KR101950072B1 - 줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질을 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 이동 또는 분화 개선용 조성물, 이를 이용한 이동 및 분화 능력이 개선된 줄기세포 배양 방법에 관한 것으로, 성체 줄기세포인 지방유래 중간엽 줄기세포주에 CSF-2 단백질을 처리하였을 때 줄기세포성(stemness)을 증가시키고, 조골세포 분화 배지에 상기 단백질을 첨가하여 배양하였을 때 조골세포(osteoblast)로 분화(differentiation)하는 능력이 크게 향상된 것을 확인하였으며, EMT 마커(marker) 유전자들인 피브로넥틴 1(fibronectin, FN 1), 스네일(snail), 트위스트(twist) 및 비멘틴(vimentin)의 발현이 현저히 증가하여 세포 이동(migration) 능력이 크게 향상됨과 동시에, 줄기세포의 세포골격 단백질(cytoskeletal protein)이 방추형(spindle shape)으로 재배열(rearrangement)되는 것을 확인함으로써, 상기 CSF-2 단백질은 줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키기 위한 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키기 위한 방법 및 조성물{Methods and compositions for enhancing clinical therapeutic effect of stem cells medicine}

본 발명은 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질을 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 이동 또는 분화 개선용 조성물, 이를 이용한 줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키는 방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 생물을 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)가 되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 분화 자극(환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며, 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포 분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.

줄기세포는 크게, 발생중인 수정란에서 유래하는 배아 유래 줄기세포와 골수 및 제대혈과 같은 여러 성체조직에 존재하고 있는 성체 줄기세포로 나눌 수 있다. 배아 줄기세포는 높은 분화 능력 및 치료 효능을 보이는 반면 윤리적인 문제와 세포 자체의 발암성으로 인하여 현재 임상적용이 많이 제한되어 있는 실정이다. 비록 분화 능력은 배아 줄기세포에 비해 떨어지지만 윤리적인 문제가 없고 발암성이 낮은 성체 줄기세포가 현재 암, 당뇨병, 난치성 질환 및 신경퇴행성 질환 등의 세포 치료제로 크게 주목받고 있을 뿐만 아니라, 유전체학 및 생물정보학의 발달과 더불어 줄기세포를 이용한 재생 의학 분야에서 성체 줄기세포는 관련 신약 개발 및 독성 검사를 위한 플랫폼으로도 활발히 연구되고 있다. 따라서 성체 줄기세포로부터 특화된 기능을 가진 세포들로 분화하는데 관여하는 다양한 세포 내 신호전달 체계들을 조절하고, 임상 적용을 위한 안정적이고 성숙한 세포를 얻기 위해서는 정교하고 적절한 세포 배양 환경의 조절이 필수적이다.

성체 줄기세포를 활용한 질환의 치료에 있어, 그 효과가 매우 제한적인 경우가 종종 보고된다. 성체 줄기세포는 체내에서 약 0.01 내지 0.001% 비율로 매우 극미량 존재하기 때문에 치료 목적을 위해서는 체외에서 대량으로 배양하는 과정이 필수적으로 요구되는데, 성체 줄기세포를 이용한 치료제에 있어서 상이한 치료 효능은 바로 이러한 체외 배양 과정 중, 상처 부위로 이동할 수 있는 줄기세포의 이동능력(migration potential), 특정(표적) 세포로 분화할 수 있는 줄기세포의 분화능력(differentiation potential) 및 줄기세포성(stemness) 등과 같은 줄기세포 고유의 기능들이 저하되거나 상실되기 때문인 것으로 알려져 있다. 이러한 맥락에서 체외 배양 동안 줄기세포의 치료 효능의 저하를 억제하고, 더 나아가 치료능력을 더욱 향상시킬 수 있는 새로운 줄기세포 체외 배양법의 개발이 절실히 필요한 실정이다.

현재 줄기세포의 증식 및 분화를 조절하기 위해 전 세계 연구자들이 현재까지 성장인자, 호르몬, 사이토카인 등을 주입하는 다양한 화학적 방법을 개발하여 줄기세포 치료제의 분화 능력 및 치료 효능을 향상시키기 위한 연구를 진행하고 있으며, 관련하여 Paul W Burridge 등은 화학적 배양 조건의 조절을 통한 줄기세포의 분화기술에 관해 개시한 바 있으나(Nature methods, 2014), 이러한 화학적인 방법은 줄기세포 수득 효율에 한계가 있고, 고비용의 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은, 기존의 줄기세포 체외 배양법의 문제점을 개선하고자 노력하던 중, 성장인자(growth factor) 단백질인 CSF-2(colony stimulating factor-2)를 첨가한 배지에 줄기세포를 체외 배양하였을 때 줄기세포 치료제로서의 치료 효능에 매우 중요한 역할을 하는 줄기세포의 이동(migration) 및 분화 (differentiation) 능력을 크게 향상시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질을 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 이동(migration) 및 분화(differentiation) 개선용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질을 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 이동(migration) 또는 분화(differentiation) 개선용 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 생체 외에서 인간 줄기세포를 배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 배양된 세포를 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질을 첨가한 배지에 배양하여 분화를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이동 또는 분화 능력이 증가된 줄기세포 배양방법을 제공한다.

