제한적인 예는 미세 바늘 흡인물, 젖꼭지 흡인물, 전혈, 혈청, 혈장, 림프, 타액 및 뇨 또는 이들로부터 분리된 떨어진(shed) 또는 순환 종양 세포들을 포함한다.
바람직하나의 구체예에서, 본 발명은 치료제를 이용한 치료에 대한 세포 반응을 예측하는 방법을 제공하는데, 이때 상기 방법은 특정 치료요법적 치료에 환자의 종양의 응답할 가능성에 대해 신속한 정보를 제공하기 위하여 진단실에서 용이하고, 신속하게 실시될 수 있다. 이와 같은 예측방법에서, 새로, 냉동된 시료 또는 FFPE 보관된 조직 시료와 같은 종양 시료를 환자로부터 수득하고 종양 수용체/리간드의 수준은 반-정량적 면역조직화학(IHC)을 통하여 측정된다. 측정될 선택된 수용체 및 리간드는 치료제가 표적으로 하는 세포 네트워크에 기초한다. (예, ErbB 경로의 경우, 다음의 리간드/수용체가 측정될 수 있다: HRG, BTC, ErbB1, ErbB2 및 ErbB3). 반-정량적 IHC 측정은 환자 시료와 비교하기 위하여, 공지의 수용체 및 리간드 발현 수준과 세포 플러그 또는 이종이식편을 포함하는 기준 슬라이드를 이용하여 농도로 전환된다. 특정 상황에서, 관심있는 하나 이상의 유전자(예, PI3K, PTEN)의 돌연변이 상태는 표준 유전자형 결정(genotyping) 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 그 다음, 데이터 세트(리간드 및 수용체 농도, 및 결정된 경우, 유전자 돌연변이 상태)는 관심 대상의 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델로 입력되고, 네트워크 활성화 상태 (NAS)가 계산된다. 그 다음, 치료제에 대한 응답 예측은 응답자 및 무-응답자에 대한 NAS 역치에 대해 계산된 NAS 값을 비교한 것에 근거하여 이루어질 수 있다. 컴퓨터에 의한 모델에 단백질 농도 및 돌연변이 데이터를 입력하기 위한 웹-기반 어플리케이션을 이용, 이어서 NAS 및 예측된 반응의 출력은 치료제를 이용한 치료에 대한 종양의 응답 가능성에 대한 즉각적 정보를 진단실에서 수득하도록 한다.
여기에서 설명된 본 발명의 임의의 예측 방법들에 있어서, 상기 방법을 이용하여 치료제를 이용한 치료에 대한 세포(예, 종양 세포들)의 반응을 예측한 후, 상기 방법은 치료에 대한 세포들(예, 종양 세포들)의 예측된 반응에 근거하여 피험자에 대한 치료 섭생을 선택하는 것을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 방법들은 치료에 대한 세포들(예, 종양 세포들)의 예측된 반응에 근거하여 피험자에 대한 치료 섭생을 도시하고, 수작업으로 또는 자동적으로 추천 및/또는 선별하는 컴퓨팅 시스템을 더 포함할 수 있다. 추가로, 세포들의 예측된 응답에 기초하여 치료 섭생이 추천된 또는 선택된 후, 본 발명의 방법들은 추천된 또는 선택된 치료 섭생에 따라, 피험자를 치료하는 것을 더 포함할 수 있는데, 상기 방법은 하나 이상의 치료제를 피험자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
여기에서 세포 네트워크내 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포(예, 종양 세포들) 반응을 예측하는 키트도 또한 제공된다. 이와 같은 키트는 a) 세포 네트워크의 하나 이상의 성분을 탐지하는 분석; b) 세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 세포에 대한 네트워크 활성화 상태 (NAS) 또는 네트워크 억제 상태 (NIS)을 계산하는 명령(instruction); 및 치료제를 이용한 치료에 대한 세포 반응을 예측하기 위하여 키트에 사용되는 명령을 포함한다. 추가 구체예에서, 키트는 NAS 또는 NIS를 계산하기 위하여 통계학적 분류 알고리즘을 적용하는 명령도 더 포함할 수 있다.
세포 네트워크는 예를 들면, ErbB 신호전달 경로, c-Met 신호전달 경로 또는 IGF1R 신호전달 경로가 될 수 있다. 치료제는 이들 경로중 임의의 경로내에서 성분들을 표적으로 하는 상기에서 설명된 임의의 치료제가 될 수 있다.
하나의 구체예에서, 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 수준을 탐지하는 수단은 하나 이상의 항체 시약과 같은 성분의 단백질 수준의 탐지를 허용하는 하나 이상의 시약이다. 또 다른 구체예에서, 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 수준을 탐지하는 수단은 하나 이상의 핵산 시약(예, 핵산 프로브, PCR 프라이머, 및 이와 유사한 것들)과 같은 성분의 mRNA 수준의 탐지를 허용하는 하나 이상의 시약이다. 세포의 성분들의 단백질 또는 mRNA 수준을 탐지하기 위한 이와 같은 시약은 본 기술분야의 당업자에 잘 공지되어 있다. 수준을 탐지하는 이와 같은 수단은 단백질 수준을 측정하도록 설정된 계산 장치도 포함할 수 있다.
세포의 성분들의 단백질 수준 탐지에 적합한 분석은 여기에서 설명된 것들을 포함하는데, 예를 들면, 정량적 형광 활성화된 세포 소팅(qFACS), 효소 링크된 면역흡착 분석 (ELISA, Luminex), 면역조직화학(IHC), 정량적 면역조직화학(qIHC), 질량분석 및 Western (면역블랏) 분석을 포함한다. 세포의 성분들의 mRNA 수준 탐지에 적합한 분석은 예를 들면, 정량적 폴리메라제 쇄 반응(qPCR) 및 Northern 블랏 분석을 포함한다. 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 탐지 수단은 또한 성분들의 수준을 평가하는 분석에 이용되는 완충액 또는 기타 시약을 포함할 수 있다. 키트는 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 수준 탐지를 위한 분석을 실행하기 위한 명령(예, 라벨 또는 포장 삽입물과 같은 인쇄된 명령)을 포함할 수 있다.
바람직하나의 구체예에서, 세포 네트워크는 ErbB 신호전달 경로이며, 키트는 ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4, HRG(HRG-β1 포함), BTC, EGF, HB-EGF, TGFα, AR, EPG 및 EPR으로부터 선택된 ErbB 신호전달 경로의 하나 이상의 성분들(예, 하나 이상의 수용체, 수용체 동종이량체, 수용체 이종이량체 및 수용체 리간드)의 수준을 탐지하는 수단들을 포함한다. 좀더 바람직하게는, 키트는 적어도 하나의 ErbB 신호전달 경로 수용체 (예, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4) 및 적어도 하나의 ErbB 신호전달 경로 리간드(예, HRG, BTC, EGF, HB-EGF, TGFα, AR, EPG 및 EPR)의 수준을 탐지하는 수단들을 포함한다. 예를 들면, 하나의 구체예에서, 키트는 ErbB1, ErbB2, ErbB3, HRG 및 BTC의 수준을 탐지하는 수단을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 키트는 ErbB1 및 HRG의 수준을 탐지하는 수단을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 키트는 ErbB1, ErbB2 및 ErbB3을 탐지하는 수단을 포함한다. 다른 구체예에서, 키트는 ErbB2 단량체, ErbB2 동종이량체, ErbB2/ErbB3 이종이량체 또는 ErbB1/ErbB3 이종이량체를 탐지하는 수단을 포함한다.
세포 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여, 세포들에 대한 네트워크 활성화 상태 (NAS) 또는 네트워크 억제 상태 (NIS)를 계산하는 수단은 예를 들면, 실행가능한 명령을 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품이 될 수 있으며, 실행되면 프로세서는 세포들에 대한 NAS 또는 NIS을 계산하기 위한 오퍼레이션을 실행하도록 만든다. 대안으로, NAS 또는 NIS를 계산하는 수단은 예를 들면, 세포내 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 수준에 대한 정보가 사용자에 의해 입력될 때, 키트의 사용자는 세포에 대한 NAS 또는 NIS를 계산할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 구동시키는 인터넷-기반 서비스에 접속을 허용하는 성분이 될 수 있다. 이와 같은 성분은 예를 들면, 인터페이스, 웹페이지 및/또는 인터넷-기반 서비스 및 서비스를 이용하기 위한 인쇄된 명령과 같은 명령에 접근을 허용하는 패스워드를 포함할 수 있다. 본 기술분야에 확립된, 및 여기에서 추가로 설명된 컴퓨터 시스템 및 소프트웨어는 본 발명의 키트에 사용하기 위해 개조될 수 있다. 도 16에서 언급된 계산 장치들 및 개산 성분들은 NAS 또는 NIS를 계산하기 위한 수단, 예를 들면, 컴퓨터 프로세서, 측정 및 입력 장치 및 기타 등등의 수단을 포함할 수 있다.
치료제를 이용한 치료에 대한 세포 반응을 예측하는 키트를 사용하기 위한 명령은 컴퓨터 명령 및 컴퓨터 인터페이스, 뿐만 아니라, 인쇄된 출판물 및 매뉴얼을 포함할 수 있다. 일부 경우, 키트는 함께 포장된다. 다른 구체예에서, 키트의 다양한 성분들은 다른 위치에 유지된다. 예를 들면, 일부 성분들은 하나 이상의 원격 컴퓨팅 시스템상에 유지, 보관 또는 호스트(host)되고, 네트워크 연결을 통해서만 이용가능하다.
바람직하게는, 본 발명의 키트는 종양을 가진 인간 환자와 같은 인간 피험자에 사용하도록 고안된다. 이와 같은 경우, 세포들은 생검 또는 종양의 절개에 의해 환자로부터 수득되는 것이 일반적이다.
VⅡ . 치료 방법 및 키트
악성 종양을 가진 환자를 치료하는 방법들이 제공된다. 일반적으로, 이와 같은 방법들은 환자의 종양으로부터 시료 (예, 생검 또는 절개된 시료)를 얻고; 시료내 하나 이상의 바이오마커의 수준을 결정하고; 시료내의 바이오마커의 수준이 예정 프로파일과 일치한다면, 가령, 바이오마커의 수준이 최저 수준 이상이라면, 환자에게 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 이와 같은 방법들은 임의의 충실성 종양에 적용된다. 적합한 종양 시료는 상기에서 일반적으로 설명된 것과 같다. 특정 구체예에서, 바이오마커는 ErbB 수용체 단백질이다.
특정 구체예에서, 이와 같은 방법은 다음을 포함한다: 종양의 시료를 수득하고, 시료에서 pErbB3의 수준을 분석하고 후속적으로 적어도 하나의 항-신생물성 치료제를 환자에게 투여하고, 이때, 시료에서 결정된 ErbB3의 수준이 최저 수준보다 낮지 않는다면, 즉 무혈청 배지에서 약 20-24시간 배양후, ACHN 세포들(신장 암세포, ATCC No. CRL-1611) 배양물에서 분석된 pErbB3 수준의 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% (바람직하게는 50%)라면, 후속적으로 환자에게 투여되는 적어도 하나의 항-신생물성 치료제는 항-ErbB3 항체를 포함하고 시료에서 측정된 pErbB3의 수준이 최저 수준보다 낮다면, 후속적으로 환자에게 투여되는 적어도 하나의 항-신생물성 치료제는 항-ErbB3 항체를 포함하지 않는다. ACHN 세포들의 바람직한 배양물은 9회를 넘지 않는, 가령, 계대 8의 ACHN 세포들이 된다. 이와 같은 구체예의 추가 측면에서, 바이오마커는 pErbB3이며, 치료제는 항-ErbB3 항체이며, 최저 수준은 ACHN 이종이식편 종양 모델의 종양 세포들에서 관찰된 수준의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이다. 추가 측면에서, 최저 수준은 0.064 pg/㎍ 전체 단백질, 0.08 pg/㎍ 전체 단백질, 0.096 pg/㎍ 전체 단백질, 0.122 pg/㎍ 전체 단백질, 0.128 pg/㎍ 전체 단백질, 0.144 pg/㎍ 전체 단백질 또는 0.16 pg/㎍ 전체 단백질이다.
전술하나의 구체예에서, 시료에서 pErbB3의 수준은 특정 측면에서 a) 시료내 ErbB3 신호전달 경로의 적어도 두 가지 성분들의 수준을 측정하고; b) ErbB3 신호전달 경로의 컴퓨터에 의한 모델로 입력된 (a)에서 측정된 수준을 이용하여 시료내 pErbB3의 수준을 시뮬레이션하는 네트워크 활성화 상태 (NAS)를 계산하고; (c) 이로부터 시료에서 pErbB3의 수준을 결정함으로써 결정된다. 특정 구체예에서, ErbB3 신호전달 경로의 적어도 3개, 4개, 5개 또는 6개 성분들의 수준이 (a)에서 탐지된다. ErbB3 신호전달 경로의 적절한 성분들은 예를 들면, ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4 ( 및 ErbB 단백질의 동종- 및 이종-이량체), HRG (예, HRG-β1), BTC, EGF, HB-EGF, TGFα, AR, EPG 및 EPR을 포함한다. 이들 성분들은 단백질 (예, 단량체, 동종이량체 또는 이종이량체), 또는 이용가능한 경우(예, 포스포릴화 상태와 무관하게 단백질의 전체 수준이 측정되나, 단량체, 동종이량체 또는 이종이량체에 대한 인단백질 수준이 측정될 수 없을 때), 단백질을 인코드하는 mRNA로 분석될 수 있다. 적절한 분석법들은 본 기술 분야에 잘 공지되어 있고, 여기에서도 설명된 것들을 포함한다.
추가 측면에서, pErbB3의 수준을 결정하는 방법은 추가적으로 NAS를 계산하는데 이용된 ErbB3 신호전달 경로의 컴퓨터에 의한 모델을 만들기 위하여 통계학적 분류 알고리즘을 적용하는 것을 포함한다. 추가 구체예에서, 계산된 NAS는 시료내에서 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 및/또는 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준을 시뮬레이션한다.
본 발명에 이용되는 항-ErbB3 항체들은 국제 특허 출원 No. PCT/US2008/002119, (국제 공개 No. WO 2008/100624, 참고문헌에 통합된다)에서 개시한 항-ErbB3을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 여기에서 개시된 특히 바람직한 항체는 현재 MM-121로 알려진 것이며, 현재 임상 시험 단계 I에 있다. 바람직한항-ErbB3 항체들은 또한 상기에서 설명된 항-ErbB3 항체들을 포함한다. 여기에서 개시된 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 또 다른 항-ErbB3 항체는 U3-1287 (A㎎888) (U3 Pharma AG and A㎎en)이며, 현재 임상 시험 단계 I에 있다.
여기에서 설명된 치료를 수용할 수 있는 종양은 일반적으로 상기에서 설명된 것들이다. 예시적인 종양은 결장, 폐, 직장, 담낭, 뇌, 척수, 유방, 신장, 췌장, 위, 간, 뼈, 피부, 비장, 난소, 고환, 전립선 및 근육으로부터 선택된 기관의 종양이다. 일부 측면에서, ErbB3 양성 종양 또는 ErbB2 및 ErbB3 양성 종양 (예, 유방 종양 및 비-소세포 폐암 종양)이 바람직하다.
항-신생물성 치료제는 임의의 적절한 형태로 환자에게 투여될 수 있다. 일반적으로 치료제는 약제학적 조성물의 형태로 제공되며, 조성물은 생리학적으로 허용가능한 캐리어와 복합된 치료제를 포함한다. 원하는 경우, 다른 활성 또는 비활성 성분들이 약제학적 조성물내에 포함될 수도 있다.
여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "생리학적으로 허용가능한(physiologically acceptable)"은 연방 관리 기관 또는 주정부(예, U.S. FDA 또는 EMEA)에 의해 승인되거나 또는 동물, 특히 인간에 사용하기 위하여 U.S. 약전(Pharmacopeia)에 등재된 또는 기타 일반적으로 인지되는 약전에 등재된 것을 의미한다. 용어 "캐리어(carrier)"는 항-신생물성 치료제를 조제하고 투여할 때 함께 사용되는 희석제, 어주번트, 부형제 또는 비이클을 말한다. 생리학적으로 허용가능한 캐리어는 멸균 액체, 예를 들면 수용액이 되며, 정맥 또는 기타 장관외 투여를 위한 바람직한 캐리어가 된다. 염 용액 및 수용성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액은 주사될 수 있는 용액에 예시적인 수용성 캐리어가 된다. 적합한 약제학적 부형제는 예를 들면, 전분, 포도당, 락토즈, 슈크로즈, 젤라틴, 엿기름, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아레이트 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지우유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 및 에탄올을 포함한다. 원하는 경우, 조성물은 또한 소량의 가습제 또는 유화제, pH 완충제, 또는 보존제를 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 예방학적 및/또는 치료요법적 치료를 위하여 예를 들면, 장관외, 비강, 국부(topical), 경구 또는 경피 수단과 같은 국소 투여를 포함하는임의의 적절한 투여 방식에 따라 조제될 수 있다. 적절한 약제학적 투여 방식 및 캐리어는 "Remington : The Science and Practice of Pharmacy ," A.R. Gennaro , ed . Lippincott Williams & Wilkins , Philadelphia (21 st ed ., 2005)에서 설명되고 있다.
흔히, 여기에서 제공된 방법에 이용되는 약제학적 조성물은 장관외 투여(예, 정맥, 근육내 또는 피하 주사)로 투여된다. 장관외 투여의 경우, 항-신생물성 치료제는 캐리어에 현탁되거나 용해될 수 있다. 물, 완충된 물, 소금물 또는 인산염-완충된 염과 같은 멸균 수용성 캐리어가 일반적으로 바람직하다. 또한, 용매 또는 현탁 매질로 멸균된, 고정된 오일이 이용될 수 있다. 이와 같은 목적을 위하여, 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 부드러운 고정된 오일이 이용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사용 조성물을 준비할 때 이용된다. 생리학적 조건에 근접하도록 약리학적으로 허용가능한 보조 물질이 포함될 수 있는데, 가령, pH 조정 및 완충제, 강장성 조절 물질, 분산제, 현탁제, 습윤제, 세정제, 보존제, 국소 마취제 및 완충제가 있다.
하나의 바람직하나의 구체예에서, 약제학적 조성물은 환자 (예, 인간)에게 정맥 투여용으로 조제된다. 일반적으로, 정맥 투여 조성물은 멸균 등장성 수용성 완충액의 용액이 된다. 필요에 따라, 조성물은 용해가능한 물질을 포함할 수 있다. 성분들은 별도로 공급되거나 또는 단위 투약형, 앰플과 같은 반구형 밀봉된 용기내 동결건조된 분말 또는 물이 없는 농축물과 같이 단위 투약형내에 함께 혼합되어 공급될 수 있다. 조성물이 주입에 의해 투여될 경우, 멸균된 약제학적 등급의 물 또는 소금물을 포함하는 주입 용기내에 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여될 경우, 주사용 멸균 수 또는 소금물의 앰플이 제공되어, 성분들은 주사전에 혼합될 수 있다.
약제학적 조성물은 통상의 멸균 기술들을 이용하여 멸균되거나 여과 멸균될 수 있다. 멸균 수용액은 그대로 사용되도록 포장되거나 또는 동결건조될 수 있고, 동결건조된 준비물은 투여전에 멸균 수용성 캐리어와 복합된다. 수용성 약제학적 조성물의 pH는 일반적으로 3 내지 11, 좀더 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 및 가장 바람직하게는 7 내지 8, 가령, 7 내지 7.5가 될 것이다.
