KR19990083043A - 단쇄의 다중 항원-결합성 분자, 이의 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 VH-VL 작제물의 형태로 연결되어 궁극적으로는 펩타이드를 통하여 함께 연결되어 있는, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 다양한 가변 영역을 지니고 있는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자, 이의 제조 방법, 및 약제 또는 진단 보조제로서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

단쇄의 다중 항원-결합성 분자, 이의 제조 방법 및 이의 용도{Single-chain multiple antigen-binding molecule, its preparation and use}
본 발명은 VH-VL 작제물의 형태로 연결되어 궁극적으로는 펩타이드를 통하여 함께 연결되어 있는, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 다양한 가변 영역을 지니고 있는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자, 이의 제조 방법, 및 약제 또는 진단 보조제로서의 이의 용도에 관한 것이다.
2가지 상이한 항원, 예를 들면, 종양 세포 표면 항원과 효능기(effector) 분자를 인식하는 이중 특이적(bispecific) 항체가 실험적인 면역 치료법에 광범위하게 사용되고 있다[참조: Fanger et al., Crit. Rev. Immunol. 12, 101-124(1992); van de Winkel et al., Immunol. Today 18, 562-564(1997)]. 이와 같이 이중 특이적 항체에 의해 점증되는 효능기 작용물로는, 예를 들면, 세포독성 세포 및 식세포, 보체 성분, 사이토킨, 및 혈전 붕괴성 및 섬유소 용해성 효소와 같이 체내에서 천연적으로 발생되는 것들 뿐만 아니라 외인성 효능기 분자, 예를 들면, 독소, 프로드럭(prodrug)-전환 효소 및 방사성핵종이 있다. 따라서, 예를 들면, 이종 이식된 종양(xenotransplanted tumor)에서 호지킨(Hodgkin) 종양 관련 항원 CD30과 T-세포 항원 CD3 및 CD28에 대한 이중 특이적 항체를 주입하면, 이는 세포독성 T 세포를 점증시키고 자극하여 항암 활성을 유도시킨다[참조: Renner et al., Science 264, 833, 1994]. 또 다른 접근법에서는, CD30과 알칼린 포스파타제에 대한 이중 특이적 항체를 사용하여, 상기 효소를 상기 종양 부위에 점증시킴으로써 약물의 비독성 전구체를 독성 약물로 전환시킨다[참조: Sahin et al., Cancer Res. 50, 6944-6948, 1990].
정제된 이중 특이적 항체를 주입하는 것에 대한 대체 방안은 시험관내 또는 생체내에서 형질감염된 세포에 의해 이들 이중 특이적 항체를 발현 및 분비시키는 것이다. 이러한 방법의 이점은 형질도입된 세포에 의한 이중 특이적 항체의 생산이 생체내에서 일어나기 때문에 주입 전에 이중 특이적 항체를 정성들여 생산하여 정제시킬 필요가 없다는 점이다. 또한, 적합한 발현 시스템을 선택함으로써, 이중 특이적 항체의 발현을 기관 또는 특정 종양에서 국부적으로 조절하거나 전신 조절하는 것이 가능하다.
이중 특이적 항체는, 예를 들면, 화학적 가교결합시킴으로써 제조할 수 있다[참조: Nisonoff et al., Nature 194, 355, 1962]. 동물 기원의 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 분자를 화학적으로 가교결합시키면, 어떠한 적은 부분도 불활성화되지 않는다. 또한, 이종이량체(heterodimer)와 동종이량체(homodimer) 모두가 생성된다. 동종이량체는 정교한 공정에 의해 필요로 하는 이종이량체로부터 분리시켜야만 한다. 이중 특이적 항체를 생산하는, 하이브리드 하이브리도마로 불리우는 하이브리도마 세포는 비교적 정교한 방식으로만 생산될 수 있는데, 이는 이를 2가지 상이한 하이브리도마와 함께 융합시킬 필요가 있기 때문이다[참조: Milstein et al., Nature 305, 537, 1983]. 작용성 이종이량체의 비율이 이론상 단지 10% 정도로 비교적 낮은데, 이는 상기 2가지 항체 분자의 중쇄와 경쇄가 어떠한 방식으로든 서로 결합될 수 있기 때문이다. 사용된 출발 물질은 사람에 대한 면역원성인 쥐의 모노클로날 항체를 주로 포함한다.
각종 2가 또는 이중 특이적 항체 분자를 또한 재조합 기술을 이용하여 제조하고 세균성 또는 진핵성 세포에서 발현시킬 수 있다[참조: WO 93/06217]. 쥐 및 사람 기원 모두의 출발 분자를 사용하여 이들을 제조할 수 있다는 것은 모든 재조합 항체 분자에 해당된다. 이중 특이적 재조합 항체 분자를 가능한 한 효율적으로 제조하기 위한 각종 방법이 개발되었다. 이들 방법을 사용하여 각종 그룹의 분자를 제조할 수 있다.
한 그룹의 분자에서는, 이량체화를 달성하기 위해서, 항체의 가변 부분을 면역글로불린 불변 영역(Fc, CH3, CL)에 융합시킨다[참조: Hu et al., Cancer Res. 56, 3055-3061(1994); Hayden et al., Ther. Immunol. 1, 3-15(1994)]. 그러나, 이러한 경우에는, 이종이량체성 분자를 선별할 필요가 없기 때문에, 이러한 방식으로는 주로 2가 동종이량체가 생성된다. 더욱이, 이들 분자를 작용성 형태로 발현시키는 것은 진핵성 세포에 한정된다.
또 다른 그룹의 분자에서는, 항체의 가변 부분을 다른 단백질로부터의 펩타이드 또는 단백질 영역에 융합시켜 2가 또는 이중 특이적 분자를 제조한다[참조: Pluckthun and Pack, Immunotechnol. 3, 83-105(1997)]. 이러한 경우 역시, 랜덤한 결합으로 인해, 통상적으로 동종이량체와 이종이량체가 형성된다. 또한, 이들 분자는 일정 비율(몇몇 경우에서는 상당한 비율)의 외래 서열을 함유하므로, 현저한 면역원성이 예상될 수 있다.
세 번째 그룹의 분자에서는, 재조합 Fv 단편을 약간 변형시킨 것, 일반적으로 단쇄 Fv 단편(scFv)을 사용하여 2가 또는 이중 특이적 항체를 제조한다[참조: Holliger and Winter, Curr. Opin. Biotechnol. 4, 446-449(1993)]. 이러한 변형에는 scFv 쇄의 C 말단에서 부가의 시스테인을 통하여 이량체화하는 것이 포함된다[참조: MacCartney et al., Protein Engin. 8, 301-314(1994)]. 그러나, 이로써, 동종이량체와 이종이량체 모두가 생성되며, 세균성 세포에서의 발현시에는 비-작용성 집합체가 생성된다. 구조물 scFv(A)-링커-scFv(B)의 세로 일렬의 scFv 분자[참조: Mallender and Voss, J. Biol. Chem. 269, 199-206, 1994]를 세균 세포와 진핵 세포 모두에서 발현시킬 수 있다. 그러나, 이들 중 몇몇 경우에서는, 4개의 가변 영역이 비-작용적으로 결합될 수도 있다.
