MX2011001764A - Metodos, sistemas y productos para predecir la respuesta de las celulas tumorales a un agente terapeutico y tratar un paciente de acuerdo con la respuesta predicha. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos para tratar pacientes, dichos métodos comprenden métodos para predecir las respuestas de las células, tales como las células tumorales, al tratamiento con agentes terapéuticos. Estos métodos incluyen medir, en una muestra de las células, los niveles de uno o más componentes de una red celular y después calcular un estado de activación de la red (NAS) o un estado de inhibición de la red (NIS) para las células usando un modelo computacional de la red celular. La respuesta de las células al tratamiento es entonces predicha en base al valor de NAS o NIS que ha sido calculado. La invención también comprende métodos predictivos para la respuesta celular en los cuales el cálculo de un valor de NAS o NIS para las células (por ejemplo, las células tumorales) se combina con el uso de un algoritmo de clasificación estadística. También se proporcionan biomarcadores para predecir la respuesta al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de la vía de señalización ErbB.

Description

MÉTODOS, SISTEMAS Y PRODUCTOS PARA PREDECIR LA RESPUESTA DE LAS CÉLULAS TUMORALES A UN AGENTE TERAPEUTICO Y TRATAR UN PACIENTE DE ACUERDO CON LA RESPUESTA PREDICHA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se han hecho considerables avances en el desarrollo de las terapias dirigidas para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades. Tales terapias dirigidas incluyen los anticuerpos monoclonales que se unen a los antígenos que se expresan específicamente o preferentemente en células tumorales y fármacos de molécula pequeña que interfieren específicamente con los componentes diferenciados de las vías de señalización activas en células tumorales. Por ejemplo, el cetuximab (Erbitux®) es un anticuerpo monoclonal que se dirige al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, también conocido como ErbBl o HERI) que se expresa en al menos ciertos cánceres de colon y cánceres de cabeza y cuello. También, por ejemplo, elimatinib (Gleevec®) es una molécula pequeña que se dirige a la tirosina quinasa BCR-Abl, la cual se expresa, y actúa como un factor oncogénico, en ciertas leucemias crónicas y es una variante anormal de una proteína celular benigna. Aunque esas terapias dirigidas se muestran como efectivas en algunos pacientes, la tasa de respuesta nunca es 100%. Por ejemplo, la tasa de respuesta promedio para la monoterapia con cetuximab es solamente alrededor de 15-20% de los pacientes, aun cuando se conoce que los tumores expresan ErbBl (EGFR). Así, la mera expresión de ErbBl (el antígeno dirigido por el anticuerpo cetuximab) en un tumor no garantiza respuesta al cetuximab.

De esta forma, aunque las terapias dirigidas son muy prometedoras, la tasa de respuesta variable de pacientes a estas terapias, combinado con los efectos secundarios asociados con esas terapias y los altos costos típicos de esas terapias, indica que los métodos para tratar pacientes que involucren predecir qué pacientes probablemente respondan al tratamiento terapéutico y solamente administrar el tratamiento a los pacientes que se les pronostique una respuesta, son altamente deseables. Una aproximación que se ha tomado ha sido tratar de identificar marcadores genéticos (por ejemplo, mutaciones o alelos) que correlacionen con la respuesta a la terapia. En esta aproximación, una muestra del paciente es genotipada antes del tratamiento para determinar si el paciente porta un(unos) marcador(es) genético(s) que es(son) indicativo(s) de respuesta a la terapia. Otra aproximación que debe tomarse es tratar de identificar los biomarcadores proteicos que correlacionan con la respuesta a la terapia. En esta aproximación, la expresión de la proteína se determina en una muestra del paciente antes del tratamiento para determinar si el paciente expresa uno o más biomarcadores proteicos que sean indicativos de respuesta a la terapia.

Ambas aproximaciones antes mencionadas se pueden considerar que son aproximaciones del marcador "directas", en donde la presencia (o ausencia, o nivel de expresión) del (de los) marcador(es) (por ejemplo, BCR-Abl o ErbBl) directamente medido ha demostrado que correlaciona con la respuesta o no-respuesta a la terapia. Además, estas dos aproximaciones descansan en el uso de marcadores que son suficientemente estables en células, de manera que puedan ser fácilmente medibles o cuantificables en una muestra que se aisla del paciente. Dado eso, puede haber un intervalo de tiempo considerable entre cuando una muestra se aisla de un paciente y cuando el(los) marcador(es) se miden en la muestra, tales aproximaciones del marcador "directas" descritas anteriormente típicamente requieren el uso de marcadores genéticos o proteicos que no están sometidos a la degradación o alteración con el tiempo cuando las muestras se someten a procesos y manejo convencionales. Aunque esos marcadores "directos", estables, que son predictivos de respuesta para ciertos agentes terapéuticos se han identificado, no está claro si tales marcadores pueden ser identificados por todos los agentes terapéuticos.

Se piensa que los tumores son llevados al crecimiento por un conjunto de de vías de señalización activadas por ligando, las que se activan usualmente por la unión de los ligandos a sus receptores afines, induciendo la fosforilación del propio receptor así como de las quinasas corriente abajo, lo que conduce a una fosforilación adicional de los componentes corriente abajo de la vía. Estas quinasas inducen la supervivencia y proliferación celular. En consecuencia, la activación de la vía de señalización conduce a la alteración de los componentes intracelulares, en particular la fosforilación de proteínas. La característica de la fosforilación de los receptores expresada en el tejido tumoral puede ayudar a identificar las vías principales que conducen al progreso del tumor particular. Sin embargo, las fosfoproteínas pueden ser muy lábiles y la fosforilación puede disiparse rápidamente después de la cirugía si la muestra de tejido no se congela inmediata y rápidamente (o, en algunos casos, fijada a formalina). Además, aun donde es posible medir formalmente los niveles de una o más fosfoproteínas en una muestra de un tumor particular, el valor predictivo de la presencia o ausencia de cualquier fosfoproteína particular respecto a la eficacia del tratamiento de un tumor de este tipo con cualquier agente terapéutico particular, es generalmente desconocido. Por lo tanto, mientras que los perfiles de fosfoproteína contienen información importante acerca de las vías que conducen al progreso del tumor, tales perfiles de fosfoproteína no son ampliamente usados como biomarcadores para predecir la respuesta al tratamiento terapéutico.

En consecuencia, los nuevos métodos para determinar los niveles de varias fosfoproteínas y de usar esos niveles y otras características de las células tumorales para predecir la respuesta de tumores individuales a agentes terapéuticos particulares son necesarios para mejorar la efectividad terapéutica y costo de las terapias del cáncer.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En la presente descripción, se proporcionan métodos para predecir la respuesta de las células, en particular células neoplásicas tales como las células tumorales (por ejemplo, células tumorales benignas o células tumorales malignas) y células malignas que no son células tumorales, a los agentes terapéuticos y métodos para tratar pacientes con esos tumores con agentes terapéuticos.

En un aspecto, se proporcionan métodos para tratar un paciente por una malignidad con un agente terapéutico anti-neoplásico al obtener una muestra de las células malignas del paciente, determinar ciertas características bioquímicas de las células en la muestra, y posteriormente administrar al menos un agente terapéutico anti-neoplásico al paciente. En ciertas modalidades, las características bioquímicas son el nivel de al menos un biomarcador; en modalidades adicionales, el(los) nivel(es) del(de los) biomarcador(es) se determinan midiendo los niveles de otros compuestos bioquímicos más estables y después usando un paradigma de modelación en computadora para determinar los niveles del(de los) biomarcador(es) de interés. El agente terapéutico se selecciona sobre la base del(de los) nivel(es) del(de los) biomarcador(es); ciertos agentes se administran solamente cuando los niveles específicos del(de los) biomarcador(es) están excedidos.

En ciertas modalidades, se proporcionan métodos para tratar un paciente con un tumor neoplásico con un agente terapéutico anti-neoplásico, que comprende: obtener una muestra del tumor (por ejemplo, una muestra de biopsia o una muestra resecada) que comprende células tumorales, determinar un nivel de ErbB3 fosforilado (fosfo-ErbB3, pErbB3) en la muestra, y posteriormente administrar al menos un agente terapéutico anti-neoplásico al paciente. Un agente terapéutico anti-ErbB3 se administra si se encuentra que las células de la muestra contienen al menos un nivel mínimo de pErbB3; un agente terapéutico anti-neoplásico que no es un agente terapéutico anti-ErbB3 se administra, y un agente terapéutico anti-ErbB3 no se administra al paciente si se encuentra que las células de la muestra no contienen al menos un nivel mínimo de pErbB3. Los agentes farmacéuticos anti-ErbB3 preferidos son los anticuerpos anti-ErbB3. En ciertas modalidades de este método, el nivel de ErbB3 en las células de la muestra se determina inferencialmente por la medición de los niveles de otros biomarcadores más estables, y usando un método computarizado que usa un sistema de computación para generar un modelo de computadora para calcular (basado en los niveeles actuales medidos empíricamente de otros biomarcadores en las células de la muestra) un estado de activación de la red que determina, por simulación, los niveles de pErbB3 en las células de la muestra.

Dentro de una de esas modalidades, se proporcionan métodos para tratar un paciente con un tumor maligno, que comprende: obtener una muestra del tumor, determinar un nivel de pErbB3 en la muestra, y posteriormente administrar al menos un agente terapéutico anti-neoplásico al paciente, en donde, si el nivel de pErbB3 determinado en la muestra no es menor que 50% de un nivel de pErbB3 medido en un cultivo de células de cáncer renal ACHN (ATCC núm. CRL-1611) seguido por el cultivo por 20-24 horas en medio libre de suero (por ejemplo, RPMI) entonces el al menos un agente terapéutico anti-neoplásico que se administra posteriormente al paciente comprende un anticuerpo anti-ErbB3, y si el nivel de pErbB3 determinado en la muestra es menor que 50% del nivel de pErbB3 medido en el cultivo de células de cáncer renal ACHN, entonces el al menos un agente terapéutico anti-neoplásico que se administra posteriormente al paciente no comprende un anticuerpo anti-ErbB3.

En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos computarizados que usan un sistema de computación que comprende al menos un dispositivo de entrada configurado para recibir la entrada y al menos un dispositivo de salida configurado para producir la salida, dichos métodos siendo para predecir la respuesta de las células (por ejemplo, las células tumorales) que comprenden un red celular (por ejemplo, una vía de señalización ErbB) para el tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de la red celular, dichos métodos comprenden: (a) recibir, a través de dicho dispositivo de entrada del sistema de computación, entradas que identifican los niveles de uno o más componentes en la red celular medidos en una muestra de las células; (b) calcular a partir de la entrada, con el sistema de computación, un estado de activación de la red (ÑAS) o un estado de inhibición de la red (NIS) para las células que usan un modelo computacional de la red celular; y (c) generar con el sistema de computación, y después de eso, producir en dicho dispositivo de salida, una respuesta predicha de las células para el tratamiento con el agente terapéutico basado al menos, en parte, en el ÑAS o el NIS calculado en (b).

En otros aspectos, se proporcionan métodos para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de una red celular (por ejemplo, una vía de señalización ErbB) comprendida por las células, los métodos comprenden: (a) medir el nivel en una muestra de las células de uno o más componentes de la red celular; y (b) aplicar un método implementado por computadora que comprende: (i) calcular un estado de activación de la red (ÑAS) o un estado de inhibición de la red (NIS) para las células que usan un modelo computacional de la entrada de la red celular con uno más niveles medidos; y (ii) calcular y producir una respuesta predicha de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado al menos, en parte, en el ÑAS o el NIS calculado en (i). En ciertas modalidades, tales métodos pueden comprender, además, tratar las células, o un paciente de quien se obtienen las células, con un agente terapéutico, basado en la respuesta predicha de las células al agente terapéutico.

También se proporcionan métodos para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de una red celular (por ejemplo, una vía de señalización ErbB), los métodos comprenden: (a) medir, en una muestra de las células, los niveles de uno o más componentes de la red celular; y (b) aplicar un método implementado por computadora que comprende: (i) calcular un modelo computacional de la red celular por la aplicación de un algoritmo de clasificación estadística para introducir los niveles medidos y calcular un ÑAS o NIS para las células de ahí; y (ii) predecir la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado al menos en parte en el ÑAS o el NIS calculado. En ciertas modalidades, tales métodos pueden comprender, además, tratar las células, o un sujeto de quien se obtienen las células, con un agente terapéutico, basado en la respuesta predicha de las células al agente terapéutico.

La presente invención proporciona, además, métodos computarizados que usan un sistema de computación que comprende, al menos, un dispositivo de entrada configurado para recibir la entrada y al menos un dispositivo de salida configurado para producir la salida, dichos métodos siendo para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de la red celular, dichos métodos comprenden: (a) recibir, a través de dicho dispositivo de entrada del sistema de computación, entradas que identifican los niveles de uno o más componentes en la red celular medidos en una muestra de las células; (b) calcular con el sistema de computación un estado de activación de la red (ÑAS) o un estado de inhibición de la red (NIS) para las células usando un modelo computacional de la red celular; (c) aplicar, con el sistema de computación, un algoritmo de clasificación estadística; y (d) generar con el sistema de computación, y después de eso producir en dicho dispositivo de salida, una respuesta predicha de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado al menos en parte en la salida del algoritmo de clasificación estadística.

También se proporcionan en la presente descripción métodos para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente de una vía de señalización ErbB. Algunos de estos métodos comprenden: (a) medir, en una muestra de las células, niveles de (i) heregulina (HRG) y (ii) al menos un receptor seleccionado de ErbBl, ErbB2 y ErbB3; y (b) predecir, usando una computadora, la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado en los niveles medidos en (a), en donde niveles elevados de HRG y el al menos un receptor, en relación a un control, predicen la respuesta al tratamiento con el agente terapéutico. Otros métodos de este tipo comprenden (a) medir, en una muestra de las células, niveles de uno o más de heterodímeros ErbBl/ErbB3, monómeros ErbB2, homodímeros ErbB2/ErbB2, homodímeros ErbB2/ErbB2 fosfonlados, heterodímeros ErbB2/ErbB3, heterodímeros ErbBl/ErbB3 fosforilados y heterodímeros ErbB2/ErbB3 fosforilados, heterodímeros ErbB2/ErbB4, heterodímeros ErbB2/ErbB4 fosforilados, heterodímeros ErbB3/ErbB4, heterodímeros ErbB3/ErbB4 fosforilados; y (b) predecir, usando una computadora, la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado en los niveles medidos en (a), en donde una diferencia en el nivel de heterodímeros ErbBl/ErbB3, monómeros ErbB2, homodímeros ErbB2/ErbB2, heterodímeros ErbB2/ErbB3, heterodímeros ErbBl/ErbB3 fosforilados o heterodímeros ErbB2/ErbB3 fosforilados, en relación a un control, predicen la respuesta al tratamiento con el agente terapéutico. En ciertas modalidades, tales métodos pueden comprender, además, tratar las células, o un sujeto de quien se obtienen las células, con un agente terapéutico, basado en la respuesta predicha de las células al agente terapéutico.

La presente invención proporciona, además, métodos computarizados usando un sistema de computación que comprende al menos un dispositivo de entrada configurado para recibir entradas y al menos un dispositivo de salida configurado para producir las salidas, dicho método siendo para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que se dirige a un componente de una vía de señalización ErbB. Algunos de estos métodos comprenden: (a) recibir, a través de dicho dispositivo de entrada del sistema de computación, una entrada que identifica los niveles medidos de (i) HRG y (ii) al menos un receptor seleccionado de ErbBl, ErbB2 and ErbB3, cuyos niveles se midieron en una muestra de las células; y (b) generar con el sistema de computación, y después de eso producir en dicho dispositivo de salida, una respuesta predicha de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado en los niveles medidos, en donde los niveles elevados de HRG y el al menos un receptor, en relación a un control, predicen la respuesta al tratamiento con el agente terapéutico. Otros métodos de este tipo comprenden: (a) recibir, a través de dicho dispositivo de entrada del sistema de computación, una entrada que identifica los niveles medidos de uno o más de heterodímeros ErbBl/ErbB3, monómeros ErbB2, homodímeros ErbB2/ErbB2, heterodímeros ErbB2/ErbB3, heterodímeros ErbBl/ErbB3 fosforilados y heterodímeros ErbB2/ErbB3 fosforilados, cuyos niveles se midieron en una muestra de las células; y (b) generar y producir, con el sistema de computación, una respuesta predicha de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado en los niveles medidos, en donde una diferencia en el nivel de heterodímeros ErbBl/ErbB3, monómeros ErbB2, homodímeros ErbB2/ErbB2, heterodímeros ErbB2/ErbB3, heterodímeros ErbBl/ErbB3 fosforilados o heterodímeros ErbB2/ErbB3 fosforilados, en relación a un control, predice la respuesta al tratamiento con el agente terapéutico.

En otros aspectos, en la presente invención se proporcionan kits para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de una red celular, los kits comprenden: (a) ensayos para detectar niveles de uno o más componentes de la red celular; y (b) instrucciones para calcular un estado de activación de la red (ÑAS) o un estado de inhibición de la red (NIS) para las células usando un modelo computacional de la red celular. En ciertas modalidades, tales kits comprenden, además: (c) instrucciones para el uso del kit para predecir la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico.

La presente invención proporciona, además, métodos para identificar un biomarcador para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de una red celular, el método comprende: (a) medir, en una muestra de las células, los niveles de uno o más componentes de la red celular; y (b) aplicar un método implementado por computadora que comprende: (i) calcular los niveles de uno o más componentes adicionales de la red celular usando un modelo computacional de la red celular; y (ii) identificar un componente de la red celular cuyo nivel calculado predice la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico para identificar, de ese modo, el componente como un biomarcador para predecir la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico.

También se proporcionan en la presente, métodos computarizados que usan un sistema de computación que comprende al menos un dispositivo de entrada configurado para recibir entradas y al menos un dispositivo de salida configurado para producir las salidas, dichos métodos siendo para identificar un biomarcador para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de una red celular, los métodos comprenden: (a) recibir, a través de dicho dispositivo de entrada del sistema de computación, una entrada que identifica los niveles medidos de uno o más componentes de una red celular medidos en una muestra de las células; (b) calcular, con el sistema de computación, los niveles de uno o más componentes adicionales de la red celular usando un modelo computacional de la red celular; y (c) identificar, con el sistema de computación, un componente de la red celular cuyo nivel calculado predice la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico, e identificar, de ese modo, el componente como un biomarcador para predecir una respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico.

Dentro de otros aspectos adicionales, la presente invención proporciona productos de programa de computadora que comprenden uno o más medios de almacenamiento legibles por computadora que almacenan instrucciones ejecutables por la computadora que, cuando se ejecutan, implementan cualquiera de los métodos anteriores.

Breve descripción de las figuras Las Figuras 1A-1D son gráficos que muestran la inhibición del crecimiento del xenoinjerto de tumor por tratamiento con el anticuerpo Ab #6. La Figura 1A muestra los resultados para el modelo de xenoinjerto de tumor MALME3M. La Figura IB muestra los resultados para el modelo de xenoinjerto de tumor DU145. La Figura 1C muestra los resultados para el modelo de xenoinjerto de tumor ADRr. La Figura ID muestra los resultados para el modelo de xenoinjerto de tumor ACHN.

La Figura 2 es un gráfico que representa la concentración de ErbB3 fosforilados (pErbB3) en xenoinjerto de tumores no tratados (en proteína total) contra la reducción de la tasa de crecimiento (%) observada para los xenoinjertos cuando se trataron con Ab #6.

Las Figuras 3A-3E son gráficos de barra que muestran el nivel de pErbB3 (Figura 3A) y AKT fosforilados (pAKT) (Figura 3B) en muestras de xenoinjerto de tumor ACHN congeladas 0, 10, 30 ó 60 minutos después de la disección del xenoinjerto, y los niveles de ErbBl (Figura 3C), ErbB2 (Figura 3D) y ErbB3 (Figura 3E) en muestras de xenoinjerto de tumor EKVX congeladas 0, 10, 30 ó 60 minutos después de la disección del xenoinjerto.

Las Figuras 4A-4D muestran un diagrama esquemático del proceso de convertir un esbozo de una vía de señalización en un modelo computacional. La Figura 4A muestra un esbozo de la vía de señalización ErbB que comprende diferentes ligandos y receptores ErbB. La Figura 4B muestra un conjunto de reacciones bioquímicas que describen las interacciones de las proteínas representadas en el esbozo. La Figura 4C muestra un conjunto de flujos derivados del conjunto de reacciones bioquímicas. La Figura 4D muestra un conjunto de ecuaciones diferenciales ordinarias no lineales (ODEs) basadas en cinéticas de acción másica que describen las redes de transducción de señales.

Las Figuras 5A-5B son gráficos que muestran los niveles de fosfo-ErbB3, fosfo-ErbB2, fosfo-ErbBl y fosfo-AKT en el tiempo en células estimuladas con nueve concentraciones diferentes de heregulina (HRG) (Figura 5A) o betacelulina (Figura 5B) en células de cáncer ovárico ADRr. Los parámetros del modelo computacional se calibraron para simular los resultados (líneas sólidas) para describir los datos experimentales (línea de puntos).

La Figura 6 es un gráfico de barras que muestra los resultados del análisis de sensibilidad local para identificar los marcadores claves para la activación de ErbB3.

La Figura 7 es un gráfico que muestra los niveles calculados de pErbB3 en las líneas celulares MALME3M, DU145, ADRr y ACHN.

Las Figuras 8A-8B son gráficos que muestran el uso de valores ÑAS para predecir la respuesta de 15 líneas celulares para el tratamiento con Ab #6, basado en valores ÑAS umbrales establecidos a partir de las 4 líneas celulares de formación (MALME3M, DU145, ADRr y ACHN). La Figura 8A es un gráfico de barras que representa los niveles de pErbB3 simulados para las 19 líneas celulares, de los niveles pErbB3 más altos a los más bajos. La Figura 8B es un gráfico que clasifica las 19 líneas celulares desde el valor ÑAS más alto al más bajo, con líneas celulares con valores ÑAS por debajo de MALME3M que se clasifican como no respondedores (NR), líneas celulares con valores ÑAS por encima de ADRr que se clasifican como respondedores y líneas celulares con valores ÑAS entre MALME3M y ADRr que se clasifican como indeterminadas.

Las Figuras 9A-9C son gráficos que muestran la inhibición del crecimiento del xenoinjerto de tumor por tratamiento con el anticuerpo Ab #6. La Figura 9A muestra los resultados para el modelo de xenoinjerto de tumor IGROVl. La Figura 9B muestra los resultados para el modelo de xenoinjerto de tumor OVCAR8. La Figura 9C muestra los resultados para el modelo de xenoinjerto de tumor SKOV3.

Las Figuras 10A-10D son gráficos en los que el logaritmo de la concentración de un receptor ErbB se representa contra el logaritmo de la concentración de uno o más de otros receptores ErbB. Los valores del receptor se muestran por líneas celulares clasificadas como respondedores o no respondedores Ab #6. La Figura 10A representa ErbB2 contra ErbBl. La Figura 10B representa ErbB3 contra ErbBl. La Figura 10C representa ErbB2 contra ErbB3. La Figura 10D representa ErbBl contra ErbB2 contra ErbB3.

La Figura 1 1 muestra un gráfico en el que el logaritmo de la concentración de HRG se representa contra el logaritmo de la concentración de ErbBl . En el gráfico, las líneas celulares que responden vs. las que no responden probadas en estudios de xenoinjerto se separan.

Las Figuras 12A-12C son gráficos en los que se representa el logaritmo de los niveles de expresión normalizados (en determinados por ELISA) de diferentes componentes de la vía de señalización ErbB en líneas celulares de xenoinjerto y muestras de tumor humano. La Figura 12A representa ErbB2 contra ErbBl . La Figura 12B representa ErbB4 contra ErbB3. La Figura 12C representa HRG-ß? contra BTC.

Las Figuras 13A-13D son gráficos que muestran los resultados inmunoquímicos cuantitativos (qlHC) para líneas celulares de xenoinjerto y muestras de tumor humano. La Figura 13A muestra una curva de línea celular estándar para ErbBl. Las Figuras 13B, 13C y 13D son gráficos de barras que representan las puntuaciones de qlHC para ErbBl, ErbB2 y ErbB3, respectivamente, en las líneas celulares de xenoinjerto (barras rojas) y muestras de tumor humano (barras azules).

La Figura 14 es un gráfico de barras que muestra el nivel del heterodímero ErbBl :3 fosforilado integrado (cantidad de heterodímeros integrados en el tiempo, por célula) calculado para ocho líneas celulares, que las se separan en no respondedores Ab #6 (MALME3M, BT474, IGROV1 y ADRr) y respondedores (OVCAR8, SKOV3, DU145 y ACHN).

Las Figuras 15A y 15B son cartas de flujo que incluyen varias etapas y actos funcionales que se pueden realizar durante la implementación de ciertas modalidades de la invención.

La Figura 16 es una modalidad de un ambiente de cálculo que se puede usar para implementar algunos aspectos de la invención.

Las Figuras 17A-D son gráficos de curvas de inhibición para las células tratadas con el anticuerpo H3 x B1D2 biespecífico. Las Figuras 17A y 17B muestran las curvas de inhibición para niveles pErbB3 y niveles pAKT, respectivamente, en células OVCAR8. Las Figuras 17C y 17D muestran las curvas de inhibición para los niveles pErbB3 y niveles pAKT, respectivamente, en células OVCAR8 transfectadas con HER2/ErbB2 (células OVCAR8-HER2). La línea sólida representa los datos simulados a partir del modelo computacional, mientras que los círculos representan los datos determinados experimentalmente. Los valores IC50 simulados (DRSOsim) y los valores ICsodeterminados experimentalmente (datosDR50) también se muestran.

Las Figuras 18A-D son gráficos de curvas de inhibición para las células tratadas con el anticuerpo H3 x B1D2 biespecífico. Las Figuras 18A y 18B muestran las curvas de inhibición para niveles pErbB3 y niveles pAKT, respectivamente, en células ADrR. La línea sólida representa los datos simulados a partir del modelo computacional, mientras que los círculos representan los datos determinados experimentalmente. Los valores IC50 simulados (DRSOsim) y los valores IC50 determinados experimentalmente (datosDR50) también se muestran. Las Figuras 18C y 18D muestran las curvas de inhibición simuladas para los niveles pErbB3 y niveles pAKT, respectivamente, en células ADrR con tratamiento simulado con ErbBl iARN.

Las Figuras 19A-C son gráficos de las tasas de crecimiento relativo (RGR) determinadas in vivo para un panel de células tumorales en un modelo de xenoinjerto tratado con H3 x B1D2 representado contra los niveles calculados de monómeros ErbB2 (Figura 19A), homodímeros ErbB2:ErbB2 (Figura 19B) y heterodímeros ErbB2:ErbB3 (Figura 19C) en el panel de células tumorales en ausencia de H3 x B1D2.

Las Figuras 20A-B son gráficos de las tasas de crecimiento relativo (RGR) determinadas in vivo para un panel de células tumorales en un modelo de xenoinjerto tratado con H3 x B1D2 representado contra los niveles relativos calculados heterodímeros ErbB2:ErbB3 (Figura 20 A) y heterodímeros ErbBl :ErbB3 (Figura 20B) en el panel de células tumorales en ausencia y presencia simulada de H3 x B1D2.

La Figura 21 proporciona representaciones gráficas de los datos de señalización pAKT y pErbB3 inducido por HRG predichos (líneas representadas) y actuales (puntos de datos) a partir de la línea celular BT474-M3 que sobreexpresa ErbB2 a dosis de HRG como las indicadas, como se detalla en el Ejemplo 11.

Descripción detallada La presente invención, en general, proporciona métodos, sistemas y productos de programas de computadora en los que el estado de activación de uno o más elementos (por ejemplo, ErbB3) en una o más vías de señalización celular se determina a través del uso de marcadores indirectos en lugar de la medición directa de niveles de uno o más elementos. Estas mediciones indirectas se pueden usar para determinar el estado de activación de elementos en una vía de señalización a través de una simulación por computadora que modela la vía de señalización. Al usar los métodos que se proporcionan en la presente, esta información se puede usar para predecir la respuesta de las células a los agentes terapéuticos, y de esta forma seleccionar un tratamiento terapéutico para un paciente con una enfermedad o trastorno {por ejemplo, cáncer).

A través del uso de la presente invención, se puede alcanzar la determinación de una firma de fosforilación representativa de una muestra de células tumorales. Esto permite el uso de proteínas celulares fosforiladas como biomarcadores para la respuesta a los agentes terapéuticos sin necesidad de medir directamente los niveles de esas fosfoproteínas en muestras de pacientes, evitando así los problemas potenciales asociados con la medición de la fosfoproteína (por ejemplo, inestabilidad, falta de fiabilidad). Tales firmas de fosforilación determinadas por simulación se pueden usar para predecir de manera exacta, la respuesta de las células a los agentes terapéuticos anti-neoplásicos, y por lo tanto, se pueden usar para evitar administrar fármacos contra el cáncer al paciente que son inefectivos para tratar a los pacientes con cáncer. Además, los métodos descritos permiten la simulación de los niveles de otros componentes lábiles dentro de una red celular, tales como homo- y/o heterodímeros de receptores, u homo- y/o heterodímeros fosforilados, dentro de redes celulares, cuyos componentes se pueden usar también para predecir la respuesta de las células a los agentes terapéuticos. Más aun, los métodos descritos permiten la simulación del efecto de un agente terapéutico en componentes dentro de una red celular, los que también se pueden usar para predecir la respuesta de las células al agente terapéutico.

En algunos métodos, los niveles de uno o más componentes celulares estables (tales como receptores celulares de superficie, ligandos y similares) dentro de una red celular se miden en una muestra de células (por ejemplo, células en una biopsia de tumor o tumor resecado). Basado en estas mediciones, se calcula un estado de activación de la red (o ÑAS) o un estado de inhibición de la red (NIS) para las células usando un modelo computacional (por ejemplo, un modelo computacional mecanicista) de una o más redes de transducción de señales. Por ejemplo, el ÑAS puede ser un valor numérico que representa el nivel calculado de una proteína fosforilada (que no se ha medido directamente) dentro de la red celular. Alternativamente, el NIS puede ser un valor numérico que representa el nivel calculado de un componente dentro de la red celular en presencia simulada del agente terapéutico (comparado con el nivel del componente en ausencia simulada del agente terapéutico). Al comparar el ÑAS o NIS calculado con los valores control que representan los valores umbrales para la respuesta o no respuesta, se puede predecir si las células tienen probabilidad de responder al tratamiento terapéutico o no.

Así, el uso de marcadores "indirectos" de la respuesta celular al tratamiento se describe, en donde el nivel de ese marcador "indirecto" (por ejemplo, una proteína o dímero fosforilados dentro de una vía de señalización activada) no se mide directamente sino que se calcula, o simula, en base a los niveles de otros componentes celulares que se miden directamente. Los métodos pueden involucrar también el uso de algoritmos de clasificación estadística, por ejemplo en conjunto con el cálculo de ÑAS o NIS.

En el contexto de la presente invención y como se describe adicionalmente en la sección de ejemplos en la presente, un modelo computacional mecanicista de la vía de señalización ErbB se usó exitosamente para calcular los niveles de ErbB3 fosforilados (pErbB3), como un indicador de activación de la red celular ErbB (o ÑAS), y los niveles de pErbB3 simulados se mostraron para predecir de manera exacta la respuesta de líneas celulares tumorales para tratamiento con un anticuerpo anti-ErbB3, Ab #6, en un sistema de xenoinjerto in vivo. Además, como se describe adicionalmente en la sección de ejemplos en la presente, un modelo computacional mecanicista de la vía de señalización ErbB se usó exitosamente para calcular los niveles relativos del heterodímero ErbB2/ErbB3 y heterodímero ErbBl/ErbB3 en ausencia y presencia simulada de un agente terapéutico, como un indicador de inhibición de la red celular ErbB (o NIS), y los niveles relativos simulados de los heterodímeros ErbB2/ErbB3 y ErbBl/ErbB3 se mostraron para predecir de manera exacta la respuesta de líneas celulares tumorales al tratamiento con un anticuerpo biespecífico anti-ErbB3 x anti-ErbB2, H3 x B1D2, en un sistema de xenoinjerto in vivo.

Para que la invención pueda ser más fácilmente comprendida, ciertos términos se definen primero.

Como se usa en la presente descripción, el término "agente terapéutico" abarca cualquier y todos los compuestos que tienen una capacidad para disminuir o inhibir la gravedad de los síntomas de una enfermedad o trastorno, o aumentar la frecuencia y/o duración de los períodos libres de síntomas o de reducción de los síntomas en una enfermedad o trastorno, o inhibir o evitar impedimentos o discapacidad debido a una aflicción de enfermedad o trastorno, o inhibir o retrasar la progresión de una enfermedad o trastorno, o inhibir o retrasar la aparición de una enfermedad o trastorno, o inhibir o prevenir la infección en una enfermedad o trastorno infeccioso. Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos incluyen las moléculas orgánicas pequeñas, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, biológicos recombinantemente manipulados, compuestos iARN y similares.

Como se usa en la presente descripción, un agente terapéutico que "dirige un componente dentro de una red celular" se refiere a un agente cuya actividad terapéutica resulta, al menos en parte, del agente con un efecto directo o indirecto específico en la actividad de un componente dentro de una red celular. Los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos que dirigen un componente dentro de una red celular incluyen el anticuerpo monoclonal cetuximab, que se une específicamente a ErbBl, dirigiendo así específicamente ErbBl dentro de la red celular ErbB, y gefitinib, una molécula pequeña que inhibe específicamente el dominio tirosina quinasa (TK) de ErbBl, dirigiendo así específicamente ErbBl-TK dentro de la red celular ErbB.

Como se usa en la presente descripción, el término "estado de activación de la red" o "ÑAS" se refiere a un indicador, típicamente un valor numérico, que refleja, o corresponde al, nivel de activación de una red celular. Un ÑAS típicamente se calcula usando un modelo computacional de la red celular. Un ÑAS puede representar, por ejemplo, el nivel simulado de una o más proteínas fosforiladas dentro de una red celular. Aunque uno o más niveles de fosfoproteína son una modalidad preferida para el ÑAS (por ejemplo, nivel pErbB3 como se describe adicionalmente en el Ejemplo 7 o nivel del homodímero o heterodímero ErbB fosforilado, tal como nivel de heterodímero pErbBl/ErbB3 como se describe adicionalmente en el Ejemplo 10, o los niveles de quinasas comente abajo tal como PI3 ), otros componentes celulares dentro de una vía de señalización activada pueden servir como un indicador(es) de la activación de la red y así se pueden usar como el ÑAS, que incluyen pero sin limitarse a la dimerización del receptor (homodímeros y heterodímeros, tales como los niveles de homodímeros ErbBl/ErbBl o ErbB2/ErbB2 o niveles de los heterodímeros ErbBl/ErbB 2, ErbBl/ErbB 3, ErbBl/ErbB 4, ErbB2/ErbB 3 o ErbB2/ErbB 4), clivaje de proteínas, activación de factores de transcripción y activación de la expresión génica. El estado de activación de la red de una célula, por ejemplo, una célula tumoral, es un indicador de la dependencia de la célula en esa vía de señalización, que se puede inhibir por un agente terapéutico que dirige esa vía de señalización particular.

Como se usa en la presente descripción, el término "estado de inhibición de la red" o "NIS" se refiere a un indicador, típicamente un valor numérico, que refleja, o corresponde al nivel de inhibición de una red celular. Un NIS típicamente se calcula usando un modelo computacional de la red celular. Un NIS puede representar, por ejemplo, el nivel simulado de uno o más componentes dentro de una red celular en presencia simulada de un agente terapéutico, comparado con (o en relación a) el(los) nivel(es) simulado(s) en ausencia simulada del agente terapéutico. Por ejemplo, el NIS puede ser una relación del nivel de uno o más componentes en presencia simulada de un agente terapéutico y el nivel de uno o más componentes en ausencia simulada del agente terapéutico. Un ejemplo no limitativo de un NIS es el nivel relativo calculado de uno o más homo- o heterodímeros (tales como los niveles relativos de los heterodímeros ErbB2/3 y ErbBl/3) calculados en ausencia y presencia simulada de un agente terapéutico {es decir, los niveles en presencia simulada del agente terapéutico comparado con los niveles en ausencia simulada del agente terapéutico). Sin embargo, se apreciará que otros componentes celulares dentro de un vía de señalización, cuyos niveles son modulados por un agente terapéutico, también pueden servir como un indicador(es) de inhibición de la red y así sus niveles se pueden usar como indicadores del NIS. El NIS de una célula y el ÑAS de una célula, por ejemplo, una célula tumoral, son indicadores del impacto del agente terapéutico en componentes dentro de una vía de señalización de la célula, y pueden ser predictivos de la respuesta de la célula a los efectos del agente terapéutico.

El término "modelo computacional de una red celular" se refiere a un modelo, tal como un programa de computadora, que traduce un diagrama o esbozo de la vía biológica (por ejemplo, un conjunto de interacciones de las proteínas relevantes al cáncer) en un conjunto de ecuaciones matemáticas conducibles por simulación posterior y análisis. Cierta información (por ejemplo, las concentraciones de proteína del ligando y/o receptor, constantes de velocidad) se pueden introducir en el modelo, el que puede simular información adicional que puede no ser fácilmente medible (por ejemplo, los niveles de fosfoproteína). Un estado de activación de la red (o ÑAS) o un estado de inhibición de la red (o NIS) para una red celular se puede calcular usando un modelo computacional de la red celular como se describe en la presente.

