KR20060123705A - 모나틴을 포함하는 음료 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 모나틴(monatin)을 포함하는 신규한 음료 조성물 및 이러한 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특이적 모나틴 입체 이성질체, 모나틴 입체 이성질체의 특이적 블렌드 및/또는 또는 생체내 (예를 들면, 세포 내부) 또는 시험관내 생합성 경로를 통해 제조된 모나틴을 포함하는 음료 조성물에 관한 것이다.

Description

모나틴을 포함하는 음료 조성물 및 이의 제조 방법{BEVERAGE COMPOSITIONS COMPRISING MONATIN AND METHODS OF MAKING SAME}

관련 출원에 대한 교차 참고

본 출원은 2003년 8월 25일자에 출원된 미국 가출원 제 60/497,627호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전문은 본 명세서에 참고 문헌으로 인용된다.

기술분야

본 발명은 모나틴(monatin)을 포함하는 신규한 음료 조성물 및 이러한 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특이적 모나틴 입체 이성질체, 모나틴 입체 이성질체의 특이적 블렌드 및/또는 생체내 (예를 들면, 세포 내부) 또는 시험관내 생합성 경로를 통해 생성된 모나틴을 포함하는 음료 조성물에 관한 것이다.

어린이 비만, 타입 II 당뇨병 및 관련 질환에 대해 제기되는 건강 문제로 인해 무칼로리 고 강도 감미제의 사용은 증가하고 있다. 따라서, 통상적인 감미제, 예를 들면 정백당 (슈크로오스)에서보다 현저하게 높은 감미성을 갖는 감미제에 대한 수요가 존재한다. 많은 고 강도 감미제는 불쾌한 이취(off-flavor) 및/또는 예기치 않은 바람직하지 못한 감미성 프로파일을 함유한다. 이러한 문제들을 극복하 기 위한 시도로, 당 산업에서는 쓴맛 억제제, 이취 차폐 기술, 및 슈크로오스에 유사한 감미성 프로파일을 얻기 위한 감미제 블렌드에 대한 상당한 연구를 계속 수행하고 있다.

모나틴 (2-히드록시-2-(인돌-3-일메틸)-4-아미노글루타르산)은 남아프리카의 트란스바알 리젼(Transvaal Region)에서 발견되는 식물 스클레로치톤 일리시폴리우스(Sclerochiton ilicifolius)로부터 단리된 천연 발생의 고 강도 감미제이다. 모나틴은 동일한 감미성의 슈크로오스 또는 다른 영양 감미제와 달리 탄수화물 또는 당을 함유하지 않고, 거의 칼로리를 함유하지 않는다.

개 요

본 발명은 하기 화학식을 갖는 화합물인, 4-아미노-2-히드록시-2-(1H-인돌-3-일메틸)-펜탄디산, 또는 별법으로, 대체 번호매김 시스템에 기준하여, 4-히드록시-4-(3-인돌일메틸) 글루탐산)으로도 알려진 모나틴 (2-히드록시-2-(인돌-3-일메틸)-4-아미노글루타르산을 포함하는 음료 조성물에 관한 것이다.

모나틴은 천연 발생의 고 강도 감미제이다. 모나틴은 다음의 4 개의 입체 이성질 형태를 갖는다: 2R, 4R ("R,R 입체 이성질체" 또는 "R,R 모나틴"), 2S, 4S ("S,S 입체 이성질체" 또는 "S,S 모나틴"), 2R, 4S ("R,S 입체 이성질체" 또는 "R,S 모나틴"), 및 2S, 4R ("S,R 입체 이성질체" 또는 "S,R 모나틴"). 달리 언급이 없으면, 본 명세서에 사용된 "모나틴"은 모나틴의 모든 4 개의 입체 이성질체, 뿐만 아니라 모나틴 입체 이성질체의 임의의 조합물의 임의의 블렌드 (예를 들면, 모나틴의 R,R 입체 이성질체 및 S,S 입체 이성질체의 블렌드)를 지칭한다.

모나틴은 우수한 감미성 품질을 갖는다. 모나틴은 다른 공지된 고 강도 감미제 만큼 깨끗하거나 더 깨끗한 향미 프로파일을 갖는다. 모나틴의 용량 반응 곡선은 더욱 선형이기 때문에 다른 고 강도 감미제, 예를 들면 사카린보다 슈크로오스와 유사하다. 모나틴의 우수한 감미성 프로파일로 인해 모나틴은 식탁용 감미제, 식품, 음료 및 다른 제품들에 사용하기 바람직하다.

감미제 산업에서 R,R 입체 이성질체 및 S,S 입체 이성질체를 비롯한 모나틴의 상이한 입체 이성질체들은 별도의 성분으로서 또는 블렌드 중에서 잠재성을 갖는다. 모나틴은 단독으로 또는 탄수화물과 혼합되는 경우에 바람직한 미감 프로파일을 갖는다. 모나틴, 및 모나틴의 입체 이성질체와 다른 감미제, 예컨대 탄수화물의 블렌드는 다른 고 강도 감미제에 비해 우수한 미감 특징 및/또는 물리적 품질을 가질 것으로 생각된다. 예를 들면, 모나틴은 아스파탐("APM"으로도 알려짐)보다 안정하고, 사카린보다 깨끗한 미감을 갖고, 수크라로오스 (sucralose)보다 더 달다. 유사하게, 모나틴 감미제는 사카린과 관련된 쓴 뒷맛, 또는 일부 다른 고 효능 감미제의 금속성, 산성, 아스트린젠트 또는 목이 화끈거리는 (throat burning) 뒷맛을 갖지 않는다. 또한, 모나틴 감미제는 특정한 천연 감미제, 예를 들면 스테비오사이드 (stevioside) 및 글리실리진 (glycyrrhizin)과 관련된 감초 뒷맛을 나타내지 않는다.

또한, 아스파탐 감미제와는 달리, 모나틴 감미제는 환자에게 페닐케톤뇨증 (phenylketonuria)의 위협이 있는 페닐알라닌을 필요로 하지 않는다. 유사하게, 모나틴은 발효 탄수화물을 함유하지 않으므로, 이는 우식원성(즉, 충치를 진행시킴)이 아닌 것으로 기대된다. 또한, 모나틴은 pH 강하 시험의 측정시에 침과 혼합되는 경우 pH 5.7(이는 치아에 해로울 수 있음) 미만의 강하를 야기하지 않을 것으로 기대된다. 그의 강한 감미성으로 인해, 특히, R,R 입체 이성질체는 다른 고 강도 감미제에 비해 경제적으로 경쟁력을 갖는다.

한 측면에서, 본 발명은 모나틴 또는 그의 염, 예컨대 R,R 모나틴, S,S 모나틴, R,S 모나틴 또는 S,R 모나틴 또는 상이한 입체 이성질체의 블렌드를 포함하는 음료 조성물을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "음료 조성물"은 그 자체로 마실 수 있는(즉, 희석될 필요가 없거나, "즉시 마실수 있는(ready-to-drink)") 조성물을 의미하거나, 액체로 희석되거나 이와 혼합되어 마실 수 있는 음료를 형성할 수 있는 농축물을 의미한다. 예를 들어, 음료 조성물은 예를 들어 물 또는 우유와 혼합되어 마실 수 있는 음료를 형성할 수 있는 건조 음료 믹스(예를 들어, 쵸콜렛 음료 믹스, 과일 음료 믹스, 맥아 음료, 또는 레모네이드 믹스)일 수 있다. 또 다른 예로서, 음료 조성물은 예를 들어 탄산수와 혼합되어 탄산 청량 음료를 형성할 수 있는 음료 시럽일 수 있다. 또 다른 예로서, 음료 시럽 또는 음료 믹스는 물/얼음 및 하나 이상의 다른 성분(예를 들어, 데킬라)에 의해 희석되어 알콜 음료(예를 들어, 마가리타)를 형성할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 모나틴은 미감에 있어서 현저한 차이 없이 다른 통상의 벌크 감미제(bulk sweetner)를 대체할 수 있다. 모나틴을 함유하는 탄산 음료는 아스파탐으로 감미된 통상의 콜라형 탄산 청량 음료에 비해 개선된 미감 프로파일을 갖는다. 모나틴은 산성의 탄산 음료 조건 하에서 아스파탐보다 안정하며, 모나틴은 더 긴 반감기를 가질 것으로 기대된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "탄산"이라는 용어는 음료가 용해된 이산화탄소 및 분산된 이산화탄소 모두를 함유하는 것을 의미한다.

일부 실시양태에서, 음료 조성물은 모나틴 및 감미제(예를 들어, 슈크로오스 또는 고 프룩토스 옥수수 시럽)의 블렌드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 모나틴을 포함하는 음료 조성물은 향미료, 카페인 및/또는 벌크 감미제를 포함한다. 벌크 감미제는, 예를 들어, 설탕 감미제, 무설탕 감미제 및 저당 탄수화물(즉, 글루코스보다 더 낮은 혈당지수를 갖는 탄수화물)일 수 있다. 다른 실시양태에서, 모나틴 함유 음료 조성물은 고강도 감미제 및/또는 저당 탄수화물을 포함한다. 다른 실시양태에서, 모나틴 함유 음료 조성물은 감미성 강화제(sweetness enhancer)를 포함한다.

일부 실시양태에서, 음료 조성물은 필수적으로 S,S 모나틴 또는 R,R 모나틴으로 이루어진 모나틴을 포함한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 주로 S,S 모나틴 또는 R,R 모나틴을 함유한다. "주로"는 조성물 중에 존재하는 모나틴 입체 이성질체 중 모나틴이 90 %를 초과하는 특정 입체 이성질체를 함유하는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 S,S 모나틴 또는 R,R 모나틴을 실질적으로 함유하지 않는다. "실질적으로 함유하지 않는"은 조성물이 조성물 중에 존재하는 모나틴 입체 이성질체 중 2 % 미만의 특정 입체 이성질체를 함유하는 것을 의미한다. 추가적으로 또는 별법으로, "실질적으로 함유하지 않는"은 생합성 경로로 생성된 모나틴을 기술하는 데 사용된 경우, 키랄-특이적 효소 (예를 들면, D-아미노산 디히드로게나아제 또는 D-아미노산 아미노트랜스퍼라아제) 및/또는 키랄-특이적 기질 (예를 들면, R-입체배위에 탄소를 갖는 것)로 상이한 특이적 입체 이성질체 (예를 들면, R,R 모나틴)를 생성하는 것을 포함하는 생합성 경로에서의 부산물로 생성된 소정의 양의 입체 이성질체 (예를 들면, S,S 모나틴)를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 생합성 경로에서 생성된 입체 이성질체-풍부 모나틴 혼합물을 포함하는 음료 조성물이 제공된다. "입체 이성질체-풍부 모나틴 혼합물"은 혼합물이 1 개를 초과하는 모나틴 입체 이성질체를 함유하고, 혼합물 중 60 % 이상의 모나틴 입체 이성질체가 특정 입체 이성질체, 예를 들면 R,R, S,S, S,R 또는 R,S인 것을 의미한다. 다른 실시양태에서, 혼합물은 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 %를 초과하는 특정 모나틴 입체 이성질체를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 음료 조성물은 입체 이성질체-풍부 R,R 모나틴 또는 입체 이성질체-풍부 S,S 모나틴을 포함한다. "입체 이성질체-풍부" R,R 모나틴은 모나틴이 60 % 이상의 R,R 모나틴을 포함하는 것을 의미한다. "입체 이성질체-풍부" S,S 모나틴은 모나틴이 60 % 이상의 S,S 모나틴을 포함하는 것을 의미한다. 다른 실시양태에서, "입체 이성질체-풍부" 모나틴은 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 %를 초과하는 R,R 모나틴 또는 S,S 모나틴을 포함한다.

모나틴은 스클레로키톤 이리시포리우스(Sclerochiton ilicifolius)의 뿌리의 나무껍질로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 나무껍질을 연마하고 물로 추출하며, 여과 및 동결 건조하여 암갈색의 비결정질 덩어리를 수득할 수 있다. 이 덩어리를 물에 재용해시키고, 산성 형태인 양이온 수지, 예를 들어, HCl 형태인 "Biorad" AG50W x8(캘리포니아주 리치몬드 바이오 라드 러보로터리사)와 반응시킬 수 있다. 이 수지를 물로 세정하고 이 수지에 결합된 화합물을 암모니아 수용액을 사용하여 용리시킬 수 있다. 용리물을 동결 건조시키고 수계 겔 여과를 실시한다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,128,164호가 참조된다. 대안으로, 모나틴은 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Holzapfel and Oliver, Synth . Commun . 23:2511(1993)]; 문헌[Holzapfel et al., Synth . Commun . 38:7025(1994)]; 미국 특허 제 5128,164호; 미국 특허 제 4,975,298호; 및 미국 특허 제 5,994,559호가 참조된다. 모나틴은 또한 재조합적으로 생성될 수 있다.

본 발명의 하나의 측면에서, 모나틴을 포함하는 음료 조성물의 제조 방법이 제공된다. 상기 방법은 생체내 또는 시험관내 생합성으로 생성되는 모나틴을 포함한다. "생합성 경로"는 하나 이상의 생물학적 전환 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생합성 경로는 다단계 방법이고, 하나 이상의 단계는 생물학적 전환 단계이다. 다른 실시양태에서, 생합성 경로는 생물학적 및 화학적 전환 단계를 양쪽 모두 포함하는 다단계 방법이다. 일부 실시양태에서, 생성된 모나틴은 입체 이성질체-풍부 모나틴 혼합물이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 생합성으로 생성된 모나틴을 포함하는 음료 조성물이 제공된다. 모나틴은 화학적으로도 합성될 수 있지만, 생합성으로 생성된 모나틴은 화학적으로 합성된 모나틴에 비하여 음료 용도에 있어서 이점을 제공하고, 이는 화학적으로 합성된 모나틴은 바람직하지 않은 오염물질을 포함할 수 있기 때문이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 글루코스, 트립토판, 인돌-3-락트산, 뿐만 아니라 인돌-3-피루베이트 및 2-히드록시-2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산 (또한, "모나틴 전구체," "MP" 또는 알파-케토 형태의 모나틴으로도 알려짐)으로부터 선택된 기질로부터 모나틴을 제조하는 몇몇 생합성 경로들이 존재한다. 모나틴 또는 그의 중간체를 생성하거나 또는 제조하는 생합성 경로들의 예는 박스 내 유력한 중간체 생성물 및 최종 생성물을 나타내는 도 1-3 및 도 11-13에 개시되어 있다. 예를 들면, 한 생성물로부터 또 다른 생성물로의 전환, 예를 들면 글루코스로부터 트립토판으로의 전환, 트립토판으로부터 인돌-3-피루베이트로의 전환, 인돌-3-피루베이트로부터 MP로의 전환, MP로부터 모나틴으로의 전환, 또는 인돌-3-락트산 (인돌-락테이트)으로부터 인돌-3-피루베이트로의 전환이 이러한 경로들에서 발생한다.

생합성 경로 내의 이러한 전환들은 화학적 및/또는 생물학적 전환을 통해 용이해질 수 있다. 용어 "전환하다"는 제 1 중간체에서 제 2 중간체로 변화시키는 반응에서 하나 이상의 폴리펩티드 또는 화학적 수단을 사용하는 것을 지칭한다. 전환은 생체내 또는 시험관내에서 일어날 수 있다. 용어 "화학적 전환"은 폴리펩티드에 의해 활발하게 촉진되지 않는 반응을 지칭한다. 용어 "생물학적 전환"은 하나 이상의 폴리펩티드에 의해 활발하게 촉진되는 반응을 지칭한다. 생물학적 전환이 사용되는 경우, 폴리펩티드 및/또는 세포는 지지체 상에 예를 들면, 중합체 지지체 상의 화학적 부착에 의해 고정될 수 있다. 전환은 당업자에게 공지된 임의의 반응기를 사용하여 예를 들면, 배치 또는 연속 반응기에서 달성될 수 있다.

생물학적 전환을 수행하는 데 사용될 수 있는 폴리펩티드, 및 그들의 코딩 서열의 예는 도 1-3 및 도 11-13에 나타나 있다. 기질 특이성 및/또는 폴리펩티드의 활성을 변형시키는 하나 이상의 점 돌연변이를 갖는 폴리펩티드를 사용하여 모나틴을 형성시킬 수 있다. 이러한 폴리펩티드를 발현하는 단리된 세포 및 재조합 세포를 사용하여 모나틴을 생성할 수 있다. 이들 세포는 임의의 세포, 예를 들면 식물, 동물, 세균, 효모, 해조류, 아케아 (archaeal), 또는 진균류 세포일 수 있다.

예를 들면, 모나틴 생성 세포는 하기 활성 물질들 중 하나 이상 (예를 들면, 2 개 이상, 또는 3 개 이상)을 포함할 수 있다: 트립토판 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.27), 티로신 (방향족) 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.5), 트립토판 디히드로게나아제 (EC 1.4.1.19), 글루타메이트 디히드로게나아제 (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), 페닐알라닌 디히드로게나아제 (EC 1.4.1.20), 트립토판-페닐피루베이트 트란스아미나아제 (EC 2.6.1.28), 다중 기질 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.-), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.1), L-아미노산 옥시다아제 (EC 1.4.3.2), 트립토판 옥시다아제 (EC 번호 없음, 문헌[Hadar et al., J Bacteriol 125: 1096-1104, 1976] 및 문헌[Furuya et al., Biosci Biotechnol Biochem 64: 1486-93, 2000] 참조), D-트립토판 아미노트랜스퍼라아제 (문헌[Kohiba and Mito, Proceedings of 8^th International Symposium on Vitamin B₆ and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japan 1990] 참조), D-아미노산 디히드로게나아제 (EC 1.4.99.1), D-아미노산 옥시다아제 (EC 1.4.3.3), D-알라닌 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.21), 신타아제/리아제 (EC 4.1.3.-), 예를 들면 4-히드록시-2-옥소글루타레이트 알돌라아제 (EC 4.1.3.16) 또는 4-히드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 알돌라아제 (EC 4.1.3.17) 및/또는 신타아제/리아제 (4.1.2.-).

또 다른 예에서, 세포는 하기 활성 물질들 중 하나 이상 (예를 들면, 2 개 이상, 또는 3 개 이상)을 포함할 수 있다: 인돌락테이트 디히드로게나아제 (EC 1.1.1.110), R-4-히드록시페닐락테이트 디히드로게나아제 (EC 1.1.1.222), 3-(4)-히드록시페닐피루베이트 리덕타아제 (EC 1.1.1.237), 락테이트 디히드로게나아제 (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-이미다졸-5-일) 락테이트 디히드로게나아제 (EC 1.1.1.111), 락테이트 옥시다아제 (EC 1.1.3.-), 신타아제/리아제 (4.1.3.-), 예를 들면 4-히드록시-2-옥소글루타레이트 알돌라아제 (EC 4.1.3.16) 또는 4-히드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 알돌라아제 (EC 4.1.3.17), 신타아제/리아제 (4.1.2.-), 트립토판 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.27), 티로신 (방향족) 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.5), 트립토판 디히드로게나아제 (EC 1.4.1.19), 글루타메이트 디히드로게나아제 (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), 페닐알라닌 디히드로게나아제 (EC 1.4.1.20), 트립토판-페닐피루베이트 트란스아미나아제 (EC 2.6.1.28), 다중 기질 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.-), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.1), D-트립토판 아미노트랜스퍼라아제, D-아미노산 디히드로게나아제 (EC 1.4.99.1) 및/또는 D-알라닌 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.21).

또한, 세포는 하기 활성 물질들 중 하나 이상 (예를 들면, 2 개 이상, 또는 3 개 이상)을 포함할 수 있다: 트립토판 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.27), 티로신 (방향족) 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.5), 트립토판 디히드로게나아제 (EC 1.4.1.19), 글루타메이트 디히드로게나아제 (EC 1.4.1.2, 1.4.1.3, 1.4.1.4), 페닐알라닌 디히드로게나아제 (EC 1.4.1.20), 트립토판-페닐피루베이트 트란스아미나아제 (EC 2.6.1.28), 다중 기질 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.-), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.1), L-아미노산 옥시다아제 (EC 1.4.3.2), 트립토판 옥시다아제, D-트립토판 아미노트랜스퍼라아제, D-아미노산 디히드로게나아제 (EC 1.4.99.1), D-아미노산 옥시다아제 (EC 1.4.3.3), D-알라닌 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.21), 인돌락테이트 디히드로게나아제(EC 1.1.1.110), R-4-히드록시페닐락테이트 디히드로게나아제 (EC 1.1.1.222), 3-(4)-히드록시페닐피루베이트 리덕타아제 (EC 1.1.1.237), 락테이트 디히드로게나아제 (EC 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3), (3-이미다졸-5-일) 락테이트 디히드로게나아제 (EC 1.1.1.111), 락테이트 옥시다아제 (EC 1.1.3.-), 신타아제/리아제 (EC 4.1.3-), 예를 들면 4-히드록시-2-옥소글루타레이트 알돌라아제 (EC 4.1.3.16) 또는 4-히드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 알돌라아제 (EC 4.1.3.17) 및/또는 신타아제/리아제 (4.1.2.-).

추가의 예로서, 세포는 하기 알돌라아제 활성 물질들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: KHG 알돌라아제, ProA 알돌라아제, KDPG 알돌라아제 및/또는 관련 폴리펩티드 (KDPH), 트란스카르복시벤잘피루베이트 히드라타아제-알돌라아제, 4-(2-카르복시페닐)-2-옥소부트-3-에노에이트 알돌라아제, 트란스-O-히드록시벤질리덴피루베이트 히드라타아제-알돌라아제, 3-히드록시아스파테이트 알돌라아제, 베조인 알돌라아제, 디히드로네오프테린 알돌라아제, L-트레오-3-페닐 세린 벤즈알데히드-리아제 (페닐 세린 알돌라아제), 4-히드록시-2-옥소발러레이트 알돌라아제, 1,2-디히드록시벤질피루베이트 알돌라아제 및/또는 2-히드록시벤잘피루베이트 알돌라아제.

모나틴은 트립토판 및/또는 인돌-3-락트산을 제 1 폴리펩티드(여기서, 제 1 폴리펩티드는 트립토판 및/또는 인돌-3-락트산을 인돌-3-피루베이트로 전환시킴 (트립토판 또는 인돌-3-락트산의 D 또는 L형은 인돌-3-피루베이트로 전환되는 기질로서 사용될 수 있으며, 당업자는 이 단계에 선택된 폴리펩티드가 이상적으로 적합한 특이성을 나타낸다는 것을 명확히 이해할 것임))와 접촉시키고, 생성되는 인돌-3-피루베이트를 제 2 폴리펩티드(여기서, 제 2 폴리펩티드는 인돌-3-피루베이트를 2-히드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산 (MP)으로 전환시킴)와 접촉시키고, 상기 MP를 제 3 폴리펩티드(여기서, 제 3 폴리펩티드는 MP를 모나틴으로 전환시킴)와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 전환에 사용될 수 있는 예시적인 폴리펩티드는 도 2 및 도 3에 도시되어 있다.

하나 이상의 생물학적 전환을 통해 생합성 경로로 모나틴을 생성하는 것은 특정한 이점을 제공한다. 예를 들면, 특이적 폴리펩티드 및/또는 특정한 기질을 사용함으로써 생합성 경로로 특이적 입체 이성질체가 풍부한 혼합물 및/또는 하나 이상의 입체 이성체를 실질적으로 함유하지 않은 모나틴 혼합물을 제조할 수 있다.

모나틴 조성물은 모나틴 합성에 사용되는 방법의 결과물로서 불순물을 포함할 수 있다. 순수한 합성 수단 (즉, 하나 이상의 생물학적 전환을 포함하지 않음)에 의해 제조된 모나틴 조성물은 생합성 경로에 의해 제조된 모나틴 조성물과는 상이한 불순물을 함유하게 된다. 예를 들면, 사용된 원료를 기준으로, 순수한 합성 수단에 의해 제조된 모나틴 조성물은 인간 소비에 부적합한 석유 화학 제품, 독성 및/또는 다른 유해한 오염물질을 포함할 수 있다. 이러한 오염물질의 예로는 유해한 화학 물질, 예를 들면 LDA, 수소-Pd/C, 디아조메탄, KCN, 그리나드 시약 및 Na/Hg가 있다. 한편, 생합성 경로를 통해 제조된 모나틴 조성물은 식용 또는 음용 불순물을 함유할 수 있지만 석유 화학 제품, 독성 및/또는 다른 유해한 물질을 함유하지는 않을 것으로 예상된다.

하나 이상의 생물학적 전환을 통해 생합성 경로로 모나틴을 제조하는 방법은 순수한 합성 수단에 비해 보다 적은 독성 또는 유해한 오염물질을 생성하고(생성하거나) 보다 높은 퍼센트의 특정 입체 이성질체를 제공할 수 있을 것으로 예상된다. 예를 들면, D-아미노산 디히드로게나아제, D-알라닌 (아스파테이트) 아미노트랜스퍼라아제, D-방향족 아미노트랜스퍼라아제 또는 D-메티오닌 아미노트랜스퍼라아제를 사용하여 모나틴을 제조하는 경우, 60 % 이상의 R,R 모나틴 및 40 % 미만의 S,S 모나틴, S,R 모나틴 및/또는 R,S 모나틴을 얻을 수 있을 것으로 예상된다. 또한, 예를 들면, 상기 D-효소, 뿐만 아니라 R-입체배위에 탄소를 갖는 하나 이상의 기질 (예를 들면, 모나틴 전구체)을 사용하여 모나틴을 제조하는 겅우, 95 % 이상의 R,R 모나틴 및 5 % 미만의 S,S 모나틴, S,R 모나틴 및/또는 R,S 모나틴을 얻을 수 있을 것으로 예상된다. 반대로, 순수한 합성 수단에 의해 모나틴을 제조하는 경우, 약 25 %-50 %의 원하는 입체 이성질체를 얻을 수 있는 것으로 예상된다.

한 실시양태에서, 예를 들면, 하나 이상의 생물학적 전환을 포함하는 생합성 경로를 통해 모나틴을 제조하는 방법은 석유 화학 제품, 독성 또는 유해한 오염물질을 생성하지 않는다. "석유 화학 제품, 독성 또는 유해한 오염물질"은 원료로서 제공되거나 또는 순수한 합성 수단에 통해 모나틴을 제조하는 경우 생성되는 오염물질을 포함하는 석유 화학 제품, 독성, 유해하고(하거나) 인간 소비에 부적합한 임의의 물질을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들면, 하나 이상의 생물학적 전환을 포함하는 생합성 경로를 통해 모나틴을 제조하는 방법은 오직 식용 또는 음용 물질만을 생성한다. "식용 또는 음용 물질"은 인간에 의한 식용 또는 음용으로 적합하거나, 또는 인간 소비에 안전한 하나 이상의 화합물 또는 물질을 의미한다. 식용 또는 음용 물질의 예는 모나틴, 트립토판, 피루베이트, 글루타메이트, 다른 아미노산, 뿐만 아니라 신체 내에 천연적으로 존재하는 다른 화합물 또는 물질을 포함한다.

한 실시양태에서, 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 음료 조성물은 모나틴 또는 그의 염 대신 슈크로오스 또는 고 프룩토오스 옥수수 시럽을 함유하는 음료 조성물의 동일한 양에 비해 비슷한 감미성에서 더 낮은 칼로리 및 탄수화물을 함유한다. "비슷한 감미성(A sweetness comparable)" 또는 "비슷한 감미성(comparable sweetness)"은 숙련된 감각 평가단이 제1의 조성물 중에 존재하는 감미성을 제2의 조성물 중에 존재하는 감미성의 80% 내지 120%의 범위 이내로 평균적으로 측정하는 것을 의미한다.

다른 실시양태에서, 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 음료 조성물은 시트러스 향미를 더 포함하고, 이때 모나틴 또는 그의 염은 시트러스 향미에 의해 제공된 향미를 강화시키는 양으로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 음료 조성물은 시트러스 향미 및 탄수화물을 더 포함하고, 이때 모나틴 또는 그의 염 및 탄수화물은 시트러스 향미에 의해 제공된 향미를 강화시키는 양으로 존재한다. 탄수화물은 에티트리톨, 말토덱스트린, 슈크로오스 및 그의 조합물 중에서 선택될 수 있으나 이에 국한되는 것은 아니다.

한 실시양태에서, 탄산 음료는 탄산 음료의 약 15 중량% 내지 약 25 중량%의 범위인 양으로 시럽 조성물을 포함하고, 이때 시럽 조성물은 모나틴 또는 그의 염을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 음료 조성물은 약 3 ppm 내지 약 10000 ppm의 모나틴 또는 그의 염을 포함한다. 다른 실시양태에서, 음료 조성물은 약 3 ppm 내지 약 30 ppm의 모나틴, 또는 2500 ppm 초과 내지 약 10000 ppm의 모나틴을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 음료 조성물은 시럽 또는 건조 음료 믹스이고, 이때 조성물은 약 10 ppm 내지 약 10000 ppm의 모나틴 또는 그의 염을 포함한다. 예를 들어, 음료 조성물은 약 1 부의 시럽 : 3 부의 음료 내지 약 1 부의 시럽 : 5.5 부의 음료의 범위로 음료 내에서 희석되도록 조절된 농축물인 시럽일 수 있다. 한 실시양태에서, 시럽은 약 600 ppm 내지 약 10000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 시럽은 약 18 ppm 내지 약 300 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함한다. 대안으로, 시럽은 약 0 ppm 내지 약 10000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염, 및 0 ppm 내지 약 300 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 음료 조성물은 약 10 ppm 내지 약 10000 ppm의 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 건조 음료 믹스이다. 한 실시양태에서, 건조 음료 믹스는 약 600 ppm 내지 약 10000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 건조 음료 믹스는 약 10 ppm 내지 약 450 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함한다. 대안으로, 건조 음료 믹스는 약 0 ppm 내지 약 10000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염, 및 약 0 ppm 내지 약 450 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함한다.

다른 실시양태에서, 음료 조성물은 약 3 ppm 내지 약 10000 ppm의 모나틴 또는 그의 염을 포함하고, 이 조성물은 R,R 모나틴 또는 그의 염을 실질적으로 함유하지 않거나, S,S 모나틴 또는 그의 염을 실질적으로 함유하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 음료 조성물은 약 3 ppm 내지 약 450 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염(예를 들어 약 6 ppm 내지 약 225 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 음료 조성물은 약 3 ppm 내지 약 10000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염(예를 들어, 약 60 ppm 내지 약 4600 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 음료 조성물은 약 0 ppm 내지 약 10000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염, 및 약 0 ppm 내지 약 450 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함한다.

한 실시양태에서, 음료 조성물은 약 3 ppm 내지 약 2000 ppm의 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 즉시 마실 수 있는(ready-to-drink) 조성물이다. 또 다른 실시양태에서, 즉시 마실 수 있는 조성물은 약 5 ppm 내지 약 50 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염, 또는 약 60 ppm 내지 약 2000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 음료 조성물은 약 450 ppm 이하의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함하고, S,S 모나틴, S,R 모나틴, R,S 모나틴 또는 그의 염을 실질적으로 함유하지 않는다. 대안으로, 음료 조성물은 약 10000 ppm 이하의 S,S 모나틴 또는 그의 염을 포함하고, R,R 모나틴, S,R 모나틴 또는 R,S 모나틴 또는 그의 염을 실질적으로 함유하지 않는다. 일부 실시양태에서, 음료 조성물 중 모나틴 또는 그의 염은 필수적으로 R,R 모나틴 또는 그의 염으로 이루어지거나, 필수적으로 S,S 모나틴 또는 그의 염으로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 음료 조성물 중 모나틴 또는 그의 염은 입체 이성질체-풍부 R,R 모나틴 또는 그의 염이거나, 입체 이성질체-풍부 S,S 모나틴 또는 그의 염이다. 다른 실시양태에서, 모나틴 또는 그의 염은 95% 이상의 R,R 모나틴 또는 그의 염, 또는 95% 이상의 S,S 모나틴 또는 그의 염을 포함한다.

한 실시양태에서, 음료 조성물은 생합성 경로로 제조된 모나틴 또는 그의 염을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 음료 조성물은 입체 이성질체-풍부 모나틴 혼합물을 포함하며, 이때 모나틴 혼합물은 생합성 경로를 통해 제조된다. 한 실시양태에서, 생합성 경로는 다단계 경로이고, 다단계 경로 중 하나 이상의 단계는 화학적 전환 단계이다. 다른 실시양태에서, 생합성 경로를 통해 제조된 모나틴 혼합물은 주로 R,R 모나틴 또는 그의 염이거나, 주로 S,S 모나틴 또는 그의 염이다.

한 실시양태에서, 음료 조성물은 생합성 경로로 제조된 모나틴 조성물을 포함한고, 이때 모나틴 조성물은 석유 화학 제품, 독성 또는 유해한 오염물질을 함유하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 음료 조성물은 모나틴 또는 그의 염을 포함하고, 이때 모나틴 또는 그의 염은 생합성 경로로 제조되며 재조합 세포로부터 단리되고, 이때 재조합 세포는 석유 화학 제품, 독성 또는 유해한 오염물질을 함유하지 않는다.

한 실시양태에서, 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 음료 조성물은 무칼로리이다. 다른 실시양태에서, 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 음료 조성물은 에리트리톨, 트레할로오스(trehalose), 시클라메이트(cyclamate), D-타가토오스(D-tagatose) 또는 그의 조합물을 더 포함한다.

다른 실시양태에서, 음료 조성물은 벌크 감미제(bulk sweetner), 고강도 감미제, 저당 탄수화물, 향미료, 산화방지제, 카페인, 감미성 강화제(sweetness enhancer) 또는 그의 조합물을 더 포함한다. 예를 들어, 향미료는 콜라 향미, 시트러스 향미 및 그의 조합물 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 벌크 감미제는 옥수수 감미제, 슈크로오스, 덱스트로오스, 전화당, 말토오스, 덱스트린, 말토덱스트린, 프룩토오스, 레불로오스, 고 프룩토오스 옥수수 시럽, 옥수수 시럽 고체, 레불로오스, 갈락토오스, 트레할로오스, 이소말툴로오스, 프룩토-올리고당 및 그의 조합물 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 고강도 감미제는 슈크라로오스, 아스파탐, 사카린, 아세설팜 K(acesulfame K), 알리탐(alitame), 소마틴(thaumatin), 디히드로칼콘(dihydrochalcone), 네오탐(neotame), 시클라메이트, 스테비오사이드, 모그로사이드(mogroside), 글리실리진(glycyrrhizin), 필로둘신(phyllodulcin), 모넬린(monellin), 마빈린(mabinlin), 브라제인(brazzein), 서큘린(circulin), 펜타딘(pentadin) 및 그의 조합물 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 저당 탄수화물은 D-타가토오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 락티톨, 에리트리톨, 말티톨(maltitol), 수소화된 전분 가수분해물, 이소말트(isomalt), D-프사이코스(D-psicose), 1,5 안하이드로 D-프룩토오스 및 그의 조합물 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 감미성 강화제는 서큘린, 미라큘린(miraculin), 시나린(cynarin), 클로로겐산, 카페인산, 스트로진(strogin), 아라비노갈락탄(arabinogalactan), 말톨(maltol), 디히드록시벤조산 및 그의 조합물 중에서 선택될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 음료 조성물은 R,R 모나틴 및 S,S 모나틴 또는 그의 염의 블렌드인 모나틴 또는 그의 염을 포함한다. 또한, 음료 조성물은 모나틴 또는 그의 염 및 비-모나틴 감미제의 블렌드를 포함할 수 있다. 비-모나틴 감미제는 예를 들어 슈크로오스 및 고 프룩토오스 옥수수 시럽 중에서 선택될 수 있다.

일부 실시양태에서, 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 음료 조성물의 제조 방법은 글루코스, 트립토판, 인돌-3-락트산, 인돌-3-피루베이트 및 모나틴 전구체 중에서 선택된 하나 이상의 기질로부터 모나틴 또는 그의 염을 제조하는 것을 포함한다. 이 방법은 모나틴 또는 그의 염을 모나틴 또는 그의 염이 아닌 하나 이상의 기타 성분(예를 들어, 에리트리톨, 트레할로오스, 시클라메이트, D-타가토오스, 말토덱스트린 또는 그의 조합물)과 배합하는 것을 더 포함한다. 일부 실시양태에서, 기타 성분은 증량제, 벌크 감미제, 액체 감미제, 저당 탄수화물, 고강도 감미제, 증점제, 지방, 오일, 유화제, 산화방지제, 감미성 강화제, 착색제, 향미료, 카페인, 산, 분말, 유동화제(flow agent), 완충제, 단백질 공급원, 향미 강화제, 향미 안정화제 및 그의 조합물 중에서 선택될 수 있다. 벌크 감미제는 예를 들어 설탕 감미제, 무설탕 감미제, 저당 탄수화물 및 그의 조합물 중에서 선택될 수 있다. 다른 실시양태에서, 이 방법에 의해 제조된 음료 조성물은 약 0 ppm 내지 약 10000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염, 및 약 0 ppm 내지 약 450 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함한다.

다른 실시양태에서, 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 음료 조성물의 제조 방법은 생합성 경로를 통해 모나틴 또는 그의 염을 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 음료 조성물의 제조 방법은 하나 이상의 생물학적 전환, 또는 오로지 생물학적 전환을 사용하여 모나틴 또는 그의 염을 제조하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 모나틴 조성물을 포함하는 음료 조성물의 제조 방법은 (a) 모나틴 또는 그의 염을 재조합 세포 내에서 생합성 경로로 제조하는 단계; (b) 상기 모나틴 조성물을 재조합 세포로부터 단리시키는 단계로서, 이때 모나틴 조성물은 모나틴 또는 그의 염 및 기타 식용 또는 음용 물질로 이루어진 것인 단계를 포함한다.

