KR20100036389A - 지방유래 줄기세포 배양액을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents
지방유래 줄기세포 배양액을 함유하는 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간 지방유래 줄기세포 배양액을 포함한 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명은 인간의 지방세포에서 추출된 지방유래 줄기세포를 적정한 배지 및 조건에서 배양하여 주름개선 및 노화완화에 현저한 활성을 가진 세포 배양액을 제공한다. 또한 본 발명의 방법에 따라 수득한 줄기세포 배양액은 기능성 화장품의 원료로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 줄기세포 배양액을 함유하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.
보다 상세하게는 (a) 포유동물의 지방세포로부터 추출한 지방유래의 성체 줄기세포를 단리하는 단계; 및 (b) 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계대배양하는 단계를 포함하거나 이에 더하여 (c) 지방유래 성체 줄기세포에 저산소 배양, 자외선 조사, 영양분결핍 및 기계적 마찰에서 선택되는 어느 하나 이상의 물리적 자극을 가하는 단계; 또는 (d) 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C 및 비타민 D에서 선택되는 하나 이상의 비타민을 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는 방법으로 수득한 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양액을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
줄기세포란 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가, 필요한 경우 신경, 혈액, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다. 이러한 줄기세포를 얻을 수 있는 방법은 크게 두 가지가 있는데, 첫째는 수정란으로부터 발생한 배아로부터 얻는 것(배아줄기세포)이고 둘째는 성인이 된 우리 몸의 각 부분에 간직되어 있는 줄기세포(성체줄기세포)를 회수하는 것이다. 기능적인 면에서 차이는 있지만 배아줄기세포나 성체줄기세포는 모두 여러 종류의 세포로 분화할 수 있는 특징을 가지고 있다.
배아줄기세포는 분화능력이 매우 뛰어나고 텔로머가 긴 장점이 있으나, 윤리적인 문제를 안고 있고 세포를 다량 획득하는 것이 어려운 단점이 있는 반면, 성체줄기세포는 세포수를 많이 얻을 수 있으나 타인에게 이식할 때 감염의 위험이나 분화능력이 상대적으로 떨어지는 단점을 가지고 있다.
상기한 단점에도 불구하고 성체줄기세포는 의학적으로 적용하기에 대단히 안전한 것이 특징이다. 구체적으로, 장기재생을 위해 몸 안에 이식하여도 암이 발생되지 않으며, 성인의 몸속에 있었기 때문에 면역거부반응이 발생하지 않아 자기 자신의 세포를 사용하는 자가 이식(autologous transplantation)이 가능하다
또한, 주변조직의 특성에 자신을 맞추어 분화하는 조직 특이적 분화능력(site-specific differentiation)이 있고, 미분화 상태에서 주입하여도 암을 유발하지 않기 때문에 이식된 이후 당장 필요한 세포를 만들어내는 것 이외에도 나중에 필요한 미분화 상태의 줄기세포를 다시 만들어서 저장하는 자가 재생산(self-renewal) 능력이 있는 장점이 있다.
상기한 장점에 따라 성체줄기세포는 최근에 그 중요성이 부각되어지고 있으며 성체줄기세포를 생체 내에서 구하기 위한 여러 가지 연구가 진행 중에 있다.
지방조직은 생체 내에서 정상적인 성장과 생리작용에 있어서 중요한 역할을 하고 있지만 지금까지는 그 중요성이 간과되어지고 있었다. 가장 일반적인 지방의 형태는 피부의 아래(피하지방)에 위치하며 복강내(내장지방)에 위치하거나 생식기관 주위(생식선지방)에 위치하는 백색지방 조직이다. 성인에게서의 다소 덜 일반적인 형태는 갈색 지방조직이며 신생아 시기에 열을 생성하는 중요한 역할을 한다(Gimble, New Biol. 2(4): 304-12, (1990)).
그러나 사실, 생식능력과 성숙과정은 개체의 지방조직 저장과 밀접하게 연관되어 있다. 여성과 남성의 사춘기는 지방조직 유래 호르몬의 생성과 분비와 밀접하게 관련되며 체지방 조성에 밀접하게 관련된다. 또한 포도당대사와 에너지 균형에 있어서도 중요한 역할을 한다.
과거 수년 동안 생물질 분야에서 상당한 진보가 있어 왔다. 현재 이를 근거로 많은 물질이 개발되고 있으며 사용되고 있다. 이러한 진보에도 불구하고 사람의 지방조직의 이용에 대해서는 많은 연구가 진행되지 않은 것이 사실이다. 그러나 최근 들어 지방의 조직 안에 성체줄기세포가 존재한다는 것이 확인되면서(Zuk PA, et al., Molecular Biology of Cell, 13: 4279-4295 (2002); Rodriguez AM, et al., Biochimie, 87: 125-128 (2005)) 지방 유래의 줄기세포의 활용에 대한 여러 가지 연구들이 진행되어 지기 시작하였다.
또한, 최근 들어 생화학 및 분자생물학의 발전을 기반으로 우리 생체 내에 존재하는 소량의 신호물질(성장인자)들을 발견하게 되었으며 이를 기반으로 한 생체 노화이론이 재정립되고 있는 중이다(Stanley Cohen, Nobel Lecture 1986, Dec, 8). 또한 이 신호물질(성장인자)은 나이가 증가함에 따라 생체 내에서 감소하게 되는데 바로 이 성장인자의 감소가 우리의 노화와 밀접한 관계가 있다는 것이 밝혀지고 있다(Sporn M and Roberts A, Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 1, Vol. 95/1, 1990, Springer-Verlag, DE, Berlin., pp. 667-698).
따라서 생체의 성장인자를 외부에서 공급하게 되면 생체의 노화를 억제할 수 있다는 것이 연구되고 있으며, 그 물질의 구체적인 효과에 대해서도 연구가 진행되고 있다(GE Pierce and TA Mustoe, Annu Rev Med, 46. 467-481 (1995)). 구체적으로 이 신호물질(성장인자)의 구조와 합성에 대한 연구가 진행되었지만 대부분의 성장인자는 단백질의 구조를 가지고 있으며 그 구조가 3차원적으로 복잡하여 화학적으로 합성하는데 여러 가지 문제점이 발생되고 있으며 그러한 합성에 들어가는 비용 또한 매우 고가인 것이 현실이다.
이에 본 발명자들은 인체 내에서의 활성을 유지하면서 낮은 가격에 활성형의 인간 성장인자를 획득하는 방법에 대해서 연구하던 중, 지방유래 성체줄기세포가 성장인자를 분비한다는 사실에 주목하기에 이르렀다(Rehman, J. et al., Circulation, 109: 1292 - 1298 (2004)).
그러나 지방유래 성체 줄기세포에 관한 연구는 대부분 그 세포 자체를 이용하는 것이나 분화에 관한 연구가 있을 뿐 이를 이용한 성장인자의 합성법에 대한 방법에 대해서는 연구가 거의 전무한 상태였다.
한국특허공개 제2004-94910호"개선된 지방세포 분화된 지방유래 성체 줄기세포 및 이의 용도"에서 지방유래 성체 줄기세포를 사용해 생체의 생착율을 증가시킬 수 있는 방법이 제시되었지만 성장인자의 의미있는 합성에 대해서는 제시하지 못하였으며, 한국특허공개 제2005-6408호"지방세포 분화 조절기능을 갖는 PBR리간드 및 그 유도체 화합물, 및 이를 함유하는 지방세포 분화 조절용조성물"에서는 지방세포를 다른 특정세포로 분화하는 방법에 관한 내용을 개시하고 있을 뿐이다.
또한 한국특허공개 제2005-99274호"인간 줄기 세포의 무동물혈청 배양 배지조성물 및 간세포로의 분화 유도방법"에서는 무동물혈청을 사용한 인간의 줄기세포의 분화에 대한 방법에 대해서 기술하였고, 한국특허등록 제484550호"세포이식을 위한 세포의 생산방법"에서는 세포이식을 위한 줄기세포의 이용에 대해서 개시하고 있다.
이와 같이 지방유래 성체 줄기세포를 이용한 성장인자의 합성에 대한 연구가 미진한 것은 성체줄기세포의 활용방법이 다른 세포로의 분화를 통한 이용에 그 초점이 맞춰져 있으며 줄기세포의 세포적 차이점에 대해서는 그 연구가 미진한 부분이 있었기 때문으로 판단된다.
또한 앞에서 기술한 것과 같이 성장인자를 합성한 방법에 대해서는 한국특허등록 제101436호"재조합된 사람의 내피세포성장인자의 제조방법", 한국특허등록 제62551호 "유전자 재조합기술에 의한 인간상피 성장인자의 제조방법", 한국특허공개 제2003-45032호 "생물학적으로 활성인 인간 산성 섬유아세포 성장인자의 제조방법과 맥관형성 촉진을 위한 그 용도" 등 유전자 재조합기술에 의한 성장인자의 제조방법에 대해서만 연구되어져 왔다.
이에 본 연구자는 지방유래 성체줄기세포를 통한 성장인자의 대량 생산 방법에 대해서 다년간 연구하였으며 그 성과로 적절한 배양조건의 확립, 물리적 및/또는 화학적 자극을 통해 지방유래 성체줄기세포가 특정한 자극을 가하지 않은 지방유래 성체줄기세포와 비교할 때 현저하게 유효한 양으로 성장인자를 합성하여 분비한다는 것을 발견하였다.
또한, 줄기세포를 배양하여 수득한 배양액(조건 배지)은 피부의 주름개선이나 노화완화에 현저한 효과가 있음을 발견하였다.
본 발명은 지방유래 줄기세포 배양액을 포함하는 안전하고 효과적인 화장품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 포유동물의 지방세포로부터 추출한 지방유래의 성체 줄기세포를 단리하는 단계; 및 (b) 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계대배양하는 단계를 포함하거나 이에 더하여 (c) 지방유래 성체 줄기세포에 저산소 배양, 자외선 조사, 영양분결핍 및 기계적 마찰에서 선택되는 어느 하나 이상의 물리적 자극을 가하는 단계; 또는 (d) 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C 및 비타민 D에서 선택되는 하나 이상의 비타민을 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는 방법으로 수득한 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양액을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물은 지방 유래 줄기세포 배양액을 함유하는 것으로 피부의 주름개선과 노화완화에 탁월한 효과가 있다.
또한 본 발명에 따라 지방유래 성체줄기세포를 이용하여 수득한 배양액은 최종적으로 무혈청 배지에서 수득된 것으로서, 이를 화장료 조성물에 적용할 경우 혈청에 의한 면역반응 등의 부작용의 염려가 없으므로 안전성이 확보된 화장품을 제조할 수 있고, 비침습적인 방법으로 일반 피부과나 성형외과 등에서 행해지는 지방흡입시술 등을 통해 입수가 용이한 지방유래 성체 줄기세포를 이용함으로써, 경제성이 제고된 효과가 있다.
