KR101178032B1

KR101178032B1 - 지방줄기세포 파쇄 추출액을 이용한 모발증식제재 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101178032B1
Application number: KR1020120042498A
Authority: KR
Inventors: 김영실; 추동원
Original assignee: 주식회사 티아라줄기세포연구소
Priority date: 2012-04-24
Filing date: 2012-04-24
Publication date: 2012-08-29

Abstract

본 발명은 모발증식제재 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 지방줄기세포를 파쇄하여 수득한 파쇄 추출물을 사용하는 모발증식제재 및 그 제조방법에 관한것이다.
본 발명의 줄기세포 파쇄 추출액은 재생 효과가 뛰어나 휴지기나 퇴행기의 모세포를 성장기의 모세포로 활성화하여 탈모방지 및 발모의 효과를 나타낸다. 본 발명의 조성물은 줄기세포가 아닌 줄기세포의 파쇄 추출액을 사용하는 것으로서 줄기세포를 직접 사용하여 나타날 수 있는 법적, 윤리적, 인체 내 주입 면역거부반응, 항생제와 소혈청 등의 부작용을 방지할 수 있다.

Description

지방줄기세포 파쇄 추출액을 이용한 모발증식제재 및 이의 제조방법{Hair grwoth material and product using fat stem cell disruped extract and manufacturing method of it}

본 발명은 모발증식제제 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 지방줄기세포를 파쇄하여 수득한 파쇄 추출물을 사용하는 모발증식제제 및 그 제조방법에 관한것이다.

모발은 모발이 성장하는 성장기(anagen), 성장이 멈추고 모구부가 축소되면서 대사과정이 늦어지는 퇴행기(catagen), 모낭이 수축되면서 모근이 위쪽으로 밀려 올라가 모발이 빠지게 되는 휴지기(telogen)로 구분되며, 같은 장소에서 새로운 모발이 생성됨으로 인해 오래된 모발이 탈락하고 성장기로 전환되는 모주기(hair cycle)를 가지고 일생동안 성장과 탈락을 반복한다.

인체의 두피에는 약 10만개의 모발이 있으며, 정상적으로 있어야 할 부분의 모발이 결여되거나 그 수가 감소하면서 발생하는 상태를 탈모라 한다. 이러한 탈모는 여러가지 원인에 의해 발생하며, 유전적인 요인외에 스트레스, 공해, 계절변화, 질병, 화학적인 시술 등의 요인들에 의해 상태가 변화되고 있다.

줄기세포는 미분화 상태로 자가 증식하고 다른 조직의 세포로 다중 분화될 수 있는 세포이다. 우리 몸의 많은 조직에서 존재한다는 것이 밝혀졌으며, 배아줄기세포와 성체줄기세포로 나눌 수 있다. 성체줄기세포가 배아줄기세포에 비해 쉽게 구할 수 있어 이를 이용한 많은 연구가 진행되고 있다. 성체줄기세포 중 가장 먼저 알려진 것이 골수유래 줄기세포이며, 가장 많은 연구가 진행되고 있다. 이후 탯줄 혈액뿐 아니라 말초혈액, 태반, 피부, 신경조직, 지방, 근육 등 우리 몸 어느 곳에서나 성체 줄기세포가 존재하고 있음이 밝혀졌다. 가장 많은 연구가 진행된 골수유래 줄기세포의 경우 줄기세포를 채취하기 위한 시술 시 고통이 따르고 이환율이 있으며, 낮은 수의 세포수득률로 인해 임상적 응용에 있어 많은 한계점을 나타내어, 상기의 다른 조직에서 줄기세포를 추출하여 임상적으로 응용하고자 하는 많은 연구가 진행되고 있다. 그러나 줄기세포 자체를 치료제로 사용하기 위해서는 자가면역거부반응으로 인해 자가줄기세포만을 사용해야 하며, 불특정 다수를 대상으로 사용하기에는 어려움이 많다. 이러한 어려움을 극복하고자 대안으로 줄기세포 배양액을 사용하지만 이 또한 배양시 배지에 첨가하는 소혈청과 항생제 등 기타 첨가제들의 안전성에 대해 많은 논란이 있다.