다른 실시양태에서, 모나틴 조성물을 포함하는 음료 조성물은 생합성 경로로 모나틴 조성물을 제조하는 것을 포함하며, 이때 모나틴 조성물은 석유 화학 제품, 독성 또는 유해한 오염물질을 함유하지 않는다. 다른 실시양태에서, 모나틴 조성물을 포함하는 음료 조성물의 제조 방법은 기질로부터 다단계 경로로 모나틴 조성물을 제조하는 것을 포함하며, 이때 다단계 경로 중 하나 이상의 단계는 생물학적 전환 단계이며, 이때 모나틴 조성물은 석유 화학 제품, 독성 또는 유해한 화학 물질을 함유하지 않는다.

다른 실시양태에서, 모나틴 조성물을 포함하는 음료 조성물의 제조 방법은 생합성 경로로 모나틴 조성물을 제조하는 것을 포함하며, 이때 모나틴 조성물은 모나틴 또는 그의 염 및 기타 식용 또는 음용 물질로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 모나틴 조성물을 포함하는 음료 조성물의 제조 벙법은 기질로부터 다단계 경로로 모나틴 조성물을 제조하는 것을 포함하고, 이때 다단계 경로 중 하나 이상의 단계는 생물학적 전환 단계이며, 이때 모나틴 조성물은 모나틴 또는 그의 염 또는 기타 식용 또는 음용 물질로 이루어진다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명과 관련된 종래 기술의 당업자 중 한 사람에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기재되어 있는 것과 유사하거나 이와 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있으며, 적절한 방법 및 물질은 하기에서 기재되어 있다. 본원에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고 문헌은 전문이 참고로 인용된다. 분쟁의 경우에, 정의를 비롯한 본 명세서가 저지하게 된다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 오로지 예시적인 것이며 제한하기 위한 것이 아니다.

본 발명의 특정 실시양태는 상기 지시된 측면 중 하나 또는 그의 조합물, 뿐만 아니라 기타 측면에 관한 것이라는 점은 본원의 교시로부터 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 기타 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.

도 1은 모나틴 및/또는 인돌-3-피루베이트를 제조하는 데 사용된 생합성 경로를 도시한다. 한 경로는 트립토판을 통해 인돌-3-피루베이트를 제조하고, 또 다른 경로는 인돌-3-락트산을 통해 인돌-3-피루베이트를 제조한다. 모나틴은 MP 중간체를 통해 추후 제조된다.

박스 내에 도시된 화합물은 기질 및 생합성 경로로 제조된 생성물이다. 화살표에 인접한 조성물은 보조인자, 또는 기질의 생성물로의 전환 동안 사용될 수 있는 시약이다. 사용된 보조인자 또는 시약은 생합성 경로의 특정 단계에 사용된 폴리펩티드에 따라 좌우되게 된다. 보조인자 PLP (피리독살 5'-포스페이트)는 폴리펩티드에 독립적인 반응을 촉매화할 수 있기 때문에, 단순히 PLP를 제공하는 것이 기질로부터 생성물로 진행할 수 있게 한다.

도 2는 MP 중간체를 활용하는 생합성 경로의 보다 세부적인 도면이다. 상기 경로에서 각각의 단계에 대한 기질을 박스에 도시한다. 기질 간 전환을 허용하는 폴리펩티드를 기질 사이의 화살표에 인접하여 나열한다. 각각의 폴리펩티드를 그의 속명 및 효소 부류 (EC) 번호로 기재한다.

도 3은 인돌-3-락트산으로부터 인돌-3-피루베이트로의 전환의 생합성 경로의 보다 세부적인 도면이다. 기질을 박스 내에 도시하고, 기질 간 전환을 허용하는 폴 리펩티드를 기질 사이의 화살표에 인접하여 나열한다. 각각의 폴리펩티드를 그의 속명 및 효소 부류 (EC) 번호로 기재한다.

도 4는 화학적 수단을 통해 MP를 제조하는 한 가능한 반응을 도시한다.

도 5A 및 5B는 효소적으로 생성된 모나틴의 LC/MS 동정을 나타내는 크로마토그램이다.

도 6은 효소적으로 합성된 모나틴의 전자분사 질량 스펙트럼이다.

도 7A 및 7B는 효소 혼합물 중에서 생성된 모나틴의 LC/MS/MS 딸이온 분석의 크로마토그램이다.

도 8은 효소적으로 생성된 모나틴의 고해상도 질량 측정을 도시하는 크로마토그램이다.

도 9A-9C는 (A) R-트립토판, (B) S-트립토판, 및 (C) 효소적으로 생성된 모나틴의 키랄 분리를 도시하는 크로마토그램이다.

도 10은 IPTG 유도 후 세균 세포에서 생성된 모나틴의 상대량을 도시하는 막대 그래프이다. (-)는 기질을 첨가하지 않음(트립토판 또는 피루베이트를 첨가하지 않음)을 표시한다.

도 11-12는 트립토판 또는 인돌-3-피루베이트로부터 제조된 모나틴의 수율을 증가시키는 데 사용된 경로를 도시하는 개략도이다.

도 13은 트립토판 또는 인돌-3-피루베이트로부터 제조된 모나틴의 수율을 증가시키는 데 사용될 수 있는 경로를 도시하는 개략도이다.

도 14는 모나틴의 R,R, 입체 이성질체를 사용하여 얻은 용량 반응 곡선을 도 시한다.

도 15는 모나틴의 R,R/S,S 입체 이성질체 혼합물을 사용하여 얻은 용량 반응 곡선을 도시한다.

도 16은 모나틴의 R,R/S,S 입체 이성질체 혼합물을 사용하여 얻은 용량 반응 곡선을 사카린을 사용하여 얻은 용량 반응 곡선과 비교한다.

도 17은 합성으로 제조된 모나틴 표준의 역상 크로마토그래피를 도시한다.

도 18은 모나틴 표준의 키랄 크로마토그래피를 도시한다.

상세한 설명

모나틴 생산에 대한 생합성 경로의 개요

용어 및 방법의 하기 설명은 본 개시 내용을 더욱 잘 설명하고, 본 개시 내용을 실시하는 당업자에게 안내하기 위해 제공된다. 본 명세서에 사용된 "비롯한"은 "포함하는"을 포함한다. 또한, 단수 형태 "a" 또는 "an" 또는 "the"는 내용상 명확히 달리 언급하지 않으면 복수도 포함한다. "약"이라는 용어는 임의의 측정시 발생하는 실험 오차의 범위를 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 측정 수치는 "약"이라는 용어가 명시적으로 사용되지 않더라도 이들 앞에 "약"이라는 단어를 갖는 것으로 가정된다. "% 중량/부피" 또는 "% w/v"는 백분율의 부피당 중량을 의미하며, 이때 100 % 중량/부피는 1 ｇ/㎖이다. 따라서. 예를 들어, 1 ｇ/100 ㎖는 2 % 중량/부피(액체 조성물 중)이다. "ppm"이라는 용어는 백만 분의 일(part per million)을 의미한다. 80 ppm의 모나틴은, 예를 들어, 백만 그램 중 80 그램(ｇ)의 모나틴을 의미한다. 유사하게, 1 ppm = 0.0001 % w/w, 또는, 수용액의 경우 1 ppm = 1 ㎎/ℓ = 1 ㎍/㎖ = 0.0001 % 중량/부피이다.

도 1-3 및 도 11-13에 도시된 바와 같이, 많은 생합성 경로를 사용하여 모나틴 또는 그의 중간체, 예를 들면 인돌-3-피루베이트 또는 MP를 제조할 수 있다. 각각의 기질 (예를 들면, 글루코스, 트립토판, 인돌-3-락트산, 인돌-3-피루베이트, 및 MP)을 각각의 생성물 (예를 들면, 트립토판, 인돌-3-피루베이트, MP 및 모나틴)로 전환시키는 경우, 몇몇 상이한 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 또한, 이들 반응을 생체내, 시험관내, 또는 생체내 반응 및 시험관내 반응의 조합, 예를 들면 비효소 화학 반응을 포함하는 시험관내 반응을 통해 수행할 수 있다. 따라서, 도 1-3 및 도 11-13은 예시적인 것이며, 원하는 생성물을 수득하는 데 사용될 수 있는 다수의 상이한 경로를 나타낸다.

글루코스로부터 트립토판

많은 유기체들은 글루코스로부터 트립토판을 합성할 수 있다. 글루코스로부터 모나틴, MP 및/또는 인돌-3-피루베이트 및/또는 트립토판을 제조하는 데 필요한 유전자(들)를 함유하는 구조체(들)를 이러한 유기체로 클로닝할 수 있다. 트립토판이 모나틴으로 전환될 수 있다는 것이 밝혀졌다.

다른 예에서, 공지된 폴리펩티드를 사용하여 유기체를 조작하여 트립토판을 생성하거나 또는 트립토판을 과다생성할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제 4,371,614호는 야생형 트립토판 오페론을 함유하는 플라스미드로 형질전환된 대장균 균주를 기재하고 있다.

미국 특허 제 4,371,614호에 개시된 트립토판의 최대 역가는 약 230 ppm이 다. 유사하게, WO 8701130은 유전자 조작되어 트립토판을 생성하는 대장균 균주를 기재하고 있으며, L-트립토판의 발효 생산 증가를 논의하고 있다. 당업자는 글루코스로부터 트립토판을 생산할 수 있는 유기체가, 유사한 결과를 제공하면서 글루코스 또는 프룩토오스-6-포스페이트로 전환될 수 있는 다른 탄소 및 에너지원도 사용할 수 있다는 점을 인식할 것이다. 예시적인 탄소 및 에너지원은 슈크로오스, 프룩토오스, 전분, 셀룰로오스 또는 글리세롤을 포함하며 이에 한정되지 않는다.

트립토판으로부터 인돌-3- 피루베이트

몇몇 폴리펩티드를 트립토판으로부터 인돌-3-피루베이트로 전환하는 데 사용할 수 있다. 예시적인 폴리펩티드는 다수의 효소 부류 (EC) 2.6.1.27, 1.4.1.19, 1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3, 2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1, 및 2.6.1.21을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 이들 부류는 L-트립토판 및 2-옥소글루타레이트를 인돌-3-피루베이트 및 L-글루타메이트로 전환시키는 트립토판 아미노트랜스퍼라아제 (또한, L-페닐알라닌-2-옥소글루타레이트 아미노트랜스퍼라아제, 트립토판 트란스아미나아제, 5-히드록시트립토판-케토글루타르산 트란스아미나아제, 히드록시트립토판 아미노트랜스퍼라아제, L-트립토판 아미노트랜스퍼라아제, L-트립토판 트란스아미나아제, 및 L-트립토판:2-옥소글루타레이트 아미노트랜스퍼라아제로도 불림), D-트립토판 및 2-옥소 산을 인돌-3-피루베이트 및 아미노산으로 전환시키는 D-트립토판 아미노트랜스퍼라아제, L-트립토판 및 NAD(P)를 인돌-3-피루베이트 및 NH₃ 및 NAD(P)H로 전환시키는 트립토판 디히드로게나아제 (또한, NAD(P)-L-트립토판 디히드로게나아제, L-트립토판 디히드로게나아제, L-Trp-디히드로게나아제, TDH 및 L-트립토판:NAD(P) 옥시도리덕타아제 (탈아민화)로도 불림), D-아미노산 및 FAD를 인돌-3-피루베이트 및 NH₃ 및 FADHZ로 전환시키는 D-아미노산 디히드로게나아제; L-트립토판 및 페닐피루베이트를 인돌-3-피루베이트 및 L-페닐알라닌으로 전환시키는 트립토판-페닐피루베이트 트란스아미나아제 (또한, L-트립토판-α-케토이소카르포에이트 아미노트랜스퍼라아제 및 L-트립토판:페닐피루베이트 아미노트랜스퍼라아제로도 불림), L-아미노산 및 H₂O 및 O₂를 2-옥소 산 및 NH₃ 및 H₂O₂로 전환시키는 L-아미노산 옥시다아제 (또한, 오피오-아미노-산 옥시다아제 및 L-아미노-산:산소 옥시도리덕타아제 (탈아민화)로도 불림), D-아미노산 및 H₂O 및 O₂를 2-옥소 산 및 NH₃ 및 H₂O₂로 전환시키는 D-아미노산 옥시다아제 (또한, 오피오-아미노-산 옥시다아제 및 D-아미노-산:산소 옥시도리덕타아제 (탈아민화)로도 불림), 및 L-트립토판 및 H₂O 및 O₂를 인돌-3-피루베이트 및 NH₃ 및 H₂O₂로 전환시키는 트립토판 옥시다아제로 불리는 폴리펩티드를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한, 이러한 부류들은 이 중 일부가 트립토판 및 2-옥소 산을 인돌-3-피루베이트 및 아미노산으로 전환시킬 수 있는 다중 아미노트랜스퍼라아제 활성을 갖는 티로신 (방향족) 아미노트랜스퍼라아제, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제, D-아미노산 (또는 D-알라닌) 아미노트랜스퍼라아제, 및 광역 (다중 기질) 아미노트랜스퍼라아제를 함유한다.

서열 번호 11 및 서열 번호 12에 나타낸 신규한 아미노트랜스퍼라아제를 비롯하여 이러한 활성을 갖는 11 개의 아미노트랜스퍼라아제 부류를 하기 실시예 1에 설명한다. 따라서, 본 개시 내용은 각각 서열 번호 11 및 서열 번호 12에 나타낸 서열과 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 98 % 이상, 또는 심지어 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는 단리된 핵산 및 아미노산 서열을 제공한다. 또한, 본 개시 내용은 아미노트랜스퍼라아제 활성을 갖거나 또는 아미노트랜스퍼라아제 활성을 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열 번호 11 및 서열 번호 12에 나타낸 서열의 단편 및 융합을 포함한다. 예시적인 단편은 서열 번호 11의 10, 12, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 또는 1000 개 이상의 인접 뉴클레오티드 또는 서열 번호 12의 6, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300 또는 350 개 이상의 인접 아미노산을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 개시된 서열 (및 그의 변이체, 단편 및 융합)은 벡터의 일부일 수 있다. 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 트립토판으로부터 인돌-3-피루베이트를 생성할 수 있는 재조합 세포를 제조할 수 있으며, 일부 예에서는 추가로 MP 및/또는 모나틴을 생성할 수 있다.

L-아미노산 옥시다아제 (1.4.3.2)는 공지되어 있고, 서열은 몇몇 상이한 공급원, 예를 들면 비페라 레베틴 (Vipera lebetine) (sp P81375), 오피오파거스 하나하 (Ophipphagus hannah) (spP81383), 아그키스트로돈 로도스토마 (Agkistrodon rhodostoma) (spP81382), 크로탈루스 아트록스 (Crotalus atrox) (sp P56742), 부르크홀더리아 세파시아 (Burkholderia cepacia), 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 카울로박터 크레센투스 (Caulobacter cresentus), 클라미도모나스 레인하르드티 (Chlamydomonas reinhardtii), 뮤스 뮤수쿨러스 (Mus musculus), 수도모나스 시린게 (Pseudomonas syringae) 및 로도코쿠스 스트르 (Rhodococcus str.)로부터 단리될 수 있다. 또한, 트립토판 옥시다아제는 문헌에 기재되어 있고, 예를 들면, 코프리누스 (Coprinus) sp. SF-1, 뿌리혹병을 갖는 배추, 아라비도프시스 탈리아나 및 포유류 간으로부터 단리될 수 있다. 트립토판을 인돌-3-피루베이트로 전환시킬 수 있는 L-아미노산 옥시다아제 부류의 한 구성원은 실시예 3에 기재되어 있을 뿐만 아니라 분자 클로닝에 대한 대체 공급원이다. 분자 클로닝에 대한 데이터베이스에서 많은 D-아미노산 옥시다아제 유전자들이 이용가능하다.

트립토판 디히드로게나아제는 공지되어 있고, 예를 들면, 시금치, 피숨사티붐 (Pisumsativum), 프로소피스 줄리플로라 (Prosopis juliflora), 완두콩, 메스키트 (mesquite), 밀, 옥수수, 토마토, 담배, 크로모박테리움 비오라세움 (Chromobacterium violaceum) 및 락토바실리 (Lactobacilli)로부터 단리될 수 있다. 많은 D-아미노산 디히드로게나아제 유전자 서열이 공지되어 있다.

도 11-13에 도시된 바와 같이, 아미노산 옥시다아제, 예를 들면 트립토판 옥시다아제를 사용하여 트립토판을 인돌-3-피루베이트로 전환시키는 경우, 카탈라아제를 사용하여 과산화수소를 감소시키거나 또는 심지어 이의 존재를 제거할 수 있다.

인돌-3- 락테이트로부터 인돌-3- 피루베이트

인돌-3-락테이트를 인돌-3-피루베이트로 전환시키는 반응은 다양한 폴리펩티드, 예를 들면 번호 1.1.1.110, 1.1.1.27, 1.1.1.28, 1.1.2.3, 1.1.1.222, 1.1.1.237, 1.1.3.-, 또는 1.1.1.111 부류의 폴리펩티드에 의해 촉매화될 수 있다. 1.1.1.110 부류의 폴리펩티드는 인돌락테이트 디히드로게나아제 (또한, 인돌락트 산:NAD⁺ 옥시도리덕타아제로도 불림)를 포함한다. 1.1.1.27, 1.1.1.28, 및 1.1.2.3 부류는 락테이트 디히드로게나아제 (또한, 락트산 디히드로게나아제, 락테이트:NAD⁺ 옥시도리덕타아제로도 불림)를 포함한다. 1.1.1.222 부류는 (R)-4-히드록시페닐락테이트 디히드로게나아제 (또한, D-방향족 락테이트 디히드로게나아제, R-방향족 락테이트 디히드로게나아제, 및 R-3-(4-히드록시페닐) 락테이트:NAD(P)⁺ 2-옥시도리덕타아제로도 불림)를 함유하고, 1.1.1.237 부류는 3-(4-히드록시페닐피루베이트) 리덕타아제 (또한, 히드록시페닐피루베이트 리덕타아제 및 4-히드록시페닐락테이트:NAD⁺ 옥시도리덕타아제로도 불림)를 함유한다. 1.1.3.- 부류는 락테이트 옥시다아제를 함유하고, 1.1.1.111 부류는 (3-이미다졸-5-일) 락테이트 디히드로게나아제 (또한, (S)-3-(이미다졸-5-일) 락테이트:NAD(P)⁺ 옥시도리덕타아제로도 불림)를 함유한다. 이들 부류 중의 몇몇 폴리펩티드는 인돌-3-락트산으로부터 인돌-3-피루베이트의 생산을 가능케 할 가능성이 높다. 이러한 전환의 예는 하기 실시예 2에 제공된다.

또한, 화학 반응을 사용하여 인돌-3-락트산을 인돌-3-피루베이트로 전환시킬 수 있다. 이러한 화학 반응은 금속 촉매의 존재 하에서 몇몇 방법, 예를 들면 B2 촉매 (문헌[China Chemical Reporter, vol. 13, no. 28, pg. 18(1), 2002] 참조), 묽은 과망간산염 및 과염소산염, 또는 과산화수소를 사용한 공기 산화를 사용하여 달성될 수 있는 산화 단계를 포함한다.

인돌-3- 피루베이트로부터 2-히드록시 2-(인돌- 3일메틸 )-4- 케토 글루타르산 (MP)

몇몇 공지된 폴리펩티드를 인돌-3-피루베이트를 MP로 전환하는 데 사용할 수 있다. 예시적인 폴리펩티드 부류는 4.1.3.-, 4.1.3.16, 4.1.3.17, 및 4.1.2.-를 포함한다. 이들 부류는 두 카르복실산 기질의 축합을 촉매화하는 탄소-탄소 신타아제/리아제, 예를 들면 알돌라아제를 포함한다. 폴리펩티드 부류 EC 4.1.3.-는 친전자체로서 옥소-산 기질 (예를 들면, 인돌-3-피루베이트)을 사용하여 탄소-탄소 결합을 형성하는 신타아제/리아제인 한편, EC 4.1.2.-는 친전자체로서 알데히드 기질 (예를 들면, 벤즈알데히드)을 사용하여 탄소-탄소 결합을 형성하는 신타아제/리아제이다.

예를 들면, EP 1045-029에 기재된 폴리펩티드 (EC 4.1.3.16, 4-히드록시-2옥소글루타레이트 글리옥실레이트-리아제 또한, 4-히드록시-2-옥소글루타레이트 알돌라아제, 2-옥소-4-히드록시글루타레이트 알돌라아제 또는 KHG 알돌라아제로도 불림)는 글리옥실산 및 피루베이트를 4-히드록시-2-케토글루타르산으로 전환시키고, 폴리펩티드 4-히드록시-4-메틸-2옥소글루타레이트 알돌라아제 (EC 4.1.3.17, 또한, 4-히드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 피루베이트-리아제 또는 ProA 알돌라아제로도 불림)은 두 케토-산, 예를 들면 두 피루베이트를 4-히드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트로 축합시킨다. 이들 리아제를 사용한 반응이 본 명세서에 기재된다.

도 1-2 및 도 11-13은 이들 반응의 개략도를 도시하며, 여기서 3-탄소 (C3) 분자가 인돌-3-피루베이트와 합쳐진다. EC 4.1.2.- 및 4.1.3.-의 많은 구성원, 특 히 PLP-사용 폴리펩티드는 아미노산, 예를 들면 세린, 시스테인, 및 알라닌, 또는 그들의 유도체인 C3 분자를 사용할 수 있다. EC 4.1.2.- 및 4.1.3.-의 대표물에 의해 촉매화되는 알돌 축합은 이 경로의 3 개의 탄소 분자가 피루베이트 또는 피루베이트의 유도체일 것을 필요로 한다. 그러나, 다른 화합물들이 C3 탄소 공급원으로 작용할 수 있고, 피루베이트로 전환될 수 있다. 상기 언급한 것들 중 많은 것들을 비롯한 많은 PLP-사용 트란스아미나아제에 의해 알라닌을 아미노기 전이시켜 피루베이트를 수득할 수 있다. 피루베이트 및 암모니아는 L-세린, L-시스테인 및 세린 및 시스테인의 유도체와 충분한 이탈기, 예를 들면 0-메틸-L-세린, 0-벤질-L-세린, S-메틸시스테인, S-벤질시스테인, S-알킬-L-시스테인, 0-아실-L-세린, 및 3-클로로-L-알라닌의 베타-제거 반응 (예를 들면, 트립토판네이즈 또는 β-티로시네이즈에 의해 촉매화되는 것들)에 의해 얻어질 수 있다. 아스파테이트는 PLP-매개 베타-리아제 반응에서 피루베이트의 공급원, 예를 들면 트립토판네이즈 (EC 4.1.99.1) 및/또는 β-티로시네이즈 (EC 4.1.99.2, 또한, 티로신-페놀 리아제로도 불림)에 의해 촉매화되는 것들로 작용할 수 있다. 베타-리아제 반응 속도는 문헌[Mouratou et al. (J. Biol. Chem 274: 1320-5, 1999)]에 기재된 바와 같이 및 실시예 8에서 (4.1.99.1-2) 폴리펩티드 상에서 특정 부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)을 수행함으로써 증가될 수 있다. 이러한 변형들은 폴리펩티드가 디카르복실산 아미노산 기질을 수용하게 한다. 또한, 락테이트는 피루베이트의 공급원으로 작용할 수 있고, 락테이트 디히드로게나아제 및 산화된 보조인자 또는 락테이트 옥시다아제 및 산소의 첨가에 의해 피루베이트로 산화된다. 이러한 반응의 예는 하기 기재되어 있다. 예를 들면, 도 2 및 도 11-13에 도시된 바와 같이, ProA 알돌라아제는 피루베이트가 C3 분자로 사용된 경우 인돌-3-피루베이트와 접촉할 수 있다.

또한, MP는 화학 반응, 예를 들면 실시예 5에 제공된 알돌 축합을 사용하여 생성될 수 있다.

MP 로부터 모나틴

MP로부터 모나틴으로의 전환은 트립토판 아미노트랜스퍼라아제 (2.6.1.27), 트립토판 디히드로게나아제 (1.4.1.19), D-아미노산 디히드로게나아제 (1.4.99.1), 글루타메이트 디히드로게나아제 (1.4.1.2-4), 페닐알라닌 디히드로게나아제 (EC 1.4.1.20), 트립토판-페닐피루베이트 트란스아미나아제 (2.6.1.28), 또는 더욱 일반적으로 다수의 아미노트랜스퍼라아제 족 (2.6.1.-), 예를 들면 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.1), 티로신 (방향족) 아미노트랜스퍼라아제 (2.6.1.5), D-트립토판 아미노트랜스퍼라아제, 또는 D-알라닌 (2.6.1.21) 아미노트랜스퍼라아제 (도 2) 중 하나 이상에 의해 촉매화될 수 있다. 서열 번호 11 및 서열 번호 12에 나타난 부류의 신규한 원을 비롯하여 11 개의 원의 아미노트랜스퍼라아제 부류를 하기 (실시예 1)에 기재하고, 아미노트랜스퍼라아제 및 디히드로게나아제 효소의 활성을 입증하는 반응을 하기 실시예 7에 제공한다.

또한, 이 반응은 화학 반응을 사용하여 수행될 수 있다. 케토 산 (MP)의 아민화는 암모니아 및 소듐 시아노보로히드리드를 사용한 환원성 아민화에 의해 수행된다.

도 11-13은 MP를 모나틴으로 전환하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 인돌-3-피루베이트 또는 트립토판으로부터 모나틴의 증가된 수율을 제공할 수 있는 추가적인 폴리펩티드를 도시한다. 예를 들면, 아스파테이트를 아미노 공여체로 사용하는 경우, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 아스파테이트로부터 옥살로아세테이트로 전환하는 데 사용할 수 있다 (도 11). 옥살로아세테이트는 데카르복실라아제, 예를 들면 옥살로아세테이트 데카르복실라아제에 의해 피루베이트 및 이산화탄소로 전환된다 (도 11). 또한, 리신을 아미노 공여체로 사용하는 경우, 리신 엡실론 아미노트랜스퍼라아제를 리신으로부터 알리신으로 전환하는 데 사용할 수 있다 (도 12). 알리신은 자발적으로 1-피페리딘 6-카르복실레이트로 전환된다 (도 12). 환원성 아민화 반응 (예를 들면, 글루타메이트 디히드로게나아제)을 촉매화할 수 있는 폴리펩티드를 사용하여 MP를 모나틴으로 전환시키는 경우, NAD(P)H를 재순환시키고(재순환시키거나) 휘발성 생성물을 생성할 수 있는 폴리펩티드 (도 13), 예를 들면 포르메이트 디히드로게나아제를 사용할 수 있다.

생합성 경로의 디자인에서의 추가적인 고려 사항

어떤 폴리펩티드를 사용하여 인돌-3-피루베이트, MP 및/또는 모나틴을 생성하느냐에 따라, 보조인자, 기질 및/또는 추가적인 폴리펩티드를 생성물 형성을 강화하도록 생산 세포에 제공할 수 있다. 또한, 유전자 변형을 디자인하여 생성물, 예를 들면 인돌-3-피루베이트, MP 및/또는 모나틴의 생산을 강화시킬 수 있다. 유사하게, 모나틴 생산에 사용되는 숙주 세포를 최적화할 수 있다.

과산화수소의 제거

과산화수소 (H₂O₂)는 생성된 경우 생성되는 생산 세포, 폴리펩티드 또는 생성물 (예를 들면, 중간체)에 손상을 줄 수 있는 생성물이다. 상기한 L-아미노산 옥시다아제는 생성물로서 H₂O₂를 생성한다. 따라서, L-아미노산 옥시다아제를 사용하는 경우, 생성되는 H₂O₂를 제거할 수 있거나 또는 세포 또는 생성물에 가능한 손상을 감소시킬 수 있는 양으로 그의 양을 감소시킨다.

카탈라아제를 사용하여 세포에서 H₂O₂의 양을 감소시킬 수 있다(도 11-13). 생산 세포는 과산화수소가 물 및 산소 기체로 분해되는 것을 촉매화하는 카탈라아제 (EC 1.11.1.6)를 코딩하는 유전자 또는 cDNA 서열을 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 카탈라아제는 생산 세포로 형질감염되는 벡터로부터 발현될 수 있다. 사용될 수 있는 카탈라아제의 예는 tr｜Q9EV50 (스타필로코쿠스 크실로수스 (Staphylococcus xylosus)), tr｜Q9KBE8 (바실러스 할로듀란스 (Bacillus halodurans)), tr｜Q9URJ7 (칸디다 알비칸스(Candida albicans)), tr｜P77948 (스트렙토마이세스 코엘리컬러 (Streptomyces coelicolor)), tr｜Q9RBJ5 (잔토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris)) (스위스프로트 기탁 번호 (SwissProt Accession Nos.))를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한, L-아미노산 옥시다아제, D-아미노산 옥시다아제 또는 트립토판 옥시다아제를 사용하는 생촉매 반응기는 카탈라아제 폴리펩티드를 함유할 수 있다.

피리독살-5'- 포스페이트 ( PLP ) 이용성의 조절

도 1에 도시된 바와 같이, PLP는 본 명세서에 기재된 생합성 단계 중 하나 이상에서 사용될 수 있다. PLP가 반응의 전체 효율을 제한하지 않도록 PLP의 농도를 보충할 수 있다.

비타민 B₆ (PLP의 전구체)에 대한 생합성 경로가 대장균에서 철저하게 연구되었으며, 일부 단백질이 결정화되었다 (문헌[Laber et al., FEBS Letters, 449: 45-8, 1999] 참조). 유전자 (epd 또는 gapB 및 serC)들 중 2 가지가 다른 대사 경로에 필요하며, 3 가지 유전자 (pdxA, pdxB 및 pdxJ)들이 피리독살 포스페이트 생합성에 유니크하다. 대장균 경로에서 출발 물질 중 하나는 1-데옥시-D-크실루로오스-5-포스페이트 (DXP)이다. 통상의 2 및 3 탄소 중심 대사 산물로부터 이 전구체를 합성하는 것은 리펩티드 1-데옥시-D크실루로오스-5-포스페이트 신타아제 (DXS)에 촉매화된다. 다른 전구체는 4-탄소 당, D-에리트로오스 4-포스페이트로부터 형성된 트레오닌 유도체이다. 포스포-4-히드록실-L 트레오닌 (HTP)으로의 전환에 필요한 유전자는 epd, pdxB 및 serC이다. PLP의 형성에 대한 마지막 반응은 pdxA 및 pdxJ의 유전자 생성물에 의해 촉매화되는 DXP와 HTP 사이의 복잡한 세포내 축합 및 폐환 (ring-closure) 반응이다.

PLP가 모나틴을 제조하는 발표 과정 동안 제한 영양분이 되는 경우, 생산 숙주 세포에서 하나 이상의 경로 유전자의 증가된 발현을 사용하여 모나틴의 수율을 증가시킬 수 있다. 숙주 유기체는 그의 본래의 경로 유전자의 다중 카피를 함유할 수 있거나 또는 비본래의 경로 유전자의 카피를 유기체의 게놈에 혼입시킬 수 있다. 게다가, 구출 (salvage) 경로 유전자의 다중 카피를 숙주 유기체로 클로닝할 수 있다.

모든 유기체에서 보존되는 한 구출 경로는 비타민 B₆의 다양한 유도체를 활성 PLP 형태로 재순환시킨다. 이 경로에 관련된 폴리펩티드는 pdxK 키나아제, pdxH 옥시다아제 및 pdxY 키나아제이다. 이들 유전자 중 하나 이상의 과발현은 PLP 이용성을 증가시킬 수 있다.

비타민 B₆ 양은 숙주 유기체에서 본래의 생합성 경로 유전자의 대사 조절을 제거하거나 또는 억제함으로써 상승될 수 있다. PLP는 세균 플라보박테리움 (Flavobacterium) sp. 균주 238-7에서 전구체 트레오닌 유도체의 생합성과 관련된 폴리펩티드를 억제한다. 대사 통제가 없는 이 세균 균주는 피리독살 유도체를 과다 생성하고, 20 mg/L 이하의 PLP를 분비할 수 있다. 유사한 방식으로 모나틴을 생성하는 숙주 유기체의 유전자 조작은 생합성 경로 유전자의 과발현 없이 PLP의 생산을 증가시키게 된다.

암모늄 활용

트립토판네이즈 반응은 더욱 이용가능한 암모니아를 제조함으로써 또는 물의 제거에 의해 합성 방향 (인돌로부터 트립토판의 생산)으로 구동될 수 있다. 또한, 환원성 아민화 반응, 예를 들면 글루타메이트 디히드로게나아제에 의해 촉매화되는 것들은 과량의 암모늄에 의해 진행될 수 있다.

암모니아는 카르보네이트 또는 포스페이트 완충 시스템에서 탄산암모늄 또는 인산암모늄 염으로 이용가능해질 수 있다. 또한, 암모니아는 암모늄 피루베이트 또는 포름산암모늄으로 제공될 수 있다. 별법으로, 반응이 암모니아, 예를 들면 글루 타메이트 디히드로게나아제 또는 트립토판 디히드로게나아제를 생성하는 반응과 커플링된 경우 암모니아를 공급할 수 있다. 암모니아는 페놀 또는 인돌, 피루베이트 및 NH₃로 가수분해되게 되는 EC 4.1.99.- (티로신 또는 트립토판)의 천연 기질을 첨가함으로써 생성될 수 있다. 또한, 이는 효소를 그의 바람직한 기질로 가수분해함으로써 정상 평형량을 넘어 합성 생성물의 수율을 증가시킬 수 있다.

생성물 및 부산물의 제거

트립토판 아미노트랜스퍼라아제를 통해 트립토판으로부터 인돌-3-피루베이트로 전환하는 것은 반응이 글루타메이트를 생산하고, 공-기질 2-옥소글루타레이트 (α-케토글루타레이트)를 필요로 하기 때문에 인돌-3-피루베이트의 생산율에 악영향을 미칠 수 있다. 글루타메이트는 아미노트랜스퍼라아제의 억제를 일으킬 수 있고, 반응은 다량의 공-기질을 소비할 수 있다. 또한, 높은 글루타메이트 농도는 하류 분리 방법에 유해할 수 있다.

폴리펩티드 글루타메이트 디히드로게나아제 (GLDH)는 글루타메이트를 2-옥소글루타레이트로 전환시킴으로써 트립토판 아미노트랜스퍼라아제에 의해 촉매화되는 반응에서 공-기질을 재순환시킨다. 또한, GLDH는 호기성 조건 하에서 세포에 대한 에너지 (ATP)를 생성하는 데 사용될 수 있는 등가물 (NADH 또는 NADPH)의 생성을 감소시킨다. 또한, GLDH에 의한 글루타메이트의 활용은 부산물 형성을 감소시킨다. 또한, 반응은 도 1에 도시된 바와 같이 최종 단계에 대한 환원성 아민화에서 세포에 대한 질소 공급원으로서 또는 기질로서 작용할 수 있는 암모니아를 생성한다. 따라서, GLDH 폴리펩티드를 과발현하는 생산 세포는 수율을 증가시키고 배지 및/또 는 분리 방법의 비용을 감소시키는 데 사용될 수 있다.

트립토판으로부터 모나틴으로의 경로에서, 단계 3의 아미노 공여체 (예를 들면, 글루타메이트 또는 아스파테이트)는 적합한 효소 부류로부터의 아미노트랜스퍼라아제가 사용되는 경우 단계 1에 필요한 아미노 수용체 (예를 들면, 2-옥소-글루타레이트 또는 옥살로아세테이트)로 다시 전환될 수 있다. 한 트란스아미나아제의 기질이 다른 트란스아미나아제의 활성을 경쟁적으로 억제하지 못하는 이 경로에 2 개의 별도의 트란스아미나아제를 활용하는 것은 이 경로의 효율을 증가시킬 수 있다.

상기 경로의 많은 반응은 가역적이기 때문에, 기질과 생성물 간의 평형에 도달할 수 있다. 상기 경로의 수율은 폴리펩티드로부터 생성물의 연속적인 제거에 의해 증가될 수 있다. 예를 들면, 퍼메아제 (permease) 또는 다른 수송 단백질, 또는 기질의 동시 재순환을 사용하여 생촉매 반응기 스트림으로부터의 모나틴의 선택적 결정화를 사용하여 모나틴을 발효 브로쓰 (broth)로 분비시키는 것은 반응 수율을 증가시킬 수 있다.

추가적인 효소 반응을 통한 또는 아미노 공여체 군의 치환 부산물의 제거는 반응 수율을 증가시키는 또 다른 방법이다. 몇몇 예들이 본 실시예 13에서 논의되며 도 11-13에 도시되어 있다. 예를 들면, 상 변화 (증발) 또는 자발적 전환에 의해 비반응성 최종 생성물, 예를 들면 이산화탄소로 역 방향 반응하는 것이 이용가능하지 않은 부산물이 제조될 수 있다.