재조합 항체 기술은 최근 수 년간 신규의 작은 2가 또는 이중 특이적 항체 단편을 개발시켰다. 이러한 유형의 분자의 예는 "디아보디(diabody)"이다[참조: Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448, 1993]. 이들은 매우 짧은 링커에 의해 함께 연결되어 있는, 면역글로불린의 가변 VH 영역과 VL 영역을 포함한다. 이러한 링커는 너무 짧아서, 단쇄 Fv 단편의 경우에 발생된 것과 같이, 특정 쇄의 VH 영역과 VL 영역이 결합하지 못한다. 이는 두 쇄의 VH 영역과 VL 영역이 결합되어 이량체를 형성하므로, 2개의 결합 부위를 갖는 분자가 생성된다는 것을 의미한다[참조: Perisic et al., Structure 2, 1217-1226, 1994]. 이중 특이적 "디아보디"는 구조물 VH(A)-VL(B) 및 VH(B)-VL(A)의 두 쇄를 한 세포에서 발현시킴으로써 생성시킨다. 이러한 경우, VL은 면역글로불린의 경쇄(L)의 가변(V) 영역을 의미하고 VH는 면역글로불린의 중쇄(H)의 가변(V) 영역을 의미하며, 이들 가변 영역은 항원(A) 또는 (B)에 결합된다. VH 부분을 VL 부분과 결합시키면 작용적으로 활성인 결합 부위를 갖는 이종이량체성 단편이 생성된다. 세균을 이용하여 발현시킨 이중 특이적 "디아보디"는 각종 효능기 분자, 면역글로불린, C1q 또는 효소 또는 효능기 세포, 예를 들면, 세포독성 T 임파구를 점증시키는데 성공적으로 사용된 바 있다[참조: Kontermann et al., Nature Biotechnol. 15, 629(1997); Holliger et al., Protein Engin. 9, 299(1996); Nature Biotechnol. 15, 632(1997); Zhu et al., BioTechnol. 14, 192(1996); FitzGerald et al., Protein Engin. 10, 1221(1997); Krebs et al., J. Biol. Chem. 273, 2858(1998)].
그러나, "디아보디"는 다음과 같은 단점을 지니고 있다: 두 VH(A)-VL(B) 및 VH(B)-VL(A) 쇄는 더 이상 물리적으로 함께 연결되지 않기 때문에, 동종이량체와 이종이량체가 동등한 정도로 생성될 수 있으며,이로써 이종이량체에 필요한 극히 정교한 정제 공정이 수반되야 한다. 또한, 기존에 scFv 단편에 대해 나타난 바와 같이, 이량체의 분리가 일어난다[참조: Glockshuber et al., Biochem. 29, 1362-1367(1990)]. 이러한 문제점을 해결하기 위해서, 디설파이드-안정화된 "디아보디"[참조: FitzGerald et al., Protein Engin. 10, 1221-1225, 1997] 또는 "크놉 인투 홀 디아보디(knob into hole diabody)"[참조: Zhu et al., Protein Sci. 6, 781-788, 1997]이 개발되었다. 그러나, 이의 제조 방법은 상당히 복잡하다. 또한, 이중 특이적 "디아보디"를 유전공학적으로 발현시키기 위해서는, 각 쇄에 대한 시그날 서열과 리보솜 결합 부위가 요구되는데, 이 역시 매우 복잡하다. 비-작용성 동종이량체의 비율을 증가시키는, 등몰량이 아닌 양의 가변 영역을 발현시키는 것이 또한 가능하다.
따라서, 본 발명의 목적은 앞서 기재된 소위 "디아보디"의 단점을 지니고 있지 않고 간단한 방식에 의해 주로 균일한 형태로 제조될 수 있는 다중 항원-결합성 분자를 개발하는 것이다.
도 1은 단쇄의 이중 항원-결합성 분자의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 효능기(effector)를 갖는 단쇄의 이중 항원-결합성 분자를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3 및 도 5는 단쇄의 이중 항원-결합성 분자를 암호화하는 핵산 작제물을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 효능기를 갖는 단쇄의 이중 항원-결합성 분자를 암호화하는 핵산 작제물을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 6은 CEA 및 이. 콜라이(E. coli) β-갈락토시다제(CEAGal)에 대한 디아보디(diabody)와 비교해서, 본 발명에 따르는 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질(scDb-CEAGal)을 통하여 플라스틱-결합된 CEA 상에 β-갈락토시다제를 점증시키는 것을 도시한 것이다. 미세역가판을 음성 대조군으로서 BSA로 피복시킨다.
도 7은 포유류 세포에 의해 분비된 scDb-CEAGal을 통하여 β-갈락토시다제를 점증시키는 것을 도시한 것인데, 여기서 상이한 양의 scDb-CEAGal와 β-갈락토시다제가 CEA-피복된 미세역가판에 이용된다. 이용된 기질은 o-니트로페닐 β-D-갈락토피라노시드이다. 미세역가판을 음성 대조군으로서 BSA로 피복시킨다.
도 8A는 본 발명에 따르는 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질(scDb), β-갈락토시다제(β-Gal), 다우노마이신 β-D-갈락토피라노시드(프로드럭) 및/또는 다우노마이신(약물)의 존재하에서 LoVo 세포의 사멸을 도시한 것이다.
도 8B는 CEA-음성 세포주(A549)를 이용한 대조 실험을 도시한 것이다.
따라서, 본 발명의 한 국면은
a) 제1 특이성(A)을 지닌 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역(VH) 및 이의 작용성 부분,
b) 제2 특이성(B)을 지닌 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역(VL) 및 이의 작용성 부분,
c) 특이성(B)을 지닌 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역(VH) 및 이의 작용성 부분, 및
d) 특이성(A)을 지닌 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역(VL) 및 이의 작용성 부분을 포함하고, 상기 VH 영역과 VL 영역이 VH-VL 작제물 또는 VL-VH 작제물의 형태로 연결되어 있으며 2개의 VH-VL 작제물이 펩타이드(P)를 통하여 연결되어 있는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자이다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명에 따르는 분자는 2개 초과의 상기 VH-VL 작제물(예: VH(B)-펩타이드-VL(B))을 포함한다. 이로써, 여러 개의 특이성 (A), (B), (C) 등을 지니고 있는 분자를 수득할 수 있다.
바람직한 양태에서는, 개개의 VH-VL 작제물을 동일한 특이성을 지닌 이들의 가변 영역을 통하여 결합시킨다. 본 발명에 따르는 분자의 특히 바람직한 구조가 도 1에 도시되어 있다.
또 다른 바람직한 양태에서는, 개개의 특이성이 본질적으로 동일하다. "본질적으로 동일한"이란 용어는 본 발명에 따르면, 상기 영역의 분자 구조는 상이하지만, 이들의 특이성, 즉 특이적 항원-결합 기능을 유지하는 것이 완벽하게 가능하다는 것을 의미한다. 이러한 결과는 본 발명에 따르는 분자가 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄의 완전한 가변 영역을 포함할 수 있을 뿐만 아니라 이의 작용성 부분, 즉 이들의 특이적 항원-결합 특성이 유지된 부분을 포함할 수 있다는 것이다. 예를 들면, 본 발명의 목적상, 면역글로불린의 가변 영역의 개개의 CDR 부분("상보적 결정 영역")으로 구성된 인위적인 작제물도 본 발명에 포함된다[참조: Jones, P.T. et al., Nature, 321, 522, 1986; Riechmann, L. et al., Nature 332, 323, 1988; Verhoeyen, M. et al., Science, 239, 1534, 1988].
