CN1890377B - 生产莫纳甜和莫纳甜前体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了可用于从葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸制造莫纳甜或其盐的方法和组合物。也公开了生产吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸中间体的方法。所提供的组合物包括核酸分子、多肽、化学结构和细胞。方法包括体外和体内方法,体外方法包括化学反应。
Description
本申请要求2003年10月21日提交的美国临时专利申请号60/513,406的优先权,该申请被全文纳入作为参考。
技术领域
本公开提供了用于生产吲哚3-丙酮酸、2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸和/或莫纳甜(monatin)的方法和材料。
背景
吲哚-3-丙酮酸是一种强效抗氧化剂,相信它抵消了氧气浓度高的组织中的氧化应激(Politi等,“色氨酸研究的最近进展”(Recent advances in Tryptophan research),G.A.Filippini等编,Plenum Press,New York,1996,第291-8页)。吲哚丙酮酸也是作为主要的植物生长激素生长素(可扩散的生长促进因子)的吲哚-乙酸(IAA)的产生途径中的中间物。在生理过程包括顶端优势、向性、纸条伸长、诱导形成层细胞***和生根中,亚微克量的IAA是有活性的。园艺中用合成生长素诱导生根并促进果实形成和发育。参见例如美国专利号5,843,782和5,952,231。在高浓度时,合成生长素是有效的阔叶植物除草剂。可认为,通过发酵生产的天然生长素比化学生产的除草剂对环境更友好。1999年生长调节剂的全球销售额为4亿英镑(14亿美元)。除了植物相关用途以外,吲哚乙酸还用于药物应用。例如,美国专利号5,173,497提出,用这些化合物治疗记忆损伤,如伴随阿尔茨海默病和老年性痴呆的记忆损伤。美国专利号5,173,497中提出的机制是这些化合物抑制乙酰胆碱酯酶并提高大脑中的乙酰胆碱水平。
通过过氧化物酶催化的氧化作用由吲哚-3-乙酸产生吲哚-3-甲醇,且可容易地转化成二吲哚甲烷。据报道,两种化合物能够消除毒素并促进产生有益于女性健康的激素。氯化D-色氨酸被鉴定为非营养性甜味剂,对探索其它衍生物的兴趣持续增加。
莫纳甜(2-羟基-2-(吲哚-3基甲基)-4-氨基戊二酸)是天然存在的,类似于氨基酸色氨酸成分的甜味剂。它可提取自南非灌木似冬青叶硬木朔(Sclerochiton ilicifolius)的根皮,作为高强度甜味剂在食品和饮料工业中有前途。关于莫纳甜的专利的一些例子包括:美国专利号5,994,559;4,975,298;5,128,164和5,128,482。
概述
本发明涉及莫纳甜(2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸一也称为4-氨基-2-羟基-(1H-吲哚-3-基甲基)-戊二酸,或者根据另一种编号***,称为4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)谷氨酸),该化合物具有下式:
莫纳甜也有以下化学名称:3-(1-氨基-1,3-二羧基-3-羟基-丁-4-基)-吲哚;4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-谷氨酸和3-(1-氨基-1,3-二羧基-3-羟基丁烷-4-基)-吲哚。
莫纳甜是一种天然存在的高强度甜味剂。莫纳甜有四种立体异构形式:2R,4R(“R,R立体异构体”或“R,R莫纳甜”);2S,4S(“S,S立体异构体”或“S,S莫纳甜”);2R,4S(“R,S立体异构体”或“R,S莫纳甜”)以及2S,4R(“S,R立体异构体”或“S,R莫纳甜”)。本文中,除非另有说明,“莫纳甜”7是指莫纳甜的所有四种立体异构体,以及莫纳甜立体异构体任意组合的任何混合物(例如莫纳甜的R,R和S,S立体异构体的混合物)。
本发明部分基于确定从葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸,和/或通过中间体如吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(莫纳甜前体,MP,莫纳甜的α-酮形式)来产生莫纳甜的几种生物合成途径。公开了可用于制造莫纳甜、吲哚-3-丙酮酸和MP的多肽和核酸序列。因为莫纳甜的有机合成需要拆分异构体,所以可利用便宜的原料并可仅产生一种异构体的生化途径在经济上更有利。
可通过吲哚-3-丙酮酸、MP、吲哚-3-乳酸、色氨酸和/或葡萄糖来产生莫纳甜(图1)。产生或制造莫纳甜或其中间体的方法见图1-3和11-13,包括将底物转化为第一种产物,然后将第一种产物转化为第二种产物,等等,直到产生所需终产物。
图1-3和11-13以框显示了可能的中间产物和终产物。例如,可用本文提供的方法和材料进行一种产物到另一种产物的转化,如葡萄糖到色氨酸、色氨酸到吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-丙酮酸到MP、MP到莫纳甜或吲哚-3-乳酸(吲哚-乳酸)到吲哚-3-丙酮酸。可用化学方法或生物学方法促进这些转化。术语“转化”指在将一种产物(如第一种中间体)转变成另一产物(如第二种中间体)的反应中使用化学方法或多肽。术语“化学转化”指不由多肽主动促进的反应。术语“生物转化”指由多肽主动促进的反应。转化可在体内或体外发生。当使用生物转化时,多肽和/或细胞能固定于支持物如化学附着于聚合物支持物上。可用本领域普通技术人员已知的任何反应器,例如在分批或连续反应器中完成转化。
也提供了方法,包括使第一种多肽接触底物,制造第一种产物,然后使产生的第一种产物接触第二种多肽,产生第二种产物,然后使产生的第二种产物接触第三种多肽,产生第三种产物,例如莫纳甜。所用多肽和所产生的产物见图1-3和11-13。
公开了可用于进行图1-3和11-13中所示转化的多肽及其编码序列。在一些实施例中,具有一个或多个改变多肽的底物特异性和/或活性的点突变的多肽可用来制造莫纳甜。
公开了产生莫纳甜的分离和重组细胞。这些细胞可以是任何细胞,如植物、动物、细菌、酵母、藻类、古菌或真菌细胞。
在具体实施例中,公开的细胞包括一种或多种(如两种或多种、三种或多种、四种或多种,或者五种或多种)以下活性:色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC 2.6.1.5)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、L-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(无EC号,Hadar等,J.Bacteriol 125:1096-1104,1976和Furuya等,Biosci Biotechnol Biochem 64:1486-93,2000)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)、合酶/裂合酶(EC 4.1.3.-)如4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)或4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、D-色氨酸转氨酶(Kohiba和Mito,《第8届国际维生素B6和羰基催化讨论会会议录》(Proceedings of 8th International Symposium on VitaminB6 and Carbonyl Catalysis),日本大阪,1990)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)和/或谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)。
在另一实施例中,细胞包括一种或多种(如两种或多种、三种或多种、四种或多种,或者五种或多种)以下活性:吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)、R-4-羟苯基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)、3-(4)-羟基苯丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)、乳酸脱氢酶(EC1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC1.1.3.-)、合酶/裂合酶(4.1.3.-)如4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)或4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC 2.6.1.5)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、D-氨基酸脱氢酶(EC1.4.99.1)、D-色氨酸转氨酶和/或D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)。
此外,公开的细胞可包括一种或多种(如两种或多种、三种或多种、四种或多种,或者五种或多种)以下活性:色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC2.6.1.5)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、色氨酸脱氢酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(无EC编号)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)、吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)、R-4-羟苯基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)、3-(4)-羟基苯丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)、乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)、合酶/裂合酶(EC 4.1.3.-)如4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)或4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)和/或D-色氨酸转氨酶。
能生成莫纳甜的方法包括使色氨酸和/或吲哚-3-乳酸接触第一种多肽,其中第一种多肽将色氨酸和/或吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸(D或L型色氨酸或吲哚-3-乳酸都可用作底物转化成吲哚-3-丙酮酸;本领域技术人员理解选择用于此步骤的多肽理想地表现出适当特异性),所得吲哚-3-丙酮酸接触第2种多肽,其中第2种多肽将吲哚-3-丙酮酸转化成MP,MP接触第3种多肽,其中第3种多肽将MP转化成莫纳甜。能用于这些转化的示范多肽示于图2和3。
本发明另一方面提供了组合物如MP,含有至少一种外源性核酸序列(如至少两种、三种、四种、五种或多种外源性核酸序列)上编码的至少两种多肽,或有时至少三种或至少四种多肽的细胞。
本文提供的方法和材料可用于制造产物如莫纳甜、MP、莫纳甜中间体和莫纳甜衍生物。莫纳甜和本文所述的一些莫纳甜中间体可用作甜味剂或合成莫纳甜衍生物的中间体。
另一方面,本发明的特征是产生莫纳甜的方法。在某些实施方式中,产生莫纳甜或其盐的方法包括:(a)在培养基中培养微生物,该微生物含有至少一种编码醛缩酶多肽的核酸和至少一种编码转氨酶多肽的核酸;和(b)从培养基或培养的微生物中提取莫纳甜或其盐。在某些实施方式中,醛缩酶多肽选自ProA醛缩酶(4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶,EC 4.1.3.17)和KHG醛缩酶(4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶,EC 4.1.3.16)。在其它实施方式中,该微生物选自苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)、***丛毛单胞菌(Comamonas testosterone)、稻草假单胞菌(Pseudomonasstraminea)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(E.coli)。或者,该微生物可选自棒杆菌属(Corynebacterium)和短杆菌属(brevibacterium)。
在其它实施方式中,培养基含有非离子去污剂、青霉素、青霉素衍生物(如氨苄青霉素)或其组合。非离子去污剂包括吐温、Triton X-100或十二烷基乙酸铵。在一个实施方式中,培养基含有浓度小于5μg/L的生物素。在另一实施方式中,在培养微生物之前,培养基的pH约为pH7-pH8。此外,培养基可包括糖蜜、玉米浆或其组合。
在一些实施方式中,该微生物是大肠杆菌,培养基是Trp-1+葡萄糖培养基。在其它实施方式中,该微生物的生长需要苯丙氨酸和酪氨酸,培养基含有苯丙氨酸和酪氨酸。该微生物也可含有aspC和proA基因。此外,该微生物可以是产生和分泌谷氨酸的谷氨酸棒杆菌。在一些实施方式中,该微生物(如谷氨酸棒杆菌)分泌莫纳甜或其盐。在另一实施方式中,在发酵罐中培养微生物。
在一些实施方式中,培养基含有色氨酸、丙酮酸,非离子去污剂(如吐温),青霉素,青霉素衍生物或其组合。在其它实施方式中,转氨酶多肽选自色氨酸转氨酶多肽(EC 2.6.1.27)、天冬氨酸转氨酶多肽(EC 2.6.1.1)、芳族转氨酶多肽(EC 2.6.1.5)和D-丙氨酸转氨酶多肽(EC 2.6.1.21)。
此外,本发明的特征是产生莫纳甜或其盐的方法,包括:(a)在培养基中培养谷氨酸棒杆菌(ATCC 13058);和(b)从培养基或培养的微生物中提取莫纳甜或其盐。在一些实施方式中,培养基含有吐温、青霉素、青霉素衍生物或其组合。
本发明的特征还有具有至少一种编码醛缩酶多肽的核酸和至少一种编码转氨酶多肽的核酸的微生物,其中所述核酸选自外源性核酸、重组核酸及其组合,其中所述微生物产生莫纳甜或其盐。在一些实施方式中,醛缩酶多肽选自ProA醛缩酶(4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶,EC 4.1.3.17)和KHG醛缩酶(4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶,EC 4.1.3.16)。在其它实施方式中,转氨酶多肽选自色氨酸转氨酶多肽(EC2.6.1.27)、天冬氨酸转氨酶多肽(EC 2.6.1.1)、芳族转氨酶多肽(EC 2.6.1.5)和D-丙氨酸转氨酶多肽(EC 2.6.1.21)。微生物可包括过量产生丙酮酸的微生物,和/或是硫胺营养缺陷型,苯丙氨酸和酪氨酸营养缺陷型或硫辛酸营养缺陷型。
在一些实施方式中,微生物选自光滑假丝酵母(Candida glabrata)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)、脂解假丝酵母(Candida lipolytica)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在其它实施方式中,该微生物含有aspC基因和proA基因。在某些实施方式中,该微生物含有aspC基因和proA基因和至少一个色氨酸操纵子基因。在其它实施方式中,该微生物是大肠杆菌。在其它实施方式中,该微生物含有缺陷的F1-ATP酶基因,破坏的内源性lipA基因,破坏的pheA基因,破坏的内源性色氨酸酶(tna)基因和/或一种或多种色氨酸生物合成基因的两个或多个拷贝。在一些实施方式中,该微生物过量产生色氨酸。在其它实施方式中,该微生物过表达ppsA基因,相对于相应的对照微生物,3-脱氧-D-***-庚酮糖7-磷酸(3-deoxy-D-arabino-hapatulosonic 7-phosphate acid)(DAHP)合酶活性提高,它包括编码具有磷酸烯醇丙酮酸(PEP)合酶活性的多肽的核酸,该核酸选自外源性核酸、重组核酸及其组合和/或tkt基因。在其它实施方式中,该微生物是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
在一些实施方式中,该微生物还含有编码具有色氨酸酶活性的多肽的外源性核酸。在其它实施方式中,该微生物分泌莫纳甜或其盐和/或是脂肪酸营养缺陷型。在其它实施方式中,该微生物是含有表达醛缩酶的核酸的细菌菌株,其中由该核酸表达的醛缩酶能够产生富含立体异构体的莫纳甜混合物。在一些实施方式中,富含立体异构体的莫纳甜混合物主要是S,S莫纳甜或其盐。或者,富含立体异构体的莫纳甜混合物主要是R,R莫纳甜或其盐。在一个实施方式中,该微生物过表达至少一种编码色氨酸摄取多肽的核酸。
在另一方面,本发明的特征是产生莫纳甜或其盐的方法,该方法包括:(a)在产生莫纳甜或其盐的条件下在培养基中培养产生莫纳甜或其盐的微生物,和(b)从培养基或培养的微生物中获得莫纳甜或其盐。在一些实施方式中,该微生物分泌莫纳甜或其盐和/或是脂肪酸营养缺陷型。
此外,本发明也包括鉴定能够合成莫纳甜或其盐的细胞的方法,该方法包括:(a)在选自莫纳甜或其盐、2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其盐、莫纳甜或其盐的类似物、2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其盐的类似物,及其组合的碳/能源的存在下培养细胞;和(b)测试细胞生长,其中细胞生长说明细胞将碳源/能源转化成丙酮酸,从而说明该细胞能够合成莫纳甜或其盐。在一个实施方式中,细胞是丙酮酸营养缺陷型,在细胞中通过代谢碳/能源产生丙酮酸。在其它实施方式中,该细胞含有破坏的pykA和pykF基因。
而且,本发明的特征是鉴定能够由色氨酸合成莫纳甜或其盐或2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其盐或其组合的细胞的方法,该方法包括:(a)在不存在色氨酸而存在莫纳甜或其盐、2-羟基2(吲哚-3-基甲基)4-酮戊二酸或其盐或其组合的情况下培养色氨酸营养缺陷型细胞;和(b)测试色氨酸营养缺陷型细胞的生长,其中细胞生长说明该细胞能够从莫纳甜或其盐,2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸或其盐或其组合合成色氨酸,从而说明该细胞能够由色氨酸合成莫纳甜或其盐或2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸或其盐或其组合。
本发明的特征还有产生莫纳甜或其盐的方法,该方法包括:(a)在培养基中培养微生物,其中该微生物选自苜蓿中华根瘤菌、***丛毛单胞菌、稻草假单胞菌和谷氨酸棒杆菌;和(b)从培养基或培养的微生物中提取莫纳甜或其盐。在一些实施方式中,该微生物未经遗传修饰。在其它实施方式中,培养基是PHB培养基。培养基也可包括色氨酸、丙酮酸、非离子去污剂、青霉素、青霉素衍生物或其组合。在一些实施方式中,该微生物是苜蓿中华根瘤菌或***丛毛单胞菌。在其它实施方式中,该微生物是***丛毛单胞菌,和/或培养基还含有色氨酸和丙酮酸。在其它实施方式中,培养基是TY培养基。培养基也可包含色氨酸、丙酮酸或其组合。
除非另有定义,本文所用的所有技术和科学术语的涵义与本发明所涉及技术领域的普通技术人员所通常理解的相同。虽然在实践本发明的过程中可采用与本文所述内容相似或相同的方法和材料,但下面描述了合适的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都被全文纳入作为参考。在冲突情况下,本说明书,包括定义将控制(本发明范围)。此外,材料、方法和实施例仅为示范性,不旨在限制。
通过以下详述和所附权利要求书将明白本发明的其它特征和优点。
附图说明
图1显示用于生成莫纳甜和/或吲哚-3-丙酮酸的生物合成途径。一种途径通过色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸,而另一种通过吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。随后通过MP中间体生成莫纳甜。
框中所示化合物是底物和生物合成途径中生成的产物。
与箭头相邻的组合物是辅因子或可在底物转化成产物期间使用的反应物。所用辅因子或反应物取决于生物合成途径的特定步骤使用的多肽。辅因子PLP(吡哆醛5′-磷酸)能催化不依赖于多肽的反应,因此仅提供PLP可从底物进行到产物。
图2是使用MP中间体的生物合成途径的更详细图。框中显示了途径中各步骤的底物。便于底物间转化的多肽列于底物间的箭头附近。各多肽通过其常用名称和酶分类(EC)号描述。
图3显示将吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸的生物合成途径的更详细图。框中显示了底物,和便于底物间转化的多肽列于底物间的箭头附近。各多肽通过其常用名称和酶分类(EC)号描述。
图4显示一种经化学方法产生MP的可能反应。
图5A和5B是色谱图,显示酶法生成的莫纳甜的LC/MS鉴定。
图6是酶法合成的莫纳甜的电喷射质谱。
图7A和7B是酶混合物中生成的莫纳甜的LC/MS/MS子离子分析色谱图。
图8是色谱图,显示酶法生成莫纳甜的高分辨质谱测量。
图9A-9C是色谱图,显示(A)R-色氨酸、(B)S-色氨酸和(C)酶法生成莫纳甜的手性分离。
图10是柱状图,显示IPTG诱导后细菌细胞中生成的莫纳甜的相对量。(-)表示不加入底物(不加入色氨酸或丙酮酸)。
图11-12是示意图,显示用于增加莫纳甜产量的途径,莫纳甜产生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
图13是示意图,显示能用于增加莫纳甜产量的途径,莫纳甜产生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
图14是描述遗传修饰的大肠杆菌7692和BW25113细胞中丙酮酸产量增加的图。
图15是描述在过量产生丙酮酸的培养基中生长的遗传修饰的大肠杆菌7692和BW25113细胞中丙酮酸产量增加的图。
图16是从***丛毛单胞菌(ATCC 49249)中克隆的proA基因的核酸序列。
图17是由来自***丛毛单胞菌(ATCC 49249)的基因编码的ProA醛缩酶多肽的氨基酸序列。
序列表
所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列是用标准字母缩写(核酸碱基)和三字母编码(氨基酸)表示的。只显示各核酸序列的一条链,但参照所示链应理解包括互补链。
SEQ ID NO:1和2分别列出来自苜蓿中华根瘤菌的转氨酶(tatA基因,在文献中称为酪氨酸转氨酶或芳族转氨酶)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:3和4分别列出来自类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的酪氨酸转氨酶(2.4.1)(与tatA(SEQ ID NO:1和2)同源)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:5和6分别列出来自类球红细菌(35053)(新颖,根据2.4.1序列SEQID NO:3和4克隆)的转氨酶的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:7和8分别列出来自硕大利什曼原虫(Leishmania maior)的广谱底物转氨酶(bsat)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:9和10分别列出来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的芳族转氨酶(araT)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:11和12分别列出来自食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)的芳族转氨酶(araT)(通过同源性鉴定为芳族转氨酶)的新核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:13和14分别列出来自类球红细菌(35053)的多底物转氨酶(msa)(通过与登录号AAAE01000093.1,bp 14743-16155和登录号ZP00005082.1同源鉴定为多底物转氨酶)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:15和16列出用于克隆枯草芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶(dat)基因序列的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:17和18列出用于克隆苜蓿中华根瘤菌tatA序列的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:19和20列出用于克隆枯草芽孢杆菌araT转氨酶序列的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:21和22列出用于克隆类球红细菌(2.4.1和35053)多底物转氨酶序列的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:23和24列出用于克隆硕大利什曼原虫bsat序列的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:25和26列出用于克隆食淀粉乳杆菌araT序列的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:27和28列出用于克隆类球红细菌tatA序列(2.4.1和35053)的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:29和30列出用于克隆大肠杆菌aspC序列(基因序列Genbank登录号:AE000195.1,蛋白质序列Genbank登录号:AAC74014.1)的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:31和32分别列出来自大肠杆菌的芳族转氨酶(tyrB)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:33和34列出用于克隆大肠杆菌tyrB序列的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:35-40列出用于克隆具有4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(KHG)(EC4.1.3.16)活性的多肽的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:41和42列出来自大肠杆菌的色氨酸酶(tna)基因和来自弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)的酪氨酸-酚裂合酶(tpl)基因的核酸序列,它们分别编码蛋白质P00913(GI:401195)和P31013(GI:401201)。
SEQ ID NO:43-46列出用于克隆色氨酸酶多肽和β-酪氨酸酶(酪氨酸酚-裂合酶)多肽的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:47-54列出用于使色氨酸酶多肽和β-酪氨酸酶多肽突变的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:55-64列出用于克隆具有4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.17)活性的多肽的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:65和66列出来自***丛毛单胞菌的4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(proA)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:67-68列出用于在pET30 Xa/LIC中具有大肠杆菌aspC的操纵子中克隆***丛毛单胞菌4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(proA)的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:69-72列出用于在pESC-his中克隆大肠杆菌aspC和***丛毛单胞菌proA的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:73-74列出加到用于克隆本文所公开基因的引物5′端的核酸序列。
SEQ ID NO:75和76列出用于缩短aspC和proA基因之间的间插序列的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:77和78列出用于在pPRONco中克隆大肠杆菌tnaA的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:79和80列出用于在pPRONco中克隆大肠杆菌色氨酸操纵子(trpE、trpD、trpC、trpB、trpA基因)的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:81和82分别列出质粒pGX50(来自5-甲基色氨酸抗性细胞)的trpE基因的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NO:83和84列出用于将含有***丛毛单胞菌4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(proA)和大肠杆菌aspC的操纵子克隆到棒杆菌/大肠杆菌穿梭载体pEKEX-2中的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:85和86列出用于在大肠杆菌中产生pykA敲除的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:87和88列出用于在大肠杆菌中产生pykF敲除的引物的核酸序列。
SEQ ID NO:89列出来自食淀粉乳杆菌的芳族转氨酶(araT)的前十个氨基酸
(SEQ ID NO:12)。
详述
提供下列术语和方法的解释以更好地描述本说明书并指导本领域普通技术人员实践本发明。如本文所用,“含有”指“包括”。此外,单数形式也指复数,除非上下文另有明确规定。例如,提到“含有一种蛋白”包括一种或多种这样的蛋白,提高“含有细胞”包括一种或多种细胞和本领域技术人员已知的它的等价物,等等。术语“约”包括发生于任何测定中的实验误差的范围。除非另有说明,假定所有的测定数字前面都有“约”字,即使没有明显地使用“约”字。
cDNA(互补DNA):缺少内部非编码节段(内含子)和决定转录的调节序列的一段DNA。可在实验室中通过提取自细胞的信使RNA逆转录合成cDNA。
保守取代:生化特性相似的氨基酸残基中的一个或多个氨基酸取代(如2、5或10个残基)。保守取代一般对得到的多肽的活性影响小或无影响。例如,包含一个或多个保守取代的色氨酸转氨酶多肽理想地保持色氨酸转氨酶活性。可通过用,例如标准方法如定位诱变或PCR来操作编码该多肽的核苷酸序列来产生含有一个或多个保守取代的多肽。
取代变体是氨基酸序列中至少一个残基被去除,并在其位置中***了一个不同残基的变体。可用来取代蛋白质中原始氨基酸的并认为是保守取代的氨基酸的例子包括:用丝氨酸或苏氨酸取代丙氨酸;用谷胺酰胺、组氨酸或赖氨酸取代精氨酸;用谷氨酸、谷胺酰胺、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸取代天冬酰胺;用天冬酰胺、谷氨酸或谷胺酰胺取代天冬氨酸;用丝氨酸或丙氨酸取代半胱氨酸;用天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸或精氨酸取代谷胺酰胺;用天冬氨酸、谷胺酰胺、赖氨酸或精氨酸取代谷氨酸;用脯氨酸取代甘氨酸;用天冬酰胺、赖氨酸、谷胺酰胺、精氨酸、酪氨酸取代组氨酸;用亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸取代异亮氨酸;用异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸取代亮氨酸;用天冬酰胺、谷氨酸、谷胺酰胺、组氨酸、精氨酸取代赖氨酸;用异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸取代甲硫氨酸;用色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代苯丙氨酸;用苏氨酸、丙氨酸取代丝氨酸;用丝氨酸或丙氨酸取代苏氨酸;用苯丙氨酸、酪氨酸取代色氨酸;用组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸取代酪氨酸;用甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸取代缬氨酸。参见Ben-Bassat等(J.Bacteriol.169:751-7,1987),O’Regan等(Gene77:237-51,1989),Sahin-Toth等(Protein Sci.3:240-7,1994),Hochuli等(Bio/Technology 6:1321-5,1988),WO 00/67796(Curd等)或遗传学和分子生物学的标准教科书,以了解关于保守取代的更多信息。
外源性:在提到核酸和特定细胞时本文所用术语“外源性”指在天然情况下不是源自该特定细胞的任何核酸。因此,认为在引入细胞时,非天然存在的核酸对细胞来说是外源性的。对于特定细胞而言,天然存在的核酸也可以是外源性的。例如,当将分离自人X的细胞的整个染色体引入人Y的细胞时,它对Y的细胞来说是外源性核酸。在细胞中外源性核酸表达产生“外源性”蛋白。
功能等效:具有等效功能。在酶中,功能等效的分子包括保持酶功能的不同分子。例如,可通过酶序列中的序列改变来提供功能等效物,其中具有一个或多个序列改变的多肽保持了未改变多肽的功能(如酶活性)。在具体实施例中,色氨酸转氨酶功能等效物保持了将色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸的能力。
序列改变的例子包括但不限于:保守取代、缺失、突变、移码和***。在一个实施例中,给定多肽与抗体结合,功能等效物是与相同抗体结合的多肽。因此,功能等效物包括结合特异性与多肽相同的肽,可用作代替该多肽的试剂。在一个实施例中,功能等效物包括结合序列不连续、抗体与线性表位结合的多肽。因此,如果肽序列是MPELANDLGL(SEQ ID NO:12的氨基酸1-10)(SEQ ID NO:89),功能等效物包括不连续的表位,可以是(**=任何数量的间插氨基酸):NH2-**-M**P**E**L**A**N**D**L**G**L-COOH。在这个例子中,如果该多肽的三维结构使其可以结合能结合SEQ ID NO:12的氨基酸1-10的单克隆抗体,那么该多肽与SEQ ID NO:12的氨基酸1-10功能等效。
杂交:本文所用术语“杂交”指根据互补的单链DNA和/或RNA形成双链体分子的能力来测试两个核酸分子的核苷酸序列的互补性的方法。在本发明范围内,核酸杂交技术可用于获得分离的核酸。简要说,与SEQ ID NO:11所列序列或其部分有同源性的任何核酸可用作在中等至高度严谨条件下杂交鉴定相似核酸的探针。鉴定后,可纯化、测序并分析该核酸,以确定它是否在本发明范围内。
可通过Southern或Northern分析进行杂交来分别鉴定与探针杂交的DNA或RNA序列。可用生物素、洋地黄毒苷、多肽或放射性同位素如32P来标记探针。可以在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离待分析的DNA或RNA,转移到硝酸纤维素膜、尼龙膜或其它合适的膜上,用本领域熟知的标准技术用探针杂交,如Sambrook等(1989)《分子克隆》(Molecular Cloning),第二版,Cold Spring HarborLaboratory,Plainview,NY的第7.39-7.52节所述。探针的长度一般至少约20个核苷酸。例如,对应于SEQ ID NO:11所列20个毗连核苷酸序列的探针可用于鉴定相同或相似的核酸。此外,可采用长于或短于20个核苷酸的探针。
本公开也提供了长度至少约为12个碱基(如,长度至少约13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000或5000个碱基)并且在杂交条件下与具有SEQ ID NO:11所列核酸序列的正义或反义链杂交的分离核酸序列。杂交条件可以是中等或高度严谨的杂交条件。就本公开目的而言,中等严谨的杂交条件意味着在约42℃下在含有25mM KPO4(pH 7.4)、5×SSC、5X Denhart溶液、50μg/mL经超声处理的变性鲑精DNA、50%甲酰胺、10%葡聚糖硫酸酯和1-15ng/mL探针(约5×107cpm/μg)的杂交溶液中进行杂交,而在约50℃下用含有2×SSC和0.1%十二烷基硫酸钠的洗涤溶液进行洗涤。
高度严谨的杂交条件意味着在约42℃下在含有25mM KPO4(pH7.4)、5×SSC、5X Denhart溶液、50μg/mL经超声处理的变性鲑精DNA、50%甲酰胺、10%葡聚糖硫酸酯和1-15ng/mL探针(约5×107cpm/μg)的杂交溶液中进行杂交,而在约65℃下用含有0.2×SSC和0.1%十二烷基硫酸钠的洗涤溶液进行洗涤。
分离:在提及核酸时,本文所用术语“分离”指不与来源于天然存在的生物体基因组中直接毗连(一个在5′端,一个在3′端)的序列直接毗连的天然存在的核酸。例如,分离的核酸可以是,但不限于:在天然存在的基因组中,通常发现重组DNA分子侧翼的一个核酸序列被去除或不存在的任何长度的重组DNA分子。因此,分离的核酸包括但不限于:以独立于其它序列的分离分子(如用PCR或限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA以及掺入载体、自主复制的质粒、病毒(如逆转录病毒载体、腺病毒或疱疹病毒)或原核生物或真核生物的基因组DNA的重组DNA。此外,分离的核酸可包括作为杂交或融合核酸序列的一部分的重组DNA分子。当提及核酸时,本文所用术语“分离”也包括任何非天然存在的核酸,因为在自然中未发现非天然存在的核酸序列,且在天然存在的基因组中非天然存在的核酸序列不具有直接毗连的序列。例如,非天然存在的核酸如工程改造的核酸被认为是分离核酸。可用普通的分子克隆技术或化学核酸合成技术来制造工程改造的核酸。分离的非天然存在的核酸可以独立于其它序列,或掺入载体、自主复制的质粒、病毒(如逆转录病毒载体、腺病毒或疱疹病毒)或原核生物或真核生物的基因组DNA。此外,非天然存在的核酸可包括作为杂交或融合核酸序列的一部分的核酸分子。
在例如,cDNA或基因组文库、或含有基因组DNA限制性消化物的凝胶片中,认为存在于几百至几百万其它核酸分子中的核酸不是分离核酸。
当提及多肽时,本文所用术语“分离”指以一些方式,例如从细胞中或从以前的环境中分离的多肽。分离多肽也可指以一些方式纯化的多肽。
核酸:本文所用术语“核酸”包括RNA和DNA,DNA包括但不限于cDNA、基因组DNA和合成(如化学合成)DNA。核酸可以是双链或单链核酸。其中单链核酸可以是正义链或反义链。此外,核酸可以是环形或线状。一个或多个核酸可存在于较大的核酸内。例如,编码醛缩酶多肽的核酸和编码转氨酶多肽的核酸可存在于较大的单一核酸内,如基因组DNA或质粒载体。或者,编码醛缩酶多肽的核酸和编码转氨酶多肽的核酸可存在于两个不同核酸,如两个不同质粒载体中。
操作性连接:当第一核酸序列与第二核酸序列发生功能性关系时,第一核酸序列“操作性连接”于第二核酸序列。例如,如果启动子影响编码序列的转录,将启动子操作性连接于编码序列。通常,操作性连接的DNA序列是毗连的,当需要时可将两个多肽编码区连接在相同的阅读框中。
过度表达:如果在细胞和/或微生物中产生的由特定核酸或基因编码的多肽的浓度高于相应的野生型或天然细胞和/或微生物中所产生的浓度,则细胞“过度表达”该特定核酸或基因。细胞可过度表达细胞中的外源性、重组或天然存在的(即天然)核酸或基因。例如,可通过在细胞中过度表达天然存在的核酸而在细胞中产生更高浓度的多肽,其中未遗传修饰编码多肽本身的核酸,但修饰或加入了指导核酸序列转录的启动子。术语“过度表达”也可涉及过度表达的蛋白质,即以高于相应野生型或天然细胞和/或微生物的浓度存在于细胞和/或微生物中的蛋白质。
多肽:多肽指与翻译后修饰无关的氨基酸链。
多肽修饰:本公开包括酶,及其合成实施方式。此外,本文所述方法可采用具有所需酶活性的类似物(非肽有机分子)、衍生物(用所公开的多肽序列为起点获得的化学功能化的多肽分子)和变体(同源物)。本文所公开的多肽包括可以是L-氨基酸和/或D-氨基酸,天然存在或非天然存在的氨基酸序列。
可通过各种化学技术修饰多肽,产生活性与未修饰多肽基本相同,并任选地具有其它所需特性的衍生物。例如,可以药学上可接受的阳离子盐,或酯化形成C1-C16酯,或转化成式NR1R2的酰胺的形式提供多肽的羧酸基团(羧基端或侧链),其中R1和R2各自独立地为H或C1-C16烷基或者结合形成杂环如5-元环或6-元环。多肽的氨基(氨基端或侧链)可以是药学上可接受的酸加成盐如盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、甲苯磺酸盐、顺丁烯二酸盐、酒石酸盐和其它有机盐形式,或可被修饰为C1-C16烷基或二烷基氨基或进一步转化为酰胺的形式。
可用熟知技术将氨基酸侧链的羟基转化为C1-C16烷氧基或转化为C1-C16酯。可用一个或多个卤原子如F、Cl、Br或I,或者用C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸及其酯或这种羧酸的酰胺来取代氨基酸侧链的苯基或酚环。氨基酸侧链的亚甲基可以延伸到同源的C2-C4亚烷基中。可用许多良好公认的保护基团中的任何一个,如乙酰胺基团来保护硫醇。本领域技术人员也将认识到将环结构引入本公开多肽中以选择和提供对结构的构象约束,导致稳定性提高。例如,可以向多肽加入C-末端或N-末端半胱氨酸,以致当氧化时,该多肽将含有二硫键,产生环状多肽。其它多肽环化方法包括形成硫醚以及羧基和氨基末端酰胺和酯。
肽模拟物和有机模拟物实施方式也是在本公开范围之内,这种肽模拟物和有机模拟物的化学组成的三维排列模拟肽骨架和成分氨基酸侧链的三维排列,导致此公开多肽的肽模拟物和有机模拟物具有可检测的酶活性。对于计算机建模应用而言,使药效团理想化,生物活性的结构要求的三维定义。用当前的计算机建模软件(用计算机辅助药物设计或CADD),可设计适合各药效团的肽模拟物和有机模拟物。参见例如Walters,《药物的计算机辅助建模》(Computer-Assisted Modeling of Drugs),刊于Klegerman和Groves(编),《制药生物技术》(Pharmaceutical Biotechnology),1993,Interpharm Press:Buffalo Grove,IL,第165-74页和第102章,Munson(编),《药理学原理》(Principles of Pharmacology),1995,Chapman和Hall,用于CADD技术的说明。用这些技术制备的模拟物也包括在本发明范围内。在一个实施例中,模拟物模拟酶或其变体、片段或融合所产生的酶活性。
探针和引物:可根据本文提供的氨基酸序列和核酸序列容易地制备核酸探针和引物。“探针”包括含有可检测标记或报道分子的分离核酸。示范性标记包括但不限于:放射性同位素、配体、化学发光剂和多肽(如酶)。例如,Sambrook等(编),《分子克隆:实验室手册》(《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual))第2版,第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y,1989,和Ausubel等(编)《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in MolecularBiology),Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(定期更新),1987中讨论了标记方法和适合各种目的的标记的选择指南。
“引物”一般是具有10个或更多个核苷酸的核酸分子(如具有约10-100个核苷酸的核酸分子)。引物可通过核酸杂交退火到互补靶核酸链上,在引物和靶核酸链之间形成杂交体,然后通过例如,DNA聚合酶多肽沿靶核酸链延伸。可通过例如,聚合酶链反应(PCR)或本领域已知的其它核酸扩增方法将引物对用于扩增核酸序列。
例如,在参考文献如Sambrook等(编),《分子克隆:实验室手册》(MolecularCloning:A Laboratory Manual)第2版,第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989;Ausubel等(编),《新编分子生物学实验指南》(CurrentProtocols in Molecular Biology),Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(定期更新),1987;和Innis等(编),《PCR方法:方法和应用指南》(PCR Protocols:A Guideto Methods and Applications),Academic Press:San Diego,1990中描述了探针和引物的制备和使用方法。例如,可通过用于此目的的计算机程序如Primer(0.5版,1991,Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,Mass.)从已知序列获得PCR引物对。本领域技术人员将理解,具体的探针或引物的特异性随长度而提高,但探针或引物的尺寸范围是序列全长到短至五个连续核苷酸的序列。因此,例如,20个连续核苷酸的引物可退火到具有特异性高于仅15个核苷酸的相应引物的靶上。因此,为了获得更大的特异性,探针和引物可选自例如:10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、3000、3050,3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450或更多个连续核苷酸。