기질 풀 ( pool )의 조절

인돌 풀은 트립토판 전구체의 생산을 증가시킴으로써 및/또는 인돌-3-피루베이트및/또는 트립토판을 포함하는 이화 경로를 변화시킴으로써 조절될 수 있다. 예를 들면, 인돌-3-피루베이트로부터의 인돌-3-아세트산의 생산은 숙주 세포에서 EC 4.1.1.74에 대한 유전자 코딩을 기능적으로 삭제함으로써 감소되거나 또는 제거될 수 있다. 트립토판으로부터의 인돌의 생산은 숙주 세포에서 EC 4.1.99.1에 대한 유전자 코딩을 기능적으로 삭제함으로써 감소되거나 또는 제거될 수 있다. 별법으로, 과량의 인돌은 EC 4.1.99.1에 대한 증가된 양의 유전자 코딩과의 조합으로 시험관내 또는 생체내 방법에서 기질로서 사용될 수 있다 (문헌[Kawasaki et al., J Ferm. and Bioeng., 82: 604-6, 1996] 참조). 또한, 유전자 변형을 수행하여 중간체, 예를 들면 D-에리트로오스-4-포스페이트 및 코리스메이트 (chorismate)의 양을 증가시킬 수 있다.

트립토판 생산은 대부분의 유기체에서 조절된다. 한 기전은 경로에서 특정한 효소의 피드백 억제를 통해 이루어지며, 트립토판 양이 증가함에 따라, 트립토판의 생산율은 감소한다. 따라서, 트립토판 중간체를 통해 모나틴를 생산하도록 조작된 숙주 세포을 사용하는 경우, 트립토판 농도에 민감하지 않은 유기체를 사용할 수 있다. 예를 들면, 다양한 트립토판 유사체에 의해 성장 억제에 내성이 있는 카타란투스 로세우스 (Catharanthus roseus)의 균주를 고 농도의 5-메틸트립토판에 반복하여 노출시킴으로써 선택하였다 (문헌[Schallenberg and Berlin, Z Naturforsch 34: 541-5, 1979] 참조). 상기 균주의 생성되는 트립토판 신타아제 활성은 유전자 중 돌연변이로 기인한 것과 같이 생성물 억제에 의해 영향을 적게 받았다. 유사하 게, 모나틴 생산에 사용된 숙주 세포를 최적화하였다.

지향된 방출을 사용함으로써 트립토판 생산을 최적화하여 생성물 억제에 덜 민감한 폴리펩티드를 방출할 수 있다. 예를 들면, 배지 중에 트립토판을 함유하지 않지만 고량의 대사가능하지 않은 트립토판 유사체를 함유하는 플레이트 상에서 스크리닝을 수행할 수 있다. 미국 특허 제 5,756,345호, 제 4,742,007호 및 제 4,371,614호는 발효 유기체에서 트립토판 생산성을 증가시키는 데 사용되는 방법을 기재하고 있다. 트립토판 생합성의 마지막 단계는 세린을 인돌에 첨가하는 것이기 때문에, 세린의 이용가능성을 증가시켜 트립토판 생산을 증가시킬 수 있다.

발효 유기체에 의해 생산되는 모나틴의 양은 숙주 유기체에 의해 생산되는 피루베이트의 양을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 특정한 효모, 예를 들면 트리코스폰 쿠타네움 (Trichosporon cutaneum) (문헌[Wang et al., Lett. Appl. Microbiol. 35: 338-42, 2002] 참조) 및 토룰로프시스 글라브라타 (Torulopsis glabrata) (문헌[Li et al., Appl Microbiol. Biotechnol. 57: 451-9, 2001] 참조)는 피루베이트를 과다생산하고, 본 명세서에 개시된 상기 방법을 실시하는 데 사용될 수 있다. 또한, 대장균 균주 W14851ip2에서의 것들과 같이 유기체에 유전자 변형을 수행하여 피루브산 생산을 촉진시킬 수 있다(문헌[Kawasaki et al., J. Ferm. and Bioeng. 82: 604-6, 1996] 참조).

키랄성 통제

모나틴의 미감 프로파일은 그의 입체화학성 (키랄성)을 통제함으로써 변할 수 있다. 예를 들면, 상이한 식품 시스템 농도로 된 상이한 블렌드 중에서 상이한 모나틴 이성질체가 바람직할 수 있다. 키랄성은 pH 및 폴리펩티드의 조합을 통해 통제될 수 있다.

모나틴의 C-4 위치(상기 분자 번호 참조)에서의 라세미화가 알파 탄소의 탈양자화 및 재양자화에 의해 발생할 수 있으며, pH 이동에 의해 또는 효소, 예를 들면 라세마아제 (racemase)에 결합되거나 또는 용액 중에 유리된 보조인자 PLP와의 반응에 의해 발생할 수 있다. 미생물에서, pH는 라세미화를 일으키기 충분하게 이동하지 못하기 쉽지만 PLP는 풍부하다. 폴리펩티드를 사용하여 키랄성을 통제하는 방법은 모나틴 생산에 활용되는 생합성 경로에 따라 좌우된다.

모나틴이 도 2에 도시된 경로를 사용하여 형성되는 경우, 하기를 고려할 수 있다. 생촉매 반응에서, 탄소-2의 키랄성은 인돌-3-피루베이트를 MP로 전환시키는 효소에 의해 결정될 수 있다. 다중 효소는 (예를 들면, EC 4.1.2.-, 4.1.3.-로부터) 인돌-3-피루베이트를 MP로 전환시킬 수 있기 때문에, 원하는 이성질체를 형성하는 효소를 선택할 수 있다. 별법으로, 인돌-3-피루베이트를 MP로 전환시키는 효소의 거울 특이성 (enantiospecificity)은 지향된 방출의 사용을 통해 변형될 수 있거나, 또는 촉매작용성 항체를 조작하여 원하는 반응을 촉매화할 수 있다. MP가 제조되면 (효소적으로 또는 화학적 축합에 의해), 아미노기는 트란스아미나아제, 예를 들면 본 명세서에 기재된 것들을 사용하여 입체특이적으로 첨가될 수 있다. D- 또는 L-방향족 산 아미노트랜스퍼라아제를 사용하느냐에 따라 탄소-4의 R 또는 S 배위가 생성될 수 있다. 대부분의 아미노트랜스퍼라아제가 L-이성질체에 특이적이나, D-트립토판 아미노트랜스퍼라아제가 특정한 식물에 존재한다(문헌[Kohiba and Mito, Proceedings of 8th International Symposium on Vitamin B₆ and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japan 1990] 참조). 또한, D-알라닌 아미노트랜스퍼라아제 (2.6.1.21), D-메티오닌-피루베이트 아미노트랜스퍼라아제 (2.6.1.41), 및 (R)-3-아미노-2-메틸프로파노에이트 아미노트랜스퍼라아제 (2.6.1.61) 및 (S)-3-아미노-2-메틸프로파노에이트 아미노트랜스퍼라아제 (2.6.1.22) 양쪽 모두가 동정되었다. 특정한 아미노트랜스퍼라아제는 오직 C2 탄소에서 특정 배위를 사용하여 이 반응에 대한 기질만을 수용할 수 있다. 따라서, 비록 MP로의 전환이 입체특이적이지 않더라도, 최종 생성물의 입체화학성은 트란스아미나아제의 적합한 선택을 통해 통제될 수 있다. 반응이 가역적이기 때문에, 미반응된 MP (원치 않은 이성질체)를 그의 구성성분으로 다시 재순환시킬 수 있고, MP의 라세믹 혼합물이 재형성될 수 있다.

기질 활성화

인산화된 기질, 예를 들면 포스폰엔올피루베이트 (PEP)를 본 명세서에 개시된 반응에서 사용할 수 있다. 인산화된 기질은 에너지적으로 유리할 수 있기 때문에, 반응 속도 및/또는 수율을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 알돌 축합에서, 포 스페이트기의 첨가는 친핵성 기질의 엔올 호변이성질체를 안정화시키고, 이를 더 반응성이게 한다. 다른 반응에서, 인산화된 기질은 더욱 우수한 이탈기를 제공할 수 있다. 유사하게, 기질은 CoA 유도체 또는 피로포스페이트 유도체로의 전환에 의해 활성화될 수 있다.

음료 조성물 중 모나틴의 용도

모나틴의 S,S 입체 이성질체는 중량 기준으로 슈크로오스보다 대략 50∼200배의 감미성을 갖는다. 모나틴의 R,R 입체 이성질체는 중량 기준으로 슈크로오스보다 대략 2,000∼2,400배의 감미성을 갖는다. 모나틴의 감미성은 시험 감미제 용액을 일련의 기준 용액 중 하나에 대한 감미성 강도에 매칭시키는 감미성 비교 절차에서 숙련된 감각 평가단을 사용하여 산정하였다. 예를 들어, ∼pH 3.0에서 시트르산 0.16%(w/v) 및 시트르산 나트륨 0.02%(w/v)를 포함하는 완충제를 사용하여 상기 용액을 제조할 수 있다.

구체적으로, 감미성 판단 절차에서 숙련된 감각 평가단 중 한 패널을 사용하여 슈크로오스에 대한 감미제의 감미성을 평가하게 할 수 있다. (동일한 완충액 중의) 모든 샘플은 22℃±1℃의 온도에서 이중으로 제공된다. 예를 들어, 샘플 용액은 ∼pH 3.0에서 시트르산 0.16%(w/v) 및 시트르산 나트륨 0.02%(w/v)를 포함하는 완충제를 사용하여 제조할 수 있다. 3개의 랜덤 디지털 숫자 코드로 코드화한 시험 용액을 개별적으로 무작위로 패널에게 제공한다. 0.5%(w/v)씩 단계적으로 증가하는 2.0∼10.0%(w/v) 슈크로오스 범위의 슈크로오스 기준 표준도 제공한다. 패널리스트에게 시험 용액의 감미성과 슈크로오스 표준의 감미성을 비교하여 감미성을 평가할 것을 요청하였다. 실험은 시험 용액을 3 모금 마신 뒤 물을 한 모금 마시고, 이어서 슈크로오스 표준을 3 모금 마신 뒤 물을 한 모금 마시는 등의 순서로 시행하였다. 패널리스트는 감미성을 소수점 한자리로(예, 6.8, 8.5)로 평가한다. 시험 용액을 평가하는 사이에는 5분의 휴식 시간을 둔다. 또한 패널리스트에게 임의의 가능한 잔류 효과를 감소시키기 위해 잘 세정하고 크래커를 먹을 것을 요청한다.

숙련된 감각 평가단의 패널이 측정한 슈크로오스 당량치((sucrose equivalent value; "SEV")(예, % 슈크로오스)를 모나틴 농도의 함수로서 플로팅하여, 용량 반응 곡선을 얻는다. 다항식 곡선 피트를 용량 반응 곡선에 적용시키고 이를 사용하여, 슈크로오스 당량치(SEV)를 모나틴 농도(예, % 모나틴)로 나누어 특정 지점(예, 8% SEV)에서의 감미성 강도 또는 효능을 계산한다. 예를 들어, 도 15(R,R/S,S 모나틴 용량 반응 곡선); 도 14(R,R 모나틴 용량 반응 곡선)를 참조한다. 상기한 S,S 및 R,R 모나틴에 대한 감미성 강도(즉, 각각 중량 기준으로 슈크로오스보다 대략 50∼200배 및 대략 2,000∼2,400배의 감미성을 가짐)는 대략 8% SEV에서 측정하였다.

모나틴은 소비에 적합한 농도로 수용액 중에서 가용성이다. 모나틴 입체 이성질체의 다양한 블렌드는 특정 매트릭스 중에서, 또는 다른 감미제와 블렌딩한 경우 질적으로 더 우수할 수 있다. 모나틴과 다른 감미제의 블렌드를 사용하여 감미성 강도 및/또는 프로파일을 최대화하고, 비용을 최소화할 수 있다. 모나틴을 다른 감미제 및/또는 다른 성분과 병용하여 슈크로오스와 유사한 일시적인 프로파일을 생성하거나, 다른 이점들을 생성할 수 있다.

예를 들어, 모나틴을 다른 영양 및 비영양 감미제와 블렌딩하여 특정 향미 프로파일 또는 칼로리 표적을 달성할 수 있다. 따라서, 감미제 조성물은 모나틴과 하기의 감미제 형태 중 하나 이상의 조합을 포함할 수 있다: (1) 당 알코올(예를 들어, 에리트리톨, 소르비톨, 말티톨(maltitol), 만니톨, 락티톨, 자일리톨, 이소말트(isomalt), 저당 시럽 등); (2) 다른 고 강도 감미제(예를 들어, 아스파탐, 수크랄로스, 사카린, 아세설팜-K, 스테비오사이드, 시클라메이트, 네오탐(neotame), 소마틴(thaumatin), 알리탐(alitame), 디히드로칼콘, 모넬린(monellin), 글리실리진(glycyrrihizin), 모그로사이드(mogroside), 필로둘신(phyllodulcin), 마빈린(mabinlin), 브라제인(brazzein), 서큘린(circulin), 펜타딘(pentadin) 등) 및 (3) 영양 감미제(예를 들어, 슈크로오스, D-타가토오스(tagatose), 전환당, 프룩토오스, 옥수수 시럽, 고 프룩토오스 옥수수 시럽(HFCS), 글루코스/덱스트로오스, 트레할로스, 이소말툴로스 등). 모나틴은 이러한 블렌드 중에서 미감 개질제로 사용되어 뒷맛을 억제하고, 다른 향미, 예를 들어 레몬향을 강화하거나 또는 일시적인 향미 프로파일을 개선시킨다. 또한, 데이터는, 시클라메이트(유럽에서 사용됨)를 사용한 경우 모나틴은 양적으로 상승 효과를 나타내지만, 아스파탐, 사카린, 아세설팜-K, 수크랄로스 또는 탄수화물 감미제를 사용한 경우 별다른 양적 상승 효과가 나타나지 않는다는 점을 시사한다.

모나틴은 탄수화물이 아니기 때문에, 모나틴을 사용하여 음료 조성물 중의 탄수화물 함량을 감소시킬 수 있다. 한 구체예에서, 모나틴을 포함하는 음료 조성물의 양은 모나틴 대신 당(예, 슈크로오스 및/또는 고 프룩토오스 옥수수 시럽)을 함유하는 동일한 양의 음료 조성물에 비해 칼로리와 탄수화물을 덜 함유한다. 다른 구체예에서, 모나틴을 포함하는(예, 모나틴 및 하나 이상의 탄수화물을 포함하는) 음료 조성물은 감미제로서 탄수화물만 함유하는 유사 음료 조성물에 비해, 시간 경과에 따라 입맛, 향미 및 감미성을 더 제공한다.

모나틴은 건조 형태에서 안정하고, 단독으로 또는 탄수화물과 혼합한 경우 바람직한 미감 프로파일을 갖는다. 비가역적인 분해는 발생하지 않는 것으로 보이며, 오히려 (수성 완충제 중에서) 낮은 pH에서 락톤 및/또는 락탐을 형성하고 평형에 도달한다. 시간 경과에 따라 용액 중 4번 위치에서 서서히 라세미화할 수 있지만, 통상적으로 이 라세미화는 높은 pH에서 일어난다. 일반적으로, 모나틴의 안정성은 아스파탐과 동등하거나 더 우수하고, 모나틴의 미감 프로파일은 다른 품질 감미제(예, 아스파탐, 알리탐 및 수크랄로스)와 동등하거나 더 우수하다. 모나틴은 일부 다른 고 강도 감미제, 예를 들어 사카린 및 스테비오사이드와 관련된 바람직하지 못한 뒷맛을 갖지 않는다.

일부 구체예에서, 모나틴을 포함하는 음료 조성물은 또한 완충제, 팽화제(bulking agent), 증점제, 지방, 향미제, 착색 제제(착색제 또는 색이라고도 불림), 감미제 및 유제(flow agent) 중 하나 이상을 포함한다. 음료 조성물은, 예를 들어, 음료 중에 존재하는 모나틴 또는 다른 감미제의 양을 맞추거나, 또는 조성물 중에 존재하는 모나틴, 또는 착색제 또는 산을 비롯한 다른 첨가제 형태의 양을 맞추어서 특정 감미성 프로파일을 가지도록 제형화할 수 있다. 다른 구체예에서, 음료 조성물에 사용되는 모든 성분은 식용 등급으로, 일반적으로 안전한 것으로 인지 된다.

일부 구체예에서, 모나틴을 포함하는 음료 조성물은 식용 등급 항산화제를 더 포함한다. 상기 항산화제의 예로는, 비타민 C(예, 아스코르브산, 마그네슘 아스코르빌 포스페이트), 에리소르베이트(이소아스코르브산), 카로테노이드(예, 루테인, 리코펜 및 베타-카로텐), 토코페롤(예, α-토코페롤(천연 비타민 E), γ-토코페롤, δ-토코페롤), 히드록시신나메이트(예, 네오클로로겐산 및 클로로겐산), 글루타티온, 페놀류(예, 코코아 페놀, 레드 와인 페놀, 자두 중의 페놀류), 부틸화 히드록시아니솔(BHA), 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 3차 부틸히드로퀴논(TBHQ), 프로필 갈레이트, 니신, 녹차 추출물 및 로즈마리 추출물을 포함한다. 다른 구체예에서, 모나틴을 포함하는 음료 조성물은 벤조산 나트륨 및/또는 칼륨 소르베이트와 같은 특정 방부제를 더 포함한다.

다른 구체예에서, 모나틴을 포함하는 음료 조성물은 비효소성 갈변화 반응(예, Maillard 반응에 의한 갈변화)을 방지하는 하나 이상의 성분을 추가로 포함한다. 상기 성분으로는, 아황산염 및 아황산화 제제(예, 이산화황, 아황산 나트륨, 이아황산 나트륨, 이아황산 칼륨, 메타이아황산염, 설프히드릴-함유 아미노산), 염화칼슘 및 다른 무기 할라이드, 항산화제, 및 수분 활성도에 영향을 주는 화합물(예, 글리세롤, 소르비톨 및 트레할로스)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일부 구체예에서, 건조 음료 믹스와 같은 모나틴 함유 음료 농축액은 쉽게 분산되기 때문에 초콜릿 음료, 과일 음료, 몰트 음료 또는 레모네이드를 제조할 수 있다. 다른 구체예에서, 음료 농축액은 탄산 청량 음료를 제조하는 데 사용할 수 있는 음료 시럽이다. 예를 들어, 탄산 음료는 물, 모나틴 및 향미제를 함유하는 음료 시럽을 탄산수로 희석시켜 제조할 수 있다. 일부 구체예에서, 음료 시럽은 다른 감미제 및/또는 첨가제도 함유한다. 예를 들어, 음료 시럽은 성분 모두를 혼합하고 가용성이 되도록 가열시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 음료 시럽은 적어도 80% 물(예, 적어도 85%, 90% 또는 95% 물)을 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, 모나틴은 약 0.0003∼약 1% 범위 내의 임의의 특정 값(예, 음료 조성물 0.0003%, 0.005%, 0.06% 또는 0.2%)을 비롯하여, 음료 조성물 약 0.0003∼약 1% 범위(즉, 약 3∼약 10,000 ppm)(예, 약 0.0005∼약 0.2%)의 양으로 존재한다. 예를 들어, 음료 조성물은 R,R 모나틴 0.0005∼0.005%(예, 0.001∼0.0045%), 또는 S,S 모나틴 0.005∼0.2%(예, 0.01∼0.175%)를 포함할 수 있다.

감미제의 조합을 사용하여 음료 조성물의 원하는 맛과 칼로리를 얻을 수 있다는 것을 당업자는 알 것이다. 따라서 음료 조성물 중 감미제의 양은 선택된 감미제 및 소정의 감미성 강도에 따라 다르다. 감미제는 Cargill Inc.(Wayzata, MN) 및 McNeil Specialty(Fort Washington, PA)와 같은 회사로부터 시판되고 있다. 한 구체예에서, 음료 조성물은 모나틴 및 감미제(예, 슈크로오스 또는 고 프룩토오스 옥수수 시럽)의 블렌드를 포함한다. 예를 들어, 음료 조성물은 모나틴 및 다량의 감미제를 포함할 수 있다.

다량의 감미제는, 예를 들어, 가당 감미제, 무가당 감미제, 저당 탄수화물 및 이의 조합 중에서 선택될 수 있다. 가당 감미제는, 예를 들어, 옥수수 감미제, 슈크로오스, 덱스트로오스(예, 세렐로스 덱스트로오스), 말토오스, 덱스트린, 말토덱스트린, 전환당, 프룩토오스, 고 프룩토오스 옥수수 시럽, 레불로스, 갈락토스, 옥수수 시럽 고형분, 갈락토스, 트레할로스, 이소말투로스, 프럭토-올리고당(예, 케스토스 또는 니스토스), 고분자량 프럭토-올리고당 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 고 프룩토오스 옥수수 시럽(HFCS) 및 다른 옥수수 유래의 감미제는, 예를 들어, 덱스트로오스(글루코스) 및 프룩토오스의 조합이다. 또한, 가당 감미제는 과일당, 메이플 시럽 및 꿀, 또는 이의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, 모나틴 0.0003∼0.15%(예, R,R 모나틴 0.0006∼0.004%) 및 슈크로오스 또는 고 프룩토오스 옥수수 시럽 2∼10%(예, 3∼10% 또는 4∼6%)를 음료 조성물에 사용할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 음료 조성물은 무가당 감미제 및/또는 저당 탄수화물(즉, 글루코스보다 당 지수가 더 낮은 탄수화물)을 포함한다. 무가당 감미제 또는 저당 탄수화물은, D-갈락토스, 소르비톨(무정질 및 결정질 소르비톨을 포함), 만니톨, 자일리톨, 락티톨, 에리트리톨, 말티톨, 수소화된 전분 가수분해물, 이소말트, D-프사이코스(psicose), 1,5 무수 D-프룩토오스 또는 이의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

특정 구체예에서, 모나틴을 포함하는 음료 조성물은 고 강도 감미제도 포함한다. 일부 구체예에서, 고 강도 감미제는 슈크로오스보다 20배 이상의 감미성을 가진다(즉, 20 X 슈크로오스). 상기 고 강도 감미제는, 수크랄로스, 아스파탐, 사카린 및 이의 염, 아세설팜의 염(예, 아세설팜 K), 알리탐, 소마틴, 디히드로칼콘(예, 네오헤스페리딘 디히드로칼콘), 네오탐, 사이클람산 및 이의 염(즉, 사이클라 메이트), 스테비오사이드(스테비아 잎에서 추출), 모그로사이드(Lo Han Guo 과일에서 추출), 글리시르히진, 필로둘신(수국 잎에서 추출, 약 400∼600 X 슈크로오스), 모넬린, 마빈린, 브라제인, 서큘린, 펜타딘, 이들 단독 또는 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

산과 같은 다른 화합물의 존재 시에만 단 맛을 나타내는 감미성 강화제를 음료 조성물에 사용할 수도 있다. 감미성 강화제(감미성 증강제로도 알려져 있음)의 비제한적인 예로는, 서큘린, 미라큘린, 시나린, 클로로겐산, 카페인산, 스트로진, 아라비노갈락탄, 말톨 및 디히드록시벤조산을 포함한다. 특정 구체예에서, 모나틴을 포함하는 음료 조성물은 향미 강화제 또는 안정화제(예, Sucramask^TM 또는 트레할로스)도 포함한다.

경우에 따라 식용 등급의 천연 착색제 또는 인공 착색제를 음료 조성물에 포함시킬 수 있다. 이들 착색제는 합성 색(예, 아조 염료, 트리페닐메탄, 잔텐, 퀴닌 및 인디고이드), 캬라멜 색, 이산화티탄, 적색 #3, 적색 #40, 청색 #1 및 황색 #5를 비롯하여 일반적으로 알려져 있으며 종래 기술에서 사용할 수 있는 것들 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 비트즙(비트 적색), 카르민, 쿠르쿠민, 루테인, 당근즙, 베리즙, 향신료 추출물(심황, 아나토 및/또는 파프리카) 및 카로테노이드와 같은 천연 착색제를 사용할 수도 있다. 선택된 착색제의 형태 및 양은 최종 산물 및 소비자의 선호도에 따라 다를 것이다.

일부 구체예에서, 음료 조성물은 하나 이상의 천연 향미제 또는 합성 향미제도 포함한다. 적절한 향미제는 시트러스 및 비시트러스 과일 향미; 향신료; 허브; 식물; 초콜릿, 코코아 또는 초콜릿 액; 커피; 바닐라 콩에서 얻은 향미제; 너트 추출물; 리큐어 및 리큐어 추출물; 과일 브랜디 증류액; 아로마 화학 물질, 모방 향미; 및 상기한 것 중 임의의 농축액, 추출액 또는 에센스를 포함한다. 예를 들어, 시트러스 향미는 레몬, 라임, 오렌지, 탕헤르 오렌지, 그레이프프루트, 시트론 또는 금귤을 포함한다. 다수의 향미제는, 예를 들어, Rhodia USA(Cranbury, NJ); IFF(South Brunswick, NJ); Wild Flavors, Inc.(Erlanger, KY); Silesia Flavors, Inc.(Hoffman Estates, IL), Chr. Hansen(Milkwaukee, WI) 및 Firmenisch(Princeton, NJ)로부터 시판되고 있다.

예를 들어, 탄산 청량 음료를 제조하기 위한 음료 시럽은 음료에 콜라 향미를 주기 위해 사용할 수 있는 천연 콜라 향미(예, 콜라 너트 추출물)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 향미제는 에멀션으로 만든 뒤, 음료 시럽에 분산시킬 수 있다. 에멀션 액적은 대개 물 중력보다 더 낮은 특정한 중력을 가지기 때문에 분리 상을 형성할 수 있다. 증량제, 유화제 및 에멀션 안정화제를 사용하여 향미 에멀션 액적을 안정화시킬 수 있다. 상기 유화제 및 에멀션 안정화제의 예로는, 검, 펙틴, 셀룰로스, 폴리소르베이트, 소르비탄 에스테르 및 프로필렌 글리콜 알기네이트를 포함한다. 일부 구체예에서, 콜라 향미 에멀션은 음료 시럽 0.8∼1.5%를 나타낸다. 다른 구체예에서, 콜라 향미를 증강시키는 데 사용할 수 있는 추가 향미제는 시트러스 향미(예, 레몬, 라임, 오렌지, 탕헤르 오렌지, 그레이프프루트, 시트론 또는 금귤) 및 향신료 향미(예, 정향 및 바닐라)를 포함한다. 다른 구체예에서, 시트러스 향미(예, 천연 레몬 또는 라임 향미)는 약 0.03∼0.06%의 음료 시럽을 나타내 고, 향신료 향미(예, 바닐라)는 0.5∼1.5%의 음료 시럽을 나타낸다.

음료 시럽의 pH는 산(예, 무기산 또는 유기산)을 첨가하여 조절할 수 있다. 통상적으로, 음료 시럽의 pH 범위는 2.5∼약 5(예, 2.5∼약 4.0)이다. 특히 유용한 무기산은 해리되지 않은 형태로 존재할 수 있는 인산, 또는 알칼리 금속 염(예, 인산수소칼륨 또는 인산수소나트륨, 또는 인산이수소칼륨 또는 인산이수소나트륨 염)으로서 포함한다. 사용될 수 있는 유기산의 비제한적인 예로는, 시트르산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 글루콘산, 글루쿠로노락톤, 히드록시시트르산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산 또는 이의 혼합물을 포함한다. 이들 산은 이의 해리되지 않은 형태로 또는 이들 각각의 염으로 존재할 수 있다.

일부 구체예에서, 음료 시럽은 (예컨대, 천연 콜라 향미 유래의) 카페인을 추가로 포함한다. 카페인은 별도 첨가할 수도 있다.

한 구체예에서, 탄산 음료는 음료 시럽을 탄산수로 희석시켜 제조할 수 있는데, 이 때 생성된 음료는 시럽 15∼25% 및 물 75∼85%를 함유한다. 대안으로, 음료를 제조하기 위해 비탄산수를 사용하여 시럽을 희석시킬 수 있는데, 이 때 이산화탄소를 음료에 넣어 탄산화시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 탄산 음료는 통상적으로 병 또는 캔과 같은 용기에 넣어서 봉인시킨다. 종래의 탄산화 방법론을 사용하여 본 발명의 탄산 음료를 제조할 수 있다.

일부 구체예에서, 음료 조성물은 건조시킨 음료 믹스일 수 있다. "건조" 물질은 액체의 잔류 레벨을 함유할 수 있음을 유념한다. 예를 들어, 음료 믹스는 몰트 음료 믹스, 초콜릿 향미의 음료 믹스, 또는 분말형 과일 드링크 믹스(예, Kool- Aid^® 또는 Crystal Light^®)일 수 있다. 한 구체예에서, 건조시킨 음료 믹스는 용액 중의 액체 성분을 웨트-믹싱(wet-mixing)하고, 드라이 케이크를 얻기 위해 이 성분을 진공 건조시킨 뒤, 이 드라이 케이크를 베이스 분말로 분쇄하여 제조할 수 있다. 오일, 유화제 및 물과 같은 성분을 사용하여, 베이스 분말에 코코아 분말을 첨가하는 것과 같이, 추가 건조 성분 중에 블렌딩할 수 있다.

다른 구체예에서, 통상적으로 감미제를 가지지 않는 베이스 음료 분말(예, 통상적으로 소비자가 슈크로오스를 첨가하는 레모네이드 패킷)은 모나틴과 같은 고 강도 감미제와 블렌딩할 수 있다. 이 블렌딩은, 예를 들어, 말토덱스트린, 가수분해된 전분, 덱스트로오스, 폴리덱스트린 및 이눌린과 같은 팽화제 또는 희석제를 사용하여 촉진시킬 수 있다.

다른 구체예에서, 몰트 음료 믹스는 건조 음료 성분, 예컨대, 분말화시킨 단백질 공급원(예, 우유 분말, 스킴 우유 분말, 난 단백질 분말, 야채 또는 곡물 단백질 분리체(예, 대두 단백질 분리체, 몰트 분말, 가수분해된 시리얼 분말, 전분 분말, 다른 탄수화물 분말)), 비타민, 미네랄, 코코아 분말, 및 분말화시킨 향미제, 또는 상기 성분의 임의의 조합을 포함한다. 액체 몰트 음료 성분은, 예를 들어, 지방 및 오일, 액체 몰트 추출액, 액체 감미제(예, 꿀 및 글루코스 시럽) 및 액체 단백질 공급원(예, 야채 단백질 농축액) 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 적절한 지방은 부분적으로 또는 완전히 수소화된 야채유, 예컨대, 면실유, 대두유, 옥수수유, 해바라기씨 오일, 팜유, 카놀라유, 팜 커넬유, 낙화생유, 쌀겨기름, 홍화유, 코코넛 오일, 채종유 및 이의 중-올레산 및 고-올레산 대응물; 또는 이의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 버터 지방과 같은 동물 지방도 사용할 수 있다. 각각의 몰트 음료 성분의 양은 소정의 제형에 따라 다양할 수 있다. 일부 구체예에서, 모나틴은 상기한 바와 같이 다량의 감미제와 병용할 수 있다.

일부 구체예에서, 과일 음료 프리믹스는 시트르산(예, 60∼70%), 향미제(예, 2∼4%), 착색제(예, 0.001∼1%), 모나틴, 인산칼슘(예, 0∼25%), 흐림제(예, 0∼5%) 및 아스코르브산(예, 0∼2%)를 포함한다. 예를 들어, 과일 음료 믹스는 시트르산 64.9%, 인산칼슘 20.5%, 흐림제 3.9%, 아스코르브산 0.78%, 향미제 2.7%, 착색제 0.1% 및 모나틴을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 모나틴은 상기한 바와 같이 다량의 감미제와 병용할 수 있다. 다른 구체예에서, 과일 음료를 제조하기 위해 프리믹스에 물을 타서 액상으로 만들고, 이렇게 생성된 음료는 믹스 약 0.5∼1.5%(예, 0.75%)를 함유한다.

한 구체예에서, 건조 초콜릿 드링크 조성물은 스킴드 우유 분말(예, 약 20∼30%), 유장 분말(예, 35∼45%), 커피 화이트너(예, 10∼15%), 저지방 코코아 분말(예, 15∼20%), 이탄산칼륨(예, 0.1∼10%), 구아 검(예, 0.06∼2%), 카라기난(예, 0.05∼5%), 향미제(예, 초콜릿 및/또는 바닐라) 및 모나틴을 포함할 수 있다. 예를 들어, 건조 초콜릿 드링크 조성물은 스킴드 우유 분말 26%, 유장 분말 40%, 커피 화이트너 12%, 저지방 코코아 분말 18%, 이탄산칼륨 1%, 구아 검 0.6%, 카라기난 0.5%, 초콜릿 향미, 바닐라 향미 및 모나틴을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 초콜릿 음료를 제조하기 위해 프리믹스에 물 또는 우유를 타서 액상으로 만들고, 이렇게 생성된 음료는 믹스 약 0.5∼1.5%(예, 0.8%)를 함유한다.

일부 구체예에서, 음료 조성물을 제조하는 데 유용한 건조 성분의 혼합물, 음료 조성물을 제조하는 데 유용한 웨트 성분의 혼합물, 또는 건조 및 웨트 성분의 액체 혼합물(분산액)을 조성물로서 제공한다. 이러한 조성물은 제조 물품으로서 제공될 수 있으며, 판매지 및 생산지로 쉽게 수송하고, 붓고/붓거나 혼합하기 쉽도록 적절한 용기(예, 백, 버킷, 큰 상자)로 포장할 수 있다. 제조 물품은 임의의 물건, 예컨대 용구; 믹싱용 용기; 또는 다른 임의 성분을 함유할 수 있다. 제조 물품에는 음료 조성물을 제조하기 위한 설명서가 포함될 수 있다.

음료에 함유된 모나틴은 음료 중의 다른 감미제에 비해 더 긴 저장 수명, 우수한 열 안정성 및 산 안정성 뿐 아니라 더 우수한 미감 특성 및 시장성의 이점을 가질 것이라 예상된다. 본 발명은 하기 실시예에서 더 설명되며, 이는 본원에 설명된 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1

트립토판 아미노트랜스퍼라아제의 클로닝 및 발현

본 실시예는 트립토판으로부터 인돌-3-피루베이트로 전환하는 데 사용할 수 있는 트립토판 아미노트랜스퍼라아제를 클론하는 데 사용된 방법을 기재한다.

실험 개요

아미노트랜스퍼라아제를 코딩하는 11 개의 유전자를 대장균으로 클로닝하였다. 이들 유전자들은 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) D-알라닌 아미노트 랜스퍼라아제(dat, 진뱅크 기탁 번호 (Genbank Accession No.) Y14082.1 bp 28622-29470 및 진뱅크 기탁 번호 NP_388848.1, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열), 시노리조비움 멜리로티 (Sinorhizobium melilot) (또한, 리조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti)로도 불림) 티로신 아미노트랜스퍼라아제 (tatA, 서열 번호 1 및 서열 번호 2, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열), 로도박터 스페로이데스 (Rhodobacter sphaeroides) 균주 2.4.1 티로신 아미노트랜스퍼라아제 (tatA, 상동성에 의해 확인함, 서열 번호 3 및 서열 번호 4, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열), R. 스페로이데스 35053 티로신 아미노트랜스퍼라아제 (상동성에 의해 확인함, 서열 번호 5 및 서열 번호 6, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열), 레슈마니아 메이저 (Leishmania major) 광역 기질 아미노트랜스퍼라아제 (bsat, L. 멕시칸 (mexican)으로부터의 펩티드 단편임을 상동성에 의해 확인함, 서열 번호 7 및 서열 번호 8, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열), 바실러스 서브틸리스 방향족 아미노트랜스퍼라아제 (araT, 상동성에 의해 확인함, 서열 번호 9 및 서열 번호 10, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열), 락토바실러스 아밀로보러스 (Lactobacillus amylovorus) 방향족 아미노트랜스퍼라아제 (araT 상동성에 의해 확인함, 서열 번호 11 및 서열 번호 12, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열), R. 스페로이데스 35053 다중 기질 아미노트랜스퍼라아제 (상동성에 의해 확인함, 서열 번호 13 및 서열 번호 14, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열), 로도박터 스페로이데스 균주 2.4.1 다중 기질 아미노트랜스퍼라아제 (msa 상동성에 의해 확인함, 진뱅크 기탁 번호 AAAE01000093.1, bp 14743-16155 및 진뱅크 기탁 번호 ZP00005082.1, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열), 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli) 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (aspC, 진뱅크 기탁 번호 AE000195.1 bp 2755-1565 및 진뱅크 기탁 번호 AAC74014.1, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열) 및 대장균 티로신 아미노트랜스퍼라아제 (tyrB, 서열 번호 31 및 서열 번호 32, 각각 핵산 서열 및 아미노산 서열)이다.

유전자를 클로닝하고, 발현시키고, 상업적으로 입수가능한 효소를 사용하여 트립토판으로부터 인돌-3-피루베이트의 전환시 활성에 대해 시험하였다. 모든 11 개의 클론은 활성을 가졌다.

