CN102224255A - 用于预测细胞对治疗剂的应答的方法和*** - Google Patents

用于预测细胞对治疗剂的应答的方法和*** Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于治疗患者的方法，所述方法包括用于预测细胞(例如肿瘤细胞)对治疗剂治疗的应答的方法。这些方法包括在细胞样品中测量一种或多种细胞网络组分的水平，然后使用细胞网络计算模型计算细胞的网络激活状态(NAS)或网络抑制状态(NIS)。然后根据计算出的NAS或NIS值来预测细胞对治疗的应答。本发明还包括针对细胞应答性的预测方法，其中细胞(例如肿瘤细胞)的NAS或NIS值的计算与统计分类算法的使用相结合。还提供了用于预测对靶向ErbB信号传导途径内组分的治疗剂治疗的应答性的生物标志。

Description

用于预测细胞对治疗剂的应答的方法和***
背景技术
在用于治疗癌症和其他疾病的靶向疗法开发中已经取得了长足进步。此类靶向疗法包括与特异性或优先表达在肿瘤细胞上的抗原结合的单克隆抗体，以及特异性干扰肿瘤细胞中活性的信号传导途径的分离组分的小分子药物。例如，西妥昔单抗(cetuximab)(Erbitux
Figure BPA00001347607400011
)是靶向在至少某些结肠癌和头颈癌中表达的表皮生长因子受体(EGFR，还称为ErbB1或HER1)的单克隆抗体。还例如，伊马替尼(imatinib)(Gleevec
Figure BPA00001347607400012
)是靶向BCR-Abl酪氨酸激酶的小分子，BCR-Abl酪氨酸激酶在某些慢性髓细胞性白血病中被表达并起致癌因子的作用，并且是良性细胞蛋白的异常变体。虽然此类靶向疗法已经显示在一些患者中有效，但应答率绝非100％。例如，西妥昔单抗单一疗法的平均应答率仅约15-20％的患者，即使当肿瘤已知表达ErbB1(EGFR)时。因此，仅仅ErbB1(西妥昔单抗抗体所靶向的抗原)在肿瘤中的表达不保证对西妥昔单抗的应答性。
因此，虽然靶向疗法非常有前景，但是患者对此类疗法易变的应答率以及与此类疗法相关的副作用和此类疗法通常高额的费用表明，包括预测哪些患者容易对治疗性治疗应答并仅对被预测应答的患者施用治疗的治疗患者的方法是非常希望的。已经采用的一个方法已试图鉴定与对疗法的应答性有关的遗传标志(例如，突变或等位基因)。在该方法中，来自患者的样品在治疗前被基因分型以确定患者是否携带指示疗法应答性的遗传标志。已经采用的另一种方法试图鉴定与疗法应答性相关的蛋白生物标志。在该方法中，在治疗前测定患者样品中的蛋白表达以确定患者是否表达指示疗法应答性的一种或多种蛋白生物标志。
前述两种方法可以被认为是“直接”标志方法，其中直接测量的标志(例如，BCR-Abl或ErbB1)的存在(或不存在，或表达水平)已经证明与疗法应答性或非应答性相关。而且，这两种方法都依赖于使用在细胞中足够稳定的标志以使它们能够在从患者分离的样品中被可靠测量或定量。假定在从患者分离样品与测量样品中标志之间存在相当长的时间延迟，则上文描述的此类“直接”标志方法通常需要使用在样品经历常规加工和处理时不随时间降解或改变的基因或蛋白标志。虽然已经鉴定了预测对某些治疗剂应答性的此类稳定的“直接”标志，但此类标志是否能够针对所有治疗剂被鉴定还不清楚。
认为肿瘤被一组配体激活的信号传导途径驱动生长，所述信号传导途径通常被与其同源受体结合的配体激活，诱导受体本身和下游激酶的磷酸化，导致途径下游组分的进一步磷酸化。这些激酶引发细胞存活和增殖。因此，信号传导途径的激活导致细胞内组分的改变，特别是蛋白磷酸化。在肿瘤组织上表达的受体的磷酸化特征可以帮助鉴定驱动特定肿瘤进展的主要途径。然而，磷蛋白可以是非常不稳定的，并且在手术后，如果组织样品不立即且快速冷冻(或者在一些情况下***固定)，则磷酸化可以快速消失。然而，即使当可能稳定测量特定肿瘤样品中一种或多种磷蛋白水平时，有关使用任何特定治疗剂治疗此类肿瘤的效力的任何特定磷蛋白的存在或不存在的预测值一般是未知的。因此，虽然磷蛋白曲线含有关于驱动肿瘤进展的途径的重要信息，但是此类磷蛋白曲线目前未广泛用作预测治疗性治疗应答性的生物标志。
因此，需要用于测定各种磷蛋白水平和利用此类水平和其他肿瘤细胞特征用于预测特定肿瘤对特定治疗剂应答性的新方法，以提高癌症疗法的治疗和成本效益。
发明概述
本文提供了用于预测细胞(特别是赘生性细胞例如肿瘤细胞(例如，良性肿瘤细胞或恶性肿瘤细胞)和非肿瘤细胞的恶性细胞)对治疗剂应答性的方法以及使用治疗剂治疗具有此类肿瘤的患者的方法。
在一个方面，提供了通过从患者获得恶性细胞样品、测定样品中细胞的某些生化特征并随后给患者施用至少一种抗肿瘤治疗剂，使用抗肿瘤治疗剂来治疗患者恶性肿瘤的方法。在某些实施方案中，生化特征是至少一种生物标志的水平；在进一步实施方案中，生物标志的水平通过测量其他更稳定的生化化合物并然后使用计算机模拟算法确定感兴趣的生物标志水平的来确定。治疗剂根据生物标志的水平来选择；某些治疗剂仅当超过生物标志的特定水平时被施用。
在某些实施方案中，提供了使用抗肿瘤治疗剂治疗具有赘生性肿瘤的患者的方法，包括：获得包括肿瘤细胞的肿瘤样品(例如，活检样品或切除的样品)，测定样品中磷酸化ErbB3(磷酸-ErbB3、pErbB3)的水平，并随后给患者施用至少一种抗肿瘤治疗剂。如果发现样品细胞含有至少最低水平的pErbB3，则施用抗ErbB3治疗剂；如果发现样品细胞不含有至少最低水平的pErbB3，则给患者施用非抗ErbB3治疗剂的抗肿瘤治疗剂，而不施用抗ErbB3治疗剂。优选的抗ErbB3药剂是抗ErbB3抗体。在该方法的某些实施方案中，样品细胞中ErbB3水平通过如下过程推断确定：测量其他更稳定的生物标志的水平，并使用计算机化方法即使用计算***产生计算(基于样品细胞中其他生物标志的实际经验测量水平)网络激活状态的计算机模型，所述网络激活状态通过模拟确定样品细胞中pErbB3的水平。
在一个这样的实施方案中，提供了治疗具有恶性肿瘤的患者的方法，包括：获得肿瘤样品，测定样品中pErbB3的水平，并随后给患者施用至少一种抗肿瘤治疗剂，其中，如果样品中测定的pErbB3的水平不低于在无血清培养基(例如RPMI)中培养20-24小时后的ACHN肾癌细胞(ATCC No.CRL-1611)培养物中测量的pErbB3水平的50％，则随后给患者施用的至少一种抗肿瘤治疗剂包括抗ErbB3抗体，并且如果在所述样品中测定的pErbB3水平低于在ACHN肾癌细胞培养物中测量的pErbB3水平的50％，则随后给患者施用的至少一种抗肿瘤治疗剂不包括抗ErbB3抗体。
在某些方面，本发明提供了使用计算***的计算机化方法，所述计算***包括至少一个配置用于接收输入的输入装置和至少一个配置用于提供输出的输出装置，所述方法用于预测包含细胞网络(例如，ErbB信号传导途径)的细胞(例如，肿瘤细胞)对靶向所述细胞网络内组分的治疗剂的治疗的应答，所述方法包括：(a)通过所述计算***输入装置接收鉴定在细胞样品中测量的细胞网络中一种或多种组分的水平的输入；(b)利用所述计算***，使用所述细胞网络的计算模型根据所述输入计算细胞的网络激活状态(NAS)或网络抑制状态(NIS)；和(c)至少部分地基于在(b)中计算的NAS或NIS，利用所述计算***产生并在所述输出装置提供细胞对所述治疗剂的治疗的预测应答。
在进一步方面，提供了预测细胞对靶向细胞所包含的细胞网络(例如，ErbB信号传导途径)内组分的治疗剂的治疗的应答的方法，所述方法包括：(a)在细胞样品中测量所述细胞网络内一种或多种组分的水平；和(b)应用计算机实现的方法，包括：(i)使用具有一个或多个测量的水平的细胞网络输入的计算模型计算细胞的网络激活状态(NAS)或网络抑制状态(NIS)；并(ii)至少部分地基于(i)中计算的NAS或NIS计算并输出细胞对治疗剂治疗的预测应答。在某些实施方案中，此类方法可以进一步包括基于细胞对治疗剂的预测应答来使用治疗剂治疗细胞或从其获得细胞的患者。
本文还提供了用于预测细胞对靶向细胞网络(例如，ErbB信号传导途径)内组分的治疗剂治疗的应答的方法，所述方法包括：(a)在细胞样品中测量所述细胞网络内一种或多种组分的水平；和(b)应用计算机实现的方法，包括：(i)通过将统计分类算法应用到输入测量水平来计算细胞网络的计算模型，并基于此计算细胞的NAS或NIS；和(ii)至少部分地基于计算的NAS或NIS预测细胞对治疗剂治疗的应答。在某些实施方案中，此类方法可以进一步包括基于细胞对治疗剂的预测应答来使用治疗剂治疗细胞或从其获得细胞的受试者。
本发明还提供了使用计算***的计算机化方法，所述计算***包括至少一个配置用于接收输入的输入装置和至少一个配置用于提供输出的输出装置，所述方法用于预测细胞对靶向细胞网络内组分的治疗剂的治疗的应答，此类方法包括：(a)通过所述计算***输入装置接收鉴定在细胞样品中测量的细胞网络中一种或多种组分的水平的输入；(b)利用所述计算***，使用所述细胞网络的计算模型计算细胞的网络激活状态(NAS)或网络抑制状态(NIS)；(c)使用所述计算***应用统计分类算法；和(d)至少部分地基于统计分类算法的输出，使用计算***产生并随后在所述输出装置提供细胞对治疗剂治疗的预测应答。
还提供了预测细胞对靶向ErbB信号传导途径的组分的治疗剂的治疗的应答的方法。某些此类方法包括：(a)在细胞样品中测量(i)调蛋白(heregulin)(HRG)和(ii)至少一种选自ErbB1、ErbB2和ErbB3的受体的水平；和(b)使用计算机，基于在(a)中测量的水平来预测细胞对所述治疗剂的治疗的应答，其中HRG和至少一种受体相对于对照的升高的水平预测对所述治疗剂的治疗的应答性。其他此类方法包括：(a)在细胞样品中测量ErbB1/ErbB3异二聚体、ErbB2单体、ErbB2/ErbB2同二聚体、磷酸化ErbB2/ErbB2同二聚体、ErbB2/ErbB3异二聚体、磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体和磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体、ErbB2/ErbB4异二聚体、磷酸化ErbB2/ErbB4异二聚体、ErbB3/ErbB4异二聚体、磷酸化ErbB3/ErbB4异二聚体的一种或多种的水平；和(b)基于(a)中测量的水平，使用计算机预测细胞对所述治疗剂的治疗的应答，其中ErbB1/ErbB3异二聚体、ErbB2单体、ErbB2/ErbB2同二聚体、ErbB2/ErbB3异二聚体、磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体或磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体相对于对照的水平差异预测对所述治疗剂治疗的应答性。在某些实施方案中，此类方法可以进一步包括基于细胞对治疗剂的预测应答来使用治疗剂治疗细胞或从其获得细胞的受试者。
本发明还提供使用计算***的计算机化方法，所述计算***包括至少一个配置用于接收输入的输入装置和至少一个配置用于提供输出的输出装置，所述方法用于预测细胞对靶向ErbB信号传导途径的组分的治疗剂的治疗的应答。某些此类方法包括：(a)通过所述计算***输入装置接收鉴定(i)HRG和(ii)至少一种选自ErbB1、ErbB2和ErbB3的受体的测量水平的输入，所述水平已经在细胞样品中测量；和(b)基于所测量的水平，利用所述计算***产生并然后在所述输出装置提供细胞对所述治疗剂的治疗的预测应答，其中HRG和至少一种受体相对于对照的升高的水平预测对所述治疗剂的治疗的应答性。其他此类方法包括：(a)通过所述计算***输入装置接收鉴定ErbB1/ErbB3异二聚体、ErbB2单体、ErbB2/ErbB2同二聚体、ErbB2/ErbB3异二聚体、磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体和磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体的一种或多种的测量水平的输入，所述水平已经在细胞样品中测量；和(b)基于所测量的水平，使用所述计算***产生并提供细胞对所述治疗剂的治疗的预测应答，其中ErbB1/ErbB3异二聚体、ErbB2单体、ErbB2/ErbB2同二聚体、ErbB2/ErbB3异二聚体、磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体或磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体相对于对照的水平差异预测对所述治疗剂治疗的应答性。
在其他方面，本文提供了用于预测细胞对靶向细胞网络内组分的治疗剂的治疗的应答的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)用于检测所述细胞网络的一种或多种组分的水平的测定；和(b)使用所述细胞网络的计算模型计算细胞的网络激活状态(NAS)或网络抑制状态(NIS)的说明书。在某些实施方案中，此类试剂盒还包括：(c)使用所述试剂盒来预测细胞对所述治疗剂的治疗的应答的说明书。
本发明还提供了鉴定用于预测细胞对靶向细胞网络内组分的治疗剂的治疗的应答的生物标志的方法，所述方法包括：(a)在细胞样品中测量所述细胞网络的一种或多种组分的水平；和(b)应用计算机实现的方法，所述计算机实现的方法包括：(i)使用所述细胞网络的计算模型计算所述细胞网络的一种或多种其他组分的水平；和(ii)鉴定其计算水平预测细胞对治疗剂治疗的应答的细胞网络组分，从而鉴定所述组分为预测细胞对所述治疗剂治疗的应答的生物标志。
本文还提供了使用计算***的计算机化方法，所述计算***包括至少一个配置用于接收输入的输入装置和至少一个配置用于提供输出的输出装置，所述方法用于鉴定用于预测细胞对靶向细胞网络内组分的治疗剂的治疗的应答的生物标志，所述方法包括：(a)通过所述计算***输入装置接收鉴定在细胞样品中测量的细胞网络的一种或多种组分的测量水平的输入；(b)利用所述计算***，使用所述细胞网络的计算模型计算细胞网络的一种或多种其他组分的水平；和(c)利用所述计算***鉴定其计算水平预测细胞对治疗剂治疗的应答的细胞网络组分，从而将该组分鉴定为用于预测细胞对所述治疗剂治疗的应答的生物标志。
在其他方面，本发明提供了计算机程序产品，包括一种或多种存储了计算机可执行指令的计算机可读存储介质，所述计算机可执行指令在被执行时实现任何前述方法。
附图简述
图1A-1D是显示Ab#6抗体治疗对异种移植肿瘤生长的抑制的图。图1A显示了MALME3M异种移植肿瘤模型的结果。图1B显示DU145异种移植肿瘤模型的结果。图1C显示ADRr异种移植肿瘤模型的结果。图1D显示ACHN异种移植肿瘤模型的结果。
图2是描绘未治疗的异种移植肿瘤中磷酸化ErbB3(pErbB3)浓度(pg/μg总蛋白)对用Ab#6治疗的异种移植物生长速率降低(％)的图。
图3A-3E是显示在异种移植物解剖之后0、10、30或60分钟冷冻的ACHN异种移植肿瘤样品中pErbB3(图3A)和磷酸化AKT(pAKT)(图3B)水平以及在异种移植物解剖之后0、10、30或60分钟冷冻的EKVX异种移植肿瘤样品中ErbB1(图3C)、ErbB2(图3D)和ErbB3(图3E)水平的条线图。
图4A-4D显示将信号传导途径动画图转化为计算模型的过程的示意图。图4A显示包括不同配体和ErbB受体的ErbB信号传导途径的动画图。图4B显示描述动画图中所示蛋白相互作用的一组生化反应。图4C显示从所述一组生化反应得到的一组变化(flux)。图4D显示了基于质量作用动力学的一组非线性常微分方程式，描述了信号转导网络。
图5A-5B是显示在ADRr卵巢癌细胞中用九种不同浓度的调蛋白(HRG)(图5A)或β细胞调节素(betacellulin)(图5B)刺激的细胞中磷酸-ErbB3、磷酸-ErbB2、磷酸-ErbB1和磷酸-AKT水平随时间的图。根据模拟结果(实线)校准计算模型参数来描述实验数据(点)。
图6是显示鉴定ErbB3激活的关键标志的局部灵敏度分析结果的条线图。
图7是显示MALME3M、DU145、ADRr和ACHN细胞系中pErbB3的计算水平的图。
图8A-8B是显示基于从4个培养细胞系(MALME3M、DU145、ADRr和ACHN)建立的NAS阈值，使用NAS值预测15个细胞系对Ab#6治疗应答性的图。图8A是描绘19个细胞系模拟的pErbB3水平的条线图，从最高到最低的pErbB3水平。图8B是将19个细胞系从最高到最低NAS值分级的图，NAS值低于MALME3M的细胞系被分级为非应答者(NR)，NAS值高于ADRr的细胞系被分级为应答者，NAS值在MALME3M和ADRr之间的细胞系被分级为中间者。
图9A-9C是显示Ab#6抗体治疗对异种移植肿瘤生长的抑制的图。图9A显示IGROV1异种移植肿瘤模型的结果。图9B显示OVCAR8异种移植肿瘤模型的结果。图9C显示SKOV3异种移植肿瘤模型的结果。
图10A-10D是其中一个ErbB受体的浓度对数对一个或多个其他ErbB受体的浓度对数绘图的图。显示了分类为Ab#6应答者或非应答者的细胞系的受体值。图10A描绘ErbB2对ErbB1作图。图10B描绘ErbB3对ErbB1作图。图10C描绘ErbB2对ErbB3作图。图10D描绘ErbB1对ErbB2对ErbB3作图。
图11显示其中HRG的对数浓度对ErbB1的对数浓度绘图的图。在该图中，在异种移植物研究中测试的应答与非应答细胞系分开。
图12A-12C是其中描绘了异种移植细胞系和人肿瘤样品中ErbB信号传导途径的不同组分的对数标准化表达水平(pg/μg，通过ELISA测定)的图。图12A描绘了ErbB2对ErbB1作图。图12B描绘了ErbB4对ErbB3作图。图12C描绘了HRG-β1对BTC作图。
图13A-13D是显示异种移植细胞系和人肿瘤样品的定量免疫组织化学(qIHC)结果的图。图13A显示ErbB1的细胞系标准曲线。图13B、13C和13D是分别描绘在异种移植细胞系(红色条)和人肿瘤样品(蓝色条)中ErbB1、ErbB2和ErbB3的qIHC评分的条线图。
图14是显示对八个细胞系计算的积分磷酸化ErbB1:3异二聚体水平(每个细胞时间积分的异二聚体的量)的条线图，将它们分成Ab#6非应答者(MALME3M、BT474、IGROV1和ADRr)和应答者(OVCAR8、SKOV3、DU145和ACHN)。
图15A和15B是包括各种功能步骤和动作的流程图，所述功能步骤和动作可以在本发明某些实施方案实施过程中进行。
图16是可用于实施本发明某些方面的计算环境的一个实施方案。
图17A-D是用双特异性抗体H3x B1D2治疗的细胞的抑制曲线图。图17A和17B分别显示在OVCAR8细胞中对pErbB3水平和pAKT水平的抑制曲线。图17C和17D分别显示在HER2/ErbB2转染的OVCAR8细胞(OVCAR8-HER2细胞)中对pErbB3水平和pAKT水平的抑制曲线。实线代表从计算模型模拟的数据，而圆圈代表实验测定的数据。还显示了模拟的IC50值(DR50模拟)和实验测定的IC50值(DR50数据)。
图18A-D显示了用双特异性抗体H3x B1D2治疗的细胞的抑制曲线图。图18A和18B分别显示在ADrR细胞中对pErbB3水平和pAKT水平的抑制曲线。实线代表从计算模型模拟的数据，而圆圈代表实验测定的数据。还显示了模拟的IC50值(DR50模拟)和实验测定的IC50值(DR50数据)。图18C和18D分别显示用ErbB1 RNAi模拟治疗的ADrR细胞中pErbB3水平和pAKT水平的模拟抑制曲线。
图19A-C是在用H3x B1D2治疗的异种移植模型中一组肿瘤细胞的体内测定的相对生长速率(RGR)对不存在H3x B1D2时所述组的肿瘤细胞中ErbB2单体(图19A)、ErbB2:ErbB2同二聚体(图19B)和ErbB2:ErbB3异二聚体(图19C)的计算水平描绘的图。
图20A-B是在用H3x B1D2治疗的异种移植模型中一组肿瘤细胞的体内测定的相对生长速率(RGR)对模拟的不存在和存在H3x B1D2时所述组的肿瘤细胞中ErbB2:ErbB3异二聚体(图20A)和ErbB1:ErbB3异二聚体(图20B)的计算相对水平描绘的图。
图21提供了在所示HRG剂量下ErbB2过表达细胞系BT474-M3的预测的(绘制的线)和实际的(数据点)HRG诱导的pErbB3和pAKT信号传导数据的图示，在实施例11中详述。
发明详述
本发明大体上提供其中一种或多种细胞信号传导途径中一种或多种元件(例如ErbB3)通过使用间接标志而非通过直接测量所述一种或多种元件的水平来确定的方法、***和计算机程序产品。所述间接测量可以通过计算机模拟来测定信号传导途径中元件的激活状态，所述计算机模拟建立信号传导途径模型。使用本文提供的方法，这种信息可用来预测细胞对治疗剂的应答性，由此选择用于具有疾病或疾患(例如，癌症)的患者的治疗性治疗。
通过使用本发明，可以实现肿瘤细胞样品的代表性磷酸化特征的确定。这允许使用磷酸化细胞蛋白作为对治疗剂应答性的生物标志而不需要直接测量患者样品中此类磷蛋白的水平，由此避免与磷蛋白测量相关的潜在问题(例如，不稳定性、不可靠性)。此类模拟确定的磷酸化特征可以用来精确预测细胞对抗肿瘤治疗剂的应答性，并因此可用于避免给患者施用对治疗患者癌症无效的癌症药物。而且，所公开的方法允许模拟细胞网络内其他不稳定组分的水平，所述组分例如细胞网络中受体的同二聚体和/或异二聚体，或者磷酸化同二聚体和/或异二聚体，这些组分还可以用于预测细胞对治疗剂的应答性。而且，所公开的方法允许模拟治疗剂对细胞网络内组分的作用，其还可以用于预测细胞对治疗剂的应答性。
在某些实施方案中，细胞网络内一种或多种不稳定细胞组分(例如，细胞表面受体、配体及类似物)的水平在细胞样品(例如，肿瘤活检或切除肿瘤中的细胞)中测量。基于这些测量，使用一种或多种信号转导网络的计算模型(例如，机械计算模型)计算细胞的网络激活状态(或NAS)或网络抑制状态(NIS)。例如，NAS可以是代表细胞网络内磷酸化蛋白(还未直接测量)的计算水平的数值。可选地，NIS可以是代表在治疗剂的模拟存在时细胞网络内组分的计算水平(与治疗剂的模拟不存在时的组分水平相比较)的数值。通过比较计算的NAS或NIS与代表应答性或非应答性阈值的对照值，可以预测细胞是否能对治疗剂治疗应答。
因此，公开了对治疗的细胞应答性的“间接”标志的用途，其中“间接”标志(例如激活的信号传导途径内磷酸化蛋白或二聚体)的水平不是直接测量而是基于直接测量的其他细胞组分的水平而计算或模拟的。所述方法还包括统计分类算法例如与NAS或NIS的计算相组合的用途。
在本发明的上下文中，如在本文实施例部分中进一步描述的，ErbB信号传导途径的机械计算模型已经成功用于计算磷酸化ErbB3(pErbB3)的水平，作为ErbB细胞网络(或NAS)的激活指示器，并且显示模拟的pErbB3水平准确预测肿瘤细胞系在体内异种移植***中对抗ErbB3抗体Ab #6治疗的应答性。因此，如在实施例部分进一步描述的，ErbB信号传导途径的机械计算模型已经成功用于计算在治疗剂的模拟不存在和存在时ErbB2/ErbB3异二聚体和ErbB1/ErbB3异二聚体的相对水平，以作为ErbB细胞网络(或NIS)抑制的指示，并且显示ErbB2/ErbB3和ErbB1/ErbB3异二聚体的模拟的相对水平准确预测肿瘤细胞系在体内异种移植***中对抗ErbB3x抗ErbB2双特异性抗体H3x B1D2治疗的应答性。
为了可以更容易理解本发明，首先定义了某些术语。
本文使用的术语“治疗剂”意图包括有能力降低或抑制疾病或疾患症状严重度、或增加疾病或疾患中无症状或症状减少期的频率和/或持续时间、或抑制或预防由于疾病或疾患影响的损伤或残疾、或抑制或延迟疾病或疾患的进展、或抑制或延迟疾病或疾患的发作、或抑制或预防感染性疾病或疾患的感染的任何和所有化合物。治疗剂的非限制性实例包括有机小分子、单克隆抗体、双特异性抗体、重组工程化生物制品、RNAi化合物等。
如本文使用的，“靶向细胞网络内组分”的治疗剂是指这样的试剂，其治疗活性至少部分源于对细胞网络内组分的活性具有特异性的直接或间接影响的该试剂。靶向细胞网络内组分的治疗剂的非限制性实例包括特异性结合ErbB1、由此特异性靶向ErbB细胞网络内ErbB1的单克隆抗体西妥昔单抗以及特异性抑制ErbB1的酪氨酸激酶(TK)结构域、由此特异性靶向ErbB细胞网络内ErbB1-TK的小分子吉非替尼(gefitinib)。