바람직한 양태에서는, VH 영역과 VL 영역이 VH-L-VL 작제물 또는 VL-L-VH 작제물의 형태로 펩타이드 링커(L)를 통하여 연결된다. 이러한 경우, 상기 링커는 일반적으로 가능한 한 짧아야 하고, 바람직하게는 약 1 내지 20개 아미노산, 특히 약 1 내지 5개 아미노산 길이이다. 서열 GGGGS을 갖는 링커가 특히 바람직하다.
링커(L)와는 대조적으로, 연결성 펩타이드(P)는 적합한 어떠한 길이를 가질 수 있다. 그러나, 펩타이드(P)는 바람직하게는 약 12 내지 40개 아미노산, 특히 약 12 내지 20개 아미노산, 특히 약 14개 아미노산을 갖는다. 특히 바람직한 펩타이드(P)는 아미노산 서열 GGGGSGGRASGGGS 또는 GGGGSGGRASGGGGS을 포함하고 상기 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드(P)가 특히 바람직하다.
또 다른 바람직한 양태에 있어서, 본 발명에 따르는 분자는 추가의 성분으로서 효능기(E)를 포함한다. 이러한 효능기는 본 발명에 따르는 분자에 직접적으로 연결되거나, 또는 경우에 따라 연결기(B)를 통하여 연결될 수 있다. 연결기(B)가 프로테아제 절단 서열, 바람직하게는 PSA(전립선-특이적 항원), 카텝신, 플라스미노겐 및/또는 플라스미노겐 활성인자 절단 서열을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
이러한 프로테아제 절단 서열이 특히 바람직한데, 이는 프로테아제의 사용에 의해 효능기를 본 발명에 따르는 분자로부터 분리시킬 수 있기 때문이다. 이러한 분리는 효능기의 활성이 연결기를 통하여 본 발명에 따르는 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는 효능기로 인해 억제되는 경우에 특히 유리하다.
프로테아제는 특히 염증 발생 영역이나 종양에 존재하기 때문에, 프로테아제 절단 서열을 통하여 본 발명에 따르는 분자에 대한 결합으로 인해 바람직하게는 불활성화되는 효능기는 광범위하게 국소적으로 방출된다. 또한, 본 발명에 따르는 분자, 예를 들면, 종양 세포 상의 항원, 종양 관련 내피 세포 또는 염증성 세포, 예를 들면, 임파구 또는 매크로파지 상의 항원에 대한 특이성을 지니고 있는 분자에 적합한 표적 구조물을 선택함으로써, 효능기를 갖는 본 발명에 따르는 분자를, 예를 들면, 염증 발생 영역 또는 종양에 축적시키는 것이 가능하다.
본 발명에 따라서 수 개의 효능기를 본 발명에 따르는 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합시킬 수 있다.
프로테아제 또는 관련 절단 서열은, 예를 들면, DE 1970430.1에 상세히 기재되어 있다.
연결기를 통하여 당해 분자에 결합되는 효능기를 갖는 본 발명에 따르는 바람직한 분자의 한 예가 도 2에 도식적으로 제시되어 있다.
본 발명에 따르는 분자 중의 개개의 성분에 대한 선택은 일반적으로 적용 분야에 따라 결정된다.
본 발명에 따르는 분자를 진단 보조제로서 사용하고자 하는 경우에는, 예를 들면, 추가의 양태에서, 제1 특이성(A)은 분석하고자 하는 분자에 대해 지시되고 제2 특이성(B)는 직접 또는 간접적으로 분석물에 대해 지시된다. 이러한 분석물은, 예를 들면, 방사능 분자, 형광성 분자, 또는 효소적 활성을 통하여 분석물의 전구체를 활성 분석물로 전환시켜 주는 효소일 수 있다.
또 다른 바람직한 양태에서는, 제1 특이성(A)이 분석하고자 하는 분자에 대해 지시되고 제2 특이성(B)은 분석하고자 하는 또 다른 분자에 대해 지시되며 효능기(E)가 분석물, 예를 들면, 방사능 분자, 형광성 분자 및/또는 앞서 설명된 바와 같은 효소이다.
그러나, 본 발명에 따르는 분자는 또한, 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터의 표적 세포-특이적 결합용 리간드로서 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서는, 본 발명에 따르는 분자가 소위 다작용성 리간드로서 사용될 수 있다. 이를 위해서는, 펩타이드(P) 및/또는 효능기(E)가 퓨소제닉(fusogenic) 펩타이드를 포함하는 경우가 유리하다. 이러한 다작용성 리간드는 뉴클레오타이드 서열의 표적 세포-특이적 전이에 이용되고, 일반적으로 표적 세포-특이적 리간드, 유전자 작제물-특이적 리간드 및 퓨소제닉 펩타이드를 포함하는 단백질이다. 이러한 유형의 다작용성 리간드는 유전자 작제물, 즉 핵산 작제물을 표적 세포에 특이적으로 결합시키는데 사용될 수 있으며, 퓨소제닉 펩타이드는 이러한 핵산 작제물이 세포막을 통해 세포핵 내로 침투되어 엔도솜(endosome)으로부터 방출될 수 있게 해준다.
본 발명에 따르는 분자를 벡터용 리간드로서 사용하거나 다작용성 리간드로서 사용하는 경우에는, 제1 특이성(A)이 표적 세포에 대해 지시되고 제2 특이성(B)이 벡터에 대해 지시되는 것이 유리하다. 이러한 벡터는 일반적으로 핵산, 양이온성 펩타이드 또는 단백질, 양이온성 지질, 양이온성 펩타이드 또는 양이온성 포르피린이다. 본 발명의 특정 양태에서는, 상기 벡터가, 예를 들면, 아데노바이러스(AdV), 아데노-관련 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스, RSV, HSV, 인플루엔자 바이러스 또는 렌티바이러스로부터 유도된 바이러스성 벡터이다.
표적 세포-특이적 리간드, 표적 세포 상의 막 구조물, 면역글로불린으로부터 유도된, 즉 VH 영역과 VL 영역을 포함하는 표적 세포-특이적 리간드 및 유전자 작제물-특이적 리간드의 예 뿐만 아니라 퓨소제닉 특성을 지닌 펩타이드의 예가 DE 19649645.4에 기재되어 있다.
본 발명에 따르는 분자는 또한 예방제 및/또는 치료제로서 적합하다.
이를 위하여, 예를 들면, 제1 특이성(A)는 세포막, 예를 들면, 임파구, 매크로파지, 단구, 과립구, 조혈 세포, 내피 세포, 평활근 세포, 횡문근(striped muscle) 세포, 상피 세포, 간 세포, 신장 세포, 신경교 세포, 지지성 조직의 세포, 종양 세포 또는 백혈병 세포; 세포외 매트릭스의 단백질, 보체 시스템의 단백질, 응고 시스템의 단백질, 키닌 시스템의 단백질, 혈장의 단백질, 지지성 조직의 단백질; 사이토킨 또는 케모카인; 내인성 또는 외인성 독소; 약제, 예를 들면, 디지탈리스(digitalis) 및/또는 병원체, 예를 들면, 세균성, 바이러스성 및/또는 기생충 병원체에 대해 지시된다.