원하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 함유할 수 있는 세균 균주의 동정

NCBI (National Center for Biotechnology Information) 데이터베이스의 어떠한 유전자도 트립토판 아미노트랜스퍼라아제로서 디자인되지 않았다. 그러나, 이 효소 활성을 갖는 유기체는 동정되었다. 하기 공급원으로부터의 정제된 단백질로부터 또는 세포 추출물 중에서 L-트립토판 아미노트랜스퍼라아제 (TAT) 활성을 측정하였다: 페스투카 옥토플로라 (Festuca octoflora), 콩 미토콘드리아 및 시토졸로부터의 리조박테리아 (Rhizobacteria) 단리물, 해바라기 뿌리혹 세포, 리조비움 레구미노사룸 비오바 트리폴리 (Rhizobium leguminosarum biovar trifoli), 에르위니아 헤르바콜라 프브 깁소필레 (Erwinia herbicola pv gypsophilae), 수도모나스 시린게 pv. 사바스타노이 (savastanoi), 아그로박테리움 튜메라시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 아조스피릴룸 립페룸 & 브라실렌스 (Azospirillum lipferum & brasilense), 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae), 엔테로박터 아글로메란스 (Enterobacter agglomerans), 브라디리조비움 엘칸피 (Bradyrhizobium elkanfi), 칸디다 말토사 (Candida maltosa), 아조토박터 비넬란디 (Azotobacter vinelandii), 래트 뇌, 래트 간, 시노리조비운 멜리로티, 수도모나스 플루오레센스 (Pseudomonas fluorescens) CHAO, 락토코쿠스 락티스, 락토바실러스 카세이 (casei), 락토바실러스 헬베티쿠스 (helveticus), 밀 묘목, 보리, 파제올루스 오레우스 (Phaseolus aureus) (녹두), 사카로마이세스 우바룸 (Saccharomyces uvarum) (카를스베르겐시스 (carlsbergensis)), 레슈마니아 sp., 옥수수, 토마토 지맥, 콩류, 담배, 돼지, 클로스트리디움 스포로겐스 (Clostridium sporogenes) 및 스트렙토마이세스 그리세우스 (Streptomyces griseus).

실시예 2

인돌-3- 락테이트로부터 인돌-3- 피루베이트로의 전환

도 1 및 도 3에 도시된 바와 같이, 인돌-3-락트산을 사용하여 인돌-3-피루베이트를 제조할 수 있다. 락트산과 피루베이트 사이의 전환은 가역 반응, 인돌-3-피루베이트와 인돌-3-락테이트 사이의 전환도 가역적이다. 전형적으로, 인돌-3-피루베이트로부터 340 nm에서 고량의 바탕으로 인해 인돌-락테이트의 산화를 수행하였다.

표준 분석 시험 혼합물은 100 mM 인산칼륨, pH 8.0, 0.3 mM NAD⁺, 7 유닛의 락테이트 디히드로게나아제 (LDH) (시그마(Sigma)-L2395, 미소우리주 세인트 루이스 소재), 및 0.1 mL 중의 2 mM 기질을 함유하였다. UV-투명 마이크로역가 플레이트에서, 몰레큘러 디바이스즈 스펙트라멕스 플러스 플레이트리더 (Molecular Devices SpectraMax Plus platereader)를 사용하여 분석 시험을 2 회 수행하였다. 폴리펩티드 및 완충제를 혼합시키고, 인돌-3-락트산 및 NAD⁺를 함유하는 웰에 피펫팅하고, 각각의 웰의 340 nm에서의 흡광도를 잠깐의 혼합 후 9 초 간격으로 읽었다. 반응을 25 ℃에서 5 분 동안 방치하였다. 340 nm에서의 흡광도의 증가는 NAD⁺로부터의 NADH의 생산을 따른 것이다. NAD⁺ 및 기질 없이 별도의 음성 통제 (negative control)를 수행하였다. 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides)로부터의 D-LDH (시그마 카탈로그 번호 L2395)는 바실러스 스테아로터모필러스 (Bacillus stearothermophilus)로부터의 L-LDH (시그마 카탈로그 번호 L5275)보다 인돌-유도체 기질을 사용한 활성이 더욱 높은 것으로 나타났다.

D-락트산 및 NAD⁺ 또는 NADH 및 피루베이트, D-LDH 폴리펩티드의 천연 기질을 사용하여 유사한 방법을 활용하였다. 피루베이트의 환원에 대한 V_max는 락테이트의 산화에 대한 V_max보다 100-1000 배 높았다. D-LDH를 사용한 인돌-3-락트산의 산화 반응에 대한 V_max는 락트산을 사용한 경우의 대략 5 분의 1이었다. 또한, 0.5 mM EDTA 및 0.5 mM 비소산나트륨을 함유하는 50 mM 붕소산나트륨 완충제 (엔올-보레이트 유도체)를 사용하여 327에서의 흡광도 변화를 뒤따름으로써 인돌-3-피루베이트의 존재를 측정하였다. L의 및 D-LDH 폴리펩티드 양쪽 모두에 대해 음성 대조군에 비해 작지만 반복적인 흡광도 변화가 관찰되었다.

또한, 광역 특이성 락테이트 디히드로게나아제 (EC 1.1.1.27, EC 1.1.1.28 및/또는 EC 1.1.2.3과 관련된 활성을 갖는 효소)를 클로닝하고, 인돌-3-락트산으로 부터 인돌-3-피루베이트를 제조하는 데 사용할 수 있었다. 광역 특이성 디히드로게나아제의 공급원은 대장균, 네이세리아 고노르호에아 (Neisseria gonorrhoeae) 및 락토바실러스 플라타럼 (plantarum)을 포함한다.

별법으로, 인돌-3-락테이트를 인돌락테이트 디히드로게나아제 (EC 1.1.1.110)를 함유하는 클로스트리디움 스포로겐스로부터의 세포 추출물, 또는 인돌-3-피루베이트에 활성을 갖는 것으로 공지된 p-히드록시페닐락테이트 디히드로게나아제 (EC 1.1.1.222)를 함유하는 트리파노소마 크루지 에피마스티고테스(Trypanosoma cruzi epimastigotes) 세포 추출물; 또는 이미다졸-5-일 락테이트 디히드로게나아제 (EC 1.1.1.111)를 함유하는 수도모나스 아시도보란스 (Pseudomonas acidovorans) 또는 대장균 세포 추출물; 또는 히드록시페닐피루베이트 리덕타아제 (EC 1.1.1.237)를 함유하는 콜레우블루메이 (Coleusblumei), 또는 D-방향족 락테이트 디히드로게나아제 (EC 1.1.1.222)를 함유하는 칸디다 말토사와 접촉시킴으로써 인돌-3-피루베이트를 제조할 수 있다. 이러한 활성을 기재하는 참조 문헌은 문헌[Nowicki et al. (FEMS Microbiol Lett 71: 119-24, 1992), Jean and De Moss (Canadian J Microbiol. 14 1968, Coote and Hassall (Biochem. J. 111: 237-9, 1969), Cortese et al. (C. R. Seances Soc. Biol. Fil. 162 390-5, 1968), Petersenand Alfermann (Z. Naturforsch. C: Biosci. 43 501-4, 1988), and Bhatnagar et al. (J Gen Microbiol 135: 353-60, 1989)]을 포함한다. 또한, 락테이트 옥시다아제, 예를 들면 수도모나스 sp.로부터의 것 (문헌[Gu et al. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic: 18: 299-305, 2002] 참조)을 인돌-3-락트산으로부터 인돌 -3-피루베이트로의 산화에 사용할 수 있다.

실시예 3

L-아미노산 옥시다아제를 활용한 L-트립토판으로부터 인돌-3- 피루베이트로의 전환

본 실시예는 실시예 1에 기재된 트립토판 아미노트랜스퍼라아제를 사용하는 것에 대한 대체물로서 옥시다아제 (EC 1.4.3.2)를 통해 트립토판으로부터 인돌-3-피루베이트로 전환하는 데 사용되는 방법을 기재한다. L-아미노산 옥시다아제를 크로탈루스 듀리서스 (Crotalus durissus) (시그마, 미소우리주 세인트 루이스 소재, 카탈로그 번호 A-2805)로부터 정제하였다. 분자 클로닝에 대한 L-아미노산 옥시다아제의 기탁 번호는 CAD21325.1, AAL14831, NP_490275, BAB78253, A38314, CAB71136, JE0266, T08202, S48644, CAC00499, P56742, P81383, 093364, P81382, P81375, S62692, P23623, AAD45200, AAC32267, CAA88452, AP003600 및 Z48565를 포함한다.

반응을 마이크로원심분리 튜브에서 1 mL의 총 부피로 수행하고, 37 ℃에서 진탕하면서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 반응 혼합물은 5 mM L-트립토판, 100 mM 인산나트륨 완충제 pH 6.6, 0.5 mM 비소산나트륨, 0.5 mM EDTA, 25 mM 사붕소산나트륨, 0.016 mg의 카탈라아제 (83U, 시그마 C-3515), 0.008 mg의 FAD (시그마), 및 0.005-0.125 유닛의 L-아미노산 옥시다아제를 함유하였다. 음성 대조군은 트립토판을 제외한 모든 성분을 함유하고, 블랭크는 옥시다아제를 제외한 모든 성분을 함유하였다. 카탈라아제를 산화 탈아민화 중 생성된 과산화수소를 제거하는 데 사용하 였다. 사붕소산나트륨 및 비소산나트륨을 사용하여 인돌-3-피루베이트의 엔올-보레이트 형태를 안정화시켰으며, 이는 327 nm에서 최대 흡광도를 나타내었다. 반응 혼합물 중 0.1-1 mM의 농도에서 인돌-3-피루베이트 표준을 제조하였다.

시판되는 L-아미노산 옥시다아제는 1 분 당 1 mg의 단백질 당 형성된 540 ㎍의 인돌-3-피루베이트의 특이적 활성을 가졌다. 이는 트립토판 아미노트랜스퍼라아제 효소의 특이적 활성과 동일한 크기이다.

실시예 4

알돌라아제를 사용한 인돌-3- 피루베이트로부터 2-히드록시 2-(인돌-3- 일메틸)-4-케토 글루타르산으로의 전환

본 실시예는 알돌라아제 (리아제)를 사용하여 인돌-3-피루베이트를 MP로 전환하는 데 사용할 수 있는 방법을 기재한다(도 2). 알돌 축합은 알데히드 또는 케톤의 β-탄소과 또 다른 알데히드 또는 케톤의 카르보닐 탄소 간의 탄소-탄소 결합을 형성하는 반응이다. 카르보음이온 (carboanion)은 한 기질의 카르보닐기에 인접한 탄소에서 형성되고, 제 2 기질의 친핵성 공격 카르보닐 탄소 (친전자성 탄소)로서 작용한다. 가장 통상적으로, 친전자성 기질은 알데히드이기 때문에, 대부분의 알돌라아제는 EC 4.1.2. 카테고리에 속한다. 아주 종종, 친핵성 기질은 피루베이트이다. 알돌라아제가 두 케토-산 또는 두 알데히드사이의 축합을 촉매화하는 것은 그리 흔치 않다.

그러나, 두 카르복실산의 축합을 촉매화하는 알돌라아제가 동정되었다. 예를 들면, EP 1045-029는 수도모나스 배양 (EC 4.1.3.16)을 사용하여 글리옥실산 및 피 루베이트로부터 L-4-히드록시-2-케토글루타르산을 생산하는 것을 기재하고 있다. 또한, 4-히드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 알돌라아제 (4-히드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 피루베이트 리아제, EC 4.1.3.17)는 두 케토 산의 축합을 촉매화할 수 있다. 따라서, 유사한 인돌-3-피루베이트와 피루베이트의 축합을 촉매화하는데 알돌라아제 폴리펩티드를 사용하였다.

클로닝

4-히드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 피루베이트 리아제 (ProA 알돌라아제, EC 4.1.3.17) 및 4-히드록시-2-옥소글루타레이트 글리옥실레이트-리아제 (KHG 알돌라아제, EC 4.1.3.16)는 도 2의 알돌라아제 반응과 매우 유사한 반응을 촉매화한다. 프라이머를 pET30 Xa/LIC 벡터 (노바겐 (Novagen), 위스콘신주 메디슨 소재)에 대한 상용가능한 돌출부 (overhangs)를 사용하여 디자인하였다.

proA 유전자 생성물을 사용한 활성 결과

C. 테스토스테로니 (testosteroni) proA 및 S. 멜리오티 SMc00502 유전자 구조체 양쪽 모두 IPTG를 사용하여 유도시킨 경우 고도로 발현하였다. 재조합 단백질은 총 단백질 및 세포 추출물 샘플의 SDS-PAGE 분석에 의해 결정된 바와 같이 상당히 가용성이었다. C. 테스토스테로니 유전자 생성물을 > 95 % 순도로 정제하였다. His-Bind 카트리지를 사용한 친화성 정제 후의 S. 멜리오티 유전자 생성물의 수율이 매우 낮기 때문에, 효소 분석 시험에 세포 추출물을 사용하였다.

양쪽 모두의 재조합 알돌라아제는 MP 인돌-3-피루베이트로부터 및 피루베이트의 형성을 촉매화하였다. 인산마그네슘 및 인산칼륨 양쪽 모두의 존재는 효소 활 성을 필요로 하였다. 인돌-3-피루베이트, 피루베이트, 또는 인산칼륨이 존재하지 않은 경우 어떠한 생성물도 나타나지 않았다. 또한, 효소의 부재 하에서 (전형적으로, 효소가 존재하는 경우 1 차의 크기 미만임) 소량의 생성물이 형성되었다.

생성물 피크는 인돌-3-피루베이트 표준 약간 후에 역 상 C18 칼럼으로부터 용리되고, 이 피크의 질량 스펙트럼은 292.1의 충돌적으로 유도된 생성물 MP로 예상되는 어미 이온 (patent ion) ([M + H]⁺)을 나타냈다. 질량 스펙트럼에 존재하는 주요한 딸 (daughter) 단편은 m/z = 158(1H-인돌-3-카르브알데히드 카르보늄 이온), 168 (3-부타-1,3-디에닐-1H-인돌 카르보늄 이온), 274 (292-H₂O), 256 (292-2H₂O), 238 (292-3 H₂O), 228 (292-CH₄O₃), 및 204 (피루베이트 손실)를 갖는 것들을 포함하였다. 또한, 생성물은 279-280의 및 대략 290 nm에서 작은 숄더 (shoulder)를 갖는 다른 인돌 함유 화합물, 예를 들면 트립토판의 UV 스펙트럼 특징을 나타내었다.

C. 테스토스테로니 알돌라아제에 의해 제조된 MP의 양은 실온으로부터 37 ℃로 반응 온도, 기질의 양 및 마그네슘의 양이 증가함에 따라 증가하였다. 효소의 합성 활성은 pH가 증가함에 따라 감소하고, 관찰된 최대 생성물은 pH 7에 있었다. 트립토판 표준을 기준으로, 20 ㎍의 정제된 단백질을 사용하여 표준 분석 시험 하에서 생성된 MP의 양은 1 mL 반응물 당 대략 10-40 ㎍이었다.

S. 멜리오티 및 C. 테스토스테로니 ProA 알돌라아제 코딩 서열과 상기한 다른 유전자와의 고도의 상동성으로 인해, 모든 재조합 유전자 생성물이 이 반응을 촉매화할 수 있을 것으로 예상된다. 또한, 위치 59 및 87에서 트레오닌 (T), 119에서 아르기닌 (R), 120에서 아스파테이트 (D), 및 31 및 71에서 히스티딘 (H) (C. 테스토스테로니의 번호매김 시스템 기준)을 갖는 알돌라아제가 유사한 활성을 가질 것으로 예상된다.

khg 유전자 생성물을 사용한 활성 결과

B. 서브틸리스 및 대장균 khg 유전자 구조체 양쪽 모두는 IPTG로 유도시킨 경우 단백질을 높은 수준으로 발현하였으며, S. 멜리오티 khg는 낮게 발현되었다. 재조합 단백질은 총 단백질 및 세포 추출물의 S-PAGE 분석에 의해 판단할 때 상당히 가용성이었다. B. 서브틸리스 및 대장균 khg 유전자 생성물을 95 % 순도로 정제하였으며, S. 멜리오티 유전자 생성물의 수율은 His-Bind 카트리지를 사용한 친화성 정제 후 그다지 높지 않았다.

마그네슘 및 포스페이트가 이 효소의 활성에 요구된다는 어떠한 증거도 없었다. 그러나, 문헌은 인산나트륨 완충제 중에서 분석 시험을 수행하는 것을 보고하고 있으며, 효소가 이관능성인 것으로 보고되며 인산화된 기질, 예를 들면 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루코네이트 (KDPG)에 대한 활성을 갖는 것으로 보고된다. 효소 분석 시험을 상기한 바와 같이 수행하고, 일부 경우 포스페이트를 생략하였다. 결과는 재조합 KHG 알돌라아제가 MP를 제조하였으나, ProA 알돌라아제만큼 활성이 높이 않은 것으로 시사하였다. 일부 경우, KHG에 의해 제조된 MP의 양은 마그네슘 및 포스페이트 단독에 의해 제조된 양과 거의 동일하였다. 포스페이트는 KHG 활성을 증가시키지 않는 것으로 보였다. 바실러스 효소는 SRM에 의해 결정할 때 가장 높은 활성을 갖고, 마그네슘 및 포스페이트 단독의 경우보다 대략 20-25 % 높은 활성을 가졌다(실시예 10 참조). 시노리조비움 효소는 최저량의 활성을 가졌으며, 이는 발현에서 나타나는 폴딩 (folding) 및 용해도 문제과 관련될 수 있다. 모든 3 가지 효소는 활성 부위 글루타메이트 (B. 서브틸리스 번호매김 시스템에서 위치 43)를 가질 뿐만 아니라 피루베이트와의 쉬프 염기 형성에 리신 (위치 130)을 가졌으나, B. 서브틸리스 효소는 위치 47, 활성 부위 잔기에서 아르기닌이 아니라 트레오닌을 함유하였다. B. 서브틸리스 KHG는 더 작고, S. 멜리오티 및 대장균 효소와는 구별되는 군집 내에 있는 것으로 보이며, 다른 효소들은 활성 부위 트레오닌을 갖는다. 활성 부위에서의 차이는 B. 서브틸리스 효소의 증가된 활성으로 인한 것일 수 있다.

알돌라아제 활성의 개선

촉매작용성 항체는 천연 알돌라아제만큼 효과적일 수 있고, 광역 범위의 기질을 수용할 수 있고, 도 2에 도시된 반응을 촉매화하는 데 사용될 수 있다.

또한, 알돌라아제는 지향된 방출에 의해, 예를 들면 DNA 셔플링 (shuffling ) 및 오류 유발 (error-prone) PCR에 의해 방출되어 포스페이트에 대한 필요성을 제거하고, 거울상선택성 (enantioselectivity)을 전도시키는 KDPG 알돌라아제 (상기한 KHG에 매우 상동성을 가짐)에 대해 상기한 바와 같이 개선될 수 있다. KDPG 알돌라아제 폴리펩티드는 공여체 기질 (본 명세서에서는, 피루베이트)에 상당히 특이적이기 때문에 생화학 반응에 유용하지만, 수용체 기질 (즉, 인돌-3-피루베이트)의 측면에서는 비교적 융통성이 있다 (문헌[Koeller & Wong, Nature 409: 232-9, 2001] 참조). KHG 알돌라아제는 피루베이트와 다수의 카르복실산의 축합에 대해 활성을 갖는다. KHG 알돌라아제의 포유류형은 4-히드록시 4-메틸 2-옥소글루타레이트에 대한 높은 활성 및 4-히드록시-2-케토글루타레이트의 양쪽 모두의 입체 이성질체의 수용성을 비롯하여 세균형보다 광역의 특이성을 갖는 것으로 생각된다. 세균 공급원은 R 이성질체에 대해 10-배 바람직함을 갖는 것으로 보인다. 게놈 데이터베이스에서 이용가능한 KHG 상동체가 거의 100 개이고, 활성은 수도모나스, 파라코쿠스 (Paracoccus), 프로비덴시아 (Providencia), 시노리조비움, 모르가넬라 (Morganella), 대장균 및 포유류 조직에서 입증되었다. 이들 효소는 모나틴 생산에 바람직한 거울 특이성을 맞추는 (tailoring) 출발점으로 사용될 수 있다.

피루베이트를 활용하는 알돌라아제 및 케토 산이고(이거나) 인돌과 같이 벌키 소수성 기를 갖는 또 다른 기질을 "방출"하여 폴리펩티드의 특이성, 속도 및 선택성을 맞출 수 있다. 본 명세서에서 나타낸 KHG 및 ProA 알돌라아제 이외에도, 이러한 효소들의 예는 KDPG 알돌라아제 및 관련 폴리펩티드 (KDPH); 노카르디오이데스 (Nocardioides) st로부터의 트란스카르복시벤잘피루베이트 히드라타아제-알돌라아제; 피루베이트 및 2-카르복시벤즈알데히드 (방향족 고리 함유 기질)을 축합시키는 4-(2-카르복시페닐)-2-옥소부트-3-에노에이트 알돌라아제 (2'-카르복시벤잘피루베이트 알돌라아제); 또한 피루베이트 및 방향족 함유 알데히드를 기질로 사용하는 수도모나스 푸티다 (putida) 및 스핑고모나스 아로마티시보란스 (Sphingomonas aromaticivorans)로부터의 트란스-O-히드록시벤질리덴피루베이트 히드라타아제-알돌라아제; 유기체 마이크로코쿠스 데니트리피칸스 (Micrococcus denitrificans) 중 에 존재하는 것으로 생각되는 3-히드록시아스파테이트 알돌라아제 (에리트로-3-히드록시-L-아스파테이트 글리옥실레이트 리아제); 벤질기를 함유하는 기질을 사용하는 베조인 알돌라아제 (벤즈알데히드 리아제); 디히드로네오프테린 알돌라아제; 글리신과 벤즈알데히드를 축합시키는 L-트레오-3-페닐세린 벤즈알데히드-리아제 (페닐세린 알돌라아제); 4-히드록시-2-옥소발러레이트 알돌라아제; 1,2-디히드록시벤질피루베이트 알돌라아제; 및 2-히드록시벤잘피루베이트 알돌라아제를 포함하며 이에 한정되지 않는다.

원하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 하기 방법을 사용하여 해당 클론을 스크리닝함으로써 선택할 수 있다. 트립토판 영양요구체를 발현 카세트 상에서 해당 클론을 갖는 벡터를 사용하여 형질전환하고, 소량의 모나틴 또는 MP를 함유하는 배지에서 성장시켰다. 아미노트랜스퍼라아제 및 알돌라아제 반응이 가역적이기 때문에, 세포는 모나틴의 라세믹 혼합물로부터 트립토판을 생성할 수 있었다. 유사하게, 유기체 (재조합 및 야생형 양쪽 모두)를 MP 또는 모나틴을 탄소원 및 에너지원으로 사용할 수 있는 능력에 의해 스크리닝할 수 있었다. 표적 알돌라아제의 한 공급원은 다양한 수도모나스 및 리조박테리아 균주의 발현 라이브러리이다. 수도모나스는 방향족 분자의 분해에 대한 많은 통상의 이화 경로를 가지며, 또한 많은 알돌라아제를 함유하는 한편, 리조박테리아는 알돌라아제를 함유하고, 식물 리보스페어 (rhizosphere)에서 성장하는 것으로 공지되어 있고, 모나틴의 생합성 경로 구조에 대해 기술된 많은 유전자들을 갖는다.

실시예 5

모나틴 전구체의 화학적 합성

실시예 4는 인돌-3-피루베이트를 MP로 전환시키기 위해 알돌라아제를 사용하는 방법을 기재하였다. 본 실시예는 MP를 화학적으로 합성하는 대체 방법을 기재한다. MP는 전형적인 알돌-타입 축합 (도 4)을 사용하여 형성될 수 있다. 간략히, 전형적인 알돌-타입 반응은 강 염기, 예를 들면 LDA (리튬 디이소프로필아미드), 리튬 헥사메틸디실라잔 또는 부틸 리튬을 사용하여 피루베이트 에스테르의 카르보음이온을 생성하는 것을 포함한다. 생성되는 카르보음이온은 인돌-피루베이트와 반응하여 커플링된 생성물을 형성한다.

인돌 질소를 보호하는 데 사용될 수 있는 보호기는 t-부틸옥시카르보닐 (Boc), 및 벤질옥시카르보닐 (Cbz)을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 카르복실산에 대한 차단제는 알킬 에스테르 (예를 들면, 메틸, 에틸, 벤질 에스테르)를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 이러한 보호기를 사용하는 경우, 형성되는 생성물의 입체화학성을 통제하는 것이 불가능하다. 그러나, R2 및/또는 R3가 키랄 보호기 (도 4), 예를 들면 (S)-2-부탄올, 멘톨, 또는 키랄 아민인 경우, 이는 한 MP 거울상 이성질체로부터 다른 것으로의 형성을 유리하게 할 수 있다.

실시예 6

트립토판 또는 인돌-3- 피루베이트으로부터 모나틴으로의 전환

두가지 효소, 아미노트랜스퍼라아제 및 알돌라아제를 사용하는 시험관내 방법은 모나틴 트립토판 및 피루베이트로부터 제조하였다. 제 1 단계에서, 알파-케토글루타레이트는 인돌-3-피루베이트 및 글루타메이트를 생성하는 아미노기 전달 반 응에서 트립토판으로부터 아미노기의 수용체였다. 알돌라아제는 알파-케토 유도체 모나틴의 (MP), 2-히드록시-2-(인돌-3-일메틸)-4-케토글루타르산을 생성하는 Mg^{2 +} 및 포스페이트의 존재 하에서 피루베이트가 인돌-3-피루베이트와 반응하는 제 2 반응을 촉매화하였다. 제 1 반응에서 형성된 글루타메이트로부터의 아미노기의 전달은 원하는 생성물, 모나틴을 생성하였다. 생성물의 정제 및 특성화는 형성된 이성질체가 S,S-모나틴임을 나타내었다. 대체 기질, 효소, 및 조건, 뿐만 아니라 이 방법으로 이루어진 개선을 기재한다.

효소

코마모나스 (Comamonas) 테스토스테로니로부터 알돌라아제, 4-히드록시-4-메틸-2-옥소글루타레이트 피루베이트 리아제 (ProA 알돌라아제, proA 유전자) (EC 4.1.3.17)를 클로닝하고, 발현시키고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 정제하였다. B. 서브틸리스, 대장균 및 S. 멜리로티로부터 4-히드록시-2-옥소글루타레이트 글리옥실레이트 리아제 (KHG 알돌라아제) (EC 4.1.3.16)를 클로닝하고, 발현시키고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 정제하였다.

모나틴을 제조하는 데 알돌라아제와 협력하여 사용된 아미노트랜스퍼라아제는 대장균 aspC 유전자에 의해 코딩되는 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제, 대장균 tyrB 유전자에 의해 코딩되는 티로신 아미노트랜스퍼라아제, S. 멜리오티 TatA 효소, L. 메이저 (major) bsat 유전자에 의해 코딩되는 광역 기질 아미노트랜스퍼라아제, 또는 돼지 심장으로부터의 글루타믹-옥살로아세트산 트란스아미나아제 (타입 IIa)였다. 비포유류 단백질의 클로닝, 발현 및 정제를 실시예 1에 기재하였 다. 돼지 심장으로부터의 글루타믹옥살로아세트산 트란스아미나아제 (타입 IIa)를 시그마 (# G7005)로부터 얻었다.

ProA 알돌라아제 및 L- 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 사용한 방법

반응 혼합물은 1 리터 중에 50 mM 아세트산암모늄, pH 8.0, 4 mM MgCl₂, 3 mM 인산칼륨, 0.05 mM 피리독살 포스페이트, 100 mM 암모늄 피루베이트, 50 mM 트립토판, 10 mM 알파-케토글루타레이트, 160 mg의 재조합 C. 테스토스테로니 ProA 알돌라아제 (비정제된 세포추출물, ~ 30 % 알돌라아제), 233 mg의 재조합대장균 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (비정제된 세포추출물, ~ 40 % 아미노트랜스퍼라아제)를 함유하였다. 효소를 제외한 모든 성분을 함께 혼합시키고, 트립토판이 용해될 때까지 30 ℃에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 효소를 첨가하고, 반응 용액을 온화하게 진탕하면서 (100 rpm) 3.5 시간 동안 30 ℃에서 인큐베이션하였다. 효소 첨가 후 0.5 및 1 시간에서, 고체 트립토판의 엘리콧 (각각 50 mmoles)을 반응에 첨가하였다. 모든 첨가된 트립토판이 용해되지 않았으나, 농도는 50 mM 이상에서 유지되었다. 3.5 시간 후, 고체 트립토판을 여과시켰다. 정해진 양의 트립토판을 표준으로 사용하여 LC/MS에 의한 반응 혼합물의 분석은 용액 중의 트립토판의 농도가 60.5 mM이고, 모나틴의 농도가 5.81 mM (1.05 g)였음을 나타내었다.

하기 방법을 사용하여 최종 생성물을 정제하였다. 90 %의 투명한 용액을 BioRad AG50W-X8 레진의 칼럼 (225 mL; 결합 용량 1.7 meq/mL)에 가하였다. 칼럼을 물로 세척하고, 280 nm에서의 흡광도가 분획물을 통한 제 1 흐름의 < 5 %가 될 때까지 300 mL 분획물을 수집하였다. 그 다음, 4 개의 300-mL 분획물을 모아 칼럼을 1 M 아세트산암모늄 (pH 8.4)으로 용리시켰다. 모든 4 분획물은 모나틴을 함유하였고, 회전 증발기를 사용하여 미온수 배쓰를 사용하여 105 mL로 증발시켰다. 감소된 부피의 침전물이 형성되고, 증발 방법을 통해 여과시켰다.

LC/MS에 의한 칼럼 분획물의 분석은 99 %의 트립토판 및 모나틴이 칼럼에 결합하였음을 나타내었다. 증발 방법 동안 형성된 침전물은 > 97 % 트립토판 및 < 2 %의 모나틴을 함유하였다. 상청액 중 트립토판 대 생성물의 비는 대략 2:1이었다.

상청액 (7 ml)을 0.5 L의 1 M NaOH, 0.2 L의 물, 1.0 L의 1.0 M 아세트산암모늄, pH 8.4, 및 0.5 L의 물로 세척함으로써 아세테이트 형태로 전환시켜 둔 100 mL 패스트 플로우 (Fast Flow) DEAE 세파로오스 (Sepharose) (아머샴 바이오사이언스즈 (Amersham Biosciences)) 칼럼에 가하였다. 상청액을 < 2 mL/min에서 충전시키고, 280 nm에서의 흡광도가 ~ 0이 될 때까지 칼럼을 3-4 mL/min에서 물로 세척하였다. 4100-mL 분획물을 수집하여 모나틴을 100 mM 아세트산암모늄 (pH 8.4)으로 용리시켰다.

분획물의 분석은 분획물을 통한 흐름 중 트립토판 대 모나틴의 비가 85:15이고, 용출 분획물 중의 비는 7:93임을 나타내었다. 280 nm 에서의 모나틴의 소광 계수가 트립토판과 동일하다고 가정하면, 용출 분획물은 0.146 mmole의 생성물을 함유하였다. 총 1 L의 반응에 대한 외삽은 68 % 회수율로 ~ 2.4 mmoles (~ 710 mg)의 모나틴을 생성할 수 있을 것이다.

DEAE 세파로오스 칼럼으로부터의 용출 분획물을 < 20 mL로 증발시켰다. 생성물의 엘리콧을 분석 규모 모나틴 특성화에 대해 실시예 10에 기재된 것과 동일한 크로마토그래피 조건을 사용하여 C8 제조용 역상 칼럼을 적용함으로써 추가 정제하였다. 워터스 프랙션린스 (Waters Fractionlynx)^TM 소프트웨어를 사용하여 m/z = 293 이온의 검출에 기초한 모나틴의 자동화된 분획물 수집을 개시하였다. 모나틴에 대한 대응하는 양자화된 분자 이온을 사용하여 C₈ 칼럼으로부터 분획물을 수집하고, 건조되도록 증발시킨 다음, 소 부피의 물 중에 용해시켰다. 이 분획물을 생성물의 특성화에 사용하였다.

하기 방법을 사용하여 생성되는 생성물을 특성화하였다.

UV /가시 광선 분광기. 효소적으로 생성된 모나틴의 UV/가시 광선 분광기 측정을 카리 (Cary) 100 바이오 (Bio) UV/가시 광선 분광 광도계를 사용하여 수행하였다. 수중에 용해된 정제된 생성물은 인돌 함유 화합물의 전형적인 특징인 280 nm 최대 흡수와 288 nm에서의 숄더를 나타내었다.

LC / MS 분석. 실시예 10에 기재된 바와 같이 시험관내 생화학 반응으로부터 유도된 모나틴에 대한 혼합물의 분석을 수행하였다. 시험관내 효소 합성 혼합물 중의 모나틴의 전형적인 LC/MS 분석을 도 5에 도시하였다. 도 5의 낮은 패널은 m/z = 293에서의 모나틴의 양자화된 분자 이온에 대한 선택된 이온 크로마토그램을 도시한다. 이 혼합물 중 모나틴의 존재를 도 6에 도시된 질량 스펙트럼에 의해 확증하였다. LC/MS에 의한 정제된 생성물의 분석은 293 및 280 nm에서의 흡광도의 분자 이온을 갖는 단일 피크를 나타내었다. 질량 스펙트럼은 도 6에 도시된 것과 동일하였다.

MS / MS 분석. 또한, 실시예 10에 기재된 바와 같이, LC/MS/MS 딸이온 실험을 모나틴 상에서 수행하였다. 모나틴의 딸이온 질량 스펙트럼을 도 7에 도시하였다. 도 7에 표지화된 모든 단편 이온을 시험적으로 구조 배정하였다. 이들은 m/z = 275 (293-H₂O), 257 (293-(2 x H₂O)), 230 (275-COOH), 212 (257-COOH), 168 (3-부타-1, 3-디에닐-1H-인돌 카르보늄 이온), 158 (1H-인돌-3-카르브알데히드 카르보늄 이온), 144 (3-에틸-1H-인돌 카르보늄 이온), 130 (3-메틸렌-1H-인돌 카르보늄 이온), 및 118 (인돌 카르보늄 이온)의 단편 이온들을 포함하였다. 이들 중 많은 것들이 분자의 인돌 부분으로부터 유도된 경우 예상한 바와 같이 MP에 대한 것들 (실시예 4)과 동일하였다. 케톤 대신 아미노기의 존재로 인해 일부는 MP에 대해 관측되는 것보다 높은 1 질량 단위이다.

모나틴의 정확한 질량 측정. 도 8은 어플라이드 바이오시스템스-퍼킨 엘머 큐-스타(Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star) 하이브리드 사중극자/비행 시간(time-of-flight) 질량 분광계를 사용하여 정제된 모나틴에 얻어진 질량 스펙트럼을 도시한다. 내부 질량 검정 표준으로서 트립토판을 사용하여 양자화된 모나틴에 대해 측정된 질량은 293.1144였다. 원자 조성 C₁₄H₁₇N₂O₅를 기준으로 한 양자화된 모나틴의 계산된 질량은 293.1137이었다. 이는 백만분의 2 부 ( ppm) 미만의 질량 측정 오차이고, 효소적으로 생성된 모나틴의 원자 조성의 결정적인 증거를 제공하였다.

NMR 분광기. 바리안 이노바(Varian Inova) 500 MHz 기기 상에서 NMR 실험을 수행하였다. 모나틴의 샘플 (~ 3 mg)을 0.5 mL의 D₂O 중에 용해시켰다.

먼저, 용매(D₂O)를 4.78 ppm에서 내부 기준으로 사용하였다. 물에 대한 피크 가 크기 때문에, ¹H-NMR을 물에 대한 피크를 억제하면서 운전하였다. 다음으로, 물 피크가 넓기 때문에, 모나틴의 C-2 양자를 기준 피크로 사용하고, 7.192 ppm의 공지 값에서 설정하였다.

¹³C-NMR에 대해, 수백 스캔의 초기 런(run)은 샘플이 너무 묽어서 할당된 시간에 적합한 ¹³C 스펙트럼을 얻을 수 없다는 것을 시사하였다. 따라서, 이들이 부착된 수소 및 탄소의 상관을 가능하게 하고, 또한 탄소의 화학적 이동에 대한 정보를 제공하는 이종핵 다중 양자 결맞음 (heteronuclear multiple quantum coherence; HMQC) 실험을 수행하였다.

¹H 및 HMQC 데이터의 요약을 하기 표 1 및 표 2에 나타낸다. 공지값에 비교함으로써, NMR 데이터는 효소적으로 생성된 모나틴이 (S,S), (R,R), 또는 양쪽 모두의 혼합물임을 시사하였다.

키랄 LC / MS 분석. 시험관내 생성된 모나틴이 한 이성질체이고 (R,R) 및 (S,S) 거울상 이성질체의 혼합물이 아님을 확인하기 위해, 실시예 10에 기재된 장치를 사용하여 키랄 LC/MS 분석을 수행하였다.

실온에서 키로바이오틱(Chirobiotic) T (어드벤스드 세퍼레이션스 테크놀로지(Advanced Separations Technology)) 키랄 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 키랄 LC 분리를 수행하였다. 매주로부터 공지된 프로토콜을 기초로 분리 및 검출을 트립토판의 R-(D) 및 S-(L) 이성질체에 대해 최적화하였다. LC 이동상은 A) 0.05 % (v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 물; B) 0.05 % (v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 메탄올로 이루어졌다. 용리는 70 % A 및 30 % B에서 등용매적이었다. 흐름 속도는 1.0 mL/min이고, PDA 흡광도를 200 nm 내지 400 nm에서 모니터링하였다. 트립토판 및 모나틴의 키랄 LC/MS 분석에 사용된 기기 매개변수는 LC/MS 분석에 대해 실시예 10에 기재된 것들과 동일하다. 영역 m/z 150-400에 대한 질량 스펙트럼의 수집을 사용하였다. 양자화된 분자 이온에 대한 선택된 이온 크로마토그램 ([M + H]⁺ = 205 R-트립토판 및 S-트립토판 양쪽 모두의 경우 및 [M + H]⁺ = 293 모나틴의 경우)은 혼합물 중의 이들 분석물의 직접적 확인을 가능하게 했다.