본 발명은 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질을 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 이동 또는 분화 개선용 조성물, 이를 이용한 이동 및 분화 능력이 개선된 줄기세포 배양 방법에 관한 것으로, 성체 줄기세포인 지방유래 중간엽 줄기세포주에 CSF-2 단백질을 처리하였을 때 줄기세포성(stemness)을 증가시키고, 조골세포 분화 배지에 상기 단백질을 첨가하여 배양하였을 때 조골세포(osteoblast)로 분화(differentiation)하는 능력이 크게 향상된 것을 확인하였으며, EMT 마커(marker) 유전자들인 피브로넥틴 1(fibronectin, FN 1), 스네일(snail), 트위스트(twist) 및 비멘틴(vimentin)의 발현이 현저히 증가하여 세포 이동(migration) 능력이 크게 향상됨과 동시에, 줄기세포의 세포골격 단백질(cytoskeletal protein)이 방추형(spindle shape)으로 재배열(rearrangement)되는 것을 확인함으로써, 상기 CSF-2 단백질은 줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키기 위한 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 섬유아세포 (Fibroblast) 및 미분화된 지방 조직 유래의 중간엽 줄기세포주 (Mesenchymal stem cell lines)에서 CSF-2 (colony stimulating factor-2) 유전자의 발현 양상을 Real-time PCR을 이용하여 비교 분석한 도이다.
도 2는 지방유래 중간엽 줄기세포주에 CSF-2 단백질을 처리한 후, MTT 어세이(assay)를 실시한 결과를 나타낸 도이다(재조합(recombinant)CSF-2; 이하 CSF 2).
도 3은 지방유래 중간엽 줄기세포주에 CSF-2 단백질을 처리한 후, 줄기세포성(stemness)과 밀접한 연관이 있는 마커 유전자인 SOX2 및 NANOG의 발현 양상을Real-time PCR을 이용하여 비교 분석한 도이다:
A: SOX2의 발현 양상; 및
B: NANOG의 발현 양상.
도 4는 지방유래 중간엽 줄기세포주에 CSF-2 단백질을 처리한 후, 조골세포(osteoblast)로 분화 유도 결과를 나타낸 도이다:
A: 조골세포(osteoblast)로 분화 유도한 후, 알리자린 레드(alizarin red)로 염색(staining)한 사진; 및
B: 흡광도(570nm)를 통해 분화의 정도를 측정하여 나타낸 도표.
도 5는 지방유래 중간엽 줄기세포주에 CSF-2 단백질을 처리한 후, 트랜스웰 어세이(transwell assay) 및 MMP-2/MMP-9 발현 양상 측정(웨스턴 블로팅(western blotting))을 수행하여 결과를 나타낸 도이다:
A: 트랜스웰 어세이(transwell assay) 결과; 및
B: MMP-2/MMP-9 발현 양상의 웨스턴 블로팅(western blotting) 결과.
도 6은 지방유래 중간엽 줄기세포주에 CSF-2 단백질을 처리한 후, 팔로이딘(phalloidin)의 면역형광 염색실험을 수행한 결과를 나타낸 도이다(DAPI: 핵염색, Merge: 사진결합).
도 7은 지방유래 중간엽 줄기세포주에 CSF-2 단백질을 처리한 후, 줄기세포의 EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition) 관련 마커(marker)유전자들의 발현 양상을 Real-time PCR을 이용하여 비교 분석한 도이다:
A: 피브로넥틴 1(fibronectin, FN 1)의 발현 양상;
B: 스네일(snail)의 발현 양상;
C: 트위스트(twist)의 발현 양상; 및
D: 비멘틴(vimentin)의 발현 양상.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질을 유효성분으로 함유하는 줄기세포의 이동 및 분화 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질은 과립구(granulocytes)와 대식세포(macrophages)의 생산과 분화 및 기능에 관여하는 사이토카인(cytokine)으로 알려져 있다.

줄기세포를 이용한 치료제의 치료 효능은 크게 줄기세포의 두 가지 능력에 의해 결정되는 것으로 알려져 있는데, 하나는 손상된 부위로 이동할 수 있는 이동 능력(migration potential)과 다른 하나는 표적 세포로 분화할 수 있는 분화 능력(differential potential)이다.

상기 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질은 성장인자(growth factor) 단백질로써, 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 서열번호 2로 기재되는 염기서열에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 염기서열의 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함되며, 구체적으로, 상기 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 구성된 유전자는 재조합 발현 벡터 내로 삽입된 것일 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 벡터가 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다. 즉, 상기 발현 벡터는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물일 수 있다.

또한, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

상기 RNA 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 에피솜 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스바이러스, 센다이 바이러스 등에서 유래한 벡터를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 pCDH, pECFP, 또는 pLKO 등의 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다.

상기 조성물은 SOX2 또는 NANOG 유전자의 발현을 증가시켜 줄기세포의 줄기세포성(stemness)을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

상기 조성물은 MMP-2(Matrix metallopeptidase-2) 또는 MMP-9(Matrix metallopeptidase-9) 유전자의 발현을 증가시키고, EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition) 마커인 피브로넥틴 1(fibronectin 1), 스네일(snail), 트위스트(twist) 또는 비멘틴(vimentin) 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ESC), 성체 줄기세포(adult stem cell), 또는 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 구체적인 실험예에서, 이미 분화가 진행된 섬유아세포보다 미분화된 중간엽 줄기세포에서 CSF-2 단백질이 현저하게 많이 발현되는 것을 확인하여 CSF-2 단백질이 줄기세포 특이발현 마커일 수 있다는 것을 확인한 후(도 1 참조), 성체 줄기세포인 지방유래 중간엽 줄기세포주에 CSF-2 단백질을 처리하였을 때, CSF-2 단백질이 중간엽 줄기세포주의 증식(growth)에는 별다른 영향을 미치지 않음을 확인하였고(도 2 참조), CSF-2 단백질을 처리하였을 때 지방유래 중간엽 줄기세포주 줄기세포성(stemness)과 밀접한 연관이 있는 마커 유전자인 SOX2 및 NANOG의 발현이 뚜렷하게 증가되는 것을 확인하였으며(도 3 참조), CSF-2 단백질에 의해 지방유래 중간엽 줄기세포주가 조골세포(osteoblast)로 분화(differentiation)하는 능력이 크게 향상된 것을 확인하였다(도 4 참조).