본 발명은 지방줄기세포의 파쇄 추출액을 이용한 모발증식제재와 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의한 모발증식제재는 지방줄기세포 파쇄 추출액을 이용하여 사용되는 구성을 가진다. 지방줄기세포 파쇄 추출액은 초음파파쇄기, 또는 French press, bead millimg, 줄기세포 세포막을 파괴하는 시약 등 을 이용하여 줄기세포를 파쇄하여 원심분리하여 그 추출액을 얻는 것으로 구성된다.

또한 본 발명은 줄기세포 파쇄 추출액을 유효성분으로 하는 모발증식제재 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의한 모발증식제제 및 이의 제조방법은 지방줄기세포 파쇄 추출액을 사용하는 것으로 구성되며, 지방줄기세포 파쇄 추출액은 줄기세포를 배양한 후 수거하여 초음파 파쇄기 및 프렌치프레스(French press), 비드밀링(bead miling), 세포막을 파괴하는 시약 등을 이용하여 파쇄하는 방법으로 구성된다.

이렇게 파쇄된 지방줄기세포 파쇄 추출액은 줄기세포가 가지는 고유성분 농축액 만을 분리한 것으로 각종 조직의 재생하는 효과가 뛰어나 휴지기나 퇴행기의 모발을 성장기의 모발로 활성화하여 탈모방지 및 발모의 효과를 나타낼 수 있다.

특히 본 발명의 조성물은 줄기세포가 아닌 줄기세포의 파쇄 추출액을 사용함으로써 줄기세포를 직접 사용하였을때 나타날 수 있는 법적 문제나 윤리적인 문제점으로부터 자유로우며, 개인의 특이성 예를 들어, 인체내 면역거부반응 등에 의한 제한이 발생하지 않는 효과를 기대할 수 있게 된다. 또한 항생제와 소혈청 등의 첨가제가 포함되어 있지 않음으로서 이로 인해 나타날 수 있는 부작용을 방지할 수 있다.

도 1은 초음파파쇄기를 이용하여 줄기세포를 파쇄한 사진이다.
도 2는 지방줄기세포 추출액을 이용하여 탈모를 치료한 두피경사진이다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명하도록 한다.

본 발명의 모발증식제재는 지방줄기세포 파쇄 추출액을 사용하여 구성되며, 지방줄기세포 파쇄 추출액은 지방에서 줄기세포를 분리한 뒤, 배양한 후 세포를 떼어내어 수득한 뒤, 세포를 파쇄함으로써 얻게되는 지방줄기세포가 가지는 고유성분 농축액을 말한다.

상기 파쇄 추출액을 얻기 위한 줄기세포는 성체줄기세포를 말하며, 성형외과나 피부과 등에서 지방흡입술 등을 시행하고 부수적으로 얻어지는 지방에서 줄기세포를 분리하게 된다. 이때 지방은 무균상태로 수집하여 분리하며, 투메센트 용액과 혈액 등 불순물을 제거하고 순수한 지방조직만을 분리하여 그 지방에서 줄기세포를 분리하게 된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a)지방에서 줄기세포를 분리하는 단계; (b)분리한 지방줄기세포를 배양하는 단계; (c)지방줄기세포를 파쇄하여 파쇄 추출액을 분리하는 단계;로 구성되며 각 단계의 제조방법을 제공한다.