키랄 크로마토그래피에 의해 분리되고 MS에 의해 모니터링된 R-트립토판 및 S-트립토판 및 모나틴의 크로마토그램을 도 9에 나타낸다. 모나틴의 크로마토그램에서의 단일 피크는 화합물이 한 이성질체이며, S-트립토판과 거의 동일한 체류 시간을 가짐을 시사한다.

편광성. 루돌프 오토폴(Rudolph Autopol) III 편광계 상에서 광학적 회전을 측정하였다. 모나틴을 수중 14.6 mg/mL 용액으로서 제조하였다. S,S 모나틴 (염 형태)에 대해 예상된 특이적 회전([α]_D ²⁰)은 수중 1 g/mL 용액에 대해 -49.6이다 (Vleggaar et al.). 정제된, 효소적으로 생성된 모나틴에 대해 관측된 [α]_D ²⁰은 -28.1이었으며, 이는 이것이 S,S 이성질체임을 시사하였다.

개선

시약 및 효소 농도를 비롯한 반응 조건을 최적화하고, 50 mM 아세트산암모늄 pH 8.3, 2 mM MgCl₂, 200 mM 피루베이트 (나트륨 또는 암모늄 염), 5 mM 알파-케토글루타레이트 (나트륨 염), 0.05 mM 피리독살 포스페이트, 효소 첨가 후 1 mL의 최종 부피를 달성하기 위한 탈기수 5-10 mg/mL, 3 mM 인산칼륨, 50 ㎍/mL의 재조합 ProA 알돌라아제 (세포 추출물; 총 단백질 농도 167 ㎍/mL), 대장균 aspC 유전자에 의해 코딩되는 1000 ㎍/mL의 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (세포 추출물; 총 단백질의 농도 2500 ㎍/mL), 및 > 60 mM의 농도를 제공하기 위한 고체 트립토판(포화됨; 반응 전체에서 일부 용해되지 않음)의 시약 혼합물을 사용하여 5-10 mg/mL의 수득물을 생성하였다. 혼합물을 4 시간 동안 온화하게 교반 또는 혼합하면서 30 ℃에서 인큐베이션하였다.

치환

알파-케토글루타레이트의 농도를 1 mM로 감소시킬 수 있고, 모나틴의 등가의 수율을 얻으면서 9 mM 아스파테이트로 보충할 수 있다. 대체 아미노산 수용체, 예를 들면 옥살로아세테이트를 제 1 단계에서 사용할 수 있다.

재조합 L. 메이저 광역 기질 아미노트랜스퍼라아제를 대장균 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 대신에 사용한 경우, 모나틴을 유사한 수율로 얻었다. 그러나, 또한, 분자 질량 292를 갖는 제 2 미확인 생성물 (3-10 %의 주요한 생성물)도 LC-MS 분석에 의해 검출되었다. 대장균 tyrB 코딩된 효소, S. 멜리오티 tat A 코딩된 효소 또는 돼지 심장으로부터의 글루타믹-옥살로아세트산 트란스아미나아제 (타입 IIa)를 아미노트랜스퍼라아제로서 첨가한 경우 0.1-0.5 mg/mL의 모나틴 농도가 생성되었다. 인돌-3-피루베이트로부터 반응을 개시하는 경우, 글루타메이트 디히드로게나아제 및 NADH를 사용한 마지막 단계 (실시예 7에서와 같은)에 대해 환원성 아민화를 행할 수 있다. 또한, B. 서브틸리스, 대장균, 및 S. 멜리오티로부터의 KHG 알돌라아제를 대장균 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제와 사용하여 효소적으로 모나틴을 제조하였다. 하기 반응 조건을 사용하였다: 50 mM NH₄-OAc pH 8.3, 2 mM MgCl₂, 200 mM 피루베이트, 5 mM 글루타메이트, 0.05 mM 피리독살 포스페이트, 효소 첨가 후 0.5 mL의 최종 부피를 달성하기 위한 탈기수, 3 mM 인산칼륨, 20 ㎍/mL의 재조합 B. 서브틸리스 KHG 알돌라아제 (정제됨), 세포 추출물로부터 정제되지 않은 약 400 ㎍/mL의 대장균 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (AspC), 및 12 mM 인돌-3-피루베이트. 반응물을 30 분 동안 진탕하면서 30 ℃에서 인큐베이션하였다. B. 서브틸리스 효소를 사용하여 제조된 모나틴의 양은 80 ng/mL였고, 알돌라아제의 양이 증가함에 따라 증가하였다. 인돌-3-피루베이트 및 글루타메이트를 포화량의 트립토판 및 5 mM 알파-케토글루타레이트에 의해 대체한 경우, 모나틴의 생산은 360 ng/mL로 증가하였다. 포화량의 트립토판을 사용하여 50 mM Tris 중에서 (pH 8.3) 30 ㎍/mL의 각각 3 개의 KHG 효소를 사용하여 반응을 반복하고, 검출을 증가시키기 위해 1 시간 동안 진행하게 하였다. 바실러스 효소는 실시예 4에서와 같이 최고 활성을 가졌으며, 대략 4000 ng/mL 모나틴을 생산하였다. 대장균 KHG는 3000 ng/mL 모나틴을 생산하고, S. 멜리오티 효소는 2300 ng/mL를 생산하였다.

실시예 7

MP 와 모나틴 간의 상호전환

MP로부터 모나틴을 형성하는 아민화는 아미노트랜스퍼라아제, 예를 들면 실시예 1 및 6에서 동정된 것들, 또는 환원 보조인자, 예를 들면 NADH 또는 NADPH를 필요로 하는 디히드로게나아제에 의해 촉매화될 수 있다. 이들 반응은 가역적이고, 어느 방향으로든 측정될 수 있다. 디히드로게나아제 효소를 사용하는 경우 방향성은 암모늄 염의 농도에 의해 크게 조절될 수 있다.

디히드로게나아제 활성. NAD(P)⁺가 보다 발색성인 NAD(P)H로 전환됨에 따라 340 nm에서의 흡광도의 증가를 뒤따름으로써 모나틴의 산화 탈아민화를 모니터링하였다. 모나틴은 효소적으로 생성되었고, 이를 실시예 6에 기재된 바와 같이 정제하였다. 전형적인 분석 시험 혼합물은 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 내지 8.9, 0.33 mM NAD⁺ 또는 NADP⁺, 2 내지 22 유닛의 글루타메이트 디히드로게나아제 (시그마), 및 0.2 mL 중의 10-15 mM 기질을 함유하였다. UV-투명 마이크로역가 플레이트에서, 몰레큘러 디바이스즈 스펙트라멕스 플러스 플레이트리더를 사용하여 분석 시험을 2 회 수행하였다. 효소, 완충제, 및 NAD(P)⁺의 혼합물을 피펫팅하여 기질을 함유하는 웰에 넣고, 잠깐 혼합한 후 10 초 간격으로 340 nm에서의 흡광도 증가를 모니터링하였다. 반응물을 25 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 기질을 첨가하지 않은 음성 대조군을 제조하고, 글루타메이트를 양성 대조군으로 사용하였다. 소 간으로부터의 타입 III 글루타메이트 디히드로게나아제 (시그마 # G-7882)는 글루타메이트로부터 알파-케토글루타레이트로의 전환 속도의 대략 100 분의 1의 전환 속도에서 모나틴으로부터 모나틴 전구체로의 전환을 촉매화하였다.

아미노기 전달 활성. 모나틴 아미노트랜스퍼라아제 분석 시험을 대장균으로부터의 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (AspC), 대장균으로부터의 티로신 아미노트랜스퍼라아제 (TyrB), L. 메이저로부터의 광역 기질 아미노트랜스퍼라아제(BSAT), 및 실시예 1에 기재된 두 상업적으로 입수가능한 돼지 글루타메이트-옥살로아세테이트 아미노트랜스퍼라아제를 사용하여 수행하였다. 옥살로아세테이트 및 알파-케토글루타레이트 양쪽 모두를 아미노 수용체로서 시험하였다. 분석 시험 혼합물은 50 mM Tris-HCI, pH 8.0, 0.05 mM PLP, 5 mM 아미노 수용체, 5 mM 모나틴, 및 25 ㎍의 아미노트랜스퍼라아제를 함유하였다(0.5 mL 중). 분석 시험을 30 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하고, 반응을 0.5 mL 이소프로필 알코올의 첨가에 의해 중단하였다. 모나틴의 손실을 LC/MS에 의해 모니터링하였다 (실시예 10). 최고 량의 활성은 아미노 수용체로서 L. 메이저 BSAT와 옥살로아세테이트 후에, 아미노 수용체로서 동일한 효소와 알파-케토글루타레이트를 사용한 경우에 나타났다. 옥살로아세테이트를 사용한 경우의 상대적 활성은 BSAT > AspC > 돼지 타입 IIa > 돼지 타입 I = TyrB였다. 알파-케토글루타레이트를 사용한 경우의 상대적 활성은 BSAT > AspC > 돼지 타입 I > 돼지 타입 IIa > TyrB였다.

실시예 8

트립토판 및 피루베이트 이외의 C3 공급원으로부터 모나틴의 생산

실시예 6에서 상기한 바와 같이, 피루베이트를 C3 분자로 사용하여 인돌-3-피루베이트 또는 트립토판을 모나틴으로 전환시킬 수 있다. 그러나, 일부 경우에서, 피루베이트는 바람직한 원료가 아닐 수 있다. 예를 들면, 피루베이트는 다른 C3 탄소 공급원보다 값비쌀 수 있거나, 또는 배지에 첨가된 경우 발효에 악영향을 미칠 수 있다. 알라닌을 많은 PLP-효소에 의해 아미노기 전이하여 피루베이트를 생성할 수 있다.

트립토판네이즈-유사 효소는 다른 PLP 효소, 예를 들면 아미노트랜스퍼라아제보다 빠른 속도로 베타-제거 반응을 수행한다. 이 부류 (4.1.99.-)로부터의 효소는 아미노산, 예를 들면 L-세린, L-시스테인, 및 우수한 이탈기를 갖는 세린 및 시스테인의 유도체, 예를 들면 0-메틸-L-세린, 0-벤질-L-세린, S-메틸시스테인, S-벤질시스테인, S-알킬-L-시스테인, O-아실-L-세린, 3-클로로-L-알라닌으로부터 암모니아 및 피루베이트를 생성할 수 있다.

EC 4.1.99.- 폴리펩티드를 사용하여 모나틴을 제조하는 방법은 문헌[Mouratou et al.(R Biol. Chem 274: 1320-5, 1999)]의 방법에 따라 β-티로시네이즈 (TPL) 또는 트립토판네이즈를 돌연변이화시킴으로써 개선될 수 있다. Mouratou et al.의 문헌은 천연적으로 발생하는 것으로 보고되지 않았던 β-티로시네이즈로부터 디카르복실산 아미노산 β-리아제로 전환이 가능하다는 것을 기재하고 있다. 발린 (V) 283을 아르기닌 (R)으로 전환시키고 아르기닌 (R) 100을 트레오닌 (T)으로 전환시킴으로써 특이성에서의 변화를 달성하였다. 이들 아미노산 변화는 리아제가 가수분해적 탈아민화 반응에 대한 디카르복실산 아미노산 (예를 들면, 아스파테이트)을 수용하게 한다. 따라서, 아스파테이트도 후속 알돌 축합 반응에 대한 피루베이트의 공급원으로 사용될 수 있다.

또한, 세포 또는 효소 반응기에 락테이트 및 락테이트를 피루베이트로 전환시키는 효소를 공급할 수 있다. 이 반응을 촉매화할 수 있는 효소의 예는 락테이트 디히드로게나아제 및 락테이트 옥시다아제를 포함한다.

반응 혼합물은 50 mM Tris-Cl pH 8.3, 2 mM MgCl₂, 200 mM C3 탄소 공급원, 5 mM 알파-케토글루타레이트, 나트륨 염, 0.05 mM 피리독살 포스페이트, 효소 첨가 후 0.5 mL의 최종 부피를 달성하기 위한 탈기수, 3 mM 인산칼륨 pH 7.5, 실시예 4에서 제조된 25 ㎍의 조 재조합 C. 테스토스테로니 ProA 알돌라아제, 실시예 1에서 제조된 500 ㎍의 조 L-아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (AspC), 및 > 60 mM의 농도를 제공하기 위한 고체 트립토판 (포화됨; 반응 전체에서 일부 용해되지 않음)으로 이루어졌다. 반응 혼합물을 30 ℃에서 30 분 동안 혼합하면서 인큐베이션하였다. 세린, 알라닌, 및 아스파테이트를 3-탄소 공급원으로서 공급하였다. 베타-제거 및 베타-리아제 반응을 수행할 수 있는 2차 PLP 효소 (정제됨) (트립토판네이즈 (TNA), 이중 돌연변이체 트립토판네이즈, β-티로시네이즈 (TPL))를 사용하여 및 사용하지 않고 분석 시험을 수행하였다. 결과를 하기 표 3에 나타낸다.

대체 C3-탄소 공급원을 사용한 모나틴의 생산
C3-탄소 공급원	추가적인 PLP 효소	상대적 활성
없음	없음	0 %
피루베이트	없음	100 %
세린	없음	3 %
세린	11 ㎍ 야생형 TNA (1 U)	5.1 %
세린	80 ㎍ 이중 돌연변이체 TNA	4.6 %
알라닌	없음	32 %
알라닌	11 ㎍ 야생형 TNA	41.7 %
알라닌	80 ㎍ 돌연변이체 TNA	43.9 %
아스파테이트	110 ㎍ 야생형 TNA (10 U)	7.7 %
아스파테이트	5 U 야생형 TPL (조)	5.1 %
아스파테이트	80 ㎍ 돌연변이체 TNA	3.3 %

3-탄소 공급원으로서 알라닌 및 세린으로부터 제조된 모나틴을 LC/MS에 의한/MS 딸 스캔 분석에 의해 확인하고, 실시예 6에서 제조된 특성화된 모나틴과 동일하였다. 알라닌을 최적 대체 시험하고, AspC 효소에 의해 아미노기 전이하였다. 생성된 모나틴의 양은 이차 활성으로서 아미노기 전달을 할 수 있는 트립토판네이즈의 첨가에 의해 증가하였다. 아미노트랜스퍼라아제에 비해 단지 5 분의 1 량의 트립토판네이즈를 첨가했음에도 트립토판네이즈 효소의 첨가로 탄소 공급원으로서 세린을 사용하여 제조된 모나틴의 양은 거의 두 배였다. AspC는 단독으로 일부 량의 베타-제거 활성을 갖는다. 아스파테이트를 사용한 결과는 아스파테이트 상의 트립토판네이즈 활성이 β-티로시네이즈에 대해 앞서 제안한 바와 같이 동일한 특정 부위 지향성 돌연변이를 사용하여 증가하지 않는다는 것을 시사한다. 돌연변이체 β-티로시네이즈는 모나틴의 생산에 대해 높은 활성을 가질 것으로 예상된다.

실시예 9

모나틴의 화학적 합성

알라닌을 인돌-3-피루브산에 첨가하여 모나틴을 생성하고, 이 반응은 그리나드 또는 유기리튬 시약을 사용하여 합성적으로 수행될 수 있다.

예를 들면, 무수 조건 하에서 카르복실 및 아미노기에서 적합하게 차단된 3-클로로- 또는 3-브로모-알라닌에 마그네슘을 첨가하였다. 그 다음, 인돌-3-피루베이트 (적합하게 차단됨)를 첨가하여 커플링된 생성물을 형성한 후, 보호기를 제거하여 모나틴을 형성하였다. 특히 유용한 보호기는 용이하게 부착되고 제거되는 THP (테트라히드로피라닐 에테르)를 포함하였다.

실시예 10

트립토판, 모나틴 및 MP 의 검출

본 실시예는 모나틴, 또는 그의 전구체 2-히드록시 2-(인돌-3-일메틸)-4-케토 글루타르산의 존재를 검출하는 데 사용된 방법을 기재한다.

LC / MS 분석

크로마토그래프와 마이크로메스 콰트트로 울티마 (Micromass Quattro Ultima) 삼중 사중극자 질량 분광계 사이에 직렬로 위치한 워터스 996 포토-다이오드 어레이 (Photo-Diode Array; PDA) 흡광도 모니터를 구비한 워터스 2690 액체 크로마토그래프를 비롯한 워터스/마이크로메스 액체 크로마토그래피-직렬 질량 분석법 (LC/MS/MS) 기기를 사용하여 시험관내 또는 생체내 생화학 반응으로부터 유도된 모나틴, MP 및/또는 트립토판에 대한 혼합물의 분석을 수행하였다. 실온에서, 수펠코 디스커버리 (Supelco Discovery) C₁₈ 역상 크로마토그래피 칼럼, 2.1 mm x 150 mm, 또는 엑스테라 MS C₈ 역상 크로마토그래피 칼럼, 2.1 mm x 250 mm를 사용하여 LC 분리를 수행하였다. LC 이동상은 A) 0.05 % (v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 물 및 B) 0.05 % (v/v) 트리플루오로아세트산을 함유하는 메탄올로 이루어졌다.

구배 용리는 5 % B 내지 35 % B, 0-9 min에서 선형이고, 35 % B 내지 90 % B, 9-16 min에서 선형이고, 90 % B, 16-20 min에서 등용매이고, 90 % B 내지 5 % B, 20-22 min에서 선형이고, 런 사이 10 min 재평형화 기간이 있었다. 흐름 속도는 0.25 mL/min이고, PDA 흡광도를 200 nm 내지 400 nm에서 모니터링하였다. ESI-MS의 모든 매개변수를 최적화하고, 해당 분석물의 양자화된 분자 이온 ([M + H]⁺)의 생성 및 특징 단편 이온의 생산에 기초하여 선택하였다.

모나틴의 LC/MS 분석에 대해 하기 기기 매개변수들을 사용하였다: 모세관: 3.5 kV; 콘 (Cone): 40 V; 헥스 (Hex) 1: 20 V; 천공: 0 V; 헥스 2: 0 V; 공급원 온도: 100 ℃; 탈용매화 온도: 350 ℃; 탈용매화 기체: 500 L/h; 콘 기체: 50 L/h; 저 질량 분해능 (Q1): 15.0; 고 질량 분해능 (Q1): 15.0; 이온 에너지: 0.2; 입구: 50V; 충돌 에너지: 2; 출구: 50V; 저 질량 분해능 (Q2): 15; 고 질량 분해능 (Q2): 15; 이온 에너지 (Q2): 3.5; 배율기 (Multiplier): 650. 기록된 질량/전하비(m/z) 및 분자 질량에 대한 불활실성은 ± 0.01 %였다. 모나틴 (MP)의 알파-케토 산 형태 및 혼합물 중의 모나틴의 초기 검출을 영역 m/z 150-400에 대한 질량 스펙트럼을 수집하며 LC/MS에 의한 모니터링에 의해 달성하였다. 양자화된 분자 이온([M + H]⁺ = 292 MP의 경우, [M + H]⁺ = 293 모나틴의 경우)에 대해 선택된 이온 크로마토그램은 혼합물 중의 이들 분석물의 직접적인 동정을 가능케 했다.

MS / MS 분석

모나틴에 대한 LC/MS/MS 딸이온 실험을 다음과 같이 수행하였다. 딸이온 분석은 제 1 질량 분석기 (Q1)로부터 질량 분광계의 충돌 세포로 해당 어미 이온 (예를 들면, m/z = 293, 모나틴의 경우)을 전달하는 것을 포함하며, 여기서 아르곤이 도입되고, 어미를 단편 (딸) 이온으로 화학적으로 해리시킨다. 그 다음, 이들 단편 이온을 제 2 질량 분석기 (Q2)를 사용하여 검출하고, 어미의 구조적 배정을 확인하는 데 사용할 수 있다. 트립토판을 특성화하고, m/z = 205의 단편화 및 전달을 통해 동일한 방식으로 정량화하였다.

모나틴의 LC/MS/MS 분석에 대해 하기 기기 매개변수를 사용하였다: 모세관: 3.5 kV; 콘: 40 V; 헥스 1: 20 V; 천공: 0 V; 헥스 2: 0 V; 공급원 온도: 100 ℃; 탈용매화 온도: 350 ℃; 탈용매화 기체: 500 L/h; 콘 기체: 50 L/h; 저 질량 분해능 (Q1): 13.0; 고 질량 분해능 (Q1): 13.0; 이온 에너지: 0.2; 입구: -5 V; 충돌 에너지: 14; 출구: 1 V; 저 질량 분해능 (Q2): 15; 고 질량 분해능 (Q2): 15; 이온 에너지 (Q2): 3.5; 배율기: 650.

모나틴 및 트립토판의 고 처리량 결정

상기한 장치, 및 LC/MS/MS에 대해 기재한 동일한 매개변수를 사용하여 시험관내 또는 생체내 반응으로부터 유도된 모나틴 및 트립토판에 대한 혼합물의 고 처리량 분석 (< 5 min/샘플)을 수행하였다. 실온에서 4.6 mm x 50 mm 어드벤스드 세퍼레이션 테크놀로지스 (Advanced Separation Technologies) 키로바이오틱 T 칼럼을 사용하여 LC 분리를 수행하였다. LC 이동상은 A) 0.25 % 아세트산을 함유하는 물; B) 0.25 % 아세트산을 함유하는 메탄올로 이루어졌다. 등용매 용리는 50 % B, 0-5 min에서 이루어졌다. 흐름 속도는 0.6 mL/min이었다. ESI-MS/MS 시스템의 모든 매개변수를 최적화하고, 트립토판 및 내부 표준 ²H₅-트립토판의 양자화된 분자 이온의 최적 인-소스 (in-source) 생성, 뿐만 아니라 다중 반응 모니터링 (MRM) 실험에 대한 아미노산-특이적 단편 이온의 충돌-유도 생산을 기준으로 선택하였다. 양성 이온 다중 반응 모니터링 (mrm) 모드에서 모나틴 및 트립토판의 LC/MS/MS 분석에 대해 하기 기기 매개변수를 사용하였다: 모세관: 3.5 kV; 콘: 20 V; 헥스 1: 15 V; 천공: 1 V; 헥스 2: 0 V; 공급원 온도: 100 ℃; 탈용매화 온도: 350 ℃; 탈용매화 기체: 500 L/h; 콘 기체: 40 L/h; 저 질량 분해능 (Q1): 12.0; 고 질량 분해능 (Q1): 12.0; 이온 에너지: 0.2; 입구: -5 V; 충돌 에너지: 14; 출구: 1 V; 저 질량 분해능 (Q2): 15; 고 질량 분해능 (Q2): 15; 이온 에너지 (Q2): 0.5; 배율기: 650. MRM 매개변수: 채널간 지연 (Interchannel delay): 0.03 s; 스캔간 지연 (Interscan delay): 0.03 s; 체류 (Dwell): 0.05 s.

모나틴의 정확한 질량 측정.

어플라이드 바이오시스템스-퍼킨 엘머 큐-스타 하이브리드 사중극자/비행 시간 질량 분광계를 사용하여 고 분해능 MS 분석을 수행하였다. 양자화된 모나틴에 대해 측정된 질량은 내부 질량 검정 표준으로서 트립토판을 사용하였다. 원자 조성 C₁₄H₁₇N₂O₅를 기준으로 한 양자화된 모나틴의 계산된 질량은 293.1137이었다. 실시예 A에 기재된 생촉매 방법을 사용하여 제조된 모나틴 293.1144의 측정된 질량을 나타내었다. 이는 백만분의 2 부 ( ppm) 미만의 질량 측정 오차이고, 효소적으로 생성된 모나틴의 원자 조성의 결정적인 증거를 제공하였다.

실시예 11

세균에서의 모나틴의 생산

본 실시예는 대장균 세포에서 모나틴을 제조하는 데 사용된 방법을 기재한다. 당업자는 유사한 방법을 사용하여 다른 세균 세포에서 모나틴을 제조할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 모나틴 합성 경로 (도 2)에서 다른 유전자를 함유하는 벡터를 사용할 수 있다.

Trp-1 + 글루코스 배지, 대장균 세포에서 트립토판의 생산 증가에 대해 사용된 최소 배지 (문헌[Zeman et al. Folia Microbiol. 35: 200-4, 1990] 참조)를 다음과 같이 제조하였다. 700 mL 나노퓨어 (nanopure) 물에 하기 시약을 첨가하였다: 2 g의 (NH₄)₂SO₄, 13.6 g의 KH₂PO₄, 0.2 g의 MgSO₄*7H₂O, 0.01 g의 CaCl₂*2H₂O, 및 0.5 mg의 FeSO₄*7H₂O. pH를 7.0으로 조정하고, 부피를 850 mL로 증가시키고, 배지를 오토클레이빙 (autoclaving)하였다. 50 % 글루코스 용액을 별도로 제조하고, 멸균 여과하였다. 40 mL를 1 L의 최종 부피에 대한 기본 배지 (850 mL)에 첨가하였다.

10 g/L L-트립토판 용액을 0.1 M 인산나트륨 중에서 pH 7에서 제조하고, 멸균 여과하였다. 전형적으로 하기 특정한 바와 같이 10 분의 1 부피를 배양물에 첨가하였다. 또한, 10 % 나트륨 피루베이트 용액을 제조하고, 멸균 여과하였다. 전형적으로, 1 리터의 배양물 당 10 mL 엘리콧을 사용하였다. 암피실린 (100 mg/mL), 카나마이신 (25 mg/mL) 및 IPTG (840 mM)의 저장액을 제조하고, 멸균 여과하고, 사용 전 -20 ℃에서 저장하였다. 트윈(Tween) 20 (폴리옥시에틸렌 20-소르비탄 (Sorbitan) 모노라우레이트)을 0.2 % (vol/vol) 최종 농도에서 사용하였다. 암피실린을 치명적이지 않은 농도, 전형적으로 1-10 ㎍/mL 최종 농도에서 사용하였다.

대장균 BL21 (DE3)::C. 테스토스테로니 proA/pET 30 Xa/LIC (실시예 4에 기재)의 신선한 플레이트를 50 ㎍/mL 카나마이신을 함유하는 LB 배지 상에서 제조하였다. 밤샘 배양물 (5 mL)을 단일 콜로니로부터 접종하고, 30 ℃에서 카나마이신을 갖는 LB 배지에서 성장시켰다. 전형적으로, trp-1 + 글루코스 배지 중에서 유도시키는 데 1 내지 50 접종원을 사용하였다. 신선한 항생제를 50 mg/L의 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 진탕 플라스크를 유도 전 37 ℃에서 성장시켰다.

0.35-0.8의 OD₆₀₀이 얻어질 때까지 매 시간마다 세포를 분취하였다. 그 다음, 세포를 0.1 mM IPTG로 유도시키고, 온도를 34 ℃로 감소시켰다. 샘플 (1 ml)을 수집하고 유도 전 (제로 시점), 5000 x g에서 원심분리하였다. LC/MS 분석시 상청액을 -20 ℃에서 동결시켰다. 유도 후 4 시간 후, 또 다른 1 mL 샘플을 수집하고, 세포 펠릿으로부터 별도의 브로쓰로 원심분리하였다. 트립토판, 나트륨 피루베이트, 암피실린, 및 트윈을 상기한 바와 같이 첨가하였다.

유도 후 48 시간 동안 세포를 성장시키고, 또 다른 1 mL 샘플을 취하고, 상기와 같이 제조하였다. 48 시간에서, 트립토판 및 피루베이트의 또 다른 엘리콧을 첨가하였다. 성장 (유도 후) 대략 70 시간 후, 20 분 동안 4 ℃ 및 3500 rpm에서 전 배양 부피를 원심분리하였다. 상청액을 따라내고, 양쪽 모두 브로쓰 및 세포를 -80 ℃에서 동결시켰다. 브로쓰 분획물을 여과하고, LC/MS에 의해 분석하였다. [M+H]⁺ = 293 피크의 높이 및 면적을 실시예 10에 기재된 바와 같이 모니터링하였다. 바탕 양의 배지를 차감하였다. 또한, 데이터를 [M+H]⁺ = 293 피크의 높이를 600 nm에서 배양물의 광학적 밀도로 나누어 플로팅함으로써 세포 성장에 대해 정상화하였다.

유도시가 아니라 유도 후 4 시간에 피루베이트, 암피실린 및 트윈을 첨가하할 때 높은 양의 모나틴을 생성하였다. 다른 첨가제, 예를 들면 PLP, 추가적인 포스페이트, 또는 추가적인 MgCl₂는 모나틴의 생산을 증가시키지 못했다. 인돌-3-피루베이트 대신 트립토판을 사용한 경우, 및 트립토판을 접종시 또는 유도시가 아닌 유도 후에 첨가한 경우, 높은 역가의 모나틴을 얻었다. 유도 전, 및 유도 후 4 시간에 (기질 첨가시), 발효 브로쓰 또는 세포 추출물에서는 전형적으로 검출가능한 양의 모나틴이 존재하지 않았다. pET30벡터 만을 갖는 세포, 뿐만 아니라 트립토판 및 피루베이트를 첨가하지 않은 배양물을 사용하여 음성 대조군을 만들었다. 어미 MS 스캔은 (m + 1)/z = 293을 갖는 화합물이 큰 분자들로부터 유도되지 않고, 딸 스캔 (실시예 10에서 수행된 것과 같음)이 시험관내 제조된 모나틴과 유사하다는 것을 나타내었다.

0, 0.2 % (vol/vol), 및 0.6 % 최종 농도의 트윈-20을 사용함으로써 트윈의 영향을 연구하였다. 진탕 플라스크에 의해 제조된 최고 량의 모나틴은 0.2 % 트윈이었다. 암피실린 농도를 0 내지 10 ㎍/mL에서 변화시켰다. 세포 브로쓰 중 모나틴의 양은 0 내지 1 ㎍/mL에서 빠르게 (2.5 X) 증가하고, 암피실린 농도가 1로부터 10 ㎍/mL로 증가한 경우 1.3 X 증가하였다.

전형적인 결과를 나타내는 시간 과정 실험을 도 10에 도시한다. 세포 브로쓰로 배출된 모나틴의 양은 심지어 값이 세포 성장에 대해 정상화된 경우에도 증가하였다. 트립토판의 몰 소광 계수를 사용함으로써, 브로쓰 중의 모나틴의 양은 10 ㎍/mL 미만인 것으로 추정되었다. proA 인서트 (insert)가 없는 벡터를 함유하는 세포를 사용하여 동일한 실험을 반복하였다. 다수가 음성이었으며, 이는 m/z = 293에서의 피크 높이가 배지 중 단독의 경우보다 이들 배양물 중에서 낮음을 시사하였다 (도 10). 트립토판 및 피루베이트가 존재하지 않는 경우 숫자들은 시종일관 더 낮았고, 이는 모나틴 생산이 알돌라아제 효소에 의해 촉매화되는 효소 반응의 결과임을 입증하였다.

800 mL 진탕 플라스크 실험 및 발효기 중에서 세균 세포 중에서 생체내 모나틴의 생산을 반복하였다. 250 mL 모나틴의 샘플 (무세포 브로쓰 중)을 음이온 교환 크로마토그래피 및 제조용 역상 액체 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이 샘플을 증발시키고, 고 분해능 질량 분석 (실시예 6에 기재됨)을 수행하였다. 고 분해능 MS는 생성된 대사 산물이 모나틴임을 시사하였다.

시험관내 분석 시험은 아미노트랜스퍼라아제가 알돌라아제 (실시예 6 참조)보다 많은 양으로 존재할 것이 필요하기 때문에 대장균으로부터 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제가 알돌라아제 유전자와 함께 과발현되어 생성되는 모나틴의 양을 증가시킨다는 것을 시사한다. 프라이머를 다음과 같이 디자인하하여 C. 테스토스테로니 proA를 aspC/pET30 Xa/LIC를 갖는 오페론에 도입시켰다: 5' 프라이머: ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT (서열 번호 67) 및 3' 프라이머: CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC (서열 번호 68). 5' 프라이머는 클로닝에 대해 BamHI 부위를 함유하고, 3' 프라이머는 SalI 부위를 함유한다. 실시예 4에 기재된 바와 같이 PCR을 수행하고, 겔 정제하였다. PCR 생성물인 aspC/pET30 Xa/LIC 구조체를 BamHI 및 SalI으로 소화시켰다. 퀴아겐 스핀 (Qiagen spin) 칼럼을 사용하여 소화물을 정제하였다. 제조자 지침에 따라 로쉐 라피드 DNA 라이게이션(Roche Rapid DNA Ligation) 키트 (인디애나주 인디아니폴리스 소재)를 사용하여 proA PCR 생성물을 벡터로 라이게이션하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이, 노바블루 싱글즈(Novablues Singles) (노바겐)를 사용하여 화학적 형질전환을 수행하였다. 50 mg/L 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 콜로니를 성장시키고, 퀴아겐 스핀 미니프렙(miniprep) 키트를 사용하여 플라스미드 DNA을 정제하였다. 클론을 제한 소화 분석에 의해 스크리닝하고, 서열을 시크라이트 (Seqwright) (텍사스 휴스턴 소재)에 의해 확인하였다. 구조체를 서브클로닝 (subcloning)하여 BLR (DE3), BLR (DE3) pLysS, BL21 (DE3) 및 BL21 (DE3) pLysS (노바겐)에 넣었다. 또한, proA/pET30 Xa/LIC 구조체를 BL21 (DE3) pLysS로 형질전환시켰다.

상기한 표준 조건 하에서 BLR (DE3) 진탕 플라스크 샘플의 초기 비교는 제 2 유전자(aspC)의 첨가가 제조된 모나틴의 양을 7 배 개선시켰음을 나타내었다. 성장을 촉진하기 위해, 숙주 균주로부터 유도된 BL21 (DE3)을 사용하였다. proA 클론 및 두 개의 유전자 오페론 클론을 상기와 같이 Trp-1 배지에서 유도시키고, pLysS 숙주는 역시 배지에 첨가된 클로람페니콜 (chloramphenicol) (34 mg/L)을 가졌다. 0.2 % 트윈-20 및 1 mg/L 암피실린의 첨가를 사용한 경우와 이를 사용하지 않고서 진탕 플라스크 실험을 수행하였다. 표준으로서 시험관내 제조된 정제된 모나틴을 사용하여 브로쓰 중의 모나틴의 양을 계산하였다. 실시예 10에 기재된 바와 같이 SRM 분석을 수행하였다. 0, 4 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 및 96 시간 성장에서 세포를 분취하였다.

배양 브로쓰에서 제조된 최대량에 대한 결과를 하기 표 4에 나타낸다. 대부분의 경우, 두 개의 유전자 구조체는 proA 구조체 단독의 경우보다 높은 값을 제공하였다. 보다 누출이 많은 세포막을 가져야 하는 pLysS 균주는 전형적으로 낮은 속도로 성장하지만 보다 많은 양의 모나틴을 배출한다. 트윈 및 암피실린의 첨가가 유익하다.

; 대장균 세균에 의해 생성된 모나틴의 양

실시예 12

효모에서 모나틴의 생산

진핵 세포에서 모나틴을 제조하는 데 사용된 본 실시예는 방법을 기재한다. 당업자는 유사한 방법을 사용하여 해당 임의의 세포에서 모나틴을 제조할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 또한, 본 실시예에 기제된 것들 외에 또는 대체적으로 다른 유전자를 사용할 수 있다 (예를 들면, 도 2에 나열된 것들).

pESC 효모 에피토프 테깅 (Epitope Tagging) 벡터 시스템 (스트라타젠(Stratagene), 캘리포니아주 라 졸라 소재)을 사용하여 대장균 aspC 및 C.테스토스테로니 proA 유전자를 사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae)로 클로닝하고 발현시켰다. pESC 벡터는 두 개의 유전자의 발현을 동시에 가능케 하는 두 개의 별개의 다중 클로닝 부위를 마주보는 가닥 상에 갖는 GAL1 및 GAL10 프로모터 양쪽 모두를 함유한다. 또한, pESC-His 벡터는 숙주 (YPH500)에 히스티딘 영양요구적인 보체에 대한 His3 유전자를 함유한다. GAL1 및 GAL10 프로모터는 글루코스에 의해 억제되고 갈락토오스에 의해 유도되며, 효모에서 최적 발현에 코자크 (Kozak) 서열을 사용한다. ESC 플라스미드는 초기 구조체가 대장균에서 제조되게 하는 (선택을 위한 bla 유전자를 가짐) 셔틀 (shuttle) 벡터이지만, 세균 리보좀 결합 부위가 다중 클로닝 부위에 존재하지 않는다.

pESC-His로의 클로닝을 위해 하기 프라이머를 디자인하였다 (제한 부위는 밑줄로 표시하고, 코자크 서열은 진하게 표시함): aspC (BamHIlSaII), GAL1: 5'-CGCGGATCC ATAATGGTTGAGAACATTACCG-3' (서열 번호 69) 및 ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3' (서열 번호 70). proA (EcoRI/NotI), GAL10: 5'-CCGGAATTC ATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3' (서열 번호 71) 및 5'-GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3' (서열 번호 72).