本文使用的术语″网络激活状态″或″NAS″指反映或对应于细胞网络的激活水平的指示，通常为数值。NAS通常使用细胞网络的计算模型来计算。NAS可以代表例如细胞网络内一种或多种磷酸化蛋白的模拟水平。尽管一种或多种磷蛋白水平是NAS的优选实施方案(例如，如实施例7中进一步描述的pErbB3水平或实施例10中进一步描述的磷酸化ErbB同二聚体或异二聚体水平，例如pErbB1/ErbB3异二聚体水平，或者下游激酶例如PI3K的水平)，但激活的信号传导途径内其他细胞组分也可以用作网络激活指示并因此可以用作NAS，包括但不限于受体二聚化(同二聚体和异二聚体，例如ErbB1/ErbB1或ErbB2/ErbB2同二聚体的水平，或者ErbB1/ErbB2、ErbB1/ErbB3、ErbB1/ErbB4、ErbB2/ErbB3或ErbB2/ErbB 4异二聚体的水平)、蛋白剪切、转录因子激活和基因表达激活。细胞例如肿瘤细胞的网络激活状态是细胞对信号传导途径依赖性的指示，其可以被靶向该特定信号传导途径的治疗剂抑制。
本文使用的术语″网络抑制状态″或″NIS″指反映或对应于细胞网络的抑制水平的指示，通常为数值。NIS通常使用细胞网络的计算模型来计算。NIS可以代表例如在治疗剂的模拟存在时细胞网络内一种或多种组分的模拟水平，与治疗剂的模拟不存在时的模拟水平相比较(或相对于)。例如，NIS可以是治疗剂的模拟存在时一种或多种组分的水平与治疗剂的模拟不存在时所述一种或多种组分的水平的比值。NIS的非限制性实例是在治疗剂的模拟不存在和存在时计算的一种或多种同二聚体或异二聚体的计算相对水平(例如，ErbB2/3和ErbB1/3异二聚体的相对水平)(即，与在治疗剂的模拟不存在时水平相比的在治疗剂的模拟存在时的水平)。然而，要理解，其水平受到治疗剂调节的信号传导途径内的其他细胞组分也可以用作网络抑制的指示，因此它们的水平可以用作NIS的指示。细胞例如肿瘤细胞的NIS和细胞的NAS是治疗剂对细胞信号传导途径内组分的影响的指示，并且可以预测细胞对治疗剂效应的应答性。
术语″细胞网络的计算模型″指诸如计算机程序的模型，其将生物途径图或动画图(例如，与癌症相关的一组蛋白相互作用)转换成一组可用于随后模拟和分析的数学公式。某些信息(例如，配体和/或受体蛋白浓度、速率常数)可以被输入模型，然后，所述模型可以模拟可能难以测量的其他信息(例如，磷蛋白水平)。细胞网络的网络激活状态(或NAS)或网络抑制状态(或NIS)可以使用本文所述的细胞网络的计算模型计算。
本文使用的术语″算法″一般指用于执行方法或解决问题的一组指令、程序或公式。术语″统计分类算法″指确定一个或多个可测量参数或输入(例如，组织样品中测量的蛋白水平)与特定结果或输出(例如，对治疗剂的应答性)之间的统计关系，从而可以进行分类或预测(例如对治疗剂的应答者与非应答者)的算法。
本文使用的术语“生物标志”指细胞内或由细胞表达的物质(例如，蛋白、mRNA、等位基因)，其中生物标志与疾病对给定治疗的应答性相关。
本文使用的术语“直接生物标志”指细胞内或由细胞表达的物质(例如，蛋白、mRNA、等位基因)，其中直接生物标志与疾病对给定治疗的应答性相关，并且其中所述物质的存在或水平在细胞中直接测量以预测疾病对给定治疗的应答性。
本文使用的术语“间接生物标志”指细胞内或由细胞表达的物质(例如，蛋白、mRNA、等位基因)，其中间接生物标志与疾病对给定治疗的应答性相关，并且其中所述物质的存在或水平不在细胞中直接测量而是通过间接方式确定，例如通过使用计算模型的模拟，以预测疾病对给定治疗的应答性。
本文使用的“抗体”是由一种或多种多肽组成的蛋白，包括基本由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的结合结构域，其中所述蛋白免疫特异性结合抗原。公知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及许多免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其转而分别定义免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。典型的免疫球蛋白结构单元包括由两个相同多肽链对组成的四聚体，每对具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。″VL″和“VH″分别指这些轻链和重链。
抗体包括完整免疫球蛋白及其抗原结合片段，其可以通过各种肽酶消化而产生或者化学地或使用重组DNA技术从头合成。此类片段包括例如F(ab)2二聚体和Fab单体。优选的抗体包括单链抗体(作为多肽单链存在的抗体)，更优选其中VH和VL链结合在一起(直接或通过肽接头)形成连续多肽的单链Fv抗体(scFv)。5,132,405和4,956,778)。
″免疫特异性″或″免疫特异性地″指经由基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的结构域结合感兴趣蛋白的一个或多个表位的抗体，但是基本上不识别和结合含有混合抗原分子群体的样品中的其他分子。通常，抗体以至少50nM的Kd结合同源抗原，通过表面等离子体共振测定或细胞结合测定来测量。此类测定的使用是本领域公知的，并且在本文实施例13中示例说明。
″抗ErbB3抗体″是免疫特异性结合ErbB3胞外域的分离的抗体。这种与ErbB3的结合表现出至少50nM的Kd，通过表面等离子体共振测定或细胞结合测定来测量。抑制EGF样配体介导的ErbB3磷酸化的抗ErbB3抗体是优选的。EGF样配体包括EGF、TGFα、β细胞调节素、肝素结合表皮生长因子、biregulin、表原(epigen)、表皮调节素(epiregulin)和双调蛋白，其通常结合ErbB1并诱导ErbB1与ErbB3的异二聚化。
本文使用的术语″双特异性″指包括两个抗原结合位点的蛋白，一个结合位点对第一抗原或表位具有亲和力，第二结合位点对不同于第一个的第二抗原或表位具有结合亲和力。
本文使用的术语“受试者”或“患者”包括具有对治疗剂治疗的应答可以使用本发明方法预测的疾病或疾患的任何人或非人动物，例如具有肿瘤的受试者或患者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、母牛、小鸡等。
本发明的许多实施方案包括一种或多种计算***，例如特殊目的和一般目的的计算机，包括各种计算机硬件，例如输入装置、输出装置、处理器、存储介质和其他相应的计算机组件。
本发明的许多实施方案还包括计算机可读储存介质，所述计算机可读存储介质具有储存在其上的计算机可执行指令或数据结构(包括其中定义的指令和数据，例如机械计算模型、测量的蛋白和生物标志水平、分类算法、突变状态等)，并且其被特别配置用于实现本文描述并要求保护的方法。此类计算机可读存储介质可以是任何可用介质，其可以通过一般目的或特殊目的的计算机访问。作为例子而非限制，此类计算机可读存储介质可以包括RAM、ROM、EEPROM、CD-ROM或其他光盘存储装置、磁盘存储装置或其他磁存储装置，或者任何可以用于存储计算机可执行指令或数据结构形式的所需程序代码工具、模块和软件并且可以通过一般目的或特殊目的计算机访问的其他介质。
在一些情况下，传输介质还可以用于携带计算机可执行指令，使得本发明还扩展至包括携带可被执行以进行本文描述的一种或多种方法的计算机可执行指令的传输介质的应用、***和其他实施方案。当信息经网络或另一种通信连接(硬线、无线或硬线或无线的组合)被传递或提供给计算机时，计算机完全将所述连接视作计算机可读传输介质。
术语“计算机可执行指令”、“可执行指令”、“模块”和“计算模块”有时在本文可互换使用，来指可通过一种或多种计算处理器和一种或多种计算***的处理组件访问和执行以实现本文所描述和权利要求所述的本发明某些方法的计算机代码、数据结构和软件。
有关前述的其他方面和本公开的各种其他方面在下面章节更详细描述，下面章节不应被解释为限制性的。
I.机械计算模型
机械计算模型可以被视为蛋白网络中分子相互作用的预测性数学描述。在至少某些实施方案中，本文提供的用于预测对治疗剂应答的方法包括使用机械计算模型。机械计算模型将生物途径图或动画图(例如，沿信号转导途径(例如与癌症相关的途径)出现的一组蛋白相互作用)转换成一组可用于随后模拟和分析的数学公式。因此，构建模型的第一步是产生生物途径的详图或动画图展示，其包括途径中涉及的相关蛋白和分子。必须做出将包括哪些蛋白和分子以及使它们关联的生物反应的关键决策。科学文献中可获得的有关哪些蛋白和分子参与途径以及哪些生物反应使它们关联的信息被收集并用于产生生物途径的动画图展示。
生物途径动画图展示一经产生，将该信息转换为代表途径(还称为细胞网络)中蛋白-蛋白相互作用的公式***。代表信号转导网络的生化反应网络的计算模型是基于例如非线性常微分方程(ODE)、随机模型、布尔(boolean)或模糊逻辑模型或petri网。它们包括微分方程，需要必须实验测量或估计的两种类型的参数：初始物类数目(第i物类的c0，i)和速率常数(第j速率的kj)。构建计算模型的过程的示意图显示于图4A-D，其示例说明ErbB信号传导途径的动画图(图4A)，该途径转换为生化反应和变化的组(图4B和4C)，以及通过一组微分方程展示蛋白-蛋白相互作用(图4D)。
计算模型通常被构建为写入计算机脚本语言的一组可执行指令，例如使用MATLAB软件Simbiology(The Math Works，Natick，MA)，任选结合The Systems Biology Toolbox 2 for MATLAB(SBtoolbox2.org)或JACOBIAN建模软件(Numerica Technology，Cambridge，MA)。然而，要理解，本发明范围还扩展至用不同于MATLAB或JACOBIAN软件和界面构建的计算模型的用软件和界面构建的计算模型的开发和使用。本发明还扩展至利用已经由第三方预先构建并下载至实现本发明其他方面的计算***的计算模型的实施方案。
在模型校核之前，基于来自科学文献的信息，尽可能多的参数的值被指定并输入计算***，例如蛋白水平、结合亲和力、配体与其同源受体的结合速率常数。科学文献中不可获得的参数值可以通过实验获得。
通过根据被输入进行训练的计算***的实验获得的数据来优化模型的输出，来“训练”模型。通过使模型拟合实验数据，选择优化的模型参数组。模型校核过程包括调整假设和参数估计。为了校核模型，必须首先鉴定在生物学上对于将配体刺激转换成下游信号传导事件特别重要的蛋白和参数亚组。这一过程被称为灵敏度分析，更准确地，其是测量响应于途径内蛋白浓度和动力学参数的输出变化(例如底物磷酸化)的数学工具。通过下述方程给出有关第j速率常数(kj)变化的第i可见的ci(t)的完全标准化的灵敏度(sij(t))：
s ij ( t ) ≡ ∂ ln ( c i ( t ) ) ∂ ln ( k j )
然后通过计算***使用局部和全局优化方法(例如但不限于遗传算法、模拟退火、Levenberg-Marquardt优化、等等)进行模型校核，所述优化方法通过改变灵敏度分析中鉴定的参数和初始蛋白浓度而使实验数据和模拟结果之间差距最小。计算***可以被配置用于在校核过程中自动改变参数或者仅响应于逐步增加的用户输入而改变参数。
各种信号传导途径的许多计算模型已经描述于科学文献(参见例如，Kholodenko，B.N.等人(1999)J.Biol.Chem.274：30169-30181；Schoeberl，B.等人(2002)Nat.Biotech.20：370-375；Hayakeyama，M.等人(2003)Biochem.J.373：451-463；Nielsen，U.B.和Schoeberl，B.(2005)IDrugs 8：822-826；Schoeberl，B.等人(2006)Conf.Proc.IEEE Eng.Med.Biol.Soc.1：53-54；Schoeberl，B.等人(2006)IBM J.Res.Dev.50：645；Fitzgerald，J.B.等人(2006)Nat.Chem.Biol.2：458-466；Kholodenko，B.N.(2007)Nat.Cell.Biol.9：324-330；Birtwistle，M.R.等人(2007)Molecular Systems Biology 3：144；Hinow，P.等人(2007)Theoretical Biology and Medical Modelling 4：14)。此外，构建和使用计算模型被综述于Kholodenko，R.N.(2006)Nature Reviews：Mol Cell.Biol.7：165-176和Kumar，N.等人(2006)Drug Discovery Today 11：806-811。
本文提供的某些方法中使用的计算模型之一是ErbB信号传导途径的模型。ErbB信号传导途径的代表性计算模型的构建详细描述于实施例4。本文使用的术语″ErbB信号传导途径″意图包括信号转导途径，所述信号转导途径通过配体与ErbB家族受体的相互作用而开始。ErbB信号传导途径内的组分可以包括：(i)一种或多种配体，实例包括HRG、β细胞调节素(BTC)、表皮生长因子(EGF)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、转化生长因子α(TGFα)、双调蛋白(AR)、表原(EPG)和表皮调节素(EPR)；(ii)一种或多种受体，实例包括ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4；和(iii)细胞内激酶、磷酸酶和底物，实例包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)、磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)、磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)、丙酮酸脱氢酶激酶同工酶1(PDK1)、AKT、RAS、RAF、MEK、细胞外信号调节激酶(ERK)、蛋白磷酸酶2A(PP2A)和SRC蛋白酪氨酸激酶。
本文提供的某些方法中使用的另一计算模型是IGF1R信号传导途径的模型。本文使用的术语″IGF1R信号传导途径″意图包括信号转导途径，所述信号转导途径通过配体与胰岛素生长因子1家族受体的相互作用而开始。IGF1R信号传导途径内的组分可以包括：(i)一种或多种配体，其实例包括胰岛素生长因子1(IGF1)；(ii)一种或多种受体，其实例包括IGF1R和胰岛素受体；(iii)一种或多种IGF结合蛋白，和(iv)细胞内激酶和底物，其实例包括胰岛素受体底物2(IRS2)、PI3K、AKT、Bcl-2相关蛋白BAD、RAS、RAF、MEK和促***原激活蛋白激酶(MAPK)。
本文提供的某些方法中使用的另一计算模型是c-Met信号传导途径的模型。本文使用的术语″c-Met信号传导途径″意图包括信号转导途径，所述信号转导途径通过配体与c-Met受体蛋白酪氨酸激酶的相互作用而开始。c-Met信号传导途径内的组分可以包括：(i)一种或多种配体，实例包括肝细胞生长因子1(HGF)；(ii)一种或多种受体，实例包括c-Met受体蛋白酪氨酸激酶；和(iii)细胞内激酶和底物，实例包括PI3K、生长因子受体结合蛋白2(GRB2)、Src同源和胶原蛋白(SHC)、SRC蛋白酪氨酸激酶和GAB1支架蛋白以及RAS、RAF、MEK和促***原激活蛋白激酶(MAPK)。
本文提供的某些方法中使用的另一计算模型是包括两种或多种生长因子信号传导途径的任何组合的模型，例如组合的IGR1R和ErbB受体信号传导、ErbB受体信号传导和c-Met信号传导或IGF1-R、ErbB和c-Met信号传导。
不论前述实施例的特异性，要理解本发明实施方案还可以包括和利用其他计算模型(例如，用于信号传导途径(例如TNF、IL-2、PDGF、FGF、TRAIL、整联蛋白、细胞因子)和实际上任何其他途径)。
在某些实施方案中，可以在计算模型中模拟一种或多种治疗剂的存在。治疗剂的计算展示可以使用质量作用反应方程来构建，所述方程描述了治疗剂与其细胞靶点的接合或描述了治疗剂对建模的细胞途径的作用。结合事件或其他生物效应的参数可以通过直接实验测量，以及通过训练模型来匹配治疗剂对细胞的作用数据而获得。例如，对于抗体试剂，抗体与其靶抗原结合的结合速率和解离速率可以通过标准方法(例如BIACore或KinExA技术)实验确定，这些参数可以被加入计算模型。此外，例如，对于双特异性抗体，作为与双特异性抗体的每个个体靶或与双特异性抗体的两个靶结合的双特异性分子数的量度，交联参数可以用作计算模型的训练参数。通过获得观察到的总结合亲和力(通过标准FACS分析测定)并拟合标准逻辑结合方程，可以获得交联参数。除了前述以外，对于特定治疗剂而言可能药学上相关的并因此在计算模型中展示的其他参数是本领域普通技术人员已知的。
当治疗剂作用要在计算模型中展示时，单个试剂可以被建模，或者多个试剂可以组合建模，从而模拟组合疗法对细胞应答的作用。例如，在一个实施方案中，各自与不同靶抗原结合的两种抗体可以展示在计算模型中。在另一实施方案中，靶向特定信号传导途径(例如，ErbB途径)的抗体和相同信号传导途径(例如，ErbB途径)的小分子抑制剂可以同时展示在计算模型中以评估信号传导途径的此类组合疗法在细胞中的作用。
II.统计分类算法
在至少某些实施方案中，本文提供的用于预测对治疗剂应答的方法(例如使用计算机产生对治疗剂的预测应答)和用于治疗具有恶性肿瘤的方法包括使用一种或多种统计分类算法。
统计模型的一个目标是鉴别例如在组织样品中测量的蛋白水平以及通过生化模型计算的激活水平(例如，网络激活状态或″NAS″)或抑制水平(例如，网络抑制状态或″NIS″)与患者对治疗剂应答之间的关系。因此，统计分类算法定义一种或多种可测量参数或输入(例如，在组织样品中测量的蛋白水平、计算的NAS或NIS值)与特定结果或输出(例如对治疗剂的应答性)之间统计关系，使得可以做出分类或预测(例如，对治疗剂的应答者与非应答者)。因此，统计模型帮助鉴定划分应答者和非应答者的阈值，还帮助定义给定阈值附近的不确定性。
现有技术已描述了各种类型的统计分类***，并且可以适用于本发明方法，其非限制性实例包括主元分析(principal component analysis)(PCA)、偏最小二乘回归(PLSR)、三线性PLSR、模糊逻辑和贝叶斯推理(Bayesian inference)、随机森林(random forest)(RF)、分类和回归树(C&RT)、提升树(boosted tree)、神经网络(NN)、支持向量机(support vector machine)(SVM)、一般卡方自动交互检测模型、交互树、多元自适应回归条(multiadaptive regression spline)、机器学习分类器(machine learning classifier)及其组合。参见例如PCT公布WO 2007/109571。
在优选实施方案中，为了训练统计分类算法，使用本领域的术语：“机器”或“计算***”(例如计算机)通过分析已经借助“分类器”(统计算法)输入计算机的许多“训练”实例，“学***和网络激活状态(NAS)与实际患者应答(例如，应答者、非应答者)之间的关系。该过程被称为″监督学***)和输出(例如，对治疗剂的应答)是已知的样品集合。应用统计分类算法的积分部分是选择信息特征(是任何测量或计算的蛋白水平或蛋白激活水平的特征)以及确定算法产生的评分的优化阈值。
一般优选对单独的样品“测试组”验证统计分类算法，所述样品的输出是已知的，但是没有对分类器公开。通过比较预测与已知结果，可以测量效果。当样品数少时，可能不可行，并且已经有避免该要求的完备技术。其中原理是交叉验证，在下文进一步讨论。分类器的输出是如果想要可以被转换成类别预测的评分。一般而言，训练分类器的方法还包括确定优化阈值的方法。
为了测试做预测的能力，交叉验证中的一般程序是留出一部分数据(一部分样品)作为“训练数据”或“训练(数据)组”；其他数据被称为“测试(数据)组”。通常，该程序被重复多次，每次使用不同的训练数据和测试数据比例。较大的训练组是明显有益的(实例越多，分类器越好)，而大测试组也是如此(你可以证实的预测越多，你对未来预测的可靠性越高)。当样品数量少时，该程序可以被修改，使得单个样品被留出用作测试数据，并使用所有剩余样品训练分类器。对单个留出的样品进行预测。这称为“留一法交叉验证(leave-one-out cross-validation)”(LOOCV)，并且是本领域公知的。该程序依次对每个留出样品重复。一经做出所有预测，评价效果。
在本发明方法中使用的统计分类算法中，各种参数或信息特征或信息条可以用作输入数据。此类输入数据的非限制性实例包括从细胞样品获得的细胞网络的一种或多种组分的蛋白水平、使用计算模型计算的网络激活状态(NAS)或网络抑制状态(NIS)、细胞样品中一种或多种蛋白的突变状态、被考察对治疗应答性的受试者的年龄和被考察对治疗应答性的受试者的性别。
III.细胞样品中细胞组分的水平的测量
在本文提供的用于产生对治疗剂治疗的预测应答和用于治疗具有恶性肿瘤的患者的方法中，一个程序通常包括在细胞样品中测量细胞网络的一种或多种组分的水平，或者可选地将已经从细胞样品获取的测量中获得的细胞网络的一种或多种测量水平输入计算***。例如，可以通过标准方法从肿瘤患者获得肿瘤样品，并且可以在肿瘤样品中测量细胞网络的一种或多种组分的水平。
输入可以是人工录入计算***。在一些情况下，例如当计算机化测量装置与接收和利用输入以实现本发明特征的计算***连接时，输入还可以是自动输入或下载至计算***。就这点而言，还要理解，本文描述的任何测量信息和任何状态信息(例如突变状态信息)以及任何其他组织/患者数据可以通过使用计算机化装置获得，所述计算机化装置自动获得并下载测量和状态信息至一个或多个其他计算***，所述其他计算***利用数据进行所描述的本发明方法。
本文使用的术语组分的“水平”指样品中存在的组分的量或浓度。组分水平可以使用多种公知技术的任何一种来测量。水平通常通过测量蛋白水平来确定，但是可选地，有些情况下水平可以通过测量mRNA水平来确定，随后可以将mRNA水平转化为预测的蛋白水平。蛋白(例如，单体、同二聚体或异二聚体)水平可以使用一种或多种本领域公知技术来测量，其非限制性实例包括定量荧光激活细胞分选(qFACS)、酶联免疫吸附测定(ELISA，Luminex)、免疫组织化学(IHC)、定量免疫组织化学(qIHC)、基于临近性的方法(例如，基于Forster共振能量转移的方法、生物分子荧光互补(BiFC)、VeraTagTM或DNA-Programmed ChemistryTM(DPCTM))、质谱法、Western(免疫印迹)测定和共免疫沉淀。蛋白水平可以表示为pg检测蛋白/μg总蛋白。
可以在细胞裂解物中测定蛋白或mRNA水平。细胞裂解物可以例如如实施例2详述制备。而且，使用ELISA测定蛋白水平的代表性实例详述于实施例2和4，使用qFACS测定蛋白水平的代表性实例详述于实施例4，测量mRNA水平并转换为蛋白水平的代表性实例详述于实施例4(对于HRG-β1)。
肿瘤样品可以是例如新鲜细胞样品、新鲜冷冻的样品或固定组织样品。对于患者组织样品，存档组织块可以比新鲜冷冻样品更容易获得。因此，在优选实施方案中，使用***固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品，并且组分(例如，配体、受体)水平可以通过半定量免疫组织化学(IHC)测定(在实施例9中进一步描述)。为了将半定量IHC信息转换成可用于输入计算模型的浓度，可以将含有受体和/或配体表达水平已知的细胞块或异种移植物的对照载玻片与患者样品相比较。而且，可以确定转换因子以将以无量纲单位(例如，蛋白或mRNA的量)获得的表达水平转换成可以输入计算模型的浓度水平，在实施例4中进一步描述关于BTC和HRG表达水平的转换。
配体mRNA和配体蛋白水平一般良好相关。因此，可以使用qRT-PCR来测定来自肿瘤细胞系和异种移植物以及来自FFPE的细胞裂解物中的mRNA表达水平。
IV.预测对治疗剂应答的方法