启动子:指导核酸序列转录的核酸控制序列。启动子包括在转录起始位点附近的必需核酸序列,例如在聚合酶II型启动子的情况下的TATA元件。启动子可包括可位于距转录起始位点多达几千碱基对的远端增强子或阻抑元件。
纯化的:本文所用术语“纯化的”不要求绝对纯净;而打算作为相对术语。因此,例如,纯化的多肽或核酸制剂可以是主题多肽或核酸各自比在生物体的天然环境中的多肽或核酸的浓度高的多肽或核酸制剂。例如,如果制剂中多肽含量至少占总可溶性蛋白质含量的50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、98%或99%,那么可认为该多肽制剂是纯化的。
重组:“重组”核酸是一种具有(1)在表达它的生物体中不天然存在的序列或(2)由两种分离的、较短的序列人工组合而成的序列。常常用化学合成,更常见的是如用遗传工程技术人工操作核酸的分离节段来完成此人工组合。“重组”也用于描述已人工操作的,但含有与发现于分离出该核酸的生物体的调节序列和编码区相同的核酸分子。“重组”多肽是由重组核酸表达的多肽。
序列同一性:用序列之间的相似性,或称为序列同一性来表示氨基酸序列之间的相似性。常常通过同一性百分数(或相似性或同源性)来量度序列同一性;此百分数越高,两个序列越相似。当用标准方法比对时,多肽的同源物或变体,如SEQ ID NO:12具有相对较高的序列同一性。
用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法见:Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981;Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-53,1970;Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444-8,1988;Higgins和Sharp,Gene 73:237-44,1988;Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-3,1989;Corpet等,Nucleic Acids Research 16:10881-90,1988;和Altschul等,Nature Genet.6:119-29,1994。
可从几种来源获得NCBI局部序列比对基本检索工具(BLASTTM)(Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-10,1990),包括国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD)和Internet,与序列分析软件blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联合使用。
多肽变体一般的特征是经缺口blastp设置为默认参数的NCBI Blast 2.0进行氨基酸序列全长比对计算具有至少50%序列同一性。对于比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列而言,采用Blast2序列函数,用设置为默认参数的默认BLOSUM62矩阵,(存在缺口损失11,每残基缺口损失1)。当比对短多肽(少于约30个氨基酸)时,用Blast2序列函数,用设置为默认参数的PAM30矩阵(开放缺口9,延伸缺口罚分1)进行比对。当用此方法评价时,与参比序列相似性更大的多肽显示出同一性百分数提高,如序列同一性为至少80%、至少90%、至少95%、至少98%,甚至至少99%。当比较少于完整序列的序列同一性时,在10-20个氨基酸的短窗口中同源物和变体的序列同一性一般至少为80%,且序列同一性可以为至少85%、至少90%、至少95%或98%,这取决于它们与参比序列的相似性。在此短窗口中确定序列同一性的方法见Bethesda,Maryland的国家生物技术信息中心维护的网站。本领域技术人员将理解,提供这些序列同一性的范围仅是为了指导;完全可能获得在所提供范围之外的非常有效的同源物。
类似的方法可用于确定核酸序列的序列同一性百分数。在具体实施例中,比对同源序列与天然序列,通过计算两个序列中存在的相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量来确定匹配数量。通过将匹配数量除以鉴定序列(如SEQ ID NO:11)中所列序列长度,或除以分节长度(如来自鉴定序列中所列序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基),然后将得到的值乘以100来确定序列同一性百分数。例如,与SEQ ID NO:11所列序列比对时具有882个匹配的核酸序列与SEQ ID NO:11所列序列的同一性为75.0%(即(882÷1176)*100=75.0)。应注意,序列同一性百分数值四舍五入到最接近的十分之一。例如,75.11、75.12、75.13和75.14四舍五入到75.1,而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19四舍五入到75.2。也应注意,长度值总是整数。
特异性结合物:能够特异性结合于本文所述任何多肽的物质。例子包括但不限于:多克隆抗体、单克隆抗体(包括人源单克隆抗体)和单克隆抗体的片段如Fab、F(ab′)2和Fv片段以及能够特异性结合于这种多肽的表位的任何其它物质。
本文所提供的多肽的抗体可用于纯化或鉴定这种多肽。本文所提供的氨基酸和核酸序列可用于生产识别本文所述多肽的基于特异性抗体的结合物。
可生产多肽、部分多肽或其变体的单克隆或多克隆抗体。多肽抗原上产生抗一个或多个表位的抗体宜特异性检测该多肽。即,产生抗特定多肽的抗体将识别和结合该特定多肽,基本不会识别和结合其它多肽。通过许多标准免疫测定方法中的任何一种,如Western印迹(参见例如,Sambrook等(编),《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)第2版,第1-3卷,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)来确定抗体与特定多肽特异性结合。
为通过Western印迹测定给定抗体制剂(如在小鼠中产生的抗具有SEQ ID NO:12所列氨基酸序列的多肽的制剂)特异性检测合适的多肽(如具有SEQ ID NO:12所列氨基酸序列的多肽),从细胞中抽提细胞总蛋白,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
然后,可将分离的细胞总蛋白转移到膜(如硝酸纤维素)上,用抗体制剂孵育该膜。洗涤膜去除非特异性结合的抗体后,可用合适的偶联于多肽如碱性磷酸酶的第二抗体(如抗鼠抗体)检测存在的特异性结合的抗体,因为通过免疫定位的碱性磷酸酶应用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基蓝四唑鎓导致产生深蓝色化合物。
适合用作免疫原的基本纯的多肽可获自转染细胞、转化细胞或野生型细胞。通过,例如Amicon过滤装置浓缩将最终制剂中多肽浓度调整到几微克/微升的水平。此外,大小范围是全长多肽至少达9个氨基酸残基的多肽可用作免疫原。这种多肽可在细胞培养物中产生、可用标准方法化学合成或可通过将大多肽切割成可纯化的较小多肽而获得。在主要组织相容性复合体(MHC)分子如I型MHC分子或II型MHC分子的情况下,当呈递给免疫***时,长度少达9个氨基酸残基的多肽可具有免疫原性。因此,具有本文所公开的任何氨基酸序列的至少9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350或更多个连续氨基酸残基可用作生产抗体的免疫原。
可根据Kohler和Milstein的经典方法(Nature 256:495-7,1975)或其衍生方法从鼠杂交瘤制备本文所公开的任何多肽的单克隆抗体。
可通过用多肽(或其片段)免疫合适的动物来制备含有本文所公开任何多肽的异源表位的抗体的多克隆抗血清,该多肽可以是未修饰或经修饰提高免疫原性的多肽。免疫兔的有效方法可参见Vaitukaitis等(J.Clin.Endocrinol. Metab.33:988-91,1971)。
可用抗体片段代替整个抗体,并可在原核宿主细胞中容易地表达抗体片段。制造和使用单克隆抗体的免疫有效部分,也称为“抗体片段”的方法是熟知的,包括Better和Horowitz(Methods Enzymol.l78:476-96,1989)、Glockshuber等(Biochemistry29:1362-7,1990)、美国专利号5,648,237(“功能性抗体片段的表达”(Expression ofFunctional Antibody Fragments))、美国专利号4,946,778(“单多肽链结合分子”(SinglePolypeptide Chain Binding Molecules))、美国专利号5,455,030(“采用单链多肽结合分子的免疫疗法”(Immunotherapy Using Single Chain Polypeptide Binding Molecules))和其中引用的参考文献中描述的方法。
转化:“转化”细胞是通过例如分子生物学技术引入了核酸分子的细胞。转化包括可将核酸分子引入细胞的所有技术,包括但不限于:用病毒载体转染、接合、用质粒载体转化和通过电穿孔引入裸DNA、脂质转染和基因枪加速。
变体、片段或融合多肽:所公开的多肽包括其变体、片段和融合物。经工程改造,编码多肽(例如SEQ ID NO:12)、融合多肽或多肽片段或变体的DNA序列(例如SEQ ID NO:11)可在真核细胞、细菌、昆虫和/或植物中表达该多肽。为了获得表达,可改变DNA序列,且操作性连接于其它调节序列。将含有调节序列和多肽编码序列的最终产物称为载体。可将该载体引入真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞和/或植物细胞。引入细胞后,该载体可产生所述多肽。
融合多肽可包括连接于不抑制所需多肽活性(例如,将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸的能力)的其它氨基酸序列的多肽,如芳族转氨酶(例如,SEQ ID NO:12)。在一个实施例中,所述其它氨基酸序列的长度不超过约10、12、15、20、25、30或50个氨基酸。
本领域普通技术人员将理解,可用不影响编码多肽生物活性的许多方式改变DNA序列。例如,可用PCR在编码多肽的DNA序列中产生变异。这种变体可以是用于表达该多肽的宿主细胞中密码子偏好优化的变体,或促进表达的其它序列改变。
载体:将核酸分子引入细胞,产生转化细胞。载体可包括允许它在细胞中复制,如含有复制起点的核酸序列。载体也可包括一个或多个可选择标记基因和本领域已知的其它遗传元件。
生物合成途径概述
如图1-3和11-13所示,可用许多生物合成途径产生莫纳甜或其中间体如吲哚-3-丙酮酸或MP。对各底物(如葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和MP)向各产物(如色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、MP和莫纳甜)的转化,可采用几种不同多肽。而且,可在体内、体外、或通过体内反应和体外反应的组合,如包括无酶化学反应的体外反应来进行这些反应。因此,图1-3和11-13是示范,显示可用于获得所需产物的多种不同途径。
葡萄糖到色氨酸
许多生物体能从葡萄糖合成色氨酸。含从葡萄糖和/或色氨酸生成莫纳甜、MP和/或吲哚-3-丙酮酸所需基因的构建物可克隆入这种生物体中。本文显示色氨酸可转化成莫纳甜。
在其它例子中,用已知多肽改造生物体可产生色氨酸或过量产生色氨酸。例如,美国专利号4,371,614描述了用含野生型色氨酸操纵子的质粒转化大肠杆菌菌株。色氨酸操纵子基因包括编码多肽邻氨基苯甲酸合酶组分I(EC 4.1.3.27)、邻氨基苯甲酸合酶组分II(EC 4.1.3.27)、N-(5′-磷酸核糖基)邻氨基苯甲酸异构酶(EC 5.3.1.24)/吲哚-3-甘油磷酸合酶(EC 4.1.1.48)、色氨酸合酶、α亚基(EC 4.2.1.20)和色氨酸合酶、β亚基(EC 4.2.1.20)的色氨酸生物合成基因,它们都参与从分支酸产生色氨酸。
美国专利号4,371,614所述色氨酸的最大效价约为230ppm。类似地,WO 8701130描述遗传改造大肠杆菌菌株以生成色氨酸并讨论增加发酵生产的L-色氨酸。本领域技术人员认识到能从葡萄糖生成色氨酸的生物体也能利用其它可转化成葡萄糖或果糖-6-磷酸的碳源和能源,结果类似。示范性碳源和能源包括但不限于蔗糖、果糖、淀粉、纤维素或甘油。
提高色氨酸产量
在大多数生物体中色氨酸产量受到调节。一个机制是通过途径中某些酶的反馈抑制。例如,提高色氨酸的水平可导致色氨酸产率降低。因此,当采用工程改造的宿主细胞通过色氨酸中间体生产莫纳甜时,可用对色氨酸浓度不敏感的生物体。例如,可通过重复接触高浓度的5-甲基色氨酸来选择耐各种色氨酸类似物的生长抑制的长春花(Catharanthus roseus)植株,如下列文献所述(Schallenberg和Berlin,Z.Naturforsch,34:541-5,1979)。所得植株的色氨酸合酶活性受由于基因突变产生的产物抑制的影响小。
可用类似方法选择抗反馈的株。例如,可以通过在苯丙氨酸类似物、β-2-噻吩基丙氨酸、间-氟-D,L-苯丙氨酸和对-氟-D,L-苯丙氨酸上培养大肠杆菌菌株#7692(来自E.Coli Genetic Stock Center,W3110tnaA2trpEfbr19(Yanofsky等,J.Bacteriol.,158:1018-1024,1984;和Doolittle和Yanofsky,J.Bacteriol.,95:1253,1968))来选择抗反馈的aroG DAHP(3-脱氧-D-***庚酮糖-7-磷酸)合酶的突变体。此大肠杆菌菌株#7692可产生可测量量的色氨酸,可用作引入外源性核酸如编码醛缩酶和转氨酶的核酸的起始宿主。另一大肠杆菌菌株E971(ATCC 15491)是显示DAHP合酶水平升高以及吲哚和色氨酸水平比亲本菌株高的原养型菌株(Lim和Mateles,1964J.Bacteriol.,87:1051-1055)。该菌株可用于获得用生长培养基中的5-甲基色氨酸类似物降低了抗反馈的邻氨基苯甲酸合酶(EC 5.3.1.24)突变体。此菌株也可用作引入编码醛缩酶和转氨酶的外源性核酸的宿主。
可通过定向进化产生对产物抑制较不敏感的多肽来优化色氨酸产量。例如,可在培养基中不含色氨酸,但含有高浓度的不可代谢的色氨酸类似物的平板上进行筛选。美国专利号5,756,345、4,742,007和4,371,614描述了在发酵生物中提高色氨酸产量的方法。色氨酸生物合成的最后一步是将丝氨酸加在吲哚上。因此,提高丝氨酸的有效性来增加色氨酸产量。
色氨酸生物合成的控制点是DAHP合酶。此多肽的三种同工酶由以下基因编码:aroF、aroG和aroH,它们分别可被酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸反馈抑制。L-酪氨酸反馈抑制的DAHP合酶约占总酶活性的20%,L-苯丙氨酸反馈抑制的DAHP合酶约占总酶活性的80%,L-色氨酸抑制的DAHP合酶对总酶活性的贡献很小。得到的酶抗反馈的突变体可提供该控制点失调的株。通常,主要的抗反馈靶是aroG和aroF。
一种分离抗反馈突变体的方法是用化学诱变或紫外线诱变并选择在氨基酸类似物上可生长的生物体。可用类似物β-2-噻吩基丙氨酸获得对反馈不敏感的aroG(Duda和Sasvari-Szekely,(1973)Acta.Biochim.Biophys.Acad.Sci.Hung.8(2):81-90)。也可用类似物间-氟-D,L-苯丙氨酸(Ito等,(1990)Agric.Biol.Chem.,54(3):707-713)以及对氟苯丙氨酸(Hagino和Nakayama,(1974)Agr.Biol.Chem.,38(1):157-161)产生对反馈不敏感的aroG。
一种获得抗反馈的DAHP合酶的方法是用氨基酸类似物并产生天然基因已突变的株。另一方法是克隆编码抗反馈的酶的基因,它能提供更大弹性,并且用不同启动子可降低转录调节的可能性(Ito等,(1990)Agric.Biol.Chem.,54(3):707-713)。
色氨酸生物合成中另一调节点是分支点酶邻氨基苯甲酸合酶,在大肠杆菌中它是trpE和trpD编码的双组分蛋白。可用氨基酸类似物5-氟色氨酸和5-甲基色氨酸获得不受色氨酸反馈抑制的突变体(Shiio等,(1975)Agr.Biol.Chem.,39(3):627-635)。
此外,在乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)中可能出现色氨酸反馈抑制邻氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶和色氨酸合酶。然而,可使这些酶对抑制不敏感(Matsui等,(1987)J.Bacteriol.,169:5330-5332)。这种突变体可显示色氨酸水平升高,因此,预计它能提高莫纳甜水平。
细胞所用控制其合成色氨酸水平的其它方法包括在转录水平上调节。在谷氨酸棒杆菌中,酪氨酸在转录水平上调节DAHP合酶,通过操纵5′调节区来减轻此种调节可提高色氨酸生物合成(Shiio,1986,《氨基酸生产的生物技术》(Biotechnology ofAmino Acids Production),Aida,K.、Chibita,L.、Nakayama,K.、Takinami,K.和Yamada,H.编.Elsevier)。在大肠杆菌中,通过阻抑和弱化在转录水平上调节色氨酸(trp)操纵子,阻抑产生80倍变异和弱化产生6-8倍变异。阻抑蛋白的TrpR多肽的失活可提高trp操纵子mRNA的水平。前导肽形成mRNA二级结构,它响应于带电荷tRNAtrp水平。5′-调节弱化区的缺失可帮助克服此额外水平的调节(Yanofsky等,J.Bacteriol.,158:1018-1024,1984)。在枯草芽孢杆菌中也观察到色氨酸-RNA-结合弱化蛋白(TRAP)的弱化机制,通过下调或缺失编码它的基因减轻弱化可提高此宿主生物体中的色氨酸合成(Babitzke和Gollnick,2001,J.Bacteriol.,183:5795-5802)。或者,可上调抗-TRAP多肽的表达。
可通过在色氨酸途径中过度表达多肽来提高色氨酸产量,这可提高莫纳甜水平。例如,过度表达编码转酮酶的核酸、aroFfbr和aroL(编码莽草酸激酶)可提高色氨酸产量。然而,过度表达这些序列可引起对细胞的代谢负担,在极限培养基中,细胞可分泌出各种中间体。可用更富有营养的培养基来提高色氨酸水平(Kim等,2000,J.Microbiol.Biotechnol.,10(6):789-796)。此外,含有失调的DAHP合酶表达、失调的邻氨基苯甲酸合酶表达和编码磷酸核糖基转移酶的多拷贝质粒的谷氨酸棒杆菌细胞的色氨酸产量可增加到43g/L(Katsumata和Ikeda,(1993)Bio/Technology,11:921-9250)。
芳族氨基酸途径中受反馈和/或转录控制的其它酶包括莽草酸脱氢酶(由aroE编码)和莽草酸激酶I/II(由aroK、aroL编码)。诱变aroE基因可提供抗反馈的酶。AroK和aroL受酪氨酸的负转录控制。遗传操纵启动子区或缺失调节基因(trpR和tyrR)可减轻酪氨酸的控制。
苯丙氨酸和酪氨酸是芳族氨基酸,它们的生物合成可从色氨酸上转移碳,因为分支酸是所有三种芳族氨基酸的共同前体,并且是色氨酸代谢和苯丙氨酸/酪氨酸代谢之间的分支点。可去除或中断苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成途径,以降低分支酸消耗,这可通过遗传敲除编码分支酸变位酶/预苯酸(prephanate)脱氢酶的pheA或tyrA基因来完成。分支酸变位酶与邻氨基苯甲酸合酶(trpD和trpE基因产物)竞争可用的分支酸。中断或去除竞争性芳族氨基酸途径的示范性菌株包括大肠杆菌NRRL B12262(参见实施例15)、大肠杆菌NRRL B 12258、大肠杆菌SR250(Rothman和Kirsch,J Mol Biol.(2003)327,593-603)、谷氨酸棒杆菌ATCC 21847(参见实施例17)、谷氨酸棒杆菌ATCC 21850、谷氨酸棒杆菌ATCC 21851。或者,除去除苯丙氨酸和酪氨酸途径和需要将氨基酸加入培养基外,可克隆trpE基因(或整个色氨酸操纵子)并用异源启动子过度表达trpE基因,因为邻氨基苯甲酸合酶与分支酸的亲和力高于pheA或tyrA(Dopheide等,(1972)J.Biol.Chem.,247:4447-4452)。降低碳流到苯丙氨酸和酪氨酸的另一方法是修饰它们的转录控制。还有,催化色氨酸转化为吲哚和丙酮酸的色氨酸酶多肽的表达降低可帮助防止色氨酸丧失(Aiba等,Appl.Environ.Microbiol.,1982,43:289-297)。
在一个实施方式中,可以改造中心机制,以提高莫纳甜产量。如本文所述,为获得足够的莫纳甜产量,选择或得到的生物体应具有高于野生型生物体的速率生产色氨酸的能力。因为色氨酸不是最终产物,而是到莫纳甜途径中的中间体,所以开发不仅具有累积更高浓度的色氨酸能力,而且具有流量提高的菌株是至关重要的。可用多种方法来改造中心碳机制,以将碳转移到莽草酸和分支酸途径中,使得可以产生高水平的莫纳甜。
芳族化合物如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的生物合成中第一步是烯醇丙酮酸磷酸(PEP)和赤藓糖4-磷酸(E4P)缩合形成DAHP。可用各种方法提高各前体的有效性,并提高此第一反应的性能。以下五种方法是用于提高PEP有效性的可能的例子。
第一,可消除通过磷酸转移酶***(PTS)摄取葡萄糖对PEP的消耗。葡萄糖转运***的失活可产生葡萄糖负突变体。已分离PTS-葡萄糖+突变体。它们中一些通过半乳糖透性酶、葡糖激酶和ATP转运和磷酸化葡萄糖,不消耗PEP(Flores等,(1996)Nat.Biotechnol.,14:620-623;和Chen等,(1997)Biotechnol.Prog.,13:768-775)。葡萄糖透性酶***需要较大量的ATP来磷酸化葡萄糖。可通过加入编码葡萄糖易化子(facilitator)(由glf编码)、葡萄糖脱氢酶(由gdhIV编码)和葡糖酸激酶(由glk编码)的基因引入不同的葡萄糖转运和磷酸化***,它们也可导致PEP水平升高(WO99/55877)。此机制可产生葡糖酸6-磷酸,它是戊糖磷酸途径中的中间体,因此可提高此途径中的碳流并导致E4P水平升高。
第二,PEP消耗酶、PEP羧化酶(Ppc)和丙酮酸激酶(如PykA和PykB)的失活可增加可用的PEP库(Bongaerts等,(2001)Met.Eng.,3,289-300)。
第三,可通过提高PEP合酶(Pps)的表达将通过PTS或丙酮酸激酶形成的丙酮酸再循环回PEP中(Patnaik等,(1995)Biotechnol.Bioeng.,46:361-370;和Yi等,(2002)Biotechnol.Prog.,18:1141-1148)。
第四,可通过破坏csrA基因改变糖异生调节(碳贮存调节器),这可增加糖异生,影响参与PEP代谢、降低糖酵解和提高PEP水平的几种酶的调节(Tatarko等,(2001)Current Microbiol.,43(1):26-32)。
第五,可通过供给糖如不像葡萄糖,绕过PTS***转运入细胞的木糖来减少PEP消耗。
为了提高E4P的有效性,可过度表达编码转酮酶的tktA基因和/或编码转醛酶的talB基因。在将碳流导入芳族途径中表达转酮酶更有效(Liao等,(1996)Biotechnol.Bioeng.,52:129-140)。例如,具有修饰的戊糖磷酸途径的谷氨酸棒杆菌菌株可用来产生色氨酸(携带pKW9901的KY9218;Ikeda和Katsumata,Appl.Environ.Microbiol.,1999,65(6):2497-502)。
可采用这些方法的任何组合。例如,可将这些修饰中的几种组合起来应用于大肠杆菌菌株。在过度表达tktA的PTS-葡萄糖+、pykA、pykB菌株中,到芳族途径的碳流几乎提高了20倍(Gosset等,(1996)J.Ind.Microbiol.,17:47-52)。此外,可将这些方法可与其它修饰联用,以降低色氨酸生物合成途径中后来发生的瓶颈(如芳族途径的色氨酸分支中过度表达基因,缺失pheA和tyrA基因以避免分支酸消耗,过表达trpE和trpD以提高邻氨基苯甲酸的合成),从而增加色氨酸产量。所产生的色氨酸不需要在细胞中累积,因为它可进一步转化为产物如莫纳甜。
产生色氨酸,以及后来产生莫纳甜,可得益于引起丝氨酸生产途径中的改变。在生产色氨酸的最后一步中需要丝氨酸,最后一步包括丝氨酸与吲哚-3-甘油磷酸酯的反应。此反应由色氨酸合酶多肽催化。通过色氨酸途径的碳流增加可导致一些反应不平衡,出现新瓶颈。由于通过另一途径产生丝氨酸,所以其产率可成为色氨酸生产中的限制因素。可通过过度表达途径中的第一个基因来增加通过丝氨酸途径的碳流,该基因编码3-磷酸甘油酸脱氢酶(PDG;Ikeda等,(1994)Biosci.Biotech.Biochem.,58(4):674-678)。
提高丙酮酸产量
可通过增加宿主生物产生的丙酮酸量来提高由生物体产生的莫纳甜量。一种产生莫纳甜的途径基于吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸反应形成莫纳甜的4-酮酸衍生物。为了将此反应向前推进,能够将大量碳转移到丙酮酸的生物体用作生产莫纳甜的宿主。选择丙酮酸超产菌,它们不需要耐受高浓度的酸,但它们的代谢途径应失调,以使更多的碳转移到丙酮酸。某些酵母,如皮状丝孢酵母(Wang等,Lett.Appl.Microbiol.,35:338-42,2002)、脂解假丝酵母、酿酒酵母和光滑假丝酵母(以前称为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)(Li等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,57:451-9,2001)从葡萄糖过量产生丙酮酸(高达50g/L),可用于产生本文所述产物。
这些不同菌株的硫胺营养缺陷型在硫胺有限的条件下累积丙酮酸,因为硫胺依赖性丙酮酸脱氢酶(PDH)的活性降低损害了丙酮酸的氧化脱羧。硫辛酸是PDH的辅因子。同样,硫辛酸营养缺陷型,如大肠杆菌菌株W1485lip2(ATCC 25645;Kawasaki等,J.Ferment.Bioeng.,82:604-6,1996)可将丙酮酸累积到显著的程度(>25g/L)(Yokota等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,41:638-643,1994)。将F1-ATP酶缺陷基因引入W1485lip2菌株可进一步提高丙酮酸生产的速率和量。此突变导致细胞的能量产生有缺陷,此缺陷趋向于由提高通过糖酵解的碳流来补偿,因此产生更大量的丙酮酸(Yokota等,J.Ferment.Bioeng.,83:132-138,1997)。双突变菌株可用于产生过量产生几种氨基酸包括色氨酸(Kawasaki等,1996上述)、亮氨酸和缬氨酸(美国专利号5,888,783和6,214,591)的宿主菌株。
除了丙酮酸脱氢酶复合物中的突变以外,可通过去除或降低丙酮酸脱羧酶、丙酮酸铁氧还蛋白-氧化还原酶、丙酮酸黄素氧还蛋白氧化还原酶、丙酮酸-甲酸裂合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸合成酶和/或丙酮酸氧化酶的表达获得丙酮酸产量的进一步提高。参见例如,WO 03/000913。
过量产生丙酮酸的菌株中过度表达色氨酸酶基因可用于从吲哚产生色氨酸(Kawasaki等,1996,上述)。过量产生丙酮酸可提高色氨酸产量,也使形成莫纳甜前体的底物(丙酮酸和吲哚-3-丙酮酸)水平提高。或者,当采用色氨酸酶基因时,在存在过量铵的情况下可同时供给丙酮酸和吲哚。可用去污剂提高吲哚的溶解性,或者可连续供给吲哚以使毒性和沉淀减至最低程度。
色氨酸到吲哚-3-丙酮酸
可用一些多肽将色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸。示范性多肽包括但不限于酶种类(EC)2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1和2.6.1.21。这些种类包括但不限于称为色氨酸转氨酶的多肽(也称为L-苯丙氨酸-2-氧戊二酸转氨酶、色氨酸转氨酶、5-羟基色氨酸-酮戊二酸转氨酶、羟基色氨酸转氨酶、L-色氨酸氨基转移酶、L-色氨酸转氨酶、和L-色氨酸:2-氧戊二酸转氨酶),它将L-色氨酸和2-氧戊二酸转化成吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酰胺;D-色氨酸转氨酶,它将D-色氨酸和2-含氧酸转化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸;色氨酸脱氢酶(也称为NAD(P)-L-色氨酸脱氢酶、L-色氨酸脱氢酶、L-Trp-脱氢酶、TDH和L-色氨酸:NAD(P)氧化还原酶(脱氨)),它将L-色氨酸和NAD(P)转化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和NAD(P)H;D-氨基酸脱氢酶,它使D-氨基酸和FAD转化成吲哚-3-丙酮酸和NH3和FADH2;色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶(也称为L-色氨酸-α-酮异己酸转氨酶和L-色氨酸:苯基丙酮酸转氨酶),它将L-色氨酸和苯基丙酮酸转化成吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸;L-氨基酸氧化酶(也称为蛇氨基酸氧化酶和L-氨基酸:氧氧化还原酶(脱氨)),它使L-氨基酸和H2O和O2转化成2-含氧酸和NH3以及H2O2;D-氨基酸氧化酶(也称为蛇氨基酸氧化酶和D-氨基酸:氧氧化还原酶(脱氨)),它将D-氨基酸和H2O和O2转化成2-含氧酸和NH3以及H2O2;色氨酸氧化酶,它使L-色氨酸和H2O和O2转化成吲哚-3-丙酮酸和NH3以及H2O2。这些种类也含有酪氨酸(芳族)转氨酶、天冬氨酸转氨酶、D-氨基酸(或D-丙氨酸)转氨酶和有多种转氨酶活性的广(多底物)转氨酶,其中一些能使色氨酸和2-含氧酸转化成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸。
转氨酶种类中有这种活性的11个成员描述于下面的实施例1,包括SEQ IDNO:11和12所示的新转氨酶。因此,本发明提供分离的核酸和氨基酸序列,与分别在SEQ ID NO:11和12中所示序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或甚至至少99%的序列同一性。本发明也涵盖SEQ ID NO:11和12中所不片段和融合体,它们保持转氨酶活性或编码具有转氨酶活性的多肽。示范性片段包括但不限于至少10、12、15、20、25、50、100、200、500或1000个SEQ ID NO:11的毗连核苷酸或至少6、10、15、20、25、50、75、100、200、300或350个SEQ IDNO:12的毗连氨基酸。所示序列(和其变体、片段和融合体)可以是载体的一部分。载体能用于转化宿主细胞,从而生成重组细胞,重组细胞可从色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸,在一些例子中能进一步产生MP和/或莫纳甜。
L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)已知,序列可分离自一些不同来源,如地中海蝰(Viperalebetine)(sp P81375)、眼睛王蛇(Ophiophagus hannah)(sp P81383)、红口蝮(Agkistrodonrhodostonma)(sp P81382)、西部菱斑响尾蛇(Crotalus atrox)(sp P56742)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepaica)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、新月柄杆菌(Caulobactercresentus)、莱因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小鼠(Mus musculus)、丁香假单胞菌(P.Syringae)和红球菌属(Rhodococcus)菌株。此外,色氨酸氧化酶描述于文献且可分离自例如鬼伞属(Coprinus)SF-1、有根肿病的大白菜、拟南芥和哺乳动物的肝。
色氨酸脱氢酶已知,并可分离自例如菠菜、豌豆(Pisum sativum)、柔黄花牧豆树(Prosopis juliflora)、豌豆、牧豆树、小麦、玉米、番茄、烟草、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)和乳杆菌(Lactobacilli)。许多D-氨基酸脱氢酶基因序列已知。
如图11-13所示,如果用氨基酸氧化酶如色氨酸氧化酶使色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸,能加入过氧化氢酶以减少或甚至去除过氧化氢的存在。
吲哚-3-乳酸到吲哚-3-丙酮酸
将吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸的反应可通过各种多肽催化,如1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-或1.1.1.111多肽类的成员。1.1.1.110多肽类包括吲哚乳酸脱氢酶(也称为吲哚乳酸:NAD+氧化还原酶)。1.1.1.27、1.1.1.28和1.1.2.3类包括乳酸脱氢酶(也称为乳酸脱氢酶、乳酸:NAD+氧化还原酶)。1.1.1.222类包含(R)-4-羟苯基乳酸脱氢酶(也称为D-芳族乳酸脱氢酶、R-芳族乳酸脱氢酶和R-3-(4-羟苯基)乳酸:NAD(P)+2-氧化还原酶)且1.1.1.237类包含3-(4-羟苯基丙酮酸)还原酶(也称为羟苯基丙酮酸还原酶和4-羟苯基乳酸:NAD+氧化还原酶)。1.1.3.-类包含乳酸氧化酶,1.1.1.111类包含(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(也称为(S)-3-(咪唑-5-基)乳酸:NAD(P)+氧化还原酶)。可能这些种类中的一些多肽能从吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。
化学反应也可用于将吲哚-3-乳酸转化成吲哚-3-丙酮酸。这种化学反应包括能用一些方法完成的氧化步骤,例如:使用B2催化剂的空气氧化(China ChemicalReporter,13卷,28期,18页(1),2002),金属催化剂存在时稀释高锰酸盐和高氯酸盐或过氧化氢。
吲哚-3-丙酮酸到2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)
一些已知多肽能用于使吲哚-3-丙酮酸加一种三碳源(如丙酮酸)转化成MP。示范多肽种类包括4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17和4.1.2.-。这些种类包括碳-碳合酶/裂合酶,如催化2种羧酸底物缩合的醛缩酶。肽类EC 4.1.3.-是形成碳-碳键的合酶/裂合酶,使用含氧酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作为亲电体,而EC 4.1.2.-是形成碳-碳键的合酶/裂合酶,使用醛底物(如苯甲醛)作为亲电体。
例如,EP 1045-029中所述多肽(EC 4.1.3.16、4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶,也称为4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶、2-氧-4-羟基戊二酸醛缩酶或KHG醛缩酶)将乙醛酸和丙酮酸转化成4-羟基-2-酮戊二酸,多肽4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC4.1.3.17,也称为4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸-裂合酶或ProA醛缩酶)缩合2种酮酸如2个丙酮酸到4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸。本文描述利用这些裂合酶的反应。
图1-2和11-13显示这些反应的示意图,其中3-碳(C3)分子结合吲哚-3-丙酮酸。EC 4.1.2.-和4.1.3.-的许多成员,特别是利用PLP的多肽能使用C3分子,C3分子是氨基酸如丝氨酸、半胱氨酸和丙氨酸或其衍生物。由EC 4.1.2.-和4.1.3.-代表催化的醛醇缩合需要此途径的3个碳分子是丙酮酸或丙酮酸衍生物。然而,其它化合物能作为C3碳源且可转化成丙酮酸。可通过许多利用PLP的转氨酶来转氨以产生丙酮酸,包括许多上述的转氨酶。可通过β消除反应(如由色氨酸酶或β酪氨酸酶催化)获得丙酮酸和氨,反应用于L-丝氨酸、L-半胱氨酸、有足够离去基团的丝氨酸和半胱氨酸的衍生物,如O-甲基-L-丝氨酸、O-苄基-L-丝氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-丝氨酸和3-氯-L-丙氨酸。天冬氨酸可在PLP-介导的β-裂合酶反应中用作丙酮酸的来源,如色氨酸酶(EC 4.1.99.1)和/或β-酪氨酸酶(EC 4.1.99.2,也称为酪氨酸-酚裂合酶)催化的反应。通过在(4.1.99.1-2)多肽上进行定点诱变可增加β-裂合酶反应速率,如Mouratou等(J.Biol.Chem 274:1320-5,1999)和实施例5所述。这些修饰使多肽接受二羧基氨基酸底物。乳酸盐也能用作丙酮酸的来源,且通过加入乳酸脱氢酶和氧化辅因子或乳酸氧化酶和氧来氧化成丙酮酸。这些反应的例子在下文描述。例如,如图2和图11-13所示,当丙酮酸用作C3分子时,ProA醛缩酶能接触吲哚-3-丙酮酸。
MP到莫纳甜
MP到莫纳甜的转化可由下列1个或多个催化:色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)或更多转氨酶家族(2.6.1.-)的一般成员如天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、酪氨酸(芳族)转氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸转氨酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)转氨酶(图2)。转氨酶类的11个成员在下文描述(实施例1),包括SEQ ID NO:11和12所示新的种类成员,实施例4提供证明转氨酶和脱氢酶活性的反应。
此反应也能用化学反应进行。酮酸(MP)胺化通过还原性胺化用氨和氰基硼氢化钠进行。
图11-13显示另外的多肽,它们能用于使MP转化成莫纳甜,以及提供增加来自吲哚-3-丙酮酸或色氨酸的莫纳甜产量的方法。例如,如果天冬氨酸用作氨基供体,天冬氨酸转氨酶能用于使天冬氨酸转化成草酰乙酸(图11)。草酰乙酸通过脱羧酶(如草酰乙酸脱羧酶)转化成丙酮酸和二氧化碳(图11)。此外,如果赖氨酸用作氨基供体,赖氨酸ε转氨酶可用于使赖氨酸转化成ε-醛基赖氨酸(图12)。ε-醛基赖氨酸自发转化成1-哌啶6-羧酸盐(图12)。如果能催化还原性胺化反应的多肽(如谷氨酸脱氢酶)用于将MP转化成莫纳甜,可使用能再循环NAD(P)H和/或产生挥发性产物的多肽,如甲酸脱氢酶。
提高莫纳甜产量的其它方法
可用于提高莫纳甜产量的具有遗传修饰的菌株的其它例子包括:
1)大肠杆菌AGX1757,可分离自W3110(具有质粒βSC101+trpI的trpAE1、trpR、tnaA)。可进行NTG诱变,选择6-氟色氨酸或5-甲基色氨酸抗性。可通过加入普朗尼克(Pluronic)L-61使色氨酸或莫纳甜在培养基中结晶以提高产率。
2)谷氨酸棒杆菌KY9225衍生自Px-115-97,显示苯丙氨酸和酪氨酸双营养缺陷型,并含有耐色氨酸抑制的邻氨基苯甲酸合酶。
3)诱变乳发酵短杆菌1041 trpE,使其对色氨酸反馈抑制脱敏感。发现该基因具有被精氨酸所取代的丝氨酸残基。发现推定弱化子内终止子结构中鸟嘌呤突变成腺嘌啉也减轻转录调节(Matsui等,(1987)J.Bacteriology,16:5330-5332)。
可用于使前体的有效性最优化和使莫纳甜产量最大化的其它修饰包括但不限于:(1)缺失编码有助于莫纳甜摄取的多肽的基因,(2)缺失或下调编码参与竞争途径的多肽的基因,(3)上调醛缩酶和转氨酶多肽表达,(4)缺失编码产生莫纳甜的不正确形式的转氨酶多肽的基因,和(5)提高PLP有效性。编码有助于莫纳甜摄取的多肽的基因可包括枯草芽孢杆菌天冬氨酸摄取转运蛋白(YveA;Lorca等,2003,J.Bacteriol.,185(10):3218-22),Glt-1 L-谷氨酸/L-天冬氨酸/D-天冬氨酸摄取多肽(协同转运子)和谷氨酸棒杆菌gluA、B、C、D谷氨酸摄取基因。编码参与竞争途径的多肽的基因可以是tnaA基因(编码色氨酸酶多肽),除非吲哚用作产生色氨酸的底物。
设计生物合成途径中的另外考虑
取决于哪种多肽用于产生吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫纳甜,能提供辅因子、底物和/或另外多肽给生产细胞以增强产物形成。此外,可设计遗传修饰来提高吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫纳甜等产物的产量。类似地,使用宿主细胞可使莫纳甜生产最优化。
如本文所述,任何生物如大肠杆菌和其它肠杆菌科(如克氏杆菌属、泛菌属和欧文氏菌属菌株)、谷氨酸棒杆菌、短杆菌菌株、杆菌菌株和酵母菌株可用于产生产物如吲哚-3-丙酮酸、MP和/或莫纳甜。例如,可对经改造从邻氨基苯甲酸过量产生色氨酸(导致许多有疑问的副产物)的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌进行修饰,以有效生成产物。此外,产生谷氨酸的野生型黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和谷氨酸棒杆菌菌株经修饰能有效产生其它氨基酸如赖氨酸。T.Oka,“氨基酸,生产工艺”(Amino Acids,Production Processes),刊于《生物工艺技术百科全书:发酵、生物催化和生物分离》(Encyclopedia of Bioprocess Technology:Fermentation,Biocatalysis,and Bioseparation),M.C.Flickinger和S.W.Drew编,JohnWiley和Sons,Inc.New York,第89-100页。此外,可选择或设计本文所述生物体,使其(1)具有有利的生长动力学,使它们可以在低成本基质上生长,(2)分泌产物如莫纳甜,和/或(3)使莫纳甜的前体如色氨酸和丙酮酸的水平提高。可用易获得的遗传学工具从良好表征的物种产生这种生物体,和/或这种生物体具有安全地用于产生食品成分的历史。
1.去除过氧化氢
过氧化氢(H2O2)是一种产物,如果产生,可对生产细胞有毒、并可损害多肽或产生的产物(如中间体)。上述L-氨基酸氧化酶产生H2O2作为产物。因此,如果使用L-氨基酸氧化酶,能去除所得H2O2或其水平减少以降低对细胞或产物的潜在损伤。
过氧化氢酶能用于降低细胞中的H2O2水平(图11-13)。生产细胞可表达编码过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)的基因或cDNA序列,此酶催化过氧化氢分解成水和氧气。例如,过氧化氢酶可从转染入生产细胞的载体中表达。能使用的过氧化氢酶例子包括但不限于:tr|Q9EV50(木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus))、tr|Q9KBE8(耐盐杆菌)、tr|Q9URJ7(白色念珠菌)、tr|P77948(天兰色链霉菌)、tr|Q9RBJ5(野油菜黄单胞菌)(SwissProt登录号)。使用L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶或色氨酸氧化酶的生物催化反应器也能包含过氧化氢酶多肽。
2.吡哆醛5′-磷酸(PLP)有效性的调节
如图1所示,PLP可用于本文所述1个或多个生物合成步骤。能补充PLP浓度,从而PLP不成为对反应总效率的限制。
已充分研究大肠杆菌中维生素B6(PLP的前体)的生物合成途径且已结晶一些蛋白(Laber等,FEBS Letters,449:45-8,1999)。其它代谢途径中需要2个基因(epd或gapB和serC),而3个基因(pdxA、pdxB和pdxJ)是吡哆醛磷酸生物合成独有的。大肠杆菌途径中的起始物质之一是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。从共同的2和3碳中心代谢物合成此前体是由多肽1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DSX)催化的。其它前体是从4-碳糖,D-赤藓糖4-磷酸形成的苏氨酸衍生物。转化到磷酸-4-羟基-L苏氨酸(HTP)所需的基因是epd、pdxB和serC。形成PLP的最后一个反应是DXP与HTP间的复杂分子内缩合和闭环反应,由pdxA和pdxJ的基因产物催化。
如果PLP成为发酵生产莫纳甜期间的限制营养物,可增加1个或多个途径中的基因在生产宿主细胞中的表达来提高莫纳甜产量。宿主生物体可包含多拷贝的天然途径基因,或非天然途径基因的拷贝可掺入生物体的基因组中。另外,可在宿主生物体内克隆入多拷贝的拯救途径基因中。
在所有生物体中保守的1个拯救途径使各种维生素B6的衍生物再循环成活性PLP形式。参与此途径的多肽是pdxK激酶、pdxH氧化酶和pdxY激酶。过量表达1个或多个这些基因可增加PLP有效性。
可通过去除或阻抑宿主生物体中天然生物合成途径基因的代谢调节提高维生素B6水平。PLP阻抑参与黄杆菌属(Flavobacterium)菌株238-7中前体苏氨酸衍生物的生物合成的多肽。此细菌菌株无代谢控制,过量产生吡哆醛衍生物且能分泌多至20mg/L的PLP。以类似方式遗传操作产生莫纳甜的宿主生物体可增加PLP生成而不过度表达生物合成途径基因。
3.铵利用