Como se usa en la presente descripción, el término "algoritmo", en general, se refiere a un conjunto de instrucciones, o procedimientos, o fórmulas, para llevar a cabo un método o solucionar un problema. El término "algoritmo de clasificación estadística" se refiere a un algoritmo que define una relación estadística entre uno o más parámetros medibles, o entradas, (por ejemplo, niveles de proteína medidos en una muestra de tejido) y un resultado particular, o salida, (por ejemplo, respuesta a un agente terapéutico) de manera que se pueda hacer una clasificación, o predicción (por ejemplo, respondedor contra no respondedor a un agente terapéutico).

Como se usa en la presente descripción, el término "biomarcador" se refiere a una sustancia (por ejemplo, proteína, ARNm, alelo) dentro, o expresada por, una célula, en donde el biomarcador correlaciona con la respuesta de la enfermedad a un tratamiento dado.

Como se usa en la presente descripción, el término "biomarcador directo" se refiere a una sustancia (por ejemplo, proteína, ARNm, alelo) dentro, o expresada por, una célula, en donde el biomarcador correlaciona con la respuesta de la enfermedad a un tratamiento dado, y en donde la presencia o nivel de esa sustancia se mide directamente en la célula para de ese modo predecir la respuesta de la enfermedad a un tratamiento dado.

Como se usa en la presente descripción, el término "biomarcador indirecto" se refiere a una sustancia (por ejemplo, proteína, ARNm, alelo) dentro, o expresada por, una célula, en donde el biomarcador correlaciona con la respuesta de la enfermedad a un tratamiento dado, y en donde la presencia o nivel de esa sustancia no se mide directamente en la célula, sino que se determina por medios indirectos, tal como por simulación usando un modelo computacional, para de ese modo, predecir la respuesta de la enfermedad a un tratamiento dado.

Un "anticuerpo," como se usa en la presente descripción es una proteína consistente de uno o más polipéptidos que comprende dominios de unión prácticamente codificados por los genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina, en donde la proteína se une inmunoespecíficamente a un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon y mu, así como genes de región variable de inmunoglobulina myriad. Las cadenas ligeras se clasifican como either kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o epsilon, las que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, respectivamente. Una unidad estructural de inmunoglobulina típica comprende un tetrámero que está compuesto de dos pares de cadenas de polipéptidos idénticas, cada par con una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). "VL" y VH" se refiere a esas cadenas ligera y pesada respectivamente.

Los anticuerpos incluyen las inmunoglobulinas intactas así como fragmentos de unión al antígeno de éstas, que se pueden producir por digestión con varias peptidasas, o sintetizadas de nuevo químicamente o usando la tecnología de ADN recombinante. Esos fragmentos incluyen, por ejemplo, dímeros F(ab)2 y monómeros Fab. Los anticuerpos preferidos incluyen anticuerpos de cadena simple (anticuerpos que existen como una cadena de polipéptido simple), con más preferencia anticuerpos Fv de cadena simple (scFv) en los cuales una cadena VH y una VL se unen (directamente o a través de un enlazador peptídico) para formar un polipéptido continuo. 5,132,405, y 4,956,778).

"Inmunoespecífico" o "inmunoespecíficamente" se refiere a los anticuerpos que se unen a través de los dominios prácticamente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina a uno o más epítopos de una proteína de interés, pero que sustancialmente no reconoce ni se une a otras moléculas en una muestra que contiene una población mezclada de moléculas antigénicas. Típicamente, un anticuerpo se une a un antígeno cognado con un K<| de al menos 50 nM, medido por un ensayo de resonancia de plasmón de superficie o un ensayo de unión celular. El uso de esos ensayos se conoce bien en la técnica, y se ejemplifica en el Ejemplo 13, en la presente.

Un "anticuerpo anti-ErbB3" es un anticuerpo aislado que se une inmunoespecíficamente al ectodominio de ErbB3. Esta unión al ErbB3 exhibe al menos Kd de 50 nM medido por un ensayo de resonancia de plasmón de superficie o un ensayo de unión celular. Los anticuerpos anti-ErbB3 que inhiben la fosforilación de ErbB3 mediada por el ligando tipo EGF son preferidos. Los ligandos tipo EGF incluyen EGF, TGFa, betacelulina, factor de crecimiento epidérmico de unión a la heparina, biregulina, epigen, epiregulina, y anfiregulina, los que típicamente se unen a ErbBl e inducen la heterodimerización de ErbBl con ErbB3.

El término "biespecífico" como se usa en la presente descripción se refiere a una proteína que comprende dos sitios de unión al antígeno, un primer sitio de unión con afinidad por un primer antígeno o epítopo y un segundo sitio de unión con afinidad de unión por un segundo antígeno o epítopo distinto del primero.

Como se usa en la presente descripción, el término "sujeto" o "paciente" incluye cualquier animal humano o no humano con una enfermedad o trastorno para el cual se puede predecir la respuesta al tratamiento con un agente terapéutico usando los métodos de la invención, tal como un sujeto o paciente con un tumor. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tal como los primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, etc.

Muchas modalidades de la presente invención comprenden uno o más sistemas de computadora, tales como computadoras para propósitos generales y propósitos especiales que incluyen varios programas de computadora, tales como dispositivos de entrada, dispositivos de salida, procesador(es), medios de almacenamiento y otros componentes de computadora correspondientes.

Muchas modalidades de la invención también incluyen medios de almacenamiento legibles por computadora con instrucciones ejecutables por la computadora o estructuras de datos almacenados allí (que incluyen las instrucciones y estructuras de datos definidos en la presente, tales como los modelos computacionales mecanicistas, los niveles de proteína y biomarcador medidos, algoritmos de clasificación, estados de la mutación, y así, sucesivamente) y que son específicamente configurados para implementar los procesos descritos y reivindicados en la presente. Tales medios de almacenamiento legibles por computadora pueden ser cualquier medio disponible al que se puede acceder por una computadora de propósito general o especial. A modo de ejemplo, y sin limitación, tales medios de almacenamiento legibles por computadora pueden comprender RAM, ROM, EEPROM, CD-ROM u otros dispositivos de almacenamiento en disco óptico, almacenamiento en disco magnético u otros dispositivos de almacenamiento magnético, o cualquier otro medio que se pueda usar para almacenar medios de código del programa, módulos, y software en forma de instrucciones ejecutables por la computadora o estructuras de datos y a los que se puede acceder por una computadora de propósito general o especial.

En algunos ejemplos, el medio de transmisión se puede usar también para portar las instrucciones ejecutables por la computadora, de manera que la presente invención también se extiende a aplicaciones, sistemas y otras modalidades que incorporan medios de transmisión que portan instrucciones ejecutables por la computadora que se ejecutan para realizar uno o más de los procesos descritos en la presente. Cuando la información se transfiere o es proporcionada en una red u otra conexión de comunicaciones (cableada, inalámbrica, o una combinación de cableada o inalámbrica) a una computadora, la computadora propiamente ve la conexión como un medio de transmisión legible por computadora.

Los términos "instrucciones ejecutables por la computadora", "instrucciones ejecutables", "módulos" y "módulos de cálculo", se usan algunas veces intercambiablemente en la presente para referirse al código de la computadora, estructuras de datos y software al que se accede y se ejecuta por uno o más procesadores de cálculo y componentes de procesamiento de uno o más sistemas de computación para implementar algunos procesos de la presente invención, como se describe en este documento y se expone en las reivindicaciones.

Los aspectos adicionales con respecto a lo anterior y varios aspectos adicionales de esta descripción se describen con más detalle en las siguientes subsecciones, las que no deben construirse como limitantes.

I. Modelos computacionales mecanicistas Los modelos computacionales mecanicistas pueden ser vistos como descripciones matemáticas predictivas de las interacciones moleculares en una red de proteína. En al menos ciertas modalidades, los métodos proporcionados en la presente para predecir las respuestas a los agentes terapéuticos incluyen el uso de un modelo computacional mecanicista. Los modelos computacionales mecanicistas traducen un diagrama o esbozo de la vía biológica (por ejemplo, un conjunto de interacciones de las proteínas que ocurren a lo largo de una vía de transducción de señal, tal como una vía relevante para cáncer) en un conjunto de ecuaciones matemáticas conducibles para la simulación posterior y análisis. Así, la primera etapa en construcción del modelo es la generación de un diagrama o esbozo detallado, representación de la vía biológica que incluye las proteínas relevantes y las moléculas involucradas en la vía. Se deben tomar decisiones críticas con respecto a cuáles proteínas y moléculas se van a incluir, así como las reacciones biológicas que las conectan. La información disponible en la literatura científica acerca de cuáles proteínas y moléculas están involucradas en la vía y cuáles reacciones biológicas las conectan se recogió y usó en la generación de la representación gráfica de la vía biológica.

Una vez que la representación gráfica de la vía biológica se genera, esta información se traduce en un sistema de ecuaciones que representan las interacciones proteína-proteína dentro de la vía, también referida como una red celular. Los modelos computacionales que representan la redes de reacción bioquímica de las redes de transducción de señales se basan en, por ejemplo, ecuaciones diferenciales ordinarias no lineales (ODE), modelos estocásticos, modelos booleanos o de lógica difusa o redes de petri. Estos se componen de ecuaciones diferenciales que requieren dos tipos de parámetros que deben medir o estimar experimentalmente: el número de especies iniciales (ca para la ima especie) y las constantes de velocidad (k¡ para la fa velocidad). Un diagrama esquemático de los procesos de construir un modelo computacional se muestra en las Figuras 4A-D, que ilustran un diagrama representativo de la vía de señalización ErbB (Figura 4A), la traducción de esta vía en conjuntos de reacción bioquímica y flujos (Figuras 4B y 4C) y la representación de las interacciones proteína-proteína por un conjunto de ecuaciones diferenciales (Figura 4D).

El modelo computacional, típicamente se construye como un conjunto de instrucciones ejecutables escritas en un lenguaje guión para computadora, por ejemplo usando la Simbiology de software MATLAB (The Math Works, Natick, MA), opcionalmente en conjunto con The Systems Biology Toolbox 2 para MATLAB (SBtoolbox2.org), o el software de modelado JACOBIAN (Numérica Technology, Cambridge, MA). Sin embargo, se apreciará que el alcance de la invención también se extiende al desarrollo y uso de modelos computacionales, construidos con software e interfaz diferentes de las construidas con el software e interfaz MATLAB o JACOBIAN . La invención también se extiende a las modalidades que utilizan modelos computacionales que se construyeron previamente por una fuente de terceras partes y cargados al sistema de computación implementando otros aspectos de la invención.

Antes de la calibración del modelo, los valores para todos los parámetros que sean posibles se especifican y se introducen al sistema de computación, basado en la información de la literatura científica, por ejemplo, niveles de proteína, afinidades de unión, constantes de velocidad de unión para los ligandos a sus receptores afines. Los valores de los parámetros que no están disponibles en la literatura científica se pueden obtener experimentalmente.

El modelo se "prepara" optimizando sus respuestas contra los datos obtenidos experimentalmente, o sea, la entrada en el sistema de computación que lleva a cabo la preparación. Mediante el ajuste del modelo a los datos experimentales, se selecciona el conjunto óptimo de los parámetros del modelo. El proceso de calibración del modelo incluye la modificación de las presunciones y parámetros estimados. Para calibrar el modelo, se debe primero identificar un subconjunto de proteínas y parámetros que son especialmente importantes biológicamente para traducir un estímulo del ligando en un evento de señalización corriente abajo. Este proceso se nombra análisis de sensibilidad, el cual, más precisamente, es una herramienta matemática que mide el cambio en una respuesta, tal como la fosforilación del sustrato, en respuesta a los cambios en las concentraciones de proteína y los parámetros cinéticos dentro de la vía. La sensibilidad completamente normalizada ( ¾(')) del imo observable c/( con respecto al cambio en la jma constante de velocidad ( ^j ) se da por la siguiente ecuación: La calibración del modelo se realiza entonces por un sistema de computación usando métodos de optimización locales y globales (tales como, pero sin limitarse a, algoritmos genéticos, hibridación simulada, optimización de Levenberg-Marquardt, y así sucesivamente) que minimizan la distancia entre los datos experimentales y los resultados de la simulación por la variación de los parámetros y las concentraciones de proteína inicial identificadas en el análisis de sensibilidad. El sistema de computación se puede configurar para variar automáticamente los parámetros durante la calibración o para variar los parámetros solamente en respuesta a la entrada del usuario adicionada incremental.

Un número de modelos computacionales para varias vías de señalización se describen en la literatura científica (ver por ejemplo, Kholodenko, B.N. y otros. (1999) J. Biol. Chem. 274:30169-30181; Schoeberl, B. y otros. (2002) Nat. Biotech. 20: 370-375; Hayakeyama, M. y otros. (2003) Biochem. J. 373:451-463; Nielsen, U.B. y Schoeberl, B. (2005) IDrugs 8:822-826; Schoeberl, B. y otros. (2006) Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 1:53-54; Schoeberl, B. y otros. (2006) IBM J. Res. Dev. 50:645; Fitzgerald, J.B. y otros. (2006) Nat. Chem. Biol. 2:458-466; Kholodenko, B.N. (2007) Nat. Cell. Biol. 9:324-330; Birtwistle, M.R. y otros. (2007) Molecular Systems Biology 3:144; Hinow, P. y otros. (2007) Theoretical Biology and Medical Modelling 4:14). Además, la construcción y uso de los modelos computacionales es revisado en Kholodenko, R.N. (2006) Nature Reviews: Mol Cell. Biol. 7:165-176 y Kumar, N. y otros. (2006) Drug Discovery Today 11 : 806-81 1.

Uno de los modelos computacionales usados en ciertos métodos proporcionados en la presente es un modelo de una vía de señalización ErbB. La construcción de un modelo computacional representativo de la vía de señalización ErbB se describe en detalle en el Ejemplo 4. Como se usa en la presente descripción, el término "vía de señalización ErbB" abarca las vías de transducción de señales que se inician a través de la interacción de un ligando con un receptor para la familia ErbB. Los componentes dentro de una vía de señalización ErbB pueden incluir: (i) uno o más ligandos, ejemplos de éstos incluyen HRG, betacelulina (BTC), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento epidérmico de unión a la heparina (HB-EGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGFa), anfiregulina (AR), epigen (EPG) y epiregulina (EPR); (ii) uno o más receptores, ejemplos de éstos incluyen ErbBl, ErbB2, ErbB3 y ErbB4; y (iii) quinasas intracelulares, fosfatasas y sustratos, ejemplos de éstos incluyen fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), fosfatidilinositol bisfosfato (PIP2), fosfatidilinositol trisfosfato (PIP3), fosfatasa y homólogo de tensina (PTEN), piruvato deshidrogenasa quinasa isozima 1 (PD 1), A T, RAS, RAF, MEK, la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK), proteína fosfatasa 2A (PP2A) y SRC proteína tirosina quinasa.

Otro modelo computacional usado en ciertos métodos proporcionados en la presente es un modelo de una vía de señalización IGF IR. Como se usa en la presente descripción, el término "vía de señalización IGF IR" abarca las vías de transducción de señales que se inician a través de la interacción de un ligando con un receptor de la familia del factor 1 de crecimiento insulínico. Los componentes dentro de un vía de señalización IGF IR pueden incluir: (i) uno o más ligandos, ejemplos de éstos incluyen el factor 1 de crecimiento insulínico (IGF1); (ii) uno o más receptores, ejemplos de éstos incluyen IGF1R y el receptor de insulina; (iii) uno o más proteínas de unión al IGF y (iv) quinasas intracelulares y sustratos, ejemplos de éstos incluyen sustrato del receptor insulínico 2 (IRS2), PI3K, AKT, proteína relacionada con Bd-2 BAD, RAS, RAF, MEK y proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK).

Aun otro modelo computacional usado en ciertos métodos proporcionados en la presente es un modelo de una vía de señalización c-Met. Como se usa en la presente descripción, el término "vía de señalización c-Met" abarca las vías de transducción de señales que se inician a través de la interacción de un ligando con un receptor c-Met de la proteína tirosina quinasa. Los componentes dentro de una vía de señalización c-Met pueden incluir: (i) uno o más ligandos, ejemplos de éstos incluyen factor de crecimiento de hepatocitos (HGF); (ii) uno o más receptores, ejemplos de éstos incluyen el receptor de la proteína tirosina quinasa c-Met; y (iii) quinasas intracelulares y sustratos, ejemplos de éstos incluyen PI3K, proteína 2 de unión al receptor del factor de crecimiento (GRB2), homólogos Src y proteína de colágeno (SHC), proteína tirosina quinasa SRC y proteína soporte GAB 1, así como RAS, RAF, MEK y proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK).

Aun otro modelo computacional usado en ciertos métodos proporcionados en la presente es un modelo que comprende cualquier combinación de dos o más vías de señalización del factor de crecimiento, tal como IGR1R y el receptor de señalización ErbB, receptor de señalización ErbB y señalización c-Met o IGF1-R, ErbB y señalización c-Met en combinación.

A pesar de la especificidad de los ejemplos anteriores, se apreciará que otros modelos computacionales (por ejemplo, para las vías de señalización tales como TNF, IL-2, PDGF, FGF, TRAIL, integrinas, citocinas y virtualmente cualquier otra vía) también se pueden incorporar en y utilizar por las modalidades de la presente invención.

En ciertas modalidades, la presencia de uno o más agentes terapéuticos se puede simular en el modelo computacional. Una representación computacional del(de los) agente(s) terapéutico(s) se puede construir usando ecuaciones de reacción masa-acción que describen la unión del (de los) agente(s) a su diana celular o de otra forma describe el efecto del (de los) agente(s) en la vía celular que se modela. Los parámetros para los eventos de unión, u otros efectos biológicos, se pueden obtener por mediciones experimentales directas, así como por la preparación del modelo para coincidir los datos para el efecto del agente terapéutico en la célula. Por ejemplo, para los agentes anticuerpo, la constante de asociación y constante de disociación para la unión del anticuerpo a su antígeno diana se puede determinar experimentalmente por métodos estándares (tales como BIACore o tecnología KinExA) y esos parámetros se pueden incorporar en el modelo computacional. Además, por ejemplo, para los agentes biespecíficos, un parámetro de entrecruzamiento, como una medida del número de moléculas biespecíficas unido a cada diana individual del biespecífico o a ambas dianas del biespecífíco, se puede usar como un parámetro de preparación para el modelo computacional. El parámetro de entrecruzamiento se puede obtener tomando la afinidad de unión general observada (determinada por análisis FACS estándares) y ajustándolo a la ecuación de unión lógica estándar. Adicionalmente a lo anterior, los parámetros adicionales que pueden ser farmacéuticamente relevantes para un agente terapéutico particular, y así ser representados en el modelo computacional, se conocen por aquellos con experiencia en la técnica.

Cuando el efecto de un agente terapéutico se representa en el modelo computacional, se puede modelar un solo agente o se pueden modelar múltiples agentes en combinación para estimular así el efecto de la terapia de combinación en las respuestas celulares. Por ejemplo, en una modalidad, dos anticuerpos que se unen cada uno a diferentes antígenos diana se pueden representar en el modelo computacional. En otra modalidad, un anticuerpo que se dirige a una vía particular de señalización (por ejemplo, una vía ErbB) y un inhibidor de molécula pequeña de esa misma vía de señalización (por ejemplo, una vía ErbB) se puede representar simultáneamente en el modelo computacional para evaluar el efecto de esa terapia de combinación de la vía de señalización en la célula.

II. Algoritmos de clasificación estadística En al menos ciertas modalidades, los métodos proporcionados en la presente para predecir respuestas a los agentes terapéuticos (por ejemplo, generar respuestas predichas a los agentes terapéuticos con una computadora) y los métodos para tratar pacientes que tienen tumores malignos involucran el uso de uno o más algoritmos de clasificación estadística.

Un objetivo de un modelo estadístico es discernir una relación entre, por ejemplo, los niveles de proteína medidos en muestras de tejidos, así como los niveles de activación (por ejemplo, el estado de activación de la red o "ÑAS") o los niveles de inhibición (por ejemplo, el estado de inhibición de la red o "NIS") calculados por el modelo bioquímico, por una parte, y la respuesta del paciente a un agente terapéutico por la otra. Así, un algoritmo de clasificación estadística define una relación estadística entre uno o más parámetros medibles, o entradas, (por ejemplo, los niveles de proteína medidos en una muestra de tejido, los valores ÑAS o NIS calculados) y un resultado particular, o salida, (por ejemplo, la respuesta a un agente terapéutico) de manera que se pueda hacer una clasificación, o predicción (por ejemplo, respondedor contra no respondedor a un agente terapéutico). En consecuencia, un modelo estadístico ayuda a identificar el umbral dividiendo los respondedores y no respondedores y también ayuda a definir la incertidumbre alrededor del umbral definido.

Varios tipos de sistemas clasificadores estadísticos se han descrito en la técnica y pueden ser adecuados para su uso en los métodos de la invención, ejemplos no limitativos de éstos incluyen el análisis del componente principal (PCA), regresión de mínimos cuadrados parcial (PLSR), PLSR trilineal, lógica difusa e inferencia bayesiana, random forest (RF), árboles de clasificación y regresión (C&RT), árbol de decisión, red neural (NN), máquina de soporte vectorial (SVM), modelo de detección de la interacción automática de Chi cuadrado general, árbol interactivo, spline multivariado de regresión de adaptación, clasificador de aprendizaje de máquina, y combinaciones de éstos. Ver, por ejemplo, la publicación PCT WO 2007/109571.

Para desarrollar un algoritmo de clasificación estadística, en una modalidad preferida, para usar los términos de la técnica: la "máquina" o "sistema de computación" (por ejemplo, computadora) "aprende" la relación entre el nivel de expresión de la proteína y el estado de activación de la red (ÑAS) con la respuesta real del paciente (por ejemplo, respondedor, no respondedor) examinando un número de ejemplos de "preparación" que se han introducido en la computadora por medio del "clasificador" (algoritmo estadístico). Este proceso es conocido como "aprendizaje supervisado", ya que existe una colección de muestras para las que la entrada (niveles de proteína, medidos y calculados) y la salida (por ejemplo, la respuesta a un agente terapéutico) se conocen a priori. Una parte integral de aplicar un algoritmo de clasificación estadística es la selección de características informativas (una característica es cualquier nivel de proteína o nivel de activación de la proteína medido o calculado), así como la determinación del umbral óptimo para la puntuación producida por el algoritmo.

Por lo general, es preferible validar un algoritmo de clasificación estadística en un "conjunto de prueba" separado de muestras, para el que se conoce la salida, pero no es descrita para el clasificador. Al comparar las predicciones con los resultados conocidos, se puede medir el rendimiento. Cuando el número de muestras es pequeño, esto pudiera no ser práctico, y existen técnicas establecidas para sortear este requerimiento. Principal entre ellas es la validación cruzada, discutida a continuación. La salida de un clasificador es una puntuación que se puede traducir en una predicción de clase, si se desea. En general, el proceso de preparación de un clasificador también incluye los métodos para determinar los umbrales óptimos.

Para probar la capacidad para hacer predicciones, el procedimiento general en la validación cruzada es dejar a un lado una parte de los datos (una fracción de las muestras) como 'datos de preparación' o el 'conjunto de datos de preparación'; los datos restantes se refieren como el 'conjunto (datos) de prueba'. Típicamente, este procedimiento se repite muchas veces, usando cada vez una fracción diferente de los datos para la preparación y prueba. Un conjunto preparación mayor es claramente beneficioso (mientras más ejemplos, mejor el clasificador), pero es por tanto un conjunto de prueba grande (mientras más predicciones usted pueda verificar, mayor será la confianza en las predicciones futuras). Cuando el tamaño de la muestra es pequeño, este procedimiento se puede enmendar de manera que una sola muestra se deja a un lado como datos de prueba, y el clasificador se prepara usando todas las muestras restantes. Se hace una predicción en la muestra simple excluida. Esto se llama 'validación cruzada dejando uno fuera' (LOOCV), y se encuentra bien establecido en la técnica. Este procedimiento se repite para cada muestra excluida a la vez. Una vez que todas las predicciones se han hecho, se evalúa el rendimiento.

En los algoritmos de clasificación estadística usados en los métodos de la invención, varios parámetros, o características informativas, o piezas de información, se pueden usar como el dato de entrada. Los ejemplos no limitativos de esos datos de entrada incluyen los niveles de proteína de uno o más componentes de una red celular obtenidos de una muestra de las células, un estado de activación de la red (ÑAS) o estado de inhibición de la red (NIS) calculados usando un modelo computacional, el estado de la mutación de una o más proteínas en la muestra de las células, la edad del sujeto para el cual la respuesta al tratamiento está siendo investigada y el género del sujeto para el cual la respuesta al tratamiento está siendo investigada.

III. Medición de los niveles de componentes celulares en una muestra de las células En los métodos proporcionados en la presente para generar la respuesta predicha al tratamiento con un agente terapéutico y para tratar un paciente que tiene un tumor maligno, un procedimiento típicamente involucra medir, en una muestra de las células, los niveles de uno o más componentes de una red celular o, alternativamente, introducir los niveles medidos de uno o más componentes de una red celular, que se obtuvieron de las mediciones tomadas de una muestra de las células, en un sistema de computación. Por ejemplo, una muestra de un tumor se puede obtener por métodos estándares de un paciente con el tumor y los niveles de uno o más componentes de una red celular se pueden medir en la muestra del tumor.

La entrada puede ser manual en el sistema de computación. La entrada puede ser una entrada automática o cargada al sistema de computación, en algunos ejemplos, como cuando los dispositivos de medición computarizados se conectan al sistema de computación que recibe y utiliza la entrada para implementar las características de la invención. Respecto a esto, será apreciado que cualquier información de la medición y cualquier información del estado (por ejemplo, información del estado de mutación), así como cualquier otro dato del tejido/paciente, descrito en este documento se puede obtener a través del uso de dispositivos de computación que obtienen automáticamente y cargan la información de la medición y del estado en uno o más sistemas de computación que usan los datos para realizar los procesos descritos de la invención.

Como se usa en la presente descripción, el término "nivel" de un componente se refiere a la cantidad o concentración del componente presente en una muestra. Los niveles de un componente se pueden medir usando cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas. El nivel típicamente se determina al medir los niveles de proteína, pero alternativamente el nivel se puede determinar en algunos casos al medir los niveles de ARNm, que puede ser seguido por la conversión de los niveles de ARNm para los niveles de proteína predichos. Los niveles de proteínas (por ejemplo, monómeros, homodímeros, o heterodímeros) se pueden medir usando una o más técnicas bien conocidas en la técnica, los ejemplos no limitativos de éstos incluyen la clasificación cuantitativa de células activadas por fluorescencia (qFACS), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, Luminex), inmunohistoquímica (IHC), inmunohistoquímica cuantitativa (qlHC), métodos basados en la proximidad (por ejemplo, método basado en la transferencia de energía por resonancia Foster, complementación de fluorescencia biomolecular (BiFC), VeraTag™ o química de ADN programado™ (DPC™)), espectrometría de masa, ensayo (inmunotransferencia) de Western y coinmunoprecipitación. Los niveles de proteína se pueden expresar como pg proteína detectada^g proteína total Los niveles de proteína o ARNm se pueden determinar en lisados celulares. Los Usados celulares se pueden preparar, por ejemplo, como se describe en detalle en el Ejemplo 2. Además, los ejemplos representativos del uso de ELISA para determinar los niveles de proteína se describen en detalle en el Ejemplos 2 y 4, un ejemplo representativo del uso de qFACS para determinar los niveles de proteína se describe en detalle en el Ejemplo 4 y un ejemplo representativo de la medición de los niveles de ARNm y la conversión a los niveles de proteína se describe en detalle en el Ejemplo 4 (para HRG-ß?).

La muestra de tumor puede ser, por ejemplo, una muestra fresca de las células, una muestra fresca congelada o una muestra de tejido fijada. Para las muestras de tejidos de pacientes, los bloques de tejido archivados pueden ser más fácilmente accesibles que las muestras frescas congeladas. Así, en una modalidad preferida, se usa una muestra de tejido embebida en parafina fijada en formalina (FFPE) y el nivel de los componentes (por ejemplo, ligandos, receptores) se puede determinar por inmunohistoquímica semi-cuantitativa (IHC) (descrito después en el Ejemplo 9). Para convertir la información de la IHC semi-cuantitativa en una concentración susceptible de introducir en un modelo computacional, un placa de control que contiene xenoinjertos o tapones de células con niveles de expresión receptor y/o ligando conocidos se pueden comparar con la muestra del paciente. Además, los factores de conversión se pueden determinar para convertir un nivel de expresión obtenido en unidades adimensionales (por ejemplo, cantidades de proteína o ARNm) en un nivel de concentración que se puede introducir en un modelo computacional, descrito con más detalles en el Ejemplo 4 para los niveles de expresión BTC y HRG.

Los niveles de proteína del ligando y ARNm ligando generalmente se correlacionan razonablemente bien. Por lo tanto, la qRT-PCR se puede usar para determinar los niveles de expresión de ARNm en Usados celulares a partir de líneas celulares tumorales y xenoinjertos así como a partir de FFPE.

IV. Métodos de predecir las respuestas a los agentes terapéuticos En ciertos aspectos, la presente invención proporciona métodos para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de una red celular. Tales métodos generalmente comprenden los elementos indicados a continuación en los métodos predictivos 1-5.

Método predictivo 1 (a) obtener mediciones de los niveles de uno o más componentes de la red celular, al medir el(los) nivel(es) presente(s) en una muestra de las células de uno o más componentes de la red celular; y (b) aplicar un método implementado por computadora que comprende: (i) calcular un estado de activación de la red (ÑAS) o un estado de inhibición de la red (NIS) para las células usando un modelo computacional de entrada en la red celular con las mediciones; y (ii) calcular y producir una respuesta predicha de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado al menos en parte en el ÑAS o el NIS calculado en (i). Método predictivo 2 (a) medir, en una muestra de las células, los niveles de uno o más componentes de la red celular; y (b) aplicar un método implementado por computadora que comprende: (i) calcular un estado de activación de la red (ÑAS) o un estado de inhibición de la red (NIS) para las células usando un modelo computacional de la red celular; (ii) aplicar un algoritmo de clasificación estadística; y (iii) predecir la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado al menos, en parte, en la salida del algoritmo de clasificación estadística.

Método predictivo 3 a) un sistema de computación que recibe, a través de un dispositivo de entrada, la entrada que identifica los niveles de uno o más componentes en una red celular medidos en una muestra de las células; b) el sistema de computación calcula un estado de activación de la red (ÑAS) o un estado de inhibición de la red (NIS) para las células usando un modelo computacional de la red celular; y c) el sistema de computación genera, y después de eso produce, en un dispositivo de salida, una respuesta predicha de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado al menos, en parte, en el ÑAS o NIS calculado en b).

Método predictivo 4 a) medir, en una muestra de las células, los niveles de uno o más componentes de la red celular; b) calcular un estado de activación de la red (ÑAS) o un estado de inhibición de la red (NIS) para las células usando un modelo computacional de la red celular; c) aplicar un algoritmo de clasificación estadística; y d) predecir la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado al menos, en parte, en la salida del algoritmo de clasificación estadística.

Método predictivo 5 a) un sistema de computación que recibe, a través de un dispositivo de entrada, la entrada que identifica los niveles de uno o más componentes en una red celular medidos en una muestra de las células; b) el sistema de computación calcula un estado de activación de la red (ÑAS) o un estado de inhibición de la red (NIS) para las células usando un modelo computacional de la red celular; c) el sistema de computación aplica un algoritmo de clasificación estadística; y d) el sistema de computación genera, y después de eso produce, en un dispositivo de salida, una respuesta predicha de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado en el resultado del algoritmo de clasificación estadística.

Los métodos anteriores pueden comprender, además, aunque no lo necesitan, tratar las células, o un paciente del cual se obtuvieron las células, con un agente terapéutico, en base a la respuesta predicha de las células al agente terapéutico.

En varios aspectos, los niveles del(de los) componente(s) detectados sirven para indicar una efectividad predicha de uno o más agentes terapéuticos específicos. En muchos casos, esto significa que si el(los) componente(s) se detecta(n) en un nivel (o a una relación de concentración particular en relación a los otros componentes especificados) que satisface un criterio de estar por encima (o en algunos casos por debajo) de un nivel o relación límite predeterminada, entonces se predice que un agente terapéutico dado es efectivo y se administra al paciente, y si el (los) componente(s) se detecta(n) a un nivel o relación de concentración que no satisface el criterio en relación con el nivel o relación límite predeterminada, entonces el agente terapéutico no se administra al paciente. Los niveles límites adecuados se pueden fijar usando prácticas de rutina y como se describe en la presente.

Para predecir la respuesta de las células, típicamente los valores ÑAS o NIS se calculan para una pluralidad de células respondedoras y células no respondedoras conocidas para el agente terapéutico y esos valores para las células respondedoras y células no respondedoras conocidos se usan para establecer los valores umbrales de ÑAS o NIS, que indican la respuesta o la no respuesta al agente terapéutico (descrito adicionalmente en los Ejemplos 7 y 10). Así, la respuesta predicha y/o generada de las células al tratamiento se puede obtener en c) comparando el ÑAS o NIS calculado en b) con los valores umbrales de ÑAS o NIS, que indican la respuesta o la no respuesta al agente terapéutico.

Para aplicar el algoritmo de clasificación estadística, una o más partes de la información se introducen en el algoritmo o el sistema de computación incorpora una o más partes de la información en el algoritmo. Por ejemplo, este procedimiento puede comprender introducir en el algoritmo una o más partes de la información seleccionada de (i) los niveles de uno o más componentes de la red celular (ii) los ÑAS o NIS calculados; (iii) el estado de la mutación de uno o más genes en la muestra de las células; (iv) la edad del sujeto a ser tratado con el agente terapéutico; (v) el género del sujeto a ser tratado con el agente terapéutico; (vi) la presencia o ausencia de receptor de estrógeno (ER) en las células; (vii) la presencia o ausencia de receptor de progesterona en las células; y (viii) la presencia o ausencia de receptor de andrógeno en las células. Adicionalmente o alternativamente, aplicar el algoritmo de clasificación estadística puede comprender el sistema de computación que calcula el algoritmo después de introducir una o más de las partes de la información que se exponen en (i)-(viii) anteriormente. Debido a que el algoritmo de clasificación estadística define una relación estadística entre la información de entrada y la respuesta de las células (por ejemplo, células tumorales) al tratamiento, la predicción de la respuesta de las células al tratamiento se puede basar entonces en el resultado del algoritmo de clasificación estadística .

Para los métodos predictivos y otros métodos proporcionados en la presente, una red celular preferida comprende una vía de señalización ErbB. En una modalidad, uno o más de los componentes medidos e introducidos en el sistema de computación en el método puede comprender uno o más ligandos involucrados en la vía de señalización ErbB. Los ejemplos no limitativos de tales ligandos incluyen HRG (que incluye HRG-ß?, HRG-p2, HRG-a, HRG-3 y HRG-4), BTC, EGF, HB-EGF, TGFa, AR, EPG y EPR. Adicionalmente o alternativamente, uno o más de los componentes medidos en el método puede comprender uno o más receptores involucrados en la vía de señalización ErbB. Los ejemplos no limitativos de tales receptores incluyen ErbBl, ErbB2, ErbB3 y ErbB4 (también conocidos en la técnica como HERI, HER2, HER3 y HER4, respectivamente). Tales receptores se pueden ensayar como entidades individuales (si existen en monómeros homodímeros o heterodímeros) y en ciertas modalidades cada homodímero y heterodímero se puede también medir como un componente distinto e introducir en el sistema de computación. Por ejemplo, los componentes medidos pueden ser 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 o más receptores, ligandos, o ambos, seleccionados de ErbBl, ErbB2, ErbB3, ErbB4, HRG, y BTC {por ejemplo, ErbBl y HRG; o ErbBl, ErbB2 y ErbB3). Por ejemplo, en algunos métodos, el ÑAS calculado simula el nivel de homodímero ErbB2/ErbB2 o heterodímero ErbB2/ErbB3 en ausencia del agente terapéutico. En otros métodos, el NIS calculado simula el nivel de heterodímero ErbB2/ErbB3 o heterodímero ErbBl /ErbB3 en presencia del agente terapéutico comparado con los niveles del heterodímero ErbB2/ErbB3 o heterodímero ErbBl/ErbB3 en ausencia del agente terapéutico.

En algunos de los métodos anteriores, el ÑAS calculado simula los niveles de una o más proteínas fosforiladas en la vía de señalización ErbB3. Por ejemplo, el ÑAS que se calcula puede simular los niveles pErbB3 en la muestra de las células. En modalidades alternativas, el ÑAS que se calcula puede simular el nivel de un heterodímero ErbBl /ErbB3 fosforilado o un heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado en la muestra de las células.

