KR101590416B1 - 지방유래 줄기세포 계대배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인체로부터 분리된 지방유래 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다.
지방유래 줄기세포 배양방법은 대기 조건보다 산소 함량이 낮은 저산소(hypoxia) 조건에서 인체의 지방조직으로부터 분리된 지방유래 줄기세포를 초대배양 및 본 발명에 따른 계대배양을 거쳐 줄기세포를 배양하는 방법으로서,
초대배양은 제1배양액은 글루코스를 포함하는 액상의 영양배지와, 인체로부터 분리되는 혈장과 가시광선을 조사한 혈소판 풍부 혈장 및 제1첨가제를 포함하여 이루어지는 제1배양액에 줄기세포를 접종하여 배양하며,
본 발명에 따른 계대배양은 영양배지와, 영양배지 중량 대비 1~5 중량%의 비율로 혼합되는 소 혈청 및 제2첨가제를 포함하여 이루어지는 제2배양액에 초대배양단계를 거친 줄기세포를 접종하여 배양하는 것에 특징이 있다.

Description

지방유래 줄기세포 계대배양방법{Method for subculturing adiposed derived stem cell}

본 발명은 줄기세포 배양방법에 관한 것으로서, 특히 성체줄기세포 중 하나로서 인체로부터 분리된 지방조직에서 추출된 후 초대배양을 거친 줄기세포를 다시 계대배양하여 분화 및 증식시키기 위한 지방유래 줄기세포 계대배양방법에 관한 것이다.

줄기세포는 조직이나 기관의 분화된 세포들 사이에 존재하는 미분화 세포로서, 끊임없이 스스로 증식하는 자가재생능력(Self Renewal)과 신체내의 모든 조직세포로 분화할 수 있는 능력(Differentiation to specific tissue)을 가진 만능세포이다.

성체줄기세포는 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 신경모세포, 상피모세포 등이 존재하는데, 조혈모세포의 경우 혈구 및 임파구를 생산할 수 있는 모세포로서 혈액암을 포함한 면역계 질환 치료에 도움이 되며, 중간엽 줄기세포의 경우 뼈, 연골, 지방 및 섬유조직으로 분화되며 각 조직이 손상되었을 때 이들의 회복에 관여한다. 그러나 이러한 성체 줄기세포는 각각의 조직에 소량 존재하며 수년간 분열 혹은 증식을 하지 않고 잠잠하게 지내기도 한다. 즉, 줄기세포라 함은 이러한 분화능력은 가지고 있으나, 아직 분화는 일어나지않은 '미분화 세포'를 말한다. 이렇게 미분화된 상태에서 줄기세포는 적절한 조건이 주어지면 다양한 조직 세포로 분화할 수 있다.

한편 줄기세포는 배아줄기세포와 성체줄기세포로도 나눌 수 있다. 즉, 출생 후부터 우리 몸에 있는 여러 종류의 조직에 존재하는 성체줄기세포(Adult Stem Cell)와 인간 생명의 시초가 되는 수정란에서 유래하는 배아 줄기세포(Embryonic Stem Cell)의 두 종류로 구분될 수 있다. 성체줄기세포는 특정한 조직을 구성하는 세포를 말하는데, 예컨대 골수세포는 혈구세포로, 피부줄기세포는 피부로, 신경줄기세포는 신경세포로만 분화되도록 운명이 정해져 있는 세포이다.

인체유래 줄기세포는 배아줄기세포를 제외한 성체로부터 얻어지는 줄기세포를 의미하며, 예로서 지방, 골수, 제대혈 및 말초혈액을 포함하는 혈액 및 조직의 기저에서 기원되는 줄기세포를 모두 포함한다.

특히, 지방유래 줄기세포는 성체줄기세포의 한 종류로서 골수줄기세포나 제대혈 줄기세포보다 채취하기가 쉽고 대량 배양이 가능하면서도 줄기세포 함유량이 많기 때문에 지방유래 줄기세포를 의료, 미용 등 다양한 목적으로 활용하기 위한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

그러나 지방유래 줄기세포는 배아 줄기 세포와는 달리 생체 외에서 배양 시 수명이 매우 짧고 분화능 또한 짧은 기간 동안만 보유된다. 이러한 줄기세포의 제한된 수명은 해당 세포의 활용에 있어 큰 제약이 되고 있다.

예컨대, 세포 치료나 재생의학에서 시술을 위해서 필요한 최소의 줄기세포 를 확보하기 위해서는 적어도 수차례의 계대배양을 거쳐야 하는데, 이렇게 계대배양하는 과정에서 세포는 노화되고 변형되어 더 이상 치료의 개념에 적합하지 않게 된다.

또한 줄기세포 배양 과정에서 기준 크기 이상으로 커지면 그 활용성이 급격하게 저하되므로, 줄기세포 배양에 있어서는 얼마나 빠른 속도로 줄기세포를 많이 증식시킬 수 있는지에 대한 양적 문제와 함께, 배양된 줄기세포의 크기를 일정 범위 이내로 제한할 수 있는지에 대한 질적 문제가 중요한 과제로 대두 되고 있다.

이러한 문제를 해결하기 위하여 다양한 선행 연구들이 있었으며, 그 중에서도 저산소(hypoxia) 조건 하에서 줄기세포를 배양하는 방법에 대하여 연구가 수행되었다. 본 연구진에서도 저산소 조건이 줄기세포 배양에 미치는 영향을 연구하였다. 본 연구진은 JSH 및 VAN으로 표시된 2명의 세포에 대하여 일반 조건과 저산소 조건에서 줄기세포를 각각 배양하였다. 일반 조건이란 이산화탄소가 5%, 산소는 대기와 같이 21% 정도 포함되어 있는 조건이며, 저산소 조건은 이산화탄소가 5%, 산소는 1% 포함된 조건이다. 인큐베이터에서 37℃를 유지하며 실험하였으며, 그 결과는 도 1 및 도 2에 도시되어 있다.

도 1은 JSH 세포를 대상으로 한 실험 결과인데, 초기의 세포수가 3.75×10⁵ 개에서 시작하였는데, 일반 조건에서는 8.40×10⁵ 개로 늘어난 반면, 저산소 조건에서는 1.60×10⁶ 개로 늘었다. 도 2는 VAN 세포를 대상으로 한 실험 결과인데, 초기의 세포수가 3.75×10⁵ 개에서 시작하였는데, 일반 조건에서는 1.02×10⁶ 개로 늘어난 반면, 저산소 조건에서는 1.45×10⁶ 개로 늘었다.

도 3에는 위 실험에서 계대배양을 4번 진행한 세포의 현미경 사진인데, 저산소(hypoxia) 조건에서 배양된 세포가 일반 조건(normoxia)에서 배양된 세포보다 크기가 작게 유지되는 것을 확인하였다.

