CN104419659A

CN104419659A - 脂肪干细胞及其干细胞分泌物的培养与量产方法

Info

Publication number: CN104419659A
Application number: CN201310390387.1A
Authority: CN
Inventors: 蔡嘉榉
Original assignee: XIANGYU BIOMEDICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: XIANGYU BIOMEDICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2015-03-18

Abstract

一种脂肪干细胞培养及其干细胞分泌物的量产方法，其步骤包括：(A)收集脂肪细胞样本；(B)分离该脂肪细胞样本中的脂肪干细胞；(C)将该脂肪干细胞种植于三维载体上，并置于一生物反应器中进行培养；(D)收集由该脂肪干细胞分泌的干细胞分泌物；其中该干细胞分泌物至少包括血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、介白素-6、1型胶原蛋白其中之一或其组合。由此，可省去繁复操作步骤与人力、设备等经济成本，并可快速大量培养脂肪干细胞及生产其干细胞分泌物，未来可应用于疾病治疗、细胞修复及再生医学领域。

Description

脂肪干细胞及其干细胞分泌物的培养与量产方法

技术领域

本发明涉及一种干细胞及其干细胞分泌物的培养与量产方法，特别是涉及一种脂肪干细胞的培养及量产其干细胞分泌物的方法。

背景技术

基于近年来生物科技与医疗技术的蓬勃发展，干细胞因其特有的分化、增生及组织修复潜能，使其在生物医药产业日趋重要。无论是从全球干细胞相关公司数量、市值的大幅成长，或是美国食品药物管理局(FDA)接受以干细胞申请的临床案件的逐年上升等情况来看，均显示出干细胞治疗已成为国际生物科技产业重点发展项目。

然而，干细胞的快速分化能力常使其在第3至4次继代后，逐渐失去其干细胞特性，以致后续实验往往无法符合临床预期。即使是初代培养的干细胞，以传统培养法的干细胞其特性也与临床表现不同。此外，不同于骨髓干细胞、脐带血干细胞及胚胎干细胞等检测体来源取得较不容易，脂肪为相对容易的检测体取得来源，且检测体取得过程对捐赠者产生的不适感较其他来源轻缓。

此外，除了干细胞本身的医疗应用以外，越来越多针对干细胞分泌物的研究显示，干细胞分泌物的复合组成因子对于再生医学也有良好表现。欧美均有研究报导，以干细胞分泌物培养受损的肝脏细胞或其他哺乳类动物组织，均有细胞增生与组织修复的成果。

因此，现阶段研究的首要目的即在于延缓干细胞分化、维持其干细胞特性并同时大量培养干细胞及其干细胞分泌物，以利后续研究。如何通过改良传统干细胞培养方法，进而制造生产大量干细胞与其干细胞分泌物以符合当下细胞生物学界的需求，已成了亟待解决的一个课题。

发明内容

基于上述公知的问题及需求，本发明主要以不同于传统细胞培养方式的创新3D培养法延缓细胞分化并维持干细胞特性，同时搭配定时灌流***以刺激干细胞分泌物产生。由于3D立体环境培养法对干细胞特性的维持与其分泌物的组成分的影响，皆可应用于再生医学且作为其他医疗领域的发展潜能。因此本发明以立体培养法制造生产大量干细胞与其干细胞分泌物符合当下细胞生物学界的需求。

本发明的一个目的为提供一种脂肪干细胞培养及量产其干细胞分泌物的方法，利用创新研发的3D培养技术大量培育脂肪干细胞且量产并收集其干细胞分泌物以利后期研究发展出个人化干细胞产品。

上述脂肪干细胞的培养方法的步骤包括：(A)收集脂肪细胞样本；(B)分离该脂肪细胞样本中的脂肪干细胞；(C)将该脂肪干细胞以干式细胞种植法分布于三维载体上，并置于一生物反应器中，以定时定量培养液灌流与细胞定时断食法进行培养；(E)收集由该脂肪干细胞分泌的干细胞分泌物；其中该干细胞分泌物至少包括血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)、介白素-6(Interleukin-6,IL-6)、1型胶原蛋白(collagen type I)其中之一或其组合。