En una modalidad, el agente terapéutico comprende un anticuerpo anti-EGFR (anti-ErbBl), un ejemplo representativo de éste es el anticuerpo anti-ErbBl cetuximab (Erbitux®, ImClone Systems). Otros ejemplos de anticuerpos anti-ErbBl incluyen matuzumab, panitumumab; nimotuzumab y mAb 806 (Mishima, K. y otros, (2001) Cáncer Res. 6J_:5349-5354). En otra modalidad, tal agente terapéutico comprende un anticuerpo anti-ErbB2, un ejemplo representativo del cual es trastuzumab (Herceptin®, Genentech).

En otra modalidad, el agente terapéutico comprende un anticuerpo anti-ErbB3. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-ErbB3 comprende MM-121, el cual comúnmente se somete a los ensayos clínicos en Fase I. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-ErbB3 comprende Ab #6, descrito adicionalmente en WO 2008/100624 y con secuencias VH y VL de la sec. con núm. de ident.: 1 y 2, respectivamente. En otra modalidad, el anticuerpo anti-ErbB3 es un anticuerpo que comprende las secuencias CDR de VH y VL de Ab #6V de las sec. con núm. de ident.: 7-9 (CDR 1, 2, 3 de VH) y 10-12 (CDRl, 2, 3 de VL), respectivamente. Otros ejemplos de anticuerpos anti-ErbB3 incluyen Ab #3, Ab #14, Ab #17 y Ab #19, también descritos adicionalmente en WO 2008/100624 y con secuencias VH y VL de la sec. con núm. de ident.: 3 y 4, 5 y 6, 25 y 26, y 33 y 34, respectivamente. En otra modalidad, el anticuerpo anti-ErbB3 es un anticuerpo que comprende las secuencias CDR de VH y VL de Ab # 3 (sec. con núm. de iden : 13-15 y 16-18, respectivamente) o anticuerpo que comprende las secuencias CDR de VH y VL de Ab # 14 (sec. con núm. de ident.: 19-21 y 22-24, respectivamente) o un anticuerpo que comprende las secuencias CDR de VH y VL de Ab # 17 (sec. con núm. de ident.: 27-29 y 30-32, respectivamente) o un anticuerpo que comprende las secuencias CDR de VH y VL de Ab # 19 (sec. con núm. de ident.: 35-37 y 38-40, respectivamente).

Otros ejemplos de anticuerpos anti-ErbB3 incluyen los anticuerpos 1B4C3 y 2D1D12 (U3 Pharma AG), los cuales se describen en la publicación de los Estados Unidos núm. 2004/0197332, y los anticuerpos monoclonales (que incluyen versiones humanizadas de éstos), tal como 8B8, descrito en patente de los Estados Unidos 5,968,511.

En otra modalidad, el anticuerpo anti-ErbB3 es un anticuerpo biespecífico (por ejemplo, una proteína de fusión) que comprende un anticuerpo anti-ErbB3 unido a un segundo anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-ErbB2 ). Un ejemplo preferido de tal anticuerpo biespecífico es H3 x B1D2, cuya secuencia de aminoácidos se expone en la sec. con núm. de ident.: 41. En este anticuerpo biespecífico, un anticuerpo de cadena simple que se une a ErbB3, referido como H3 (con CDR de VH y VL como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 42-44 y 45-47, respectivamente) se une a un anticuerpo de cadena simple que se une a ErbB2, referido como B1D2 (con CDR en VH y VL como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 48-50 y 51-53, respectivamente). Los componentes del anticuerpo del anticuerpo biespecífico H3 x B1D2 se describen en las patentes de los Estados Unidos núms. 7,332,585 y 7,332,580, así como la solicitud PCT/US2006/023479 (publicada como WO 2007/084181) y la solicitud PCT/US2007/024287 (publicada como WO 2008/140493).

En aún otra modalidad, el agente terapéutico comprende dos o más anticuerpos anti-ErbB3, cada uno de los cuales se une a un epítopo diferente en ErbB3. Preferentemente, el agente terapéutico comprende tres anticuerpos anti-ErbB3, cada uno de los cuales se une a un epítopo diferente en ErbB3.

En otra modalidad, el agente terapéutico comprende un anticuerpo anti-ErbB4. En aún otra modalidad, el agente terapéutico comprende un inhibidor pan-ErbB o un inhibidor de dimerización HER. Un ejemplo de un inhibidor de dimerización HER es el anticuerpo pertuzumab (también conocido como el anticuerpo 2C4), que se describe adicionalmente en Agus, D.B. y otros, (2005) J. Clin. Oncol. 23:2534-2543.

En aún otra modalidad, el agente terapéutico comprende uno o más inhibidores de molécula pequeña de una vía de señalización ErbB, los ejemplos representativos de éstos incluyen gefitinib (Iressa®), que se encuentra comercialmente disponible de AstraZeneca y Teva, y lapatinib (Tykerb®), comercialmente disponible de GlaxoSmithKline. Otros ejemplos de inhibidores de molécula pequeña de la vía de señalización ErbB incluyen CI-1033 (PD 183805; Pfizer), erlotinib HCL (OSI-774; Tarceva®; OSI Pharma); PKI-166 (Novartis); PD-158780; EKB-569; y Tyrphostin AG 1478 (4-(3-Cloroanilino)-6,7-dimetoxiquinazolina).

En otra modalidad, la red celular comprende una vía de señalización c-Met (factor de transición epitelio mesenquimal). En una modalidad, uno o más de los componentes medidos y/o introducidos en a) pueden comprender uno o más ligandos involucrados en la vía de señalización c-Met. Un ejemplo no limitativo de tal ligando es el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). Adicionalmente o alternativamente, uno o más de los componentes medidos en a) pueden comprender uno o más receptores involucrados en la vía de señalización c-Met. Un ejemplo no limitativo de tal receptor es el receptor de la proteína tirosina quinasa c-Met.

En vista de lo anterior, los métodos predictivos proporcionados en la presente permiten la predicción de respuestas celulares, por ejemplo, predicción generada por computadora de respuestas del tumor, a los agentes terapéuticos que dirigen los componentes dentro de la vía de señalización c-Met. El agente terapéutico puede comprender, por ejemplo, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) que se une a c-Met. Los ejemplos de tales anticuerpos anti-cMet incluyen AV299 (AVEO); AMG102 (Amgen) y 5D5 (OA-5D5; Genentech). Un agente terapéutico preferido que dirige la vía de señalización c-Met comprende un anticuerpo biespecífico monoclonal que comprende un anticuerpo anti-ErbBl unido a un anticuerpo anti-cMet. Los ejemplos de tales anticuerpos biespecíficos se describen en las publicaciones PCT WO 2005/117973 y WO 2006/091209. En otra modalidad, el agente terapéutico es un inhibidor de molécula pequeña de la señalización de c-Met, los ejemplos de éstos incluyen ARQ 197 (ArQule) y PHA665752 (Christensen, J.G. y otros. (2003) Cáncer Res. 63:7345-7355).

En otra modalidad, la red celular comprende una vía de señalización del receptor del factor 1 de crecimiento insulínico (IGF IR). En una modalidad, uno o más de los componentes medidos en a) pueden comprender uno o más ligandos involucrados en la vía de señalización IGF IR. Un ejemplo no limitativo de tal ligando es el factor 1 de crecimiento insulínico (IGF1). Adicionalmente o alternativamente, uno o más de los componentes medidos en a) pueden comprender uno o más receptores involucrados en la vía de señalización IGF IR. Un ejemplo no limitativo de tal receptor es el receptor IGF IR.

En vista de lo anterior, los métodos predictivos proporcionados en la presente permiten la predicción de respuestas celulares, por ejemplo, la predicción generada por computadora de respuestas del tumor, a los agentes terapéuticos que dirigen los componentes dentro de la vía de señalización IGF IR. En una modalidad preferida, el agente terapéutico es un anticuerpo que se une a IGF IR, ejemplos de éstos incluyen mAb391 (Hailey, J. y otros. (2002) Mol. Cáncer. Ther. 1:1349-1353); IMC-A12 (Imclone Systems, Inc.), 19D12 (Schering Plough), H7C10 (Goetsch, L. y otros, (2005) Int. J. Cáncer 113:316-328), CP751,871 (Pfizer), SCV/FC (ImmunoGen, Inc.) y EM/164 (ImmunoGen, Inc.). En una modalidad preferida, el agente terapéutico es un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo anti-IGFIR unido a un anticuerpo anti-ErbB3. Tales anticuerpos biespecíficos se describen en las publicaciones PCT WO 2005/117973 y WO 2006/091209. En otra modalidad, el agente terapéutico es un inhibidor de molécula pequeña de IGF IR (por ejemplo, inhibidor de tirosina quinasa), ejemplos de éstos incluyen NVP-AEW541 (Novartis); NVP-ADW742 (Novartis); NVP-TAE226 (Novartis); BMS-536, 924 (Bristol-Myers Squibb); BMS-554, 417 (Bristol-Myers Squibb); ciclolignanos tales como picropodofilina (PPP) (Menú, E. y otros. (2006) Blood 107:655-660); y PQ401 (Gable, .L. y otros. (2006) Mol. Cáncer Ther. 5:1079-1086).

En aun otra modalidad, el agente terapéutico comprende una combinación de agentes terapéuticos, en donde la combinación incluye, al menos, un agente que dirige un componente dentro de la vía de señalización ErbB, tal como una combinación de agentes que incluye al menos uno de los agentes de la vía ErbB descritos anteriormente. Por ejemplo, un agente de combinación puede comprender dos o más agentes que dirigen los componentes dentro de la vía de señalización ErbB. Alternativamente, un agente de combinación puede comprender al menos un agente que dirige un componente dentro de la vía de señalización ErbB y al menos un agente que dirige un componente dentro de otra vía de señalización, tal como una vía de señalización c-Met o IGF IR.

En varias otras modalidades, la red celular comprende una combinación de dos o más vías de señalización, tal como una vía de señalización ErbB en combinación con una vía de señalización c-Met o una vía de señalización ErbB en combinación con una vía de señalización IGF IR.

En otra modalidad de los métodos predictivos proporcionados en la presente, tales métodos pueden comprender además un procedimiento para determinar, en la muestra de las células, el estado de la mutación de uno o más genes en las células. Preferentemente, se determina el estado de la mutación de al menos un gen seleccionado de KRAS (homólogo del oncogén viral Kirsten del sarcoma de rata), PI3K y PTEN. Adicionalmente o alternativamente, el método puede comprender un sistema de computación que recibe, a través de un dispositivo de entrada, la entrada que identifica el estado de la mutación de uno o más genes en las células, tal como el estado de la mutación de al menos un gen seleccionado de KRAS, PI3K y PTEN.

En otra modalidad de los métodos predictivos, la red celular comprende una vía de señalización ErbB y a) comprende medir y/o introducir niveles medidos de BTC y AR y el método comprende además determinar el estado de la mutación, o introducir el estado de la mutación, del gen KRAS. En otra modalidad, la red celular comprende una vía de señalización ErbB y a) comprende medir y/o introducir niveles medidos de ErbBl, ErbB2, ErbB3, HRG, BTC, AR, HB-EGF, EGF, TGFa, EPG y EPR, y el método comprende además determinar el estado de la mutación, o introducir el estado de la mutación, del gen KRAS. Preferentemente para estas modalidades, el ÑAS calculado en b) simula los niveles de una o más proteínas fosforiladas en la vía de señalización ErbB. En otra modalidad preferida, el ÑAS calculado en b) simula los niveles de heterodímero ErbBl/ErbB3 fosfonlado en la muestra de un tumor del paciente. En aun otra modalidad preferida, el ÑAS calculado en b) simula los niveles de heterodímero ErbB2/ErbB3 fosfonlado en la muestra de un tumor del paciente.

Dentro de ciertos métodos descritos anteriormente, los valores ÑAS o NIS calculados para cada una de una pluralidad de células respondedoras y células no respondedoras conocidos al agente terapéutico se usan para establecer los valores umbrales de ÑAS o NIS, que indican la respuesta o la no respuesta al agente terapéutico. En otros métodos, la respuesta de las células al tratamiento es predicha al comparar el ÑAS o NIS calculados en (b) con los valores umbrales de ÑAS o NIS, que indican la respuesta o la no respuesta al agente terapéutico.

V. Biomarcadores v métodos para predecir respuestas a los inhibidores de la vía ErbB En otro aspecto, la invención proporciona biomarcadores directos que predicen la respuesta de las células (por ejemplo, las células tumorales) al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente de una red celular (por ejemplo, la vía de señalización ErbB). Tales biomarcadores se pueden identificar usando los modelos computacionales proporcionados en la presente. Los métodos para identificar tales biomarcadores generalmente comprenden: (a) medir, en una muestra de las células, niveles de uno o más componentes de la red celular; y (b) aplicar un método implementado por computadora que comprende: (i) calcular los niveles de uno o más componentes adicionales de la red celular usando un modelo computacional de la red celular; y (ii) identificar un componente de la red celular cuyo nivel calculado predice la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico para identificar, de ese modo, el componente como un biomarcador para predecir la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico.

Ciertos métodos para identificar un biomarcador para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de una red celular comprenden: a) un sistema de computación que recibe, a través de un dispositivo de entrada, una entrada que identifica los niveles medidos de uno o más componentes de una red celular medidos en una muestra de las células; b) el sistema de computación calcula los niveles de uno o más componentes adicionales de la red celular usando un modelo computacional de la red celular; y c) el sistema de computación identifica un componente de la red celular cuyo nivel calculado predice la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico, e identifica, de ese modo, el componente como un biomarcador para predecir una respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico.

Por ejemplo, como se ilustra en el Ejemplo 10, un modelo computacional se puede usar para calcular los niveles de uno o más componentes de una red celular (por ejemplo, la vía de señalización ErbB) para obtener uno o más valores ÑAS (como una medida de la activación de la red celular) y se puede determinar la correlación de ÑAS con la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico. Esos componentes de la red celular para los que el nivel calculado separa las muestras en respondedores y no respondedores se pueden usar también como biomarcadores directos para predecir la respuesta al tratamiento, en particular cuando aquellos componentes son fácilmente medibles por medios directos. Esto es, la aproximación del modelo computacional/NAS descrita en la presente se puede usar para identificar el(los) componente(s) (calculados) que predicen la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico y después una vez que el (los) componente(s) haya(n) sido identificado(s), estos se pueden medir directamente como biomarcadores directos para predecir la respuesta. Por ejemplo, el modelo computacional descrito en la presente se usó para calcular los niveles de homo- y heterodímeros de la vía de señalización ErbB y después esos dímeros que dividen las muestras en respondedores y no respondedores se pueden medir directamente como biomarcadores directos para predecir la respuesta al tratamiento del tumor.

Más aun, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 8, se demostró ahora que la medición combinada del nivel de (i) HRG y (ii) al menos un receptor de la familia ErbB (por ejemplo, ErbBl, ErbB2 and ErbB3) en una muestra de tumor eficazmente estratifica los tumores en respondedores y no respondedores con respecto a la respuesta al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente de una vía de señalización ErbB, tal como un anticuerpo anti-ErbB3 (por ejemplo, Ab #6). Además, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 10, los niveles del heterodímero ErbBl/ErbB3 o los niveles del heterodímero ErbBl/ErB3 fosforilado pueden servir como marcadores directos para la respuesta al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente de una vía de señalización ErbB, tal como un anticuerpo anti-ErbB3 (por ejemplo, Ab #6). Además, como se describe adicionalmente en el Ejemplo 12, los niveles del monómero ErbB2, homodímero ErbB2/ErbB2 y heterodímero ErbB2/ErbB3 estratifican eficazmente los tumores en respondedores y no respondedores con respecto a la respuesta al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente de una vía de señalización ErbB, tal como un anticuerpo biespecífico anti-ErbB3 x anti-ErbB2 {por ejemplo, H3 x B1D2).

Como se denotó anteriormente, la presente invención proporciona métodos para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente de una vía de señalización ErbB. Algunos de estos métodos comprenden: (a) medir, en una muestra de las células, los niveles de (i) HRG y (ii) al menos un receptor seleccionado de ErbBl, ErbB2 y ErbB3; y (b) predecir, usando una computadora, la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado en los niveles medidos en (a), en donde niveles elevados de HRG y el al menos un receptor, en relación a un control, predicen la respuesta al tratamiento con el agente terapéutico.

En ciertas situaciones se miden los niveles de HRG y ErbBl. En otros casos se miden los niveles de HRG y ErbB2, o se miden los niveles de HRG y ErbB3. En otras situaciones se miden los niveles de HRG y al menos dos receptores seleccionados de ErbBl, ErbB2 y ErbB3, o se miden los niveles de HRG, ErbBl, ErbB2 y ErbB3. En ciertas situaciones, la predicción se puede realizar por computadora, usando un método que comprende: (i) un sistema de computación que recibe, a través de un dispositivo de entrada, una entrada que identifica los niveles medidos de (i) HRG y (ii) al menos un receptor seleccionado de ErbBl, ErbB2 y ErbB3, cuyos niveles se midieron en una muestra de las células; y (ii) el sistema de computación genera, y después de eso produce en un dispositivo de salida, una respuesta predicha de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado en los niveles medidos, en donde los niveles elevados de HRG y el al menos un receptor, en relación a un control, predicen la respuesta al tratamiento con el agente terapéutico.

Los agentes terapéuticos preferidos para los que la respuesta es predicha incluyen los anticuerpos anti-ErbB3, más preferentemente Ab #6 (con secuencias VH y VL como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 1 y 2, respectivamente) o un anticuerpo anti-ErbB3 que comprende las secuencias CDR de VH y VL de Ab #6, que se muestran en las sec. con núm. de ident.: 7-9 (CDR1, 2, 3 de VH ) y 10-12 (CDR1, 2, 3 de VL), respectivamente.

Otros métodos para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente de una vía de señalización ErbB comprenden: (a) medir, en una muestra de las células, los niveles de uno o más de heterodímero ErbBl/ErbB3, monómeros ErbB2, homodímero ErbB2, heterodímero ErbB2/ErbB3, heterodímero ErbBl/ErbB3 fosforilado y heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado; y (b) predecir, usando una computadora, la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado en los niveles medidos en (a), en donde una diferencia en el nivel de heterodímero ErbBl/ErbB3, monómeros ErbB2, homodímero ErbB2/ErbB2, heterodímero ErbB2/ErbB3, heterodímero ErbBl/ErbB3 fosforilado o heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado, en relación a un control, predicen la respuesta al tratamiento con el agente terapéutico.

La predicción se puede realizar por computadora, usando un método que comprende: (i) un sistema de computación que recibe, a través de un dispositivo de entrada, una entrada que identifica los niveles medidos de uno o más de heterodímero ErbBl/ErbB3, monómero ErbB2, homodímero ErbB2/ErbB2, heterodímero ErbB2/ErbB3, heterodímero ErbBl/ErbB3 fosforilado y heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado, cuyos niveles se midieron en una muestra de las células; y (ii) el sistema de computación genera, y después de eso produce en un dispositivo de salida, una respuesta predicha de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado en los niveles medidos, en donde una diferencia en el nivel de heterodímero ErbBl/ErbB3, monómero ErbB2, homodímero ErbB2/ErbB2, heterodímero ErbB2/ErbB3, heterodímero ErbBl/ErbB3 fosforilado o heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado, en relación a un control, predicen la respuesta al tratamiento con el agente terapéutico.

Dentro de ciertas modalidades de los métodos anteriores, los niveles medidos se introducen en un algoritmo de clasificación estadística y la respuesta de las células al tratamiento se predice en base al resultado del algoritmo. Además, en estos métodos, un estado de activación de la red (ÑAS) o un estado de inhibición de la red (NIS) se calculada en base a los niveles medidos usando un modelo computacional de una red celular ErbB; preferentemente, la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico se predice en base al valor de ÑAS o NIS calculado.

Dentro de ciertas modalidades, los niveles medidos son niveles del monómero ErbB2, homodímero ErbB2:ErbB2 y/o heterodímero ErbB2:ErbB3 y el agente terapéutico es un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo anti-ErbB3 unido a un anticuerpo anti-ErbB2, como se describió anteriormente.

Las células preferidas para su uso en los métodos anteriores son células tumorales, incluyendo aquellas mencionadas anteriormente. Las muestras incluyen tejido tumoral, aspirado con aguja fina, aspirado del pezón, sangre completa, suero, plasma, linfa, saliva y orina o células tumorales liberadas o circulantes aisladas de ahí.

Será aparente que, como se denotó anteriormente, los niveles medidos son niveles de proteína (por ejemplo, monómeros, homodímeros oheterodímeros) o niveles de ARNm, y generalmente se pueden determinar como se describió anteriormente.

Cualquiera de los métodos anteriores puede comprender además, pero no lo necesita, seleccionar un régimen de tratamiento (por ejemplo, para el agente terapéutico) basado en la respuesta predicha de las células al tratamiento; y/o puede comprender, además, preparar el agente terapéutico para su uso en base a la respuesta predicha.

En una modalidad preferida, la diferencia en el nivel, en relación con un control, es un nivel elevado. Los métodos anteriores pueden comprender además, tratar las células, o un paciente de quien se obtienen las células, con un agente terapéutico, basado en la respuesta predicha de las células al agente terapéutico.

Para las modalidades en las cuales los niveles del heterodímero ErbBl/ErbB3 y/o heterodímero ErbBl/ErbB3 fosforilado se miden, preferentemente el agente terapéutico para el que se predice la respuesta es un anticuerpo anti-ErbB3, más preferentemente Ab #6 (con secuencias VH y VL como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 1 y 2, respectivamente) o un anticuerpo anti-ErbB3 que comprende las secuencias CDR de VH y VL de Ab #6, las que se exponen en las sec. con núm. de ident.: 7-9 (CDR1, 2, 3 de VH) y 10-12 (CDR1, 2, 3 de VL ), respectivamente: Para las modalidades en las que se miden los niveles del monómero ErbB2, homodímero ErbB2/ErbB2 y/o heterodímero ErbB2/ErbB3, preferentemente el agente terapéutico para el que se predice la respuesta es un anticuerpo biespecífico anti-ErbB3 x anti-ErbB2, más preferentemente el anticuerpo biespecífico H3 x B1D2 (que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la sec. con núm. de ident.: 41) o un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo anti-ErbB3 que comprende las CDR de H3 (sec. con núm. de ident.: 42-44 y 45-47) unidas al anticuerpo anti-ErbB2 que comprende las CDR de B1D2 (sec. con núm. de ident.: 48-50 y 51-53).

Los niveles del homo- o heterodímero receptor o del homo- o heterodímero receptor fosforilado se pueden medir en la muestra de las células usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, tales homo- o heterodímeros se pueden medir usando métodos de detección por dimerización tales como los descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 7,105,308, patente de los Estados Unidos núm. 7,255,999, publicación de los Estados Unidos núm. 20040229380 y la publicación de los Estados Unidos núm. 20080187948. Estos métodos emplean pares de sondas (por ejemplo, anticuerpos), una sonda marcada y una sonda de clivaje, en donde cada sonda se une específicamente a un componente del dímero. La unión de las dos sondas al dímero resulta en el clivaje y la liberación de la etiqueta molecular del complejo del dímero, proporcionando una medida de la formación del complejo del dímero. Esos ensayos se refieren también en la presente como métodos basados en la proximidad, un ejemplo comercialmente disponible de estos es el sistema VeraTag™ (Monogram Biosciences). Alternativamente, otros métodos conocidos en la técnica para cuantificar los niveles de dímero se pueden usar, que incluyen pero sin limitarse a, la coinmunoprecipitación de los componentes dentro del dímero y el uso de otros métodos basados en la proximidad tales como el método basado en la transferencia de energía por resonancia Foster y la complementación de fluorescencia biomolecular (BiFC) (descritos en, por ejemplo, Tao, R.H. y Maruyama, I.N. (2008) J. Cell Sci. 121 :3207-32171.

En una modalidad de los métodos de biomarcador directo anteriores, los niveles medidos en a) son la introducción en un algoritmo de clasificación estadística almacenado en un sistema de computación y la respuesta de las células al tratamiento se predice en base al resultado del algoritmo basado en los cálculos y la transformación de los datos en el sistema de computación con el uso del algoritmo y los niveles medidos. En otra modalidad, un estado de activación de la red (ÑAS) o estado de inhibición de la red (NIS) se calcula en base a los niveles medidos en a) usando un modelo computacional de una red celular ErbB. La respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico se puede predecir basado al menos, en parte, en el valor de ÑAS o NIS calculado.

En varias modalidades, el agente terapéutico comprende cualquier combinación de uno o más de un anticuerpo anti-ErbB3, un anticuerpo anti-ErbBl, un anticuerpo anti-ErbB2, un anticuerpo anti-ErbB4, un inhibidor pan-ErbB, un inhibidor de dimerización HER, y un inhibidor de molécula pequeña de una vía de señalización ErbB, cada uno de los cuales se describió y ejemplificó anteriormente.

VI. Uso de los métodos en el tratamiento Los métodos de la invención se pueden usar para predecir la eficacia del tratamiento para una amplia variedad de trastornos en los que están disponibles agentes terapéuticos que dirigen uno o más componentes de una red celular involucrados en el trastorno. Aun adicionalmente, los métodos de la invención se pueden usar en la selección de un régimen de tratamiento para un sujeto que padece del trastorno, en donde los métodos pueden comprender, además, tratar al sujeto de acuerdo con el régimen de tratamiento seleccionado, que puede comprender administrar uno o más agentes terapéuticos al sujeto. Los ejemplos no limitativos de trastornos incluyen cáncer, trastornos autoinmunes y trastornos inflamatorios.

Los métodos de la invención son particularmente útiles para predecir, por ejemplo, usando la computadora, la respuesta de un tumor al tratamiento con un agente terapéutico, es decir, predecir la respuesta de un paciente que porta el tumor al tratamiento con un agente terapéutico. Los métodos predictivos se pueden usar con cualquier tumor que sea dependiente de la vía de señalización que se modela en el método. Por ejemplo, en una modalidad, el método se usa con tumores que son dependientes de la vía de señalización ErbB (por ejemplo, la vía de señalización ErbB3). En otras modalidades, el método se puede usar con tumores que son dependientes de las vías de señalización c-Met o IGF IR. En una modalidad preferida, el tumor es un tumor de cáncer de colon. En otra modalidad preferida, el tumor es un tumor de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En otra modalidad, el tumor es un tumor sólido. En otra modalidad, el tumor es un tumor no sólido, tal como un sarcoma de células claras. En otras modalidades, el tumor puede ser, por ejemplo, un tumor de un tejido seleccionado de pulmón, colon, recto, vesícula biliar, cerebro, médula espinal, mamas, riñon, páncreas, estómago, hígado, huesos, piel, bazo, ovarios, testículos, próstata, cabeza y cuello, tiroides y músculos. En aun otras modalidades, el tumor es un tumor gástrico, un tumor de estómago o un tumor oral/faríngeo.

Para conducir el método predictivo, se obtiene una muestra de células, por ejemplo, células del tumor, del paciente. Por ejemplo, una muestra preferida del tumor es una muestra de tejido tumoral. Una muestra de tejido tumoral se puede obtener por métodos estándares, tales como biopsia del tumor o resección quirúrgica del tumor. Una muestra de tejido tumoral congelada, fresca se puede usar o, alternativamente, una muestra de tejido embebida en parafina fijada con formalina (FFPE) es adecuada para usar también. Otros tipos de muestras del tumor también pueden ser susceptibles de usar en los métodos, donde la muestra contiene células del tumor y/o componentes celulares secretados por el tumor. Los ejemplos no limitativos de otros tipos de muestras del tumor incluyen aspirado con aguja fina, aspirado del pezón, sangre completa, suero, plasma, linfa, saliva y orina, o células tumorales liberadas o circulantes aisladas de ahí.

En una modalidad preferida, la invención proporciona un método para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con un agente terapéutico, en donde el método puede ser fácilmente y rápidamente llevado a cabo por un laboratorio de diagnóstico para proporcionar información rápida de la probabilidad de que un tumor del paciente responda a un tratamiento terapéutico particular. En este método predictivo, una muestra de tumor, tal como una muestra fresca, congelada o una muestra de tejido archivada FFPE se obtiene del paciente y los niveles de receptor/ligando del tumor se miden a través de inmunohistoquímica semi-cuantitativa (IHC). El (los) receptor(es) y ligando(s) escogidos para ser medidos se basan en la red celular a la que se dirige el agente terapéutico (por ejemplo, para la vía ErbB, los siguientes ligandos/receptores se pueden medir: HRG, BTC, ErbBl, ErbB2 y ErbB3). Las mediciones IHC semi-cuantitativas se convierten entonces en concentraciones usando una placa de control, que contiene xenoinjertos o tapones celulares con niveles de expresión del receptor y ligando conocidos para comparar con la muestra del paciente. En algunas situaciones, el estado de las mutaciones de uno o más genes de interés (por ejemplo, PI3K, PTEN) se pueden determinar en la muestra usando métodos de genotipado estándares. A continuación, el conjunto de datos (concentraciones de ligando y receptor, estado de mutación de los genes si se determina) se introduce en un modelo computacional de la red celular de interés y se calcula un estado de activación de la red (ÑAS). La predicción de la respuesta al agente terapéutico se puede hacer entonces en base a la comparación del valor de ÑAS calculado con los valores umbrales de ÑAS para respondedores y no respondedores. El uso de una aplicación con base en la web para introducir los datos de la concentración de proteína y mutación en el modelo computacional, seguido por la entrada de ÑAS y la respuesta predicha, permite al laboratorio de diagnóstico obtener casi instantáneamente conocimiento de la probabilidad de que el tumor responda al tratamiento con el agente terapéutico.

Para cualquiera de los métodos predictivos de la invención descritos en la presente, después que se ha predicho la respuesta de las células (por ejemplo, las células tumorales) al tratamiento con un agente terapéutico usando el método, el método pueden comprender además seleccionar un régimen de tratamiento para el sujeto basado en la respuesta predicha de las células (por ejemplo, las células tumorales) al tratamiento. Por ejemplo, los métodos pueden comprender, además, el sistema de computación que exhibe y manualmente o automáticamente recomienda y/o selecciona un régimen de tratamiento para el sujeto basado en la(s) respuesta(s) de las células al tratamiento predicha(s) por la computadora. Más aun, una vez que se recomienda o selecciona el régimen de tratamiento en base a la respuesta predicha de las células, los métodos de la invención pueden comprender, además, el tratamiento del sujeto de acuerdo con el régimen de tratamiento recomendado o seleccionado, el cual puede comprender administrar uno o más agentes terapéuticos al sujeto.

También se proporcionan en la presente, kits para predecir la respuesta de las células (por ejemplo, las células tumorales) al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de una red celular. Un kit de este tipo comprende: a) un ensayo o ensayos para detectar niveles de uno o más componentes de la red celular; b) instrucciones para calcular un estado de activación de la red (ÑAS) o estado de inhibición de la red (NIS) para las células usando un modelo computacional de la red celular; y c) instrucciones para el uso del kit para predecir la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico. En una modalidad adicional, el kit puede comprender, además, instrucciones para aplicar un algoritmo de clasificación estadística para calcular el ÑAS o NIS.

La red celular puede ser, por ejemplo, una vía de señalización ErbB, una vía de señalización c-Met o una vía de señalización IGF IR. El agente terapéutico puede ser, por ejemplo, cualquiera de los agentes terapéuticos descritos anteriormente que dirigen los componentes dentro de estas vías.

En una modalidad, los medios para detectar los niveles de uno o más componentes de la red celular es uno o más reactivos que permita la detección de los niveles de proteína del(de los) componente(s), tal como uno o más reactivos anticuerpos. En otra modalidad, los medios para detectar los niveles de uno o más componentes de la red celular es uno o más reactivos que permita la detección de los niveles de ARNm del(de los) componente(s), tal como uno o más reactivos de ácido nucleico por ejemplo, sondas de ácido nucleico, cebadores PCR y similares). Tales reactivos para la detección de proteína o niveles de ARNm de los componentes celulares son bien conocidos por las personas con experiencia en la técnica. Esos medios para detectar niveles también pueden incluir dispositivos de cálculo configurados para medir los niveles de proteína.

Los ensayos adecuados para la detección de los niveles de proteína de los componentes celulares incluyen los descritos en la presente, tales como la clasificación cuantitativa de células activadas por fluorescencia (qFACS), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, Luminex), inmunohistoquímica (IHC), inmunohistoquímica cuantitativa (qlHC), espectrometría de masa y ensayo (inmunotransferencia) de Western. Los ensayos adecuados para la detección de los niveles de ARNm de los componentes celulares incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y análisis de la membrana de Northern. Los medios para detectar niveles de uno o más componentes de la red celular también pueden incluir, por ejemplo, tampones u otros reactivos para usar en un ensayo para evaluar los niveles del (de los) componente(s). El kit puede incluir instrucciones, {por ejemplo, instrucciones impresas, tales como una etiqueta o accesorio del empaque) para llevar a cabo el(los) ensayo(s) para detectar los niveles de uno o más componentes de la red celular.

En una modalidad preferida, la red celular es una vía de señalización ErbB, y el kit incluye medios para detectar los niveles de uno o más componentes (por ejemplo, uno o más de los receptores, receptores homodímeros, receptores heterodímeros y receptores ligandos) de una vía de señalización ErbB seleccionados de ErbBl, ErbB2, ErbB3, ErbB4, HRG (que incluyen HRG-ß 1 ), BTC, EGF, HB-EGF, TGFa, AR, EPG y EPR. Más preferentemente, el kit incluye medios para detectar los niveles de al menos un receptor de la vía de señalización ErbB (por ejemplo, ErbBl, ErbB2, ErbB3, ErbB4) y al menos un ligando de la vía de señalización ErbB (por ejemplo, HRG, BTC, EGF, HB-EGF, TGFa, AR, EPG y EPR). Por ejemplo, en una modalidad, el kit incluye medios para detectar niveles de ErbBl, ErbB2, ErbB3, HRG y BTC. En otra modalidad, el kit incluye medios para detectar los niveles de ErbBl y HRG. En aun otra modalidad, el kit incluye medios para detectar ErbBl, ErbB2 y ErbB3. En aun otras modalidades, el kit incluye medios para detectar los monómero ErbB2, homodímero ErbB2, heterodímero ErbB2/ErbB3 o heterodímero ErbBl/ErbB3.

Los medios para calcular un estado de activación de la red (ÑAS) o un estado de inhibición de la red (NIS) para las células usando un modelo computacional de la red celular pueden ser, por ejemplo, un producto de programa de computadora que contiene instrucciones ejecutables que cuando se ejecutan provocan que un procesador realice las operaciones para calcular un ÑAS o NIS para las células. Alternativamente, los medios para calcular un ÑAS o NIS pueden ser, por ejemplo, un componente que permita al usuario del kit la interrelación con un servicio basado en internet que corre un programa de computadora que puede calcular un ÑAS o NIS para las células con la entrada por el usuario de la información en los niveles de uno o más componentes de la red celular en las células. Tal componente puede incluir, por ejemplo, una interfaz, una página web y/o una palabra clave para permitir el acceso al servicio basado en internet e instrucciones, por ejemplo, instrucciones impresas, para uso del servicio. Los sistemas de computación y de software establecidos en la técnica, y descritos en la presente, se pueden adaptar para su uso en los kits de la invención. Los dispositivos de cálculo y los componentes de cálculo referenciados en la Figura 16 pueden incluir también medios para calcular el ÑAS o NIS, tales como los procesadores de cálculo, los dispositivos de entrada y de medición, los dispositivos de salida, y así sucesivamente.

Las instrucciones para el uso del kit para predecir la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico pueden incluir instrucciones de la computadora y interfaz de la computadora, así como publicaciones impresas y manuales. En algunos casos, el kit se empaca junto. En otras modalidades, los diferentes componentes del kit se mantienen en lugares distintos. Por ejemplo, algunos de los componentes se pueden mantener, almacenar u alojar en uno o más sistemas de computación remotos y solamente se hacen disponibles a través de una conexión de red.

Preferentemente, los kits de la invención se diseñan para usar con un sujeto humano, tal como un paciente humano que tiene un tumor. En esos casos, las células son típicamente células obtenidas del paciente por biopsia o resección del tumor.

VII. Métodos terapéuticos v kits Se proporcionan métodos para tratar un paciente que tiene un tumor maligno. En general, esos métodos comprenden: obtener un muestra (por ejemplo, una muestra de biopsia o resección) de un tumor del paciente; determinar el nivel de uno o más biomarcadores en la muestra; y administrar un agente terapéutico al paciente si los niveles del(de los) biomarcador(es) en la muestra coinciden con un perfil predeterminado, por ejemplo, el nivel de un biomarcador es mayor que un nivel mínimo. Tales métodos aplican para cualquier tumor sólido. Las muestras de tumores adecuadas son generalmente como se describió anteriormente. En ciertas modalidades un biomarcador es una proteína del receptor ErbB.