위 결과들을 참고하면, 저산소 조건에서 세포의 사이즈는 작게 유지되며, 세포 성장 속도도 1.4~1.9배 증가한 결과를 보였다. 그러나 저산소 조건에서 세포 배양 속도가 일반 조건에 비하여 2배 이상 획기적으로 증가하지 않는다는 문제는 여전히 해결해야할 과제로 남아 있다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 저산소 조건에서 다양한 첨가제를 포함하는 배양액을 이용하여 빠른 속도로 줄기세포를 증식시키면서도 줄기세포의 크기가 작게 유지될 수 있는 지방유래 줄기세포 계대배양방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 지방유래 줄기세포 계대배양방법은, 대기 조건보다 산소 함량이 낮은 저산소(hypoxia) 조건에서 인체의 지방조직으로부터 분리된 지방유래 줄기세포를 계대배양 하기 위한 것으로서, 글루코스를 포함하는 액상의 영양배지와, 상기 영양배지 중량 대비 1~5 중량%의 비율로 혼합되는 소 혈청과, 제2첨가제 및 이미 줄기세포의 배양에 사용되었던 리유스배양액을 포함하여 이루어지는 제2배양액에 초대배양을 거쳐 배양된 줄기세포를 접종하여 배양하는 것에 특징이 있다.

본 발명에 따르면, 상기 리유스배양액은 상기 제2배양액에 함유된 상기 영양배지 중량 대비 1~10 중량%의 범위로 상기 제2배양액에 포함되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명에 따르면, 상기 리유스배양액은 글루코스를 포함하는 기본배지와, 첨가제를 포함하며, 선택적으로 상기 기본배지 중량 대비 1~5 중량%의 비율로 소 혈청이 혼합되는 것이 바람직하다.

특히, 상기 리유스배양액은 저산소 조건에서 줄기세포를 배양하는데 사용한 배양액인 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 제2첨가제는 상기 영양배지 중량 대비 0.3~1.7 중량%의 비율로 상기 제2배양액에 혼합된다.

그리고, 상기 제2첨가제는 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄을 포함하며, 첨가제의 상호작용에 의한 기능을 증진시키도록, 상기 제2첨가제는 에탄올아민 및 비타민E를 더 포함할 수 있다.

한편, 상기 계대배양을 시작한 후 48~72 시간 내에 EGF(Epidermal Growth Factor)를 상기 제2배양액에 첨가하는 것이 바람직하다.

계대배양에서 접종하는 줄기세포는 초대배양을 거쳐서 배양된 것으로서, 상기 초대배양에서 인체로부터 분리되며 자외선을 조사하는 전처리 과정을 거친 혈장과 혈소판 풍부 혈장을 혼합한 배양액에서 배양된 줄기세포인 것이 바람직하다.

본 발명에서는 저산소 조건에서 제2배양액을 사용하여 초대배양된 줄기세포를 계대배양하는데, 제2배양액에는 위험성이 상존하는 소 혈청을 최소한으로 유지하면서도, 기존에 줄기세포를 배양하는데 사용되었던 리유스배양액과 제2첨가제를 혼합하여 사용함으으로써 세포의 배양속도를 증대시키고 세포의 크기를 유지할 수 있다.

즉 본 발명에 따른 계대배양을 수행하는 경우, 일반 배양방법에 비하여 적어도 4배 이상으로 세포의 성장속도를 증진시킬 수 있어 줄기세포를 대량 배양 가능하다.

이를 통해 줄기세포의 산업적 이용이 활발하게 이루어질 수 있는 계기가 마련될 것으로 기대된다. 더욱이 세포의 크기를 작게 유지할 수 있으므로 줄기세포를 치료의 목적이나 미용의 목적으로 사용하는 경우에 있어서 보다 안전하고 효율적인 사용이 가능할 것으로 기대된다.

도 1 및 도 2는 저산소 조건이 줄기세포 배양에 미치는 영향을 실험한 결과가 나타나 있는 표이다.
도 3은 도 1 및 도 2에 도시된 실험을 통해 계대배양된 줄기세포의 현미경 사진이다.
도 4는 초대배양방법과 본 발명의 일 실시예에 따른 지방유래 줄기세포 계대배양방법을 함께 설명하기 위한 개략적 흐름도이다.
도 5는 가시광선을 혈장과 혈소판 풍부 혈장에 조사한 경우 세포 배양에 미치는 영향을 실험(이하, '가시광선 영향 실험'이라 함)하는데 사용한 배양액의 조성표이다.
도 6은 가시광선 영향 실험의 결과가 나타나 있는 표이다.
도 7 및 도 8은 가시광선 조사 여부에 따라 배양된 세포의 크기를 관찰한 전자 현미경 사진이다.
도 9는 첨가제의 농도 조건에 따른 배양 실험의 결과를 나타낸 현미경 사진이다.
도 10은 초대배양 실험에서 사용한 배지1~3의 조성표이다.
도 11은 도 10에 나타난 배지들을 사용한 초대배양 실험 조건을 나타낸 표이다.
도 12는 초대배양 실험의 결과를 나타낸 표이다.
도 13 및 도 14는 각각 JOO 세포와 VAN 세포의 그룹별 세포배양 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 초대배양된 세포의 크기를 나타낸 표이다.
도 16 및 도 17은 줄기세포 배양을 마친 후의 줄기세포 배양액에서 TGF를 측정한 결과가 나타나 있는 표와 그래프이다.
도 18은 계대배양 실험에서 사용한 배지1~4의 조성표이다.
도 19는 도 18에 나타난 배지들을 사용한 계대배양 실험 조건을 나타낸 표이다.
도 20은 도 18에 나타난 배지들을 사용한 계대배양 실험의 결과를 나타낸 표이다.
도 21 및 도 22는 각각 TIEN 세포와 NHJ 세포의 그룹별 세포배양 결과를 나타낸 그래프이다.
도 23은 계대배양된 세포의 크기를 나타낸 표이다.
도 24는 리유스배양액을 포함한 제2배양액을 이용한 계대배양 실험에서 사용한 배지1~5의 조성표이다.
도 25는 도 24에 나타난 배지들을 사용한 계대배양 실험 조건을 나타낸 표이다.
도 26은 도 24에 나타난 배지들을 사용한 계대배양 실험의 결과를 나타낸 표이다.
도 27 및 도 28은 각각 JOO 세포와 VAN 세포의 그룹별 세포배양 결과를 나타낸 그래프이다.
도 29는 계대배양된 세포의 크기를 나타낸 표이다.
도 30은 EGF의 첨가시기에 따른 영향을 관찰하기 위한 실험조건이 나타나 있는 표이다.
도 31은 도 30에 따른 실험결과가 나타나 있는 그래프이다.