通过制备更能利用的氨或去除水能驱动色氨酸酶反应趋向合成方向(从吲哚生成色氨酸)。还原性胺化反应如由谷氨酸氢化酶催化的反应,也能通过铵过量来驱动。
氨可作为碳酸或磷酸缓冲***中的碳酸铵或磷酸铵盐而得到。氨也能作为丙酮酸铵或甲酸铵提供。另外,如果反应偶联产生氨的反应如谷氨酸脱氢酶或色氨酸脱氢酶,可提供氨。加入EC 4.1.99.-的天然底物(酪氨酸或色氨酸)能产生氨,底物会水解成酚或吲哚、丙酮酸和NH3。通过酶水解其优选底物也能使增加的合成产物的产量超过正常平衡量。
4.除去声物和副产物
色氨酸经色氨酸转氨酶转化成吲哚-3-丙酮酸可不利地影响吲哚-3-丙酮酸的产率,因为反应生成谷氨酰胺并需要共底物2-氧戊二酸(α-酮戊二酸)。谷氨酰胺可引起转氨酶的抑制,反应会消耗大量共底物。此外,高谷氨酸浓度对下游分离过程有害。
多肽谷氨酸脱氢酶(GLDH)将谷氨酸转化成2-氧戊二酸,从而在反应中再循环共底物,反应由色氨酸转氨酶催化。GLDH也产生还原性等效物(NADH或NADPH),能用于在需氧条件下产生细胞所用能量(ATP)。通过GLDH利用谷氨酸也减少副产物形成。另外,反应产生氨,它能用作细胞的氮源或作为图1所示最后步骤中还原性胺化的底物。因此,过度表达GLDH多肽的生产细胞能用于增加产量和降低培养基和/或分离方法的成本。
在色氨酸到莫纳甜的途径中,如果使用来自适当酶类的转氨酶,步骤3的氨基供体(如谷氨酸或天冬氨酸)可反转化成步骤1所需的氨基受体(如2-氧戊二酸或草酰乙酸)。使用此途径的2种独立的转氨酶能提高此途径的效率,其中1种转氨酶的底物非竞争性抑制其它转氨酶的活性。
所述途径中的许多反应是可逆的,因此可达到底物和产物间的平衡。可通过从多肽中连续取出产物来增加途径的产量。例如,用通透酶或其它转运蛋白使莫纳甜分泌入发酵液,或者从生物催化反应器流中选择性结晶莫纳甜并伴随底物再循环会提高反应产量。
另一种增加反应产量的方法是通过另外的酶反应或通过氨基供体基团的取代来去除副产物。例如,可产生不能在反方向中反应的副产品,或通过相变(例如终产物的沉淀)或通过自发转化成挥发性终产物如二氧化碳实现。
5.底物库的调节
可通过增加色氨酸前体生成和/或改变包括吲哚-3-丙酮酸和/或色氨酸的分解代谢途径调节吲哚库。例如,可通过宿主细胞中编码EC 4.1.1.74的基因功能性缺失来减少或去除从吲哚-3-丙酮酸生成吲哚-3-乙酸。可通过功能性缺失宿主细胞中编码EC4.1.99.1的基因减少或去除从色氨酸生成吲哚。另外,过量吲哚能用作体外或体内过程中的底物,结合增加量的编码EC 4.1.99.1的基因(Kawasaki等,J.Ferm.and Bioeng.,82:604-6,1996)。
此外,可进行遗传修饰以增加中间体,如D-赤藓糖4-磷酸和分支酸的水平。
6.控制手性
通过控制立体化学(手性)能改变莫纳甜的品尝描绘。例如,不同食物***的浓度不同的混合物中需要不同的莫纳甜异构体。手性可通过pH和多肽的组合控制。
通过α碳的去质子化和再质子化可在莫纳甜的C-4位置(见上面编号的分子)外消旋,这能通过pH变化或与酶(例如外消旋酶)结合或在溶液中游离的辅因子PLP反应来发生。在微生物中,pH不太可能变化到足以引起外消旋,但PLP是丰富的。控制多肽手性的方法取决于用于生成莫纳甜的生物合成途径。
当莫纳甜用图2所示途径形成时,可考虑下列各项。在生物催化反应中,碳-2的手性由酶确定,该酶将吲哚-3-丙酮酸转化成MP。多种酶(如来自EC 4.1.2.-、4.1.3.-)能使吲哚-3-丙酮酸转化成MP,因此可选择形成所需立体异构体的酶。另外,可用定向进化改变将吲哚-3-丙酮酸转化成MP的酶的对映特异性,或能改造催化抗体以催化所需反应。一旦生成MP(通过酶法或化学缩合),可用转氨酶立体特异性加入氨基,如本文所述的转氨酶。能产生碳-4的R或S构象,这取决于使用D-还是L-芳族酸转氨酶。大部分转氨酶优先与底物的L-异构体反应,然而,在某些植物中存在D-色氨酸转氨酶(Kohiba和Mito,《第8届国际维生素B6和羰基催化讨论会会议录》,日本大阪,1990)。此外,鉴定了D-丙氨酸转氨酶(2.6.1.21)、D-甲硫氨酸-丙酮酸转氨酶(2.6.1.41)、(R)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(2.6.1.61)和(S)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(2.6.1.22)。某些转氨酶优先与在C2碳具有特定构象的底物反应。因此,即使转化成MP不是立体有择的,可通过适当选择转氨酶控制终产物的立体化学。由于反应是可逆的,未反应MP(不需要的异构体)可再循环回到其组分且可再形成MP的外消旋混合物。
在发酵或全细胞生物催化生产途径(体内)中,由于与D-转氨酶相比,大量天然L-转氨酶有利于S,S或R,S莫纳甜的生产。如果R,R和/或S,R莫纳甜是所需的立体异构体,那么可能不得不敲除宽特异性和芳族L-转氨酶如AspC和TyrB,如在SR250菌株中(Rothman和Kirsch,J Mol Biol.(2003)327,593-603)。在这种情况下,生长培养基中可能需要苯丙氨酸和酪氨酸。在生产莫纳甜的途径中优选与色氨酸的L-异构体反应的L-色氨酸转氨酶可代替吲哚-3-丙酮酸生产,而最可能需要存在比野生型生物体更多量的优选与D-氨基酸反应的D-转氨酶(如D-丙氨酸转氨酶),以促进R,R或S,R莫纳甜的产生。
在一个实施方式中,在生物合成途径和/或细胞中产生富含立体异构体的莫纳甜混合物。“富含立体异构体的莫纳甜混合物”指该混合物含有一种以上莫纳甜立体异构体,且混合物中至少60%的莫纳甜立体异构体为一种特定的立体异构体,如R,R、S,S、S,R或R,S。其它实施方式中,混合物中一种特定的莫纳甜立体异构体的含量大于65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。“富含立体异构体的”R,R莫纳甜指含有至少60%R,R莫纳甜的莫纳甜。“富含立体异构体的”S,S莫纳甜指含有至少60%S,S莫纳甜的莫纳甜。其它实施方式中,“富含立体异构体的”莫纳甜含有大于65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的R,R或S,S莫纳甜。
在其它实施方式中,主要在生物合成途径和/或细胞中产生S,S或R,R莫纳甜。“主要”指在生物合成途径和/或细胞中产生的莫纳甜立体异构体中,该莫纳甜所含有的一种特定立体异构体大于90%。一些实施方式中,所产生的莫纳甜基本不含R,S或S,R莫纳甜。“基本不含”指在生物合成途径和/或细胞中产生的莫纳甜立体异构体中,该莫纳甜立体异构体所含的一种特定立体异构体少于2%。此外,或另选的,当用来描述在生物合成途径和/或细胞中产生的莫纳甜时,“基本不含”包括在生物合成途径中作为副产物产生的一定量的立体异构体(如R,S莫纳甜),所述生物合成途径涉及手性特异性酶(如D-氨基酸脱氢酶或D-氨基酸转氨酶)和/或手性特异性底物(例如在R立体构型中具有一个碳)以产生不同的特定立体异构体(如R,R莫纳甜)。
7.激活底物
磷酸化底物如磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)可用于本文所示反应。磷酸化底物可在能量上更有利,因此可用于增加反应速度和/或产量。在醛醇缩合中,加入磷酸基团稳定亲核底物的烯醇互变异构体,使它更具反应性。在其它反应中,磷酸化底物通常提供更好的离去基团。类似地,可通过转化成CoA衍生物或焦磷酸盐衍生物激活底物。
8.分泌产物
微生物可产生氨基酸。例如,棒杆菌(Corynebacteria)和短杆菌(Brevibacteria)可产生各种氨基酸如谷氨酸、组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸,而泛菌(Pantoea)、欧文氏菌(Erwinia)、克氏杆菌(Klebsiella)、成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和液化沙雷氏菌(Serratialiquefacience)可产生谷氨酸。此外,微生物可分泌有机酸和氨基酸。例如,芽孢杆菌(Bacillus)和乳酸杆菌(Lactobacillus)可分泌有机酸如乳酸和乙酸,而棒杆菌和短杆菌可分泌许多(如果不是全部)它们产生的氨基酸。
可分泌氨基酸的生物通常因为以下两个原因之一而这样做:(1)它们利用多肽作为碳源和能源,但不能分解代谢特定氨基酸,或(2)可分泌带电荷氨基酸作为应激反应,以控制pH或渗透压。例如,野生型棒杆菌不会组成性地***谷氨酸。几种条件可能与触发谷氨酸输出有关,如氧戊二酸脱氢酶活性水平、存在特定输出蛋白、细胞外被膜状态,通过改变化学势或调节来逆转摄取过程和应激。
培养基组成和生长条件可影响细胞外被膜状态。通常,肽聚糖(细胞壁和胞壁质)不是转运的屏障,但在棒杆菌和谷氨酸的情况下是例外。加入青霉素或青霉素衍生物如氨苄青霉素或羧苄青霉素似乎有助于谷氨酸流出,尤其在棒杆菌中。青霉素和青霉素衍生物如氨苄青霉素和羧苄青霉素是β-内酰胺类抗生素,抑制末期由转肽酶催化的细胞壁交联的合成。它们也抑制称为青霉素结合蛋白、是大肠杆菌棒状结构和***期间形成隔膜所必需的酶。
也可涉及细胞膜的流动性。例如,更多饱和脂肪酸的存在可降低流动性和流出量。限制生物素和加入表面活性剂可影响流动性。升高温度、加入十二烷基乙酸铵、油酸营养缺陷型、甘油营养缺陷型中的甘油缺陷、加入去污剂如吐温60、加入局部麻醉剂、脂肪酸突变体、用溶菌酶敏感型突变体和应用电势可影响细胞膜/细胞壁的通透性。例如,质子动力可能对分泌带电荷分子重要,与胞内pH相比,它受培养基pH的影响很大。
可用任何方法来提高膜流动性和产物分泌。例如,可将异烟酸酰肼(INH)加入培养物中以抑制分枝菌酸合成活性,这可导致膜流动性和产物分泌增加。此外,cspl(PSI-分枝菌酸转移酶(mycolyltransferase))失活可以将细胞壁结合的分枝菌酸含量降低50%,增加亲水底物的转运通过细胞外被膜。由于acp基因(参与分枝菌酸合成)的过度表达可抵消吐温60加入培养基的益处,可用下调该基因的方法来提高棒杆菌菌株的莫纳甜分泌。
谷氨酸棒杆菌细胞膜上的主要脂肪酸是油酸(18∶1)和棕榈酸(16∶0),具有少量或没有不饱和的脂肪酸。根据饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例和脂肪酸的长度,来自短杆菌和棒杆菌的不同脂肪酸合酶具有不同特性。棒杆菌具有用于脂肪酸合成的FAS I酶(酵母和哺乳动物体系)和FAS II酶(大肠杆菌和植物体系)。实际上,谷氨酸棒杆菌具有两种脂肪酸合酶I。操纵这些基因或表达这些基因可改变膜流动性。
脂肪酸合成和细胞生长需要生物素。限制生物素水平可降低油酸(或具有少量或没有不饱和的其它脂肪酸)水平的效果比它影响高度不饱和脂肪酸的效果更强,这使细胞膜流动性更高。为增加分泌,可下调或抑制含有生物素和合成磷脂所必需的乙酰辅酶A羧化酶多肽。此外,可用生物素拮抗剂,而不是限制生物素。例如,温度敏感型生物素抑制多肽(dtsR基因产物)可给予表面活性剂抗性和增进分泌。此外,可将编码温度敏感型生物素抑制多肽的核酸转化入棒杆菌,这可用来产生谷氨酸和赖氨酸(参见例如,美国专利申请公布20030077765)。
可将编码去饱和酶多肽的基因加入生物体,以提高膜流动性。在谷氨酸棒杆菌中,过度表达编码磷脂生物合成多肽如plsC、cma和cls的基因可用于增进谷氨酸分泌。
已知二十碳五烯酸(EPA)对膜流动性起重要作用(Hashimoto等,1999,Lipids,34:1297-1304),因此过量产生此聚不饱和脂肪酸有助于宿主生物的总流动性/转运特性。从海洋细菌(希瓦氏菌属(Shewanella))中成功克隆了38 kbp基因组DNA片段并在大肠杆菌中表达,导致产生EPA(Yazawa,1996,Lipids,31:S297-S300)。用于EPA合成的希瓦氏菌基因是市售的。也已知聚酮化合物合酶产生聚不饱和脂肪酸,这些酶的酶结构域存在于相同开放阅读框,如用于EPA生产的上述FAS相关基因那样。将这些基因簇克隆入宿主生物中可显著影响膜流动性和随后的产物流出量。
培养基可影响副产物的量和转运速率。在谷氨酸棒杆菌中,相对于乙酸和乳酸副产物,增加矿物质的量可以与NADPH、H+产生速率的提高相关的方式促进谷氨酸产生。碳源的选择也可影响NADPH与NADP+的比例,导致副产物形成和转运速率的改变。在培养基中存在高H+或其它带正电荷的离子如钠和钾可影响反向转运(流出)或同向转运(摄取)的速率。
谷氨酸/谷氨酰胺比例常常是细胞中氮(氨)的有效性的指征。在一些生物体中将谷氨酰胺用作从天冬氨酸产生天冬酰胺的氨供体。高水平谷氨酸可累积,这可预兆细胞分泌谷氨酸。同时,可在不同应激条件下将谷氨酸和其它阴离子分子转运进和转运出细胞。
在谷氨酸棒杆菌中,芳族氨基酸可共享共同转运***。发现摄取这些氨基酸有缺陷的菌株可用于产生氨基酸产量提高的菌株(Ikeda和Katsumata,(1995)iosci.Bioch.Biochem.,59:1600-1602)。
在一个实施方式中,可进行以下步骤来鉴定显示谷氨酸流出的生物体。可获得菌株如ATCC 13655和13058,它们被重新分类为谷氨酸棒杆菌。参见例如美国专利号3,128,237和3,002,889。可评价生物体以确定所产生的谷氨酸水平。然后,可测定各种条件如使用吐温、氨苄青霉素(或者青霉素或羧苄青霉素)和减少生物素的作用,以确定用于谷氨酸流出的最有效处理。如果检测到谷氨酸流出,那么可用该生物获得编码具有转运活性的多肽的基因。
细菌中的氨基酸流出多肽主要是质子动力驱动的。通常,这些是质子反向转运蛋白,但是当氨基酸分泌时可输入其它带正电荷的分子。输出带负电荷的分子应该不需要输入质子,因为它已经在电荷梯度的方向运行。因此,谷氨酸转运蛋白可以是单向转运蛋白,而不是反向转运蛋白。
可筛选任何生物的转运莫纳甜或谷氨酸的多肽。例如,可检测以下生物的莫纳甜或谷氨酸转运蛋白:(1)具有大量预测二级转运蛋白的生物体,如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和立克次氏体,(2)分泌谷氨酸的生物,如棒杆菌和短杆菌,(3)植物和豆科作物,包括植物如大豆、豌豆、花生和扁豆,(4)根瘤菌种类,和(5)耐酸性高的生物体,如乳酸菌、醋杆菌属(Acetobacter)菌株、克鲁维酵母菌属、酿酒酵母和黑曲霉(Aspergillus niger)。也可筛选生物体利用富含谷氨酸合成多肽或天然多肽(如GLURP,来自镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)富含谷氨酸的多肽或聚谷氨酸)作为唯一氮源的能力。这种生物具有分泌谷氨酸的能力,允许它们在高水平胞内谷氨酸的存在下存活,高水平胞内谷氨酸可能有毒,或可能对细胞渗透势造成不利影响。
可对不识别莫纳甜的转运蛋白多肽进行操作,产生识别莫纳甜的转运蛋白多肽。特别是,可用技术如选择方法来获得将莫纳甜识别为底物的转运蛋白多肽。例如,通过经典诱变使苯丙氨酸和酪氨酸调节基因突变并在大肠杆菌中筛选显示导致苯丙氨酸的产量和分泌的增加。
如果检测到促进色氨酸分泌的多肽,那么可敲除编码这些多肽的基因,以致在细胞内容易地获得色氨酸来产生莫纳甜,从而提高产量。此外,可在过量产生色氨酸的宿主细胞中表达编码色氨酸摄取多肽的基因,以致可将色氨酸用于莫纳甜生产,而不是分泌。这种基因包括MTR通透酶(色氨酸特异性转运蛋白)、TyrP(酪氨酸特异性转运蛋白)、TnaB(色氨酸特异性转运蛋白)(大肠杆菌)和AroP(芳族氨基酸摄取蛋白)。
9.遗传工具
在过去二十年中,已经为产生氨基酸的棒杆菌和短杆菌菌株开发了普通分子生物学工具如克隆载体和DNA转移方法。这些工具中的几种可用于操作生产谷氨酸和/或色氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株,使它们产生产物如莫纳甜。例如,当proA和aspC基因在谷氨酸棒杆菌菌株中过度表达时,可产生和分泌高水平的莫纳甜。
Kyowa Hakko Kogyo Co.的研究实验室对谷氨酸棒杆菌菌株进行遗传操作,以通过过度表达参与芳族氨基酸生物合成的几个基因来提高色氨酸产量。可从ATCC(目录号39019)得到该公司开发的穿梭载体pCE54。它具有多克隆位点,3个抗生素标记,以及棒杆菌/短杆菌的pCG2复制子和大肠杆菌的pMB1复制子。KyowaHakko开发的具有不同可选择标记的几种其它穿梭载体包括pCB101、pEthr1、pCG11和pCE53(美国专利号4,710,471;和Ikeda和Katsumata,(1999)App.Env.Microbiology,65:2497-2502)。
Eikmanns和Sahm小组构建了谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌的穿梭载体和表达载体家族(Eikmanns等,(1991)Gene,102:93-98)。这些载体基于棒杆菌pBL1和大肠杆菌ColE1的复制起点,具有多个限制性位点,携带卡那霉素或氯霉素抗性基因。可用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导其中两种载体,8.2kb的pEKEx1或pEKEx2载体。也存在启动子探针载体以测定启动子强度。
Sinskey和同事们开发了用于在棒杆菌中进行代谢工程的载体。他们的穿梭载体基于最初从谷氨酸棒杆菌和乳发酵棒杆菌(C.lactofermentum)中分离的pSR1(宿主范围广)、pBL1和pNG2质粒。它们包括偶联载体、转录分析载体、含有大肠杆菌tac启动子或tac启动子和获自fda-基因的棒杆菌启动子以及启动子探针载体的双表达载体(Jetten等,(1994)Ann.NY Acad.Sci.,721:12-29;和Jetten和Sinskey,(1995)Crit.Rev.Biotechnology,15:73-103)。
遗传工具也可用于真菌种类。参见例如Zhou等,(1994)Gene,142:135-40;Willins等,(2002)Gene,292:141-9;Hanic-Joyce和Joyce,(1998)Gene,211:395-400;和Barkani等,(2000)Gene,246:151-5。简要说,大多数球拟酵母属种类已经更名为假丝酵母,包括光滑球拟酵母。光滑假丝酵母是无性单倍体子囊菌真菌。它处于与酿酒酵母一样的目中,但不是所有的克隆工具都相容。例如,常见的mu自主复制序列(ARS)在光滑假丝酵母中不复制。不过,基于着丝粒(CEN)的酿酒酵母质粒pRS316可用于光滑假丝酵母。此外,URA3可用于光滑假丝酵母,作为营养缺陷型选择标记,存在的整合质粒可用于通过同源重组将序列***URA3基因座。
Genomics Therapeutics Corp.的研究人员设计了在光滑假丝酵母中起作用的表达载体(Willins等,(2002)Gene 292:141-149),它含有HIS3、ADE2和LEU2营养缺陷型。该载体也具有酿酒酵母CEN和ARS区。光滑假丝酵母的铜诱导的金属硫蛋白I(MT-1)启动子以及标准的新霉素和卡那霉素抗性基因可用于光滑假丝酵母。同样,高拷贝数的具有ADE2基因的载体在光滑假丝酵母中有功能,含有用作ARS的酿酒酵母线粒体(mt)DNA片段(Hanic-Joyce和Joyce,(1998)Gene 11:395-400)。
已构建用于光滑假丝酵母的大肠杆菌穿梭载体,它含有光滑假丝酵母CEN-ARS盒和大肠杆菌的lacZ编码序列(E1 Barkani等,(2000)Gene 246:151-155)。HIS3基因启动子和核糖体结合位点用于表达lacZ。也制成了MTII基因:lacZ报道基因融合物,以用铜区别诱导。
为其它假丝酵母菌株开发的方法,如酿酒酵母的FLP重组酶、分离启动子和选择标记、UV诱变技术和细胞通透法可用于光滑假丝酵母。此外,乙酸锂或电穿孔技术可用于转化假丝酵母种类。
在非重组生物体中产生莫纳甜和分离能够产生莫纳甜的生物体的筛选方法。
苜蓿中华根瘤菌,***丛毛单胞菌和稻草假单胞菌是具有4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶及芳族转氨酶活性的原核生物。因为这些生物体含有从色氨酸产生莫纳甜所必需的酶,所以它们不需要对其生物合成进行遗传修饰。编码醛缩酶和芳族转氨酶的基因是可诱导的,需要合适的生长条件(例如,在对羟基苯甲酸的存在下生长)来保证它们被诱导。4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶是假单胞菌和相关种类的原儿茶酸(protocatechuate)降解途径的一部分。谷氨酸棒杆菌也能够产生莫纳甜。虽然在此中生物中尚未鉴定到4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶,但它含有参与原儿茶酸降解的其它酶。
可通过在莫纳甜或莫纳甜前体(MP)作为唯一碳源的培养基上生长筛选来检测携带这些基因或可通过其它途径合成莫纳甜的其它生物。从色氨酸和丙酮酸产生莫纳甜或莫纳甜前体(MP)的反应都可逆。因此,筛选可将莫纳甜或莫纳甜前体(MP)转化为色氨酸或丙酮酸的细胞是可用于测试具有用于莫纳甜生产的酶的细胞的工具。可用色氨酸营养缺陷型(不能产生色氨酸并需要将色氨酸加入培养基以生长的细胞)完成该测试,确定细胞是否可在莫纳甜或MP上生长,这可能表明细胞将莫纳甜或MP转化为色氨酸。或者,可将细胞种板于莫纳甜、MP、莫纳甜类似物和/或MP类似物是主要碳源/能源的极限培养基上(如下所述)。为了存活(和生长成可见菌落),这些细胞必须将莫纳甜、MP、莫纳甜类似物和/或MP类似物转化为丙酮酸或中心代谢的其它成分。可通过例如,在琼脂平板上查找菌落形成或在液体培养物中与阴性对照相比查找生长的证据(如查看液体的光密度差异)来测试细胞生长。测试细胞可以是丙酮酸营养缺陷型(不能产生丙酮酸并需要培养基中有丙酮酸以生长的细胞),确定细胞是否可在莫纳甜、MP、莫纳甜类似物和/或MP类似物上生长。测试细胞可以是天然地含有用于莫纳甜生产的酶的野生型生物。一旦通过能够在平板上生长而鉴定为阳性测试细胞,例如,可从阳性测试细胞中纯化醛缩酶和/或转氨酶。
测试细胞也可以是重组细胞,它含有表达能够将莫纳甜或MP转化为色氨酸和/或丙酮酸的基因产物的基因。能够生长的细胞表明外源性基因编码可将莫纳甜或MP转化为色氨酸和/或丙酮酸的酶。用此方法筛选的条件需要:(1)该合成途径可逆,使得能够通过此途径代谢产物莫纳甜,和(2)该生物体具有能够输出莫纳甜或MP(或类似物)的转运***。用经典诱变技术可改进这些生物体中的效价。
以下实施例进一步描述了本发明,但它们不限制权利要求书所述的本发明范围。
实施例
实施例1
色氨酸转氨酶的克隆和表达
该实施例描述用于克隆色氨酸转氨酶的方法,它可用于使色氨酸转化成吲哚-3-丙酮酸。将基因克隆入pET 30 Xa/LIC载体中以产生具有可切割N末端HIS6-标记/T7-标记的融合蛋白。用固定金属亲和层析纯化得到的蛋白。
实验概述
11个编码转氨酶的基因克隆入大肠杆菌中。这些基因是枯草芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶(dat,Genbank登录号Y14082.1bp 28622-29470和Genbank登录号NP_388848.1分别为核酸序列和氨基酸序列)、苜蓿中华根瘤菌(也称为苜蓿根瘤菌)酪氨酸转氨酶(tatA,SEQ ID NO:1和2,分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌菌株2.4.1酪氨酸转氨酶(tatA通过同源性确定,SEQ ID NO:3和4,分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球细红菌35053酪氨酸转氨酶(通过同源性确定,SEQ ID NO:5和6,分别为核酸序列和氨基酸序列),硕大利什曼原虫广底物转氨酶(bsat,通过与来自墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)的肽片段的同源性确定,SEQ ID NO:7和8,分别为核酸序列和氨基酸序列)、枯草芽孢杆菌芳族转氨酶(araT,通过同源性确定,SEQ ID NO:9和10,分别为核酸序列和氨基酸序列)、食淀粉乳杆菌芳族转氨酶(araT,通过同源性确定,SEQ ID NO:11和12,分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌35053多底物转氨酶(通过同源性确定,SEQ ID NO:13和14,分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌菌株2.4.1多底物转氨酶(msa,通过同源性确定,Genbank登录号NZ AAAE01000093.1,bp 14743-16155和Genbank登录号ZP-00005082.1分别为核酸序列和氨基酸序列)、大肠杆菌天冬氨酸转氨酶(aspC,Genbank登录号AE000195.1bp 2755-1565和Genbank登录号AAC74014.1,分别为核酸序列和氨基酸序列)和大肠杆菌酪氨酸转氨酶(tyrB,SEQ ID NO:31和32,分别为核酸序列和氨基酸序列)。
克隆、表达和测试这些基因以及市售酶将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸的活性。所有十一个克隆都有活性。
鉴定可包含具有所需活性的多肽的细菌菌株
NCBI(全国生物技术信息中心)数据库中没有基因命名为色氨酸转氨酶。然而,鉴定了有此酶活性的生物体。在细胞提取物或从纯化蛋白中测量到L-色氨酸转氨酶(TAT)活性,来源如下:八花羊茅(Festuca octoflora)的根瘤菌分离物、豌豆线粒体和细胞溶质、向日葵冠瘿细胞、豌豆根瘤菌三叶草生物变种(R.leguminosarum biovartrifoli)、草生欧文氏菌石头花致病变种(E.herbicola pv.gypsophilae)、丁香假单胞菌萨氏致病变种(P.syringae pv.savastanio)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、生脂固氮螺菌(Azospirillum lipferum)、巴西固氮螺菌(A.brasilense)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、麦芽念珠菌(C.maltosa)、棕色固氮菌(A.vinelandii)、大鼠脑、大鼠肝、苜蓿中华根瘤菌、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CHA0、乳酸乳杆菌(L.Lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳杆菌(L.Helveticus)、小麦苗、大麦、金色菜豆(Phaseolus aureus)(绿豆)、葡萄状酵母(卡尔斯伯根糖酵母)、利什曼原虫属、玉米、番茄茎、豌豆植物、烟草、猪、生孢梭菌(C.Sporogenes)和灰色链霉菌(Streptomyces griseus)。
分离基因组DNA用于克隆
在TY培养基中,25℃、pH 7.2下培养苜蓿中华根瘤菌(ATCC号9930)。细胞生长至600nm处的光密度(OD600)为1.85,用2%接种物制备基因组DNA。用Qiagengenomic tip 20/G试剂盒(Valencia,CA)分离基因组DNA。
在Bereto营养肉汤(Difco;Detroit,MI)中,30℃下培养枯草芽孢杆菌6051(ATCC)。用Qiagen genomic tip 20/G法分离基因组DNA,作出以下改变:蛋白酶K和溶菌酶的浓度加倍,孵育时间增加2-3倍。
由IDI,Inc.(Quebec,Canada)提供溶于TE缓冲液(pH8.0)的硕大利什曼原虫ATCC 50122基因组DNA,17ng/μL。
用标准酚抽提制备类球红细菌2.4.1(由休斯敦得克萨斯大学的Sam Kaplan教授提供)、类球红细菌35053(ATCC号)和食淀粉乳杆菌基因组DNA。在对数生长晚期收获细胞,重悬于TEN缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.5,1mM EDTA,100mM NaCl),向每毫升细胞悬液中加入0.024mL月桂酰肌氨酸钠来裂解细胞。用等体积的TE缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.5,1mM EDTA)饱和酚抽提至少三次后,用氯仿∶辛醇9∶1抽提DNA溶液一次,用氯仿抽提三次。通过加入0.1倍体积的3M乙酸钠(pH6.8)和2倍体积的乙醇来沉淀DNA。离心收集沉淀物,用70%乙醇洗涤一次。最后,将DNA溶解于0.10mL蒸馏水中。
从菌株DH10B(Invitrogen)中分离大肠杆菌基因组DNA并用QiagenGenomic-tipTM(500/G)试剂盒制备。。从LB中生长到OD650为1.87的30mL该菌株中获得0.3mg纯化的DNA。将纯化DNA溶解于Qiagen洗脱缓冲液(EB),浓度为0.37g/μL。
聚合酶链反应流程
为pET 30 Xa/LIC载体(Novagen,Madison,WI)设计具有相容突出端的引物。pET载体在Xa/LIC位点的5′侧具有12个碱基的单链突出端,在Xa/LIC位点的3′侧具有15个碱基的单链突出端。该质粒设计用于不依赖连接的克隆,具有N末端His和S标记以及任选的C末端His标记。Xa蛋白酶识别位点(IEGR)正好在感兴趣基因的启动密码子的前方,以致可去除融合蛋白标记。
当设计引物时,将以下序列加入生物特异性序列的5′端:正向引物:5′GGTATTGAGGGTCGC(SEQ ID NO:73);反向引物:5′AGAGGAGAGTTAGAGCC(SEQ ID NO:74)。
枯草芽孢杆菌dat引物:N末端:
5′-GGTATTGAGGGTCGCATGAAGGTTTTAGTCAATGG-3′和C末端:
5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGAAATGCTAGCAGCCT3′(SEQ ID NO:15和16)。
苜蓿中华根瘤菌tatA引物:N末端:
5′-GGTATTGAGGGTCGCATGTTCGACGCCCTCGCCCG和C末端:
5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGAGACTGGTGAACTTGC(SEQ ID NO:17和18)。
枯草芽孢杆菌araT引物:N末端:
5′-GGTATTGAGGGTCGCATGGAACATTTGCTGAATCC和C末端:
5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAACGCCGTTGTTTATCG(SEQ ID NO:19和20)。
类球红细菌msa(2.4.1.和35053):N末端:
5′-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCGAGCCTCTTGCCCT和C末端:
5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGGGGAAGCTCCGGG(SEQ ID NO:21和22)。
硕大利什曼原虫bsat:N末端:
5′-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCACGCAGGCGGCCAT和C末端:
5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCACTCACGATTCACATTGC(SEQ ID NO:23和24)。
食淀粉乳杆菌araT:N末端:
5′-GGTATTGAGGGTCGCATGCCAGAATTAGCTAATGA和C末端:
5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATTCGTCCTCTTGTAAAA(SEQ ID NO:25和26)。
类球红细菌tatA(2.4.1和35053菌株):N末端:
5′-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCTCTACGACGGCTCC和C末端:
5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGCGCAGCACCTTGG(SEQ ID NO:27和28)。
大肠杆菌aspC:N末端:
5′-GGTATTGAGGGTCGCATGTTTGAGAACATTACCGC-3′和C末端:
5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3′(SEQ ID NO:29和30)。
大肠杆菌tyrB: N末端:
5′-GGTATTGAGGGTCGCGTGTTTCAAAAAGTTGACGC和C末端:
5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACATCACCGCAGCAAACG-3′(SEQ ID NO:33和34)。
用以下PCR流程扩增获自苜蓿中华根瘤菌(tatA)的基因。在50μL反应中,采用0.1-0.5μg模板,1.5μM各引物,0.4mM各dNTP,3.5 U Expand High FidelityTM聚合酶(Roche,Indianapolis,IN)和含有Mg的1X ExpandTM缓冲液。所用热循环程序包括在96℃热启动5分钟,然后29个以下步骤的循环:94℃30秒,55℃2分钟,72℃2.5分钟。29个循环后,将样品在72℃保持10分钟,然后储存于4℃。此PCR流程产生1199bp的产物。
用以下PCR流程扩增获自类球红细菌(msa和ratA)、食淀粉乳杆菌araT和芽孢杆菌araT的基因序列。在50μL反应中,加入0.1-0.5μg模板,1.5μM各引物,0.4mM各dNTP,3.5 U Expand High FidelityTM聚合酶和含有Mg的1X ExpandTM缓冲液。所用热循环程序包括在96℃热启动5分钟,然后是29个以下步骤的循环:94℃30秒,40-60℃1分钟45秒(梯度热循环仪)和72℃2分钟15秒。29个循环后,将样品在72℃保持10分钟,然后储存于4℃。
对于类球红细菌msa基因而言,42℃和48℃的退火温度产生多种产物,但产生一条约1464 bp的独特条带。对于食淀粉乳杆菌araT而言,42℃、48℃和56℃的退火温度产生单一产物,在1173bp处产生一条浓条带。对于枯草芽孢杆菌araT而言,40℃、45℃、50℃、55℃的退火温度从基因组DNA和菌落中产生单一产物(1173bp)。对于硕大利什曼原虫bsa而言,55℃的退火温度产生最洁净的产物(1239bp)。对于红细菌tatA基因而言,50-55℃的退火温度产生正确大小(1260bp)的洁净产物。对于大肠杆菌基因和枯草芽孢杆菌dat基因而言,采用55-60℃的退火温度,退火温度时间缩短到45秒。获得正确大小的洁净产物(大肠杆菌基因约1.3kb,dat基因850bp)。
克隆
用Qiagen凝胶抽提试剂盒(Valencia,CA)从0.8或1%TAE-琼脂糖凝胶中凝胶纯化PCR产物。通过与琼脂糖凝胶上的标准品比较来定量PCR产物,然后按照LigationIndependent Cloning(Novagen,Madison,WI)生产商推荐的方案用T4 DNA聚合酶处理。
简要说,在dGTP存在下,用1U T4 DNA聚合酶在22℃处理约0.2 pmol纯化的PCR产物30分钟。聚合酶从PCR产物的3′端去除连续的碱基。当聚合酶碰到鸟嘌呤残基时,该酶的5′至3′聚合酶活性抵消外切核酸酶活性,以有效防止进一步切除。这样建立的单链突出端与pET Xa/LIC载体相容。在75℃孵育20分钟使该聚合酶失活。
如Novagen所推荐地使该载体和处理的***物退火。在22℃下将约0.02pmol处理的***物和0.01pmol载体孵育5分钟,加入6.25mM EDTA(终浓度),重复上述22℃的孵育步骤。将退火反应(1μL)加入NovaBlueTM单个感受态细胞(Novagen,Madison,WI),冰上孵育5分钟。混合后,通过42℃热激30秒转化该细胞。将细胞在冰上放置2分钟,用250μL室温SOC回收,在37℃振荡(225rpm)30分钟。将细胞接种于含有卡那霉素(25-50μg/mL)的LB平板上。
用Qiagen离心小抽试剂盒纯化质粒DNA,通过XhoI和XbaI限制性消化筛选正确的***物。通过双脱氧链终止DNA测序法确证似乎具有正确***物的质粒序列。
SEQ ID NO:1-14和31-32显示重组转氨酶的核苷酸序列和相应的氨基酸序列,来自Genbank序列的任何改变是沉默的,或者在蛋白序列中产生保守取代。SEQ IDNO:11和12是新序列。
基因表达和测定
将序列分析确证的质粒DNA亚克隆入大肠杆菌表达宿主BLR(DE3)或BL21(DE3)(Novagen,Madison,WI)中。培养培养物,用Qiagen小抽试剂盒分离质粒,用限制性消化分析来确认同一性。
用BLR(DE3)和BL21(DE3)细胞中的食淀粉乳杆菌araT,枯草芽孢杆菌araT,和苜蓿中华根瘤菌tatA开始进行诱导。当培养物在含有卡那霉素(30mg/L)的LB中生长到OD600为0.5-0.8时进行时程研究,用1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导,在诱导后0、1、2和4小时取样。将来自2.0mL培养物的细胞重悬于0.10mL含有10%十二烷基硫酸钠、10%2-巯基乙醇和20%甘油的120mM Tris-HCl(pH6.8)中,在95℃加热10分钟,冷却,用0.10mL H2O稀释。将这些细胞总蛋白样品分成等份,用4-15%梯度凝胶进行SDS-PAGE分析。诱导2小时和4小时,以及BLR(DE3)和BL21(DE3)细胞间表达的蛋白量没有显著差异。
也通过将来自2mL培养物的细胞沉淀重悬于0.25mL含有0.25μL苯甲酸酶(benzonase)核酶的Novagen BugBusterTM试剂从4小时样品中制备细胞提取物,在室温下温和振荡孵育20分钟,16,000×g离心去除细胞碎片。将上清(细胞提取物)上样于4-15%梯度凝胶上,以分析细胞的可溶性蛋白质。
这3个克隆(食淀粉乳杆菌araT(SEQ ID NO:11和12)、枯草芽孢杆菌araT(SEQID NO:9和10)和苜蓿中华根瘤菌tatA(SEQ ID NO:1和2)显示出对应于正确大小(约45 kDa)的可溶性蛋白质。枯草芽孢杆菌araT基因产物以最高水平过度表达和/或该基因产物比其它两种基因产物更可溶解。
在随后的表达方法中,将来自阳性克隆的质粒DNA亚克隆入BL21(DE3)中,由于此宿主的生长特性更佳。当培养物在含有50mg/L卡那霉素的LB中生长时,当OD600达到约0.8诱导时,用1mM IPTG重复诱导。在37℃生长4小时后收获细胞,3000rpm离心10分钟(4℃),用TEGGP缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.0),0.5mMEDTA,100mg/L谷胱甘肽,5%甘油,含有Roche完全蛋白酶抑制剂混合物)洗涤,在-80℃乙醇中快速冷冻。
将样品重悬于5mL/g湿细胞重的BugBusterTM(Novagen)试剂中,其中含有5μL/mL蛋白酶抑制剂混合物组#3(Calbiochem-Novabiochem Corp.,San Diego,CA)和1μL/mL苯甲酸酶核酸酶。在室温下,在定轨摇床上孵育样品20分钟。通过在4℃下16,000×g离心20分钟去除不溶性细胞碎片。
用SDS-PAGE分析细胞提取物,用以下方法通过随后产生的吲哚-丙酮酸来测定色氨酸转氨酶活性。1mL反应在50mM四硼酸钠(pH8.5)、0.5mM EDTA、0.5mM砷酸钠、50μM吡哆醛磷酸盐、5mM α-酮戊二酸和5mM L-色氨酸中进行。通过加入无细胞提取物或纯化酶开始反应,在30℃孵育30分钟。加入20%TCA(200μL)终止反应,离心去除沉淀的蛋白质。测量327nm处的吸光度并与测定缓冲液中新鲜制备的吲哚-3-丙酮酸的标准曲线比较。也进行无底物色氨酸或用得自只用pET30a转化的克隆的无细胞提取物的对照反应。
由于在细胞提取物中天然大肠杆菌转氨酶有背景,按照生产商的方案(Novagen,Madison,WI),用具有His-结合柱体的固定金属亲和层析纯化各自含有与pET30氨基末端HIS6-标记/S-标记融合的转氨酶蛋白的重组融合蛋白。融合蛋白的HIS6-标记序列与固定在基于IDA的His结合树脂上的Ni2+二价阳离子结合。洗脱馏分在PD-10(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)柱上脱盐,用50mM Tris,pH7.0洗脱。SDS-PAGE分析纯化的蛋白质,测定转氨酶活性。
用1mM IPTG在37℃诱导(4小时)得到的结果证明,硕大利什曼原虫bsat、苜蓿中华根瘤菌tatA、大肠杆菌aspC和类球红细菌tatA克隆都具有显著水平的色氨酸转氨酶活性。来自枯草芽孢杆菌的araT蛋白过度表达并可溶,但酶活性小。食淀粉乳杆菌araT基因产物似乎可溶解于细胞提取物,但用His结合柱体纯化仅产生少量分子量正确的蛋白。msa基因产物不可溶,又在24℃进行表达试验,以使包含体形成减至最低程度。用10μM和1mM之间几种浓度的IPTG使可溶性蛋白量增加至最大程度。
表1列出了比活,以每毫克蛋白每分钟形成的吲哚-3-丙酮酸(I3P)微克数表示。在一些情况下,很少量的重组蛋白就显示出该测定有效线性范围之上的高水平活性。在这些情况下,在比活数之前加上“>”。
表1
细胞提取物(CE)和纯化(P)以及市售酶中克隆的比活
比较所有克隆的重组蛋白的比对说明,在araT、tatA、bsat和msa序列之间没有许多高度保守区域。活性最高的重组蛋白:红细菌tatA基因产物同源物、硕大利什曼原虫宽底物转氨酶和苜蓿中华根瘤菌酪氨酸转氨酶的比对显示有几个保守区域,但它们在蛋白质水平仅约30-43%相同。广范围的D-特异性(D-丙氨酸)转氨酶的有效性在生产其它莫纳甜立体异构体中有用(参见实施例3和4)。
实施例2
用醛缩酶将吲哚-3-丙酮酸转化为2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸
该实施例描述的方法可用于将吲哚-3-丙酮酸转化成MP,使用醛缩酶(裂合酶)(图2)。醛醇缩合是在一种醛的β-碳或酮与另一种醛或酮的羰基碳间形成碳-碳键的反应。在一个底物的羰基相邻碳上形成碳负离子,并用作亲核体攻击第2个底物的羰基碳(亲电碳)。最通常地,亲电底物是醛,因此大部分醛缩酶属于EC 4.1.2.-类别。亲核底物通常是丙酮酸。醛缩酶不常催化2个酮酸或2个醛间的缩合。
然而,鉴定了催化2个羧酸缩合的醛缩酶。例如,EP 1045-029描述从乙醛酸和丙酮酸使用假单胞菌培养物(EC 4.1.3.16)生成L-4-羟基-2-酮戊二酸。此外,4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶,EC 4.1.3.17)能催化2个酮酸的缩合。因此,类似的醛缩酶多肽用于催化吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸的缩合。可修饰这些酶的活性和对映异构体特异性以产生特定的莫纳甜立体异构体,并用下面实施例9所述的方法筛选。
克隆
4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛缩酶,EC 4.1.3.17)和4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛缩酶,EC 4.1.3.16)催化与图2的醛缩酶反应非常相似的反应。设计引物的突出端与pET30 Xa/LIC载体(Novagen,Madison,WI)相容。上述实施例1中描述了这些引物的设计。
为pET30Xa/LIC克隆设计了以下引物:
1.稻草假单胞菌proA基因(Genbank登录号:12964663版本:12964663;或者指定为AB050935.2 GI:12964663)和***丛毛单胞菌proA基因(SEQ ID NO:65-66,分别是核酸序列和氨基酸序列)正向5′-GGTATTGAGGGTCGCATGTACGAACTGGGAGTTGT-3′和反向5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAGTCAATATATTTCAGGC-3′(SEQ ID NO:55和56)。
2.苜蓿中华根瘤菌1021 SMc00502基因(与proA同源,Genbank登录号:15074579或AL591788.1 GI:15074579和CAC46344.1,分别是核酸序列和氨基酸序列)正向5′-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCGTGGTTCACCGGAA-3′和反向5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAATCGATATATTTCAGTC-3′(SEQ ID NO:61和62)。
3.鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)LB126 fldZ基因(Genbank登录号:7573247版本:7573247或AJ277295.1 GI:7573247,编码推定的酰基转移酶GenBank登录号:CAB87566.1 GI:7573254)正向5′-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCGGCATCGTTGTCCA-3′和反向5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGACATATTTCAGTCCCA-3′(SEQ ID NO:57和58)。
4.凯氏节杆菌(Arthrobacter keyseri)pcmE基因(Genbank登录号:AF331043版本:AF331043.1,编码草酰柠苹酸(oxalocitramalate)醛缩酶GenBank登录号:AAK16525.1 GI:13242045)正向5′-GGTATTGAGGGTCGCATGCGACTGAACAACCTCGG-3′和反向5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGTTCTCCACGTATTCCA-3′(SEQID NO:59和60)。
5.鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)菌株CO92 YPO0082基因(Genbank登录号:15978115版本:15978115或AJ414141.1 GI:15978115,编码可能的转移酶GenBank登录号:CAC88948.1 GI:15978195)正向5′-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCCTGGTTAATATGAA-3′和反向5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGACTTTAACGCGTTGA-3′(SEQ ID NO:63和64)。
