CN110669728A - 一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法和无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，包括采集鳄鱼脂肪组织；将鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞；将鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养。本发明还公开了鳄鱼脂肪干细胞分离培养中所需的无血清培养基包括F12基础培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、大豆胰酶、层粘连蛋白、硒酸钠、维生素C和茶多酚。本发明鳄鱼脂肪干细胞细胞分离培养方法，细胞采用无血清培养基进行培养，无异源血清成分加入，避免了血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，减少了对细胞的伤害和后期临床使用时的风险。

Description

一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法和无血清培养基
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法和无血清培养基。
背景技术
脂肪干细胞（Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs）是来源于脂肪组织中的具有不断的自我更新与多向分化潜能的间充质干细胞。脂肪干细胞为成纤维细胞样，脂肪干细胞低表达HLA-ABC，而不表达HLA-DR，从而说明ADSCs具有低免疫原性，用于同种异体、异种异体移植后，均不会发生免疫排斥反应，在一定条件下，可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞和成骨细胞分化，脂肪干细胞的基本形态、增殖周期、免疫周期、免疫原性及多向分化潜能与目前研究较多的骨髓间充质干细胞相似。
ADCSs取自于脂肪组织，具有来源广泛、取材简单、培养成功率高、细胞老化率低等优点，引起研究者的广泛关注，逐渐成为组织工程学的理想种子细胞。
目前分离培养组织干细胞的培养基通常为含有牛血清或人血清的DMEM/F12完全培养基，而血清可能存在对细胞的毒性作用和血清源性污染等缺陷。且目前还未有见对鳄鱼脂肪干细胞的分离培养相关的报道。
发明内容
本发明的目的是提供了一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，解决了现有脂肪干细胞的分离培养采用血清培养基，可能对细胞存在毒性作用和血清源性污染的问题。
本发明的另一个目的是提供一种无血清培养基。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，具体步骤包括：
步骤1，采集鳄鱼脂肪组织；
步骤2，将步骤1得采集到的鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞；
步骤3，将步骤2得到的鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养。
进一步地，步骤2中将步骤1得采集到的鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞，具体为：
将步骤1得到的鳄鱼脂肪组织用生理盐水清洗3-5次，去除脂肪样本中的血丝，并将脂肪样本剪成1.0-1.2mm3的小块，放入50ml离心管中，体积为1.0-2.5ml；加入消化酶，消化酶与鳄鱼脂肪组织的体积比为2-6:1，37℃恒温摇床震荡消化50-70min，消化结束后，消化液经70μm滤网过滤，将滤液移入50ml离心管，1200rpm离心15-20min，移除上层黄色油脂和中间层消化液，收集沉淀并加入生理盐水冲洗1-2次，1500rpm离心7-8min，收集沉淀，即为鳄鱼脂肪干细胞。
进一步地，消化酶由0.1%I型胶原酶和0.25%胰酶/EDTA按体积比为2-5：1混合制成。
进一步地，步骤3中将步骤2得到的鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养，具体为：
鳄鱼脂肪干细胞沉淀中加入2ml无血清培养基重悬，接种于培养皿中，接种密度为0.8×105个/ml-1.2×105个/ml，在37℃、5％二氧化碳培养箱中进行培养，培养12-15天直至细胞融合率达到70％-80％，之后再进行传代培养。