도 1은 지방조직으로부터 단리된 줄기세포의 광학현미경 사진이고,
도 2는 최초 단리된 PLA세포의 유세포 분석 결과를 나타내고,
도 3은 계대배양 이후의 유세포 분석 결과를 나타낸 그래프이고,
도 4는 지방유래 줄기세포로부터 역전사 PCR을 통해 확인한 TGFβ-1, bFGF 및 VEGF의 전기영동사진이고,
도 5는 지방유래 줄기세포의 배양시 배양액에 분비된 bFGF와 VEGF의 농도를 확인한 그래프이고,
도 6은 섬유아세포와 지방유래 줄기세포의 혼합배양을 통한 섬유아세포의 콜라겐 합성정도를 측정한 그래프이고,
도 7은 지방유래 줄기세포 배양액의 농도별 섬유아세포 세포수를 나타낸 그래프이고,
도 8은 지방유래 줄기세포 배양배지와 재조합성장인자 첨가 배지와의 세포 증식력을 비교한 그래프이고,
도 9는 본 발명에 따른 물리적, 화학적 조건에 따라 배양한 지방세포 유래 줄기세포의 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)의 분비량을 비교한 그래프이고,
도 10은 본 발명에 따른 물리적, 화학적 조건에 따라 배양한 지방세포 유래 줄기세포의 맥관 내피세포 성장인자(VEGF)의 분비량을 비교한 그래프이고,
도 11은 본 발명에 따른 물리적, 화학적 조건에 따라 배양한 지방세포 유래 줄기세포의 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β)의 분비량을 비교한 그래프이고,
도 12 내지 도 15는 자가 지방유래 성체줄기 세포로부터 분리한 성장인자 함유 조성물의 주름개선 활성을 확인한 사진이고,
도 16은 지방유래 줄기세포 배양액에 의한 섬유아세포의 콜라겐 합성정도를 확인한 웨스턴 블랏 사진이다.
도 2는 최초 단리된 PLA세포의 유세포 분석 결과를 나타내고,
도 3은 계대배양 이후의 유세포 분석 결과를 나타낸 그래프이고,
도 4는 지방유래 줄기세포로부터 역전사 PCR을 통해 확인한 TGFβ-1, bFGF 및 VEGF의 전기영동사진이고,
도 5는 지방유래 줄기세포의 배양시 배양액에 분비된 bFGF와 VEGF의 농도를 확인한 그래프이고,
도 6은 섬유아세포와 지방유래 줄기세포의 혼합배양을 통한 섬유아세포의 콜라겐 합성정도를 측정한 그래프이고,
도 7은 지방유래 줄기세포 배양액의 농도별 섬유아세포 세포수를 나타낸 그래프이고,
도 8은 지방유래 줄기세포 배양배지와 재조합성장인자 첨가 배지와의 세포 증식력을 비교한 그래프이고,
도 9는 본 발명에 따른 물리적, 화학적 조건에 따라 배양한 지방세포 유래 줄기세포의 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)의 분비량을 비교한 그래프이고,
도 10은 본 발명에 따른 물리적, 화학적 조건에 따라 배양한 지방세포 유래 줄기세포의 맥관 내피세포 성장인자(VEGF)의 분비량을 비교한 그래프이고,
도 11은 본 발명에 따른 물리적, 화학적 조건에 따라 배양한 지방세포 유래 줄기세포의 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β)의 분비량을 비교한 그래프이고,
도 12 내지 도 15는 자가 지방유래 성체줄기 세포로부터 분리한 성장인자 함유 조성물의 주름개선 활성을 확인한 사진이고,
도 16은 지방유래 줄기세포 배양액에 의한 섬유아세포의 콜라겐 합성정도를 확인한 웨스턴 블랏 사진이다.
본 발명의 제1 형태는 지방유래 줄기세포를 이용한 성장인자의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
지방유래 줄기세포가 함유하고 있는 성장인자는 산성 섬유아세포 성장인자(acidic FGF), 염기성 섬유아세포 성장인자(basic FGF), 인슐인-유사 성장인자-1(IGF-1), 인슐인-유사 성장인자-2(IGF-2), 각질형성세포 성장인자(KGF), 혈소판유래 성장인자(PDGF), 인간형질전환 성장인자-알파(TGF-α), 인간형질전환 성장인자-베타(TGF-β), 맥관내피세포 성장인자(VEGF), 표피세포 성장인자(EGF), 신경세포 성장인자(NGF) 또는 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 성장인자가 포함된다.
본 발명에서는 지방 유래의 줄기세포를 사용하여 특이적으로 하기 성장인자의 합성 촉진을 도모하고자 하였다.
1) 염기성 섬유아세포 성장인자(basic Fibroblast Growth Factor, 이하 "bFGF")
bFGF 혹은 헤파린이 결합된 성장 인자2(HBGF-2)는 7개의 종류로 아미노산 수준에서 약 30-50％의 상동성을 가지는 요소들로 구성되어 있다(Burgess, W.H and Maciag, T., Annu. Rev. Biochem., 58: 575-606 (1989); Baird, A. and Klagsbrun, M., Cancer Cells, 3(6): 239-43 (1991)). bFGF는 신경 조직, 뇌하수체, 부신피질, 황체, 태반에서 분리된다.
생체내로부터 분리한 bFGF는 약 18kDa의 크기를 가진다. 여러 연구에서 bFGF의 더 큰 형태의 종류가 존재한다는 것이 밝혀졌으며 그 크기는 약 24kDa으로 AUG 시작 부위를 포함하지 않는 곳에서의 해독 개시에 의해 단백질의 아미노 끝부분이 연장되어 나타나는 현상이다(Burgess, W.H and Maciag, T., Annu. Rev. Biochem., 58: 575-606 (1989); Baird, A. and Klagsbrun, M., Cancer Cells, 3(6): 239-43 (1991); Prats, H. et al., PNAS, 86: 1836 - 1840 (1989); Quarto, N. et al., J. Cell. Physiol., 147(2): 311-8 (1991); Bugler, B. et al., Mol. Cell. Biol., 11(1): 573-7 (1991)). 이러한 현상은 세포질 보다 세포핵에 bFGF를 위치시키는 결과를 초래하며(Quarto, N. et al., J. Cell. Physiol., 147(2): 311-8 (1991); Bugler, B. et al., Mol. Cell. Biol., 11(1): 573-7 (1991)) 일반적인 재조합 혹은 화학적 방법에 의해 생산되는 bFGF 단백질은 18kDa 부위를 위주로 하여 생산된다. 이는 bFGF가 형태학적으로 소수성 신호 펩티드 염기서열이 결핍되어 있는 상태이기에 종례의 방법과 다르게 표출될 수 있다(Mignatti, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11007 (1991)).
2) 맥관내피세포 성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, 이하 "VEGF")
VEGF(Ferrara, N. and Henzel, W.J. Biochem Biophys Res Commun, 161(2): 851-8 (1989))는 혈관 투과성 요소(Senger, D.R. st al., Science, 219(4587): 983-5 (1983))로 알려져 있으며 이는 동종 이량체로 34-42 kDa 의 분자량을 가지며, 헤파린이 결합된 글리코 단백질이다, 이는 혈관형성 요소를 가지고 있어 내피세포의 유사분열촉진과 혈관 투과성 능력을 향상시킬 수 있다.
VEGF는 제한된 염기서열로 알려진 일차구조로 표현되며 이는 혈소판유래 성장인자(PDGF)의 A, B사슬과 상동성을 가진다. 이러한 성장인자들은 보존된 8개의 시스테인 잔기를 가지며 이황화 결합 외내부 사슬에 포함된다. VEGF 단백질이 암호화 하고 있는 cDNA는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)와 53％ 아미노산 서열의 상동성을 가지며 VEGF는 인간 태반의 cDNA 라이브러리에서 분리한 것이다(Maglione, D. et al., PNAS, 88: 9267 (1991)). 이 단백질을 태반 성장인자(PGF)로 부르며, 현재에는 VEGF의 패밀리 중 하나로 인식되고 있다. VEGF와의 상동성을 기반으로, 태반 성장인자(PGF)는 혈관형성 요소로 제안되고 있다.
인간 VEGF에 대한 유전자는 8개의 엑손 안에서 조합된다. 선택적인 접합의 결과로써 4개의 단량체적 VEGF를 암호화하고 있는 121, 165, 189, 206아미노산 염기서열을 포함한다. 각각은 26개의 신호 펩티드 아미노산 잔기를 가지고 있으며 이로 인하여 검출할 수 있다. VEGF121과 VEGF165는 세포외 기질로 노출되는 확산성 단백질이며 VEGF189와 VEGF206는 헤파린과 높은 친화력을 가지고 있어 세포외 지질체 안에서 헤파린과 프로테오글리칸 결합을 이룬다. VEGF는 N과 연결된 글리코실 부위를 포함하고 있으며 이는 본래 글리코 단백질이다.
일반적인 재조합 혹은 화학적 방법에 의해 생산되는 VEGF 단백질은 확산성 단백질인 VEGF121과 VEGF165 부위를 위주로 하여 생산된다. 종례에는 재조합된 인간 VEGF의 대장균 내 발현이 in vitro 상에서 본래의 VEGF와 생물학적 역할의 차이가 없는 것으로 연구되었다(Connolly, D.T.J. Cell. Biochem, 47(3): 219-23 (1991); Schott, R.J. and Morrow, L.A. Cardiovasc, Res., 27(7): 1155-61 (1993); Neufeld, G. et al., Prog. Growth Factor Res., 5(1): 89-97 (1994); Senger, D.R. et al., Cancer and Metastasis Reviews, 12(3-4): 303-24 (1993)).
3) 인간형질전환 성장인자-베타(Transforming Growth Factor-β, 이하 "TGF-β"),
종양 유사성 표현형으로 분화되는 배양성인 섬유아세포의 형질전환을 촉진하는 요인인 인간 형질전환 성장인자(TGF)는 TGF-α와 TGF-β의 두 단백질의 혼합체로 구성되며, 종양 촉진요소보다 억제요소와 수반되어 발견된다(Lawrence, D.A. Eur. Cytokine Netw, 7(3): 363-74 (1996); Cox, D.A. and Maurer, T., Clin. Immunol. Immunopathol, 83(1): 25-30 (1997); Alevizopoulos, A. and Mermod, N., Bioessays. 19(7): 581-91 (1997)).