코자크 서열의 도입으로 인해 방향족 아미노산으로부터 발린까지 양쪽 모두의 성숙 단백질에 대한 제 2 코돈을 변화시켰다. 실시예 1 및 실시예 4에 기재된 클론으로부터 pET30 Xa/LIC 미니프렙 DNA를 주형으로 사용하여 해당 유전자를 증폭시켰다. 50 ㎕ 반응물에 대해 에펜드로프 매스터 사이클러 (Eppendorf Master cycler) 구배 써모사이클러 (thermocycler) 및 하기 프로토콜을 사용하여 PCR을 수행하였다: 1.0 ㎕ 주형, 각각 1.0 μM의 프라이머, 각각 0.4 mM dNTP, 3.5 U 익스펜드 하이 피델리티 (Expand High Fidelity) 중합효소 (로쉐, 인디애나주 인디아니폴리스 소재), 및 Mg를 갖는 1X 익스펜드 (Expand)^TM 완충제. 사용된 써모사이클러 프로그램은 94 ℃에서 5 분 동안 고온 출발 후, 4 ℃ 30 초, 50 ℃ 1 분 45 초, 및 72 ℃ 2 분 15 초의 단계를 29 회 반복하는 것으로 이루어졌다. 29 회 반복 후, 샘플을 72 ℃에서 10 분 동안 유지시킨 다음, 4 ℃에서 저장하였다. PCR 생성물을 정제한 후, 1 % TAE-아가로오스 겔 상에서 분리한 후 퀴아퀵 겔 추출 키트 (QIAquick Gel Extraction Kit) (퀴아겐, 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 회수하였다.

pESC-His 벡터 DNA (2.7 ㎍)를 BamHI/SalI으로 소화시키고, 상기와 같이 겔 정제하였다. aspC PCR 생성물을 BamHI/SalI으로 소화시키고, 퀴아퀵 PCR 정제 칼럼을 사용하여 정제하였다. 제조자의 프로토콜을 따라 로쉐 라피드 DNA 라이게이션 키트를 사용하여 라이게이션을 수행하였다. 제조자 지침에 따라 펄스 조절기를 구비한 바이오라드 진 펄서 (Biorad Gene Pulser) II를 사용하여 0.2 cm 바이오라드 (Biorad) 일회용 큐베트에서 탈염화 라이게이션을 40 ㎕ 일렉트로맥스 (Electromax) DH1OB 컴페턴트 (competent) 세포 (인비트로겐 (Invitrogen)로 일렉트로포레이션 (electroporation)하였다. 1 mL의 SOC 배지에서 1 시간의 회수 후, 100 ㎍/mL 암피실린을 함유하는 LB 배지 상에서 형질전환체를 플레이팅하였다. 퀴아프렙 스핀 (QIAprep Spin) 미니프렙 키트를 사용하여 클론용 플라스미드 DNA 제조를 수행하였다. 플라스미드 DNA를 제한 소화에 의해 스크리닝하고, 벡터용으로 디자인된 프라이머를 사용하여 확인을 위해 시퀀싱하였다 (시크라이트).

proA PCR 생성물인 aspC/pESC-His 클론을 EcoRI 및 NotI으로 소화시켰다. DNA를 상기와 같이 정제하고, 상기와 같이 라이게이션하였다. 두 개의 유전자 구조체를 DH1 OB 세포로 형질전환시키고, 제한 소화 및 DNA 시퀀싱에 의해 스크리닝하였다.

S. c. 이지콤프 (EasyComp)^TM 형질전환 키트 (인비트로겐)를 사용하여 구조체를 S. 세레비시에 균주 YPH500으로 형질전환시켰다. 2 % 글루코스를 함유하는 SC-His 최소 배지 (인비트로겐 pYES2 메뉴얼) 상에서 형질전환 반응물을 플레이팅하였다. 상기 PCR 프라이머를 사용하여 콜로니 PCR에 의해 proA 및 aspC 유전자의 존재에 대해 개개의 효모 콜로니를 스크리닝하였다. 펠릿화된 세포 (2 ㎕)를 1 ㎕의 지몰라아제 (zymolase)를 함유하는 20 ㎕의 Y-Lysis 완충제 (지모 리서치 (Zymo Reserach))에서 현탁시키고, 37 ℃에서 10 분 동안 가열하였다. 그 다음, 4 ㎕의 현탁액을 물을 PCR 반응 혼합물 및 상기한 프로그램을 사용하는 50 ㎕의 PCR 반응물에 사용하였다.

5 mL 배양물을 SC-His + 글루코스 상에서 30 ℃ 및 225 rpm에서 밤새 성장시켰다. 세포를 갈락토오스를 사용한 유도 전 지연 기간을 최소화하기 위해 라피노오스 (raffinose) 상에서 성장하도록 점진적으로 조정하였다. 대략 12 시간의 성장 후, 600 nm에서의 흡광도 측정을 수행하고, 적합한 부피의 세포를 교반시키고, 재현탁하여 신선한 SC-His 배지에서 0.4의 OD를 제공하였다. 유도를 위해 하기 탄소 공급원을 순차적으로 사용하였다: 1 % 라피노오스 + 1 % 글루코스, 0.5 % 글루코스 + 1.5 % 라피노오스, 2 % 라피노오스, 및 마지막으로 1 % 라피노오스 + 2 % 갈락토오스.

유도 배지에서 대략 16 시간의 성장 후, 50 mL 배양물을 2 개의 25 mL 배양물로 나누고, 하기를 두 개 중 오직 하나에 첨가하였다: (최종 농도) 1 g/L L-트립토판, 5 mM 인산나트륨 pH 7.1, 1 g/L 나트륨 피루베이트, 1 mM MgCl₂. 비유도 배지로부터, 및 모나틴 경로에 대한 기질 첨가 전 16 시간 배양으로부터의 브로쓰 및 세포 펠릿의 샘플은 음성 대조군으로 작용하였다. 또한, 오직 기능적 aspC 유전자 (및 끝이 잘린 proA 유전자) 만을 함유하는 구조체를 또 다른 음성 대조군으로 사용하였다. 유도 후 총 69 시간 동안 세포를 성장시켰다. 종종 효모 세포를 낮은 OD에서 유도시키고, 트립토판 및 피루베이트의 첨가 전 오직 4 시간 동안만 성장시켰다. 그러나, 이들 모나틴 기질은 성장을 억제하는 것으로 보였으며, 높은 OD에서의 첨가가 더 효과적이었다.

세포 제조자의 프로토콜을 따라 배양물로부터 세포 펠릿을 5 mL의 이스트부스터 (YeastBuster)^TM + 1 그램 당 (습윤 중량) 50 ㎕ THP (노바겐)로 용균시키고, 상기 실시예에 기재된 바와 같이 프로테아제 억제제 및 벤조나아제 뉴클레아제를 첨가하였다. 배양 브로쓰 및 세포 추출물을 여과하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 SRM에 의해 분석하였다. 이 방법을 사용하여, 브로쓰 샘플에서 모나틴이 검출되지 않았으며, 이는 세포가 이들 조건 하에서는 모나틴을 분비하지 못한다는 것을 시사하였다. 양자 기동력이 이들 조건 하에서 불충분할 수 있거나 또는 일반적인 아미노산 수송제는 트립토판으로 포화될 수 있다. 단백질 발현은 SDS-PAGE를 상용하여 변화를 검출할 수 있는 양이 못되었다.

트립토판 및 피루베이트를 배지에 첨가한 경우 두 가지 기능적 유전자를 갖는 배양물의 세포 추출물에서 모나틴은 일시적으로 검출가능하였다(대략 60 ng/mL). 모나틴은 임의의 음성 대조군 세포 추출물에서 검출되지 않았다. 실시예 6에 기재된 최적화된 분석 시험을 사용하여 4.4 mg/mL의 총 단백질 (대장균 세포 추출물에 전형적으로 사용된 것의 약 두 배)을 사용하여 모나틴에 대한 시험관내 분석 시험을 2 회 수행하였다. 32 ㎍/mL C. 테스토스테로니 ProA 알돌라아제 또는 400 ㎍/mL AspC 아미노트랜스퍼라아제를 첨가하여 어떤 효소가 세포 추출물에서 제한적인지 결정하기 위해 다른 분석 시험을 수행하였다. 효소를 첨가하지 않거나, 또는 오직 AspC 아미노트랜스퍼라아제 (효소 없이 어느 정도 알돌 축합이 발생할 수 있음)만을 첨가한 음성 대조군을 제조하였다. 16 ㎍/mL 알돌라아제 및 400 ㎍/mL 아미노트랜스퍼라아제를 사용하여 부분적으로 순수한 효소 (30-40 %)를 갖는 양성 대조군을 제조하였다.

시험관내 결과를 SRM에 의해 분석하였다. 세포 추출물의 분석은 유도 후 트립토판을 배지에 첨가한 경우 트립토판이 세포로 유효하게 수송되어 추가적인 트립토판을 첨가하지 않은 경우보다 두 배 높은 트립토판의 양을 제공하였다는 것을 보여주었다. 시험관내 모나틴 분석에 대한 결과를을 하기 표 6에 나타낸다 (숫자들은 ng/mL를 표시함).

효모 세포 추출물을 사용한 모나틴 생산
	aspC 구조체	+ 알돌라아제	+ AspC	2-유전자 구조체	+ 알돌라아제	+ AspC
억제 (글루코스 배지)	0	888.3	173.5	0	465.2	829
24 hr 유도	0	2832.8	642.4	0	1375.6	9146.6
69 hr 유도	0	4937.3	340.3	71.9	1652.8	23693.5
69 hr + subs.	0	556.9	659.1	21.9	755.6	16688.2
+ 대조군 (정제된 효소)	21853			21853
- 대조군 (효소 비함유)	0		254.3	0		254.3

성장 배지에 첨가된 기질을 함유하는 완전 2-유전자 구조체 세포 추출물 및성장 배지에 첨가된 기질을 함유하지 않는 완전 2-유전자 구조체 세포 추출물을 사용하여 양성 결과를 얻었다. 이들 결과는 양성 대조군과 비교할 때, 효소가 1 %에 근사한 총 단백질의 양을 효모에서 발현하였다는 것을 시사한다. aspC 구조체 (끝이 잘린 proA를 가짐)의 세포 추출물을 알돌라아제로 분석 시험한 경우, 제조된 모나틴의 양은 세포 추출물을 단독으로 분석 시험한 경우보다 현저하게 컸으며, 이는 재조합 AspC 아미노트랜스퍼라아제가 대략 1-2 %의 효모 총 단백질을 포함함을 시사한다. 알돌라아제로 분석 시험한 경우 유도되지 않은 배양물의 세포 추출물은 세포 중의 본래의 아미노트랜스퍼라아제의 존재로 인해 소량의 활성을 가졌다. AspC 아미노트랜스퍼라아제로 분석 시험한 경우, 유도되지 않은 세포로부터의 추출물의 활성은 AspC (약 200 ng/ml)를 갖는 모나틴 음성 대조군에 의해 제조된 모나틴의 양으로 증가되었다. 반대로, 두 개의 유전자 구조체 세포 추출물을 분석 시험한 경우 관측된 활성은 아미노트랜스퍼라아제를 보충한 경우 알돌라아제를 첨가한 경우보다 증가하였다. 양쪽 모두의 유전자가 동일한 양으로 발현되어야 하기 때문에, 이는 생성된 모나틴의 양이 아미노트랜스퍼라아제의 양이 알돌라아제의 양보다 높은 경우 최대화된다는 것을 시사하며, 실시예 6에서의 결과와 일치한다.

피루베이트 및 트립토판의 첨가는 세포 성장을 억제할 뿐만 아니라 단백질 발현도 확실히 억제한다. pESC-Trp 플라스미드의 첨가를 사용하여 YPH500 숙주 세포 트립토판 영양요구성을 보정함으로써 성장, 발현 및 분비에 대해 영향이 적은 트립토판을 공급하는 수단을 제공할 수 있다.

실시예 13

커플링된 반응을 사용한 효소 방법의 개선

이론상, 부반응 또는 기질 또는 중간체의 분해가 발생하지 않는 경우, 도 1에 도시된 효소 반응으로부터 형성된 생성물의 최대량은 각각의 반응의 평형 상수, 및 트립토판 및 피루베이트의 농도에 정비례한다. 트립토판은 그다지 가용성이지 않은 기질이고, 200 mM를 초과하는 피루베이트의 농도는 수율에 악영향을 미치는 것으로 보인다 (실시예 6 참조).

이상적으로, 분리 비용을 감소시키기 위해 모나틴의 농도를 기질에 대해 최대화시킨다. 물리적 분리는 역 반응이 발생하는 것을 방지하면서 모나틴을 반응 혼합물로부터 제거하도록 수행될 수 있다. 그 다음, 원료 및 촉매를 재생할 수 있다. 몇몇 시약 및 중간체에 대한 모나틴의 크기, 전하 및 소수성에서의 유사성으로 인해, 모나틴에 대한 높은 양의 친화성 (예를 들면, 친화성 크로마토그래피 기술)이 존재하지 않는다면 물리적 분리가 어려울 것이다. 그러나, 시스템의 평형이 모나틴 생산으로 이동하도록 다른 반응에 모나틴 반응을 커플링시킬 수 있다. 하기는 트립토판 또는 인돌-3-피루베이트으로부터 얻어진 모나틴의 수율을 개선시키는 방법의 예이다.

옥살로아세테이트 데카르복실라아제 ( EC 4.1.1.3)를 사용한 커플링된 반응

도 11은 반응도이다. 트립토판 옥시다아제 및 카탈라아제를 사용하여 인돌-3-피루베이트 생산 방향으로 반응을 유도시켰다. 역 방향으로 반응하거나 또는 효소 또는 중간체에 손상을 주는 과산화수소가 이용가능하지 않도록 카탈라아제를 과량으로 사용한다. 카탈라아제 반응 동안 산소를 재생시켰다. 별법으로, 인돌-3-피루베이트를 기질로 사용할 수 있었다.

아스파테이트를 MP의 아민화에 대한 아미노 공여체로 사용하고, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 사용하였다. 이상적으로, MP로부터의 모나틴 반응에 비해 트립토판/인돌-3-피루베이트 반응에 낮은 특이성을 갖는 아미노트랜스퍼라아제를 사용하여, 인돌-3-피루베이트를 재아민화하는 아스파테이트를 사용하지 않았다. 옥살로아세테이트 데카르복실라아제 (수도모나스 sp.로부터)를 첨가하여 옥살로아세테이트를 피루베이트 및 이산화탄소로 전환시킬 수 있다. CO₂가 휘발성이기 때문에, 역 반응을 감소시키거나 심지어 방지하는 효소를 사용한 반응이 이용가능하지 않다. 또한, 이 단계에서 생성된 피루베이트를 알돌 축합 반응에 사용할 수 있다. 다른 데카르복실라아제 효소를 사용할 수 있고, 상동체는 엑틴바실러스 엑티노마이세템코미탄스 (Actinobacillus actinomycetemcomitans), 아퀴펙스 에올리쿠스 (Aquifex aeolicus), 아케오글로부스 플기더스 (Archaeoglobus fulgidus), 아조토박터 비넬란디 (vinelandii), 박테로이데스 프라길리스 (Bacteroides fragilis), 몇몇 보르데텔라 (Bordetella) 종, 캄필로박테 제주니 (Campylobacter jejuni), 클로로비움 테피덤 (Chlorobium tepidum), 클로로플렉서스 오란티아쿠스 (Chloroflexus aurantiacus), 엔테로코쿠스 페칼리스 (Enterococcus faecalis), 퍼소박테리움 뉴클레아텀 (Fusobacterium nucleatum), 클레브시엘라 뉴모니에 (Klebsiella pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 마그네토코쿠스 (Magnetococcus) MC-1, 만헤이마 헤몰리티카 (Mannheimia haemolytica), 메틸로바실러스 플라겔라터스 (Methylobacillus flagellatus) KT, 파스퇴렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida) Pm70, 페트로토가 미토써마 (Petrotoga miotherma), 포르피로모나스 긴기발리스 (Porphyromonas gingivalis), 몇몇 수도모나스 종, 몇몇 피로코쿠스 (Pyrococcus) 종, 로도코쿠스, 몇몇 살모넬라 (Salmonella) 종, 몇몇 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 종, 써모크로마티움 테피덤 (Thermochromatium tepidum), 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima), 트레포네마 팔리덤 (Treponema pallidum), 및 몇몇 비브리오 (Vibrio) 종에 존재하는 것으로 공지되어 있다. 실시예 1에 기재된 바와 같이, 대장균으로부터의 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제 (AspC), 대장균으로부터의 티로신 아미노트랜스퍼라아제 (TyrB), L. 메이저로부터의 광역 기질 아미노트랜스퍼라아제 (BSAT), 및 두 상업적으로 입수가능한 돼지 글루타메이트-옥살로아세테이트 아미노트랜스퍼라아제를 사용하여 트립토판 아미노트랜스퍼라아제 분석 시험을 수행하였다. 옥살로아세테이트 및 알파-케토글루타레이트 양쪽 모두를 아미노 수용체로서 시험하였다. 모나틴을 사용한 활성 (실시예 7) 대 트립토판을 사용한 활성비를 비교하여 어떠한 효소가 모나틴 아미노트랜스퍼라아제 반응에 최고 특이성을 갖는지 결정하였다. 이들 결과는 트립토판 반응에 대해 모나틴 반응에 최고 특이성을 갖는 효소가 돼지 타입 II-A 글루타메이트-옥살로아세테이트 아미노트랜스퍼라아제, GOAT (시그마 G7005)였다는 것을 시사하였다. 이 특이성은 어떤 아미노 수용체가 사용되느냐와는 독립적이었다. 따라서, 이 효소를 옥살로아세테이트 데카르복실라아제와의 커플링된 반응에 사용하였다.

인돌-3-피루베이트로부터 출발하는 전형적인 반응은 (최종 농도) 50 mM Tris-Cl pH 7.3, 6 mM 인돌-3-피루베이트, 6 mM 나트륨 피루베이트, 6 mM 아스파테이트, 0.05 mM PLP, 3 mM 인산칼륨, 3 mM MgCl₂, 25 ㎍/mL 아미노트랜스퍼라아제, 50 ㎍/mL C. 테스토스테로니 ProA 알돌라아제, 및 3 단위/mL의 데카르복실라아제 (시그마 04878)를 포함하였다. 반응을 1 시간 동안 26 ℃에서 진행하였다. 일부 경우, 데카르복실라아제를 생략하거나 또는 아스파테이트를 알파-케토글루타레이트 (음성 대조군으로서)로 대체하였다. 또한, GOAT 대신에 상기한 아미노트랜스퍼라아제 효소를 시험하여 조기 특이성 실험을 확인하였다. 샘플을 여과하고, 실시예 10에 기재된 바와 같이 LC/MS에 의해 분석하였다. 결과는 GOAT 효소가 1 mg의 단백질 당 최고 모나틴의 양을 생산하였으며, 최저량의 트립토판이 부산물로서 생성되었다는 것을 나타내었다. 또한, 데카르복실라아제 효소의 첨가로 2-3 배의 이익을 얻었다. 또한, 대장균 AspC 효소는 다른 아미노트랜스퍼라아제에 비해 다량의 모나틴을 생산하였다.

모나틴 생산은 1) 주기적으로 인돌-피루베이트, 피루베이트, 및 아스파테이트를 2 mM 첨가(매 0.5 시간 내지 1 시간마다)하고, 2) 반응을 혐기성 환경에서 또는 탈기된 완충제를 사용하여 수행하고, 3) 반응을 밤새 진행시키고, 4) 여러번 동결-해동되지 않은 신선하게 제조된 데카르복실라아제를 사용함으로써 증가하였다. 데카르복실라아제는 12 mM를 초과하는 농도의 피루베이트에 의해 억제되었다. 4 mM를 초과하는 인돌-3-피루베이트의 농도에서, 인돌-3-피루베이트와의 부반응이 촉진되었다. 알돌라아제의 양이 또한 증가하는 경우 반응에 사용된 인돌-3-피루베이트의 양은 증가될 수 있다. 높은 수준의 포스페이트 (50 mM) 및 아스파테이트 (50 mM)가 데카르복실라아제 효소를 억제하는 것으로 발견되었다. 1 시간 반응으로 모나틴 생산은 감소하지 않으면서 첨가된 데카르복실라아제 효소의 양을 0.5 U/mL로 감소시킬 수 있었다. 26 ℃에서 30 ℃로 및 30 ℃에서 37 ℃로 온도가 증가하는 경우 제조된 모나틴의 양은 증가하였으나, 37 ℃에서 인돌-3-피루베이트의 부반응도 촉진되었다. pH가 7로부터 7.3으로 증가함에 따라 생성된 모나틴의 양은 증가하고 pH 7.3-8.3에서 상대적으로 안정하였다.

트립토판으로 출발하는 전형적인 반응은 (최종 농도) 50 mM Tris-Cl pH 7.3, 20 mM 트립토판, 6 mM 아스파테이트, 6 mM 나트륨 피루베이트, 0.05 mM PLP, 3 mM 인산칼륨, 3 mM MgCl₂, 25 ㎍/mL 아미노트랜스퍼라아제, 50 ㎍/mL C. 테스토스테로니 ProA 알돌라아제, 4 단위/mL의 데카르복실라아제, 5-200 mU/mL L-아미노산 옥시다아제 (시그마 A-2805), 168 U/mL 카탈라아제 (시그마 C-3-3515), 및 0.008 mg의 FAD를 포함하였다. 반응을 30 분 동안 30 ℃에서 수행하였다. 데카르복실라아제의 첨가로 개선이 관측되었다. 가장 큰 모나틴의 양은 50 mU/mL의 옥시다아제를 사용한 경우 생성되었다. 개선은 인돌-3-피루베이트를 기질로 사용한 경우 관측된 것과 유사하였다. 또한, 생성된 모나틴의 양은 1) 트립토판 양이 낮은 경우 (즉, 아미노트랜스퍼라아제 효소의 K_m 미만이어서, 활성 부위에서 MP와 경쟁할 수 없는 경움), 및 2) 옥시다아제 대 알돌라아제 및 아미노트랜스퍼라아제의 비가 인돌-3-피루베이트가 축적될 수 없는 양으로 유지된 경우 증가하였다.

인돌-3-피루베이트로 출발하든 또는 트립토판으로 출발하든, 2-4 배량의 모든 효소를 동일한 효소 비를 유지하면서 사용한 경우 1-2 시간의 인큐베이션 시간을 갖는 분석 시험에서 제조된 모나틴의 양은 증가하였다. 기질을 사용하여, 대략 1 mg/mL의 모나틴의 농도를 얻었다. 인돌-피루베이트로부터 출발한 경우 생성된 트립토판의 양은 전형적으로 생성물 양의 20 % 미만이었으며, 이는 커플링된 반응 사용의 이익을 보여주었다. 추가의 최적화 및 중간체의 농도 및 부반응의 통제를 사용하여, 생산성 및 수율은 상당히 개선될 수 있다.

리신 엡실론 아미노트랜스퍼라아제 ( EC 2.6.1.36)를 사용한 커플링된 반응

리신 엡실론 아미노트랜스퍼라아제 (L-리신 6-트란스아미나아제)는 로도코쿠스, 미코박테리움 (Mycobacterium), 스트렙토마이세스, 노르카디아 (Nocardia), 플라보박테리움, 칸디다 유틸리스 (Candida utilis) 및 스트렙토마이세스를 비롯한 몇몇 유기체에서 발견된다. 이는 일부 베타-락탐 항생제의 생산시 제 1 단계로서 유기체에 의해 사용된다 (문헌[Rius and Demain, J. Microbiol. Biotech., 7: 95-100, 1997] 참조). 이 효소는 알파-케토글루타레이트를 아미노 수용체로 사용하는 리신의 C-6의 PLP-매개 아미노기 전달에 의해 리신을 L-2-아미노아디페이트 6-세미알데히드 (알리신)로 전환시킨다. 알리신은 불안정하고, 자발적으로 세포내 탈수되어 1-피페리딘 6-카르복실레이트인 시클릭 분자를 형성한다. 이는 임의의 역 반응이 발생하는 것을 유효하게 억제한다. 반응도를 도 12에 도시한다. 또한, 대체 효소인 리신-피루베이트 6-트란스아미나아제 (EC 2.6.1.71)를 사용할 수 있다.

전형적인 반응물은 1 mL 중에 50 mM Tris-HCl pH 7.3, 20 mM 인돌-3-피루베이트, 0.05 mM PLP, 6 mM 인산칼륨 pH 8,2-50 mM 나트륨 피루베이트, 1.5 mM MgCl₂, 50 mM 리신, 100 ㎍ 아미노트랜스퍼라아제 (리신 엡실론 아미노트랜스퍼라아제 LAT-101, 캘리포니아주 파사데나 소재의 바이오카탈리틱스 (BioCatalytics)), 및 200 ㎍ C. 테스토스테로니 ProA 알돌라아제를 함유하였다. 생성된 모나틴의 양은 피루베이트의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 이들 반응 조건 (50 mM 피루베이트에서)을 사용한 최대량은 옥살로아세테이트 데카르복실라아제 (대략 0.1 mg/mL)를 사용한 커플링된 반응으로 관측된 것보다 10-배 적었다.

[M+H]⁺ = 293을 갖는 피크는 모나틴에 대한 예상된 시간에서 용리되고, 질량 스펙트럼은 단편 다른 효소 방법을 사용하여 관측된 동일한 것들을 몇몇 함유하였다. 보정 질량 대 전하 비 (293)를 갖는 제 2 피크는 실시예 6에서 제조된 S,S 모나틴에 대해 전형적으로 관측된 것보다 약간 이르게 용리되고, 모나틴의 또 다른 이성질체의 존재를 시사할 수 있었다. 이 효소에 의해 매우 적은 트립토판이 생성되었다. 그러나, 피루베이트에 대해 일부 활성이 있는 것 같았다 (부산물로서 알라닌 생성). 또한, 효소는 불안정한 것으로 공지되어 있다. 지향된 방출 실험을 수행하여 안정성을 증가시키고, 피루베이트에 대한 활성을 감소시키고, MP에 대한 활성을 증가시킴으로써 개선이 이루어질 수 있다. 또한, 이들 반응물을 상기한 바와 같이 L-아미노산 옥시다아제/카탈라아제에 커플링할 수 있다.

다른 커플링된 반응

트립토판 또는 인돌-피루베이트으로부터의 모나틴 수율을 개선시킬 수 있는 또 다른 커플링 반응을 도 13에 도시한다. 포르메이트 디히드로게나아제 (EC 1.2.1.2 또는 1.2.1.43)는 통상의 효소이다. 일부 포르메이트 디히드로게나아제는 NADH를 필요로 하지만 다른 것들은 NADPH를 사용할 수 있다. 상기 실시예에서, 글루타메이트 디히드로게나아제는 암모늄 기재 완충제를 사용하여 모나틴 전구체와 모나틴 간의 상호전환을 촉매화하였다. 포름산암모늄 및 포르메이트 디히드로게나아제의 존재는 보조인자 재생에 대한 효과적인 시스템이고, 이산화탄소의 생산은 역 반응 속도를 감소시키는 효과적인 방법이다 (문헌[Bommarius et al., Biocatalysis 10: 37, 1994 and Galkin et al. Appl. Environ. Microbiol. 63: 4651-6, 1997] 참조). 또한, 다량의 포름산암모늄을 반응 완충제 중에 용해시킬 수 있다. 글루타메이트 디히드로게나아제 반응 (또는 유사한 환원성 아민화)에 의해 제조된 모나틴의 수율은 포르메이트 디히드로게나아제 및 포름산암모늄의 첨가에 의해 개선될 수 있다.

모나틴 생산 쪽으로 평형을 유도시키는 데 다른 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 오메가-아미노산 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.18), 예를 들면 미국 특허 5,360,724 및 5,300,437에 기재된 것들을 사용하여 MP에서 모나틴으로의 전환시 아미노프로판을 아미노산 공여체로서 사용하는 경우, 생성되는 생성물 중 하나는 기질인 아미노프로판보다 더 휘발성인 생성물인 아세톤일 것이다. 온도를 주기적으로 짧은 시간 동안 상승시켜 아세톤을 증발시킴으로써, 평형을 완화할 수 있다. 아세톤은 단기간 사용된 경우 중간체로 잘 분해되지 않는 47 ℃의 비등점을 갖는다. 또한, 알파-케토글루타레이트에 대해 활성을 갖는 대부분의 아미노트랜스퍼라아제는 모나틴 전구체에 대한 활성을 갖는다. 유사하게, 글리옥실레이트/방향족 산 아미노트랜스퍼라아제 (EC 2.6.1.60)가 아미노 공여체로서 글리신과 사용된 경우, 상대적으로 불안정하고 글리신에 비해 상당히 감소된 비등점을 갖는 글리옥실레이트가 생성된다.

실시예 14: 용량 반응 곡선

15 ppm, 30 ppm, 45 ppm, 60 ppm, 75 ppm 및 90 ppm의 모나틴 용액(2R, 4R/2S,4S 거울상이성체 쌍 약 96%와 2R,4S/2S,4R 거울상이성체 쌍 4%의 혼합물 - 모나틴의 "라세미 혼합물"이라고도 함)을, 0.14%(w/v) 시트르산 및 0.04%(w/v) 시트르산나트륨을 함유하는 pH 3.2 모델 소프트 드링크 시스템 중에서 제조하였다. 슈크로오스와 비교한 모나틴의 감미성은 후술하는 감미성 평가 방법을 이용하여 측정하였다. 모든 평가는 이 감미성 측정 절차에 경험이 있는 숙련된 패널리스트로 구성된 패널(n = 6-8)에 의해 이중으로 수행되었다. 모든 샘플은 20℃±1℃의 온도에서 사용되었다.

모나틴 용액을 코드화하고, 개별적으로 패널리스트에게 무작위 순서로 제공하였다. 슈크로오스 농도가 2.0∼11.0%(w/v)인 슈크로오스 표준 물질 역시, 0.5%(w/v) 단위로 슈크로오스 농도를 증가시키면서 제공하였다. 패널리스트들에게 테스트 용액과 슈크로오스 표준 물질의 감미성을 비교하여 감미성을 평가하게 하였다. 이 과정은 테스트 용액을 3회 음미하고, 물을 1회 음미하고, 슈크로오스 표준 물질을 3회 음미하고, 물을 1회 음미하는 등의 순으로 수행하였다. 패널리스트에게, 예를 들어 6.8, 8.5와 같이 소수점 첫째자리까지 감미성을 평가하라고 요청하였다. 테스트 용액을 평가하는 사이에 5분의 휴지기를 두었다. 또한 임의의 잠재적 이월 효과를 감소시키기 위해 패널리스트에게 입안을 잘 헹구고 크래커를 먹도록 요청하였다. 슈크로오스 당량치(Sucrose equivalence value; SEV) 및 표준 편차는 하기 표 6에 요약하였다.

배합물은 모두 신속한 감미성 개시 및 최대 강도로의 신속한 감미성 고조를 나타내는 것으로 판단되었다. 감미성의 소실 역시 신속하였다. 모나틴/글루코스 배합물을 제외하고, 대부분의 혼합물은 슈크로오스보다 과일맛이 덜한 것으로 판단되었다. 뒷맛에 약간의 잔류 감미성이 감지되었으며, 아주 약간 쓴맛/금속성 맛이 감지되었다. 감초맛이나 청량감의 뒷맛은 감지되지 않았다.

모나틴 용량 반응 데이터
모나틴 농도(ppm)	SEV(%; w/v)	표준 편차
15	3.6	±0.7
30	4.9	±0.5
45	7.1	±0.6
60	8.5	±0.5
75	9.8	±0.5
90	10.5	±0.6

실시예 15: 모나틴과 탄수화물 감미제의 배합

10.0%(w/v) 슈크로오스와 감미성이 동등한, 슈크로오스, HFCS(55% 프룩토오스) 및 글루코스 시럽(63 덱스트로오스 당량, DE)과 모나틴의 배합물(실시예 14에 기재된 바와 같음)을 제조하였다. 각 탄수화물 감미제에 대하여, 모나틴이 전체 감미성의 25%, 50% 및 75%를 전달하도록 모나틴 대 감미제의 비를 조정하였다. 실시예 14에 기재된 감미성 평가 방법을 이용하여 10.0%(w/v) 슈크로오스에 대한 감미성 당량을 측정하였다. 실시예 14에서와 같이, 모든 평가는 pH 3.2의 모델 소프트 드링크 시스템에서, 6∼8인의 패널리스트가 각각 2회씩 음미하여 수행하였다. 결과는 하기 표 7∼9에 제시하였다. 마찬가지로 모나틴을, 감미성 개시에 약간 지연이 있는 슈크라로오스와 비교하였다.

모나틴 및 슈크로오스의 등가 감미 배합물
모나틴의 감미성 기여도(%)	슈크로오스 농도 (%; w/v)	모나틴 농도(ppm)	모나틴의 유효 상대 감미성 강도 (x 슈크로오스)
25	7.5	12.3	2000
50	5.0	30.8	1600
75	2.5	50.3	1500

모나틴과 HFCS의 등가 감미 배합물
모나틴의 감미성 기여도(%)	HFCS 농도(%; w/v 고형분)	모나틴 농도(ppm)
25	7.8	12.3
50	4.7	30.8
75	2.7	50.3

모나틴과 글루코스 시럽의 등가 감미 배합물
모나틴의 감미성 기여도(%)	글루코스 시럽 농도 (%; w/v 고형분)	모나틴 농도(ppm)
25	16.4	12.3
50	10.4	30.8
75	5.4	50.3

그 후 소그룹의 숙련된 평가자 패널이 슈크로오스에 비교하여 등가 감미(equisweet) 모나틴/탄수화물(50:50) 배합물의 품질을 평가하였다. 이 평가는 "이중 맹검법"으로 수행하였다. 슈크로오스 감미 시스템은 대조군으로서 사용하고 다른 모든 제품은 무작위적으로 코드화하였다. 패널리스트에게 하기의 특징에 따라 대조군과 비교하여 무작위로 코드화된 샘플을 평가하게 하였다: 감미성 프로파일: 개시, 고조 및 소실; 향미 프로파일: 산미, 쓴맛 및 기타 특성; 입안 느낌; 및 뒷맛. 또한 패널리스트에게 감미제 시스템의 품질에 대하여 점수(1점; 불량 ∼ 5점; 우수)를 매기라고 요청하였다. 작성된 코멘트 및 부여된 점수를 하기 표 10에 요약하였다.

모나틴/탄수화물 배합물의 미각 프로파일
감미제 시스템	감미성 프로파일	향미 프로파일	입안 느낌	뒷맛	평균 점수
슈크로오스	신속한 개시 및 최고 강도로의 신속한 고조. 신속하고 깨끗한 소실.	좋은맛, 시트러스 산미. 쓴맛 없음.	충만하고 시럽같고 따뜻함.	약간의 잔류 감미성이 있으나, 느끼하지 않음. 날아가는 향은 없음.	4.0
슈크로오스/ 모나틴	신속한 개시 및 고조. 전반적인 프로파일이 매우 균일함. 신속하고 깨끗한 소실.	슈크로오스보다 과일맛과 시트러스맛이 적음. 약간 쓴맛 감지.	시럽같지만 슈크로오스보다 약간 묽음.	약간의 잔류 감미성이 감지됨. 약간의 쓴맛과 신맛.	3.4
HFCS/ 모나틴	신속한 개시 최고 강도로의 신속한 고조. 매우 신속한 소실, 약간의 잔류 감미성. 아주 약간 느끼함.	슈크로오스보다 과일맛과 시트러스맛이 적음. 약간의 솜사탕맛이 감지됨. 약간의 쓴맛.	슈크로오스보다 묽은 입안 느낌. 감미성이 사라지자 입안이 산뜻함.	약간의 잔류 감미성이 감지됨. 약간의 쓴맛과 금속성 맛이 감지됨. 매우 건조하고 뒷맛이 없음.	2.9
글루코스 시럽/ 모나틴	신속한 개시 및 최고 강도로의 신속한 고조, 슈크로오스보다 약간 느림. 신속하고 깨끗한 소실.	슈크로오스와 매우 유사함.	충만감이 있고 설탕맛이고 따뜻함. 슈크로오스와 유사함.	약간의 감미성이 감지됨.	3.2

실시예 16: 소프트 드링크 시스템에서의 모나틴의 시간 강도 프로파일

80 ppm 모나틴(실시예 14에 기재된 모나틴의 라세미 혼합물), 10.0%(w/v) 슈크로오스 및 200 ppm 슈크라로오스의 용액을 실시예 14에 기재된 pH 3.2 모델 소프트 드링크 시스템에서 제조하였다. 그 후 이들 용액의 시간 강도 프로파일을 하기 절차를 이용하여 평가하였다. 6명의 패널리스트를 이 실험에 포함시켰다. 이들 패널리스트는 일반적 감각 예민성을 기준으로 스크리닝하고 감미성 강도 및 감미성 품질 차이에 대한 감수성을 기준으로 선별하였다. 모두 감미제 평가 방법에 경험이 있으며 시간 강도 평가에서 전문적인 훈련을 받은 바 있는 사람들이었다. 트레이닝 기간은, 먼저 패널이 평가 방법을 익히게 하고 전산화된 데이터 입력 시스템을 사용하여 시간 경과에 따라 샘플을 채점하여 수행하였다.

각 용액의 샘플(13 mL)을 코드화하고 무작위 순서로 패널리스트에게 개별적으로 제공하였다. 각 패널리스트에 대하여 삼킨 직후 컴퓨터가 시한 강도 기록을 매초 0∼100의 스케일로 60초까지 기록하였다. 각 용액은 이중으로 평가하였다. 시간 강도 평가 결과는 하기 표 11에 요약하였다.

시간 강도 실험 결과
	슈크로오스	모나틴	슈크라로오스
최대 감미성의 강도(단위)	64.1	66.6	64.6
최대 감미성까지의 시간(초)	8.0	9.0	8.0
최대 감미성의 1/2까지의 시간(초)	2.3	2.4	2.6
최대 감미성의 1/2까지 감미성이 감쇠하는 시간(초)	24.9	34.2	33.1
개시 속도(단위/초)	17.9	14.9	16.0
감쇠 속도(단위/초)	2.3	2.2	2.1
곡선 아래의 면적(단위 x 초)	116.9	117.3	119.7

상기 결과들은 모나틴의 일시적 맛 특징이 슈크로오스와 유사함을 나타내며, 이는 모나틴이 고품질의 감미성을 갖는다는 것을 암시한다. 또한, 모나틴은 통용되는 고강도 감미제인 슈크라로오스와 감미성이 유사하게 좋았다.

