KR101126618B1

KR101126618B1 - 비타민 ｄ를 유효성분으로 포함하는 지방 줄기세포의 발모능 증진용 조성물

Info

Publication number: KR101126618B1
Application number: KR1020090105129A
Authority: KR
Inventors: 조대호; 방사익; 정민경; 박유림; 송지혜; 박정민
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단; 숙명여자대학교산학협력단; 일양약품주식회사
Priority date: 2009-11-02
Filing date: 2009-11-02
Publication date: 2012-03-26
Also published as: KR20110048363A

Abstract

본 발명은 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비타민 D로 활성화된 지방 줄기세포를 포함하는 발모 촉진용 조성물, 상기 지방 줄기세포를 포함하는 탈모 또는 무모증의 예방 및 치료용 조성물 및 지방 줄기세포의 발모능 증진 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 지방 줄기세포는 비타민 D에 의해서 발모능이 향상되어 더 우수한 발모 효과를 나타내게 된다. 따라서 본 발명의 조성물 및 발모능 증진방법은 발모가 필요한 경우나 탈모/무모증의 예방 및 치료를 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

지방 줄기세포, 발모, 탈모, 무모증

Description

비타민 Ｄ를 유효성분으로 포함하는 지방 줄기세포의 발모능 증진용 조성물{Composition for enhancing the action for hair growth of adipose stem cell comprising vitamin D as an active ingredient}

본 발명은 지방 줄기세포의 발모능 증진을 위한 비타민 D의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비타민 D를 유효성분으로 포함하는 지방 줄기세포의 발모능 증진용 조성물, 비타민 D를 포함하는 배지에서 지방 줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 지방 줄기세포의 발모능 증진 방법 및 상기 방법에 의한 지방 줄기세포를 포함하는 발모 촉진용 조성물 및 탈모 또는 무모증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 인체의 모발은 약 10만 ~ 15만개 정도이며 각각의 모발은 서로 다른 주기를 가지며 성장기 (활발한 모발성장), 퇴행기(과도기), 휴지기(새로 성장하기 전에 모간이 빠지는 정지시기)를 통해 성장한다. 이러한 주기는 3 ~ 6년에 걸쳐 반복되는데, 두피상의 모발의 약 88%는 성장기에 속하고 약 1%만이 퇴행기에 속 하며 나머지는 휴지기에 속한다. 탈모가 진행될수록 급격히 높은 비율의 모발이 휴지기에 속하게 되고, 이에 상응하여 활발한 성장기에 속하는 모발의 비율은 더 낮아진다.

탈모는 나이가 들면서 남성과 여성에 나타나는 두피 탈모가 특징인 안드로겐성 탈모(AGA)가 일반적이다. 다른 탈모로는 미시적 염증성으로 보통 복원이 가능하고 국부적 탈모증이라고 지칭되는 원형 탈모증(AA) 및 화학요법 또는 방사선 치료와 관련된 탈모증(2차 탈모증)이 있다.

일반적으로 탈모 현상은 여성보다는 남성에게서 월등하게 그 발생빈도가 높다. 모발이 잘 빠지거나 거칠며 영양이 없는 원인은 아직 과학적으로 명확하게 구명되지는 않았지만, 이는 유전적 소인이 가장 큰 것으로 알려져 있고, 그 밖에 내분비계의 장애, 자율신경계의 이상, 알레르기, 모근의 영양결핍, 세균 감염, 노화 등의 원인으로 추정되고 있다. 최근에 현대인들은 환경오염과 같은 외부 환경적 요인과, 과다한 정신적인 스트레스 등으로 인해여 탈모증의 발생비율이 높아지는 추세다.