상기 (a)단계는 성형외과나 피부과 등에서 지방흡입술 등을 통해 수득한 지방에서 지방줄기세포를 분리하는 단계로 흡입된 지방조직을 원심분리하여 순수한 지방조직만을 수득한다. 이때 수득한 지방조직은 생리식염수 등으로 세척한 후, 콜라게나아제(SIGMA, SERVA)를 생리식염수와 혼합하여 만든 콜라게나아제 용액을 1:1로 지방조직과 혼합한다. 이렇게 혼합된 지방조직을 37℃에서 20-30분간 효소처리한 후 600G-1000G 3-6분간 원심분리하여 오일층과 지방층, 지방줄기세포층으로 층 분리한다. 상기 지방줄기세포는 펠렛(pelet)의 형태로 형성된다. 이때 콜라게나아제는 SIGMA를 통상적으로 사용하나 무독성인 SERVA를 사용할 수도 있다. SIGMA를 사용하였을 경우에는 독성 중화과정을 따로 진행하여야 한다. 이렇게 분리된 지방줄기세포는 생리식염수나 P인산완충식염수(PBS;phosphate buffered saline)등을 사용하여 300-500G 3분간 2-3회 세척하여 남아있을 잔여 지방과 오일 등의 불순물을 제거하게 된다. 2-3회 세척한 후 세포성 잔사를 제거하기 위하여 100㎛의 필터를 사용하기도 하나 이에 한정돼있는 것이 아니며 또한 이 과정은 생략해도 무방하다.

상기 (b)단계는 분리한 지방줄기세포를 배양하는 단계이다. 상기에서 분리한 지방줄기세포를 배양하게 되는데 통상적으로 사용하는 DMEM(dulbecco's modified eagle medium)배지를 사용하며, 여기에 10% 소혈청(FBS;fetal bovine serum)을 첨가하고 항생제로 페니실린과 스트렙도마이신을 100unit/ml, 100㎍/ml로 첨가한다. 소혈청대신 인체혈청을 사용할 수도 있으며, 기타 항생제나, 추가로 다른 영양성분을 첨가하여도 무방하다. 배양은 37℃, 5CO₂ 환경하에 배양하며, 세포의 밀도가 80-90% 일때 계대배양한다.

상기 (c)단계는 본 발명 모발증식제재에 사용되는 파쇄 추출액을 분리하는 단계로, 본 발명은 상기 (b)단계서 수득하여 사용한다. 상기 줄기세포 파쇄 추출액은 계대배양 시 마다 분리할 수 있으며, 줄기세포를 파쇄하여 세포막을 깨어버린 후 세포잔여물을 제거한 세포가 가지는 고유성분만을 추출한 것을 의미한다. 상기 (a)단계에서 세포의 밀도가 80-90% 이상일 때 수득하며, 10㎝ 플레이트(plate)에 계대배양 되었을 시 수득한다. 10㎝ 플레이트(plate)보다 작은 5㎝ 플레이트(plate), 3㎝ 플레이트(plate)나 24웰플레이트(well plate), 12웰플레이트(well plate)에서도 추출액의 수득이 가능하나 줄기세포의 수가 적기 때문에 추출액의 양이 적게지게 된다. 상기 (b)단계에서 줄기세포의 밀도가 80-90%가 되면 0.25%의 트립신-EDTA를 사용하여 줄기세포를 plate에서 떼어내게 된다. 이렇게 떼어낸 줄기세포는 생리식염수나 인산완충식염수(PBS;phosphate buffer saline)등을 사용하여 2-3회 세척하여 순수한 줄기세포만을 수득할 수 있다. 이렇게 수득한 줄기세포를 파쇄하여 파쇄 추출액을 얻게 되는데, 이때 파쇄하는 방법으로는 통상적인 세포 파쇄법인 초음파파쇄기, 비드밀링(bead milling), 프렌치프레스(french press), 시약 등을 사용할 수 있으며, 이외 세포막을 깰 수 있는 다른 파쇄 방법 또한 사용가능하다.