进一步地，无血清培养基，包括F12基础培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、大豆胰酶、层粘连蛋白、硒酸钠、维生素C和茶多酚。
进一步地，转铁蛋白的浓度为0.3-40 μg/ml、血清白蛋白的浓度为0.3-4mg/ml、胰岛素的浓度为10-60ng/ml、大豆胰酶的浓度为0.5-40μg/ml、层粘连蛋白的浓度为0.05-4mg/ml、硒酸钠的浓度为0.5-30ng/ml、维生素C的浓度为20-50ng/ml和茶多酚的浓度为2.5-40μg/ml。
本发明还公开了一种无血清培养基，包括F12基础培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、大豆胰酶、层粘连蛋白、硒酸钠、维生素C和茶多酚。
进一步地，转铁蛋白的浓度为0.3-40 μg/ml、血清白蛋白的浓度为0.3-4mg/ml、胰岛素的浓度为10-60ng/ml、大豆胰酶的浓度为0.5-40μg/ml、层粘连蛋白的浓度为0.05-4mg/ml、硒酸钠的浓度为0.5-30ng/ml、维生素C的浓度为20-50ng/ml和茶多酚的浓度为2.5-40μg/ml。
进一步地，转铁蛋白的浓度为10-30 μg/ml、血清白蛋白的浓度为1-3mg/ml、胰岛素的浓度为20-40ng/ml、大豆胰酶的浓度为10-30μg/ml、层粘连蛋白的浓度为0.2-3mg/ml、硒酸钠的浓度为2-20ng/ml、维生素C的浓度为30-40ng/ml和茶多酚的浓度为5-30μg/ml。
本发明还公开了一种无血清培养基在鳄鱼脂肪干细胞分离培养中的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1）本发明鳄鱼脂肪干细胞细胞分离培养方法，细胞采用无血清培养基进行培养，无异源血清成分加入，避免了血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，减少了对细胞的伤害和后期临床使用时的风险。
2）本发明鳄鱼脂肪干细胞细胞分离培养方法，将脂肪组织剪成1.0-1.2mm3的小块，再用消化酶进行消化，使得组织消化更彻底，大大提高了脂肪干细胞的分离效率。
3）本发明无血清培养基不含有动物血清，不含动物血清内潜在的动物源性内毒素或病毒，方便应用于临床；通过添加层粘连蛋白，可显著提高鳄鱼脂肪干细胞的贴壁性和增殖效率，有利于鳄鱼脂肪干细胞的增殖和干细胞特性保持；通过添加茶多酚，有助于维持鳄鱼脂肪干细胞的幼稚状态和细胞干性，防止脂肪干细胞的老化；培养基的成份简单，成本较低。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法的具体流程图。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明公开了一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，如图1所示，具体步骤包括：
步骤1，采集鳄鱼脂肪组织；
步骤2，将步骤1得采集到的鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞，具体为：
将步骤1得到的鳄鱼脂肪组织用生理盐水清洗3-5次，去除脂肪样本中的血丝，并将脂肪样本剪成1.0-1.2mm3的小块，放入50ml离心管中，体积为1.0-2.5ml；加入消化酶，消化酶与鳄鱼脂肪组织的体积比为2-6:1，37℃恒温摇床震荡消化50-70min，消化结束后，消化液经70μm滤网过滤，将滤液移入50ml离心管，1200rpm离心15-20min，移除上层黄色油脂和中间层消化液，收集沉淀并加入生理盐水冲洗1-2次，1500rpm离心7-8min，收集沉淀，即为鳄鱼脂肪干细胞。
其中消化酶由0.1%I型胶原酶和0.25%胰酶/EDTA按体积比为2-5：1混合制成。
步骤3，将步骤2得到的鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养，具体为：
鳄鱼脂肪干细胞沉淀中加入2ml无血清培养基重悬，接种于培养皿中，接种密度为0.8×105个/ml-1.2×105个/ml，在37℃、5％二氧化碳培养箱中进行培养，培养12-15天直至细胞融合率达到70％-80％，之后再进行传代培养。