현재, 이러한 탈모치료를 위해서 현재 가장 많이 쓰이고 있는 방법은 자기 자신의 머리털을 이용하여 이식하는 자가모발이식(자기모발이식)이며, 두피에 충분한 혈액을 순환시키기 위한 혈관 확장제(염화카프로니움, 미녹시딜 및 각종 식물의 추출물 등)나 모유두(毛乳頭)에 부착하여 모발을 탈락시키는 남성 호르몬의 작용을 억제하기위한 호르몬제(에스트로겐, 에스트라지올, 프로게스테론 등의 여성 호르몬제) 또는 남성 호르몬 활성화 억제제(펜타데칸산, 휘나스테리드)등을 이용한 약물치료가 널리 시술되고 있다. 그 중 미국의 식품의약국(FDA)로부터 탈모치료제로 허가를 받은 약물은 두 종류(미녹시딜 및 프로페시아)로서 바르는 치료제인 미녹시딜은 혈관 확장작용에 의해, 경구용인 프로페시아는 피나스테라이드를 주제로 한 남성 호르몬의 활성화 억제작용에 의해 탈모방지 효과가 우수한 제제로 많이 이용되고 있다. 하지만, 약물치료의 효과는 투여할 당시에는 그 발모효능이 나타나지만 치료가 중단되면 탈모가 다시 진행되며, 미녹시딜의 경우에는 성기능 장애 등의 부작용이 단점으로 알려져 있다 (Bouhanna, P., Dermatol Surg., 29:1130, 2003; Thiboutot, D., Arch Dermatol., 135:1417, 1999; Messenger, A.G. and Rundegren J., Br J Dermatol., 150:186, 2004). 아울러, 발모 효과를 나타낸다고 보고되어 있는 화합물 또는 천연물들은 그 효과가 미약하거나 전혀 없고, 과학적 혹은 의학적으로도 검증되지 않은 것이 많아 오히려 문제를 일으킬 소지가 있는 것들도 많다.

최근, 분자생물학적 기법이 발전함에 따라서, 탈모와 관련된 유전자를 모낭에 전달하거나 유전자 발현을 차단하는 방법으로 시술되는 유전자 치료나 줄기세포를 이용한 탈모치료가 새롭게 부각되고 있다. 하지만, 유전자 치료는 치료의 효능성, 치료비용, 안정성 등에 대해 불확실하고, 치료법이 안전하게 현실화되기까지는 상당한 기간이 걸릴 수 있다는 단점 때문에 임상적용이 용이하지 않은 단점이 있다.

아울러, 줄기세포를 이용한 방법은 줄기세포가 가지고 있는 다분화능을 이용하여, 탈모 또는 무모의 증상을 나타내는 곳에 줄기세포를 주입하여 모낭세포로 분화하도록 유도하는 과정으로 시술되는 방법으로, 지방(fat) 및 지방세포(Adipocyte)가 지방세포형성 및 모포(hair follicle) 형성이 밀접한 관계로 발모에 효과를 보이며, 최근, 지방 줄기 세포(Adipose stem cell)의 주입이 보다 효과적이라고 보고된 바가 있다(Am. J. Anat. 161:85-100, 1981). 하지만, 줄기세포 사용하여 발모효과를 유도하기 위해서는 많은 양의 줄기세포가 필요하지만 아직까지 조직에서 분리한 줄기세포를 임상에 적용할 수 있을 정도로 충분한 양을 얻을 수 있는 배양기술이 미미하여, 실제로 임상에 적용하기에는 어려운 실정이다.

이에 본 발명자들은 지방 줄기세포를 이용하여 발모를 촉진하고, 탈모를 예방 및 치료하기 위한 효과적은 방법을 개발하고자 연구한 결과, 비타민 D를 포함하는 배지에서 배양하여 비타민 D로 활성화된 지방 줄기세포를 이용하는 경우 지방 줄기세포에 비해서 우수한 발모효과를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 지방 줄기세포의 발모능 증진을 위한 비타민 D의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비타민 D를 유효성분으로 포함하는 지방 줄기세포의 발모능 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비타민 D를 포함하는 배지에서 지방 줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 지방 줄기세포의 발모능 증진 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해서 발모능이 증진된 지방 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해서 발모능이 증진된 지방 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 탈모 또는 무모증의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 비타민 D를 포함하는 배지에서 배양되어 비타민 D에 의해서 활성화된 지방 줄기세포가 보다 우수한 발모 촉진 효과를 보인다는 점에 착안하여 비타민 D를 유효성분으로 포함하는 지방 줄기세포의 발모능 증진용 조성물, 비타민 D를 포함하는 배지에서 지방 줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 지방 줄기세포의 발모능 증진 방법 및 상기 방법에 의한 지방 줄기세포를 포함하는 탈모 또는 무모증의 예방 및 치료용 조성물 및 발모 촉진용 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 지방 줄기세포(지방유래 줄기세포)는 개체의 지방조직에서 얻을 수 있는 성체줄기세포(Adult stem cells)를 말한다. 이러한 지방 줄기세포는 지방세포는 물론 근육세포, 연골세포, 뼈세포 등 다양한 종류의 세포로 분화될 수 있는 능력을 가진 다분화능력세포(Multipotent stem cell)이며, 스스로 증식할 수 있는 능력이 있다. 본 발명에서의 지방 줄기세포는 이에 한정되지는 않으나, 주로 인간의 피하지방조직에서부터 지방흡입(liposuction) 방법으로 수득할 수 있으며, 바람직하게는 자신의 피하지방조직에서 수득한 자가 지방 줄기세포일 수 있다.