또한, CSF-2 단백질에 의해 지방유래 중간엽 줄기세포주가 트랜스웰(transwell)을 통과하는 이동(migration) 능력이 크게 향상됨과 동시에, 줄기세포의 이동 능력 조절에 중요한 인자로 잘 알려져 있는 MMP-2 및 MMP-9(Matrix metallopeptidase-2/9)의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였고(도 5 참조), CSF-2 단백질을 지방유래 중간엽 줄기세포주에 처리하였을 때, 줄기세포의 세포골격 단백질(cytoskeletal protein)이 이동성(mobility)이 더욱 증가된 형태인 방추형(spindle shape)으로 재배열(rearrangement)되는 것을 확인하였으며(도 6 참조), 세포 이동에 관여하는 것으로 잘 알려져 있는 EMT 마커(marker) 유전자들인 피브로넥틴 1(fibronectin, FN 1), 스네일(snail), 트위스트(twist) 및 비멘틴(vimentin)의 발현이 현저히 증가하는 것을 최종 확인하였다(도 7 참조).

따라서, 본 발명의 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질은 줄기세포의 이동 및 분화를 증가시키므로, 상기 CSF-2 단백질을 체외에서 치료용 성체 줄기세포를 대량 배양하였을 때 분화(differentiation) 및 이동(migration) 능력과 같은 줄기세포 고유의 성질을 개선시킬 수 있어, 줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키기 위한 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명은

1) 생체 외에서 인간 줄기세포를 배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 배양된 세포를 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질을 첨가한 배지에 배양하여 분화를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이동 및 분화 능력이 증가된 줄기세포 배양방법을 제공한다.

상기 단계 1)의 줄기세포는 배아 줄기세포(embryonic stem cell; ESC), 성체 줄기세포(adult stem cell), 또는 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며 가장 바람직하게는 성체 줄기세포이나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly), 신경, 상피 또는 피부 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있으며, 지방조직 또는 골수 유래인 것이 보다 바람직하며, 지방조직 유래의 중간엽 줄기세포인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지는 않는다.

또한, 본 발명의 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질의 처리 농도는 10 내지 500 ng/ml인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 단백질의 농도가 10 ng/ml 미만일 경우 줄기세포의 이동 또는 분화 효율이 저하되는 문제점이 있고, 500 ng/ml 이상이면 줄기세포에 독성이 생길 수 있는 문제점이 있다. 이러한 측면에서 본 발명인 줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시키기 위한 방법 및 조성물에서의 CSF-2 단백질 농도는 50 내지 300 ng/ml인 것이 바람직할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 200 ng/ml 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질의 처리는 48 내지 72시간 동안인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 줄기세포(stem cell)의 배양액에 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질을 첨가하여 줄기세포 치료제의 치료효과를 향상시킨 조성물을 제공하며, 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 지방유래 중간엽 줄기세포주의 준비

실험에 우선하여, 지방유래 중간엽 줄기세포주(mesenchymal stem cell lines: MSCs)를 다음과 같이 준비하였다.

채취된 지방조직을 준비된 완충용액 D-PBS에 세척한 뒤, 세척된 지방조직에서 분홍색으로 보이는 부분인 fibrus material과 적색 혈관(red blood vessel)을 멸균된 핀셋과 수술용가위로 제거한 후, 정리된 지방조직에 미리 준비한 10㎖ 콜라게네이즈(collagenase) 효소 절단 용액을 첨가하여 수술용 가위로 1㎜³이하의 크기로 잘게 절단하고, 절단된 지방조직을 멸균한 500㎖ 삼각플라스크로 옮긴 후 콜라게네이즈(collagenase) 효소 절단 용액을 약 30㎖ - 40㎖ 정도 첨가하였다. 다음으로 삼각플라스크의 입구를 호일로 봉하고 37℃, 100rpm으로 고정된 항온수조에서 하루 동안 효소 반응시킨 후, 지방조직을 50㎖ 원심분리용 튜브(tube)에 다시 옮겨 담고 2500rpm, 10분에서 원심분리 하여 상층(supernatant)의 세포외기질 및 노란색의 기름층을 진공펌프를 이용하여 제거하였다. 다음으로, 하층에 침전된 층(stromal vascular cell fraction, SVF)에 배양 배지 DMEM을 넣어 부유시키고, 새 원심분리용 튜브(tube)에 100μm 세포 스트레이너(cell strainer)를 얹어 부유된 SVF를 천천히 통과시켰다. 여과된 SVF를 같은 방법으로 40μm 세포 스트레이너(cell strainer)에 통과시켰으며, 다시 여과된 SVF에 배양배지 DMEM을 첨가하고 collagen I cell ware 100㎜ 배양 접시로 옮긴 후 이산화탄소 배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 세포가 부착할 때까지 배양하였고, 세포들이 부착된 것이 확인되면 계대 배양하여 실험에 사용하였다.