상기 (c)의 파쇄 추출액을 분리하는 단계는 상기과정에서 세포막이 깨어진 줄기세포와 그 추출액을 분리하여 줄기세포 잔여물을 제거한 상등액을 수거하는 과정을 의미한다. 상기 초음파파쇄기, 비드밀링(bead milling), 프렌치프레스(french press), 시약 등 통상적으로 세포막을 깰 수 있는 방법들을 사용하여 줄기세포의 세포막을 깨어버리게 되면 세포막이 파괴된 줄기세포 잔여물과 줄기세포가 가지는 고유성분 농축액이 함께 섞여있게 된다. 이러한 상태에서 원심분리를 하여 줄기세포 잔여물을 제거하여 줄기세포의 성분만이 농축되어 있는 상등액을 수거하게 된다. 이때 줄기세포 잔여물은 필터를 사용하여 제거하여도 무방하다.

이렇게 원심분리 과정을 거쳐 상등액만을 수득한 것을 본 발명의 유효성분인 지방줄기세포 파쇄 추출액이라 한다. 이 줄기세포 파쇄 추출액은 재생효과가 뛰어나 휴지기나 퇴행기의 모세포를 성장기의 모세포로 활성화시켜 탈모방지와 발모의 효과를 나타낸다.

또한 이렇게 추출한 줄기세포 파쇄 추출액은 줄기세포를 직접 사용하였을때, 나타날 수 있는 법적 문제나 윤리적인 문제, 인체내 면역거부반응 등의 부작용이 없으며, 또한 기존의 배양액이 가지는 항생제나 소혈청의 첨가로 인해 발생할 수 있는 부작용의 위험을 방지할 수 있다.

이러한 구성을 이하 실시예를 통해 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 쉽게 이해하기 위한 예시일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 지방조직으로부터 지방줄기세포 분리

성형외과나 피부과 등에서 지방흡입술을 시행한 환자로부터 동의를 구한 후, 무균상태의 지방조직을 수거하였다. 수거한 지방은 10cc 주사기에 옮겨 담은 후 3000-3500rpm으로 2-3분간 원심분리 하게 된다. 이러한 원심분리를 통해 투메센트 용액과 혈액, 오일 등 불순물을 제거한 후, 다시 생리식염수 등으로 세척하여 순수한 지방조직만을 모아 10cc 주사기에 담아둔다. 이렇게 수거한 지방조직에 생리식염수와 혼합된 0.66%~0.1%의 콜라게나아제와 1:1로 혼합하여 37℃에서 20-30분간 효소처리하였다. 이후 다시 800G에서 5분간 원심분리하여 지방세포층과 지방줄기세포층을 분리하였으며, 상층의 지방세포층은 제거한 후 하층의 지방줄기세포층만을 분리하였다. 이렇게 분리한 지방줄기세포층은 생리식염수나 하트만용액, PBS등을 사용하여 2-3번 세척한 후, 세포성잔사를 제거하기 위하여 100㎛의 필터를 사용하여 여과하여 지방으로부터 지방줄기세포를 분리하였다.

<실시예 2> 지방줄기세포 배양

상기에서 분리된 지방줄기세포를 세포배양하였다. 세포배양과정은 통상적으로 사용되는 세포배양법을 사용하였다.

세포배양에 사용되는 배지는 통상적으로 사용되는 DMEM(Dubecco's modified eagle medium)을 사용하며, 여기에 10% 소혈청(FBS;fetal bovin serum)과 페니실린과 스트렙도마이신을 100units/ml, 100㎍/ml을 항생제로 첨가하였다. DMEM외에 세포배양에 사용되는 배지는 모두 사용가능하며, 추가로 비타민 등의 영양성분을 첨가하여도 무관하다. 배양은 37℃, 5CO₂ 환경에서 배양하였다. 지방조직에서 분리된 지방줄기세포는 혈액과 함께 분리되어 초대배양시 혈액과 함께 배양된다. 이때 라이시스버퍼(lysis buffer)를 사용하여 혈액을 제거한 후 배양하여도 무관하다. 초대배양 1일 후, 인산완충식염수를 사용하여 플레이트(plate)에 부착되지 않은 지방줄기세포와 혈액세포들을 제거하였다. 완전히 제거되지않은 혈액세포의 경우 계대배양시 트립신화(trypsinization)에 의해 제거하였다. 세포의 밀도가 80-90% 일때 계대배양하였으며, 섬유모세포(fibroblast)의 형태를 확인함으로써 지방줄기세포가 배양되고 있음을 확인하였다.