6.枯草芽孢杆菌khg基因(Genbank登录号Z99115.1 GI:2634478,126711-127301或Z99115.1 GI:2634478,126711-127301和CAB14127.1,分别是核酸序列和氨基酸序列)正向5′-GGTATTGAGGGTCGCATGGAGTCCAAAGTCGTTGA-3′和反向5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACACTTGGAAAACAGCCT-3′(SEQ ID NO:35和36)。
7.大肠杆菌khg基因(Genbank登录号.AE000279.1 1331-1972和AAC74920.1,分别是核酸序列和氨基酸序列)正向5′-GGTATTGAGGGTCGCATGAAAAACTGGAAAACAAG-3′和反向5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCTTAGCGCCTTCTA-3′(SEQ ID NO:37和38)。
8.苜蓿中华根瘤菌khg或SMc03153基因(Genbank登录号AL591792.1GI:15075850或AL591792.1 GI:15075850,64673..65311和CAC47463.1,分别是核酸序列和氨基酸序列)正向5′-GGTATTGAGGGTCGCATGCGAGGGGCATTATTCAA-3′和反向5′-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCCTTGAGCGCGAAG-3′(SEQ ID NO:39和40)。
用Qiagen Genomic-tipTM(Valencia,CA)方法纯化来自以上1-2和6-8所述生物的基因组DNA。采用类似技术,可纯化来自3-5中所述生物的基因组DNA。
在营养肉汤和羟基苯甲酸培养基中30℃下培养稻草假单胞菌(ATCC 33636)。在营养肉汤和羟基苯甲酸培养基中26℃下培养***丛毛单胞菌(ATCC 49249)。根据Wattiau等(Research in Microbiol.152:861-72,2001)所述方法培养鞘氨醇单胞菌属LB126(佛兰德技术研究所(Flemish Institute for Technological Research),VITO,B-2400Mol,Belgium)。根据Eaton(J.Bacteriol.183:3689-3703,2001)所述的方法培养凯氏节杆菌(海湾生态学部(Gulf Ecology Division),国立健康和环境影响研究实验室(National Health and Environmental Effects Research Laboratory),美国环境保护局(U.S.Environmental Protection Agency),Gulf Breeze,FL 32561,USA)。在ATCC TY培养基和羟基苯甲酸培养基中26℃下培养苜蓿中华根瘤菌1021(ATCC 51124)。在ATCC培养基739马血琼脂中26℃下培养鼠疫耶尔森氏菌菌株CO92(ATCC)。在Bereto营养肉汤(Difco;Detroit,MI)中30℃下培养枯草芽孢杆菌6051(ATCC)。大肠杆菌基因组DNA分离自DH10B菌株(Invitrogen),如实施例1所述。
将实施例1所述的PCR、克隆和筛选方法用于克隆***丛毛单胞菌和苜蓿中华根瘤菌proA序列,以及大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和苜蓿中华根瘤菌khg序列。相同方法可用于克隆上述其它序列。对于***丛毛单胞菌proA基因而言,PCR的退火和延伸条件是40-60℃1分钟45秒(梯度热循环仪)和72℃2分钟15秒。
用双脱氧链终止测序法(Seqwright,Houston,TX)与S-标记和T7终止子引物(Novagen)以及Integrated DNATechnologies,Inc.(Coralville,IA)的内部引物对阳性克隆进行测序。
表达和活性测定
将质粒DNA(通过序列分析确证)亚克隆入表达宿主BL21(DE3)(Novagen)中。培养物在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中生长,用Qiagen离心质粒小抽试剂盒分离质粒,然后用限制性消化来分析以确认同一性。用在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中37℃下生长的BL21(DE3)构建物进行诱导试验。在OD600达到约0.6后用0.1mM IPTG诱导蛋白表达。在30℃下培养细胞4小时,离心收获细胞。然后用BugbusterTM试剂(Novagen)裂解细胞,用His-结合柱体纯化His-标记重组蛋白,如上所述(实施例1)。在PD-10一次性柱上使纯化蛋白脱盐,用含有2mM MgCl2的50mMTris-HCl,pH7.3缓冲液洗脱。
在4-15%梯度凝胶上用SDS-PAGE分析蛋白质,以检测在重组融合蛋白的预计分子量处的可溶性蛋白质水平。
用吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸钠作为底物测定蛋白活性。1mL测定混合物中含有100mM Tris-HCl(pH7-pH8.9),0-8mM MgCl2,3 mM磷酸钾(pH8)和6mM各底物。通过加入不同量的多肽(例如10-100μg)启动反应,在25℃-37℃孵育30分钟,过滤,然后在-80℃冷冻。
proA基因产物的活性结果
当用IPTG诱导时,***丛毛单胞菌proA和苜蓿中华根瘤菌SMc00502基因构建物有高水平表达。重组蛋白是高度可溶的,如通过SDS-PAGE分析总蛋白和细胞提取物样品所确定的。***丛毛单胞菌基因产物纯化至>95%纯度。由于用His-结合柱体亲和纯化后苜蓿中华根瘤菌基因产物的产量很低,细胞提取物用于酶测定。
两种重组醛缩酶都催化从吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸形成MP。酶活性需要二价镁和磷酸钾的存在。当缺少吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸或磷酸钾时,没有明显产物。缺乏酶时也形成少量产物(通常比酶存在时少1个数量级)。
采用实施例6所述的LC/MS方法,从反相C18柱洗脱的产物峰稍迟于吲哚-3-丙酮酸标准,此峰的质谱显示292.1的碰撞诱导母离子([M+H]+),产物MP预期的母离子。质谱中存在的主要子片段包括具有m/z=158(1H-吲哚-3-碳醛正碳离子)、168(3-丁-1,3-二烯基-1H-吲哚-正碳离子)、274(292-H2O)、256(292-2H2O)、238(292-3H2O)、228(292-CH4O3)和204(失去丙酮酸)的子片段。产物也表现出其它含吲哚的化合物的UV光谱特征,如色氨酸,λmax为279-280且在约290nm处有一小肩。
随着反应温度从室温增加到37℃、底物量和镁量的增加,***丛毛单胞菌醛缩酶法生成的MP量增加。酶的合成活性随着pH增加而减少,在pH7观察到最多产物。在色氨酸标准基础上,用20μg纯化的蛋白在标准测定下生成的MP量约为每毫升反应物10-40μg。
由于苜蓿中华根瘤菌和***丛毛单胞菌ProA醛缩酶编码序列与上述其它基因的高度同源性,预期所有重组基因产物能催化此反应。此外,预期有类似活性的醛缩酶在59位和87位有苏氨酸(T),在119位有精氨酸(R),在120位有天冬氨酸(D),在31位和71位有组氨酸(H)(以***丛毛单胞菌的编号***为基础)。
khg基因产物的活性结果
当用IPTG诱导时,枯草芽孢杆菌和大肠杆菌khg基因构建物有高水平表达,而苜蓿中华根瘤菌khg的表达水平较低。重组蛋白高度可溶,如通过SDS-PAGE分析总蛋白和细胞提取物样品判断的。枯草芽孢杆菌和大肠杆菌khg基因产物纯化到>95%纯度;用His-结合柱体亲和纯化后,苜蓿中华根瘤菌基因产物的产量不高。
没有证据说明此酶活性需要镁和磷酸盐。然而,文献报导在磷酸钠缓冲液中进行测定,报导的酶是双功能并对磷酸化底物如2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸(KDPG)有活性。酶测定如上所述进行,在一些情况中省略磷酸盐。结果表明重组KHG醛缩酶产生MP,但活性不如ProA醛缩酶。在一些情况中,KHG产生的MP水平几乎与镁和磷酸盐单独产生的量相同。磷酸盐似乎不增加KHG活性。杆菌酶活性最高,比单独镁和磷酸盐的活性约高20-25%,如LC/MS/MS所确定(见实施例6)。中华根瘤菌酶活性量最低,这可能与表达中注意到的折叠和溶解度问题相关。所有3种酶有活性位点谷氨酰胺(枯草芽孢杆菌编号***中的43位)以及与丙酮酸形成Shiff碱基所需的赖氨酸(130位);然而,枯草芽孢杆菌酶在47位含有活性位点残基苏氨酸,而不是精氨酸。枯草芽孢杆菌KHG较小且似乎在簇中不同于苜蓿中华根瘤菌和大肠杆菌酶,其它酶有活性位点苏氨酸。活性位点的差异可能是枯草芽孢杆菌酶活性增加的原因。
改进醛缩酶活性
催化抗体可与天然醛缩酶一样有效,接受广范围的底物,并能用于催化图2所示反应。
通过定向进化也能改进醛缩酶,例如上述用于KDPG醛缩酶的例子(与上述KHG高度同源),KDPG醛缩酶通过DNA改组和易错PCR去除对磷酸盐的需求和反转对映选择性。KDPG醛缩酶多肽用于生化反应,因为它们高度特异于供体底物(本文是丙酮酸),但对于受体底物(即吲哚-3-丙酮酸)相对灵活(Koeller和Wong,Nature409:232-9,2001)。KHG醛缩酶有缩合丙酮酸与许多羧酸和醛的活性。认为KHG醛缩酶的哺乳动物形式的对映特异性比许多细菌形式更广,包括对4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸活性较高和接受4-羟基-2-酮戊二酸的2种立体异构体。细菌来源似乎对R异构体有10倍偏好。基因组数据库中存在将近100个KHG同系物,在假单胞菌、副球菌、普罗威登斯菌、中华根瘤菌、摩根氏菌、大肠杆菌和哺乳动物组织中证明活性。这些酶能用作修改对映特异性的起始点,这是莫纳甜生成需要的。
利用丙酮酸和另一底物的醛缩酶能“进化”以修改多肽特异性、速度和选择性,另一底物是酮酸和/或有体积大的疏水基团,像吲哚。除了本文证明的KHG和ProA醛缩酶之外,这些酶的例子包括但不限于:KDPG醛缩酶和相关多肽(KDPH);来自类诺卡氏菌属(Nocardioides sp)的转羧基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶;4-(2-羧苯基苯基)-2-氧丁-3-烯醇盐醛缩酶(2’-羧基亚苄基丙酮酸醛缩酶),它缩合丙酮酸与2-羧基苯甲醛(一种含芳环的底物);来自恶臭假单胞菌(P.Putida)和食芳香物鞘氨醇单胞菌的反式-O-羟基苯亚甲基丙酮酸水合酶-醛缩酶,它也利用丙酮酸和含芳族的醛作为底物;3-羟基天冬氨酸醛缩酶(赤-3-羟基-L-天冬氨酸乙醛酸裂合酶),它使用2-含氧酸作为底物且被认为在生物体脱氮微球菌(Micrococcus denitrificans)中;苯偶姻醛缩酶(苯甲醛裂合酶),它利用含苄基的底物;二氢新蝶呤醛缩酶;L-苏-3-苯基丝氨酸苯甲醛-裂合酶(苯基丝氨酸醛缩酶),它缩合甘氨酸与苯甲醛;4-羟基-2-氧戊酸醛缩酶;1,2-二羟基苄基丙酮酸醛缩酶和2-羟基亚苄基丙酮酸醛缩酶。
采用与上述类似的测定,和实施例6所述的检测方法,异柠檬酸裂合酶、N-乙酰基神经氨酸合酶、柠檬酸裂合酶、色氨酸酶和某些突变体、β-酪氨酸酶和某些突变体、PLP、催化醛缩酶抗体、色氨酸合酶在测试条件下似乎没有将吲哚-3-丙酮酸可检测地转化为MP。
通过筛选感兴趣的克隆可选择有所需活性的多肽,使用下列方法。用表达盒上携带感兴趣克隆的载体转化色氨酸营养缺陷型且生长于含少量莫纳甜或MP的培养基。由于转氨酶和醛缩酶反应是可逆的,细胞能从莫纳甜的外消旋混合物生成色氨酸。类似地,通过利用MP或莫纳甜作为碳源和能源的能力可筛选生物体(重组和野生型)。靶醛缩酶的一个来源是多种假单胞菌和根瘤菌菌株的表达文库。假单胞菌有许多不寻常的分解代谢途径用于降解芳族分子,它们也含有许多醛缩酶;而根瘤菌含有醛缩酶,已知在植物根瘤中生长,有许多描述用于构建莫纳甜生物合成途径的基因。
实施例3
色氨酸或吲哚-3-丙酮酸转化成莫纳甜
体外方法使用2种酶转氨酶和醛缩酶,从色氨酸和丙酮酸生成莫纳甜。在第1步中,α-酮戊二酸是转氨反应中来自色氨酸氨基的受体,反应产生吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸。醛缩酶催化第2个反应,其中丙酮酸在Mg2+和磷酸盐存在下与吲哚-3-丙酮酸反应,产生莫纳甜(MP)的α-酮衍生物,2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸。转移第1个反应中形成的谷氨酸的氨基生成所需产物莫纳甜。纯化和表征产物确定形成的异构体是S,S-莫纳甜。描述另外的底物、酶和条件以及对此方法所作的改进。
酶
克隆、表达和纯化来自***丛毛单胞菌的醛缩酶、4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛缩酶,proA基因)(EC 4.1.3.17),如实施例2所述。克隆、表达和纯化来自枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和苜蓿中华根瘤菌的4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛缩酶)(EC 4.1.3.16),如实施例2所述。
用于结合醛缩酶以生成莫纳甜的转氨酶是大肠杆菌aspC基因编码的L-天冬氨酸转氨酶、大肠杆菌tyrB基因编码的酪氨酸转氨酶、苜蓿中华根瘤菌TatA酶、硕大利什曼原虫bsat基因编码的宽底物转氨酶或来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)。如实施例1描述克隆、表达和纯化非哺乳动物蛋白。来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)获得自Sigma(#G7005)。
使用ProA醛缩酶和L-天冬氨酸转氨酶的方法
1升反应混合物中含有50mM醋酸铵,pH8.0、0.4mM MgCl2、3mM磷酸钾、0.05mM吡哆醛磷酸、100mM丙酮酸铵、50mM色氨酸、10mMα-酮戊二酸、160mg重组***丛毛单胞菌ProA醛缩酶(未纯化细胞提取物,~30%醛缩酶)、233mg重组大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶(未纯化细胞提取物,~40%醛缩酶)。除了酶,所有成分混合一起并在30℃孵育直到色氨酸溶解。然后加入酶,反应溶液30℃孵育并温和振荡(100rpm)3.5小时。酶加入后0.5和1小时,在反应中加入固体色氨酸的等分试样(各50微摩尔)。所有加入的色氨酸不溶解,但浓度维持于50mM或更高。3.5小时后,滤去固体色氨酸。使用确定量的色氨酸作为标准,通过LC/MS分析反应混合物显示溶液中的色氨酸浓度为60.5mM且莫纳甜浓度为5.81mM(1.05g)。
下列方法用于纯化终产物。90%的澄清溶液加到BioRad AG50W-X8树脂柱(225mL;结合力为1.7meq/mL)上。柱用水洗,收集300mL部分,直到280nm处的吸光度<5%首先流过部分。然后柱用1M醋酸铵,pH8.4洗脱,收集4个300-mL部分。所有4个部分含有莫纳甜并用旋转蒸发器蒸发到105mL,蒸发器装有温水浴。随着体积减小形成沉淀且在蒸发过程中滤去。
通过LC/MS分析柱部分显示99%色氨酸和莫纳甜结合于柱。蒸发过程中形成的沉淀含有>97%色氨酸和<2%莫纳甜。上清中色氨酸与产物的比例约为2∶1。
上清(7ml)应用于100mLFast Flow DEAE琼脂糖(Amersham Biosciences)柱,柱预先用0.5L 1M NaOH、0.2L水、1.0L 1.0M醋酸铵,pH8.4和0.5L水洗转化成醋酸盐形式。上清以<2mL/分钟上样,柱用3-4mL/分钟的水洗直到280nm处的吸光度约为0。莫纳甜用100mM醋酸铵,pH8.4洗脱,收集4个100-mL部分。
部分的分析显示流过部分的色氨酸与莫纳甜比例为85∶15且洗脱部分的比例为7∶93。假定莫纳甜在280nm处的消光系数与色氨酸相同,洗脱部分含有0.146毫摩尔产物。对于68%的回收,推断总共1L的反应会生成约2.4毫摩尔(约710mg)莫纳甜。
来自DEAE琼脂糖柱的洗脱部分蒸发到<20mL。通过用C8制备型反相柱进一步纯化产物的等分部分,所用色谱条件与实施例6所述用于分析-规模莫纳甜特征的条件相同。Waters FractionlynxTM软件用于在检测m/z=293离子基础上触发自动分部收集莫纳甜。收集来自莫纳甜的相应质子化分子离子的C8柱的部分,蒸发到干燥,随后溶于小体积水。此部分用于产物的鉴定。
所得产物用下列方法表征。
UV/可见光谱学.用Cary 100 Bio UV/可见光分光光度计完成UV/可见光谱测量酶法生成的莫纳甜。溶于水的纯化产物显示280nm的最大吸收,在288nm处有一肩,是含吲哚的化合物的典型特征。
LC/MS分析.用于莫纳甜的混合物分析如实施例6所述完成,莫纳甜获得自体外生化反应。图5说明体外酶合成混合物中莫纳甜的典型LC/MS分析。图5的下面一组阐明莫纳甜的质子化分子离子在m/z=293的所选离子色谱。混合物中的此莫纳甜鉴定通过图6所述质谱确证。LC/MS分析纯化产物显示293的分子离子单峰和280nm处的吸光度。质谱与图6所示相同。
MS/MS分析.如实施例6所述,也对莫纳甜进行LC/MS/MS子离子实验。图7说明莫纳甜的子离子质谱。对图7中标记的所有片段离子进行了试验性结构分配。这些包括m/z=275(293-H2O)、257(293-(2xH2O))、230(275-COOH)、212(257-COOH)、168(3-丁-1,3-二烯基-1H-引哚-正碳离子)、158(1H-吲哚-3-碳醛正碳离子)、144(3-乙基-1H-吲哚-正碳离子)、130(3-亚甲基-1H-吲哚-正碳离子)和118(吲哚正碳离子)的片段离子。如预料的,如果获得自分子的吲哚部分,这些中的许多与MP获得的(实施例2)相同。由于存在氨基而不是酮,一些比MP所见高1个质量单位。
莫纳甜的精确质量测量.图8阐明使用Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star杂合四极/飞行时间质谱仪获得的纯化莫纳甜的质谱。使用色氨酸作为内部质量校准标准,质子化莫纳甜的测量质量是293.1144。在C14H17N2O5元素组成的基础上,质子化莫纳甜的计算质量是293.1137。此质量测量误差小于每百万分二(2ppm),提供酶法生成莫纳甜的元素组成的确证。
NMR光谱学.NMR实验在Varian Inova 500 MHz仪器上进行。莫纳甜样品(~3mg)溶于0.5ml D2O。溶剂(D2O)起初用作4.78ppm的内部参考。由于水的峰大,运行1H-NMR,同时抑制水峰。随后,由于水峰宽,莫纳甜的C-2质子用作参考峰,设在7.192ppm的发表值。
对于13C-NMR,几百次扫描的初始运行表明样品太稀释不能在规定时间获得适当13C谱。因此,进行异核多级量子相干(HMQC)实验,它能使其附着的氢和碳相关,也提供碳化学位移的信息。
表2和3显示1H和HMQC数据的概括。通过与发表值比较,NMR数据表明酶法生成的莫纳甜是(S,S)、(R,R)或两者的混合物。
手性LC/MS分析.为确定体外生成的莫纳甜是一种异构体而不是(R,R)和(S,S)对映异构体的混合物,用实施例6所述仪器完成手性LC/MS分析。
用Chirobiotic T(高级分离技术)手性色谱柱在室温进行手性LC分离。在供应商发表的方案基础上,对色氨酸的R-(D)和S-(L)异构体优化分离和检测。LC流动相包括A)含0.05%(v/v)三氟醋酸的水;B)含0.05%(v/v)三氟醋酸的甲醇。洗脱在70%A和30%b为等度。流速为1.0mL/分钟,从200nm到400nm监控PDA吸光度。用于手性LC/MS分析色氨酸和莫纳甜的仪器参数与实施例6所述用于LC/MS分析的相同。收集使用m/z150-400区的质谱。质子化分子离子的所选离子色谱(用于R-和S-色氨酸的[M+H]+=205且用于莫纳甜的[M+H]+=293)可直接鉴定混合物中的这些分析物。
图9显示R-和S-色氨酸和莫纳甜的色谱,它们由手性色谱分离并通过MS监控。莫纳甜色谱中的单峰表明该化合物是一种异构体,保留时间几乎与S-色氨酸相同。
表2
1H NMR数据
1Vleggaar等(J.C.S.Perkin Trans.1:3095-8,1992)。
2Takeshi和Shusuke(JP2002060382,2002-02-26)。
表3
13C NMR数据(来自HMQC谱)
1Vleggaar等(J.C.S.Perkin Trans.1:3095-8,1992)。
旋光测定.在Rudolph Autopol III旋光仪上测量旋光性。莫纳甜制备为14.6mg/mL的水溶液。对于1g/mL水溶液,S,S莫纳甜(盐形式)的预期比旋光([α]D 20)是-49.6(Veleggaar等)。观察到纯化、酶法生成莫纳甜的[α]D 20为-28.1,表明它是S,S异构体。
改进
优化包括试剂和酶浓度的反应条件,5-10mg/mL的产量用下列试剂混合物产生:50mM醋酸铵,pH8.3、2mM MgCl2、200mM丙酮酸(钠或铵盐)、5mMα-酮戊二酸(钠盐)、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后达到1mL终体积的脱气水、3mM磷酸钾、50μg/mL重组ProA醛缩酶(细胞提取物;总蛋白浓度为167μg/mL)、1000μg/mL大肠杆菌aspC基因编码的L-天冬氨酸转氨酶(细胞提取物;总蛋白浓度为2500μg/mL)和使浓度>60mM的固体色氨酸(饱和;一些在整个反应中未溶解)。混合物在30℃孵育4小时并温和搅拌或混合。
取代
α-酮戊二酸的浓度可减少到1mM并补充9mM天冬氨酸,莫纳甜的产量相等。另外的氨基酸受体可用于第1个步骤,如草酰乙酸。
当用重组硕大利什曼原虫宽底物转氨酶代替大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶时,获得类似的莫纳甜产量。然而,分子量为292的第2种未鉴定产物(主要产物的3-10%)也通过LC-MS分析检测。当大肠杆菌tyrB编码的酶、苜蓿中华根瘤菌tatA编码的酶或来自猪心的谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(IIa型)作为转氨酶加入时,产生0.1-0.5mg/mL的莫纳甜浓度。当反应从吲哚-3-丙酮酸开始时,还原性胺化可用于最后步骤,此步有谷氨酸脱氢酶和NADH(如实施例4)。
来自枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和苜蓿中华根瘤菌的KHG醛缩酶也与大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶一起使用以酶法生成莫纳甜。使用下列反应条件:50mM NH4-OAcpH8.3、2mM MgCl2、200mM丙酮酸、5mM谷氨酸、0.05mM吡哆醛磷酸、在酶加入后达到0.5mL终体积的脱气水、3mM磷酸钾、20μg/mL重组枯草芽孢杆菌KHG醛缩酶(纯化的)、大约400μg/mL来自细胞提取物的未纯化大肠杆菌L-天冬氨酸转氨酶(AspC)和12mM吲哚-3-丙酮酸。反应在30℃振荡孵育30分钟。用枯草芽孢杆菌酶生成的莫纳甜量为80ng/mL,随着醛缩酶量增加而提高。如果用饱和量的色氨酸和5mMα-酮戊二酸代替吲哚-3-丙酮酸和谷氨酸,莫纳甜产量增加到360ng/mL。用50mM Tris pH8.3中的3种30μg/mL KHG酶和饱和量的色氨酸重复反应,进行1小时以增加检测。如实施例2,杆菌酶活性最高,产生约4000ng/mL莫纳甜。大肠杆菌KHG产生3000ng/mL莫纳甜,苜蓿中华根瘤菌酶产生2300ng/mL。
实施例4
MP和莫纳甜间的相互转化
MP的胺化以形成莫纳甜可通过如实施例1和3鉴定的转氨酶,或通过需要还原辅因子如NADH或NADPH的脱氢酶催化。这些反应是可逆的且能以任何一个方向测量。当使用脱氢酶时,方向性主要通过铵盐的浓度控制。
脱氢酶活性.随着NAD(P)+转化成更生色的NAD(P)H,通过跟踪340nm处吸光度增加来监控莫纳甜的氧化脱氨。如实施例3所述酶法生成和纯化莫纳甜。
典型的0.2mL测定混合物含有50mM Tris-HCl,pH8.0到8.9、0.33mM NAD+或NADP+、2到22单位的谷氨酸脱氢酶(Sigma)和10-15mM底物。测定在UV-透明微量滴定板中进行2次,用Molecular Devices SpectraMax Plus板阅读器读数。将酶、缓冲液和NAD(P)+的混合物移吸入含底物的孔,短暂混合后,以10秒间隔监控340nm处的吸光度增加。反应在25℃孵育10分钟。不加入底物作为阴性对照,谷氨酸用作阳性对照。来自牛肝的III型谷氨酸脱氢酶(Sigma#G-7882)催化莫纳甜转化为莫纳甜前体,转化率约为谷氨酰胺转化为α-酮戊二酸的百分之一。
转氨活性.用来自大肠杆菌的L-天冬氨酸转氨酶(AspC)、来自大肠杆菌的酪氨酸转氨酶(TyrB)、来自硕大利什曼原虫的宽底物转氨酶(BSAT)和2个实施例1所述可商业购买的猪谷氨酸-草酰乙酸转氨酶进行莫纳甜转氨酶测定。草酰乙酸和α-酮戊二酸作为氨基受体测试。测定混合物含有(0.5mL中)50mM Tris-HCl,pH8.0、0.05mM PLP、5mM氨基受体、5mM莫纳甜和25μg转氨酶。测定在30℃孵育30分钟,通过加入0.5mL异丙醇终止反应。莫纳甜损失通过LC/MS监控(实施例6)。注意到以草酰乙酸作为氨基受体的硕大利什曼原虫BSAT活性量最高,接着是以α-酮戊二酸作为氨基受体的相同酶。草酰乙酸的相对活性是:BSAT>AspC>猪IIa型>猪I型=TyrB。α-酮戊二酸的相对活性是:BSAT>AspC>猪I型>猪IIa型>TyrB。
采用与上述类似的测定,和实施例6所述的检测方法,两种酶苜蓿中华根瘤菌tatA和类球红细菌tatA在测试条件下似乎没有将莫纳甜可检测地转化为MP。然而,这种缺乏可检测的活性可能归因于莫纳甜有时难以检测,因为它在水溶液中不稳定。
实施例5
从色氨酸和除丙酮酸的C3来源生成莫纳甜
如上面实施例3所述,吲哚-3-丙酮酸或色氨酸能转化成莫纳甜,使用丙酮酸作为C3分子。然而,在一些情况中,丙酮酸可能不是理想的原料。例如,丙酮酸可能比其它C3碳源更昂贵,或如果加入培养基对发酵有不利影响。
丙氨酸可通过许多PLP-酶转氨以产生丙酮酸。
色氨酸酶样酶进行β-消除反应的速度快于其它PLP酶如转氨酶。来自此类别(4.1.99.-)的酶能从氨基酸(如L-丝氨酸、L-半胱氨酸、具有良好离去基团的丝氨酸和半胱氨酸的衍生物例如O-甲基-L-丝氨酸、O-苄基-L-丝氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-丝氨酸和3-氯-L-丙氨酸)产生氨和丙酮酸。
可根据Mouratou等(J.Biol.Chem 274:1320-5,1999)的方法通过β-酪氨酸酶(TPL)或色氨酸酶突变,改进用EC 4.1.99.-多肽生成莫纳甜的方法。Mouratou等描述将β-酪氨酸酶转化成二羧氨基酸β-裂合酶的能力,此裂合酶没有报导在自然界中产生。通过使缬氨酸(V)283转化成精氨酸(R)和精氨酸(R)100变成苏氨酸(T)来完成特异性变化。这些氨基酸变化使裂合酶接受二羧氨基酸用于水解脱氨反应(如天冬氨酸)。因此,天冬氨酸也能用作丙氨酸的来源用于随后的醛醇缩合反应。
另外,能提供乳酸和将乳酸转化成丙酮酸的酶的细胞或酶反应器。能催化此反应的酶的例子包括乳酸脱氢酶和乳酸氧化酶。
分离基因组DNA
以前例如,Mouratou等(JBC 274:1320-5,1999)报道了色氨酸酶多肽。为分离编码色氨酸酶多肽的基因,将来自大肠杆菌DH10B的基因组DNA用作PCR模板,如实施例1所述。
酪氨酸-酚裂合酶基因分离自弗氏柠檬酸杆菌(ATCC目录号8090,指定ATCC13316;NCTC 9750),在营养琼脂(Difco 0001)和营养肉汤(Difco 0003)中37℃下培养到OD为2.0。用Qiagen Genomic-tip TM 100/G试剂盒纯化基因组DNA。
PCR扩增编码序列
为pET30Xa/LIC载体(Novagen,Madison,WI)设计具有相容性突出端的引物,如实施例1所述。
大肠杆菌tna(SEQ ID NO:41)。用于pET30 Xa/LIC克隆的N-末端引物:5′-GGTATT GAG GGT CGC ATG GAA AAC TTT AAA CAT CT-3′(SEQ ID NO:43)。用于pET30 Xa/LIC克隆的C-末端引物:5′-AGA GGA GAG TTA GAG CCT TAAACT TCTTTAAGT TTT G-3′(SEQ ID NO:44)。
弗氏柠檬酸杆菌tpl(SEQ ID NO:42)。用于pET30 Xa/LIC克隆的N-末端引物:5′-GGT ATT GAG GGT CGC ATGAATTATCCGGCAGAACC-3′(SEQ ID NO:45)。用于pET30 Xa/LIC克隆的C-末端引物:5′-AGA GGA GAG TTA GAGCCTTAGATGTAATCAAAGCGTG-3′(SEQ ID NO:46)。
所有PCR反应都使用Eppendorf MastercyclerTM梯度5331热循环仪。在50μL中加入0.5μg模板(基因组DNA),1.0μM各引物,0.4mM各dNTP,3.5 U Expand HighFidelity聚合酶(Roche),含有Mg的1X Expand缓冲液和5%DMSO(终浓度)。所用的热循环仪PCR程序如下:96℃热启动(5分钟),94℃-30秒,40-60℃-1分钟45秒,72℃-2分钟15秒;30个循环。最后聚合步骤为7分钟,然后将样品储存于4℃。
克隆
将上面实施例1中详述的克隆和阳性克隆鉴定程序用于鉴定合适的克隆。
基因表达和活性测定
将质粒DNA(通过序列分析确证)亚克隆入表达宿主BL21(DE3)(Novagen)中。在含有30mg/L卡那霉素的LB培养基中培养构建物,用Qiagen小抽试剂盒分离质粒,用限制性消化来分析以确认同一性。
用BL21(DE3)表达宿主进行诱导实验,在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中37℃下培养构建物。当培养物的OD600达到约0.6后用0.1mM IPTG诱导蛋白表达。在30℃下培养细胞4小时,离心收获细胞。然后在5mL/g湿细胞重的BugBusterTM(Novagen)试剂中裂解细胞,该试剂中含有5μL/mL蛋白酶抑制剂混合物组#III(Calbiochem)和1μL/mL苯甲酸酶核酸酶(Novagen),用His-结合柱体纯化His-标记的重组蛋白,如实施例1所述。纯化蛋白在PD-10(G25 Sephadex,AmershamBiosciences)柱上脱盐,用100mM Tris-Cl缓冲液,pH8.0洗脱。在4-15%梯度凝胶上用SDS-PAGE分析蛋白,以检测在重组融合蛋白的预计分子量处的可溶性蛋白质水平。
诱变
多肽类4.1.99.-(色氨酸酶和β-酪氨酸酶)的一些成员将与天冬氨酸或类似氨基酸进行β-裂合酶反应,没有任何修改。然而,该类的一些成员可能需要被诱变才能使用这些底物和/或生成产物。而且,在一些情况下,通过诱变进一步优化可进行转化的多肽。
根据PLP-结合多肽的3D结构分析进行定位诱变。下面介绍改变多肽的底物特异性的两个例子。
色氨酸酶例子A的诱变
以下提供的诱变方法将两个点突变引入氨基酸序列中。第一个点突变将103位上的精氨酸(R)改变成苏氨酸(T),第二个点突变将299位上的缬氨酸(V)改变成精氨酸(R)(大肠杆菌成熟蛋白的编号***)。由ATG实验室(Eden Prairie,MN)进行诱变实验。通过基因片段的PCR以及用PCR完成片段组装连续地引入突变。
用于将精氨酸(R)103转化为苏氨酸(T)的引物:
5′-CCAGGGCACCGGCGCAGAGCAAATCTATATT-3′(SEQ ID NO:47)和
5′-TGCGCCGGTGCCCTGGTGAGTCGGAATGGT-3′(SEQ ID NO:48)。
用于将缬氨酸(V)299转化为精氨酸(R)的引物:
5′-TCCTGCACGCGGCAAAGGGTTCTGCACTCGGT-3′(SEQ ID NO:49)和
5′-CTTTGCCGCGTGCAGGAAGGCTTCCCGACA-3′(SEQ ID NO:50)。
用Xba I/HindIII和SphI进行限制性消化来筛选突变体,用测序确认。
酪氨酸酚裂合酶(β-酪氨酸酶)例子B的诱变
在酪氨酸酚裂合酶氨基酸序列上产生两个点突变。这些突变将100位上的精氨酸(R)转变成苏氨酸(T),将283位上的缬氨酸(V)转变成精氨酸(R)(在弗氏柠檬酸杆菌成熟蛋白质序列中)。
用于R100T转化的引物:
5′-AGGGGACCGGCGCAGAAAACCTGTTATCG-3′(SEQ ID NO:51)和
5′-TCTGCGCCGGTCCCCTGGTGAGTCGGAACAAT-3′(SEQ ID NO:52)。
用于V283R转化的引物:
5′-GTTAGTCCGCGTCTACGAAGGGATGCCAT-3′(SEQ ID NO:53)和
5′-GTAGACGCGGACTAACTCTTTGGCAGAAG-3′(SEQ ID NO:54)。
采用上述方法以及用KpnI/SacI消化和BstXI消化筛选克隆。用双脱氧链终止测序来确证序列。如上所述产生野生型酶的重组蛋白。
反应混合物包含50mM Tris-Cl pH 8.3、2mM MgCl2、200mM C3碳源、5mMα-酮戊二酸、钠盐、0.05mM吡哆醛磷酸盐、脱气水,使得加入酶后最终体积为0.5mL、3mM磷酸钾pH 7.5、25μg、如实施例2所制备的25μg粗重组***丛毛单胞菌ProA醛缩酶、如实施例1所制备的500μg粗L-天冬氨酸转氨酶(AspC)和浓度>60mM的固体色氨酸(饱和;一些色氨酸在整个反应中不溶解)。在30℃下边混合边孵育该反应混合物30分钟。丝氨酸、丙氨酸和天冬氨酸作为3-碳源提供。用和不用能够进行β-消除和β-裂合酶反应的二级PLP酶(纯化)(色氨酸酶(TNA)、双突变色氨酸酶、β-酪氨酸酶(TPL))来进行测定。反应混合物的LC/MS分析结果见表4:
表4
利用替代C3-碳源生成莫纳甜
从作为3-碳源的丙氨酸和丝氨酸产生的莫纳甜通过LC/MS/MS子扫描分析确认,与实施例3中产生的莫纳甜特征相同。丙氨酸是测试的最佳选择之一,通过AspC酶转氨。产生的莫纳甜量通过加入色氨酸酶而增加,色氨酸酶具有转氨二级活性。通过加入色氨酸酶,用丝氨酸作为碳源产生的莫纳甜量几乎加倍,即使与转氨酶相比仅加入五分之一的色氨酸酶量。AspC能有一些单独的β-消除活性的量。天冬氨酸的结果表明色氨酸酶对天冬氨酸的活性不随着定点诱变增加,定点诱变与前面β-酪氨酸酶提示的相同。预计突变β-酪氨酸酶产生莫纳甜的活性较高。
实施例6
检测莫纳甜、MP、色氨酸和谷氨酸
该实施例描述了用于检测莫纳甜或其前体2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸,以及色氨酸和谷氨酸的存在的方法。也描述了用于分离和检测莫纳甜的四种立体异构体的方法。
莫纳甜、MP和色氨酸的LC/MS分析
用Waters/Micromass液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)仪器进行来源于体外或体内生化反应的莫纳甜、MP和/或色氨酸的混合物分析,该仪器包括Waters 2795液相色谱,装有Waters 996光电二极管阵列(PDA)吸光度监控器,串联置于色谱与Micromass Quattro Ultima三重四极质谱仪间。用Xterra MS C8反相色谱柱,2.1mm×250mm或Supelco DiscoveryC18反相色谱柱,2.1mm×150 mm在室温或40℃下进行LC分离。LC流动相包括A)含0.05%(v/v)三氟醋酸的水和B)含0.05%(v/v)三氟醋酸的甲醇。
梯度洗脱是从5%B到35%B线性,0-4分钟,从35%B到60%B线性,4-6.5分钟,从60%B到90%B线性,6.5-7分钟,在90%B等度,7-11分钟,从90%B到95%B线性,11-12分钟,从90%B到5%B线性,12-13分钟,运行间有5分钟再平衡阶段。流速是0.25mL/分钟,从200nm到4000nm监控PDA吸光度。所有ESI-MS参数是基于产生感兴趣分析物的质子化分子离子([M+H]+)、生成特征性片段离子基础上优化和选择的。
下列仪器参数用于莫纳甜的LC/MS分析:毛细管:3.5kV;圆锥:40V;六角形(Hex)1:20V;孔径:0V;六角形(Hex)2:0V;来源温度:100℃;去溶剂化温度:350℃;去溶剂化气体:500L/h;圆锥气体:50L/h;低质量分辨率(Q1):15.0;高质量分辨率(Q1):15.0;离子能量:0.2;进入:50V;碰撞能量:2;出口:50V;低质量分辨率(Q2):15;高质量分辨率(Q2):15;离子能量(Q2):3.5;倍增器:650。报导的质量/电荷比(m/z)和分子量的不确定性为±0.01%。混合物中莫纳甜的α-酮酸形式(MP)和莫纳甜的初始检测用LC/MS监控完成,收集m/z150-400区的质谱。质子化分子离子的所选离子色谱(用于MP的[M+H]+=292,用于莫纳甜的[M+H]+=293,用于色氨酸的[M+H]+=205)可直接鉴定混合物中的这些分析物。检测莫纳甜和MP的后续方法采用多反应监测(MRM)的LC/MS/MS方法(见下文)。
莫纳甜的LC/MS/MS分析
对莫纳甜进行LC/MS/MS子离子实验如下。子离子分析包括将感兴趣的母离子(如对于莫纳甜,m/z=293)从第1个质量分析器(Q1)传送到质谱仪的碰撞细胞,其中导入氩并使母离子化学解离成片段(子)离子。然后用第2个质量分析器(Q2)检测这些片段离子,它们可用于确证母离子的结构分配。
下列仪器参数用于LC/MS/MS分析莫纳甜:毛细管:3.5kV;圆锥:40V;六角形1:20V;孔径:0V;六角形2:0V;来源温度:100℃;去溶剂化温度:350℃;去溶剂化气体:500 L/h;圆锥气体:50L/h;低质量分辨率(Q1):15.0;高质量分辨率(Q1):15.0;离子能量:0.2;进入:-5V;碰撞能量:14;出口:1V;低质量分辨率(Q2):15;高质量分辨率(Q2):15;离子能量(Q2):3.5;倍增器:650。
LC/MS/MS多反应监测
为提高莫纳甜检测的灵敏度和选择性,开发了采用MRM测量的LC/MS/MS法。如前章节所述进行LC分离。如前章节所述设定ESI-MS/MS的仪器参数,除了将Q1和Q2的低质量分辨率和高质量分辨率设定为12.0,以使灵敏度最大化。用5种莫纳甜特异性母-子跃迁在体外和体内反应中特异性检测莫纳甜。所述跃迁是293.1至158.3、293.1至168.2、293.1至211.2、293.1至230.2和293.1至257.2。
高通量测定莫纳甜、色氨酸和谷氨酸
用上述仪器高通量分析(<5分钟/样品)来源于体外和体内反应的莫纳甜、色氨酸和/或谷氨酸的混合物,MS参数与LC/MS/MS多反应监测所述相同。LC分离用4.6mm×50mm Advanced Separation Technologies Chirobiotic T柱在室温进行。LC流动相包括A)含0.25%乙酸的水;B)含0.25%乙酸的甲醇。用50%B等度洗脱0-5分钟。流速为0.6mL/min。优化ESI-MS/MS***的所有参数,并根据色氨酸和莫纳甜和内标2H5-色氨酸或2H3-谷氨酸的质子化分子离子的最佳来源产生、以及多反应监测(MRM)实验中碰撞诱导产生的分析物特异性片段离子进行选择(色氨酸:204.7至146.4,2H5-色氨酸:209.7至151.4,谷氨酸:147.6至102.4,2H3-谷氨酸:150.6至105.4,前一节中列出莫纳甜-特异性跃迁)。
莫纳甜的精确质量测量
使用Applied Biosystems-Perkin Elmer Q-Star杂合四极/飞行时间质谱仪进行高分辨MS分子。使用色氨酸作为内部质量校准标准,测量质子化莫纳甜的质量。在C14H17N2O5元素组成的基础上,质子化莫纳甜的计算质量是293.1137。用实施例3描述的生物催化法产生的莫纳甜显示的测量质量为293.1144。此质量测量误差小于每百万分二(2ppm),提供酶法生成莫纳甜的元素组成的确证。
莫纳甜的手性LC/MS/MS(MRM)测定
用1-氟-2-4-二硝基苯基-5-L-丙氨酸酰胺(FDAA)的衍生作用,然后是反相LC/MS/MS MRM测定完成测定体外和体内反应中莫纳甜的立体异构体分布。
用FDAA衍生莫纳甜
将200μL1%FDAA的丙酮溶液加入50μL样品或标准品。加入40μL1.0M碳酸氢钠,在40℃不时混合孵育该混合物1小时。取出样品,冷却,用20μL 2.0MHCl中和(可能需要更多HCl来有效中和缓冲的生物混合物)。完成脱气后,样品随时用于LC/MS/MS分析。
LC/MS/MS多反应监测用于测定体外和体内反应中莫纳甜的立体异构体分布。
用前一节所述的LC/MS/MS仪器进行分析。在Phenomenex Luna(5μm)C18反相层析柱上40℃下进行能够分离莫纳甜的所有四种立体异构体(尤其是FDAA-莫纳甜)的LC分离。LC流动相包括A)含0.05%(质量/体积)乙酸铵的水和B)乙腈。梯度洗脱是从2%B到34%B线性,0-33分钟,从34%B到90%B线性,33-34分钟,在90%B等度,34-44分钟,从90%B到2%B线性,44-46分钟,运行间有16分钟再平衡阶段。流速是0.25mL/分钟,从200nm到400nm监控PDA吸光度。优化ESI-MS的所有参数并基于产生FDAA-莫纳甜的质子化分子离子([M+H]+)、生成特征性片段离子进行选择。
下列仪器参数用于在阴离子ESI/MS模式中对莫纳甜进行LC/MS分析:毛细管:2.0kY;圆锥:25V;六角形1:10V;孔径:0V;六角形2:0V;来源温度:100℃;去溶剂化温度:350℃;去溶剂化气体:500L/h;圆锥气体:50L/h;低质量分辨率(Q1):12.0;高质量分辨率(Q1):12.0;离子能量:0.2;进入:-5V;碰撞能量:20;出口:1V;低质量分辨率(Q2):12;高质量分辨率(Q2):12;离子能量(Q2):3.0;倍增器:650。用3种FDAA-莫纳甜特异性母-子跃迁在体外和体内反应中特异性检测FDAA-莫纳甜。所述跃迁是543.6至268.2、543.6至499.2和543.6至525.2。FDAA-莫纳甜立体异构体的鉴定是基于与纯化莫纳甜立体异构体相比的层析保留时间和质谱数据。
液相色谱-包括谷氨酸的氨基酸的后柱荧光检测
在Waters 2690 LC***或装有Waters 474扫描荧光检测器的等效仪器,和Waters后柱反应模块上进行具有后柱荧光检测的液相色谱,以确定体外和体内反应中的谷氨酸。在装载有Interaction-Sodium的离子交换柱上60℃下进行LC分离。流动相A是Pickering Na 328缓冲液(Pickering Laboratories,Inc.;Mountain View,CA)。流动相B是Pickering Na 740缓冲液。梯度洗脱是从0%B至100%B,0-20分钟,在100%B等度,20-30分钟,在100%B至0%B线性,30-31分钟,运行间有20分钟再平衡阶段。流动相的流速是0.5 mL/分钟。OPA支柱衍生溶液的流速是0.5mL/分钟。荧光检测器设置为EX 338nm和Em 425nm。将正亮氨酸用作该分析的内标。氨基酸的鉴定基于纯化标准品的层析保留时间数据。
实施例7
在细菌中产生莫纳甜
该实施例描述的方法用于在大肠杆菌细胞中产生莫纳甜。本领域技术人员理解类似方法可用于在其它细菌细胞中产生莫纳甜。此外,可使用含莫纳甜合成途径中其它基因(图2)的载体。
在大肠杆菌BL21(DE3)::proA/pET30 Xa/LIC细胞是产生莫纳甜在含50μg/mL卡那霉素的LB培养基上制备大肠杆菌BL21(DE3)::***丛毛单胞菌proA/pET30 Xa/LIC细胞(如实施例2所述)的新鲜平板。接种来自单菌落的过夜培养物(5mL),在含卡那霉素的LB培养基中30℃下培养。一般将1-50个接种物用于含50μg/mL卡那霉素的trp-1+葡萄糖培养基中进行诱导。
极限培养基Trp-1+葡萄糖培养基用于增加大肠杆菌细胞中的色氨酸产量(Zeman等,Folia Microbiol.35:200-4,1990),此培养基制备如下。在700mL纳米纯水中加入下列试剂:2g(NH4)2SO4、13.6g KH2PO4、0.2g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2·2H2O和0.5mg FeSO4·7H2O。pH调至7.0,体积增加到850mL,培养基高压灭菌。单独制备50%葡萄糖溶液并无菌过滤。在基础培养基(850mL)中加入40ml,终体积1L。
在0.1M磷酸钠pH7中制备10g/LL-色氨酸溶液并无菌过滤。通常加入十分之一体积到下面特定的培养物中。还制备了10%丙酮酸钠溶液并无菌过滤。每升培养物通常使用10mL等分试样。制备氨苄青霉素(100mg/mL)、卡那霉素(25mg/mL)和IPTG(840mM)贮存液,无菌过滤,使用前-20℃贮存。吐温20(聚氧乙烯20-山梨聚糖单月桂酸酯)以0.2%(体积/体积)终浓度使用。氨苄青霉素以非致死浓度使用,通常为1-10μg/mL终浓度。
在37℃培养细胞,每小时取样,直到获得0.35-0.8的OD600。随后用0.1mM IPTG诱导细胞,孵育温度降到34℃。诱导前(0时间点)收集样品(1ml)并5000xg离心。上清在-20℃冷冻用于LC-MS分析。诱导后4小时,收集另外的1mL样品,离心以从细胞沉淀中分离培养液。如上所述加入色氨酸、丙酮酸钠、氨苄青霉素和吐温。
诱导后细胞生长48小时,另取1mL样品且如上制备。在48小时,加入另一等分的色氨酸和丙酮酸。生长约70小时后(诱导后),3500rpm 4℃离心整个培养物体积20分钟。轻轻倒出上清,培养液和细胞都在-80℃冷冻。过滤培养液部分并通过LC/MS分析。如实施例6所述监控[M+H]+=293峰的高度和面积。减去培养基的背景水平。数据也对于细胞生长标准化,这是通过绘出[M+H]+=293峰的高度6图,峰高除以培养物在600nm处的光密度。
当丙酮酸、氨苄青霉素和吐温在诱导后4小时而不是诱导时加入时,产生较高水平的莫纳甜。其它添加物如PLP、另外的磷酸盐或MgCl2不增加莫纳甜产量。当使用色氨酸而不是吲哚-3-丙酮酸时且当色氨酸在诱导后而不是接种或诱导时加入时,获得较高效价的莫纳甜。诱导前和诱导后4小时(底物加入时),发酵液或细胞提取物中通常没有可检测水平的莫纳甜。阴性对照仅用有pET30a载体的细胞以及培养物进行,培养物中不加入色氨酸和丙酮酸。母体MS扫描证明具有(m+1)/z=293的化合物不来源于较大分子,子扫描(如实施例6进行)类似于体外产生的莫纳甜。
研究了非离子去污剂(如吐温、Trixon X-100和十二烷基乙酸铵)对莫纳甜细胞分泌的影响。特别是,用0、0.2%(体积/体积)和0.6%终浓度的吐温-20研究吐温对莫纳甜分泌的影响。0.2%吐温摇瓶产生最高量的莫纳甜。