제2 특이성(B)은, 예를 들면, 임파구, 매크로파지, 단구 또는 과립구의 세포막에 대해 지시될 수 있으며, 그 결과 이러한 세포막이 표적 구조물과 가교결합되어 세포독성, 면역조절성 또는 염증성 진행 과정을 유발시킬 수 있다.
이는 또한, 사이토킨, 케모카인 또는 성장 인자에 대해 지시될 수 있으며, 그 결과 이들과 표적 구조물과의 가교결합으로 인해 면역조절성 또는 증식성 진행 과정이 유도될 수 있다. 이는 또한, 이의 활성을 개시하거나, 증진시기커나 또는 억제시키는 보체 시스템의 단백질에 대해 지시될 수 있다. 이러한 유형의 단백질과 표적 구조물과의 가교 결합으로 인해, 단백질의 선택에 따라서, 염증성 및 세포 용해성 또는 소염성 및 세포 보호성 반응이 유발될 수 있다. 이는 또한, 이의 활성을 개시하거나, 증진시기커나 또는 억제시키는 응고 시스템의 단백질에 대해 지시될 수 있다. 이러한 유형의 단백질과 표적 구조물과의 가교 결합으로 인해, 단백질의 선택에 따라서, 혈전증이 유발되거나 억제될 수 있다. 이는 추가로, 표적 구조물 상의 피브린 혈병의 용해를 촉발시키는 섬유소 용해성 단백질; 표적 구조물 상의 약물의 불활성 전구체를 활성, 예를 들면, 세포독성 약물로 전환시킬 수 있는 효소; 펩타이드 호르몬 또는 스테로이드 호르몬; 면역글로불린의 불변 영역; 매개인자, 예를 들면, 히스타민, 세로토닌, 류코트리엔, 프로스타사이클린 또는 키닌; 병원체, 예를 들면, 세균성, 바이러스성 및/또는 기생충성 병원체; 또는 종양 세포에 대해 지시될 수 있다.
표적 구조물로서의 사이토킨, 또는 표적 구조물로서의 단구, 매크로파지 및/또는 임파구는 종양 항원으로 감염시킨 본 발명에 따르는 분자에 의해 가교결합시킴으로써, 생체내에서 이러한 항원에 대한 증진된 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 이와 관련하여 병원체 또는 종양의 특정한 항원, 및 경우에 따라, 사이토킨을 본 발명에 따르는 분자에 가하고, 상기와 같이 가교결합된 복합체를 국소적으로 투여 또는 주입하는 것이 유리하다.
제2 특이성(B)은 또한, 내인성 또는 외인성 독소에 대해 지시될 수 있기 때문에, 이러한 독소의 중화 및 식작용이나 표적 구조물 상의 그 밖의 다른 독성 반응이 일어날 수 있다. 이는 또한, 약제, 예를 들면, 디지탈리스에 대해 지시될 수 있기 때문에, 이러한 약제의 복합체 형성 및 제거가 일어날 수 있다.
또 다른 바람직한 양태에서는, 효능기를 갖는 본 발명에 따르는 분자가 하나 이상의 효능기(들)를 갖는 2개의 동일하거나 상이한 표적 구조물의 가교결합을 허용해준다.
적합한 효능기의 예는 막관통(transmembrane) 영역, 글리코포스포리피드 앵커, 수용체의 리간드-결합 부분; 수용체에 대한 리간드 또는 리간드의 수용체 결합 부분-서열; 펩타이드 호르몬; 사이토킨; 성장 인자, 성장 인자 억제제; 케모카인; 인터페론; 매개인자; 순환시 작용하는 펩타이드; 약물의 불활성 전구체를 활성 약물로 전환시키는 효소; 응고를 활성화시키거나 억제시키는 단백질; 섬유소 용해를 활성화시키거나 억제시키는 단백질; 보체 시스템을 활성화시키거나 억제시키는 단백질; 면역글로불린의 하나 이상의 불변 영역; 세포독성 펩타이드, 또 다른 단쇄의 단일 또는 다중, 특히 이중 항원-결합성 분자; 종양 항원 또는 병원체의 항원, 예를 들면, 세균성 항원 또는 바이러스성 항원; 본 발명에 따르는 분자의 이량체를 생성시키기 위한 시스테인을 포함하는 펩타이드; 및/또는 이량체화 또는 다량체화 펩타이드이다[참조: Pluckthun and Pack, Immunotechnol. 3, 83-105(1997)].
본 발명의 또 다른 국면은 본 발명에 따르는 분자를 암호화하는 핵산이다. 이러한 핵산은 일반적으로 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 이본쇄 DNA이다.
경우에 따라 요구되는, 본 발명에 따르는 발현 생성물의 분비를 위해, 본 발명에 따르는 핵산은 5' 말단에 시그날 또는 막관통 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 있다[참조: 예를 들면, DE 19639103.2 또는 DE 19651443.6]. 적합한 시그날 또는 막관통 서열의 한 예는 면역글로불린에 대한 시그날 서열(DNA 위치 ≤63 내지 ≥107), CEA에 대한 시그날 서열(DNA 위치 ≤33 내지 ≥134) 또는 사람 호흡 합포체성 바이러스 당단백질의 시그날 서열(아미노산 서열 ≤38 내지 ≥50 또는 48 내지 65의 cDNA)이다.
또 다른 양태에서는, 본 발명에 따르는 핵산이 5' 말단에 프로모터 및/또는 활성인자를 포함한다. 이러한 활성인자는 바람직하게는 세포 특이적으로, 세포 주기 특이적으로, 대사 특이적으로 및/또는 특정 약물에 의해 활성화되거나 억제될 수 있다. 이러한 유형의 활성인자(이의 조합물 포함) 서열이 EP 97101507.8, DE 19617851.7, DE 19639103.2, DE 19651443.6, DE 19704301.1, EP 97102547.3 및 DE 19710643.9에 기재되어 있다. 특히 바람직한 본 발명에 따르는 핵산 작제물이 도 3 및 4에 도식적으로 제시되어 있다.
바람직한 양태에서는, 본 발명에 따르는 핵산이 출발 코돈의 5' 말단에 해독을 증진시킬 수 있는 서열 GCCACC 또는 GCCGCC를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따르는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 경우, 상기 벡터는 특히 양이온성 지질, 양이온성 중합체, 양이온성 펩타이드 또는 양이온성 포르피린 중에서 선택되는, 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터, 바람직하게는 비-바이러스성 벡터일 수 있다.
본 발명에 따르는 분자를 제조하기 위하여, 상기 언급된 핵산을 발현 벡터, 예를 들면, 적합한 플라스미드 내로 클로닝시키고 이를 적합한 세포, 예를 들면, 세균, 효모, 곤충 또는 포유류 세포에 도입하며, 이러한 방식으로 형질전환되거나 형질감염된 세포를 배양한 다음, 경우에 따라 발현 생성물을 분리시킨다. 이러한 방법은 일반적으로 당해 분야의 숙련인에게 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook J. et al. Molecular Cloning, A Laboratory Handbook 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 특정한 양태에서는, 이들 세포가 특정 효능기를 갖는 본 발명에 따르는 분자를 발현시키며, 여기서 이러한 효능기는 바람직하게는 막관통 영역이다.