실시예 17: 모나틴을 함유하는 콜라 및 레몬/라임 음료의 제조

하기 제형을 이용하여 콜라 및 레몬/라임 음료를 제조하고, 슈크로오스, HFCS(55% 프룩토오스), 아스파탐, 슈크라로오스, 모나틴(실시예 14에 기재된 라세미 혼합물), 모나틴/슈크로오스, 또는 모나틴/HFCS로 감미를 하였다. 시럽 1 부를 탄산수 5.5 부에 첨가하여 평가하였다.

레몬/라임 시럽 제형:

성분 % wt / vol

시트르산 2.400

시트르산나트륨 0.500

벤조산나트륨 0.106

향미료 0.450 (레몬/라임 향미료 730301-H ex. Givaudan Roure)

감미제 하기 참조

물 100.000 (적량)

콜라 시럽 제형:

성분 % wt / vol

인산 0.650 (75% 용액)

시트르산 0.066

시트르산나트륨 0.300

벤조산나트륨 0.106

콜라향 A 1.100 (A01161 ex. Givaudan Roure)

콜라향 B 1.100 (B01162 ex. Givaudan Roure)

감미제 하기 참조

물 100.00 (적량)

레몬/라임 또는 콜라 탄산염 중의 감미제 농도:

슈크로오스 10%

HFCS (55% 프룩토오스) 10% (고형분)

아스파탐 500 ppm

슈크라로오스 200 ppm

모나틴 67 ppm (레몬/라임 중); 80 ppm (콜라 중)

모나틴/슈크로오스 30.8 ppm/5.0%

모나틴/HFCS 30.8 ppm/5.0% (고형분)

평가는 훈련된 미각 평가자 패널에 의해 '이중 맹검법'으로 수행하였다. 슈크로오스 감미 제품은 대조군으로 이용하였고, 다른 모든 제품들은 무작위로 코드화하였다. 패널리스트에게 하기 특징에 대하여 무작위로 코드화된 샘플을 대조군과 비교하여 평가하게 하였다:

향미 프로파일: 산미

쓴맛

기타 특성

감미성 프로파일 개시

고조

강도

소실

입안 느낌

뒷맛

또한 패널리스트에게 감미제 시스템의 품질에 대하여 점수(1점; 불량 ∼ 5점; 우수)를 부여하게 하였다. 부여된 평균 점수와 함께 작성된 코멘트의 요약이, 레몬/라임 탄산염 및 콜라에 대하여 각각 하기 표 12 및 13에 제시되어 있다. 레몬/라임 향미에서, 모나틴은 아스파탐의 향미와 유사하였다. 모나틴/탄수화물의 배합물은 더 높은 점수를 얻었다. 콜라에서 모나틴은 아스파탐과 유사하였다.

레몬/라임 탄산염의 미각 프로파일
감미제 시스템	향미 프로파일	감미성 프로파일	입안 느낌	뒷맛	점수
슈크로오스	부드럽고, 균형잡힌 레몬/라임맛. 청량감이 약간 부족함. 레몬맛보다 라임맛이 더 많이 감지됨.	감미성 개시가 약간 지연되나 최고 강도로 신속하게 고조됨. 소실이 빠름.	따뜻함, 매우 충만감이 있고 시럽같음 - 특히 마지막에.	약간 쓴맛과 약간의 수렴성 있음. 약간 감미성이 있으나 느끼하거나 잔류감은 없음.	4.8
HFCS	과일맛이 많고 강한 맛. 대조군보다 산미가 약간 강함. 레몬맛보다 라임맛이 더 많이 감지됨.	깨끗한 프로파일. 신속한 개시, 최고 강도로의 빠른 고조, 빠른 소실.	대조군보다 묽음. 약간 물같음.	약간 쓴맛. 대조군만큼 깨끗하지는 않음.	3.6
아스파탐	처음에는 약간 부족하지만 나중에는 프로파일이 대조군과 매우 유사함.	감미성 개시가 매우 빠름. 전반적으로 피크가 매우 균일함. 약간의 잔류 감미성이 감지됨.	대조군보다 약간 묽고 더 차가움	매우 깨끗하나 약간 잔류 감미성이 있음. 약간 "아스피린" 같은 맛이 감지됨.	4.0
슈크라로오스	맛이 강하고 청량감이 있음. 약간의 유성이 감지됨.	개시가 지연되나 비교적 빨리 고조됨. 후두부에서 약간의 감미성이 감지됨	대조군과 유사한 입안 느낌	뒷맛에 약간 감초맛이 느껴짐. 약간 쓴맛도 감지됨.	4.1

레몬/라임 탄산염의 미각 프로파일
감미제 시스템	향미 프로파일	감미성 프로파일	입안 느낌	뒷맛	평균 점수
모나틴	대조군보다 더 부드러운 맛. 깊이가 깊지 않고 산미가 덜함	대조군보다 개시가 약간 지연됨 - 대조군보다 감미성이 강함, 피크로 고조되기보다는 균일한 감미성 프로파일. 대조군보다 약간 더 늦게 소실함.	대조군보다 입안 느낌이 약간 덜함. 그러나 충만감이크고 시럽같음.	매우 깨끗하고, 약간의 잔류 감미성이 감지됨. 약간 쓴맛과 금속성 맛 역시 감지됨.	4.0
모나틴/ 슈크로오스	대조군보다 약간 산뜻하지만 과일맛이 많음. 강한맛. 청량감이 큼.	깨끗하고 둥근 피크. 빠른 개시, 고조 및 소실.	충만감이 있고 시럽같음. 대조군보다 약간 차가움.	깨끗한 뒷맛. 약간의 향미와 산미가 뒷맛에 감지됨. 약간 감미성이 있으나, 압도적이거나 느끼하지는 않음.	5.0
모나틴/ HFCS	대조군보다 향미가 약간 적음. 산미가 약간 덜함.	개시가 약간 지연됨. 넓고 둥근 피크. 소실 속도 양호.	충만감이 크고 시럽같음. 대조군보다 약간 덜 따뜻함.	약간 감미성이 있으나 매우 깨끗함. 느끼함이 없음.	4.4

콜라의 미각 프로파일
감미제 시스템	향미 프로파일	감미성 프로파일	입안 느낌	뒷맛	평균 점수
슈크로오스	달콤하고, 맛이 깊고, 따뜻한 콜라맛. 약간 짜릿하고 시트러스맛 및 레몬맛. 마지막에 약간 산미가 있음.	감미성 개시가 아주 약간 지연됨. 둥근 피크로 빨리 고조됨. 소실이 빠름.	매우 따뜻하고 충만감이 있고 시럽같은 입안 느낌	매우 깨끗하고 균형잡힌 맛. 약간의 감미성. 약간 쓴맛이 있으나 약간의 향미가 있고 산미도 감지됨.	4.5
HFCS	달콤하고 약간 짜릿함. 대조군보다 맛의 깊이가 낮고 부드러움. 특히 처음에.	감미성 개시가 약간 지연됨. 균일한 감미성 프로파일. 소실이 매우 빠름.	매우 충만하나 대조군보다 차갑고 약간 묽음.	약간 감미성이 감지되나 느끼하지는 않음. 약간 쓴맛이 있고 산미가 있음.	3.3
아스파탐	달콤한 맛, 대조군보다 처음에 맛이 덜함. 탄맛/카라멜 및 강렬한 맛이 약하지만 레몬맛이 더 많이 감지됨.	감미성 개시가 지연됨. 대조군보다 약간 느리게 피크로 고조되고 감미성이 약간 잔류함. 그러나, 대체로 아주 둥근 피크.	대조군보다 묽은 입안 느낌이 있으나 여전히 매우 따뜻함.	잔류하는 감미성이 감지됨. 약간 느끼함. 대조군보다 쓴맛이 강함.	3.3
슈크라로오스	달콤한 맛, 처음에 대조군보다 약간 탄맛이 남. 그 후에 산미가 더 나고 마지막에 레몬맛이 남.	감미성 개시가 약간 지연됨. 대조군보다 약간 느리게 고조되나 프로파일전반에 고조되는 것으로 보임.	대조군보다 약간 묽지만 충만감이 크고 시럽같은 느낌.	뒷맛에 약간의 감미성이 감지됨. 약간 느끼함. 감미성에 의한 향미가 감지됨.	3.8

콜라의 미각 프로파일
감미제 시스템	향미 프로파일	감미성 프로파일	입안 느낌	뒷맛	평균 점수
모나틴	대조군보다 약간 맛이 적음. 산미가 강하고 시트러스맛이 남. 덜 따뜻하고 카라멜맛.	개시가 지연되나 매우 빨리 고조됨. 전체적으로 대조군보다 균일한 프로파일. 대조군보다 소실 속도가 느림, 약간의 감미성이 잔류함.	대조군보다 묽음. 처음에 약간 더 차갑고 물같은 느낌.	약간 잔류 감미성이 감지됨 - 느끼함. 약간 쓴맛도 감지됨.	2.9
모나틴/ 슈크로오스	대조군보다 콜라맛이 적음. 맛이 약하고 강렬한 맛이 적음. 시트러스맛/레몬맛이 더 많음. 특히 뒤로 갈수록.	개시 속도가 약간 지연됨. 매우 빨리 고조됨. 비교적 빨리 소실하고, 잔류 감미성이 없음. 피크로 고조되기보다 균일한 프로파일.	대조군보다 약간 더 차가움. 충만감이 크고 시럽같음.	대조군보다 약간 쓴맛이 있음. 약간 감미성이 있으나 향미는 적음.	3.0
모나틴/ HFCS	충만감, 따뜻하고 강한맛. 뒤로 갈수록 약간 무맛, 대조군보다 시트러스맛/레몬맛이 강함.	개시가 빠르고 최대 감미성으로 매우 빨리 고조됨. 소실이 약간 느림. 약간의 느끼한 감미성이 감지됨.	대조군보다 약간 묽음.	약간 감미성이 감지됨. 약간 느끼함. 약간의 향미, 쓴맛과 산미도 감지됨.	3.3

고찰

본 실시예에 사용된 모나틴은, 천연 고강도 감미제에서 종종 관찰되는 쓴맛, 청량감 및 감초맛이 실질적으로 없는, 깨끗하고 달콤한 미각 프로파일을 유발하였다. 본 실시예에 사용된 모나틴 입체이성체의 배합물은 10.0%(w/v) SEV의 슈크로오스보다 1250배 더 감미성이 강한 상대적 감미성 강도를 갖는 평활하고 규칙적인 용량 반응 곡선을 생성하였다.

시간 강도 실험의 결과는 모나틴이 슈크로오스 및 슈크라로오스의 시간/감미성 강도 프로파일과 대체적으로 유사한 시간/감미성 강도 프로파일을 나타내는 것을 보여주었다. 슈크로오스와 비교하여, 모나틴은 최대 강도에 도달하는 데 약간 더 많은 시간이 걸렸고, 소실 속도가 더 느렸으며, 평가 후반부(60 초)에 감지되는 감미성이 더 강했다. 그러나, 관찰된 차이는 통계적으로 유의적인 것은 아니었다.

탄수화물 감미제와 배합하였을 때, 모나틴은 슈크로오스의 1500∼2000배의 감미성 강도를 나타내었다. 생성된 배합물은 매우 우수한 품질의 감미성 및 향미 프로파일을 생성하였다. 감미성 개시는 거의 소실되지 않았고 단지 약간의 잔류 감미성만이 감지되었다. 모나틴 및 탄수화물 감미제의 배합물은, 예를 들어 중칼로리 음료를 제조하는 데 사용될 수 있다.

평가된 모나틴은 단독 감미제로서도 탄수화물 감미제와 배합하여 사용하기에도 적합하였다. 레몬/라임 탄산염에서 모나틴으로만 감미를 한 제품은 아스파탐 및 슈크라로오스 감미 드링크 둘 다와 매우 유사한 미각 프로파일을 나타내었다. 모나틴/슈크로오스 드링크가 특히 우수하였고, 실제로 슈크로오스 대조군 제품보다 더 적합한 것으로 판단되었다. 모나틴은 다른 탄수화물 감미제와의 배합물에서 레몬/라임 향미를 강화시킬 것으로 예상된다. 콜라 시스템에서, HFCS와 모나틴을 배합하면 HFCS 대조군만큼 적합한 드링크가 제조되었다.

실시예 18: 수중 모나틴의 감각 안정성

수중(8% SEV) 모나틴(실시예 14에 기재된 라세미 혼합물)의 감각 안정성은 0∼6 시간 동안 실온에서 보관한 후에 조사하였다. SEV는 모나틴 용액을 제조한 지 0∼1 시간 또는 5∼6 시간 후에 (실시예 14에 기재된 바와 같이) 모니터하였다. 실온에서 6 시간 후, 모나틴 SEV의 손실은 검출할 수 없었다. 이러한 데이터는 LC/MS를 이용한 분석 조사에 의해 확증되었다(예를 들어, 락톤화가 관찰되지 않았다).

실시예 19: 맥아 음료 프리믹스의 제조

하기 표 14에 기재된 성분들을 사용하여 맥아 음료 프리믹스를 제조한다.

성분	%(중량)
맥아즙	31∼35
탈지유 분말	10∼12
코코아	5∼10
모나틴	0.001∼0.46
지방	8∼9
미네랄 및 비타민	0.5∼1
희석제	적량

실시예 20: 초컬릿맛 음료 프리믹스의 제조

하기 표 15에 기재된 성분들을 사용하여 초컬릿맛 음료 프리믹스를 제조한다. 비-유제품 크리머는 식물유, 농후제, 레시틴, 단백질, 비타민, 미네랄, 유화제(예, 레시틴, DATEM 및 모노- 및 디-글리세라이드) 및 증량제(예, 옥수수 시럽 고형분, 저칼로리 증량제)를 포함할 수 있다.

성분	%(중량)
코코아 분말	3∼13
카라멜 분말	3∼5
맥아즙	10∼20
모나틴	0.015∼1
향미 강화제/염	0.25∼1
비-유제품 크리머	10∼32
희석제	적량

실시예 21: 오렌지맛 음료 프리믹스의 제조

하기 표 16에 기재된 성분들을 이용하여 오렌지맛 프리믹스를 제조한다.

성분	%(중량)
유장 단백질 농축물	60∼70
프룩토오스	20∼25
건조 감미 유장	8∼10
무수 시트르산	3∼7
오렌지 향미료	0.5∼1
비타민/미네랄 프리믹스	0.10∼0.15
모나틴	S,S 0.06∼0.35, R,R 0.006∼0.01 또는 혼합물
인공 색소	0.006∼0.010

8 oz. 물 중에 건조 믹스 약 1 oz.를 혼합한 후에, 완전히 수화될 때까지 교반 또는 진탕시켜 오렌지 음료를 제조할 수 있다. 따라서, 바로 음용할 수 있는 최종 음료는 약 66∼약 440 ppm의 S,S 모나틴, 약 6∼약 13 ppm의 R,R, 또는 이들의 혼합물을 함유한다.

실시예 22: 모나틴 감미제를 사용한 레모네이드의 제조

모나틴을 포함하는 감미제의 편리한 1회용 패킷을 제조할 수 있는데, 이때 감미제는 2 티스푼(∼8 그램)의 과립 설탕의 것과 유사한 감미성을 제공하도록 배합된다. S,S는 슈크로오스보다 감미성이 50∼200배 더 강하기 때문에, S,S 모나틴 40∼160 mg은 8 g의 과립 설탕과 유사한 감미성을 제공한다. 따라서, 예를 들어 +/- 25% 감미성 최적화를 고려하면, 1회용 패킷 1 g 모나틴 제형은 S,S 모나틴 약 40∼200 mg을 포함할 수 있다.

마찬가지로, R,R은 슈크로오스보다 감미성이 2000∼2400배 더 강하기 때문에, R,R 모나틴 3.3∼4.0 mg은 설탕 8 g의 감미성과 유사한 감미성을 제공한다. 따라서, 또 다른 구체예에서, +/-25% 감미성 최적화를 고려하면, 1회용 패킷 1 g 모나틴 제형는 약 3.3∼5.0 mg의 R,R 모나틴을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 패킷 제형은 과립 설탕 2 티스푼의 감미성과 유사한 감미성을 제공하기 위해, S,S 모나틴 40∼200 mg, R,R 모나틴 3.3∼5.0 mg 또는 이들의 조합을 총 중량(g)에 대하여 동량 또는 더 적은 양 포함할 수 있다.

레모네이드를 제조하기 위해, 세로로 긴 유리컵에서 2 테이블스푼의 레몬즙 및 3 패킷(3 g)의 모나틴 패킷 제형을, 3/4 컵의 물과 용해될 때까지 혼합하였다. 얼음을 첨가한다. 모나틴으로 감미성을 감미한 레모네이드의 감미성은, 6 티스푼(24 g)의 슈크로오스로 감미한 레모네이드와 거의 동등하거나 이보다 더 우수하며, 칼로리가 현저히 더 적다(약 0 칼로리 대 96 칼로리).

실시예 23: 커피 및 아이스티 중에서의 R,R 모나틴 함유 감미제의 평가

커피 또는 아이스티 중에서 R,R 모나틴 또는 R,R 모나틴/에리트리톨 조합물을 포함하는 모나틴 감미제 제형을 다른 공지된 감미제(아스파탐 및 슈크라로오스)와 비교하여 평가하였다. 평가된 주요 감각 파라미터는 감미성 품질, 뒷맛, 쓴맛 및 그 뒷맛을 포함하였다. 정성적 평가를 수행하였다.

생성물 배합

(i) 커피

감미제 성능을 평가하기 위해 표준 커피를 사용하였다(표 17).

커피 배합
성분	공급처	농도 (%; w/w)	g/700 ml
클래식 로스트 커피	폴저(Folger)®	5.41	37.87
물		94.59	662.13

하기 농도에서 감미제를 커피에 첨가하였다:

아스파탐 0.025 % (w/v)

수크라로오스 0.0082 % (w/v)

R,R 모나틴* 0.0020, 0.0025, 0.0030 % (w/v)와 1 g의 말 토덱스트린

R,R 모나틴/에리트리톨 0.0020, 0.0025, 0.0030 % (w/v)와 1 g의 에 리트리톨

( ii ) 아이스티

아이스티 제형을 개발하여 감미제 성능을 평가하였다 (표 18).

아이스티 제형
성분	공급처	농도 (w/v)
시트르산		0.200
시트르산나트륨		0.020
티 추출물'아쌈 (Assam)' 285002	플렌텍스크락트 (Plantextrakt)	0.150
천연 홍차향 추출물 31108304010000	루돌프 와일드 (Rudolph Wild)	0.050
나트륨 벤조에이트 (20 % w/w)		0.075
감미제		필요에 따라
물		부피에 맞추어

하기 농도에서 감미제를 티에 첨가하였다:

아스파탐 0.0450 % (w/v)

수크라로오스 0.0170 % (w/v)

R,R 모나틴 0.0030, 0.0035, 0.0040 %(w/v)와 1 g의 말 토덱스트린

R,R, 모나틴/에리트리톨 0.0030, 0.0035, 0.0040 % (w/v)와 1 g의 에리트리톨

감각 평가

커피 제품을 먼저 음미하고 티 제품을 나중에 음미하여 평가한 숙련된 감각 평가단으로 된 소 (n = 6) 패널에 의해 이들 커피 및 티 음료의 평가를 수행하였다. 이들 평가의 결과를 하기 표 19에 요약한다.

커피 및 티의 감각 평가 (200 ml 서빙 크기)
제품	감미제/농도	해설
커피	아스파탐/250 ppm	균형잡힌 감미성 프로파일. 매우 낮은 수준의 쓴맛, 아마도 APM에 의한 억제로 기인한 것. 맛없는, 심지어 커피 향미 전달. 혀 뒤쪽에서 지각되는 전형적인 APM 뒷맛
	수크라로오스/82 ppm	감미성 감각이 보다 강한 커피 특색을 인식하게 함. 균형잡혀 있지만 다소 수크라로오스의 질질끄는 감미 특징으로 인해 쓴 커피 특색이 뒷맛에서 확연하게 뚜렷하게 나타남.
	모나틴 (25 ppm) + 말토덱스트린 (1 g) (0.5 %)	균형잡힌 감미성 프로파일. 뒷맛에서 깨끗한 커피 향미. 모나틴의 역량을 억제하는 제한된 쓴맛으로 인한 것일 수 있지만 (적어도 부분적으로), 다른 감미제를 사용한 경우보다 전체적으로 커피 향미가 강함.
	모나틴 (25 ppm) + 에리트리톨 (1 g) (0.5 %)	모나틴 샘플에서 더 많은 커피 향미가 있음. 감미성은 모나틴/말토덱스트린을 사용한 경우보다 모나틴/에리트리톨 조합물을 사용한 경우 덜 지연됨. 에리트리톨은 커피 향미를 부드럽게 내고 감미성 지각을 약간 빠르게 함.
아이스티	아스파탐/450 ppm	전형적인 아스파탐 향미가 명확하게 나타나지만 우수한 시간 특징을 가짐. 다소 미묘한 티 향미가 있지만 균형잡힘. 향미 강화의 증거 없음.
	수크라로오스/170 ppm	감미성 지각의 지연은 첫 인상이 산성임을 의미한다. 감미성 프로파일이 산성 또는 향미 프로파일과 매칭되지 않기 때문에 생성물 향미 및 전체적인 인상은 다소 균형을 벗어남.
	모나틴 (40 ppm) + 말토덱스트린 (1 g) (0.5 %)	감미성 및 향미 프로파일이 매우 균형잡힘. 레몬 향미 특질이 다른 감미제에 비해 분명히 강화됨.
	모나틴 (40 ppm) + 에리트리톨 (1 g) (0.5 %)	감미성 및 향미 프로파일이 균형잡힘. 레몬 향미 특질은 모나틴/말토덱스트린 단독의 경우보다 훨씬 더 강화됨. 뒷맛의 수렴성이 크게 감소/제거됨.

논의

모나틴은 감미제 제형 중 깨끗한 감각상의 이득을 비롯하여 예상 외의 성능 이득을 전달하였다. 모나틴을 커피에 첨가할 경우, 커피 향미 수준의 분명한 증가가 지각되었다. 이러한 이득은 균형을 맞추고 향미를 제공하고 감미성 지각 시간을 단축시키는 저 농도의 에리트리톨의 첨가를 통해 더 강화되었다. 아이스티, 특히 산성화된 산성 티에서, 모나틴은 레몬 향미 특질을 강화하였다. 또한, 에리트리톨을 모나틴과 블렌딩하면 추가적인 향미 이득이 부여되었다.

모나틴은 티 및 커피와 같이 보편적으로 소비되는 음료의 감각 성질을 개선시켰다(예, 적은 뒷맛, 적은 오프-테이스트(off-taste), 향미 차폐효과가 없음). 모나틴 감미 커피의 칼로리는 거의 0 칼로리에 가까운데 반해, 2 티스푼(~ 8 g)의 슈크로오스를 사용하여 감미를 낸 커피의 칼로리는 32 칼로리이다.

아스파탐 또는 수크랄로스에 비해, 음료 조성물 중의 모나틴은 모든 시트러스 향미를 강화시킬 뿐 아니라 더 바람직한 감미성 시간/강도 프로파일을 제공할 것이라 예상된다. 또한, 아스파탐 또는 수크랄로스에 비해, 음료 조성물 중의 모나틴과 에리트리톨의 블렌드는 시트러스 향미를 더 강화하고, 더 바람직한 감미성 프로파일을 제공할 것이라 예상된다. 모나틴과 에리트리톨의 블렌드는 소프트 드링크, 탄산음료, 시럽, 건조 음료 믹스 및 저온에서 유지되는 슬러시 음료와 같은 임의의 음료 조성물 중에서 상기한 이점을 나타낼 것이라 예상된다.

실시예 24 : 음료 중 R,R 모나틴의 평가

음료(콜라, 레몬-라임 및 오렌지)를 아스파탐, 수크랄로스 또는 R,R 모나틴으로 제형화하고 감미를 내었다. 정성 분석을 수행하였다.

제품 제형

개발되고 평가된 소프트 드링크 제형은 표 20에 나타나 있다. 용어 "쓰로우(throw)"는 수 중 희석도를 뜻한다. 예를 들어, "1+4" 쓰로우는 물 4부에 대한 농축액 제형 1부를 의미한다. 따라서, 예를 들어, 농축액 제형이 R,R 모나틴 0.021 중량/부피%(즉, 210 ppm)를 포함할 경우, 1+4 쓰로우로 R,R 모나틴 42 ppm(210 ppm/5)을 함유하는 희석된 음료를 만들 수 있다.

소프트 드링크 제형(농축액)
향미	성분	농도(% ; w/v)
레몬/라임	L/L 향미 : 76291-76	0.55
	시트르산	0.80
	구연산나트륨	0.10
	벤조산나트륨(20% 용액)	0.38
	감미제	(i) 아스파탐 0.250 (ii) 수크랄로스 0.100 (iii) R,R 모나틴 0.021
	물	부피에 따름(to volume)
	쓰로우	1+4
오렌지에이드	오렌지 주스 농축액(6×)	5.420
	시트르산	2.600
	구연산나트륨	0.520
	오렌지 향미 2SX-73268	0.650
	β-카로텐 0F0996	0.100
	벤조산나트륨(20% 용액)	0.488
	감미제	(i) 아스파탐 0.3575 (ii) 수크랄로스 0.1430 (iii) R,R 모나틴 0.0293
	물	부피에 따름(to volume)
	쓰로우	1+5.5
콜라	콜라 향미 C40385	0.7150
	콜라 향미 C40386	0.7150
	벤조산나트륨(20% 용액)	0.3750
	감미제	(i) 아스파탐 0.275 (ii) 수크랄로스 0.110 (iii) R,R 모나틴 0.0225
	물	부피에 따름(to volume)
	쓰로우	1+4

(쓰로우 후) 바로 마실 수 있는 최종 음료가 함유하는 감미제 농도는 다음과 같다:

레몬/라임 아스파탐 500 ppm

수크랄로스 200 ppm

R,R 모나틴 42 ppm

오렌지에이드 아스파탐 550 ppm

수크랄로스 220 ppm

R,R 모나틴 45 ppm

콜라 아스파탐 550 ppm

수크랄로스 220 ppm

R,R 모나틴 45 ppm

음료의 감각 평가

상기한 소프트 드링크의 평가는 별도 시험에서 각각 일련의 드링크를 평가하는 평가자 패널(n = 6)에 의해 수행되었다. 평가 결과는 표 21에 요약되어 있다.

소프트 드링크의 감각 평가
제품	감미제 /농도	코멘트
레몬/라임	아스파탐/500 ppm	균형잡힌 감미성/산도 프로파일. 매우 낮은 수준의 쓴맛. 좋은 과일 향미. 혀 뒤쪽에서 지각되는 전형적인 APM 뒷맛.
	수크랄로스/200 ppm	느린 감미성 발현으로 인해 혀 앞쪽에서 지각되는 레몬/라임 맛이 더 강함. 향미를 통해 차단되고 좋은 과일 향미를 남기지 않는 강하게 남는 감미성과 싫증나는 뒷맛.
	모나틴/42 ppm	균형잡힌 감미성/산도 프로파일, 그러나 혀 앞쪽에서 인지되는 레몬/라임 향미의 수준이 낮음.
오렌지에이드	아스파탐/550 ppm	통상적인 아스파탐 향미가 매우 명백하지만 우수한 일시적인 특징을 보임. 향미 개선의 증거는 없음.
	수크랄로스/220 ppm	감미성 개시의 지연은 첫 느낌이 신맛임을 뜻함. 제품 향미와 전체적인 느낌은 다소 균형적이지 않은데, 이는 산도 또는 향미 프로파일이 감미성 프로파일과 일치하지 않기 때문임.
	모나틴/45 ppm	전형적인 아스파탐의 뒷맛이 명백하지만 우수한 일시적인 특징을 보임. 강한 향미 개선의 증거는 없음. 전체적으로 아스파탐과 질적으로 매우 유사하게 평가됨.
콜라	아스파탐/550 ppm	전형적인 아스파탐 향미가 매우 명백하지만 우수한 일시적인 특징을 보임. 우수한 감미/산 균형.
	수크랄로스/220 ppm	감미성 개시의 지연은 첫 느낌이 신맛임을 뜻함. 제품 향미와 전체적인 느낌은 다소 균형적이지 않은데, 이는 산도 또는 향미 프로파일이 감미성 프로파일과 일치하지 않기 때문임.
	모나틴/45 ppm	전체적으로, 아스파탐과 질적으로 매우 유사하게 평가됨. 모나틴의 개시는 다소 지연되는 것으로 보이는데, 이는 제품의 균형성을 다소 떨어지게 함. 강한 향미 개선의 증거는 없음.

논의

레몬/라임, 오렌지에이드 및 콜라 음료에서, 모나틴은 아스파탐과 질적으로 유사한 감미 특성을 보이고, 수크랄로스보다는 다소 우수한 감미 특성을 보이며, 상기 아스파탐과 수크랄로스는 둘 다 고품질의 감미제이다. 레몬/라임 음료에서는, 아스파탐 제형에서보다 모나틴 제형에서 뒷맛이 더 적었다. 또한, R,R 모나틴의 효능이 아스파탐 및 수크랄로스의 효능보다 더 우수하다.

실시예 25: 모나틴 및 사카린의 감미성 용량 반응 곡선

20 명의 단련된 감각 평가단을 사용하여 모나틴 및 사카린의 감미성을 2 회 판단하게 하여 평가하였다. 시험 및 기준 용액을 시트르산/시트레이트 완충제 중에서 pH 3.2에서제조하였다. 도 16을 참조할 수 있다. 사카린에 비해 R,R/S,S 모나틴의 더욱 선형인 반응은 더욱 당-유사한 미감 특징의 전달과 일치한다. 10 % SEV를 초과하는 정체기는 "혼합물 억제" 오프-테이스트 및 뒷맛의 양이 존재하지 않거나/낮다는 것을 시사한다. 모나틴의 용량 반응 곡선의 형상은 모두 "품질 좋은" 감미제인 아스파탐, 수크라로오스 및 알리탐의 경우와 유사하다.

모델 시스템(pH 3.2) 중에서 단독의 감미제로서 R,R/S,S 모나틴을 사용하는 경우, 하기 특징이 관측되었다: (1) 감미성 지각에서 약간의 지연; (2) 감미성 쇠퇴가 매우 빠름; (3) 약간의 "아스파탐-유사" 뒷맛, 약간의 단 뒷맛, 뒷맛에서 쓴맛은 없음; 및 (4) 향미되지 않은 시스템에서 잔류하는 시원한 감각.

실시예 26: pH 3에서 온도의 증가에 따른 모나틴의 안정성

25 ℃, 50 ℃ 및 100 ℃의 온도에서 합성 모나틴의 샘플을 pH 3 하에 두었다. 실온 및 pH 3에서, 48 시간 동안 모나틴의 14 % 손실이 관측되었다. 이 손실은 락톤 형성에 기여하였다. 50 ℃ 및 pH 3에서, 48 시간 동안 모나틴의 23 % 손실이 관측되었다. 이 손실은 락톤 형성 및 약 15.5 분 후 미지의 화합물의 형성에 기여하였다. 100 ℃ 및 pH 3에서, 24 시간 후 거의 모든 모나틴이 손실되었다. 주요한 검출가능한 성분은 15.5 분에서 미지의 물질이었다.

실시예 27: 40 ℃에서 pH 2.5, 3.0, 4.0에서 모나틴 및 아스파탐의 감각 안정성

pH 2.5, 3.0 및 4.0에서 제조되고 40 ℃에서 저장된 모나틴 용액의 감각 안정성을 100 일 동안 모니터링하였다. 이들 용액으로부터의 감미성의 손실을 동일한 조건 하에서 제조되고 저장된 아스파탐 용액으로부터의 감미성의 손실과 비교하였다.

40 ℃에서 저장한 후, pH 2.5, 3.0, 및 4.0을 갖는 포스페이트/시트레이트 완충제 중에서 모나틴의 감각 안정성 (8 % SEV, ~ 55 ppm, 대략 96 %의 2R,4R/2S,4S 거울상이성질 쌍 및 4 %의 2R,4S/2S,4R 거울상이성질 쌍을 함유하는 합성 블렌드)을 조사하였다. 모나틴의 안정성을 동일한 완충제 중에서 아스파탐 (400 ppm)의 경우와 비교하였다. 동일한 포스페이트/시트레이트 완충제 중에서 모나틴 및 아스파탐 용액으로서 3 개의 슈크로오스 기준 용액을 제조하였다. 모든 제조된 용액을 어둠 속에서 저장하였다.

완충제 조성물: pH 2.5 인산 (75 % 용액) 0.127 % (w/v)

트리-소듐 시트레이트 모노히드레이트 0.005 % (w/v)

pH 3.0 인산 (75 % 용액) 0.092 % (w/v)

트리-소듐 시트레이트 모노히드레이트 0.031 % (w/v)

pH 4.0 인산 (75 % 용액) 0.071 % (w/v)

트리-소듐 시트레이트 모노히드레이트 0.047 % (w/v)

감미성 평가 절차에 숙련된 단련된 소 패널 (n = 8)의 감각 평가단에 의해 슈크로오스를 기준으로 각각의 감미제의 감미성을 2 회 평가하였다. 22 ±1 ℃의 온도에서 모든 샘플 (동일한 완충제 중)을 제공하였다. 3 개의 숫자의 랜덤한 번호 코드로 코드화된 모나틴 (시험) 용액을 랜덤한 순서로 패널리스트들에게 개별적으로 제공하였다. 또한, 0.5 % (w/v) 슈크로오스의 단계로 증가하는 4.0-10.0 % (w/v) 슈크로오스 범위의 슈크로오스 참고 표준을 제공하였다. 패널리스트들에게, 슈크로오스 표준에 시험 용액의 감미성을 비교함으로써 감미성을 평가해 달라고 요청하였다. 이는 3 모금의 시험 용액을 마신 후, 한 모금의 물을 마시고, 그 후 3 모금의 슈크로오스 표준을 마신 후, 한 모금의 물을 마시는 것 등으로 수행하였다. 패널리스트들에게 1 소수자리, 예를 들면, 6.8, 8.5로 감미성을 평가해달라고 하였다. 시험 용액 평가 사이에 5 분 휴식 시간을 주었다. 또한, 패널리스트에게 잘 세정하고 임의의 가능한 잔류 효과를 감소시키기 위해 크래커를 먹으라고 요청하였다.

하기 표 22 및 표 23은 포스페이트 시트레이트 완충제에서의 안정성 연구의 결과를 제공한다. 각각의 pH에서 및 40 ℃ 어둠 속에서 100 일간 저장한 후, 모나틴 감미성의 % 보유는 아스파탐의 경우보다 컸다. pH 4.0에서, 제 17 일과 제 100 일 사이에 측정된 감미성 강도에서 매우 근소한 변화가 있었기 때문에 모나틴 용액의 감미성의 손실은 거의 안정화된 것으로 보였으나, 아스파탐 용액은 계속 감미성을 상실하였다.

: A

:B

:C

* A,B,C ; 모나틴의 감각 안정성: 40 ℃에서 100 일 저장 후 감미성

pH	감미제	보유된 감미성 (%)
2.5	아스파탐	11
2.5	모나틴	29
3.0	아스파탐	31
3.0	모나틴	58
4.0	아스파탐	58
4.0	모나틴	78

; 안정성: 상기 pH에서 40 ℃에서 100 일 저장 후 잔류하는 감미성의 양

각각의 완충제들은 하기 표 24에서 알 수 있는 바와 같이 pH를 유지하는 데 효과적이었다.

감미제	공칭 pH	실제 pH (50일 후)
모나틴	2.5	2.39
	3.0	3.13
	4.0	4.28
아스파탐	2.5	2.49
	3.0	3.13
	4.0	4.19

의사 1차 분해 반응을 가정하는 경우, log_n % 보유 대 시간(log_n% RTN v. t)의 플롯은 임의의 주어진 설정 조건 하에서 감미성 손실의 반감기 (t½) 및 속도 상수 (k)의 평가를 가능케 한다. 이렇게 하면, 모나틴의 및 아스파탐 감미성 손실의 동역학(kinetics)을 다음과 같이 하기 표 25에 요약할 수 있다.

감미제	PH	반감기 (t½; 일)	속도 상수 (k; 일-1)
모나틴	2.5	65 일	0.011 일-1
	3.0	115 일	0.006 일-1
	4.0	230 일	0.003 일-1
아스파탐	2.5	55 일	0.013 일-1
	3.0	75 일	0.009 일-1
	4.0	140 일	0.005 일-1

각 pH 및 40℃에서 100일간 저장한 후, 모나틴 감미제의 보유율(%)은 아스파탐의 보유율(%)보다 더 크다. pH 4.0에서, 모나틴 용액 감미성의 소실은 17일∼100일 사이에 측정한 감미성 강도에 변화가 거의 없기 때문에 거의 안정화된 반면, 아스파탐 용액의 감미성은 계속 감소한다.

모나틴과 아스파탐의 반감기의 추정값은 모나틴 유래의 감미성이 아스파탐 유래의 감미성보다 더 느린 속도로 감소함을 나타낸다. pH 2.5, 3.0 및 4.0에서 모나팀 감미성에 대한 반감기 추정값은 각각 65일, 115일 및 230일이었다. 동일한 조건 하에서 아스파탐의 반감기는 55일, 75일 및 140일이었다.

