CN111548988B - 一种医用漂洗液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种医用漂洗液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种医用漂洗液及其制备方法和应用，属于医用试剂技术领域。本发明的医用漂洗液包括葡萄糖、维生素、碱性成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、瘦素和缓冲液；所述葡萄糖、维生素、碱性成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子和瘦素的浓度依次为0.5～4g/L、0.002～0.02g/L、0.005～0.05mg/L、0.002～0.02mg/L、0.02～0.25mg/L、0.04～0.4mg/L和0.002～0.02mg/L；所述医用漂洗液的pH值为7.2～7.5。本发明提供的医用漂洗液能够有效保证细胞或组织的活性。

Description

一种医用漂洗液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医用试剂技术领域，具体涉及一种医用漂洗液及其制备方法和应用。
背景技术
在细胞或组织的体外处理过程中，通常需要用漂洗液对其进行洗涤，以在保证细胞或组织活性的基础上去除杂质，使后续相关处理顺利进行。因此，漂洗液对于细胞或组织的体外处理过程的顺利进行有重要影响。
目前，脂肪颗粒注射自体移植技术广泛应用于软组织充填，具有生物相容性好、获取方便、来源充裕、操作简单、充填效果好、成本低等优点。但脂肪颗粒注射自体移植后吸收率较高，通常移植的脂肪颗粒在体积和重量上均减少50％以上，脂肪移植术后效果难以预测，未存活细胞易发生液化、坏死、感染，导致脂肪移植存活率低。
脂肪移植存活率与很多因素有关，脂肪组织的获取、体外处理以及注射等步骤均会对脂肪移植存活率产生一定影响。脂肪颗粒注射自体移植技术中脂肪颗粒通常是在肿胀麻醉条件下负压吸脂所获，但目前对如何处理脂肪细胞仍无共识，部分整形科医生对脂肪细胞进行洗涤时采用生理盐水(临床上也可采用林格氏液代替生理盐水)，存活率仍有待提高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种医用漂洗液及其制备方法和应用，本发明提供的医用漂洗液中采用多种生长因子共同作用，并配以能量物质和缓冲体系，能够有效保证细胞或组织的活性，如可以有效提高自体脂肪移植成活率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种医用漂洗液，包括葡萄糖、维生素、碱性成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、瘦素和缓冲液；
其中，所述葡萄糖的浓度为0.5～4g/L，维生素的浓度为0.002～0.02g/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.005～0.05mg/L，角质细胞生长因子的浓度为0.002～0.02mg/L，肝细胞生长因子的浓度为0.02～0.25mg/L，血管内皮生长因子的浓度为0.04～0.4mg/L，瘦素的浓度为0.002～0.02mg/L；
所述缓冲液的溶剂为水；
所述医用漂洗液的pH值为7.2～7.5。
优选地，所述医用漂洗液中葡萄糖的浓度为0.5～2g/L，维生素的浓度为0.002～0.01g/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.005～0.03mg/L，角质细胞生长因子的浓度为0.005～0.015mg/L，肝细胞生长因子的浓度为0.04～0.15mg/L，血管内皮生长因子的浓度为0.08～0.2mg/L，瘦素的浓度为0.005～0.015mg/L。
优选地，所述医用漂洗液中葡萄糖的浓度为1g/L，维生素的浓度为0.002g/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.01mg/L，角质细胞生长因子的浓度为0.01mg/L，肝细胞生长因子的浓度为0.05mg/L，血管内皮生长因子的浓度为0.1mg/L，瘦素的浓度为0.01mg/L。
优选地，所述维生素包括维生素B、微生素C、维生素K1和维生素E，所述维生素B、微生素C、维生素K1和维生素E的质量比为1:1:1:1。
优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，组成上包括NaCl、KCl、NaHCO3、Na2HPO4、KH2PO4和水；所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.2～7.5。
本发明提供了上述方案所述医用漂洗液的制备方法，包括以下步骤：
将医用漂洗液的各组分混合后除菌，得到漂洗液。
本发明提供了上述方案所述医用漂洗液或上述方案所述制备方法制备得到的医用漂洗液在细胞或组织的培养、转移、储存或漂洗中的应用。