其中无血清培养基，包括F12基础培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、大豆胰酶、层粘连蛋白、硒酸钠、维生素C和茶多酚。
进一步地，转铁蛋白的浓度为0.3-40 μg/ml、血清白蛋白的浓度为0.3-4mg/ml、胰岛素的浓度为10-60ng/ml、大豆胰酶的浓度为0.5-40μg/ml、层粘连蛋白的浓度为0.05-4mg/ml、硒酸钠的浓度为0.5-30ng/ml、维生素C的浓度为20-50ng/ml和茶多酚的浓度为2.5-40μg/ml。
本发明鳄鱼脂肪干细胞细胞分离培养方法，细胞采用无血清培养基进行培养，无异源血清成分加入，避免了血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，减少了对细胞的伤害和后期临床使用时的风险。
本发明鳄鱼脂肪干细胞细胞分离培养方法，将脂肪组织剪成1.0-1.2mm3的小块，再用消化酶进行消化，使得组织消化更彻底，大大提高了脂肪干细胞的分离效率。
本发明无血清培养基中各组分的作用如下：
F12基础培养基，动物细胞培养基，成分复杂，含有多种微量元素，为鳄鱼脂肪干细胞的培养提供充足的营养成分。
转铁蛋白为鳄鱼脂肪干细胞的增殖培养提供铁源，是血浆中主要的含铁蛋白质，转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性并被细胞利用。
血清白蛋白能够提供细胞生长所需大量的营养物质，维持培养基正常的渗透压；可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。
胰岛素促进、刺激细胞生长，维持细胞功能。
大豆胰酶用以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。
层粘连蛋白显著提高鳄鱼脂肪干细胞的贴壁性和增殖效率，有利于鳄鱼脂肪干细胞的增殖和干细胞特性保持。
硒酸钠，为血清中必须的微量元素和离子，在细胞代谢解毒中其重要作用。
维生素C为脂肪干细胞培养提供营养，参与细胞的蛋白质代谢、脂肪代谢、糖代谢等重要生命活动。
茶多酚有助于维持鳄鱼脂肪干细胞的幼稚状态和细胞干性，防止脂肪干细胞的老化。
实施例1
一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，具体步骤包括：
步骤1，采集鳄鱼脂肪组织；
步骤2，将步骤1得采集到的鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞，具体为：
将步骤1得到的鳄鱼脂肪组织用生理盐水清洗3次，去除脂肪样本中的血丝，并将脂肪样本剪成1.0mm3的小块，放入50ml离心管中，体积为2.5ml；加入消化酶，消化酶与鳄鱼脂肪组织的体积比为2:1，37℃恒温摇床震荡消化70min，消化结束后，消化液经70μm滤网过滤，将滤液移入50ml离心管，1200rpm离心20min，移除上层黄色油脂和中间层消化液，收集沉淀并加入生理盐水冲洗1-2次，1500rpm离心7min，收集沉淀，即为鳄鱼脂肪干细胞。
其中消化酶由0.1%I型胶原酶和0.25%胰酶/EDTA按体积比为2：1混合制成。
步骤3，将步骤2得到的鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养，具体为：
鳄鱼脂肪干细胞沉淀中加入2ml无血清培养基重悬，接种于培养皿中，接种密度为0.8×105个/ml，在37℃、5％二氧化碳培养箱中进行培养，培养12天直至细胞融合率达到70％，之后再进行传代培养。
其中无血清培养基，包括F12基础培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、大豆胰酶、层粘连蛋白、硒酸钠、维生素C和茶多酚。
进一步地，转铁蛋白的浓度为0.3μg/ml、血清白蛋白的浓度为4mg/ml、胰岛素的浓度为40ng/ml、大豆胰酶的浓度为40μg/ml、层粘连蛋白的浓度为3mg/ml、硒酸钠的浓度为0.5ng/ml、维生素C的浓度为20ng/ml和茶多酚的浓度为2.5μg/ml。
实施例2
一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，具体步骤包括：
步骤1，采集鳄鱼脂肪组织；
步骤2，将步骤1得采集到的鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞，具体为：