也在大肠杆菌中测试了此浓度的其它吐温类型(如吐温-40、吐温-60和吐温-80),因为在该宿主中,预计许多去污剂会非特异性地提高细胞泄漏,尽管吐温或其它去污剂一般会抑制细胞生长。吐温40引起的生长抑制最小,然后是吐温60、吐温80和吐温20。在吐温20中细胞生长的最终OD600稍高于在吐温40中生长的培养物的一半。
氨苄青霉素浓度在0和10μg/mL间变化。在0-1μg/mL间细胞培养液中的莫纳甜量迅速增加(2.5倍),当氨苄青霉素浓度从1增加到10μg/mL时,莫纳甜量增加1.3倍。
显示典型结果的时程实验示于图10。甚至当值对于细胞生长标准化时,分泌到细胞培养液的莫纳甜量增加。通过使用色氨酸的摩尔消光系数,培养液中的莫纳甜量估计小于10μg/mL。用不含proA***的载体的细胞重复相同实验。许多数字为负,表明这些培养物中m/z=293的峰高度小于单独培养基中的峰高度(图10)。当色氨酸和丙酮酸缺乏时,数字一致较低,证明莫纳甜生成是醛缩酶催化酶反应的结果。
在800mL摇瓶实验和发酵罐中重复细菌细胞中的莫纳甜体内生成。通过阴离子交换层析和制备型反相液相色谱纯化250mL莫纳甜样品(在无细胞的培养液中)。蒸发此样品,交付高分辨质量分析(如实施例3所述)。高分辨MS表明生成的代谢物是莫纳甜。
因为体外方法的优化实验提示,当转氨酶浓度比醛缩酶浓度高几倍时,可产生较高浓度的莫纳甜(参见实施例3),所以为体内研究构建了操纵子,其中aspC基因的表达水平高于proA基因。
设计引物以将***丛毛单胞菌proA导入具有aspC/pET30 Xa/LIC的操纵子,引物如下:5’引物:ACTCGGATCCGAAGGAGATATACATATGTACGAACTGGGACT(SEQ ID NO:67)和3′引物:CGGCTGTCGACCGTTAGTCAATATATTTCAGGC(SEQID NO:68)。5′引物含有BamHI位点,3′引物含有SalI位点,用于克隆。如实施例2所述进行PCR,用QIAquick凝胶抽提试剂盒凝胶纯化产物。用BamHI和SalI消化aspC/pET30 Xa/LIC构建物和PCR产物。用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化消化物,用EB缓冲液从离心柱上洗脱。用Roche快速DNA连接试剂盒(Indianapolis,IN)根据生产商说明书将proA PCR产物与载体连接。用Novablues Singles(Novagen)进行化学转化,如实施例1所述。用单菌落接种含有50mg/L卡那霉素(5mL)的LB培养基,用Qiagen QIAquick离心小抽试剂盒纯化质粒DNA。用限制性消化分析筛选质粒DNA,用Seqwright(Houston,TX)确认序列。
用Stratagene QuikChangeTM定位诱变试剂盒(LaJolla,CA)将两个基因之间的间插序列缩短23个碱基对。设计和合成以下引物:正向5′-GAAGCGATTGTGGCAGTGCTGTAAGGCTCTAACGGATCCGAAGGAGATATACATATGTAC(SEQ ID NO:75);反向5′-GTACATATGTATATCTCCGGATCCGTTAGA-GCCTTACAGCACTGCCACAATCGCTTC(SEQ ID NO.76)。按照生产商方案进行温度循环、消化和转化入XL10-Gold感受态细胞中。用限制性消化分析来筛选能够在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上生长的克隆,用双脱氧链终止DNA测序法(Seq Wright,Houston,TX)确认序列。在所有测序的克隆的proA基因(G642A)中都发生了一个突变,将醛缩酶氨基酸序列的214位从甲硫氨酸转变为异亮氨酸。无需进一步修饰即可使用此构建物。将构建物亚克隆入BLR(DE3)、BLR(DE3)pLysS、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS(Novagen)。也将proA/pET30 Xa/LIC构建物转化入BL21(DE3)pLysS中。
在上述标准条件下,由如实施例6所述的LC/MS分析来初始比较BLR(DE3)摇瓶样品,证明加入第2个基因(aspC)使产生的莫纳甜量提高7倍。因为生长速率较快,将BL21(DE3)-衍生宿主菌株用于以下实验。在上述Trp-1培养基中诱导proA克隆和2个基因操纵子克隆。将氯霉素(34μg/L)加入培养基,培养基中含有具有pLysS载体的细胞。加入或不加入0.2%吐温-20和1mg/L氨苄青霉素,进行摇瓶实验。用体外生成的纯化莫纳甜作为标准计算培养液中的莫纳甜量。如实施例6所述进行LC/MS/MS分析。在生长0、4小时、24小时、48小时、72小时和96小时时进行细胞取样。
结果见表5,显示培养液中生成的最大量。在大多数情况下,2个基因构建物产生的值高于相应的proA构建物。细胞包膜更易渗漏的带有PLysS载体的宿主菌株分泌的莫纳甜水平较高,尽管这些菌株通常以较慢的速率生长。加入吐温和氨苄青霉素有益于莫纳甜分泌。预计用青霉素或其它青霉素衍生物(如羧苄青霉素)替换氨苄青霉素将产生类似益处。
表5
大肠杆菌产生的莫纳甜量
在摇瓶实验中研究了几种去污剂吐温对大肠杆菌BL21(DE3)生长速率的影响。在10μg/mL氨苄青霉素的存在下加入0.2%的吐温-20、吐温-40、吐温-60或吐温-80,跟踪生长48小时。吐温-40对生长速率的影响最小。在吐温-20存在下该生物的生长速率约为在吐温-40存在下观察到的一半。吐温-60和-80的影响居中。预计,除了对大肠杆菌宿主生物的生长速率的影响不同以外,不同的吐温制剂对莫纳甜分泌具有不同的影响。
构建aspCproApET32b
用XbaI和SalI消化间插序列缩短的aspCproA/PET30 Xa/LIC质粒(~7μg)和pET32b(~6.6μg)。用XbaI和SalI消化pET32b载体去除氨基末端的硫氧还蛋白-标记、His-标记和S-标记,同时此消化保留了pET30 Xa/LIC质粒中aspC序列上游的His标记。用QIAquick凝胶抽提试剂盒从1%-TAE琼脂糖凝胶中纯化2.1kBaspCproA条带和5.4kB pET32b条带。用Roche快速DNA连接试剂盒连接消化的DNA与消化的载体,将连接混合物转化入NovaBlueTM Singles(Novagen),如上所述。用限制性消化分析来筛选能够在含有100μg/mL氨苄青霉素或羧苄青霉素的LB平板上生长的克隆,用双脱氧链终止DNA测序(Seq Wright,Houston,TX)来确认序列。根据Novagen的方案,用aspCproA/PET32转化大肠杆菌BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS细胞。测试能够在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上生长的来自BL21(DE3)转化组的两个克隆和能够在含有100μg/mL氨苄青霉素+34μg/mL氯霉素的LB平板上生长的来自BL21(DE3)pLysS转化组的两个克隆表达醛缩酶和转氨酶基因的能力。具有合适抗生素的LB中50mL构建物的培养物在37℃振荡培养,
使OD600达到0.5-0.75。通过加入0.1mM IPTG诱导基因表达,再在30℃振荡孵育该培养物3小时。4000×g离心10分钟收获细胞,用50mM MOPS,pH7洗涤,再次离心。根据Novagen方案,用含有苯甲酸酶核酸酶和Calbiochem蛋白酶抑制剂混合物III的Novagen BugBusterTM试剂制备细胞提取物。用4-15%梯度凝胶(Bio-Rad,Hercules,CA)SDS-PAGE分析细胞提取物的蛋白表达水平。两种多肽表达良好;在BL21(DE3)宿主培养物中,醛缩酶多肽似乎占可溶性蛋白部分的15-20%,而转氨酶多肽似乎占可溶性蛋白部分的20-30%。BL21(DE3)pLysS培养物中的表达水平较低。
在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基上制备大肠杆菌BL21(DE3)::aspCproA/pET32b新鲜平板。接种来自单菌落的过夜培养物(5mL),在含氨苄青霉素的LB培养基中30℃下培养。一般将1-100个接种物用于含100mg/L氨苄青霉素或羧苄青霉素的trp-1+葡萄糖培养基中进行诱导。在37℃振荡孵育接种的培养物(100mL),直到OD600达到0.5。通过加入0.1mM IPTG(终浓度)诱导基因表达,再在30℃振荡孵育该培养物4小时。诱导基因表达时也加入吡哆醇,使终浓度为0.5mM。诱导4小时后,将25-mL等份的trp-1培养基和0.05mL 100mg/mL羧苄青霉素(5mg)加入培养物,继续在30℃振荡孵育。诱导18小时后,加入0.04mM吡哆醛磷酸盐(终浓度)的磷酸钾(50mM,pH7.2)溶液。将培养物分成两等份,装在无菌培养瓶中。将固体色氨酸(终浓度为50mM)、吐温-20(终浓度为0.2%)(储存液浓度为20%)和丙酮酸钠(终浓度为0.1%)(储存液浓度为10%)加入第一等份。将固体色氨酸(终浓度为50mM)和吐温-20(终浓度为0.2%)加入第二等份。将两种培养物的pH调节到8.2-8.4,继续在30℃孵育。在用IPTG诱导4、18(加入前)、19、24和48小时后,取出用于分析莫纳甜(0.5mL)和蛋白产量(5-10mL)的样品。离心这些样品,使细胞沉淀。用Acrodisc13mm注射器滤器(0.45um;Gelman Laboratory)过滤上清,然后用LC-MS分析莫纳甜。用50mM MOPS,pH7洗涤细胞沉淀,冷冻于-80℃,直到制备用于分析蛋白产量的细胞提取物。
用LC/MS或LC/MS/MS测量发酵液样品中莫纳甜的浓度(如实施例6所述)。当色氨酸和吐温加入培养物时,在24小时发酵液样品中检测到的莫纳甜浓度为34mg/L。诱导后48小时,浓度下降到4.4mg/L。当色氨酸、丙酮酸和吐温加入培养物时,诱导后19-48小时在发酵液样品中检测到的莫纳甜浓度为130-150mg/L。
根据Novagen方案,用含有苯甲酸酶核酸酶和Calbiochem蛋白酶抑制剂混合物III的Novagen BugBusterTM试剂制备细胞提取物。用4-15%梯度凝胶(Bio-Rad,Hercules,CA)SDS-PAGE分析细胞提取物的蛋白表达水平。诱导后18-24小时,细胞提取物样品中表达的蛋白浓度最高。醛缩酶多肽占可溶性蛋白>10%,而转氨酶蛋白似乎占可溶性蛋白>25%。
实施例8
在酵母中产生莫纳甜
该实施例描述用于在真核细胞中生成莫纳甜的方法。本领域技术人员理解类似方法可用于在任何感兴趣细胞中生成莫纳甜。此外,除了该实施例所述的那些基因,还可另外使用其它基因(例如图2所列)。
pESC酵母抗原表位标记载体***(Stratagene,La Jolla,CA)用于克隆和表达大肠杆菌aspC和***丛毛单胞菌proA基因入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中。pESC载体含有相反链上的GAL1和GAL10启动子,有2个不同多克隆位点,可同时表达2个基因。pESC-His载体也含有His3基因用于宿主(YPH500)中组氨酸营养缺陷型的互补。GAL1和GAL10启动子受葡萄糖阻抑且由半乳糖诱导;Kozak序列是酵母中最佳表达需要的。pESC载体是穿梭载体,能在大肠杆菌中产生初始构建物(具有bla基因用于选择);然而,多克隆位点中没有细菌核糖体结合部位。
设计下列引物用于克隆入pESC-His(限制性位点加下划线,Kozak序列粗体显示):aspC(BamHI/SalI),GAL1:5′-CGCGGATCCATAATGGTTGAGAACATTACCG-3′(SEQ ID NO:69)和5′-ACGCGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCG-3′(SEQ IDNO:70);proA(EcoRI/NotI),GAL10:5′-CCGGAATTCATAATGGTCGAACTGGGAGTTGT-3′(SEQ ID NO:71)和5′-GAATGCGGCCGCTTAGTCAATATATTTCAGGCC-3′(SEQ ID NO:72)。
由于导入Kozak序列,两种成熟蛋白的第2个密码子从芳族氨基酸变成缬氨酸。实施例1和2所述克隆作为模板用pET30 Xa/LIC DNA扩增感兴趣的基因,用Qiaprep离心小抽试剂盒(Valencia,CA)纯化。使用Eppendorf Master循环梯度热循环仪进行PCR,和下列用于50μL反应的方案:1.0μL模板、1.0μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U扩增高保真聚合酶(Roche,Indianapolis,IN)和有Mg的1X ExpandTM缓冲液。所用热循环仪程序包括94℃5分钟的热启动,接着是29个下列步骤的重复:94℃30秒,50℃1分钟45秒,72℃2分钟15秒。29个重复后,样品在72℃维持10分钟,随后于4℃贮存。纯化PCR产物是通过在1%TAE-琼脂糖凝胶上分离,接着用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)回收。
如上所述用BamHI/SalI消化并凝胶纯化pESC-His载体DNA(2.7μg)。用BamHI/SalI消化aspC PCR产物并用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。用Roche快速DNA连接试剂盒根据厂商的方案进行连接。根据厂商说明书,使用Biorad基因脉冲器II***在0.2cm Biorad一次性小杯中将脱盐的连接混合物电穿孔入40μlElectromasx DH10B感受态细胞(Invitrogen;Carlsbad,CA)中。在1mL SOC培养基中恢复1小时后,转化子平板培养于含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基。用单菌落接种5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养物,在37℃下孵育过夜。用QIAprep离心小抽试剂盒纯化来自过夜培养物的质粒DNA。通过限制酶切消化筛选该质粒DNA,用设计用于载体的引物测序(Seqwright)以确认。
用EcoRI和NotI消化aspC/pESC-His克隆和proA PCR产物。如上所述,纯化DNA并进行连接。将2个基因构建物转化入Electromax DH10B感受态细胞(Invitrogen)中,通过限制性消化筛选,测序(Seqwright)以确认。
使用S.c.EasyCompTM转化试剂盒(Invitrogen)将2个基因构建物转化入酿酒酵母菌株YPH500中。转化反应物铺在含2%葡萄糖的SC-His极限培养基(InvitrogenpYES2手册)上。通过菌落PCR用以上所列的PCR引物筛选单独酵母菌落中proA和aspC基因的存在。沉淀细胞(2μl)悬浮于20μL含1μl消解酶的Y-裂解缓冲液(ZymoResearch,Orange,CA)并于37℃加热10分钟。随后将4μL此悬浮液用于50μL PCR反应,使用上述PCR方案。
5mL培养物在SC-His+2%葡萄糖中30℃和225rpm生长过夜。逐步调整细胞在棉子糖上生长以便将半乳糖诱导前的延滞期减至最小。生长约12小时后,测量600nm处的吸光度,旋下适当体积的细胞且重悬浮于新鲜SC-His培养基中产生0.4的OD600。连续使用下列碳源:1%棉子糖+1%葡萄糖,0.5%葡萄糖+1.5%棉子糖,2%棉子糖和最后的1%棉子糖+2%半乳糖用于诱导。
诱导培养基中生长约16小时后,50mL培养物分成双份25mL培养物,将下列物质加入培养物之一:(终浓度)1g/LL-色氨酸、5mM磷酸钠pH7.1、1g/L丙酮酸钠、1mM MgCl2。保存来自非诱导培养基和来自16小时培养物(将底物加入莫纳甜途径之前)培养液和细胞沉淀的样品作为阴性对照。此外,仅含功能性aspC基因(和截短的无功能proA基因)的构建物用作另一种阴性对照。细胞可在诱导后总共生长69小时。在一些实验中,在OD600较低时诱导酵母细胞,仅在加入色氨酸和丙酮酸前生长4小时。然而,莫纳甜途径底物似乎抑制生长且在OD600较高时加入更有效。
根据厂商方案用每克细胞(湿重)5mL YeastBusterTM+50μl THP(Novagen)裂解来自培养物的细胞沉淀。此外,将Calbiochem蛋白酶抑制剂组III和苯甲酸酶核酸酶加入该试剂,如之前制备细菌细胞提取物的例子所述。过滤培养液和细胞提取物并通过LC/MS/MS分析,如实施例6所述。用此方法,培养液样品中没有检测到莫纳甜,表明细胞不能在这些条件下分泌莫纳甜(在这些条件下质子动力可能不足,或总氨基酸转运蛋白可能被色氨酸饱和)。重组蛋白的表达是在不能用SDS-PAGE检测变化的水平。
当色氨酸和丙酮酸加入培养基时,可在表达2个功能基因的细胞产生的细胞提取物中瞬时检测到莫纳甜(约60ng/mL)。任何阴性对照细胞提取物中不能检测到莫纳甜。使用实施例3所述的优化实验用含有4.4mg/mL总蛋白(约为通常用于大肠杆菌细胞提取物的两倍)的细胞提取物进行2次莫纳甜的体外测定。加入32μg/mL***丛毛单胞菌ProA醛缩酶或400μg/mLAspC转氨酶进行其它测定,以确定哪个酶在酵母细胞提取物中是限制性的。不加入酶或仅加入AspC转氨酶(无酶时发生低水平的醛醇缩合)进行阴性对照。用部分纯化的酶(30-40%)进行阳性对照,使用16μg/mL醛缩酶和400μg/mL转氨酶。
用SRM分析体外测定。细胞提取物分析显示当色氨酸在诱导后加入培养基时,它被有效转运入细胞中,使色氨酸水平比没有另外加入色氨酸的高2个数量级。体外莫纳甜的分析结果示于表6(数字表示ng/mL)。
表6
用酵母细胞提取物产生莫纳甜
在生长期间从加入或不加入底物的培养物用全二基因构建物细胞提取物获得阳性结果。这些结果与正对照相比,表明酶表达水平接近酵母中1%的总蛋白。当aspC构建物(具有截短的proA)的细胞提取物用醛缩酶测定时,产生的莫纳甜量显著大于单独细胞提取物测定。这表明重组AspC转氨酶包含约1-2%酵母总蛋白。由于细胞中存在天然转氨酶,用加入的ProA醛缩酶测定时未诱导培养物的细胞提取物有小量活性。当用加入的AspC转氨酶测定时,来自未诱导细胞的提取物活性增加到用AspC的负对照生成的莫纳甜量(大约200ng/ml)。相反,补充转氨酶时二基因构建物细胞提取物测定中观察到的活性增加大于加入醛缩酶时观察到的活性。由于2个基因都应以相同水平表达,表明当转氨酶水平高于醛缩酶水平时,产生的莫纳甜量最大。
加入丙酮酸和色氨酸不仅抑制细胞生长,而且也明显抑制蛋白表达。加入pESC-Trp质粒可用于纠正YPH500宿主细胞的色氨酸营养缺陷型,是提供色氨酸而对生长、表达和分泌影响更少的方法。用S.c.EasyCompTM转化试剂盒(Invitrogen)以aspCproA/PESC-His构建物和pESC-trp共转化酿酒酵母菌株YPH500。在不含组氨酸和色氨酸的培养基中培养培养物,如上所述进行诱导。在诱导后没有向生长培养基中加入底物(既无色氨酸又无丙酮酸)的YPH500::aspCproA/pESC-His培养物的细胞提取物样品中检测到低水平的莫纳甜(小于8.7ng/mL)。相反,在含有仅用aspCproA/PESC-His构建物转化的YPH500细胞的培养物的细胞提取物中没有检测到莫纳甜。
实施例9
在野生型生物体中产生莫纳甜
对于一些市场来说,可能需要未经遗传修饰的生物作为莫纳甜的产生宿主。搜索基因组数据库中已知含有4-羟基4-甲基2-氧戊二酸醛缩酶的生物体,该酶可用于产生莫纳甜。已知苜蓿中华根瘤菌、***丛毛单胞菌和稻草假单胞菌含有此醛缩酶以及芳族转氨酶。在各种条件下培养这些生物以诱导产生莫纳甜。可利用经典诱变技术提高这些生物产生莫纳甜的效价。
材料
除非另有说明,所有试剂的纯度都是培养基级或更高。TY培养基含有(每L)6g胰蛋白胨、3g酵母提取物、9mM CaCl2。将胰蛋白胨和酵母提取物溶解于纳米纯水中,将pH调节到7.2。将体积调节到991ml,用高压灭菌混合物。单独地制备一摩尔氯化钙,过滤除菌,加入新鲜高压灭菌的培养基中。
根据ATCC(ATCC 1702)的指导制备对羟基苯甲酸(PHB)培养基。溶液A(990ml)含有3g(NH4)2SO4、1.6gK2HPO4、2.5gNaCl、0.5g酵母提取物和3g4-羟基苯甲酸。溶液B(10ml)含有0.27gMgSO4-7H2O。溶液A和B分别高压灭菌,冷却后混合,制备成溶液C。向此新鲜制备的溶液C中加入1ml含有0.05gFe(NH4)2(SO4)2-6H2O(用前过滤除菌)的溶液。用6N NaOH将最终培养基的pH调节到7.0。
在0.1M磷酸钠pH7中制备10g/LL-色氨酸溶液,过滤除菌。一般将十分之一体积加入培养物中,如下所述。也制备10%丙酮酸钠溶液,过滤除菌。每升培养物一般使用10ml等份。
制备M9极限培养基平板,如Sambrook等(编),《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第二版,第1-3卷,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y,1989所述,如下所述制备制备根瘤菌极限培养基平板。每升培养基中含有15g琼脂、0.1g酵母提取物、1g(NH4)2SO4、7gK2HPO4、2gKH2PO4、0.1gMgSO4-7H2O、0.02gZnSO4-7H2O、0.0025gNiCl2-6H2O和4mL1M CaCl2(过滤除菌,高压灭菌后加入)。加入各种浓度的碳源和酪蛋白氨基酸,如下文所述。
方法
将苜蓿中华根瘤菌1021(ATCC 51124)接种于TY培养基中,而在营养肉汤(Difco)中培养***丛毛单胞菌(ATCC 49249)和稻草假单胞菌(ATCC 33636)。在26℃下培养所有菌株。生长2天后,用2mL培养物接种100mL新鲜制备的PHB培养基。用PHB作为唯一碳源和能源培养1小时后(这可诱导***丛毛单胞菌中包含醛缩酶的途径),加入10mL色氨酸和1mL丙酮酸。细胞生长60小时,所有培养物的最终pH为8-9。
60小时后所记录的600nm处的吸光度如下:苜蓿中华根瘤菌,3.35;稻草假单胞菌,1.28;***丛毛单胞菌,1.93。
3500rpm,4℃离心细胞20分钟。将沉淀冷冻在-80℃,直到进行加工。过滤上清(发酵液),用于LC/MS分析。使结果标准化,以说明生物质的量差。用BugBuster试剂(Novagen)处理细胞沉淀,如实施例1所述,用SDS-PAGE分析得到的细胞提取物,过滤用于LC/MS。由于裂解效率的不同,用指出细胞蛋白质相对量的280nm处吸光度使结果标准化。制备在PHB上生长的细胞的相似细胞提取物,不加入色氨酸和丙酮酸,在一种情况下(苜蓿中华根瘤菌),在TY培养基而不是PHB上培养细胞。
生长几天后,在SDS-PAGE上醛缩酶预计大小处没有明显的条带。在PD10柱上使这些细胞提取物脱盐,测定来自吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸和谷氨酸的莫纳甜或莫纳甜前体的体外产量。1mL测定混合物中含有100mM Tris-HCl(pH7)、2mM MgCl2、1mM磷酸钾(pH8)、0.05mM PLP、酶(细胞提取物)以及吲哚-3-丙酮酸(在乙醇中制备的)、谷氨酸和丙酮酸钠各6mM。通过加入0.5mL脱盐的细胞提取物启动反应,在37℃下孵育30分钟,过滤,冷冻于-80℃,然后进行LC/MS分析。
如实施例6所述进行LC/MS检测。对于体外测定而言,用无细胞提取物进行阴性对照,以确定底物与镁和磷酸盐反应产生的莫纳甜或MP的基线量。结果见表7-9。数字反映LC-MS分析中Electrospray峰高,由于在一些情况下难以对面积积分。这些数字基本与莫纳甜浓度成正比,用于寻找定性趋势。
表7
体内结果:发酵液分析
LC/MS色谱分析说明,与另外两种生物相比,***丛毛单胞菌菌株可代谢供给的较大百分率的色氨酸,尽管它似乎不提高所检测的莫纳甜水平。这些结果提示,该细胞分泌莫纳甜的效率不高。因此,也用LC/MS分析了细胞提取物(表8)。
表8
细胞提取物分析
在培养液和细胞提取物中缺少可检测水平的MP说明MP在此特定基质中不稳定。不能检测到加入色氨酸和丙酮酸的任何效果,除了注意到在丛毛单胞菌的情况下产生了益处。后来的实验说明,加入色氨酸和丙酮酸的时机非常重要,在不正确的时间加入可能对培养物的生长产生不良影响。不知道色氨酸和丙酮酸是否被这些野生型生物有效吸收,或大浓度的这些底物加入培养基的结果产生基因表达的什么变化。虽然仅了解对羟基苯甲酸底物在丛毛单胞菌中能诱导醛缩酶,但它似乎也提高了苜蓿中华根瘤菌产生莫纳甜的水平。
为确认苜蓿中华根瘤菌和***丛毛单胞菌的细胞提取物中存在能够从吲哚-3-丙酮酸产生莫纳甜的酶,如上所述进行体外测定。使细胞提取物脱盐,以去除培养物中任何残留的莫纳甜。细胞培养条件见表9左侧,莫纳甜的MS峰高见右侧一栏。
表9
细胞提取物的体外结果
表9中所示结果定性地证明与阴性对照相比,由这些过滤的细胞提取物形成莫纳甜。表的最后一行的阴性对照表示化学诱导的醇醛缩合。在没有过量色氨酸的PHB上培养的细胞产生的莫纳甜信噪比很低,说明加入色氨酸可诱导天然芳族转氨酶的表达。来自在TY上生长的细胞的苜蓿中华根瘤菌细胞提取物似乎含有至少一种其它污染物,该污染物干扰了定量,因为质谱和UV谱显示出阳性对照和其它样品的差异不同。苜蓿中华根瘤菌293莫纳甜峰的子片段和UV谱与纯化的醛缩酶/转氨酶混合物产生的莫纳甜一致,尽管有较大分子量物质的迹象。然而,母扫描未说明较大分子与293峰相关。
用苜蓿中华根瘤菌和***丛毛单胞菌进行进一步生长实验。在含有和没有色氨酸和丙酮酸的TY和PHB培养基中培养苜蓿中华根瘤菌。此外,将吐温和氨苄青霉素加入一个PHB+色氨酸+丙酮酸培养瓶中,通透细胞。在加入和不加入色氨酸的NB或PHB培养基中培养***丛毛单胞菌。在LC/MS分析中TY培养基用作阴性对照。在所测试的两种生物中,在PHB培养基中培养的细胞所产生的莫纳甜分子量峰高高于在富营养的TY培养基中培养的细胞,且在加入色氨酸和丙酮酸时两种细胞类型峰高升高。加入吐温和氨苄青霉素大大降低中华根瘤菌细胞的生长速率,但当用OD600标准化时似乎不提高培养液中莫纳甜的水平。在PHB培养基中,培养液样品中莫纳甜相应的LC/MS信号水平比阴性对照高2-3倍。
蒸发来自苜蓿中华根瘤菌PHB实验的样品,用阳离子交换层析部分纯化。洗脱分布图看上去与其它酶产生的莫纳甜样品相似。
用莫纳甜作为主要碳源和能源的平板测定
可通过筛选在莫纳甜(或莫纳甜前体(MP))是主要碳源和能源的平板上生长来检测可合成莫纳甜的生物体。用此方法筛选需要(1)合成途径可逆,使产物、莫纳甜可通过此途径代谢和(2)该生物体具有能够输入莫纳甜或MP的转运***。测试苜蓿中华根瘤菌、稻草假单胞菌和***丛毛单胞菌在含有莫纳甜作为主要碳源和能源的极限培养基平板上生长的能力。
实验方法和结果
用0.01%酪蛋白氨基酸和0.1-0.2%碳源(葡萄糖或纯化莫纳甜)制备含有M9极限培养基或根瘤菌极限培养基平板。阴性对照平板含有酪蛋白氨基酸但不加入碳源。在富营养培养基中培养苜蓿中华根瘤菌、稻草假单胞菌和***丛毛单胞菌,至OD达到2.1-2.7,用无菌1X磷酸缓冲盐水(PBS)稀释1000倍。1-10μL体积用于涂平板。在26℃孵育平板数天。M9培养基+莫纳甜上培养的苜蓿中华根瘤菌生长好于其它测试菌株,而仅在M9培养基上不生长。重复该实验,在NB以及PHB培养基中培养***丛毛单胞菌,然后诱导。再次用M9培养基铺平板,用莫纳甜作为碳源,苜蓿中华根瘤菌的生长似乎好于其它生物体。***丛毛单胞菌也显示一些生长。采用根瘤菌极限培养基,用莫纳甜作为碳源和能源,***丛毛单胞菌的生长好于用葡萄糖作为碳源。此外,在较高稀释度(10-6),与NB上生长的接种物相比,采用PHB上生长的接种物能增加得到的菌落数量和大小。
为保证不发生污染,用HMG醛缩酶基因引物进行菌落-PCR来分析来自各种***丛毛单胞菌平板的4个菌落。所有4个菌落产生的PCR产物都约为750bp(正确大小),而阴性对照不含产物。再将这些菌落在PHB平板上划线,再次发现它们能够生长。重复用PHB生长液体培养物和M9平板进行的***丛毛单胞菌的平板实验,离心下细胞,用1XPBS洗涤,重悬于1XPBS,然后涂平板。获得的菌落数量与葡萄糖平板相当,而阴性对照不含菌落。
这些结果,以及中华根瘤菌和几种假单胞菌含有用于体外产生莫纳甜的醛缩酶基因的事实说明,这些生物体在不导入异源基因时能产生莫纳甜。很明显,生长培养基、加入底物如色氨酸和丙酮酸以及加入影响细胞壁的成分是提高这些野生型生物体产生的莫纳甜水平的重要因素。理解这些生物体中醛缩酶和芳族转氨酶基因的表达和对表达的影响能改进莫纳甜产生。预计经典诱变技术可用于提高产率。
采用不同给料方案的其它实验
用底物和辅因子的不同给料方案重复改进的稻草假单胞菌、***丛毛单胞菌和苜蓿中华根瘤菌培养物摇瓶实验,并用LC/MS/MS MRM分析。
方法
在PHB培养基中培养稻草假单胞菌和***丛毛单胞菌。如上所述在补充有3.75ml 20%酵母提取物和2ml 50%葡萄糖的PHB培养基中培养苜蓿中华根瘤菌。让起始培养物生长,并接种入1L摇瓶中的250ml培养基。将所有培养物在29℃、250rpm振荡孵育过夜,至OD600达到~0.5-1.1。
实施加入底物、辅因子和物质(表10和11中列出的成分)以促使莫纳甜流出的的给料方案,如下表每250ml培养物中有:
表10
第2天:加入
第2天加入后,在25℃、90-100rpm振荡孵育培养物。
表11
第3天:加入
第3天加入后,培养物生长约8小时,然后离心培养物以分离细胞。过滤上清,用LC/MS/MS分析莫纳甜(参见实施例6)。从细胞沉淀中制备细胞提取物如下:将沉淀重悬于1X磷酸缓冲盐水,将悬浮液通过两次French压(~20,000psi),然后离心去除细胞碎片。
表12
结果:莫纳甜形成(ppb)
用LC/MS/MS MRM法分析过滤的发酵液样品确定地证明莫纳甜由***丛毛单胞菌和稻草假单胞菌产生(参见表12)。用实施例6所述的FDAA衍生法确认,在***丛毛单胞菌样品中形成S,S莫纳甜。
由实验2条件分析过滤的细胞提取物证明,苜蓿中华根瘤菌也在胞内产生莫纳甜。在苜蓿中华根瘤菌的发酵液中没有检测到莫纳甜,说明该生物体不分泌莫纳甜。然而,当检测来自实验2条件的此培养物的细胞提取物时,用反向LC/MS/MS鉴定多种莫纳甜异构体。这些异构体鉴定为S,S或R,R和S,R或R,S莫纳甜。这些分析说明,至少两种莫纳甜异构体由苜蓿中华根瘤菌产生。产生多种莫纳甜异构体的生物可用作体外产生特定莫纳甜立体异构体的酶来源。
总之,上述结果清楚地证明稻草假单胞菌、***丛毛单胞菌和苜蓿中华根瘤菌产生莫纳甜或用作可在异源宿主中表达的莫纳甜操纵子的基因来源的潜力。
在重组大肠杆菌中筛选丙酮酸醛缩酶的选择方法
之前描述了在以核糖作为碳源的M9极限培养基上生长时需要补充丙酮酸的大肠杆菌菌株(J.Bacteriol.1995.177:5719-5722)。该菌株的基因型是:ΔpykAΔpykF。用Datsenko和Wanner(PNAS.2000.97:6640-6645)的方法可产生双敲除。这些菌株可形成产生丙酮酸的醛缩酶筛选的基础,以筛选对特定莫纳甜立体异构体、特定莫纳甜前体的立体异构体、或者莫纳甜或莫纳甜前体的类似物更有活性的醛缩酶。莫纳甜前体类似物包括被鉴定为proA醛缩酶或KHG醛缩酶底物的化合物,如4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸、4-羧基-4-羟基-2-氧己二酸、4-羟基-4-甲基-2-氧己二酸或在醛醇反应中能转化为丙酮酸的其它富含羧基的化合物。可以使用的莫纳甜类似物的例子是4-羟基-4-甲基谷氨酸,可用测试细胞中的天然转氨酶使其容易地转氨成4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸(proA的底物)。
克隆
将以下引物用于产生pykA敲除:
5′-ATGTCCAGAAGGCTTCGCAGAACAAAAATCGTTACCACGTTAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′(SED ID NO:85)和
5′-CTCTACCGTTAAAATACGCGTGGTATTAGTAGAACCCACGGTACCATATGAATATCCTCCTTAG-3′(SED ID NO:86)。
将以下引物用于产生pykF敲除:
5′-AGGACGTGAACAGATGCGGTGTTAGTAGTGCCGCTCGGTACCAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3′(SED ID NO:87)和
5′-ATGAAAAAGACCAAAATTGTTTGCACCATCGGACCGAAAACCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3′(SED ID NO:88)。
用标准方案以pKD3或pKD4为模板进行PCR反应。将PCR产物电穿孔入表达λ红同源重组***的大肠杆菌菌株中。PCR产物与ykA或pykF同源,将其重组入染色体的那些位点中。当发生双交叉时,得到的后代携带缺失的pykA或pykF基因和抗生素抗性标记。用标准的P1转导技术将具有抗生素抗性标记的缺失基因转导入大肠杆菌菌株(MG1655)。
菌株分析
测试双敲除在极限培养基(补充Balch维生素溶液,Balch改良的痕量元素溶液(Balch,W.E.,G.E.Fox,L.J.Magrum,C.R.Woese,和R.S.Wolfe.1979.“甲烷微生物:再次评价独特的生物类群”(Methanogens:reevaluation of a unique biologicalgroup).Microbiol.Rev.43:260-296),0.4%D-核糖的M9盐(Difco))上的生长。未观察到双突变体的生长,除非培养基中还包括5mM丙酮酸。在存在和不存在丙酮酸的情况下,野生型MG1655都在上述培养基上生长。测试双敲除在补充有0.4%葡萄糖而不是核糖的上述极限培养基上的生长。在该培养基上的生长与用野生型菌株观察到的类似。用此培养基。通过ptsI基因产物(从磷酸烯醇丙酮酸制造丙酮酸并将磷酸转移给葡萄糖的磷酸转移酶***的酶)从葡萄糖产生丙酮酸。用补充有0.4%L-***糖或0.4%D-木糖而非核糖的上述培养基测试双敲除菌株的生长。在这些5碳(非PTS)底物上生长不产生丙酮酸。在这些条件下双敲除不生长,除非补充5mM丙酮酸,而野生型菌株在存在或不存在丙酮酸的情况下正常生长。
用pBAD TOPO TA表达试剂盒(Invitrogen)将来自***丛毛单胞菌的proA醛缩酶基因(如实施例2所述,克隆在pET30Xa/LIC中)和实施例3所述aspC/proA基因(克隆在pET30Xa/LIC和pET32中)亚克隆入pBAD-TOPO中。在这些构建物中,基因的表达受可诱导araBAD启动子的调节。在***糖(如0.4%)和IPTG的存在下,表达基因。除非补充丙酮酸或丙酮酸来源,该菌株在极限培养基上不生长。该培养基可补充莫纳甜、莫纳甜前体、或者莫纳甜或莫纳甜前体的类似物。文献中所用底物的一般范围是0.5-5mM。例如,倘若该菌株(利用)丙酮酸来源并能够在含有0.4%***糖的极限培养基上生长,proA醛缩酶可将莫纳甜前体转化成丙酮酸和吲哚-3-丙酮酸。表达proA和aspC基因的构建物可将莫纳甜转化成莫纳甜前体,并将莫纳甜前体转化成丙酮酸和吲哚-3-丙酮酸。此***可用于筛选醛缩酶和筛选对特定的莫纳甜立体异构体、特定的莫纳甜前体立体异构体、或者莫纳甜或莫纳甜前体的类似物更有活性的醛缩酶。例如,如果对实施例2所示的任何醛缩酶实施定向进化,平板测定可利用含有R或S莫纳甜前体的培养基测量得到的突变酶的对映异构体特异性。如果在含有R-莫纳甜前体的平板上出现生长和在含有S-莫纳甜前体的平板上生长少或不生长,醛缩酶对在反应位点上具有R-手性的底物特异。
制备含有1×Balch维生素溶液和Balch改良的痕量元素溶液(Balch,W.E.,G.E.Fox,L.J.Magmm,C.R.Woese,和R.S.Wolfe.1979.“甲烷微生物:再次评价独特的生物类群”(Methanogens:reevaluation of a unique biologicalgroup)Microbiol.Rev.43:260-296)的M9极限培养基平板。包括葡萄糖或***糖作为碳源(0.4%w/v),平板补充5 mM溶解于20 mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)的莫纳甜(R,R;S,S消旋混合物)或不含莫纳甜的等体积磷酸钾缓冲液。下表13中小结了生长情况:
表13
预计可通过控制proA和AspC的水平、提高莫纳甜的摄取、用莫纳甜前体代替莫纳甜(在此情况下不需要存在转氨酶)、或用如上所述莫纳甜的疏水性较小的类似物来优化筛选。提高莫纳甜的摄取的方法包括加入氨基酸混合物、加入特定氨基酸和使用去污剂、抗生素、抗生素类似物或促进细胞壁通透的酶。多粘菌素B九肽(Dixon和Chopra.1986.Antimicrobial Agents and Chemotherapy.29:781-788)和微囊藻素RR(Dixon、Al-Nazawi和Alderson.FEMS Microbiology Letters.2004.230:167-170)被描述为通透大肠杆菌的外膜的物质。
预计其它启动子***/质粒可用于此筛选***,获得相同结果。例子包括T7启动子***和IPTG诱导的启动子如taq和lac。
合成莫纳甜和莫纳甜前体(MP)类似物
用Shannon和Marcus(1962)或Prey等(1955)或Waldmann等(1954)合成莫纳甜前体(MP)类似物4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸。用Tack等(1972)的方法或Martius(1943)的方法合成莫纳甜前体(MP)类似物4-羧基-4-羟基-2-氧己二酸。
通过在氨基供体谷氨酸的存在下与aspC转氨酶反应,从4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸生物合成莫纳甜类似物4-羟基-4-甲基谷氨酸,如实施例4的转氨基活性一节中所述。
实施例10
通过敲除硫辛酸生物合成基因提高大肠杆菌中的丙酮酸产量
硫辛酸生物合成途径中断可提高大肠杆菌中的丙酮酸产量,这可有益于体内莫纳甜产生。如果很少或没有硫辛酸可用作丙酮酸脱氢酶的辅因子,那么从丙酮酸形成乙酰辅酶A有限。DE3菌株可用于从pET30Xa/LIC中的T7启动子表达莫纳甜操纵子。BW25113ΔlipA::cam菌株用作将lipA敲除(氯霉素***)P1转导入过量产生色氨酸的大肠杆菌菌株7692中的供体菌株。使大肠杆菌7692ΔlipA和BW25113ΔlipA突变体溶原化,以进行T7表达。
菌株
大肠杆菌菌株BW25113和大肠杆菌CGSC 7692获自Genetic Stock Center(YaleUniversity)。大肠杆菌CGSC 7692的基因型如下:W3110tnaA2trpEFBR19(Doolittle和Yanofsky,J.Bacteriol.,(1968)95:1283-1294;和Yanofsky等,J.Bacteriol.,(1984)158:1018-1024)。此菌株含有抗反馈的邻氨基苯甲酸合酶基因(trpE),它是色氨酸生物合成中的关键分支点和调节点。
BW25113ΔlipA::cam构建物由Hans Liao博士提供(WO02085293A)。
材料和方法
P1噬菌体购自ATCC(Manassas,VA),目录#25404-B1。λ(DE3)溶原化试剂盒购自Novagen(Madison,WI)。除非另有说明,所有试剂都是培养基级或更高。
采用含有以下物质的丙酮酸过量表达培养基:50g/L葡萄糖(高压灭菌后加入);10g/gH4)2SO4;4g/L蛋白胨(Fisher);1g/L K2HPO4;2g/l NaCl;0.5g/IMgSO4-7H2O;14.7mg/L CaCl2-2H2O(高压灭菌后加入);和1μg/L硫辛酸(高压灭菌后加入)。用NaOH将丙酮酸过量表达培养基的pH调节到8。
遗传操作大肠杆菌菌株
用Miller(Miller,J.H.,“细菌遗传学短期教程”(A short course in bacterialgenetics):Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1992)的方法进行P1转导。用大肠杆菌BW25113ΔlipA::cam细胞建立P1裂解物。然后将分离的P1噬菌体用于转导大肠杆菌CGSC 7692。通过在含有34μg/ml氯霉素和10nM硫辛酸的LB平板上生长来选择感兴趣的克隆。通过在含有和没有硫辛酸的平板上进行生长比较,并通过PCR筛选和分析PCR产物的正确大小和限制性图来确认硫辛酸合酶的缺失。
用NovagenλDE3溶原化试剂盒按照厂商方案进行大肠杆菌菌株CGSC 7692、7692ΔlipA和BW25113ΔlipA的λDE3溶原化。利用在没有T7 RNA聚合酶的情况下不能形成噬斑的T7测试噬菌体(4107)确认DE3噬菌体的存在。通过用aspC/pET30Xa/LIC构建物进行的表达研究进一步确认溶原化。
检测丙酮酸
用甲酸处理来自体外或体内生化反应实验的待分析丙酮酸的样品,以将pH降低到3以下,然后通过0.45μm尼龙注射器滤器过滤,然后进行LC/MS分析。丙酮酸的鉴定基于保留时间和质量选择性检测。用Waters 2690液相色谱***和2.1mm×250mm Phenomenex Aqua C18反向色谱柱进行LC分离,40℃等度洗脱。LC流动相是含有0.1%(v/v)甲酸的1%甲醇水溶液,流速为0.18mL/分钟。
分析丙酮酸的检测***包括Waters 996光电二极管阵列(PDA)检测器和WatersMicromass ZQ四极质谱仪。将在195-225nm操作、用于监测色谱图PDA串联置于色谱***和质谱仪之间。为提高丙酮酸的[M-H]-离子的稳定性,在进入质谱仪之前,以0.025mL/分钟的速率加入串联式后柱添加剂1%(v/v)NH4OH的异丙醇溶液和水。
操作于负电喷雾电离模式(-ESI)下的Micromass ZQ四极质谱仪的参数设置如下:毛细管:2.0kV;圆锥:30V;抽提器:4V;RF透镜:1V;来源温度:120℃;去溶剂化温度:380℃;去溶剂化气体:600L/h;圆锥气体:关;低质量分辨率:15.0;高质量分辨率:15.0;离子能量:0.2;倍增器:650。建立单离子监测MS实验,以选择性检测m/z87,它是丙酮酸的去质子化分子的[M-H]-离子。
生长实验
在125mL摇瓶中培养20mL BW25113、BW25113ΔlipA、BW25113ΔlipA(DE3)、CGSC 7692、7692ΔlipA、7692(DE3)和7692ΔlipA(DE3)的培养物,摇瓶中含有10nM硫辛酸的2YT培养基(Sambrook等)。24小时后,取出发酵液样品进行分析,加入20g/L葡萄糖。培养物再生长24小时,然后收获细胞,过滤发酵液,用LC/MS进行分析,如上所述。遗传敲除硫辛酸生物合成的益处见图14,7692ΔlipA和BW25113ΔlipA细胞能够产生比含有lipA基因的CGSC 7692和BW25113细胞更多的丙酮酸。在含有50g/L葡萄糖的过量产生丙酮酸的培养基中重复该实验(Yokota等,(1997).J.Ferment.Bioeng.,83:132-138)。生长24、48和72小时后,取出两个样品,用LC/MS分析丙酮酸。结果见图15,用不同培养基确认了图14的结果。7692构建物的产量似乎高于2YT培养基。预计在其它微生物中的相似遗传突变将具有相似效果。
实施例11
在缺少硫辛酸合酶基因的大肠杆菌构建物中产生莫纳甜
在实施例10中,在lipA基因缺失的大肠杆菌构建物中丙酮酸产量提高。用莫纳甜操纵子(实施例7所述的aspCproA/pET32b构建物)转化lipA敲除的DE3菌株,并评价它们表达诱导蛋白和产生莫纳甜的能力。当诱导数小时后色氨酸加入培养物中时,用莫纳甜操纵子转化的大肠杆菌BW25113ΔlipA(DE3)构建物产生8-9ng/mL生物莫纳甜。在不供给色氨酸的情况下,用莫纳甜操纵子转化的过量产生色氨酸的大肠杆菌菌株7692ΔlipA(DE3)产生约2ng/mL莫纳甜。用莫纳甜操纵子转化但含有lipA基因的大肠杆菌7692(DE3)构建物不产生任何可检测的莫纳甜。
制备大肠杆菌7692(DE3)、7692ΔlipA(DE3)和BW25113ΔlipA(DE3)的电感受态细胞
在37℃振荡培养200毫升大肠杆菌7692(DE3)、7692ΔlipA(DE3)和BW25113ΔlipA(DE3)在LB培养基(如果ΔlipA则含有12.5μg/mL氯霉素和10nMα-硫辛酸)中的培养物,至OD650达到0.45-0.5。在冰浴中冷却后,4,000×g4℃离心培养物10分钟。倾去上清,将细胞沉淀各自悬浮于200mL冰冷的无菌水中。再离心,将细胞沉淀各自悬浮于20mL冰冷的无菌水中。第三次离心后,将细胞沉淀各自悬浮于2mL冰冷的10%甘油中。将第四次离心产生细胞沉淀悬浮于0.15mL冰冷的10%甘油中,将悬浮液分成40μL等份,冷冻在-80℃。
在Bio-Rad电穿孔手册所述的标准条件下用Bio-Rad基因脉冲器II装置通过电穿孔用莫纳甜操纵子构建物(aspCproA/pET32)转化大肠杆菌7692(DE3)、7692ΔlipA(DE3)和BW25113ΔlipA(DE3)电感受态细胞。分析能够在含有100mg/mL氨苄青霉素(如果ΔlipA则含有20nMα硫辛酸)的LB平板上生长的克隆表达醛缩酶和转氨酶基因的能力。
在37℃振荡培养2个7692(DE3)克隆在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB中的50mL培养物,至OD650为0.5和0.9之间。此外,在37℃振荡培养1个7692DlipA(DE3)克隆和1个BW25113ΔlipA(DE3)克隆在含有100μg/mL氨苄青霉素和10nMα硫辛酸的LB中的50mL培养物,至OD650为0.5和0.9之间。通过加入0.1mM IPTG诱导基因表达,在30℃将培养物再振荡孵育4小时。通过4,000rpm离心10分钟收获细胞,用50mM MOPS,pH7缓冲液洗涤,再离心。根据厂商方案用含有苯甲酸酶核酸酶和Calbiochem蛋白酶抑制剂混合物III的Novagen BugBusterTM试剂制备细胞提取物。用4-15%梯度凝胶(Bio-Rad,Hercules,CA)SDS-PAGE分析细胞提取物的蛋白表达水平。醛缩酶和转氨酶在所有宿主中表达良好,在LB培养基上生长时,表达水平与大肠杆菌BL21(DE3)宿主中观察到的相似。
在用aspCproApET32转化的大肠杆菌7692(DE3)、7692ΔlipA(DE3)和BW25113ΔlipA(DE3)细胞中产生莫纳甜
在这些实验中,如上所述培养和诱导用aspCproA/pET32转化的大肠杆菌菌株。将色氨酸和丙酮酸加入这些培养物中,分析胞内和胞外样品中产生的莫纳甜。