이 두 분자들은 골격형성단백질인 5 종류의 활성체와 불활성체를 가진 TGF-β1을 포함하고 있는 수퍼패밀리의 한 구성요소이다(Kingsley, D.M., Genes Dev, 8: 133 (1994)). 인간의 TGF-β1는 25kDa의 분자량과 이황화 결합, 비글리코실 동종 이량체로 구성되어 있으며, 거의 대부분의 포유동물 종들 사이에서 100％ 보존적인 유전자 서열을 가지고 있다고 알려져 있다. TGF-β1은 서브틸리신과 유사한 단백질 분해효소에 의해 전구체에서 이황화결합체가 전달되면서 세포내 신호전달을 시작하게 되며(Dubois, C.M. et al., J. Biol. Chem., 270: 10618 (1995)), 일반적으로 이것은 불활성체 혹은 두 가지의 복합체로 분비된다(Gleizes, P-E. et al., Stem Cells, 15: 190 - 197 (1997)) TGF-β1 신호전달과정에는 두 가지의 수용체를 포함하고 있으며(ten Dijke, P. Curr. Opin. Cell Biol, 8(2): 139-45 (1996); Derynck, R. and Feng X.H., Biochim. Biophys. Acta 1333(2): F105-50 (1997); Padgett, R.W. et al., Bioessays, 20(5): 382-90 (1998)), 75kDa의 리간드 결합 단백질인 TGF-β RⅡ 이량체는 지속적으로 활성화되는 세포내 세린-티레오닌 키나아제 효소를 가지며, TGF-β1와 결합으로 TGF-β RⅡ는 53kDa의 신호전달 이량체 단백질인 TGF-β RI을 구성하고 인산화시킨다. 인산화된 TGF-β RI는 단백질 키나아제를 활성화시켜, 세포내 단백질인 SMADS를 통해 연차적인 신호 시작을 유도한다.
신호전달과정에 관여하는 TGF 수용체는 모든 세포에서 발현되며, 거의 대부분의 생리학적인 작용에 영향을 미친다. 그것의 체계적이고 세포 특이적인 활성화는 대단히 복잡한 기작이지만, 세 가지의 기초적 활성을 띠고 있다. TGF-β1은 일반적으로 억제요소같은 세포의 증식을 조절하고, 단백질 분해의 저해와 합성의 반복에 따라 세포막 외에 단백질 분해물들의 침전을 꾀하며, 면역억제반응을 다양한 기작을 통해 촉진한다.
종전의 방법인 재조합 혹은 화학적 합성에 의해 생산되는 TGF-β1 단백질은 25kDa의 크기를 가진 활성화 상태의 단백질이기에 in vitro 상에서 본래의 TGF-β1 단백질과 유사한 생물학적 활성을 가지고 있지만 이는 TGF-β1 단백질 고유의 성질 일부만을 포함한다.
본 발명의 제1 형태에 따른 방법은 (a) 포유동물의 지방세포로부터 추출한 지방유래의 성체 줄기세포를 단리하는 단계; (b) 선택적으로 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계대배양하는 단계; (c) 지방유래 줄기세포에 저산소 배양, 자외선 조사, 영양분결핍 및 기계적 마찰에서 선택되는 어느 하나의 물리적 자극을 가하는 단계; 및 (d) 선택적으로 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C 및 비타민 D에서 선택되는 하나 이상의 비타민을 배양액에 첨가하는 단계를 포함하고, 이 때 (c) 단계와 (d) 단계는 인간 성장인자의 최대 생산이 일어나는 조건으로 조합하여 진행한다.
줄기세포의 수득
본 발명에 따른 지방유래의 성체줄기세포는 지방조직 내에 존재하는 세포 중에서 정제과정을 거쳐서 수득하는 것이 가능하다. 바람직하게는 사람의 지방유래의 성체줄기세포를 수득하는 것이고, 이를 위하여 사람의 지방조직으로부터 지방유래 줄기세포를 분리한다.
지방조직은 피하, 그물막, 내장, 유방 생식선 또는 그 밖의 지방 조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 지방 조직이며, 피부 아래에 있는 백색 지방조직을 지방흡입술로부터 편리하게 얻을 수 있다.
지방조직은 통상적으로 흔히 시행되는 지방흡입의 과정에서 폐기되었던 지방조직을 이용하는 것이 가능하므로, 추가적으로 침습적 시술을 할 필요가 없다는 점에도 그 유용성이 배가되는 이점이 있다.
분리한 지방흡입물을 세척하여 지방조직만을 분리하고 지방조직의 세포외기질(extracellular matrix)을 콜라게나아제로 효소처리 한 다음 원심분리시켜 고밀도의 줄기세포를 포함한 스트로마성 혈관 분획을 수득한다. 이렇게 얻은 펠렛을 세척한 다음 세포 여과기를 통과시켜 기타 조직을 제거하고 단핵구 분리 용액으로 적혈구를 포함한 세포파편과 단핵세포만을 분리한다. 분리된 단핵세포를 비유도성 배양액으로 배양 후 비접착성 세포들을 제거해준다.
줄기세포의 배양
본 발명에서는 상기 과정으로 획득한 지방유래 줄기세포를 이용한 후속 작업인 시험관 내에서의 배양을 위해 고유의 배양배지를 확립하였다.
세포배양의 시작에 앞서 공급원으로부터 추출한 생검은 일반적인 항생제를 포함한 세척배지를 이용한 반복적인 세척과정을 통해 후속배양에 있을 오염의 가능성을 최소한으로 감소시킬 수 있다.
본 발명에서는 지방유래 줄기세포에서 성장인자의 최대 합성과 분비를 유도하도록 배양 배지를 최적화한다.
구체적으로, 지방유래 줄기세포의 시험관 내 배양은 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계대배양하는 단계를 순차 진행함으로써 성장인자의 합성량을 극대화한다.
혈청을 포함한 초기단계 세포배양을 위한 배지는 지방유래 줄기세포와 같은 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지인 것이 바람직하다.
본 발명에서는 당업계에서 일반적으로 세포배양에 사용하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)을 기본으로 하고, 세포배양에 통상적으로 사용되는 혈청을 포함한다.
이 때 초기 배지에 7∼10％의 디메틸 술폭시드(DMSO ; dimethyl sulfoxide)를 첨가하면 동결 배지일 수도 있고, 따라서 줄기세포를 동결한 다음 필요한 경우 해동하여 사용할 수 있다.
혈청은 0.1 내지 20％의 소 태아 혈청(FBS)을 첨가하는 것이 바람직하고, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.
항생제로는 페니실린-스트렙토마이신 등 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 모두 이용가능하며, 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있으며, 필요에 따라 글루타민 등의 산화영양소와 소디움 피루베이트등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.
더욱 바람직한 배지는 1∼2mM 의 글루타민, 0.5∼1mM 소디움 피루베이트, 0.1∼10％ FBS, 1％ 항생제(100 IU/ml)로 보충된 글루코오스 및 DMEM을 함유하는데 이를 완전배지라 한다. 이 때 글루코스의 농도범주는 대략적으로 1g/L ∼ 4.5g/L이다. 상기 완전혈청배지는 지방유래 줄기세포의 보관과 유지 및 시험관내 안정된 기본배양조건을 제공해 주며 효과적인 세포의 안정화를 보여준다.
초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90∼95％, 온도 35∼39℃, 5∼10％ CO2 배양기에서 배양하고, 5∼10％ CO2 배양시에는 최종농도가 0.17∼0.22％가 되게 소디움 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해준다.
초기배양 단계동안 조직단편은 배양 용기 바닥에 부착된 상태를 유지시키는것이 바람직하며, 세포 배양의 표준 기술에 따라 트립신-EDTA 처리로 인한 짧은 자극으로 성장을 촉진할 수 있다.
누적집단배증시간 (doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 75∼85％ 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게 80％ 합류시기에 세포를 채취하여 후기 배양인 무혈청배지에서 계대배양을 한다.
본 발명에서는 지방유래 줄기세포에서 성장인자의 분화를 촉진하는 성장인자 분화용 무혈청배지를 제공한다.
성장인자 분화용 무혈청배지를 이용한 계대배양은 배양액을 제거한 플라스크를 인산화 완충 용액으로 세척하고 트립신-EDTA로 세포를 떨어뜨린 후 세포부유액을 원심분리하여 획득한 펠렛을 인산화 완충 용액으로 세척하는데 세척 과정은 2∼3번 반복하는 것이 바람직하다. 세척된 펠렛은 본 발명에서 개발된 무혈청 배지에 의해 부유시키고 세포 배양 플라스크에 대략 3배로 계대시킨다.
본 발명에서 개발된 무혈청배지는 페놀 레드 등의 pH 지시약이 첨가되지 않은 DMEM을 기본으로 하고 Ham's F-12 영양소 혼합액(SIGMA, Cancer Research Vol 47, Issue 1 275-280)을 대략 1: 0.5 ∼ 2의 비율로 첨가한다. 이 때 L-글루타민 등의 산화영양원, 소디움 피루베이트 등의 에너지 대사물질, 소디움 바이카보네이트 등의 탄소조절원을 첨가하는 것이 가능하고, 그 외에 본 발명에서 목적하고자 하는 성장인자가 아닌 다른 성장인자들과 성장호르몬 등도 첨가할 수 있다.
본 발명에서 개발된 무혈청배지의 고유성은 Ham's F-12 영양소 혼합액에서 찾아볼 수 있다. 본 혼합액은 세포의 성장과 항상성 유지를 돕고 지방유래 줄기세포의 초기배양 후 후기배양에 있어 세포의 안정성과 유지력 증진에 관여되는 여러 가지의 무기질과 아미노산들, 지방유래 줄기세포에서 분비되는 성장인자의 더 높은 생산을 촉진할 수 있는 비타민 계열의 영양소들과 다른 인자들이 일정한 비율로 혼합하여 형성한다. 본 발명에서 확립화된 Ham's F-12 혼합액을 포함한 무혈청배지에서 지방유래 줄기세포의 배양과 성장인자의 생산력은 일반적인 동물혈청을 포함하고 있는 혈청배지의 조건과 비교하였을 경우 전혀 감소된 현상 혹은 부정적인 효과를 볼 수 없으며, 일부 성장인자는 무혈청 배지에서 더 높은 생산력을 보이며, 혈청에 의한 미지의 성분을 가진 혈청배지와는 달리 배양 배지의 모든 성분 함량을 확인할 수 있다.
*이는 혈청배지에 포함된 동물혈청에서 올 수 있는 여러 가지 변수들을 최소화할 수 있음을 시사하는 것이고, 거의 50％ 정도의 적은 비용으로 본 발명이 목적하는 효능을 달성할 수 있는 이점이 있다.
하기 표 1은 본 발명에서 확립한 무혈청배지에 혼합되는 Ham's F-12 영양 혼합액 각 구성성분들의 성분과 함량을 표시한 것이다.
표 1
상기 무혈청배지의 아미노산, 비타민, 무기염의 성분과 함량은 본 발명의 목적을 해하지 않는 조건하에서 당업자에 의하여 변형가능함을 자명한 일이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 상기 방법으로 배양한 지방유래 성체줄기세포를 특정 자극을 통해 활성화시킴으로써 목적하는 성장인자의 합성을 촉진하는 것이 가능하다. 이 때 성장 및 자극조건에 있어서 물리적 조건과 화학적 조건으로 구분하여 자극하는 것이 가능하다.