将步骤1得到的鳄鱼脂肪组织用生理盐水清洗4次，去除脂肪样本中的血丝，并将脂肪样本剪成1.1mm3的小块，放入50ml离心管中，体积为2.2ml；加入消化酶，消化酶与鳄鱼脂肪组织的体积比为3:1，37℃恒温摇床震荡消化60min，消化结束后，消化液经70μm滤网过滤，将滤液移入50ml离心管，1200rpm离心19min，移除上层黄色油脂和中间层消化液，收集沉淀并加入生理盐水冲洗1-2次，1500rpm离心8min，收集沉淀，即为鳄鱼脂肪干细胞。
其中消化酶由0.1%I型胶原酶和0.25%胰酶/EDTA按体积比为4：1混合制成。
步骤3，将步骤2得到的鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养，具体为：
鳄鱼脂肪干细胞沉淀中加入2ml无血清培养基重悬，接种于培养皿中，接种密度为1.0×105个/ml，在37℃、5％二氧化碳培养箱中进行培养，培养13天直至细胞融合率达到75％，之后再进行传代培养。
其中无血清培养基，包括F12基础培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、大豆胰酶、层粘连蛋白、硒酸钠、维生素C和茶多酚。
进一步地，转铁蛋白的浓度为40μg/ml、血清白蛋白的浓度为0.3mg/ml、胰岛素的浓度为30ng/ml、大豆胰酶的浓度为10μg/ml、层粘连蛋白的浓度为0.2mg/ml、硒酸钠的浓度为2ng/ml、维生素C的浓度为40ng/ml和茶多酚的浓度为5μg/ml。
实施例3
一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，具体步骤包括：
步骤1，采集鳄鱼脂肪组织；
步骤2，将步骤1得采集到的鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞，具体为：
将步骤1得到的鳄鱼脂肪组织用生理盐水清洗5次，去除脂肪样本中的血丝，并将脂肪样本剪成1.2mm3的小块，放入50ml离心管中，体积为2.0ml；加入消化酶，消化酶与鳄鱼脂肪组织的体积比为4:1，37℃恒温摇床震荡消化50min，消化结束后，消化液经70μm滤网过滤，将滤液移入50ml离心管，1200rpm离心18min，移除上层黄色油脂和中间层消化液，收集沉淀并加入生理盐水冲洗1-2次，1500rpm离心7.5min，收集沉淀，即为鳄鱼脂肪干细胞。
其中消化酶由0.1%I型胶原酶和0.25%胰酶/EDTA按体积比为3：1混合制成。
步骤3，将步骤2得到的鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养，具体为：
鳄鱼脂肪干细胞沉淀中加入2ml无血清培养基重悬，接种于培养皿中，接种密度为1.2×105个/ml，在37℃、5％二氧化碳培养箱中进行培养，培养14天直至细胞融合率达到80％，之后再进行传代培养。
其中无血清培养基，包括F12基础培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、大豆胰酶、层粘连蛋白、硒酸钠、维生素C和茶多酚。
进一步地，转铁蛋白的浓度为10μg/ml、血清白蛋白的浓度为1mg/ml、胰岛素的浓度为60ng/ml、大豆胰酶的浓度为30μg/ml、层粘连蛋白的浓度为4mg/ml、硒酸钠的浓度为20ng/ml、维生素C的浓度为50ng/ml和茶多酚的浓度为30μg/ml。
实施例4
一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，具体步骤包括：
步骤1，采集鳄鱼脂肪组织；
步骤2，将步骤1得采集到的鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞，具体为：
将步骤1得到的鳄鱼脂肪组织用生理盐水清洗3次，去除脂肪样本中的血丝，并将脂肪样本剪成1.2mm3的小块，放入50ml离心管中，体积为1.8ml；加入消化酶，消化酶与鳄鱼脂肪组织的体积比为5:1，37℃恒温摇床震荡消化65min，消化结束后，消化液经70μm滤网过滤，将滤液移入50ml离心管，1200rpm离心17min，移除上层黄色油脂和中间层消化液，收集沉淀并加入生理盐水冲洗1-2次，1500rpm离心8min，收集沉淀，即为鳄鱼脂肪干细胞。
其中消化酶由0.1%I型胶原酶和0.25%胰酶/EDTA按体积比为5：1混合制成。
步骤3，将步骤2得到的鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养，具体为：