在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基上制备用aspCproA/pET32转化的大肠杆菌7692(DE3)、7692ΔlipA(DE3)和BW25113ΔlipA(DE3)细胞的新鲜平板。用于Δlip4菌株的平板也含有10nMα硫辛酸。接种来自单菌落的过夜培养物(5mL),在含有100μg/mL氨苄青霉素和10nMα硫辛酸的LB培养基中37℃下培养。将1mL过夜培养物用作接种物,接种到100mL含有100μg/mL羧苄青霉素和10nMα硫辛酸的trp-1培养基中。在37℃振荡孵育培养物,直到OD650达到约0.5。通过加入1mMIPTG诱导基因表达,再在30℃振荡孵育培养物4小时。在诱导基因表达时,加入吡哆醇(终浓度0.5mM)以及1纳摩尔α硫辛酸。诱导4小时后,将25mL等份的trp-1培养基和0.05mL 100mg/mL羧苄青霉素(5mg)加入培养物,继续在30℃振荡孵育。诱导18小时后,将0.04mM吡哆醛磷酸盐的磷酸钾(50mM,pH7.2)溶液加入所有培养物。用aspCproA/pET32转化的大肠杆菌7692(DE3)和7692ΔlipA(DE3)培养物接受葡萄糖(0.2g)和吐温-20(终浓度0.2%)。大肠杆菌BW25113ΔlipA(DE3)构建物培养物接受固体色氨酸(终浓度50mM)和吐温-20(终浓度0.2%)。将所有3种培养物的pH调节到8.2-8.4,继续在30℃孵育。在用IPTG诱导0、4、18(加入前)、19、24和48小时后,取出用于分析莫纳甜(0.5mL)和蛋白产量(5-10mL)的样品。
用LC/MS或LC/MS/MS测量发酵液样品中的莫纳甜浓度,如实施例6所述。
在来自用aspCproA/pET32转化的大肠杆菌7692ΔlipA(DE3)培养物的18小时样品中,检测到发酵液中莫纳甜浓度约为2ng/mL。在24-72小时取出的样品中没有检测到莫纳甜。在来自用aspCproA/pET32转化的大肠杆菌7692(DE3)培养物的任何样品中没有检测到莫纳甜。然而,在用aspCproA/pET32转化的大肠杆菌BW25113ΔlipA(DE3)培养物的48和72小时发酵液样品中检测到莫纳甜的浓度为8-9ng/mL。
根据Novagen方案用含有苯甲酸酶核酸酶和Calbiochem蛋白酶抑制剂混合物III的Novagen BugBusterTM试剂制备细胞提取物。用4-15%梯度凝胶(Bio-Rad,Hercules,CA)SDS-PAGE分析细胞提取物的蛋白表达水平。对于用aspCproA/pET32转化的大肠杆菌7692(DE3)样品而言,在24小时细胞提取物样品中表达蛋白的浓度水平最高。对于用aspCproA/pET32转化的大肠杆菌7692ΔlipA(DE3)细胞提取物样品而言,4小时和18小时样品中表达蛋白的浓度水平最高。在这些样品中,醛缩酶多肽约占可溶性蛋白的15%,而转氨酶多肽似乎占可溶性蛋白>30%。在生长于trp-1培养基中的用aspCproA/pET32转化的大肠杆菌BW25113ΔlipA(DE3)培养物中这两种多肽也不表达。然而,在18和24小时细胞提取物样品中表达水平似乎最高,但没有一个多肽大于总可溶性蛋白的10-15%。
这些结果证明,用IPTG诱导后,所有用aspCproA/pET32转化的菌株都产生蛋白。2株菌株缺失lipA基因(大肠杆菌BW25113ΔlipA(DE3)和7692ΔlipA(DE3))用aspCproA/pET32转化的菌株在无丙酮酸供给的情况下产生莫纳甜。这说明,lipA基因敲除对体内产生莫纳甜有益。过量产生色氨酸的大肠杆菌菌株7692ΔlipA(DE3)能在不加入色氨酸或丙酮酸的情况下产生莫纳甜。然而,莫纳甜产量水平大大低于供给色氨酸和丙酮酸的大肠杆菌构建物所产生和分泌的量(参见例如,实施例7的表5)。
实施例12
在过量产生色氨酸和丙酮酸的大肠杆菌构建物中产生莫纳甜
当用含有aspC和proA基因的质粒以及含有色氨酸操纵子的第二个操纵子转化时,评价缺少lipA基因的过量产生色氨酸的大肠杆菌菌株NRRL 12264产生莫纳甜的能力。诱导基因表达后,测量莫纳甜和色氨酸。
菌株
在实施例15中,检测美国专利号4,371,614引用为色氨酸过量产生菌株的3株菌株在两种培养基配方中产生色氨酸的能力。1株NRRL B-12262(也称为AGX15,具有引用的基因型serB-、trpΔED、tnaA2-、tetS、tyrA-、pheA-)携带称为pGX44的质粒,该质粒衍生自pBR322(Roeder和Somerville,Molec.Gen.Genet.,1979,176:361-368)并含有serB基因和色氨酸操纵子。另1株NRRL B-12264(也称为AGX6,具有引用的基因型serB-、trpΔED、tnaA2-、aroP-)含有称为pGX50的质粒,该质粒衍生自pBR322并含有serB基因、获自5-甲基色氨酸抗性细胞的色氨酸操纵子和氨苄青霉素抗性基因。对这2株菌株进行以下遗传操作,分析衍生自NRRL B-12264的菌株的莫纳甜产量。
遗传操作
如实施例10所述,进行P1转导以缺失lipA基因和大肠杆菌NRRL菌株12262和12264的λDE3溶原化。通过在有和没有硫辛酸的平板上进行生长比较,并通过PCR筛选和分析PCR产物的正确大小和限制性图来确认硫辛酸合酶的缺失。利用T7测试噬菌体和当用aspCpET30(Xa/LIC)转化时表达aspC基因的能力来确认DE3噬菌体的存在。通过在含有丝氨酸和色氨酸而不含氨苄青霉素的富营养培养基上重复传代从菌株12262中消除质粒pGX44和从菌株12264中消除质粒pGX50。通过丧失在氨苄青霉素存在下生长的能力来确认菌株12264中的消除。
制备大肠杆菌12262ΔlipA(DE3)和12264ΔlipA(DE3)的电感受态细胞
如实施例10所述制备大肠杆菌12264ΔlipA(DE3)和12262ΔlipA(DE3)的电感受态细胞。最后洗涤和和重悬于冰冷的10%甘油后,将细胞分成40μL等份并冷冻于-80℃。
构建含有色氨酸操纵子的质粒
用Qiagen QIAprep离心小抽试剂盒从菌株12262中纯化质粒pGX44和从菌株12264中纯化质粒pGX50。如实施例1所述,从大肠杆菌菌株DH10B(Invitrogen;Carlsbad,CA)中分离大肠杆菌基因组DNA。
设计引物,用KpnI和BamHI限制性位点将来自大肠杆菌菌株DH10B的质粒pGX44、pGX50和基因组DNA的色氨酸操纵子克隆入pPRONco质粒中。该质粒是pPROLar.A122载体的衍生物(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA),其中通过突变T1538C去除了一个NcoI位点。色氨酸操纵子(Genbank登录号:NC_00913.2GI:49175990 1320970-1314440)含有以下基因的开放阅读框:trpE、trpD、trpC、trpB和trpA。基因产物的GenBank登录号如下:trpE,GenBank登录号:NP_415780.1GI:16129225;trpD,GenBank登录号:NP_415779.1 GI:16129224;trpC,GenBank登录号:NP_415778.1 GI:16129223;trpB,GenBank登录号:NP_415777.1 GI:16129222;trpA GenBank登录号:NP_415776.1 GI:16129221。
N末端:5′-CGGGGTACCCATGCAAACACAAAAACCGACTCTCGAACTG-3′(SEQ ID NO:79)
C末端:5′-CGCGGATCCTTAACTGCGCGTCGCCGCTTTCAT-3′(SEQ ID NO:80)。以下PCR方案用于基因扩增:在50μL反应中,加入100-300ng DNA模板,1.0μM各引物,0.2mM各dNTP,0.75U pfuUltra HF聚合酶(Stratagene;LaJolla,CA),2.5 U Expand High FidelityTM聚合酶(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis,IN)和含有Mg的1X ExpandTM缓冲液。利用热循环程序如下:94℃热启动5分钟;然后是30个以下步骤的循环:变性步骤94℃(30秒),退火步骤61.5℃(1分钟)和延伸步骤72℃(8分钟);最后是终止步骤72℃(7分钟)。用Qiagen QIAquick凝胶抽提试剂盒(Valencia,CA)从1%琼脂糖凝胶中纯化扩增的DNA。
依次用购自NEB(Beverly,MA)的BamHI和KpnI按照厂商方案消化PCR产物和pPRONco载体。双消化后,用Qiagen QIAquick PCR清洁试剂盒从蛋白质和缓冲液盐中纯化DNA。也根据厂商的推荐用小虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals,Indianapolis,IN)处理载体,然后进行第二步清洁步骤。通过测量260nm处的吸光度定量纯化的DNA,并用T4连接酶(NEB)连接,***物与载体之比为>8-1。如Bio-Rad电穿孔手册所述,在标准条件下用0.1cm小杯和Bio-Rad基因脉冲器II***将连接混合物转化入电感受态大肠杆菌DH10B细胞中。通过限制性分析鉴定含有色氨酸操纵子的克隆,用DNA测序确认。来自大肠杆菌DH10B和pGX44(大肠杆菌菌株12262)的色氨酸操纵子基因的核酸序列相同,与NCBI数据库一致(参见上述登录号),而来自pGX50(大肠杆菌菌株12264)的色氨酸操纵子显示trpE基因中出现15个突变,但与trpD、trpC、trpB和trpA基因中的DH10B和pGX44序列相同。pGX44的trpE基因中的突变如下:G30A(沉默)、T61C(沉默)、C63G(沉默)、G160A(沉默)、T189A(沉默)、C210T(沉默)、C211A(Gln72Lys)、A217G(沉默)、C218T(沉默)、T220A(沉默)、C229T(沉默)、C232T(沉默)、C241G(沉默)、G281A(Ser94Asn)、C349T(沉默)。SEQ ID NO:81和82分别列出来自pGX50的trpE基因的核酸和氨基酸序列。
大肠杆菌菌株12262ΔlipA(DE3)和12264ΔlipA(DE3)的转化
通过在Bio-Rad电穿孔手册所述标准条件下用Bio-Rad基因脉冲器II装置进行电穿孔,用aspCproApET32转化(如实施例10所述)或用aspCproApET32和上述色氨酸操纵子构建物之一共转化大肠杆菌12264ΔlipA(DE3)和12262ΔlipA(DE3)电感受态细胞。选择能够在含有100mg/L氨苄青霉素和20nMα硫辛酸的LB平板上生长的克隆(aspCpro ApET32转化的菌株)或在100mg/L氨苄青霉素、50mg/L卡那霉素和20mMα硫辛酸的LB平板上生长的克隆(aspCproApET32和色氨酸操纵子转化菌株)进一步分析。
在用含有aspC和proA基因和色氨酸操纵子的质粒转化的大肠杆菌菌株12264ΔlipA(DE3)中产生莫纳甜
在含有合适抗生素和20nMα硫辛酸的LB培养基上制备用aspCproA/pET32,或aspCproA/pET32和DH10trp操纵子/pPRONco,或用aspCproA/pET32和pGX44trp操纵子/pPRONco,或用aspCproA/pET32和pGX50trp操纵子/pPRONco转化的大肠杆菌12264ΔlipA(DE3)的新鲜平板。接种来自单菌落的过夜培养物(5mL),在含有合适抗生素和20nMα硫辛酸的LB培养基或trp-1培养基中培养37℃下培养(如实施例1和7所述)。携带aspCproA/pET32和pGX50trp操纵子/pPRONco的菌株在trp-1或LB的液体培养基中不生长,不能进一步使用。1-2mL各过夜培养物接种于100mL含有合适抗生素、0.4%酪蛋白氨基酸、0.1%Balch维生素溶液和20nMα硫辛酸的trp-1培养基。1L Balch维生素溶液含有以下成分:对氨基苯甲酸(5.0mg)、叶酸(2.0mg)、生物素(2.0mg)、烟酸(5.0mg)、泛酸钙(5.0mg)、核黄素(5.0mg)、硫胺素盐酸盐(5.0mg)、吡哆醇盐酸盐(10.0mg)、维生素B12(0.1mg),和α硫辛酸(0.1mg)。用NaOH将pH调节到7.0,使用前将溶液过滤除菌。
在37℃振荡孵育菌株。仅携带aspCproA/pET32载体的菌株8小时后OD600不增加,不再孵育。孵育其它培养物,直到OD600达到约0.5(约8小时)。通过加入0.2mMIPTG和0.5%***糖诱导基因表达。将0.5mM吡哆醇和1mg/mL生物素加入各培养瓶中。诱导5小时后,将0.04mM吡哆醛磷酸盐、0.5%丙酮酸钠、0.2%吐温-20和10μg/mL氨苄青霉素加入各培养瓶中,继续在30℃孵育。在用IPTG诱导0、4、16、24、40、49和67小时后,取出用于分析莫纳甜(0.5mL)和蛋白产量(5-10mL)的样品。用LC-MS/MS MRM测量发酵液样品中莫纳甜和色氨酸的浓度。结果见下表。在诱导16-24小时后取出的发酵液样品中,色氨酸和莫纳甜的浓度最高,如表14和15所示。
表14
用aspCproA/pET32和DH10trp操纵子/pPRONco转化的大肠杆菌12264ΔlipA(DE3)中的莫纳甜和色氨酸产量发酵液样品
表15
用aspCproA/pET32和pGX44trp操纵子/pPRONco转化的大肠杆菌12264ΔlipA(DE3)中的莫纳甜和色氨酸产量发酵液样品
根据Novagen方案,用含有苯甲酸酶核酸酶、r-溶菌酶和Calbiochem蛋白酶抑制剂混合物III的Novagen BugBusterTM试剂制备细胞提取物。用4-15%梯度凝胶(Bio-Rad,Hercules,CA)SDS-PAGE分析细胞提取物的蛋白表达水平。由诱导4-24小时后收获的样品制备的细胞提取物有效表达蛋白。分子量为55-59kD(trpD和trpE基因产物)和48-50kD(trpC和HIS6aspC基因产物)的蛋白表达水平高。将细胞提取物样品稀释5倍,过滤,用LC/MS/MS MRM分析。在细胞提取物样品中检测到色氨酸而非莫纳甜。在诱导16-24小时后取出的样品中测量的色氨酸浓度最高,在随后的时间点降低。预计浓度更高的细胞提取物样品显示可检测水平的莫纳甜浓度。
实施例13
在重组革兰氏阳性菌中产生莫纳甜
此实施例描述了可用于在革兰氏阳性菌如棒杆菌细胞中产生莫纳甜的方法。本领域技术人员将理解,可采用相似方法在其它细菌细胞中产生莫纳甜。此外,载体可包含用于提高莫纳甜产量的其它基因。
方法和材料
谷氨酸棒杆菌ATCC 21847获自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)。已知此菌株对各种芳族氨基酸类似物有抗性,其生长需要苯丙氨酸和酪氨酸。
所有限制性酶均购自New England BioLabs(Beverly,MA)。由Integrated DNATechnologies,Inc(Coralville,IA)合成引物,除非另有说明。棒杆菌/大肠杆菌穿梭载体、pEKEX-2获自Lothar Eggeling博士,Institute of Biotechnology 1,Forschungszentrum Jülich GmbH,52425 Jülich Germany(Eikmanns等,(1991)Gene102(1):93-8))。
构建aspCproApEKEX-2
根据已建立的方案(Sambrook,Fritsch,Maniatis等,1989)进行用于PCR、纯化DNA、连接和转化的重组DNA技术。用aspCproApET32b构建物作为模板将含有aspC和proA基因的莫纳甜操纵子克隆入pEKEX-2载体中。设计合成操纵子的引物用于PCR扩增,该引物含有KpnI限制性酶切位点且5′为aspCATG启动密码子,3′为proA终止密码子。设计的正向引物包括核糖体结合位点,5′为aspC序列,并且不包括存在于pET32构建物的His标记序列。正向引物:5′-CGGGGTACCAGAAGGAGAGATGCACGAT-GTTTGAGAACATTACCGCCGCT-3′;反向引物:5′-CGGGGTACCGCTTAGTCAAT-ATATTTCAGGC-3′(SEQ ID NO:83和84)。
以下PCR方案用于扩增莫纳甜操纵子。在50μL反应中,加入50ng模板,1.0μM各引物,0.2mM各dNTP,0.5U Pfuturbo DNA聚合酶(Stratagene,LaJolla,CA),2.8U Expand High FidelityTM聚合酶和含有Mg的1X ExpandTM缓冲液(Roche,Indianapolis,IN)。所用热循环程序包括在96℃热启动5分钟;10个以下步骤的循环:94℃30秒,59-59℃1分钟45秒(梯度热循环仪)和72℃1分钟30秒;15个以下步骤的循环:94℃30秒,59-59℃1分钟45秒和72℃1分钟30秒,每次循环增加5秒;10个以下步骤的循环:94℃30秒,59-59℃1分钟45秒和72℃2分钟45秒。35个循环后,在72℃孵育样品7分钟,然后储存于4℃。用QIAQuick PCR提纯试剂盒(Valencia,CA)纯化PCR产物,通过测量260 nm处的吸光度定量。
在37℃用KpnI消化pEKEX-2质粒2小时,然后用小虾碱性磷酸酶处理15分钟(Roche Molecular Biochemicals;Indianapolis,IN)。在37℃用KpnI消化PCR产物过夜,用QIAQuick PCR提纯试剂盒纯化两种消化物。用Roche快速DNA连接试剂盒(Indianapolis,IN)使84ng质粒和130ng PCR产物进行连接反应,以厂商推荐的大肠杆菌细胞转化方案用0.2cm微型电穿孔杯和Bio-Rad基因脉冲器II***(Hercules,CA)将得到的连接混合物转化入大肠杆菌DH10B ElectroMAX细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)。在SOC培养基中回收后,将转化混合物铺平板于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上。从LB+卡那霉素平板上挑选的菌落的液体培养物(5mL2×YT培养基+卡那霉素(50μg/mL),37℃培养过夜)中分离质粒DNA,用QIAprep离心小抽试剂盒(Qiagen)纯化。然后用限制性消化具有正确方向和大小的***物来筛选质粒,用双脱氧核苷酸链终止DNA测序法(SeqWright,Houston,TX)确认序列。
测试了序列和方向正确的2个克隆表达醛缩酶和转氨酶基因的能力。在37℃振荡培养含有50μg/mL卡那霉素的LB中的50mL构建物的培养物,至OD600约0.3。通过加入1mM IPTG诱导基因表达,再在30℃振荡孵育培养物15小时。在诱导0、2和15小时后取出样品(10mL)。4000×g离心10分钟收获细胞,用50mM MOPS,pH7洗涤,再次离心。根据Novagen方案,用含有苯甲酸酶核酸酶和Calbiochem蛋白酶抑制剂混合物III的Novagen BugBusterTM试剂制备细胞提取物。用4-15%梯度凝胶(Bio-Rad,Hercules,CA)SDS-PAGE分析细胞提取物的蛋白表达水平。两种多肽都有表达。诱导15小时后proA醛缩酶多肽占可溶性蛋白部分的5-10%,而在15小时样品中,aspC转氨酶多肽似乎占可溶性蛋白部分的20-30%。
制备用于电穿孔的谷氨酸棒杆菌感受态细胞
采用结合Tauch等方案(Current Microbiology,(2002)45:362-367)和Koffas等方案(Metabolic Engineering,(2003)5:32-41)的方法制备电感受态谷氨酸棒杆菌细胞。培养谷氨酸棒杆菌细胞过夜,第二天接种入200mL MB培养基(600nm处初始吸光度为0.1)中。MB培养基含有5g/L酵母提取物、15g/L胰蛋白胨、5g/L大豆蛋白胨(soytone)和5g/L氯化钠。然后,在200rpm振荡使细胞生长到600nm处的最终吸光度为0.7。离心收集细胞(4℃、4000×g20分钟),用40mL冰冷的缓冲液(20mMHEPES,pH 7.2,含5%甘油)洗涤细胞沉淀3次。用20mL冰冷的10%v/v甘油将洗涤过3次的沉淀再洗涤2次。4℃、4000×g离心10分钟后,将细胞沉淀悬浮于1.0mL10%v/v甘油中,分成0.15mL等份,储存于-80℃。
用aspCproApEKEX-2转化谷氨酸棒杆菌
用结合Tauch等方案(Current Microbiology,(2002)45:362-367)和Koffas等方案(Metabolic Engineering,(2003)5:32-41)的方法进行谷氨酸棒杆菌细胞(菌株21847)的转化。电感受态谷氨酸棒杆菌细胞在冰上解冻。加入aspCproApEKEX-2DNA(1μg),该混合物在冰上孵育5分钟,然后转移到预冷的0.2cm电穿孔杯中。在电脉冲之前,非常温和地将0.8mL冰冷的10%v/v甘油加入细胞悬液,以避免混合二液体层。电穿孔条件是200欧姆、25μFd和12.5kV/cm。进行单次电脉冲后,立即将细胞悬液转移到4mL预热(46℃)MB培养基中,在46℃不振荡孵育6分钟。然后,200rpm30℃振荡孵育细胞50分钟。将细胞部分涂在含有25μg/mL卡那霉素的选择性MB平板上,以回收转化子。用PCR筛选能够在含有25μg/mL卡那霉素的选择性MB平板上生长的克隆,以确认转化。
在用aspCproApEKEX-2转化的棒杆菌中产生莫纳甜
在含有25μg/mL卡那霉素的MB培养基上制备谷氨酸棒杆菌::aspCproA/pEKEX-2(菌株21847)的新鲜平板。接种来自单菌落的过夜培养物(5mL),在含有25μg/mL卡那霉素的MB中30℃下培养。离心该培养物,将细胞悬浮于1mL生产培养基中。用等份悬液(0.5mL)接种100mL生产培养基。该生产培养基与Koffas等(Metabolic Engineering,(2003)5:32-41)用于产生具有以下修饰的赖氨酸所用的培养基相似。加入的氨基酸是终浓度为200μg/mL的酪氨酸和苯丙氨酸;加入25μg/mL的卡那霉素;不加入苏氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸。在30℃振荡孵育接种的培养物(100mL),直到OD600达到0.2-0.4。通过加入1mM IPTG(终浓度)诱导基因表达,在30℃振荡孵育该培养物。当诱导基因表达时,加入吡哆醇(终浓度0.5mM)。继续在30℃振荡孵育过夜。
诱导16小时后,加入0.04mM吡哆醛磷酸盐(终浓度)的磷酸钾(50mM,pH7.2)溶液、丙酮酸钠(0.1%)和吐温-20(0.2%)。继续在30℃孵育。在用IPTG诱导后0-112小时的几个时间点取出用于分析莫纳甜和蛋白生产的样品(5mL)。离心样品,将分离的上清和沉淀部分冷冻于-80℃,直到分析。
用LC-MS/MS测量发酵液样品中的莫纳甜浓度(如实施例6所述)。在诱导后66-112小时取出的培养液样品中检测到莫纳甜(3-12ng/mL)。培养物产生的色氨酸越多,产生的莫纳甜也越多。例如,当在诱导后40小时取出的培养液样品中色氨酸浓度为70μg/mL时,在诱导后66-112小时取出的培养液样品中莫纳甜浓度为11-12ng/mL。相反,产生色氨酸较少(40小时51μg/mL)的培养物仅分泌3 ng/mL的莫纳甜。
在谷氨酸过量产生菌谷氨酸棒杆菌(ATCC 13058)中产生莫纳甜
方法和材料
谷氨酸棒杆菌ATCC 13058获自美国典型培养物保藏中心。已知该菌株能产生和分泌谷氨酸。
制备用于电穿孔和用aspCproApEKEX-2转化的谷氨酸棒杆菌(ATCC 13058)感受态细胞
如在ATCC菌株21847中所述制备电感受态谷氨酸棒杆菌(ATCC 13058)细胞。最后洗涤和重悬于10%甘油后,将0.15mL等份贮存于-80℃。也用aspCproApEKEX-2和pEKEX-2转化细胞,如在ATCC菌株21847中所述。
在用aspCproApEKEX-2转化的棒杆菌(ATCC 13058)细胞中产生莫纳甜
在含有25μg/mL卡那霉素的MB培养基上制备谷氨酸棒杆菌::aspCroA/pEKEX-2(ATCC 13058)的2个分离物和谷氨酸棒杆菌::pEKEX-2(ATCC13058)的1个分离物的新鲜平板。接种来自单菌落的过夜培养物(5mL),在含有25μg/mL卡那霉素的MB中30℃下培养。离心培养物,将细胞悬浮于1mL谷氨酸棒杆菌发酵培养基中。1L该培养基含有以下成分:葡萄糖(100g)、(NH4)2SO4(2g)、K2HPO4(1g)、KH2PO4(1g)、MgSO4-7H2O(0.25g)、FeSO4-7H2O(0.01g)、MnSO4-4H2O(0.01g)、生物素(2.5μg)。(间隔4-6小时将小等份的10%脲加入培养物中,以在长时间发酵中维持pH。)将等份的各悬液(0.5mL)用于接种2×100-mL培养基。在30℃振荡孵育接种的培养物(100mL),直到OD600达到约0.4。通过加入1.0mM IPTG(终浓度)诱导基因表达,在30℃振荡孵育该培养物。在诱导基因表达时加入吡哆醇(终浓度0.5mM)。继续在30℃振荡孵育过夜。
诱导9小时后,将0.04mM吡哆醛磷酸盐(终浓度)的磷酸钾(50mM,pH7.2)溶液、丙酮酸钠(0.1%)和吐温-20(0.2%)加入各构建物的培养瓶中。从各培养物的第二个培养瓶中省去吐温-20。继续在30℃孵育。在用IPTG诱导后0-68小时的几个时间点取出用于分析莫纳甜和蛋白生产的样品(5mL)。离心样品,将分离的上清和沉淀部分冷冻于-80℃,直到分析。
结果
用LC-MS/MS测量发酵液样品中的莫纳甜浓度。在诱导后30-68小时取出的培养液样品中检测到莫纳甜。诱导45小时后加入240-330ng/mL吐温-20的用aspCproApEKEX-2转化的培养物中莫纳甜浓度最高。在不含吐温-20的培养物中莫纳甜水平的范围是50-66ng/mL。令人惊讶的是,在对照培养物中也观察到可检测水平的莫纳甜,但未达到可定量水平。
在用aspCproApEKEX-2(con,t)转化的棒杆菌(ATCC 13058)细胞中产生莫纳甜
用不同给料方案,以谷氨酸棒杆菌13058::aspCproA/pEKEX-2和谷氨酸棒杆菌13058::pEKEX-2重复摇瓶实验,并用LC/MS/MS MRM分析,如实施例6所述。
在含有50mg/L卡那霉素的LB中,将以下起始培养物在30℃250rpm下振荡培养过夜:
谷氨酸棒杆菌13058::aspCproA/pEKEX-2-1(莫纳甜操纵子)
谷氨酸棒杆菌13058::pEKEX-2-1(载体对照)
将5ml起始培养物转移到100mI含有50mg/L卡那霉素的谷氨酸棒杆菌发酵培养基。在30℃、250rpm振荡孵育培养物,至OD600约0.5。此时,将以下物质加入各培养瓶中以诱导基因表达:1μl IPTG(840mM储存液)、10ml吡哆醇盐酸盐(50mM储存液)和200μl PLP(20mM储存液)。在30℃、250rpm振荡孵育培养物3小时(OD600约0.5),然后用IPTG诱导。通过取出55ml(一半)体积到新培养瓶中将培养物分入两个培养瓶。对各培养瓶进行以下两种处理之一。加入物如表16所述:
表16
加入后,在30℃、250rpm振荡孵育培养物48小时。从各培养瓶中取出10ml培养液,测定干细胞重。离心剩余的培养物体积,过滤上清,用于谷氨酸和莫纳甜分析。
培养液的结果见下表17。
表17
如上所述,与用载体pEKEX-2转化的细胞相比时,表达aspC和proA基因的谷氨酸棒杆菌13058细胞中的莫纳甜产量显著提高。然而,清楚的是,在未用含有aspC和proA基因的载体转化的细胞中形成莫纳甜,表明野生型谷氨酸棒杆菌菌株能够产生莫纳甜。在吐温-40、吐温-60和氨苄青霉素加入培养物时,也观察到莫纳甜流出进一步增加。此外,用实施例6的FDAA衍生法对仅用载体转化的谷氨酸棒杆菌13058上清样品进行的手性分析证明存在S,S莫纳甜和痕量R,R莫纳甜(瞬时可见)。在单独实验中,LC/MS/MS MRM分析显示存在多个莫纳甜峰,表明存在S,R或R,S和RR或SS莫纳甜。
也采用与用谷氨酸棒杆菌13058::aspCproA/PEKEX-2相同方案在摇瓶实验中培养谷氨酸棒杆菌13032::aspCproA/PEKEX-2。在诱导21小时后,当除底物外用吐温和氨苄青霉素处理培养物时,谷氨酸棒杆菌13032::aspCroA/PEKEX-2产生1059ppb的莫纳甜,如表16所示。在用IPTG诱导后21小时的相应时间点,在没有吐温和氨苄青霉素处理的情况下,谷氨酸棒杆菌13032::aspCproA/PEKEX-2产生428ppb的莫纳甜。在用IPTG诱导后21小时,用或未用吐温和氨苄青霉素处理的情况下,采用谷氨酸棒杆菌13032::PEKEX-2的对照实验产生45-58ppb的莫纳甜。谷氨酸棒杆菌13032代表,了另一种用于产生莫纳甜的生产宿主。
总之,上述结果清楚地证明谷氨酸棒杆菌和棒杆菌属的其它成员产生莫纳甜的潜力或用作可在异源宿主中表达的莫纳甜操纵子中的基因来源。
实施例14
用减轻大肠杆菌中调节的突变提高色氨酸体内的产量
在大肠杆菌中,色氨酸生物合成途径受高度调节。减轻调节点可增加色氨酸生物合成的流出。可通过酶的反馈抑制,以及阻抑该途径中的合成酶进行调节。由于色氨酸是莫纳甜生产中的中间体,提高色氨酸水平可提高所产生的莫纳甜水平。下述调节基因仅为色氨酸途径中的几个调节点,本领域技术人员了解,其它过量产生色氨酸的方案也可增加大肠杆菌中的莫纳甜产量。
本领域技术人员可采用类似物来选择可过量产生色氨酸的抗性突变体。减轻色氨酸途径中的调节点可导致细菌如大肠杆菌产生的莫纳甜水平升高。一种改变反馈抑制控制点的方法是选择对类似化合物有抗性的突变体。这种化合物的例子包括但不限于:5-氟色氨酸、3-氟苯丙氨酸、β-2-噻吩基丙氨酸、6-氟色氨酸、色氨酸异羟肟酸、对氟苯丙氨酸、对氨基苯丙氨酸、酪氨酸异羟肟酸和苯丙氨酸异羟肟酸(Azuma等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,1993,39:471-476;和Duda和Sasvari-Szekely,Acta Biochim.Biophys.Acad.Sci.Hung,1973,8:81-90)。
可以在新鲜LB平板上培养大肠杆菌菌株如7692和大肠杆菌7692ΔlipA DE3(如实施例10所述)。单菌落可用于接种含有M9培养基加葡萄糖和其它所需维生素或辅因子的摇瓶。在37℃、250rpm振荡孵育24小时后,可取出小等分的大肠杆菌培养物,铺于含有各种浓度的类似物(如1mg/mL对氟苯并氨酸)M9培养基平板上。挑取抗性菌落,并在5mLLB培养物中37℃振荡培养,以筛选提高色氨酸产量(的菌落)。通过逐渐增加类似物浓度可提高对平板上类似物的耐受。这也可在连续培养中进行。
例如,这些类似物影响芳族氨基酸合成开始时的关键分支点,即3-脱氧-D-***庚酮糖-7-磷酸合酶。在大肠杆菌中,这由三种异构酶aroF、aroG和aroH编码,它们各自由该途径的氨基酸,即酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸反馈抑制。对上述类似物有抗性的突变体显示减轻这种反馈抑制。
另一个关键分支点是邻氨基苯甲酸合酶,此基因中抗反馈的突变也可提高色氨酸产量。同时,一个调节突变(如抗反馈的邻氨基苯甲酸合酶)的效应可被此途径中一个后备中间体所掩盖。因此,本领域技术人员将组合色氨酸途径突变来提高莫纳甜产量。色氨酸途径和芳族生物合成途径中可用于提高莫纳甜产量的突变的其它例子包括但不限于:抗色氨酸反馈抑制的对色氨酸生物合成特异的任何酶,和减轻改变trpR或其结合位点的阻抑,以及减轻操纵子表达的弱化控制(Kim等,J.Microbiol.Biotechnol.,2000,10:789-796;Jossek等,FEMS Microbiol.Lett.,2001,202:145-148;Bongaerts等,Metabol.Eng.,2001,3:289-300;Azuma等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,1993,39:471-476;Flores等,Nature Biotechnol.,1996,14:620-623;Tribe和Pittard,Appl.Environ.Microbiol.,1979,38:181-190;Yanofsky等,J.Bacteriol.,1984,158:1018-1024;Gosset等,J.Indus.Microbiol.,1996,17:47-52)。
除了对菌株进行遗传改变以提高色氨酸和莫纳甜产量之外,生长条件如培养基成分,以及改变的过程条件如pH、温度和混合可增加宿主微生物合成的色氨酸和莫纳甜。因此,合适的培养基如含有生长因子的培养基可用于增加大肠杆菌的色氨酸产量。例如,生长因子如嘧啶、痕量元素和生物素的浓度可影响中间体的产量和分泌(Jensen,(1993)J.Bacteriol.,175:3401-3407)。
实施例15
用过度表达方案增加大肠杆菌中的色氨酸产量
另一种提高大肠杆菌中色氨酸水平的方案是增加细胞中色氨酸生物合成基因的拷贝数。这可通过将基因克隆入载体,并将该载体转化入细胞中完成。本领域技术人员将认识到,增加基因的拷贝数也可通过将基因克隆入染色体DNA或改变天然启动子区来完成。
美国专利号4,371,614所引用的3株菌株获自U.S.D.A.Peoria培养物保藏所。第一株宿主菌株NRRL B-4574也称为KB3100,是ΔaroP。第二株菌株NRRL B-12262也称为AGX15,基因型为serB-、trpΔED、tnaA2-、tetS、tyrA-、pheA-。它含有称为pGX44的质粒。pGX44衍生自pBR322(Roeder和Somerville,Molec.Gen.Genet.,1979,176:361-368),含有serB基因和色氨酸操纵子。第三株菌株NRRL B-12264也称为AGX6,基因型为serB-、trpΔED、tnaA2-、aroP-。它含有称为pGX50的质粒。pGX50衍生自pBR322,含有serB基因和获自5-甲基色氨酸抗性细胞的色氨酸操纵子。
NRRL B-12262和B-12264菌株缺失了serB基因,这导致宿主菌株生长需要丝氨酸。pGX44(在B12262中)和pGX50(在B-12264中)质粒各含有serB基因,因此丝氨酸营养缺陷型是保持该质粒的选择压力。缺少丝氨酸的培养基可用于保持质粒,甚至在这些生物体产生的高浓度色氨酸的存在下。当培养于无丝氨酸的培养基时,携带质粒的菌株12262和12264必须保持多拷贝的质粒,以存活和生长,从而携带多拷贝的色氨酸操纵子。NRRL B-4574菌株不携带任意这些质粒,因此,仅含有一个拷贝的色氨酸操纵子(在基因组上)。用于NRRL B-12264的所有生长培养基和发酵培养基含有50μg/mL氨苄青霉素,由于pGX50载体含有氨苄青霉素抗性基因。
这些菌株在LB肉汤和Trp生产培养基中生产。每升Trp生产培养基包含:30g葡萄糖,10g(NH4)2SO4,1.0g KH2PO4,1.0gMgSO4-7H2O,0.01g FeSO4-7H2O,0.01gMnCl2-4H2O,4g酪蛋白氨基酸和40gCaCO3。摇瓶的接种物在LB培养基中生长。将3毫升的接种培养物用于接种250mL挡板摇瓶中的50mL培养基。在30℃温和振荡(200rpm)孵育摇瓶。如实施例6所述测量色氨酸。定期从摇瓶中取样,测量葡萄糖和OD550。结果见表18。
表18
含有多拷贝的色氨酸操纵子的大肠杆菌菌株的色氨酸产量
多拷贝的色氨酸操纵子似乎能提高大肠杆菌的色氨酸产量。含有一些相同的遗传修饰但没有多余拷贝的色氨酸操纵子的菌株在相似实验条件下产生较少色氨酸。例如,大肠杆菌SR 250(Rothman和Kirsch,2003)是tyrA-和pheA-菌株,但在相似条件下测试时,它仅产生约0.1μg/mL。这些数据表明,含有多拷贝的色氨酸生物合成基因的宿主菌株,尤其是具有破坏的pheA的菌株可用于提高莫纳甜产量。
实施例16
在发酵罐中产生色氨酸
发酵罐可用于实现经济上有效的莫纳甜生产。利用发酵罐设备可容易地控制参数如pH、氧气和混合,以致可优化发酵反应。
三株大肠杆菌菌株NRRL B-4575、NRRL B-12262和NRRL B-12264获自Peoria,Illinois的U.S.D.A.实验室。后两株菌株的质粒都包含色氨酸操纵子。实施例15中更详细地描述了这些菌株。含有300ml培养基的Infors发酵罐用于发酵研究。实施例15描述了色氨酸生产培养基。
细菌接种物取自新鲜划线的LB平板。将一铂环量接种入250mL摇瓶中的50mLTrp生产培养基,在37℃培养过夜。从种瓶中取15mL接种入两个含有250mL Trp生产培养基的Infor 300mL发酵罐容器。开始以500rpm搅拌,然后提高到1000rpm。以1vvm鼓入空气,经4小时增加到5vvm。用1N氢氧化钠将pH维持在7.0。
定期取样,分析葡萄糖和OD550。3天后,15,000rpm离心发酵液2分钟,过滤,冷冻,直到色氨酸分析。
如实施例15所示,在摇瓶中NRRL B-12262用Trp生产培养基产生的色氨酸比NRRL B-12264约多4倍。如表19所见,NRRL B-12262在发酵罐中产生的色氨酸比摇瓶中少得多,这可能是由于未优化微生物的规模扩大压力。NRRL B-12264菌株的相似压力可解释在发酵罐中它没有产生可检测的色氨酸。预计本领域技术人员能够提高NRRL B-12262和NRRL B-12264菌株在发酵罐中的色氨酸产量。
表19
实施例17
通过棒杆菌突变体提高色氨酸产量
谷氨酸棒杆菌ATCC 21847获自美国典型培养物保藏所。该菌株对各种类似物有抗性,含有产生苯丙氨酸和酪氨酸营养缺陷型的遗传突变。谷氨酸棒杆菌21850和21851是用类似物如6-氟色氨酸、4-氨基苯丙氨酸、色氨酸异羟肟酸和4-甲基色氨酸建立的不同菌株。
将取自营养琼脂平板的ATCC 21847的新鲜菌落接种入含有2%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母提取物和0.3%NaCl的5 mL种子管。30℃振荡培养过夜后,将管中2 mL液体接种入50mL摇瓶培养基中。使用两种培养基。第一种培养基(培养基1)包含:葡萄糖10%、KH2PO40.05%、K2HPO40.05%、MgSO4-7H2O0.025%、(NH4)2SO42%、NZ-胺0.5%、生物素30μg/mL和CaCO32%。将pH调节到7.2。每升第二种培养基(培养基2)含有:基于葡萄糖的糖蜜100g、KH2PO4,0.5g、K2HPO40.5g、MgSO40.25g、NH4SO40.25 g、玉米浆10g、CaCO320g、4mg/mL酪氨酸储存液38mL和25mg/mL苯丙氨酸储存液12mL(美国专利3849251)。将pH调节到7.2。
培养瓶在Innova摇床上30℃250rpm培养4天,如实施例6所述测量色氨酸水平。
结果见表20。棒杆菌的类似物抗性突变体产生的色氨酸(表20)水平高于其它谷氨酸棒杆菌菌株。培养基2中观察到较高水平可能反映了丰富的培养基组分,如玉米浆和糖蜜。相似地,ATCC 21851在培养基2中产生300-370μg/mL色氨酸,培养基1中仅产生1-2μg/mL色氨酸。未在优化培养基(培养基2)中测试ATCC 21850,但预计与21851表现相仿。这些结果证明棒杆菌宿主菌株可以是经济的莫纳甜产生菌。此外,与本文所述增加大肠杆菌中色氨酸产量类似的方案(参见例如,实施例14-17)可用于棒杆菌以提高其作为产生莫纳甜的宿主微生物菌株的特性(Shiio等,Agr.Biol.Chem.,1975,39:627-635;Hagino和Nakayama,Agr.Biol.Chem.,1975,39:343-349;Shiio等,Agr.Biol.Chem.,1984,48:2073-2080;Heery等,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1994,201:1255-1262;Heery和Dunican,Appl.Environ.Microbiol.,1993,59:791-799;和Katsumata和Ikeda,Bio/Technol.,1993,11:921-925)。
表20
棒杆菌ATCC 21847的色氨酸产量
实施例18
谷氨酸棒杆菌中生产谷氨酸
A部分:用于提高培养基中谷氨酸产量的物理方法
经济地生产氨基酸的一个重要限制是氨基酸分泌出细胞。微生物细胞一般具有将氨基酸转运入细胞的机制,但在许多情况下细胞输出高水平氨基酸的机制未知。物理方法,如使用去污剂和改良培养基可用于影响谷氨酸流出。由于谷氨酸和莫纳甜为二羧酸,本领域技术人员可用下述谷氨酸技术来增加释放到培养基中的莫纳甜。
谷氨酸棒杆菌ATCC 13058,13655和13689获自美国典型培养物保藏所。将这些菌株作为谷氨酸的产生菌(美国专利3,002,889和3,128,237)。
在摇瓶中培养这些菌株,每升培养基含有:KH2P04 1.0g、大豆蛋白胨2.0 g、MgS04·7H2O 0.4g、FeSO4 0.01g、MnSO4 0.01g、葡萄糖100g、尿素5g、生物素4μg、硫胺200μg。将培养基pH调至6.0,尿素、葡萄糖、生物素和硫胺单独灭菌。在30℃振荡孵育培养物72小时。18小时时,将1.8%尿素加入瓶中。
三种菌株均产生谷氨酸并将一些谷氨酸分泌入培养基,如表21所示。从培养瓶中离心收集细胞,破裂细胞并用两种方法之一处理:采用BugBuster加LysonaseTMfNovagen)的去污剂.酶法和渗透性休克法。用冷的去离子水1∶20稀释细胞进行渗透性休克。预计这些处理能够部分而非全部破坏革兰氏阳性生物(如谷氨酸棒杆菌)的细胞外被膜,因而应该有利于细胞内代谢物的释放。利用实施例6中所述的高通量方法分析谷氨酸。
数据表明,分泌的谷氨酸和细胞内保留的谷氨酸等量,各种物理处理能够释放谷氨酸。除了这些处理之外,预计其它物理处理也能够从细胞中释放谷氨酸,这些技术亦可用于促进莫纳甜的释放。
表2l
培养基中谷氨酸浓度(分泌)和物理处理谷氨酸棒杆菌释放的谷氨酸
*数值代表每毫升发酵液产生的μg谷氨酸。
B部分:提高谷氨酸产量的其它因素
谷氨酸分泌可受各种因素,包括抗生素、表面活性剂、温度、渗透压、pH和生物素浓度的影响。本实施例阐述涉及谷氨酸生产和/或分泌的因素。
谷氨酸棒杆菌ATCC 13058和ATCC 13655获自美国典型培养物保藏所。这些菌株为已知的谷氨酸产生菌。
进行一系列统计、因子设计,以研究在谷氨酸棒杆菌ATCC菌株13058和13655中产生谷氨酸的各种因素,将各菌株的菌落用于接种5mL改良MCGC培养基,30℃培养过夜。用0.5-1.0mL的种子培养物接种装有改良MCGC培养基的摇瓶。改良MCGC培养基包含(每升):3gNa2HPO4、6gKH2PO4、2gNaCl、8g(NH4)2SO4、0.5g大豆蛋白胨、60g葡萄糖、3.9mgFeCl3、0.9mgZnSO4-7H2O、0.56mg CuSO4-5H2O、3.9mg MnSO4-7H2O、0.1mg(NH4)6Mo7O4-4H2O、0.3mg Na2B4O7-10H2O、84mgCaCl2-2H2O、2g甜菜碱。处理包括(每升)100mmol MOPS或MES,50或400mgMgSO4-7H2O,4或20mg硫胺和4或20μg生物素。16小时时,每升中加入3ml吐温40或60,氨苄青霉素(0或10μg/mL);对需要较高温度处理的培养瓶温度升至40℃。培养瓶在30℃250rpm下孵育2-3天,除非另有注明。
定期取样,分析葡萄糖浓度(g/L)、细胞密度(OD600)和pH。2-3天后,离心样品,过滤上清并冷冻,直到用HPLC分析谷氨酸,如实施例6中的荧光检测方法。
研究谷氨酸产生/分泌的因素包括:氨苄青霉素、吐温、温度、起始pH、生物素、镁和硫胺。对于谷氨酸棒杆菌ATCC 13058来说,谷氨酸生产中的统计学显著性因素包括生物素、起始pH以及生物素和pH间的相互作用。将方差分析(ANOVA),一种用于测试两种或多种方法之间差异假设的统计学方法用于分析结果。预期模型在α水平<0.0001,R2调整为0.96时是显著的。起始pH 8.0比pH 7.6或6.5更利于产生谷氨酸。最低生物素浓度4μg/L使谷氨酸产量更大。该结果与表明2-5μg/L(微克/L)的生物素限制浓度影响细胞膜流动性并增加谷氨酸流出的其它研究一致(Eggeling L和Sahm H(1999)“氨基酸生产:代谢工程原则”(Amino-acid production:principles of metabolic engineering),刊于《代谢工程》(Metabolic Engineering),(Lee SY,Papoutsakis ET编);Marcel Dekker,Inc,NY,NY。因此,在一个实施方式中,微生物培养基含有5μg/L或更少的生物素。
低水平和高水平的生物素(4μg/L和20μg/L)在pH 8.0产生的谷氨酸高于在pH 7.6产生的谷氨酸。吐温40和吐温60的效果一样好,虽然,镁浓度和吐温类型之间可能的相互作用会影响谷氨酸产量。吐温存在时,加入氨苄青霉素减少了谷氨酸产量。ATCC 13058和ATCC 13655的上清中谷氨酸浓度范围分别为0-13.3mM和0-11.3mM。
这些结果表明,谷氨酸生产/分泌可能由上述显著因素操控。根据莫纳甜与谷氨酸共有的二羧酸结构,预计相同因素可用于莫纳甜生产/分泌。(Delaunay S.等,1999,Enzyme and Microbial Technology,25,762-768)。
C部分:用Kramer培养基和升高温度来提高谷氨酸产量
本实施例证明,可用不同菌株、温度和培养基提高谷氨酸产量。
谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13032和ATCC 13058获自美国典型培养物保藏所。
在30℃和37℃,KramerA培养基中进行两种菌株的研究。用各菌株的菌落接种5mL Kramer A培养基,30℃培养过夜。用0.5-1.0mL的种子培养物接种装有KramerA培养基的摇瓶。Kramer A培养基包含(每升):5g(NH4)2SO4、5.0g尿素、2.0gKH2PO4、1.53gK2HPO4、1摩尔MgSO4-7H2O、50g葡萄糖、0.01gFeSO4-7H2O、0.01g MnSO4-7H2O、0.01g CaCl2-2H2O、0.03mg ZnSO4-7H2O、来自(NH4)6Mo7O4-4H2O的0.1mg Mo、0.10mg H3BO3、0.07mg COCl2-6H2O、0.01mgNiCl2-2H2O、0.03mg CuCl2-2H2O和1μg生物素。用5M NaOH将pH调节到7.0。本实验中不加入吐温和氨苄青霉素。培养瓶在30℃或37℃250rpm下孵育24小时。用实施例6中所述高通量方法分析谷氨酸。
用ATCC 13032和ATCC 13058在30℃和37℃实验的结果见表22。
表22
两种温度下Kramer A培养基中谷氨酸浓度
谷氨酸棒杆菌ATCC 13058在37℃产生更多谷氨酸(54mM),而谷氨酸棒杆菌13032在两种温度产量相似(~40mM)。这些结果再次表明,可通过改变温度和培养基成分来操作谷氨酸生产/分泌。根据莫纳甜与谷氨酸共有二羧酸骨架,预计相同因素可用于莫纳甜生产/分泌。(Hoischen C.和Kramer R.,1989,Arch Microbiol,151:342-347)。
实施例19
从大肠杆菌中克隆色氨酸酶基因(tna)
色氨酸酶多肽(EC 4.1.99.1)催化以下可逆反应:
L-色氨酸+H2O吲哚+丙酮酸+NH3
在一些情况下,从宿主菌株中缺失编码色氨酸酶的基因以防止色氨酸的水解性破坏。然而,如果将过量吲哚、丙酮酸和铵供给细胞,此酶可过度表达以促进色氨酸合成。当色氨酸的宿主生物合成途径不失调时,该方法尤其有用。将来自大肠杆菌DH10B的色氨酸酶基因克隆入与含有莫纳甜生物合成途径基因和补充基因的pET载体相容的pPROLAR衍生载体。