치료제는 일반적으로 환자에게 단일 투약량을 투여시 치료요법적으로 유효량을 전달하게 되는 농도에서 약제학적 조성물내에 존재한다. 치료요법적 유효량은 환자에게서 식별가능한 이익을 초래하는, 가령, 종양 성장의 지체 또는 중단 또는 바람직하게는 종양 크기의 감소를 초래하는 양이다. 치료요법적 유효량은 이용되는 항-신생물성 치료제의 활성; 환자의 나이, 체중, 전반적인 건강상태, 성별 및 식이요법; 투여 경로 및 횟수; 배출율; 약물 복합물과 같은 임의 동시 치료; 및 치료 동안 환자에서 조직 손상 유형 및 그 정도를 포함하는 다양한 인자들에 의해 영향을 받는다. 최적의 약량은 본 기술 분야에 공지된 일상적인 테스트 및 과정에 의해 확립될 수 있다. 일반적으로, 매일, 주당 또는 2주마다 한 번씩 체 중 kg당 약 1 ㎎ 내지 약 100 ㎎의 범위 약량 수준을 제공하는 조성물이 바람직하다. 적절한 약량 범위 및 섭생의 비-제한적인 예는 2-50 ㎎/kg (피험자의 체중)이 1주에 1회, 또는 2주에 1회 또는 3주에 1회 투여되고 1-100 ㎎/kg이 1주에 1회, 1주에 2회, 3일에 1회 또는 2주에 1회로 투여된다. 다양하나의 구체예에서, 치료제는 3.2 ㎎/kg, 6 ㎎/kg, 10 ㎎/kg, 15 ㎎/kg, 20 ㎎/kg, 25 ㎎/kg, 30 ㎎/kg, 35 ㎎/kg 또는 40 ㎎/kg의 약량이 1주에 1회, 1주에 2회, 3일에 1회, 2주에 1회 또는 3주에 1회로 투여된다. 추가적인 약량 범위는 1-1000 ㎎/kg, 1-500 ㎎/kg, 1-400 ㎎/kg, 1-300 ㎎/kg 및 1-200 ㎎/kg을 포함한다. 적절한 투약 일정은 3일에 1회, 4일에 1회, 7일에 1회(예, 1주에 1회), 10일에 1회, 14일에 1회(예, 2주에 1회), 21일에 1회(예, 3주에 1회), 28일에 1회(예, 4주에 1회) 및 한 달에 1회를 포함한다.
바람직하게는 치료제 (예, 항-ErbB3 항체)은 치료제 제조업자 또는 공급업자가 제공하는 처방 정보 지시에 따라 환자에게 투여된다.
악성 종양을 가진 환자의 치료에 이용되는 키트도 제공된다. 이와 같은 특정 키트는 일반적으로 다음을 포함한다: a) 시료내에 ErbB3 신호전달 경로의 적어도 하나의 성분 수준을 탐지하는 적어도 하나의 분석법; 및 b) 적어도 하나의 분석법에서 수득된 데이터와, ErbB3 신호전달 경로 입력의 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 pErbB3의 수준을 시뮬레이션하는 네트워크 활성화 상태 (NAS)을 계산하는 명령. 특정 구체예에서, 이와 같은 키트는 통계학적 분류 알고리즘을 적용하기 위한 명령을 더 포함한다. 특정 구체예에서, 키트는 또한 항-ErbB3 항체을 포함한다. 분석법은 적어도 하나의 단백질 성분 또는 적어도 하나의 mRNA 성분의 탐지를 허용하는 하나 이상의 시약을 일반적으로 포함한다. 특정 구체예에서, NAS를 계산하기 위한 명령은 실행가능한 명령을 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품의 사용을 명령하는 것을 포함하고, 컴퓨터에 의해 실행되었을 때, 프로세스는 NAS를 계산하기 위하여 연산을 실행하게 된다; 이와 같은 구체예에서, 사용자는 지역 컴퓨터상의 컴퓨터 프로그램을 작동하도록 명령을 받거나 또는 사용자는 따로 떨어져 있는 컴퓨터 프로그램을 작동하는 인터넷 기반 서비스에 접속하도록 명령을 받을 수 있다.
추가 구체예에서, 환자의 종양 생검내 pErbB3 수준이 명시된 최저 값을 초과할 경우, 환자에게 항-ErbB3 항체가 투여되어야 하고, pErbB3의 수준이 명시된 최저 값을 초과하지 못하는 경우, 항-ErbB3 항체는 환자에게 투여되지 않아야 한다는 것을 표시하는 명령(예, 라벨링의 형태, 포장 삽입물)를 포함하는 키트가 제공된다. 예를 들면, 이와 같은 명령은 시료에서 결정된 pErbB3의 수준이 무혈청 배지에서 약 20-24시간 배양후, ACHN 신장 암세포(ATCC No. CRL-1611) 배양물에서 분석된 pErbB3 수준의 50%보다 낮지 않다면, 항-ErbB3 항체가 악성 종양을 가진 환자에게 투여되어야 하며; 시료에서 결정된 pErbB3의 수준이 ACHN 신장 암세포(ATCC No. CRL-1611) 배양물에서 분석된 pErbB3 수준의 50%보다 낮다면, 항-ErbB3 항체는 악성 종양을 가진 환자에게 투여되어서는 안된다는 것을 표시할 수 있다.
VⅢ. 계산 구체예
상기에서 언급된 바와 같이, 및 이 문헌에서 제공된 설명으로부터 명백하게 할 수 있는 것과 같이, 본 발명의 많은 구체예들은 상기에서 설명하는 다양한 프로세스, 환자 반응 예측, 추천된 치료를 가져오고, 바이오마커를 확인하고, NAS 또는 NIS 값을 계산하고, 신호전달 경로의 컴퓨터에 의한 모델을 얻거나 기타 유사한 것을 포함한 프로세스를 실행하기 위하여 하나 이상의 컴퓨팅 시스템을 이용한다.
도 15a 및 15b는 본 발명의 특정 구체예를 실행하는 동안, 하나 이상의 컴퓨팅 시스템에 의해 실행될 수 있는 몇 가지 프로세스의 순서도를 설명한다. 나타낸 것과 같이, 예를 들면, 컴퓨팅 시스템은 종양의 세포 네트워크내 성분들의 수준을 측정하거나 및/또는 측정된 수준의 입력을 제공받고, 뿐만 아니라 종양 유전자들의 돌연변이 상태를 측정하거나 및/또는 측정된 수준의 입력을 제공받는데 이용될 수 있다. 컴퓨팅 시스템은 컴퓨터에 의한 모델을 수득하는데 이용될 수 있는데, 이 모델은 예를 들면, 지역적 및 멀리있는 소스로부터 컴퓨터에 의한 모델을 제공받고, 다운로드하고, 구축하고, 변형시키고, 훈련시키고 및/또는 접근함으로써 수득된다.
일단 컴퓨터에 의한 모델이 수득되면, 하나 이상의 컴퓨팅 시스템은 세포에 대한 NAS 또는 NIS를 계산하는데, 예를 들면, 세포내에서 포스포릴화된 단백질, 동종이량체 및/또는 이종이량체의 관련 수준을 시뮬레이션함으로써 계산한다. 컴퓨팅 시스템에 의해 컴퓨터에 의한 모델은 컴퓨팅 시스템에서 제공받은 사용자 세팅에 기초하여, 세포 네트워크내 추가적인 관련 성분들의 확인을 통하여 예측 바이오마커를 확인하는데 이용될 수도 있다.
컴퓨팅 시스템은 또한 확인 프로세스의 일부로써 컴퓨팅 시스템에 의해 수용, 구축 및/또는 변형될 수 있고 치료에 대한 예측된 환자 반응을 생성하거나 및/또는 권장된 치료를 만들고 선택하기 위하여 NAS 또는 NIS 데이터, 기타 바이오마커 데이터, 및 환자 데이터와 복합되어 이용되는 통계학적 분류 알고리즘을 확인하는데 이용될 수 있다.
도 15a 및 15b의 순서도에서 설명된 요소들은 본 발명의 계산 프로세스를 실행하기 위하여 제안된 순서를 말하는 것이지만, 도 15a 및 15b에서 설명된 프로세스는 상이한 순서로 실행될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들면, 추천된 치료는 컴퓨터에 의한 모델을 만들기 전 또는 NAS 또는 NIS를 계산하기 전에 확인될 수 있으며, 컴퓨터에 의한 모델을 구축하는데 이용될 수 있다. 유사하게, 단백질 수준의 측정은 컴퓨터에 의한 모델의 생성 전후에 일어날 수 있다.
본 발명의 일부분으로 추가적인 프로세스가 실행될 수 있어, 따라서, 본 발명은 순서도에 설명되는 프로세스를 포함하는 방법에만 국한되지 않음을 인지할 것이다. 예를 들면, 본 발명은 환자 정보(예, 나이, 성별, 병력)를 얻는 프로세스, 및 추천된 치료의 실제 결과를 추적하는 프로세스 및 기타 프로세스를 포함할 수 있다.
본 발명의 프로세스를 실행하는데 이용되는 컴퓨팅 시스템은 상이한 유형 뿐만 아니라 다른 곳에 있는 하나 이상의 상이한 컴퓨팅 시스템을 포함할 수 있다.
도 16은 본 발명의 특정 측면을 실행하는데 이용되는 컴퓨팅 시스템의 하나의 예를 설명한다(예를 들면, 도 15a 및 15b에서 설명되는 일부 프로세스 및 이 문헌에서 설명되는 것을 포함). 설명된 것과 같이, 컴퓨팅 시스템은 다양한 입력 장치, 출력 장치, 계산 모듈, 프로세싱 성분들 및 저장 매체를 포함한다. 입력 장치는 키보드, 마우스 장치, 터치 패드, 터치 스크린, 마이크로폰 뿐만 아니라 임의의 기타 입력 장치를 포함할 수 있다. 출력 장치는 스피커, 디스플레이 스크린, 프린트 장치, 스위치 뿐만 아니라 기타 출력 장치를 포함한다. 계산 모듈은 컴퓨터에 의한 모델을 수용하고, 구축하기 위한 모듈, NAS 또는 NIS를 계산하기 위한 모듈, 예측 바이오마커를 확인하기 위한 모듈, 성분들의 측정된 수준을 수득, 인지 및 저장하기 위한 모듈 및 돌연변이 유전자 상태를 확인하고 결정하는 모듈, 통계학적 분류 알고리즘을 확인하고 적용시키는 모듈, 치료에 대한 예측된 반응을 생성시키는 모듈, 추천된 치료를 생성시키고, 선택하는 모듈, 사용자와 하나 이상의 기타 장치들에 접속하는 통신 모듈 뿐만 아니라, 여기에서 설명된 다양한 기타 프로세스를 실행하는 모듈을 포함하여, 이 문헌에서 설명되는 기능을 실행하는데 필요한 다양한 모듈을 포함한다.
컴퓨팅 시스템은 전술한 모듈을 실행하는데 필요한 하나 이상의 프로세스와 기타 프로세싱 성분들 뿐만 아니라 다양한 데이터 구조, 컴퓨터에 의한 모델, 및 여기에서 설명된 기타 데이터를 저장하기 위한 저장 매체도 포함한다. 저장 매체는 컴퓨팅 시스템에 근접한 것으로 설명되어 있지만, 컴퓨팅 시스템과 떨어져 위치하거나 또는 컴퓨팅 시스템에 오로지 부분적으로 근접하게 위치될 수도 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들면, 일부 경우에, 저장 매체는 다수의 상이한 컴퓨팅 시스템에서 공유하고 다수의 컴퓨팅 시스템에 위치한 저장 공간을 포함하는 광범위하게 분포된 저장 장치를 나타낸다. 저장 매체는 지속적인 메모리와 휘발성(volatile) 메모리의 임의 복합을 포함할 수 있다.
도 16은 측정 장치, 멀리 위치한 컴퓨터, 원격 서비스 및 원격 네트워크를 포함하는 하나 이상의 기타 장치들에 네트워크적으로 연결될 수 있다는 것을 설명한다. 일부 경우, 이와 같은 하나 이상의 기타 장치는 여기에서 설명하는 하나 이상의 프로세스를 실행하고, 다중 분포된 컴퓨팅 시스템 및 장치를 포함하는 분산된 네트워크 환경에서 일부 방법의 실행된다.
전술한 측면에서, 다양한 상이한 계산 형상에서 본 발명의 범위가 실행된다는 것을 인지할 것이다.
IX . 실시예
본 발명은 다음의 비-제한적 실시예를 통하여 더 설명된다. 여기에서 언급된 미국, 국제 특허 또는 기타 특허 또는 특허 출원 또는 공개 모두는 여기 참고문헌에 통합된다.
실시예 1 : Ab #6을 이용한 이종이식편 효과 연구: 훈련 데이터 세트
이 실시예에서, 4가지 이종이식편 종양 모델을 이용하여 항-ErbB3 항체 Ab #6을 이용한 치료에 응답하는 종양 세포계를 확인하였다. 연구된 4가지 이종이식편 종양 모델은 상이한 징후를 나타낸다: MALME3M (흑색종 암 세포계; ATCC No. HTB-64), ADRr (난소 암 세포계; NCI-60, 포괄적(cosmic) 시료 ID No. 905987), ACHN (신장 암 세포계; ATCC No. CRL-1611) 및 DU145 (전립선 암 세포계; ATCC No. HTB-81). 하기에서 더 상세하게 설명되겠지만, MALME3M 및 ADRr 이종이식편은 Ab #6을 이용한 치료에 반응을 보이지 않은 반면, ACHN 및 DU145 이종이식편은 Ab #6 치료에 반응을 보였다.
이종이식편 종양 모델에서, 마우스(nu/nu 마우스: 3-4 주령의 암컷 마우스, T-세포 결핍; 무작위교배계; Albino 배경; Charles River Labs , Wilmington , MA)에게 피하 주사를 통하여 200 ㎖에 마우스당 3.5 106~3×108 개의 세포(세포계에 따라)를 우측 옆구리에 이식한다. 초기 종양 성장에 대해 마우스를 모니터한다. 종양 세포들은 종양 용적이 대략 200㎣가 될 때까지 몇 일간 성장할 수 있도록 둔다. 종양 용적은 V=(π/6 (L×W2)으로 계산된다. 마우스는 3일마다(qd3) 주사당 600㎍ 약량의 Ab#6 항체로 치료받는다. 대조군 생쥐는 인산염 완충된 염(PBS)으로 치료된다.
종양 용적은 60-80일간 측정된다. 종양 성장에서 항체 치료의 효과에 대한 결과(상기에서 설명되는 방법 또는 이의 약간의 변화된 방법으로 수득된 결과들)는 도 1a-1d에 나타낸 그래프에 요약되어 있으며, 이들 도면에서 Ab #6으로 치료하면 DU145 및 ACHN 이종이식편 모델에서 종양 성장이 억제되었지만, ADRr 및 MALME3M 이종이식편 모델에서 Ab#6 항체를 이용한 치료는 종양 성장을 억제하지 못하였다(PBS 대조군과 비교하여).
Ab #6에 대한 종양 응답의 측량으로, 최상의 실험 데이터로 설명되는 지수( exponential) 성장 속도가 측정된다. 다음의 식을 이용하여 지수 성장을 설명한다.
V=V0 *exp(k*t)
여기서, V는 종양 용적 ㎣을 나타내고, V0는 0시간 대에 종양 용적으로 나타내고, k는 지수 성장 속도를 나타내고, t는 일수(시간)을 나타낸다.
상이한 이종이식편 연구에서 성장 감소를 비교하기 위하여, 성장 속도 감소(GRR) 값은 테스트되는 각 세포계에 대해 계산되며, 이는 다음의 식을 이용하여 PBS 대조군에서 관찰된 성장 속도에 대해 Ab #6 존재시의 관찰된 성장 속도와 관련된다:
성장 속도 감소 = 1 - (Ab #6 성장 속도 kAb #6)/(PBS성장속도 kPBS)
테스트된 4가지 세포계의 GRR 값(상기에서 설명되는 방법 또는 이의 약간의 변화된 방법으로 수득된 결과들)은 하기 표 1에 요약하였다. 네가티브 성장 속도 감소의 경우, GRR 값은 0으로 설정된다.
[표 1]
Figure pct00002
결과에 따르면, 4가지 이종이식편은 Ab #6 치료에 대하여, ADRr 및 MALME3M 세포들은 반응이 없으며, ACHN는 중간-범위의 응답을 나타내고, DU145 세포들은 Ab #6 치료에 대해 최고의 응답을 나타내는 응답 범위를 가지는 것을 알 수 있다.
실시예 2 : 이종이식편에서 종양 세포 용해물내 pErbB3 수준은 Ab #6 응답과 관련있다.
본 실시예에서는, 실시예 1에서 연구된 4가지 종양 세포계, MALME3M, ADRr, DU145 및 ACHN 각각에서 단기 약역학적(pharmacodynamic: PD) 연구에서 포스포릴화된 ErbB3 (pErbB3)의 농도는 생체내에서 측정되었다. OvCAR8 이종이식편 또한 본 실험에 포함되었다(이 이종이식편은 하기 실시예 5에서 설명된 Ab #6 치료에 응답을 보인다)
MALME3M, ADRr, DU145, OvCAR 8 및 ACHN 세포들은 배양물에서 생장되고, 이식을 위해 수거된 후(15×15cm 플레이트, ~80% 합류, 세포들의 전체 수 = 2-4×108), 및 이식전까지 얼음위에 둔다. 세포(대략 2×107개 세포들/마우스)를 20마리 마우스의 우측 옆구리(피하 주사, 200㎖ 세포/주사/마우스)에 이식하고, 그 다음 마우스들은 초기 종양 성장을 모니터하는 동안 회복되도록 둔다. 디지털 칼리퍼 측정에 의해 종양이 측정된다(L×W). 일단 마우스의 종양 용적이 100㎣에 도달되면, C02 질식에 의해 마우스를 마취시키고, 각 마우스로부터 종양을 절제하여, 액화 질소에 재빨리 냉동시킨다. 냉동된 종양 조직 시료는 생화학 분석을 위하여 -80℃에 보관된다. 종양 용해물내에 포스포릴화된 ErbB(pErbB3)의 양은 ELISA에서 R&D Systems Human pErbB3 ELISA 키트(Catalog #DYC1769)를 이용하여 측정된다. 시료 준비와 ELISA 프로토콜은 하기에서 더욱 상세하게 설명된다.
시료 준비 및 단백질 추출을 위하여, 우선 냉동된 종양을 분쇄하여 가루로 만들고, 미리-무게가 측정된 2 ㎖ VWR 냉동튜브(VWR International)로 이동시킨다. 가루가 된 시료의 무게를 측정하고, 기록한다. 시료 무게를 계산한 후, 최종 농도가 62 ㎎/㎖ 되도록 얼음-냉각된 용해 완충액 적정량을 각 튜브에 첨가한다. 시료는 저속에서 간단하게 볼텍스하고, 회전시키면서 4℃에 항온처리한다.
미정제 종양 용해물은 Qiagen Qiashredder으로 옮기고, 시료의 추가 균질화를 위하여 8분간 12000 rpm에서 원심분리시킨다. 맑아진 용해물은 새로운 튜브로 옮긴 후, BCA 단백질 분석을 위하여 각 용해물 소량을 취한다. 나머지 용해물은 한방울씩 취하여 추가 ELISA 분석을 위하여 -80℃에 보관한다.