< 실험예 1> 줄기세포 특이적으로 발현되는 CSF -2 단백질

우선, 본 발명자들은 같은 중배엽 유래 세포로서 이미 분화가 진행된 섬유아세포(fibroblast)와 두 개의 미분화된 지방 조직 유래의 중간엽 줄기세포주(mesenchymal stem cell lines: MSCs)에서 Real-time PCR을 이용하여 CSF-2 (colony stimulating factor-2) 유전자의 발현 양상을 비교하고자 다음과 같이 실험을 수행하였다.

상기의 섬유아세포(fibroblast)와 지방유래 중간엽 줄기세포주(mesenchymal stem cell lines: MSCs)를 각각 60mm 플레이트(plate)에 세포 수가 약 2 x 10⁵ 이 되도록 분주(seeding)하여 48시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 10ml D-PBS를 넣어 세포를 세척한 후, 500μl Tizol(6 웰 플레이트(well plate)기준)을 넣고 15분간 반응시켰다. 피펫팅(pipetting)으로 다시 세포를 모아서 튜브(tube)에 옮기고 200μl 클로로포름(chloroform)을 넣어 4℃, 13000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 이후 투명한 상층액(supernatant)만을 따로 분리하여 새 튜브(tube)에 옮기고 500μl 이소프로판올(isopropanol)을 넣어 15분간 반응시킨 후 다시 4℃, 13000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 다음으로 상층액은 버린 후 가라앉은 펠렛만을 분리하여 75% 에탄올(ethanol)로 세척한 후, 다시 4℃, 13000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 다음으로 에탄올(ethanol)을 제거하고 완전히 말린 후, 멸균수에 펠렛을 녹여 Nano-drop으로 RNA를 정량한 후, 희석한 RNA에 Random 6mers, dNTP 혼합물(mixture), Rnase 저해제 및 Primescript RTase가 첨가된 버퍼(Buffer)를 섞어서 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 1/10로 희석한 후 표 1에 기재된 CSF-2 Primer와 SYBER Green mixture를 섞어서 RT-qPCR을 수행하였다.

이름	서열번호	서열
CSF-2 아미노산 서열	서열번호 1	MAPARSPSPS TQPWEHVNAI QEARRLLNLS RDTAAEMNET VEVISEMFDL QEPTCLQTRL ELYKQGLRGS LTKLKGPLTM MASHYKQHCP PTPETSCATQ IITFESFKEN LKDFLLVIPF DCWEPVQE
CSF-2 염기 서열	서열번호 2	5‘atggcgccggcgcgcagcccgagcccgagcacccagccgtgggaacatgtgaacgcgattcaggaagcgcgccgcctgctgaacctgagccgcgataccgcggcggaaatgaacgaaaccgtggaagtgattagcgaaatgtttgatctgcaggaaccgacctgcctgcagacccgcctggaactgtataaacagggcctgcgcggcagcctgaccaaactgaaaggcccgctgaccatgatggcgagccattataaacagcattgcccgccgaccccggaaaccagctgcgcgacccagattattacctttgaaagctttaaagaaaacctgaaagattttctgctggtgattccgtttgattgctgggaaccggtgcaggaa-3’
CSF-2 정방향 프라이머	서열번호 3	5'-ATGATGGCCAGCCACTACAA-3'
CSF-2 역방향 프라이머	서열번호 4	5'-AGCAGTCAAAGGGGATGACA-3'

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 이미 분화가 진행된 섬유아세포보다 미분화된 중간엽 줄기세포에서 CSF-2 단백질이 100배 이상 더 많이 발현되는 것을 확인하였다(도 1). 이는 CSF-2 단백질이 줄기세포 특이발현 마커일 수 있다는 것을 의미한다.

< 실험예 2> CSF -2 단백질 처리를 통한 줄기세포 증식(growth)에의 효과 확인

다음으로 본 발명자들은 CSF-2 단백질이 줄기세포의 증식(growth)에 미치는 영향을 확인해보기 위하여 상기의 지방유래 중간엽 줄기세포주에 재조합(recombinant)된 CSF-2(rCSF2) 단백질을 처리한 후 세포 생존도를 측정하는 실험방법인 MTT 어세이(assay)를 다음과 같이 수행하였다.

우선, 지방유래 중간엽 줄기세포주를 96 웰 플레이트(well plate)에 세포 수가 약 2 x 10³ 이 되도록 분주(seeding)하여 기본 배양 배지(medium)에 1% FBS(Fetal bovine serum)를 처리하고 200ng/ml 재조합 CSF-2 단백질에서 72시간 동안 배양하였다. 이때 배지를 매일 갈아주면서 재조합 CSF-2 단백질이 일정농도가 되도록 하여 처리하였다. 다음으로 MTT 솔루션(solution: (MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide agent)을 배양 배지(medium)의 1/20 볼륨이 되도록 넣어준 후 4시간 동안 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 다시 배양배지를 제거한 후, 200μl DMSO를 넣어주고, 빛을 차단한 상태에서 상온에서 3 내지 5분간 반응시켰다. 다음으로 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 MTT가 미토콘드리아에 의해 formazan으로 환원되는 정도를 흡광도 570 nm로 측정하였으며, 정상세포(control cells)의 흡광도 대비 재조합 CSF-2 단백질이 처리된 중간엽 줄기세포주의 흡광도 퍼센트(%)로 세포의 생존성 및 세포 증식(growth)에의 영향을 평가하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, CSF-2 단백질은 중간엽 줄기세포주의 증식(growth)에는 별다른 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 2).