본 발명은 지방유래 줄기세포, 특히 인체의 지방조직으로부터 분리된 지방유래 줄기세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 다만, 본 발명의 대상을 인체로부터 분리된 지방유래 줄기세포에만 제한하는 것은 아니며, 다른 동물의 지방조직으로부터 분리된 줄기세포도 포함한다.

이하, 첨부된 도면을 참고하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 지방유래 줄기세포 계대배양방법에 대하여 더욱 상세히 설명한다.

줄기세포는 인체로부터 분리된 후 초대배양을 거친 후 플라스크를 옮겨 계대배양된다. 계대배양은 1회에 끝나는 것이 아니라 연속적으로 차수를 거듭하여 수행하게 된다.

본 발명은 줄기세포 전체 배양과정 중 계대배양에 관한 것이다. 그러나, 본 연구진에서는 초대배양 및 계대배양 전체 과정을 개발하였으며, 본 발명에서도 바람직하게는 본 연구진에 의해서 개발된 초대배양 방법을 통해 배양된 줄기세포를 이용하여 계대배양을 실시한다.

이에, 본 발명에 대한 전체적인 이해를 돕기 위하여, 이하에서는 본 발명의 직접적인 대상인 계대배양방법만을 설명하는 것이 아니라, 초대배양 과정에서부터 계대배양에 이르는 전체적인 과정을 함께 설명하기로 한다.

도 4는 인체로부터 줄기세포를 분리한 후, 초대배양 및 본 발명에 따른 계대배양을 거쳐 줄기세포를 배양하는 전체 과정을 설명하기 위한 개략도이다.

먼저 초대배양에 대하여 설명한다.

초대배양 시기는 세포가 조직으로부터 분리되어 나와 체외에서 적응해야 하는 중요한 시기이다. 세포는 작고 약하기 때문에 세포가 안정적으로 배양될 수 있는 환경은 매우 중요하다.

초대배양단계에서는 저산소 조건의 인큐베이터 내에 제1배양액이 담긴 플라스크에 줄기세포를 접종하여 줄기세포를 배양한다.

저산소(hypoxia) 조건이란 대기 중의 산소의 농도(대략 21%)보다 낮은 산소 함량을 가지는 환경 조건을 말하며, 본 발명에서도 이러한 개념은 동일하게 적용된다. 그러나 좀 더 적극적인 관점에서, 본 발명에서 사용하는 저산소 조건은 인큐베이터 내 공기 중의 산소 농도가 1~5% 정도인 것을 의미한다. 또한 인큐베이터는 대략 37℃ 정도의 온도를 유지하며, 이산화탄소의 농도는 대략 5%를 유지한다.

그리고 제1배양액은 줄기세포가 안정적으로 증식하는데 필요한 영양소를 공급하기 위한 것으로서 본 발명에서는 줄기세포의 배양 속도를 증진시키고, 세포 크기를 작게 유지하기 위하여 최적의 제1배양액 조합을 만들어 냈다.

제1배양액에는 글루코스를 포함하는 액상의 영양배지와 인체로부터 분리되는 혈장과 가시광선을 조사한 혈소판 풍부 혈장(PRP,Platet Rich Plasma) 및 제1첨가제가 포함된다.

본 발명에서 글루코스를 포함하는 액상의 영양배지는 세포배양에 많이 사용되는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media)을 사용하였다.

본 발명에 따르면, 초대배양에서 사용하는 제1배양액의 가장 핵심적인 2가지 요소는 인체로부터 분리된 혈장(plasma)과 혈소판 풍부 혈장(PRP, platet rich plasma)을 사용하였다는 점과, 혈장과 혈소판 풍부 혈장에 미리 가시광선을 조사한다는 점이다.

일반적으로 동물세포를 증식하기 위한 배양액에는 소 혈청이 들어가는데, 소 혈청은 소가 가지는 질병이나 예상치 못한 면역반응의 영향을 배제할 수 없기 때문에, 사람(특히 환자라면 본인)의 혈장과 혈소판 풍부 혈장을 사용하여 체내와 가장 유사한 조건을 형성함으로써 초대배양을 안전하게 안정적으로 수행할 수 있다.

혈장과 혈소판 풍부 혈장은 사람의 혈액을 원심분리하여 얻어진다. 본 발명에서는 혈액을 원심분리하여 혈장과 혈소판 풍부 혈장을 상호 분리해낸다. 혈소판에는 세포가 증식하는데 필요한 성장인자(growth foactor)와 사이토카인 등이 다량 함유되어 있다.

제1배양액에서 혈장은 영양배지의 중량 대비 10~20 중량%의 비율로 혼합되며, 혈소판 풍부 혈장은 영양배지의 중량 대비 1~8 중량%의 비율로 혼합된다.

특히, 본 발명에서는 사람의 혈액으로부터 분리된 혈장과 혈소판 풍부 혈장을 그대로 배양액에 첨가하여 사용하는 것이 아니라, 혈장과 혈소판 풍부 혈장에 가시광선을 조사하는 전처리를 수행하는데 특징이 있다.

본 연구진은 LED 광원으로부터 나온 가시광선을 혈장 및 혈소판 풍부 혈장에 조사하여 세포 성장에 미치는 효과를 실험하였다.

도 5는 가시광선을 혈장과 혈소판 풍부 혈장에 조사한 경우 세포 배양에 미치는 영향을 실험(이하, '가시광선 영향 실험'이라 함)하는데 사용한 배양액의 조성표이며, 도 6은 가시광선 영향 실험의 결과가 나타나 있는 표이다.

도 5를 참고하면, 실험은 3개의 그룹으로 나누어 진행하였는데, 그룹1 내지 그룹3은 모두 글루코스를 포함하는 영양배지를 공통으로 사용하였고, 그룹1에는 소 혈청을 첨가하였고, 그룹2에는 사람의 혈액으로부터 분리한 혈장과 혈소판 풍부 혈장을 첨가하였고, 그룹3에는 가시광선을 조사한 혈소판 풍부 혈장을 첨가하였다.

도 6의 실험 결과는 두 번의 실험(case1 및 case2)의 결과값인데, 소 혈청을 첨가한 그룹1은 두 번의 실험결과가 동일하였고, 그룹2와 그룹3에서는 두 번의 실험결과가 약간 차이를 보였다. 중요한 점은 소 혈청을 첨가한 그룹1에 비하여 사람 혈액의 혈장과 혈소판 풍부 혈장을 첨가한 그룹2 및 그룹3에서 세포가 더욱 빠르게 자라나는 것을 확인할 수 있었다는 것이다. 다만, 그룹2와 그룹3의 세포 배양 결과를 보면, 가시광선을 조사 여부에 따라 세포 배양 속도가 큰 차이를 보이지 않았다.