在某些方面，本发明提供了预测细胞对靶向细胞网络内组分的治疗剂的治疗的应答的方法。此类方法一般包括在下面预测方法1-5中指示的元素。
预测方法1
(a)通过测量细胞样品中存在的细胞网络的一种或多种组分的水平，获得所述细胞网络的一种或多种组分的水平测量值；和
(b)应用计算机实现的方法，包括：
(i)使用输入测量值的细胞网络的计算模型计算细胞的网络激活状态(NAS)或网络抑制状态(NIS)；和
(ii)至少部分地基于(i)中计算的NAS或NIS计算并输出细胞对治疗剂治疗的预测应答。
预测方法2
(a)在细胞样品中测量所述细胞网络的一种或多种组分的水平；和
(b)应用计算机实现的方法，包括：
(i)使用细胞网络的计算模型计算细胞的网络激活状态(NAS)或网络抑制状态(NIS)；
(ii)应用统计分类算法；和
(iii)至少部分地基于统计分类算法的输出预测细胞对治疗剂治疗的应答。
预测方法3
a)计算***通过输入装置接收鉴定在细胞样品中测量的细胞网络的一种或多种组分的水平的输入；
b)计算***使用细胞网络的计算模型计算细胞的网络激活状态(NAS)或网络抑制状态(NIS)；和
c)计算***至少部分基于b)中计算的NAS或NIS产生并随后在输出装置提供细胞对治疗剂治疗的预测应答。
预测方法4
a)测量样品中细胞网络的一种或多种组分的水平；
b)使用细胞网络的计算模型计算细胞的网络激活状态(NAS)或网络抑制状态(NIS)；
c)应用统计分类算法；和
d)至少部分地基于统计分类算法的输出预测细胞对治疗剂治疗的应答。
预测方法5
a)计算***通过输入装置接收鉴定细胞样品中测量的细胞网络的一种或多种组分的水平的输入；
b)计算***使用细胞网络的计算模型计算细胞的网络激活状态(NAS)或网络抑制状态(NIS)；
c)计算***应用统计分类算法；和
d)计算***基于统计分类算法的输出产生并随后在输出装置提供细胞对治疗剂治疗的预测应答。
上述方法可以但不必需进一步包括：基于细胞对治疗剂的预测应答性，用治疗剂治疗细胞或从其获得细胞的患者。
在各个方面，检测的组分水平用于指示一种或多种特定治疗剂的预测有效性。在许多情况下，这表示如果组分在满足预定截止水平或比值之上(或一些情况下是之下)的标准的水平(或者是相对于其他指定组分的特定浓度比值)被检测到，则预测给定治疗剂是有效的并被施用给患者，而如果组分在不满足相对于预定截止水平或比值的标准的水平或浓度比值被检测到，则治疗剂不被施用给患者。适当的截止水平可以使用常规实践和如本文所述来设定。
为了预测细胞的应答，通常计算许多已知应答细胞和非应答细胞对治疗剂的NAS或NIS值，这些已知应答细胞和非应答细胞的值被用于设定NAS或NIS阈值，指示对治疗剂的应答性或非应答性(进一步描述于实施例7和10)。因此，产生和/或预测的细胞对治疗的应答可以在c)中通过比较b)中计算的NAS或NIS与NAS或NIS阈值来获得，指示对治疗剂的应答性或非应答性。
为了应用统计分类算法，一个或多个信息条被输入算法，或计算***将一个或多个信息条加入算法。例如，该程序可以包括将选自以下的一个或多个信息条输入算法：(i)细胞网络的一种或多种组分的水平；(ii)计算的NAS或NIS；(iii)细胞样品中一种或多种基因的突变状态；(iv)用所述治疗剂治疗的受试者的年龄；(v)用所述治疗剂治疗的受试者的性别；(vi)细胞上***受体(ER)的存在或不存在；(vii)细胞上孕酮受体的存在或不存在；和(viii)细胞上雄激素受体的存在或不存在。附加或可选地，应用统计分类算法可以包括在输入以上(i)-(viii)所列信息条的一个或多个之后计算算法的计算***。因为统计分类算法定义了输入信息与细胞(例如，肿瘤细胞)对治疗的应答性之间的统计关系，细胞对治疗的应答的预测可以基于统计分类算法的输出。
对于预测方法和本文提供的其他方法，优选的细胞网络包括ErbB信号传导途径。在一个实施方案中，被测量并输入方法的计算***的一种或多种组分可以包括ErbB信号传导途径中涉及的一种或多种配体。此类配体的非限制性实例包括HRG(包括HRG-β1、HRG-β2、HRG-α、HRG-3和HRG-4)、BTC、EGF、HB-EGF、TGFα、AR、EPG和EPR。附加或可选地，在方法中测量的一种或多种组分可以包括ErbB信号传导途径中涉及的一种或多种受体。此类受体的非限制性实例包括ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4(本领域还分别称为HER1、HER2、HER3和HER4)。此类受体可以作为个体实体被分析(不论它们是以单体同二聚体或异二聚体出现)，在某些实施方案中，每个同二聚体和异二聚体还可以作为不同组分测量并被输入计算***。例如，测量的组分可以是选自ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、HRG、和BTC的1、2、3、4、5或6种或更多种受体、配体或两者(例如，ErbB1和HRG；或ErbB1、ErbB2和ErbB3)。例如，在一些方法中，计算的NAS模拟在不存在治疗剂时ErbB2/ErbB2同二聚体或ErbB2/ErbB3异二聚体的水平。在其他此类方法中，计算的NIS模拟在存在治疗剂时ErbB2/ErbB3异二聚体或ErbB1/ErbB3异二聚体的水平，与不存在治疗剂时ErbB2/ErbB3异二聚体或ErbB1/ErbB3异二聚体的水平相比较。
在某些上述方法中，计算的NAS模拟ErbB3信号传导途径中一种或多种磷酸化蛋白的水平。例如，计算的NAS可以模拟细胞样品中pErbB3的水平。在可选实施方案中，计算的NAS可以模拟细胞样品中磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体或磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体的水平。
在一个实施方案中，治疗剂包括抗EGFR(抗ErbB1)抗体，其代表性实例是抗ErbB1抗体西妥昔单抗(Erbitux
Figure BPA00001347607400251
ImClone Systems)。抗ErbB1抗体的其他实例包括马妥珠单抗(matuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)和mAb 806(Mishima，K.等人(2001)Cancer Res.61：5349-5354)。在另一实施方案中，治疗剂包括抗ErbB2抗体，代表性实例是曲妥珠单抗(transtuzumab)(Herceptin
Figure BPA00001347607400252
Genentech)。
在另一实施方案中，治疗剂包括抗ErbB3抗体。在优选实施方案中，抗ErbB3抗体包括MM-121，其目前经历I期临床试验。在优选实施方案中，抗ErbB3抗体包括Ab#6，其在WO 2008/100624中进一步描述，并且具有分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的VH和VL序列。在另一实施方案中，抗ErbB3抗体是包括分别为SEQ ID NO：7-9(VH CDR1，2，3)和SEQ ID NO：10-12(VL CDR1，2，3)的Ab#6的VH和VL CDR序列的抗体。抗ErbB3抗体的其他实例包括Ab#3、Ab#14、Ab#17和Ab#19，还进一步描述于WO 2008/100624，并具有分别为SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：25和26、以及SEQ ID NO：33和34的VH和VL序列。在另一实施方案中，抗ErbB3抗体是包含Ab#3的VH和VL CDR序列(分别为SEQ ID NO：13-15和SEQ ID NO：16-18)的抗体，或者包含Ab#14的VH和VL CDR序列(分别为SEQ ID NO：19-21和SEQ ID NO：22-24)的抗体，或者包含Ab#17的VH和VL CDR序列(分别为SEQ ID NO：27-29和SEQ ID NO：30-32)的抗体，或者包含Ab#19的VH和VL CDR序列(分别为SEQ ID NO：35-37和SEQ ID NO：38-40)的抗体。
抗ErbB3抗体的其他实例包括抗体1B4C3和2D1D12(U3 Pharma AG)，两者都描述于美国公布号2004/0197332，以及单克隆抗体(包括其人源化形式)，例如8B8，描述于美国专利5,968,511。
在另一实施方案中，抗ErbB3抗体是包含与第二抗体(例如，抗ErbB2抗体)连接的抗ErbB3抗体的双特异性抗体(例如，融合蛋白)。此类双特异性抗体的优选实例是H3x B1D2，其氨基酸序列在SEQ ID NO：41中列出。在该双特异性抗体中，被称为H3的与ErbB3结合的单链抗体(具有分别如SEQ ID NO：42-44和SEQ ID NO：45-47所示的VH和VLCDR)与被称为B 1D2的结合ErbB2的单链抗体(具有分别如SEQ ID NO：48-50和SEQ ID NO：51-53所示的VH和VL CDR)连接。双特异性抗体H3x B 1D2的抗体组成进一步描述于美国专利号7,332,585和7,332,580以及PCT申请PCT/US2006/023479(公开为WO 2007/084181)和PCT申请PCT/US2007/024287(公开为WO 2008/140493)。
在另一实施方案中，治疗剂包括两种或多种抗ErbB3抗体，每种结合ErbB3上的不同表位。优选地，治疗剂包括三种抗ErbB3抗体，每种结合ErbB3上的不同表位。
在另一实施方案中，治疗剂包括抗ErbB4抗体。在另一实施方案中，治疗剂包括pan-ErbB抑制剂或HER二聚化抑制剂。HER二聚化抑制剂的实例是抗体帕妥珠单抗(pertuzumab)(还称为2C4抗体)，其进一步描述于Agus，D.B.等人(2005)J.Clin.Oncol.23：2534-2543。
在另一实施方案中，治疗剂包括一种或多种ErbB信号传导途径的小分子抑制剂，代表性实例包括可商业途径获自AstraZeneca and Teva的吉非替尼(Iressa
Figure BPA00001347607400261
)和可商业途径获自GlaxoSmithKline的拉帕替尼(lapatinib)(Tykerb
Figure BPA00001347607400262
)。ErbB信号传导途径的小分子抑制剂的其他实例包括CI-1033(PD 183805；Pfizer)、厄洛替尼HCL(erlotinib HCL)(OSI-774；Tarceva
Figure BPA00001347607400263
OSI Pharma)；PKI-166(Novartis)；PD-158780；EKB-569；和Tyrphostin AG 1478(4-(3-氯苯胺基)-6，7-二甲氧基喹唑啉)。
在另一实施方案中，细胞网络包括c-Met(间质上皮转变因子)信号传导途径。在一个实施方案中，a)中测量和/或输入的一种或多种组分可以包括c-Met信号传导途径中涉及的一种或多种配体。此类配体的非限制性实例是肝细胞生长因子(HGF)。附加或可选地，在a)中测量的一种或多种组分可以包括c-Met信号传导途径中涉及的一种或多种受体。此类受体的非限制性实例是c-Met受体蛋白酪氨酸激酶。
鉴于以上，本文提供的预测方法允许预测对靶向c-Met信号传导途径内的组分的治疗剂的细胞应答，例如计算机产生的肿瘤应答预测。治疗剂可以包括例如与c-Met结合的抗体(例如，单克隆抗体)。此类抗c-Met抗体的实例包括AV299(AVEO)；AMG102(Amgen)和5D5(OA-5D5；Genentech)。靶向c-Met信号传导途径的优选治疗剂包括双特异性单克隆抗体，所述双特异性单克隆抗体包含与抗cMet抗体连接的抗ErbB1抗体。此类双特异性抗体的实例进一步描述于PCT公布WO 2005/117973和WO 2006/091209。在另一实施方案中，治疗剂是c-Met信号传导的小分子抑制剂，其实例包括ARQ 197(ArQule)和PHA665752(Christensen，J.G.等人(2003)Cancer Res.63：7345-7355)。
在另一实施方案中，细胞网络包括胰岛素生长因子1受体(IGF1R)信号传导途径。在一个实施方案中，a)中测量的一种或多种组分可以包括IGF1R信号传导途径中涉及的一种或多种配体。此类配体的非限制性实例是胰岛素生长因子1(IGF1)。附加或可选地，在a)中测量的一种或多种组分可以包括IGF1R信号传导途径中涉及的一种或多种受体。此类受体的非限制性实例是IGF1R受体。
鉴于以上，本文提供的预测方法允许预测对靶向IGF1R信号传导途径内的组分的治疗剂的细胞应答，例如计算机产生的肿瘤应答的预测。在优选实施方案中，治疗剂是结合IGF1R的抗体，其实例包括mAb391(Hailey，J.等人(2002)Mol.Cancer.Ther.1：1349-1353)；IMC-A12(Imclone Systems，Inc.)、19D 12(Schering Plough)、H7C10(Goetsch，L.等人(2005)Int.J.Cancer113：316-328)、CP751，871(Pfizer)、SCV/FC(ImmunoGen，Inc.)和EM/164(ImmunoGen，Inc.)。在优选实施方案中，治疗剂是包含与抗ErbB3抗体连接的抗IGF1R抗体的双特异性抗体。此类双特异性抗体进一步描述于PCT公布WO 2005/117973和WO 2006/091209。在另一实施方案中，治疗剂是IGF1R的小分子抑制剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)，其实例包括NVP-AEW541(Novartis)；NVP-ADW742(Novartis)；NVP-TAE226(Novartis)；BMS-536,924(Bristol-Myers Squibb)；BMS-554,417(Bristol-Myers Squibb)；环木脂体，例如苦鬼臼脂素(PPP)(Menu，E.等人(2006)Blood 107：655-660)；和PQ401(Gable，K.L.等人(2006)Mol.Cancer Ther.5：1079-1086)。
在另一实施方案中，治疗剂包括治疗剂组合，其中所述组合包括至少一种靶向ErbB信号传导途径内组分的试剂，例如包括至少一种上述ErbB途径试剂的试剂组合。例如，组合剂可以包括两种或多种靶向ErbB信号传导途径内组分的试剂。可选地，组合剂可以包括至少一种靶向ErbB信号传导途径内组分的试剂和至少一种靶向另一信号传导途径(例如c-Met或IGF1R信号传导途径)内组分的试剂。
在各种其他实施方案中，细胞网络包括两种或多种信号传导途径的组合，例如ErbB信号传导途径与c-Met信号传导途径的组合，或者ErbB信号传导途径与IGF1R信号传导途径的组合。
在本文提供的预测方法的另一实施方案中，此类方法可以进一步包括在细胞样品中确定细胞的一个或多个基因的突变状态的程序。优选地，确定了选自KRAS(Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物)、PI3K和PTEN的至少一个基因的突变状态。附加或可选地，方法可以包括通过输入装置接收鉴定细胞中一个或多个基因的突变状态(例如选自KRAS、PI3K和PTEN的至少一个基因的突变状态的输入)的计算机***。
在预测方法的另一实施方案中，细胞网络包括ErbB信号传导途径，并且a)包括测量和/或输入BTC和AR的测量水平，并且方法还包括确定KRAS基因的突变状态或输入KRAS基因的突变状态。在另一实施方案中，细胞网络包括ErbB信号传导途径，并且a)包括测量和/或输入ErbB1、ErbB2、ErbB3、HRG、BTC、AR、HB-EGF、EGF、TGFα、EPG和EPR的测量水平，并且方法还包括确定KRAS基因的突变状态或输入KRAS基因的突变状态。优选地，对于这些实施方案，b)中计算的NAS模拟ErbB信号传导途径中一种或多种磷酸化蛋白的水平。在另一个优选实施方案中，b)中计算的NAS模拟患者肿瘤样品中磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体的水平。在另一优选实施方案中，b)中计算的NAS模拟患者肿瘤样品中磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体的水平。
在某些上述方法中，计算的许多已知应答细胞和非应答细胞中每一个的对治疗剂的NAS或NIS值被用于设定NAS或NIS的阈值，指示对治疗剂的应答性或非应答性。在其他方法中，细胞对治疗的应答通过比较(b)中计算的NAS或NIS与NAS或NIS的阈值来预测，指示对治疗剂的应答性或非应答性。
V.用于预测对ErbB途径抑制剂应答的生物标志和方法
另一方面，本发明提供了预测细胞(例如，肿瘤细胞)对靶向细胞网络(例如，ErbB信号传导途径)组分的治疗剂的治疗应答性的直接生物标志。此类生物标志可以使用本文提供的计算模型鉴定。用于鉴定此类生物标志的方法一般包括：(a)在细胞样品中测量所述细胞网络的一种或多种组分的水平；和(b)应用计算机实现的方法，所述计算机实现的方法包括：(i)使用所述细胞网络的计算模型计算所述细胞网络的一种或多种其他组分的水平；和(ii)鉴定其计算水平预测细胞对治疗剂治疗的应答的细胞网络组分，从而鉴定所述组分为预测细胞对所述治疗剂治疗的应答的生物标志。
某些用于鉴定用于预测细胞对靶向细胞网络内组分的治疗剂的治疗的应答的生物标志的方法包括：
(a)计算***通过输入装置接收鉴定在细胞样品中测量的细胞网络的一种或多种组分的测量水平的输入；
(b)计算***使用所述细胞网络的计算模型计算细胞网络的一种或多种其他组分的水平；和
(c)计算***鉴定其计算水平预测细胞对治疗剂治疗的应答的细胞网络组分，从而将该组分鉴定为用于预测细胞对所述治疗剂治疗的应答的生物标志。
例如，如实施例10所示例说明的，计算模型可以用于计算细胞网络(例如，ErbB信号传导途径)的一种或多种组分的水平以获得一个或多个NAS值(作为细胞网络激活的量度)，并且可以确定NAS与细胞对治疗剂治疗的应答性的关联。其计算水平将样品分为应答者和非应答者的细胞网络的那些组分还可用作预测治疗应答性的直接生物标志，特别是当那些组分容易通过直接方式测量时。即，本文描述的计算模型/NAS方法可以用于鉴定(计算)预测细胞对治疗剂治疗应答性的组分，一旦鉴定了这样的组分，它们可以作为预测应答性的直接生物标志被直接测量。例如，本文描述的计算模型被用于计算ErbB信号传导途径的同二聚体和异二聚体的水平，将样品分为应答者和非应答者的那些二聚体可以作为预测对肿瘤治疗应答性的直接生物标志被直接测量。
而且，如在实施例8中进一步描述的，目前已经证明针对肿瘤样品中(i)HRG和(ii)至少一种ErbB家族受体(例如ErbB1、ErbB2和ErbB3)的水平的组合测量，根据对靶向ErbB信号传导途径的组分的治疗剂(例如抗ErbB3抗体(例如Ab #6))的治疗的应答性，有效地将肿瘤分为应答者和非应答者。而且，如实施例10进一步描述的，ErbB1/ErbB3异二聚体的水平或磷酸化ErbB1/ErB3异二聚体的水平可以用作对靶向ErbB信号传导途径的组分的治疗剂(例如抗ErbB3抗体(例如Ab#6))的治疗的应答性的直接生物标志。而且，如实施例12中进一步描述的，针对ErbB2单体、ErbB2/ErbB2同二聚体和ErbB2/ErbB3异二聚体的水平，根据对靶向ErbB信号传导途径的组分的治疗剂(例如抗ErbB3x抗ErbB2双特异性抗体(例如，H3x B1D2))的治疗的应答性，有效地将肿瘤分为应答者和非应答者。
如上所述，本发明提供了用于预测细胞对靶向ErbB信号传导途径的组分的治疗剂的治疗的应答的方法。某些此类方法包括：
(a)在细胞样品中测量(i)HRG和(ii)选自ErbB1、ErbB2和ErbB3的至少一种受体的水平；和
(b)使用计算机，基于在(a)中测量的水平来预测细胞对所述治疗剂的治疗的应答，其中HRG和至少一种受体相对于对照的升高的水平预测对所述治疗剂的治疗的应答性。
在某些情况下，测量HRG和ErbB1的水平。在其他情况下，测量HRG和ErbB2的水平，或者测量HRG和ErbB3的水平。在其他情况下，测量HRG和选自ErbB1、ErbB2和ErbB3的至少两种受体的水平，或者测量HRG、ErbB1、ErbB2和ErbB3的水平。在某些情况下，预测可经计算进行，使用包括以下的方法：
(i)计算***通过输入装置接收鉴定(i)HRG和(ii)选自ErbB1、ErbB2和ErbB3的至少一种受体的测量水平的输入，所述水平已经在细胞样品中测量；和
(ii)计算***基于所测量的水平产生并然后在输出装置提供细胞对所述治疗剂的治疗的预测应答，其中HRG和至少一种受体相对于对照的升高的水平预测对所述治疗剂的治疗的应答性。
其应答性被预测的优选治疗剂包括抗ErbB3抗体，更优选Ab#6(具有分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的VH和VL序列)，或者包含分别如SEQ ID NO：7-9(VH CDR1，2，3)和SEQ ID NO：10-12(VLCDR1，2，3)所示的Ab#6VH和VL CDR序列的抗ErbB3抗体。
用于预测细胞对靶向ErbB信号传导途径的组分的治疗剂的治疗的应答的其他方法包括：
(a)在细胞样品中测量ErbB1/ErbB3异二聚体、ErbB2单体、ErbB2同二聚体、ErbB2/ErbB3异二聚体、磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体和磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体的一种或多种的水平；和
(b)基于(a)中测量的水平，使用计算机预测细胞对所述治疗剂的治疗的应答，其中ErbB1/ErbB3异二聚体、ErbB2单体、ErbB2/ErbB2同二聚体、ErbB2/ErbB3异二聚体、磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体或磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体相对于对照的水平差异预测对所述治疗剂治疗的应答性。
预测可以使用包括以下的方法经计算进行：
(i)计算***通过输入装置接收鉴定ErbB1/ErbB3异二聚体、ErbB2单体、ErbB2/ErbB2同二聚体、ErbB2/ErbB3异二聚体、磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体和磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体的一种或多种的测量水平的输入，所述水平已经在细胞样品中测量；和
(ii)计算***基于所测量的水平产生并然后在输出装置提供细胞对所述治疗剂的治疗的预测应答，其中ErbB1/ErbB3异二聚体、ErbB2单体、ErbB2/ErbB2同二聚体、ErbB2/ErbB3异二聚体、磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体和磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体相对于对照的水平差异预测对所述治疗剂治疗的应答性。
在上述方法的某些实施方案中，测量的水平被输入统计分类算法，并基于算法的输出预测细胞对治疗的应答。在其他此类方法中，使用ErbB细胞网络的计算模型基于所测量的水平计算网络激活状态(NAS)或网络抑制状态(NIS)；优选地，基于所计算的NAS或NIS值预测细胞对治疗剂治疗的应答。
在某些实施方案中，测量的水平是ErbB2单体、ErbB2:ErbB2同二聚体和/或ErbB2:ErbB3异二聚体的水平，并且治疗剂是包含与抗ErbB2抗体连接的抗ErbB3抗体的双特异性抗体，如上所述。
用于上述方法的优选细胞是肿瘤细胞，包括上述那些。样品包括肿瘤组织、细针抽吸物、***抽吸物、全血、血清、血浆、淋巴、唾液和尿、或者从其分离的脱落或循环肿瘤细胞。