< 실험예 3> CSF -2 단백질 처리를 통한 줄기세포의 줄기세포성( stemness ) 향상 효과 확인

본 발명자들은 CSF-2 단백질이 줄기세포의 줄기세포성(stemness: 분화성 유지능력)에 미치는 영향을 확인해보기 위해, CSF-2 단백질을 처리한 후 줄기세포성(stemness)과 밀접한 연관이 있는 마커 유전자인 SOX2 및 NANOG의 발현 양상을 real-time PCR을 이용하여 측정하고자 하였다.

우선 지방유래 중간엽 줄기세포주의 기본 배양 배지(medium)에 1% FBS (Fetal bovine serum)를 처리하고 200ng/ml CSF-2 단백질을 매일 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 배지를 제거하고 1ml trizol을 첨가하여 상온에서 5분간 교반(shaking)하였으며 피펫팅(pipetting)으로 trizol이 첨가된 1.5ml 세포액을 튜브(tube)에 넣어주었다. 다음으로 200μl 클로로포름(chloroform)을 첨가하고 잘 섞어주어 상온에서 5분간 반응시킨 후, 12000rpm 15분간 4℃에서 원심분리하였다. 다음으로 상층액(supernatant)을 새 튜브(tube)로 옮기고 500μl isopropanol을 첨가하여 튜브(tube)를 위 아래로 뒤집어 가면서 섞어주었다. 그리고 상온에서 15분간 그대로 두었다. 이후 12000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액(supernatant)을 버리고 1ml 에탄올(etanol)(75%)을 첨가한 후 잘 섞어준 뒤, 다시 12000rpm, 4℃에서 12분간 원심분리하였다. 다음으로 상층액(supernatant)을 버리고 에탄올(etanol)이 남지 않도록 튜브(tube)를 뒤집어 놓고 건조시킨 후 멸균수로 RNA를 녹인 다음, RNA 농도를 nanodrop을 이용하여 정량하였다. 그 후 정량한 RNA를 2μg/8μl로 하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 하기 표 2에 기재된 SOX2 및 NANOG primer를 이용하여 RT-qPCR을 진행하여 각각의 유전자 발현 양상을 비교하였다.

이름	서열번호	서열
SOX2 정방향 프라이머	서열번호 5	5'-AAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGGAG-3'
SOX2 정방향 프라이머	서열번호 6	5'-CAGCTGTCATTTGCTGTGGGTGATG-3'
NANOG 정방향 프라이머	서열번호 7	5'-ACACCATTGCTATTCTTCGGCCAGTTG-3'
NANOG 정방향 프라이머	서열번호 8	5'-CAGCTGTGTGTACTCAATGATAGATTT-3'

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, CSF-2 단백질을 처리하였을 때, 줄기세포성(stemness)과 밀접한 연관이 있는 마커 유전자인 SOX2(도 3의 A) 및 NANOG(도 3의 B)의 발현이 뚜렷하게 증가되는 것을 확인하였다.

< 실험예 4> CSF -2 단백질의 처리를 통한 줄기세포의 분화(differentiation) 능력 증가 확인

본 발명자들은 CSF-2 단백질을 줄기세포에 처리하였을 때, 줄기세포의 분화(differentiation) 능력에 미치는 영향을 확인하기 위하여 지방유래 중간엽 줄기세포주에 CSF-2 단백질을 처리한 후, 조골세포(osteoblast)로 분화 유도하였다.

우선 6 웰 플레이트(well plate)에 지방유래 중간엽 줄기세포주를 배양하다가, 세포 수가 약 70%의 용적(confluency)에 이르면 분화유도용 배지 (DMEM High Glucose with 10mM β-glycerophosphate, 50μM ascorbic acid, 100μM dexamethasone)에 1% FBS를 처리하고 3일에 한번 씩 배지를 갈아주면서 2주 정도 배양하였다. 이때, 200ng/ml CSF-2 단백질을 배지를 교체할 때마다 함께 처리하였다. 다음으로 분화유도된 세포가 자라고 있는 6 웰 플레이트(well plate)에서 배지를 제거하고 2ml 멸균수를 넣고 두 번씩 세척하였다. 다음으로 세포를 고정하기 위해서 1ml 에탄올(etanol)(70%)을 넣어주고 4℃에서 30분 내지 1 시간 정도 건조시킨 후, 고정이 끝난 세포에 1㎖ D-PBS을 첨가하여 세척하고, 세포를 1㎖ 알리자린 레드(alizarin red) 용액을 사용하여 10분 내지 한 시간 정도 염색(staining)하였다. 그 후, 멸균수 또는 D-PBS를 이용하여 세포를 다섯 번 정도 세척한 후, 세척이 끝난 세포에 2㎖ 멸균수를 넣고 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 분화 정도를 육안으로 확인하였다. 그리고 570nm에서 흡광도를 측정하여 분화의 정도를 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, CSF-2 단백질을 처리하였을 때 지방유래 중간엽 줄기세포주가 조골세포(osteoblast)로 분화(differentiation)하는 능력이 크게 향상된 것을 알리자린 레드(alizarin red) 염색(staining)사진을 통하여 확인하였고(도 4의 A), 흡광도를 통해 분화의 정도를 측정하여 그래프화 시킨 도표를 통해서도 지방유래 중간엽 줄기세포주에 CSF-2 단백질을 처리하였을 때, 분화(differentiation)하는 능력이 크게 향상된 것을 확인하였다(도 4의 B).