BCA 단백질 분석 키트 (Pierce, Catalog # 23225)를 이용하여 전체 단백질을 정량화시키기 위하여, 우선 BCA 카트에서, 2 ㎎/㎖ 원액 농도에서 출발하여 2 ㎎/㎖ BSA 표준 용액을 이용하여 소 혈청 알부민(BSA) 8 포인트 표준 곡선을 준비한다. 키트에서 시약 A와 B를 혼합(50:1)하고 원액 종양 용해물을 PBS을 이용하여 3배 및 5배 희석액을 준비한 후, 20㎕ 의 BSA 표준 또는 희석된 종양 용해물 시료 및 160㎕의 작업(working) 시약을 96웰 플레이트 각 웰에 첨가한다. 플레이트는 20분간 37℃에서 항온처리된다. OD562가 판독되고, 종양 용해물내 전체 단백질의 양은 BSA 표준 곡선을 이용하여 계산된다.
pErbB3 ELISA를 실행하기 위하여, PBS를 이용하여 상이한 캡쳐(capture) 항체를 키트 (R&D Systems DYC1769)에서 권장하는 작업 농도로 희석시킨다. 블랙 96-웰 플레이트(Nunc Maxisorb)를 희석된 캡쳐 항체로 피복시킨 후, 모든 플레이트는 하룻밤 동안 실온(RT)에서 항온처리된다. 플레이트는 Bio Tek 플레이트 워셔 상에서 PBST (PBS + 0.05% Tween-20)으로 3회 세척되고, RT에서 2시간 동안 200 ㎕의 1% BSA/PBST에서 차단된다.
표준 곡선을 위한 재조합 단백질은 키트에서 권장하는 최대 농도와 전체 11 포인트에 대해 2배 희석액으로 준비된다. 플레이트는 PBS로 3회 세척되고, 100 ㎕ 의 종양 용해물이 첨가된 후 2 시간 동안 RT에서 항온처리된다. 그 다음, 플레이트는 PBST로 3회 세척되고, 100 ㎕의 1차 탐지 항체(PBS/0.1% BSA/0.05% Tween-20에서 작업 농도로 희석됨)가 첨가된다. 플레이트는 추가 2시간 동안 RT에서 항온처리된다. 최종적으로, 100 ㎕의 혼합된 SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, Catalog # 37069)를 각 웰에 첨가한 후, 플레이트를 판독한다.
도 2는 Ab #6으로 처리된 이종이식편에서 관찰된 성장 속도 감소(상기에서 설명된 방법 또는 약간 변형된 방법을 이용하여 수득됨, %)에 대해 미처리 이종이식편 종양(pg/㎍ 종양 용해물)에서 pErbB3의 농도를 플롯팅한 그래프이다. 도 2는 단기 약역학 연구에서 측정된 구성 pErbB3와 종양 성장 속도 감소 사이에 양호한 상관 관계가 있다는 것을 설명한다. Ab #6 치료에 응답하지 않는 MALME3M 및 ADRr 이종이식편은 최저 수준의 pErbB3을 가지며, 반면 Ab #6 치료에 응답하는 ACHN, OvCAR8 및 DU145 이종이식편은 상당히 더 높은 수준의 pErbB3을 가진다. 이 결과는 종양 세포들에서 pErbB3의 수준은 항-ErbB3 항체 치료에 대한 종양 세포의 응답과 충분한 상관 관계가 있다는 것을 설명한다.
실시예 3 : pErbB3 및 pAKT 수준은 냉동되는 시간에 대한 함수로 감소한다.
본 실시예에서, pErbB3 및 pAKT의 안정성이 평가되었고, 뿐만 아니라, 종양 용해물에서 ErbB1, ErbB2 및 ErbB3의 발현 수준이 종양 냉동으로부터 부활 후 시간에 대한 함수를 평가하였다.
미처리 ACHN 및 EKVX 이종이식 생쥐는 CO2 질식을 통하여 마취시키고, 종양을 잘라내어, 4조각으로 자른 후, 상이한 시간(0분, 10분, 30분 및 60분)대에 액화 질소에 넣는다. 그 다음, 해동 후 각 시료에서 pErbB3 및 pAKT의 수준, 뿐만 아니라 ErbB1-3 수준을 측정한다. 상기 방법 또는 약간의 수정된 방법을 이용하여 수득된 결과는 도 3a-3e에서 나타낸 막대 그래프에 요약되어 있는데, 도 3a 및 3b는 ACHN 용해물에서 pErbB3와 pAKT의 수준을 차례로 보여주며, 도 3c, 3d 및 3e는 EKVX 용해물에서 ErbB1, ErbB2 및 ErbB3의 수준을 차례로 보여준다.
도 3a 및 3b에서 볼 수 있는 것과 같이, 10분 시료내 pErbB3 및 pAKT 수준은 0분 시점의 시료의 것과 비교하였을 때 이미 측정가능할 정도의 감소가 있었다. 기준 시료(종양의 즉각적 냉동, 0분 시료)와 비교하였을 때, 30 분 시점의 시료에서 pErbB3에 대한 40% 농도 감소가 관찰되었고 기준과 비교하였을 때, pAKT에서 20% 농도 감소가 관찰되었다. 대조적으로, EKVX 및 ACHN 종양 세포 용해물에서, ErbB1-3의 전체 수준은 일정하게 유지되었고, 냉동되기 까지의 시간에 영향을 받지 않았다(도 3c-3e 참고). 따라서, 종양 시료내 인단백질의 관찰된 불안정성 및 전체 단백질의 관찰된 안정성은 종양 세포 용해물에서 직접적으로 수준을 측정하는 것보다는 ErbB3의 포스포릴화 수준을 계산하는 것이 유리하다는 것을 설명한다. 이와 같이 pErbB3의 계산된 수준은 실시예 4에서 설명된 것과 같이 구축된 기계적인 컴퓨터에 의한 모델을 이용한 다음의 실시예에서 네트워크 활성화 상태 (NAS)로 지칭된다.
실시예 4 : ErbB 신호전달 경로의 기계적인 컴퓨터에 의한 모델의 구축 및 훈련
다음의 실시예에서, 신호 변환 경로의 기계적인 컴퓨터에 의한 생화학 모델을 설명한다. ErbB 신호에 대한 문헌 지식에 근거하여, 수용체에 대한 리간드의 결합을 설명하는 단백질-단백질 상호작용, 이량체화, 수용체 내화(internalization) 및 분해 뿐만 아니라 PI3K 캐스캐이드를 유도하는 어뎁터 분자 Gab1의 결합을 포함하는 기계적인 컴퓨터에 의한 모델이 개발되었다. 도 4a는 실행되는 ErbB 신호 네트워크를 그림으로 설명한다. 컴퓨터에 의한 모델은 질량 작용 역학을 이용한 비-선형 상미분방정식(ODEs) 세트다. 도 4b는 신호전달 경로로부터 생화학 반응 세트이며, 도 4c는 유동 세트를 나타낸다. 생화학 반응 및 유동은 도 4d에서 설명되는 것과 같은 비-선형 ODE 세트로 전환된다. 일반적으로, 단백질 농도 ci의 변화 상태는 방정식 1에서 나타낸 것과 같이 단백질의 생산 속도(v 생산 )에서 단백질의 소비 속도(v 소비 )를 뺀 것과 같다:
Figure pct00003
다음의 실시예에서 Ab #6 에 대한 반응을 예측하는데 이용되는 컴퓨터에 의한 모델은 4가지 수용체 (ErbB1-4) 모두와 Akt 신호 변환 캐스캐이드를 포함하는 포유류 ErbB 네트워크로 구성된다.
ErbB 수용체는 세포외 리간드 결합 도메인들, 세포내 티로신 키나아제 도메인 및 신호를 보내는 비계(scaffold)로 작용하는 세포질 꼬리를 가진 단일-패스 타입 I 막통과 수용체이다. ErbB1 및 ErbB4는 리간드 결합 및 티로신 키나아제 활성에 완전한 기능을 하지만, ErbB2는 임의의 공지의 리간드에 결합하지 않고, 대신 이량체화-준비 신호 증폭기로 기능을 한다(Klapper , L.N. et al .(1999) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 96 :4995-5000). ErbB3는 손상된(crippled) 키나아제 도메인을 가지고(Guy , P.M. et al .(1994) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91 :8132-8136) 따라서, 촉매 활성이 결핍되어, 다른 ErbB 수용체에 의해 포스포릴화될 때 신호를 변환시킨다. 공지의 13가지 ErbB 리간드중에서, BTC 및 HRG는 최대의 ErbB3 포스포릴화 수준을 유도하는 리간드로 이행된다. 공지의 13가지 ErbB 리간드는 세 가지 군으로 나뉠 수 있다: (i) ErbB1에 특이적으로 결합하는 군, 가령, EGF, 형질변환 성장 인자 알파 (TGFα), 및 암피레굴린 (AR), (ⅱ) ErbB1 및 ErbB4 모두에 이중 특이적 결합을 나타내는 군, BTC, HB-EGF, EPG 및 EPR을 포함, 및 (ⅲ) 뉴레굴린(NRGs), 이는 두 가지 하위군으로 나뉘는데: NRG1 (GGF2, SMDF 또는HRG으로 알려지기도 함)은 ErbB3/ErbB4에 결합하고, NRG2와 일부 성질을 공유하며, ErbB4에만 결합되는 NRG3/NRG4. 리간드 결합이후, 수용체는 이량체화되고, 세포질 꼬리에 있는 잔기에서 포스포릴화를 겪고, 이에 의해 Shc, Grb2, GAP, Sos, 및 PI3K와 같은 SH2 함유 어뎁터 분자의 도킹 부위가 만들어진다. ErbB1는 이의 세포질 꼬리에 적어도 티로신 포스포릴화 부위 20개를 가지는데, 이중 12개는 SH2 함유 어뎁터 단백질 및 효소의 파트너로 기획된다. (Schulze , W.X. et al .(2005) Mol . Syst . Biol . 1 :2005-2008). 기타 ErbB 수용체들은 동등한 전사후 복합체 변형을 겪는다. Grb2 및 PI3K와 같은 수용체-연합된 어뎁터는 RAS를 활성화시키고 결국 ERK 및 AKT를 활성화시킨다. AKT는 ErbB3상에 있는 다중 부위에 PI3K-p85의 직접적인 결합을 통하여 RAS-독립적인 방식으로 활성화될 수도 있다.
컴퓨터에 의한 다수의 모델이 공개되었지만(예, Kholodenko , B. N. et al.(1999) J. Biol . Chem . 274 :30169-30181; Hatakeyama , M. et al .(2003) Biochem. J. 373 :451-463; Resat , H. et al .(2003) Biophys . J. 85:730-743; Hendriks, B. S. et al .(2005) J. Biol . Chem . 280 :6157-6169); Sasagawa , S. et al.(2005) Nat . Cell . Biol . 7 :365-373; Birtwistle , M. R. et al .(2007) Molecular Systems Biology 3:144), 여기에서 이용된 컴퓨터에 의한 모델은 좀더 광범위하고, 4가지 ErbB 수용체 모두와 두 가지 별개 리간드 (HRG 및 BTC)를 포함하며, 기존 반응들에 기초한 질량 작용 공식의 엄밀함은 유지된다.
문헌에서 설명된 ErbB1/1, ErbB1/2, ErbB1/3, ErbB1/4, ErbB2/2, ErbB2/3 및 ErbB2/4의 7가지 ErbB 이종이량체 및 동종이량체는 모델에서 실행되었다. 이들 이량체의 대부분은 리간드 결합에 의해 활성화되지만, 몇 가지는 "측면 신호발생(lateral signaling)" (또는 2차 이량체화)의 프로세스를 통하여 발생되며, 이때, 리간드-의존적 방식으로 포스포릴화된 이량체는 단량체로 분리되고, 활성 이량체를 만들기 위하여 활성화된 또는 비활성화된 단량체와 동종 또는 이종-올리고머화된다. 컴퓨터에 의한 모델은 ADRr 세포주를 이용하여 HRG 또는 BTC 존재하에 형성되는 이량체를 확인할 수 있는 일련의 실험 데이터로 훈련되었다.
컴퓨터에 의한 모델은 추정되거나 측정되어야만 하는 두 가지 타입의 변수(초기 종의 수 및 속도 상수)를 요구하는 비-선형 상미분방정식에 기반을 둔 것이다. 모델 교정(calibration) 전에, 가령, 이들의 고유 수용체에 대한 리간드의 결합 상수와 같은 가능한 많은 변수의 값들이 문헌에 기재된 정보에 근거하여 명시되어야 한다. qFACS 분석을 이용하여, ErbB 수용체의 발현 수준은 본 출원에 이용된 모든 세포계에서 정량화된다. 더욱이, ELISA는 BTC 및 pErbB3의 수준을 정량화하는데 이용된다. 또한, HRG-β1의 mRNA 수준은 ZR-75 세포계(ATCC No. CRL-1500)의 mRNA 수준과 비교하여 결정되었다. 컴퓨터에 의한 모델에서 이용되는 정보인 수용체 및 리간드 발현 수준은 하기 표 2에 요약하였다. 이들 발현 수준을 얻는 방법은 하기에서 더 상세하게 설명된다.
종양 세포계는 National Cancer Institute으로 부터 구하였다. 모든 세포계는 5% CO2, 95% 대기의 가습 환경에서, 37℃에서 완전 배지: RPMI-1640 배지(Gibco)+ 10% 태아 송아지 혈청(FCS)(Hyclone), 2mM L-글루타민(Gibco) 및 units/mL Pen-Strep(Gibco)에서 단층 배양물로 성장된다.
수용체의 발현 수준은 qFACS에 의해 수용체 발현의 정량화를 허용하는Quantum Simply Cellular Kit 816A(Bangs Laboratories)를 이용하여 정량화된다. 키트는 염소 항-인간 IgG+ 블랭크(blank) 집단의 양을 다양하게 하면서 라벨된 4개 미소구 집단을 포함한다. 비드 표면에 콘쥬게이트된 IgG는 IgG 항체의 Fc 부분에 특이적이다. 비드는 세포 시료와 유사하게 동일한 항체로 착색된다. 상이한 각 미소구 집단은 공지의 양의 라벨된 단클론성 항체에 결합한다. 할당된 항체 결합 능력(ABC) 값에 대해 각 집단의 형광 강도를 플롯팅함으로써, 표준 ABC 곡선이 만들어지고, 착색된 세포 시료의 ABC는 Bangs Laboratories (QuickCal v 2.3)에서 제공되는 소프트웨어를 이용하면 바로 결정된다. 이 프로그램은 이용되는 도구의 구성, 시료에 대한 전압 및 이용된 형광 색소를 고려한다.
BTC 발현 수준은 R&D Systems Dy261 DuoSet-IC 인간 베타셀룰린 키트를 이용하여, ELISA에 의해 측정된다. 384 웰 플레이트는 4 ㎍/㎖ 캡쳐 항체로 피복된다. 384 웰 플레이트는 50 ㎕의 2% BSA/ 1×PBS (Tween-20 없음)를 첨가하여 1시간 동안 차단시키고, 재조합 표준 곡선을 만든다. 플레이트를 세척한 후, 16 ㎕의 세포 용해물을 첨가하고, 항-포스포-티로신-HRP (말 래디쉬 과산화효소(radish peroxidase)) 탐지 항체를 첨가한 후 2시간 동안 항온처리한다. 끝으로, 20 ㎕의 Pico 발광 기질을 첨가하고, 플레이트를 분광광학적으로 판독한다.
HRG-β1 단백질 발현 수준를 측정하기 위한 상업적으로 이용가능한 분석들은 검사되는 세포계에 대하여 신뢰성있는 데이터를 수득할 정도로 충분한 감도가 없기 때문에, 관심 세포계에 대해 HRG-β1 mRNA 수준을 정량화한다. RNeasy Mini 프로토콜(74104 RNEASY 키트, QUIAGEN)을 이용하여 세포 용해물로부터 RNA를 분리시킨다. 분리된 RNA를 cDNA로 전환시키고 Applied Biosystems 430443 7 Tagman Master mix를 이용하여 정량 PCR(QPCR)을 위하여 마스터 믹스를 만든 후, QPCR를 실행하여 ZR75-1 세포내 mRNA 수준에 비교하여 HRG-β1 mRNA 발현을 정량화한다. QPCR을 위한 프라이머는 Applied Biosystems에서 구입한다.
표 2에 나타낸 상이한 세포계에 대한 ErbB3 포스포릴화 수준은 상기 실시예 2에서 설명된 방법들 또는 약간 변형된 이들 방법에 따라 R&D의 pErbB3 ELISA 키트 (Dyc1769-2 DuoSet-IC 인간 포스포-ErbB3)를 이용하여 결정한다.
표 2는 상기에서 설명된 방법들 또는 이들 방법의 약간의 변형을 이용하여 상이한 세포계에서 수득된 수용체 및 리간드 발현 수준 정보를 요약한 것이며, 이들 정보는 ErbB 신호전달 경로의 컴퓨터에 의한 모델 구축에 이용되었다. 컬럼 1은 세포계 이름을 보여준다; 컬럼 2는 종양 타입을 나타낸다; 컬럼 3-5는 ErbB1, ErbB2 및 ErbB3에 대해 차례로 세포당 수용체의 수를 나타낸다; 컬럼 6은 ZR-75 세포들에서 mRNA 수준과 비교하여 배수로 표현된 HRG-β1 mRNA 수준을 나타내며; 컬럼 7 및 8은 세포들에 존재하는 BTC 및 pErbB3의 양을 (pg/세포)로 나타낸 것이다.
[표 2]
Figure pct00004
컴퓨터에 의한 모델을 훈련시키기 위하여, 약량-시간 매트릭스로 구성된 데이터 세트를 이용하는데, ADRr 세포들에서, 다양한 시간대 및 9가지 상이한 농도의 BTC 또는 HRG 시뮬레이션에서 ErbB1, ErbB2, ErbB3 및 AKT의 포스포릴화가 ELISA에 의해 측정된다. 세포의 시뮬레이션을 위하여, 96웰 조직 배양 플레이트에 웰당 35,000개 세포로 100 ㎕ 완전 배지에 세포를 접종시키고, 5% CO2, 95% 대기 및 37℃의 가습 대기에서 하룻밤동안 배양시켰다. 세포를 무혈청 배지로 옮긴다: RPMI-1640 배지 (Gibco) +2 mM L-글루타민(Gibco) 및 units/mL Pen-Strep (Gibco). 시뮬레이션하기 전, 5% CO2, 95% 대기 및 37℃의 가습 대기에서 20-24 시간동안 굶주린 세포를 항온처리하였다. 약량-시간 매트릭스 연구를 위하여, 0분, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 7분, 10분, 20분, 30분, 60분 및 120분에 리간드(BTC 또는 HRG)로 세포를 시뮬레이션시킨다. 각 시간 일정에 대해 9가지 상이한 농도의 HRG (0.038 nM-250 nM) 및 BTC (0-700 nM)로 시뮬레이션한 후, 세포들을 얼음 위에 두고, 냉각 PBS로 세척시키고, 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma-Aldrich, P2714), 1mM 오르소바나데이트 나트륨(Sigma-Aldrich, S6508), 5mM 피로포스페이트 나트륨(Sigma-Aldrich, 221368), 50mM 옥소페닐아르신(EMD Biosciences, 521000) 및 10μM bpV(phen) (EMD Biosciences, 203695)이 보충된 30 ㎕ 냉각 M-PER 포유류 단백질 추출 완충액(Mammalian Protein Extraction Buffer) (Thermo Scientific, Catalog # 78501)에 용해시켰다.
시뮬레이션된 세포내 단백질 포스포릴화 수준은 ELISA에 의해 측정된다. ErbB1 (R&D Systems, AF231), ErbB2 (R&D Systems, MAB1129), ErbB3 (R&D Systems, MAB3481) 및 AKT (Upstate, 05-591 MG)에 대한 캡쳐 항체들은 384 웰 블랙 편평-바닥 폴리스트렌 고 결합 플레이트(Corning, Catalog # 3708)에 실온에서 하룻밤 동안 항온처리되었다. ELISA 플레이트는 2% 소 혈청 알부민(BSA) 및 포스페이트 완충된 염(PBS)으로 1시간 동안 차단시키고, 그 다음 2% BSA, 0.1% Tween-20 및 PBS으로 희석된 용해물로 실온에서, 2시간 동안 항온처리되었다. 각 항온처리 사이에, 플레이트는 0.05% Tween-20/PBS로 3회 세척되었다. 포스포-ErbB1, -ErbB2 및 -ErbB3를 측정하기 위한 ELISA는 2시간 동안 포스포-티로신 말 래디쉬 과산화효소(HRP) 링크된 단클론성 항체 (R&D Systems, HAM1676)와 함께 항온처리된다. 포스포-AKT를 측정하는 ELISA는 2시간 동안 세린 473 특이적 항-포스포 AKT 마우스 단클론성 1차 항체 (Cell Signaling Technologies, Catalog # 5102)와 함께 항온처리되고, 그 다음 Streptavidin-HRP (R & D Systems, Catalog#, DY998)과 함께 30분 동안 항온처리된다. 모든 ELISA는 SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, Catalog # 37069)으로 시각화되며, 발광 시그날은 발광계측기를 이용하여 측정된다.