鳄鱼脂肪干细胞沉淀中加入2ml无血清培养基重悬，接种于培养皿中，接种密度为1.1×105个/ml，在37℃、5％二氧化碳培养箱中进行培养，培养15天直至细胞融合率达到72％，之后再进行传代培养。
其中无血清培养基，包括F12基础培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、大豆胰酶、层粘连蛋白、硒酸钠、维生素C和茶多酚。
进一步地，转铁蛋白的浓度为30μg/ml、血清白蛋白的浓度为3mg/ml、胰岛素的浓度为10ng/ml、大豆胰酶的浓度为0.5μg/ml、层粘连蛋白的浓度为0.05mg/ml、硒酸钠的浓度为30ng/ml、维生素C的浓度为30ng/ml和茶多酚的浓度为40μg/ml。
实施例5
一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，具体步骤包括：
步骤1，采集鳄鱼脂肪组织；
步骤2，将步骤1得采集到的鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞，具体为：
将步骤1得到的鳄鱼脂肪组织用生理盐水清洗4次，去除脂肪样本中的血丝，并将脂肪样本剪成1.0mm3的小块，放入50ml离心管中，体积为1.5ml；加入消化酶，消化酶与鳄鱼脂肪组织的体积比为6:1，37℃恒温摇床震荡消化55min，消化结束后，消化液经70μm滤网过滤，将滤液移入50ml离心管，1200rpm离心16min，移除上层黄色油脂和中间层消化液，收集沉淀并加入生理盐水冲洗1-2次，1500rpm离心7min，收集沉淀，即为鳄鱼脂肪干细胞。
其中消化酶由0.1%I型胶原酶和0.25%胰酶/EDTA按体积比为2.5：1混合制成。
步骤3，将步骤2得到的鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养，具体为：
鳄鱼脂肪干细胞沉淀中加入2ml无血清培养基重悬，接种于培养皿中，接种密度为0.9×105个/ml，在37℃、5％二氧化碳培养箱中进行培养，培养14天直至细胞融合率达到77％，之后再进行传代培养。
其中无血清培养基，包括F12基础培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、大豆胰酶、层粘连蛋白、硒酸钠、维生素C和茶多酚。
进一步地，转铁蛋白的浓度为20μg/ml、血清白蛋白的浓度为2mg/ml、胰岛素的浓度为20ng/ml、大豆胰酶的浓度为20μg/ml、层粘连蛋白的浓度为0.1mg/ml、硒酸钠的浓度为10ng/ml、维生素C的浓度为25ng/ml和茶多酚的浓度为10μg/ml。
实施例6
一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，具体步骤包括：
步骤1，采集鳄鱼脂肪组织；
步骤2，将步骤1得采集到的鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞，具体为：
将步骤1得到的鳄鱼脂肪组织用生理盐水清洗5次，去除脂肪样本中的血丝，并将脂肪样本剪成1.1mm3的小块，放入50ml离心管中，体积为1.0ml；加入消化酶，消化酶与鳄鱼脂肪组织的体积比为4:1，37℃恒温摇床震荡消化60min，消化结束后，消化液经70μm滤网过滤，将滤液移入50ml离心管，1200rpm离心15min，移除上层黄色油脂和中间层消化液，收集沉淀并加入生理盐水冲洗1-2次，1500rpm离心7.5min，收集沉淀，即为鳄鱼脂肪干细胞。
其中消化酶由0.1%I型胶原酶和0.25%胰酶/EDTA按体积比为4.5：1混合制成。
步骤3，将步骤2得到的鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养，具体为：
鳄鱼脂肪干细胞沉淀中加入2ml无血清培养基重悬，接种于培养皿中，接种密度为1.0×105个/ml，在37℃、5％二氧化碳培养箱中进行培养，培养12天直至细胞融合率达到78％，之后再进行传代培养。
其中无血清培养基，包括F12基础培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、大豆胰酶、层粘连蛋白、硒酸钠、维生素C和茶多酚。
进一步地，转铁蛋白的浓度为5μg/ml、血清白蛋白的浓度为0.8mg/ml、胰岛素的浓度为50ng/ml、大豆胰酶的浓度为25μg/ml、层粘连蛋白的浓度为2mg/ml、硒酸钠的浓度为8ng/ml、维生素C的浓度为35ng/ml和茶多酚的浓度为20μg/ml。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于，具体步骤包括：