물리적 자극으로써는 자외선, 영양분, 산소 등을 그 예로 들을 수 있으며, 화학적 조건으로는 세포 배양 배지 조성물에 있어서 비타민과 그 외 활성화 화합물 등을 그 예로 들 수 있다.
물리적 자극
기존의 지방유래 성체줄기세포 배양 방법에 비하여 현저히 많은 양의 성장인자를 수득하기 위하여, 물리적인 스트레스로는 저산소반응 (Circulation. 2004 Mar 16;109(10):1292-8.), 자외선조사(FASEB J. 2003 Mar;17(3):446-8), 영양분결핍반응(Blood. 2004 Nov 1;104(9):2886-92. Epub 2004 Jun 24), 기계적 마찰 등의 자극을 줄 수 있으며, 이러한 물리적 자극으로 본 발명에서 목적하는 성장인자를 선택적 혹은 종합적으로 증가시킬 수 있다.
물리적 자극이 성장인자의 합성 및 분비를 촉진하는 지 확인하기 위하여, 본 발명에서는 상기한 바와 같이 지방유래 줄기세포를 혈청 배지 및 무혈청 배지를 순차적으로 이용하여 시험관 내 배양한 다음, 세포를 잘 수거하여 배양액을 완전히 제거한 상태에서 각각 저산소 배양, 자외선 조사, 영양분결핍 또는 기계적인 마찰을 수행한 다음 다시 정상적으로 배양하여, 지방유래 줄기세포의 배양액에 분비된 성장인자의 농도를 측정하였다.
구체적으로, 저산소 배양은 성장인자의 최대 합성을 위하여 약 5％ 이산화탄소에 1∼5％의 산소 조건에서 36 ∼ 48시간 배양하는 것이 바람직하다. 자외선 조사는 280∼320nm 의 자외선 B를 80 ∼ 120 mJ/㎠의 열량으로 조사하는 것이 바람직하다. 영양분결핍반응으로는 Mg2 +와 Ca2 +이 첨가된 Dulbecco's phosphate buffered saline로 세포가 떨어지기 직전 상태인 최대 4시간까지 배양한 후 페놀 레드 등의 pH 지시약이 첨가되지 않은 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합액을 대략 1:1의 비율로 첨가하여 혼합한 배지에서 정상 배양을 하는 것이 바람직하다. 기계적인 마찰은 세포배지에 격자 모양으로 긁어주는 스크래치 자극을 가하는 것이 바람직하다.
그 결과, bFGF의 경우에는 저산소 자극을 주는 경우 1.74배 증가하였고, 자외선 자극을 주는 경우 2.71배 증가하였다. 또한 상기 물리적 자극 중에서 저산소 자극과 자외선 자극을 병행하였을 경우 그 상승효과가 증대되었다(도 9 참조).
VEGF의 경우에는 저산소 자극을 주는 경우 2.53배 증가하였고, 자외선 자극을 주는 경우 1.36배 증가하였으며 기계적인 마찰을 이용한 스크래치 자극을 주는 경우 1.30배 증가하였다. 또한 상기 물리적 자극 중에서 저산소 자극, 자외선 자극, 스크래치 자극을 병행하였을 경우 그 상승효과가 증대되었다(도 10 참조).
TGFβ-1의 경우에는 저산소 자극을 주는 경우 1.64배 증가하였고, 자외선 자극을 주는 경우 1.75배 증가하였으며. 기계적인 마찰을 이용한 스크래치 자극을 주는 경우 2.13배 증가하였고. 영양분결핍 자극을 주는 경우 2.01배 증가하였다. 또한 물리적 자극 중에서 저산소 자극과 자외선 자극을 병행하였을 경우 그 상승효과가 증대되었다(도 11 참조).
화학적 자극
화학적인 조건으로는 일반적으로 널리 알려진 다양한 활성화 화합물들을 개체에 직접적 혹은 간접적으로 노출시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 지방유래 줄기세포에 첨가할 수 있는 활성화 화합물에는 세포 노화와 관련된 레티노산과 그 전 단계 산물인 빈포세틴과 이러한 사이클의 보조역할을 하는 피카밀론이 있으며, 단백질 키나아제의 역할을 수행하는 퀸산과 퀸산염이 있다. 그 외에 아데닌 디뉴클레오티드, 아세틸-L-카르니틴 등 신진대사에 관여하는 탄수화물 합성의 인자들은 세포에 중요한 영양 작용을 하며, 아포토시스(apoptosis) 중지 역할을 하는 디메틸아니모 에탄올, 세포 증식에 관여하는 L-리포산, L-하이드록시산 그리고, 아미노산 생산에 관여하는 보조효소 Q-10 같은 다른 촉진성 첨가제 등을 포함한다. 상기한 바와 같이 이들 활성화 화합물들은 지방유래 줄기세포 배양시에 동시에 또는 개별적으로 첨가될 수 있다.
다양한 활성화 화합물 중에서, 본 발명에서는 비타민 계열을 이용한 자극 효과에 초점을 맞추었다.
일반적으로 비타민 A는 일차적인 면역반응과 그에 관계된 세포발달과정들, 계획화된 아포토시스(apoptosis)의 일련반응들에 관여한다고 알려져 있으며, 대표적인 물질로는 retinoic acid가 알려져 있으며 이는 retinoic acid receptor(RAR)에 결합하여 이에 관련된 대사과정을 조절하고 활성화시킨다. 그 중 RAR-alpha, RXR-alpha, RXR-beta에 결합된 복합체들은 주요 면역세포인 T lymphocyte의 발달에 관여하는 128 여개 유전자의 발현을 촉진 혹은 억제다고 발표되었다. 특히 아포토시스(apoptosis) 기작에서 대표적인 anti-apoptotic protein으로 알려진 bcl2 family 유전자들이 확연히 증가됨을 보여주고 있다(Rasooly, R. et al., J. Immunol., 175: 7916 - 7929 (2005); Spilianakis, C.G. et al., Eur. J. Immunol., 35(12): 3400-4 (2005); Evans T, Exp. Hematol., 33(9): 1055-61 (2005)). 이것은 비타민 A가 아포토시스(apoptosis)반응을 억제하는 효과를 보여줄 수 있음을 시사하고 있다.
비타민 B는 흔히 riboflavin이라고 알려져 있으며, 인간의 건강을 유지하는데 중요한 역할을 하며, 스웨덴의 한 연구팀은 이 물질의 처리로 인해 호중구(neutrophil) migration의 효과를 보임으로 증가된 일차적 면역반응을 야기한다고 발표했다(Verdrengh, M. and Tarkowski, A., Inflamm. Res., 54(9): 390-3 (2005)). 이것은 일차적 면역세포들의 이동으로 인한 확장된 초기 면역반응 효과를 기대할 수 있을 것으로 예상된다.
비타민 C의 세포내 가장 중요한 기능은 콜라겐 합성과 새로운 섬유아세포의 합성을 촉진하고 있다는 것으로, 대표적으로 ascorbic acid가 있다. 다른 사이토카인인 TGF-β와 IFN-γ와 동시 처리는 그 효과를 배가시킨다(Chung, J.H. et al., J. Dermatol. Sci., 15(3): 188-200 (1997)). 다른 비타민들보다 세포 발달과 분화에 영향을 준다고 알려져 있어 많이 사용되어 왔던 비타민 D3는 세포성장과 분화발달과정, 특히 표피(epidermis)의 각질형성세포(keratinocytes)와 골격형성세포인 osteoblasts와 osteoclasts들의 형성 과정에 중요한 신호전달체계를 매개하고 있다. 또한 염증반응에 포함된 여러 가지의 사이토카인인 가령 IL-1α, IL-6, IL-8등에 억제효과를 가진다(Alper, G. et al., Endocr. Rev., 23: 763 (2002))
본 발명에서는 화학적인 조건으로 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D를 각각 혹은 혼합하여 세포독성이 없는 이하의 유효수준에서 배양액에 첨가하여 배양하였다.
비타민을 이용한 화학적 자극이 성장인자의 합성 및 분비를 촉진하는 지 확인하기 위하여, 본 발명에서는 상기한 바와 같이 지방유래 줄기세포를 혈청 배지 및 무혈청 배지를 순차적으로 이용하여 시험관 내 배양한 다음, 세포를 잘 수거하여 인산화 완충 용액을 이용한 세척과정으로 배양액을 완전히 제거하고 페놀 레드 등의 pH 지시약이 첨가되지 않은 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합액을 대략 1:1의 비율로 첨가하여 혼합하고, 선택적으로 L-글루타민 등의 산화영양원, 소디움 피루베이트 등 에너지 대사물질, 소디움 바이카보네이트 등의 탄소조절원을 첨가한 배지에 적량의 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D를 각각 혹은 혼합하여 배양액에 첨가한 다음 지방유래 줄기세포의 배양액에 분비된 성장인자의 농도를 측정하였다.
구체적으로, 비타민 A의 최적농도는 2∼5μM, 비타민 B2의 최적농도는 50-100μM, 비타민 C의 최적농도는 10∼100μM, 비타민 D의 최적농도는 5∼10μM이며, 비타민을 첨가하고 48시간 이상 배양하는 것이 바람직하다. 비타민을 성분별로 혼합하는 경우에도 최적농도는 동일하다.
그 결과, bFGF의 경우 비타민 A의 경우 1.62배 증가하였고, 비타민 B의 경우 1.33배 증가하였고, 비타민 C의 경우 2.33배 증가하였고, 비타민 D의 경우 2.80배 증가하는 것을 확인하였다.
VEGF의 경우는 비타민 A의 경우 1.59배 증가하였고, 비타민 C의 경우 1.68배 증가하였고, 비타민 D의 경우 1.30배 증가하는 것을 확인하였다.
TGFβ-1의 경우는 비타민 A의 경우 1.20배 증가하였고, 비타민 B의 경우 1.56배 증가하였고, 비타민 C의 경우 1.20배 증가하였고, 비타민 D의 경우 1.16배 증가하는 것을 확인하였다.
비타민을 혼합하여 배양하는 경우 비타민들의 농도를 최적화한 상태에서 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D가 혼합된 배양액 하에서는 bFGF의 경우 3.62배, VEGF의 경우 2.03배 및 TGFβ-1의 경우의 경우 1.68배로 증가하는 것을 확인하였다.
자극의 결합
bFGF의 경우 물리적 자극과 화학적인 자극을 같이 주었을 경우에는, 자외선의 광량을 주고 곧바로 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D의 농도를 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 저산소 자극을 최적화 배양시간 하에 배양하면 4.11배로 증가되었다.
VEGF의 경우 자외선의 광량을 준 다음 스크래치 자극을 주고 곧바로 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D의 농도를 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 저산소 자극을 최적화 배양시간 하에 배양하면 3.92배로 증가되었다.