在上述方法中，较佳地，步骤(C)进一步包括以定时定量培养液灌流与细胞定时断食法进行培养；每个生物反应器装载的三维载体的数目介于100～1500；培养获取的脂肪干细胞总数量为1×10⁸～1×10⁹个/培养瓶。干细胞分泌物的血管内皮生长因子的浓度可介于0～2090pg/ml、肝细胞生长因子的浓度可介于0～1780pg/ml、介白素-6的浓度可介于0～523pg/ml、1型胶原蛋白的浓度可介于0～42ng/ml，，且脂肪干细胞在三维载体上的贴覆率较佳地可达到90%。

本发明相对于传统细胞培养法有下列优势：

通过三维培养脂肪干细胞的方法，可省去繁复操作步骤与人力、减少设备空间、量产干细胞分泌物以及节省细胞培养液的经济成本。此外，干式细胞植入技术可改善以往3D培养法细胞贴覆率较差的瓶颈、并以定时定量培养液灌流与细胞定时断食法，改变干细胞分泌物的组成及生产量，且在经济效益方面可节约8至10倍的培养耗材用量与支出。通过本发明揭露内容，可快速大量培养脂肪干细胞及大量生产其干细胞分泌物，以提供疾病治疗、细胞修复及再生医学等领域的研究应用。独创的细胞培养***也可做为其他种类细胞培养的研究开发应用。

附图说明

图1为显示本发明脂肪干细胞的培养方法的步骤流程图；

图2为脂肪干细胞的纯化步骤流程图；

图3为脂肪干细胞的培养以及干细胞分泌物的生产步骤流程图；

图4显示经纯化培养后的脂肪干细胞存活率；

图5显示以干式细胞种植法将细胞液均匀分布于培养瓶中的三维载体后的细胞贴覆率；

图6显示本发明的方法与公知的培养液中的葡萄糖含量比较结果；

图7A～7D显示各种干细胞分泌物的浓度比较。

具体实施方式

参阅图1，其为显示本发明脂肪干细胞培养及量产其干细胞分泌物的方法的步骤流程图。本发明主要提供一种脂肪干细胞及其干细胞分泌物的培养与量产方法，步骤包括：收集脂肪细胞样本(步骤101)；分离该脂肪细胞样本中的脂肪干细胞(步骤102)；将该脂肪干细胞以干式细胞种植法分布于三维载体上，并置于一生物反应器中进行培养(步骤103)；收集该培养液中由该脂肪干细胞分泌的干细胞分泌物(步骤104)。其中该干细胞分泌物至少包括血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、肝细胞生长因子(Hepatocytegrowth factor,HGF)、介白素-6(Interleukin-6,IL-6)、1型胶原蛋白(collagen typeI)其中之一或其组合。

在上述方法中，较佳地，干细胞分泌物的血管内皮生长因子的浓度介于0～2090pg/ml，肝细胞生长因子的浓度介于0～1780pg/ml、介白素-6的浓度介于0～523pg/ml、1型胶原蛋白的浓度介于0～42ng/ml，培养获取的脂肪干细胞总数量为1×10⁸～1×10⁹个/培养瓶，且脂肪干细胞在三维载体上的贴覆率较佳地可达到90%，每个生物反应器装载的三维载体的数目介于100～1500。上述内容仅是先行简述各步骤，具体实施方式将详述如后。

脂肪干细胞的分离及纯化

参阅图2，其显示脂肪干细胞的纯化步骤流程图。如图所示，步骤201～208分别为：清洗脂肪，待脂肪分层后去掉下方血水废液(步骤201)，将脂肪移至离心管中离心(步骤202)，将脂肪块倒入盘中剪碎后移至离心管中(步骤203)，加入胶原蛋白酶后放入培养箱，并慢速转动以混合均匀(步骤204)，将混合液过滤至离心管内离心(步骤205)，离心后取出细胞沉淀物清洗，然后再次离心(步骤206)，将细胞沉淀物以dPBS分散，然后再过滤离心(步骤207)，取离心的上清液并送检验部门进行无菌检验、微浆菌及内毒素含量测试(步骤208)，离心后所得的脂肪干细胞再在传统培养瓶中培养。由于步骤201～208的脂肪检测体收集及干细胞分离与公知的技术相同，在此不针对细节部分进行说明。