< 실험예 5> CSF -2 단백질의 처리를 통한 줄기세포 이동(migration) 능력 증가 확인

<5-1> 트랜스웰 어세이 ( transwell assay) 실험

본 발명자들은 CSF-2 단백질이 줄기세포의 이동(migration) 능력에 미치는 영향을 측정하기 위해 CSF-2 단백질을 처리한 후, 트랜스웰 어세이(transwell assay)실험을 수행하였다.

우선, 지방유래 중간엽 줄기세포주에 200ng/ml CSF-2 단백질을 매일 처리하면서 48시간 동안 배양하였다. 실험을 수행하기에 앞서 1㎖ trypsin-EDTA를 첨가하여 고루 퍼지도록 손으로 가볍게 흔들어 주고 이산화탄소 배양기에서 5분간 반응시킨 후, 배양 접시에 FBS가 첨가된 배양 배지를 2㎖ 첨가하여 Trypsin-EDTA의 작용을 중화시킨다. 배양 접시를 손으로 살살 쳐주면서 부착되어 있던 세포가 떨어지는 것을 확인하고 50㎖ 원심분리용 튜브(tube)에 옮겨 2000rpm에서 3분간 원심분리 한 후, 상층액(supernatant)을 제거하고 1㎖ 배양 배지를 첨가하여 피펫팅(pipeting)하였다. 다음으로, 12 웰 플레이트(well plate)에 1ml serum free 배지와 200ng/ml CSF-2 단백질을 함께 처리하고 인설트 웰(insert well)을 넣어준다. 상기 준비한 세포를 인설트 웰(insert well)에 150μl씩 넣어주고, 세포가 뭉치지 않도록 살살 흔들어 준 후, 24시간 동안 배양하였다. 다음으로, 인설트 웰(insert well)에 있는 배지를 버리고 새로 분주한 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA; 4%)로 15분간 고정하였다. 그리고 인설트 웰(insert well)과 플레이트(plate)에 있는 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA; 4%)를 버리고, 1ml DPBS로 두 번씩 세척한 후, 플레이트(plate)에 헤마톡실린(Hematosillin)을 웰(well)당 700μl씩 넣고 인설트 웰(insert well)을 반응시켰다. 이때, 빛을 차단한 상태에서 상온에서 30분간 반응시켰다. 이후, 면봉으로 인설트 웰(insert well) 안쪽을 조심스럽게 닦아낸 후, 염색된 세포의 수를 정량하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, CSF-2 단백질에 의해 지방유래 중간엽 줄기세포주가 트랜스웰(transwell)을 통과하는 이동(migration) 능력이 크게 향상되었음을 확인하였다(도 5의 A 좌, 우).

<5-2> MMP -2 및 MMP -9(Matrix metallopeptidase -2/9) 발현 확인

또한, 본 발명자들은 줄기세포의 이동(migration) 능력에 CSF-2 단백질이 미치는 영향을 더욱 구체적으로 알아보기 위해, CSF-2 단백질을 처리한 후, 줄기세포의 이동 능력 조절에 중요한 인자로 알려진 MMP-2 및 MMP-9 (Matrix metallopeptidase-2/9)의 발현 양상을 웨스턴 블로팅(western blotting) 실험을 수행하여 확인하였다.

우선, 지방유래 중간엽 줄기세포주의 기본 배지에 1% FBS(Fetal bovine serum)를 처리하고 200ng/ml CSF-2 단백질을 처리하여 72시간 동안 배양하였다. CSF-2 단백질은 매일 배지를 갈아주면서 처리하였다. 세포가 배양된 접시(dish)에 pro-prep protein extraction 용액을 넣고 세포를 스크래퍼(scraper)를 사용하여 모아서 1.5ml 튜브(tube)로 모아둔 뒤, 12000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 펠렛은 버리고 상층액(supernatant)만을 새 튜브(tube)로 옮긴 후, BCA 용액을 이용하여 단백질을 정량하였다. 다음으로 10μg의 단백질에 증류수(DW)와 5X 염료(dye)를 섞어주고 99℃에서 5분간 끓인 후, SDS-PAGE 젤(gel)에 Protein marker 및 시료를 로딩(loading)한 후 20 - 40mA 전류를 걸어 50-90 분간 전기영동을 수행하여 단백질을 크기별로 분리시켰다. 그 다음, 젤(gel) 상에 존재하는 단백질을 100V에서 180분간 니트로셀룰로오즈 막(nitrocellulose membrane)으로 옮겨준 후(transfer), 5% 스킴 밀크(skim milk)를 이용하여 블로킹(blocking)처리 한 후, MMP-2 및 MMP-9 (Matrix metallopeptidase-2/9)에 대한 1차 항체(primary antibody)가 포함된 T-PBS에 멤브레인(membrane)을 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 다음날 T-PBS로 10분씩 3번 멤브레인(membrane)을 세척한 후 2차 항체(secondary antibody)가 포함된 T-PBS에 멤브레인(membrane)을 반응시켰고, 2시간 후 T-PBS로 10분씩 3번 세척하여 ECL 용액을 멤브레인(membrane)에 처리하여 단백질의 발현을 필름으로 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, CSF-2 단백질을 지방유래 중간엽 줄기세포주에 처리하였을 때, 줄기세포의 이동 능력 조절에 중요한 인자로 잘 알려져 있는 MMP-2 및 MMP-9(Matrix metallopeptidase-2/9)의 발현이 현저히 증가하는 것을 통해, 줄기세포의 이동(migration) 능력이 크게 향상되었음을 확인하였다(도 5의 B 좌, 우).