显然如上所述，测量的水平是蛋白水平(例如单体、同二聚体或异二聚体)或mRNA水平，并且一般可以如上所述测定。
任何上述方法可以但不必需还包括根据所预测的细胞对治疗的应答来选择治疗方案(例如，对于治疗剂)；和/或可以进一步包括基于预测应答制备要使用的治疗剂。
在优选实施方案中，相对于对照的水平差异是升高的水平。上述方法可以但不必需进一步包括基于细胞对治疗剂的预测应答性而使用所述治疗剂治疗细胞或从其获得细胞的受试者(患者)。
对于其中测量ErbB1/ErbB3异二聚体和/或磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体的水平的实施方案，优选地，其应答性被预测的治疗剂是抗ErbB3抗体，更优选Ab#6(具有分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的VH和VL序列)或包含分别如SEQ ID NO：7-9(VH CDR1，2，3)和SEQ ID NO：10-12(VL CDR1，2，3)所示的Ab#6的VH和VLCDR序列的抗ErbB3抗体。
对于其中ErbB2单体、ErbB2/ErbB2同二聚体和/或ErbB2/ErbB3异二聚体的水平被测量的实施方案，优选地，其应答性被预测的治疗剂是抗ErbB3x抗ErbB2双特异性抗体，更优选双特异性抗体H3xB1D2(具有SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列)或包含与含有B1D2的CDR(SEQ ID NO：48-50和51-53)的抗ErbB2抗体连接的含有H3的CDR(SEQ ID NO：42-44和45-47)的抗ErbB3抗体的双特异性抗体。
可以使用本领域已知的方法在细胞样品中测量受体同二聚体或异二聚体或磷酸化受体同二聚体或异二聚体的水平。例如，此类同二聚体或异二聚体可以使用二聚化检测方法测量，例如在美国专利号7,105,308、美国专利号7,255,999、美国公布号20040229380和美国公布号20080187948中描述的那些。这些方法采用探针(例如抗体)对，一个标记探针和一个剪切探针，其中每个探针特异性结合二聚体的一个组分。两个探针与二聚体的结合导致分子标签从二聚体复合物切割和释放，提供二聚体复合物形成的量度。此类测定在本文还称为基于临近性的方法，其可商业途径获得的实例是VeraTagTM***(Monogram Biosciences)。可选地，可以使用本领域已知的用于定量二聚体水平的其他方法，包括但不限于二聚体内组分的共免疫沉淀和使用其他基于临近性的方法，例如基于Forster共振能量转移的方法和生物分子荧光互补(BiFC)(进一步描述于例如Tao，R.H.和Maruyama，I.N.(2008)J.Cell Sci.121：3207-3217)。
在上述直接生物标记方法的一个实施方案中，在a)中测量的水平被输入计算***存储的统计分类算法，并根据基于使用算法和测量水平在计算***的数据计算和转换的算法输出来预测细胞对治疗的应答。在另一实施方案中，使用ErbB细胞网络的计算模型，基于在a)中测量的水平计算网络激活状态(NAS)或网络抑制状态(NIS)。细胞对治疗剂治疗的应答可以至少部分基于计算的NAS或NIS值来预测。
在各种实施方案中，治疗剂包括抗ErbB3抗体、抗ErbB1抗体、抗ErbB2抗体、抗ErbB4抗体、pan-ErbB抑制剂、HER二聚化抑制剂和ErbB信号传导途径小分子抑制剂的一种或多种的任何组合，每一种在上文描述并示例。
VI.方法的治疗用途
本发明方法可用于预测多种疾病的治疗的效力，在所述疾病中靶向疾病中涉及的细胞网络的一种或多种组分的治疗剂是可获得的。而且，本发明方法可用于选择罹患疾病的受试者的治疗方案，其中所述方法可进一步包括根据所选治疗方案治疗受试者，所述治疗方案可包括向受试者施用一种或多种治疗剂。疾病的非限制性示例包括癌症、自身免疫性疾病和炎性疾病。
本发明方法特别用于预测，例如计算机预测，肿瘤对治疗剂治疗的应答，即，预测肿瘤患者对治疗剂治疗的应答性。预测方法可以用于依赖于在所述方法中建模的信号传导途径的任何肿瘤。而且，在一个实施方案中，所述方法用于依赖于ErbB信号传导途径(例如，ErbB3信号传导途径)的肿瘤。在其他实施方案中，所述方法可以用于依赖于c-Met或IGF1R信号传导途径的肿瘤。在优选实施方案中，肿瘤是结肠癌肿瘤。在另一优选实施方案中，肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)肿瘤。在另一实施方案中，肿瘤是实体瘤。在另一实施方案中，肿瘤是非实体瘤，例如明细胞肉瘤。在各种其他实施方案中，肿瘤可以是例如选自以下组织的肿瘤：肺、结肠、直肠、胆囊、脑、脊髓、***、肾、胰腺、胃、肝、骨、皮肤、脾、卵巢、睾丸、***、头颈、甲状腺和肌肉。在其他实施方案中，肿瘤是胃部肿瘤、胃肿瘤或口/咽肿瘤。
为了进行预测方法，从患者获得细胞样品，例如肿瘤细胞样品。例如，优选的肿瘤样品是肿瘤组织样品。肿瘤组织样品可以通过标准方法获得，例如肿瘤活检或肿瘤的外科切除。新鲜冷冻的肿瘤组织样品可以被使用，或者可选地，***固定的石蜡包埋的(FFPE)组织样品也适合使用。其他类型的肿瘤样品也可用于本方法，其中样品含有来自肿瘤的细胞和/或由肿瘤分泌的细胞组分。其他类型肿瘤样品的非限制性实例包括细针抽吸物、***抽吸物、全血、血清、血浆、淋巴、唾液和尿、或从其分离的脱落或循环肿瘤细胞。
在优选实施方案中，本发明提供预测癌症患者对治疗剂治疗的应答的方法，其中可以由诊断实验室容易且快速进行该方法以提供有关患者肿瘤对特定治疗性治疗应答可能性的快速信息。在该预测方法中，肿瘤样品，例如新鲜冷冻样品或FFPE归档组织样品获自患者，并且肿瘤受体/配体水平通过半定量免疫组织化学(IHC)测量。被选择测量的受体和配体是基于治疗剂靶向的细胞网络(例如，对于ErbB途径，下述配体/受体可以被测量：HRG、BTC、ErbB1、ErbB2和ErbB3)。然后使用对照载玻片将半定量IHC测量转换为浓度，所述对照载玻片含有受体和配体表达水平已知的、与患者样品相比较的细胞块或异种移植物。在某些情况中，一个或多个感兴趣的基因(例如，PI3K、PTEN)的突变状态可以使用标准基因分型方法在样品中确定。接下来，将数据组(配体和受体浓度，如果测定的话，还包括基因突变状态)输入感兴趣的细胞网络的计算模型，并计算网络激活状态(NAS)。然后根据计算的NAS值与应答者和非应答者的NAS阈值的比较，预测对治疗剂的应答性。使用基于网络的应用将蛋白浓度和突变数据录入计算模型，随后输入NAS和预测应答，允许诊断实验室几乎即时了解肿瘤对治疗剂治疗应答的可能性。
对于本文描述的发明的任何预测方法，在使用该方法预测细胞(例如肿瘤细胞)对治疗剂治疗的应答之后，该方法还可以进一步包括基于细胞(例如肿瘤细胞)对治疗的预测应答来为受试者选择治疗方案。例如，所述方法可进一步包括展示和基于细胞对治疗的计算预测应答来为受试者人工或自动地推荐和/或选择治疗方案的计算***。而且，一经基于细胞的预测应答性而推荐或选择了治疗方案，本发明的方法还可以包括根据推荐的或选择的治疗方案治疗受试者，其可以包括向受试者施用一种或多种治疗剂。
本文还提供了用于预测细胞(例如肿瘤细胞)对靶向细胞网络内组分的治疗剂的治疗的应答的试剂盒。一个此类试剂盒包括：(a)用于检测所述细胞网络的一种或多种组分的水平的测定；(b)使用所述细胞网络的计算模型计算细胞的网络激活状态(NAS)或网络抑制状态(NIS)的说明书；和(c)使用所述试剂盒来预测细胞对所述治疗剂的治疗的应答的说明书。在其他实施方案中，所述试剂盒还可以包括应用统计分类算法来计算NAS或NIS的说明书。
细胞网络可以是例如ErbB信号传导途径、c-Met信号传导途径或IGF1R信号传导途径。治疗剂可以是例如上文描述的靶向这些路径的任何一个内的组分的任何治疗剂。
在一个实施方案中，用于检测细胞网络的一种或多种组分的水平的手段是允许检测组分的蛋白水平的一种或多种试剂，例如一种或多种抗体试剂。在另一实施方案中，用于检测细胞网络的一种或多种组分的手段是允许检测组分的mRNA水平的一种或多种试剂，例如一种或多种核酸试剂(例如核酸探针、PCR引物等)。用于检测细胞组分的蛋白或mRNA水平的此类试剂是普通技术人员公知的。用于检测水平的这样的手段还可以包括配置用于测量蛋白水平的计算装置。
适合检测细胞组分的蛋白水平的测定包括本文描述的那些，例如定量荧光激活细胞分选(qFACS)、酶联免疫吸附测定(ELISA，Luminex)、免疫组织化学(IHC)、定量免疫组织化学(qIHC)、质谱法和Western(免疫印迹)测定。适合检测细胞组分的mRNA水平的测定包括例如定量聚合酶链式反应(qPCR)和Northern印迹分析。用于检测细胞网络的一种或多种组分的水平的手段还可以包括例如在评价组分水平的测定中使用的缓冲液或其他试剂。试剂盒还可以包括有关进行检测细胞网络的一种或多种组分的水平的测定的说明书(例如，打印的说明书，例如标签或包装说明书)。
在优选实施方案中，细胞网络是ErbB信号传导途径，所述试剂盒包括用于检测选自ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、HRG(包括HRG-β1)、BTC、EGF、HB-EGF、TGFα、AR、EPG和EPR的ErbB信号传导途径的一种或多种组分(例如，受体、受体同二聚体、受体异二聚体和受体配体的一种或多种)的水平的手段。更优选地，试剂盒包括用于检测至少一种ErbB信号传导途径受体(例如，ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4)和至少一种ErbB信号传导途径配体(例如HRG、BTC、EGF、HB-EGF、TGFα、AR、EPG和EPR)的水平的手段。例如，在一个实施方案中，试剂盒包括用于检测ErbB1、ErbB2、ErbB3、HRG和BTC的水平的手段。在另一实施方案中，试剂盒包括用于检测ErbB1和HRG的水平的手段。在另一实施方案中，试剂盒包括用于检测ErbB1、ErbB2和ErbB3的手段。在其他实施方案中，试剂盒包括用于检测ErbB2单体、ErbB2同二聚体、ErbB2/ErbB3异二聚体或ErbB1/ErbB3异二聚体的手段。
使用细胞网络的计算模型计算细胞的网络激活状态(NAS)或网络抑制状态(NIS)的手段可以是例如含有在执行时使处理器进行计算细胞的NAS或NIS的操作的可执行指令的计算机程序产品。可选地，用于计算NAS或NIS的手段可以是例如允许试剂盒用户与基于因特网的服务对接的组件，所述基于因特网的服务运行可以在用户录入细胞中细胞网络的一种或多种组分的水平信息之后计算细胞的NAS或NIS的计算机程序。此类组件可以包括例如允许访问基于因特网的服务和使用服务的说明书(例如打印的说明书)的界面、网页和/或口令。本领域建立并在本文进一步描述的计算机***和软件可以适用于本发明的试剂盒。图16中参考的计算装置和计算组件还可以包括用于计算NAS或NIS的手段，例如计算处理器、测量和输入装置、输出装置等。
使用试剂盒预测细胞对治疗剂治疗的应答的说明书可以包括计算机指令和计算机界面以及打印的出版物和手册。在一些情况下，试剂盒被包装在一起。在其他实施方案中，试剂盒的各种组成部分保持在不同的位置。例如，一些组成部分可以保持、存储或置于一个或多个远程计算***上并且仅可通过网络连接而可用。
优选地，本发明试剂盒被设计用于人类受试者，例如具有肿瘤的人类患者。在此类情况下，细胞通常是通过肿瘤活检或肿瘤切除从患者获得的细胞。
VII.治疗性方法和试剂盒
提供了用于治疗恶性肿瘤患者的方法。一般而言，此类方法包括：从患者肿瘤获得样品(例如活检或切除样品)；测定样品中一种或多种生物标志的水平；和如果样品中生物标志水平满足预定特征，例如生物标志水平大于最低水平，则给患者施用治疗剂。此类方法应用至任何实体瘤。适合的肿瘤样品一般如上描述。在某些实施方案中，生物标志是ErbB受体蛋白。
在某些实施方案中，此类方法包括：获得肿瘤样品，测定样品中pErbB3的水平，随后给患者施用至少一种抗肿瘤治疗剂，其中，如果样品中测定的pErbB3水平不低于在无血清培养基中培养约20-24小时后的ACHN细胞(肾癌细胞，ATCC No.CRL-1611)培养物中测定的pErbB3水平的25％、50％、60％、70％、80％、90％或100％(优选50％)的最低水平，则随后给患者施用的至少一种抗肿瘤治疗剂包括抗ErbB3抗体，并且如果在样品中测定的pErbB3水平低于最低水平，则随后给患者施用的至少一种抗肿瘤治疗剂不包括抗ErbB3抗体。优选的ACHN细胞培养物是传代不超过9次的那些，例如第8代ACHN细胞。在此类实施方案的其他方面，生物标志是pErbB3，治疗剂是抗ErbB3抗体，最低水平是在ACHN异种移植肿瘤模型的肿瘤细胞中观察到的水平的40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在其他方面，最低水平是0.064pg/μg总蛋白、0.08pg/μg总蛋白、0.096pg/μg总蛋白、0.122pg/μg总蛋白、0.128pg/μg总蛋白、0.144pg/μg总蛋白或0.16pg/μg总蛋白。
在前述实施方案中，样品中的pErbB3水平在某些方面可以通过如下测定：(a)测量所述样品中ErbB3信号传导途径的至少两种组分的水平；(b)使用被输入ErbB3信号传导途径计算模型的在(a)中测量的水平计算模拟所述样品中pErbB3水平的网络激活状态(NAS)；和(c)由此测定所述样品中pErbB3的水平。在某些实施方案中，ErbB3信号传导途径的至少三种、四种、五种或六种组分的水平在(a)中检测。ErbB3信号传导途径的适合组分包括例如ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4(和ErbB蛋白的同二聚体和异二聚体)、HRG(例如，HRG-β1)、BTC、EGF、HB-EGF、TGFα、AR、EPG和EPR。这些组分可以作为蛋白(例如，单体、同二聚体或异二聚体)测定，或者适用时(例如，不论磷酸化状态而测量蛋白总水平时，但不是测量磷蛋白水平，例如对于单体、同二聚体或异二聚体)作为编码蛋白的mRNA测定。适当的测定方法是本领域公知的，并且包括本文描述的那些。
在其他方面，测定pErbB3水平的方法还包括应用统计分类算法来产生在计算NAS时使用的ErbB3信号传导途径的计算模型。在其他实施方案中，计算的NAS模拟样品中磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体和/或磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体的水平。
用于本发明的抗ErbB3抗体包括但不限于在国际专利申请号PCT/US2008/002119(公布为国际公布号WO 2008/100624，通过引用并入本文)中公开的抗ErbB3抗体。其中公开的特别优选的抗体目前已知为MM-121，其目前经历I期临床试验。优选的抗ErbB3抗体还包括上述抗ErbB3抗体。可以用于本文公开的方法的另一种抗ErbB3抗体是U3-1287(AMG888)(U3Pharma AG and Amgen)，其目前经历I期临床试验。
适用本文公开的治疗的肿瘤大体如上所述。示例性肿瘤是选自结肠、肺、直肠、胆囊、脑、脊髓、***、肾、胰脏、胃、肝、骨、皮肤、脾、卵巢、睾丸、***和肌肉的器官的肿瘤。在一些方面，ErbB3阳性肿瘤或ErbB2和ErbB3阳性肿瘤(例如，***肿瘤和非小细胞肺癌肿瘤)是优选的。
抗肿瘤治疗剂可以任何适合形式施用给患者。通常，治疗剂以药物组合物的形式提供，所述药物组合物包含治疗剂和生理上可接受的载体。如果需要，药物组合物还可以包括其他活性或非活性成分。
本文使用的术语“生理上可接受的”表示得到联邦或州政府的管理机构(例如美国FDA或EMEA)的批准，或者列于美国药典或其他公认药典中，用于动物，更特别用于人。术语“载体”指抗肿瘤治疗剂与之一起配制和施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。生理上可接受的载体可以是无菌液体，例如水溶液，其是静脉内或其他胃肠外施用的优选载体。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液是注射溶液水性载体的实例。适合的药物赋形剂包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水和乙醇。如果需要，组合物还可以含有小量润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或防腐剂。
药物组合物可以被配制用于任何适当的施用方式，包括例如胃肠外、鼻内、局部、口服或局部施用，例如通过透皮方式，用于预防性和/或治疗性治疗。适合的药物施用方式和载体的实例描述于″Remington：The Science and Practice of Pharmacy，″A.R.Gennaro，编辑.Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA(第21版，2005)。
通常，本文提供的方法中使用的药物组合物经胃肠外施用(例如，通过静脉内、肌内或皮下注射)。对于胃肠外施用，抗肿瘤治疗剂可以悬浮或溶解于载体中。无菌水性载体一般是优选的，例如水、缓冲的水、盐水或磷酸盐缓冲盐水。此外，无菌不挥发油可以用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。此外，诸如油酸的脂肪酸可用于制备注射组合物。也可以包含药学可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、分散剂、悬浮剂、润湿剂、去污剂、防腐剂、局部麻醉剂和缓冲剂。
在一个优选实施方案中，药物组合物被配制用于静脉内施用至患者(例如人)。通常，静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液溶液。必要时，组合物还可以包括增溶剂。成分可以单位剂量形式分开提供或混合在一起，例如在密封容器(例如安瓿瓶)中的冻干粉末或无水浓缩物。当组合物通过输注施用时，其可以用含有无菌药物级水或盐水的输液瓶配药。当组合物通过注射施用时，可以提供无菌注射水或盐水的安瓿以使成分可以在施用之前混合。
药物组合物可以通过常规灭菌技术灭菌，或者可以过滤灭菌。无菌水溶液可以被包装而原样使用，或者被冻干，冻干制品在施用之前与无菌水性载体混合。水性药物组合物的pH通常是3至11，更优选5至9，或者6至8，最优选7至8，例如7至7.5。
治疗剂一般以使单剂施用至患者时递送治疗有效量的浓度存在于药物组合物中。治疗有效量是产生可分辨的患者益处的量，所述可分辨的患者益处例如肿瘤生长的延迟或停止或者优选肿瘤大小的减小。治疗有效量受多种因素影响，包括采用的抗肿瘤治疗剂的活性；患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食；施用的时间和途径；***率；任何同时治疗，例如药物组合；经历治疗的患者中组织损伤的类型和严重度。可以使用本领域公知的常规测试和程序来确定理想剂量。一般而言，提供每天、每周或每两周约1mg至约100mg/千克体重的剂量水平的组合物是优选的。适合的剂量范围和用药方案的非限制性实例包括每周一次、每周两次或每三天一次、每两周一次或每三周一次施用2-50mg/kg(受试者的体重)，以及每周一次或每周两次或每三天一次或每两周一次施用1-100mg/kg。在各种实施方案中，治疗剂以每周一次、每周两次或每三天一次、每两周一次或每三周一次的时间安排以3.2mg/kg、6mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg或40mg/kg的剂量施用。其他剂量范围包括：1-1000mg/kg、1-500mg/kg、1-400mg/kg、1-300mg/kg和1-200mg/kg。适合的剂量方案包括每三天一次、每五天一次、每七天一次(即，每周一次)、每10天一次、每14天一次(即每两周一次)、每21天一次(即每三周一次)、每28天一次(即，每四周一次)和每月一次。
优选地，治疗剂(例如，抗ErbB3抗体)根据治疗剂生产商或销售商提供的处方信息中的指导来给患者施用。
还提供了用于治疗恶性肿瘤患者的试剂盒。某些此类试剂盒通常包括：(a)用于检测样品中ErbB3信号传导途径的至少一种组分的水平的至少一种测定；和(b)使用输入了从所述至少一种测定获得的数据的ErbB3信号传导途径计算模型模拟pErbB3的水平的网络激活状态(NAS)的说明书。在某些实施方案中，此类试剂盒还包括应用统计分类算法的说明书。在某些实施方案中，试剂盒还包括抗ErbB3抗体。所述测定通常包括允许检测至少一种蛋白组分或至少一种mRNA组分的一种或多种试剂。在某些实施方案中，用于计算NAS的说明书包括指导使用含有可执行指令的计算机程序产品，所述可执行指令在被计算机执行时使处理器进行操作来计算NAS；在此类实施方案中，用户可以被教导在本地计算机上运行所述计算机程序，或者用于可以被教导与远程运行所述计算机程序的基于因特网的服务对接。
在其他实施方案中，提供了包括抗ErbB3抗体和说明书(例如，标签形式，例如包装插页)的试剂盒，所述说明书指示：如果患者肿瘤活检中pErbB3的水平超过指定最低水平则给患者施用抗ErbB3抗体，而如果pErbB3的水平不超过指定最低水平则不给患者施用抗ErbB3抗体。例如，此类说明书可以指示：如果样品中测定的磷酸化ErbB3水平不低于在无血清培养基中培养约20-24小时后的ACHN肾癌细胞(ATCC No.CRL-1611)培养物中测量的磷酸化ErbB3水平的50％，则给恶性肿瘤患者施用抗ErbB3抗体；而如果在样品中测定的磷酸化ErbB3水平低于在ACHN肾癌细胞培养物中测量的磷酸化ErbB3水平的50％，则不给恶性肿瘤患者施用抗ErbB3抗体。
VIII.计算实施方案
如上文提到并应根据本文提供的公开内容而容易得知的，本发明的许多实施方案利用一种或多种计算***来进行上述各种过程，包括但不限于预测患者应答、产生推荐治疗、鉴定生物标志、计算NAS或NIS值、获得信号途径的计算模型，等等。
图15A和15B示例说明了在本发明某些实施方案的实现过程中可通过一个或多个计算***进行的一些过程的流程图。如所示的，例如，可利用计算***测量和/或接收肿瘤细胞网络中组分的测量水平的输入以及肿瘤基因的突变状态。计算***还可用于获得计算模型，其可以例如通过接收、下载、构建、调整、训练和/或评价本地或远程的计算模型来获得。
一旦获得计算模型，一个或多个计算***例如通过模拟细胞中磷酸化蛋白、同二聚体和/或异二聚体的相对水平来计算细胞的NAS或NIS。基于计算***接收的用户设置、通过鉴定细胞网络中其他相关组分，计算模型还可以被计算***用来鉴定预测性生物标志。
还可以使用计算***来鉴定统计分类算法，其可以由计算***接收、构建和/或调整作为鉴定过程的部分，并且可以与NAS或NIS数据、其他生物标志数据和患者数据以多种组合使用来产生患者对治疗的预测应答，和/或产生并选择推荐的治疗。
虽然图15A和15B的流程图中示例的元素表明进行本发明过程的建议的顺序或排序，但要理解，图15A和15B中显示的过程还可以具有不同排序的顺序进行。例如，推荐的治疗可以在产生计算模型或计算NAS或NIS之前被鉴定，并且其可以用于构建计算模型。类似地，蛋白水平的测量可以在计算模型产生之前或之后进行。
还要理解，其他过程可以作为本发明的部分进行，使得本发明不限于仅包括流程图所示过程的方法。例如，本发明还可以包括获得患者信息(例如年龄、性别、医疗史)和跟踪推荐治疗的实际结果的过程以及其他过程。
还应理解，用于实现本发明过程的计算***可以包括一个或多个不同类型及不同位置的不同的计算***。