TGFβ-1의 경우 자외선의 광량 자극과 스크래치 자극을 주고 영양분 결핍자극을 준 다음 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D의 농도를 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 저산소 자극을 최적화 배양시간하에 배양하면 2.35배로 증가되었다.
또한 bFGF, VEGF 및 TGFβ-1을 얻기 위하여는 저산소자극과 자외선 자극 및 비타민 A,B,C,D를 첨가하여 조합하는 경우가 가장 바람직하다. 구체적으로 자외선 광량을 준 다음 비타민 A, 비타민B, 비타민C, 비타민D의 농도를 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 저산소 자극을 최적화 배양시간 하에 배양하면 bFGF 4.11배, VEGF 3.8배 및 TGFβ-1 1.9배가 생산된다.
본 발명의 제2 형태는 지방유래 성체 줄기세포의 배양액을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명에 따른 화장료 조성물은, 포유동물의 지방세포로부터 추출한 지방유래의 성체 줄기세포를 단리하고 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지로 옮겨 무혈청배지에서 계대배양하여 수득한 배양액을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 (a)포유동물의 지방세포로부터 추출한 지방유래의 성체 줄기세포를 단리하는 단계; (b) 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계대배양하는 단계; (c) 지방유래 성체 줄기세포에 저산소 배양, 자외선 조사, 영양분결핍 및 기계적 마찰에서 선택되는 어느 하나 이상의 물리적 자극을 가하는 단계; 및 (d) 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C 및 비타민 D에서 선택되는 하나 이상의 비타민을 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는 방법으로 수득한 것을 특징으로 하는 줄기세포 배양액을 포함한다.
구체적으로 본 발명에 따라 수득한 지방유래 줄기세포 배양액은 주름개선 및 치료, 상처치료, 흉터개선 및 치료를 위한 용도로 사용되는 의약품, 의약부외품, 의약보조품, 화장품 등에 이용될 수 있다.
본 발명에 따라 수득한 지방유래 줄기세포 배양액은 a) 지방유래 줄기세포를 무혈청배지에서 배양하거나 b) 혈청배지에서 안정화시킨 후 무혈청배지에서 배양한 경우 혹은 c) 배양시 물리적 자극이나 화학적 자극을 통하여 세포를 활성화시킨 경우를 모두 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 제1 형태에 따라 최적화된 방법으로 혈청배지와 무혈청배지를 순차적용하여 배양한 배양액을 이용하는 것이다.
더욱 바람직하게는 본 발명의 제1 형태에 따라 최적화된 방법으로 혈청배지와 무혈청배지를 순차적용하여 배양하고 이때 물리적 자극이나 화학적 자극을 통하여 세포를 활성화시켜 수득한 배양액을 이용하는 것이다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 지방유래 줄기세포 배양액은 최종적으로 무혈청 배지에서 배양된 것이다. 세포 배양액을 화장품이나 의약품의 원료로 사용하기 위하여는 혈청이 포함된 배지에서 세포를 배양한 경우 혈청에 의한 면역반응 등의 부작용이 발생할 우려가 크기 때문에, 본 발명에서는 혈청을 배제한 배지를 사용하면서도 세포의 특성에 맞추어 그 성장이나 활성이 유지되는 새로운 배양 조건 및 방법을 제공한 것이다.
또한, 본 발명에 따른 배양액은 다종의 인간 성장인자를 포함하고, 이러한 지방유래 성체줄기세포로부터 생산된 성장인자는 기존의 합성방법 즉, 화학적 합성법으로 아미노산을 사용한 성장인자의 합성, 유전자 재조합방법에 의한 성장인자의 합성과 구별되며, 이러한 유전자재조합 방법이나 화학적인 합성법으로 생산된 성장인자와 비교할 때 생체 내의 본래 성장인자와 구조적으로 더 유사하기 때문에 피부적합성이 우수하며 안전성이 확보되는 이점이 있다.
또한 기능적인 면에서도 이성질체나 3차원 구조적으로 입체특이성이 나타나지 않은 생체내의 성장인자와 동일한 형태의 성장인자로, 재조합 방법이나 화학적 합성법으로 생산된 성장인자와 비교할 때 더 우수한 활성이 확보되는 이점이 있다.
구체적으로, 본 발명에 따라 포유동물의 지방세포로부터 추출한 지방유래의 성체 줄기세포를 단리하고 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지로 옮겨 무혈청배지에서 계대배양하여 수득한 배양액의, 섬유아세포 증식 능력을 비교한 결과 본 발명에 따라 지방유래 줄기세포를 이용하여 생산된 성장인자를 포함하는 배양액이 기존의 합성법으로 생산된 성장인자가 포함된 배지보다 그 활성이 우수함을 확인하였다(표 5 참조).
또한 본 발명에 따른 지방유래 줄기세포의 배양액은 세포내 콜라겐 합성을 증가시키고 섬유아세포의 증식을 촉진시키는 활성이 있으며, 자외선에 의한 각질형성세포의 증식을 억제하며, 피부 과각화를 완화시키고 주름을 개선하는 활성이 있다(표 4, 6, 7, 8 및 도 6, 12, 13, 14, 15, 16 참조).
따라서 본 발명에 따른 지방유래 줄기세포의 배양액은 주름개선 및 치료, 상처치료, 흉터개선 및 치료를 위한 용도로 사용되는 의약품, 의약부외품, 의약보조품, 화장품의 원료로 유효하게 이용될 수 있다. 특히 본 발명의 배양액을 이용하면, 고가인 혈청의 사용을 줄이고, 비침습적인 방법으로 일반 피부과나 성형외과 등에서 행해지는 지방흡입시술 등을 통해 입수가 가능한 지방유래 성체 줄기세포를 이용함으로써, 경제성이 제고되고, 또한 자연적으로 분비되어 포함된 양을 크게 상회하는 양으로 인간 성장인자가 포함된 세포 배양액이므로 화장료 조성물에 적은 양으로 사용해도 효과면에서 우수한 기능성 화장품을 제조할 수 있다.
이하 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 기술할 것이나, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 청구범위에 기재된 본 발명의 보호범위 내에서 다양한 보완 및 변형이 가능하다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
＜실시예1＞
(1-1) 지방유래 줄기 세포의 단리
병의원(리더스 피부과, 서울)에서 수득한 인간의 지방흡입물을 동일 부피의 인산화 완충 용액으로 세척하고 지방조직만을 분리하였다.
지방조직의 세포외기질을 37℃, 5％ CO2 배양기에서 45분간 0.075％ 콜라게나아제로 효소처리하고, 최적의 효소 처리된 지방조직을 1200g에서 5분간 원심분리시켜 고밀도의 줄기세포를 포함한 스트로마성 혈관 분획을 수득하였다. 펠렛을 인산화 완충 용액으로 세척하고 70㎛ 나일론 세포 여과기를 통하여 기타 조직을 제거하고 Histopaque-1077(SIGMA)로 적혈구를 포함한 세포파편과 단핵세포만을 분리하였다.
분리된 단핵세포를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10％ fetal bovine serum(FBS), 1％ penicillin streptomycin, 0.17％ sodium bicarbonate 를 포함하는 비유도성 배양액으로 37℃, 5％ CO2, 배양기에서 24시간 배양 후 비접착성 세포들을 제거함으로써 줄기 세포를 단리하였다(도 1 참조).
(1-2) 지방유래 줄기 세포의 배양
지방조직으로부터 분리된 줄기세포의 초기 세포배양은 DMEM을 사용하며, 10％ FBS를 첨가하여 사용하였다. 또한 항생제로 1％ 페니실린-스트렙토마이신(100 IU/ml,GIBCO)을 첨가하였고, 항진균제로 암포테리신 B(0.5μg/ml, Amresco), 마이코플라스마 억제제로 타일로신(10μg/ml, Serva, Heidelberg), 그리고 2 mM 글루타민과 1mM 소디움 피루베이트를 더 첨가하였다. 배양조건은 습도 95％, 37℃, 5％ CO2 배양기에서 배양하고, 5％ CO2 배양시에는 최종농도가 0.17％가 되게 소디움 바이카보네이트를 첨가해 주었다.
상기 (1-1)에서 단리한 줄기세포를 104 cells/ml가 되도록 세포 부유액 10 ml를 T25 플라스크(면적 25cm2, 용량 50 ml)에 옮겨 상기조건에서 배양하였다.
누적집단배증시간 (doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 80％ 합류(confluence) 때까지 유지하고 80％ 합류시기에 계대배양을 수행하였다.
계대배양은 배양액을 제거한 플라스크를 PBS로 세척하고 0.25％ Trypsin-EDTA(GIBCO)로 세포를 떨어뜨린 후 세포부유액을 원심분리한 다음, 세포수 측정과 viability 검사한 뒤 다시 3배로 계대배양 하였다. 계대배양시 사용한 무혈청배지는 페놀 레드 등의 pH 지시약이 첨가되지 않은 DMEM을 기본으로 하고 Ham's F-12 영양소 혼합액(SIGMA)을 1:1의 비율로 첨가하고, 2mM L-글루타민, 1mM 소디움 피루베이트를 첨가한 후 0.1 중량％가 되게 소디움 바이카보네이트를 첨가하여 사용하였으며, 상기 과정을 3번 반복하였다.
세포수의 측정과 viability 검사는 0.1ml의 세포부유액과 동량의 0.2％ trypan blue(SIGMA)를 혼합한 후 hemocytometer를 이용하여 현미경 시야에서 염색된 세포와 안 된 세포를 세어 전체 세포중의 백분율을 구하였다.
(1-3) 줄기세포의 확인
지방유래 줄기세포는 다수의 유착 및 표면 단백질을 발현한다. 이들 단백질로서 SH-2와 SH-3와 SH-4 단클론 항체는 인간 중간엽 줄기세포의 세포표면 에피토프를 인식한다. 펩타이드 염기서열과 흡광도 분석 결과 SH-3와 SH-4는 CD73(ecto-5'-nucleotidase)으로 식별되고 SH-2는 CD105(엔도글린)으로 식별된다. 이들 세포표면 마커는 지방유래 줄기세포에 의해 공유된다(Barry, F. et al., Biochem Biophys Res Commun., 289(2): 519-24 (2001)).
줄기세포의 확인은 배양된 지방조직 유래 줄기세포를 초기, 1계대, 2계대 배양 별로 Flourescence Activated Cell Sorter (Beckman Coulter)로 유세포분석을 수행하였다. 구체적으로 세포를 0.25％ 트립신-EDTA로 채취하고, PBS로 세척한 후 105 cells/ml가 되도록 맞춘 뒤 중간엽줄기세포의 특이성 마커인 CD73-PE, CD105-FITC (BD science) 항체로 반응시켜 488 nm에서 아르곤 레이져로 분석하였다.