高效能脂肪干细胞培养及其干细胞分泌物的收集

完成上述脂肪干细胞的分离及纯化步骤后，先进行第一次放大培养，其存活率如图4所示。接着进行后续的高效能脂肪干细胞培养及其干细胞分泌物的收集，其分别为步骤301～310，如图3所示。

将培养盘中的细胞悬浮于容器中(步骤301)。

以干式细胞种植法将细胞液均匀分布于培养瓶中的三维载体上(步骤302)。三维载体数量较佳为100～1,500，其材质可以是玻璃纤维、PET或其他具有孔隙、孔洞，以及适用于脂肪细胞贴覆培养、兼具生物兼容性的材质。公知的的湿式细胞种植法是将三维载体、培养液和细胞置于离心管中，让细胞自行贴附于载体上，但此法需静置摆放且需定时进行摇晃，步骤较繁琐且所需时间较长。而在此采用的干式细胞种植法和公知的湿式细胞种植法不同之处在于，干式细胞种植法是将含有特定数量的细胞液直接分布在干燥的三维载体上，节省了上述静置摆放、摇晃等步骤及所需时间，且经这种改良的干式种植法大幅提高了细胞在载体上的贴覆率。

参阅图5，在经过约200分钟后，以干式细胞种植法所得的细胞贴覆率可达到约90%，确实地改善了公知的脂肪干细胞培养技术贴覆率不高的缺点。干式细胞种植法的步骤为如下所示：

前置作业

a.以细胞培养技术在传统培养瓶中将脂肪干细胞放大培养。

b.在操作前准备100～1500个三维载体。

操作步骤

1.移除培养盘中的旧培养液。2.以dPBS(杜式磷酸缓冲液)清洗细胞2次。3.加入适量胰蛋白酶-EDTA溶液，使所有细胞悬浮。4.以适量培养液将细胞悬浮液中和后离心300-500g/3-10分钟。5.去除上清液，保留管底细胞，用培养液将细胞冲散悬浮至每毫升约1千万至1千5百万个细胞。6.将细胞悬浮液均匀分布于生物反应器专用瓶中的三维载体上。此步骤较佳为使用上述的干式细胞种植法，可获得较好的细胞贴覆率。7.将生物反应器专用瓶置于37℃，5%CO₂培养箱中静置60-120分钟(步骤303)。

培养液倒入生物反应器专用瓶中后置于培养箱中培养(步骤304)。在此使用的培养液成分包括培养液(DMEM、DMEM/F12、F12、StemPro...等任何一种)、胎牛血清(FBS)、抗生素(gentamicin、penicillin…等)，与公知的培养皿法相似，在此不再赘述。只是在进行细胞植入以及细胞数目放大时使用含有动物来源的添加物，例如FBS，须为CTS等级或是狂牛症非疫区的来源。

串接生物反应器专用瓶与含培养液的血清瓶(步骤305)。

再将串接管线装于蠕动泵上(步骤306)。

定时定量灌流细胞培养液(步骤307)。在此步骤可配合给予特定次数及特定时间长度的断食，以刺激干细胞调整其干细胞分泌物的组成比例及产量。

培养数十小时后即可收集含高浓度生长因子的干细胞分泌物(步骤308)。进行干细胞分泌物收集时，不可使用动物血清，以无动物来源(xeno-free)、无抗生素的培养液或是基础培养液进行，以避免因为成品中含有非人类成分而造成使用者过敏。以下为脂肪干细胞在生物反应器中培养并收集干细胞分泌物的详细步骤，以使上述步骤更为明确：