图16示例说明可用于进行本发明某些方面(包括例如图15A和15B所示过程的至少一些，以及本文通篇描述的那些)的计算***的一个实例。如所示例的，计算***包括各种输入装置、输出装置、计算模块、处理组件和存储介质。输入装置可以包括键盘、鼠标、触摸板、触摸屏、麦克风以及其他任何输入装置。输出装置可以包括扬声器、显示屏、打印设备、交换机以及其他输出装置。计算模块包括进行本文所述功能性所必需的各种模块，包括接收和构建计算模型的模块，计算NAS或NIS的模块，鉴定预测性生物标志的模块，获得、识别和存储测量的组分水平以及鉴定和确定突变基因状态的模块，鉴定和应用统计分类算法的模块，产生对治疗的预测应答的模块，产生和选择推荐治疗的模块，与用户以及一种或多种其他装置对接的通信模块，以及进行本文描述的各种其他过程的模块。
计算***还包括一个或多个处理器，以及执行前述模块所必需的其他处理组件，以及用于储存前述模块及各种数据结构、计算模型和本文描述的其他数据的存储介质。虽然存储介质被示例为在计算***本地，但要理解，存储介质还可以位于计算***远端，或者仅部分在计算***本地。例如，在一些情况下，存储介质代表在多个不同计算***之间共享并且包括位于多个计算***的存储空间的分布式存储器。存储介质还可以包括永久和非永久内存的任何组合。
图16还示例说明，计算***是可连接至一个或多个其他装置的网络，包括测量装置、远程计算机、远程服务和远程网络。在一些情况下，这些其他装置的一个或多个进行本文描述过程的一个或多个，使得一些方法的执行在涉及多个分布的计算***和装置的分布式网络环境中进行。
考虑前述内容，要理解，本发明的范围可以各种不同计算配置来实现。
IX.实施例
本发明通过下述非限制性实施例进一步示例说明。这里提及的每一个美国、国际或其他专利或专利申请或出版物的公开内容通过引用整体并入本文。
实施例1：Ab#6的异种移植物效力研究：训练数据组
该实施例中，使用四个异种移植肿瘤模型鉴定对抗ErbB3抗体Ab#6治疗应答的肿瘤细胞系。四个异种移植肿瘤模型研究代表不同的适应症：MALME3M(黑素瘤癌系；ATCC No.HTB-64)、ADRr(卵巢癌细胞系；NCI-60，cosmic样品ID No.905987)、ACHN(肾癌细胞系；ATCC No.CRL-1611)和DU145(***癌细胞系；ATCC No.HTB-81)。如下文进一步描述的，MALME3M和ADRr异种移植物没有显示对Ab#6治疗的应答，而ACHN和DU145异种移植物显示了对Ab#6治疗的应答。
在异种移植肿瘤模型中，小鼠(nu/nu小鼠：3-4周大的雌性小鼠，T-细胞缺陷；远交；Albino背景；来自Charles River Labs，Wilmington，MA)右肋腹植入3.5x106-3x108细胞/小鼠(取决于细胞系)，200μl皮下注射。监测小鼠的最初肿瘤生长。允许肿瘤细胞生长几天，直至肿瘤体积为大约200mm3。计算肿瘤体积为V＝(π/6(LxW2)。小鼠用Ab#6抗体治疗，剂量为600μg/每三天注射(qd3)。对照小鼠用磷酸盐缓冲盐水(PBS)治疗。
测量肿瘤体积60-80天。抗体治疗对肿瘤生长的作用的结果(使用上述方法或其小变化形式获得)概括于图1A-1D所示的图，该图说明Ab#6治疗抑制了DU145和ACHN异种移植模型中的肿瘤生长，而Ab#6治疗没有抑制ADRr和MALME3M异种移植模型中的肿瘤生长(与PBS对照相比较)。
作为肿瘤对Ab#6的应答性的量度，测定了指数生长速率，其描述了最佳实验数据。下式用于描述指数生长。
V＝Vo*exp(k*t)
其中V是肿瘤体积(mm3)，Vo是零时的肿瘤体积，k是指数生长速率，并且t是时间(天)。
为了比较不同异种移植物研究之间的生长降低，使用下式计算每个试验细胞系的生长速率降低(GRR)值，其使在Ab#6存在时观察到的生长速率与PBS对照组中观察到的生长速率相关联：
生长速率降低＝1-(Ab#6生长速率kAb#6)/(生长速率kPBS)
四个试验细胞系的GRP值(使用上述方法或其小变化形式获得)概述于下表1。在阴性生长速率降低的情况下，GRR值设为零。
表1：异种移植物研究的训练组的肿瘤生长速率降低概括
  细胞系   GRR[％]
  MALME3M   0
  DU145   72.6
  ADRr   0
  ACHN   28.0
结果说明，四个异种移植物显示对Ab#6治疗的一系列应答性，ADRr和MALME3M细胞显示对Ab#6治疗无应答，ACHN具有中等范围的应答性，而DU145细胞具有对Ab#6治疗的最高应答性。
实施例2：肿瘤细胞系裂解物中pErbB3水平与异种移植物中Ab#6应答性相关
该实施例中，在短期药效学(PD)研究中，在实施例1中研究的四个肿瘤细胞系MALME3M、ADRr、DU145和ACHN的每一个中体内测量磷酸化ErbB3(pErbB3)的浓度。OvCAR8异种移植物也包括在该实验中(下文实施例5中显示该异种移植物对Ab#6治疗有应答性)。
MALME3M、ADRr、DU145、OvCAR 8和ACHN细胞在培养基中生长并被收集用于植入(15x15cm板，～80％汇合，细胞总数＝2-4x108)并保持在冰上直到植入。细胞(大约2x107个细胞/小鼠)被植入到20只小鼠的右肋腹(经皮下注射，200μl细胞/注射/小鼠)，然后使小鼠恢复，同时监测最初的肿瘤生长。通过数字卡尺测量来测量肿瘤(LxW)。一旦小鼠达到超过100mm3的肿瘤体积，通过CO2窒息使它们安乐死，每只小鼠的肿瘤被切离并在液氮中快速冷冻。冷冻的肿瘤组织样品保存在-80℃用于生化分析。使用R&D Systems人pErbB3 ELISA试剂盒(目录号DYC1769)，肿瘤裂解物中磷酸化ErbB3(pErbB3)的量通过ELISA测定。样品制备和ELISA方案在下文更详细描述。
为了样品制备和蛋白提取，首先将冷冻的肿瘤研成粉末并转移至预称重的2ml VWR冷冻管(cryotube)(VWR International)。研成粉末的样品被称重并记录重量。计算样品重量之后，向每个管加入适量冰冷裂解缓冲液至终浓度为62mg/ml。样品以低速简单涡旋并在旋转下4℃孵育。
然后将粗制肿瘤裂解物转移至Qiagen Qiashredder并在12000rpm离心8分钟，用于进一步均化样品。在澄清裂解物转移至新管之后，小量的每种裂解物被取出用于BCA蛋白测定。剩余裂解物分成小份并储存在-80℃用于进一步的ELISA测定分析。
为了使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce，目录号23225)定量总蛋白，首先使用BCA试剂盒的2mg/ml BSA标准溶液制备牛血清白蛋白(BSA)8点标准曲线，从2mg/ml的储备浓度开始。在将试剂盒的试剂A和B混合(50∶1)并用PBS制备3倍和5倍稀释储存肿瘤裂解物之后，将20μl BSA标准或稀释肿瘤裂解物样品和160μl工作试剂添加到96孔板的每一个孔。板在37摄氏度孵育20分钟。读取OD562，并使用BSA标准曲线计算肿瘤裂解物中的蛋白总量。
为了进行pErbB3 ELISA，不同的捕获抗体用PBS稀释至试剂盒(R&D Systems DYC1769)推荐的工作浓度。用稀释的捕获抗体涂布黑色96孔板(Nunc Maxisorb)之后，所有板在室温(RT)下孵育过夜。然后在Bio Tek洗板器上用PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗涤板3次，并用200μl的1％BSA的PBST溶液在RT封闭2小时。
标准曲线的重组蛋白用试剂盒推荐的最高浓度和共计11个点的2倍稀释液来制备。板用PBS洗涤3次，在RT孵育2小时之前添加100μl肿瘤裂解物。然后，用PBST洗涤板3次，添加在PBS/0.1％BSA/0.05％Tween-20中稀释至工作浓度的100μl初级检测抗体。板在RT进一步孵育2小时。最后，在读板之前，向每个孔添加100μl混合的SuperSignal ELISA Pico化学发光底物(Pierce，目录号37069)。
图2是描绘未治疗的异种移植肿瘤中pErbB3浓度(pg/μg肿瘤裂解物)对当用Ab#6治疗时异种移植物观察到的生长速率降低(％--使用上述方法或其小变化形式获得)的图。图2说明，肿瘤生长速率降低与短期药效研究中测量的组成型pErbB3水平之间存在良好相关性。对Ab#6治疗无应答的MALME3M和ADRr异种移植物显示最低水平的pErbB3，而对Ab#6治疗应答的ACHN、OvCAR8和DU145异种移植物显示显著更高水平的pErbB3。结果说明，肿瘤细胞中pErbB3水平与肿瘤细胞对抗ErbB3抗体治疗的应答性良好相关。
实施例3：pErbB3和pAKT水平下降作为冷冻时间的函数
在该实施例中，分析pErbB3和pAKT的稳定性以及肿瘤裂解物中ErbB1、ErbB2和ErbB3的表达水平，作为从冷冻肿瘤恢复后的时间的函数。
未治疗的ACHN和EKVX异种移植小鼠通过CO2窒息而安乐死，肿瘤被切离并切成4片并在以下不同时间点放入液氮：0min、10min、30min和60min。然后，在解冻之后测量每个样品中的pErbB3和pAKT水平以及ErbB1-3水平。使用上述方法或其小变化形式获得的结果总结于图3A-3E所示条线图，图3A和3B分别显示ACHN裂解物中pErbB3和pAKT水平，图3C、3D和3E分别显示EKVX裂解物中ErbB1、ErbB2和ErbB3的水平。
如图3A和3B所示，在10分钟样品中，与0分钟样品相比在pErbB3和pAKT水平上有可测量的下降。在30分钟样品中，观察到pErbB3与对照(立即快速冷冻肿瘤，0分钟样品)相比40％的浓度下降，并观察到pAKT与对照相比20％的浓度下降。相反，在EKVX和ACHN肿瘤细胞裂解物中，ErbB1-3的总水平保持恒定并不受冷冻时间的影响(参见图3C-3E)。因此，肿瘤样品中所观察到的磷蛋白的不稳定性和观察到的总蛋白测量的稳定性说明，计算的ErbB3的磷酸化水平、而不是直接测量肿瘤细胞裂解物中的水平的优点。该计算的pErbB3水平在下述实施例中被称为网络激活状态(NAS)，使用如下文实施例4所描述的构建的机械计算模型。
实施例4：ErbB信号传导途径的机械计算模型的构建和训练
在下述实施例中，描述了信号转导途径的机械计算生化模型的构建。基于有关ErbB信号传导的文献知识，开发了机械计算模型，包括描述配体与受体结合、二聚化、受体内化和降解以及适体分子Gab1结合导致PI3K级联激活的所有蛋白-蛋白相互作用。使用的ErbB信号传导网络的动画图描绘于图4A。计算模型是一组非线性的常微分方程(ODE)，使用质量作用动力学。图4B显示信号传导途径的一组生化反应，图4C显示一组变化。生化反应和变化被转换成一组非线性ODE，示于图4D。一般而言，蛋白浓度ci改变的改变状态等于蛋白生成速率v生成减去蛋白消耗速率v消耗，如方程1所示。
Figure BPA00001347607400481
下述实施例中用于预测对Ab#6应答的计算模型由哺乳动物ErbB网络和Akt信号转导级联组成，所述ErbB网络包括所有四种受体(ErbB1-4)。
ErbB受体是单程I型跨膜受体，具有细胞外配体结合结构域、细胞内酪氨酸激酶结构域和用作信号传导支架的胞质尾区。ErbB1和ErbB4在配体结合和酪氨酸激酶活性中是完全功能性的，但是ErbB2不结合任何已知配体，而是起二聚化就绪信号放大器的功能(Klapper，L.N.等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：4995-5000)。ErbB3具有受损的激酶结构域(Guy，P.M.等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8132-8136)，因此缺乏催化活性，而是当被其他ErbB受体磷酸化时转换信号。在13种已知ErbB配体中，BTC和HRG已被用作诱导最高ErbB3磷酸化水平的配体。13种已知ErbB配体可以被分成三组：(i)特异性结合ErbB1的那些，例如EGF、转化生长因子α(TGFα)和双调蛋白(AR)，(ii)表现出结合ErbB1和ErbB4的双重特异性的那些，包括BTC、HB-EGF、EPG和EPR，和(iii)神经调节蛋白(NRG)，其分成两个亚组：结合ErbB3/ErbB4的NRG1(还称为GGF2、SMDF或HRG)，NRG2也共有该性质，以及仅结合ErbB4的NRG3/NRG4。在配体结合之后，受体二聚化并在其胞质尾区残基经历转磷酸作用，从而产生含有SH2的适体分子的停靠位点，所述适体分子例如Shc、Grb2、GAP、Sos和PI3K。ErbB1在其胞质尾区具有至少20个酪氨酸磷酸化位点，其中12个被提出与含有SH2的适体蛋白和酶相伴(Schulze，W.X.等人(2005)Mol.Syst.Biol.1：2005-2008)。其他ErbB受体同样经历复杂的翻译后修饰。受体相关适体例如Grb2和PI3K刺激RAS，并最终启动ERK和AKT。AKT还可通过PI3K-p85与ErbB3上多个位点的直接结合以RAS非依赖方式激活。
尽管已经公开了许多计算模型(参见例如，Kholodenko，B.N.等人(1999)J.Biol.Chem.274：30169-30181；Hatakeyama，M.等人(2003)Biochem.J.373：451-463；Resat，H.等人(2003)Biophys.J.85：730-743；Hendriks，B.S.等人(2005)J.Biol.Chem.280：6157-6169)；Sasagawa，S.等人(2005)Nat.Cell.Biol.7：365-373；Birtwistle，M.R.等人(2007)Molecular Systems Biology 3：144)，但本文使用的计算模型更广泛并且包括所有四种ErbB受体和两种不同类别的配体(HRG和BTC)，但仍然保留了基于基本反应的质量作用方程的严格性。
在文献中描述的七种ErbB异二聚体和同二聚体以下述模型实现：ErbB1/1、ErbB1/2、ErbB1/3、ErbB1/4、ErbB2/2、ErbB2/3和ErbB2/4。这些二聚体的大部分由配体结合激活，但是几个通过“横向信号传导”(或二次二聚化)的过程产生，其中以配体依赖性方式磷酸化的二聚体被解离成单体，该单体然后与激活或未激活的单体同寡聚或异寡聚而产生活性二聚体。用一组实验数据训练计算模型，所述实验数据允许使用ADRr细胞系鉴定在HRG或BTC存在下形成的二聚体。
计算模型是基于非线性常微分方程，其需要必须被测量或估计的两种类型的参数：初始物类数目和速率常数。在模型校核之前，基于文献信息来规定尽可能多的参数的值，例如，配体与其同源受体的结合常数。使用qFACS分析，ErbB受体的表达水平对用于本申请的所有细胞系定量。而且，ELISA用于定量BTC和pErbB3的水平。而且，测定与ZR-75细胞系(ATCC No.CRL-1500)中的mRNA水平相比较的HRG-β1的mRNA水平。其信息用于计算模型的受体和配体表达水平总结于下表2。用于获得这些表达水平的方法在下文进一步详细描述。
肿瘤细胞系获自国立癌症研究所(National Cancer Institute)。所有细胞系在5％CO2、95％空气和37摄氏度的加湿气氛中在以下完全培养基中生长为单层培养物：RPMI-1640培养基(Gibco)，其补充了10％胎牛血清(FCS)(Hyclone)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)和单位/mL Pen-Strep(Gibco)。
使用允许通过qFACS定量受体表达水平的Quantum Simply Cellular Kit 816A(Bangs Laboratories)定量受体表达水平。其含有标记有不同量的山羊抗人IgG的一系列4微球体群以及空白群体。与珠表面结合的IgG特异性针对IgG抗体的Fc部分。珠粒如同细胞样品并使用相同抗体进行染色。不同群体的微球的每一个结合已知量的标记的单克隆抗体。通过绘制每个群体的荧光强度与其指定的抗体结合能力(ABC)值，产生标准的ABC曲线，通过使用Bangs Laboratories(QuickCal v 2.3)提供的软件容易确定染色的细胞样品的ABC。该程序考虑了使用的仪器的构造、样品的电压和使用的荧色物。
BTC表达水平通过ELISA测量，使用R&D Systems Dy261DuoSet-IC人B细胞调节素试剂盒。384孔板用4μg/ml捕获抗体涂布。384孔板通过添加50μl 2％BSA/1X PBS(无Tween-20)持续1小时而被封闭，并制备重组标准曲线。洗涤板之后，添加16μl细胞裂解物以及抗磷酸酪氨酸HRP(辣根过氧化物酶)检测抗体，随后孵育2小时。最后添加20μl Pico发光底物，然后分光光度法读板。
因为测量HRG-β1蛋白表达水平的可商业途径获得的测定不足够灵敏以获得有关被检验细胞系的可靠数据，所以定量感兴趣细胞系的HRG-β1mRNA水平。使用RNeasy Mini方案(74104RNEASY试剂盒，来自QUIAGEN)从细胞裂解物分离RNA。在将分离的RNA转化为cDNA并使用Applied Biosystems 430443 7 Tagman主混合物(Master mix)制备定量PCR(QPCR)的主混合物之后，QPCR被运行并定量相对于ZR75-1细胞中mRNA水平的HRG-β1mRNA表达水平。QPCR引物购自Applied Biosystems。
使用来自R&D的pErbB3 ELISA试剂盒(Dyc 1769-2 DuoSet-IC人磷酸-ErbB3)测定表2所示不同细胞系的ErbB3磷酸化水平，使用实施例2所描述的方法或其小变化形式。
下表2概述了使用上述方法或其小变化形式获得的有关不同细胞系的受体和配体表达水平信息，所述信息用于构建ErbB信号传导途径的计算模型。第1列显示细胞的名称；第2列显示肿瘤类型；第3-5列分别显示ErbB1、ErbB2和ErbB3的每个细胞受体数目；第6列显示HRG-β1mRNA水平，表示为与ZR-75细胞中mRNA水平相比的倍数；且第7列和第8列显示细胞中存在的BTC和pErbB3的量，表示为pg/细胞。
表2：异种移植物实验中使用的细胞系的受体和配体表达水平的概述
Figure BPA00001347607400511
为了训练计算模型，使用了包括剂量-时间矩阵的数据组，其中在多个时间点以及九种不同浓度的BTC或HRG刺激下，ADRr细胞中ErbB1、ErbB2、ErbB3和AKT的磷酸化通过ELISA测量。为了刺激细胞，将细胞在96孔组织培养板中以每孔35,000个细胞接种于100μl完全培养基，并在5％CO2，95％空气和37摄氏度的加湿气氛中孵育过夜。然后将细胞转移至无血清培养基：RPMI-1640培养基(Gibco)，补充有2mM L-谷氨酰胺(Gibco)和单位/mL Pen-Strep(Gibco)。饥饿的细胞在刺激之前在5％CO2，95％空气和37摄氏度的加湿气氛中孵育20-24小时。对于剂量-时间矩阵研究，细胞在0、1、2、3、4、5、7、10、20、30、60和120分钟用配体(BTC或HRG)刺激。对于每个时程，在用9种不同浓度的HRG(0.038nM-250nM)和BTC(0-700nM)刺激之后，将细胞置于冰上，用冷PBS洗涤，然后在30μl冷M-PER哺乳动物蛋白提取缓冲液(Thermo Scientific，目录号78501)中裂解，所述缓冲液补充了蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich，P2714)、1mM原钒酸钠(Sigma-Aldrich，S6508)、5mM焦磷酸钠(Sigma-Aldrich，221368)、50μM氧苯砷(EMD Biosciences，521000)和10μM bpV(phen)(EMD Biosciences，203695)。
通过ELISA测量刺激的细胞中蛋白磷酸化水平。针对ErbB1(R&D Systems，AF231)、ErbB2(R&D Systems，MAB1129)、ErbB3(R&D Systems，MAB3481)和AKT(Upstate，05-591MG)的捕获抗体在室温下在384孔黑色平底聚苯乙烯高结合板(Corning，目录号3708)中孵育过夜。ELISA板用2％牛血清白蛋白(BSA)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)封闭1小时，然后与在2％BSA、0.1％Tween-20和PBS中稀释的裂解物在室温孵育2小时。在每次孵育之间，板用PBS中0.05％Tween-20洗涤三次。用于测量磷酸-ErbB1、磷酸-ErbB2和磷酸-ErbB3的ELISA与磷酸-酪氨酸辣根过氧化物酶(HRP)连接的单克隆抗体(R&D Systems，HAM1676)孵育2小时。测量磷酸-AKT的ELISA与丝氨酸473特异性抗磷酸AKT小鼠初级单克隆抗体(Cell Signaling Technologies，目录号5102)孵育2小时，然后与链霉亲和素-HRP(R&D Systems，目录号DY998)孵育30分钟。所有ELISA用SuperSignal ELISA Pico化学发光底物(Pierce，目录号37069)显影，并使用光度计测量发光信号。
在多个时间点和九种不同浓度BTC或HRG时的蛋白磷酸化的数据组的结果(使用上述方法或其小变化形式获得)显示于图5A-5B，其中图5A显示HRG刺激的细胞的磷酸-ErbB3、磷酸-ErbB2、磷酸-ErbB3和磷酸-AKT的水平，并且图5B显示BTC刺激的细胞的磷酸-ErbB3、磷酸-ErbB2、磷酸-ErbB3和磷酸-AKT的水平。该数据组用于校核ErbB信号传导途径的计算模型，使得模拟结果(线)描述图5A-5B所示的实验数据(点)。
有关开发ErbB受体信号传导网络的计算模型的进一步信息在下文提供：
模型结构
ErbB受体信号传导网络模型由三种受体(ErbB1、ErbB2、ErbB3)、受体磷酸酶、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K，其结合受体)和PI3K-AKT级联的组分(磷脂酰肌醇二磷酸酶、PIP2、磷酸肌醇依赖性蛋白激酶、PDK1、从染色体10切除的PTEN、PTEN、丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶(还称为蛋白激酶B)、AKT、蛋白磷酸酶2A、PP2A)构成(参见下表8)。还包括两种ErbB受体配体：调蛋白(HRG1-β)，其结合ErbB3和ErbB4(不包括在模型中，因为实验中ErbB4表达水平在细胞系中很难检测(参见下表3)，以及主要结合ErbB1的B细胞调节素(BTC)(Beerli，R.R.和Hynes，N.E.(1996)J.Biol.Chem.271：6071-6076；Jones，J.T.等人(1999)FEBS Lett.447：227-231)。完整列于下表11的质量作用动力学反应使用Matlab Simbiology 2.3(Mathworks，MA)转换为常微分方程。
模型中包括配体诱导的二聚化、内化、循环和降解，如在文献中对于所有同二聚体和异二聚体所描述的(Hendriks，B.S.等人(2003)J.Biol.Chem.278：23343-23351；Wang，Z.等人(1999)Mol.Biol.Cell 10：1621-1636)。使用Shankaran，H.等人(2008)Biochem.Biophys.Res.Commun.371：220-224公布的相对量来实现受体二聚体的稳定性，其中ErbB1与ErbB2或ErbB3的共表达倾向向细胞表面的信号传导并阻碍信号下调，并且其中ErbB1-3的同时共表达导致ErbB2-ErbB3异二聚体的富集。因此，含有ErbB3的二聚体比ErbB1同二聚体或ErbB1-ErbB2异二聚体更缓慢内化和降解。还包括组成性二聚化，尽管认为不带配体的二聚体不引发任何下游信号传导(Yu，X.等人(2002)Mol.Biol.Cell 13：2547-2557)并不会保留在细胞表面。ErbB配体以不同亲和力结合ErbB同二聚体和异二聚体(Teramura，Y.等人(2006)EMBO J.25：4215-4222)，但是为了减少要评估的动力学参数的数目并描述可能最简单模型的实验数据，我们将配体与ErbB同二聚体和异二聚体的结合亲和力限制为相同。