优选地，所述细胞包括干细胞或脂肪细胞，所述组织包括脂肪组织。
优选地，所述漂洗的方法，包括以下步骤：
将医用漂洗液与待处理的细胞或组织混合后进行漂洗，之后去除所得体系中液体，完成细胞或组织的漂洗。
优选地，所述漂洗的次数为2～3次，单次漂洗的过程中，医用漂洗液与待处理的细胞或组织的体积比为3～4:10。
本发明提供了一种医用漂洗液，包括葡萄糖、维生素、碱性成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、瘦素和缓冲液；其中，所述葡萄糖的浓度为0.5～4g/L，维生素的浓度为0.002～0.02g/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.005～0.05mg/L，角质细胞生长因子的浓度为0.002～0.02mg/L，肝细胞生长因子的浓度为0.02～0.25mg/L，血管内皮生长因子的浓度为0.04～0.4mg/L，瘦素的浓度为0.002～0.02mg/L；所述缓冲液的溶剂为水；所述医用漂洗液的pH值为7.2～7.5。本发明提供的医用漂洗液中采用多种生长因子共同作用，并配以能量物质和缓冲体系，能够有效保证细胞或组织的活性，如可以有效提高自体脂肪移植成活率。实施例的结果显示，采用本发明提供的漂洗液对脂肪颗粒进行漂洗，细胞增殖率明显高于生理盐水漂洗的脂肪颗粒；与含1％双抗的生理盐水相比，采用本发明提供的漂洗液对脂肪组织漂洗后进行培养，原代细胞会更快贴壁并伸展。
附图说明
图1为应用例1中实验组和对照组所得脂肪细胞经相同条件培养后的细胞增值率对比图；
图2为应用例2中实验组和对照组所得脂肪干细胞分离并在相同条件培养3天后细胞生长状态对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种医用漂洗液，包括葡萄糖、维生素、碱性成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、瘦素和缓冲液；所述缓冲液的溶剂为水；所述医用漂洗液的pH值为7.2～7.5。在本发明中，所述医用漂洗液中葡萄糖的浓度为0.5～4g/L，维生素的浓度为0.002～0.02g/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.005～0.05mg/L，角质细胞生长因子的浓度为0.002～0.02mg/L，肝细胞生长因子的浓度为0.02～0.25mg/L，血管内皮生长因子的浓度为0.04～0.4mg/L，瘦素的浓度为0.002～0.02mg/L；优选地，所述医用漂洗液中葡萄糖的浓度为0.5～2g/L，维生素的浓度为0.002～0.01g/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.005～0.03mg/L，角质细胞生长因子的浓度为0.005～0.015mg/L，肝细胞生长因子的浓度为0.04～0.15mg/L，血管内皮生长因子的浓度为0.08～0.2mg/L，瘦素的浓度为0.005～0.015mg/L；更优选地，所述医用漂洗液中葡萄糖的浓度为1g/L，维生素的浓度为0.002g/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.01mg/L，角质细胞生长因子的浓度为0.01mg/L，肝细胞生长因子的浓度为0.05mg/L，血管内皮生长因子的浓度为0.1mg/L，瘦素的浓度为0.01mg/L。
在本发明中，所述碱性成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子和瘦素可以为天然生长因子(或瘦素)，也可以为重组生长因子(或瘦素)；在本发明的实施例中，具体是采用重组生长因子(或瘦素)。
在本发明中，所述维生素优选包括维生素B、微生素C、维生素K1和维生素E，所述维生素B、微生素C、维生素K1和维生素E的质量比优选为1:1:1:1。在本发明中，所述维生素可起到辅酶因子(如，维生素K和大多数维生素B)和生物抗氧化剂(如，维生素C和维生素E)的作用，有利于维持细胞活力及稳定性。
在本发明中，所述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为7.4，组成上优选包括NaCl、KCl、NaHCO3、Na2HPO4、KH2PO4和水；所述磷酸盐缓冲液的pH值优选为7.2～7.5；在本发明中，更优选地，所述医用漂洗液中NaCl的浓度为8g/L，KCl的浓度为0.4g/L，NaHCO3的浓度为0.35g/L，Na2HPO4的浓度为0.1g/L，KH2PO4的浓度为0.06g/L。在本发明中，缓冲液能够为细胞或组织等的提取纯化提供必要的缓冲环境。本发明优选采用磷酸盐缓冲液，在对细胞或组织等进行漂洗时，能够去除混入细胞或组织中的血液、麻醉液、纤维碎块等；同时还可提高抽离体外的脂肪细胞及间充质干细胞的细胞稳定性，保持脂肪细胞完整性和活性，提高细胞移植存活率。