<5-3> 세포골격(cytoskeleton)의 재배열(rearrangement) 유도 확인

줄기세포의 이동(migration)이 이루어질 때는 액틴 필라멘트(actin-filament)등과 같은 세포골격 단백질(cytoskeletal protein)들의 재배열(rearrangement)이 매우 중요하다. 본 발명자들은 F-액틴(actin)에 특이적으로 반응하는 형광물질이 결합된 팔로이딘(phalloidin)의 면역형광 염색실험을 통해 CSF-2 단백질이 세포골격 단백질(cytoskeletal protein)의 재배열(rearrangement)에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

우선 지방유래 중간엽 줄기세포주의 기본배지에 1% FBS (fetal bovine serum)를 처리하고 200ng/ml CSF-2 단백질을 매일 처리하면서 72시간 동안 배양하였다. 세포가 배양된 접시(dish)의 배지를 제거하고 PBS로 세척한 뒤 세포 고정용액(fixation solution)인 2㎖ 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA; 4%)를 넣고 상온에 30분 동안 반응시킨 후, PBS로 5분씩 3번 세척하였다. 다음으로 팔로이딘(phalloidin) 항체(antibody)를 빛을 차단한 상태에서 1:1000 농도로 처리하여 2시간 동안 반응시킨 후, 상온에서 PBS로 5분씩 3번 세척하였다. 또한 핵의 염색을 위해 DAPI를 1:30,000 농도로 1분간 처리하였고, 상온에서 PBS로 5분씩 3번 세척 후 슬라이드를 봉입(mounting)처리하여 형광형미경을 이용하여 팔로이딘(phalloidin)의 발현 양상을 관찰하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, CSF-2 단백질을 지방유래 중간엽 줄기세포주에 처리하였을 때, 줄기세포의 세포골격 단백질(cytoskeletal protein)이 이동성(mobility)이 더욱 증가된 형태인 방추형(spindle shape)으로 재배열(rearrangement)되는 것을 확인하였다(도 6).

<5-4> 상피간엽이행 (Epithelial- Mesenchymal Transition; EMT ) 연관 유전자 발현 증가 확인

아울러, 줄기세포의 이동(migration)은 피브로넥틴 1(fibronectin, FN 1), 스네일(snail), 트위스트(twist) 및 비멘틴(vimentin) 등과 같은 Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) 마커(marker)들에 의해 조절된다는 사실 또한 이미 잘 알려져 있다. 이에, 본 발명자들은 CSF-2 단백질이 줄기세포의 EMT 마커(marker)들의 발현에 미치는 영향을 확인하고자 다음과 같이 실험을 수행하였다.

우선, 지방유래 중간엽 줄기세포주의 기본배지에 1% FBS (fetal bovine serum)를 처리하고 200ng/ml CSF-2 단백질을 매일 처리하면서 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 배지를 제거하고 1ml trizol을 첨가하여 상온에 5분간 교반한 뒤, 피펫팅(pipetting)으로 다시 세포를 모아서 1.5ml 튜브(tube)에 넣어주고, 200μl 클로로포름(chloroform)을 넣어 잘 섞어준 후 상온에서 5분간 반응시켜 12000rpm 15분간 4℃에서 원심분리하였다. 다음으로 상층액(supernatant)을 새 튜브(tube)로 옮기고 500μl 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 튜브(tube)를 위아래로 뒤집어 가면서 섞어준 후, 상온에서 15분간 반응시킨다. 다음으로 12000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리한 후 상층액(supernatant)을 버리고 1ml의 75% 에탄올(ethanol)을 첨가한 후 잘 섞어준 다음 12000rpm, 4℃에서 12분간 원심분리 하였다. 그리고 상층액(supernatant)을 버리고 에탄올(etanol)이 남지 않도록 튜브를 뒤집어 놓고 건조시킨 후, 멸균수로 RNA를 녹여 RNA 농도를 nanodrop을 이용하여 정량하였다. 정량한 RNA를 2μg/8μl로 하여 cDNA를 합성하였고, 합성된 cDNA를 이용하여 하기 표 3에 기재된 피브로넥틴 1(fibronectin, FN 1), 스네일(snail), 트위스트(twist) 및 비멘틴(vimentin) 프라이머(primer)를 사용하여 RT-qPCR을 진행한 뒤, 각각 유전자의 발현 양상을 비교하였다.

이름	서열번호	서열
FN 1 정방향 프라이머	서열번호 9	5'-GAGAATGGACCTGCAAGCCCA-3'
FN 1 역방향 프라이머	서열번호 10	5'-GGTGCAAGTGATGCGTCCGC -3'
snail 정방향 프라이머	서열번호 11	5'-CCTCCCTGTCAGATGAGGAC-3'
snail 역방향 프라이머	서열번호 12	5'-CCAGGCTGAGGTATTCCTTG-3'
twist 정방향 프라이머	서열번호 13	5'-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3'
twist 역방향 프라이머	서열번호 14	5'-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3'
vimentin 정방향 프라이머	서열번호 15	5'-ACCCGCACCAACGAGAAGGT-3'
vimentin 역방향 프라이머	서열번호 16	5'-ATTCTGCTGCTCCAGGAAGCG-3'

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, CSF-2 단백질을 지방유래 중간엽 줄기세포주에 처리하였을 때, 세포 이동에 관여하는 것으로 알려져 있는 EMT 마커(marker) 유전자들인 피브로넥틴 1(fibronectin, FN 1), 스네일(snail), 트위스트(twist) 및 비멘틴(vimentin)의 발현이 현저히 증가한 것을 최종 확인하였다(도 7의 A, B, C 및 D).