그 결과 지방조직으로부터 분리된 PLA 세포의 유세포분석 결과는 초기 단리된 스트로마성 혈관 분획에서는 5.27％의 줄기세포 상동성을 나타냈고(도 2 참조), 2차 계대배양 이후에는 CD73-PE에 대해선 92.32％, CD105-FITC에 대해선 90.67％의 줄기세포 상동성을 보였다(도 3 참조).
＜실시예2＞
지방유래 줄기세포의 활성화된 성장인자의 확인
지방유래 줄기세포가 성장인자를 합성하는지 확인하기 위하여, 우선 지방유래 줄기세포를 실시예 (1-2)의 배양배지와 배양조건하에서 배양한 후 역전사-핵산 중합효소 증폭반응을 통해 줄기세포 안에 있는 RNA를 확인하였다.
구체적으로, 지방유래의 줄기세포의 전체 RNA를 RNeasy Plus Mini kit(QIAGEN Corp., Valencia, California)로 추출하고 RNA를 MMLV-reverse transferase(Promega Corp., U.S.A)를 사용하여 PCR로 37℃에서 45분간 반응한 후 65℃에서 15분간 MMLV-역전사 효소를 불활성화시켰다. 특이검출 PCR 반응액은 총 부피 50㎕로 하였으며 각 시약들의 농도는 1.5mM MgCl2와 0.25mM dNTP, 2.5unit Taq polymerase (QIAGEN) 이었다. PCR 반응은 TGRADIENT (BIOMETRA)에서 수행하였으며 cDNA의 변성을 위해 94℃ 3분을 수행한 후 94℃ 30초 (DNA 변성), 60℃ 30초 (풀림), 72℃ 30초 (신장반응)를 30회 반복한 후 최종 신장을 위하여 72℃ 5분을 더 주어 증폭 수행하였다. 위와 같이 역전사 반응을 수행하여 cDNA를 합성하고 VEGF-β, bFGF, TGFβ-1 의 primer(표 2)를 이용하여 역전사 PCR을 수행하였다.
표 2
성장인자별 검출가능 특이적 염기서열
그 결과 서열목록 7에 해당하는 482bp의 bFGF의 산물(1522bp∼2003bp)과 서열목록 8에 해당하는 343bp의 VEGF 산물(1080bp∼1422bp)과 서열목록 9에 해당하는 212bp의 TGFβ-1 산물(2119bp∼2330bp)을 지방유래 줄기세포 내의 성장인자로 확인하였다(도 4 참조).
또한 배양액 중에도 성장인자가 존재하는지 확인하기 위해 면역효소중합반응(Enzyme-linked immunosorbent assay)을 실시하였다.
구체적으로, 지방유래 줄기세포를 실시예 (1-2) 조건하에 3계대로 배양한 배양액 1 ml을 1200 g에서 5분 동안 원심분리한 뒤 0.22mm 필터로 여과하여 세포 잔여물을 여과한 뒤, 여과물을 단계별로 희석하여 비특이반응이 일어나지 않는 최적 조건을 설정한 뒤 VEGF, bFGF, TGFb-1 각각을 샌드위치 ELISA kit (Quantikine Human FGF basic Immunoassay, R＆D systems)를 이용하여 배양액에 분비된 성장인자의 농도를 측정하였다.
최적으로 희석된 성장인자의 농도를 알아내기 위해 kit내 보정 희석액으로 같은 농도비로 연속적인 희석을 하여 스탠다드 곡선 범위에 들어오는 흡광도의 농도를 확인하였고 스탠다드 곡선 흡광도 범위에 들어오는 값들을 데이터로 작성하였다. 성장인자가 함유된 배양약과 성장인자의 표준용액을 각각의 성장인자에 대한 항체(Quantikine Human FGF basic Immunoassay, R＆D systems)가 코팅되어 있는 well에 100 ml씩 넣고 상온에서 2시간 배양하였다. 항원항체 결합반응이 끝난 뒤 각 well을 세척액으로 4회 세척하고 각 성장인자의 이차 항체가 결합된 용액(Quantikine Human FGF basic Immunoassay, R＆D systems) 200 ml를 넣어준 뒤 상온에서 2시간 배양하였다. 이차항체 결합반응이 끝난 뒤 각 well을 세척액으로 4회 세척하고 발색시약 200 ml(tetramethylbenzidine, R＆D systems)를 넣은 다음 450 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.
그 결과 bFGF는 12시간 뒤 54.96pg/ml 24시간 뒤 76.393pg/ml 의 증가량을 보였고 VEGF는 12시간 뒤 87.021pg/ml 24시간 뒤 163.52pg/ml의 증가량을 보였다(도 5 참조).
＜실시예3＞
섬유아세포의 콜라겐 생성에 미치는 지방유래 줄기세포 배양액의 활성
피부주름의 발생원인 중 하나로 피부교원질(콜라겐)의 결핍을 들고 있다. 콜라겐은 피부 진피를 구성하는 주요 단백질로서 피부구조와 탄력을 유지하는 역할을 하고 있다. 콜라겐은 나이가 들면서 생성의 감소를 보이며 분해도 증가되어 피부 진피층의 함몰을 유도하여 피부의 주름을 생성하는 것으로 알려져 있다. 따라서 콜라겐의 생성, 분해정도를 실험하여 피부 주름개선 물질의 효력을 뒷받침할 수 있다.
(3-1) 지방유래 줄기세포와 섬유아세포의 혼합배양
지방유래 줄기세포와 섬유아세포의 coculture를 통해 섬유아세포의 콜라겐생성에 지방유래 줄기세포가 미치는 영향을 평가한다. 시험방법은 지방유래 줄기세포와 섬유아세포(fibroblast)를 transell (Costar, Corning)에 함께 배양 시 섬유아세포 내 콜라겐 생성 증가 정도를 섬유아세포 단독배양과 비교하는 것이다.
a) 혼합배양
섬유아세포(primary cell line)는 사람의 피부조직의 일부(한강성심병원 진단검사의학과, 9살 circumcison 파편)를 PBS 부유 상태에서 잘게 자르고 트립신 50∼100 ml로 20분간 교반하여 원심분리 후 70 um나일론 여과기로 여과하여 수득하였다.
여과된 세포 부유물을 섬유아세포를 배양접시의 바닥에 접종한 후 페니실린(100 IU/mL), 스트렙토마이신(100 g/mL), 10％ FBS를 함유하는 DMEM 배지를 넣고 37 ℃, 5％ 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 80％ 합류에 도달한 섬유아세포를 6-well plate에 well당 5 × 104 개로 분주한 다음 subculture 때와 같은 세포배양조건에서 24시간 배양하였다.
실시예 (1-1)에서 단리한 지방유래 줄기세포도 섬유아세포와 동일한 조건에서 transwell insert에 24시간 배양한 뒤에 transwell insert를 섬유아세포가 배양중인 6-well plate에 잘 삽입하여 coculture 하였다. 이 때 transwell insert의 아래쪽 배지를 버리고 PBS 로 세척한 다음 새로운 배지를 넣고, 섬유아세포와 지방유래 줄기세포를 함께 배양하였다.
Coculture 한 배양액을 배양 24시간, 72시간 후 1 ml을 취하여 배양액 중에 존재하는 콜라겐 양을 측정하였다.
대조군 실험으로 confluence에 도달한 섬유아세포를 6-well plate에 well당 5 × 104개로 분주한 다음 24시간 배양하고, 지방유래 줄기세포를 seeding 하지 않은 transwell insert 만을 transwell plate에 잘 삽입하여 배양하였다.
b) 콜라겐 생성에 대한 활성 확인
1) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용한 콜라겐양의 측정
콜라겐 양의 측정은 Procolagen type I peptide EIA kit (TAKARA BIOMEDICAL Co.)를 이용하였다. Antibody-PoD conjugate solution 100 ml를 well에 넣은 다음 콜라겐 스탠다드 곡선에 범위에 들어오도록 보정 희석액에 최적으로 희석된 섬유아세포 및 지방유래 줄기세포와 혼합배양된 섬유아세포 배양액 20 μl를 넣고 37℃에서 3시간 방치하였다. 이후 Well을 세척액으로 4회 세척한 다음 발색시약 100 μl를 넣고 상온에서 15분간 배양 후 450nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.
2) Semi-quantity PCR를 이용한 세포내 콜라겐양의 측정
RNeasy plus mini kit(QIAGEN)를 이용하여 줄기세포와 혼합배양된 섬유아세포의 전체 RNA를 추출하였고, 추출된 3㎍의 RNA는 MMLV-역전사 효소(Promega) 200unit, 50mM Tris-HCl(pH8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM DTT, 10mM dNTP, RNase inhibitor 25unit, 20pmole Oligo-dT를 사용하였다. PCR 반응은 T-GRADIENT (BIOMETRA)에서 수행하였고 37℃에서 45분간 반응한 후 65℃에서 15분간 MMLV-역전사 효소를 불활성화시켰다. 콜라겐 I형(GenBank No. NM-000089)의 확인을 위한 특이 염기서열은 NCBI의 Genbank에 등록된 염기서열을 기반으로 작성하였고 이는 표 3에 제시하였다.
표 3
콜라겐 I형의 검출 특이성 염기서열
그 결과 도 6에 도시한 바와 같이, 세포내 콜라겐 합성량은 대조군에 비해 1일 배양 시 2.17배 증가, 3일 배양 시 1.27배 증가하였으며, 전체 콜라겐 합성량은1일 배양 시 1.44배 증가, 3일 배양 시 1.14배 증가함을 확인하였다.
(3-2) 지방유래 줄기세포 배양액에 의한 섬유아세포의 콜라겐 합성
지방유래 줄기세포의 배양액(conditioned media)이 섬유아세포의 콜라겐 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 western blot(특수 단백질 검출)을 시행하였다.
지방유래 줄기세포의 배양액을 수집하기 위해 subculture 후 T75 flask에 5×105의 지방유래 줄기세포를 seeding하였다. 이 때 배지는 serum free DMEM을 사용하였다. 3일간 37℃, 5％ CO2 incubator(배양기)에서 배양한 후 배지를 수확하여 0.22um syringe filter로 여과한 후 이를 serum free conditioned media로 실험에 사용하였다.
섬유아세포는 subculture 후 6well plate에 5×104으로 0.1％ FBS가 포함된 DMEM에 seeding하였다. 24시간 배양한 후 상기 serum free conditioned media로 교체하였으며 control로 serum free DMEM을 사용하였다. 12시간 후 2％로 serum을 보정하고 30시간 배양한 후 배양액을 수확하여 western blot을 실시하였다.