En ciertas modalidades, tales métodos comprenden: obtener una muestra del tumor, ensayar el nivel de pErbB3 en la muestra, y posteriormente administrar al menos un agente terapéutico anti-neoplásico al paciente, en donde, si el nivel de pErbB3 determinado en la muestra no es menor que un nivel mínimo que sea 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 100% (preferentemente 50%) del nivel de pErbB3 ensayado en un cultivo de células ACHN (células de cáncer renal, ATCC núm. CRL-1611) seguido por el cultivo por 20-24 horas en medio libre de suero, entonces el al menos un agente terapéutico anti-neoplásico que se administra posteriormente al paciente comprende un anticuerpo anti-ErbB3, y si el nivel de pErbB3 determinado en la muestra es menor que el nivel mínimo, entonces el al menos un agente terapéutico anti-neoplásico que se administra posteriormente al paciente no comprende un anticuerpo anti-ErbB3. Los cultivos preferidos de células ACHN son los que se pasan no más de 9 veces, por ejemplo, células ACHN con 8 pases. En aspectos adicionales de esas modalidades, el biomarcador es pErbB3, el agente terapéutico es un anticuerpo anti-ErbB3, y el nivel mínimo es 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 100% del nivel observado en células tumorales a partir de un modelo de xenoinjerto de tumor ACHN. En otros aspectos adicionales, el nivel mínimo es 0.064 pg^g proteína total, 0.08 pg^g proteína total, 0.096 proteína total o 0.16 proteína total.

En las modalidades anteriores, el nivel de pErbB3 en la muestra puede, en algunos aspectos, determinarse por: a) medir niveles de al menos dos componentes de la vía de señalización ErbB3 en la muestra; b) calcular un estado de activación de la red (ÑAS) que simula el nivel de pErbB3 en la muestra usando el(los) nivel(es) medido(s) en (a) entrada en un modelo computacional de la vía de señalización ErbB3; y (c) determinar de ahí el nivel de pErbB3 en la muestra. En ciertas modalidades, los niveles de al menos tres, cuatro, cinco o seis componentes de la vía de señalización ErbB3 se detectan en (a). Los componentes adecuados de la vía de señalización ErbB3 incluyen, por ejemplo, ErbBl, ErbB2, ErbB3, ErbB4 (y homo- y hetero-dímeros de las proteínas ErbB), HRG (por ejemplo, HRG-ß?), BTC, EGF, HB-EGF, TGFa, AR, EPG y EPR. Estos componentes se pueden ensayar como la proteína (por ejemplo, un monómero, un homodímero o un heterodímero), o donde sea aplicable (por ejemplo, donde el nivel total de la proteína se mide a pesar del estado de fosforilación, pero no donde se mide un nivel de fosfoproteína, por ejemplo, para un monómero, homodímero o heterodímero), como el ARNm que codifica la proteína. Los ensayos adecuados son bien conocidos en la técnica, e incluyen los descritos en la presente.

En otros aspectos, el método para determinar el nivel de pErbB3 comprende, adicionalmente, aplicar un algoritmo de clasificación estadística para generar el modelo computacional de la vía de señalización ErbB3 usado en el cálculo de ÑAS. En otras modalidades, el ÑAS calculado simula los niveles de un heterodímero ErbBl/ErbB3 fosforilado y/o un heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado en la muestra.

Los anticuerpos anti-ErbB3 para usar con la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, los anticuerpos anti-ErbB3 descritos en la solicitud internacional de patente núm.

PCT/US2008/0021 19, publicada como publicación internacional núm. WO 2008/100624, la que se incorpora en la presente como referencia. Un anticuerpo particularmente preferido descrito en la presente se conoce ahora como MM-121, el cual se somete a los ensayos clínicos en Fase I. Los anticuerpos anti-ErbB3 preferidos también incluyen los anticuerpos anti-ErbB3 descritos anteriormente. Otro anticuerpo anti-ErbB3 que se puede usar en los métodos descritos en la presente es el U3-1287 (AMG888) (U3 Pharma AG and Amgen), el cual se somete a los ensayos clínicos en Fase I.

Los tumores susceptibles al tratamiento como se describe en la presente son generalmente como se describió anteriormente. Los ejemplos de tumores son de un órgano seleccionado de colon, pulmón, recto, vesícula biliar, cerebro, médula espinal, mamas, riñon, páncreas, estómago, hígado, huesos, piel, bazo, ovarios, testículos, próstata y músculos. En algunos aspectos, se prefieren los tumores positivos ErbB3 o tumores positivos ErbB2 y ErbB3 (por ejemplo, tumores de mama y tumores de cáncer de pulmón células no pequeñas).

El agente terapéutico anti-neoplásico se puede administrar al paciente en cualquier forma adecuada. Típicamente, el agente terapéutico se proporciona en forma de una composición farmacéutica, que comprende el agente terapéutico en combinación con un portador fisiológicamente aceptable. Si se desea, otros ingredientes activos o inactivos se pueden incluir también dentro de la composición farmacéutica Como se usa en la presente descripción, el término "fisiológicamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora de un gobierno estatal o federal (por ejemplo, la FDA de los Estados Unidos o EMEA) o enumerados en la farmacopea de los Estados Unidos u otras farmacopeas generalmente reconocidas para uso en animales, y más particularmente en humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que el agente terapéutico anti-neoplásico se formula y se administra. Los portadores fisiológicamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como soluciones acuosas, las que son portadores preferidos para administración intravenosa u otra parenteral. Las soluciones salinas y de dextrosa acuosa y las soluciones de glicerina son ejemplos de portadores acuosos para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos aceptables incluyen, por ejemplo, almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, caliza, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerina, talco, cloruro sódico, leche desnatada seca, glicerina, propilenglicol, agua y etanol. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, agentes tampones de pH, o preservantes.

Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para cualquier manera adecuada de administración, que incluyen, por ejemplo, administración parenteral, intranasal, tópico, oral, o local, tal como por un medio transdérmico, para tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Los ejemplos de modos farmacéuticos adecuados de administración y portadores se describen en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", A.R. Gennaro, ed. Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfía, PA (21ma ed., 2005).

Comúnmente, las composiciones farmacéuticas usadas en los métodos proporcionados en la presente se administran parenteralmente (por ejemplo, por inyección intravenosa, intramuscular, o subcutánea). Para la administración parenteral, el agente terapéutico anti-neoplásico se puede suspender o disolver en el portador. Un portador acuoso estéril es generalmente preferido, tal como agua, agua tamponada, solución salina o solución salina de tampón fosfato. Además, los aceites fijos estériles se pueden emplear como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito cualquier aceite fijo suave se puede emplear incluyendo los mono- o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como ácido oleico encuentran uso en la preparación de composiciones inyectables. Las sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables se pueden incluir también para condiciones fisiológicas aproximadas, tal como ajuste de pH y agentes tampones, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes humectantes, detergentes, preservantes, anestésicos locales y agentes tampones.

En una modalidad preferida, la composición farmacéutica se formula para la administración intravenosa a un paciente (por ejemplo, un humano). Típicamente, las composiciones para la administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición puede incluir también un agente de solubilización. Los ingredientes se pueden suministrar separadamente o mezclados juntos en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolleta. Cuando la composición se administra por infusión, ésta se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua o solución salina de grado farmacéutico estéril. Cuando la composición se administra por inyección, una ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina se puede proporcionar de manera que los ingredientes se pueden mezclar antes de la administración.

Las composiciones farmacéuticas se pueden esterilizar por técnicas de esterilización convencionales, o pueden ser estériles filtradas. Las soluciones acuosas estériles se pueden empacar para su uso como son, o liofilizadas, la preparación liofilizada se combina con un portador acuoso estéril antes de la administración. El pH de una composición farmacéutica acuosa típicamente estará entre 3 y 11, más preferentemente entre 5 y 9 o entre 6 y 8, y más preferentemente entre 7 y 8, tal como 7 a 7.5.

El agente terapéutico está generalmente presente dentro de una composición farmacéutica a una concentración tal que la administración de una dosis única al paciente entrega una cantidad terapéuticamente efectiva. Una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que resulta en un beneficio al paciente apreciable, tal como retardo o cese del crecimiento del tumor o preferentemente una reducción del tamaño del tumor. Las cantidades terapéuticamente efectivas se afectan por una variedad de factores, que incluyen la actividad del agente terapéutico anti-neoplásico empleado; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo y la ruta de administración; la tasa de excreción; cualquier tratamiento simultáneo, tal como una combinación de fármacos; y el tipo y gravedad del daño al tejido en el paciente sometido al tratamiento. Las dosificaciones óptimas se pueden establecer usando pruebas de rutina, y procedimientos que son bien conocidos en la técnica. En general, las composiciones que proporcionan niveles de dosificación en el intervalo de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal por día, por semana o una vez cada 2 semanas se prefieren. Los ejemplos no limitativos de intervalos de dosificación adecuados y regímenes incluyen 2-50 mg kg (peso corporal del sujeto) administrados una vez por semana, o dos veces por semana o una vez cada tres días, una vez cada dos semanas, o una vez cada tres semanas, y 1-100 mg/kg administrados una vez por semana, o dos veces por semana o una vez cada tres días, o una vez cada dos semanas. En varias modalidades, un agente terapéutico se administra a una dosificación de 3.2 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg ó 40 mg/kg a un ritmo de una vez por semana, o dos veces por semana o una vez cada tres días, una vez cada dos semanas, o una vez cada tres semanas. Los intervalos de dosificación adicionales incluyen: 1-1000 mg/kg, 1-500 mg/kg, 1-400 mg/kg, 1-300 mg/kg y 1-200 mg kg. Los programas de dosificación adecuados incluyen una vez cada tres días, una vez cada cinco días, una vez cada siete días (es decir, una vez por semana), una vez cada 10 días, una vez cada 14 días (es decir, una vez cada dos semanas), una vez cada 21 días (es decir, una vez cada tres semanas), una vez cada 28 días (es decir, una vez cada cuatro semanas) y dos veces por mes.

Preferentemente, el agente terapéutico (por ejemplo, el anticuerpo anti ErbB3) se administra al paciente de acuerdo con las indicaciones en la información de prescripción proporcionadas por el fabricante o distribuidor del agente terapéutico.

Los kits para usar en el tratamiento de los pacientes que tienen un tumor maligno también se proporcionan. Algunos de esos kits típicamente comprenden: a) al menos un ensayo para detectar el nivel de al menos un componente de la vía de señalización ErbB3 en una muestra; y b) instrucciones para calcular un estado de activación de la red (ÑAS) que simula el nivel de pErbB3 usando un modelo computacional de la entrada de la vía de señalización ErbB3 con los datos obtenidos a partir de al menos un ensayo. En ciertas modalidades, esos kits comprenden, además, instrucciones para aplicar un algoritmo de clasificación estadística. En ciertas modalidades el kit también comprende un anticuerpo anti-ErbB3. El ensayo comprende, típicamente, uno o más reactivos que permiten la detección de al menos un componente de la proteína o al menos un componente del ARNm. En ciertas modalidades, las instrucciones para calcular un ÑAS comprenden dirigir el uso de un producto de programa de computadora que contiene instrucciones ejecutables que cuando se ejecutan por una computadora provocan que el procesador realice operaciones para calcular un ÑAS; en esas modalidades, el usuario puede ser instruido para correr el programa de computadora en una computadora local o el usuario puede ser instruido para interrelacionar con un servicio basado en internet que corre el programa de computadora remotamente.

Dentro de otras modalidades, se proporcionan kits que comprenden el anticuerpo anti-ErbB3s e instrucciones (por ejemplo, en forma de etiquetas, por ejemplo, un accesorio del empaque) que indican que el anticuerpo anti-ErbB3 se administrará al paciente si el nivel de pErbB3 en una biopsia del tumor del paciente excede un valor mínimo específico, y que el anticuerpo anti-ErbB3 no se administrará al paciente si el nivel de pErbB3 no excede un valor mínimo específico. Por ejemplo, tales instrucciones pueden indicar que el anticuerpo anti-ErbB3 se administrará a un paciente que tiene un tumor maligno si el nivel de ErbB3 fosforilado determinado en la muestra no es menor que el 50% de un nivel de ErbB3 fosforilado medido en un cultivo de células ACHN de cáncer renal (ATCC núm. CRL-1611) seguido del cultivo por aproximadamente 20-24 horas en medio libre de suero; y que un anticuerpo anti-ErbB3 no se administrará a un paciente que tiene un tumor maligno si el nivel de ErbB3 fosforilado determinado en la muestra es menor que el 50% del nivel de ErbB3 fosforilado medido en el cultivo de células ACHN de cáncer renal.

VIII. Modalidades de computación Como se mencionó anteriormente, y como debe ser fácilmente evidente de la descripción proporcionada en este documento, muchas de las modalidades de la invención utilizan uno o más sistemas de computación para realizar los distintos procesos descritos anteriormente, incluyendo, pero sin limitarse a predecir las respuestas del paciente, generar tratamientos recomendados, identificar biomarcadores, calcular los valores ÑAS o NIS, obtener modelos computacionales de vías señales, y así sucesivamente.

Las Figuras 15A y 15B ilustran cartas de flujo de algunos procesos que se pueden realizar por uno o más sistemas de computación durante la implementación de ciertas modalidades de la invención. Como se muestra, por ejemplo, los sistemas de computación se pueden utilizar para medir y/o recibir la introducción de niveles medidos de los componentes en una red celular de un tumor así como el estado de la mutación de los genes del tumor. Los sistemas de computación también se pueden usar para obtener modelos computacionales, los cuales se pueden obtener, por ejemplo, al recibir, cargar, construir, modificar, preparar y/o acceder a modelos computacionales de fuentes locales y remotas.

Una vez que se obtiene un modelo computacional, uno o más sistemas de computación calculan el ÑAS o el NIS para las células, tales como, por ejemplo, simulando los niveles relevantes de proteínas fosforiladas, homodímeros y/o heterodímeros en las células. El modelo computacional también se puede usar por el sistema de computación para identificar biomarcadores predictivos a través de la identificación de componentes relevantes adicionales en la red celular basado en los ajustes de los usuarios recibidos en el sistema de computación.

El sistema de computación también se puede usar para identificar los algoritmos de clasificación estadística que se pueden recibir, construir, y/o modificar por el sistema de computación como parte del proceso de identificación y que se pueden usar en varias combinaciones con los datos ÑAS o NIS, otros datos del biomarcador, y los datos del paciente, para generar respuestas predichas del paciente a los tratamientos, y/o para generar y seleccionar tratamientos recomendados.

Aunque los elementos ilustrados en las cartas de flujo de las Figuras 15A y 15B infieren una secuencia sugerida u ordenamiento para realizar los procesos de cálculo de la invención, se apreciará que los procesos ilustrados en las Figuras 15A y 15B se pueden también realizar en secuencias que tienen un ordenamiento diferente. Por ejemplo, un tratamiento recomendado se puede identificar antes de generar el modelo computacional o calcular el ÑAS o NIS y el cual se puede usar en la construcción del modelo computacional. Similarmente, la medición de los niveles de proteína puede ocurrir antes de o posterior a la generación del modelo computacional.

Se apreciará también que se pueden realizar procesos adicionales como parte de la invención, de manera que la invención no se limita solamente a los métodos que incluyen los procesos ilustrados en la carta de flujo. Por ejemplo, la invención puede incluir también los procesos para obtener información del paciente (por ejemplo, edad, género, historial médico), y para rastrear los resultados actuales de los tratamientos recomendados, así como otros procesos.

Se debe apreciar también que los sistemas de computación usados para implementar los procesos de la presente invención pueden incluir uno o más sistemas de computación diferentes, de tipos diferentes, así como en localizaciones diferentes.

La Figura 16 ilustra un ejemplo de un sistema de computación que se puede usar para realizar ciertos aspectos de la invención (incluyendo, por ejemplo, al menos alguno de los procesos ilustrados en las Figuras 15A y 15B, así como aquellos descritos a través de este documento). Como se ilustra, el sistema de computación incluye varios dispositivos de entrada, dispositivos de salida, módulos de cálculo, componentes de procesamiento y medios de almacenamiento. Los dispositivos de entrada pueden incluir teclados, ratones, almohadillas táctiles, pantallas táctiles, micrófonos, así como cualquier otro dispositivo de entrada. Los dispositivos de salida pueden incluir altavoces, pantallas, dispositivos de impresión, conmutadores, así como otros dispositivos de salida. Los módulos de cálculo incluyen los diferentes módulos necesarios para realizar la funcionalidad descrita en este documento, que incluyen los módulos para recibir y construir modelos computacionales, módulos para calcular el ÑAS o NIS, módulos para identificar biomarcadores predictivos, módulos para obtener, reconocer y almacenar los niveles medidos de los componentes y para identificar y determinar estado del gen mutante, módulos para identificar y aplicar los algoritmos de clasificación estadística, módulos para generar respuesta predichas a los tratamientos, módulos para generar y seleccionar tratamientos recomendados, módulos de comunicaciones para la interrelación con los usuarios y uno o más dispositivos diferentes, así como módulos para realizar otros varios procesos descritos en la presente.

El sistema de computación también incluye uno o más procesadores y otros componentes de procesamiento necesarios para ejecutar los módulos antes mencionados, así como medios de almacenamiento para almacenar los módulos antes mencionados, así como las varias estructuras de datos, modelos computacionales, y otros datos descritos en la presente. Aunque los medios de almacenamiento se ilustran como que son locales con el sistema de computación, se apreciará que los medios de almacenamiento se pueden localizar también de manera remota al sistema de computación, o solo parcialmente local con el sistema de computación. Por ejemplo, en algunos casos, los medios de almacenamiento representan un almacenamiento distribuido que se comparte entre una pluralidad de sistemas de computación diferentes y que incluyen el espacio de almacenamiento localizado en una pluralidad de sistemas de computación. Los medios de almacenamiento pueden comprender también cualquier combinación de memoria persistente y volátil.

La Figura 16 también ilustra que el sistema de computación se puede conectar en red a uno o más de otros dispositivos, incluyendo dispositivos de medición, computadoras localizadas de forma remota, servicios remotos y redes remotas. En algunos casos, uno o más de estos otros dispositivos realizan uno o más de los procesos descritos en este documento, de manera que la ejecución de algunos métodos se realiza en un entorno de red distribuida que involucra múltiples dispositivos y sistemas de computación distribuidos.

En vista de lo anterior, se apreciará que el alcance de la presente invención se puede implementar en varias configuraciones de cómputo diferentes.

IX. Ejemplos La presente invención se ilustra además por los siguientes ejemplos no limitativos. La descripción de cada patente, solicitud de patente o publicación de los Estados Unidos o internacional mencionada en la presente se incorpora por este medio en la presente como referencia en su totalidad.

Ejemplo 1 Estudios de eficacia de xenoinjerto con Ab #6: Conjunto de datos de preparación En este ejemplo, se usaron cuatro modelos de xenoinjerto de tumor para identificar las líneas celulares tumorales que respondieron al tratamiento con el anticuerpo anti-ErbB3 Ab #6. Los cuatro modelos de xenoinjertos de tumor estudiados representan diferentes indicaciones: MALME3M (línea de cáncer de melanoma; ATCC núm. HTB-64), ADRr (línea celular de cáncer de ovario; NCI-60, identificación de la muestra cósmica núm. 905987), ACHN (línea celular de cáncer de células renales; ATCC núm. CRL- 161 1) y DU145 (línea celular de cáncer de próstata; ATCC núm. HTB-81). Como se describe en más detalle a continuación, los xenoinjertos MALME3M y ADRr no mostraron una respuesta al tratamiento con Ab #6, mientras que los xenoinjertos ACHN y DU145 mostraron una respuesta al tratamiento con Ab #6.

En los modelos de xenoinjerto de tumores, los ratones (ratones nu/nu: ratones hembra de 3-4 semanas de edad, deficientes en células-T; consanguíneos; de fondo albino; de Charles River Labs, Wilmington, MA) se implantan en el lado derecho con 3.5 x 106 -3 x 108 células/ratón (en dependencia de la línea celular) en 200 µ? por inyección subcutánea. Los ratones se supervisan para el crecimiento inicial del tumor. Las células tumorales se dejaron crecer durante varios días hasta que el volumen del tumor es aproximadamente 200 mm3. El volumen del tumor se calcula como V = (p/6 (L x W2). Los ratones se trataron con el anticuerpo Ab #6 a una dosificación de 600 µg/inyección cada 3 días (qd3). Los ratones control se trataron con solución salina de tampón fosfato (PBS).

El volumen tumoral se mide durante 60 a 80 días. Los resultados (obtenidos mediante los métodos descritos anteriormente o variaciones mínimas de éstos) del efecto del tratamiento con el anticuerpo en el crecimiento tumoral se resumen en los gráficos que se muestran en las Figuras 1 A- ID, que demuestran que el tratamiento con Ab #6 inhibe el crecimiento tumoral en los modelos de xenoinjerto DU145 y ACHN, mientras que el tratamiento con Ab #6 no inhibió el crecimiento tumoral (en comparación con el control PBS) en los modelos de xenoinjerto ADRr y MALME3M.

Como una medida de la capacidad de respuesta del tumor al Ab #6, se determina la tasa de crecimiento exponencial, lo que describe mejor los datos experimentales. La siguiente fórmula se usa para describir el crecimiento exponencial.

V=Vo*exp (k*t) donde V es el volumen tumoral en mm3, Vo es el volumen tumoral en el tiempo cero, k es la tasa de crecimiento exponencial y t es el tiempo en días.

Para comparar la reducción del crecimiento a través de los diferentes estudios de xenoinjerto, un valor de reducción de la tasa de crecimiento (GRR) se calcula para cada línea celular ensayada, lo que relaciona la tasa de crecimiento observada en presencia del Ab #6 con la tasa de crecimiento observada en el grupo control de PBS mediante la siguiente fórmula: Reducción de la tasa de crecimiento = 1 - (tasa de crecimiento de Ab#6 k Ab )l (tasa de crecimiento de PBS kpes) Los valores GRR de las cuatro líneas celulares ensayadas (obtenidos mediante los métodos descritos anteriormente o por variaciones mínimas de éstos) se resumen en la Tabla 1 a continuación. En el caso de una reducción de la tasa de crecimiento negativa, el valor GRR se ajusta a cero.

Tablal: Resumen de la reducción de la tasa de crecimiento tumoral para el conjunto de preparación de los estudios de xenoinjerto Línea Celular GRR G%1 MALME3M 0 DU145 72.6 ADRr 0 ACHN 28.0 Los resultados demuestran que los cuatro xenoinjertos muestran un intervalo de capacidad de respuesta al tratamiento con Ab #6, con las células ADRr y MALME3M que no muestran respuesta al tratamiento con Ab #6, las células ACHN tienen una capacidad de respuesta media y las células DU145 tienen la más alta capacidad de respuesta al tratamiento con Ab #6.

Ejemplo 2: Los niveles de pErbB3 en los Usados de línea celular tumoral se correlacionan con la capacidad de respuesta al Ab #6 en los xenoinjertos En este ejemplo, la concentración de ErbB3 fosforilado (pErbB3) se midió, in vivo, en cada una de las cuatro líneas celulares tumorales estudiadas en el Ejemplo 1, MALME3M, ADRr, DU145 y ACHN, en un estudio farmacodinámico (PD) a corto plazo. El xenoinjerto OvCAR8 también se incluyó en este experimento (este xenoinjerto se muestra sensible al tratamiento con Ab #6 en el Ejemplo 5 descrito a continuación).

Las células MALME3M, ADRr, DU145, OvCAR 8 y ACHN crecieron en cultivos y se cosecharon para la implantación (placas 15 x 15cm, ~ 80% de confluencia, # total de células = o 2 a 4 x l0 ) y se mantuvieron en hielo hasta su implantación. Las células (aproximadamente 2 x 10 células/ratón) se implantan en 20 ratones (por inyección subcutánea, 200 µ? de células/inyección/ratón) en el lado derecho y después se dejan recuperar los ratones mientras que se supervisan para el crecimiento tumoral inicial. Los tumores se miden (L x W) por la medición del calibrador digital. Una vez que los ratones alcanzaron un volumen tumoral mayor que 100 mm3, se sacrifican por asfixia con C02 y los tumores de cada ratón se extirpan y congelan en seco con nitrógeno líquido. Las muestras de tejido tumoral congeladas se almacenan a -80 °C para los análisis bioquímicos. La cantidad de ErbB3 fosforilado (pErbB3) en los Usados tumorales se determina por ELISA mediante el kit R&D Systems Human pErbB3 ELISA (Catálogo # DYC1769). La preparación de la muestra y los protocolos de ELISA se describen en más detalle a continuación.

Para la preparación de la muestra y la extracción de las proteínas, en primer lugar, los tumores congelados se pulverizan y se transfieren a criotubos de 2 mi VWR pre-pesados (VWR International). Las muestras pulverizadas se pesan y los pesos se registran. Después de calcular el peso de la muestra, la cantidad apropiada de tampón de lisis helado se adiciona a cada tubo hasta una concentración final de 62 mg/ml. Las muestras se agitan brevemente a baja velocidad y se incuban con rotación a 4 °C.

El Usado tumoral crudo se transfiere después a Qiagen Qiashredder y se centrifuga a 12000 rpm durante 8 minutos para más homogenización de las muestras. Después de la transferencia de los Usados clarificados en un tubo nuevo, una pequeña cantidad de cada Usado se toma para el análisis de proteína por BCA. El resto del Usado se alícuota y se almacena a -80°C para el análisis adicional por el ensayo ELISA.

Para cuantificar el total de proteína mediante un kit BCA Protein Assay (Pierce, Catálogo # 23225), en primer lugar, una curva estándar de 8 puntos de albúmina de suero bovino (BSA) se prepara por medio del uso de la solución estándar de BSA 2 mg/ml del kit de BCA, a partir de la concentración inicial de 2 mg/ mi. Después de mezclar los reactivos A y B del kit (50:1) y preparar diluciones de 3 veces y 5 veces de Usado tumoral inicial con PBS, 20 µ? de muestra de BSA estándar o muestra diluida del Usado tumoral y 160 µ? de reactivo de trabajo se adicionan a cada pocilio de una placa de 96 pocilios. La placa se incuba a 37° centígrados durante 20 minutos. La D0562 se lee y la cantidad total de proteína en los Usados tumorales se calcula mediante la curva estándar de BSA.

Para llevar a cabo el ELISA pErbB3, los diferentes anticuerpos de captura se diluyen con PBS a la concentración de trabajo recomendado por el kit (R&D Systems DYC1769). Después del recubrimiento en la oscuridad de las placas de 96 pocilios (Nunc Maxisorb) con anticuerpos de captura diluidos, todas las placas se incuban a temperatura ambiente (TA) durante toda la noche. Las placas se lavan después tres veces con PBST (PBS + 0.05% de Tween-20) en un lavador de placas Bio Tek y se bloquean durante 2 horas a TA con 200 µ? de 1% de BSA en PBST.

Las proteínas recombinantes para las curvas estándares se preparan con la concentración más alta recomendada por el kit y diluciones dobles para un total de 11 puntos. Las placas se lavan 3 veces con PBS y 100 µ? de Usado tumoral se adiciona antes de la incubación durante 2 horas a TA. Después, las placas se lavan tres veces con PBST y 100 µ? del anticuerpo de detección primario se adicionan diluidos a la concentración de trabajo en PBS/0.1% de BSA /0.05% de Tween-20. Las placas se incuban además a TA durante 2 horas. Por último, 100 µ? del sustrato quimioluminiscente SuperSignal ELISA Pico mezclado (Pierce, Catálogo # 37069) se adiciona a cada pocilio antes de leer las placas.

La Figura 2 es un gráfico que representa la concentración de pErbB3 en los xenoinjertos de tumores sin tratar (en lisado tumoral) contra la reducción de la tasa de crecimiento (% - obtenido mediante los métodos descritos anteriormente o variaciones mínimas de estos) observada para los xenoinjertos cuando se trata con Ab #6. La Figura 2 muestra que existe una buena correlación entre la reducción de la tasa de crecimiento del tumor y los niveles constitutivos de pErbB3 medidos en los estudios farmacodinámicos a corto plazo. Los xenoinjertos MALME3M y ADRr, que no respondieron al tratamiento con Ab #6, mostraron los niveles más bajos de pErbB3, mientras que los xenoinjertos ACHN, OvCAR8 y DU145, que respondieron al tratamiento con Ab #6, tenían de manera significativa, niveles superiores de pErbB3. Los resultados demuestran que los niveles de pErbB3 en las células tumorales se correlacionan bien con la capacidad de respuesta de las células tumorales al tratamiento con anticuerpos anti-ErbB3.

Ejemplo 3: Los Niveles de pErbB3 y pAKT disminuyen en función del tiempo de congelación En este ejemplo, la estabilidad de pErbB3 y pAKT se evaluó, así como los niveles de expresión de ErbBl, ErbB2 y ErbB3, en Usados tumorales en función del tiempo después que resurge de la congelación del tumor.

Los ratones sin tratar con xenoinjerto ACHN y EKVX se sacrifican por asfixia con C02 y los tumores se disecan y cortan en cuatro pedazos y se ponen en nitrógeno líquido a diferentes puntos de tiempo: 0 min, 10 min, 30 min y 60 min. Después, los niveles pErbB3 y pAKT, así como los niveles de ErbBl -3, se miden en cada una de las muestras después de descongelar. Los resultados obtenidos mediante los métodos descritos anteriormente o variaciones mínimas de éstos se resumen en los gráficos de barra que se muestran en las Figuras 3A-3E, con las Figuras 3A y 3B que muestran los niveles de pErbB3 y pAKT, respectivamente, en los Usados ACHN y las Figuras 3C, 3D y 3E que muestran los niveles de ErbBl, ErbB2 y ErbB3, respectivamente, en los Usados EKVX.

Como se muestra en las Figuras 3A y 3B, en las muestras del minuto 10, ya existía una disminución apreciable en los niveles de pErbB3 y pAKT en comparación con las muestras del minuto 0. En las muestras del minuto 30, se observó una disminución en la concentración del 40% para pErbB3 en comparación con el control (congelación en seco inmediata del tumor, muestra del minuto 0) y una disminución del 20% se observó en la concentración de pAKT en comparación con el control. En contraste, en los Usados de las células tumorales EKVX y ACHN, los niveles totales de ErbB 1-3 se mantienen constantes y no se afectan al parecer por el tiempo de congelación (ver las Figuras 3C-3E). De este modo, la inestabilidad de las fosfoproteínas observada en las muestras tumorales y la estabilidad de las mediciones de proteína total observada demuestran la ventaja de calcular el nivel de fosforilación de ErbB3, en lugar de medir de manera directa el nivel en un sado de célula tumoral. Este nivel calculado de pErbB3 se refiere como el estado de activación de la red (ÑAS) en los siguientes ejemplos que usan un modelo computacional mecanicista construido como se describe en el Ejemplo 4 a continuación.

Ejemplo 4; Construcción y preparación de un modelo computacional mecanicista de la vía de señalización de ErbB En el siguiente ejemplo, se describe la construcción de modelos bioquímicos computacionales mecanicistas de las vías de transducción de señales. Sobre la base de los conocimientos de la literatura acerca de la señalización de ErbB, se desarrolló un modelo computacional mecanicista que comprende todas las interacciones proteína-proteína que describen la unión del ligando al receptor, la dimerización, la internalización del receptor, y la degradación, así como la unión de la molécula adaptadora Gabl que conduce a la activación de la cascada de PI3K. Un esbozo de la red de señalización de ErbB aplicada se describe en la Figura 4 A. El modelo computacional es un conjunto de ecuaciones diferenciales ordinarias no lineales (ODEs), que usan las cinéticas de acción de masas. La Figura 4B muestra un conjunto de reacciones bioquímicas de la vía de señalización y la Figura 4C muestra un conjunto de flujos. Las reacciones bioquímicas y los flujos se traducen en un conjunto de ODEs no lineales, que se ilustran en la Figura 4D. En general, el estado de cambio de una concentración de proteína ci es igual a la tasa de la producción de la proteína vproducción menos la tasa de consumo de la proteína vconsumo como se representa en la Ecuación 1.

— = S V production ~ S V consuman (EcUaClÓn 1 ) El modelo computacional usado para predecir las respuestas al Ab #6 en los siguientes ejemplos se compone de la red de ErbB de los mamíferos que incluye los cuatro receptores (ErbBl -4) y la cascada de transducción de la señal Akt.

Los receptores ErbB son receptores transmembrana de Tipo I de un solo paso con dominios extracelulares de unión al ligando, un dominio intracelular de la tirosina quinasa y una cola citoplasmática que actúa como un soporte de la señalización. Los ErbBl y ErbB4 son funcionales por completo en la actividad de unión del ligando y de tirosina quinasa pero ErbB2 no une a ningún ligando conocido, que funciona más bien como un amplificador de la señal lista para la dimerización (Klapper, L.N y otros. (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 96:4995-5000). ErbB3 tiene un dominio quinasa deteriorado (Guy, P.M. y otros, (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 91:8132-8136) y por lo tanto carece de la actividad catalítica, en su lugar se transducen las señales cuando se fosforila por otros receptores ErbB. De los 13 ligandos ErbB conocidos, BTC y HRG se han aplicado como los ligandos que inducen los más altos niveles de fosforilación de ErbB3. Los 13 ligandos ErbB conocidos se pueden dividir en tres grupos: (i) aquellos que se unen en específico al ErbBl, tales como EGF, factor de crecimiento transformador alfa (TGFa), y anfiregulina (AR), (ii) aquellos que exhiben doble especificidad, que se unen tanto a ErbBl y ErbB4, que incluyen BTC, HB-EGF, EPG y el EPR, y (iii) la neuregulinas (NRG), que se dividen en dos subgrupos: NRG1 (también conocido como GGF2, SMDF o HRG) que se une a ErbB3/ErbB4, una propiedad también compartida con NRG2 y NRG3 NRG4 que se unen sólo a ErbB4. Tras la unión del ligando, los receptores dimerizan y experimentan la transfosforilación en residuos de sus colas citoplasmáticas, por consiguiente la creación de sitios de acoplamiento para las moléculas adaptadoras que contienen SH2 como Shc, Grb2, GAP, Sos, y PI3K. El ErbBl tiene al menos 20 sitios de fosforilación de la tirosina en su cola citoplasmática, 12 de los cuales se han propuesto asociar con las proteínas y enzimas adaptadoras que contienen SH2 (Schulze, W.X. y otros, (2005) Mol. Syst. Biol. 1:2005-2008). Otros receptores ErbB experimentan por igual la compleja modificación posterior a la traducción. Los adaptadores asociados al receptor, tales como Grb2 y PI3K activan RAS, y por último estimulan a ERK y AKT. A T también se puede activar de manera independiente de RAS por la unión directa de PI3K-p85 a varios sitios en ErbB3.

Aunque un número de modelos computacionales se han publicados (ver por ejemplo, Kholodenko, B.N. y otros, (1999) J. Biol. Chem.274:30169-30181 ; Hatakeyama, M. y otros. (2003) Biochem. J.373: 451-463; Re§at, H. y otros, (2003) Biophys. J.85j730-743; Hendriks, B.S. y otros, (2005) J. Biol C/¾em.280:6157-6169); Sasagawa, S. y otros,(2005) Nat. Cell. Biol. 7:365-373; Birtwistle, M.R. y otros, (2007) Molecular Systems Biology 3:144), el modelo computacional usado en este documento es más amplio e incluye los cuatro receptores de ErbB y dos clases distintas de ligandos (HRG y BTC), a la vez que retiene, a pesar de todo, el rigor de una formulación de acción de masas basada en las reacciones básicas.

Siete heterodímeros y homodímeros de ErbB que se han descrito en la literatura se aplicaron en el modelo: ErbBl/1, ErbBl/2, ErbBl/3, ErbBl/4, ErbB2/2, ErbB2/3 y ErbB2/4. La mayoría de estos dímeros se activan por la unión al ligando, pero varios se originan a través de un proceso de "señalización lateral" (o dimerización secundaria) en el que los dímeros fosforilados se disocian de una forma dependiente del ligando en monómeros que homo o hetero oligomerizan después ya sea con monómeros activados o inactivados para crear dímeros activos. El modelo computacional se preparó con un conjunto de datos experimentales que permitieron la identificación de los dímeros que se forman usando la línea celular ADRr en la presencia de HRG o BTC.

El modelo de cálculo se basa en ecuaciones diferenciales ordinarias no lineales, que requieren dos tipos de parámetros que se deben medir o estimar: el número inicial de especies y las constantes de velocidad. Antes de la calibración del modelo, los valores de tantos parámetros como sean posibles se especificaron sobre la base de la información de la literatura, por ejemplo, las constantes de unión para los ligandos a sus receptores afines. Mediante un análisis de qFACS, la expresión de los niveles de los receptores ErbB se cuantificó a través de todas las líneas celulares usadas en esta solicitud. Además, los ELISA se usaron para cuantificar los niveles de BTC y pErbB3. Además, los niveles de ARNm de HRG-ß 1 se determinaron en comparación con los niveles de ARNm en la línea celular ZR-75 (ATCC núm. CRL-1500). Los niveles de expresión del receptor y el ligando, cuya información se usa en el modelo computacional, se resumen en la Tabla 2 a continuación. Las metodologías para obtener estos niveles de expresión se describen en más detalle a continuación.

Las líneas celulares tumorales se obtienen del Instituto Nacional del Cáncer. Todas las líneas celulares crecen como cultivos en monocapa en una atmósfera de humedad con 5% de C02, 95% de aire y 37 grados centígrados en los medios completos: medio RPMI-1640 (Gibco) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FCS) (Hyclone), 2 mM de L-glutamina (Gibco) y las unidades/ mi Pen-Estrep (Gibco).