步骤1，采集鳄鱼脂肪组织；
步骤2，将步骤1得采集到的鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞；
步骤3，将步骤2得到的鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养。
2.根据权利要求1所述的鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于，步骤2中将步骤1得采集到的鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞，具体为：
将步骤1得到的鳄鱼脂肪组织用生理盐水清洗3-5次，去除脂肪样本中的血丝，并将脂肪样本剪成1.0-1.2mm3的小块，放入50ml离心管中，体积为1.0-2.5ml；加入消化酶，消化酶与鳄鱼脂肪组织的体积比为2-6:1，37℃恒温摇床震荡消化50-70min，消化结束后，消化液经70μm滤网过滤，将滤液移入50ml离心管，1200rpm离心15-20min，移除上层黄色油脂和中间层消化液，收集沉淀并加入生理盐水冲洗1-2次，1500rpm离心7-8min，收集沉淀，即为鳄鱼脂肪干细胞。
3.根据权利要求2所述的鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于，所述消化酶由0.1%I型胶原酶和0.25%胰酶/EDTA按体积比为2-5：1混合制成。
4.根据权利要求1-3任一项所述的鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于，步骤3中将步骤2得到的鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养，具体为：
鳄鱼脂肪干细胞沉淀中加入2ml无血清培养基重悬，接种于培养皿中，接种密度为0.8×105个/ml-1.2×105个/ml，在37℃、5％二氧化碳培养箱中进行培养，培养12-15天直至细胞融合率达到70％-80％，之后再进行传代培养。
5.根据权利要求4所述的鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于，所述无血清培养基，包括F12基础培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、大豆胰酶、层粘连蛋白、硒酸钠、维生素C和茶多酚。
6.根据权利要求5所述的鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于，所述转铁蛋白的浓度为0.3-40 μg/ml、所述血清白蛋白的浓度为0.3-4mg/ml、所述胰岛素的浓度为10-60ng/ml、所述大豆胰酶的浓度为0.5-40μg/ml、所述层粘连蛋白的浓度为0.05-4mg/ml、所述硒酸钠的浓度为0.5-30ng/ml、所述维生素C的浓度为20-50ng/ml和所述茶多酚的浓度为2.5-40μg/ml。
7.一种无血清培养基，其特征在于，包括F12基础培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、大豆胰酶、层粘连蛋白、硒酸钠、维生素C和茶多酚。
8.根据权利要求7所述的无血清培养基，其特征在于，所述转铁蛋白的浓度为0.3-40 μg/ml、所述血清白蛋白的浓度为0.3-4mg/ml、所述胰岛素的浓度为10-60ng/ml、所述大豆胰酶的浓度为0.5-40μg/ml、所述层粘连蛋白的浓度为0.05-4mg/ml、所述硒酸钠的浓度为0.5-30ng/ml、所述维生素C的浓度为20-50ng/ml和所述茶多酚的浓度为2.5-40μg/ml。
9.根据权利要求7或8所述的无血清培养基，其特征在于，所述转铁蛋白的浓度为10-30μg/ml、所述血清白蛋白的浓度为1-3mg/ml、所述胰岛素的浓度为20-40ng/ml、所述大豆胰酶的浓度为10-30μg/ml、所述层粘连蛋白的浓度为0.2-3mg/ml、所述硒酸钠的浓度为2-20ng/ml、所述维生素C的浓度为30-40ng/ml和所述茶多酚的浓度为5-30μg/ml。
10.一种权利要求7-9任一项所述的无血清培养基在鳄鱼脂肪干细胞培养中的应用。
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