따라서, 산성 조건 하에서, 40℃에서 저장한 모나틴은 아스파탐보다 더 안정적인 감미성을 전달한다. 모나틴은 더 낮은 pH 뿐 아니라 고온에서 콜라 및 기타 음료 중의 아스파탐보다 더 우수한 안정성을 보인다. 모나틴이 아스파탐보다 더 우수한 안정성을 보이고 pH 3에서 평형 상태에 이르러 비가역적으로 분해되지 않기 때문에, 콜라 음료와 같은 음료 중에서 모나틴은 저 pH에서 장기간 안정적인 감미성을 제공할 것이라 예상된다.

또한 자외선(UV)에 노출될 경우, (상온에서) pH 3.0에서 인산/시트르산 완충액 중의 모나틴이 아스파탐과 유사하게 안정적이거나 또는 약간 더 안정적이라는 것을 발견하였다(데이터는 나타내지 않음). UV 불안정성은 특정 향미 시스템에 의해 가속화시킬 수 있다. UV 흡수 패키징제, 착색제 및/또는 항산화제로 모나틴 함유 음료 중 자외선 유도성 향미 상호작용을 보호할 수 있다.

실시예 28: 모나틴의 입체 이성질체의 크로마토그래피

샘플 제조 - 대략 50-75 ㎍의 동결건조된 물질을 마이크로원심분리 튜브에 넣었다. 여기에 1.0 mL의 HPLC 등급 메탄올을 첨가하였다. 용액을 30 분 동안 볼텍싱(voltex)하고, 원심분리하고, 상청액의 엘리콧을 분석을 위해 제거하였다.

역상 HPLC - 두 개의 별개의 부분입체 이성질체 피크 (R,R/S,S 및 R,S/S,R)의 역상 HPLC-크로마토그래피를 2.1 x 250 mm 엑스테라 (Xterra)^TM MS C₈ 5 ㎛ (워터스 코퍼레이션 (Waters Corporation)) HPLC 칼럼을 사용하여 수행하였다. 마이크로메스사로부터의 울티마 (Ultima)^TM 삼중 사중극자 질량 분광계를 사용하여 검출을 수행하였다. 이동상은 하기 구배에 의해 전달되었다:

시간 (분) 0 9 16 20 21

0.05 % TFA A % 95 65 10 10 95

메탄올, 0.05 % TFA B % 5 35 90 90 5

흐름 mL/min 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25

키랄 HPLC- 250 x 4.6 mm 키로바이오틱 T (어드벤스드 세퍼레이션스 테크놀로지스, 인크. (Advanced Separations Technologies, Inc.)) HPLC 칼럼을 사용하여 두 개의 별개의 모나틴 입체 이성질체 (R,R 및 S,S)의 크로마토그래피를 수행하였다. 마이크로메스사로부터의 울티마^TM 삼중 사중극자 질량 분광계를 사용하여 검출을 수행하였다. 이동상은 0.2 % 아세트산 및 0.05 % 수산화암모늄과 메탄올로 이루어졌다.

질량 분석 측정 ( MS / MS ) - 모나틴의 존재를 선택된 반응 모니터링 (SRM) 실험에 의해 검출하였다. 모나틴의 양자화된 분자 이온([M+H]⁺)은 m/z = 293.3을 갖는다. 이 분자 이온의 단편화는 m/z = 257.3에서 상당한 이온을 생성하였으며, 이는 분자 이온의 다중 탈수로부터 비롯되었다. 이러한 전이는 모나틴에 매우 특이적인 적으로 밝혀졌으며, 이를 SRM 실험 동안 모니터링에 대한 전이 (293.3 내지 257.3)로서 선택하였다. 이 검출 방법을 모나틴의 역상 분리 및 키랄 분리 양쪽 모두에 사용하였다.

결과 - R,S/S,R 및 S,S/R,R의 표준 샘플을 역상 HPLC 하에서 평가하였다. 유도체화 및 효소 분해능에 의해 샘플을 제조하였다. 표준 용액에 대한 크로마토그램을 도 17에 도시한다. 역상 분석 후, 키랄 크로마토그래피를 수행하여 샘플 중에 존재하는 특이적 이성질체를 평가하였다. 표준 S,S 및 R,R, 모나틴 용액에 대한 키랄 크로마토그래피를 도 18에 도시한다.

실시예 29: 고온 (80 ℃) 및 중성 pH 에서의 모나틴의 안정성

pH 7에서 75 ppm 모나틴의 100 밀리미터 용액을 저장 용액으로서 사용하였다. 합성 모나틴 샘플은 대략 96 %의 2R,4R/2S,4S 거울상 이성질체 쌍 및 4 %의 2R,4S/2S,4R 거울상 이성질체 쌍을 함유하였다. 샘플을 80 ℃에서 pH 7에서 실험 기간 동안 인큐베이션하고, 샘플을 0, 1, 2, 3, 4 시간 및 1, 2, 4, 7, 14, 21 및 35 일에 회수하였다. 모든 실험 조건을 2 회 러닝하였다.

LC - MS 를 사용하고 역 상 크로마토그래피를 사용한 분리 및 정량화 - 반응 곡선을 합성 모나틴의 검출된 부분입체 이성질체 피크 양쪽 모두에 대해 정하였다. 5-150 ppm의 범위를 DI 물 중에 용해된 합성 모나틴 표준과 일괄하여 다루었다. 3.9 x 150mm 노바파크 (Novapak) C18 (워터스 코퍼레이션) HPLC 칼럼을 사용하여 두 개의 부분입체 이성질체 피크의 분리를 수행하였다. 검출 및 정량화에 자외선-가시 광선 (UV) 및 질량 분광계 (MS) 검출기를 연속하여 사용하였다. 모나틴 및 그의 락톤 피크 각각은 정확한 검출을 보조하는 279 nm에서의 UV_max를 가졌다. 양성 이온 전자분사 모드에서 293.3 m/z 및 275.3 m/z의 선택된 이온 모니터링 (Selected Ion Monitoring; SIM) 스캔을 얻음으로써 정량화를 수행하였다.

결과 - 중성 pH (베이킹 및 디저트에 대해 통상적임)에서, 모나틴의 분해도는 심지어 7-35 일 후에도 상당하지 않은 것으로 결정되었다. 시간의 경과에 따른 모나틴의 소멸은 1차 부산물이 고리화 및 가능하게는 매우 소량의 라세미화되기 때문에 pH에 크게 의존적이다. 80 ℃ 및 pH 7에서 실험하는 동안, 정량화를 위한 LCMS를 사용함으로써 제공된 정확도의 한계 내에서는 라세믹 RR/SS 모나틴 또는 그의 락톤의 농도의 변화가 검출되지 않았다. 이 데이터에 기초하여, 고온 및 중성 pH에서, 모나틴 안정성은 베이킹에 대해 허용가능한 것으로 예상된다.

본 개시 내용의 원리가 적용될 수 있는 많은 가능한 실시양태의 측면에서, 상술된 실시양태들은 본 개시 내용의 오직 특정 예이며 본 개시 내용의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다는 것이 인식되어야 한다. 예를 들면, 본 명세서의 개시 내용의 교시로부터, 모나틴 음료 조성물이 고체 형태보다는 액체 농축물 형태로 제조될 수 있으며, 여기서 선택된 부피의 액체 농축물, 예를 들면 1 mL 또는 0.35 mL는 선택된 양, 예를 들면 2 티스푼의 정백당과 동등한 감미성을 가질 것이라는 점이 당업자에게 명확하게 이해될 것이다.

실시예 30 : 기타 소프트 드링크 제형(농축액)

제형 A :

성분	농도(%; 중량/부피)
콜라 향미 C40385	0.7150
콜라 향미 C40386	0.7150
벤조산나트륨(20% 용액)	0.3750
S,S 모나틴	0.99
물	부피에 따름(to volume)

쓰로우 1+4. 희석시킨 바로 마실 수 있는 음료는 S,S 모나틴을 1,980 ppm 함유한다.

제형 B :

성분	농도(%; 중량/부피)
콜라 향미 C40385	0.7150
콜라 향미 C40386	0.7150
벤조산나트륨(20% 용액)	0.3750
모나틴(라세미 혼합)	0.04
물	부피에 따름

쓰로우 1+4. 희석시킨 바로 마실 수 있는 음료는 모나틴 라세미 믹스를 80 ppm 함유한다.

제형 C :

성분	농도(%; 중량/부피)
콜라 향미 C40385	0.7150
콜라 향미 C40386	0.7150
벤조산나트륨(20% 용액)	0.3750
S,S 모나틴	0.275
R,R 모나틴	0.016
물	부피에 따름

쓰로우 1+4. 희석시킨 바로 마실 수 있는 음료는 S,S 모나틴을 550 ppm, R,R 모나틴을 32 ppm 함유한다.

본 명세서에 기재된 원리를 적용할 수 있는 다수의 가능한 구체예의 관점에서, 예시된 구체예는 단지 본 명세서에 기재된 특정 예로서, 본 명세서의 범위를 한정하지 않는 것으로 이해해야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Cargill, Incorporated <120> Chewing Gum Compositions Comprising Monatin and Methods for Making Same <130> 6682-64349 <150> 60/495,191 <151> 2003-08-14 <160> 74 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1170 <212> DNA <213> Sinorhizobium meliloti <400> 1 atgttcgacg ccctcgcccg ccaagccgac gatcccttgc ttttcctgat cggcctgttc 60 aggaaggatg agcgccccgg aaaggtcgat ctcggcgtag gagtctatcg cgacgagacc 120 ggacgcacgc cgatcttccg ggccgtcaag gcggcggaaa agcggcttct cgaaacacag 180 gacagcaagg cctatatcgg ccccgaaggg gacctcgtct ttctcgatcg gctctgggaa 240 ctcgtcggcg gcgacacgat cgagcggagc catgttgcgg gcgtccagac gcccggcggc 300 tccggcgcgc tccgtttggc ggcggacctc atcgcccgca tgggcggccg aggcatctgg 360 ctcgggctgc cgagctggcc gaaccacgcg ccgatcttca aggcggccgg gctcgatatc 420 gccacctacg acttcttcga cattccgtcg cagtcggtca tcttcgataa tctggtgagc 480 gcgctggaag gcgccgcatc cggcgatgcg gtgctgctgc atgcaagctg ccacaacccg 540 accggcggcg tcctgagcga agcacaatgg atggagatcg ccgcgctggt ggccgagcgc 600 ggcctgctgc cgctcgtcga 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55 60 Tyr Ile Gly Pro Glu Gly Asp Leu Val Phe Leu Asp Arg Leu Trp Glu 65 70 75 80 Leu Val Gly Gly Asp Thr Ile Glu Arg Ser His Val Ala Gly Val Gln 85 90 95 Thr Pro Gly Gly Ser Gly Ala Leu Arg Leu Ala Ala Asp Leu Ile Ala 100 105 110 Arg Met Gly Gly Arg Gly Ile Trp Leu Gly Leu Pro Ser Trp Pro Asn 115 120 125 His Ala Pro Ile Phe Lys Ala Ala Gly Leu Asp Ile Ala Thr Tyr Asp 130 135 140 Phe Phe Asp Ile Pro Ser Gln Ser Val Ile Phe Asp Asn Leu Val Ser 145 150 155 160 Ala Leu Glu Gly Ala Ala Ser Gly Asp Ala Val Leu Leu His Ala Ser 165 170 175 Cys His Asn Pro Thr Gly Gly Val Leu Ser Glu Ala Gln Trp Met Glu 180 185 190 Ile Ala Ala Leu Val Ala Glu Arg Gly Leu Leu Pro Leu Val Asp Leu 195 200 205 Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Arg Gly Leu Asp Gln Asp Val Ala Gly Leu 210 215 220 Arg His Leu Leu Gly Val Val Pro Glu Ala Leu Val Ala Val Ser Cys 225 230 235 240 Ser Lys Ser Phe Gly Leu Tyr Arg Glu Arg Ala Gly Ala Ile Phe Ala 245 250 255 Arg Thr Ser Ser Thr Ala Ser Ala Asp Arg Val Arg Ser Asn Leu Ala 260 265 270 Gly Leu Ala Arg Thr Ser Tyr Ser Met Pro Pro Asp His Gly Ala Ala 275 280 285 Val Val Arg Thr Ile Leu Asp Asp Pro Glu Leu Arg Arg Asp Trp Thr 290 295 300 Glu Glu Leu Glu Thr Met Arg Leu Arg Met Thr Gly Leu Arg Arg Ser 305 310 315 320 Leu Ala Glu Gly Leu Arg Thr Arg Trp Gln Ser Leu Gly Ala Val Ala 325 330 335 Asp Gln Glu Gly Met Phe Ser Met Leu Pro Leu Ser Glu Ala Glu Val 340 345 350 Met Arg Leu Arg Thr Glu His Gly Ile Tyr Met Pro Ala Ser Gly Arg 355 360 365 Ile Asn Ile Ala Gly Leu Lys Thr Ala Glu Ala Ala Glu Ile Ala Gly 370 375 380 Lys Phe Thr Ser Leu 385 <210> 3 <211> 1260 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 3 atgcgctcta cgacggctcc tggtccgagt ggggcatgta tgacgatctc aaggtcgcga 60 aaggatgacg aaggaatgct gaccgccctg aagccgcagc ccgcggacaa gatcctgcaa 120 ctgatccaga tgttccgcga ggatgcgcgc gcggacaaga tcgatctggg cgtgggcgtc 180 tacaaggacc cgaccgggct caccccggtc atgcgggccg tgaaggcggc cgagaagcgg 240 ctctgggagg tcgagaccac caagacctac accggccttg ccgacgagcc ggcctacaat 300 gccgcgatgg cgaagctgat cctcgcgggc gcggtcccgg ccgaccgggt ggcctcggtc 360 gccacccccg gcggcacggg cgcggtgcgt caggcgctcg agctgatccg catggcctcg 420 cccgaggcca ccgtctggat ctcgaacccg acctggccga accatctgtc gatcgtgaaa 480 tatctcggca tcccgatgcg ggaataccgc tatttcgacg ccgagaccgg cgccgtcgat 540 gccgagggca tgatggagga tctggcccag gtgaaggcgg gcgacgtggt gctgctgcac 600 ggctgctgcc acaacccgac cggcgccaac ccgaacccgg tgcagtggct ggccatctgc 660 gagagcctgg cccggacagg cgcggtgccg ctgatcgacc tcgcctatca gggcttcggc 720 gacgggctcg agatggatgc ggcggcgacg cggcttctgg ccaccagact gcccgaggtg 780 ctgatcgcgg cctcctgctc gaagaacttc ggcatctacc gcgagcgcac gggcatcctg 840 atcgccatcg gcgaggcggc gggccggggc acggtgcagg ccaacctcaa cttcctgaac 900 cggcagaact actccttccc gccggaccat ggcgcgcggc tcgtgaccat gatcctcgag 960 gacgagacgc tgagcgccga ctggaaggcg gaactcgagg aggtgcggct caacatgctg 1020 acactgcgcc gccagcttgc cgatgcgctg caggccgaga ccggctcgaa ccgcttcggc 1080 ttcgtggccg agcatcgcgg catgttctcg cgcctcggga tcacgcccgc cgaggtggag 1140 cggctgcgga ccgagcacgg ggtctacatg 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atttctttga taccacgcag 420 ggccatagcc agatcaacgg ctgtaccgtg cgtaacgtct atatcaaaga agccttcgat 480 acgggcgtgc gttacgactt taaaggcaac tttgaccttg agggattaga acgcggtatt 540 gaagaagttg gtccgaataa cgtgccgtat atcgttgcaa ccatcaccag taactctgca 600 ggtggtcagc cggtttcact ggcaaactta aaagcgatgt acagcatcgc gaagaaatac 660 gatattccgg tggtaatgga ctccgcgcgc tttgctgaaa acgcctattt catcaagcag 720 cgtgaagcag aatacaaaga ctggaccatc gagcagatca cccgcgaaac ctacaaatat 780 gccgatatgc tggcgatgtc cgccaagaaa gatgcgatgg tgccgatggg cggcctgctg 840 tgcatgaaag acgacagctt ctttgatgtg tacaccgagt gcagaaccct ttgcgtggtg 900 caggaaggct tcccgacata tggcggcctg gaaggcggcg cgatggagcg tctggcggta 960 ggtctgtatg acggcatgaa tctcgactgg ctggcttatc gtatcgcgca ggtacagtat 1020 ctggtcgatg gtctggaaga gattggcgtt gtctgccagc aggcgggcgg tcacgcggca 1080 ttcgttgatg ccggtaaact gttgccgcat atcccggcag accagttccc ggcacaggcg 1140 ctggcctgcg agctgtataa agtcgccggt atccgtgcgg tagaaattgg ctctttcctg 1200 ttaggccgcg atccgaaaac cggtaaacaa ctgccatgcc cggctgaact gctgcgttta 1260 accattccgc gcgcaacata tactcaaaca catatggact tcattattga agcctttaaa 1320 catgtgaaag agaacgcggc gaatattaaa ggattaacct ttacgtacga accgaaagta 1380 ttgcgtcact tcaccgcaaa acttaaagaa gtttaa 1416 <210> 42 <211> 1371 <212> DNA <213> Citrobacter freundii <400> 42 atgaattatc cggcagaacc cttccgtatt aaaagcgttg aaactgtatc tatgatcccg 60 cgtgatgaac gcctcaagaa aatgcaggaa gcgggttaca atactttcct gttaaattcg 120 aaagatattt atattgacct gctgacagac agtggcacta acgcaatgag cgacaagcag 180 tgggccggaa tgatgatggg tgatgaagcg tacgcgggca gcgaaaactt ctatcatctg 240 gaaagaaccg tgcaggaact gtttggcttt aaacatattg ttccgactca ccaggggcgt 300 ggcgcagaaa acctgttatc gcagctggct attaaacctg ggcaatatgt tgccgggaat 360 atgtatttca ctaccacccg ttatcaccag gaaaaaaatg gtgcggtgtt tgtcgatatc 420 gttcgtgacg aagcgcacga tgccggtctg aatattgcgt ttaaaggtga tatcgatctt 480 aaaaaattac aaaagctgat tgatgaaaaa ggcgcagaga atattgcgta tatctgcctg 540 gcggtgacgg ttaacctcgc gggcggccaa ccggtctcga tggctaacat gcgtgcggtg 600 cgtgaactga cagaagcgca tggcattaaa gtgttctacg acgctacccg ctgcgtagaa 660 aacgcctact ttatcaaaga gcaagagcag ggctttgaga acaagagcat cgccgagatc 720 gtgcatgaga tgttcagcta cgccgacggt tgtaccatga gtggtaaaaa agactgtctg 780 gtgaacatcg gcggcttcct gtgcatgaac gatgacgaaa tgttctcttc tgccaaagag 840 ttagtcgtgg tctacgaagg gatgccatct tacggcggcc tggccggacg tgatatggaa 900 gcgatggcga ttggcctgcg tgaagccatg cagtacgaat atattgagca ccgcgtgaag 960 caggttcgct acctgggcga taagctgaaa gccgctggcg taccgattgt tgaaccggta 1020 ggcggtcacg cggtattcct cgatgcgcgt cgcttctgcg agcatctgac gcaagatgag 1080 ttcccggcac aaagtctggc tgccagcatc tatgtggaaa ccggcgtgcg cagtatggag 1140 cgcggaatta tctctgcggg ccgtaataac gtgaccggtg aacaccacag accgaaactg 1200 gaaaccgtgc gtctgactat tccacgtcgt gtttatacct acgcacatat ggatgttgtg 1260 gctgacggta ttattaaact ttaccagcac aaagaagata ttcgcgggct gaagtttatt 1320 tacgagccga agcagttgcg tttctttact gcacgctttg attacatcta a 1371 <210> 43 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 43 ggtattgagg gtcgcatgga aaactttaaa catct 35 <210> 44 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 44 agaggagagt tagagcctta aacttcttta agttttg 37 <210> 45 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 45 ggtattgagg gtcgcatgaa ttatccggca gaacc 35 <210> 46 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 46 agaggagagt tagagcctta gatgtaatca aagcgtg 37 <210> 47 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 47 ccagggcacc ggcgcagagc aaatctatat t 31 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 48 tgcgccggtg ccctggtgag tcggaatggt 30 <210> 49 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 49 tcctgcacgc ggcaaagggt tctgcactcg gt 32 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 50 ctttgccgcg tgcaggaagg cttcccgaca 30 <210> 51 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 51 aggggaccgg cgcagaaaac ctgttatcg 29 <210> 52 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 52 tctgcgccgg tcccctggtg agtcggaaca at 32 <210> 53 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 53 gttagtccgc gtctacgaag ggatgccat 29 <210> 54 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 54 gtagacgcgg actaactctt tggcagaag 29 <210> 55 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 55 ggtattgagg gtcgcatgta cgaactggga gttgt 35 <210> 56 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 56 agaggagagt tagagcctta gtcaatatat ttcaggc 37 <210> 57 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 57 ggtattgagg gtcgcatgtc cggcatcgtt gtcca 35 <210> 58 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 58 agaggagagt tagagcctca gacatatttc agtccca 37 <210> 59 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 59 ggtattgagg gtcgcatgcg actgaacaac ctcgg 35 <210> 60 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 60 agaggagagt tagagcctca gttctccacg tattcca 37 <210> 61 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 61 ggtattgagg gtcgcatgag cgtggttcac cggaa 35 <210> 62 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 62 agaggagagt tagagcctca atcgatatat ttcagtc 37 <210> 63 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 63 ggtattgagg gtcgcatgag cctggttaat atgaa 35 <210> 64 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 64 agaggagagt tagagcctta tgactttaac gcgttga 37 <210> 65 <211> 684 <212> DNA <213> C. testosteroni <400> 65 atgtacgaac tgggagttgt ctaccgcaat atccagcgcg ccgaccgcgc tgctgctgac 60 ggcctggccg ccctgggctc cgccaccgtg cacgaggcca tgggccgcgt cggtctgctc 120 aagccctata tgcgccccat ctatgccggc aagcaggtct cgggcaccgc cgtcacggtg 180 ctgctgcagc ccggcgacaa ctggatgatg catgtggctg ccgagcagat tcagcccggc 240 gacatcgtgg tcgcagccgt caccgcagag tgcaccgacg gctacttcgg cgatctgctg 300 gccaccagct tccaggcgcg cggcgcacgt gcgctgatca tcgatgccgg cgtgcgcgac 360 gtgaagacgc tgcaggagat ggactttccg gtctggagca aggccatctc ttccaagggc 420 acgatcaagg ccaccctggg ctcggtcaac atccccatcg tctgcgccgg catgctggtc 480 acgcccggtg acgtgatcgt ggccgacgac gacggcgtgg tctgcgtgcc cgccgcgcgt 540 gccgtggaag tgctggccgc cgcccagaag cgtgaaagct tcgaaggcga aaagcgcgcc 600 aagctggcct cgggcatcct cggcctggat atgtacaaga tgcgcgagcc cctggaaaag 660 gccggcctga aatatattga ctaa 684 <210> 66 <211> 227 <212> PRT <213> C. testosteroni <400> 66 Met Tyr Glu Leu Gly Val Val Tyr Arg Asn Ile Gln Arg Ala Asp Arg 1 5 10 15 Ala Ala Ala Asp Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ser Ala Thr Val His Glu 20 25 30 Ala Met Gly Arg Val Gly Leu Leu Lys Pro Tyr Met Arg Pro Ile Tyr 35 40 45 Ala Gly Lys Gln Val Ser Gly Thr Ala Val Thr Val Leu Leu Gln Pro 50 55 60 Gly Asp Asn Trp Met Met His Val Ala Ala Glu Gln Ile Gln Pro Gly 65 70 75 80 Asp Ile Val Val Ala Ala Val Thr Ala Glu Cys Thr Asp Gly Tyr Phe 85 90 95 Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Phe Gln Ala Arg Gly Ala Arg Ala Leu 100 105 110 Ile Ile Asp Ala Gly Val Arg Asp Val Lys Thr Leu Gln Glu Met Asp 115 120 125 Phe Pro Val Trp Ser Lys Ala Ile Ser Ser Lys Gly Thr Ile Lys Ala 130 135 140 Thr Leu Gly Ser Val Asn Ile Pro Ile Val Cys Ala Gly Met Leu Val 145 150 155 160 Thr Pro Gly Asp Val Ile Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Cys Val 165 170 175 Pro Ala Ala Arg Ala Val Glu Val Leu Ala Ala Ala Gln Lys Arg Glu 180 185 190 Ser Phe Glu Gly Glu Lys Arg Ala Lys Leu Ala Ser Gly Ile Leu Gly 195 200 205 Leu Asp Met Tyr Lys Met Arg Glu Pro Leu Glu Lys Ala Gly Leu Lys 210 215 220 Tyr Ile Asp 225 <210> 67 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 67 actcggatcc gaaggagata tacatatgta cgaactggga ct 42 <210> 68 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 68 cggctgtcga ccgttagtca atatatttca ggc 33 <210> 69 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 69 cgcggatcca taatggttga gaacattacc g 31 <210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 70 acgcgtcgac ttacagcact gccacaatcg 30 <210> 71 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 71 ccggaattca taatggtcga actgggagtt gt 32 <210> 72 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 72 gaatgcggcc gcttagtcaa tatatttcag gcc 33 <210> 73 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 73 ggtattgagg gtcgc 15 <210> 74 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 74 agaggagagt tagagcc 17 1

Claims (57)

1. 모나틴(monatin) 또는 그의 염을 포함하는 음료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 조성물의 양은 모나틴 또는 그의 염 대신 슈크로오스 또는 고 프룩토오스 옥수수 시럽을 함유하는 음료 조성물의 동일한 양에 비해 비슷한 감미성에서 더 낮은 칼로리 및 탄수화물을 함유하는 것인 음료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 조성물은 시트러스 향미를 더 포함하고, 모나틴 또는 그의 염은 시트러스 향미에 의해 제공되는 향미를 강화시키는 양으로 존재하는 것인 음료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 조성물은 시트러스 향미 및 탄수화물을 더 포함하고, 모나틴 또는 그의 염 및 탄수화물은 시트러스 향미에 의해 제공되는 향미를 강화시키는 양으로 존재하는 것인 음료 조성물.
5. 제4항에 있어서, 탄수화물은 에리트리톨, 말토덱스트린, 슈크로오스 및 그의 조합물 중에서 선택된 것인 음료 조성물.
6. 시럽 조성물을 탄산 음료의 약 15 중량% 내지 약 25 중량%의 범위인 양으로 포함하는 탄산 음료로서, 상기 시럽 조성물은 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 탄산 음료.
7. 제1항에 있어서, 조성물은 약 3 ppm 내지 약 10000 ppm의 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 음료 조성물.
8. 제1항에 있어서, 음료 조성물은 시럽 또는 건조 음료 믹스(dry beverage mix)이고, 조성물은 약 10 ppm 내지 약 10000 ppm의 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 음료 조성물.
9. 제8항에 있어서, 음료 조성물은 시럽이고, 시럽은 약 1 부의 시럽 : 3 부의 음료 내지 약 1 부의 시럽 : 5.5 부의 음료의 범위로 음료 내에서 희석되도록 조절된 농축물인 것인 음료 조성물.
10. 제9항에 있어서, 시럽은 약 600 ppm 내지 약 10000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 음료 조성물.
11. 제9항에 있어서, 시럽은 약 18 ppm 내지 약 300 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 음료 조성물.
12. 제1항에 있어서, 음료 조성물은 약 0 ppm 내지 약 10000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염, 및 약 0 ppm 내지 약 300 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 시럽인 것인 음료 조성물.
13. 제1항에 있어서, 음료 조성물은 약 10 ppm 내지 약 10000 ppm의 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 건조 음료 믹스인 것인 음료 조성물.
14. 제13항에 있어서, 건조 음료 믹스는 약 600 ppm 내지 약 10000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 음료 조성물.
15. 제13항에 있어서, 건조 음료 믹스는 약 10 ppm 내지 약 450 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 음료 조성물.
16. 제1항에 있어서, 음료 조성물은 약 0 ppm 내지 약 10000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염, 및 약 0 ppm 내지 약 450 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 건조 음료 믹스인 것인 음료 조성물.
17. 제7항에 있어서, 조성물은 R,R 모나틴 또는 그의 염을 실질적으로 함유하지 않는 것인 음료 조성물.
18. 제7항에 있어서, 조성물은 S,S 모나틴 또는 그의 염을 실질적으로 함유하지 않는 것인 음료 조성물.
19. 제1항에 있어서, 조성물은 약 3 ppm 내지 약 450 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 음료 조성물.
20. 제19항에 있어서, 조성물은 약 6 ppm 내지 약 225 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 음료 조성물.
21. 제1항에 있어서, 조성물은 약 3 ppm 내지 약 10000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 음료 조성물.
22. 제21항에 있어서, 조성물은 약 60 ppm 내지 약 4600 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 음료 조성물.
23. 제1항에 있어서, 조성물은 약 0 ppm 내지 약 10000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염, 및 약 0 ppm 내지 약 450 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 음료 조성물.
24. 제1항에 있어서, 조성물은 약 3 ppm 내지 약 2000 ppm의 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 즉시 마실 수 있는(ready-to-drink) 조성물인 것인 음료 조성물.
25. 제24항에 있어서, 즉시 마실 수 있는 조성물은 약 5 ppm 내지 약 50 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 즉시 마실 수 있는 조성물.
26. 제24항에 있어서, 즉시 마실 수 있는 조성물은 약 60 ppm 내지 약 2000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 즉시 마실 수 있는 조성물.
27. 제1항에 있어서, 조성물은 약 450 ppm 이하의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함하고, 모나틴 또는 그의 염은 S,S 모나틴, S,R 모나틴 또는 R,S 모나틴 또는 그의 염을 실질적으로 함유하지 않는 것인 음료 조성물.
28. 제1항에 있어서, 조성물은 약 10000 ppm 이하의 S,S 모나틴 또는 그의 염을 포함하고, 모나틴 또는 그의 염은 R,R 모나틴, S,R 모나틴, R,S 모나틴 또는 그의 염을 실질적으로 함유하지 않는 것인 음료 조성물.
29. 제1항에 있어서, 모나틴 또는 그의 염은 필수적으로 R,R 모나틴 또는 그의 염으로 이루어진 것인 음료 조성물.
30. 제1항에 있어서, 모나틴 또는 그의 염은 필수적으로 S,S 모나틴 또는 그의 염으로 이루어진 것인 음료 조성물.
31. 제1항에 있어서, 모나틴 또는 그의 염은 입체 이성질체-풍부 R,R 모나틴 또는 그의 염인 것인 음료 조성물.
32. 제1항에 있어서, 모나틴 또는 그의 염은 입체 이성질체-풍부 S,S 모나틴 또는 그의 염인 것인 음료 조성물.
33. 제1항에 있어서, 모나틴 또는 그의 염은 95% 이상의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 음료 조성물.
34. 제1항에 있어서, 모나틴 또는 그의 염은 95% 이상의 S,S 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 음료 조성물.
35. 제1항에 있어서, 모나틴 또는 그의 염은 생합성 경로로 제조되는 것인 음료 조성물.
36. 제1항에 있어서, 음료 조성물은 에리트리톨, 트레할로오스, 시클라메이트, D-타가토오스 또는 그의 조합물을 더 포함하는 것인 음료 조성물.
37. 제1항에 있어서, 조성물은 무칼로리인 것인 음료 조성물.
38. 입체이성질체 풍부 모나틴 혼합물을 포함하는 음료 조성물로서, 모나틴 혼합물은 생합성 경로를 통해 제조되는 것인 음료 조성물.
39. 제38항에 있어서, 생합성 경로는 다단계 경로이고 다단계 경로 중 하나 이상의 단계는 화학적 전환 단계인 것인 음료 조성물.
40. 제38항에 있어서, 혼합물은 주로 R,R 모나틴 또는 그의 염인 것인 음료 조성물.
41. 제38항에 있어서, 혼합물은 주로 S,S 모나틴 또는 그의 염인 것인 음료 조성물.
42. 생합성 경로로 제조된 모나틴 조성물을 포함하는 음료 조성물로서, 모나틴 조성물은 석유 화학 제품, 독성 또는 유해한 오염물질을 함유하지 않는 것인 음료 조성물.
43. 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 음료 조성물로서, 모나틴 또는 그의 염은 생합성 경로로 제조되고 재조합 세포로부터 단리되며, 재조합 세포는 석유 화학 제 품, 독성 또는 유해한 오염물질을 함유하지 않는 것인 음료 조성물.
44. 제1항에 있어서, 모나틴 또는 그의 염은 R,R 모나틴 및 S,S 모나틴 또는 그의 염의 블렌드인 것인 음료 조성물.
45. 제1항에 있어서, 조성물은 벌크 감미제(bulk sweetner), 고강도 감미제, 저당 탄수화물, 향미료, 산화방지제, 카페인, 감미성 강화제(sweetness enhancer) 또는 그의 조합물을 더 포함하는 것인 음료 조성물.
46. 제45항에 있어서,

    향미료는 콜라 향미, 시트러스 향미 및 그의 조합물 중에서 선택되고,

    벌크 감미제는 옥수수 감미제, 슈크로오스, 덱스트로오스, 전화당, 말토오스, 덱스트린, 말토덱스트린, 프룩토오스, 레불로오스, 고 프룩토오스 옥수수 시럽, 옥수수 시럽 고체, 레불로오스, 갈락토오스, 트레할로오스, 이소말툴로오스, 프룩토-올리고당 및 그의 조합물 중에서 선택되고,

    고강도 감미제는 슈크라로오스, 아스파탐, 사카린, 아세설팜 K(acesulfame K), 알리탐(alitame), 소마틴(thaumatin), 디히드로칼콘(dihydrochalcone), 네오탐(neotame), 시클라메이트, 스테비오사이드, 모그로사이드(mogroside), 글리실리진(glycyrrhizin), 필로둘신(phyllodulcin), 모넬린(monellin), 마빈린(mabinlin), 브라제인(brazzein), 서큘린(circulin), 펜타딘(pentadin) 및 그의 조합물 중에서 선택되고,

    저당 탄수화물은 D-타가토오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 락티톨, 에리트리톨, 말티톨(maltitol), 수소화된 전분 가수분해물, 이소말트(isomalt), D-프사이코스(D-psicose), 1,5 안하이드로 D-프룩토오스 및 그의 조합물 중에서 선택되며,

    감미성 강화제는 서큘린, 미라큘린(miraculin), 시나린(cynarin), 클로로겐산, 카페인산, 스트로진(strogin), 아라비노갈락탄(arabinogalactan), 말톨(maltol), 디히드록시벤조산 및 그의 조합물 중에서 선택된 것인 음료 조성물.
47. 제1항에 있어서, 음료 조성물은 모나틴 또는 그의 염 및 비-모나틴 감미제의 블렌드를 포함하는 것인 음료 조성물.
48. 제47항에 있어서, 비-모나틴 감미제는 슈크로오스 및 고 프룩토오스 옥수수 시럽 중에서 선택된 것인 음료 조성물.
49. 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 음료 조성물의 제조 방법으로서, 이 방법은 글루코스, 트립토판, 인돌-3-락트산, 인돌-3-피루베이트 및 모나틴 전구체 중에서 선택된 하나 이상의 기질로부터 모나틴 또는 그의 염을 제조하는 것을 포함하는 것인 방법.
50. 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 음료 조성물의 제조 방법으로서, 이 방법은 생합성 경로를 통해 모나틴 또는 그의 염을 제조하는 것을 포함하는 것인 방법.
51. 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 음료 조성물의 제조 방법으로서, 이 방법은 하나 이상의 생물학적 전환 단계를 사용하여 모나틴 또는 그의 염을 제조하는 것을 포함하는 것인 방법.
52. 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 음료 조성물의 제조 방법으로서, 이 방법은 생물학적 전환 단계만을 사용하여 모나틴 또는 그의 염을 제조하는 것을 포함하는 것인 방법.
53. 제49항에 있어서, 상기 방법은 모나틴 또는 그의 염을 모나틴 또는 그의 염이 아닌 하나 이상의 기타 성분과 배합하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
54. 제49항에 있어서, 상기 방법은 모나틴 또는 그의 염을 에리트리톨, 트레할로오스, 시클라메이트, D-타가토오스, 말토덱스트린 또는 그의 조합물과 배합하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
55. 제53항에 있어서, 하나 이상의 기타 성분은 증량제, 벌크 감미제, 액체 감미제, 저당 탄수화물, 고강도 감미제, 농후제, 지방, 오일, 유화제, 산화방지제, 감 미성 강화제, 착색제, 향미료, 카페인, 산, 분말, 유동화제(flow agent), 완충제, 단백질 공급원, 향미 강화제, 향미 안정화제 및 그의 조합물 중에서 선택된 것인 방법.
56. 제53항에 있어서, 음료 조성물은 약 0 ppm 내지 약 10000 ppm의 S,S 모나틴 또는 그의 염, 및 약 0 ppm 내지 약 450 ppm의 R,R 모나틴 또는 그의 염을 포함하는 것인 방법.
57. 모나틴 조성물을 포함하는 음료 조성물의 제조 방법으로서, 이 방법은

    (a) 모나틴 또는 그의 염을 재조합 세포 내에서 생합성 경로로 제조하는 단계;

    (b) 상기 모나틴 조성물을 재조합 세포로부터 단리시키는 단계

    를 포함하며, 이때 모나틴 조성물은 모나틴 또는 그의 염 및 기타 식용 또는 음용 물질로 이루어진 것인 방법.

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