도 5a-5b에서는 상이한 시간대 및 9가지 상이한 BTC 또는 HRG 농도에서 단백질 포스포릴화의 데이터 세트에 대한 결과(상기에서 설명된 방법 또는 이를 약간 변형시킨 방법을 이용하여 얻은)를 나타내며, 여기서 도 5a는 HRG-시뮬레이션된 세포에 대한 포스포-ErbB3, 포스포-ErbB2, 포스포-ErbB3 및 포스포-AKT의 수준을 나타내고 도 5b는 BTC-시뮬레이션된 세포들에 대한 포스포-ErbB3, 포스포-ErbB2, 포스포-ErbB3 및 포스포-AKT의 수준을 나타낸다. 이 데이터 세트는 ErbB 신호전달 경로의 컴퓨터에 의한 모델을 측정하는데 이용되었으며, 시뮬레이션 결과(선)은 도 5a-5b에 나타낸 실험 데이터(점)를 설명한다.
ErbB 수용체 신호 발생 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델 개발에 추가 정보는 아래에 제공된다:
모델 구조
ErbB 수용체 신호발생 네트워크 모델은 3가지 수용체(ErbB1, ErbB2, ErbB3), 수용체 포스파타제, 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 (PI3K, 이는 수용체에 결합함) 및 PI3K-AKT 캐스캐이드 성분들(포스파티딜이노시톨 바이포스페이트, PIP2, 포스포이노시티드-의존적 단백질 키나아제, PDK1, 염색체 10으로부터 결손된 PTEN, PTEN, 세린, 트레오닌 단백질 키나아제-단백질 키나아제 B로도 알려짐, AKT, 단백질 포스파타제 2A, PP2A) (하기 표 8 참고)로 구성된다. 두 가지 ErbB 수용체 리간드가 포함된다: ErbB3 및 ErbB4에 결합되는 헤레굴린(HRG1-β)(세포계에서 실험적으로 ErbB4의 발현 수준은 탐지하기가 매우 어렵기 때문에 모델에는 포함되지 않음)(하기 표 3 참고) 및 ErbB1에 주로 결합되는 베타셀룰린 (BTC)(Beerli , R.R. and Hynes, N.E. (1996) J. Biol . Chem . 271 :6071-6076; Jones , J. T. et al .(1999) FEBS Lett . 447 :227-231). 아래 표 11에서 완전하게 열거된 질량-작용 역학은 Matlab Simbiology 2.3 (Mathworks, MA)을 이용하여 상미분방정식(ordinary differential equations)으로 변환되었다.
모든 동종- 및 이종이량체에 대해 문헌에서 설명된 것과 같이, 리간드 유도된 이량체화, 내화, 리사이클링 및 분해가 모델에 포함되었다(Hendriks , B.S. etal.(2003) J. Biol . Chem . 278 :23343-23351; Wang , Z. et al .(1999) Mol . Biol . Cell 10 :1621-1636). Shankaran , H. et al .(2008) Biochem . Biophys . Res . Commun. 371 :220-224에서 공개된 것과 같이 상대적인 스케일을 이용하여 수용체 이량체 안정화가 실행되었는데, ErbB1와 ErbB2 또는 ErbB3의 공동 발현은 세포 표면으로 신호 발생을 편향시키고, 신호 하향 조절을 늦추고 ErbB1-3의 동시 공동 발현은 ErbB2-ErbB3 이종이량체를 풍부하게 하였다. 따라서, ErbB3 함유 이량체는 내화되고, ErbB1 동종이량체 또는 ErbB1-ErbB2 이종이량체 보다 더 느리게 분해된다. 구성적 이량체화 또한 포함되지만, 리간드-없는 이량체는 임의의 하류 신호발생을 촉발하지 않고(Yu , X. et al .(2002) Mol . Biol . Cell 13 :2547-2557) 및 세포 표면에 남아있는 것으로 추정되었다. ErbB 리간드는 ErbB 동종- 및 이종이량체에 상이한 친화력으로 결합하지만(Teramura , Y. et al .(2006) EMBO J. 25 :4215-4222), 측정해야할 역학 변수의 수를 감소시키고, 가능한 가장 간단한 모델로 실험 데이터를 설명하기 위하여, 우리는 ErbB동종- 및 이종이량체에 대해 리간드의 동일한 결합 친화력의 리간드로 강제하였다.
이량체화된 수용체는 신속하게 포스포릴화되며, 수용체 세포질 꼬리상에 있는 포스포티로신 부위에 신호 발생 어뎁터의 결합을 통하여 하류 경로를 활성화시킨다(Yarden Y. and Sliwkowski , M.X. (2001) Nat . Rev . Mol . Cell . Biol .2:127-137). 여기서, 단순화된 PI3K-AKT 캐스캐이드가 실행되었고, 이에 의해 PI3K는 리간드 결합된 이종이량체에 직접적으로 결합하고, PIP2를 활성화시켜, AKT의 2단계 이중 포스포릴화를 유도하는 PDK1 와 AKT의 복합체가 형성된다. ErbB3는 PI3K 결합에 대해 6개 부위를 가지는 반면, 다른 ErbB 수용체들은 한 개만을 가진다(Wallasch , C. et al .(1995) EMBO J. 14 :4267-4275; Soltoff , S. P. et al .(1994) Mol. Cell . Biol . 14 :3550-3558). 6개 PI3K 분자들이 동시에 ErbB3에 결합할 수 있는지는 아직 모르지만, PI3K는 다른 수용체들 보다는 ErbB3에 의해 10-20배 더 강력하게 활성화된다(Fedi , P. et al .(1994) Mol . Cell . Biol . 14 :492-500). 다른 ErbB 수용체들보다 더 큰 친화력으로 ErbB3에 PI3K가 결합한다는 또 다른 증거가 있다(Jones , R.B. et al .(2006) Nature 439 :168-174). 우리는 이들 현상을 모델에 통합시켰고, ErbB3 함유 이량체상에 다음과 같은 조건을 부과함으로써 6개 결합 부위를 포함하는 복합적인 복잡성을 피하였다: 강화된 PI3K 결합 속도; PI3K에 대한 강화된 PIP2 결합 속도, 및 PIP3의 강화된 활성화 속도. PIP2는 엔도좀에 존재하지 않고(Haugh , J.M. (2002) Mol . Interv . 2:292-307), 따라서, 혈장-막 결합된 수용체 이량체만 모델에서 PIP2를 활성화시킬 수 있다. 처음 시뮬레이션은 AKT 활성화를 너무 느리게 가속화시켜, 시뮬레이션 전, AKT 포스파타제를 거의 완전하게 비활성화시킬 필요가 있고, 여러부분에서 설명된 현상인, AKT가 자체 포스파타제를 활성화시켜 네가티브 피이드백 루프를 통합시킨다(Camps , M. et al .(1998) Science 280 :1262-1265). MAPK 캐스캐이드는 단순할 뿐만 아니라 AKT 신호발생이 MAPK 캐스캐이드의 종 및 변수에 상대적으로 둔감하다는 최근 발견 때문에 무시되었고(Chen , W.W. et al .(2009) Mol . Syst . Biol . 5 :239); 따라서, AKT 신호발생 역학을 설명하기 위하여 MAPK-PI3K 혼선(cross talk)은 요구되지 않는다. 초기 종(species) 값은 문헌으로부터 추정되어 바로 측정되거나(ErbB 수용체, PDK1, AKT)(Birtwistle , M.R. et al .(2007) Mol . Syst . Biol .3:144; Hatakeyama , M. et al .(2003) Biochem . J. 373 :451-453) 또는 무한-속도 제한 값으로 설정되었다.
모델 교정( Model Calibration )
우리가 연구했던 세포 시스템에서 많은 반응 속도 변수들이 아직 알려지지 않고 있어, 측정되어야만 한다. (표 10 참고). 출발 점에 편향되는 것을 피하기 위하여, 모든 변수들은 디폴트 값으로 설정되었다(Aldridge , B. B. et al .(2006) Nat . Cell. Biol . 8 :1195-1203). 측정된 변수들의 수는 두 단계 측정으로 실행되어 제한되었다; 우선, 모델은 실험적으로 관찰된 ErbB 수용체 포스포릴화 데이터에 대해 교정되었다; 둘째, AKT 포스포릴화에 민감한 변수들은 실험 데이터에 대해 최적화되었다. 집단 크기가 50 내지 25 세대인 유전적 알고리즘을 이용하여 다중 변수 런(multiple parameter runs)하에 변수들이 강제된 경우에만 예측된 값이 수용되었다. (Mathworks , MA). HRG1-β 및 BTC의 리간드 결합 속도 상수는 두 가지 리간드에 대한 1×105M-1s-1의 대략적인 포워드 결합 속도에 대한 초기 약량 반응 곡선과 공지의 KdS를 이용하여 별도로 측정되었다(Tzahar , E. etal .(1996) Mol . Cell . Biol. 16 :5276-5287; Singer , E. et al .(2001) J. Biol . Chem . 276 :44266-44274; Jones, .T. et al .(1999) FEBS Lett . 447 :227-231). HRG1-β 또는 BTC 자극과 ErbB1, ErbB2, ErbB3, 및 AKT 포스포릴화의 활성화에 강력하게 영향을 주었던 변수들을 확인하기 위하여 감응도 분석(Mathworks , MA)이 실시되었다(하기 표 11 참고). 시스템이 1 nM의 HRG1-β 또는 BTC으로 자극받는 동안 각 변수들은 별도라 변화되는 것이 허용되었다. 각 종의 표준화된 감응도는 두 시간 자극 동안에 통합되었고 임의 역치 1000보다 더 큰 표준화된, 통합된 감응도를 가진 변수들은 하기 표 11에 열거되어 있다. 상기에서 언급된 바와 같이, ErbB4 포스포릴화는 변수 평가에 포함되어 있지 않는데, 그 이유는 연구된 세포계는 ErbB4를 거의 간신히 탐지하였기 때문이다(하기 표3 참고). ErbB4 반응은 ErbB3 반응에 대해 파라미터로 나타내었다.
ErbB 수용체 포스포릴화 프로파일은 이량체화, 내화, 리사이클링 및 분해 변수(효소적 분해, 이량체 해리 및 포스파타제 속도 상수는 감응성이 없다)에 감응성이 있었다. 이들 변수들은 고밀도 데이터세트를 이용하여 피트되었다. 각 리드아웃(readout)은 각 리간드의 상대적인 효능을 보존하는 리간드에 의해 수득된 최대 활성화에 대해 표준화되었다. ErbB 수용체 이량체화 속도는 매우 억제되어, 변수 상관 관계는 문헌 발견과 유사하게 관찰되었다: ErbB2는 리간드 결합된 ErbB1 또는 ErbB3에 대해 바람직한 이량체화 짝이다(헤레굴린 자극으로 좀더 두드러지며). 이용가능한 데이터로부터, 리사이클링 및 내화 속도를 모두 억제하는 것은 불가능하였고; 따라서 리사이클링 속도는 0.005s-1 로 설정되었으며, 내화 속도만 피트되었다: 따라서 결과 관찰은 리사이클링 속도에만 동등하게 적용된다(역수). 내화 속도는 리간드 자극에 기초하여 변화되었으며, HRG1-β 결합된 이량체는 BTC 결합된 동종- 및 이종이량체보다 훨씬 느린 내화를 보였다(Sorkin , A. and Goh , L.K. (2008) Exp. Cell Res . 314 :3093-3106). 분해 속도 또한 억제되었지만, 모든 이량체에 대해 유사하여, 관찰된 데이터를 설명하는데 개별 이량체 분해 속도가 요구되지는 않는다는 것을 알 수 있다. 포스포릴화된 AKT는 PI3K 캐스캐이드내에서 및 수용체 수준에서 많은 변수들에 민감하다(아래 표 11 참고). 따라서, 우리는 PI3K-AKT 캐스캐이드내에 있는 및 AKT 포스포릴화의 시간 곡선에 대해 훈련된 모델 변수로 계산을 한정시키고, ErbB 수용체 프로파일상에 이미 훈련된 변수들 값은 고정시켰다.
모델 훈련(training)후, 각 변수들의 영향을 판독하고, 추가 개선이 가능한지를 결정하고 변수들을 생물학적으로 타당한 값으로 제한시키기 위하여, 변수들의 국소적, 수작업 조정을 실행하였다. 표준화를 위하여, 변수 유형에 걸쳐 보존되었을 때 유사한 값으로 집약되었다(분해 속도에서 설명된 것과 같이).
억제제 이행
공지의 작용 기전의 가장 간단한 해석을 이용하여 ErbB 네트워크 억제제들은 모델에 포함되었다(하기 표 12 참고): 항-ErbB3 단클론성 항체 Ab #6는 리간드 결합을 방해함으로써 ErbB3를 격리시키고, 내화 및 분해를 유도하였다; 세투시맙는 ErbB1를 격리시키고 리간드 결합을 저지시켰으며; 라파티닙는 ErbB 수용체들의 활성를 억제시켰지만 이량체화 또는 리간드 결합은 억제시키지 않았으며; 페르투주맙은 ErbB2 이량체화를 차단시킨다. Ab #6의 경우, Kinexa에 의해 측정된 속도 상수가 이용되며, 다른 억제제의 경우에는 문헌에서 보고되고(Wood , E.R. et al .(2004) Cancer Res . 64 :6652-6659; Patel , D. et al .(2007) Anticancer Res . 27 :3355-3366; Adams , C. W. et al .(2006) Cancer Immunol . Immunother . 55 :717-727) 및 하기 표 13에 열거된 속도 상수들이 이용되었으며; 세투시맙 변수들은 Kinexa에 의해 실험적으로 확인되었다.
ErbB 신호전달 경로의 컴퓨터에 의한 모델 개발에 이용된 다양한 추가 정보는 다음과 같이 표 3-13에 제시된다:
[표 3]
Figure pct00005
[표 4]
Figure pct00006
[표 5]
Figure pct00007
[표 6]
Figure pct00008
[표 7]
Figure pct00009
[표 8]
Figure pct00010
[표 9]
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[표 10]
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[표 11]
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[표 12]
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[표 13]
Figure pct00026
Figure pct00027

실시예 5: pErbB3 의 활성화의 예측 마커들의 선별
본 실시예에서, pErbB3에 의해 나타낸 것과 같이, ErbB3 활성화를 예측하는 단백질 마커들은 실시예 4에서 설명된 것과 같이 ErbB 신호전달 경로의 기계적인 컴퓨터에 의한 모델에 의해 확인되었다.
ErbB3 포스포릴화 수준은 종양 반응 속도와의 상관 관계를 설명하기 위하여, 실시예 2에서 설명되었기 때문에, 감도 분석은 ErbB3 포스포릴화의 수준을 결정하는 주요 단백질을 확인하기 위하여 훈련된 컴퓨터에 의한 모델에서 실시되었다.
이와 같은 국소 감응도 분석에서, 세포들은 ErbB 신호전달 경로를 활성화시키는 리간드인 0.4nM의 HRG 또는 BTC로 실질적으로 컴퓨터에 의해 가상적(in silico)으로 자극되었다. 다음의 세포 수용체, 키나아제 및 기타 단백질들에 대한 pErbB3의 감응도가 결정되었다: ErbB3, ErbB2, ErbB1, PI3K, PIP2, PTEN, PDK1, PP2A, AKT, RTKpase 및 리간드 (BTC 및 HRG).
국소 감응도 분석은 경로내 단백질 농도 및 역학 변수들의 변화에 반응하여 출력에서의 변화를 측정하는 수학적 도구이다. j th 속도 상수(k j )에서 변화에 대하여 i th 관측가능한 c i (t)의 완전히 표준화된 감응도 (s ij (t))는 다음의 식으로 제공된다:
Figure pct00028
감응도 분석에서 확인된 초기 단백질 농도와 변수들을 변화시킴으로써 실험 데이터와 시뮬레이션 결과 사이의 간격을 최소화시킨 국소적 및 전체적 최적화 방법들(유전적 알고리즘, 시뮬레이션된 어닐링, Levenberg-Marquardt 최적화)을 이용하여 모델 교정이 실행되었다.
국소 감응도 분석 결과는 도 6의 막대 그래프에 요약되어 있다. 결과에서, 다음의 5가지 단백질들; 즉 ErbB1, ErbB2, ErbB3, HRG 및 BTC이 ErbB3의 활성화 (예, pErbB3의 형성)를 예측하는 주요 마커들이라는 것을 나타낸다.
실시예 6 : pErbB3 수준을 계산하기 위한 기계적인 컴퓨터에 의한 모델의 사용
컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 pErbB3을 예측하기 위한 주요 마커으로써 ErbB1, ErbB2, ErbB3, HRG, BTC이 확인된 실시예 5에서 얻은 결과에 기초하여, 표 2에서 나타낸 단백질 발현 수준의 측량을 상이한 종양 세포계에 있어서 pErbB3 수준을 계산하기 위하여 컴퓨터에 의한 모델에 입력으로 이용하였다.
컴퓨터에 의한 모델에 BTC 및 HRG의 발현 수준 입력은 크기 단위 또는 pg/㎍를 농도[M]로 전환시켜야 한다. 따라서, 전환 인자들을 확립할 필요가 있다. HRG mRNA 수준 및 BTC 단백질의 발현 수준을 몰 농도로 전환시키는 전환 인자들은 실험적으로 측정된 pErbB3 수준과 예측된 pErbB3 수준 사이의 선형 범위에서 외삽되었다. 실험적으로 측정된 값에 대하여, 구성적 ErbB3 포스포릴화 수준 (pg/㎍)은 10 % 태아 소 혈청(FBS)에서 4가지 세포계 (MALME3M, DU145, ADRr 및 ACHN)에서 측정되었다. 이들 실험적으로 측정된 결과들은 실시예 4, 표, 컬럼 7에 나타낸다. 리간드 전환 인자 훈련(training)을 위하여, 시간에 대해 통합된 표준화된 예측된 pErbB3 시그날은 6.1e-005의 BTC 전환 인자 및 3.1e-013의 HRG mRNA 전환 인자를 이용하여, 시험관에서 10% FBS에서 실험적으로 측정된 pErbB3에 대해 플롯되었다. 리간드 전환 인자들은 세포계 ADRr, MALME3M, ACHN 및 DU145에서 예측된 pErbB3과 측정된 구성적 pErbB3 수준 (ELISA에 의해) 사이에 선형 관계를 최적화시켜 훈련되었다.
따라서, HRG 및 BTC에 의한 경로 활성화는 계산된 pErbB3 수준에 의해 나타낸 것과 같이, 모델 및 네트워크 활성화 상태 (NAS)를 이용하여 시뮬레이션된되었고, 출력으로 수득되었다. 이 경우, NAS는 HRG 및 BTC의 첫 두 시간 자극에 대해 모델에서 시뮬레이션된 시간-통합된 pErbB3의 양으로 정의되었다. 계산된 pErbB3 수준에 대한 결과는 도 7의 그래프에 나타낸다. ADRr 세포에 대한 시뮬레이션된 NAS는 Ab #6 치료에 대한 응답자와 무-응답자 간에 역치로 처음 설정되었고, 이종이식편 모델에서 테스트된 4가지 세포계이후, ADRr 세포계는 최대 pErbB3 수준에서도 무-응답자였다.