전기영동(electrophoresis)은 SDS-PAGE 법을 응용하여 시행하였고, 전기영동장치는 Bio-rad사의 electrophoresis kit를 사용하였다. gel은 8％ polyacrylamide을 사용하였으며 PVDF membrane(bio-rad)을 이용하여 전이(transfer)하였다. 그 후 blot을 5％ nonfat dry milk(탈지분유)가 포함된 TBST(50mM Tris, pH8.0, 138mM NaCl, 2.7mM KCl, 0.1％ (w/v) tween20)로 block하였다. 1차 항체(primary antibody)는 collagen type I(santacruz)을 overnight으로 반응시켰고 2차 항체(secondary antibody)는 peroxidase-Rabbit anti-goat IgG(Zymed)로 30분간 반응시켰다. 마지막으로 항체를 탐지하기 위한 detection reagent(ECL, milipore)에 1분간 반응시킨 후 결과를 확인하였다.
그 결과 도 16 나타낸 바와 같이 지방유래 줄기세포 배양액을 섬유아세포에 처리했을 때 처리하지 않은 배양액보다 콜라겐 양이 2배 이상 증가하였다(gene tool software로 정량 ; 2.16배 증가). 이것은 지방유래 줄기세포의 배양액이 섬유아세포의 콜라겐 합성을 증가시킨다는 것을 증명하는 것이며 따라서 지방유래 줄기세포의 배양액이 피부 노화를 막는 주름 개선의 물질로 사용될 수 있음을 시사한다.
＜실시예4＞
지방유래 줄기세포 배양액의 섬유아세포의 증식 촉진 확인
실시예 (1-2)와 같이 지방조직으로부터 분리된 줄기세포를 3계대 후 106개의 세포를 T175 플라스크(면적 175㎠, 용량500ml)에 도포하고 3일 동안 배양 후 배양액을 수거하여 9살 남자 피부조직 (한강성심병원 진단검사의학과 9살 circumcison 파편) 섬유아세포 4계대 세포가 25,000개씩 분주된 6웰 플레이트에 줄기세포배양액을 10％, 25％, 50％, 100％가 되게 배양액을 첨가하였다.
3일 경과 후 섬유아세포의 증식정도를 세포생존력 측정키트(cell counting kit-8, Dojindo Molecular Technologies, Inc.)로 반응시킨 후 ELISA reader로 450nm 흡광도를 측정하였다.
분석 결과 표 4에 나타낸 바와 같이, 지방유래 줄기세포에서 분비된 성장인자가 섬유아세포의 증식을 촉진한다는 것을 입증하였으며, 지방유래 줄기세포에서 분비된 성장인자의 농도가 높아질수록, 이러한 섬유아세포의 증식은 비례하여 촉진된다는 것을 확인하였다(도 7 참조).
표 4
지방유래 줄기세포에서 분비된 성장인자 함유된 배양액 농도별 섬유아세포 세포수
＜실시예 5＞
지방유래 줄기세포에서 분비된 성장인자와 E. coli 에서 발현된 재조합 성장인 자의 비교
실시예 (1-2)에서와 같이 지방조직으로부터 분리된 줄기세포를 3계대 후 106개의 세포를 T175 플라스크(면적 175㎠, 용량 500ml)에 도포하고 3일 동안 배양 후 배양액을 수거하여 9살 남자 피부조직 섬유아세포 4계대 세포가 5000개씩 분주된 6웰 플레이트에 줄기세포배양액 100％를 첨가하였고, 대조군으로 E. coli에서 발현된 같은 농도의 재조합 성장인자 VEGF, bFGF(Santa Cruz.)를 첨가한 배지와 섬유아세포의 세포생존력 측정키트로 비교해 보았다.
그 결과 유전자 재조합법을 이용한 대장균 내 성장인자 유전자의 과발현과 순수분리를 통해 얻어진 성장인자와 성체줄기세포를 이용하여 합성한 성장인자를 비교할 때 지방유래 성체줄기세포를 이용하여 합성한 성장인자가 기존의 합성방법을 통해 만들어진 성장인자보다 그 효과가 우수하다는 것이 입증되었다. 분석 결과는 표 5와 같다.
표 5
지방유래 줄기세포 배양배지와 재조합성장인자 첨가 배지와의 세포 증식력 비교
＜실시예 6＞
성장인자 분비량을 증가시킨 지방유래 줄기세포의 배양 방법
(6-1) 물리적 자극
실시예 (1-2)에서와 같이 지방조직유래 줄기세포를 3계대한 후, 배양한 세포가 80％ 합류되었을 시 트립신/EDTA로 세포를 잘 수거한 다음 25,000개씩의 세포를 6웰 플레이트에 정확히 분주하였다.
분주 후 24시간 뒤 세포가 모두 부착되었을 시 배양액을 완전히 제거하고 물리적인 조건으로 이산화탄소 5％에 산소 1％ 멀티가스배양기(Sanyo)에서 배양시켰고, 자외선 B에 해당되는 280∼320nm (model BEX-800; Ultra-Lum, Inc.)의 파장으로 90 mJ/㎠의 열량을 조사하였다. 영양분결핍반응으로는 Mg2 +와 Ca2 +이 첨가된 Dulbecco's phosphate buffered saline로 세포가 떨어지기 직전 상태인 최대 4시간까지 배양한 후 실시예 (1-2)의 무혈청배지로 교체하였다. 기계적인 마찰을 이용한 스크래치는 접착되어 배양되는 세포배지에 블레이드를 이용하여 가로, 세로 1mm의 격자 모양으로 긁어주는 스크래치 자극을 가하였다.
(6-2) 화학적인 조건
실시예 (1-2)의 무혈청배지 즉, 페놀 레드 등의 pH지시약이 첨가되지 않은 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합액을 1:1의 비율로 첨가하여 혼합하고, 2mM L-글루타민, 1mM소디움 피루베이트, 0.17％ 소디움 바이카보네이트가 첨가된 무혈청 배지에, 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D를 세포독성이 없는 이하의 유효수준으로 첨가하여 배양하였다.
조건별로 37℃, 5％ 이산화탄소 배양기에서 48시간 이상 배양 후 배양액 상등액 200㎕를 3,000rpm에서 원심분리 후 0.22㎛여과지에 여과 후 실시예 2의 효소면역측정법(ELISA)으로 bFGF, VEGF,TGFβ1의 농도를 확인하였다.
검사된 비타민 A의 최적농도는 2∼10μM, 비타민 B2의 최적농도는 50∼100μM, 비타민 C의 최적농도는 10∼100μM, 비타민 D의 최적농도는 5∼10μM에서 MTT assay 결과 세포독성이 없으며, 본 발명에서 원하고자 하는 각각의 성장인자의 합성이 증가하는 것을 확인하였다.
(6-3) 대조군 배양 조건
물리적 자극과 화학적인 조건을 주지 않은 정상 상태의 배양을 대조군로 하였고, 물리적 자극과 화학적인 조건을 준 배양배지와 성장인자의 증가정도를 비교하였다.
배양 조건으로 계대배양 후 페놀 레드 등의 pH지시약이 첨가되지 않은 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합액을 1:1의 비율로 첨가하여 혼합하고, 2mM L-글루타민, 1mM소디움 피루베이트, 0.17％ 소디움 바이카보네이트가 첨가된 무혈청 배지에 37℃, 5％ 이산화탄소 배양기에서 48시간 이상 배양 후 배양액 상등액 200㎕를 3,000rpm에서 원심분리 후 0.22㎛여과지에 여과 후 실시예 2의 효소면역측정법(ELISA)으로 bFGF, VEGF, TGFβ1의 농도를 확인하였다.
(6-4) 자극의 병합
bFGF의 경우 물리적 자극과 화학적인 자극을 같이 주었을 경우에는, 자외선의 광량을 주고 곧바로 비타민 A 2μM, 비타민 B 50μM, 비타민 C 10μM, 비타민 D 10μM의 농도로 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 1％ 산소, 5％ 이산화탄소의 저산소 자극을 48시간 동안 배양하였다.
VEGF의 경우 자외선의 광량을 준 다음 스크래치 자극을 주고 곧바로 비타민 A 2μM, 비타민 B 50μM, 비타민 C 10μM, 비타민 D 10μM의 농도로 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 1％ 산소, 5％ 이산화탄소의 저산소 자극을 48시간 동안 배양하였다.
TGFβ-1의 경우 자외선의 광량 자극과 스크래치 자극을 주고 영양분 결핍자극을 준 다음 비타민 A 2μM, 비타민 B 50μM, 비타민 C 10μM, 비타민 D 10μM의 농도로 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 1％ 산소, 5％ 이산화탄소의 저산소 자극을 48시간 동안 배양하였다.
또한 bFGF, VEGF 및 TGFβ-1의 총괄적 최대량을 얻기 위하여 자외선 광량을 준 다음 비타민 A 2μM, 비타민 B 50μM, 비타민 C 10μM, 비타민 D 10μM의 농도로 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 1％ 산소, 5％ 이산화탄소의 저산소 자극을 48시간 동안 배양하였다.
(6-5) 결과
bFGF의 경우에는 도 9에 도시한 바와 같이 대조군과 비교하였을 때 저산소 자극을 주는 경우 1.74배 증가하였고, 자외선 자극을 주는 경우 2.71배 증가하였다. 화학적인 자극의 경우에는 비타민 A의 경우 1.62배 증가하였고, 비타민 B의 경우 1.33배 증가하였고, 비타민 C의 경우 2.33배 증가하였고, 비타민 D의 경우 2.80배 증가하는 것을 확인하였다.
상기 자극 중에서 자극효과가 뛰어난 물리적 자극원인 저산소 자극과 자외선 자극을 병행하였을 경우에는 그 상승효과가 증가되었으며, 화학적인 자극의 경우에도 비타민들의 농도를 최적화한 상태에서 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D가 혼합된 배양액 하에서는 3.62배로 증가하는 것을 확인하였다.
물리적 자극과 화학적인 자극을 같이 주었을 경우에는 저산소 자극을 최적화하여 투여하면서, 자외선의 광량과 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D의 농도를 최적화한 경우에는 4.11배로 증가할 수 있었다.
VEGF의 경우에는 도 10에 도시한 바와 같이, 대조군과 비교하였을 때 저산소 자극을 주는 경우 2.53배 증가하였고, 자외선 자극을 주는 경우 1.36배 증가하였으며 기계적인 마찰을 이용한 스크래치 자극을 주는 경우 1.30배 증가하였다. 맥관 내피세포 성장인자(VEGF)의 경우 화학적인 자극의 경우에는 비타민 A의 경우 1.59배 증가하였고, 비타민 C의 경우 1.68배 증가하였고, 비타민 D의 경우 1.30배 증가하는 것을 확인하였다.
상기 자극 중에서 자극효과가 뛰어난 물리적 자극원인 저산소 자극과 자외선 자극, 스크래치 자극을 병행하였을 경우에는 그 상승효과가 증가되었으며, 화학적인 자극의 경우에도 비타민들의 농도를 최적화한 상태에서 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D가 혼합된 배양액 하에서는 2.03배로 증가하는 것을 확인하였다.
물리적 자극과 화학적인 자극을 같이 주었을 경우에는 저산소 자극을 최적화하여 투여하면서, 자외선의 광량과 스크래치 자극을 주고 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D의 농도를 최적화한 경우에는 3.92배로 증가할 수 있었다.