<실시예3> 지방줄기세포 파쇄 추출액 분리

지방줄기세포를 파쇄하여 파쇄 추출액을 분리하는 방법으로는 물리적인 방법과 화학적인 방법으로 크게 나눌 수 있다. 물리적인 방법으로는 초음파파쇄기, ㅂ비드밀링(bead milling), 프렌치프레스(french press) 등이 있으며, 화학적인 방법으로는 시약 등을 사용하여 파쇄하게 된다.

(1) 초음파파쇄기를 이용한 파쇄

배양된 줄기세포를 트립신화(trypsinization)을 통해 세포를 떼어낸 후, 생리식염수로 2-3회 세포를 세척하여 줄기세포 외에 기타 불순물이 섞이지 않도록 하였다. 하나의 10cm 플레이트(plate)에서 떼어낸 세포를 각각 10ml씩 생리식염수와 혼합하여 초음파파쇄기를 사용하여 파쇄하였다. 이때 혼합하는 생리식염수의 양은 세포배양시 사용하는 배지의 양과 동일하게 사용한다. 10ml 당 10-40초의 시간으로 파쇄가 가능하며, 파쇄하는 양이 증가할수록 시간도 증가하게 되나, 파쇄하는 시간은 최대 5분을 넘기지 않는다. 이때 10-30kHz의 초음파로 파쇄한다.

(2)bead milling을 이용한 파쇄

비드밀링(bead milling)을 이용한 방법은 상기와 동일하게 배양된 줄기세포를 트립신화를 통해 세포를 떼어낸 후, 생리식염수로 2-3회 세척한다. 이렇게 분리한 줄기세포 역시 10cm plate 당 10ml의 생리식염수와 혼합하여 사용하게 되며, 0.20mm~0.30mm의 유리조각(bead)를 사용하게 되며, 5,500rpm에서 6,500rpm의 회전속도로 2-4분간 세포를 파쇄하게 된다.

(3)프렌치프레스(french press)를 이용한 파쇄

french press를 이용한 방법 역시 상기와 동일하게 배양된 줄기세포를 트립신화를 통해 세포를 떼어낸 후, 생리식염수로 2-3회 세척한다. 이렇게 분리한 줄기세포는 생리식염수와 혼합된 상태로 사용하며, 14,000~16,000pci의 압력으로 세포를 파쇄한다. 이때 줄기세포 양에 따라 압력은 높아질 수 있다.

(4)시약을 이용한 파쇄

시약을 이용한 파쇄는 상기에서 트립신화를 통해 세포를 떼어낸 후, 1,100rpm에 3분간 원심분리를 통해 줄기세포만을 수득하여 사용한다. 이때 사용되는 시약은 라이시스버퍼(lysis buffer), 라이소자임(lysozyme), SDS 용액(20% sodium dodesylsulfate) 등을 사용할 수 있다. 라이시스버퍼(lysis buffer)의 경우 50mM 헬페스(HEPES), pH7.4, 150mM 염화나트륨(NaCl), 1% 데옥시콜산(deoxycholate), 1mM 에틸렌디아민사아세트산(EDTA), 1mM 페닐메틸술포닐플로라이드(PMSF), 1㎍/ml 아프로티닌(aprotinin)을 혼합하여 사용하여 4℃에서 30분간 처리하여 파쇄하였다. 라이소자임(lysozyme)의 경우 ml당 5㎎의 양으로 파쇄한다. SDS 용액의 경우 줄기세포와 혼합하여 56℃ 수조에서 2시간 동안 반응함으로써 세포를 파쇄한다. 이외에 다른 기타 시약들을 사용할 수도 있다.