<110> Gachon University of Industry-Academic cooperation Foundation Gil Medical Center Gwangju Institute of Science and Technology Jung Won University of Industry-Academic cooperation Foundation <120> Methods and compositions for enhancing clinical therapeutic effect of stem cells medicine <130> 2016P-08-012 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF-2 <400> 1 Met Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His 1 5 10 15 Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp 20 25 30 Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe 35 40 45 Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 50 55 60 Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 65 70 75 80 Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 85 90 95 Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 100 105 110 Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 115 120 125 <210> 2 <211> 388 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF-2 <400> 2 Ala Ala Ala Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Gly Gly Cys Gly Cys Gly 1 5 10 15 Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys 20 25 30 Ala Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly Thr Gly Gly Gly Ala Ala Cys 35 40 45 Ala Thr Gly Thr Gly Ala Ala Cys Gly Cys Gly Ala Thr Thr Cys Ala 50 55 60 Gly Gly Ala Ala Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr Gly 65 70 75 80 Cys Thr Gly Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys Gly Cys Gly 85 90 95 Ala Thr Ala Cys Cys Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Ala Ala Thr 100 105 110 Gly Ala Ala Cys Gly Ala Ala Ala Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala 115 120 125 Gly Thr Gly Ala Thr Thr Ala Gly Cys Gly Ala Ala Ala Thr Gly Thr 130 135 140 Thr Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Ala Cys Cys 145 150 155 160 Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Cys Cys 165 170 175 Cys Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Thr Ala Thr Ala 180 185 190 Ala Ala Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Cys Gly Cys Gly Gly 195 200 205 Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly 210 215 220 Ala Ala Ala Gly Gly Cys Cys Cys Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala 225 230 235 240 Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Gly Ala Gly Cys Cys Ala Thr Thr Ala 245 250 255 Thr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala Thr Thr Gly Cys Cys Cys Gly 260 265 270 Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala 275 280 285 Gly Cys Thr Gly Cys Gly Cys Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Thr 290 295 300 Thr Ala Thr Thr Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Ala Ala Ala Gly Cys 305 310 315 320 Thr Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Ala 325 330 335 Ala Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr 340 345 350 Gly Ala Thr Thr Cys Cys Gly Thr Thr Thr Gly Ala Thr Thr Gly Cys 355 360 365 Thr Gly Gly Gly Ala Ala Cys Cys Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly 370 375 380 Ala Ala Ala Ala 385 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF-2 primer F <400> 3 atgatggcca gccactacaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF-2 primer R <400> 4 agcagtcaaa ggggatgaca 20 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 primer F <400> 5 aaatgggagg ggtgcaaaag aggag 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 primer R <400> 6 cagctgtcat ttgctgtggg tgatg 25 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG primer F <400> 7 acaccattgc tattcttcgg ccagttg 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG primer R <400> 8 cagctgtgtg tactcaatga tagattt 27 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FN 1 primer F <400> 9 gagaatggac ctgcaagccc a 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FN 1 primer R <400> 10 ggtgcaagtg atgcgtccgc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> snail primer F <400> 11 cctccctgtc agatgaggac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> snail primer R <400> 12 ccaggctgag gtattccttg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> twist primer F <400> 13 ggagtccgca gtcttacgag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> twist primer R <400> 14 tctggaggac ctggtagagg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vimentin primer F <400> 15 acccgcacca acgagaaggt 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vimentin primer R <400> 16 attctgctgc tccaggaagc g 21

Claims (11)

1. CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 지방 유래 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)의 이동(migration) 촉진용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 지방 유래 중간엽줄기세포의 이동 촉진용 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 CSF-2(colony stimulating factor-2) 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 염기 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 지방 유래 중간엽줄기세포의 이동 촉진용 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 줄기세포의 줄기세포성(stemness)을 증가시키는 것을 특징으로 하는 지방 유래 중간엽줄기세포의 이동 촉진용 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 SOX2 또는 NANOG 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 지방 유래 중간엽줄기세포의 이동 촉진용 조성물.
   
6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 MMP-2(Matrix metallopeptidase-2) 또는 MMP-9(Matrix metallopeptidase-9) 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 지방 유래 중간엽줄기세포의 이동 촉진용 조성물.
   
7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 피브로넥틴 1(fibronectin 1), 스네일(snail), 트위스트(twist) 또는 비멘틴(vimentin) 유전자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 지방 유래 중간엽줄기세포의 이동 촉진용 조성물.
   
8. 삭제
9. 1) 생체 외에서 지방 유래 중간엽줄기세포를 배양하는 단계;
   2) 상기 단계 1)의 배양된 세포를 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질을 첨가한 배지에서 더 배양하는 단계;
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 지방 유래 중간엽줄기세포의 이동을 촉진하는 방법.
   
10. 삭제
11. 제 9항에 있어서, 상기 단계 1)의 CSF-2(colony stimulating factor-2) 단백질의 농도는 10 내지 500 ng/ml인 것을 특징으로 하는 지방 유래 중간엽줄기세포의 이동을 촉진하는 방법.
    

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