1.将脂肪干细胞培养于三维载体上，在生物反应器中进行培养，培养液为含10%胎牛血清的DMEM/F12。

2.培养时将生物反应器专用瓶置于生物反应器上。

3.培养期间每2-3天以缓冲液清洗并更换培养液。缓冲液可为dPBS或PBS。

4.培养7～10天后即可开始收集脂肪干细胞分泌物。

5.去除旧培养液后以约1-2公升缓冲液清洗含有三维载体的生物反应器专用瓶。缓冲液可为dPBS或PBS。

6.加入培养液DMEM/F12。使用的培养液可为DMEM、DMEM/F12、F12、StemPro...等任何一种，并非仅限于在此所述的DMEM/F12。

7.以灌流管线串连血清瓶与生物反应器专用瓶，并搭载蠕动泵以调控流速及流量，由此达到定时定量及细胞定时断食的目的。

8.培养48～72小时后收集细胞培养液中的脂肪干细胞分泌物。

细胞可继续进行培养与收集干细胞分泌物(步骤309)。

收集的干细胞分泌物以恒温恒湿保存(步骤310)。

就公知的利用培养皿的培养方法而言，10cm培养皿所能培养的人类脂肪干细胞约为1×10⁶个，所能获取的培养液体积约为10～15ml；T-175培养角瓶所能培养的人类脂肪干细胞约为2.5×10⁶个，所能获取的培养液体积约为40～100ml，而本方法的脂肪干细胞总数量较佳可达到1×10⁹个/培养瓶，而一次所能获取的细胞培养液最多为12L。

细胞分化程度比较

参阅图6，其显示本发明的方法与公知的培养液中的葡萄糖含量比较结果。由于过去研究发现干细胞对葡萄糖利用率与细胞分化程度有关，细胞分化程度越大时，对葡萄糖的利用率越高，通过分析传统法与本发明的三维培养法的培养液中葡萄糖含量可发现，三维培养法的培养液葡萄糖含量显著高于传统法，表明脂肪干细胞在三维立体环境下培养较能维持干细胞的特性。

干细胞分泌物浓度比较

经过上述步骤收集得到的干细胞分泌物，其中包括了多种干细胞分泌物，其中至少包含有血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)、介白素-6(Interleukin-6,IL-6)、1型胶原蛋白(collagen type I)。除上述几种因子外，培养所得的干细胞还可能含有其他多种细胞激素(cytokine)与细胞外基质(ECM)；例如:生长因子(GrowthFactor)、细胞介素(Interlukin)及细胞骨架(cytoskeleton)等等，在此仅以血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、介白素-6、1型胶原蛋白的检测为例，并非仅限于此。

将本发明方法与传统培养盘的结果作比较，以上述因子的浓度作为比较基准。请参阅图7A～7D，并同时参阅表1。创新法即为本发明公开的培养方法，在培养时培养瓶内含1000片三维载体，黑、白、灰色条（bar）分别代表以500mL、2700mL及6000mL培养液灌流48～50小时后收取，并以ELISA kit分别检测VEGF、HGF、LI-6及Collagen type I浓度。传统法为使用T75培养瓶，以34mL DMEM/F12培养液培养48～50小时后收取，并以ELISA kit分别检测VEGF、HGF、LI-6及Collagen type I浓度。

在相同细胞来源、培养液条件、温度和二氧化碳浓度的培养状况下，以T75培养瓶所获取的培养液中所测得的VEGF浓度为246.78±58.64pg/ml，而本发明培养方法为1987.18±103.25pg/ml。以T75培养瓶所获取的培养液中所测得的HGF浓度为299.31±86.3pg/ml，而本发明培养方法为1613.25±166.71pg/ml。以T75培养瓶所获取的培养液中所测得的IL-6浓度为76.21±22.65pg/ml，而本发明培养方法为514.12±9.29pg/ml。以T75培养瓶所获取的培养液中所测得的collagen type I浓度为17.75±6.96ng/ml，而本发明培养方法为39.45±2.55ng/ml。两种培养方式的VEGF、HGF、IL-6及collagen type I浓度以Student’s t test进行双尾统计分析，结果显示均具有显著差异，因此使用本发明的方法所测得的VEGF、HGF、IL-6及collagen type I浓度显著较高。

表1

	传统法	创新法(本发明)
			VEGF(pg/mL)	246.78±58.64	1987.18±103.25
HGF(pg/mL)	299.31±86.3	1613.25±166.71
			IL-6(pg/mL)	76.21±22.65	514.12±9.29
collagen type I(ng/mL)	17.75±6.96	39.45±2.55