상기에서 지방흡입 방법은 주사기를 이용하여 몸에서 지방을 채취하는 것으로 일반적으로, 복부나 둔부의 피하 지방조직에서 미세도관을 이용해 지방을 흡입한 후 이를 원심분리를 하여 정제하는 방법을 말한다. 이러한 방법을 통하여 비교 적 많은 양의 세포를 추출할 수도 있으나, 충분히 지방세포로 분화되지 않은 세포는 이식 후 발모와 관련된 지방세포 등으로의 분화를 확신할 수 없으며, 완전히 성숙한 지방세포는 세포수집 과정에서 손실되거나 이식 후 생착율이 떨어지는 등 효율이 낮고, 대부분의 경우 발모 촉진이나 탈모 예방/치료에 활용하기에는 충분하지 않은 양으로 추출되므로 본 발명에서와 같이 발모능을 높이는 경우 큰 의미가 있다.

발모능을 높이기 위하여 처리되는 비타민 D는 10^-8 내지 10^-4M의 농도로 처리되는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 10^-7 내지 10^-4M의 농도로, 가장 바람직하게는 10^-7 내지 10^-5M의 농도로 처리될 수 있다. 이는 지방 줄기세포의 배양시 비타민 D를 추가로 넣은 배지에서 3 내지 36시간동안 배양하는 것에 의해서 수행될 수 있다. 즉, 비타민 D를 포함하는 배지에 지방 줄기세포를 접종하고 3 내지 36시간동안 배양하는 것에 의해서 수행될 수 있다.

비타민 D는 골격 형성에 필요한 칼슘을 대장과 콩팥에서 흡수시키는 데 기여하며, 부갑상선에서 생산되는 파라트호르몬(Parathormone) 과 칼키토닌(Calcitonin)과 협동으로 칼슘을 알맞게 골수로 운반하여 뼈대가 제모양으로 크도록 하는데 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 화학적 구조로 볼 때 비타민 D2(Ergocalciferol])와 D3(Cholecalciferol)로 구분하며, 피부에서 7-디하이드 로코르스테린(7-Dehydrochorsterin)이 태양의 자외선을 받아 형성된다. 본 발명의 비타민 D는 비타민 D2 및 비타민 D3를 모두 포함하며, 이를 처리하는 경우 지방 줄기세포의 발모능이 증진됨이 확인되었다.

본 발명에서 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James et al., Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions)에 개시되어 있다. 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양을 배양방법에 따라 회분식과 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다.

배양에 사용되는 배지는 지방 줄기세포의 배양 요구조건을 적절하게 만족시켜야 하다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원, 미량원소 성분 및 성장인자 등을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예로는, 포도당, 자당, 유당, 과당(fructose), 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예로는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 적절한 방식으로 첨가하여, pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 바람직하게 본 발명에서 배양 배지는 동물세포 배양 기술분야에서 통상적으로 사용되는 배지를 사용할 수 있으며, 상업적으로 입수가능한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), DMEM-F12, MEM(Minimum Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), α-MEM, RPMI 1640 배지 등을 사용할 수 있으며, 상기 배지를 기본으로 사용하여 상기한 바와 같이 비타민 D를 추가로 첨가한 것을 사용할 수 있다. 아울러, 필요시 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이나 성장인자 또는 분화관련 인자를 추가로 포함할 수 있으며, 줄기세포 배양을 위해 통상적으로 사용되는 항생제, 예를 들어, 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 카나마이신(kanamycin), 암피실린(ampicillin) 또는 암포테리신 B(amphotericin B) 등과 같은 항생제를 단독으로 또는 혼합하여 첨가할 수 있다. 배양시에는 통상의 동물세포의 배양조건에서와 같이 일정농도(예를 들어 5%)의 CO₂를 유지시킬 수 있다. 배양시의 온도는 보통 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃를 유지할 수 있다.