따라서, 예를 들면, 사람 매크로파지 콜로니 자극 인자의 막관통 서열을 암호화하는 DNA 서열(DNA 위치 ≤1485 내지 ≥1554), 사람 호흡 합포체성 바이러스(RSV) 당단백질 G의 시그날 및 막관통 영역을 암호화하는 DNA 서열(아미노산 1 내지 63 또는 이의 부분 서열인 아미노산 38 내지 63) 또는 인플루엔자바이러스 뉴라미니다제의 시그날 및 막관통 영역을 암호화하는 DNA 서열(아미노산 7 내지 35 또는 이의 부분 서열인 아미노산 7 내지 27)을 프로모터 서열과 본 발명에 따르는 분자의 DNA 서열 사이에 삽입시키거나 상기 유전자의 3' 말단에 삽입할 수 있다.
그러나, 약물을 본 발명에 따르는 분자를 발현하는 세포의 세포막에 정착시키기 위해서, 글리코포스포리피드 앵커를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 핵산 작제물에 삽입시킬 수도 있다.
글리코포스포리피드 앵커의 삽입은 일반적으로 본 발명에 따르는 분자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 3' 말단에서 일어나며, 시그날 서열의 삽입에 덧붙여 일어난다.
예를 들면, CEA, N-CAM 및 기타 막 단백질, 예를 들면, Thy-1에 대한 글리코포스포리피드 앵커가 기재되어 있다.
이러한 막관통 영역으로 인해, 특정한 세포가 세포막 상에 본 발명에 따르는 분자를 발현시키므로, 본 발명에 따르는 분자의 항원-결합 부분의 의해 인식되는 표적 또는 효능기 구조물에 대해 특이적인 "수용체"가 획득된다.
또 다른 바람직한 수용체는 수용체, 예를 들면, T-세포 수용체 또는 M-CSF 수용체의 막관통- 또는 시그날-형질도입성 영역이다. 이는 표적 구조물을 특이적 작용기에 결합시킴으로써 활성화되는 세포막 상에 본 발명에 따르는 분자를 세포가 발현시킬 수 있게 해준다. 이러한 유형의 특이적 작용기는, 예를 들면, T 임파구의 세포독성 반응물, 매크로파지 및 과립구의 식작용 반응물, 또는 과립구, 단구 및 매크로파지의 세포외 배출(exocytosis) 반응물일 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 국면은 본 발명에 따르는 핵산 또는 본 발명에 따르는 벡터를 포함하는 세포, 특히 세균, 곤충, 효모 또는 포유류 세포이다. 적합한 포유류 세포는 CHO 또는 BHK 세포와 같이 핵산을 발현시키는 것으로 일반적으로 공지된 세포 이외에도, 또한 임파구, 매크로파지, 신경교 세포, 상피 세포, 간 세포, 신장 세포, 골수 세포, 내피 세포, 평활근 또는 횡문근 세포 또는 섬유아세포이다.
바로 앞서 언급된 세포는 특히 유전자 치료법 응용에 적합한데, 이는 본 발명에 따르는 핵산 작제물을 포함하는 이들 세포를 특정 질환의 예방 또는 치료를 위해, 환자에게 국부적 또는 비경구적, 예를 들면, 정맥내, 동맥내로 주입하거나, 체강 내로 주입하거나, 특정 기관 내로 주입하거나 또는 피하 주사할 수 있기 때문이다.
그러나, 유전자 치료법에 의한 질환 치료의 경우, 본 발명에 따르는 핵산 작제물을 환자에게 직접적으로 국부 투여하거나, 체강, 기관, 순환계, 피하 또는 근육내 주사할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 국면은 또한, 본 발명에 따르는 분자, 본 발명에 따르는 핵산, 본 발명에 따르는 벡터 또는 본 발명에 따르는 세포를 포함하는 약제, 및 앞서 상세히 기재된 바와 같이, 분석물에 대해 지시된 본 발명에 따르는 분자를 포함하는 진단 보조제이다.
따라서, 본 발명에 따르는 분자, 본 발명에 따르는 핵산, 본 발명에 따르는 벡터 또는 본 발명에 따르는 세포는, 예를 들면, 종양, 자가면역 질환, 염증성 질환, 혈액 장애, 특히 혈액 응고 및/또는 순환계의 장애, 신경계 장애 및/또는 감염성 질환을 치료, 예방 또는 진단하는데 적합하다.
이와 관련하여 개개의 성분에 관한 선택은 일반적으로 본 발명에 따르는 항목의 용도에 좌우된다. 이러한 개개의 성분 및 이의 용도는 다음의 예를 통하여 보다 상세히 기재되어 있다:
본 발명에 따르는 항목을 제조하기 위해서, 도 3 및 4에 예로써 이미 도시된 바와 같이, 본 발명에 따르는 핵산 작제물의 5' 말단을 시그날 서열을 암호화하는 핵산의 3' 말단에 연결시키고, 이러한 핵산의 5' 말단을 프로모터 서열의 3' 말단에 차례로 연결시킬 수 있다.
선별될 프로모터 서열로는, 예를 들면, 자유롭게 활성화시킬 수 있는 프로모터 및 활성인자 서열, 예를 들면, RNA 폴리머라제 Ⅲ의 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅱ의 프로모터, CMV 프로모터 및/또는 인핸서(enhancer), SV40 프로모터, 또는 바이러스성 프로모터 및 활성인자 서열, 예를 들면, HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, HIV가 있다.
HIV 프로모터의 사용시, 바람직하게는 TAR 서열을 포함하는 완전한 LTR 서열(위치 ≤-453 내지 ≥-80, Rosen et al., Cell 41, 813(1985))이 바이러스-특이적 프로모터로서 이용된다.
선별될 기타 프로모터 서열은, 예를 들면, 대사적으로 활성화될 수 있는 프로모터 및 인핸서 서열, 예를 들면, 저산소증에 의해 유도될 수 있는 인핸서, 세포 주기 특이적으로 활성화될 수 있는 프로모터, 예를 들면, cdc25C 유전자, cdc25B 유전자, 사이클린 A 유전자, cdc2 유전자, B-myb 유전자, DHFR 유전자 또는 E2F-1 유전자의 프로모터, 또는 그 밖에 세포 주기 특이적으로 발생되거나 활성화되는 전사 인자에 대한 결합 서열이다. 이들 결합 서열에는, 예를 들면, c-myc 단백질에 대한 결합 서열이 포함된다. Myc E-Box[5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3']로서 지칭된 뉴클레오타이드 서열의 단량체 또는 다량체가 이들 결합 서열에 포함된다.