二聚化受体经历快速磷酸化并通过信号传导适体与受体胞质尾区的磷酸酪氨酸位点的结合而激活下游途径(Yarden Y.和Sliwkowski，M.X.(2001)Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.2：127-137)。这里，实现了简化的PI3K-AKT级联，从而PI3K直接结合配体结合的异二聚体，激活PIP2，其与PDK1和AKT形成复合物，导致AKT的两步双磷酸化。ErbB3具有PI3K结合的六个位点，而其他ErbB受体仅具有一个位点(Wallasch，C.等人(1995)EMBO J.14：4267-4275；Soltoff，S.P.等人(1994)Mol.Cell.Biol.14：3550-3558)。尽管不知道六个PI3K分子是否能够同时结合ErbB3，但是PI3K被ErbB3激活的强度比被其他受体激活的强度高10-20倍(Fedi，P.等人(1994)Mol.Cell.Biol.14：492-500)。还有证据表明PI3K与ErbB3结合的亲和力大于其与其他ErbB受体结合的亲和力(Jones，R.B.等人(2006)Nature 439：168-174)。我们将这些现象加入模型并避免了包括六个结合位点的组合复杂性，这是通过将下述规定应用于含有ErbB3的二聚体：提高的PI3K-结合速率；提高的对PI3K的PIP2结合速率，和提高的PIP3激活速率。PIP2不存在于内体中(Haugh，J.M.(2002)Mol.Interv.2：292-307)，因此，仅质膜结合的受体二聚体能够激活模型中的PIP2。初始模拟加速AKT激活太慢，有必要在模拟之前几乎完全失活AKT磷酸酶并加入负反馈环，AKT通过负反馈环激活其自身磷酸酶，该现象在其他地方描述(Camps，M.等人(1998)Science 280：1262-1265)。因为简单和我们最近发现AKT信号传导对MAPK级联中的物类和参数相对不灵敏，忽略MAPK级联(Chen，W.W.等人(2009)Mol.Syst.Biol.5：239)；因此，不需要MAPK-PI3K联合来描述AKT信号传导动力学。初始物类值被直接测量(ErbB受体、PDK1、AKT)，从文献推论(Birtwistle，M.R.等人(2007)Mol.Syst.Biol.3：144；Hatakeyama，M.等人(2003)Biochem.J.373：451-453)或设为非限速值。
模型校核
在我们研究的细胞***中许多反应速率参数是未知的并因此不得不估计(参见下表10)。为了避免偏离起始点，所有参数被设为默认值(Aldridge，B.B.等人(2006)Nat.Cell.Biol.8：1195-1203)。估计的参数的数目受以两个阶段进行评估的限制：首先模型根据实验观察到的ErbB受体磷酸化数据来校核；其次，对AKT磷酸化灵敏的参数根据实验数据来优化。估计的值只有当参数在多参数运行下使用具有50和25代群体大小的遗传算法限制时被接受(Mathworks，MA)。HRG1-β和BTC的配体结合速率常数使用已知Kds(Tzahar，E.等(1996)Mol.Cell.Biol.16：5276-5287；Singer，E.等人(2001)J.Biol.Chem.276：44266-44274；Jones，J.T.等人(1999)FEBS Lett.447：227-231)和初始计量应答曲线分别估计，以接近两种配体的1x105M-1s-1的正向结合速率。进行灵敏度分析(Mathworks，MA)以鉴定在HRG1-β或BTC刺激下强烈影响ErbB1、ErbB2、ErbB3和AKT磷酸化活性的参数(参见下表11)。允许每个参数独立变化，同时***用1nM HRG1-β或BTC刺激。每个物类的标准化灵敏度对两个小时的刺激积分，具有标准化的积分灵敏度大于1000的任意阈值的参数列于下表11。如上所提到的，ErbB4磷酸化未被加入参数评估，因为所研究的细胞系具有几乎不可检测的ErbB4(参见下表3)。ErbB4反应根据ErbB3反应而被参数化。
ErbB受体磷酸化曲线对于二聚化、内化、再循环和降解参数灵敏(酶反应、二聚体解离和磷酸酶速率常数不灵敏)。这些参数使用高密数据集拟合。每个读数被标准化为任一配体实现的最大激活，保留每个配体的相对效价。ErbB受体二聚化速率被严格限制，并且观察到符合文献发现的参数关系：ErbB2是配体结合的ErbB1或ErbB3的优选二聚化配偶体(更值得注意的是调蛋白刺激)。根据可用数据，不可能同时限制再循环速率和内化速率，因此再循环速率被设为0.005s-1并仅拟合内化速率：得到的观察因此等同应用于再循环速率(倒数)。内化速率基于配体刺激而变化，HRG1-β结合的二聚体表现出比BTC结合的同二聚体和异二聚体慢得多的内化，还参见(Sorkin，A.和Goh，L.K.(2008)Exp.Cell Res.314：3093-3106)。降解速率也被良好限制，但是对于所有二聚体是类似的，表明个体二聚体降解速率不是解释观察数据所必需的。磷酸化AKT对PI3K级联内和受体水平下许多参数是灵敏的(参见下表11)。因此，我们将校核限制于PI3K-AKT级联中的模型参数，并且根据AKT磷酸化时程来训练，同时我们锁定已经在ErbB受体曲线上训练的参数值。
模型训练之后，进行参数的本地人工调节以解释每个参数的影响，来确定是否可能进一步改善，并将参数限制在生物学合理的值。为了标准化，参数被四舍五入并在参数类型保守时简化为类似值(如对降解速率所解释的)。
抑制剂实现
使用已知作用机制的最简单解释将ErbB网络抑制剂加入模型(参见下表12)：抗ErbB3单克隆抗体Ab#6通过防止配体结合而隔离ErbB3并诱导内化和降解；西妥昔单抗隔离ErbB1并防止配体结合；拉帕替尼抑制ErbB受体的激活但不抑制二聚化或配体结合；并且帕妥珠单抗阻断ErbB2二聚化。对于Ab#6，使用通过Kinexa测量的速率常数，而对于其他抑制剂，使用文献报道(Wood，E.R.等人(2004)Cancer Res.64：6652-6659；Patel，D.等人(2007)Anticancer Res.27：3355-3366；Adams，C.W.等人(2006)Cancer Immunol.Immunother.55：717-727)和列于下表13的速率常数；西妥昔单抗参数通过Kinexa实验证实。
用于开发ErbB信号传导途径的计算模型的各种其他信息在如下表3-13中列出：
表3：考察细胞系的测量的ErbB受体表达和突变状态
Figure BPA00001347607400561
ND-不可检测的
#-通过qFACS测量
*用于确定所考察的细胞系的突变状态的网址
-http://www.sanger.ac.uk/perl/genetics/CGP/core_line_viewer？action＝nci60_list
表4：ErbB1结合配体和HRG1-β的ErbB1磷酸化剂量应答曲线的表征
Figure BPA00001347607400571
ND：不能被测定
CI：95％置信区间
表5：ErbB1结合配体和HRG1-β的ErbB2磷酸化剂量应答曲线的表征
Figure BPA00001347607400572
ND：不能被测定
CI：95％置信区间
表6：ErbB1结合配体和HRG1-β的ErbB3磷酸化剂量应答曲线的表征
Figure BPA00001347607400581
ND：不能被测定
CI：95％置信区间
表7：ErbB1结合配体和HRG1-β的AKT磷酸化剂量应答曲线的表征
Figure BPA00001347607400582
ND：不能被测定
CI：95％置信区间
表8：计算模型中非零物类的初始量
Figure BPA00001347607400591
表9：使用具有相应参数的质量作用动力学在计算模型中实现的生化反应的概述
使用的缩写的定义：
: 指示蛋白复合物，例如与受体结合的配体
_p 指示蛋白是磷酸化的
iy 指示物类y是内化的
<-> 指示可逆反应
-> 指示不可逆反应
Figure BPA00001347607400611
Figure BPA00001347607400621
Figure BPA00001347607400631
Figure BPA00001347607400641
Figure BPA00001347607400651
表10：参数值的描述。对应于其中参数出现的第一反应的参数数目
Figure BPA00001347607400671
Figure BPA00001347607400681
表11：ErbB3、ErbB2、ErbB1和AKT灵敏度参数
Figure BPA00001347607400691
表12：Ab#6、西妥昔单抗、帕妥珠单抗和拉帕替尼的实施方案
Figure BPA00001347607400701
Figure BPA00001347607400711
Figure BPA00001347607400721
表13：抑制剂参数值
Figure BPA00001347607400731
实施例5：选择pErbB3激活的预测标志
在该实施例中，使用实施例4中所述的ErbB信号传导途径的机械计算模型鉴定了预测ErbB3激活(由pErbB3指示)的一组蛋白标志。
因为ErbB3磷酸化的水平在实施例2中被证明与肿瘤应答率相关，对训练的计算模型进行灵敏度分析以鉴定决定ErbB3磷酸化水平的关键蛋白。
在这种局部灵敏度分析中，细胞实际上用0.4nM HRG或BTC计算机模拟刺激，HRG或BTC都是激活ErbB信号传导途径的配体。测定了pErbB3就下述细胞受体、激酶和其他蛋白而言的灵敏度：ErbB3、ErbB2、ErbB1、PI3K、PIP2、PTEN、PDK1、PP2A、AKT、RTKpase和配体(BTC和HRG)。
局部灵敏度分析是一种数学工具，测量响应于途径内蛋白浓度和动力学参数的变化的输出变化。通过下述方程给出有关第j速率常数(kj)变化的第i可见的ci(t)的完全标准化的灵敏度(sij(t))：
s ij ( t ) &equiv; &PartialD; ln ( c i ( t ) ) &PartialD; ln ( k j )                 (方程2)
然后使用局部和全局优化方法(例如但不限于遗传算法、模拟退火、Levenberg-Marquardt优化)进行模型校核，所述优化方法通过改变灵敏度分析中鉴定的参数和初始蛋白浓度而使实验数据和模拟结果之间差距最小。
局部灵敏度分析的结果概括于图6的条线图。结果表明，下述五种蛋白是预测ErbB3激活(例如，pErbB3形成)的关键标志组：ErbB1、ErbB2、ErbB3、HRG和BTC。
实施例6：使用机械计算模型来计算pErbB3水平
基于实施例5获得的结果，其中ErbB1、ErbB2、ErbB3、HRG和BTC被鉴定为使用计算模型预测pErbB3的关键标志，表2描述的蛋白表达水平的测量被用作计算模型的输入来计算不同肿瘤细胞系的pErbB3水平。
BTC和HRG表达水平输入计算模型需要从无量纲的单位或pg/μg转换为浓度[M]。因此，需要确定转换因子。在实验测量的pErbB3水平与预测的pErbB3水平之间在线性范围推测将HRG mRNA水平和BTC蛋白表达水平转换为摩尔浓度的转换因子。对于实验测量的值，在10％胎牛血清(FBS)中测量了四种细胞系(MALME3M、DU145、ADRr和ACHN)中组成型ErbB3磷酸化水平(pg/μg)。这些实验测量的结果显示在实施例4，表2，第7列。对于配体转换因子训练，随时间积分的标准化预测的pErbB3信号对在体外10％FBS中实验测量的pErbB3绘图，使用6.1e-005的BTC转换因子和3.1e-013的HRG mRNA转换因子。通过优化细胞系ADRr、MALME3M、ACHN和DU145中预测的组成型pErbB3与测量的组成型pErbB3水平(通过ELISA)之间的线性关系，训练配体转换因子。
因此，使用模型模拟HRG和BTC对途经的激活，且如计算的pErbB3水平所示，获得网络激活状态(NAS)为输出。在这种情况下，NAS被定义为在HRG和BTC刺激的前两个小时内模型中模拟的时间积分pErbB3的量。计算的pErbB3水平的结果显示于图7的图中。ADRr细胞的模拟的NAS初始被设为对Ab#6治疗的应答者与非应答者之间的阈值，因为在异种移植模型中试验的四种细胞系中，ADRr细胞系是具有最高pErbB3水平的非应答者。
实施例7：使用异种移植物应答设定NAS阈值并基于NAS阈值预测应答性
在该实施例中，实施例1中描述的四种肿瘤细胞系的异种移植物应答与如实施例6所述计算的NAS值(标准化的时间积分的pErbB3水平)相结合来设定对Ab#6治疗的应答者和对Ab#6治疗的非应答者的NAS阈值。
更特别地，对ADRr、ACHN、DU145和MALME3细胞系测定的生长速率降低(GRR)值(实施例1中进一步描述)被转换为二元结果，用于分层训练，通过将“应答者”设定为具有大于ADRr细胞中pErbB3水平的pErbB3水平(即，pErbB3＞pErbB3(ADRr))，其中“非应答者”被设定为具有小于ADRr细胞中pErbB3水平的pErbB3水平(即，pErbB3＜pErbB3(ADRr))。应该注意，这不是模型预测；确切说，这是分层训练过程的部分。
对于四种细胞系，实验测定的GRP值根据计算的NAS值(标准化时间积分pErbB3)绘制。x轴上GRR值被分成应答者(pErbB3＞pErbB3(ADRr))和非应答者(pErbB3＜pErbB3(ADRr))。NAS训练数据(如实施例4所述获得)允许将网络激活状态y-轴分成三类：模拟的应答者(″Sim R″)、模拟的非应答者(″Sim NR″)和模拟的中间者(″Sim I″)。两种异种移植细胞系被鉴定为生长速率降低值超过20％(DU145，ACHN)，其中DU145细胞系具有最低的网络激活状态。因此，将细胞系分类为模拟应答者的阈值被设在大于或等于ADRr水平的网络激活状态。类似地，MALME3细胞系异种移植物是非应答者(pErbB3＜pErbB3(ADRr))，因此，低于ADRr水平的细胞系的网络激活状态被分类为模拟的非应答者。这些ADRr和DU145阈值之间的网络激活状态被分类为模拟的中间者。
模拟一组15种细胞系的计算的pErbB3水平所指示的网络激活状态，其HRG、BTC、ErbB1、ErbB2和ErbB3的实验测量是可获得的。对15种细胞计算的积分pErbB3水平，连同四种训练细胞系的水平，绘制在图8A所示的条形图中，从最高到最低的pErbB3水平。然后对这15种细胞系计算的NAS值分级，依据之前对四种训练细胞系ADRr、ACHN、DU145和MALME3M测定的NAS值。共19种细胞系的NAS结果被分级，如图8B图中所示。等于或低于MALME3M细胞系的NAS值被设为模拟的非应答者(″Sim NR″)，在MALME3M和DU145细胞系之间的NAS值被设为模拟的中间者(″Sim I″)，而等于或高于DU145细胞系的NAS值被设为模拟的应答者(″Sim R″)。因此，如图8B所示，IGROV1(NCI-60、cosmic样品ID No.905968)、MDA-MB-361(ATCC No.HTB-27)、SKMEL-5(ATCC No.HTB-70)、MDA-MB-231(ATCC No.HTB-26)和T47D(ATCC No.HTB-133)细胞系被预测为是模拟的非应答者，因为它们的计算NAS值低于MALME3M的计算NAS值。而且，ZR75-1(ATCC No.CRL-1500)、HOP92(NCI-60，cosmic样品ID No.905973)和HOP62(NCI-60，cosmic样品ID No.905972)细胞系被预测为是模拟的中间者，因为它们计算的NAS值在ADRr与DU145之间。最后，SKBR3(ATCC No.HTB-30)、UACC62(NCI-60，cosmic样品ID No.905976)、EKVX(NCI-60，cosmic样品ID No.905970)、BT474(ATCC No.HTB-20)、SKOV3(ATCC No.HTB-77)、OVCAR8(获自National Cancer Institute，Division of Cancer Treatment and Diagnostics)和CAKl1(NCI-60，cosmic样品ID No.905963)细胞系被预测为模拟的应答者，因为它们的计算NAS值高于ADRr的计算NAS值。
为了测试这些模型预测，进行了三个额外的体内异种移植物研究。IGROV1、OVCAR8和SKOV3细胞系被用于实施例1所述进行的异种移植物研究，其中小鼠用每3天600μg Ab#6治疗或者用PBS治疗作为对照。通过肿瘤体积(mm3)随时间变化而测定的异种移植物应答概括于图9A-9C的图中。同样，使用下式计算每种细胞系的生长速率降低(GRP)值：
生长速率降低＝1-(Ab#6生长速率)/(PBS生长速率)
试验的四种细胞系的GRP值概括于下表14：
表14：异种移植物研究的预测组的肿瘤生长速率降低概述
  细胞系  GRR[％]
  IGROV1  6.3
  OVCAR8  91.4
  SKOV3  19.6
有关每种细胞系的Ab#6应答性的预测，基于异种移植物应答者必须具有比ADRr的模拟pErbB3高的模拟pErbB3水平的标准，IGROV1异种移植物被分类为非应答者，而OVCAR8和SKOV3异种移植物被分类为应答者。
这些数据说明，基于计算的NAS值而做出的预测准确对应于在异种移植物研究中实验观察到的三种试验细胞系对体内Ab#6治疗的应答性。更具体说，IGROV1细胞系基于其计算的NAS值被预测为模拟的非应答者，并且基于其GRR值被实验观察为非应答者。类似地，OVCAR8和SKOV3细胞系基于其计算的NAS值被预测为模拟的应答者，并且基于其GRR值被实验观察为应答者。
因此，这些实验证实了计算模型的效力，标准化的时间积分的pErbB3水平的计算NAS值预测对体内Ab#6治疗的应答性。
实施例8：Ab#6应答性的直接生物标志的鉴定
在该实施例中，针对在实施例1描述的异种移植物研究中检验的四种细胞系(ADRr、ACHN、DU154和MALME3M)以及在实施例7描述的异种移植物研究中检验的三种细胞系(IGROV1、OVCAR8和SKOV3)所获得的数据被进一步检验以确定是否可以鉴定Ab#6应答性的直接生物标志。
首先，检验ErbB1、ErbB2和ErbB3的受体浓度是否有效将异种移植物数据分类为应答者和非应答者。如在图10A-10D的图(其中一个受体的浓度的对数对一个或多个其他受体的浓度的对数绘图)中所示例说明的，仅ErbB1受体测量表现出将异种移植物数据分类为应答者和非应答者，而其他受体都没有。
接下来，检验HRG的浓度与一种受体浓度(例如，ErbB1，ErbB3)的组合是否有效将异种移植物数据分类为应答者和非应答者。如在图11的图(其中HRG的浓度的对数对ErbB1的浓度的对数绘图)中所示例说明的，HRG和ErbB受体之一这两种浓度测量能够准确地将异种移植物数据分类为应答者和非应答者。更具体说，三种非应答者MALME3、ADRr和IGROV1的数据可从六种应答者的数据分开，从而允许非应答者与应答者的分类。
因此，Ab#6应答性的直接生物标志被鉴定为HRG与ErbB途径受体之一(例如，ErbB1，ErbB3)的组合。
下表15总结了实施例7中研究的细胞系的预测的应答者和非应答者，使用Ab#6的直接生物标志做出预测。使用直接生物标志确定的预测很好对应于使用NAS值确定的预测(如实施例7所述)。例如，ACHN、DU145、OVCAR8和SKOV3细胞系之前已经使用NAS值被鉴定为应答者，并且还使用直接生物标志预测为应答者。类似地，ADRr、MALME3M和IGROV1细胞系之前已经使用NAS值被鉴定为非应答者，并且还使用直接生物标志预测为非应答者。
表15：使用Ab#6的直接生物标志预测的应答者和非应答者
Figure BPA00001347607400781
比较使用NAS区分应答者和非应答者的实施例7的结果与使用直接生物标志区分的实施例8的结果，只有BT474、MDA-MB-231和UACC62细胞系是不一致的。这两种不同分类方法之间存在一定差异是不令人惊讶的。在这种情况下，有争议的细胞系被认为是应答者，因为在对患者分层情况下，假阳性比假阴性优选。
实施例9：通过ELISA和qIHC比较异种移植物和人肿瘤之间的蛋白表达水平
在该实施例中，评估了在异种移植物中观察到的蛋白表达谱与在人肿瘤中观察的蛋白表达谱之间的相似性或差异。其被进行来确定在异种移植物中观察到的蛋白水平是否与在人肿瘤中观察到的蛋白水平相当。
在第一组实验中，通过ELISA测量蛋白水平。基本上如实施例2详细描述，从来自人肿瘤样品或来自异种移植物的快速冷冻肿瘤制备裂解物，并基本如实施例2所述，通过ELISA分析裂解物中ErbB1-4、HRG-β1和BTC的蛋白水平。结果(使用上述方法或其小变化形式获得)在图12A-12C的图中绘制。结果说明，异种移植物样品中获得的蛋白水平的值大大散布在不同组织来源的人肿瘤样品中获得的蛋白水平值，表明异种移植物中观察的蛋白水平与人肿瘤中观察的蛋白水平相当。基于这些数据，肯定为预测异种移植物中应答性而确定的NAS阈值可以被应用来使用人肿瘤组织样品预测应答者。
因为在临床条件下可能难以获得冷冻组织样品，使用测量技术进行第二组实验，所述测量技术允许在***固定和石蜡包埋的(FFPE)样品中的蛋白质定量。更具体说，使用AQUA
Figure BPA00001347607400791
***(HistoRx，Inc.，New Haven，CT)进行定量免疫组织化学(qIHC)。使用免疫荧光和具有代表性蛋白表达水平的细胞系组，制备细胞系标准曲线。细胞系标准曲线则允许回算肿瘤样品和异种移植物中的蛋白表达水平。结果示于图13A-13D。图13A显示ErbB1的细胞系标准曲线。图13B、13C和13D分别显示绘制在异种移植物细胞系(红色条)和人肿瘤样品(蓝色条)中ErbB1、ErbB2和ErbB3的qIHC评分的条线图。qIHC结果说明人肿瘤样品和异种移植物样品之间蛋白表达水平的相似性，其横跨很宽范围的蛋白表达水平。这些结果再次支持如下判断：预测在异种移植物中应答性而确定的NAS阈值可应用来使用人肿瘤组织样品预测应答者。
实施例10：应答性与磷酸化异二聚体的相关性
在该实施例中，磷酸化ErbB同二聚体和异二聚体的积分水平被计算为NAS值以确定它们是否与对Ab#6治疗的应答性相关。
使用如实施例4所述制备的相同计算模型。该模型基于对ErbB1、ErbB2、ErbB3、HRG-β1和BTC的水平的实验确定的测量值而产生。如实施例4所讨论的，在文献中描述的七种ErbB异二聚体和同二聚体以下述模型实现：ErbB1/1、ErbB1/2、ErbB1/3、ErbB1/4、ErbB2/2、ErbB2/3和ErbB2/4。这些二聚体的大部分由配体结合激活，但是几个通过“横向信号传导”(或二次二聚化)的过程产生，其中以配体依赖性方式磷酸化的二聚体被解离成单体，该单体然后与激活或未激活的单体同寡聚化或异寡聚化而产生活性二聚体。用一组实验数据训练计算模型，所述实验数据允许使用ADRr细胞系鉴定在HRG或BTC存在下形成的二聚体。
因此，磷酸化同二聚体和异二聚体的积分水平被计算为下述细胞系的网络激活状态(NAS)的量度：MALME3M、BT474、IGROV1、ADRr、OVCAR8、SKOV3、DU145和ACHN。如图14的图所示，磷酸化ErbB1/3异二聚体(pErbB1:3)的计算水平将八种细胞系分成Ab#6非应答者(MALME3M、BT474、IGROV1、ADRr)和应答者(OVCAR8、SKOV3、DU145和ACHN)。这种基于计算的pErbB1:3水平的区分与实施例8所述使用直接生物标志确定的预测非应答者和应答者等同地相关。这种基于计算的pErbB1:3水平的区分还与实施例7所述使用NAS值的计算的pErbB3水平而确定的预测非应答者和应答者几乎等同地相关，唯一差异是BT474细胞系，BT474细胞系使用直接生物标志和计算的pErbB1:3水平都被鉴定为非应答者，而使用计算的pErbB3水平被鉴定为应答者。
ErbB1/1、ErbB1/2、ErbB1/3、ErbB1/4、ErbB2/2、ErbB2/3和ErbB2/4二聚体的水平还使用计算模型计算，但是这些同二聚体或异二聚体的任何一种的水平都不将细胞系区分为对Ab#6治疗的应答者和非应答者。因此，ErbB1/3异二聚体观察到的结果在所检验的二聚体中是独特的。