배양 종료 후에 배양액과 지방 줄기세포를 분리하기 위해 원심분리(centrifugation) 또는 여과(filtration)과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 비타민 D에 의한 지방 줄기세포의 활성화를 확인하기 위하여 비타민 D 처리 후 발모 억제 관련 인자인 인터페론 감마의 발현율을 확인하였다. 그 결과, 비타민 D2 또는 비타민 D3의 처리에 의하여 인터페론 감마의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 비타민 D가 활성화된 지방 줄기세포의 안전성을 확인하기 위하여 지방 줄기세포의 이식에 따른 면역반응 유발 정도를 확인하였다. 그 결과, 이식한 마우스의 비장이 대조군과 차이가 없어 안전성에 문제점이 없음을 알 수 있었다.

본 발명의 또다른 실시예에서는 털이 제거된 마우스의 등 부위에 비타민 D가 활성화된 지방 줄기세포를 이식하여 모발 생성 효과를 확인하였다. 대조군으로 생리식염수만 주입한 그룹 및 비타민 D로 활성화되지 않은 지방 줄기세포를 이식한 그룹을 사용하여 비교하였다. 그 결과, 비타민 D로 활성화된 지방 줄기세포를 이식한 그룹이 대조군에 비하여 모발이 더 빠르고 풍부하게 생성되어 더 우수한 모발 증식 효과가 있음을 알 수 있었다. 특히, 비타민 D의 활성화로 지방 줄기세포의 발모능이 더 높아짐을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 비타민 D로 활성화된 지방 줄기세포를 포함하는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 발모 촉진은 탈모된 부위 또는 털이 없는 부위(무모 부위)에 모낭을 형성하여 털이 나도록 유도하는 것을 말한다.

본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 방법에 의해서 발모능이 증진된 지방 줄기세포를 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.

본 발명의 발모용 조성물은 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구적으로 투여할 수 있다. 더 바람직하게는 경피 투여 또는 피하 내에 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 비경구 투여용 제제 로 제형화 할 수 있으며, 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 지방 줄기세포의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 탈모 상태에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으며, 그 유효 투여량은 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 발모 촉진용 조성물에 함유된 지방 줄기세포는 체내에 투여된 후 지방세포로 분화하여 모낭세포가 발모 기능을 원활하게 수행하도록 간접적 역할을 수행하여 발모가 촉진될 수도 있으며, 모낭세포 자체로 분화하여 발모에 직접적으로 관여할 수도 있다.

한편, 본 발명은 비타민 D로 활성화된 지방 줄기세포를 포함하는 탈모 또는 무모증 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 부위는 두피 뿐만 아니라 발모를 필요로 하는 신체 부위라면 어디나 적용할 수 있다. 예를 들면, 외상으로 인한 흉터로 모발 또는 털이 손상된 부위 또는 단순 미용효과를 목적으로 하는 넓은 이마 또는 M형 이마, 속눈썹 또는 눈썹 및 무모증의 상태 호전에도 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에서 비타민 D의 처리로 인해 지방 줄기세포의 발모능이 향상되므로 본 발명은 비타민 D를 포함하는 배지에서 지방 줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 지방 줄기세포의 발모능 증진 방법을 제공한다.

참고로, 본 발명에서 언급한 뉴클레오타이드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 지방 줄기세포는 비타민 D에 의해서 발모능이 향상되어 더 우수한 발모 효과를 나타내게 된다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 발모능 증진방법은 발모가 필요한 경우나 탈모/무모증의 예방 및 치료를 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

비타민 D 처리에 의한 지방 줄기세포의 활성화 및 이의 확인

<1-1> 지방 줄기세포의 배양

지방세포로 분화가 가능한 마우스 3T3-L1 세포주를 이용하여 실험을 하였으며, 실험에 사용된 세포의 배양은 37℃, 5% CO2로 설정된 항온항습기에서 10% FBS를 함유된 DMEM 배지에서 배양하였으며, 주 1회 트립신을 처리하여 계대배양을 하였다.