실시예 7: 이종이식편 반응을 이용하여 NAS 역치 설정 및 NAS 역치에 근거한 응답 예측
본 실시예에서, 실시예 1에서 설명된 4가지 종양 세포계에 대한 이종이식편 반응은 실시예 6에서 설명된 것과 같이 계산된 NAS 값 (표준화된, 시간-통합된 pErbB3 수준)과 복합되어, Ab #6 치료에 대한 응답자에 대한 NAS 역치와 Ab #6 치료에 대한 무-응답자의 NAS 역치를 설명하였다.
좀더 특이적으로, ADRr, ACHN, DU145 및 MALME3 세포계 (실시예 1에서 추가 설명된)에 대해 결정된 성장 속도 감소 (GRR) 값은 ADRr 세포들에서 pErbB3의 수준보다 큰 pErbB3 수준을 가진 것을 "응답자"로 설정하고 (예, pErbB3> pErbB3(ADRr)), "무-응답자"는 ADRr 세포들에서 pErbB3 수준보다 적은 pErbB3 수준을 가진 것으로 설정하여(예, pErbB3< pErbB3(ADRr)), 계층화 훈련을 위한 이원체 출력으로 전환되었다. 이것은 모델 예측이 아니라 계층화 훈련(stratification training) 프로세스의 일부분이라는 것을 밝혀둔다.
4가지 세포계에 대해, 실험적으로 결정된 GRR 값은 계산된 NAS 값 (표준화된, 시간-통합된 pErbB3)에 대해 플롯되었다. x-축상에 GRR 값은 응답자 (pErbB3 > pErbB3(ADRr))와 무-응답자 (pErbB3 < pErbB3(ADRr))로 나뉜다. NAS 훈련(training) 데이터 (실시예 4에서 설명된 것과 같이 수득된)는 네트워크 활성화 상태를 세가지 범주로 분할을 허용하였다: 시뮬레이션된 응답자("SimR"), 시뮬레이션된 무-응답자("SimNR") 및 시뮬레이션된 중간자("SimI"). 두 가지 이종이식편 세포계(DU145, ACHN)는 20% 이상의 성장 속도 감소 값으로 특징화되고, 이중에서 DU145 세포계는 최저의 네트워크 활성화 상태를 가졌다. 결과적으로, 세포계를 시뮬레이션된 응답자로 분류하기 위한 역치는 ADRr 수준 이상의 또는 이와 동등한 수준으로 설정되었다. 유사하게, MALME3 세포계 이종이식편은 무-응답자 (pErbB3 < pErbB3(ADRr))였고, 따라서, ADRr 수준보다 낮은 세포계의 네트워크 활성화 상태s은 시뮬레이션된 무-응답자로 분류되었다. ADRr 및 DU145 역치 사이의 네트워크 활성화 상태s는 시뮬레이션된 중간자로 분류되었다.
계산된 pErbB3 수준에 의해 표시된 것과 같이, 네트워크 활성화 상태는 HRG, BTC, ErbB1, ErbB2 및 ErbB3의 실험적 측량이 이용가능한 15가지 세포계의 패널에 대해 시뮬레이션된다. 15개 세포들에 대해 계산되고 통합된 pErbB3 수준은 도 8a에서 볼 수 있는 것과 같이 막대 그래프에서 4개 훈련 세포계에 대한 수준과 함께 최대치부터 최저치 pErbB3 수준으로 플롯되었다. 이들 15개 세포계에 대한 계산된 NAS 값은 4개 훈련 세포계 ADRr, ACHN, DU145 및 MALME3M에 대해 미리 결정된 NAS 값에 대해 정렬되었다. 총 19개 세포계에 대한 NAS 결과는 도 8b에 나타낸 그래프에서 볼 수 있는 것과 같이 정렬되어있다. MALME3M 세포계와 동등한 또는 그 이하의 NAS 값은 시뮬레이션된 무-응답자 ("Sim NR")로 설정되었으며, MALME3M 및 DU145 세포계 사이의 NAS 값은 시뮬레이션된 중간자("Sim I")로, 및 DU145 세포계와 동등한 또는 그 이상의 NAS 값은 시뮬레이션된 응답자 ("Sim R")로 설정되었다. 따라서, 도 8b에서 설명된 것과 같이, IGROV1 (NCI-60, 포괄절(cosmic) 시료 ID No. 905968), MDA-MB-361 (ATCC No. HTB-27), SKMEL-5 (ATCC No. HTB-70), MDA-MB-231 (ATCC No. HTB-26) 및 T47D (ATCC No. HTB-133) 세포계는 시뮬레이션된 무-응답자로 예측되었는데, 이들의 계산된 NAS 값이 MALME3M의 것보다 아래에 있기 때문이다. 더욱이, ZR75-1 (ATCC No. CRL-1500), HOP92 (NCI-60, 포괄적(cosmic) 시료 ID No. 905973) 및 HOP62 (NCI-60, 포괄적(cosmic) 시료 ID No. 905972) 세포계는 시뮬레이션된 중간자로 예측되었는데, 이들의 계산된 NAS 값은 ADRr 및 DU145 사이에 있기 때문이다. 끝으로, SKBR3 (ATCC No. HTB-30), UACC62 (NCI-60, 포괄적(cosmic) 시료 ID No. 905976), EKVX (NCI-60, 포괄적(cosmic) 시료 ID No. 905970), BT474 (ATCC No. HTB-20), SKOV3 (ATCC No. HTB-77), OVCAR8 (National Cancer Institute, Division of Cancer Treatment and Diagnostics에서 수득됨) 및CAKl1 (NCI-60, 포괄적(cosmic) 시료 ID No. 905963) 세포계는 시뮬레이션된 응답자로 예측되었는데, 이들의 계산된 NAS 값은 ADRr 보다 크기 때문이다.
이와 같은 모델 예측을 테스트하기 위하여, 생체내에서 세 가지 추가적인 이종이식편 연구가 실행되었다. IGROV1, OVCAR8 및 SKOV3 세포계는 실시예 1에서 설명된 것과 같이 실행된 이종이식편 연구에 이용되었으며, 이때 마우스는 3일마다 600 ㎍의 Ab #6으로 치료되거나 또는 기준은 PBS로 치료되었다. 시간에 따른 종양 용적(㎣)의 변화로 결정된 것과 같이, 이종이식편 반응은 도 9a-9c에 그래프로 요약되어 있다. 다시, 각 세포주에 대한 성장 속도 감소 (GRR)는 다음의 식을 이용하여 계산되었다:
성장 속도 감소 = 1 (Ab #6 성장 속도)/(PBS 성장 속도)
하기 표 14에는 4가지 세포계에 대한 GRR 값을 요약하였다:
[표 14]
Figure pct00029
각 세포계에 대한 Ab #6 응답 예측에 있어서, 이종이식편 응답자는 ADRr에 대해 시뮬레이션된 pErbB3보다 더 큰 수준의 시뮬레이션된 pErbB3 수준을 가져야 한다는 기준에 근거하여, IGROV1 이종이식편은 무-응답자로 분류되었고, 반면, OVCAR8 및 SKOV3 이종이식편은 응답자로 분류되었다.
이들 데이터는 계산된 NAS 값에 기초하여 만들어진 예측이 생체내 이종이식편 연구에서 Ab #6 치료에 대한 3가지 테스트 세포계의 실험적으로 관찰된 응답에 정확하게 대응된다는 것을 설명한다. 좀더 특이적으로, IGROV1 세포계는 이의 계산된 NAS 값에 근거하여 시뮬레이션된 무-응답자로 예측되었고 이의 GRR 값에 근거하여 실험적으로 무-응답자로 관찰되었다. 유사하게, OVCAR8, 및 SKOV3 세포계는 이들의 계산된 NAS 값에 근거하여 시뮬레이션된 응답자로 예측되었고 이들의 GRR 값에 근거하여 실험적으로 응답자로 관찰되었다..
따라서, 이들 실험은 생체내에서 Ab #6 치료에 대해 응답으로 예측된 것과 같이, 컴퓨터에 의한 모델의 효과와 및 표준화된 시간-통합된 pErbB3 수준의 계산된 NAS 값의 효과를 확인하였다.
실시예 8: Ab #6 응답에 대한 직접적인 바이 오마커의 확인
본 실시예에서, 실시예 1에서 설명된 이종이식편 연구에서 검사된 4가지 세포계(ADRr, ACHN, DU154, MALME3M)에 대해 수득된 데이터와 실시예 7에서 설명된 이종이식편 연구에서 검사된 세 가지 세포계 (IGROV1, OVCAR8 및 SKOV3)는 Ab #6 응답에 대한 직접적인 바이오마커로 확인될 수 있는 지를 결정하기 위하여 추가 검사되었다.
우선, ErbB1, ErbB2 및 ErbB3에 대한 수용체 농도에 의해 이종이식편 데이터가 응답자와 무-응답자로 효과적으로 분류되었는 지를 검사하였다. 도 10a-10d의 그래프에서 설명된 것과 같이(그래프에서 한 수용체의 log 농도는 하나 이상의 다른 수용체들의 로그 농도에 대해 플롯됨), ErbB1 수용체 측량만이 이종이식편 데이터를 응답자와 무-응답자로 분류시키는 것으로 보이며, 다른 수용체들은 이러한 분류를 시키지 못하였다.
그 다음, 하나의 수용체 농도(예, ErbB1, ErbB3)와 복합하여 HRG 농도는 이종이식편 데이터를 응답자와 무-응답자로 분류시키는지를 검사하였다. 도 11의 그래프에서 설명된 것과 같이(그래프에서 HRG의 log 농도는 ErbB1의 로그 농도에 대해 플롯됨), 이들 두 가지 농도 측량, HRG 및 ErbB 수용체 중 하나는 이종이식편 데이터를 응답자와 무-응답자로 정확하게 분류시킬 수 있었다. 좀더 특이적으로, 세 가지 무-응답자 MALME3, ADRr 및 IGROV1에 대한 데이터는 6가지 응답자에 대한 데이터로부터 분리가능하였으며, 따라서 무-응답자와 응답자의 분류가 허용되었다.
따라서, Ab #6 응답에 대한 직접적인 바이오마커들은 ErbB 경로 수용체 중 하나(예, ErbB1, ErbB3)와 복합하여 HRG로 확인되었다.
하기 표 15에는 예측을 위하여 Ab #6에 대하여 직접적인 바이오마커를 이용하여 실시예 7에서 연구된 세포계에 대한 예측된 응답자 및 무-응답자가 요약되어 있다. 직접적인 바이오마커를 이용하여 결정된 예측은 NAS 값을 이용하여 결정된 예측(실시예 7에서 설명된 것과 같은)과 잘 대응되었다. 예를 들면, ACHN, DU145, OVCAR8 및 SKOV3 세포계는 NAS 값을 이용하였을 때 응답자로 이미 확인되었는데, 직접적인 바이오마커를 이용하였을 때 역시 응답자로 예측되었다. 유사하게, ADRr, MALME3M 및IGROV1 세포계는 NAS 값을 이용하였을 때 무-응답자로 이미 확인되었는데, 직접적인 바이오마커를 이용하였을 때 역시 무-응답자로 예측되었다.
[표 15]
Figure pct00030
응답자와 무-응답자를 분리하기 위하여 NAS를 이용한 실시예 7의 결과와 분리를 위하여 직접적인 바이오마커를 이용하여 실시예 8의 결과를 비교하면, 유일한 차이는 BT474, MDA-MB-231 및 UACC62 세포계에 있었다. 두 가지 별개의 분류 방법간에 약간의 차이가 있다는 것은 놀라운 것이 아니다. 이와 같은 상황에서, 환자 계층화에서 긍정 오류(false positives)는 부정 오류(false negatives)보다 우위에 있기 때문에, 논쟁의 되는 세포계는 응답자로 간주된다.
실시예 9: ELISA 및 qIHC 에 의해 이종이식편 및 인간 종양 사이에서 단백질 발현 수준 비교
본 실시예에서, 인간 종양에서 관찰된 단백질 발현 프로파일과 비교하여 이종이식편에서 관찰된 단백질 발현 프로파일에서 유사성 또는 차이점이 평가되었다. 이와 같은 평가는 이종이식편에서 관찰된 단백질 수준과 인간 종양에서 관찰된 단백질 수준이 필적가능한지를 결정하기 위하여 실행되었다.
첫 번째 실험에서, 단백질 발현 수준은 ELISA에 의해 측정되었다. 실질적으로 실시예 2에서 설명된 것과 같이, 인간 종양 시료 또는 이종이식편의 급속 냉동 종양으로부터 용해물이 준비되고 실시예 2에서 설명된 것과 같이, ErbB1-4, HRG-β1 및 BTC에 대한 단백질 수준은 ELISA로 분석되었다. 결과(상기에서 설명된 방법 또는 이의 약간의 변형된 방법에 의해 수득된)는 도 12a-12c의 그래프에 플롯되어 있다. 결과는 이종이식편 시료에서 단백질 수준에 대해 수득된 값은 상이한 조직 기원의 인간 종양 시료내 단백질 수준에 대해 수득된 값과 상당히 점철(interspersed)되어 있었다는 것을 설명하고, 이는 이종이식편에서 관찰된 단백질 수준이 인간 종양에서 관찰된 단백질 수준과 필적된다는 것을 나타낸다. 이들 데이터에 근거하여, 이종이식편에서 응답 예측을 위하여 결정된 NAS 역치는 인간 종양 조직 시료를 이용하여 응답자를 예측하는데 적용될 수 있다고 단언할 수 있다.
냉동된 조직 시료를 임상적 세팅에서 수득하기 어렵기 때문에, 두 번째 실험은 포르말린 고정된 및 파라핀에 박힌(FFPE) 시료에서 단백질 정량화가 허용되는 측량 기술을 이용하여 실행되었다. 좀더 특이적으로, 정량적인 면역조직화학(qIHC)은 AQUA®시스템 (HistoRx , Inc ., New Haven , CT)을 이용하여 실행되었다. 면역형광 및 대표적인 단백질 발현 수준과 세포계 패널을 이용하여, 세포계 표준 곡선이 준비되었다. 세포계 표준 곡선은 종양 시료 및 이종이식편에서 단백질 발현 수준의 후향 연산(back-calculation)을 허용하였다. 결과는 도 13a-13d에 나타내고 있다. 도 13a 는 ErbB1에 대한 세포계 표준 곡선을 나타낸다. 도 13b, 13c 및 13d는 이종이식편 세포계 (적색 막대) 및 인간 종양 시료(청색 막대)에서 차례로 ErbB1, ErbB2 및 ErbB3의 qIHC 수치를 플롯팅한 막대 그래프이다. qIHC 결과는 인간 종양 시료 및 이종이식편 시료 사이의 단백질 발현 수준의 유사성을 설명하였는데, 광범위한 단백질 발현 수준에 걸쳐있다. 이 결과들은 다시 이종이식편에서 응답의 예측을 위하여 측정된 NAS 역치가 인간 종양 조직 시료를 이용하여 응답자를 예측하는데 적용될 수 있을 것이라는 주장을 뒷받침한다.
실시예 10: 포스포릴화된 이종이량체에 대한 응답 상관 관계
본 실시예에서, 포스포릴화된 ErbB 동종- 및 이종이량체의 통합된 수준은 Ab #6 치료에 대한 응답과 관련되는지를 결정하기 위하여 NAS 값으로 계산되었다.
실시예 4에서 설명된 것과 같이 준비된 동일한 컴퓨터에 의한 모델이 이용되었다. 이 모델은 ErbB1, ErbB2, ErbB3, HRG-β1 및 BTC의 수준에 대해 실험적으로 결정된 측량에 기초하여 생성되었다. 실시예 4에서 논의된 것과 같이, 문헌에서 설명된 것과 같은 7가지 ErbB 이종이량체 및 동종이량체 즉, ErbB1/1, ErbB1/2, ErbB1/3, ErbB1/4, ErbB2/2, ErbB2/3 및 ErbB2/4가 이모델에서 실행되었다. 이들 이량체들의 대부분은 리간드 결합에 의해 활성화되지만, 몇 가지는 "측면 신호발생" (또는 이차 이량체화) 프로세스를 통하여 발생되며, 이때 리간드-의존적 방식으로 포스포릴화된 이량체는 단량체로 해리되고, 그 다음 활성화된 또는 비-활성화된 단백질와의 동종- 또는 이종-올리고머화되어, 활성 이량체가 만들어진다. 컴퓨터에 의한 모델은 ADRr 세포계를 이용하여 HRG 또는 BTC 존재하에 형성되는 이량체의 확인을 허용하는 실험 데이터 세트로 훈련되었다.
따라서, 포스포릴화된 동종- 및 이종이량체의 통합된 수준은 다음의 세포계에 대한 네트워크 활성화 상태 (NAS) 측량으로 계산되었다: MALME3M, BT474, IGROV1, ADRr, OVCAR8, SKOV3, DU145 및 ACHN. 도 14의 그래프에서 나타낸 것과 같이, 포스포릴화된 ErbB1/3 이종이량체 (pErbB1:3)의 계산된 수준은 8개 세포계를 Ab #6 무-응답자 (MALME3M, BT474, IGROV1, ADRr)와 응답자 (OVCAR8, SKOV3, DU145 및 ACHN)로 분리시켰다. 계산된 pErbB1:3 수준에 기초된 이와 같은 분리는 실시예 8에서 설명된 직접적인 바이오마커를 이용하여 결정된 예측된 무-응답자 및 응답자와 동일하게 관련되어 있다. 계산된 pErbB1:3 수준에 기초된 이와 분리는 실시예7에서 설명된 것과 같이 NAS 값에 대한 계산된 pErbB3 수준을 이용하여 결정된 예측된 무-응답자 및 응답자와 거의 동일하게 관련되어 있는데, 단지 BT474 세포계만 차이가 있는데, 이 세포계는 직접적인 바이오마커 및 계산된 pErbB1:3 수준을 이용하였을 때 무-응답자로 확인되었지만, 계산된 pErbB3 수준을 이용하였을 때 응답자로 확인되었다.
ErbB1/1, ErbB1/2, ErbB1/3, ErbB1/4, ErbB2/2, ErbB2/3 및 ErbB2/4 이량체의 수준은 컴퓨터에 의한 모델을 이용하여 계산되었지만, 이들 동종- 또는 이종이량체 중 어느 것의 수준도 Ab #6 치료에 대해 응답자와 무-응답자로 세포계를 분리시키지 못하였다. 따라서, 검사된 이량체들중에서 ErbB1/3 이종이량체로 관찰된 결과만이 독특하였다.
이들 결과는 포스포릴화된 ErbB 동종- 또는 이종이량체의 통합된 수준은 본 발명의 예측 방법들에서 NAS 값으로 이용될 수 있으며, 좀더 특이적으로 pErbB1:3의 계산된 수준은 Ab #6을 이용한 치료에 대한 응답을 예측하기 위한 바람직한 NAS 값이 된다는 것을 설명한다. 이들 결과는 ErbB1:3 이종이량체의 수준이 높은 암에 특히 효과적이며, 따라서, 전체 ErbB1:3 이종이량체 또는 pErbB1:3 이종이량체 수준의 직접적 측량은 또한 Ab #6 치료의 효과를 예측하는 직접적 바이오마커로 이용될 수 있다고 해석된다.
실시예 11: ErbB 신호전달 경로 상에서 치료제 효과에 대한 컴퓨터에 의한 모델 구축 및 훈련
본 실시예에서, 기계적인 컴퓨터에 의한 모델을 구축하기 위하여 실시예 4에서 설명된 방법이 이용되어 ErbB 신호전달 경로의 모델을 구축하고, 훈련되었으며, 더욱이, 특정 치료제에 의해 신호전달 경로를 방해하는 기전의 컴퓨터에 의한 재현이 개발되었다.