这些结果说明，磷酸化ErbB同二聚体或异二聚体的积分水平可用作本发明预测方法中的NAS值，并且更具体说，计算的pErbB1:3水平是预测对Ab#6治疗的应答性的优选NAS值。这些结果被解释为表示，Ab#6在具有高水平ErbB1:3异二聚体的癌症中特别有效，因此，ErbB1:3异二聚体总水平或pErbB1:3异二聚体水平的直接测量还可以用作预测Ab#6治疗效力的直接生物标志。
实施例11：治疗剂对ErbB信号传导途径效应的计算模型的构建和训练
在该实施例中，实施例4所述用于构建机械计算模型的方法被用于构建和训练ErbB信号传导途径的模型，并进一步用于开发特定治疗剂抑制信号传导途径的机制的计算展示。
该实施例中使用的治疗剂是双特异性抗体H3x B1D2(其氨基酸序列示于SEQ ID NO：41并进一步描述于美国专利号7,332,585、美国专利号7,332,580和公布为WO 2007/084187的PCT申请PCT/US2006/023479、以及公布为WO 2008/140493的PCT申请PCT/US2007/024287)。该双特异性抗体由与抗ErbB2单链抗体连接的抗ErbB3单链抗体组成。
预测H3x B1D2剂优先靶向ErbB2-过表达肿瘤。因此，在过表达的ErbB2存在下的ErbB信号传导网络的计算模型使用实施例4所述方法和模型构建。模型加入了HRG与ErbB1、ErbB2和ErbB3受体之间的相互作用，导致AKT下游的受体运输和细胞内信号传导，产生磷酸化AKT(pAKT)。加入的相互作用基本上与实施例4模型中发现的那些相同。与实施例4模型相反，与配体BTC相关的反应未加入该模型中。
该模型被校核以匹配ErbB2过表达的***细胞系BT474-M3(该细胞系描述于例如Drummond等人(2005)Clin.Cancer Res.11：3392；Park等(2002)Clin.Cancer Res.8：1172；Kirpotin等人(2006)Cancer Res.66：6732)的实验数据。模型校核导致与实施例4模型相比仅小的参数值差异。最显著的差异是ErbB受体内化和降解的速率的降低。该变化与已知数据相一致，表明ErbB2过表达降低其他ErbB受体(诸如ErbB1)的内化/运输速率(参见，例如，Hendriks等人(2003)J.Biol.Chem.278：23343-23351；Wang等人(1999)Mol.Biol.Cell 10：1621-1636；Haslekas等人(2005)Mol.Biol.Cell 16：5832-5842)。
为了训练模型，使用包括剂量-时间矩阵的数据组，其中通过ELISA测量了BT474-M3细胞中在多个时间点和六种不同浓度HRG刺激时ErbB1、ErbB2、ErbB3和AKT的磷酸化。
为了刺激细胞，细胞以每孔150,000个细胞被接种在12孔组织培养板中具有1000μl完全培养基的重复孔中(用于96半孔ELISA)，或者以每孔20,000细胞被接种在96孔组织培养板中含有100μl完全培养基的重复板中(用于384孔ELISA)。这些细胞在5％CO2，95％空气和37摄氏度的加湿气氛中孵育过夜。然后将细胞转移至无血清培养基：RPMI-1640培养基(Gibco)，补充有2mM L-谷氨酰胺(Gibco)和单位/mLPen-Strep(Gibco)。饥饿的细胞在刺激之前在5％CO2，95％空气和37摄氏度的加湿气氛中孵育20-24小时。对于剂量-时间矩阵研究，细胞用配体(HRG)在0、1、2、3、4、5、7、10、20、30、60和120分钟刺激。对于每个时程，在用6种不同浓度的HRG(0.098nM-100nM)刺激之后，细胞置于冰上，用冷PBS洗涤，然后在200μl(对于12孔板)和45μl(对于96孔板)冷M-PER哺乳动物蛋白提取缓冲液(Thermo Scientific，目录号78501)中裂解，所述缓冲液补充了蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich，P2714)、1mM原钒酸钠(Sigma-Aldrich，S6508)、5mM焦磷酸钠(Sigma-Aldrich，221368)、50μM氧苯砷(EMD Biosciences，521000)和10μM bpV(phen)(EMD Biosciences，203695)。
通过ELISA测量刺激的细胞中蛋白磷酸化水平。使用R&D Systems Duoset IC试剂盒(ErbB1 DYC1095-E、ErbB2 DYC1768-E、ErbB3 DYC1769-E)测量ErbB1、ErbB2和ErbB3。针对ErbB1(R&D Systems，841402)、ErbB2(R&D Systems，841425)、ErbB3(R&D Systems，841428)和AKT(Upstate，05-591MG)的捕获抗体在室温下在96半孔板(Greiner，目录号82050-046)或384孔板(Nunc目录号40518)中孵育过夜，所述板是黑色平底聚苯乙烯高结合板。ELISA板用2％牛血清白蛋白(BSA)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)封闭1小时，然后与在2％BSA、0.1％Tween-20和PBS中稀释的裂解物在室温孵育2小时。在每次孵育之间，板用PBS中0.05％Tween-20洗涤三次。用于测量磷酸-ErbB1、磷酸-ErbB2和磷酸-ErbB3的ELISA与抗磷酸-酪氨酸-HRP检测抗体(R&D Systems，841403)孵育2小时。测量磷酸-AKT的ELISA与丝氨酸473特异性抗磷酸AKT小鼠初级单克隆抗体(Cell Signaling Technologies，目录号5102)孵育2小时，然后与链霉亲和素-HRP(R&D Systems，目录号DY998，)孵育20分钟。所有ELISA用SuperSignal ELISA Pico化学发光底物(Pierce，目录号37069)显影，并使用光度计测量发光信号。
如图21所示，在实验检验的HRG的所有剂量下，该模型匹配ErbB2过表达细胞系BT474-M3中HRG诱导的pErbB3信号传导数据。此外，在大约5nM和更低的HRG剂量下，该模型匹配BT474-M3细胞系中HRG诱导的pAKT信号传导数据。
接下来，开发了H3x B1D2抑制ErbB途径的HRG依赖性信号传导的机制的计算展示。使用质量作用方程构建抑制剂的计算展示，所述方程描述抑制剂与ErbB2和ErbB3的结合以及随后HRG诱导的信号传导的抑制。结合事件的参数通过组合直接测量(使用本领域公知技术)和模型的计算训练以匹配H3x B1D2抑制细胞中HRG诱导的pErbB3的数据来获得。特别地，通过标准BIACore和KinExA技术实验确定了双特异性抗体的H3单链臂对ErbB3结合的结合速率和解离速率以及双特异性抗体的B1D2单链臂对ErbB2结合的结合速率和解离速率。H3xB1D2计算模型的反应和参数出现于表16a和16b。
表16a
Figure BPA00001347607400841
**在该反应方案中，游离(H3x B1D2)的量保持恒定。
表16B
Figure BPA00001347607400842
ErbB信号传导模型与抑制剂模型组合并用于预测H3x B1D2抑制pErbB3和pAKT信号传导的实验数据。使用与上述相同的方法产生实验数据，除了在血清饥饿过程中添加浓度范围从15pM至1μM的H3xB1D2。此外，使用在5nM HRG刺激后十分钟裂解时间点产生抑制数据。该模型成功地重新总结了实验结果，显示H3x B1D2的抑制的IC50在不同细胞系中不显著改变，但是抑制百分比却相差很大。抑制百分比改变的主要原因是ErbB2的表达水平。这在实验中被说明，其中ErbB2被转染入OVCAR8细胞系以产生ErbB2过表达细胞系(称为OVCAR8-HER2)。用H3x B1D2治疗的OVCAR8细胞的pErbB3和pAKT抑制曲线与用H3x B1D2治疗的OVCAR8-HER2细胞的相同抑制曲线相比较。结果示于图17A-D，其中图17A和17B分别显示在用H3x B1D2治疗(实验或模型模拟)的OVCAR8细胞中pErbB3和pAKT的抑制曲线，并且图17C和17D分别显示在用H3x B1D2治疗(实验或模型模拟)的OVCAR8-HER2细胞中pErbB3和pAKT的抑制曲线。还显示了实验治疗的细胞(″DR50数据″)和模拟治疗的细胞(″DR50模拟″)的IC50。数据显示，高水平的ErbB2表达导致H3x B1D2治疗的更高抑制百分比。
除了ErbB2调节百分比抑制的主要作用外，ErbB1的意想不到的作用被计算模型所揭示。ErbB1的这种作用通过模拟示例说明，显示了向ADRr细胞添加ErbB1 RNAi刺激ErbB1下调的作用。ADRr细胞仅表达低水平的ErbB2，并在计算模型和实验测定的数据中都表现出差的H3xB1D2百分比抑制。该数据示于图18A和18B，其分别显示了用H3xB1D2治疗(实验或模型模拟)的ADRr细胞中pErbB3和pAKT的抑制曲线。还显示了实验治疗的细胞(″DR50数据″)和模拟治疗的细胞(″DR50模拟″)的IC50。然而，ErbB1表达的下调(通过模拟添加RNAi)导致模拟中更大的抑制百分比，如图图18C和18D，其分别显示用ErbB1 RNAi和H3x B1D2治疗模拟的ADRr细胞中pErbB3和pAKT的抑制曲线。ErbB1 RNAi模拟的结果表明，ErbB1表达是H3x B1D2的阴性反应生物标志。
总之，计算模型和实验数据表明，存在用于体外负调节对H3x B1D2应答性的两个机制：(i)不够高的ErbB2水平；和(ii)高ErbB1水平。相反，ErbB2表达的高水平和ErbB1表达的低水平与对H3x B1D2应答性增加相关。
实施例12：对H3x B1D2治疗的体内应答性与从计算模型预测的应答性相关
在该实施例中，肿瘤对H3x B1D2治疗的体内应答性与ErbB途径中各种组分的计算水平相关，以鉴定对H3x B1D2治疗的应答性的直接和间接生物标志。
为了鉴定肿瘤对H3x B1D2治疗的体内应答，在异种移植肿瘤模型中试验了一组肿瘤细胞系，如实施例1所述。在异种移植肿瘤模型中，小鼠(nu/nu小鼠：4-5周大的雌性小鼠，无胸腺，裸，远交背景；Albino；购自Charles River Labs，Wilmington，MA)肋腹植入5x106-2x107个细胞/小鼠(取决于细胞系)，200μl皮下注射。监测小鼠的最初肿瘤生长。允许肿瘤生长几天，直至平均肿瘤体积为大约150-200mm3。计算肿瘤体积为V＝(π/6(LxW2)。小鼠用H3x B 1D2抗体治疗，剂量为600μg/每三天注射(q3d)。对照小鼠用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或野生型HAS(人血清白蛋白)治疗。测量肿瘤体积40-80天。
检验了下述12种肿瘤细胞系：ACHN、ADRr、IGROV1、LS180、MIA PaCa2、ZR75-1、MDA-MB-361、ADrR-HER2(被转染以过表达HER2的ADrR细胞)、NCI-N87、CALU-3、SKOV-3和BT474-M3。对于这些细胞系在计算模型中的使用，使用上述方法或其小变化形式实验测定了每种细胞系中ErbB1、ErbB2和ErbB3的表达水平，结果示于下表17：
表17：ErbB受体水平
Figure BPA00001347607400861
来自体内异种移植物实验的对照和治疗数据被拟合指数生长曲线，使用下式：V＝Vo*exp(k*t)
其中V是肿瘤体积，Vo是零时的肿瘤体积，k是指数生长速率，并且t是时间。H3x B1D2抑制肿瘤生长的效价表示为每个试验细胞系的治疗指数生长速率与对照指数生长速率的比。该比被称为“相对生长速率”(RGR)并表示为：
RGR＝kH3x B1D2/k对照
1的相对生长速率(RGR)表示该试剂没有作用。0的RGR表示该试剂完全阻止肿瘤生长。负的RGR表示该试剂导致肿瘤逆转。
在检验的12种细胞系中，仅BT474-M3具有负的RGR(即H3xB1D2仅在该细胞系中导致肿瘤逆转)。两种细胞系IGROV1和LS180具有大于1的RGR值，表示H3x B1D2对这些细胞系的肿瘤生长无作用。其余9种细胞系的RGR值在0与1之间，表示H3x B1D2部分抑制这些细胞系的肿瘤生长。
12种细胞系的RGR值对细胞系中不存在H3x B1D2抑制剂时ErbB2单体、ErbB2:ErbB2同二聚体和ErbB2:ErbB3异二聚体的模型计算的水平而绘图，基于每种细胞系中ErbB1、ErbB2和ErbB3的测量水平。结果示于图19A-C，其显示了用H3x B1D2治疗的异种移植模型中一组肿瘤细胞的体内测定的相对生长速率(RGR)对在不存在H3x B1D2时该组肿瘤细胞中ErbB2单体(图19A)、ErbB2:ErbB2同二聚体(图19B)和ErbB2:ErbB3异二聚体(图19C)的计算水平绘制的图。
图19的结果显示，RGR与ErbB2单体、ErbB2:ErbB2同二聚体和ErbB2:ErbB3异二聚体的计算水平之间存在线性关系。鉴于该发现，ErbB2单体、ErbB2:ErbB2同二聚体和/或ErbB2:ErbB3异二聚体的直接测量可用作H3x B1D2应答性的直接生物标志。而且，肿瘤样品中ErbB1、ErbB2和ErbB3的测量可用于计算ErbB2:ErbB2同二聚体和/或ErbB2:ErbB3异二聚体的水平以分类肿瘤对H3x B1D2治疗的应答性(即，ErbB1、ErbB2和ErbB3的测量水平可用作H3x B1D2应答性的直接生物标志，其可用于计算ErbB2:ErbB2同二聚体和/或ErbB2:ErbB3异二聚体的水平)。因此，例如ErbB2:ErbB2同二聚体和/或ErbB2:ErbB3异二聚体的计算水平可用作网络激活状态(NAS)值，根据其可预测对H3x B1D2治疗的应答性。
12种细胞系的RGR值还可对在模拟的H3x B1D2抑制剂不存在和存在下细胞系中ErbB2:ErbB2异二聚体和ErbB1:ErbB3异二聚体计算的相对水平(例如，比率)绘图。较低的相对水平指示H3x B1D2可以更有效地抑制异二聚体物类的形式。结果示于图20A-B，其显示了用H3xB1D2治疗的异种移植模型中一组肿瘤细胞的体内测定的相对生长速率(RGR)对在模拟存在H3x B1D2时该组肿瘤细胞中ErbB2:ErbB3异二聚体(图20A)和ErbB1:ErbB3异二聚体(图20B)的计算水平绘制的图，与模拟不存在H3x B1D2时异二聚体的模拟水平相比。
图20的结果说明抑制剂破坏ErbB2:ErbB3和ErbB1:ErbB3异二聚体的能力与肿瘤相对生长速率之间的相关性。即，其中ErbB2:ErbB3异二聚体与ErbB1:ErbB3异二聚体的计算的相对水平在模拟存在H3xB1D2抑制剂时低(即，抑制剂对异二聚体破坏高)的肿瘤细胞(例如，BT474-M3细胞)表现出较低的RGR值(表明抑制剂对肿瘤生长更大的作用)。相反，其中ErbB2:ErbB3异二聚体与ErbB1:ErbB3异二聚体的计算的相对水平在模拟存在H3x B1D2抑制剂时高(即，抑制剂对异二聚体破坏低)的肿瘤细胞(例如，ACHN细胞)表现出较高的RGR值(表明抑制剂对肿瘤生长的作用较小)。这些结果说明，模拟信号传导途径的计算模型中治疗剂的存在，与模拟治疗剂不存在相比，允许基于ErbB2:ErbB3或ErbB1:ErbB3异二聚体的相对水平产生网络抑制状态(NIS)，所述NIS可用作肿瘤细胞对治疗剂体内应答性的预测器。
实施例13：结合亲和力(KD)的测量
抗ErbB抗体的解离常数可以使用两种独立技术-表面等离子体共振测定和细胞结合测定-的任何一个或两者来测量。
表面等离子体共振测定
表面等离子体共振测定如Wassaf等人(2006)Analytical Biochem.，351：241-253所述进行。优选的实施方式使用BIACORE 3000仪器(GE Healthcare)，利用重组ErbB蛋白作为分析物，抗ErbB抗体作为配体，基于式KD＝Kd/Ka计算KD值。
细胞结合测定
使用用于ErbB1结合的A-431细胞、用于ErbB2结合的ZR-75-1细胞或用于ErbB3结合的MALME-3M细胞(全部来自ATCC)，进行细胞结合测定。测定基本如下进行。
细胞用2mL胰蛋白酶-EDTA+2mL RMPI+5mM EDTA在室温解离5分钟。将完全RPMI(10mL)直接添加至胰蛋白酶化的细胞，温和重悬，在Beckman台式离心机中以1100rpm离心5分钟。细胞以2x106个细胞/ml的浓度重悬于BD染色缓冲液(PBS+2％FBS+0.1％叠氮化钠，Becton Dickinson)，将50μl(1x105个细胞)小份置于96-孔滴定板。
200nM抗ErbB抗体在BD染色缓冲液中的150μl溶液被制备并连续二倍稀释入75μl BD染色缓冲液。稀释抗体的浓度范围从200nM至0.4nM。然后将50μl小份的不同蛋白稀释液直接添加至50ul细胞悬浮液，产生最终浓度为100nM、50nM、25nM、12nM、6nM、3nM、1.5nM、0.8nM、0.4nM和0.2nM的抗体。
96孔板中的小份细胞与蛋白稀释液在平台式振动器上室温孵育30分钟，用300μl BD染色缓冲液洗涤3次。然后细胞与100μl二级抗体(例如，Alexa 647标记的山羊抗人IgG在BD染色缓冲液中的1∶750稀释液)在冷室内的平台式振动器上孵育45分钟。最后，细胞被洗涤两次，沉淀，并重悬于250μl BD染色缓冲液+0.5μg/ml碘化丙啶。在使用FL4通道的FACSCALIBUR流式细胞仪中进行10,000个细胞的分析。分别在y轴和x轴绘制抗ErbB抗体的MFI值和相应浓度。分子的KD使用GraphPad PRISM软件测定，使用非线性回归曲线的单位点结合模型。
根据式Y＝Bmax*X/KD+X(Bmax＝饱和荧光。X＝抗体浓度。Y＝结合度)计算KD值。
Figure IWB00000006690100011
Figure IWB00000006690100031
Figure IWB00000006690100041
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Figure IWB00000006690100091
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Claims (104)

1.一种用于治疗具有赘生性肿瘤的患者的方法，所述方法包括：获得肿瘤样品，测定所述样品中pErbB3的水平，并随后给患者施用至少一种抗肿瘤治疗剂，
其中，
如果在所述样品中测定的pErbB3水平不低于在无血清培养基中培养20-24小时后的ACHN细胞培养物中测量的pErbB3水平的50％，则随后给患者施用的至少一种抗肿瘤治疗剂包括抗ErbB3抗体，
并且
如果在所述样品中测定的pErbB3水平低于在ACHN细胞培养物中测量的pErbB3水平的50％，则随后给患者施用的至少一种抗肿瘤治疗剂不包括抗ErbB3抗体。
2.根据权利要求1的方法，其中所述样品中pErbB3的水平如下测定：
(a)测量所述样品中ErbB3信号传导途径的至少两种组分每一种的水平；
(b)使用被输入ErbB3信号传导途径计算模型的在(a)中测量的水平来计算模拟所述样品中pErbB3水平的网络激活状态；和
(c)由此测定所述样品中pErbB3的水平。
3.根据权利要求2的方法，其中其水平被测量的至少一种组分选自ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、调蛋白、β细胞调节素、表皮生长因子、肝素结合表皮生长因子、转化生长因子α、双调蛋白、表原和表皮调节素。
4.根据权利要求2或权利要求3的方法，其中水平被测量的一种组分是蛋白，所述蛋白是单体、同二聚体或异二聚体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述异二聚体是ErbB1/ErbB3异二聚体或ErbB2/ErbB3异二聚体。
6.根据权利要求4的方法，其中所述蛋白的水平通过定量荧光激活细胞分选、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学、定量免疫组织化学、荧光共振能量转移、Forster共振能量转移、生物分子荧光互补、质谱法、免疫印迹分析或免疫共沉淀分析来测量。
7.根据权利要求2或权利要求3的方法，其中在(a)中被检测的一种组分是mRNA。
8.根据权利要求2-7任一项的方法，其中计算网络激活状态包括ErbB3信号传导途径的计算机模型，所述计算机模型包括机械模型或统计分类算法。
9.根据权利要求2-8任一项的方法，其中计算的网络激活状态模拟所述样品中pErbB3、磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体和磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体中至少一种的水平。
10.根据权利要求1-9任一项的方法，其中所述肿瘤是器官的恶性肿瘤，所述器官选自结肠、肺、直肠、胆囊、脑、脊髓、***、肾、胰脏、胃、肝、骨、皮肤、脾、卵巢、睾丸、***和肌肉。
11.根据权利要求1-10任一项的方法，其中所述抗ErbB3抗体包括以下至少一种：
(i)具有分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列的Ab#6抗体，或具有分别如SEQ ID NO：7-9和SEQ ID NO：10-12所示的Ab#6的VH和VL CDR序列的抗体；
(ii)具有分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的VH和VL序列的Ab#3，或者包括分别如SEQ ID NO：13-15和SEQ ID NO：16-18所示的Ab#3的VH和VL CDR序列的抗体；
(iii)具有分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的VH和VL序列的Ab#14，或者包括分别如SEQ ID NO：19-21和SEQ ID NO：22-24所示的Ab#14的VH和VL CDR序列的抗体；
(iv)具有分别如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示的VH和VL序列的Ab#17，或者包括分别如SEQ ID NO：27-29和SEQ ID NO：30-32所示的Ab#17的VH和VL CDR序列的抗体；和
(v)具有分别如SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示的VH和VL序列的Ab#19，或者包括分别如SEQ ID NO：35-37和SEQ ID NO：38-40所示的Ab#19的VH和VL CDR序列的抗体。
12.根据权利要求1-11任一项的方法，其中所述抗ErbB3抗体包括MM-121。
13.一种使用计算***的计算机化方法，所述计算***包括至少一个配置用于接收输入的输入装置和至少一个配置用于提供输出的输出装置，所述方法用于预测包含细胞网络的细胞对靶向所述细胞网络内组分的治疗剂的治疗应答，所述方法包括：
(a)通过所述计算***输入装置来接收代表在细胞样品中测量的细胞网络中一种或多种组分的水平的输入；
(b)利用所述计算***，使用所述细胞网络的机械计算模型根据所述输入来计算细胞的网络激活状态或网络抑制状态；和
(c)至少部分地基于在(b)中计算的网络激活状态或网络抑制状态，利用所述计算***产生并在所述输出装置提供细胞对所述治疗剂的治疗的预测应答。
14.一种使用计算***的计算机化方法，所述计算***包括至少一个配置用于接收输入的输入装置和至少一个配置用于提供输出的输出装置，所述方法用于预测包含细胞网络的细胞对靶向所述细胞网络内组分的治疗剂的治疗应答，所述方法包括：
(a)通过所述计算***输入装置接收代表在细胞样品中测量的细胞网络中一种或多种组分的水平的输入；
(b)利用所述计算***，使用所述细胞网络的计算模型根据所述输入来计算细胞的网络激活状态或网络抑制状态，所述计算模型包括统计分类算法；和
(c)至少部分地基于在(b)中计算的网络激活状态或网络抑制状态，利用所述计算***产生并在所述输出装置提供细胞对所述治疗剂的治疗的预测应答。
15.一种用于预测细胞对靶向细胞网络内组分的治疗剂的治疗应答的方法，所述方法包括：