그러나, 가시광선 조사 여부에 따라 배양된 세포의 크기에서는 많은 차이가 나타난다는 것을 확인하였다. 도 7 및 도 8은 가시광선 조사 여부에 따라 배양된 세포의 크기를 관찰한 전자 현미경 사진이다.

도 7은 가시광선을 조사한 혈소판 풍부 혈장을 사용하여 배양한 세포의 사진이며, 도 8은 가시광선을 조사하지 않은 경우이다. 도 7의 전자 현미경 사진에서는 세포의 평균 사이즈가 14μm인데 반하여, 도 8의 사진에서는 세포의 평균 사이즈가 19.4μm로서 훨씬 크게 나타났다.

실험 결과를 종합하면, 사람의 혈액으로부터 분리된 혈장과 혈소판 풍부 혈장을 사용하여 세포를 배양하면 소 혈청을 사용하는 경우에 비하여 세포의 배양 속도가 크게 증가하며, 혈소판 풍부 혈장에 가시광선을 조사하는 경우 배양된 세포의 크기를 작게 유지할 수 있다는 것을 확인하였다.

상기한 바와 같이, 저산소 조건에서 인체로부터 분리된 혈장과 가시광선을 조사한 혈소판 풍부 혈장을 사용하여 세포의 크기 유지 및 속도에서 일정 정도 진전을 보였으나, 조금 더 성장을 촉진시키기 위하여 제1첨가제를 사용하게 되었다.

다만, 제1첨가제는 고농도, 고용량을 사용하여 너무 많은 기능을 하도록 유도하기 보다는 적은 양으로도 세포가 안정적으로 적응할 수 있도록 유도하였다.

본 실시예에서 제1첨가제는 상기 영양배지 중량 대비 0.2~0.6중량%의 범위로 상기 제1배양액에 혼합되며, 트랜스페린, 셀레늄, 트리요오드티로닌(T3), 오르니틴을 포함한다.

트랜스페린(Transferrin)은 세포외기질 철이온의 저장과 운송을 촉진하며, 중요한 산화방지제의 역할을 한다. 세포환경에서 철의 양을 조절한다. 철의 양이 모자라면 세포분열이 저해되고 사멸될 수 있다. 따라서, 초대배양에 트랜스페린의 역할은 세포가 사멸하는 것을 방지하고, 세포분열이 원활이 되도록 도와주는 역할을 한다.

트리요오드티로닌(T3, 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)은 단백질합성을 높이고, 단백질 발현을 조절한다. 초대배양에서 세포의 성장에 필수적인 것은 세포의 안정적인 적응이다. 이를 위해서는 세포막의 단백질의 발현이 필수적이다. 배양용기에 부착하는 세포막의 단백질의 역할은 중요하고, 또한 미네랄, 호르몬 등을 운반하는 수송단백질도 중요하기 때문에 T3는 일종의 자극제로서 필요하다.

오르니틴(L-Ornithine)은 폴리아민(Polyamine)의 합성을 돕는 아미노산이다. 폴리아민은 거의 모든 세포의 분화와 성장에 관여하는 필수적인 물질로 세포의 발달과정에서 중추적을 역할을 한다. 초대배양에서 L-Ornithine을 첨가함으로서 폴리아민의 합성을 촉진하여 어린 줄기세포의 안정적인 적응과 성장효과를 보려고 한 것이다.

셀레늄(Selenium)은 생체 내 정상세포의 성장을 위해 필요하다. 과산화물을 줄여 세포를 보호하는 항산화기능을 한다. 또한 glutathione 의 활성을 촉진하여 필수 영양소 하나로 여겨진다. 또한 셀레늄은 selenoprotein P(SeP)로 병합되고 SeP는 초기 셀레늄을 운송하고 단백질을 세포로 운반하는 역할을 한다. 세포막의 밖과 세포외기질과 결합하여 나타나며, 지방의 과산화작용에서 세포막을 보호한다. SeP는 사람의 혈장에서 총 셀레늄의 50%로 존재한다. 초대배양에서 세포의 안정화를 위해서는 세포막의 보호도 중요하고, 단백질의 운송도 중요하기 때문에 셀레늄의 역할은 중요하다.

본 발명에서는 초대 배양에서 소혈청 대신 사람의 혈장을 사용하였는데, 여기에 포함된 SeP 역시 셀레늄이 효소로 병합되는 것을 활성화시켜 초기배양되는 세포들의 세포막보호가 더욱 촉진될 것으로 기대한다.

상기한 바와 같이, 본 실시예에서 제1첨가제는 상기 영양배지 중량 대비 0.2~0.6중량%의 범위로 상기 제1배양액에 혼합되는데, 함량이 위 범위에 미달하면 첨가제로서의 원하는 효과를 얻을 수 없으며, 이 범위를 초과하는 경우에도 세포성장이 저해된다. 본 연구진의 첨가제의 적합한 농도를 찾기 위해 많은 실험을 수행하여, 상기한 범위의 농도를 찾아냈다.

도 9는 첨가제의 농도 조건에 따른 배양 실험의 결과를 나타낸 현미경 사진이다. 배양용기 면적당 5,000개의 세포를 접종하고 4일이 경과한 시점에서 현미경 사진을 촬영하였다. (a)사진은 본 발명에 따른 범위 내에서 제1첨가제를 배합한 경우이며, (b)는 (a)에 비하여 4배 농도의 첨가제를 배합한 경우이다. 사진에 나타난 바와 같이, (b)가 (a)에 비하여 세포 수가 현저하게 작다는 것을 확인하였다.

상기한 바와 같이, 글루코스를 포함하는 영양배지, 인체로부터 분리되며 가시광선을 조사한 혈장 및 혈소판 풍부 혈장, 그리고 제1첨가제가 포함되어 있는 제1배양액을 배양용기에 담고, 인체의 지방조직으로부터 분리된 줄기세포를 접종한다. 그리고 배양용기를 저산소 조건의 인큐베이터에 넣고 배양을 진행한다.

그리고 배양을 시작한 후 2일 후, 즉 48~72 시간 내에 세포의 생산을 촉진하는 성장인자인로 알려진 EGF(Epidermal Growth Factor, 상피세포 성장인자)를 제1배양액에 첨가한다. 본 연구진의 실험에 따르면 배양을 시작할 때부터 EGF 단독으로 또는 FGF와 함께 EGF를 첨가하여도 세포배양 속도가 증진되지 않았으나, EGF를 세포배양 후 48 시간 이후에 첨가하는 경우 가장 효과적으로 세포 성장이 촉진되는 것을 발견하였다.