선별될 추가의 프로모터는, 예를 들면, 상응하는 억제인자와 결합된 테트라사이클린 작동인자와 같은 테트라사이클린에 의해 활성화될 수 있는 프로모터, 또는 키메릭 프로모터이다. 키메릭 프로모터는 세포 특이적으로, 대사적으로 또는 바이러스 특이적으로 활성화될 수 있고 상부에 위치한 활성인자 서열과, 하부에 위치하고 억제인자 단백질이 결합됨으로써 세포 주기의 G0및 G1상에서 상부에 위치된 활성인자 서열의 활성을 억제시킬 수 있는 CDE-CHR 또는 E2FBS-CHR 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터 모듈과의 결합물이다[참조: WO 96/06943; Lucibello et al., EMBO J. 14, 132(1995)].
선별될 기타 프로모터 서열은, 예를 들면, 세포 특이적으로 활성화될 수 있는 프로모터이고, 바람직하게는 선별된 세포에서 생성되는 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터 또는 인핸서로부터의 프로모터 또는 활성인자 서열이다.
예를 들면, 다음 단백질에 대한 프로모터가 다음 세포에서 본 발명의 목적상 바람직하게 사용된다:
내피 세포에서 활성화되는 프로모터 및 활성인자 서열은, 예를 들면, 다음 단백질을 암호화하는 유전자로부터의 유전자-조절 서열이다: 뇌-특이적 내피 글루코즈 1 트랜스포터(transporter), 엔도글린, VEFG 수용체 1(flt-1), VEGF 수용체 2(flk-1, KDR), til-1 또는 til-2, B61 수용체(Eck 수용체), B61, 엔도텔린, 구체적으로 엔도텔린 B 또는 엔도텔린 1, 엔도텔린 수용체, 특히 엔도텔린 B 수용체, 만노즈 6-포스페이트 수용체, 폰 빌레브란트 인자, IL-1α, IL-1β, IL-1 수용체, 맥관성 세포 유착 분자(VCAM-1), 또는 내피 세포에서 우선적으로 또는 선택적으로 활성인 전사 인자에 대한 올리고머화 결합 부위로 이루어진 합성 활성인자 서열. 이의 한 예는 엔도텔린 1 유전자에서의 결합 부위가 5'-TTATCT-3'인 전사 인자 GATA-2이다.
활성화된 내피 세포 근처에 있는 세포에서 활성화된 프로모터 또는 활성인자 서열은, 예를 들면, 다음 단백질을 암호화하는 유전자로부터의 유전자-조절 서열이다: VEGF(이러한 경우 VEGF 유전자에 대한 유전자-조절 서열은 5'-플랭킹 영역, 3'-플랭킹 영역, c-Src 유전자 또는 v-Src 유전자이다), 또는 스테로이드 호르몬 수용체 및 이들의 프로모터 요소, 특히 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터.
근육 세포, 특히 평활근 세포에서 활성화되는 프로모터 또는 활성인자 서열은, 예를 들면, 다음 단백질을 암호화하는 유전자로부터의 유전자-조절 서열이다: 트로포미오신, α-액틴, α-미오신, PDGF에 대한 수용체, FGF에 대한 수용체, MRF-4, 포스포프럭토키나제 A, 포스포글리세레이트 뮤타제, 트로포닌 C, 미오겐, 엔도텔린 A에 대한 수용체, 데스민, VEGF(상기 참조), "인위적인" 프로모터, 또는 헬릭스-루프-헬릭스(HLH) 계열 인자(MyoD, Myf-5, 미오겐, MRF-4) 또는 징크 핑거(finger) 단백질 GATA-4 등과 같은 근육-특이적 전사 인자의 프로모터.
HLH 단백질 및 GATA-4는 근육-특이적 유전자의 프로모터의 경우 뿐만 아니라 이종 구조 상황에서 근육-특이적 전사를 나타내므로 또한 인위적인 프로모터의 경우에도 근육 특이적 전사를 나타낸다. 이러한 유형의 인위적인 프로모터의 예는 E box 등의 근육 특이적 HLH 단백질(Myo D)에 대한 (DNA) 결합 부위의 다중 복사물(예를 들면, 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC) 또는 α-미오신 중쇄 유전자의 GATA-4에 대한 DNA 결합 부위의 다중 복사물(예를 들면, 5'-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG3')이다.
신경교 세포에서 활성화되는 프로모터 및 활성인자 서열은, 예를 들면, 다음 단백질을 암호화하는 유전자로부터의 유전자-조절 서열이다: 슈반(Schwann) 세포-특이적 단백질 페리악신, 글루타민 신세타제, 신경교 세포-특이적 단백질(신경교 섬유성 산 단백질 = GFAP), 신경교 세포 단백질 S100b, IL-6, CNTF, 5-HT 수용체, TNFα, IL-10, 인슐린 유사 성장 인자 수용체 Ⅰ 및 Ⅱ 또는 VEGF(상기 참조).
혈액 형성 세포에서 활성화되는 프로모터 및 활성인자 서열은, 예를 들면, 혈액 형성 세포 또는 인접한 세포, 예를 들면, 간질(stroma)에서 발현되는 사이토킨 또는 이의 수용체의 유전자에 대한 프로모터 서열이다.
이들로는, 예를 들면, 다음 사이토킨 및 이의 수용체를 암호화하는 유전자로부터의 프로모터 서열이 있다: 간 세포(stem cell) 인자 수용체, 간 세포 인자, IL-1α, IL-1 수용체, IL-3, IL-3 수용체(α 아단위), IL-3 수용체(β 아단위), IL-6, IL-6 수용체, GM-CSF, GM-CSF 수용체(α 쇄), 인터페론 조절 인자 1(IRF-1). IRF-1의 프로모터는 IFNγ 또는 IFNβ, 에리트로포이에틴 또는 에리트로포이에틴 수용체에 의한 것과 동일한 정도로 IL-6에 의해 활성화된다.
임파구 및/또는 매크로파지에서 활성화되는 프로모터 및 활성인자 서열은, 예를 들면, 사이토킨, 사이토킨 수용체 및 유착 분자, 및 항체의 Fc 단편에 대한 수용체, 예를 들면, IL-1 수용체, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-2 수용체, IL-3, IL-3 수용체(α 아단위), IL-3 수용체(β 아단위), IL-4, IL-4 수용체, IL-5, IL-6, IL-6 수용체, 인터페론 조절 인자 1(IRF-1)을 암호화하는 유전자의 프로모터 및 활성인자 서열이고, 여기서 IRF-1의 프로모터는 IFNγ 또는 IFNβ, IFNγ 반응성 프로모터, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IFNγ, GM-CSF, GM-CSF 수용체(α쇄), IL-13, LIF, 매크로파지 콜로니 자극 인자(M-CSF) 수용체, 유형 Ⅰ 및 Ⅱ 매크로파지 스캐빈저 수용체, MAC-1(백혈구 작용성 관련 항원), LFA-1α(백혈구 작용성 관련 항원) 또는 p150.95(백혈구 작용성 관련 항원)에 의한 것과 동일한 정도로 IL-6에 의해 활성화된다.
활액성 세포에서 활성화되는 프로모터 및 활성인자 서열은, 예를 들면, 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 예를 들면, MMP-1(간질성 콜라게나제), MMP-3(스트로멜리신/트랜신) 또는 메탈로프로테이나제의 조직 억제인자(TIMP)(예: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3)를 암호화하는 유전자의 프로모터 서열이다.