Los niveles de expresión de los receptores se cuantifican mediante el kit816A Quantum Simply (Cellular (Bangs Laboratories), lo que permite cuantificar los niveles de expresión del receptor por qFACS. Este contiene una serie de cuatro poblaciones de microesferas marcadas con cantidades variables de IgG de carnero anti-humano más una población blanco. La IgG conjugada a la superficie de las perlas es específica para las partes Fe de los anticuerpos IgG. Las perlas se tiñen al igual que las muestras de células, y con el mismo anticuerpo. Cada una de las diferentes poblaciones de las microesferas se une a una cantidad conocida del anticuerpo monoclonal marcado. Al representar cada intensidad de la fluorescencia de la población frente a su valor asignado de capacidad de unión al anticuerpo (ABC), una curva ABC estándar se genera y el ABC de las muestras de células teñidas se determina de manera fácil mediante el software proporcionado por Bangs Laboratories (QuickCal v 2.3). Este programa toma en consideración la marca del instrumento usado, el voltaje para esa muestra y el fluorocromo usado.

Los niveles de expresión de BTC se miden por ELISA mediante el kit R&D Systems Dy261 DuoSet-IC Betacelulina humana. Una placa de 384 pocilios se recubre con 4 µg/ml de anticuerpo de captura. La placa de 384 pocilios se bloquea por adicionar 50 µ? de BSA 2%/PBS IX (sin-Tween-20) durante 1 hora y se prepara una curva estándar recombinante. Después de lavar las placas, 16 µ? de Usados celulares se adicionan, así como un anticuerpo de detección Anti-Fosfo-Tirosina-HRP (peroxidasa de rábano picante), a continuación de una incubación durante 2 horas. Por último 20 µ? de sustrato Pico luminiscente se adiciona y las placas se leen por espectrofotómetro.

Como los ensayos disponibles en el comercio para medir los niveles de expresión de la proteína HRG-ß 1 no fueron sensibles de manera suficiente para obtener datos fiables para las líneas celulares examinadas, los niveles de ARNm de HRG-ß 1 se cuantifican para las líneas celulares de interés. El ARN se aisla de los Usados celulares mediante el protocolo RNeasy Mini (74104 RNEASY KIT de QUIAGEN). Después de convertir el ARN aislado a ADNc y hacer una mezcla maestra para el PCR cuantitativo (QPCR) mediante el mezclador de Applied Biosystems 430443 7 Tagman Master, el QPCR se ejecuta y cuantifica la expresión del ARNm de HRG-ß en relación con los niveles de ARNm en las células ZR75-1. Los cebadores para el QPCR se compraron a Applied Biosystems.

Los niveles de fosforilación de ErbB3 para las diferentes líneas celulares que se muestra en la Tabla 2 se determinan mediante el kit de ELISA pErbB3 de R&D (Dyc 1769-2 DuoSet-IC human phospho-ErbB3), mediante los métodos descritos anteriormente en el Ejemplo 2 o variaciones mínimas de estos.

La Tabla 2, a continuación, resume la información del nivel de expresión del receptor y ligando de las diferentes líneas celulares que se obtiene mediante los métodos descritos anteriormente o por variaciones mínimas de estos, cuya información se usó en la construcción del modelo computacional de la vía de señalización de ErbB. La columna 1 muestra el nombre de la línea celular; la columna 2 muestra el tipo de tumor; las columnas 3-5 muestran el número de receptores por célula para ErbBl, ErbB2 y ErbB3, respectivamente; la columna 6 muestra los niveles de ARNm de la HRG-ß?, que se expresan según las veces que se compara con los niveles de ARNm en células ZR-75; y las columnas 7 y 8 muestran la cantidad de BTC y pErbB3 presente en las células, expresados como pg/célula.

Tabla 2;Sumario de los niveles de expresión del receptor y ligando para las líneas celulares usadas en experimentos de xenoinjerto Para la preparación del modelo computacional, se usó un conjunto de datos que comprende las matrices de dosis-tiempo en las que se miden por ELISA la fosforilación de ErbBl, ErbB2, ErbB3 y AKT en múltiples intervalos de tiempo y a nueve concentraciones diferentes de estimulación para BTC o HRG en las células ADRr. Para la estimulación de las células, las células se siembran en 100 µ? de medios completos con 35,000 células por pocilio en placas de cultivo de tejido de 96 pocilios y se incuban toda la noche en una atmósfera de humedad de 5% de C02, 95% de aire y 37 grados centígrados. Las células se cambian después a los medios libres de suero: medios RPMI-1640 (Gibco) suplementado con, 2 mM de L- glutamina (Gibco) y las unidades/ml de Pen-Estrep (Gibco). Las células desnutridas se incuban en una atmósfera de humedad con 5% de C02, 95% de aire y 37 grados centígrados durante 20-24 horas previo a la estimulación. Para los estudios de la matriz tiempo-dosis, las células se estimulan con el ligando (BTC o HRG) a los 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 20, 30, 60 y 120 minutos. Después de la estimulación con 9 concentraciones diferentes de HRG (0.038 nM-250 nM) y BTC (0-700 nM) para cada plazo de tiempo, las células se colocan en hielo, se lavan con PBS frío, se lisan después en 30 µ? de tampón de extracción para proteína de mamíferos M-PER frío (Thermo Scientific, Catálogo # 78501), suplementado con cóctel de inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich, P2714), 1 mM de ortovanadato de sodio (Sigma-Aldrich, S6508), 5 mM de pirofosfato de sodio (Sigma-Aldrich, 221368), 50 µ? de oxofenilarsina (EMD Biosciences, 521000) y 10 µ? de bpV (fen) (EMD Biosciences, 203695).

Los niveles de fosforilación de la proteína en las células estimuladas se miden por ELISA. Los anticuerpos de captura contra ErbBl (R & D Systems, AF231), ErbB2 (R & D Systems, MAB1129), ErbB3 (R & D Systems, MAB3481) y AKT (Upstate, 05-591MG) se incuban en placas oscuras de alta unión de poliestireno con 384 pocilios de fondo plano (Corning, Catálogo # 3708) toda la noche a temperatura ambiente. Las placas ELISA se bloquean con 2% de albúmina de suero bovino (BSA) y tampón fosfato salino (PBS) durante una hora y después se incuban con Usados diluidos en 2% de BSA, 0.1% Tween-20 y PBS durante dos horas a temperatura ambiente. Entre cada incubación, las placas se lavan tres veces con 0.05% de Tween-20 en PBS. Los ELISA para medir el fosfo-ErbBl, fosfo-ErbB2 y fosfo-ErbB3 se incuban con peroxidasa de rábano picante fosfo-tirosina (HRP) unida al anticuerpo monoclonal (R & D Systems, HAM1676) durante dos horas. Los ELISA que miden fosfo-AKT se incuban con el anticuerpo monoclonal primario de ratón anti-fosfo AKT específico a la serina 473 (Cell Signaling Technologies, Catálogo # 5102) durante 2 horas, se incuban después con estreptavidina-HRP (R & D Systems, Catálogo # DY998,) durante 30 minutos. Todos los ELISA se visualizan con el sustrato quimioluminiscente SuperSignal ELISA Pico (Pierce, Catálogo # 37069) y la señal luminosa se mide mediante un luminómetro.

Los resultados (obtenidos mediante los métodos descritos anteriormente o variaciones mínimas de estos) para el conjunto de datos de la fosforilación de la proteína en múltiples intervalos de tiempo y nueve concentraciones diferentes de BTC o HRG se muestran en las Figuras 5A-5B, donde la Figura 5A muestra los niveles de fosfo- ErbB3, fosfo- ErbB2, fosfo-ErbB3 y fosfo-AKT para las células estimuladas con HRG y la Figura 5B muestra los niveles de fosfo-ErbB3, fosfo-ErbB2, fosfo-ErbB3 y fosfo-AKT para las células estimuladas con BTC. Este conjunto de datos se usa para calibrar el modelo computacional de la vía de señalización de ErbB para que los resultados de la simulación (líneas) describan los datos experimentales (puntos) que se muestran en las Figuras 5A-5B.

La información adicional sobre el desarrollo de un modelo computacional de la red de señalización del receptor ErbB se proporciona a continuación: Estructura del modelo El modelo de la red de señalización del receptor ErbB consiste de tres receptores (ErbBl, ErbB2, ErbB3), un receptor de la fosfatasa, fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K, que se une a los receptores) y componentes de la cascada de PI3K-AKT (fosfatidilinositol bifosfato, PIP2, proteína quinasa dependiente de fosfoinositida, PDK1, PTEN suprimido del cromosoma 10, PTEN, serina, proteína treonina quinasa también conocida como proteína quinasa B, AKT, la Proteína fosfatasa 2A, PP2A) (ver la Tabla 8 a continuación). Los dos ligandos de los receptores ErbB se incluyeron: heregulina (HRGl-ß), la que se une a ErbB3 y ErbB4 (no incluidos en el modelo porque de manera experimental los niveles de expresión de ErbB4 fueron muy difíciles de detectar en las líneas celulares (ver la Tabla 3 a continuación) y Betacelulina (BTC), la que se une de manera principal a ErbBl (Beerli, R.R. y Hynes, N.E. (1996) J. Biol. Chem. 271 :6071-6076; Jones, J.T. y otros, (1999) FEBS Lett. 447:227-231). Las reacciones cinéticas de acción de masas, que se enumeran en su totalidad en la Tabla l i a continuación, se convirtieron en ecuaciones diferenciales ordinarias mediante el Matlab Simbiology 2.3 (Mathworks, MA).

Se incluyeron en el modelo la dimerización inducida por ligando, la internalización, el reciclaje, y la degradación tal como se describe en la literatura para todos los homo y heterodímeros (Hendriks, B.S. y otros. (2003) J. Biol. Cfom278:23343-23351; Wang, Z. y otros, (1999) Mol. Biol. Cell 10:1621-1636). Las estabilidades del dímero del receptor, que usan la escala relativa como se publica en Shankaran, H. y otros, (2008) Biochem. Biophys. Res. Commun. 371 :220-224. se aplicaron, donde la co-expresión de ErbBl con ErbB2 o ErbB3 sesga la señalización a la superficie celular y retrasa la desregulación la señal y donde la co-expresión simultánea de ErbB 1-3 lleva a una abundancia de los heterodímeros ErbB2-ErbB3. Por lo tanto, los dímeros que contienen ErbB3 se internalizan y se degradan más lento que los homodímeros ErbB lo los heterodímeros ErbBl-ErbB2. La dimerización constitutiva también se incluyó, aunque no se asumió que los dímeros libres de ligando desencadenen ninguna señalización corriente abajo (Yu, X. y otros, (2002) Mol. Biol. Cell 13:2547-2557) y permanecen en la superficie celular. Los ligandos ErbB se unen con diferentes afinidades a homo y heterodímeros de ErbB (Teramura, Y. y otros, (2006), EMBO J. 25:4215-4222), pero para reducir el número de parámetros cinéticos que se estiman y describir los datos experimentales con el modelo más simple posible, se restringió la afinidad de unión de los ligandos como la misma para los homo y heterodímeros de ErbB.

Los receptores dimerizados experimentan la fosforilación rápida y activan las vías de corriente abajo a través de la unión de adaptadores de señalización a los sitios fosfotirosina en el receptor de la cola citoplasmática (Yarden Y. y Sliwkowski, M.X. (2001) Nat. Rev. Mol Cell. Biol. 2:127-137). Aquí, una cascada simplificada de PI3 -AKT se aplicó, por la que la PI3K se une de manera directa a los heterodímeros unidos al ligando, se activa la PIP2, que forma un complejo con PDK1 y AKT, que conduce a una fosforilación doble de AKT en dos pasos. El ErbB3 tiene seis sitios para la unión de PI3K, mientras que los otros receptores ErbB sólo tienen uno (Wallasch, C. y otros, (1995) EMBO J. 14:4267-4275; Soltoff, S.P. y otros. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:3550-3558). Aunque no se conoce si seis moléculas de PI3K se pueden unir de manera simultánea a ErbB3, la PI3K se activa de 10 a 20 veces más fuerte por el ErbB3 (Fedi, P. y otros, (1994) Mol. Cell. Biol. 14:492-500) que por los otros receptores. Existe también la evidencia de que la PI3K se une a ErbB3 con mayor afinidad que para otros receptores ErbB (Jones, R.B. y otros, (2006) Nature 439: 168-174). Nosotros incorporamos estos fenómenos en el modelo y se evitó la complejidad combinatoria de incluir seis sitios de unión, mediante la imposición de las siguientes estipulaciones en los dímeros que contienen ErbB3: una tasa de unión de PI3K mejorada; tasa de unión de PIP2 a PI3K mejorada, y tasa de activación de PIP3 mejorada. La PIP2 no está presente en los endosomas (Haugh, J.M. (2002) Mol. Interv. 2:292-307), de este modo, sólo los dímeros del receptor unidos a la membrana plasmática son capaces de activar PIP2 en el modelo. Las simulaciones iniciales aceleran la activación AKT muy lentamente, lo que hace necesario desactivar casi por completo la fosfatasa AKT antes de simular e incorporar un circuito de retroalimentación negativa por el que AKT activa su propia fosfatasa, un fenómeno descrito en otra parte (Camps, M. y otros, (1 98) Science2S : 1262- 1265). La cascada de MAPK se abandonó tanto por la sencillez como debido a nuestros recientes hallazgos de que la señalización AKT es insensible de manera relativa a las especies y los parámetros en la cascada de MAPK (Chen, W.W. y otros, (2009) Mol Syst. Biol. 5:239); por lo tanto, no se requiere la interferencia de MAPK-PI3K para describir la dinámica de señalización de AKT. Los valores iniciales de las especies se midieron de manera directa (receptores ErbB, PDK1, AKT), deducidos de la literatura (Birtwistle, M.R. y otros, (2007) Mol. Syst. Biol. 3:144; Hatakeyama, M. y otros, (2003) Biochem. J. 373:451-453) o se ajustaron a valores sin límites de velocidad.

Modelo de calibración Muchos de los parámetros de la velocidad de reacción se desconocen en el sistema celular que nosotros estudiamos y por lo tanto se tuvieron que estimar (ver la Tabla 10). Para evitar que se sesgue el punto de partida, todos los parámetros se ajustaron a los valores predeterminados (Aldridge, B.B. y otros, (2006) Nat. Cell. Biol. 8: 1195-1203). El número de parámetros estimados se limitó al realizar la estimación en dos etapas: en primer lugar el modelo se calibró contra los datos observados de forma experimental de la fosforilación del receptor ErbB; en segundo lugar, los parámetros sensibles a la fosforilación de AKT se optimizaron contra los datos experimentales. Los valores estimados se aceptaron sólo si los parámetros se limitaron según las corridas de múltiples parámetros mediante un algoritmo genético con un tamaño de población de 50 y 25 generaciones (Mathworks, MA). Las constantes de velocidad de la unión del ligando de HRGl-ß y BTC se estimaron por separado mediante K<is conocidos (Tzahar, E. y otros. (1996) Mol. Cell. Biol. 16:5276-5287; Singer, E. y otros, (2001) J Biol. CAem.276:44266-44274; Jones, J.T. y otros, (1999) FEBS Lett. 447:227-231) y las curvas iniciales de dosis respuesta para aproximar una tasa de unión adelantada de 1 x 105M"1s"1 para ambos ligandos. Los análisis de la capacidad de respuesta (Mathworks, MA) se realizaron para identificar los parámetros que influyeron de manera fuerte en las actividades de ErbBl, ErbB2, ErbB3, y la fosforilación de AKT con HRGl-ß o la estimulación de BTC (ver la Tabla 11). Se dejó que cada parámetro variara por separado, mientras que el sistema se estimuló, ya sea con InM de HRGl-ß o BTC. Las capacidades de respuesta normalizadas de cada especie se integraron durante las dos horas de estimulación, y los parámetros con la capacidad de respuesta normalizada e integrada mayor que un umbral arbitrario de 1000 se listan en la Tabla l i a continuación. Como se mencionó anteriormente, la fosforilación ErbB4 no se incluyó en la estimación del parámetro porque la línea celular estudiada apenas tenía ErbB4 detectable (ver la Tabla 3). Las reacciones ErbB4 se indican de acuerdo con las reacciones ErbB3.

Los perfiles de fosforilación del receptor ErbB fueron sensibles a la dimerización, la internalización, el reciclaje, y los parámetros de degradación (reacciones enzimáticas, la disociación del dímero, y las constantes de velocidad de la fosfatasa no fueron sensibles). Estos parámetros se ajustaron mediante un conjunto de datos de alta densidad. Cada lectura se normalizó a la activación máxima alcanzada por cualquiera ligando, lo que preserva la potencia relativa de cada ligando. Las tasas de la dimerización del receptor ErbB se limitaron de manera fuerte y se observó que las relaciones de los parámetros igualaron los hallazgos de la literatura: ErbB2 es la pareja de dimerización preferida para ErbBl unido al ligando o ErbB3 unido al ligando (más notable con la estimulación de heregulina). A partir de los datos disponibles, no fue posible limitar las tasas de reciclaje y de internalización, por lo tanto, las tasas de reciclaje se ajustaron a 0.005s'1 y sólo se fijaron las tasas de internalización. Las observaciones que resultan, por lo tanto, se aplican por igual a las tasas de reciclaje (en lo contrario). Las tasas de internalización variadas se basan en el estímulo del ligando, con los dímeros unidos a HRGl-ß- que exhiben la internalización mucho más lenta que los heterodímeros unidos a BTC y homodímeros unidos a BTC, un punto de vista que se soporta en otra parte (Sorkin, A. y Goh, L.K. (2008) Exp. Cell Res. 314:3093-3106) Las tasas de degradación también se limitaron bien, pero fueron similares para todos los dímeros, lo que sugiere que las tasas individuales de degradación del dímero no se requieren para explicar los datos observados. La A T fosforilada es sensible a muchos parámetros dentro de la cascada de PI3K y a nivel del receptor (ver la Tabla l i a continuación). Por lo tanto, se limitó la calibración de los parámetros del modelo que se encontraban en la cascada de PI3K-AKT y se preparó en contra del curso de tiempo de la fosforilación de AKT, mientras se fijaron los valores de los parámetros ya preparados en los perfiles de los receptores ErbB.

Siguiendo con la preparación del modelo, se realizó el ajuste manual, local, de los parámetros para descifrar el impacto de cada parámetro, para determinar si la mejora adicional era posible, y para restringir los parámetros a valores biológicos convincentes. Para la estandarización, los parámetros se redondearon y se condensaron a valores similares cuando se conservan a través de un tipo de parámetro (como se explica en las tasas de degradación).

Aplicación del Inhibidor Los inhibidores de la red de ErbB se incluyeron en el modelo mediante la interpretación más simple de los mecanismos de acción conocidos (ver la Tabla 12 a continuación): el anticuerpo monoclonal Ab#6 anti-ErbB3 secuestra ErbB3 por la prevención de la unión del ligando e induce la internalización y la degradación; cetuximab secuestra ErbBl y previene la unión del ligando; lapatinib inhibe la activación de los receptores ErbB pero no la dimerización o la unión del ligando; y pertuzumab bloquea la dimerización de ErbB2. Para Ab #6, las constantes de velocidad medida por Kinexa se usaron y para los otros inhibidores las constantes de velocidad reportadas en la literatura (Wood, E.R. y otros, (2004) Cáncer Res.64:6652-6659; Patel, D. y otros, (2007) Anticancer Res. 27:3355-3366; Adams, C.W. y otros, (2006) Cáncer Immunol. Immunother.55:717-727) y se listan en la Tabla 13 a continuación se usaron; los parámetros de cetuximab se confirmaron en experimentos por Kinexa.

Varias informaciones adicionales usadas en el desarrollo del modelo computacional de la vía de señalización de ErbB se divulgan a continuación en las Tablas 3-13, como sigue: Tabla 3: Expresión del receptor ErbB y estado de la mutación medidos para las líneas celulares investigadas.

ND - no detectable #-medido por qFACS * Sitio web usado para determinar el estado de la mutación de las líneas celulares investigadas -ht^://www.sanger.ac.uk/perl/genetics/CGP/core_line_viewer?action=nci60_list Tabla 4: Caracterización de las curvas de respuesta para la dosis de fosforilación de ErbBl para ligandos de unión ErbBl y HRGl-ß. pErbBI NCI-ADRr % estimulación a 5 min en relación al máximo EGF EC50 [nM] 6.0 100.0 95% CI 2.5-14 HB-EGF EC50 [nM] 21.0 87.0 95% CI 12-38 Epigen EC50 [nM] ND 12.0 95% CI AR EC50 [nM] 37.0 95.0 95% CI 21 -68 BTC EC50 [nM] 5.7 100.0 95% CI 2.3-14 TGFa EC50 [nM] 30.0 1 Ó0.0 95% CI 10-87 Epiregulina EC50 [nM] ND 9.0 95% CI HRGI -ß EC50 [nM] ND 0.0 ND: no se pudo determinar CI: Intervalo de confidencia 95% Tabla 5: Caracterización de las curvas de respuesta para la dosis de fosforilación de ErbB2 para ligandos de unión ErbBl y HRGl-beta pErbB2 NCI-ADRr % estimulación a 5 min en relación al máximo EGF EC50 [nM] 27.0 100.0 95% CI 15-51 HB-EGF EC50 [nM] 230.0 94.0 95% CI 74-730 Epigen EC50 [nM] ND 25.0 95% CI AR EC50 [nM] ND 54.0 95% CI BTC EC50 [nM] 27.0 94.0 95% CI 4-190 TGFa EC50 [nM] 41.0 36.0 95% CI 20-86 Epiregulina EC50 [nM] ND 18.0 95% CI HRGI-ß EC50 [nM] 7.0 43.0 95% CI 2.1-23 ND: no se pudo determinar CI: Intervalo de confidencia 95% Tabla 6: Caracterización de las curvas de respuesta para la dosis de fosforilación de para ligandos de unión ErbBl y HRGl-beta pErbB3 NCI-ADRr % estimulación a 5 min en relación al máximo EGF EC50 [nM] ND 7.0 95% CI HB-EGF EC50 [nM] ND 32.0 95% CI Epigen EC50 [nM] ND 3.0 95% CI AR EC50 [nM] 380.0 17.0 95% CI 240-600 BTC EC50 [nM] 100.0 35.0 95% CI 47-220 TGFa EC50 [nM] ND 9.0 95% CI Epiregplina EC50 [nM] ND 22.0 95% CI HRGI-ß EC50 [nM] 9.9 100.0 95% CI 7.9-12 ND: no se pudo determinar CI: Intervalo de confidencia 95% Tabla 7: Caracterización de las curvas de respuesta para la dosis de fosforilación de AKT para ligandos de unión ErbBl y HRGl-beta. pAKT NCI-ADRr » o estimulación a 5 min en relación al máximo EGF EC50 [nM] ND 26.0 95% CI HB-EGF EC50 [nM] ND 20.0 95% CI Epigen EC50 [nM] ND 11.0 95% CI AR EC50 [nM] 0.0 28.0 95% CI 0.064-27 BTC EC50 [nM] ND 22.0 95% CI TGFa EC50 [nM] ND 27.0 95% CI Epiregulina EC50 [nM] ND 11.0 95% CI HRGI-ß EC50 [nM] 1.9 100.0 95% CI 0.23-17.1 ND: no se pudo determinar CI: Intervalo de confidencia 95% Tabla 8: Cantidades iniciales de especies no cero en el modelo computacional.