TGFβ-1의 경우에는 도 11에 도시한 바와 같이, 대조군과 비교하였을 때 저산소 자극을 주는 경우 1.64배 증가하였고, 자외선 자극을 주는 경우 1.75배 증가하였으며. 기계적인 마찰을 이용한 스크래치 자극을 주는 경우 2.13배 증가하였고. 영양분결핍 자극을 주는 경우 2.01배 증가하였다. 인간형질전환 성장인자-베타(TGFb-1)의 경우 화학적인 자극의 경우에는 비타민 A의 경우 1.20배 증가하였고, 비타민 B의 경우 1.56배 증가하였고, 비타민 C의 경우 1.20배 증가하였고, 비타민 D의 경우 1.16배 증가하는 것을 확인하였다.
상기의 자극 중에서 자극효과가 뛰어난 물리적 자극원인 저산소 자극과 자외선 자극을 병행하였을 경우에는 그 상승효과가 증가되었으며, 화학적인 자극의 경우에도 비타민들의 농도를 최적화한 상태에서 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D가 혼합된 배양액 하에서는 1.68배로 증가하는 것을 확인하였다.
물리적 자극과 화학적인 자극을 같이 주었을 경우에는 저산소 자극을 최적화하여 투여하면서, 자외선의 광량과 스크래치 자극과 영양결핍 자극을 주고, 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D의 농도를 최적화한 경우에는 2.35배로 증가할 수 있었다.
또한 bFGF, VEGF 및 TGFβ-1의 총괄적 최대량을 얻기 위하여는 저산소자극과 자외선 자극 비타민 A,B,C,D를 첨가배지 조합하는 경우가 가장 바람직하다. 구체적으로 자외선 광량을 준 다음 비타민 A, 비타민B, 비타민C, 비타민D의 농도를 최적화한 DMEM에 Ham's F-12 영양소 혼합 배지로 교체하고 저산소 자극을 최적화 배양시간 하에 배양하면 대조군과 비교하였을 때 bFGF 4.11배, VEGF 3.8배 및 TGFβ-1 1.9배가 생산된다.
＜실시예 7＞
지방유래 줄기세포 성장인자의 자외선에 대한 각질형성세포 방어효과
지방유래 줄기세포에서 분비된 성장인자의 자외선에 대한 각질형성세포 방어효과는 다음과 같은 방법으로 시험하였다.
각질형성세포를 적정세포농도로 6웰 플레이트에 분주하고 37℃, 5％ 이산화탄소의 농도로 맞춘 배양기에서 KGM(karatinocyte growth media; Clonetics.)의 배지 조건하에, ADSC 3 passage 3일 배양액 100％ 2.5cc를 첨가하여 5cc로 맞추고, 레티놀 2uM을 KGM 5cc에 첨가하거나, KGM 5cc만을 각각 투여하고 4시간동안 안정화시켜 원료가 충분히 분산되게 하였다. 원료를 충분히 분산시킨 후 무균실험실에서 40W 더블램프로 8분 동안 자외선을 조사하였다. 24시간 후에 아무것도 처리하지 않고 8분 동안 조사한 음성대조군과 비교하여 세포의 생존율을 구하여 원료에 대한 자외선 방어기능을 측정하였다.
측정결과 아래 표 6과 같이 실시예 (1-2)와 같이 배양하여 VEGF, bFGF, TGFβ-1를 함유한 배양액을 투여한 세포군은 67％, 레티놀을 투여한 세포군은 54％, 그리고 음성대조군은 55％로 나타났다. 이것은 레티놀은 자외선에 대한 방어효과가 떨어지는 것에 반해 지방유래 줄기세포에서 분비된 성장인자는 자외선 방어효과가 더 높은 것을 보여주고 있다.
표 6
노화완화 효과 측정결과
＜실시예 8＞
탈모쥐에서 자외선 조사로 유발된 피부 광노화 현상에 대하여 지방유래 줄기 세포 성장인자의 개선 효과
실시예 (1-2)와 같이 배양하여 VEGF, bFGF, TGFβ-1를 함유한 배양액의 활성을 평가하기 위하여 생후 15내지 20주령의 탈모쥐 30마리씩을 사용하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
탈모쥐의 등부위에 자외선 조사기(UV Simulator)를 이용하여 2 mJ/cm2의 조사량으로 조사하는 것을 주당 2회의 빈도로 4주간 실시함으로써 피부의 비정상적 과각화를 유발시켰다. 그 후 화학적합성법에 의한 성장인자, 유전자 재조합방법에 의한 성장인자, 지방유래 성체줄기세포로 합성한 성장인자를 탈모쥐 등부위의 한쪽 면에 1일 2회, 2주간 1cc씩 도포해주는 반면, 다른 한쪽 면에는 비교를 위해 처리하지 않고 비교하였다. 2주후에 노화완화 효과를 육안 관찰하여 평가(Jin Ho Chung et al. Archives of Dermatology, 137,8 (2001))하였으며, 그 결과는 표 7에 나타내었다.
표 7
노화완화 효과 측정결과
인위적으로 노화가 유발된 탈모쥐에 성장인자를 각각 적용한 결과 지방유래 성체줄기세포를 사용하여 합성한 성장인자의 경우에 30마리의 동물 모두에서 비정상적인 피부 과각화의 완화효과가 나타남을 관찰할 수 있었는데, 화학적 합성방법이나 유전자재조합 방법으로 합성한 성장인자의 경우와 비교하여 볼 때 우수한 결과임을 알 수 있다.
＜실시예 9＞
사람에게 있어서 자가지방유래 줄기세포에서 분비된 성장인자의 주름 개선 효과
30∼50세의 여성을 대상으로 지방유래 성체줄기세포를 통해 합성된 성장인자의 주름 완화 효과를 검증하기 위하여 각 실험군당 20명을 선택하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.
1일 2회 빈도로 8주간 여성의 미간 혹은 눈 주위에 지방유래 줄기세포 배양액에서 VEGF 30ng, bFGF 30ng, TGFβ-1 70ng 함량으로 정제한 배양액 1cc를 도포해 주었으며 다른 쪽 눈 주위에는 비교를 위해 음성대조군(기본 용액으로서 생리식염수 1cc)을 도포해 주었다. 4주 후 및 8주 후, 주름 완화효과를 육안관찰하고 그 결과를 다음과 같이 정리하였다.
표 8
주름완화 효과 측정결과
상기 표와 도 12 내지 15의 결과로부터 알 수 있듯이, 성체줄기세포를 이용하여 합성한 성장인자를 적용한 경우 주름완화 효과가 우수한 것으로 확인되었다.
본 발명에 따른 방법으로 수득한 지방유래 줄기세포 배양액은 안정성과 생리활성이 확보된 물질로써, 이를 이용하여 주름 개선 및 치료, 상처 치료, 흉터 개선 및 치료 등을 목적으로 하는 의약품, 의약부외품, 화장품 등을 개발할 수 있다.
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<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for VEGF
<400> 1
tacctccacc atgccaagtg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for VEGF
<400> 2
tgatgattcd tgccctcctc c 21
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for bFGF
<400> 3
gacggcagag ttgacgg 17
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for bFGF
<400> 4
ctctctcttc tgcttgaagt tgtagc 26
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for TGFb-1
<400> 5
gctgagcgct tttctgatcc t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for TGFb-1
<400> 6
cgagtgtgct gcaggtagac a 21
<210> 7
<211> 482
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
tgctggtgat gggagttgta ttttcagtct tcgccaggtc attgagatcc atccactcac 60
atcttaagca ttcttcctgg caaaaattta tggtgaatga atatggcttt aggcggcaga 120
tgatatacat atctgacttc ccaaaagctc caggatttgt gtgctgttgc cgaatactca 180
ggacggacct gaattctgat tttataccag tctcttcaaa aacttctcga accgctgtgt 240
ctcctacgta aaaaaagaga tgtacaaatc aataataatt acacttttag aaactgtatc 300
atcaaagatt ttcagttaaa gtagcattat gtaaaggctc aaaacattac cctaacaaag 360
taaagttttc aatacaaatt ctttgccttg tggatatcaa gaaatcccaa aatattttct 420
taccactgta aattcaagaa gcttttgaaa tgctgaatat ttctttggct gctacttgga 480
gg 482
<210> 8
<211> 343
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
tacctccacc atgccaagtg gtcccaggct gcacccatgg cagaaggagg agggcagaat 60
catcacgaag tggtgaagtt catggatgtc tatcagcgca gctactgcca tccaatcgag 120
accctggtgg acatcttcca ggagtaccct gatgagatcg agtacatctt caagccatcc 180
tgtgtgcccc tgatgcgatg cgggggctgc tgcaatgacg agggcctgga gtgtgtgccc 240
actgaggagt ccaacatcac catgcagatt atgcggatca aacctcacca aggccagcac 300
ataggagaga tgagcttcct acagcacaac aaatgtgaat gca 343
<210> 9
<211> 212
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
gctgagcgct tttctgatcc tgcatctggt cacggtcgcg ctcagcctgt ctacctgcag 60
cacactcgat atggaccagt tcatgcgcaa gaggatcgag gcgatccgcg ggcagatcct 120
gagcaagctg aagctcacca gtcccccaga agactatcct gagcccgagg aagtcccccc 180
ggaggtgatt tccatctaca acagcaccag gg 212
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for Collagen type I
<400> 10
ccctcaaggt ttccaaggac 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for Collagen type I
<400> 11
accaggttca cccttcacac 20
Claims (3)
- 줄기세포 배양액을 함유하는 기능성 화장료 조성물에 있어서,
줄기세포 배양액은
(a) 포유동물의 지방세포로부터 추출한 지방유래의 성체 줄기세포를 단리하는 단계;
(b) 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계대배양하는 단계;
(c) 지방유래 성체 줄기세포에 저산소 배양, 자외선 조사, 영양분결핍 및 기계적 마찰에서 선택되는 어느 하나 이상의 물리적 자극을 가하는 단계; 및
(d) 선택적으로 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C 및 비타민 D에서 선택되는 하나 이상의 비타민을 배양액에 첨가하는 단계를 포함하는 방법으로 수득한 것을 특징으로 하는 조성물. - 제1 항에 있어서, 기능성은 주름개선 및/또는 노화완화 활성인 화장료 조성물.
- 주름개선 및/또는 노화완화 기능성 화장료 조성물에 있어서,
줄기세포 배양액을 포함하고
이 때 줄기세포 배양액은 (a) 포유동물의 지방세포로부터 추출한 지방유래의 성체 줄기세포를 단리하는 단계; 및
(b) 줄기세포를 혈청배지에서 배양한 다음 무혈청배지에서 계대배양하는 단계를 포함하는 방법으로 수득한 것을 특징으로 하는 조성물.
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