(a)在细胞样品中测量所述细胞网络内一种或多种组分的水平；和
(b)应用计算机实现的方法，包括：使用输入了在(a)中测量的水平的所述细胞网络的机械计算模型来计算细胞的网络激活状态或网络抑制状态；并至少部分地基于利用所述机械计算模型输出的统计分类算法来预测细胞对所述治疗剂的治疗应答。
16.一种使用计算***的计算机化方法，所述计算***包括至少一个配置用于接收输入的输入装置和至少一个配置用于提供输出的输出装置，所述方法用于预测细胞对靶向细胞网络内组分的治疗剂的治疗应答，所述方法包括：
(a)通过所述计算***输入装置来接收代表在细胞样品中测量的细胞网络中一种或多种组分的水平的输入；
(b)利用所述计算***，使用所述细胞网络的计算模型来计算细胞的网络激活状态或网络抑制状态；和
(c)利用所述计算***产生并在所述输出装置提供细胞对所述治疗剂的治疗的预测应答。
17.根据权利要求13-16任一项所述的方法，其中所述细胞网络包括ErbB信号传导途径。
18.根据权利要求17所述的方法，其中其水平被测量的一种组分是参与所述ErbB信号传导途径的ErbB受体配体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述ErbB受体配体是调蛋白、β细胞调节素、表皮生长因子、肝素结合表皮生长因子、转化生长因子α、双调蛋白、表原或表皮调布素。
20.根据权利要求17所述的方法，其中其水平被测量的一种组分是参与所述ErbB信号传导途径的受体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述受体是ErbB1、ErbB2、ErbB3或ErbB4。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗剂包括抗EGFR抗体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述抗EGFR抗体是选自西妥昔单抗、马妥珠单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗和mAb 806的抗体。
24.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗剂包括抗ErbB2抗体。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗ErbB2抗体包括曲妥珠单抗。
26.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗剂包括抗ErbB3抗体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗ErbB3抗体包括以下至少一种：
(i)具有分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列的Ab #6抗体，或具有分别如SEQ ID NO：7-9和SEQ ID N O：10-12所示的Ab#6的VH和VL CDR序列的抗体；
(ii)具有分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的VH和VL序列的Ab#3，或者包括分别如SEQ ID NO：13-15和SEQ ID NO：16-18所示的Ab#3的VH和VL CDR序列的抗体；
(iii)具有分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的VH和VL序列的Ab#14，或者包括分别如SEQ ID NO：19-21和SEQ ID NO：22-24所示的Ab#14的VH和VL CDR序列的抗体；
(iv)具有分别如SEQ ID N O：25和SEQ ID NO：26所示的VH和VL序列的Ab#17，或者包括分别如SEQ ID NO：27-29和SEQ ID NO：30-32所示的Ab#17的VH和VL CDR序列的抗体；和
(v)具有分别如SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示的VH和VL序列的Ab#19，或者包括分别如SEQ ID NO：35-37和SEQ ID NO：38-40所示的Ab#19的VH和VL CDR序列的抗体；
(vi)MM-121；和
(vii)U3-1287。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗ErbB3抗体是包含与抗ErbB2抗体连接的抗ErbB3抗体的双特异性抗体。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述双特异性抗体包括：具有如SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的H3xB1D2双特异性抗体，或者包含与包含分别如SEQ ID NO：48-50和SEQ ID NO：51-53所示的B1D2的VH和VL CDR序列的抗体连接的包含分别如SEQ ID NO：42-44和SEQ ID NO：45-47所示的H3的VH和VL CDR序列的抗体的双特异性抗体。
30.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗剂包括两种或多种抗ErbB3抗体，每种抗体结合ErbB3上的不同表位。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗ErbB3抗体是MM-121。
32.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗剂包括抗ErbB4抗体。
33.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗剂包括pan-ErbB抑制剂或HER二聚化抑制剂。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述治疗剂包括帕妥珠单抗。
35.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗剂包括ErbB信号传导途径的小分子抑制剂，该小分子抑制剂选自吉非替尼、拉帕替尼、CI-1033、厄洛替尼HCL、PKI-166、PD-158780、EKB-569和4-(3-氯苯胺基)-6，7-二甲氧基喹唑啉。
36.根据权利要求13-16任一项所述的方法，其中所述细胞网络包括c-Met信号传导途径。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述治疗剂包括抗-c-Met或抗HGF抗体。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述治疗剂选自AV299、AMG102和5D5。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述治疗剂包括双特异性单克隆抗体，所述双特异性单克隆抗体包含与抗ErbB1抗体连接的抗HGF抗体。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述治疗剂包括c-Met信号传导的小分子抑制剂。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述c-Met信号传导的小分子抑制剂是ARQ 197或PHA665752。
42.根据权利要求13-16任一项所述的方法，其中所述细胞网络包括胰岛素生长因子1受体(IGF1R)信号传导途径。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述治疗剂包括抗IGF1R抗体。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述抗IGF1R抗体是mAb391、IMC-A12、19D12、H7C10、CP751,871、SCV/FC和EM/164。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述抗IGF1R抗体包括双特异性单克隆抗体，所述双特异性单克隆抗体包含与抗ErbB3抗体连接的抗IGF1R抗体。
46.根据权利要求42所述的方法，其中所述治疗剂包括IGF1R信号传导途径的小分子抑制剂，该小分子抑制剂选自NVP-AEW541、NVP-ADW742、NVP-TAE226、BMS-536,924、BMS-554,417、PQ401和环木脂体。
47.根据权利要求13-16任一项所述的方法，其中所述网络包括ErbB信号传导途径，并且水平被测量的组分是ErbB1和调蛋白。
48.根据权利要求13-16任一项所述的方法，其中所述网络包括ErbB信号传导途径，并且水平被测量的组分是ErbB1、ErbB2和ErbB3。
49.根据权利要求13-16任一项所述的方法，其中所述网络包括ErbB信号传导途径，并且水平被测量的组分是ErbB1、ErbB2、ErbB3、调蛋白和β细胞调节素。
50.根据权利要求47-49任一项所述的方法，其中在(b)中计算的网络激活状态模拟ErbB3信号传导途径中一种或多种磷酸化蛋白的水平。
51.根据权利要求50所述的方法，其中在(b)中计算的网络激活状态模拟细胞样品中磷酸化ErbB3的水平。
52.根据权利要求50所述的方法，其中在(b)中计算的网络激活状态模拟细胞样品中磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体或磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体的水平。
53.根据权利要求49所述的方法，其中在(b)中计算的网络激活状态模拟在所述治疗剂不存在时ErbB2:ErbB2同二聚体或ErbB2:ErbB3异二聚体的水平。
54.根据权利要求52所述的方法，其中在(b)中计算的NIS模拟在所述治疗剂存在时ErbB2:ErbB3异二聚体或ErbB1:ErbB3异二聚体的水平，与在所述治疗剂不存在时ErbB2:ErbB3异二聚体或ErbB1:ErbB3异二聚体的水平相比较。
55.根据权利要求13-16任一项所述的方法，还包括通过输入装置来接收代表至少一种选自KRAS、PI3K和PTEN的基因的突变状态的输入的计算***。
56.根据权利要求55所述的方法，其中水平被测量的组分是β细胞调节素和双调蛋白，并且所述方法还包括通过输入装置来接收代表KRAS基因的突变状态的输入的计算***。
57.根据权利要求55所述的方法，其中其水平被测量的一种或多种组分选自ErbB1、ErbB2、ErbB3、调蛋白、β细胞调节素、双调蛋白、肝素结合表皮生长因子、表皮生长因子、转化生长因子α、表原和表皮调节素，并且所述方法还包括确定KRAS基因的突变状态或通过输入装置来接收代表KRAS基因的突变状态的输入的计算***。
58.根据权利要求56或57所述的方法，其中在(b)中计算的网络激活状态模拟ErbB信号传导途径中一种或多种磷酸化蛋白的水平。
59.根据权利要求50-58任一项所述的方法，其中为许多已知的对所述治疗剂的应答者和非应答者而计算的网络激活状态或网络抑制状态值被用于设定网络激活状态或网络抑制状态值的阈值，指示对所述治疗剂的应答性或非应答性。
60.根据权利要求59所述的方法，其中细胞对治疗的应答通过比较(b)中计算的网络激活状态或网络抑制状态与网络激活状态或网络抑制状态阈值来预测，指示对所述治疗剂的应答性或非应答性。
61.根据权利要求15或16所述的方法，其中应用统计分类算法包括将一个或多个选自以下的信息项输入所述算法：
1.在(a)中测定的细胞网络的一种或多种组分的水平；
2.在(b)中计算的网络激活状态或网络抑制状态；
3.细胞样品中一种或多种基因的突变状态；
4.用所述治疗剂治疗的受试者的年龄；
5.用所述治疗剂治疗的受试者的性别；
6.细胞上***受体(ER)的存在或不存在；
7.细胞上孕酮受体的存在或不存在；和
8.细胞上雄激素受体的存在或不存在。
62.一种用于预测细胞对靶向ErbB信号传导途径的组分的治疗剂的治疗应答的方法，所述方法包括：
(a)在细胞样品中测量(i)调蛋白和(ii)至少一种选自ErbB1、ErbB2和ErbB3的受体的水平；和
(b)使用计算机，基于在(a)中测量的水平来预测细胞对所述治疗剂的治疗应答，其中HRG和至少一种受体相对于对照的升高的水平预测对所述治疗剂的治疗的应答性。
63.一种使用计算***的计算机化方法，所述计算***包括至少一个配置用于接收输入的输入装置和至少一个配置用于提供输出的输出装置，所述方法用于预测细胞对靶向ErbB信号传导途径的组分的治疗剂的治疗应答，所述方法包括：
(a)通过所述计算***输入装置接收代表(i)调蛋白和(ii)至少一种选自ErbB1、ErbB2和ErbB3的受体的测量水平的输入，所述水平已经在细胞样品中测量；和
(b)基于所测量的水平，利用所述计算***产生并然后在所述输出装置提供细胞对所述治疗剂的治疗的预测应答，其中HRG和至少一种受体相对于对照的升高的水平预测对所述治疗剂的治疗的应答性。
64.根据权利要求62或63所述的方法，其中所测量的水平是HRG和ErbB1的水平。
65.根据权利要求62或63所述的方法，其中所测量的水平是HRG和ErbB2的水平。
66.根据权利要求62或63所述的方法，其中所测量的水平是HRG和ErbB3的水平。
67.根据权利要求62或63所述的方法，其中所测量的水平是HRG和至少两种选自ErbB1、ErbB2和ErbB3的受体的水平。
68.根据权利要求62或63所述的方法，其中所测量的水平是HRG、ErbB1、ErbB2和ErbB3的水平。
69.一种用于预测细胞对靶向ErbB信号传导途径的组分的治疗剂的治疗应答的方法，所述方法包括：
(a)在细胞样品中测量ErbB1/ErbB3异二聚体、ErbB2单体、ErbB2/ErbB2同二聚体、ErbB2/ErbB3异二聚体、磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体和磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体的一种或多种的水平；和
(b)基于(a)中测量的水平，使用计算机预测细胞对所述治疗剂的治疗应答，其中ErbB1/ErbB3异二聚体、ErbB2单体、ErbB2/ErbB2同二聚体、ErbB2/ErbB3异二聚体、磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体或磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体相对于对照的水平差异预测对所述治疗剂治疗的应答性。
70.一种使用计算***的计算机化方法，所述计算***包括至少一个配置用于接收输入的输入装置和至少一个配置用于提供输出的输出装置，所述方法用于预测细胞对靶向ErbB信号传导途径的组分的治疗剂的治疗应答，所述方法包括：
(a)通过所述计算***输入装置来接收代表ErbB1/ErbB3异二聚体、ErbB2单体、ErbB2/ErbB2同二聚体、ErbB2/ErbB3异二聚体、磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体和磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体的一种或多种的测量水平的输入，所述水平已经在细胞样品中测量；和
(b)基于所测量的水平，使用所述计算***产生并提供细胞对所述治疗剂的治疗的预测应答，其中ErbB1/ErbB3异二聚体、ErbB2单体、ErbB2/ErbB2同二聚体、ErbB2/ErbB3异二聚体、磷酸化ErbB1/ErbB3异二聚体或磷酸化ErbB2/ErbB3异二聚体相对于对照的水平差异预测对所述治疗剂治疗的应答性。
71.根据权利要求62、63、69和70任一项所述的方法，其中所测量的水平被输入统计分类算法，并根据所述算法的输出来预测细胞对治疗的应答。
72.根据权利要求62、63、69和70任一项所述的方法，其中使用ErbB细胞网络的的计算模型根据所测量的水平来计算网络激活状态或网络抑制状态。
73.根据权利要求72所述的方法，其中根据所计算的网络激活状态或网络抑制状态值来预测细胞对所述治疗剂的治疗应答。
74.根据权利要求62、63、69和70任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括抗ErbB3抗体。
75.根据权利要求76所述的方法，其中所述抗ErbB3抗体包括具有分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列的Ab#6抗体，或具有分别如SEQ ID NO：7-9和SEQ ID NO：10-12所示的Ab#6的VH和VL CDR序列的抗体。
76.根据权利要求69或70所述的方法，其中所测量的水平是ErbB2单体、ErbB2/ErbB2同二聚体和/或ErbB2/ErbB3异二聚体的水平，并且其中所述治疗剂是包含与抗ErbB2抗体连接的抗ErbB3抗体的双特异性抗体。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述双特异性抗体包括：具有如SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的H3x B1D2双特异性抗体，或者包含与包含分别如SEQ ID NO：48-50和SEQ ID NO：51-53所示的B1D2的VH和VL CDR序列的抗体连接的包含分别如SEQ ID NO：42-44和SEQ ID NO：45-47所示的H3的VH和VL CDR序列的抗体的双特异性抗体。
78.根据权利要求13-16、62、63、69和70任一项所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述肿瘤是乳腺癌肿瘤。
80.根据权利要求78所述的方法，其中所述肿瘤是选自肺、直肠、胆囊、脑、脊髓、***、肾、胰脏、胃、结肠、肝、骨、皮肤、脾、卵巢、睾丸、***和肌肉的组织的肿瘤。
81.根据权利要求78所述的方法，其中所述肿瘤样品选自肿瘤组织、细针抽吸物、***抽吸物、从血液样品分离的循环肿瘤细胞、全血、血清、血浆、淋巴、唾液和尿或者从其分离的脱落或循环肿瘤细胞。
82.根据权利要求13-81任一项所述的方法，其中所测量的水平是蛋白水平，并且所述蛋白是单体、同二聚体或异二聚体。
83.根据权利要求82所述的方法，其中蛋白水平通过一种或多种选自定量荧光激活细胞分选、酶联免疫吸附测定、免疫组织化学、定量免疫组织化学、荧光共振能量转移、Forster共振能量转移、生物分子荧光互补、质谱法、免疫印迹分析和免疫共沉淀分析的方法来测量。
84.根据权利要求13-81任一项所述的方法，其中所测量的水平是mRNA水平。
85.根据权利要求13-81任一项所述的方法，还包括根据细胞对治疗的预测应答来选择治疗方案。
86.根据权利要求13-81任一项所述的方法，还包括根据所述预测应答来选择施用所述治疗剂的治疗方案。
87.根据权利要求13-81任一项所述的方法，还包括根据所述预测应答来准备要使用的所述治疗剂。
88.一种用于预测细胞对靶向细胞网络内组分的治疗剂的治疗应答的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)一种或多种用于检测所述细胞网络的一种或多种组分的水平的测定；和
(b)使用所述细胞网络的计算模型计算细胞的网络激活状态或网络抑制状态的说明书。
89.根据权利要求88的试剂盒，还包括：
(c)使用所述试剂盒来预测细胞对所述治疗剂的治疗应答的说明书。
90.根据权利要求88或89所述的试剂盒，还包括应用统计分类算法的说明书。
91.根据权利要求88或89所述的试剂盒，其中用于检测所述细胞网络的一种或多种组分的水平的测定包括允许检测所述组分的蛋白水平的一种或多种试剂。
92.根据权利要求88或89所述的试剂盒，其中用于检测所述细胞网络的一种或多种组分的水平的测定包括允许检测所述组分的mRNA水平的一种或多种试剂。
93.根据权利要求88或89所述的试剂盒，其中用于计算细胞的网络激活状态或网络抑制状态的说明书是使用含有可执行指令的计算机程序产品的说明书，所述可执行指令当被执行时使处理器进行计算细胞网络激活状态或网络抑制状态的操作。
94.根据权利要求88或89所述的试剂盒，其中计算细胞网络激活状态或网络抑制状态的说明书包括试剂盒用户与基于因特网的服务对接的说明书，所述基于因特网的服务在用户输入指示细胞中细胞网络的一种或多种组分的水平的信息时运行计算细胞网络激活状态或网络抑制状态的计算机程序。
95.根据权利要求88-94任一项所述的试剂盒，其中所述细胞网络是ErbB信号传导途径。
96.根据权利要求95所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括一种或多种用于检测至少一种ErbB信号传导途径受体和至少一种ErbB信号传导途径配体的水平的测定。
97.根据权利要求96所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于检测ErbB1、ErbB2、ErbB3、调蛋白和β细胞调节素的水平的测定。
98.根据权利要求95所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于检测ErbB1和调蛋白的水平的测定。
99.根据权利要求95所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括一种或多种用于检测ErbB2单体、ErbB2/ErbB2同二聚体、ErbB2/ErbB3异二聚体或ErbB1/ErbB3异二聚体的至少一种的水平的测定。
100.根据权利要求88-89任一项所述的试剂盒，其中所述细胞是肿瘤细胞。
101.一种用于鉴定用于预测细胞对靶向细胞网络内组分的治疗剂的治疗应答的生物标志的方法，所述方法包括：
(a)在细胞样品中测量所述细胞网络的一种或多种组分的水平；
(b)应用计算机实现的方法，所述计算机实现的方法包括：
(i)使用所述细胞网络的计算模型计算所述细胞网络的一种或多种其他组分的水平；和
(ii)鉴定其计算水平预测细胞对治疗剂治疗的应答的细胞网络组分，从而鉴定所述组分为预测细胞对所述治疗剂治疗的应答的生物标志。
102.一种使用计算***的计算机化方法，所述计算***包括至少一个配置用于接收输入的输入装置和至少一个配置用于提供输出的输出装置，所述方法用于鉴定用于预测细胞对靶向细胞网络内组分的治疗剂的治疗应答的生物标志，所述方法包括：
(a)通过所述计算***输入装置接收鉴定在细胞样品中测量的细胞网络的一种或多种组分的测量水平的输入；
(b)利用所述计算***，使用所述细胞网络的计算模型计算细胞网络的一种或多种其他组分的水平；和
(c)利用所述计算***鉴定其计算水平预测细胞对治疗剂治疗的应答的细胞网络组分为用于预测细胞对所述治疗剂治疗的应答的生物标志。
103.一种计算机程序产品，包括一种或多种存储了计算机可执行指令的计算机可读存储介质，所述计算机可执行指令在被执行时实现权利要求1至87或101至102任一项所述的方法。
104.一种用于治疗具有赘生性肿瘤的患者的方法，所述方法包括：获得肿瘤样品，测定所述样品中pErbB3的水平，并随后给患者施用至少一种抗肿瘤治疗剂，
其中
如果在所述样品中测定的pErbB3水平不低于最低水平，则随后给患者施用的至少一种抗肿瘤治疗剂包括抗ErbB3抗体，
并且
如果在所述样品中测定的pErbB3水平低于0.064pg/μg总蛋白、0.08pg/μg总蛋白、0.096pg/μg总蛋白、0.122pg/μg总蛋白、0.128pg/μg总蛋白、0.144pg/μg总蛋白或0.16pg/μg总蛋白的最低水平，则随后给患者施用的至少一种抗肿瘤治疗剂不包括抗ErbB3抗体。
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