본 실시예에 이용된 치료제는 이중특이적 항체 H3×B1D2 (이의 아미노산 서열은 서열 번호: 41 에 나타내고 있으며, U.S. 특허 No. 7,332,585, U.S. 특허 No. 7,332,580 및 PCT 출원 PCT/US2006/023479(WO 2007/084187으로 공개됨), 및 PCT 출원 PCT/US2007/024287(WO 2008/140493으로 공개됨)에서 설명되고 있다. 이 이중특이적 항체는 항-ErbB2 단일 쇄 항체에 링크된 항-ErbB3 단일 쇄 항체로 구성된다.
H3×B1D2 물질은 ErbB2-과다발현 종양을 선호적으로 표적할 것으로 예측되었다. 따라서, 과다발현된 ErbB2 존재하에 ErbB 신호발생 네트워크의 컴퓨터에 의한 모델은 실시예 4에서 설명된 방법들 및 모델을 이용하여 구축되었다. 이 모델 수용체 이동(trafficking)와 AKT 하류의 세포내 신호발생을 유도하고, 포스포릴화된 AKT (pAKT)를 생산하는, HRG와 ErbB1, ErbB2, 및 ErbB3 수용체 사이의 상호작용을 통합시켰다. 포함된 상호작용은 실시예 4의 모델에서 발견되는 것들과 실질적으로 동일하였다. 실시예 4의 모델과 대조적으로, 리간드 BTC에 관련된 반응은 이 모델에 포함되지 않았다.
이 모델은 ErbB2-과다발현 유방 세포계 BT474-M3(이 세포계는 가령, Drummond et al .(2005) Clin . Cancer Res . 11:3392; Park et al .(2002) Clin . Cancer Res . 8:1172; Kirpotin et al .(2006) Cancer Res . 66:6732에서 설명됨)에 대한 실험적 데이터에 일치되도록 조정되었다. 모델 교정(calibration)으로 실시예 4의 모델과 비교하였을 때 변수 값에 약간의 차이가 초래되었다. 가장 큰 차이는 ErbB 수용체 내와 및 분해 속도에서 감소였다. 이와 같은 변화는 공지의 데어터와 일관되었으며, 이는 ErbB2 과다발현은 기타 ErbB 수용체들, 이와 같은 ErbB1 (예, Hendriks et al.(2003) J. Biol . Chem . 278:23343-23351; Wang et al .(1999) Mol . Biol . Cell 10:1621-1636; Haslekas et al .(2005) Mol . Biol . Cell 16:5832-5842)와 같은 수용체의 내화/이동 속도를 감소시킨다고 제안된다.
모델의 훈련을 위하여, BT474-M3 세포에서 다중 시간대와 상이한 6가지 농도의 HRG에서 ErbB1, ErbB2, ErbB3 및 AKT의 포스포릴화가 ELISA에 의해 측정된 약량-시간 매트릭스로 구성된 데이터 세트가 이용되었다.
세포들의 자극을 위하여, 세포는 12개 웰 조직 배양 플레이트(96 하프 웰 ELISA)에서 웰당 150,000개 세포로 1000㎕ 완전 배지로 이중 웰에 접종되거나 또는 96 웰 조직 배양 플레이트(384 웰 ELISA)에서 웰당 20,000개 세포로 100㎕ 완전 배지의 이중 플레이트에 접종된다. 이들 세포들은 5% CO2, 95% 대기, 37℃의 가습 대기에서 하룻밤동안 배양된다. 그 다음 세포는 무혈청 배지로 교환된다: RPMI-1640 배지 (Gibco) + 2 mM L-글루타민(Gibco) 및 units/mL Pen-Strep (Gibco). 굶은 세포들은 자극 전 20-24시간 동안, 5% CO2, 95% 대기, 37℃의 가습 대기에서 배양된다. 약량-시간 매트릭스 연구를 위하여, 세포들은 0분, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 7분, 10분, 20분, 30분, 60분 및 120분 시점에서 리간드(HRG)로 자극을 받는다. 각 시간 과정에서 6가지 상이한 농도의 HRG (0.098 nM-100 nM)로 자극을 받은 후, 세포들을 얼음위에 두고, 냉각 PBS로 세척한 후, 그 다음 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma-Aldrich, P2714), 1mM 오르소바나데이트 나트륨(Sigma-Aldrich, S6508), 5mM 피로포스페이트 나트륨(Sigma-Aldrich, 221368), 50μM 옥소페닐아르신(EMD Biosciences, 521000) 및 10μM bpV(phen) (EMD Biosciences, 203695)이 보충된 냉각 M-PER 포유류 단백질 추출 완충액 (Thermo Scientific, Catalog # 78501)에서 12웰 플레이트에 대해서는 200㎕, 및 96웰 플레이트에 대해서는 45㎕에서 용해시킨다.
자극된 세포에서 단백질 포스포릴화 수준은 ELISA에 의해 측정된다. ErbB1, ErbB2, 및 ErbB3는 R & D Systems Duoset IC 키트 (ErbB1 DYC1095-E, ErbB2 DYC1768-E, ErbB3 DYC1769-E)를 이용하여 측정된다. ErbB1 (R & D Systems, 841402), ErbB2 (R & D Systems, 841425), ErbB3 (R & D Systems, 841428) 및 AKT (Upstate, 05-591㎎)에 대한 캡쳐 항체는 블랙의 편평한 바닥 폴리스티렌 고 결합 플레이트인 96 하프 웰 플레이트(Greiner, Catalog # 82050-046) 또는 384 웰 플레이트에서, 실온에서 하룻밤동안 항온처리되었다. ELISA 플레이트는 1시간 동안 2% 소 혈청 알부민(BSA)과 인산염 완충된 염 용액(PBS)으로 차단되고, 2% BSA, 0.1% Tween-20 및 PBS로 희석된 용해물로 실온에서 2시간 동안 항온처리된다. 각 항온 처리사이에, 플레이트는 0.05% Tween-20/PBS로 3회 세척된다. 포스포-ErbB1, -ErbB2 및 -ErbB3를 측정하기 위한 ELISA는 2시간 동안 항-포스포-티로신-HRP 탐지 항체 (R & D Systems, 841403)로 항온처리된다. 포스포-AKT를 측정하는 ELISA는 1차 세린 473 특이적 항-포스포 AKT 마우스 단클론성 항체 (Cell Signaling Technologies, Catalog # 5102)와 함께 2시간 동안 항온처리되고, 그 다음 스트렙타아비딘-HRP(R & D Systems, Catalog#DY998)와 함께 20분간 항온처리된다. 모든 ELISA는 SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, Catalog # 37069)로 볼 수 있으며, 발광 시그날은 발광계를 이용하여 측정된다.
도 21에서 볼 수 있는 것과 같이, 모델은 실험적으로 검사된 HRG의 모든 약량에서 ErbB2-과다발현 세포계에서 HRG 유도된 pErbB3 신호발생 데이터와 일치하였다. 추가로, 모델은 대략 5 nM 및 이보다 낮은 HRG 약량에서 BT474-M3 세포에서 HRG 유도된 pAKT 신호발생 데이터와 일치하였다.
그 다음, H3×B1D2가 ErbB 경로의 HRG-의존적 신호발생을 차단하는 기전의 컴퓨터에 의한 연출이 개발되었다. 억제제의 컴퓨터에 의한 연출은 억제제의 ErbB2 및 ErbB3에 결합 및 후속적으로 HRG 유도된 신호발생 저해를 설명하는 질량-작용 반응 방정식을 이용하여 구축되었다. H3×B1D2에 의해 세포에서 HRG 유도된 pErbB3 억제에 대한 데이터와 일치되도록 하기 위하여 직접적인 측정(본 기술분야에 널리 공지된 기술을 이용하여)과 모델의 컴퓨터에 의한 훈련의 조합에 의해 수득되었다. 특히, ErbB3에 대한 이중특이적 항체의 H3 단일 쇄 팔의 결합을 위한 on-rate와 off-rate 그리고, ErbB2에 대한 이중특이적 항체의 B1D2 단일 쇄 팔의 결합을 위한 on-rate와 off-rate는 BIACore 및 KinExA 표준 기술에 의해 실험적으로 결정되었다. H3×B1D2의 컴퓨터에 의한 모델에 대한 반응 및 변수들은 표 16a 및 16b에 나타내었다.
[표 16a]
Figure pct00031
[표 16b]
Figure pct00032
ErbB 신호발생 모델과 억제제 모델이 복합되고 H3×B1D2의 pErbB3 및 pAKT 신호발생 억제에 대한 실험적 데이터를 예측하는데 이용되었다. 실험적 데이터는 상기에서 설명된 동일한 방법에 의해 생성되었지만, 단, H3×B1D2의 15 pM 내지 1μM 범위의 농도가 혈청 결핍 동안 첨가되었다. 추가로, 억제 데이터는 5 nM HRG 자극후 10분-용해 시간대를 이용하여 생성되었다. H3×B1D2의 IC50 억제를 나타내는 실험적 결과를 성공적으로 반복한 모델은 상이한 세포계에서도 크게 변화가 없었지만, 억제율은 상당히 변화되었다. 억제 비율의 변화의 주요 원인은 ErbB2 발현 수준이었다. 이것은 ErbB2가 OVCAR8 세포계에 형질감염되어 ErbB2-과다발현 세포계(OVCAR8-HER2로 칭함)를 만드는 실험에서 설명되었다. H3×B1D2으로 처리된 OVCAR8 세포에 대한 pErbB3 및 pAKT의 억제 곡선은 H3×B1D2으로 처리된 OVCAR8-HER2 세포들에 대한 동일한 억제 곡선과 비교되었다. 그 결과는 도 17a-d에서 나타내고 있는데, 도 17a와 17b는 H3×B1D2 처리된 OVCAR8 세포들(실험적으로 또는 모델에서 시뮬레이션된)에서 차례로 pErbB3 및 pAKT에 대한 억제 곡선을 나타내며,, 도 17c 및 17d는 H3×B1D2 처리된 OVCAR8-HER2 세포들(실험적으로 또는 모델에서 시뮬레이션된)에서 차례로 pErbB3 및 pAKT의 억제 곡선을 나타낸다. 실험적으로 처리된 세포들("DR50데이터") 및 시뮬레이션처리된 세포들("DR50sim")에 대한 IC50 또한 나타낸다. 데이터는 ErbB2의 더 높은 발현이 H3×B1D2 처리에 의한 더 큰 억제를 야기한다는 것을 보여준다.
억제를 조절함에 있어서 ErbB2의 1차 역할에 추가하여, ErbB1에 대한 기대하지 않은 역할이 컴퓨터에 의한 모델에 의해 밝혀졌다. ErbB1에 대한 이와 같은 역할은 ErbB1의 하향 조절을 시뮬레이션하기 위하여 ADRr 세포에 ErbB1 RNAi의 추가 효과를 보여주는 시뮬레이션에 의해 예시화되었다. ADRr 세포들은 낮은 수준의 ErbB2만을 발현시키고 컴퓨터에 의한 모델 및 실험적으로 결정된 데이터 모두에서 H3×B1D2에 의한 낮은 비율의 억제를 나타내었다. 이 데이터는 도 18a 및 18b에서 볼 수 있는데, 이들은 실험적으로 또는 모델에서 시뮬레이션에 의해 H3×B1D2처리된 ADRr 세포에서 차례로 pErbB3 및 pAKT의 억제 곡선을 각각 나타낸다. 실험적으로 처리된 세포들("DR50 데이터") 및 시뮬레이션으로 처리된 세포들("DR50sim")에 대한 IC50 값도 나타낸다. 그러나, ErbB1 발현의 하향 조절(RNAi 첨가 시뮬레이션에 의해)은 도 18c 및 18d에서 볼 수 있는 것과 같이, 시뮬레이션에서 더 큰 억제 비율을 초래하였고, 이들 도면은 ErbB1 RNAi 및 H3×B1D2 처리에 대하여 시뮬레이션된 ADRr 세포에서 차례로 pErbB3 및 pAKT에 대한 억제 곡선을 나타낸다. ErbB1 RNAi 시뮬레이션에 의한 결과의 의미는 ErbB1 발현은 H3×B1D2에 대해 네가티브한 반응 바이오마커라는 것을 말한다.
요약하면, 컴퓨터에 의한 모델 및 실험적 데이터에서, 시험관에서 H3×B1D2에 대한 응답을 네가티브하게 조절하기 위한 두 가지 기전이 있다는 것을 나타낸다: (i) 충분하지 못한 ErbB2의 높은 수준; 및 (ⅱ) ErbB1의 높은 수준. 역으로, ErbB2 발현의 높은 수준과 ErbB1 발현의 낮은 수준은 H3×B1D2에 대한 증가된 응답과 관련된다.
실시예 12: H3 ×B1D2 치료에 대한 생체내 응답은 컴퓨터에 의한 모델의 예측된 응답과 관련된다.
본 실시예에서, H3×B1D2 치료에 대한 종양의 생체내 응답은 H3×B1D2 치료에 대한 응답의 직접적 및 간접적 바이오마커를 확인하기 위하여 ErbB 경로의 다양한 성분들의 계산된 수준과 관련있었다.
H3×B1D2 치료에 대한 종양의 생체내 반응을 특징화시키기 위하여, 종양 세포계 패널은 실시예 1에서 설명된 것과 같이, 이종이식편 종양 모델에서 테스트되었다. 이종이식편 종양 모델에서, 마우스(nu/nu 마우스: 4-5 주령의 암컷 마우스, 흉선이 없는, 누드(nude), 무작위교배계; Albino; Charles River Labs, Wilmington, MA으로부터 구입)의 옆구리에 피하 주사를 통하여 200㎕의 5×106 -2×107개의 세포/마우스(세포계에 따라 달라짐)를 이식하였다. 초기 종양 성장에 대해 마우스를 모니터하였다. 종양은 평균 종양 용적이 대략 150-200㎣이 될 때 까지 몇 일간 성장하도록 두었다. 종양 용적은 V =(π/6 (L×W2)으로 계산된다. 마우스는 3일마다(q3d), 주사당 600㎍ 약량의 H3×B1D2 항체로 치료된다. 기준 마우스는 인산염 완충된 염(PBS) 또는 야생형 HSA(인간 혈청 알부민)으로 치료된다. 종양 용적은 40-80일간 측정된다.
다음의 12개의 종양 세포계가 검사되었다: ACHN, ADRr, IGROV1, LS180, MIA PaCa2, ZR75-1, MDA-MB-361, ADrR-HER2 (HER2를 과다발현시키기 위해 형질감염된 ADrR 세포들), NCI-N87, CALU-3, SKOV-3 및 BT474-M3. 컴퓨터에 의한 모델에 이들 세포계를 사용하기 위하여, 각 세포계에서 ErbB1, ErbB2 및 ErbB3 발현 수준은 상기에서 설명된 방법 또는 이들 방법을 약간 변형시킨 방법을 이용하여 실험적으로 결정되었고, 그 결과는 아래 표 17에 나타낸다.
[표 17]
Figure pct00033
생체내 이종이식편 실험에서 얻은 기준 및 치료 데이터는 다음의 식을 이용하여 지수 성장 곡선에 피트되었다:
V= V 0 * exp (k * t)
여기서, V는 종양 용적이며, V0는 0 시간대의 종양 용적이며, k는 지수 성장 속도이며, t는 시간이 된다. 종양 성장을 저해시키는데 있어서, H3×B1D2의 능력은 테스트된 각 세포주에 대한 처리 및 기준 지수 성장 속도의 비율로 나타낸다. 이 비율은 "상대적인 성장 속도" (RGR)로 표시되며, 다음과 같이 나타낸다:
RGR = k H3 ×B1D2 /k 대조군
상대적 성장 속도 (RGR)가 1이라고 함은 물질이 전혀 효과가 없다는 것을 말한다. RGR이 0이면, 치료제는 종양 성장을 완전히 중단시켰다는 것을 의미한다. 네가티브 RGR는 이 물질이 종양 퇴행을 일으켰다는 것을 의미한다.
검사된 12개 세포계중, 유일하게 BT474-M3가 네가티브 RGR (즉, H3×B1D2은 이 세포계에서만 종양 퇴행을 일으켰다)이다. 두 가지 세포계, IGROV1 및 LS180는 1이상의 RGR 값을 가지는데, 이는 H3×B1D2가 이들 세포계에 종양 성장에 효과가 없다는 것을 나타낸다. 나머지 9가지 세포계는 0과 1사이의 RGR 값을 가지는데, 이는 H3×B1D2가 이들 세포계에 대해 종양 성장을 부분적으로 억제시킨다는 것을 의미한다.
12가지 세포계에 대한 RGR 값은 각 세포계에서 ErbB1, ErbB2 및 ErbB3의 측정된 수준에 근거하여, H3×B1D2 억제제 부재하에 세포계에서 ErbB2 단량체, ErbB2:ErbB2 동종이량체 및 ErbB2:ErbB3 이종이량체의 모델 계산된 수준에 근거하여 플롯되었다. 결과는 도 19a-c에서 설명되는데, 이들은 H3×B1D2 부재하에 종양 세포 패널에서 ErbB2 단량체 (도19a), ErbB2:ErbB2 동종이량체 (도19b) 및 ErbB2:ErbB3 이종이량체 (도19c)의 계산된 수준에 대해 플롯된 H3×B1D2으로 처리된 이종이식편 모델에서 종양 세포 패널에 대한 생체내에서 결정된 상대적인 성장 속도(RGR)의 그래프를 나타낸다.
도 19의 결과에서, RGR와 ErbB2 단량체, ErbB2:ErbB2 동종이량체 및 ErbB2:ErbB3 이종이량체의 계산된 수준 사이에 1차원적 관계가 있다는 것을 보여준다. 이와 같은 관찰에 근거하여, ErbB2 단량체, ErbB2:ErbB2 동종이량체 및/또는 ErbB2:ErbB3 이종이량체의 직접적 측량이 H3×B1D2 응답의 직접적인 바이오마커로 이용될 수 있다. 더욱이, 종양 시료에서 ErbB1, ErbB2 및 ErbB3의 측량은 H3×B1D2 치료에 대한 종양 응답을 계층화시키기 위하여 ErbB2:ErbB2 동종이량체 및/또는 ErbB2:ErbB3 이종이량체의 수준을 계산하는데 이용될 수 있다(예, ErbB1, ErbB2 및 ErbB3의 측정된 수준은 H3×B1D2 응답의 간접적 바이오마커로 이용될 수 있고, 간접적 바이오마커들은 ErbB2:ErbB2 동종이량체 및/또는 ErbB2:ErbB3 이종이량체의 수준을 계산하는데 이용될 수 있다). 따라서, 예를 들면, ErbB2:ErbB2 동종이량체 및/또는 ErbB2:ErbB3 이종이량체의 계산된 수준은 H3×B1D2 치료에 대한 응답이 예측될 때 네트워크 활성화 상태 (NAS) 값으로 이용될 수 있다.
12개의 세포계에 대한 RGR 값은 H3×B1D2 억제제의 존부의 시뮬레이션에서 세포계내 ErbB2:ErbB2 이종이량체 및 ErbB1:ErbB3 이종이량체의 계산된 상대적 수준(예, 비율)에 대해 플롯되었다. 더 낮은 상대적 수준은 H3×B1D2가 이들 이종이량체의 형성을 더 강력하게 억제한다는 것을 나타낸다. 결과는 도 20a-b에서 설명되고 있는데, 이들 도면은 H3×B1D2이 없는 것으로 시뮬레이션된 상태에서 이종이량체의 시뮬레이션된 수준과 비교하였을 때, H3×B1D2가 존재하는 것으로 시뮬레이션된 상태에서 종양 세포 패널내 ErbB2:ErbB3 이종이량체 (도20a) 및 ErbB1:ErbB3 이종이량체 (도20b)의 계산된 상대적 수준에 대하여 H3×B1D2 치료된 이종이식편 모델에 대한 생체내 결정된 상대적 성장 속도(RGR)를 플롯시킨 그래프를 나타낸다.