<실시예 4> 파쇄 추출액 분리 과정

상기 초음파 파쇄기, 비드밀링(bead milling), 프렌치프레스(french press), 시약 등 세포를 파쇄할 수 있는 기타 방법들을 사용하여 줄기세포를 파쇄하게 되면, 파쇄된 세포 잔여물이 추출액과 함께 혼합되어 있게 된다. 초음파파쇄기나 ㅂ비드밀링(bead milling), 프렌치프레스(french press) 등 물리적인 방법으로 파쇄한 추출액은 생리식염수에 추출액과 세포잔여물이 함께 혼합되어 있게 된다. 물리적인 방법으로 파쇄한 추출액은 1000G에 3분간 원심분리하여 파쇄된 세포잔여물은 제거하고 위에 상등액만을 수거하여 사용하게 된다. 원심분리외에 세포잔여물은 필터를 사용하여 파쇄 추출액만을 걸려 사용할 수도 있다. 시약을 사용하여 화학적으로 파쇄한 추출액의 경우 추출액과 시약이 함께 혼합되어 있는 형태로 파쇄하는 시약과 추출액을 완전히 분리하기는 어렵다.

<실시예 5> 모발증식제재 제조방법

본 발명의 모발증식제제는 하나의 형태에 국한된 것이 아니라 여러 형태로 제조될 수 있다. 모발증식제제의 형태가 약학적 조성물이나 화장료용 조성물 등으로 사용할 경우 스킨, 토너, 에센스, 스프레이 등의 액상 류나 크림, 로션, 샴푸 등의 크림류, 젤류 등의 형태로 제조하여 사용한다. 이러한 조성물들은 지방줄기세포 추출액을 1-100%까지 사용할 수 있으며, 추가로 탈모방지의 시스테인, 모발발육촉진 아이오딘, 모발성장을 촉진시키는 아르기닌 등의 아미노산이나 성장인자, 비타민류 예로, 비타민A, 비타민D, 비타민E, 비타민H, 비타민C 등 화학적 성분과 탈모 방지 및 발모에 효과있는 다른 첨가물을 추가로 첨가할 수 있으며 1-99%까지 사용 가능하다. 상온에 보관하기 위한 방부제로 메칠파라벤이나 에칠파라벤 등 파라벤류를 사용할 수 있으며, 이는 통상적으로 사용되고 있는 것을 사용하여 식약청의 허용 농도를 넘기지 않는다. 또한 유화제나 점증제 등의 첨가물을 사용하여 제품의 농도를 조절한다.

예로 유분감을 향상시키는 스테아릭산, 보습감을 위한 베타인, 글리세린, 프로필렌글리콜 등이 첨가되는 구성이 가능하다. 유연제로 사이클로펜타실록산, 사이클로메치콘, 하이드로제네이티드폴리데션 등의 첨가제가 사용되는 구성도 가능하며, 점증제로 펜타에리스리틸테트라헥사노에이트, 소듀폴리아크릴레이트, 브이피코폴리머, 하이드로제네이티드폴리이소부텐 등의 첨가제가 사용되는 구성도 가능하다. 상기 형태가 액체일 경우, 용매로 화장수, 증류수, 미네랄 워터 등의 첨가제가 사용가능하다.

상기 모발증식제재는 두피에 도포하는 방법으로 사용가능하며, 주사제와 같이 주사하는 방법으로도 사용 가능하다.

Claims

37℃, 5% 이산화탄소 환경하에서 배양한 지방줄기세포를 트립신화하여 배양된 세포를 떼어내는 제 1단계;
상기에서 떼어낸 지방줄기세포를 초음파파쇄기, 프렌치프레스(french press) 또는 비드밀링(bead milling)을 사용하여 지방줄기세포 세포막을 깨어 지방줄기세포 파쇄 추출액을 추출하는 제 2단계;
상기 지방줄기세포 파쇄 추출액을 1000G 3분간 원심분리하여 파쇄잔여물을 제거하는 제 3단계;
상기 지방줄기세포 파쇄 추출액을 액상, 크림 또는 젤류의 형태로 제제화하는 제 4단계:를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 지방줄기세포 파쇄 추출액을 이용한 모발증식제제의 제조방법