백혈병 세포에서 활성화되는 프로모터 및 활성인자 서열은, 예를 들면, 다음 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터이다: HSP-70, bcl-1/사이클린 D-1, bcl-2, IL-6, IL-10, TNFα, TNFβ, HOX-11, BCR-Abl, E2A-PBX-1, PML-RAR(전골수구성 백혈병 레티노산 수용체) 또는 c-myc(여기서, c-myc 단백질은 Myc E box(5'-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3')로서 칭해지는 뉴클레오타이드 서열의 다량체에 결합되어 이를 활성화시킨다).
종양 세포에서 활성화되는 프로모터 또는 활성인자 서열은, 예를 들면, 전사 인자를 형성시키거나 이와 상호작용하는 종양 세포에서 활성인 유전자-조절 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명의 목적상 바람직한 프로모터 또는 활성인자 서열에는 특히 암세포 또는 육종 세포에서 생성되는 단백질을 암호화하는 유전자의 유전자-조절 서열 또는 요소가 포함된다. 따라서, 작은 세포 기관지 암종에 바람직하게 사용되는 것은 N-CAM 단백질의 프로모터이고, 난소 암종에 바람직하게 사용되는 것은 간염 성장 인자 수용체 또는 L-플라스틴의 프로모터이며, 췌장 암종에 바람직하게 사용되는 것은 L-플라스틴 또는 다형성 상피 점소(PEM)의 프로모터이다.
본 발명의 상당한 이점은 개개의 성분의 연결이 이종이량체성 결합에 유리하기 때문에 단쇄의 다중 항원-결합성 분자가 우점적으로 형성된다는 것이다. 또한, scFv 단편에 대해 제시된 바와 같이, 이량체의 분해가 감소된다[참조: Glockshuber et al., Biochem. 29, 1362-1367, 1990]. 따라서, 소위 "디아보디"가 디설파이드-안정화되거나 "크놉 인투 홀 디아보디"의 형태인 경우일지라도, 이러한 디아보디보다 덜 복잡하고 더 균일한 형태로 본 발명에 따르는 분자를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르는 분자를 제조하는데에는 단지 하나의 시그날 서열과 하나의 리보좀 결합 부위(RBS)가 필요하다. 이와는 달리, 본 발명에 따르는 "디아보디"에서는 각 쇄에 대해 시그날 서열과 RBS가 요구된다. 본 발명의 또 다른 이점은 본 발명에 따르는 분자를 사용하는 경우에는 등몰량의 가변 영역이 발현되는 반면, 2개 쇄의 "디아보디"의 발현시에는 등몰량이 아닌 양이 생성될 수 있으므로 비-작용성 동종이량체의 비율이 증가하게 된다는 것이다.
본 발명에 따르는 분자의 또 다른 이점은 이를 세균성 및 효모, 바쿨로바이러스 및 진핵성 세포 모두에서 작용성 형태로 간단하게 발현시킬 수 있다는 것이다. 더우기, 본 발명에 따르는 분자의 분비 외에도, 이들은 세포 내부에서 또는 막과 결합하여 발현될 수 있다[참조: Blocca & Cattaneo, Trends Cell Biol. 5, 248-252(1995)].
본 발명에 따르는 분자의 또 다른 이점은 이들이 이중 특이적 항체와 같이, 특정 질환의 예방 및/또는 치료용 약물로서 및 진단 보조제로서 모두 광범위하게 이용될 수 있다는 것이다.
효능기의 유전자 및 프로모터 서열은 목적하는 용도에 따라 형질도입시킬 표적 세포를 고려하여 선별해야 한다. 예를 들면, 다음 질환에 대해 선택될 프로모터 서열과 효능기에 대한 유전자의 조합물은 다음과 같다.
종양 치료법
종양 치료법에 대한 표적 세포는, 예를 들면, 증식성 내피 세포, 또는 이러한 내피 세포에 인접한 간질 세포 및 근육 세포, 또는 종양 세포 또는 백혈병 세포이고, 사용된 프로모터는, 예를 들면, 내피 세포 특이적 및 세포 주기 특이적이거나, 세포-비특이적 또는 근육 세포 특이적 및 세포 주기 특이적이거나, 또는 종양 세포 특이적(고형 종양, 백혈병) 및 세포 주기 특이적인 프로모터이며, 사용된 효능기는, 예를 들면, 다음 유전자이다:
세포성 증식 억제인자의 유전자는, 예를 들면, 망막아종 단백질(pRb=p110) 또는 관련 p107 및 p130 단백질의 유전자이다. 망막아종 단백질(pRb/p110) 및 관련 p107 및 p130 단백질은 포스포릴화에 의해 불활성화된다. 사용되는 것이 바람직한 세포 주기 억제인자의 유전자는 발현된 단백질의 기능을 손상시키지 않으면서 이러한 단백질의 불활성화 부위에 대해 돌연변이를 지닌 유전자이다. 이들 돌연변이의 예는 p110에 대해 기재되어 있다. p107 단백질 또는 p130 단백질에 대한 DNA 서열은 유사한 방식으로 돌연변이된다. p53 단백질의 유전자가 또한 적합하다. 이러한 p53 단백질은 특이적 단백질, 예를 들면, MDM2에 대한 결합에 의해 또는 탈포스포릴화 C-말단 세린을 통한 p53의 올리고머화에 의해 세포에서 불활성화된다. 따라서, C 말단에서 세린 392에 의해 절단되는 p53 단백질에 대한 DNA 서열을 사용하는 것이 바람직하다. 추가의 적합한 유전자는 p21의 유전자(WAF-1), p16 단백질의 유전자, 기타 cdk 억제인자의 유전자, GADD45 단백질의 유전자 또는 bak 단백질의 유전자이다.
응고-유도성 인자 및 혈관형성 억제인자의 유전자는, 예를 들면, 플라스미노겐 활성인자 억제제 1(PAI-1), PAI-2, PAI-3, 안지오스태틴, 인터페론(IFNα, IFNβ 또는 IFNγ), 혈소판 인자 4, IL-12, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, 백혈병 억제 인자(LIF) 또는 조직 인자(TF) 및 이들의 응고-촉진 단편의 유전자이다.
사이토스태틱(cytostatic) 및 세포독성 단백질의 유전자는, 예를 들면, 퍼포린, 그랜자임, IL-2, IL-4, IL-12, 인터페론(예: IFNα, IFNβ 또는 IFNγ), TNF(예: TNFα 또는 TNFβ), 온코스태틴 M, 스핑고미엘리나제 또는 마가이닌 및 마가이닌 유도체의 유전자이다.