비타민 D의 처리를 위하여 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 세포를 키우다가 컨플루언시(confluency)가 70% 정도가 되었을 때, 비타민 D를 첨가하고 일정시간동안 배양 후에 세포를 수득하였다.

<1-2> 비타민 D3에 의한 지방줄기세포의 활성화 유도 및 확인

비타민 D3 처리에 의하여 지방줄기세포의 활성화 유도를 확인해 보기 위해서 RT-PCR 실험을 시행하였다. 지방줄기세포에 비타민 D3(10^-7 M)를 시간별로, 0, 3, 6, 12시간 동안 처리한 후, 인터페론 감마(interferon gamma) mRNA 양(level)을 살펴보았다.

그 결과, 도 1에서 보듯이, 하우스키핑 유전자(house keeping gene)인 베타-액틴(beta actin)은 거의 동일하게 발현되지만, 발모 억제 관련 인자인 인터페론 감마(Br J Dermatol. 2005 Apr;152(4):623-31)의 발현율은 비타민 D3 처리에 의하여 감소되는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과로 비타민 D3(10^-7 M) 처리에 의해, 지방줄기세포가 발모촉진 형태로 활성화 되는 것을 확인할 수 있었다.

<1-3> 비타민 D2에 의한 지방줄기세포의 활성화 유도 및 확인

비타민 D2 처리에 의하여 지방줄기세포의 활성화 유도를 확인해 보기 위해서 RT-PCR 실험을 시행하였다. 지방줄기세포에 비타민 D2를 10^-7,10^-6,10^-5,10^-4M의 농도별로, 12시간 동안 처리한 후, 인터페론 감마(interferon gamma) mRNA 양(level)을 살펴보았다.

그 결과, 도 2에서 보듯이, 하우스키핑 유전자(house keeping gene)인 베타-액틴(beta actin)은 거의 동일하게 발현되지만, 발모 억제 관련 인자인 인터페론 감마(Br J Dermatol. 2005 Apr;152(4):623-31)의 발현율은 비타민 D2 처리에 의하여 감소되는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과로 비타민 D2 처리에 의해, 지방줄기세포가 발모촉진 형태로 활성화 되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 2>

지방 줄기세포 및 비타민 D3로 처리된 지방 줄기세포의 안전성 확인

모발 생장 촉진시 사용되는 지방 줄기 세포 및 비타민 D3 처리의 안전성을 확인하기 위하여 지방세포의 주입에 따른 면역반응 유발 정도를 다음과 같이 알아보았다.

10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 배양한 지방 줄기세포를 비타민 D3(10^-7 M) 처리를 한 군 및 처리 하지 않은 군으로 나누어 배양한 후, 배양배지를 확실히 제거한 다음, 각각의 지방 줄기 세포 (1.5 x 10⁷ / 200 μl)를 C57BL6 마우스(8주령, (주)오리엔트 바이오)의 피하(등부위)에 이식하였다. 음성대조군으로 같은 부피의 생리식염수를 주입한 군을 사용하였다. 이식된 마우스는 공조시스템하에서 22ㅁ2ㅀC의 조건으로 30일간 사육한 후 비장을 적출하여 그 크기를 비교하였다. 면역 거부 반응 발생 시, 림프구와 같은 면역세포의 생성 및 활성이 증대 되고, 이들의 생성과 밀접한 관련이 있는 비장의 크기 비대해지게 된다. 따라서 면역거부반응의 정도를 비장의 크기를 비교함으로써 살펴볼 수 있다.

그 결과, 도 3에서 보듯이 생리식염수만 넣어준 마우스와 비타민 D3 처리 또는 미처리한 지방 줄기 세포를 넣어준 마우스에 대해서 각각 비장의 크기가 거의 같음을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 지방 줄기 세포를 사용하여도 지방 줄기 세포에 의한 면역 거부반응 유도가 없어 안전성에 별다른 문제가 없음을 알 수 있었다.