본 연구진에서는 저산소 조건에서 제1배양액을 이용한 초대배양의 효과에 대하여 실험을 수행하였다.

초대배양 실험에서 배지(media)1~3의 세 가지 배지를 사용하였다. 배지1 내지 배지3의 조성이 도 10의 표에 나타나 있다. 도 10의 표를 참고하면, 배지1 내지 배지3 모두 공통으로 DMEM을 사용하였고, 비교예인 배지1의 경우 소 혈청(FBS)을 사용한 반면, 본 발명에 따른 배양액에 근거한 배지2와 배지3에서는 소 혈청을 대체하여 인체로부터 분리된 혈장과 혈소판 풍부 혈장을 사용하였다. 그리고 혈장과 혈소판 풍부 혈장은 LED 광원을 이용하여 green, blue, red 및 yellow 파장의 가시광선을 15분간 조사하는 전처리를 수행하였다. 배지2와 배지3은 오르니틴과 셀레늄을 첨가했는지 여부에서 차이가 있다.

초대배양 실험은 JOO 및 VAN으로 표시된 2명의 세포를 사용하여 재현성을 관찰였으며, 혈장은 A,B,C로 표시된 세 명의 혈액으로부터 분리된 혈장(및 혈소판 풍부 혈장)을 사용하였다. 그리고 저산소 조건과 일반조건에서 각각 다른 배지들을 사용하여 실험을 진행하였다. 초대배양 실험 조건에 대한 표가 도 11에 나타나 있다.

도 11을 참고하면 비교군(group1)에서는 모두 소 혈청을 첨가한 배지1을 사용하였고, 대조군1~3(group2~4)에서는 본 발명에 따른 배양액인 배지2 및 배지3을 사용하였다. 그리고 배지1에는 EGF를 첨가하지 않았고, 배지2 및 배지3에는 EGF를 첨가하였다.

각각의 그룹은 T75 플라스크에 면적당 10,000개/Cm²가 되도록 세포를 접종하였다. 그리고 플라스크 내에 세포의 농도가 약 80~90% 정도로 자라게 되면 세포를 플라스크로부터 떼어내어 세포의 수, 생존률, 세포의 모양을 확인하였다. 세포의 수, 생존률은 'Logosbiosystems'의 'Luna'를 사용하여 측정하였다.

초대배양 실험의 결과를 도면에 표시하였다. 도 12의 표는 배양 속도에 대한 결과이며, 도 13, 도 14의 그래프로 시각화하였다. 도 15는 배양된 세포의 크기를 나타낸 표이다.

실험 결과를 참고하면, 기존 배양방법에 비해 본 연구진에서 개발한 배양액으로 세포를 배양하였을 때 세포의 증식속도가 더 빠른 결과가 나타났으며, 저산소 조건에서는 일반 배양조건보다 더 빠른 것으로 나타났다. 특히 T3 성분이 0.5ng/ml 들어간 배지3을 이용한 그룹 4를 저산소 조건에서 세포를 배양하였을 때 일반 배양방법보다 2~3배 성장속도가 빠른 것을 확인할 수 있었다.

특히 JOO의 경우를 보면 일반 배양 조건에서 세포가 초기 배양세포(plating한 세포)와 큰 차이를 보이지 않는 것을 볼 수 있다. 사람세포는 초대배양을 시작하여 세포배양용기의 80~90% 농도가 되기까지 약 7일 정도가 소요된다. JOO의 경우는 6일 경과 후의 농도가 50%도 되지 않는데, 이 경우 세포배양용기에 세포를 채우기 위해서 상당히 많이 시간이 소요된다. 그러나 본 연구진에서 개발한 저산소 조건과 배양액을 이용한 방법을 사용하면 이러한 성장이 어려운 세포도 일반 세포의 경우처럼 빠른 성장을 유도할 수 있다.

참고로, 배지1을 사용한 저산소 조건에 대해서는 배지1을 사용한 일반 조건과 거의 차이가 없으므로 결과표에서 별도로 표시하지 않았다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 배양방법을 사용하여 초대배양을 실시한 경우 기존의 배양방법(일반 산소 조건 및 보통의 배양액 사용)에 비하여 세포 성장 속도가 훨씬 빠르며, 세포의 크기도 작게 유지할 수 있다.

한편, 상기한 바와 같이, 초대배양이 완료되면 플라스크에서 줄기세포를 분리하여 다른 플라스크에 옮겨 계대배양을 실시한다. 계대배양도 초대배양과 마찬가지로 저산소 조건의 인큐베이터 내에서 실시하지만, 플라스크에 담기는 제2배양액이 초대배양시의 제1배양액과는 다른 조성으로 이루어진다는 점에서 차이가 있다.

계대배양 시기는 세포가 초대배양을 거치면서 체외에서 적응된 상태이다. 초기배양을 거쳐 안정적이고 건강한 세포들만이 새로운 배양용기로 옮겨져 있기 때문에 계대배양시에는 안정적인 배양환경을 유지하면서도 성장률을 높이는 것에 초점이 맞추어진다. 이에 본 발명에서는 세포의 성장에 적합한 조성의 제2배양액을 도출하였다.

계대배양에서 사용하는 제2배양액은 초대배양에서 사용한 것과 동일한 영양배지와, 영양배지 중량 대비 1~5 중량%의 비율로 혼합되는 소 혈청 및 제2첨가제를 포함하여 이루어진다. 그리고 선택적이지만 리유스배양액을 제2배양액에 혼합하는 것이 바람직하다.

초대배양에서는 소 혈청이 가지는 위험성으로 인하여 인체로부터 분리된 혈장을 사용하였지만 계대배양에서는 증대된 세포의 배양에 적합할 정도로 충분한 양의 혈액을 확보할 수 없으므로, 소 혈청(FBS)를 사용한다. 그러나, 소 혈청은 값이 비싸고 소가 가지는 질병으로부터의 영향이 있을 수 있는 위험성, 생산 LOT마다 활성도에 차이가 나타나는 단점이 있기 때문에 소 혈청의 사용을 줄이고자 하였다. 이에 본 발명에서는 소 혈청을 영양배지의 중량 대비 1~5중량%의 범위로만 배합한다.

소 혈청의 사용을 줄임으로써 결핍되는 많은 영양소는 제2첨가제를 효과적으로 사용함으로써 보충하고, 동시에 저산소 조건을 이용하여 줄기세포가 성장을 빠르고 안정적으로 할 수 있도록 하고자 하였다.