Nombre de la Cantidad inicial Descripción adicional especie HRG variable Heregulina 5 BTC variable betacelulina El 178000 ErbBl E2 41000 ErbB2 E3 33000 ErbB3 Receptor tirosina quinad RT pase 500000 fosfatase PI3 800000 fosfatidilinositol 3-quinasa PIP2 700000 fosfatidilinositol bisfosfato PTEN eliminado del PTEN 350000 cromosoma 10 proteína quinasa dependiente PDK1 9500000 de fosfoinosítido Serina, treonina proteína AKT 900000 quinasa también conocida como proteína quinasa B Proteína fosfatase 2A (AKT PP2A 4000 fosfatasa) PP2Aoff 64000 AKT fosfatasa Inactiva Tabla 9: Sumario de las reacciones bioquímicas implementadas en el modelo computacional usando cinéticas de acción másica con los parámetros correspondientes Definición de las abreviaturas usadas: indica un complejo de proteína, por ejemplo, ligando unido al receptor _p indica que una proteína es fosforilada iy indica que una especie y es interiorizada <-> indica una reacción reversible -> indica una reacción irreversible Numero de la _ ., Parámetros Parámetros .. Reacción reacción directos inversos Unión del ligando vi HRG + E3 <-> [E3:HRG] kfl krl v2 HRG + [E2-.E3] <-> [E2:E3:HRG] kf2 kr2 v3 BTC + El <-> [BTC:E1] kf3 kr3 v4 BTC + [E1 :E1] <-> [BTC:E1 :E1] kf4 kr3 v5 BTC + [El :E2] <-> [BTC:E1 :E2] kf5 kr3 v6 BTC + [E1 :E3] <-> [BTC:E1 :E3] kf5 kr3 Dimerización v7 [E3:HRG] + E2 <-> [E2:E3:HRG] kf7 kr7 v8 [E3:HRG_p] + E2_p <-> [E2:E3:HRG_p] kf7 kr7 v9 [E3:HRG_p] + E2 -> [E2:E3:HRG_p] kf7 vlO [E3:HRG] + El <-> [E1:E3:HRG] kflO kr7 vll [E3:HRG_p] + El<-> [El:E3:HRG_p] kflO kr7 vl2 E2_p + E2 -> [E2:E2_p] kfl2 vl3 E2_p + E2_p <-> [E2:E2_p] kfl2 krl2 vl4 [BTC:E1] + El <-> [BTC:E1:E1] kfl4 krl4 vl5 [BTC:El_p] + E1 <-> [BTC:El:El_p] kfl4 krl4 vl6 [BTC:E1] + [BTC:E1] <-> [BTC:E1:E1:BTC] kfl6 krl6 vl7 [BTC:El_p] + [BTC:E1] <-> [BTC:El :El:BTC_p] kfl6 krl6 vl8 [BTC:El_p] + [BTC:El_p] <-> [BTC:El:El:BTC_p] kfl6 krl6 vl9 [BTC:E1] + E2 <-> [BTC:E1:E2] kfl9 krl9 v20 [BTC:E1] + E2_p -> [BTC:El:E2_p] kfl9 v21 [BTC:El_p] + E2_p <-> [BTC:El:E2_p] kfl9 krl9 v22 [BTC:El_p] + E2 -> [BTC:El:E2_p] kfl9 v23 [BTC:E1] + E3 <-> [BTC:E1:E3] kf23 krl9 v24 [BTC:El_p] + E3 <-> [BTC:El:E3_p] kf23 krl9 v25 E3 + E2 <-> [E2:E3] kfl2 krl2 v26 E3 + E1 <->[El:E3] kfl2 krl2 v27 E1+E2<->[E1:E2] kfl2 krl2 v28 El + El <->[El:El] kfl2 krl2 v29 E2 + E2 <-> [E2:E2] kfl2 krl2 Fosforilación y desfosforilación v30 [E2:E3:HRG] -> [E2:E3:HRG_p] kf30 v31 [E1:E3:HRG] -> [El:E3:HRG_p] kf30 v32 [BTC:E1:E1] -> [BTC:El:El_p] kOO v33 [BTC:E1:E1:BTC] -> [BTC:El:El:BTC_p] kf30 v34 [BTC:E1:E2] -> [BTC:El:E2_p] kfiO v35 [BTC:E1:E3] -> [BTC:El:E3_p] kf30 v36 [E3:HRG_p] -> HRG + E3 krl v37 [BTC:El_p] ->BTC + E1 kr3 v38 [E2:E3:HRG_p] + RT pase <-> [E2:E3 :HRG_p:RTKpase] kf38 kr38 v39 [El:E3:HRG_p] + RTKpase <-> [El :E3:HRG_p:RTKpase] kf38 kr38 v40 [BTC:El:El_p] + RTKpase <-> [BTC:El:El_p:RTKpase] kD8 kr38 [BTC:El:El:BTC_p] + RTKpase <-> v41 kf38 kr38 [BTC:E1:E1:BTC p:RTKpasel v42 [BTC:El:E2_p] + RTKpase <-> [BTC:El:E2_p:RT pase] kfi8 kr38 v43 [BTC:El:E3_p] + RTKpase <-> [BTC:El:E3_p:RTKpase] kfi8 kr38 v44 [E2:E2_p] + RTKpase <-> [E2:E2_p:RTKpase] kfi8 kr38 v45 [E2:E3:HRG_p:RTKpase] -> [E2:E3:HRG] + RTKpase kf45 v46 [El :E3:HRG_p:RTKpase] -> [E1:E3:HRG] + RTKpase kf45 v47 [BTC.El:El_p:RTKpase] -> [BTC:E1:E1] + RTKpase kf45 [BTC:El:El:BTC_p:RTKpase] -> [BTC:E1:E1:BTC] + v48 kf45 RTKpase v49 [BTC:El:E2_p:RTKpase] ->' [BTC:E1:E2] + RTKpase kf45 v50 [BTC:El:E3_p:RTKpase] -> [BTC:E1:E3] + RTKpase kf45 v51 [E2:E2_p:RTKpase] -> [E2:E2] + RTKpase kf45 Unión PI3Ky activación PIP2 v52 [E2:E3:HRG_p] + PI3K <-> [E2:E3:HRG_p:PI3K] kf52 kr52 v53 [El:E3:HRG_p] +PI3K <-> [El:E3:HRG_p:PI3K] kf52 kr52 v54 [E2:E2_p] + PI3K <-> [E2:E2_p:PI3K] kf54 kr54 v55 [BTC:El:El_p] + PI3K <-> [BTC:El:El_p:PI3K] kf54 kr54 [BTC:El:El:BTC_p] + PI3K <-> v56 kf54 kr54 fBTC:El:El:BTC p:PI3Kl v57 [BTC:El:E2_p] + PI3K <-> [BTC:El:E2_p:PI3K] kf54 kr54 v58 [BTC:El:E3_p] + PI3K <-> [BTC:El:E3_p:PI3K] kf52 kr52 [E2:E3:HRG_p:PI3K] + PIP2 <-> v59 kf59 kr59 [E2:E3:HRG p:PI3K:PIP2] [El:E3:HRG_p:PI3K] + PIP2 <-> v60 kf59 kr59 [E1:E3:HRG p:PI3K:PIP2] v61 [E2:E2_p:PI3K] +PIP2 <-> [E2:E2_p:PI3K:PIP2] kf61 kr61 [BTC:El:El_p:PI3K] + PIP2 <-> v62 kf61 kr61 [BTC:E1:E1 p:PI3K:PIP2] [BTC:El:El:BTC_p:PI3K] + PIP2 <-> v63 kf61 kr61 [BTC:E1:E1:BTC p:PI3K:PIP21 [BTC:El:E2_p:PI3K] + PIP2 <-> v64 kf61 kr61 [BTC:E1:E2 p:PI3K:PIP2] [BTC:El:E3_p:PI3K] + PIP2 <-> v65 kf59 kr59 [BTC:E1:E3 p:PI3K:PIP2] v66 [E2:E3:HRG_p:PI3K:PIP2] -> [E2:E3:HRG_p:PI3K] +PIP3 kf66 v67 [El:E3:HRG_p:PI3K:PIP2] -> [El:E3:H G_p:P13K] +PIP3 kf66 v68 [E2:E2_p:PI3K:PIP2] -> [E2:E2_p:PI3K] + PIP3 kf68 v69 [BTC:El:El_p:PI3K:PIP2] -> [BTC:El:El_p:PI3K] + PIP3 kf68 [BTC:El:El:BTC_p:PI3K:PIP2] -> v70 kf68 [BTC:E1:E1:BTC p:PI3K] + PIP3 v71 [BTC:El:E2_p:PI3K:PIP2] -> [BTC:El:E2_p:PI3K] + PIP3 kf68 v72 [BTC:El:E3_p:PI3K:PIP2] -> [BTC:El:E3_p:PI3K] + PIP3 kf66 Cascada de activación AKT v73 PIP3 + PTEN <-> [PIP3-.PTEN] kf73 kr73 v74 [PIP3:PTEN] -> PIP2 + PTEN kf74 v75 PIP3 + AKT <-> [PIP3:AKT] kf75 kr75 v76 [PIP3:AKT] + PDK1 <-> [PIP3:AKT:PDK1] kf76 kr76 v77 [PIP3:AKT:PDK1] -> AKT_p + [PIP3:PDK1] kf77 v78 [PIP3:PDK1] -> PIP3 + PDK1 kf78 v79 PIP3 + AKT_p <-> [PlP3:AKT_p] kf75 kr75 v80 [PIP3:AKT_p] + PDKl <-> [PIP3:AKT_p:PDKl] kf76 kr76 v81 [PIP3:AKT_p:PDKl] -> AKT_p_p + [PIP3:PDK1] kf81 v82 AKT_p_p + PP2A <-> [AKT_p_p:PP2A] kf82 kr82 v83 [AKT_p_p:PP2A] -> AKT_p + PP2A kf83 v84 AKT_p + PP2A <-> [AKT_p:PP2A] kf82 kr82 v85 [AKT_p:PP2A] -> AKT + PP2A kf83 v86 AKT_p_p + PP2Aoff <-> [AKT_p_p:PP2Aoff] kf86 kr86 v87 [AKT_p_p:PP2Aoff] -> AKT_p_p + PP2A kf87 Internalización v88 [E3:H G] <-> [iE3:HRG] kf88 kr88 v89 [E3:HRG_p] <-> [iE3:HRG_p] kf88 kr88 v90 E2_p <-> iE2_p kf88 kr88 v91 [BTC:E1] <-> [iBTC:El] kf88 kr88 v92 [BTC:El_p] <-> [iBTC:El_p] kf88 kr88 v93 [E2:E3:HRG] <-> [iE2:E3:HRG] kf93 kr93 v94 [E2:E3:HRG_p] <-> [iE2:E3:HRG_p] kf93 kr93 v95 [E2 : E3 : HRG_p : RTKpase] <-> [iE2:E3:HRG_p:RTKpase] kf93 kr93 v96 [E2:E3:HRG_p:PI3K] <-> [iE2:E3:HRG_p:PI3K] kf93 kr93 v97 [E2:E3:HRG_p:PI3K:PIP2] <-> [iE2:E3:HRG_p:PI3K:PIP2] kf93 kr93 v98 [E1 :E3:HRG] <-> [iEl:E3:HRG] kf98 kr98 v99 [El :E3:HRG_p] <-> [iEl :E3:HRG_p] kf98 kr98 vlOO [El :E3:HRG_p:RTKpase] <-> [iEl :E3:HRG_p:RTKpase] kf98 kr98 vlOl [El :E3:HRG_p:PI3K] <-> [iEl:E3:HRG_p:PI3K] kf98 kr98 vi 02 [El :E3:HRG_p:PI3K:PIP2] <-> [iEl :E3:HRG_p:PI3K:PIP2] kf98 kr98 vl03 [E2:E2_p] <-> [iE2:E2_p] kf93 kr93 vl04 [E2:E2_p:RTKpase] <-> [iE2:E2_p:RTKpase] kfí>3 kr93 vl05 [E2:E2_p:PI3K] <-> [iE2:E2_p:PI3K] kf93 kr93 vl06 [E2:E2_p:PI3K:PIP2] <-> [iE2:E2_p:PI3K:PIP2] kf93 kr93 vl07 [BTC:E1:E1] <-> [iBTC:El:El] kfl07 krl07 vi 08 [BTC:E1:E1:BTC] <-> [iBTC:El:El:BTC] kfl07 krl07 vl09 [BTC:El:El_p] <-> [iBTC:El:El_p] kfl07 krl07 vllO [BTC:El:El:BTC_p] <-> [iBTC:El:El:BTC_p] kfl07 krl07 vlll [BTC:El:El_p:RT pase] <-> [iBTC:El:El_p:RTKpase] kfl07 krl07 [BTC:El:El:BTC_p:RTKpase] <-> vll2 kfl07 krl07 [iBTC:El:El:BTC p:RTKpase] vll3 [BTC:El:El_p:PI3 ] <-> [iBTC:El:El_p:PI3K] kfl07 krl07 vll4 [BTC:El:El:BTC_p:PI3K] <-> [iBTC:El:El:BTC_p:PI3K] kfl07 krl07 vll5 [BTC:El:El_p:PI3K:PIP2] <-> [iBTC:El:El_p:PI3K:PIP2] kfl07 krl07 [BTC:El:El:BTC_p:PI3K:PIP2] <-> vll6 kfl07 krl07 [iBTC:El:El:BTC p:PI3K:PIP21 vll7 [BTC:E1:E2] <-> [iBTC:El:E2] kfll7 krl 17 vll8 [BTC:El:E2_p] <-> [iBTC:El:E2_p] kfl 17 krll7 vll9 [BTC:El:E2_p:RTKpase] <-> [iBTC:El:E2_p:RT pase] kfll7 krll7 vl20 [BTC:El:E2_p:P13K] <-> [iBTC:El:E2_p:PI3K] kfl 17 krl 17 vl21 [BTC:El:E2_p:PI3 :PIP2] <-> [iBTC:El:E2_p:PI3K:PIP2] kfl 17 krl 17 vl22 [BTC:E1:E3] <-> [iBTC:El:E3] kfl 17 krll7 vl23 [BTC:El:E3_p] <-> [iBTC:El:E3_p] kfl 17 krl 17 vl24 [BTC:El:E3_p:RTKpase] <-> [iBTC:El:E3_p:RTKpase] kfl 17 krll7 vl25 [BTC:El:E3_p:PI3K] <-> [iBTC:El:E3_p:PI3K] kfl 17 krll7 vl26 [BTC:El:E3_p:PI3K:PIP2] <-> [iBTC:El:E3_p:PI3K:PIP2] kfl 17 krll7 Unión al ligando endosomal vl27 iHRG + iE3<->[iE3:HRG] kfl 27 krl vl28 iHRG + [iE2:E3] <-> [¡E2:E3:HRG] kfl 27 krl vl29 iBTC + ¡El <-> [iBTC:El] kfl 29 kr3 vl30 iBTC + [iEl:El] <-> [iBTC:El:El] kfl 29 kr3 vl31 iBTC + [iEl:E2] <-> [iBTC:El:E2] kfl 29 kr3 vl32 iBTC + [iEl:E3] <-> [iBTC:El:E3] kfl 29 kr3 Dimerización endosomal vl33 [iE3:HRG] + iE2 <-> [iE2:E3:HRG] kf7 kr7 vl34 [iE3:HRG_p] + iE2_p <-> [iE2:E3:HRG_p] kf7 kr7 vl35 [iE3:HRG_p] + iE2 -> [iE2:E3:HRG_p] kf7 vl36 [iE3:HRG] + iEl <-> [iEl:E3:HRG] kflO kr7 vl37 [iE3:HRG_p] + iEl <-> [iEl:E3:HRG_p] kflO kr7 vl38 iE2_p + iE2 -> [iE2:E2_p] kfl2 vl39 iE2_p + iE2_p <-> [iE2:E2_p] kfl2 krl2 [¡BTC:E1] + ¡El <-> [iBTC:El:El] kfl4 krl4 vl41 [iBTC:El_p] + ¡El <-> [iBTC:El:El_p] kfl4 krl4 vl42 [iBTC:El] + [iBTC:El] <-> [iBTC:El:El:BTC] kfl6 krl6 vl43 [iBTC:El_p] + [iBTC:El] <-> [iBTC:El:El:BTC_p] kfl6 krl 6 vl44 [iBTC:El_p] + [iBTC:El_p] <-> [iBTC:El:El:BTC_p] kfl6 krl 6 vl45 [iBTC:El] + iE2 <-> [iBTC:El:E2] kfl9 krl9 vl46 [iBTC:El_p] + iE2 -> [iBTC:El:E2_p] kfl9 vl47 [iBTC:El] + iE2_p -> [iBTC:El:E2_p] kfl9 vl48 [iBTC:El_p] + iE2_p <-> [¡BTC:El:E2_p] kfl9 krl9 vl49 [iBTC:El] + iE3 <-> [iBTC:El:E3] kf23 krl9 vl50 [¡BTC:E1 _p] + ¡E3 <-> [iBTC:El:E3_p] kf23 krl9 vl51 ¡E3 + iE2 <-> [iE2:E3] kfl2 krl2 vi 52 ÍE3 + ÍE1 <-> [iEl:E3] kfl2 krl2 vl53 iEl + iE2 <-> [iEl:E2] kfl2 krl2 vl54 iEl + iEl <-> [iEl:El] kfl2 krl2 vl55 iE2 + iE2 <-> [iE2:E2] kfl2 krl2 Fosforilación y desfosforilación endosomal vl56 [iE2:E3:HRG] -> [iE2:E3:HRG_p] kf30 vl57 [iEl:E3:HRG] -> [íEl:E3:HRG_p] kfiO vl58 [iBTC:El:El] -> [iBTC:El:El_p] kOO vl59 [iBTC:El:El:BTC] -> [iBTC:El:El:BTC_p] kOO vl60 [iBTC:El:E2] -> [iBTC:El:E2_p] kfiO vlól [iBTC:El:E3] -> [iBTC:El:E3_p] kf30 vl62 [iE3:HRG_p] -> iHRG + iE3 krl vl63 [iBTC:El_p] -> iBTC + iEl kr3 vl64 [iE2:E3:HRG_p] + RTKpase <-> [iE2:E3:HRG_p:RTKpase] kf38 kr38 vi 65 [iEl:E3:HRG_p] + RTKpase <-> [iEl:E3:HRG_p:RTKpase] kfi8 kr38 vl66 [iE2:E2_p] + RTKpase <-> [iE2:E2_p:RTKpase] kfi8 kr38 vl67 [iBTC:El:El_p] + RTKpase <-> [iBTC:El:El_p:RTKpase] kfi8 kr38 [iBTC:El:El:BTC_p] + RTKpase <-> vl68 kf38 kr38 [iBTC:El:El:BTC p:RTKpase] vl69 [iBTC:El:E2_p] + RTKpase <-> [iBTC:El:E2_p:RTKpase] kf38 kr38 vl70 [iBTC:El:E3_p] + RTKpase <-> [iBTC:El:E3_p:RTKpase] k08 kr38 vl71 [iE2:E3:HRG_p:RTKpase] -> [iE2:E3:HRG] + RTKpase kf45 vl72 [iEl:E3:HRG_p:RTKpase] -> [iEl:E3:HRG] + RTKpase kf45 vi 73 [iE2:E2_p:RTKpase] -> [iE2:E2] + RTKpase kf45 vl74 [iBTC:El:El_p:RTKpase] -> [iBTC:El:El] + RTKpase kf45 [iBTC:El:El:BTC_p:RTKpase] -> [iBTC:El:El:BTC] + vl75 kf45 RTKpase vi 76 [iBTC:El:E2_p:RTKpase] -> [iBTC:El:E2] + RTKpase kf45 vl77 [iBTC:El:E3_p:RTKpase] -> [iBTC:El:E3] + RTKpase kf45 Unión PI3K endosomal vl78 [iE2:E3:HRG_p] + PI3K <-> [iE2:E3:HRG_p:PI3K] kf52 kr52 vl79 [iEl:E3:HRG_p] + PI3K <-> [iEl:E3:HRG_p:PI3K] kf52 kr52 vl80 [iE2:E2_p] + PI3K <-> [iE2:E2_p:PI3K] kf54 kr54 vl81 [iBTC:El:El_p] + PI3K<-> [iBTC:El:El_p:PI3K] kf54 kr54 [iBTC:El:El:BTC_p] + PI3K <-> vl82 kf54 kr54 [iBTC:El:El:BTC p:PI3K] vl83 [iBTC:El:E2_p] + PI3K <-> [iBTC:El:E2_p:PI3K] kf54 kr54 vl84 [iBTC:El:E3_p] + PI3K <-> [iBTC:El:E3_p:PI3K] kf52 kr52 Degradación vl85 iHRG -> dHRG kfl85 vl86 iBTC -> dBTC kfl85 vl87 [iE3:HRG] -> [dE3:HRG] kfl87 vl88 [iBTC:El] -> [dBTC:El] kfl87 vl89 [iE3:HRG_p] -> [dE3:HRG_p] kfl87 vl90 [iBTC:El_p] -> [dBTC:El_p] kfl87 vl91 iE2_p -> dE2_p kfl87 vl92 [iE2:E3:HRG] -> [dE2:E3:HRG] kfl92 vl93 [iE2:E3:HRG_p] -> [dE2:E3:HRG_p] kfl92 vl94 [iE2:E3:HRG_p:RTKpase] -> [dE2:E3:HRG_p:RTKpase] kfl92 vl95 [iE2:E3:HRG_p:PI3K] -> [dE2:E3:HRG_p:PI3K] kfl92 vl96 [iE2:E3:HRG_p:PI3K:PIP2] -> [dE2:E3:HRG_p:PI3K:PIP2] kfl92 vl97 [iE2:E2_p] -> [dE2:E2_p] kfl 2 vl98 [iE2:E2_p:RTKpase] -> [dE2 :E2_p: RTKpase] kfl92 vl99 [iE2:E2_p:PI3K] -> [dE2:E2_p:PI3K] kfl92 v200 [iE2:E2_p:PI3K:PIP2] -> [dE2:E2_p:PI3K:PIP2] kfl92 v201 [iEl:E3:HRG] -> [dEl:E3:HRG] kf201 v202 [iEl :E3:HRG_p] -> [dEl:E3:HRG_p] kf201 v203 [iEl:E3:HRG_p:RTKpase] -> [dE 1 :E3 :HRG_p:RTKpase] kf201 v204 [iEl:E3:HRG_p:PI3K] -> [dEl:E3:HRG_p:PI3K] k£201 v205 [iEl:E3:HRG_p:PI3K:PIP2] -> [dEl:E3:HRG_p:PI3K:PIP2] kf201 v206 [¡BTC:E1:E1] -> [dBTC:El:El] kf206 v207 [iBTC:El:El_p] -> [dBTC:El:El_p] kf206 v208 [iBTC:El:El_p:RTKpase]-> [dBTC:El:Elj5:RTKpase] kf206 v209 [iBTC:El:El_p:PI3K] -> [dBTC:El:El_p:PI3K] kf206 v210 [iBTC:El:El_p:PI3 :PIP2] -> [dBTC:El:El_p:PI3 :PIP2] kf206 v211 [iBTC:El:El:BTC] -> [dBTC:El:El:BTC] kf206 v212 [iBTC:El:El:BTC_p] -> [dBTC:El:El:BTC_p] kG06 [iBTC:El:El:BTC_p:RTKpase] -> v213 kf206 [dBTC:El:El:BTC p:RTKpasel v214 [iBTC:El:El:BTC_p:PI3K] -> [dBTC:El:El:BTC_p:PI3K] kf206 [iBTC:El:El:BTC_p:PI3K:PIP2] -> v215 kf206 fdBTC:El:El:BTC p:PI3K:PIP21 v216 [iBTC:El:E2] -> [dBTC:El:E2] kf201 v217 [iBTC:El:E2_p] -> [dBTC:El:E2_p] kf201 v218 [iBTC:El:E2_p:RTKpase] -> [dBTC:El:E2_p:RTKpase] kf201 v219 [iBTC:El:E2_p:PI3 ] -> [dBTC:El:E2_p:PI3K] kOOl v220 [iBTC:El:E2_p:PI3 :PIP2] -> [dBTC:El:E2_p:PI3K:PIP2] kOOl v221 [iBTC:El:E3] -> [dBTC:El:E3] kf201 v222 [iBTC:El:E3_p] -> [dBTC:El:E3_p] k£201 v223 [iBTC:El:E3_p:RTKpase] -> [dBTC:El:E3_p:RTKpase] kf201 v224 [iBTC:El:E3_p:PI3 ] -> [dBTC:El:E3_p:PI3K] kf201 v225 [iBTC:El:E3_p:PI3K:PIP2] -> [dBTC:El:E3_p:PI3K:PIP2] kf201 Tabla 10: Descripción de los parámetros con valores. Los números de los parámetros corresponden a la primera reacción en la que aparecen esos parámetros Nombre Valor Unidades Descripción Av 6.0 x 1023 Número de avogadro Vmedia 1.00x10"04 Litros Volumen medio por pocilio Vcélula 1.00 x 10"12 Litros volumen de la célula Núm. 30000 Número de células por pocilio. células Unión de HRG a E3 o E4. Conversión kfl 5.00x10'11 moléculas- 1 seg-1 unidades calculado como le5M-ls-l /(Vmedia* Av/Num_células). krl 0.001 seg-1 Disociación HRG de E3 kO 5.00 x 10"11 moléculas-1 seg-1 Unión de HRG a dímeros E3:E2 kr2 0.001 seg-1 Disociación de HRG de dímeros E3:E2 kD 5.00 x 10 " moléculas- 1 seg- 1 Unión de BTC a E 1 kr3 0.001 seg-1 Disociación de BTC de El kf4 5.00 x 10"11 moléculas-1 seg-1 Unión de BTC a homodímeros El kf5 5.00 x 10" moléculas-1 seg-1 Unión de BTC a heterodímeros El kf7 3.00 x 10 moléculas-1 seg-1 Dimerización de E2 a HRG:E3 kr7 0.001 seg-1 Disociación de E2 a HRG:E3 kflO 3.00 x 10 ü8 moléculas- 1 seg-1 Dimerización de El a HRG:E3 kfl2 4.20 x Ww moléculas- 1 seg-1 Dimerización - constitutiva y libre de ligando krl2 0.001 seg-1 Disociación - constitutiva y libre de ligando kfl4 1.70 x 10 U5 moléculas- 1 seg-1 Dimerización de El a BTC:E1 krl4 0.001 seg-1 Disociación de El a BTC:E1 kfl 6 1.70 x 10'U5 moléculas- 1 seg-1 Dimerización de BTC:E1 a BTC:E1 krl6 0.001 seg-1 Disociación de BTC:E1 a BTC:E1 kfl9 3.30 x 10 moléculas- 1 seg-1 Dimerización de E2 a BTC:E1 krl9 0.001 seg-1 Disociación de E2 o E3 a BTC:E1 kG3 4.70 x 10"ut> moléculas- 1 seg-1 Dimerización de E3 a BTC:E1 Tasa de auto-fosforilación enzimática de los kf30 1 seg-1 dímeros de unión al ligando k08 5.00 x 10-U6 moléculas- 1 seg-1 Unión al receptor de la fosfatasa kr38 0.1 seg-1 Disociación del receptor de la fosfatasa Tasa enzimática para la desfosforilación del kf45 1 seg-1 receptor Unión de PI3K a los dímeros que contienen kf52 3.00 x 10"06 moléculas- 1 seg-1 E3 Disociación de PI3K de los dímeros que kr52 0.1 seg-1 contienen E3 Unión de PI3 a los dímeros que no kf54 7.50 x 10"07 moléculas- 1 seg-1 contienen E3 Disociación de PI3K de los dímeros que no kr54 0.1 seg-1 contienen E3 Unión de PIP2 a los heterodímeros que kf59 5.00 x 10-06 moléculas- 1 seg-1 contienen E3 Disociación de PIP2 de los heterodímeros kr59 0.1 seg-1 que contienen E3 Unión de PIP2 a los heterodímeros que no kf61 5.00 x lo-07 moléculas- 1 seg-1 contienen E3 Disociación de PIP2 de heterodímeros que kr61 0.1 seg-1 no contienen E3 Activación de P1P3 por dímeros que kf66 0.2 seg-1 contienen E3 Tasa de activación de PIP3 por dímeros que kf68 0.013 seg-1 no contienen E3 kf73 5.00 x 10-"6 moléculas- 1 seg-1 Unión de PIP3 a PTEN kr73 0.1 seg-1 Disociación de PIP3 de PTEN kf74 0.1 seg-1 Inactivación de PIP3 por PTEN kf75 2.60 x 10 U4 moléculas- 1 seg-1 Unión de PIP3 a Akt o Akt p kr75 0.1 seg-1 Disociación de PIP3 de Akt o Akt p kf76 6.70 x 10 "5 moléculas- 1 seg-1 Unión de PDK1 a PIP3:Akt kr76 0.1 seg-1 Disociación de PDK1 de PIP3:Akt kf77 1 seg-1 Tasa de fosforilación enzimática para Akt kf78 0.2 seg-1 Disociación de PD 1 de PIP3 kf81 1 seg-1 Tasa de fosforilación enzimática para Akt p k 82 1.70 x 10-"" moléculas- 1 seg-1 Unión de PP2A a AKT fosforilados kr82 0.1 seg-1 Disociación de PP2A de AKT fosforilados kf83 1.5 seg-1 Desfosforilación de Akt y disociación kf86 8.30 x 10 w moléculas-1 seg-1 Unión de AKT p p a PP2Aoff kr86 0.5 seg-1 Disociación de AKT p_p de PP2Aoff k 87 0.1 seg-1 Activación de PP2Aoff por AKT p p Tasa de internalización para monómeros k 88 0.1 seg- 1 activos o de unión al ligando Tasa de reciclaje para monómeros activos o kr88 0.005 seg-1 de unión al ligando Tasa de internalización para heterodímeros kf93 0.005 seg-1 E2:E3 y homodímeros E2 de unión a HRG Tasa de reciclaje para heterodímeros E2:E3 y kr93 0.005 seg-1 homodímeros E2 de unión a HRG Tasa de internalización para heterodímeros kf98 0.005 seg-1 E1 :E3 de unión a HRG Tasa de reciclaje para heterodímeros E1 :E3 kr98 0.005 seg-1 de unión a HRG Tasa de internalización para homodímeros kfl 07 0.1 seg-1 El de unión a BTC Tasa de reciclaje para homodímeros El de krl07 0.005 seg-1 unión a BTC Tasa de internalización para heterodímeros kfl 17 0.1 seg-1 El de unión a BTC Tasa de reciclaje para heterodímeros que krl l7 0.005 seg-1 contienen El de unión a BTC kñ27 3.8 moléculas-1 seg-1 Unión HRG en el endosoma kfl 29 3.8 moléculas-1 seg-1 Unión BTC en el endosoma kfl 85 0.002 seg-1 Tasa de degradación para el ligando Tasa de degradación para los monómeros de kfl 87 0.002 seg-1 unión al ligando Tasa de degradación para los homo o kfl 92 0.002 seg-1 heterodímeros que contienen E2 de unión al ligando Tasa de degradación para los heterodímeros kf201 0.002 seg-1 que contienen El de unión al ligando Degradación de los homodímeros El de kf206 0.002 seg-1 unión al ligando Tabla 11: ErbB3, ErbB2, ErbBl y parámetros sensibles a AKT Sensibilidad a Sensibilidad a p£rbB3 p£rbB3 durante la durante la estimulación estimulación con con betacelulina kfl 4799 kf5 3824 kr93 2163 kf23 2353 kf7 1902 kf3 1821 kr88 1277 kfl2 1389 krl2 1 192 krl2 -1343 kfl 2 -1 1 1 1 kfl4 -1742 kfl 87 -1 136 kf!4 -6462 kf88 -1907 kf93 -3122 kfl92 -4452 Sensibilidad a Sensibilidad a pErbB2 pErbB2 durante la durante la estimulación estimulación con con betacelulina kfl 4747 kf3 3878 kr93 2245 kfl 9 3124 kf7 2136 kf5 1060 kr88 1267 kfl 4 -2768 krl2 1 155 kfl4 -6515 kfl 2 -1071 kfl 87 -1137 kf88 -1892 kf93 -3239 kfl92 -4617 Sensibilidad a Sensibilidad pErbBl a pErbBl durante la durante la estimulación estimulación con con betacelulina kflO 6990 kf3 2847 kfl 6222 kf4 1044 krl2 2224 kfl4 -1665 kr98 2174 kf206 -4983 kr88 1616 kfl 87 -1423 kfl 2 -2189 kf88 -2414 kf98 -3155 kfl4 -4457 kf7 -4469 Sensibilidad a Sensibilidad a pAKTdurante pAKT durante la estimulación la estimulación con con heregulina betacelulina kf66 6657 kf75 5462 kf75 5418 kf66 5395 kfi 4799 krl 17 4420 kr93 3937 kf5 3250 kr73 2705 kr86 2854 kf7 2022 kr73 2726 kr86 1918 kf3 2351 kf78 1584 kf68 1815 kr88 1209 kf23 1804 krl2 1 127 kf78 1750 kfl2 -1044 krl07 1024 kfl87 -1073 kf83 -1019 kf87 -1929 kfl4 -1338 kf88 -1967 kfl07 -1552 kf86 -2302 kf74 -2720 kf83 -2520 kf87 -2861 kf74 -2719 kf86 -3425 kfl92 -3667 kfl4 -3890 kf82 -4458 kf73 -5459 kf73 -5416 k 82 -5921 kf93 -5748 kfl l7 -6849 Tabla 12: Esquema de implementación para Ab#6, Cetuximab, Pertuzumab, y Lapatinib.

Numero de _ Parámetros Parámetros . . , Reacción la reacción directos inversos Implementación con Ab #6 Ab #6 v 1 Ab #6 + E3 <-> [E3 : Ab #6] kfAb #6 1 krAb #6 1 Ab #6 v2 [E3:Ab #61 + E3 <-> rE3:Ab #6:E31 kfAb #6 2 krAb #6 2 Ab #6 v3 rE3:Ab #6:E31 <-> [iE3:Ab #6:E3] kfAb #6 3 krAb #6 3 Ab #6 v4 [iE3:Ab #6:E3] <-> [dE3:Ab #6:E3] kfAb #6 4 Implementación con Cetuximab Cetuximab_ cetuxjmajj + £i <_> [ElrCetuximab] kfCetuximab krCetuximab 1 1 Cetuximab , [E 1 :Cetuximab] + E1 <_> [El :Cetuximab:El] kfCetuximab krCetuximab 2 2 Implementación con Pertuzumab Pertuzumab [per Uzumab] + E2 <-> [E2: Pertuzumab] kfPertuzuma krPertuzuma b 1 b 1 Pertuzumab [E2:pertuzumab] + E2 <-> [E2: Pertuzumab :E2] kfPertuzuma krPertuzuma b 2 b 2 Implementación con Lapatinib Lapatinib v Lapatinib + El <-> [Lapatinib:El] kfLapatinib krLapatinib 1 1 Lapatinib v Lapatinib + E2 <-> [Lapatinib:E2] kfLapatinib krLapatinib 2 2 Lapatinib v Lapatinib + [El :E1] <-> [Lapatinib:El :El] kfLapatinib_ krLapatinib_ 3 3 1 Lapatinib V kfLapatinib krLapatinib Lapatinib + [El :E2] <-> [Lapatinib:El :E2] 4 3 1 Lapatinib V kfLapatinib krLapatinib Lapatinib + [El :E3] <-> [Lapatinib:El:E3] 5 1 1 Lapatinib V kfLapatinib krLapatinib Lapatinib + [E2:E2] <-> [Lapatinib:E2:E2] 6 4 2 Lapatinib V kfLapatinib krLapatinib Lapatinib + [E2:E3] <-> [Lapatinib:E2:E3] 7 2 2 Lapatinib V Lapatinib + [Lapatinib:El :El] <-> kfLapatinib krLapatinib 8 [Lapatinib:El :E1 :Lapatinib] 1 1 Lapatinib V Lapatinib + [Lapatinib:El :E2] <-> kfLapatinib krLapatinib 9 [Lapatinib:El :E2:Lapatinib] 1 1 Lapatinib V Lapatinib + [Lapatinib:E2:E2] <-> kfLapatinib krLapatinib 10 [Lapatinib:E2:E2:Lapatinib] 2 2 Lapatinib V kfLapatinib krLapatinib Lapatinib + [BTC:E1] <-> [Lapatinib:BTC:El] 11 1 1 Lapatinib V Lapatinib + [BTC:E1 :E1] <-> kfLapatinib krLapatinib 12 [Lapatinib:BTC:El:El] 3 1 Lapatinib V Lapatinib + [BTC:E1 :E1:BTC] <-> kfLapatinib krLapatinib 13 [Lapatinib:BTC:E 1 :E 1 :BTC1 3 1 Lapatinib V Lapatinib + [BTC:E1:E2] <-> kfLapatinib krLapatinib 14 [Lapatinib:BTC:El:E2] 3 1 Lapatinib V Lapatinib + [BTC:E1 :E3] <-> kfLapatinib krLapatinib 15 [Lapatinib:BTC:El:E3] 1 1 Lapatinib V Lapatinib + [E2:E3:HRG] <-> kfLapatinib krLapatinib 16 [Lapatinib:E2:E3:HRG] 2 2 Lapatinib V Lapatinib + [E1 :E3:HRG] <-> kfLapatinib krLapatinib 17 fLapatinib:El :E3:HRG] 1 1 Lapatinib V Lapatinib + [Lapatinib:BTC:El :El ] <-> kfLapatinib krLapatinib 18 [Lapatinib:BTC:E 1 :E 1 :Lapatinib] 1 1 Lapatinib V Lapatinib + [Lapatinib:BTC:El :El :BTC] <-> kfLapatinib krLapatinib 19 [Lapatinib:BTC:El :E1 :BTC -.Lapatinib] 1 1 Lapatinib V Lapatinib + [Lapatinib:BTC:El :E2] <-> kfLapatinib krLapatinib 20 [Lapatinib:BTC : E 1 : E2 :Lapatinib] 1 1 Lapatinib V [Lapatinib:El] + El <-> [Lapatinib:El:El] kfl2 krl2 21 Lapatinib y [Lapatinib:El] + E2 <-> [Lapatinib:El :E2] kfl2 krl2 22 Lapatinib V [Lapatinib:El] + E3 <-> [Lapatinib:El :E3] kfl2 krl2 23 Lapatinib V [Lapatinib:E2] + El <-> [Lapatinib:El :E2] kfl2 krl2 24 Lapatinib V [Lapatinib:E2] + E3 <-> [Lapatinib:E2:E3] kfl2 krl2 25 Lapatinib V [Lapatinib:El] + [Lapatinib:El] <-> kfl2 krl2 26 [Lapatinib:El :E1 ¡Lapatinib] Lapatinib V [Lapatinib:El] + [Lapatinib:E2] <-> kfl2 krl2 27 [Lapatinib:El :E2:Lapatinib] Lapatinib V [Lapatinib:E2] + [Lapatinib:E2] <-> kfl2 krl2 28 [Lapatinib:E2:E2:Lapatinib] Lapatinib V [Lapatinib:BTC:El] + El <-> kfl4 krl4 29 [Lapatinib:BTC:El :El] Lapatinib V [Lapatinib:BTC:El] + E2 <-> kfl9 krl9 30 [Lapatinib:BTC:El :E2] Lapatinib_ V [Lapatinib:BTC:El] + E3 <-> kf23 krl9 31 [Lapatinib:BTC:El :E31 Lapatinib V [Lapatinib:BTC:El] + [BTC:E1] <-> kfló krló 32 [Lapatinib:BTC:El:El :BTC| Lapatinib V [Lapatinib:BTC:El] + [Lapatinib:BTC:El] <-> kfló krl 6 33 fLapatinib:BTC:El:El :BTC:Lapatinibl Lapatinib V [Lapatinib:BTC:El] + [Lapatinib:E2] <-> kfl9 krl9 34 [Lapatinib: BTC : E 1 : E2 :Lapatinib] Lapatinib V [Lapatinib:E2] + [HRG.E3] <-> kf7 kr7 35 [Lapatinib.E2:E3 :HRG] Lapatinib_ V [Lapatinib:El] + [HRG:E3] <-> kflO kr7 36 [Lapatinib:El :E3:HRG] Lapatinib V [Lapatinib:El] + BTC <-> [Lapatinib:BTC:El] kf3 kr3 37 Lapatinib_ V [Lapatinib:El :El] + BTC <-> kf4 kr3 38 [Lapatinib:BTC:El:El] Lapatinib V [Lapatinib:El :E2] + BTC <-> kf5 kr3 39 [Lapatinib:BTC:El:E2] Lapatinib_ V [Lapatinib:El :E3] + BTC <-> kf5 kr3 40 [Lapatinib:BTC:El:E3] Lapatinib_ V [Lapatinib:BTC:El:El] + BTC <-> kf4 kr4 41 [Lapatinib:BTC:El :El :BTC] Lapatinib V [Lapatinib:E2:E3] + HRG <-> kO krl 42 [Lapatinib:E2:E3:HRG] Tabla 13: Valores de los parámetros del inhibidor.

Nombre Valor Unidades Descripción 1.0E- Vcélula Litros Volumen de la célula 12 Volumen Vshell reducido para 2 ° brazo de unión a IgG. Vshell = 4/3*pi*((Radio_célula + alturaenvoltura_célula)A3- Radio_célula) 4.8E- Vshell Litros radio célula (Vcell*3/(4*pi()))A(l/3) en decímetros. 15 Alturaenvoltura célula = le-7 decímetros. La alturaenvoltura_célula representa la distancia promedio entre los sitios de unión del anticuerpo.

Parámetros MM-121 7.15E- moléculas Unión del inhibidor Ab #6 a ErbB3. Conversión de kfAb #6 1 1 1 seg" unidades calculado como 1.43e5M-y /(Vmedia*Av/Núm_células). Núm células = 30,000 por pocilio. 1.10E-kr Ab #6 _1 seg"1 Disociación del inhibidor Ab #6 de ErbB3 04 Unión del inhibidor Ab #6 a un segundo ErbB3. 4.96E- moléculas"1 kfAb #6 _2 Avidez debido a la reducción del volumen =kr Ab #6 05 seg"1 1 *(Vmedia/Númcélulas)/V shell. 2.20E- Disociación del inhibidor Ab #6 de un segundo ErbB3 kr Ab #6 _2 seg"1 04 (2*krmml21 1) 5.56E- Tasa de internalización para Ab #6 unido a dos kfAb #6 _3 seg"1 04 moléculas ErbB3 5.00E- Tasa de reciclaje para Ab #6 unido a dos moléculas kr Ab #6 _3 seg"1 03 ErbB3 2.00E-kf Ab #6 _4 seg'1 Degradación de las especies unidas a Ab #6 04 Parámetros de Cetuximab Unión del inhibidor Cetuximab a ErbBl . Conversión kfCetuximab 1.10E- moléculas"1 de unidades calculada como 2.2e5M"'s'1 _1 10 seg"1 /(Vmedia*Av Núm células). krCetuximab 1.10E- seg"1 Disociación del inhibidor de Cetuximab de ErbBl 1 03 Unión del inhibidor Cetuximab a un segundo ErbB 1. kfCetuximab 7.64E- moléculas"1 Avidez debida a la reducción del _2 05 seg"1 volumen=krCetuximab 1 *(Vmedia/Númcélulas)/V sh ell. krCetuximab 2.20E- Disociación del inhibidor Cetuximab cuando se une a seg"1 2 03 dos moléculas ErbBl (2*krcetuximab 1) Parámetros de Pertuzumab Unión del inhibidor Pertuzumab a ErbB2. Conversión kfPertuzumab 5.60E- moléculas"1 de unidades calculada como l . ^eSM 's"1 _1 11 seg"1 /(Vmedia*Av/Núm células). krPertuzumab 9.50E- seg'1 Disociación del inhibidor de Pertuzumab de ErbB2 1 04 Unión del inhibidor Pertuzumab a un segundo ErbB2. kfPertuzumab 3.90E- moléculas"1 Avidez debida a la reducción del volumen _2 05 seg'1 =krPertuzumab 1 *(Vmedia/Númcélulas)/Vshell. krPertuzumab 1.90E- Disociación del inhibidor Pertuzumab de un segundo seg"1 2 03 ErbB2 (2*krpertuzumab 1).

Parámetros de Lapatinib Unión del inhibidor Lapatinib a los dímeros 1-3 o 6.40E- moléculas"1 kfLapatinib_l ErbBl. Conversión de unidades calculada como 12 seg"1 1.28e4M"'s"1 /(Vmedia*Av/Núm_células).

SESEDisociación del inhibidor Lapatinib de los dímeros 1-3 krLapatinib l seg"1 OS o ErbBl .

Unión del inhibidor Lapatinib de los dímeros 2-3 o 1.50E- moléculas"1 kfLapatinib_2 ErbB2. Conversión de unidades calculada como 12 seg'1 2.95e3M"V /(Vmedia*Av/Núm_células).

Ejemplo 5: Selección de los marcadores pronóstico de la activación de pErbB3 En este ejemplo, un conjunto de marcadores de proteínas que se pronostican para la activación de ErbB3, según lo indicado por pErbB3, se identificaron mediante el modelo computacional mecanicista para la vía de señalización de ErbB que se describió en el Ejemplo 4.

Como se demostró en el Ejemplo 2, para correlacionar el nivel de fosforilación de ErbB3 con la tasa de respuesta tumoral, se realizó un análisis de la capacidad de respuesta en el modelo computacional preparado para identificar las principales proteínas que determinan el nivel de fosforilación de ErbB3.

En este análisis de la capacidad de respuesta local, las células se estimularon virtualmente in silico con 0.4 nM ya sea de HRG o BTC, los cuales son ligandos que activan la vía de señalización de ErbB. La capacidad de respuesta de pErbB3 se determinó con respecto a los siguientes receptores celulares, quinasas y otras proteínas: ErbB3, ErbB2, ErbBl, PI3K, PIP2, PTEN, PDK1, PP2A, AKT, RTKpase y los ligandos (BTC y HRG).

El análisis de la capacidad de respuesta local es una herramienta matemática que mide los cambios en una salida en respuesta a los cambios en las concentraciones de proteína y parámetros cinéticos dentro de la vía. La sensibilidad completamente normalizada ( ¾(¾ del imo observable CX con respecto al cambio en la jma constante de velocidad ( ^;) se da por la siguiente ecuación: (Ecuación 2) La calibración del modelo se realizó después mediante los métodos de optimización local y global (los algoritmos genéticos, el recocido simulado, la optimización de Levenberg-Marquardt) que minimizan la distancia entre los datos experimentales y los resultados de la simulación por la variación de los parámetros y las concentraciones iniciales de las proteínas identificadas en el análisis de la capacidad de respuesta.

Los resultados del análisis de la capacidad de respuesta local se resumen en el gráfico de barras de la Figura 6. Los resultados indican que las siguientes cinco proteínas son el conjunto principal de marcadores que se pronostican para activar el ErbB3 (por ejemplo, la formación de pErbB3): ErbBl, ErbB2, ErbB3, HRG y BTC.

Ejemplo 6: Uso del modelo computacional mecanicista para calcular los niveles de pErbB3 Sobre la base de los resultados obtenidos en el Ejemplo 5, en los que ErbBl, ErbB2, ErbB3, HRG y BTC se identificaron como los principales marcadores para pronosticar el pErbB3 mediante el modelo computacional, las mediciones de los niveles de expresión de la proteínas descritas en la Tabla 2 se usaron como entradas en el modelo computacional para calcular los niveles de pErbB3 en diferentes líneas celulares tumorales.

La entrada de los niveles de expresión de BTC y GHR en el modelo computacional requirió la conversión de unidades adimensionales o pg ^g en una concentración [M]. De ese modo, se necesitan establecer los factores de conversión. Los factores de conversión que convierten los niveles de ARNm de HRG y los niveles de expresión de la proteína BTC en una concentración molar se extrapolaron en el intervalo lineal entre la medida experimental y los niveles pronóstico de pErbB. Para los valores experimentalmente medidos, los niveles constitutivos de fosforilación de ErbB3 (pg/^g) se midieron en las cuatro líneas celulares (MALME3M, DU145, ADRr y ACHN) en suero fetal bovino al 10% (FBS). Estos resultados medidos experimentalmente se muestran en el Ejemplo 4 en la Tabla 2, columna 7. Para la conversión del ligando en factor de entrenamiento, la señal integra normalizada del pErbB3 pronosticado con el tiempo se representó frente al pErbB3 experimentalmente medido, in vitro, en SFB al 10%, mediante un factor de conversión de BTC de 6.1e-005 y un factor de conversión del ARNm de HRG de 3.1e-013. Los factores de conversión del ligando se formaron para optimizar la relación lineal entre el pErbB3 pronosticado y los niveles constitutivos de medición de pErbB3 (por ELISA) en las líneas celulares ADRr, MALME3M, ACHN y DU145.

De ese modo, la activación de la vía por HRG y BTC que se simuló mediante el modelo y el estado de activación de la red (ÑAS), como es indicado por los niveles de pErbB3 calculados, se obtuvo como salida. En este caso, el ÑAS se definió como la cantidad íntegra de pErbB3 por tiempo simulado en el modelo en las dos primeras horas de la estimulación por HRG y BTC. Los resultados para los niveles calculados de pErbB3 se muestran en el gráfico de la Figura 7. La simulación de ÑAS para las células ADRr se ajustó inicialmente como el umbral entre respondedor y no respondedor al tratamiento con Ab #6, ya que de las cuatro líneas celulares estudiadas en los modelos de xenoinjerto, la línea celular ADRr fue un no-respondedor con el más alto nivel de pErbB3 Ejemplo 7: Ajuste de los valores umbrales de ÑAS mediante las respuestas de xenoinjertos y pronóstico de la capacidad de respuesta en base a los umbrales de ÑAS En este ejemplo, las respuestas de xenoinjerto para las cuatro líneas celulares tumorales descritas en el Ejemplo 1 se combinaron con los valores ÑAS (niveles íntegros de pErbB3 por tiempo, normalizados) calculados como se describe en el Ejemplo 6 para seleccionar los valores umbrales de ÑAS de los respondedores al tratamiento con Ab #6 y no respondedores al tratamiento con Ab #6.

Más específicamente, los valores de reducción de la tasa de crecimiento (GRR) que se determinan para las líneas celulares ADRr, ACHN, DU145 y MALME3 (se describen, además, en el Ejemplo 1) se convirtieron en un resultado binario para la preparación de la estratificación estableciendo los "respondedores" como los que tienen un nivel de pErbB3 que es mayor que el nivel de pErbB3 en las células ADRr (es decir, un pErbB3> pErbB3 (ADRr)), donde los "no respondedores" se establecieron como teniendo un nivel de pErbB3 que es menor que el nivel de pErbB3 en las células ADRr (es decir, un pErbB3 <pErbB3 (ADRr)). Cabe señalar que esto no era un pronóstico modelo, sino que fue parte del proceso de preparación de la estratificación.