综上所述，本发明揭露的培养方法相对于传统细胞培养法有下列优势：

短期大量培养脂肪干细胞、省去繁复操作步骤与人力、减少设备空间、量产干细胞分泌物以及节省细胞培养液的经济成本。此外，具有干式细胞植入技术可改善公知的培养法细胞贴覆率较差的瓶颈、以及通过定时定量培养液灌流与细胞定时断食法，以改变干细胞分泌物的组成及生产量。

以T175细胞培养瓶为例，可培养的面积为175cm²，每次操作仅能操作单一细胞培养瓶。本发明使用的三维载体的有效培养面积约为25cm²，而每个生物反应器最多可装载1,500个载体总共仅需500ml培养液，相当于同时培养142至214个T175细胞培养瓶，这需要约4,000-6,500ml培养液。经济效益方面可节约8至10倍的培养耗材用量与支出。以一个培养批次(一整个细胞培养箱)为例，一个细胞培养箱可同时培养144个T25细胞培养瓶或是2个生物反应器。如果分别以T25细胞培养瓶及本发明的3D高效能***进行培养，与利用T25细胞培养瓶的传统生产方式相比，3D高效能***的每个培养批次可减少工时至少24小时，同时达到约27倍的产量。

干细胞分泌物的检测

为验证所生产的干细胞分泌物，不会对细胞产生不正常增生等影响，将收取的培养液，进行人类纤维母细胞(human foreskin fibroblast,HSF)培养。

培养3天后进行细胞增殖倍率分析，以20%或是100%干细胞分泌物培养的细胞，细胞增殖倍率分别为1.7±0.3和1.3±0.2。

以5%或10%FBS培养3天的HSF细胞增殖倍率分别为4.4±0.2和6.3±0.4，均显著比干细胞分泌物高。上述测试证明，本发明的培养方法所生产的干细胞分泌物没有人体使用上的安全疑虑。

依据上述内容，本发明可快速大量培养脂肪干细胞及量产其干细胞分泌物，以提供疾病治疗、细胞修复及再生医学等领域的研究应用。独创的细胞培养***也可作为其他种类细胞培养的研究开发应用。

由以上实施例可知，本发明所提供的脂肪干细胞的培养方法及其干细胞分泌物确实具有产业上的利用价值，以上的叙述仅为本发明的优选实施例的说明，本领域技术人员可以依据上述说明作出其它种类的改良，这些改变也包含于本发明的精神及权利要求所限定的专利保护范围内。

Claims

1.一种脂肪干细胞培养及量产其干细胞分泌物的方法，其步骤至少包括：

(A)收集脂肪细胞样本；

(B)分离该脂肪细胞样本中的脂肪干细胞；

(C)将该脂肪干细胞以干式细胞种植法分布于三维载体上，并置于一生物反应器的培养液中进行培养；

(D)收集由该脂肪干细胞分泌的干细胞分泌物；

其中该干细胞分泌物至少包括血管内皮生长因子(Vascular endothelialgrowth factor,VEGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)、介白素-6(Interleukin-6,IL-6)、1型胶原蛋白(collagen type I)其中之一或其组合。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(C)进一步包括以定时定量培养液灌流与细胞定时断食法进行培养。

3.如权利要求1所述的方法，其中该干细胞分泌物的血管内皮生长因子的浓度介于0～2090pg/ml，肝细胞生长因子的浓度介于0～1780pg/ml、介白素-6的浓度介于0～523pg/ml、1型胶原蛋白的浓度介于0～42ng/ml。

4.如权利要求1所述的方法，其中培养获取的该脂肪干细胞总数量为1×10⁸～1×10⁹个/培养瓶。

5.如权利要求1所述的方法，其中该脂肪干细胞在三维载体上的贴覆率为90%。

6.如权利要求1所述的方法，其中该每个生物反应器装载的三维载体的数目介于100～1500。

7.一种干细胞分泌物，是以如权利要求1项所述的方法所取得，其中该干细胞分泌物至少包括血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)、介白素-6(Interleukin-6,IL-6)、1型胶原蛋白(collagen type I)其中之一或其组合。

8.如权利要求7所述的干细胞分泌物，其中该干细胞分泌物的血管内皮生长因子的浓度介于0～2090pg/ml，肝细胞生长因子的浓度介于0～1780pg/ml、介白素-6的浓度介于0～523pg/ml、1型胶原蛋白的浓度介于0～42ng/ml。