在本发明中，所述碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能够促进前脂肪细胞和***增生，促进再血管化过程，有利于脂肪细胞成活；角质细胞生长因子(KGF)和血管内皮生长因子(VEGF)能够促进内皮细胞有丝***，促进移植组织周围的神经血管再生，提高脂肪细胞成活率；肝细胞生长因子(HGF)具有很强的促进血管新生和建立侧支循环作用，有利于提高自体脂肪移植存活率；瘦素(Leptin)主要由脂肪细胞分泌，能够促进前脂肪细胞向成熟脂肪细胞转化，血管内皮细胞具有瘦素受体，瘦素能够促进血管内皮细胞增殖，加速局部血管增生，增加局部供血，增强移植组织血管增生。
在本发明中，所述葡萄糖作为能量物质，能够为脂肪细胞或组织等的提取纯化提供必要的营养环境。
本发明采用多种生长因子共同作用，并配以能量物质和缓冲体系，能够有效提高自体脂肪移植成活率。
在本发明中，所述水优选为纯化水。
本发明提供了上述技术方案所述医用漂洗液的制备方法，包括以下步骤：将医用漂洗液的各组分混合后除菌，得到漂洗液。
在本发明中，按照上述配比将医用漂洗液的各组分混合后，所得混合料液的pH值为7.2～7.5，可以进一步根据需要采用HCl或NaOH调节混合料液的pH值。本发明对所述除菌没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可；本发明优选采用过滤除菌，具体是将医用漂洗液的各组分混合后过0.22μm滤膜，以实现除菌。除菌完成后，本发明优选在氦气保护条件下进行分装(以避免不稳定成分被氧化)，得到漂洗液。
本发明提供了上述技术方案所述医用漂洗液或上述技术方案所述制备方法制备得到的医用漂洗液在细胞或组织的培养、转移、储存或漂洗中的应用。本发明对所述细胞或组织的种类不作特殊限定，任意需要进行上述体外处理(培养、转移、储存或漂洗)的细胞或组织均可，具体的，所述细胞可以为脂肪细胞或干细胞，所述干细胞可以为脂肪干细胞，也可以为其它干细胞，本发明对此不作特殊限定；所述组织可以为脂肪组织。本发明提供的医用漂洗液可应用于皮肤科、整形外科、医学美容科的脂肪移植手术，具体可用于抽提脂肪细胞的体外处理，还可用于干细胞移植过程中干细胞的体外处理。
在本发明中，所述漂洗的方法，优选包括以下步骤：将医用漂洗液与待处理的细胞或组织混合后进行漂洗，之后去除所得体系中液体，完成细胞或组织的漂洗。在本发明中，所述漂洗的次数优选为2～3次，单次漂洗的过程中，医用漂洗液与待处理的细胞或组织的体积比优选为3～4:10。在本发明的实施例中，具体是将待处理的细胞或组织装入注射器中，用所述注射器吸取所述医用漂洗液，上下翻动3～5次后，静置5～15min除去下层液体，完成1次漂洗；按照前述操作再重复进行1～2次漂洗，得到纯化后的细胞或组织。采用本发明提供的方法对细胞或组织进行漂洗，整个漂洗过程结束后细胞或组织的丢失率<5％，且细胞成活率高。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例中，所用重组bFGF、KGF、HGF、VEGF和Leptin均购自R&D Systems公司，商品名称及商品号具体如下：
重组bFGF：商品名称为Recombinant Human FGF basic，商品号为233-FB-025；
重组KGF：商品名称为Recombinant Human KGF/FGF-7Protein，商品号为251-KG-050；
重组HGF：商品名称为Recombinant Human HGF Protein，商品号为294-HG-025；
重组VEGF：商品名称为Recombinant Human VEGF，商品号为293-VE-050
重组Leptin：商品名称为Recombinant Human LeptinProtein，商品号为398-LP-01M。
按以下浓度称取原料：NaCl为8g/L，KCl为0.4g/L，NaHCO3为0.35g/L，Na2HPO4为0.1g/L，KH2PO4为0.06g/L，葡萄糖为1g/L，维生素B为0.5mg/L，维生素C为0.5mg/L，维生素E为0.5mg/L，维生素K1为0.5mg/L，bFGF为0.01mg/L，KGF为0.01mg/L，HGF为0.05mg/L，VEGF为0.1mg/L，Leptin为0.01mg/L，余量为纯化水；
制备方法：将上述原料混合均匀，调节pH值至7.4，之后过滤除菌(过0.22μm滤膜)，并通入氦气保护进行分装，得到漂洗液。
应用例1
脂肪细胞的漂洗
实验组：采用注射器负压抽吸得到脂肪颗粒，将50mL脂肪颗粒装入注射器中，用所述注射器吸取15mL实施例1制备的漂洗液，上下翻动4次后，静置10min除去下层液体，完成1次漂洗；按照前述操作再重复进行2次漂洗，得到纯化后的脂肪颗粒。
对照组：按照上述方法操作，不同之处在于将实施例1制备的漂洗液替换为生理盐水。