分离基因组DNA用于克隆
大肠杆菌基因组DNA分离自DH10B(Invitrogen)菌株,用QiagenGenomic-tipTM(500/G)试剂盒制备。从在LB中生长到OD650为1.87的30mL此菌株中,获得0.3mg纯化DNA。纯化DNA溶解于Qiagen洗脱缓冲液(EB),浓度为0.37μg/μL。
聚合酶链反应方案
设计引物,用于在卡那霉素基因的NcoI识别位点被突变(本文称为pPRONco)的pPROLar.A122(Clontech Laboratories,Inc.)中分子克隆。pPRONco引物序列如下:
正向:5′-TGCCATGGAAAACTTTA-AACATCT-3′;
反向:5′-CCAAGCTTTTAAACTTCTTTAAGTTTTG-3′(sEQ ID NO:77和78)。
用以下PCR方案进行PCR。在50μL反应中,采用0.1-0.5μg模板、1.5μM各引物、0.4 mM各dNTP、3.5 U Expand High Fidelity聚合酶(Roche,Indianapolis,IN)和含有Mg的1X ExpandTM缓冲液。所用热循环程序包括在96℃热启动5分钟,接着是29个以下步骤的重复:94℃30秒,50℃1.75分钟和72℃2.25分钟。29个循环后,使样品保持72℃10分钟,然后储存于4℃。此PCR方案产生的产物约为1500bp。
克隆
用Qiagen凝胶抽提试剂盒(Valencia,CA)从0.8或1%TAE-琼脂糖凝胶中凝胶纯化PCR产物。通过在多克隆位点中NcoI和HindIII限制性位点之间***将tna基因***pPRONco载体中。通过在NdeI和HindIII位点之间***完成pPRONde的克隆。
用电穿孔将连接混合物转化入DH10B细胞。将细胞铺于含有用于选择的50mg/L卡那霉素的LB平板上。用Qiagen离心小抽试剂盒纯化质粒DNA,并通过限制性消化来筛选正确的***物。用双脱氧链终止DNA测序法确认似乎含有正确***物的质粒序列。根据厂商方案(Novagen,Madison,WI),用aspCproA/pET32和tna/pPRONco共转化或单用tna/pPRONco转化化学感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
在用aspCproApET32和tna/pPRONco转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中产生莫纳甜和色氨酸
在含有0.4%葡萄糖和Balch维生素溶液的trp-1培养基中37℃振荡培养用tna/pPRONco或用aspCproA/pET32和tna/pPRONco转化的大肠杆菌BL21(DE3)培养物(培养两份各构建物的培养物)。tna/pPRONco培养物也含有50μg/mL卡那霉素,而含有用两个质粒转化的BL21(DE3)的培养物也含有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素。(参见实施例1、7和11的方法)。当OD600达到0.5-0.7时,用1.0mM IPTG和0.5%L-***糖诱导培养物,继续在30℃孵育。此外,在诱导时加入0.5mM吡哆醇。诱导5小时后,将0.04mM吡哆醛磷酸盐、0.5%丙酮酸钠和0.6%氯化铵加入各培养瓶,将各瓶的pH调节到7.5-7.6,然后将5mM吲哚(2%TritonX-100水溶液中的50mM吲哚储存液)加入各瓶。继续在30℃孵育。在用IPTG诱导0、5、7.5、20、30、48和74小时后,取出用于分析色氨酸和莫纳甜(0.5mL)和蛋白诱导(1mL)的样品。在诱导7.5、20、30和48小时后取出用于分析细胞干重(DCW)的样品。用实施例6所述的LC-MS/MS MRM测量发酵液样品中的莫纳甜和色氨酸浓度。
结果见下表23和24。在仅表达tna基因的培养物中诱导20小时后,发酵液中的色氨酸浓度达到约1.1g/L,74小时后提高到约1.3g/L。从仅表达tna基因的培养物取出的任何样品中没有检测到莫纳甜。在表达tna和aspCproA基因的培养物中的色氨酸浓度约为仅表达tna基因的培养物的10%。然而,在这些培养物中产生了莫纳甜。在诱导48小时后测定的莫纳甜浓度最高(263 ng/mL)。
表23
在用tna/pPRONco转化的大肠杆菌BL21(DE3)的发酵液样品中的色氨酸产量
表24
在用tna/pPRONco和aspCproA/pET32a转化的大肠杆菌BL21(DE3)发酵液样品中的莫纳甜和色氨酸产量
实施例20
通过过度表达磷酸烯醇丙酮酸合酶(EC 2.7.9.2)和相关基因增加到芳族途径的流出
增加从葡萄糖或丙酮酸到芳族途径的碳流出的中心代谢的工程改造可增加色氨酸量,从而增加发酵过程中所产生的莫纳甜量。采用不同方法,其中之一是通过增强PEP合酶(Pps)表达将由PTS或丙酮酸激酶形成的丙酮酸再循环回PEP中(Patnaik和Liao,(1994),Appl.Env.Microbiol.,60:3903-3908;Patnaik等,(1995),Biotechnol.Bioeng.,46,361-370;Yi等,(2002),Biotechnol.Prog.,18,1141-1148;美国专利6,489,100;美国专利5,985,617;和美国专利5,906,925)。PEP合酶在水存在下将ATP和丙酮酸转化为AMP、磷酸烯醇丙酮酸和磷酸。PEP水平提高引起DAHP产量增加,DAHP是莽草酸、分支酸和芳族氨基酸产生的重要前体。ppsA基因高度普遍存在,可容易地分离,并在如大肠杆菌的产生宿主中过度表达。可将重组PpsA引入宿主生物的染色体或质粒中。含有ppsA基因的质粒可与实施例7所述莫纳甜操纵子共表达,或可加入莫纳甜操纵子中。可共表达转酮酶(tkt)基因以进一步增加芳族氨基酸前体分子。预计这种遗传构建物会提高莫纳甜产量。
实施例21
在发酵罐中产生生物合成基因
实施例3描述了采用两种酶-转氨酶和醛缩酶从色氨酸和丙酮酸产生莫纳甜的方法。克隆、表达和纯化来自***丛毛单胞菌的醛缩酶(ProA醛缩酶、proA基因)和由大肠杆菌aspC基因编码的L-天冬氨酸转氨酶,如之前实施例所述。开发可提高酶产量的发酵方法,因此它们可用于产生莫纳甜的体外方法。
用于产生L-天冬氨酸转氨酶的分批发酵
在3L发酵罐中批量培养大肠杆菌aspC/pET30/BL21(DE3)(L-天冬氨酸转氨酶产生菌)菌株,所用培养基每升含:2g(NH4)2SO4、1.6g KH2PO4、9.9g Na2HPO4*7H2O、0.65g柠檬酸钠、0.24gMgSO4、20gNZ胺A、20g葡萄糖和25mg卡那霉素。用NaOH将pH控制在7.0,诱导前将温度保持在37℃,诱导时降至34℃。在整个发酵过程中通过增加搅拌速率保持培养物有氧。用0.1-0.4mM IPTG诱导酶表达。在OD600为3(接种后3-4小时)或10(接种后5-6小时)时,诱导细胞。在OD600为3用0.1mM IPTG诱导细胞时获得最佳结果。在这些条件下,细胞生物质浓度达到7.2g/L,总可溶性蛋白的约20-40%是转氨酶。总酶量(每升培养物中0.8克转氨酶多肽)比如实施例3所述进行的摇瓶培养实验获得的酶量大6倍。
用于产生proA醛缩酶的补料分批发酵
在补料-分批模式的3升发酵罐中培养大肠杆菌proA/pET30/BL21(DE3)(醛缩酶产生菌)。所用的确定成分培养基每升含有:2g(NH4)2SO4、8gKH2PO4、2gNaCl、1g柠檬酸钠、0.01gFeSO4·7H2O、2gMgSO4·7H2O、0.05gCaSO4·2H2O、7.5mgEDTA、2.5mg MnSO4·H2O、0.5mgCoCl2·6H2O、0.5mgZnSO4·7H2O、0.05mgCuSO4·5H2O、0.05mgH3BO3、50mg对氨基苯甲酸、20mg叶酸、20mg生物素、20mg烟酸、50mg泛酸钙、50mg核黄素、50mg硫胺盐酸盐和100mg吡哆醇盐酸盐。起始葡萄糖浓度为2g/L,按指数供给葡萄糖,使生长速率维持在0.15-0.25小时-1。整个用NH4OH控制pH的过程中按需提供氮气。当OD600为25(接种后17小时)或35(接种后21小时)时,用1mMIPTG诱导培养物。诱导细胞时细胞密度越低,获得的蛋白表达越好。在总可溶性蛋白为20-30%时酶表达非常高,即使与培养瓶中生长的细胞相比特定酶活降低,每升培养基中的总酶活比如实施例3所述进行的摇瓶实验中测定的酶活高9倍。在每升培养物中测定到总1.8克醛缩酶多肽。根据生长速率获得不同的细胞浓度,最大为26.3g细胞干重/L。
两种发酵方法均可用于产生任何这些酶。按指数供给葡萄糖以使生长速率维持在0.15-0.25小时-1的补料-分批方案获得高细胞密度和高酶浓度的较佳方法,可进一步优化,以提高各情况下的特定酶活。也可采用补料-分批发酵的替代给料方案,如恒量给料速率或间歇给料。
其它实施方式
应理解,结合本发明详述进行描述时,以上说明书旨在说明而非限制由所附权利要求书范围限定的本发明范围。其它方面、优点和修改在所附权利要求书的范围之内。
序列表
<110>嘉吉有限公司(Cargill,Incorporated)
<120>生产莫纳甜和莫纳甜前体
<150>60/513,406
<151>2003-10-21
<160>89
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1170
<212>DNA
<213>苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)
<400>1
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<210>2
<211>389
<212>PRT
<213>苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)
<400>2
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Ile Gly Leu Phe Arg Lys Asp Glu Arg Pro Gly Lys Val Asp Leu Gly
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<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400>3
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<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
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<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
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tatctcggca tcccgatgcg ggaataccgc tatttcgacg ccgagaccgg cgccgtcgat 540
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ggctgctgcc acaacccgac cggcgccaac ccgaacccgg tgcagtggct ggccgtctgc 660
gagagcctgg cccggacagg cgcggtgccg ctgatcgacc tcgcctatca gggcttcggc 720
gacgggctcg agatggatgc ggcggcgacg cggcttctgg ccaccagact gcccgaggtg 780
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atcgccatcg gcgaggcggc gggccggggc acggtgcagg ccaacctcaa cttcctgaac 900
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acgctgcgcc gccagcttgc cgatgcgctg caggccgaga ccggctcgaa ccgcttcggc 1080
ttcgtggccg agcatcgcgg catgttctcg cgcctcggga tcacgcccgc cgaggtggag 1140
cggctgcgga ccgagcacgg ggtctacatg gtgggcgatt cgcggctgaa catcgcgggg 1200
ctgaaccgga cgaccgtgcc ggtgctggcg cgcgcggtgg ccaaggtgct gcgcggctga 1260
<210>6
<211>419
<212>PRT
<213>类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)
<400>6
Met Arg Ser Thr Thr Ala Pro Gly Pro Ser Gly Ala Cys Met Thr Ile
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Tyr Leu Gly Ile Pro Met Arg Glu Tyr Arg Tyr Phe Asp Ala Glu Thr
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Gly Ala Val Asp Ala Glu Gly Leu Met Glu Asp Leu Ala Gln Val Lys
180 185 190
Ala Gly Asp Val Val Leu Leu His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly
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Ala Asn Pro Asn Pro Val Gln Trp Leu Ala Val Cys Glu Ser Leu Ala
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Asp Gly Leu Glu Met Asp Ala Ala Ala Thr Arg Leu Leu Ala Thr Arg
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Leu Pro Glu Val Leu Ile Ala Ala Ser Cys Ser Lys Asn Phe Gly Ile
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Tyr Arg Glu Arg Thr Gly Ile Leu Ile Ala Ile Gly Glu Ala Ala Gly
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Arg Gly Thr Val Gln Ala Asn Leu Asn Phe Leu Asn Arg Gln Asn Tyr
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Ser Phe Pro Pro Asp His Gly Ala Arg Leu Val Thr Met Ile Leu Glu
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Asp Glu Thr Leu Ser Ala Asp Trp Lys Ala Glu Leu Glu Glu Val Arg
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Leu Asn Met Leu Thr Leu Arg Arg Gln Leu Ala Asp Ala Leu Gln Ala
340 345 350
Glu Thr Gly Ser Asn Arg Phe Gly Phe Val Ala Glu His Arg Gly Met
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Phe Ser Arg Leu Gly Ile Thr Pro Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Thr
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<210>7
<211>1239
<212>DNA
<213>硕大利什曼原虫(Leishmania major)
<400>7
atgtccatgc aggcggccat gaccacggcg gagcgctggc agaagattca ggcacaagct 60
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ctcgtcattg gtgcctaccg cgacgagcag ggccgtccct atccgctacg cgtggtccgc 180
aaggctgagc agcttctctt ggacatgaat ctcgactacg agtacctacc catctcgggc 240
taccagccct tcatcgatga ggcggtaaag attatctacg gcaataccgt cgagctggag 300
aacctggttg cggtgcagac gctgagcggg accggtgctg tctctctcgg ggcgaagctg 360
ctgactcgcg tcttcgacgc tgagacgacg cccatctacc tttccgaccc cacgtggccc 420
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gaccccaaga cggtcagcct gaatttcgag ggcatgaaga aagacattct ggcggcgccg 540
gacggctccg tgttcattct gcaccagtgc gcgcacaacc ccaccggcgt ggacccgtcg 600
caggagcagt ggaacgagat cgcgtcactg atgctggcca agcaccatca ggtgttcttc 660
gactccgcct accaaggcta tgcgagcggc agcctcgaca cggacgcgta tgctgcccgc 720
ctgtttgccc gccgcggcat cgaggtactg ctggcgcagt cgttctccaa gaacatgggc 780
ttgtacagcg agcgtgcagg cacgctgtcg ctgctcctca aggacaagac gaagcgcgcg 840
gatgtaaaga gcgtgatgga ttcgctgatc cgtgaggagt acacgtgccc cccagcccac 900
ggtgcccgct tagcccacct aatcctgagc aacaacgaac tgcgaaagga gtgggaggca 960
gagctatcag ccatggcaga gcgcatccgt acgatgcgcc gcaccgtgta cgacgagctg 1020
ctgcgcctgc agacgcccgg gagctgggaa catgtcatta accagattgg catgttttcc 1080
ttcctcgggc tgtcaaaggc gcagtgcgaa tactgccaaa accacaacat cttcatcaca 1140
gtgtcgggcc gcgctaacat ggcaggtctg acgcatgaga cggcgctgat gctagcacag 1200
acgatcaacg atgctgtgcg caatgtgaat cgtgagtga 1239
<210>8
<211>412
<212>PRT
<213>硕大利什曼原虫(Leishmania major)
<400>8
Met Ser Met Gln Ala Ala Met Thr Thr Ala Glu Arg Trp Gln Lys Ile
1 5 10 15
Gln Ala Gln Ala Pro Asp Val Ile Phe Asp Leu Ala Lys Arg Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Lys Gly Pro Lys Ala Asn Leu Val Ile Gly Ala Tyr Arg Asp
35 40 45
Glu Gln Gly Arg Pro Tyr Pro Leu Arg Val Val Arg Lys Ala Glu Gln
50 55 60
Leu Leu Leu Asp Met Asn Leu Asp Tyr Glu Tyr Leu Pro Ile Ser Gly
65 70 75 80
Tyr Gln Pro Phe Ile Asp Glu Ala Val Lys Ile Ile Tyr Gly Asn Thr
85 90 95
Val Glu Leu Glu Asn Leu Val Ala Val Gln Thr Leu Ser Gly Thr Gly
100 105 110
Ala Val Ser Leu Gly Ala Lys Leu Leu Thr Arg Val Phe Asp Ala Glu
115 120 125
Thr Thr Pro Ile Tyr Leu Ser Asp Pro Thr Trp Pro Asn His Tyr Gly
130 135 140
Val Val Lys Ala Ala Gly Trp Lys Asn Ile Cys Thr Tyr Ala Tyr Tyr
145 150 155 160
Asp Pro Lys Thr Val Ser Leu Asn Phe Glu Gly Met Lys Lys Asp Ile
165 170 175
Leu Ala Ala Pro Asp Gly Ser Val Phe Ile Leu His Gln Cys Ala His
180 185 190
Asn Pro Thr Gly Val Asp Pro Ser Gln Glu Gln Trp Asn Glu Ile Ala
195 200 205
Ser Leu Met Leu Ala Lys His His Gln Val Phe Phe Asp Ser Ala Tyr
210 215 220
Gln Gly Tyr Ala Ser Gly Ser Leu Asp Thr Asp Ala Tyr Ala Ala Arg
225 230 235 240
Leu Phe Ala Arg Arg Gly Ile Glu Val Leu Leu Ala Gln Ser Phe Ser
245 250 255
Lys Asn Met Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ala Gly Thr Leu Ser Leu Leu
260 265 270
Leu Lys Asp Lys Thr Lys Arg Ala Asp Val Lys Ser Val Met Asp Ser
275 280 285
Leu Ile Arg Glu Glu Tyr Thr Cys Pro Pro Ala His Gly Ala Arg Leu
290 295 300
Ala His Leu Ile Leu Ser Asn Asn Glu Leu Arg Lys Glu Trp Glu Ala
305 310 315 320
Glu Leu Ser Ala Met Ala Glu Arg Ile Arg Thr Met Arg Arg Thr Val
325 330 335
Tyr Asp Glu Leu Leu Arg Leu Gln Thr Pro Gly Ser Trp Glu His Val
340 345 350
Ile Asn Gln Ile Gly Met Phe Ser Phe Leu Gly Leu Ser Lys Ala Gln
355 360 365
Cys Glu Tyr Cys Gln Asn His Asn Ile Phe Ile Thr Val Ser Gly Arg
370 375 380
Ala Asn Met Ala Gly Leu Thr His Glu Thr Ala Leu Met Leu Ala Gln
385 390 395 400
Thr Ile Asn Asp Ala Val Arg Asn Val Asn Arg Glu
405 410
<210>9
<211>1182
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>9
atggaacatt tgctgaatcc gaaagcaaga gagatcgaaa tttcaggaat acgcaaattc 60
tcgaatcttg tagcccaaca cgaagacgtc atttcactta caatcggcca gcctgatttt 120
ttcacaccgc atcatgtgaa agctgccgca aaaaaagcca ttgatgaaaa cgtgacgtca 180
tatactccga atgccggcta cctggagctg agacaagctg tgcagcttta tatgaagaaa 240
aaagcggatt tcaactatga tgctgaatct gaaattatca tcacaacagg cgcaagccaa 300
gccattgatg ctgcattccg gacgatttta tctcccggtg atgaagtcat tatgccaggg 360
cctatttatc cgggctatga acctattatc aatttgtgcg gggccaagcc tgtcattgtt 420
gatactacgt cacacggctt taagcttacc gcccggctga ttgaagatgc tctgacaccc 480
aacaccaagt gtgtcgtgct tccttatccg tcaaacccta ccggcgtgac tttatctgaa 540
gaagaactga aaagcatcgc agctctctta aaaggcagaa atgtcttcgt attgtctgat 600
gaaatataca gtgaattaac atatgacaga ccgcattact ccatcgcaac ctatttgcgg 660
gatcaaacga ttgtcattaa cgggttgtca aaatcacaca gcatgaccgg ttggagaatt 720
ggatttttat ttgcaccgaa agacattgca aagcacattt taaaggttca tcaatacaat 780
gtgtcgtgcg cctcatccat ttctcaaaaa gccgcgcttg aagctgtcac aaacggcttt 840
gacgatgcat tgattatgag agaacaatac aaaaaacgtc tggactatgt ttatgaccgt 900
cttgtttcca tgggacttga cgtagttaaa ccgtccggtg cgttttatat cttcccttct 960
attaaatcat ttggaatgac ttcatttgat tttagtatgg ctcttttgga agacgctggc 1020
gtggcactcg tgccgggcag ctcgttctca acatatggtg aaggatatgt aaggctgtct 1080
tttgcatgct caatggacac gctgagagaa ggcctagacc gtttagaatt atttgtatta 1140
aaaaaacgtg aagcaatgca gacgataaac aacggcgttt aa 1182
<210>10
<211>393
<212>PRT
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>10
Met Glu His Leu Leu Asn Pro Lys Ala Arg Glu Ile Glu Ile Ser Gly
1 5 10 15
Ile Arg Lys Phe Ser Asn Leu Val Ala Gln His Glu Asp Val Ile Ser
20 25 30
Leu Thr Ile Gly Gln Pro Asp Phe Phe Thr Pro His His Val Lys Ala
35 40 45
Ala Ala Lys Lys Ala Ile Asp Glu Asn Val Thr Ser Tyr Thr Pro Asn
50 55 60
Ala Gly Tyr Leu Glu Leu Arg Gln Ala Val Gln Leu Tyr Met Lys Lys
65 70 75 80
Lys Ala Asp Phe Asn Tyr Asp Ala Glu Ser Glu Ile Ile Ile Thr Thr
85 90 95
Gly Ala Ser Gln Ala Ile Asp Ala Ala Phe Arg Thr Ile Leu Ser Pro
100 105 110
Gly Asp Glu Val Ile Met Pro Gly Pro Ile Tyr Pro Gly Tyr Glu Pro
115 120 125
Ile Ile Asn Leu Cys Gly Ala Lys Pro Val Ile Val Asp Thr Thr Ser
130 135 140
His Gly Phe Lys Leu Thr Ala Arg Leu Ile Glu Asp Ala Leu Thr Pro
145 150 155 160
Asn Thr Lys Cys Val Val Leu Pro Tyr Pro Ser Asn Pro Thr Gly Val
165 170 175
Thr Leu Ser Glu Glu Glu Leu Lys Ser Ile Ala Ala Leu Leu Lys Gly
180 185 190
Arg Asn Val Phe Val Leu Ser Asp Glu Ile Tyr Ser Glu Leu Thr Tyr
195 200 205
Asp Arg Pro His Tyr Ser Ile Ala Thr Tyr Leu Arg Asp Gln Thr Ile
210 215 220
Val Ile Asn Gly Leu Ser Lys Ser His Ser Met Thr Gly Trp Arg Ile
225 230 235 240
Gly Phe Leu Phe Ala Pro Lys Asp Ile Ala Lys His Ile Leu Lys Val
245 250 255
His Gln Tyr Asn Val Ser Cys Ala Ser Ser Ile Ser Gln Lys Ala Ala
260 265 270
Leu Glu Ala Val Thr Asn Gly Phe Asp Asp Ala Leu Ile Met Arg Glu
275 280 285
Gln Tyr Lys Lys Arg Leu Asp Tyr Val Tyr Asp Arg Leu Val Ser Met
290 295 300
Gly Leu Asp Val Val Lys Pro Ser Gly Ala Phe Tyr Ile Phe Pro Ser
305 310 315 320
Ile Lys Ser Phe Gly Met Thr Ser Phe Asp Phe Ser Met Ala Leu Leu
325 330 335
Glu Asp Ala Gly Val Ala Leu Val Pro Gly Ser Ser Phe Ser Thr Tyr
340 345 350
Gly Glu Gly Tyr Val Arg Leu Ser Phe Ala Cys Ser Met Asp Thr Leu
355 360 365
Arg Glu Gly Leu Asp Arg Leu Glu Leu Phe Val Leu Lys Lys Arg Glu
370 375 380
Ala Met Gln Thr Ile Asn Asn Gly Val
385 390
<210>11
<211>1176
<212>DNA
<213>食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)
<400>11
atgccagaat tagctaatga tttaggatta agcaaaaaga tcactgatgt aaaagcttca 60
ggaattagaa tctttgataa caaagtttca gctattcctg gcattatcaa attgactttg 120
ggtgaaccag atatgaatac tcctgagcat gttaagcaag cggctattaa gaatattgca 180
gataatgatt cacactatgc tccacaaaag ggaaagcttg aattaagaaa agctatcagt 240
aaatatttga aaaagattac tggaattgaa tatgatccag aaacagaaat cgtagtaaca 300
gttggtgcaa ctgaagcaat taacgctacc ttgtttgcta ttactaatcc gggtgacaag 360
gttgcaattc ctacgccagt cttttctcta tattggcccg tggctacact tgctgatgcc 420
gattatgttt tgatgaatac tgcagaagat ggttttaagt taacacctaa gaagttagaa 480
gaaactatca aagaaaatcc aacaattaaa gcagtaattt tgaattatcc aactaaccca 540
actggtgttg aatatagcga agatgaaatt aaagctttgg ctaaggtaat taaagataat 600
catctgtacg taattaccga tgaaatttac agtactttga cttacggtgt aaaacacttt 660
tcaattgcca gcttaattcc agaaagagca atttatatct ctggtttatc taaatcacat 720
gcgatgactg gttatcgttt aggctatgtt gccggacctg caaaaattat ggcagaaatt 780
ggtaaagttc atggccttat ggtgacgact acgacggatt catcacaagc tgccgcaatt 840
gaagcacttg aacacggact tgatgaccct gagaaatata gggaagttta tgaaaagcgt 900
cgtgactatg ttttaaagga attagccgag atagagatgc aagcagttaa gccagaaggt 960
gcattttata tctttgctaa aattccagct aagtatggca aagacgatat gaaatttgcc 1020
ttggatttag cttttaaaga aaaagtgggt atcactccag gtagtgcatt tggtcctggt 1080
ggtgaaggtc atattagatt atcttatgca tcaagtgatg aaaacttgca tgaggcaatg 1140
aagcgaatga agaaagtttt acaagaggac gaataa 1176
<210>12
<211>391
<212>PRT
<213>食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)
<400>12
Met Pro Glu Leu Ala Asn Asp Leu Gly Leu Ser Lys Lys Ile Thr Asp
1 5 10 15
Val Lys Ala Ser Gly Ile Arg Ile Phe Asp Asn Lys Val Ser Ala Ile
20 25 30
Pro Gly Ile Ile Lys Leu Thr Leu Gly Glu Pro Asp Met Asn Thr Pro
35 40 45
Glu His Val Lys Gln Ala Ala Ile Lys Asn Ile Ala Asp Asn Asp Ser
50 55 60
His Tyr Ala Pro Gln Lys Gly Lys Leu Glu Leu Arg Lys Ala Ile Ser
65 70 75 80
Lys Tyr Leu Lys Lys Ile Thr Gly Ile Glu Tyr Asp Pro Glu Thr Glu
85 90 95
Ile Val Val Thr Val Gly Ala Thr Glu Ala Ile Asn Ala Thr Leu Phe
100 105 110
Ala Ile Thr Asn Pro Gly Asp Lys Val Ala Ile Pro Thr Pro Val Phe
115 120 125
Ser Leu Tyr Trp Pro Val Ala Thr Leu Ala Asp Ala Asp Tyr Val Leu
130 135 140
Met Asn Thr Ala Glu Asp Gly Phe Lys Leu Thr Pro Lys Lys Leu Glu
145 150 155 160
Glu Thr Ile Lys Glu Asn Pro Thr Ile Lys Ala Val Ile Leu Asn Tyr
165 170 175
Pro Thr Asn Pro Thr Gly Val Glu Tyr Ser Glu Asp Glu Ile Lys Ala
180 185 190
Leu Ala Lys Val Ile Lys Asp Asn His Leu Tyr Val Ile Thr Asp Glu
195 200 205
Ile Tyr Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Val Lys His Phe Ser Ile Ala Ser
210 215 220
Leu Ile Pro Glu Arg Ala Ile Tyr Ile Ser Gly Leu Ser Lys Ser His
225 230 235 240
Ala Met Thr Gly Tyr Arg Leu Gly Tyr Val Ala Gly Pro Ala Lys Ile
245 250 255
Met Ala Glu Ile Gly Lys Val His Gly Leu Met Val Thr Thr Thr Thr
260 265 270
Asp Ser Ser Gln Ala Ala Ala Ile Glu Ala Leu Glu His Gly Leu Asp
275 280 285
Asp Pro Glu Lys Tyr Arg Glu Val Tyr Glu Lys Arg Arg Asp Tyr Val
290 295 300
Leu Lys Glu Leu Ala Glu Ile Glu Met Gln Ala Val Lys Pro Glu Gly
305 310 315 320
Ala Phe Tyr Ile Phe Ala Lys Ile Pro Ala Lys Tyr Gly Lys Asp Asp
325 330 335
Met Lys Phe Ala Leu Asp Leu Ala Phe Lys Glu Lys Val Gly Ile Thr
340 345 350
Pro Gly Ser Ala Phe Gly Pro Gly Gly Glu Gly His Ile Arg Leu Ser
355 360 365
Tyr Ala Ser Ser Asp Glu Asn Leu His Glu Ala Met Lys Arg Met Lys
370 375 380
Lys Val Leu Gln Glu Asp Glu
385 390
<210>13
<211>1413
<212>DNA
<213>类球红细菌(R.sphaeroides)
<400>13
atgcgcgagc ctcttgccct cgagatcgac ccgggccacg gcggcccgct gttcctcgcc 60
atcgccgagg cgatcaccct cgacatcacc cgcgggcggc tgaggcccgg agcgagactg 120
cccggcacac gcgcgctggc gcgggcgctc ggcgtgcatc gcaacacggt ggatgccgcc 180
tatcaggagt tgctgaccca gggctggctg caggccgagc ccgcgcgggg caccttcgtg 240
gcgcaggatc tgccgcaggg gatgctggtg cacaggcccg cgcccgcgcc ggtcgagccg 300
gtcgcgatgc gcgcggggct cgccttctcc gatggcgcgc cggaccccga gctggtgccc 360
gacaaggcgc tggcgcgggc ctttcgccgg gcgctcctgt cgcccgcctt ccgcgccgga 420
gcggattacg gcgatgcccg cggcacctcc tcgctgcggg aggcgctggc agcctatctc 480
gcctcggacc ggggcgtggt cgcggatcct gcgcggctgc tgatcgcgcg gggcagccag 540
atggcgctgt tcctggtagc ccgggcggcg ctggcgccgg gagaggcgat cgcggtcgag 600
gagccgggct atccgctggc ctgggaggcg ttccgcgcag cgggagcgga ggtgcgcggc 660
gtgccggtgg atggcggcgg cctcaggatc gacgcgctcg aggccgcgct ggcccgggat 720
ccgcgaatcc gggcggtcta tgtcacgccc catcaccagt atccgacgac cgtcaccatg 780
ggcgcggcgc ggcggttgca gcttctggaa ctggcagagc gccaccggct cgcgctgatc 840
gaggacgact acgaccacga ataccgcttc gagggccgtc cggtgctgcc gctggctgcc 900
cgcgcgccgg aaggtctgcc gctgatctat gtgggctcgc tgtcgaaact gctctcgccc 960
ggtatccggc tgggatacgc gctggcgccc gagcggctgc tgacccgcat ggccgcggcg 1020
cgcgccgcca tcgaccggca gggcgacgcg ccgctcgagg cggcgctggc cgagctgatc 1080
cgcgacggcg atctgggccg tcatgcccgc aaggcgcgca gggtctaccg ggcgcggcgg 1140
gatctgctgg cggagcgtct cacggcgcag ctggccgggc gcgccgcctt cgatctgccg 1200
gccgggggcc tcgcgctgtg gctgcgctgc gcgggcgtct cggccgagac ctgggccgaa 1260
gccgcagggc aggcggggct cgccctgctg ccgggcacgc gcttcgcgct ggagagcccg 1320
gcgccgcagg ccttccggct gggctatgcg gcgctggacg aggggcagat cgcccgggcg 1380
gtggagatcc tcgcccggag cttccccggc tga 1413
<210>14
<211>470
<212>PRT
<213>类球红细菌(R.sphaeroides)
<400>14
Met Arg Glu Pro Leu Ala Leu Glu Ile Asp Pro Gly His Gly Gly Pro
1 5 10 15
Leu Phe Leu Ala Ile Ala Glu Ala Ile Thr Leu Asp Ile Thr Arg Gly
20 25 30
Arg Leu Arg Pro Gly Ala Arg Leu Pro Gly Thr Arg Ala Leu Ala Arg
35 40 45
Ala Leu Gly Val His Arg Asn Thr Val Asp Ala Ala Tyr Gln Glu Leu
50 55 60
Leu Thr Gln Gly Trp Leu Gln Ala Glu Pro Ala Arg Gly Thr Phe Val
65 70 75 80
Ala Gln Asp Leu Pro Gln Gly Met Leu Val His Arg Pro Ala Pro Ala
85 90 95
Pro Val Glu Pro Val Ala Met Arg Ala Gly Leu Ala Phe Ser Asp Gly
100 105 110
Ala Pro Asp Pro Glu Leu Val Pro Asp Lys Ala Leu Ala Arg Ala Phe
115 120 125
Arg Arg Ala Leu Leu Ser Pro Ala Phe Arg Ala Gly Ala Asp Tyr Gly
130 135 140
Asp Ala Arg Gly Thr Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Ala Ala Tyr Leu
145 150 155 160
Ala Ser Asp Arg Gly Val Val Ala Asp Pro Ala Arg Leu Leu Ile Ala
165 170 175
Arg Gly Ser Gln Met Ala Leu Phe Leu Val Ala Arg Ala Ala Leu Ala
180 185 190
Pro Gly Glu Ala Ile Ala Val Glu Glu Pro Gly Tyr Pro Leu Ala Trp
195 200 205
Glu Ala Phe Arg Ala Ala Gly Ala Glu Val Arg Gly Val Pro Val Asp
210 215 220
Gly Gly Gly Leu Arg Ile Asp Ala Leu Glu Ala Ala Leu Ala Arg Asp
225 230 235 240