<실시예 3>

비타민 D3로 활성화된 지방 줄기세포의 효과 확인

본 발명의 비타민 D3로 활성화된 지방 줄기세포의 이식시의 모발생장효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 수행하였다. C57BL6 마우스(8주령)의 등 부위의 털을 제거한 후, 음성 대조군으로 생리식염수(200 μl) 단독 주입군, 지방 줄기세포(1.5 x 10⁷ / 200 μl)를 이식한 군 및 비타민 D3(10^-7 M)로 활성화한(비타민 D3를 포함하는 배지에서 24시간 동안 배양) 지방 줄기세포(1.5 x 10⁷ / 200 μl)를 이식한 군으로 나누어 각각 마우스 피하에 이식하였다. 이식된 마우스는 공조시스템하에서 22ㅁ2ㅀC의 조건으로 15일간 사육한 후 마우스 등쪽 모발 생성 정도를 살펴보았다.

그 결과, 도 4 및 도 5에서 보듯이, 지방 줄기 세포를 주입한 부분을 중심으로 모발이 생성됨을 확인할 수 있었으며, 본 발명에서의 비타민 D3로 처리된 지방 줄기세포의 발모능이 아무런 처리가 없는 지방 줄기세포의 발모능에 비해서 훨씬 우수함을 알 수 있었다.

발모 스코어(score)를 측정한 것에 대해서도 음성대조군인 생리식염수를 투여한 군 및 지방 줄기세포만을 이식한 군에 비해 비타민 D3로 활성화한 지방 줄기세포를 이식한 군의 발모 스코어가 높아, 본 발명에서의 비타민 D3로 처리된 지방 줄기세포의 발모능이 아무런 처리가 없는 지방 줄기세포의 발모능에 비해서 훨씬 우수함을 알 수 있었다. 이 때, 발모 스코어 평가는 훈련된 3인의 평가결과를 평균하였으며, 그 기준은 다음과 같다: 0점: 검은색 20% 미만, 1점: 검은색 50% 미만, 육안으로 털 보이지 않음, 2점: 검은색 50% 이상, 육안으로 털 보이지 않음, 3점: 검은색 50% 이상, 짧은 털 보임, 4점: 검은색 70% 이상, 털이 길어지는 현상 관찰, 5점: 검은색 90% 이상, 제모부위와 제모하지 않은 부위의 구별이 되지 않음.

따라서, 비타민 D3의 처리로 인해서 지방 줄기세포가 활성화되어 지방 줄기세포가 가지는 발모능이 한층 더 향상됨을 알 수 있었다.

도 1은 비타민 D3로 처리된 지방줄기세포에서의 인터페론 감마(IFN-γ) mRNA 발현율을 확인함으로써, 지방줄기세포의 활성화를 확인한 것이다.

도 2는 비타민 D2로 처리된 지방줄기세포에서의 인터페론 감마(IFN-γ) mRNA 발현율을 확인함으로써, 지방줄기세포의 활성화를 확인한 것이다.

도 3은 지방 줄기세포 및 비타민 D3로 처리된 지방 줄기세포의 체내 안전성을 확인한 것이다.(A: 생리식염수 주입군, B : 지방 줄기 세포 단독 이식군, C: 비타민 D3 처리 지방 줄기세포 이식군)

도 4는 비타민 D3로 처리된 지방 줄기세포의 발모능을 확인한 것이다. (A: 생리식염수 주입 직후 , B: 지방 줄기세포 단독 이식 직후, C: 비타민 D3 처리 지방 줄기세포 이식 직후, D: 생리식염수 주입 15일후 , E: 지방 줄기 세포 단독 이식 15일후, F: 비타민 D3 처리 지방 줄기세포 이식 15일후)

도 5는 비타민 D3로 처리된 지방 줄기세포의 발모능을 제시된 기준에 의해 스코어링(scoring)을 나타낸 것이다. 이는 지방줄기세포 이식 직후와 이식 15일 후의 것을 데이터화 확인한 것이다

Claims

비타민 D를 유효성분으로 포함하는 지방 줄기세포의 발모능 증진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 비타민 D는 비타민 D2 또는 비타민 D3인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지방 줄기세포는 자가 지방 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
비타민 D를 포함하는 배지에서 지방 줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 지방 줄기세포의 발모능 증진 방법.
제4항에 있어서, 상기 배양은 비타민 D를 포함하는 배지에 지방 줄기세포를 접종하고 3시간 내지 36시간동안 배양하는 것임을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 비타민 D는 10^-8 내지 10^-4M의 농도로 배지에 포함되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 발모능이 증진된 지방 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 약학적 조성물.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 발모능이 증진된 지방 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 탈모 또는 무모증의 예방 및 치료용 약학적 조성물.