Para las cuatro líneas celulares, los valores GRR determinados experimentalmente se representaron contra los valores ÑAS calculados (pErbB3 íntegro por tiempo, normalizado). Los valores GRR, en el eje x, se dividieron en respondedores (pErbB3>; pErbB3 (ADRr)) y no respondedores (pErbB3<; pErbB3 (ADRr)). Los datos de la preparación con ÑAS (obtenidos como se describe en el Ejemplo 4) permitieron la división del eje y estado de activaciónde la red en tres categorías: Simulador de respuesta ("Sim R"), Simulador de no respuesta ("Sim NR") y simulador indeterminado ("Sim I "). Dos líneas celulares de xenoinjerto se caracterizaron por los valores de reducción de la tasa de crecimiento en más del 20% (DU145, ACHN) y de éstos, la línea celular DU145 tuvo el menor estado de activación de la red. En consecuencia, el umbral para clasificar una línea celular como un simulador de respuesta se fijó en un estado de activación de la red mayor o igual al nivel de ADRr. Del mismo modo, el xenoinjerto de línea celular MALME3 fue un no respondedor (pErbB3 <pErbB3 (ADRr)) y, por tanto, los estados de activación de la red de líneas celulares que son menores que el nivel de ADRr se clasificaron como simuladores no respondedores. Los estados de activación de la red entre los umbrales de estos ADRr y los de DU145 se clasifican como simulador indeterminado.

El estado de activación de la red, según lo indicado por los niveles de pErbB3 calculados, se simuló para un panel de 15 líneas celulares para el que las mediciones experimentales de HRG, BTC, ErbBl, ErbB2 y ErbB3 estaban disponibles. Los niveles íntegros de pErbB3 calculados para las 15 células se representaron, junto con los niveles de las 4 líneas celulares de entrenamiento, en el gráfico de barras que se muestra en la Figura 8A, desde el mayor hasta el menor de los niveles pErbB3. Los valores de ÑAS calculados para estas 15 líneas celulares se ordenaron después, contra los valores de la ÑAS previamente determinados para las cuatro líneas celulares de entrenamiento ADRr, ACHN, DU145 y MALME3M. Los resultados ÑAS para el total de las 19 líneas celulares se ordenan como se muestra en el gráfico de la Figura 8B. Los valores del ÑAS iguales o por debajo de los valores de la línea celular MALME3M se seleccionaron como simuladores no respondedores ("Sim NR"), los valores ÑAS entre las líneas celulares de MALME3M y DU145 se seleccionaron como simulador indeterminado ("Sim I") y los valores ÑAS iguales o por encima de la línea celular DU145 se seleccionaron como simulador de respuesta ("Sim R"). De ese modo, como se ilustra en la Figura 8B, las líneas celulares IGROV1 (NCI-60, muestra cósmica ident. Núm. 905968), MDA-MB-361 (ATCC núm. HTB-27), SKMEL-5 (ATCC núm. HTB-70), MDA -MB-231 (ATCC núm. HTB-26) y T47D (ATCC núm. HTB-133) se pronosticaron para ser simuladores no respondedores, ya que sus valores ÑAS calculados fueron inferiores a los de MALME3M. Además, las líneas celulares ZR75-1 (ATCC CRL-núm. 1500), HOP92 (NIC- 60, muestra cósmica ident. núm. 905.973) y HOP62 (NIC-60, muestra cósmica ident. núm. 905.972) se pronostican para ser un simulador indeterminado, ya que sus valores ÑAS calculados estaban entre aquellos de ADRr y DU145. Por último, las líneas celulares SKBR3 (ATCC núm.HTB-30), UACC62 (NIC-60, muestra cósmica ident. núm. 905976), EKVX (NIC-60, muestra cósmica ident. núm. No. HTB-77), OVCAR8 (se obtuvo del Instituto Nacional del Cáncer, la División de Diagnósticos y Tratamiento del Cáncer) y CAK11 (NIC- 60, muestra cósmica ident. núm 905.963) se pronosticaron para ser simuladoras de respuesta, ya que sus valores ÑAS calculados fueron mayores que el de ADRr.

Para probar estos pronósticos del modelo, se realizaron in vivo tres estudios de xenoinjertos. Las líneas celulares IGROVl, OVCAR8 y S OV3 se usaron en los estudios de xenoinjerto llevados a cabo como se describe en el Ejemplo 1, caracterizado por ratones que se trataron con 600 µg de Ab#6 cada 3 días o con PBS como un control. Las respuestas de xenoinjerto, según determinado por los cambios en el volumen de tumor (en mm3) en el tiempo, se resumieron en los gráficos de las Figuras 9A-9C. Una vez más, el valor de reducción de la tasa de crecimiento (GRR) para cada línea celular se calculó mediante la siguiente fórmula: Reducción de la Tasa de Crecimiento = 1 - (tasa de crecimiento con el Ab#6)/ (tasa de crecimiento con PBS) Los valores de GRR para las cuatro líneas celulares se resumen en la Tabla 14 a continuación: Tabla 14: Resumen de la reducción de la tasa de crecimiento del tumor para pronosticar la selección de los estudios de xenoinjertos.

En cuanto al pronóstico de la capacidad de respuesta de Ab #6 para cada línea celular, sobre la base del criterio que un xenoinjerto respondedor debe tener un nivel simulado de pErbB3 mayor que el simulado de pErbB3 para ADRr, el xenoinjerto IGROVl se clasificó como no respondedor, mientras que los xeno injertos OVCAR8 y SKOV3 se clasificaron como respondedores.

Estos datos demuestran que los pronósticos hechos sobre la base de los valores ÑAS calculados corresponden con precisión a la capacidad de respuesta observada experimentalmente de las tres líneas celulares para el tratamiento in vivo con Ab #6 en los estudios de xenoinjerto. Más específicamente, la línea celular IGROV1 se predijo que fuera una simulación no respondedora sobre la base de su valor ÑAS calculado, y se observó experimentalmente que fue una no respondedora sobre la base de su valor GRR. Del mismo modo, las líneas celulares OVCAR8, y SKOV3 se predijeron para ser simuladoras de respuesta sobre la base de sus valores ÑAS calculados, y se observó experimentalmente que eran respondedoras sobre la base de sus valores GRR.

En consecuencia, estos experimentos confirmaron la eficacia del modelo computacional, y del valor ÑAS calculado para los niveles normalizados de pErbB3 íntegro en el tiempo, según fuera el pronóstico de la capacidad de respuesta al tratamiento in vivo con Ab #6.

Ejemplo 8; Identificación de biomarcadores directos de la capacidad de respuesta al Ab · #6 En este ejemplo, los datos obtenidos para las cuatro líneas celulares examinadas en los estudios de xenoinjerto se describen en el Ejemplo 1 (ADRr, ACHN, DU154 y MALME3M) y se examinaron además las tres líneas celulares examinadas en los estudios de xenoinjerto descritas en el Ejemplo 7 (IGROV1, OVCAR8 y SKOV3), para determinar si se podrían identificar los biomarcadores directos de la capacidad de respuesta a Ab # 6.

En primer lugar, se examinó si las concentraciones del receptor para ErbBl, ErbB2 y ErbB3 clasificaron eficazmente los datos del xenoinjerto en los respondedores y los no respondedores. Como se ilustra en los gráficos de las Figuras 10A-10D (en las que el logaritmo de la concentración de un receptor se representa contra el logaritmo de la concentración de un receptor u otros receptores), sólo las mediciones del receptor ErbBl parecen clasificar los datos del xenoinjerto en los respondedores y los no respondedores, mientras que ninguno de los otros receptores lo hizo.

A continuación, se examinó si la concentración de HRG en combinación con una concentración de receptor (por ejemplo, ErbBl, ErbB3) clasifica eficazmente los datos xenoinjerto en los respondedores y los no respondedores. Como se ilustra en el gráfico de la Figura 11 (en la que el logaritmo de la concentración de HRG se representa contra el logaritmo de la concentración de ErbBl), estas dos mediciones de concentración, HRG y uno de los receptores ErbB, fueron capaces de clasificar con precisión los datos del xenoinjerto en los respondedores y los no respondedores. Más concretamente, los datos de los tres no respondedores MALME3, ADRr e IGROVl, se separaron de los datos correspondientes a los seis respondedores, permitiendo por consiguiente la clasificación de los no respondedores frente a los respondedores.

En consecuencia, los biomarcadores directos de la capacidad de respuesta al Ab #6 se identificaron como HRG en combinación con uno de los receptores de la vía de ErbB (por ejemplo, ErbBl, ErbB3).

La Tabla 15 a continuación resume el pronóstico de los respondedores y los no respondedores a las líneas celulares estudiadas en el Ejemplo 7 mediante los biomarcadores directos del Ab #6 para hacer los pronósticos. El pronóstico se determina mediante los biomarcadores directos que se corresponden bien con los pronósticos determinados mediante los valores ÑAS (como se describe en el Ejemplo 7). Por ejemplo, las líneas celulares ACHN, DU145, OVCAR8 y SKOV3 se habían identificado previamente mediante los valores ÑAS como respondedores y se predijeron también para ser de respuesta mediante los biomarcadores directos. Del mismo modo, se han identificado anteriormente mediante los valores ÑAS las líneas celulares ADRr, MALME3M e IGROVl como no respondedores y se predijo también que son respondedoras mediante los biomarcadores directos.

Tabla 15: Respondedores y no respondedores predichos usando los biomarcadores directos para Ab #6 Respondedores Intermedio No respondedores ACHN SKBR3 ADRr CAKI1 BT474 DU145 HOP92 EKVX IGROV1 HOP62 ALME3M MDA-MB-231 MDA-MB-361 OVCAR8 SKMEL5 SKOV3 T47D UACC62 ZR75-1 Al comparar los resultados del Ejemplo 7 que usa el ÑAS para separar entre los respondedores y no respondedores con los resultados del Ejemplo 8 que usan los biomarcadores directos para la separación, las diferencias sólo fueron para las líneas celulares BT474, MDA-MB-231 y UACC62. No es sorprendente que existan algunas diferencias entre estos dos métodos de clasificación distintos. En esta situación, las líneas celulares en disputa son consideradas respondedoras ya que, en el contexto de estratificación de los pacientes, los falsos positivos se prefieren a los falsos negativos.

Ejemplo 9; Comparación por ELISA y qlHC de los niveles de expresión de proteínas entre los xenoinjertos y tumores humanos En este ejemplo, se evaluó la similitud o diferencia en los perfiles de expresión de la proteína observados en los xenoinjertos en comparación con los perfiles de expresión de la proteína observados en los tumores humanos. Esto se hizo para determinar si los niveles de proteína observados en los xenoinjertos se comparaban a los niveles de proteína observados en los tumores humanos.

En un primer conjunto de experimentos, los niveles de expresión de proteínas se midieron por ELISA. Los Usados se prepararon a partir de tumores congelados en seco a partir de muestras de tumores humanos o de xenoinjertos, básicamente como se describe en detalle en el Ejemplo 2, y se analizaron por ELISA para los niveles de proteínas de ErbBl, HRG-ß? y BTC, también como es descrito básicamente en el Eemplo 2. Los resultados (se obtienen mediante los métodos descritos anteriormente o variaciones mínimas de éstos) se representan en los gráficos de las Figuras 12A-12C. Los resultados demuestran que los valores obtenidos para los niveles de proteína en las muestras de xenoinjerto son en gran parte mezclados con los valores obtenidos para los niveles de proteína en las muestras de tumor humano de origen de tejido diferente, lo que indica que los niveles de proteína observados en los xenoinjertos son comparables a los niveles de proteínas observados en los tumores humanos. En base a estos datos, se afirma que los umbrales de ÑAS determinados para el pronóstico de la capacidad de respuesta en xenoinjertos se pueden aplicar para predecir los respondedores mediante muestras de tejido tumoral humano.

Como las muestras de tejido congeladas pueden ser difíciles de obtener en un entorno clínico, se realizó un segundo conjunto de experimentos mediante técnicas de medición que permiten la cuantificación de proteínas en muestras fijadas con formalina y embebidas en parafina (FFPE). Más concretamente, la inmunohistoquímica cuantitativa (qlHC) se realizó mediante el sistemaAQUA ® (HistoRx, Inc., New Haven, CT). Mediante imunoflourescencia y un panel de línea celular con niveles representativos de expresión de proteínas, se preparó una curva estándar de línea celular. La curva estándar de línea celular se deja después para el cálculo posterior del nivel de expresión de proteínas en las muestras tumorales y xenoinjertos. Los resultados se muestran en las Figuras 13A-13D. La Figura 13A, muestra una curva estándar de línea celular para ErbBl. Las Figuras 13B, 13C y 13D muestran los gráficos de barras que representan las puntuaciones qlHC para ErbBl, ErbB2 y ErbB3, respectivamente, en las líneas celulares de xenoinjerto (barras rojas) y las muestras de tumores humanos (barras azules). Los resultados qlHC demuestran la similitud en los niveles de expresión de la proteína entre las muestras de tumores humanos y las muestras de xenoinjerto, que abarcan un intervalo amplio de niveles de expresión de la proteína. Estos resultados apoyan de nuevo la afirmación de que los umbrales de ÑAS determinados para el pronóstico de la capacidad de respuesta en xenoinjertos se pueden aplicar para pronosticar los respondedores mediante las muestras de tejido tumoral humano.

Ejemplo 10: Correlación de la capacidad de respuesta con los heterodímeros fosforilados.

En este ejemplo, los niveles integrados de homo y heterodímeros de ErbB fosforilados se calcularon como valores de ÑAS para determinar si se correlacionan con la capacidad de respuesta al tratamiento con Ab #6.

El mismo modelo computacional preparado como se describe en el Ejemplo 4 se usó. Este modelo se generó en base a las mediciones determinadas experimentalmente para los niveles de ErbBl, ErbB2, ErbB3, HRG-ß? y BTC. Como se discute en el Ejemplo 4, los siete hetero y homo-dímeros de ErbB que se han descrito en la literatura se aplicaron en el modelo: ErbBl/1, ErbBl/2, ErbBl/3, ErbBl/4, ErbB2/2, ErbB2/3 y ErbB2/4. La mayoría de estos dímeros se activan por la unión al ligando, pero varios se originan a través de un proceso de "señalización lateral" (o dimerización secundaria) en el que los dímeros fosforilados se disocian de una forma dependiente del ligando en monómeros que homo o hetero oligomerizan después ya sea con monómeros activados o inactivados para crear dímeros activos. El modelo computacional se preparó con un conjunto de datos experimentales que permitieron la identificación de los dímeros que se forman usando la línea celular ADRr en presencia de HRG o BTC.

De este modo, los niveles integrados de homo y heterodímeros fosforilados se calcularon como una medida del estado de activación de la red (ÑAS) para las líneas celulares siguientes: MALME3M, BT474, IGROV1, ADRr, OVCAR8, SKOV3, DU145 y ACHN. Como se muestra en el gráfico de la Figura 14, los niveles calculados de heterodímeros fosforilados de ErbB 1/3 (pErbBl :3) separaron las ocho líneas celulares en no respondedores al Ab #6 (MALME3M, BT474, IGROV1, ADRr) y respondedores (OVCAR8, SKOV3, DU145 y ACHN). Esta separación se basa en que los niveles de pErbBl :3 calculados se correlacionan de forma idéntica con el pronóstico de los no respondedores y respondedores determinados mediante los biomarcadores directos como se describe en el Ejemplo 8. Esta separación se basa en que los niveles de pErbBl :3 calculados se correlacionan también casi de forma idéntica con el pronóstico de los no respondedores y los respondedores determinados mediante el nivel calculado de pErbB3 para el valor de ÑAS como se describe en el Ejemplo 7, con la única diferencia que existe para la línea celular BT474, la que se identificó como no respondedora tanto por los biomarcadores directos como por los niveles de pErbBl :3 calculados, pero fue identificada como una respondedora mediante los niveles de pErbB3 calculados.

Los niveles de los dímeros ErbBl/1, ErbBl/2, ErbBl/3, ErbBl/4, ErbB2/2, ErbB2/3 y ErbB2/4 se calcularon también mediante el modelo computacional, pero ninguno de los niveles de cualquiera de estos homo- o heterodímeros separaron las líneas celulares en respondedores y no respondedores al tratamiento con Ab #6. De este modo, los resultados observados con el heterodímero ErbBl/3 fueron únicos entre los dímeros examinados.

Estos resultados demuestran que los niveles integrados de homo o heterodímero ErbB fosforilado se pueden usar como el valor de ÑAS en los métodos de pronóstico de la invención y, más concretamente, que el nivel calculado de pErbBl :3 es un valor ÑAS preferido para predecir la capacidad de respuesta al tratamiento con Ab #6. Estos resultados se interpretan para significar que Ab #6 es particularmente eficaz en los cánceres con altos niveles de heterodímeros ErbB 1 :3 y, por tanto, que la medición directa del total de heterodímeros ErbB 1 :3 o niveles del heterodímero pErbBl :3 se puede usar también como biomarcadores directos para predecir la eficacia del tratamiento con Ab #6.

Ejemplo 11: Construcción y preparación de un modelo computacional para los efectos de un agente terapéutico en la vía de señalización de ErbB.

En este ejemplo, el enfoque descrito en el Ejemplo 4 para la construcción de un modelo computacional mecanicista se usó para construir y preparar un modelo de la vía de señalización de ErbB y, además, desarrollar una representación computacional del mecanismo por el cual un agente terapéutico particular, inhibe la vía señalización.

El agente terapéutico que se usa en este ejemplo es el anticuerpo biespecífico H3 x B1D2 (la secuencia de aminoácidos que se muestra en la sec. con núm. de ident: 41 y que se describen además en la patente de los Estados Unidos núm. 7,332,585, la patente de los Estados Unidos núm. 7,332,580 y la solicitud de PCT US2006/023479, publicada como WO 2007/084187 y la solicitud de PCT/US2007/024287, publicada como WO 2008/140493). Este anticuerpo biespecífico se compone de un anticuerpo de cadena simple anti-ErbB3 unido a un anticuerpo de cadena simple anti-ErbB2.

El agente H3 x B1D2 se predijo para tumores que sobreexpresan con mayor preferencia el blanco ErbB2. De este modo, un modelo computacional de la red de señalización de ErbB en presencia de ErbB2 sobreexpresado se construyó usando los métodos y el modelo descrito en el Ejemplo 4. El modelo incorpora las interacciones entre los receptores HRG y ErbBl, ErbB2, y ErbB3, lo que conduce al tráfico y señalización intracelular del receptor corriente abajo de AKT, que produce la AKT fosforilada (pAKT). Las interacciones que se incluyen fueron idénticas básicamente a las que se encuentran en el modelo del Ejemplo 4. En contraste con el modelo del Ejemplo 4, las reacciones que se relacionan con el ligando BTC no se incluyeron en este modelo.

Este modelo se calibró con los datos experimentales coincidentes de la línea celular de mama BT474-M3 que sobreexpresa la ErbB2 (la línea celular se describe en, por ejemplo, Drummond y otros, (2005) Clin. Cáncer Res. JJ_:3392; Park^ otros. (2002) Clin. Cáncer Res. 8:1 172; Kirpotin otros. (2006) Cáncer Res. 66:6732). La calibración del modelo resultó en tan sólo diferencias mínimas en los valores de parámetros en comparación con el modelo del Ejemplo 4. La diferencia más significativa fue una reducción en las tasas de internalización y degradación para el receptor ErbB. Este cambio es consistente con los datos conocidos que sugieren que la sobreexpresión de ErbB2 reduce las tasas de internalización/tráfico de otros receptores ErbB, como el ErbBl (ver, por ejemplo, Hendriks y otros, (2003) J. Biol. Chem. 278:23343-23351 ; Wang y otros. (1999) Mol. Biol. Cell 10:1621-1636; Haslekas y otros, (2005) Mol. Biol. Cell 16:5832-5842).

Para la preparación del modelo, se usó un conjunto de datos que comprendía las matrices dosis-tiempo en las que se midió por ELISA la fosforilación de ErbBl, ErbB2, ErbB3 y AKT en múltiples intervalos de tiempo y en seis concentraciones diferentes de estimulación para HRG en las células BT474-M3.

Para la estimulación de las células, las células se siembran en pocilios duplicados de 1000 µ? de medios completos con 150.000 células por pocilio en placas de cultivo de tejido de 12 pocilios (para 96 medios pocilios de ELISA) o en placa duplicada de 100 µ? de medios completos con 20.000 células por pocilio en placas de cultivo de tejido de 96 pocilios (para 384 pocilios de ELISA). Estas células se incubaron durante la noche en una atmósfera de humedad con 5% C02, 95% de aire y 37 grados centígrados. Las células se cambian después a los medios libres de suero: medios RPMI-1640 (Gibco) suplementado con, 2 mM de L-glutamina (Gibco) y las unidades/ml de Pen-Estrep (Gibco). Las células desnutridas se incuban en una atmósfera de humedad con 5% de C02, 95% de aire y 37 grados centígrados durante 20-24 horas previo a la estimulación. Para los estudios de la matriz tiempo-dosis, las células se estimularon con el ligando (HRG) a los 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 20, 30, 60 y 120 minutos. Después de la estimulación con seis concentraciones diferentes de HRG (0.098 nM-100 nM) para cada plazo de tiempo, las células se colocan en el hielo, se lavan con PBS frío, se Usan después en 200 µ? para placas de 12 pocilios y 45 µ? para placas de 96 pocilios en tampón de extracción para proteína de mamífero M-PER frío (Thermo Scientific, Catalogo # 78501) suplementado con el cóctel de inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich, P2714), lmM de ortovanadato de sodio (Sigma-Aldrich, S6508), 5mM de pirofosfato de sodio (Sigma-Aldrich, 221368), 50µ? de oxofenilarsina (EMD Biosciences, 521000) y 1 ?µ? de bpV(fen) (EMD Biosciences, 203695).

Los niveles de fosforilación de la proteína en las células estimuladas se miden por ELISA. ErbBl, ErbB2 y ErbB3 se miden mediante los kits R&D Systems Duoset IC (ErbBl DYC1095-E, ErbB2 DYC1768-E, ErbB3 DYC1769-E). Los anticuerpos de captura contra ErbBl (R&D Systems, 841402), ErbB2 (R&D Systems, 841425), ErbB3 (R&D Systems, 841428) y A T (Upstate, 05-59 IMG) se incuban toda la noche a temperatura ambiente en placas de 96 medios pocilios (Greiner, Catalogo # 82050-046) o placas de 384 pocilios (Nunc Catálogo # 40518) que son placas oscuras de alta unión poliestireno fondo plano. Las placas ELISA se bloquean con 2% de albúmina de suero bovino (BSA) y tampón fosfato salino (PBS) durante una hora y se incuban después con lisados diluidos en 2% de BSA, 0.1% Tween-20 y PBS durante dos horas a temperatura ambiente. Las placas ELISA se bloquean con 2% de albúmina de suero bovino (BSA) y tampón fosfato salino (PBS) durante una hora y después se incuban con lisados diluidos en 2% de BSA, 0.1% Tween-20 y PBS durante dos horas a temperatura ambiente. Entre cada incubación, las placas se lavan tres veces con 0.05% de Tween-20 en PBS. Los ELISA para medir el fosfo-ErbBl, fosfo-ErbB2 y fosfo-ErbB3 se incuban con el anticuerpo de detección Anti-Fosfo-Tirosina-HRP (R&D Systems, 841403) durante dos horas. Los ELISA que miden fosfo-AKT se incuban con el anticuerpo monoclonal primario de ratón anti-fosfo AKT específico a la serina 473 (Cell Signaling Technologies, Catálogo # 5102) durante 20 horas, y se incuban después con estreptavidina-HRP (R & D Systems, Catálogo #DY998,) durante 30 minutos. Todos los ELISA se visualizan con el sustrato quimioluminiscente SuperSignal ELISA Pico (Pierce, Catálogo # 37069) y la señal luminosa se mide mediante un luminómetro.

Como se muestra en la Figura 21, en todas las dosis de HRG experimentalmente examinadas, el modelo iguala los datos de la señalización de la pErbB3 inducida por HRG con la sobreexpresión de ErbB2 en la línea celular BT474-M3. Además, el modelo iguala los datos de la señalización de pAKT inducida por HRG en las células BT474-M3 en las dosis de HRG de aproximadamente 5 nM e inferiores.

A continuación, se desarrolló una representación computacional del mecanismo por el cual H3 x B1D2 inhibe la señalización de la vía ErbB dependiente de HRG. La representación computacional del inhibidor se construyó utilizando las ecuaciones de las reacciones de acción de masas que describen la unión del inhibidor a ErbB2 y ErbB3 y la inhibición siguiente de la señalización inducida por HRG. Los parámetros para los eventos de unión se obtienen mediante una combinación de la medición directa (que usa las técnicas ampliamente conocidas en la técnica) y la preparación computacional del modelo para hacer coincidir los datos de la inhibición por H3 x B1D2 de pErbB3 inducida por HRG en las células. En particular, la velocidad-de inicio y la velocidad-final para la unión del brazo de cadena simple H3 del anticuerpo biespecífico a ErbB3 y la velocidad-de inicio y la velocidad-final para la unión del brazo de cadena simple B1D2 del anticuerpo biespecífico a ErbB2 se determinaron experimentalmente por BIACore y tecnología KinExA estándares. Las reacciones y los parámetros para el modelo computacional de H3 x B1D2 aparecen en las Tablas 16a y 16b.

Tabla 16a Número de la Parámetros Parámetros reacción Reacción directos inversos Implementación con H3 x BlD2 E2 + (H3 x B1D2) <-> E2:(H3 x H3 x BlD2 vi B1D2) h3xbld2 kfl h3xbld2 krl (H3 x B1D2) + E3 <-> (H3 X H3 x BlD2 v2 B1D2):E3 h3xbld2 kf2 h3xbld2 kr2 E2 + (H3 x B1D2):E3 <-> E2:(H3 X H3 x BlD2 v3 B1D2):E3 h3xbld2 kf3 h3xbld2 krl E2:(H3 x B1D2) + E3 <-> E2:(H3 X H3 x BlD2 v4 B1D2):E3 h3xbld2 kf4 h3xbld2 kr2 E2:(H3 x B1D2) + E2:(H3 x B1D2) -> H3 x BlD2 v5 E2:E2 h3xbld2 kf5 H3 x BlD2 v6 E2:(H3 x B1D2) + E2 -> E2:E2 h3xbld2 kf5 H3 x BlD2 v7 E2:(H3 x B1D2) + E2_p -> E2:E2_p h3xbld2 kf5 H3 x BlD2 v8 E2:(H3 x B1D2) + El -> E1 :E2 h3xbld2 kf6 H3 x BlD2 v9 E2:(H3 x B1D2) + E3 -> E2:E3 h3xbld2 kf6 H3 x B1D2 vlO E2 + (H3 x B1D2):E3 -> E2:E3 h3xbld2 kf6 H3 X E2:(H3 x B1D2) + E3:HRG -> B1D2 vi l E2:E3:HRG h3xbld2 kf7 H3 X E2:(H3 x B1D2) + E3:HRG_p <-> B1D2 vl2 E2:E3:HRG_p h3xbld2 kf7 H3 X B1D2 vl3 El + (H3 x B1D2):E3 -> E1 :E3 h3xbld2 kf8 **En este esquema de reacción, la cantidad de (H3 x B1D2) libre se mantiene constante.

Tabla 16B Nombre Valor Unidades Parámetros de H3 x B1D2 h3xbld2 kfl 3.13E+04 (mol/L)-l seg-1 h3xbld2 krl 1.50E-04 seg-1 h3xbld2 kf2 3.50E+05 (mol/L)-l seg-1 h3xbld2 kr2 2.20E-02 seg-1 h3xbld2 kD 1.08E-06 (moléculas/célula)-lseg-l h3xbld2 kf4 1.20E-05 (moléculas/célula)- 1 seg- 1 h3xbld2 kf5 1.67E-08 (moléculas/célula)- 1 seg- 1 h3xbld2 kf6 5.00E-08 (moléculas/célula)- 1 seg- 1 h3xbld2 kf7 5.00E-07 (moléculas/célula)- 1 seg- 1 h3xbld2 kf8 5.00E-08 (moléculas/célula)- 1 seg- 1 El modelo de señalización de ErbB se combinó con el modelo del inhibidor y se usaron para predecir los datos experimentales durante la inhibición de la señalización de pErbB3 y pAKT por H3 x B1D2. Los datos experimentales se generaron usando la misma metodología que se describió anteriormente, excepto que las concentraciones de H3 x B1D2 que están en el intervalo de 15 pM hasta ?µ? se adicionaron durante la inanición del suero. Además, los datos de la inhibición se generaron usando un intervalo de tiempo en la lisis de diez minutos después de 5 nM de la estimulación con HRG. El modelo recapituló exitosamente los resultados experimentales que muestran que la IC50 de la inhibición de H3 x B1D2 no cambió mucho en las diferentes líneas celulares, pero el porcentaje de inhibición se desvió mucho. Una causa principal del cambio de porcentaje de inhibición fue el nivel de expresión de ErbB2. Esto se demostró en experimentos donde la ErbB2 se transfectó en la línea celular OVCAR8 para crear una línea celular que sobreexpresa la ErbB2 (referida como OVCAR8-HER2). Las curvas de inhibición de pErbB3 y pAKT para las células OVCAR8 tratadas con H3 x B1D2 se compararon con curvas de inhibición similares para las células OVCAR8- HER2 tratadas con H3 x B1D2. Los resultados se muestran en las Figuras 17A-D, donde las Figuras 17A y 17B muestran las curvas de inhibición de pErbB3 y pAKT, respectivamente, en las células OVCAR8 tratadas con H3 x B1D2 (ya sea de manera experimental o simulada en el modelo) y las Figuras 17C y 17D muestran las curvas de inhibición de pErbB3 y pAKT, respectivamente, en las células OVCAR8-HER2 tratados con H3 x B1D2 (ya sea de manera experimental o simulada en el modelo). El IC5o para las células experimentalmente tratadas ("datos DR50") y las células tratadas con simulación ("DR50sim") se muestran también. Los datos muestran que niveles superiores de los niveles de expresión de ErbB2 resultan en mayor porcentaje de inhibición por el tratamiento con H3 x B1D2.

Además del papel principal de ErbB2 en la modulación del porcentaje de inhibición, un papel inesperado para ErbBl se reveló por el modelo computacional. Este papel de ErbBl se ejemplificó por una simulación que muestra el efecto de la adición del ARNi de ErbBl a las células ADRr, para simular la desregulación de ErbBl. Las células ADRr sólo expresan bajos niveles de ErbB2 y exhiben un porcentaje pobre de inhibición por H3 x B1D2 tanto en el modelo computacional como en los datos determinados experimentalmente. Este dato se muestra en las Figuras 18A y 18B, que muestran las curvas de inhibición para pErbB3 y pAKT, respectivamente, en las células ADRr tratadas con H3 x B1D2, ya sea de manera experimental o simulada en el modelo. El IC50 para las células experimentalmente tratadas ("datos DR50") y las células tratadas con simulación ("DR50sim") se muestran también. Sin embargo, la desregulación de la expresión ErbBl (por la simulación de- la adición de ARNi) resultó en un mayor porcentaje de inhibición en la simulación, como se muestra en las Figuras 18C y 18D, que muestran las curvas de inhibición de pErbB3 y pAKT, respectivamente, en las células ADRr simuladas para el tratamiento con ErbBl RNAi y H3 x B1D2. La implicación de los resultados de la simulación del ARNi de ErbBl es que la expresión ErbBl es un biomarcador de respuesta negativa para H3 x B 1 D2.

En resumen, los datos del modelo computacional y los experimentales indicaron que existen dos mecanismos para modular negativamente la capacidad de respuesta a la H3 x B1D2 in vitro (i) un nivel insuficientemente alto de ErbB2, y (ii) los niveles elevados de ErbBl. Por el contrario, los niveles elevados de expresión de ErbB2 y los bajos niveles de expresión de ErbBl se correlacionan con la capacidad de respuesta aumentada a H3 x B1D2.

Ejemplo 12: La capacidad de respuesta In vivo con H3xBlD2 se correlaciona con la capacidad de respuesta predicha de un modelo computacional En este ejemplo, la capacidad de respuesta in vivo de los tumores al tratamiento con H3 x B1D2 se correlacionó con los niveles calculados de los diversos componentes de la vía ErbB para identificar los biomarcadores directos e indirectos de la capacidad de respuesta al tratamiento con H3 x B1D2.

Para caracterizar la respuesta in vivo de los tumores al tratamiento con H3 x B1D2, un panel de líneas celulares tumorales se probaron en un modelo tumoral de xenoinjerto, tal como se describe en el Ejemplo 1. En los modelos tumorales de xenoinjertos, los ratones (ratones nu/nu: ratones hembras de 4-5 semanas de edad, deficiente de células T, de fondo consanguíneo; albinos; de los Laboratorios Charles River, Wilmington, MA) se implantan en 6 7 el lado derecho con 5 x 10 -2 x 10 células/ratón (en dependencia de la línea celular) en 200 µ? por inyección subcutánea. Los ratones se supervisan por el crecimiento inicial del tumor. Las células tumorales se les permiten crecer durante varios días hasta que el volumen tumoral medio sea aproximadamente 150-200 mm . El volumen tumoral se calcula como: V = (p/6 (L x W ). Los ratones se tratan con el anticuerpo H3 x B1D2 a una dosis de 600 cada 3 días (qd3). Los ratones de control se tratan con tampón fosfato salino (PBS) o con HSA (albúmina de suero humano) tipo salvaje. El volumen de tumor se mide durante 40-80 días.

Los siguientes doce líneas celulares tumorales se examinaron: ACHN, ADRr, IGROV1, LS180, MIA PaCa2, ZR75-1, la MDA-MB-361, ADrR-HER2 (células ADrR transfectadas para sobreexpresar HER2), NCI-N87, CALU-3, SKOV-3 y M3-BT474. Para el uso de estas líneas celulares en el modelo computacional, los niveles de ErbBl, ErbB2, y ErbB3 expresados en cada línea celular se determinaron experimentalmente mediante los métodos descritos anteriormente o por variaciones mínimas de éstos, cuyos resultados se muestran a continuación en la Tabla 17: Tabla 17: Niveles del receptor ErbB Línea celular ErbBl ErbB2 ErbB3 ACHN 448284 45456 15200 ADrR 177818 40792 33205 BT474-M3 129436 1706601 49238 SKOV3 264132 1377661 13694 ZR75-1 37409 199132 39492 IGROV1 149031 158418 5355 0VCAR8 236157 53272 31813 MDA-MB-361 65855 371731 32981 NCI-N87 417753 1233479 34678 Calu-3 161357 1 196976 30031 LS180 122520 143339 28841 MIAPaCa-2 138563 84865 5735 ADrR-HER2 271000 722000 34400 Los datos de control y tratamiento de los experimentos de xeno injerto in vivo se ajustaron a las curvas de crecimiento exponencial, mediante la siguiente fórmula: V = Vo*exp (k*t) donde V es el volumen tumoral, Vo es el volumen tumoral en el momento cero, k es la tasa de crecimiento exponencial y t es el tiempo. La potencia de H3 x B1D2 para inhibir el crecimiento tumoral se representó como el cociente entre las velocidades de crecimiento exponencial del tratamiento y control para cada línea celular ensayada. Este cociente se denominó "tasa de crecimiento relativo" (RGR) y se representa como: RGR = kH3xBlD2 kcontrol Una tasa de crecimiento relativo (RGR), de 1 significa que el agente no tuvo ningún efecto. Un RGR de 0 significa que el agente detuvo el crecimiento del tumor por completo. Un RGR negativo significa que el agente causa la regresión del tumor.

De las doce líneas celulares examinadas, sólo BT474-M3 tuvo un RGR negativo (es decir, H3 x B1D2 causó la regresión del tumor sólo en esta línea celular). Dos líneas celulares, IGROV1 y LSI 80, tuvieron valores de RGR superiores a 1, lo que indica que H3x B1D2 no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento tumoral de estas líneas celulares. Los nueve líneas celulares restantes tenían valores RGR entre 0 y 1, lo que indica que H3 x B1D2 inhibió parcialmente el crecimiento tumoral de estas líneas celulares.

Los valores de RGR de las doce líneas celulares se representaron contra los niveles calculados del modelo de monómero de ErbB2, el homodímero ErbB2:ErbB2 y el heterodímero ErbB2:ErbB3 en las líneas celulares en la ausencia del inhibidor de H3 x B1D2, sobre la base de los niveles medidos de ErbBl, ErbB2 y ErbB3 en cada una de las líneas celulares. Los resultados se ilustran en las Figuras 19A-C, que muestran los gráficos de las tasas de crecimiento relativo (RGR) determinados, in vivo, para el panel de células tumorales en el modelo de xenoinjerto tratado con H3 x B1D2 que se representa contra los niveles calculados de monómeros ErbB2 (Figura 19 A), homodímeros ErbB2:ErbB2 (Figura 19B) y heterodímeros ErbB2: ErbB3 (Figura 19C) en el panel de células tumorales en ausencia de H3 X B1D2.