Pro Arg Ile Arg Ala Val Tyr Val Thr Pro His His Gln Tyr Pro Thr
245 250 255
Thr Val Thr Met Gly Ala Ala Arg Arg Leu Gln Leu Leu Glu Leu Ala
260 265 270
Glu Arg His Arg Leu Ala Leu Ile Glu Asp Asp Tyr Asp His Glu Tyr
275 280 285
Arg Phe Glu Gly Arg Pro Val Leu Pro Leu Ala Ala Arg Ala Pro Glu
290 295 300
Gly Leu Pro Leu Ile Tyr Val Gly Ser Leu Ser Lys Leu Leu Ser Pro
305 310 315 320
Gly Ile Arg Leu Gly Tyr Ala Leu Ala Pro Glu Arg Leu Leu Thr Arg
325 330 335
Met Ala Ala Ala Arg Ala Ala Ile Asp Arg Gln Gly Asp Ala Pro Leu
340 345 350
Glu Ala Ala Leu Ala Glu Leu Ile Arg Asp Gly Asp Leu Gly Arg His
355 360 365
Ala Arg Lys Ala Arg Arg Val Tyr Arg Ala Arg Arg Asp Leu Leu Ala
370 375 380
Glu Arg Leu Thr Ala Gln Leu Ala Gly Arg Ala Ala Phe Asp Leu Pro
385 390 395 400
Ala Gly Gly Leu Ala Leu Trp Leu Arg Cys Ala Gly Val Ser Ala Glu
405 410 415
Thr Trp Ala Glu Ala Ala Gly Gln Ala Gly Leu Ala Leu Leu Pro Gly
420 425 430
Thr Arg Phe Ala Leu Glu Ser Pro Ala Pro Gln Ala Phe Arg Leu Gly
435 440 445
Tyr Ala Ala Leu Asp Glu Gly Gln Ile Ala Arg Ala Val Glu Ile Leu
450 455 460
Ala Arg Ser Phe Pro Gly
465 470
<210>15
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
ggtattgagg gtcgcatgaa ggttttagtc aatgg 35
<210>16
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
agaggagagt tagagcctta tgaaatgcta gcagcct 37
<210>17
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
ggtattgagg gtcgcatgtt cgacgccctc gcccg 35
<210>18
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
agaggagagt tagagcctca gagactggtg aacttgc 37
<210>19
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
ggtattgagg gtcgcatgga acatttgctg aatcc 35
<210>20
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
agaggagagt tagagcctta aacgccgttg tttatcg 37
<210>21
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
ggtattgagg gtcgcatgcg cgagcctctt gccct 35
<210>22
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
agaggagagt tagagcctca gccggggaag ctccggg 37
<210>23
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
ggtattgagg gtcgcatgtc cacgcaggcg gccat 35
<210>24
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
agaggagagt tagagcctca ctcacgattc acattgc 37
<210>25
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>25
ggtattgagg gtcgcatgcc agaattagct aatga 35
<210>26
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>26
agaggagagt tagagcctta ttcgtcctct tgtaaaa 37
<210>27
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
ggtattgagg gtcgcatgcg ctctacgacg gctcc 35
<210>28
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
agaggagagt tagagcctca gccgcgcagc accttgg 37
<210>29
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
ggtattgagg gtcgcatgtt tgagaacatt accgc 35
<210>30
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
agaggagagt tagagcctta cagcactgcc acaatcg 37
<210>31
<211>1194
<212>DNA
<213>大肠杆菌(E.coli)
<400>31
gtgtttcaaa aagttgacgc ctacgctggc gacccgattc ttacgcttat ggagcgtttt 60
aaagaagacc ctcgcagcga caaagtgaat ttaagtatcg gtctgtacta caacgaagac 120
ggaattattc cacaactgca agccgtggcg gaggcggaag cgcgcctgaa tgcgcagcct 180
catggcgctt cgctttattt accgatggaa gggcttaact gctatcgcca tgccattgcg 240
ccgctgctgt ttggtgcgga ccatccggta ctgaaacaac agcgcgtagc aaccattcaa 300
acccttggcg gctccggggc attgaaagtg ggcgcggatt tcctgaaacg ctacttcccg 360
gaatcaggcg tctgggtcag cgatcctacc tgggaaaacc gcgtagcaat attcgccggg 420
gctggattcg aagtgagtac ttacccctgg tatgacgaag cgactaacgg cgtgcgcttt 480
aatgacctgt tggcgacgct gaaaacatta cctgcccgca gtattgtgtt gctgcatcca 540
tgttgccaca acccaacggg tgccgatctc actaatgatc agtgggatgc ggtgattgaa 600
attctcaaag cccgcgagct tattccattc ctcgatattg cctatcaagg atttggtgcc 660
ggtatggaag aggatgccta cgctattcgc gccattgcca gcgctggatt acccgctctg 720
gtgagcaatt cgttctcgaa aattttctcc ctttacggcg agcgcgtcgg cggactttct 780
gttatgtgtg aagatgccga agccgctggc cgcgtactgg ggcaattgaa agcaacagtt 840
cgccgcaact actccagccc gccgaatttt ggtgcgcagg tggtggctgc agtgctgaat 900
gacgaggcat tgaaagccag ctggctggcg gaagtagaag agatgcgtac tcgcattctg 960
gcaatgcgtc aggaattggt gaaggtatta agcacagaga tgccagaacg caatttcgat 1020
tatctgctta atcagcgcgg catgttcagt tataccggtt taagtgccgc tcaggttgac 1080
cgactacgtg aagaatttgg tgtctatctc atcgccagcg gtcgcatgtg tgtcgccggg 1140
ttaaatacgg caaatgtaca acgtgtggca aaggcgtttg ctgcggtgat gtaa 1194
<210>32
<211>397
<212>PRT
<213>大肠杆菌(E.coli)
<400>32
Val Phe Gln Lys Val Asp Ala Tyr Ala Gly Asp Pro Ile Leu Thr Leu
1 5 10 15
Met Glu Arg Phe Lys Glu Asp Pro Arg Ser Asp Lys Val Asn Leu Ser
20 25 30
Ile Gly Leu Tyr Tyr Asn Glu Asp Gly Ile Ile Pro Gln Leu Gln Ala
35 40 45
Val Ala Glu Ala Glu Ala Arg Leu Asn Ala Gln Pro His Gly Ala Ser
50 55 60
Leu Tyr Leu Pro Met Glu Gly Leu Asn Cys Tyr Arg His Ala Ile Ala
65 70 75 80
Pro Leu Leu Phe Gly Ala Asp His Pro Val Leu Lys Gln Gln Arg Val
85 90 95
Ala Thr Ile Gln Thr Leu Gly Gly Ser Gly Ala Leu Lys Val Gly Ala
100 105 110
Asp Phe Leu Lys Arg Tyr Phe Pro Glu Ser Gly Val Trp Val Ser Asp
115 120 125
Pro Thr Trp Glu Asn Arg Val Ala Ile Phe Ala Gly Ala Gly Phe Glu
130 135 140
Val Ser Thr Tyr Pro Trp Tyr Asp Glu Ala Thr Asn Gly Val Arg Phe
145 150 155 160
Asn Asp Leu Leu Ala Thr Leu Lys Thr Leu Pro Ala Arg Ser Ile Val
165 170 175
Leu Leu His Pro Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ala Asp Leu Thr Asn
180 185 190
Asp Gln Trp Asp Ala Val Ile Glu Ile Leu Lys Ala Arg Glu Leu Ile
195 200 205
Pro Phe Leu Asp Ile Ala Tyr Gln Gly Phe Gly Ala Gly Met Glu Glu
210 215 220
Asp Ala Tyr Ala Ile Arg Ala Ile Ala Ser Ala Gly Leu Pro Ala Leu
225 230 235 240
Val Ser Asn Ser Phe Ser Lys Ile Phe Ser Leu Tyr Gly Glu Arg Val
245 250 255
Gly Gly Leu Ser Val Met Cys Glu Asp Ala Glu Ala Ala Gly Arg Val
260 265 270
Leu Gly Gln Leu Lys Ala Thr Val Arg Arg Asn Tyr Ser Ser Pro Pro
275 280 285
Asn Phe Gly Ala Gln Val Val Ala Ala Val Leu Asn Asp Glu Ala Leu
290 295 300
Lys Ala Ser Trp Leu Ala Glu Val Glu Glu Met Arg Thr Arg Ile Leu
305 310 315 320
Ala Met Arg Gln Glu Leu Val Lys Val Leu Ser Thr Glu Met Pro Glu
325 330 335
Arg Asn Phe Asp Tyr Leu Leu Asn Gln Arg Gly Met Phe Ser Tyr Thr
340 345 350
Gly Leu Ser Ala Ala Gln Val Asp Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val
355 360 365
Tyr Leu Ile Ala Ser Gly Arg Met Cys Val Ala Gly Leu Asn Thr Ala
370 375 380
Asn Val Gln Arg Val Ala Lys Ala Phe Ala Ala Val Met
385 390 395
<210>33
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
ggtattgagg gtcgcgtgtt tcaaaaagtt gacgc 35
<210>34
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
agaggagagt tagagcctta catcaccgca gcaaacg 37
<210>35
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
ggtattgagg gtcgcatgga gtccaaagtc gttga 35
<210>36
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
agaggagagt tagagcctta cacttggaaa acagcct 37
<210>37
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>37
ggtattgagg gtcgcatgaa aaactggaaa acaag 35
<210>38
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
agaggagagt tagagcctta cagcttagcg ccttcta 37
<210>39
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>39
ggtattgagg gtcgcatgcg aggggcatta ttcaa 35
<210>40
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
agaggagagt tagagcctca gcccttgagc gcgaag 36
<210>41
<211>1416
<212>DNA
<213>大肠杆菌(E.coli)
<400>41
atggaaaact ttaaacatct ccctgaaccg ttccgcattc gtgttattga gccagtaaaa 60
cgtaccaccc gcgcttatcg tgaagaggca attattaaat ccggtatgaa cccgttcctg 120
ctggatagcg aagatgtttt tatcgattta ctgaccgaca gcggcaccgg ggcggtgacg 180
cagagcatgc aggctgcgat gatgcgcggc gacgaagcct acagcggcag tcgtagctac 240
tatgcgttag ccgagtcagt gaaaaatatc tttggttatc aatacaccat tccgactcac 300
cagggccgtg gcgcagagca aatctatatt ccggtactga ttaaaaaacg cgagcaggaa 360
aaaggcctgg atcgcagcaa aatggtggcg ttctctaact atttctttga taccacgcag 420
ggccatagcc agatcaacgg ctgtaccgtg cgtaacgtct atatcaaaga agccttcgat 480
acgggcgtgc gttacgactt taaaggcaac tttgaccttg agggattaga acgcggtatt 540
gaagaagttg gtccgaataa cgtgccgtat atcgttgcaa ccatcaccag taactctgca 600
ggtggtcagc cggtttcact ggcaaactta aaagcgatgt acagcatcgc gaagaaatac 660
gatattccgg tggtaatgga ctccgcgcgc tttgctgaaa acgcctattt catcaagcag 720
cgtgaagcag aatacaaaga ctggaccatc gagcagatca cccgcgaaac ctacaaatat 780
gccgatatgc tggcgatgtc cgccaagaaa gatgcgatgg tgccgatggg cggcctgctg 840
tgcatgaaag acgacagctt ctttgatgtg tacaccgagt gcagaaccct ttgcgtggtg 900
caggaaggct tcccgacata tggcggcctg gaaggcggcg cgatggagcg tctggcggta 960
ggtctgtatg acggcatgaa tctcgactgg ctggcttatc gtatcgcgca ggtacagtat 1020
ctggtcgatg gtctggaaga gattggcgtt gtctgccagc aggcgggcgg tcacgcggca 1080
ttcgttgatg ccggtaaact gttgccgcat atcccggcag accagttccc ggcacaggcg 1140
ctggcctgcg agctgtataa agtcgccggt atccgtgcgg tagaaattgg ctctttcctg 1200
ttaggccgcg atccgaaaac cggtaaacaa ctgccatgcc cggctgaact gctgcgttta 1260
accattccgc gcgcaacata tactcaaaca catatggact tcattattga agcctttaaa 1320
catgtgaaag agaacgcggc gaatattaaa ggattaacct ttacgtacga accgaaagta 1380
ttgcgtcact tcaccgcaaa acttaaagaa gtttaa 1416
<210>42
<211>1371
<212>DNA
<213>弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)
<400>42
atgaattatc cggcagaacc cttccgtatt aaaagcgttg aaactgtatc tatgatcccg 60
cgtgatgaac gcctcaagaa aatgcaggaa gcgggttaca atactttcct gttaaattcg 120
aaagatattt atattgacct gctgacagac agtggcacta acgcaatgag cgacaagcag 180
tgggccggaa tgatgatggg tgatgaagcg tacgcgggca gcgaaaactt ctatcatctg 240
gaaagaaccg tgcaggaact gtttggcttt aaacatattg ttccgactca ccaggggcgt 300
ggcgcagaaa acctgttatc gcagctggct attaaacctg ggcaatatgt tgccgggaat 360
atgtatttca ctaccacccg ttatcaccag gaaaaaaatg gtgcggtgtt tgtcgatatc 420
gttcgtgacg aagcgcacga tgccggtctg aatattgcgt ttaaaggtga tatcgatctt 480
aaaaaattac aaaagctgat tgatgaaaaa ggcgcagaga atattgcgta tatctgcctg 540
gcggtgacgg ttaacctcgc gggcggccaa ccggtctcga tggctaacat gcgtgcggtg 600
cgtgaactga cagaagcgca tggcattaaa gtgttctacg acgctacccg ctgcgtagaa 660
aacgcctact ttatcaaaga gcaagagcag ggctttgaga acaagagcat cgccgagatc 720
gtgcatgaga tgttcagcta cgccgacggt tgtaccatga gtggtaaaaa agactgtctg 780
gtgaacatcg gcggcttcct gtgcatgaac gatgacgaaa tgttctcttc tgccaaagag 840
ttagtcgtgg tctacgaagg gatgccatct tacggcggcc tggccggacg tgatatggaa 900
gcgatggcga ttggcctgcg tgaagccatg cagtacgaat atattgagca ccgcgtgaag 960
caggttcgct acctgggcga taagctgaaa gccgctggcg taccgattgt tgaaccggta 1020
ggcggtcacg cggtattcct cgatgcgcgt cgcttctgcg agcatctgac gcaagatgag 1080
ttcccggcac aaagtctggc tgccagcatc tatgtggaaa ccggcgtgcg cagtatggag 1140
cgcggaatta tctctgcggg ccgtaataac gtgaccggtg aacaccacag accgaaactg 1200
gaaaccgtgc gtctgactat tccacgtcgt gtttatacct acgcacatat ggatgttgtg 1260
gctgacggta ttattaaact ttaccagcac aaagaagata ttcgcgggct gaagtttatt 1320
tacgagccga agcagttgcg tttctttact gcacgctttg attacatcta a 1371
<210>43
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>43
ggtattgagg gtcgcatgga aaactttaaa catct 35
<210>44
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
agaggagagt tagagcctta aacttcttta agttttg 37
<210>45
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>45
ggtattgagg gtcgcatgaa ttatccggca gaacc 35
<210>46
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>46
agaggagagt tagagcctta gatgtaatca aagcgtg 37
<210>47
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>47
ccagggcacc ggcgcagagc aaatctatat t 31
<210>48
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>48
tgcgccggtg ccctggtgag tcggaatggt 30
<210>49
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>49
tcctgcacgc ggcaaagggt tctgcactcg gt 32
<210>50
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>50
ctttgccgcg tgcaggaagg cttcccgaca 30
<210>51
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>51
aggggaccgg cgcagaaaac ctgttatcg 29
<210>52
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>52
tctgcgccgg tcccctggtg agtcggaaca at 32
<210>53
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>53
gttagtccgc gtctacgaag ggatgccat 29
<210>54
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>54
gtagacgcgg actaactctt tggcagaag 29
<210>55
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>55
ggtattgagg gtcgcatgta cgaactggga gttgt 35
<210>56
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>56
agaggagagt tagagcctta gtcaatatat ttcaggc 37
<210>57
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>57
ggtattgagg gtcgcatgtc cggcatcgtt gtcca 35
<210>58
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>58
agaggagagt tagagcctca gacatatttc agtccca 37
<210>59
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>59
ggtattgagg gtcgcatgcg actgaacaac ctcgg 35
<210>60
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>60
agaggagagt tagagcctca gttctccacg tattcca 37
<210>61
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>61
ggtattgagg gtcgcatgag cgtggttcac cggaa 35
<210>62
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>62
agaggagagt tagagcctca atcgatatat ttcagtc 37
<210>63
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>63
ggtattgagg gtcgcatgag cctggttaat atgaa 35
<210>64
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>64
agaggagagt tagagcctta tgactttaac gcgttga 37
<210>65
<211>684
<212>DNA
<213>***丛毛单胞菌(C.testosteroni)
<400>65
atgtacgaac tgggagttgt ctaccgcaat atccagcgcg ccgaccgcgc tgctgctgac 60
ggcctggccg ccctgggctc cgccaccgtg cacgaggcca tgggccgcgt cggtctgctc 120
aagccctata tgcgccccat ctatgccggc aagcaggtct cgggcaccgc cgtcacggtg 180
ctgctgcagc ccggcgacaa ctggatgatg catgtggctg ccgagcagat tcagcccggc 240
gacatcgtgg tcgcagccgt caccgcagag tgcaccgacg gctacttcgg cgatctgctg 300
gccaccagct tccaggcgcg cggcgcacgt gcgctgatca tcgatgccgg cgtgcgcgac 360
gtgaagacgc tgcaggagat ggactttccg gtctggagca aggccatctc ttccaagggc 420
acgatcaagg ccaccctggg ctcggtcaac atccccatcg tctgcgccgg catgctggtc 480
acgcccggtg acgtgatcgt ggccgacgac gacggcgtgg tctgcgtgcc cgccgcgcgt 540
gccgtggaag tgctggccgc cgcccagaag cgtgaaagct tcgaaggcga aaagcgcgcc 600
aagctggcct cgggcatcct cggcctggat atgtacaaga tgcgcgagcc cctggaaaag 660
gccggcctga aatatattga ctaa 684
<210>66
<211>227
<212>PRT
<213>***丛毛单胞菌(C.testosteroni)
<400>66
Met Tyr Glu Leu Gly Val Val Tyr Arg Asn Ile Gln Arg Ala Asp Arg
1 5 10 15
Ala Ala Ala Asp Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ser Ala Thr Val His Glu
20 25 30
Ala Met Gly Arg Val Gly Leu Leu Lys Pro Tyr Met Arg Pro Ile Tyr
35 40 45
Ala Gly Lys Gln Val Ser Gly Thr Ala Val Thr Val Leu Leu Gln Pro
50 55 60
Gly Asp Asn Trp Met Met His Val Ala Ala Glu Gln Ile Gln Pro Gly
65 70 75 80
Asp Ile Val Val Ala Ala Val Thr Ala Glu Cys Thr Asp Gly Tyr Phe
85 90 95
Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Phe Gln Ala Arg Gly Ala Arg Ala Leu
100 105 110
Ile Ile Asp Ala Gly Val Arg Asp Val Lys Thr Leu Gln Glu Met Asp
115 120 125
Phe Pro Val Trp Ser Lys Ala Ile Ser Ser Lys Gly Thr Ile Lys Ala
130 135 140
Thr Leu Gly Ser Val Asn Ile Pro Ile Val Cys Ala Gly Met Leu Val
145 150 155 160
Thr Pro Gly Asp Val Ile Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Cys Val
165 170 175
Pro Ala Ala Arg Ala Val Glu Val Leu Ala Ala Ala Gln Lys Arg Glu
180 185 190
Ser Phe Glu Gly Glu Lys Arg Ala Lys Leu Ala Ser Gly Ile Leu Gly
195 200 205
Leu Asp Met Tyr Lys Met Arg Glu Pro Leu Glu Lys Ala Gly Leu Lys
210 215 220
Tyr Ile Asp
225
<210>67
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>67
actcggatcc gaaggagata tacatatgta cgaactggga ct 42
<210>68
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>68
cggctgtcga ccgttagtca atatatttca ggc 33
<210>69
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>69
cgcggatcca taatggttga gaacattacc g 31
<210>70
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>70
acgcgtcgac ttacagcact gccacaatcg 30
<210>71
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>71
ccggaattca taatggtcga actgggagtt gt 32
<210>72
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>72
gaatgcggcc gcttagtcaa tatatttcag gcc 33
<210>73
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>73
ggtattgagg gtcgc 15
<210>74
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>74
agaggagagt tagagcc 17
SEQ ID NO:75(DNA-引物)
GAAGCGATTGTGGCAGTGCTGTAAGGCTCTAACGGATCCGAAGGAGATATACATATGTAC
SEQ ID NO:76(DNA-引物)
GTACATATGTATATCTCCGGATCCGTTAGAGCCTTACAGCACTGCCACAATCGCTTC
SEQ ID NO:77(DNA-引物)
TGCCATGGAAAACTTTAAACATCT
SEQ ID NO:78(DNA-引物)
CCAAGCTTTTAAACTTCTTTAAGTTTTG
SEQ ID NO:79(DNA-引物)
CGGGGTACCCATGCAAACACAAAAACCGACTCTCGAACTG
SEQ ID NO:80(DNA-引物)
CGCGGATCCTTAACTGCGCGTCGCCGCTTTCAT
SEQ ID NO:81(DNA)
ATGCAAACACAAAAACCGACTCTCGAACTACTAACCTGCGAAGGCGCTTATCGCGACAAC
CCGACCGCGCTTTTTCACCAGTTGTGTGGGGATCGTCCGGCAACGCTGCTGCTGGAATCC
GCAGATATCGACAGCAAAGATGATTTAAAAAGCCTGCTACTGGTAGACAGTGCGCTGCGC
ATTACAGCATTAGGTGACACTGTCACAATTAAGGCGTTATCCGGCAATGGTGAAGCCCTG
CTGGCACTACTGGATAACGCCCTGCCTGCGGGTGTGGAAAATGAACAATCACCAAACTGC
CGTGTGCTGCGCTTCCCCCCTGTCAGTCCACTGCTGGATGAAGACGCTCGCTTATGCTCC
CTTTCGGTTTTTGACGCTTTCCGTTTATTGCAGAATCTGTTGAATGTACCGAAGGAAGAA
CGAGAAGCCATGTTCTTCGGCGGCCTGTTCTCTTATGACCTTGTGGCGGGATTTGAAGAT
TTACCGCAACTGTCAGCGGAAAATAACTGCCCTGATTTCTGTTTTTATCTCGCTGAAACG
CTGATGGTGATTGACCATCAGAAAAAAAGCACCCGTATTCAGGCCAGCCTGTTTGCTCCG
AATGAAGAAGAAAAACAACGTCTCACTGCTCGCCTGAACGAACTACGTCAGCAACTGACC
GAAGCCGCGCCGCCGCTGCCAGTGGTTTCCGTGCCGCATATGCGTTGTGAATGTAATCAG
AGCGATGAAGAGTTCGGTGGCGTAGTGCGTTTGTTGCAAAAAGCGATTCGCGCTGGAGAA
ATTTTCCAGGTGGTGCCATCTCGCCGTTTCTCTCTGCCCTGCCCGTCACCGCTGGCGGCC
TATTACGTGCTGAAAAAGAGTAATCCCAGCCCGTACATGTTTTTTATGCAGGATAATGAT
TTCACCCTATTTGGCGCGTCGCCGGAAAGCTCGCTCAAGTATGATGCCACCAGCCGCCAG
ATTGAGATCTACCCGATTGCCGGAACACGCCCACGCGGTCGTCGCGCCGATGGTTCACTG
GACAGAGATCTCGACAGCCGTATTGAACTGGAAATGCGTACCGATCATAAAGAGCTGTCT
GAACATCTGATGCTGGTTGATCTCGCCCGTAATGATCTGGCACGCATTTGCACCCCCGGC
AGCCGCTACGTCGCCGATCTCACCAAAGTTGACCGTTATTCCTATGTGATGCACCTCGTC
TCTCGCGTAGTCGGCGAACTGCGTCACGATCTTGACGCCCTGCACGCTTATCGCGCCTGT
ATGAATATGGGGACGTTAAGCGGTGCGCCGAAAGTACGCGCTATGCAGTTAATTGCCGAG
GCGGAAGGTCGTCGCCGCGGCAGCTACGGCGGCGCGGTAGGTTATTTCACCGCGCATGGC
GATCTCGACACCTGCATTGTGATCCGCTCGGCGCTGGTGGAAAACGGTATCGCCACCGTG
CAAGCGGGTGCTGGTGTAGTCCTTGATTCTGTTCCGCAGTCGGAAGCCGACGAAACCCGT
AACAAAGCCCGCGCTGTACTGCGCGCTATTGCCACCGCGCATCATGCACAGGAGACTTTC
TGA
SEQ ID NO:82(氨基酸)
MQTQKPTLELLTCEGAYRDNPTALFHQLCGDRPATLLLESADIDSKDDLKSLLLVDSALR
ITALGDTVTIKALSGNGEALLALLDNALPAGVENEQSPNCRVLRFPPVSPLLDEDARLCS
LSVFDAFRLLQNLLNVPKEEREAMFFGGLFSYDLVAGFEDLPQLSAENNCPDFCFYLAET
LMVIDHQKKSTRIQASLFAPNEEEKQRLTARLNELRQQLTEAAPPLPVVSVPHMRCECNQ
SDEEFGGVVRLLQKAIRAGEIFQVVPSRRFSLPCPSPLAAYYVLKKSNPSPYMFFMQDND
FTLFGASPESSLKYDATSRQIEIYPIAGTRPRGRRADGSLDRDLDSRIELEMRTDHKELS
EHLMLVDLARNDLARICTPGSRYVADLTKVDRYSYVMHLVSRVVGELRHDLDALHAYRAC
MNMGTLSGAPKVRAMQLIAEAEGRRRGSYGGAVGYFTAHGDLDTCIVIRSALVENGIATV
QAGAGVVLDSVPQSEADETRNKARAVLRAIATAHHAQETF
SEQ ID NO:83(DNA-引物)
CGGGGTACCAGAAGGAGAGATGCACGATGTTTGAGAACATTACCGCCGCT
SEQ ID NO:84(DNA-引物)
CGGGGTACCGCTTAGTCAATATATTTCAGGC
SEQ ID NO:85(DNA-引物)
ATGTCCAGAAGGCTTCGCAGAACAAAAATCGTTACCACGTTAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
SEQ ID NO:86(DNA-引物)
CTCTACCGTTAAAATACGCGTGGTATTAGTAGAACCCACGGTACCATATGAATATCCTCCTTAG
SEQ ID NO:87(DNA-引物)
AGGACGTGAACAGATGCGGTGTTAGTAGTGCCGCTCGGTACCAGCATATGAATATCCTCCTTAG
SEQ ID NO:88(DNA-引物)
ATGAAAAAGACCAAAATTGTTTGCACCATCGGACCGAAAACCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
SEQ ID NO:89(氨基酸)
MPELANDLGL
Claims (23)
1.一种生产莫纳甜或其盐的方法,所述方法包括:
(a)在培养基中培养野生型微生物,其中所述微生物选自:苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、***丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)和稻草假单胞菌(Pseudomonas straminea),其中,所述微生物包含至少一种编码醛缩酶多肽的核酸和至少一种编码转氨酶多肽的核酸;和
(b)从所述培养基或培养的微生物中提取莫纳甜或其盐。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养基包含非离子去污剂、青霉素、青霉素衍生物或其组合。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述非离子去污剂选自吐温、TritonX-100和十二烷基乙酸铵。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养基所含生物素的浓度小于5μg/L。
5.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述青霉素衍生物是氨苄青霉素。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(a)中,培养微生物前所述培养基的pH为pH 7-pH 8。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养基包含糖蜜、玉米浆或其组合。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述微生物的生长需要苯丙氨酸和酪氨酸,其中所述培养基包含苯丙氨酸和酪氨酸。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述微生物含有aspC和proA基因。
10.一种生产莫纳甜或其盐的方法,所述方法包括:
(a)在培养基中培养谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13058;和
(b)从所述培养基或培养的微生物中提取莫纳甜或其盐。
11.如权利要求10所述的方法,其特征在于,所述培养基包含吐温、青霉素、青霉素衍生物或其组合。
12.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养基包含色氨酸、丙酮酸、非离子去污剂、青霉素、青霉素衍生物或其组合。
13.如权利要求12所述的方法,其特征在于,所述非离子去污剂是吐温。
14.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养基包含丙酮酸、吐温和青霉素衍生物。
15.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述微生物分泌莫纳甜或其盐。
16.如权利要求1所述的方法,其特征在于,在发酵罐中培养所述微生物。
17.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述微生物是脂肪酸营养缺陷型。
18.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述微生物未经遗传修饰。
19.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养基包含PHB培养基。
20.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述微生物是苜蓿中华根瘤菌或***丛毛单胞菌。
21.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述微生物是***丛毛单胞菌,所述培养基还包含色氨酸和丙酮酸。
22.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养基包含TY培养基。
23.如权利要求22所述的方法,其特征在于,所述培养基还包含色氨酸、丙酮酸或其组合。
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