도 20의 결과는 ErbB2:ErbB3 및 ErbB1:ErbB3 이종이량체를 파괴시키는 억제제의 능력과 종양의 상대적인 성장 속도간에 상관 관계를 설명한다. 즉, H3×B1D2 억제제가 존재하는 것으로 시뮬레이션된 경우에 ErbB2:ErbB3 및 ErbB1:ErbB3 이종이량체의 계산된 상대적 수준이 낮은(예, 억제제에 의한 이종이량체 파괴가 높은) 종양 세포들(예, BT474-M3 세포들)은 더 낮은 RGR 값을 나타낸다(억제제가 종양 성장에 더 큰 효과를 나타냄). 대조적으로, H3×B1D2 억제제가 존재하는 것으로 시뮬레이션된 경우 ErbB2:ErbB3 및 ErbB1:ErbB3 이종이량체의 계산된 상대적 수준이 높은(즉, 억제제에 의한 이종이량체 파괴가 낮은 경우) 종양 세포들 (예,ACHN 세포들)은 더 높은 RGR 값을 나타낸다(억제제가 종양 성장에 효과가 덜 하다는 것을 나타냄). 이와 같은 결과들은 치료제가 없는 것으로 시뮬레이션된 것과 비교하였을 때, 신호경로의 컴퓨터에 의한 모델에서 치료제가 존재하는 것으로 시뮬레이션하면, ErbB2:ErbB3 또는ErbB1:ErbB3 이종이량체의 상대적 수준에 근거하여 네트워크 억제 상태 (NIS) 생성을 허용하고, NIS는 생체내에서 치료제에 대한 종양 세포의 응답 예측물질로 이용될 수 있다는 것을 설명한다.
실시예 13: 결합 친화력의 측정( KD )
항-ErbB 항체들의 해리 상수는 표면 플라즈몬 공명 분석(Surface Plasmon Resonance Assay) 또는 세포 결합 분석중 하나 또는 이들 두 가지에 의해 측정될 수 있다.
표면 플라즈몬 공명 분석
표면 플라즈몬 공명 분석은 Wassaf et al .(2006) Analytical Biochem .,351:241-253에서 설명된 것과 같이 실행된다. 바람직한 실행은 재조합 ErbB 단백질을 분석 물질로써, 및 항-ErbB 항체를 리간드로 이용하여 BIACORE 3000 기구(GE Healthcare)를 이용하는 것이다. KD 값은 다음의 식에 근거하여 계산된다: KD=Kd/Ka.
세포 결합 분석
세포 결합 분석은 ErbB1 결합에 대해서는 A-431 세포를, ErbB2 결합에 대해서는 ZR-75-1 세포를, 또는 ErbB3 결합에 대해서는 MALME-3M 세포를 이용하여 실행한다(모두 ATCC에서 구함). 이 분석은 실질적으로 다음과 같이 실행된다.
세포들은 실온에서 5분간 2 ㎖ 트립신-EDTA + 2 ㎖ RMPI + 5mM EDTA으로 분리된다. 완전한 RPMI (10 ㎖)가 트립신 처리된 세포에 즉각 첨가되고, 부드럽게 재현탁되고, 5분간 탁상용 Beckman 원심분리기에서 1100 rpm에서 스핀다운되었다. 세포들은 BD 스테인 완충액(PBS + 2% FBS + 0.1% 아지드 나트륨, Becton Dickinson)에서 ㎖당 2×106개 세포들의 농도로 재현탁되었고, 50㎕(1×105세포들) 방울은 96웰 적정 플레이트에 도말된다.
BD 스테인 완충액내 200nM 항-ErbB 항체 150㎕ 용액을 준비하고, 75 ㎕ BD 스테인 완충액으로 연속적으로 2배 희석시킨다. 희석된 항체의 농도는 200 nM 내지0.4 nM이다. 상이한 단백질 희석액 50㎕ 방울을 50 ㎕ 세포 현탁액에 직접 첨가하여, 최종 농도가 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12 nM, 6 nM, 3 nM, 1.5 nM, 0.8 nM, 0.4 nM 및 0.2 nM의 항체가 되도록 한다.
96웰 플레이트에 나누어진 세포들은 실온에서 30분간 플랫포옴 쉐이크 상에서 단백질 희석액과 함께 항온처리되고, 300㎕ BD 스테인 완충액으로 3차례 세척된다. 그 다음 세포들은 냉실에서 플랫포옴 쉐이커상에서 45분간 100㎕의 2차 항체 (예, BD 스테인 완충액내 Alexa 647-라벨된 염소 항-인간 IgG 1:750 희석액)로 항온처리된다. 최종적으로 세포는 2회 세척되고, 펠렛화되고, 250㎕ BD 스테인 완충액 + 0.5 ㎍/㎖ 요오드 프로피디움에 재현탁된다. 10,000개 세포 분석은 FL4 채널을 이용하여 FACSCALIBUR 유세포 분석기에서 실시된다. MFI 값 및 항-ErbB-항체의 대응하는 농도는 차례로 y-축과 x-축상에 플롯된다. 분자의 KD는 비-선형 회귀 곡선에 대한 한-부위 결합 모델을 이용하여 GraphPad PRISM 소프트웨어에 의해 결정된다.
KD 값은 식 Y=Bmax*X/KD+X 에 의해 계산된다 (Bmax = 포화시 형광. X= 항체 농도. Y = 결합도).
SEQUENCE LISTING <110> MERRIMACK PHARMACEUTICALS, INC. <120> METHODS, SYSTEMS AND PRODUCTS FOR PREDICTING RESPONSE OF TUMOR CELLS TO A THERAPEUTIC AGENT AND TREATING A PATIENT ACCORDING TO THE PREDICTED RESPONSE <130> MMJ-009PC <140> <141> <150> 61/170,367 <151> 2009-04-17 <150> 61/208,206 <151> 2009-02-20 <150> 61/194,702 <151> 2008-09-30 <150> 61/189,053 <151> 2008-08-15 <160> 53 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr 20 25 30 Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Gly Trp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 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Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val 565 570 575 Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr 580 585 590 Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu 595 600 605 Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val 610 615 620 Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys 625 630 635 640 Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn 645 650 655 Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro 660 665 670 Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys 675 680 685 Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu 690 695 700 Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val 705 710 715 720 Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg 725 730 735 Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu 740 745 750 Phe Gln Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser 755 760 765 Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val 770 775 780 Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp 785 790 795 800 Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu 805 810 815 Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala 820 825 830 Ala Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly 835 840 845 Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly 850 855 860 Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met 865 870 875 880 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser 885 890 895 Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val 900 905 910 Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro 915 920 925 Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys 930 935 940 Thr Asp Arg Thr Cys Ala Lys Trp Pro Glu Trp Leu Gly Val Trp Gly 945 950 955 960 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly 965 970 975 Gly Gly 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1 5 10

Claims (104)

  1. 신생물성 종양을 가진 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 방법은 종양 시료를 수득하고, 시료에서 pErbB3 수준을 결정하며, 후속적으로 1 이상의 항-신생물성 치료제를 환자에게 투여하는 것을 포함하며,
    여기서, 시료내에서 결정된 pErbB3 수준이 무혈청 배지에서 20-24시간 동안 세포 배양후 ACHN 세포 배양물에서 측정된 pErbB3 수준의 50%보다 낮지 않으면, 환자에게 후속적으로 투여되는 1 이상의 항-신생물성 치료제는 항-ErbB3 항체를 포함하고,
    시료내에서 결정된 pErbB3 수준이 ACHN 세포 배양물에서 측정된 pErbB3 수준의 50%보다 낮으면, 환자에게 후속적으로 투여되는 1 이상의 항-신생물성 치료제는 항-ErbB3 항체를 포함하지 않는 것인, 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서, 시료내 pErbB3의 수준은,
    (a) 시료내에서 ErbB3 신호전달 경로의 2 이상의 성분들 각각에 대한 수준을 측정하는 단계;
    (b) ErbB3 신호전달 경로의 컴퓨터이용 모델에 입력된 (a) 단계에서 측정된 수준을 이용하여 시료내 pErbB3 수준을 시뮬레이션하는 네트워크 활성화 상태(Network Activation Stat)를 계산하는 단계;
    (c) 그것으로부터 시료내 pErbB3 수준을 결정하는 단계
    에 의해 결정되는 것인, 치료 방법.
  3. 제2항에 있어서, 수준이 측정되는 1 이상의 성분은 ErbB1, ErbB2, ErbB3, ErbB4, 헤레굴린, 베타셀룰린, 상피 성장 인자, 헤파린 결합 상피 성장 인자, 형질변환 성장 인자 알파, 암피레굴린, 에피겐, 및 에피레굴린에서 선택되는 것인, 치료 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 수준이 측정되는 1 성분은 단량체, 동종이량체 또는 이종이량체의 단백질인, 치료 방법.
  5. 제4항에 있어서, 이종이량체는 ErbB1/ErbB3 이종이량체 또는 ErbB2/ErbB3 이종이량체인, 치료 방법.
  6. 제4항에 있어서, 단백질의 수준은 정량적 형광 활성화된 세포 분류법, 효소 연결된 면역흡착 분석법, 면역조직화학법, 정량적인 면역조직화학법, 형광 공명 에너지 전달법, 포스터(Forster) 공명 에너지 전달법, 생분자 형광 상보법, 질량 분광분석법, 면역블랏 분석법 또는 공면역침전 분석법에 의해 측정되는 것인, 치료 방법.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서, (a) 단계에서 탐지되는 1 성분은 mRNA인, 치료 방법.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 네트워크 활성화 상태의 계산은 기계론적 모델 또는 통계학적 분류 알고리즘을 포함하는 ErbB3 신호전달 경로의 컴퓨터 모델을 포함하는 것인, 치료 방법.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 계산된 네트워크 활성화 상태는 시료내에서 pErbB3, 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 및 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체 중 1 이상의 수준을 시뮬레이션하는 것인, 치료 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 종양은 결장, 폐, 직장, 담낭, 뇌, 척수, 유방, 신장, 췌장, 위, 간, 뼈, 피부, 비장, 난소, 고환, 전립선, 및 근육에서 선택된 장기의 악성 종양인, 치료 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항-ErbB3 항체는 하기 (i) 내지 (v) 중 1 이상을 포함하는 것인 치료 방법:
    (i) 각각 서열 번호: 1 및 서열 번호: 2에 표시된 바와 같은 중쇄 가변 부위(VH) 및 경쇄 가변 부위(VL) 서열을 갖는 Ab #6 항체, 또는 각각 서열 번호: 7-9 및 10-12에 표시된 바와 같은 Ab #6의 VH 및 VL CDR 서열을 갖는 항체;
    (ⅱ) 각각 서열 번호: 3 및 서열 번호: 4로 표시되는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 갖는 Ab #3 항체, 또는 각각 서열 번호: 13-15 및 16-18로 표시되는 바와 같은 Ab #3의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체;
    (ⅲ) 각각 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6로 표시되는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 갖는 Ab #14 항체, 또는 각각 서열 번호: 19-21 및 22-24로 표시되는 바와 같은 Ab #14의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체;
    (iv) 각각 서열 번호: 25 및 서열 번호: 26로 표시되는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 갖는 Ab #17 항체, 또는 각각 서열 번호: 27-29 및 30-32로 표시되는 바와 같은 Ab #17의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체; 및
    (v) 각각 서열 번호: 33 및 서열 번호: 34로 표시되는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 갖는 Ab #19 항체, 또는 각각 서열 번호: 35-37 및 38-40로 표시되는 바와 같은 Ab #19의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항-ErbB3 항체는 MM-121을 포함하는 것인, 치료 방법.
  13. 입력값을 수신하도록 구성된 1 이상의 입력 장치와 출력을 제공하도록 구성된 1 이상의 출력 장치를 포함하는 컴퓨팅 시스템을 이용한 컴퓨터화된 방법으로서,
    상기 방법은 세포 네트워크내 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대해 세포 네트워크를 포함하는 세포들의 반응을 예측하기 위한 것이며,
    상기 방법은,
    (a) 세포들의 시료에서 측정된 세포 네트워크내 하나 이상의 성분들의 수준을 확인한 입력값을 컴퓨팅 시스템 입력 장치를 통하여 수신하는 단계;
    (b) 세포 네트워크의 기계론적 컴퓨터이용 모델을 이용하여 세포에 대한 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태를 컴퓨팅 시스템을 사용해, 입력값으로부터 계산하는 단계; 및
    (c) (b) 단계에서 계산된 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태의 적어도 일부를 근거하여, 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 예측되는 반응을 컴퓨팅 시스템을 사용해 생성하고, 상기 출력 장치에서 제공하는 단계를 포함하는, 컴퓨터화된 방법.
  14. 입력값을 수신하도록 구성된 1 이상의 입력 장치와 출력을 제공하도록 구성된 1 이상의 출력 장치를 포함하는 컴퓨팅 시스템을 이용한 컴퓨터화된 방법으로서,
    상기 방법은 세포 네트워크내 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대해 세포 네트워크를 포함하는 세포들의 반응을 예측하기 위한 것이고,
    상기 방법은,
    (a) 세포들의 시료내에서 측정된 세포 네트워크내 하나 이상의 성분들의 수준을 확인한 입력값을 상기 컴퓨팅 시스템 입력 장치를 통해 수신하는 단계;
    (b) 통계학적 분류 알고리즘을 포함하는 세포 네트워크의 컴퓨터이용 모델을 이용하여 세포에 대한 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태를, 컴퓨팅 시스템을 사용해, 입력값으로부터 계산하는 단계; 및
    (c) (b) 단계에서 계산된 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태의 적어도 일부에 근거하여, 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 예측되는 반응을 컴퓨팅 시스템을 사용해 생성하고, 상기 출력 장치에서 제공하는 단계를 포함하는, 컴퓨터화된 방법.
  15. 세포 네트워크내 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    (a) 세포들의 시료내에서 세포 네트워크의 하나 이상 성분들의 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) (a) 단계에서 측정된 수준을 가지는 세포 네트워크 입력값의 기계론적인 컴퓨터이용 모델을 이용하여 세포에 대한 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태를 계산하고; 기계론적인 컴퓨터이용 모델의 출력값을 이용하는 통계학적 분류 알고리즘의 적어도 일부에 근거하여 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하는 것을 포함하는 컴퓨터-실행법을 적용하는 단계
    를 포함하는, 예측 방법.
  16. 입력값을 수신하도록 구성된 1 이상의 입력 장치와 출력값을 제공하도록 구성된 1 이상의 출력 장치를 포함하는 컴퓨팅 시스템을 이용한 컴퓨터화된 방법으로서,
    상기 방법은 세포 네트워크내 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하기 위한 것이고,
    상기 방법은,
    (a) 세포들의 시료내에서 측정된 세포 네트워크내 하나 이상의 성분들의 수준을 확인한 입력값을 컴퓨팅 시스템 입력 장치를 통해 수신하는 단계;
    (b) 세포 네트워크의 컴퓨터이용 모델을 이용하여 세포에 대한 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태를 컴퓨팅 시스템을 사용해 계산하는 단계; 및
    (c) 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 예측되는 반응을 컴퓨팅 시스템으로 생성하고, 출력 장치에서 제공하는 단계
    를 포함하는, 컴퓨터화된 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 네트워크는 ErbB 신호전달 경로를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 수준이 측정되는 1 성분은 ErbB 신호전달 경로에 관련된 ErbB 수용체 리간드인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, ErbB 수용체 리간드는 헤레굴린, 베타셀룰린, 상피 성장 인자, 헤파린 결합 상피 성장 인자, 형질변환 성장 인자 알파, 암피레굴린, 에피겐 또는 에피레굴린인, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 수준이 측정되는 1 성분은 ErbB 신호전달 경로에 관련된 수용체인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 수용체는 ErbB1, ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4인, 방법.
  22. 제17항에 있어서, 치료제는 항-EGFR 항체를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 항-EGFR 항체는 세투시맙, 마투주맙, 파니투무맙, 니모투주맙 및 mAb 806에서 선택된 항체인, 방법.
  24. 제17항에 있어서, 치료제는 항-ErbB2 항체를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 항-ErbB2 항체는 트라스투주맙을 포함하는, 방법.
  26. 제17항에 있어서, 치료제는 항-ErbB3 항체를 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 항-ErbB3 항체는 하기 (i) 내지 (vii) 중 1 이상을 포함하는, 방법:
    (i) 각각 서열 번호: 1 및 서열 번호: 2에 표시된 바와 같은 중쇄 가변 부위(VH) 및 경쇄 가변 부위(VL) 서을을 갖는 Ab #6 항체, 또는 각각 서열 번호: 7-9 및 10-12에 표시된 바와 같은 Ab #6의 VH 및 VL CDR 서열을 갖는 항체;
    (ⅱ) 각각 서열 번호: 3 및 서열 번호: 4에 표시된 바와 같은 VH 및 VL 서열을 갖는 Ab #3 항체, 또는 각각 서열 번호: 13-15 및 16-18에 표시된 바와 같은 Ab #3의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체;
    (ⅲ) 각각 서열 번호: 5 및 서열 번호: 6에 표시된 바와 같은 VH 및 VL 서열을 갖는 Ab #14 항체, 또는 각각 서열 번호: 19-21 및 22-24에 표시된 바와 같은 Ab #14의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체;
    (iv) 각각 서열 번호: 25 및 서열 번호: 26에 표시된 바와 같은 VH 및 VL 서열을 갖는 Ab #17 항체, 또는 각각 서열 번호: 27-29 및 30-32에 표시된 바와 같은 Ab #17의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체;
    (v) 각각 서열 번호: 33 및 서열 번호: 34에 표시된 바와 같은 VH 및 VL 서열을 갖는 Ab #19 항체, 또는 각각 서열 번호: 35-37 및 38-40에 표시된 바와 같은 Ab #19의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체;
    (vi) MM-121; 및
    (vⅱ) U3-1287.
  28. 제26항에 있어서, 항-ErbB3 항체는 항-ErbB2 항체에 링크된 항-ErbB3 항체를 포함하는 이중특이적 항체인, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 이중특이적 항체는 서열 번호: 41에 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 H3×B1D2 이중특이적 항체, 또는 각각 서열 번호: 48-50 및 51-53의 B1D2의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체에 링크된, 각각 서열 번호: 42-44 및 45-47에 표시된 바와 같은 H3의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체를 포함하는 이중특이적 항체인, 방법.
  30. 제17항에 있어서, 치료제는 ErbB3의 상이한 에피토프에 각각 결합하는, 2 이상의 항-ErbB3 항체들을 포함하는, 방법.
  31. 제26항에 있어서, 항-ErbB3 항체는 MM-121인, 방법.
  32. 제17항에 있어서, 치료제는 항-ErbB4 항체를 포함하는, 방법.
  33. 제17항에 있어서, 치료제는 팬(pan)-ErbB 억제제 또는 HER 이량체화 억제제를 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 치료제는 페르투주맙을 포함하는, 방법.
  35. 제17항에 있어서, 치료제는 제피티닙, 라파티닙, CI-1033, 에르로티닙 HCL, PKI-166, PD-158780, EKB-569 및 4-(3-클로로아닐리노)-6,7-디메톡시퀴나졸린에서 선택되는 ErbB 신호전달 경로의 소분자 억제제를 포함하는, 방법.
  36. 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 네트워크는 c-Met 신호전달 경로를 포함하는, 방법.
  37. 제36에 있어서, 치료제는 항-c-Met 또는 항-HGF 항체를 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 치료제는 AV299, AMG102 및 5D5에서 선택되는, 방법.
  39. 제37항에 있어서, 치료제는 항-ErbB1 항체에 링크된 항-HGF 항체를 포함하는 이중특이적 단클론성 항체를 포함하는, 방법.