상업적으로 줄기세포를 이용하는데 있어서 가장 큰 단점이 고가의 가격이기 때문에 본 연구진에서는 저혈청으로 줄기세포가 빠르게 성장하여 단시간에 대량의 세포를 얻을 수 있도록 하며, 또한 계대배양을 진행하면서 세포의 크기가 커지는 단점을 보완하는 방법을 제안한다.

본 발명에서 사용하는 제2배양액에 첨가하는 제2첨가제는 영양배지 중량 대비 0.3~1.7 중량%의 비율로 상기 제2배양액에 혼합되며, 지질, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 에탄올아민 및 비타민E를 포함한다. 또한, 계대배양을 시작한 후 48~72 시간 내에 EGF를 제2배양액에 첨가한다. EGF를 배양시작 후 2일 이후에 첨가하는 이유는 초대배양에서 설명한 바와 동일하다.

지질은 생체막 합성 기능을 담당한다. 생존하는 세포들의 에너지원이며 구조를 구성하는 중요성분이다. 소 혈청 사용을 줄임으로써 결핍되는 지질성분을 보충해 줌으로서 체외배양시 세포가 풍부한 지질을 사용하여 성장할 수 있도록 한다.

인슐린은 Glucose와 아미노산의 세포 내로 섭취를 촉진하여 세포증식 촉진 효과를 낼 수 있다. 소 혈청이 부족한 배양액 상태에서는 생화학적인 활성도가 급격히 감소하기 때문에 첨가가 필요하다.

트랜스페린은 인슐린과 마찬가지로 소 혈청이 감소된 배양액 상태에서 세포의 성장을 촉진시킨다.

셀레늄은 종양억제 유전자 p53유전자의 활성을 유도, 암세포로 발달할 수 있는 비정상적인 세포가 스스로 사멸하도록 유도하거나 분열하는 과정을 차단한다. 또한 항산화 기능 및 세포막 보호의 역할뿐만 아니라 , 세포의 마이토콘드리아의 생체합성 신호를 촉진시키고 기능적인 역할을 강화함으로써세포의 성장을 촉진시킨다.

에탄올아민(Ethanolamine)은 세포막 인지질의 성분이 된다. 세포의 성장촉진효과가 있다.

비타민 E는 강력한 산화방지역할을 하여 산화 스트레스를 줄여 세포분열을 높인다. 즉 세포성장을 빠르게 하는 작용을 한다.

또한 제2첨가제에는 하이드로코티손(Hydrocortisone)을 포함하여 세포의 유착과 증식을 촉진하는 역할을 하며, T3가 포함되어 혈청이 줄어든 배양액 안에서 Insulin, hydrocortisone과 함께 세포의 성장을 촉진한다.

소혈청이 줄어든 배양액 상태에서, Insulin, Transferrin, Selenium은 중요하게 요구되는 성분이다. 이 필수 성분이 배양액에 첨가가 되었을 시 줄어든 소 혈청으로부터 결핍된 영양분을 대신하여 세포 성장이 촉진된다.

또한 위에서 설명한 첨가제들은 아래에서 설명하는 바와 같이 상호 연관관계에 의해 그 역할이 증대된다.

예컨대 Insulin이 한 가지만 배양액 내에 존재하는 것보다 ethanolamine이 존재할 때 더욱 glucose가 세포 내로 섭취되는 것이 더 활성화된다. 왜냐하면, ethanolamine은 glucose의 운송을 용이하게 하는 역할을 하기 때문이다.

또한 Selenium은 항산화 역할을 하고 Vitamin E와 함께 결합하여 항산화의 역할을 더욱 촉진시킨다. 즉 세포의 스트레스를 효과적으로 줄여 세포의 성장을 돕는다.

지질과 에탄올아민도 상호 작용을 수행한다. 즉, 글라이세롤의 2개의 OH기에 지방산과 인산이 결합한 인지질 (Phospholipid)의 기본구조가 포함되어 있고, 인산기가 ethanolamine과 결합한 phosphatidyl ethanolamine이 있다. 이들은 세포막이나 미토콘드리아 막의 중요성분이 된다.

한편, 본 발명에서 사용하는 제2배양액에는 리유스배양액을 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 리유스배양액은 줄기세포를 배양하는데 사용하였던 배양액, 즉 이미 사용한 배양액을 의미하는 것으로서 이를 농축한 후 제2배양액에 첨가할 수 있다.

줄기세포를 배양하는데 사용된 배양액은 폐기물로 관리되어 처리되어야 하는데, 이 줄기세포 배양액에는 세포배양에 유익한 성분들이 다량 포함되어 있으므로, 이를 직접적으로 또는 농축한 후 첨가제 형태로 재사용할 수 있다.

즉, 줄기세포를 배양하는 과정에서 줄기세포가 자연적으로 분비하는 사이토카인, 각종 성장인자 등이 포함된 배양액은 버리지 않고 농축하여 배양액의 첨가제로 다시 사용하였을 때, 인위적으로 만들어진 첨가제를 배양액에 섞지 않고도 줄기세포가 성장하는데 더욱 효과적일 수 있다는 아이디어를 접목시켰다.

줄기세포가 분비하는 수많은 성장인자들 그리고 단백질 등은 수십 가지가 넘을 것으로 판단된다. 특히, 이들은 자연적인 것이고 자가분비한 인자들이기 때문에 안전하고 효과적인 것이 특징이다. 리유스배양액은 제2배양액에 함유된 영양배지 중량 대비 1~10 중량%의 범위로 첨가된다. 리유스배양액은 본 발명에 따른 제2배양액을 재사용하는 형태가 될 수도 있으며, 또는 일반 배양방법에서 사용하는 배양액이 될 수도 있다. 예컨대, 글루코스를 포함하는 기본배지와, 다양한 첨가제가 포함될 수 있으며, 소 혈청도 포함될 수 있다. 다만 소 혈청이 포함된 리유스배양액에서도, 소 혈청의 비율은 기본배지의 중량 대비 1~5 중량%의 범위로 혼합되어 있는 것이 바람직하다. 특히 리유스배양액은 저산소 조건에서 세포를 배양할 때 사용된 배양액인 것이 더욱 바람직하다.

저산소 상태에서 배양된 지방줄기세포의 배양액에서는 인슐리유사성장인자결합단백질(IGFBP-1) , 대식세포증식자극인자(M-CSF)와 그 수용기, 혈소판유도성장인자베타(IGFBP-β), 혈관내피세포성장인자(VEGF)가 확연히 증가한다.