Los resultados en la Figura 19 muestran que existe una relación lineal entre la RGR y los niveles calculados de monómeros ErbB2, homodímeros ErbB2:ErbB2 y heterodímeros ErbB2:ErbB3. Teniendo en cuenta esta observación, la medición directa de monómeros ErbB2, homodímeros ErbB2:ErbB2 y/o heterodímeros ErbB2:ErbB3 se puede usar como biomarcadores directos de la capacidad de respuesta a H3 x B1D2. Además, la medición de ErbBl, ErbB2 y ErbB3 en una muestra tumoral se puede usar para calcular los niveles de homodímeros ErbB2:ErbB2 y/o heterodímeros ErbB2:ErbB3 para estratificar la capacidad de respuesta del tumor al tratamiento con H3 x B1D2 (es decir, los niveles medidos de ErbBl, ErbB2 y ErbB3 se pueden usar como biomarcadores indirectos de la capacidad de respuesta a H3 x B1D2, que se usa para calcular los niveles de homodímeros ErbB2:ErbB2 y/o heterodímeros ErbB2:ErbB3). De este modo, los niveles calculados de, por ejemplo, homodímeros ErbB2:ErbB2 y/o heterodímeros ErbB2:ErbB3 se pueden usar como un valor del estado de activación de la red (ÑAS) sobre el cual la capacidad de respuesta al tratamiento con H3 x B1D2 se puede predecir.

Los valores de RGR de las doce líneas celulares se representaron también contra los niveles relativos calculados (por ejemplo, el cociente) del heterodímero ErbB2:ErbB2 y el heterodímero ErbBl :ErbB3 en las líneas celulares en ausencia y presencia simulada del inhibidor H3 x B1D2. Un nivel relativo menor indica que el H3 x B1D2 puede inhibir con más potencia la formación de esa especie de heterodímeros. Los resultados que se ilustran en las Figuras 20A-B, muestran los gráficos de las tasas de crecimiento relativo determinadas, in vivo, (RGR) para un panel de células tumorales en un modelo de xenoinjerto tratados con H3 x B1D2 que se representan contra los niveles relativos calculados del heterodímero ErbB2: ErbB3 (Figura 20 A) y el heterodímero ErbBl :ErbB3 (Figura 20B) en el panel de células tumorales en la presencia simulada de H3 x B1D2, en comparación con los niveles simulados de los heterodímeros en ausencia simulada de H3 x B1D2.

Los resultados en la Figura 20 muestran una correlación entre la capacidad del inhibidor para desestabilizar los heterodímeros ErbB2: ErbB3 y ErbBl :ErbB3 y la tasa de crecimiento relativo de los tumores. Es decir, las células tumorales (por ejemplo, las células BT474-M3) en las que los niveles relativos calculados de los heterodímeros ErbB2:ErbB3 y ErbBl :ErbB3 son bajos en presencia simulada del inhibidor H3 x B1D2 (es decir, la desestabilización del heterodímero por el inhibidor es alta) presentan los valores más bajos de RGR (lo que indica un mayor efecto del inhibidor sobre el crecimiento tumoral). En contraste, las células tumorales (por ejemplo, las células ACHN) en las que los niveles relativos calculados de los heterodímeros ErbB2:ErbB3 y ErbBl:ErbB3 son altos en la presencia simulada del inhibidor H3 x B1D2 (es decir, la desestabilización del heterodímero por el inhibidor es baja) presentan los valores más altos de RGR (lo que indica un menor efecto del inhibidor sobre el crecimiento del tumor). Estos resultados demuestran que simular la presencia del agente terapéutico en el modelo computacional de la vía de señalización, en comparación con la ausencia simulada del agente terapéutico, permite la generación de un estado de Inhibición de la red (NEI), en base a los niveles relativos de los heterodímeros ErbB2:ErbB3 o ErbBl :ErbB3, cuyos NIS pueden ser usados como una predicción de la capacidad de respuesta de las células tumorales al agente terapéutico in vivo.

Ejemplo 13; Medición de la afinidad de unión (KD) Las constantes de disociación de los anticuerpos anti-ErbB se pueden medir usando una o las dos técnicas independientes, un ensayo de resonancia de plasmón superficial y un ensayo de unión celular.

Ensayo de resonacia de plasmón superficial El ensayo de resonancia de plasmón superficial se realiza como se describe en Wassaf y otros, (2006) Analytical Biochem.,35l :24l-253. Una implementación preferida usa un instrumento BIACORE 3000 (GE Healthcare) que usa una proteína recombinante ErbB como el analito y el anticuerpo anti-ErbB como el ligando. El valor de Kose calcula basado en la fórmula KD = K,j/KA.

Ensayo de unión celular Un ensayo de unión celular se realiza usando las células A-431 para la unión de ErbBl , las células ZR-75-1 para la unión de ErbB2 o las células MALME-3M para la unión de ErbB3 (todas de la ATCC). El ensayo se realiza básicamente como sigue.

Las células se separan con 2 mi de tripsina-EDTA y 2 mi de RMPI + 5 mM EDTA a temperatura ambiente durante 5 minutos. El RPMI completo (10 mi) se adiciona de inmediato a las células tripsinizadas, se resuspenden suavemente y se centrifugan en una centrífuga de mesa Beckman a 1100 rpm durante 5 minutos. Las células se resuspenden en tampón de tinción BD (PBS + 2%FBS + 0,1% de azida de sodio, Becton Dickinson) a una concentración de 2 x 106 células por mi y 50 µ? de las alícuotas (1 x 105 células) se colocan en una placa de titulación de 96 pocilios.

Una solución de 150 µ? de 200 nM de anticuerpos anti-ErbB en tampón de tinción BD se prepara y se diluye 2 veces en serie en 75 µ? tampón de tinción BD. Las concentraciones de los anticuerpos diluidos se extendieron desde 200 nMhasta 0,4 nM. Las alícuotas de 50 µ? de las diferentes diluciones de proteína se adicionaron directamente después a la suspensión celular de 50 µ? dando las concentraciones finales del anticuerpo de 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12 nM, 6 nM, 3 nM, 1,5 nM, 0,8 nM, 0,4 nM y 0.2 nM.

Las células alícuotadas en la placa de 96 pocilios se incubaron con las diluciones de la proteína durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de plataforma y se lavaron tres veces con 300 µ? tampón de tinción BD. Las células se incubaron con 100 µ? del anticuerpo secundario (por ejemplo, una dilución 1 :750 de la IgG de carnero anti-humana marcada con Alexa 647 en tampón de tinción BD) durante 45 minutos en un agitador de plataforma en el cuarto frío. Por último, las células se lavaron dos veces, se centrifugaron para obtener el sedimento celular y se resuspendieron en 250 µ? de tampón de tinción BD + 0,5 µ^??? de yoduro de propidio. Los análisis de 10,000 células se realizaron en un citómetro de flujo FACSCALIBUR que usa el canal FL4. Los valores de MFI y las concentraciones correspondientes de los anticuerpos anti-ErbB se representan en el eje y el eje x, respectivamente. El KD de la molécula se determina mediante el software GraphPad PRISM que usa el modelo de unión de un sitio para una curva de regresión no lineal.

El valor de KD se calcula sobre la base de la fórmula Y = Bmax*X/Ko + X (Bmáx = fluorescencia en la saturación. X = concentración de anticuerpo. Y = grado de unión).

Claims (104)

REIVINDICACIONES:

1. Un método para tratar un paciente que tiene un tumor neoplásico, dicho método comprende: obtener una muestra del tumor, determinar un nivel de pErbB3 en la muestra, y posteriormente administrar al menos un agente terapéutico anti-neoplásico al paciente, el método carcaterizado porque, si el nivel de pErbB3 determinado en la muestra no es menor que 50% de un nivel de pErbB3 medido en un cultivo de células ACHN seguido por el cultivo 20-24 horas en medio libre de suero, entonces el al menos un agente terapéutico anti-neoplásico que se administra posteriormente al paciente comprende un anticuerpo anti-ErbB3, y si el nivel de pErbB3 determinado en la muestra es menor que 50% del nivel de pErbB3 medido en el cultivo de células ACHN, entonces el al menos un agente terapéutico anti-neoplásico que se administra posteriormente al paciente no comprende un anticuerpo anti-ErbB3.

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el nivel de pErbB3 en la muestra se determina por: (a) medir un nivel para cada uno de al menos dos componentes de la vía de señalización ErbB3 en la muestra; (b) calcular un estado de activación de la red que simula el nivel de pErbB3 en la muestra usando los niveles medidos en (a) introducidos en un modelo computacional de la vía de señalización ErbB3; y (c) determinar de ahí el nivel de pErbB3 en la muestra.

3. Un método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque, al menos un componente para el cual se mide el nivel, se selecciona de ErbBl, ErbB2, ErbB3, ErbB4, heregulina, betacelulina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento epidérmico de unión a la heparina, factor de crecimiento transformante alfa, anfiregulina, epigen, y epiregulina.

4. Un método de conformidad con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, caracterizado además porque un componente para el cual se mide el nivel es una proteína que es un monómero, un homodímero o un heterodímero.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el heterodímero es un heterodímero ErbBl/ErbB3 o un heterodímero ErbB2/ErbB3.

6. Un método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el nivel de la proteína se mide por clasificación cuantitativa de las células activadas por fluorescencia, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, inmunohistoquímica, inmunohistoquímica cuantitativa, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, transferencia de energía por resonancia Foster, complementación de fluorescencia biomolecular, espectrometría de masa, ensayo de inmunotransferencia o ensayo de coinmunoprecipitación.

7. Un método de conformidad con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, caracterizado además porque un componente detectado en (a) es un ARNm.

8. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-7, caracterizado además porque el cálculo de un estado de activación de la red comprende un modelo de computadora de la vía de señalización ErbB3 que comprende un modelo mecanicista o un algoritmo de clasificación estadística.

9. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-8, caracterizado además porque el estado de activación calculado de la red simula un nivel de al menos uno de pErbB3, heterodímero ErbBl/ErbB3 fosforilado y heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado en la muestra.

10. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado además porque el tumor es un tumor maligno de un órgano seleccionado de colon, pulmón, recto, vesícula biliar, cerebro, médula espinal, mamas, riñon, páncreas, estómago, hígado, huesos, piel, bazo, ovarios, testículos, próstata y músculos.

1 1. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado ademas porque el anticuerpo anti-ErbB3 comprende al menos uno de: (i) un anticuerpo Ab #6 que tiene secuencias de región variable de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) como se muestra en las sec. con núm. de ident: 1 y 2, respectivamente, o un anticuerpo que tiene secuencias CDR de VH y VL de Ab #6 como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 7-9 y 10-12, respectivamente; (ii) Ab #3 que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 3 y 4, respectivamente, o un anticuerpo que comprende secuencias CDR de VH y VL de Ab #3 mostradas en las sec. con núm. de ident.: 13-15 y 16-18, respectivamente; (iii) Ab #14 que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 5 y 6, respectivamente, o un anticuerpo que comprende secuencias CDR de VH y VL de Ab #14 mostradas en las sec. con núm. de ident.: 19-21 y 22-24, respectivamente; (iv) Ab #17 que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 25 y 26, respectivamente, o un anticuerpo que comprende secuencias CDR de VH y VL de Ab #17 mostradas en las sec. con núm. de ident.: 27-29 y 30-32, respectivamente; y (v) Ab #19 que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 33 y 34, respectivamente, o un anticuerpo que comprende secuencias CDR de VH y VL de Ab # 19 mostradas en las sec. con núm. de ident.: 35-37 y 38-40, respectivamente.

12. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado además porque el anticuerpo anti-ErbB3 comprende MM-121.

13. Un método computarizado usando un sistema de computación que comprende al menos un dispositivo de entrada configurado para recibir entradas y al menos un dispositivo de salida configurado para producir las salidas, dicho método predice la respuesta de las células y comprende un red celular para el tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de la red celular, dicho método carcaterizado porque comprende: (a) recibir, a través de dicho dispositivo de entrada del sistema de computación, la entrada que identifica los niveles de uno o más componentes en la red celular medidos en una muestra de las células; (b) calcular a partir de la entrada, con el sistema de computación, un estado de activación de la red o un estado de inhibición de la red para las células usando un modelo computacional mecanicista de la red celular; y (c) generar con el sistema de computación, y producir en dicho dispositivo de salida, una respuesta predicha de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado al menos, en parte, en el estado de activación de la red o el estado de inhibición de la red calculados en (b).

14. Un método computarizado que usa un sistema de computación que comprende al menos un dispositivo de entrada configurado para recibir entradas y al menos un dispositivo de salida configurado para producir las salidas, dicho método predice la respuesta de las células y comprende un red celular para el tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de la red celular, dicho método caracterizado porque comprende: (a) recibir, a través de dicho dispositivo de entrada del sistema de computación, la entrada que identifica los niveles de uno o más componentes en la red celular medidos en una muestra de las células; (b) calcular a partir de la entrada, con el sistema de computación, un estado de activación de la red o un estado de inhibición de la red para las células usando un modelo computacional de la red celular que comprende un algoritmo de clasificación estadística; y (c) generar con el sistema de computación, y producir en dicho dispositivo de salida, una respuesta predicha de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado al menos, en parte, en el estado de activación de la red o el estado de inhibición de la red calculados en (b).

15. Un método para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de una red celular, el método caracterizado porque comprende: (a) medir el nivel en una muestra de las células de uno o más componentes de la red celular; y (b) aplicar un método implementado por computadora que comprende: calcular un estado de activación de la red o un estado de inhibición de la red para las células usando un modelo computacional mecanicista de la entrada de la red celularcon los niveles medidos en (a); y predecir la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado, al menos, en parte, en un algoritmo de clasificación estadística que utiliza la entrada del modelo computacional mecanicista.

16. Un método computarizado que usa un sistema de computación que comprende al menos un dispositivo de entrada configurado para recibir entradas y al menos un dispositivo de salida configurado para producir las salidas, dicho método predice la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de una red celular, el método caracterizado porque comprende: (a) recibir, a través de dicho dispositivo de entrada del sistema de computación, la entrada que identifica los niveles de uno o más componentes en una red celular medidos en una muestra de las células; (b) calcular con el sistema de computación un estado de activación de la red o un estado de inhibición de la red para las células usando un modelo computacional de la red celular; y (c) generar con el sistema de computación, y producir en dicho dispositivo de salida, una respuesta predicha de las células al tratamiento con el agente terapéutico.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado además porque la red celular comprende una vía de señalización ErbB.

18. El método de la reivindicación 17, caracterizado además porque un componente para el cual se mide un nivel es un ligando del receptor ErbB involucrado en la vía de señalización ErbB.

19. El método de la reivindicación 18, caracterizado además porque el ligando del receptor ErbB es heregulina, betacelulina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento epidérmico de unión a la heparina, factor de crecimiento transformante alfa, anfiregulina, epigen o epiregulina.

20. El método de la reivindicación 17, caracterizado además porque un componente para el cual se mide un nivel es un receptor involucrado en la vía de señalización ErbB.

21. El método de la reivindicación 20, caracterizado además porque el receptor es ErbBl , ErbB2, ErbB3 o ErbB4.

22. El método de la reivindicación 17, caracterizado además porque el agente terapéutico comprende un anticuerpo anti-EGFR.

23. El método de la reivindicación 22, caracterizado además porque el anticuerpo anti-EGFR es un anticuerpo seleccionado de cetuximab, matuzumab, panitumumab, nimotuzumab y mAb 806.

24. El método de la reivindicación 17, caracterizado además porque el agente terapéutico comprende un anticuerpo anti-ErbB2.

25. El método de la reivindicación 24, caracterizado además porque el anticuerpo anti-ErbB2 comprende trastuzumab.

26. El método de la reivindicación 17, caracterizado además porque el agente terapéutico comprende un anticuerpo anti-ErbB3.

27. El método de la reivindicación 26, caracterizado además porque el anticuerpo anti-ErbB3 comprende al menos uno de: (i) un anticuerpo Ab #6 que tiene secuencias de región variable de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 1 y 2, respectivamente, o un anticuerpo que tiene secuencias CDR de VH y VL de Ab #6 como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 7-9 y 10-12, respectivamente; (ii) Ab #3 que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 3 y 4, respectivamente, o un anticuerpo que comprende secuencias CDR de VH y VL de Ab #3 mostradas en las sec. con núm. de ident.: 13-15 y 16-18, respectivamente; (iii) Ab #14 que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 5 y 6, respectivamente, o un anticuerpo que comprende secuencias CDR de VH y VL de Ab #14 mostradas en las sec. con núm. de ident.: 19-21 y 22-24, respectivamente; (iv) Ab #17 que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 25 y 26, respectivamente, o un anticuerpo que comprende secuencias CDR de VH y L de Ab #17 mostradas en las sec. con núm. de ident.: 27-29 y 30-32, respectivamente; (v) Ab #19 que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 33 y 34, respectivamente, o un anticuerpo que comprende secuencias CDR de VH y VL de Ab #19 mostradas en las sec. con núm. de ident.: 35-37 y 38-40, respectivamente; (vi) MM-121 ; y (vii) U3-1287.

28. El método de la reivindicación 26, caracterizado además porque el anticuerpo anti-ErbB3 es un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo anti-ErbB3 unido a un anticuerpo anti-ErbB2.

29. El método de la reivindicación 28, caracterizado además porque el anticuerpo biespecífico comprende un anticuerpo biespecífico H3 x B1D2 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la sec. con núm. de ident.: 41, o un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo que comprende secuencias CDR de VH y VL de H3 mostradas en las sec. con núm. de ident.: 42-44 y 45-47, respectivamente, unidas a un anticuerpo que comprende secuencias CDR de VH y VL de B1D2 de las sec. con núm. de ident.: 48-50 y 51-53, respectivamente.

30. El método de la reivindicación 17, caracterizado además porque el agente terapéutico comprende dos o más anticuerpos anti-ErbB3, cada uno de los anticuerpos se une a un epítopo diferente en ErbB3.

31. El método de la reivindicación 26, caracterizado además porque el anticuerpo anti-ErbB3 es MM-121.

32. El método de la reivindicación 17, caracterizado además porque el agente terapéutico comprende un anticuerpo anti-ErbB4.

33. El método de la reivindicación 17, caracterizado además porque el agente terapéutico comprende un inhibidor pan-ErbB o un inhibidor de dimerización HER.

34. El método de la reivindicación 33, caracterizado además porque el agente terapéutico comprende pertuzumab.

35. El método de la reivindicación 17, caracterizado además porque el agente terapéutico comprende un inhibidor de molécula pequeña de una vía de señalización ErbB seleccionado de gefitinib, lapatinib, CI-1033, erlotinib HCL, PKI-166, PD- 158780, EKB-569 y 4-(3-cloroanilino)-6,7-dimetoxiquinazolina.

36. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado además porque la red celular comprende una vía de señalización c-Met.

37. El método de la reivindicación 36, caracterizado además porque el agente terapéutico comprende un anticuerpo anti-c-Met o anti-HGF.

38. El método de la reivindicación 37, caracterizado además porque el agente terapéutico es seleccionado de AV299, AMG102 y 5D5.

39. El método de la reivindicación 37, caracterizado además porque el agente terapéutico comprende un anticuerpo biespecífico monoclonal que comprende un o anticuerpo anti-HGF unido a un anticuerpo anti-ErbB 1.

40. El método de la reivindicación 36, caracterizado además porque el agente terapéutico comprende un inhibidor de molécula pequeña de señalización c-Met.

41. El método de la reivindicación 40, caracterizado además porque el inhibidor de molécula pequeña de señalización c-Met es A Q 197 o PHA665752.

42. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado además porque la red celular comprende una vía de señalización del receptor del factor 1 de crecimiento insulínico (IGF IR).

43. El método de la reivindicación 42, caracterizado además porque el agente terapéutico comprende un anticuerpo anti-IGFIR.

44. El método de la reivindicación 43, caracterizado además porque el anticuerpo anti-IGFIR es mAb391, IMC-A12, 19D12, H7C10, CP751,871, SCV/FC y EM/164.

45. El método de la reivindicación 43, caracterizado además porque el anticuerpo anti-IGF1R comprende un anticuerpo biespecífico monoclonal que comprende un anticuerpo anti-IGF1R unido a un anticuerpo anti-ErbB3.

46. El método de la reivindicación 42, caracterizado además porque el agente terapéutico comprende un inhibidor de molécula pequeña de una vía de señalización IGF IR seleccionado de NVP-AEW541, NVP-ADW742, NVP-TAE226, BMS-536, 924, BMS-554, 417, PQ401 y ciclolignanos.

47. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado además porque la red comprende una vía de señalización ErbB y los componentes para los que se miden los niveles son ErbBl y heregulina.

48. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado además porque la red comprende una vía de señalización ErbB y los componentes para los que se miden los niveles son ErbBl, ErbB2 y ErbB3.

49. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado además porque la red comprende una vía de señalización ErbB y los componentes para los que se miden los niveles son ErbBl, ErbB2, ErbB3, heregulina y betacelulina.

50. El método de cualquiera de las reivindicaciones 47-49, caracterizado además porque el estado de activación de la red calculado en (b) simula los niveles de una o más proteínas fosforiladas en la vía de señalización ErbB3.

51. El método de la reivindicación 50, caracterizado además porque el estado de activación de la red calculado en (b) simula los niveles de ErbB3 fosforilado en la muestra de las células.

52. El método de la reivindicación 50, caracterizado además porque el estado de activación de la red calculado en (b) simula los niveles de un heterodímero ErbBl ErbB3 fosforilado o un heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado en la muestra de las células.

53. El método de la reivindicación 49, caracterizado además porque el estado de activación de la red calculado en (b) simula los niveles de homodímeros ErbB2:ErbB2 o heterodímeros ErbB2:ErbB3 en ausencia del agente terapéutico.

54. El método de la reivindicación 52, caracterizado además porque el NIS calculado en (b) simula los niveles del heterodímero ErbB2:ErbB3 o heterodímero ErbBl :ErbB3 en presencia del agente terapéutico, comparado con los niveles del heterodímero ErbB2:ErbB3 o heterodímero ErbBl :ErbB3 en ausencia del agente terapéutico.

55. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado porque comprende, además, el sistema de computación que recibe, a través de un dispositivo de entrada, la entrada que identifica el estado de la mutación de al menos un gen seleccionado de KRAS, PI3K y PTEN.

56. El método de la reivindicación 55, caracterizado además porque los componentes para los que se miden los niveles son betacelulina y anfiregulina y el método, además del sistema de computación, recibe a través de un dispositivo de entrada, la entrada que identifica el estado de la mutación del gen KRAS.

57. El método de la reivindicación 55, caracterizado además porque uno o más de los componentes para los que se miden los niveles se seleccionan de ErbBl, ErbB2, ErbB3, heregulina, betacelulina, anfiregulina, factor de crecimiento epidérmico de unión a la heparina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento transformante alfa, epigen y epiregulina, y el método comprende, además, determinar el estado de la mutación del gen KRAS o el sistema de computación que recibe, a través de un dispositivo de entrada, la entada que identifica el estado de la mutación del gen KRAS.

58. El método de la reivindicación 56 ó 57, caracterizado además porque el estado de activación de la red calculado en (b) simula los niveles de uno o más proteínas fosforiladas en la vía de señalización ErbB.

59. El método de cualquiera de las reivindicaciones 50-58, caracterizado además porque los valores del estado de activación de la red o estado de inhibición de la red calculados para una pluralidad de respondedores y no respondedores conocidos al agente terapéutico se usan para establecer valores umbrales del estado de activación de la red o estado de inhibición de la red, que indican la respuesta o la no respuesta al agente terapéutico.

60. El método de la reivindicación 59, caracterizado además porque la respuesta de las células al tratamiento se predice al comparar el estado de activación de la red o estado de inhibición de la red calculado en (b) con los valores umbrales del estado de activación de la red o estado de inhibición de la red, que indican la respuesta o la no respuesta al agente terapéutico.

61. El método de la reivindicación 15 ó 16, caracterizado además porque aplicar un algoritmo de clasificación estadística comprende introducir en el algoritmo uno o más puntos de información seleccionados de: 1. los niveles de uno o más componentes de la red celular determinados en (a); 2. el estado de activación de la red o estado de inhibición de la red calculados en (b); 3. el estado de la mutación de uno o más genes en la muestra de las células; 4. la edad del sujeto que se va a tratar con el agente terapéutico; 5. el género del sujeto que se va a tratar con el agente terapéutico; 6. la presencia o ausencia del receptor de estrógeno (ER) en las células; 7. la presencia o ausencia del receptor de progesterona en las células; y 8. la presencia o ausencia del receptor de andrógeno en las células.

62. Un método para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente de una vía de señalización ErbB, el método cracterizado porque comprende: (a) medir, en una muestra de las células, niveles de (i) heregulina y (ii) al menos un receptor seleccionado de ErbBl, ErbB2 y ErbB3; y (b) predecir, usando una computadora, la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado en los niveles medidos en (a), en donde niveles elevados de HRG y el al menos un receptor, en relación a un control, predicen la respuesta al tratamiento con el agente terapéutico.

63. Un método computarizado que usa un sistema de computación que comprende al menos un dispositivo de entrada configurado para recibir entradas y al menos un dispositivo de salida configurado para producir las salidas, dicho método predice la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente de una vía de señalización ErbB, el método caracterizado porque comprende: (a) recibir, a través de dicho dispositivo de entrada del sistema de computación, una entrada que identifica los niveles medidos de (i) heregulina y (ii) al menos un receptor seleccionado de ErbBl, ErbB2 y ErbB3, cuyos niveles se midieron en una muestra de las células; y (b) generar con el sistema de computación, y después de eso, producir en dicho dispositivo de salida, una respuesta predicha de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado en los niveles medidos, en donde los niveles elevados de HRG y el al menos un receptor, en relación a un control, predicen la respuesta al tratamiento con el agente terapéutico.

64. El método de la reivindicación 62 ó 63, caracterizado además porque los niveles medidos son niveles de HRG y ErbBl .

65. El método de la reivindicación 62 ó 63, caracterizado además porque los niveles medidos son niveles de HRG y ErbB2.

66. El método de la reivindicación 62 ó 63, caracterizado además porque los niveles medidos son niveles de HRG y ErbB3.

67. El método de la reivindicación 62 ó 63, caracterizado además porque los niveles medidos son niveles de HRG y al menos dos receptores seleccionados de ErbBl, ErbB2 y ErbB3.

68. El método de la reivindicación 62 ó 63, caracterizado además porque los niveles medidos son niveles de HRG, ErbB 1 , ErbB2 y ErbB3.

69. Un método para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente de una vía de señalización ErbB, el método caracterizado porque comprende: (a) medir, en una muestra de las células, niveles de uno o más de heterodímero ErbBl/ErbB3, monómeros ErbB2, homodímero ErbB2/ErbB2, heterodímero ErbB2/ErbB3, heterodímero ErbBl/ErbB3 fosforilado y heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado; y (b) predecir, usando una computadora, la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado en los niveles medidos en (a), en donde una diferencia en el nivel de heterodímero ErbBl/ErbB3, monómeros ErbB2, homodímero ErbB2/ErbB2, heterodímero ErbB2/ErbB3, heterodímero ErbBl/ErbB3 fosforilado o heterodímero ErbB2/ErbB3 fosforilado, en relación a un control, predicen la respuesta al tratamiento con el agente terapéutico.

70. Un método computarizado que usa un sistema de computación que comprende al menos un dispositivo de entrada configurado para recibir entradas y al menos un dispositivo de salida configurado para producir las salidas, dicho método predice la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente de una vía de señalización ErbB, el método caracterizado porque comprende: (a) recibir, a través de dicho dispositivo de entrada del sistema de computación, una entrada que identifica los niveles medidos de uno o más de heterodímeros ErbBl/ErbB3, monómeros ErbB2, homodímeros ErbB2/ErbB2, heterodímeros ErbB2/ErbB3, heterodímeros ErbBl/ErbB3 fosforilados y heterodímeros ErbB2/ErbB3 fosforilados, cuyos niveles se midieron en una muestra de las células; y (b) generar y producir, con el sistema de computación, una respuesta predicha de las células al tratamiento con el agente terapéutico basado en los niveles medidos, en donde una diferencia en el nivel de heterodímeros ErbBl/ErbB3, monómeros ErbB2, homodímeros ErbB2/ErbB2, heterodímeros ErbB2/ErbB3, heterodímeros ErbBl/ErbB3 fosforilados o heterodímeros ErbB2/ErbB3 fosforilados, en relación a un control, predicen la respuesta al tratamiento con el agente terapéutico.

71. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62, 63, 69 y 70, caracterizado además porque los niveles medidos son introducidos en un algoritmo de clasificación estadística y la respuesta de las células al tratamiento se predice en base al resultado del algoritmo.

72. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62, 63, 69 y 70, caracterizado además porque se calcula un estado de activación de la red o un estado de inhibición de la red basado en los niveles medidos usando un modelo computacional de una red celular ErbB.

73. El método de la reivindicación 72, caracterizado además porque la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico se predice en base al valor calculado del estado de activación de la red o estado de inhibición de la red.

74. El método de cualquiera de las reivindicaciones 62, 63, 69 y 70, caracterizado además porque el agente terapéutico comprende un anticuerpo anti-ErbB3.

75. El método de la reivindicación 76, en donde el anticuerpo anti-ErbB3 comprende un anticuerpo Ab #6 que tiene secuencias de región variable de cadena pesada (VH) y región variable de cadena ligera (VL) como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 1 y 2, respectivamente, o un anticuerpo que tiene secuencias CDR de VH y VL de Ab #6 como se muestra en las sec. con núm. de ident.: 7-9 y 10-12, respectivamente.

76. El método de la reivindicación 69 ó 70, en donde los niveles medidos son niveles del monómero ErbB2, homodímero ErbB2/ErbB2 y/o heterodímero ErbB2/ErbB3 y en donde el agente terapéutico es un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo anti-ErbB3 unido a un anticuerpo anti-ErbB2.

77. El método de la reivindicación 76, caracterizado además porque el anticuerpo biespecífico comprende un anticuerpo biespecífico H3 x B1D2 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la sec. con núm. de ident.: 41, o un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo que comprende secuencias CDR de VH y VL de H3 mostradas en las sec. con núm. de ident.: 42-44 y 45-47, respectivamente, unidas a un anticuerpo que comprende secuencias CDR de VH y VL de B1D2 mostradas en las sec. con núm. de ident.: 48-50 y 51-53, respectivamente.

78. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13-16, 62, 63, 69 y 70, caracterizado además porque las células son células de un tumor.

79. El método de la reivindicación 78, caracterizado además porque el tumor es un tumor de cáncer de mamas.

80. El método de la reivindicación 78, caracterizado además porque el tumor es un tumor de un tejido seleccionado de pulmón, recto, vesícula biliar, cerebro, médula espinal, mamas, riñon, páncreas, estómago, colon, hígado, huesos, piel, bazo, ovarios, testículos, próstata y músculos.

81. El método de la reivindicación 78, caracterizado además porque la muestra del tumor es seleccionada de tejido tumoral, aspirado con aguja fina, aspirado del pezón, células tumorales circulantes aisladas a partir de una muestra de sangre, sangre completa, suero, plasma, linfa, saliva y orina, o células tumorales liberadas o circulantes aisladas de ahí.

82. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13-81, caracterizado además porque los niveles medidos son niveles de proteína y las proteínas son monómeros, homodímeros o heterodímeros.

83. El método de la reivindicación 82, caracterizado además porque los niveles de proteína se miden por uno o más métodos seleccionados de clasificación cuantitativa de células activadas por fluorescencia, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, inmunohistoquímica, inmunohistoquímica cuantitativa, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, transferencia de energía por resonancia Foster, complementación de fluorescencia biomolecular, espectrometría de masa, ensayo de inmunotransferencia o ensayo de coinmunoprecipitación.

84. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13-81, caracterizado además porque los niveles medidos son niveles de ARNm.

85. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13-81, caracterizado además porque comprende, además, seleccionar un régimen de tratamiento basado en la respuesta predicha de las células al tratamiento.

86. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13-81, caracterizado porque comprende, además, seleccionar un régimen de tratamiento para la administración de dicho agente terapéutico basado en la respuesta predicha.

87. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13-81, caracterizado porque comprende, además, preparar dicho agente terapéutico para su uso en base a la respuesta predicha.

88. Un kit para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de una red celular, el kit caracterizado porque comprende: (a) un ensayo o ensayos para detectar niveles de uno o más componentes de la red celular; y (b) instrucciones para calcular un estado de activación de la red o un estado de inhibición de la red para las células usando un modelo computacional de la red celular.

89. Un kit de acuerdo con la reivindicación 88, caracterizado porque comprende, además: (c) instrucciones para el uso del kit para predecir la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico.

90. El kit de la reivindicación 88 ó 89, caracterizado porque comprende, además, instrucciones para aplicar un algoritmo de clasificación estadística.

91. El kit de la reivindicación 88 ó 89, caracterizado además porque el ensayo o ensayos para detectar niveles de uno o más componentes de la red celular comprende uno o más reactivos que permita la detección de los niveles de proteína de los componentes.

92. El kit de la reivindicación 88 ó 89, caracterizado además porque el ensayo para detectar niveles de uno o más componentes de la red celular comprende uno o más reactivos que permita la detección de los niveles de ARNm de los componentes.

93. El kit de la reivindicación 88 ó 89, caracterizado además porque las instrucciones para calcular un estado de activación de la red o un estado de inhibición de la red para las células son instrucciones para usar un producto de programa de computadora que contiene instrucciones ejecutables que cuando se ejecutan provocan que el procesador realice operaciones para calcular un estado de activación de la red o un estado de inhibición de la red para las células.

94. El kit de la reivindicación 88 ó 89, caracterizado además porque las instrucciones para calcular un estado de activación de la red o un estado de inhibición de la red para las células comprende instrucciones para un usuario del kit para interrelacionar con un servicio basado en internet que corre un programa de computadora que calcula un estado de activación de la red o un estado de inhibición de la red para las células con la introducción por el usuario de la información que indica los niveles de uno o más componentes de la red celular en las células.

95. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 88-94, caracterizado además porque la red celular es una vía de señalización ErbB.

96. El kit de la reivindicación 95, caracterizado además porque el kit comprende un ensayo o ensayos para detectar niveles de al menos un receptor de la vía de señalización ErbB y al menos un ligando de la vía de señalización ErbB.

97. El kit de la reivindicación 96, caracterizado además porque el kit comprende ensayos para detectar niveles de ErbB 1 , ErbB2, ErbB3, heregulina y betacelulina.

98. El kit de la reivindicación 95, caracterizado además porque el kit comprende ensayos para detectar niveles de ErbBl y heregulina.

99. El kit de la reivindicación 95, caracterizado además porque el kit comprende un ensayo o ensayos para detectar niveles de al menos uno de monómero ErbB2, homodímero ErbB2/ErbB2, heterodímero ErbB2/ErbB3 o heterodímero ErbBl/ErbB3.

100. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 88-99, caracterizado además porque las células son células tumorales.

101. A método para identificar un biomarcador para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de una red celular, el método caracterizado porque comprende: (a) medir, en una muestra de las células, niveles de uno o más componentes de la red celular; (b) aplicar un método implementado por computadora que comprende: (i) calcular los niveles de uno o más componentes adicionales de la red celular usando un modelo computacional de la red celular; y (ii) identificar un componente de la red celular cuyo nivel calculado predice la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico para identificar, de ese modo, el componente como un biomarcador para predecir la respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico.

102. Un método computarizado que usa un sistema de computación que comprende al menos un dispositivo de entrada configurado para recibir entradas y al menos un dispositivo de salida configurado para producir las salidas, dicho método identifica un biomarcador para predecir la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico que dirige un componente dentro de una red celular, el método caracterizado porque comprende: (a) recibir, a través de dicho dispositivo de entrada del sistema de computación, una entrada que identifica los niveles medidos de uno o más componentes de una red celular medidos en una muestra de las células; (b) calcular, con el sistema de computación, niveles de uno o más componentes adicionales de la red celular usando un modelo computacional de la red celular; y (c) identificar, con el sistema de computación, un componente de la red celular cuyo nivel calculado predice la respuesta de las células al tratamiento con un agente terapéutico, e identificar, de ese modo, el componente como un biomarcador para predecir una respuesta de las células al tratamiento con el agente terapéutico.

103. Un producto de programa de computadora que comprende uno o más medios de almacenamiento legibles por computadora que almacenan instrucciones ejecutables por la computadora que, cuando se ejecutan, implementan el método descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 87 ó 101 a 102.

104. Un método para tratar un paciente que tiene un tumor neoplásico, dicho método caracterizado porque comprende: obtener una muestra del tumor, determinar un nivel de pErbB3 en la muestra, y posteriormente administrar al menos un agente terapéutico anti-neoplásico al paciente, donde, si el nivel de pErbB3 determinado en la muestra no es menor que el nivel mínimo, entonces el al menos un agente terapéutico anti-neoplásico que se administra posteriormente al paciente, comprende un anticuerpo anti-ErbB3, y si el nivel de pErbB3 determinado en la muestra es menor que un nivel mínimo, o sea, 0.064 pg^g proteína total, 0.08 pg^g proteína total, 0.096 pg/µg proteína total, 0.122 pg^g proteína total, 0.128 pg^g proteína total, 0.144 pg^g proteína total ó 0.16 pg^g proteína total, entonces el al menos un agente terapéutico anti-neoplásico que se administra posteriormente al paciente, no comprende un anticuerpo anti-ErbB3.