  40. 제36항에 있어서, 치료제는 c-Met 신호전달의 소분자 억제제를 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, c-Met 신호전달의 소분자 억제제는 ARQ 197 또는 PHA665752인, 방법.
  42. 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 네트워크는 인슐린 성장 인자 1 수용체 (IGF1R) 신호전달 경로를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 치료제는 항-IGF1R 항체를 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 항-IGF1R 항체는 mAb391, IMC-A12, 19D12, H7C10, CP751,871, SCV/FC 및 EM/164인, 방법.
  45. 제43항에 있어서, 항-IGF1R 항체는 항-ErbB3 항체에 링크된 항-IGF1R 항체를 포함하는 이중특이적 단클론성 항체를 포함하는, 방법.
  46. 제42항에 있어서, 치료제는 NVP-AEW541, NVP-ADW742, NVP-TAE226, BMS-536, 924, BMS-554, 417, PQ401 및 사이클로리그난에서 선택되는 IGF1R 신호전달 경로의 소분자 억제제를 포함하는, 방법.
  47. 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 네트워크는 ErbB 신호전달 경로를 포함하며, 수준이 측정되는 성분들은 ErbB1 및 헤레굴린인, 방법.
  48. 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 네트워크는 ErbB 신호전달 경로를 포함하며, 수준이 측정되는 성분들은 ErbB1, ErbB2 및 ErbB3인, 방법.
  49. 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 네트워크는 ErbB 신호전달 경로를 포함하며, 수준이 측정되는 성분들은 ErbB1, ErbB2, ErbB3, 헤레굴린 및 베타셀룰린인, 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 하나의 항에 있어서, (b) 단계에서 계산된 네트워크 활성화 상태는 ErbB3 신호전달 경로의 1 이상의 포스포릴화된 단백질의 수준을 시뮬레이션하는 것인, 방법.
  51. 제50항에 있어서, (b) 단계에서 계산된 네트워크 활성화 상태는 세포들의 시료내에서 하나 이상의 포스포릴화된 ErbB3 수준을 시뮬레이션하는 것인, 방법.
  52. 제50항에 있어서, (b) 단계에서 계산된 네트워크 활성화 상태는 세포들의 시료내에서 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 또는 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준을 시뮬레이션하는 것인, 방법.
  53. 제49항에 있어서, (b) 단계에서 계산된 네트워크 활성화 상태는 치료제 부재하에서 ErbB2:ErbB2 동종이량체 또는 ErbB2:ErbB3 이종이량체의 수준을 시뮬레이션하는 것인, 방법.
  54. 제52항에 있어서, (b) 단계에서 계산된 NIS는 치료제 부재 하에서ErbB2:ErbB3 이종이량체 또는 ErbB1:ErbB3 이종이량체의 수준과 비교하여, 치료제 존재 하에서의 ErbB2:ErbB3 이종이량체 또는 ErbB1:ErbB3 이종이량체의 수준을 시뮬레이션하는 것인, 방법.
  55. 제13항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, KRAS, PI3K 및 PTEN에서 선택된 1 이상의 유전자의 돌연변이 상태를 확인하는 입력값을 입력 장치를 통하여 수신하는 컴퓨팅 시스템을 추가로 포함하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 수준이 측정되는 성분들은 베타셀룰린 및 암피레굴린이며, KRAS 유전자의 돌연변이 상태를 확인하는 입력값을 입력 장치를 통하여 수신하는 컴퓨팅 시스템을 추가로 포함하는, 방법.
  57. 제55항에 있어서, 수준이 측정되는 1 이상의 성분들은 ErbB1, ErbB2, ErbB3, 헤레굴린, 베타셀룰린, 암피레굴린, 헤파린 결합 상피 성장 인자, 상피 성장 인자, 형질변환 성장 인자 알파, 에피겐 및 에피레굴린에서 선택되며, KRAS 유전자의 돌연변이 상태를 결정하는 단계를 더 포함하거나, 또는 KRAS 유전자의 돌연변이 상태를 확인하는 입력값을 입력 장치를 통하여 수신하는 컴퓨팅 시스템을 추가로 포함하는, 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, (b)에서 계산된 네트워크 활성화 상태는 ErbB 신호전달 경로에서의 1 이상의 포스포릴화된 단백질의 수준을 시뮬레이션하는 것인, 방법.
  59. 제50항 내지 제58항 중 어느 하나의 항에 있어서, 치료제에 대한 반응 또는 무-반응을 나타내는, 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태의 역치값을 설정하기 위하여, 치료제에 대해 복수의 기지 반응자 및 무-반응자에 대해 계산된 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태 값을 이용하는 것인, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 치료에 대한 세포의 반응은 치료제에 대한 반응 또는 무-반응을 나타내는, 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태의 역치값과 (b) 단계에서 계산된 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태 값을 비교하여 예측하는 것인, 방법.
  61. 제15항 또는 제16항에 있어서, 통계학적 분류 알고리즘의 적용 단계는 하기 (1) 및 (8)에서 선택된 1 이상의 정보 아이템을 알고리즘에 입력하는 것을 포함하는 것인 방법:
    (1) (a) 단계에서 결정된 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 수준;
    (2) (b) 단계에서 계산된 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태;
    (3) 세포들의 시료내에서 하나 이상의 유전자들의 돌연변이 상태;
    (4) 치료제로 치료하려는 피험자의 나이;
    (5) 치료제로 치료하려는 피험자의 성별;
    (6) 세포상에 에스트로겐 수용체 (ER)의 존부;
    (7) 세포상에 프로게스테론 수용체의 존부; 및
    (8) 세포상에 안드로겐 수용체의 존부.
  62. ErbB 신호전달 경로의 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    (a) 세포들의 시료내에서, (i) 헤레굴린과 (ⅱ) ErbB1, ErbB2 및 ErbB3에서 선택된 1 이상의 수용체의 수준을 측정하는 단계;
    (b) 컴퓨터를 이용하여 (a) 단계에서 측정된 수준에 근거하여 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하는 단계로서, 여기서, 대조군에 비하여, HRG 및 1 이상의 수용체의 수준 증가는, 치료제를 이용한 치료에 대한 반응이 예측되는 것인 단계
    를 포함하는 것인 예측 방법.
  63. 입력값을 수신하도록 구성된 1 이상의 입력 장치와 출력값을 제공하도록 구성된 1 이상의 출력 장치를 포함하는 컴퓨팅 시스템을 이용한 컴퓨터화된 방법으로서,
    상기 방법은 ErbB 신호전달 경로의 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하기 위한 것이며,
    상기 방법은,
    (a) 세포들의 시료내에서 그 수준을 측정한, (i) 헤레굴린과 (ⅱ) ErbB1, ErbB2 및 ErbB3에서 선택된 1 이상의 수용체의 측정된 수준을 확인하는 입력값을 컴퓨팅 시스템 입력 장치를 통하여 수신하는 단계;
    (b) 측정된 수준에 근거하여 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 예측된 반응을 컴퓨팅 시스템에서 생성시키고, 그 다음 출력 장치에서 제공하는 단계로서, 여기서, 대조군과 비교하여, HRG 및 1 이상의 수용체의 수준 증가는, 치료제를 이용한 치료에 대한 반응이 예측되는 것인 단계
    를 포함하는 것인 컴퓨터화된 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 측정된 수준은 HRG 및 ErbB1의 수준인, 방법.
  65. 제62항 또는 제63항에 있어서, 측정된 수준은 HRG 및 ErbB2의 수준인, 방법.
  66. 제62항 또는 제63항에 있어서, 측정된 수준은 HRG 및 ErbB3의 수준인, 방법.
  67. 제62항 또는 제63항에 있어서, 측정된 수준은 HRG와, ErbB1, ErbB2 및 ErbB3에서 선택된 2 이상의 수용체의 수준인, 방법.
  68. 제62항 또는 제63항에 있어서, 측정된 수준은 HRG, ErbB1, ErbB2 및 ErbB3의 수준인, 방법.
  69. ErbB 신호전달 경로의 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    (a) 세포들의 시료내에서, 하나 이상의 ErbB1/ErbB3 이종이량체, ErbB2 단량체, ErbB2/ErbB2 동종이량체, ErbB2/ErbB3 이종이량체, 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 및 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 컴퓨터를 이용하여, (a) 단계에서 측정된 수준에 근거하여, 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하는 단계로서, 여기서 대조군과 비교하여, ErbB1/ErbB3 이종이량체, ErbB2 단량체, ErbB2/ErbB2 동종이량체, ErbB2/ErbB3 이종이량체, 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 또는 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준 차이는 치료제를 이용한 치료에 대한 반응이 예측되는 것인 단계
    를 포함하는 것인 예측 방법.
  70. 입력값을 수신하도록 구성된 1 이상의 입력 장치와 출력을 제공하도록 구성된 1 이상의 출력 장치를 포함하는 컴퓨팅 시스템을 이용한 컴퓨터화된 방법으로서,
    상기 방법은 ErbB 신호전달 경로의 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하기 위한 것이며,
    상기 방법은,
    (a) 세포들의 시료내에서 그 수준이 측정된 1 이상의 ErbB1/ErbB3 이종이량체, ErbB2 단량체, ErbB2/ErbB2 동종이량체, ErbB2/ErbB3 이종이량체, 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 및 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 측정된 수준을 확인하는 입력값을 상기 컴퓨팅 시스템 입력 장치를 통하여 수신하는 단계; 및
    (b) 측정된 수준에 근거하여 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 예측된 반응을 컴퓨팅 시스템에서 생성시키고, 제공하는 단계로서, 여기서 대조군과 비교하여 ErbB1/ErbB3 이종이량체, ErbB2 단량체, ErbB2/ErbB2 동종이량체, ErbB2/ErbB3 이종이량체, 포스포릴화된 ErbB1/ErbB3 이종이량체 또는 포스포릴화된 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준 차이는 치료제를 이용한 치료에 대한 반응이 예측되는 것인 단계
    를 포함하는 것인 컴퓨터화된 방법.
  71. 제62항, 제63항, 제69항 또는 제70항 중 어느 하나의 항에 있어서, 측정된 수준은 통계학적 분류 알고리즘으로 입력되고, 치료에 대한 세포들의 반응은 알고리즘의 출력값에 근거하여 예측되는 것인, 방법.
  72. 제62항, 제63항, 제69항 또는 제70항 중 어느 하나의 항에 있어서, 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태는 ErbB 세포 네트워크의 컴퓨터이용 모델을 이용하여 측정된 수준에 근거하여 계산되는 것인, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응은 계산된 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태 값에 근거하여 예측되는 것인, 방법.
  74. 제62항, 제63항, 제69항 또는 제70항 중 어느 하나의 항에 있어서, 치료제는 항-ErbB3 항체를 포함하는 것인, 방법.
  75. 제76항에 있어서, 항-ErbB3 항체는
    각각 서열 번호: 1 및 서열 번호: 2에 표시된 바와 같은 중쇄 가변 부위(VH) 및 경쇄 가변 부위(VL) 서열을 갖는 Ab #6 항체, 또는 각각 서열 번호: 7-9 및 10-12에 표시된 바와 같은 Ab #6의 VH 및 VL CDR 서열을 갖는 항체를 포함하는, 방법.
  76. 제69항 또는 제70항에 있어서, 측정된 수준은 ErbB2 단량체, ErbB2/ErbB2 동종이량체 및/또는 ErbB2/ErbB3 이종이량체의 수준이며, 이때 치료제는 항-ErbB2 항체에 링크된 항-ErbB3 항체를 포함하는 이중특이적 항체인, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 이중특이적 항체는 서열 번호: 41에 표시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 H3×B1D2 이중특이적 항체, 또는 각각 서열 번호: 48-50 및 51-53에 표시된 바와 같은 B1D2의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체에 링크된, 각각 서열 번호: 42-44 및 45-47에 표시된 바와 같은 H3의 VH 및 VL CDR 서열을 포함하는 항체를 포함하는 이중특이적 항체를 포함하는, 방법.
  78. 제13항 내지 제16항, 제62항, 제63항, 제69항 또는 제70항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포들은 종양 세포인, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 종양은 유방암 종양인, 방법.
  80. 제78항에 있어서, 종양은 폐, 직장, 담낭, 뇌, 척수, 유방, 신장, 췌장, 위, 결장, 간, 뼈, 피부, 비장, 난소, 고환, 전립선, 및 근육에서 선택된 조직의 종양인, 방법.
  81. 제78항에 있어서, 종양 시료는 종양 조직, 미세 바늘 흡인물, 유두 흡인물, 혈액 샘플, 전혈, 혈청, 혈장, 림프, 타액 및 뇨로부터 분리된 순환 종양 세포 또는 이로부터 분리된 탈리(shed) 또는 순환 종양 세포에서 선택되는, 방법.
  82. 제13항 내지 제81항 중 어느 하나의 항에 있어서, 측정된 수준은 단백질 수준이며, 단백질은 단량체, 동종이량체 또는 이종이량체인, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 단백질 수준은 정량적 형광 활성화된 세포 분류법, 효소 연결된 면역흡착 분석법, 면역조직화학법, 정량적 면역조직화학법, 형광 공명 에너지 전달법, 포스터 공명 에너지 전달법, 생분자 형광 상보법, 질량 분광분석법, 면역블랏 분석법 또는 공면역침전법에서 선택된 1 이상의 방법에 의해 측정되는, 방법.
  84. 제13항 내지 제81항 중 어느 하나의 항에 있어서, 측정된 수준은 mRNA 수준인, 방법.
  85. 제13항 내지 제81항 중 어느 하나의 항에 있어서, 치료에 대한 세포들의 예측된 반응에 근거하여 치료 요법을 선택하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  86. 제13항 내지 제81항 중 어느 하나의 항에 있어서, 예측된 반응에 근거하여 상기 치료제의 투여를 위한 치료 요법을 선택하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  87. 제13항 내지 제81항 중 어느 하나의 항에 있어서, 예측된 반응에 근거하여 사용하기 위한 치료제를 준비하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  88. 세포 네트워크내 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하기 위한 키트로서,
    상기 키트는,
    (a) 세포 네트워크의 하나 이상의 성분의 수준을 탐지하기 위한 분석 또는 분석들; 및
    (b) 세포 네트워크의 컴퓨터이용 모델을 이용하여 세포에 대한 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태를 계산하기 위한 명령을 포함하는, 키트.
  89. 제88항에 있어서, (c) 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하기 위하여 키트 사용 설명서를 추가로 포함하는, 키트.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 통계학적 분류 알고리즘을 적용하기 위한 명령을 추가로 포함하는, 키트.
  91. 제88항 또는 제89항에 있어서, 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 수준을 탐지하기 위한 분석 또는 분석들은 성분들의 단백질 수준을 탐지할 수 있게 하는 1 이상의 시약을 포함하는, 키트.
  92. 제88항 또는 제89항에 있어서, 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 수준을 탐지하기 위한 분석은 성분들의 mRNA 수준을 탐지할 수 있게 하는 1 이상의 시약을 포함하는, 키트.
  93. 제88항 또는 제89항에 있어서, 세포에 대한 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태를 계산하기 위한 명령은, 실행되면, 프로세스가 세포들에 대한 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태를 계산하기 위한 작업을 수행하는, 실행가능한 명령을 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품을 이용하기 위한 명령인, 키트.
  94. 제88항 또는 제89항에 있어서, 세포에 대한 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태를 계산하기 위한 명령은 세포들에서의 세포 네트워크의 1 이상의 성분의 수준을 나타내는 정보를 사용자가 입력시, 세포들에 대한 네트워크 활성화 상태 또는 네트워크 억제 상태를 계산하는 컴퓨터 프로그램을 운용하는 인터넷-기반 서비스에 접속하기 위한 키트 사용자용 명령을 포함하는, 키트.
  95. 제88항 내지 제94항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 네트워크는 ErbB 신호전달 경로인, 키트.
  96. 제95항에 있어서, 1 이상의 ErbB 신호전달 경로 수용체의 수준 및 1 이상의 ErbB 신호전달 경로 리간드의 수준을 탐지하기 위한 분석 또는 분석들을 포함하는, 키트.
  97. 제96항에 있어서, ErbB1, ErbB2, ErbB3, 헤레굴린 및 베타셀룰린의 수준을 탐지하기 위한 분석들을 포함하는, 키트.
  98. 제95항에 있어서, ErbB1 및 헤레굴린의 수준을 탐지하기 위한 분석들을 포함하는, 키트.
  99. 제95항에 있어서, 1 이상의 ErbB2 단량체, ErbB2/ErbB2 동종이량체, ErbB2/ErbB3 이종이량체 또는 ErbB1/ErbB3 이종이량체의 수준을 탐지하기 위한 분석 또는 분석들을 포함하는, 키트.
  100. 제88항 내지 제99항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포들은 종양 세포들인, 키트.
  101. 세포 네트워크내 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하기 위한 바이오마커를 확인하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    (a) 세포들의 시료내에서, 세포 네트워크의 1 이상의 성분들의 수준을 측정하는 단계;
    (b) (i) 세포 네트워크의 컴퓨터이용 모델을 이용하여 세포 네트워크의 하나 이상의 추가 성분들의 수준을 계산하고;
    (ⅱ) 그 계산된 수준이, 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하게 되는 세포 네트워크내의 성분을 확인하여, 그 성분을 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하는 바이오마커로써 확인하는 것
    을 포함하는, 컴퓨터 실행법을 적용하는 단계
    를 포함하는 것인 확인 방법.
  102. 입력값을 수신하도록 구성된 1 이상의 입력 장치와 출력을 제공하도록 구성된 1 이상의 출력 장치를 포함하는 컴퓨팅 시스템을 이용한 컴퓨터화된 방법으로서,
    상기 방법은 세포 네트워크내 성분을 표적으로 하는 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하기 위한 바이오마커를 확인하기 위한 것이며,
    상기 방법은,
    (a) 세포들의 시료내에서 측정된 세포 네트워크의 하나 이상의 성분들의 측정된 수준을 확인하는 입력값을 상기 컴퓨팅 시스템 입력 장치를 통하여, 수신하는 단계;
    (b) 세포 네트워크의 컴퓨터이용 모델을 이용하여 세포 네트워크의 하나 이상의 추가 성분들의 수준을 컴퓨팅 시스템을 사용하여 계산하는 단계; 및
    (c) 그 계산된 수준이, 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하게 되는 세포 네트워크내 성분을 컴퓨팅 시스템을 사용해 확인하여, 그 성분을 치료제를 이용한 치료에 대한 세포들의 반응을 예측하기 위한 바이오마커로써 확인하는 단계
    를 포함하는 것인 컴퓨터화된 방법.
  103. 실행시, 제1항 내지 제87항 또는 제101항 또는 제102항 중 어느 하나의 항에서 언급된 방법을 수행하는, 컴퓨터-실행가능한 명령을 저장하는 1 이상의 컴퓨터 판독가능한 저장 매체를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품.
  104. 신생물성 종양을 가진 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 방법은 종양 시료를 수득하고, 시료에서 pErbB3의 수준을 결정하고 후속적으로 환자에게 1 이상의 항-신생물성 치료제를 투여하는 것을 포함하며,
    이때, 시료내 결정된 pErbB3의 수준이 최저 수준보다 낮지 않으면, 환자에게 후속적으로 투여되는 1 이상의 항-신생물성 치료제는 항-ErbB3 항체를 포함하며,
    시료내 결정된 pErbB3의 수준이 0.064 pg/㎍ 전체 단백질, 0.08 pg/㎍ 전체 단백질, 0.096 pg/㎍ 전체 단백질, 0.122 pg/㎍ 전체 단백질, 0.128 pg/㎍ 전체 단백질, 0.144 pg/㎍ 전체 단백질 또는 0.16 pg/㎍ 전체 단백질인 최저 수준보다 낮으면, 환자에게 후속적으로 투여되는 1 이상의 항-신생물성 치료제는 항-ErbB3 항체를 포함하지 않는 것인, 치료 방법.
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