도 15 및 도 16은 줄기세포 배양을 마친 후의 줄기세포 배양액에서 TGF를 측정한 결과가 나타나 있는 표와 그래프이다. 도 15 및 도 16의 측정 결과에 나타난 바와 같이, 실제 본 연구진에서 개발한 제2배양액의 조건에서도 세포 배양을 종료한 시점에서 배양액에 첨가하지 않았던 TGF가 검출되는 것을 확인하였다. 즉, 줄기세포 배양액에 TGF를 첨가하지 않았음에도 불구하고, 줄기세포 배양이 종료된 시점에서 1~4ng/ml까지 TGF가 검출 되었다. 도 15의 표에서 시료 1~7은 일반 산소 조건과 저산소 조건이 포함되어 있는데, 7번 시료는 저산소 조건에서 배양을 실시한 것인데 저산소 조건에서 배양한 후에 배양액 내에 TGF가 가장 많이 포함되어 있는 것을 확인하였다.

본 연구진에서는 저산소 조건에서 제2배양액을 이용한 계대배양의 효과에 대하여 실험을 수행하였다.

도 18은 계대배양 실험에서 사용한 배지1~4의 조성표이다.

도 18의 표를 참고하면, 배지1~5는 공통적으로 DMEM을 사용하였으며, 배지1,2는 소 혈청이 10~20%로 혼합되었고, 배지3,4는 1~5%로 낮게 혼합되었다. 그리고 배지2~4에서는 본 발명에 따른 제2첨가제가 영양배지 대비 0.33~1.62 중량%로 혼합되었다.

계대배양 실험은 NHJ 및 TIEN으로 표시된 2명의 세포를 사용하여 재현성을 관찰였다. 그리고 저산소 조건과 일반조건에서 각각 다른 배지들을 사용하여 실험을 진행하였다. 계대배양 실험 조건에 대한 표가 도 19에 나타나 있다. 계대배양 실험에서 모든 그룹은 면적당 5000개의 세포를 배양용기에 넣고 4일간 배양하였다.

계대배양 실험결과는 도 20 내지 도 22에 나타나 있다. 도 20은 도 18에 나타난 배지들을 사용한 계대배양 실험의 결과를 나타낸 표이며, 도 21 및 도 22는 각각 TIEN 세포와 NHJ 세포의 그룹별 세포배양 결과를 나타낸 그래프이다.

실험결과를 참고하면, 기존 배양방법 (group 1, control)에 비해 본 연구진에서 개발한 배양액(Group 2,3,4)에서 자란 세포가 hypoxia 조건에서 더 많이 증식한 것을 확인할 수 있다. 생존율은 모든 그룹에서 99% 이상으로 나타났다.

또한, 도 23의 표를 참고하면, 일반 산소 조건(CO₂ Incubator)과 저산소조건(1% O₂)에서 세포모양을 비교 하였을 때 저산소조건의 세포들은 일반조건의 세포보다 세포 사이즈가 작은 것을 관찰 할 수 있었다.

또한, 본 연구진은 리유스배양액을 제2배양액에 첨가하여 저산소 조건에서 계대배양을 실시하였다.

도 24는 리유스배양액을 첨가한 배양액을 사용한 계대배양 실험에서 사용한 배지1~5의 조성표이다.

도 24의 표를 참고하면, 배지1~5는 공통적으로 DMEM을 사용하였으며, 배지1~3은 소 혈청이 10~20%로 혼합되었고, 배지4,5는 소 혈청이 1~5%로 낮게 혼합되었다. 그리고 배지2~5에서는 본 발명에 따른 제2첨가제가 영양배지 대비 0.33~1.62 중량%로 혼합되었다. 무엇보다도 배지2~4에서는 리유스배양액을 영양배지 중량 대비 1~10중량%의 범위로 배지에 혼합하였다. 배지2 및 배지4는 리유스배양액에 소 혈청이 포함되어 있으며, 배지3 및 배지5에는 소 혈청이 포함되어 있지 않다. 그리고 리유스배양액은 모두 줄기세포 배양에 사용된 배양액을 농축한 후 첨가하였다.

리유스배양액을 포함하는 배양액을 사용한 계대배양 실험은 JOO 및 VAN으로 표시된 2명의 세포를 사용하여 재현성을 관찰였다. 그리고 저산소 조건과 일반조건에서 각각 다른 배지들을 사용하여 실험을 진행하였다. 계대배양 실험 조건에 대한 표가 도 25에 나타나 있다.

계대배양 실험결과는 도 26 내지 도 28에 나타나 있다. 도 26은 도 24에 나타난 배지들을 사용한 계대배양 실험의 결과를 나타낸 표이며, 도 27 및 도 28은 각각 JOO 세포와 VAN 세포의 그룹별 세포배양 결과를 나타낸 그래프이다.

리유스배양액을 사용하지 않은 배양액을 이용한 실험결과에서는 저산소 조건에서 본 연구진이 개발한 배양액을 사용하였을 때 세포의 성장이 빠르긴 하였지만, 소혈청이 10%, 5%, 3%로 낮아질수록 성장률의 성장이 두드러지게 나타나지는 않았다. 그러나 본 실험에서와 같이 저산소조건에서 리유스배양액을 배양액에 추가하여 넣어주는 조건에서는 소 혈청 농도가 줄어들수록 더 높은 성장률을 보였다. 그리고 세포의 성장속도는 JOO와 VAN 세포에서 모두 4배 이상으로 획기적으로 증가하였다. 즉, 세포성장에 있어서 위험요소를 많이 내포하고 있으며 비경제적인 소 혈청을 소량만 사용하고, 리유스배양액을 사용함으로써 세포의 성장속도를 증진시킬 수 있다는 결과를 도출하였다.

세포가 성장하면서 분비하는 수많은 사이토카인, 성장인자들로 인해 배양액을 농축하여 첨가제로 사용한 것 고농도의 성장촉진제를 넣어준 것과 같다. 배양액에 결핍되어 있는 성장촉진 물질이 들어감으로 인해 줄기세포의 성장이 촉진된 것이라고 볼 수 있다.

또한 세포의 크기에 있어서도, 도 29의 표에 나타난 바와 같이, 리유스배양액을 사용한 경우에도 본 발명에 따른 배양액과 방법을 사용한 경우가 일반 배양 방법을 사용한 경우에 비하여 작게 유지되는 것을 확인하였다.

본 연구진에 의하여 개발된 초대배양 및 계대배양의 효과를 정리하면 아래와 같다.

초대배양은 본 연구진에서 개발한 제1배양액을 사용하여 저산소 조건에서 배양시 세포의 성장속도를 증진시킬 수 있었다. 또한, 세포의 크기도 작게 유지할 수 있었다.