取实验组和对照组纯化后的脂肪颗粒，用DMEM+10％FBS培养基稀释至细胞个数为5×104个/mL，按每孔100μL接种到96孔板中，预培养24h后，进行CCK-8检测，具体是每孔加入10μL的CCK-8溶液，孵育2h，测定450nm吸光值，并计算细胞增值率，结果如图1所示，图1中“生理盐水”对应对照组，“漂洗液”对应实验组。由图1可知，经过实施例1制备的漂洗液处理，脂肪细胞经相同条件培养后，细胞增殖率为对照组的135％(P<0.01)。
应用例2
脂肪干细胞的分离培养
实验组：用实施例1制备的漂洗液充分吸取脂肪组织块，用眼科剪剔除脂肪组织块上的***及小血管，之后按照应用例1的方法，利用所述漂洗液对脂肪组织块进行3次漂洗，将漂洗后的脂肪组织块置于无菌纱布上，干燥脂肪组织块(具体是在无菌环境下晾干脂肪组织块，至表面无明显漂洗液痕迹)；在干燥后的脂肪组织块上加入纯小牛血清，并快速将脂肪组织块剪成约1mm3的小组织块，分散植于25cm2培养瓶中，在37℃、二氧化碳培养箱中倒置培养。
对照组：按照上述方法操作，不同之处在于将实施例1制备的漂洗液替换为含1％双抗的生理盐水。
利用显微镜观察实验组和对照组培养3天后的细胞，结果如图2所示，图2中“生理盐水”对应对照组，“漂洗液”对应实验组。由图2可知，与对照组相比，采用本发明提供的漂洗液对脂肪组织漂洗后进行培养，原代细胞会更快贴壁并伸展。继续培养发现，利用含1％双抗的生理盐水漂洗后的原代细胞经15天铺满瓶底，利用本发明提供的漂洗液漂洗后的原代细胞在第10天即可铺满瓶底。这说明本发明提供的漂洗液能够促进脂肪干细胞的生长，维持脂肪干细胞活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种医用漂洗液，其特征在于，由葡萄糖、维生素、碱性成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、瘦素和缓冲液组成；
其中，所述葡萄糖的浓度为0.5～4g/L，维生素的浓度为0.002～0.02g/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.005～0.05mg/L，角质细胞生长因子的浓度为0.002～0.02mg/L，肝细胞生长因子的浓度为0.02～0.25mg/L，血管内皮生长因子的浓度为0.04～0.4mg/L，瘦素的浓度为0.002～0.02mg/L；
所述维生素由维生素B、微生素C、维生素K1和维生素E组成；
所述缓冲液的溶剂为水；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，组成上包括NaCl、KCl、NaHCO3、Na2HPO4、KH2PO4和水；
所述医用漂洗液的pH值为7.2～7.5。
2.根据权利要求1所述的医用漂洗液，其特征在于，所述医用漂洗液中葡萄糖的浓度为0.5～2g/L，维生素的浓度为0.002～0.01g/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.005～0.03mg/L，角质细胞生长因子的浓度为0.005～0.015mg/L，肝细胞生长因子的浓度为0.04～0.15mg/L，血管内皮生长因子的浓度为0.08～0.2mg/L，瘦素的浓度为0.005～0.015mg/L。
3.根据权利要求2所述的医用漂洗液，其特征在于，所述医用漂洗液中葡萄糖的浓度为1g/L，维生素的浓度为0.002g/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.01mg/L，角质细胞生长因子的浓度为0.01mg/L，肝细胞生长因子的浓度为0.05mg/L，血管内皮生长因子的浓度为0.1mg/L，瘦素的浓度为0.01mg/L。
4.根据权利要求1～3任一项所述的医用漂洗液，其特征在于，所述维生素B、微生素C、维生素K1和维生素E的质量比为1：1：1：1。
5.根据权利要求1所述的医用漂洗液，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.2～7.5。
6.权利要求1～5任一项所述医用漂洗液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将医用漂洗液的各组分混合后除菌，得到漂洗液。
7.权利要求1～5任一项所述医用漂洗液或权利要求6所述制备方法制备得到的医用漂洗液在细胞或组织的培养、转移、储存或漂洗中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细胞包括干细胞或脂肪细胞，所述组织包括脂肪组织。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述漂洗的方法，包括以下步骤：
将医用漂洗液与待处理的细胞或组织混合后进行漂洗，之后去除所得体系中液体，完成细胞或组织的漂洗。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述漂洗的次数为2～3次，单次漂洗的过程中，医用漂洗液与待处理的细胞或组织的体积比为3～4：10。
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