계대배양은 상기한 바와 같이 사람의 혈청을 이용하여 배양하는데 한계가 있기 때문에 소 혈청을 사용하되, 소혈청 사용은 안정성 문제가 있기 때문에 최대한 사용량을 줄이고자 하는 것을 목표로 하였다. 첫 번째 실험결과 본 연구진에서 개발한 제2배양액에 소혈청을 10%, 5%, 3%로 넣고 배양하였을 때, 저산소 조건에서는 모두 일반배양 방법보다 증식률이 높았다. 그러나 혈청의 농도가 낮아질수록 증식률이 두드러지게 증가하지는 않았다.

이에 추가적으로 세포를 배양하는데 기 사용된 리유스배양액을 농축하여 첨가해 주었을 때 소 혈청의 농도가 낮아져도 증식률이 높아지는 것을 확인하였으며, 더욱이 세포의 증식률을 일반 배양방법에 비하여 4배 이상 높일 수 있었다.

이 결과는 줄기세포가 상업적으로 활용되는 것에 기반이 되고, 현재 질병치료를 위하여 대량생산해야 하는 줄기세포 배양 시스템에 많은 도움을 줄 것으로 사료된다. 더 나아가서 사람에게 적용되어야 하는 줄기세포 배양 시스템에 저농도소혈청을 사용함으로써 안전성을 높여주는 중요한 기반이 된다고 판단된다.

한편, 본 연구진은 초대배양 및 계대배양시 EGF를 제1배양액 및 제2배양액에 처음부터 첨가하지 않고, 배양을 시작한 후 48~72 시간 내에 첨가하는 방법을 제시하였다.

도 30은 EGF의 첨가시기에 따른 영향을 관찰하기 위한 실험조건이 나타나 있는 표이고, 도 31은 도 30에 따른 실험결과가 나타나 있는 그래프이다.

도 30의 표를 참고하면, 배양액 시료들은 모두 DMEM을 기본 배지로 하여 제조되었으며, FGF 단독으로 초기부터 배양액에 첨가한 경우(control), EGF만 단독으로 초기에 첨가한 경우(EGF only), EGF는 초기에 FGF는 2일 후에 첨가한 경우(EGF+2day FGF), FGF와 EGF를 함께 초기에 배양액에 첨가한 경우(FGF+EGF) 및 FGF는 초기에 EGF는 2일 후에 첨가한 경우(FGF+2day EGF)로 나누어 실험하였다.

도 31의 그래프를 참고하면, JOO와 VAN 세포에서 모두 EGF를 2일 후에 첨가한 케이스에서 배양속도가 가장 빠르게 나타나는 것을 확인하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서는 초대배양에서 인체로부터 혈장 및 혈소판 풍부 혈장을 분리하여 가시광선을 조사하는 전처리를 수행하며, 독특한 조성과 배합비를 가지는 제1첨가제를 혼합하여 제1배양액을 조성한다. 세포를 제1배양액에 접종하여 저산소 조건에서 배양함으로써 세포의 성장속도를 증진시키고 세포의 크기를 작게 유지할 수 있다.

그리고 계대배양에서는 위험성이 상존하는 소 혈청을 최소한으로 유지한 채 제2첨가제를 혼합하고, 바람직하게는 리유스배양액을 혼합하여 제2배양액을 조성함으로써 세포의 배양속도를 증대시키고 세포의 크기를 유지할 수 있다.

즉 본 발명에 따른 배양방법을 이용하여 초대배양 및 계대배양을 연속적으로 수행하는 경우, 일반 배양방법에 비하여 적어도 4배 이상으로 세포의 성장속도를 증진시킬 수 있어 줄기세포를 대량 배양 가능하다. 이를 통해 줄기세포의 산업적 이용이 활발하게 이루어질 수 있는 계기가 마련될 것으로 기대된다. 더욱이 세포의 크기를 작게 유지할 수 있으므로 줄기세포를 치료의 목적이나 미용의 목적으로 사용하는 경우에 있어서 보다 안전하고 효율적인 사용이 가능할 것으로 기대된다.

참고로 도면의 도표에 나타난 E+06, E+07과 같이 E+아라비아숫자 표시에서 E는 10을 의미하고, 아라비아 숫자는 몇 승을 의미한다. 즉 E+06은 10⁶을 E+07은 10⁷을 의미한다.

본 발명은 첨부된 도면에 도시된 일 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 보호 범위는 첨부된 청구 범위에 의해서만 정해져야 할 것이다.

Claims (9)

1. 인체의 지방조직으로부터 분리된 지방유래 줄기세포를 대기 조건보다 산소 함량이 낮은 저산소(hypoxia) 조건에서 계대배양 하기 위한 방법으로서,
   글루코스를 포함하는 액상의 영양배지와, 상기 영양배지 중량 대비 1~5 중량%의 비율로 혼합되는 소 혈청 및 초대배양 또는 계대배양에서 이미 줄기세포의 배양액으로 사용되었던 리유스배양액을 포함하여 이루어지는 제2배양액에 초대배양을 거쳐 배양된 줄기세포를 접종하여 배양하며,
   상기 리유스배양액은 상기 제2배양액에 함유된 상기 영양배지 중량 대비 1~10 중량%의 범위로 상기 제2배양액에 포함되는 것을 특징으로 하는 지방유래 줄기세포 계대배양방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 리유스배양액은 글루코스를 포함하는 기본배지를 포함하며, 상기 기본배지 중량 대비 1~5 중량%의 비율로 소 혈청이 혼합되는 것을 특징으로 하는 지방유래 줄기세포 계대배양방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 리유스배양액은 저산소 조건에서 줄기세포를 배양하는데 사용한 배양액인 것을 특징으로 하는 지방유래 줄기세포 계대배양방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 제2배양액은 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄을 포함하는 제2첨가제를 더 포함하며, 상기 제2첨가제는 상기 영양배지 중량 대비 0.3~1.7 중량%의 비율로 상기 제2배양액에 혼합되는 것을 특징으로 하는 지방유래 줄기세포 계대배양방법.
6. 삭제
7. 제5항에 있어서,
   상기 제2첨가제는 에탄올아민 및 비타민E를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 지방유래 줄기세포 계대배양방법.
8. 제1항에 있어서,
   상기 계대배양을 시작한 후 48~72 시간 내에 EGF(Epidermal Growth Factor)를 상기 제2배양액에 첨가하는 것을 특징으로 하는 지방유래 줄기세포 계대배양방법.
9. 제1항에 있어서,
   상기 줄기세포는 초대배양을 거쳐서 배양된 것으로서,
   상기 초대배양에서 인체로부터 분리되며 자외선을 조사하는 전처리 과정을 거친 혈장과 혈소판 풍부 혈장을 혼합한 배양액에서 배양된 줄기세포인 것을 특징으로 하는 지방유래 줄기세포 계대배양방법.

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