염증 유도인자의 유전자는, 예를 들면, IL-1, IL-2, RANTES(MCP-2) 단구 화학주성 및 활성화 인자(MCAF), IL-8, 매크로파지 염증성 단백질 1(MIP-1α, -β), 호중구 활성화 단백질-2(NAP-2), IL-3, IL-5, 사람 백혈병 억제인자(LIF), IL-7, IL-11, IL-13, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 코브라 사독 인자(CVF), 또는 사람 보체 인자 C3b에 작용적으로 상응하는, 즉 보체 인자 B에 결합할 수 있고 인자 D에 의해 절단된 후, C3 컨버타제, 사람 보체 인자 C3 또는 이의 부분 서열 C3b를 나타내는 CVF의 부분 서열, CVF와 작용적 및 구조적으로 유사한 사람 보체 인자 C3의 절단 생성물 또는 보체를 활성화시키거나 염증을 유발시키는 세균성 단백질, 예를 들면, 살모넬라 티피뮤륨(Salmonella typhimurium)의 포린, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 클럼핑 인자, 특히 그램 음성 세균의 모둘린, 레지오넬래(legionellae), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) 유형 B 또는 클렙시엘래(klebsiellae)의 주요 외막 단백질 또는 그룹 G 스트렙토코씨의 M 분자의 유전자이다.
사이토스태틱의 전구체를 활성화시키기 위한 효소의 유전자는, 예를 들면, 불활성 전구체(프로드럭)을 활성 사이토스태틱(약물)로 절단시키는 효소의 유전자이다. 이러한 유형의 물질 및 이들 각각과 관련된 프로드럭과 약물이 이미 문헌[참조: Deonarain et al., Br. J. Cancer 70, 786(1994), Mullen(Pharmac. Ther. 63, 199(1994) and Harris et al., Gene Ther. 1, 170(1994)]에서 검토되었다. 예를 들면, 다음 효소들 중의 하나의 DNA 서열이 사용될 수 있다: 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제, 바리셀라 조스터 바이러스 티미딘 키나제, 세균성 니트로리덕타제, 세균성 β-글루쿠로니다제, 세칼레 세레알레(Secale cereale)로부터의 식물 β-글루쿠로니다제, 사람 β-글루쿠로니다제, 사람 카복시펩티다제(CB), 예를 들면, 비만 세포 CB-A, 췌장 CB-B 또는 세균성 카복시펩티다제, 세균성 β-락타마제, 세균성 시토신 데아미나제, 사람 카탈라제 또는 퍼옥시다제, 포스파타제, 특히 사람 알칼린 포스파타제, 사람 전립선 산 포스파타제 또는 유형 5 산 포스파타제, 옥시다제, 특히 사람 리실 옥시다제 또는 사람 D-아미노산 옥시다제, 특히 사람 글루타티온 퍼옥시다제, 사람 호산구성 퍼옥시다제 또는 사람 갑상선 퍼옥시다제, β-갈락토시다제 또는 α-갈락토시다제. 프로드럭 다우노마이신 β-D-갈락토피라노시드를 사이토스태틱 다우노마이신으로 전환시키기 위한 β-갈락토시다제가 특히 바람직하다.
자가 면역 질환 및 염증 치료법
자가 면역 질환 및 염증 치료법에 대한 표적 세포는, 예를 들면, 증식성 내피 세포 또는 매크로파지 및/또는 임파구 또는 활액성 세포이고, 사용된 프로모터는, 예를 들면, 내피 세포 특이적 및 세포 주기 특이적이거나, 매크로파지- 및/또는 임파구-특이적 및/또는 세포 주기 특이적이거나, 또는 활액 세포 특이적 및/또는 세포 주기 특이적인 프로모터이고, 사용된 효능기는, 예를 들면, 다음 유전자이다:
알레르기 치료법에 대한 유전자는, 예를 들면, IFNβ, IFNγ, IL-10, IL-4에 대한 항체 또는 항체 단편, 가용성 IL-4 수용체, IL-12 또는 TGFβ의 유전자이다.
이식된 기관의 거부 반응을 방지하기 위한 유전자는, 예를 들면, IL-10, TGFβ, 가용성 IL-1 수용체, 가용성 IL-2 수용체, IL-1 수용체 길항제 또는 가용성 IL-6 수용체의 유전자이다.
항체 매개된 자가 면역 질환 치료법에 대한 유전자는 예를 들면, TGFβ, IFNα, IFNβ, IFNγ, IL-12, 가용성 IL-4 수용체, 가용성 IL-6 수용체, 면역억제제 항체 또는 이의 VH및 VL함유 단편의 유전자이다.
세포 매개된 자가면역 질환 치료법에 대한 유전자는, 예를 들면, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, TNFα 또는 TNFβ, IL-13, 면역억제제 항체 또는 이의 VH및 VL함유 단편의 유전자이다.
세포 증식 억제인자, 사이토스태틱 또는 세포독성 단백질 및 사이토스태틱의 전구체를 활성화시키기 위한 효소의 유전자는 상기에서 상세히 언급된 바와 같다.
관절염 치료법에 대한 유전자는, 예를 들면, 이의 발현 단백질이, 예를 들면, 관절에서의 염증을 직접적 또는 간접적으로 억제시키고/시키거나 관절에서의 세포외 매트릭스(연골, 연결 조직)의 재구성을 촉진시켜 주는 구조 유전자이다.
이들로는, 예를 들면, IL-1α,β의 형성을 억제시켜 주는 IL-1 수용체 길항제(IL-1-RA); IL-1과 결합되어 이를 불활성화시키는 가용성 IL-1 수용체; TIMP 및 슈퍼옥시다제의 분비를 증가시키고 활액 세포와 연골 세포에 의한 IL-1과 TNFα의 분비를 감소시키는 IL-6; TNF와 결합되어 이를 불활성화시키는 가용성 TNF 수용체; IL-1, TNFα 및 MMP의 형성과 분비를 억제시키는 IL-4; IL-1, TNFα 및 MMP의 형성과 분비를 억제시키고 TIMP의 분비를 증가시키는 IL-10; 세포외 매트릭스의 합성을 자극시키는 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1); 세포외 매트릭스의 합성을 자극시키는 TGFβ, 특히 TGFβ1 및 TGFβ2; 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 또는 TIMP, 특히 TIMP-1, TIMP-2 또는 TIMP-3이 있다.
혈액 형성 시스템의 치료법
혈구 형성의 결핍 치료법에 대한 표적 세포는, 예를 들면, 혈액 형성 시스템의 증식성 미성숙 세포 또는 이러한 혈액 형성 세포에 인접한 간질 세포이고; 사용된 프로모터는, 예를 들면, 혈액 형성 세포에 특이적이고/이거나 세포 주기 특이적, 또는 세포 비특이적 및 세포 주기 특이적인 프로모터이며; 사용된 효능기는, 예를 들면, 다음 유전자, 즉 빈혈 치료법에 대한 유전자, 예를 들면, 에리트로포이에틴의 유전자이다.
백혈병 치료법에 대한 유전자는 예를 들면, G-CSF, GM-CSF 또는 M-CSF의 유전자이다.
혈소판감소증 치료법에 대한 유전자는, 예를 들면, IL-3, 백혈병 억제인자(LIF), IL-11 또는 트롬보포이에틴의 유전자이다.
신경계의 치료법
신경계 손상의 치료법에 대한 표적 세포는, 예를 들면, 신경교 세포 또는 증식성 내피 세포이고; 사용된 프로모터는, 예를 들면, 신경교 세포 특이적 및 세포 주기 특이적이거나, 내피 세포 특이적 및 세포 주기 특이적이거나, 또는 세포 비특이적 및 세포 주기 특이적인 프로모터이며; 사용된 효능기는, 예를 들면, 다음 유전자이다:
신경단위 성장 인자에 대한 유전자는, 예를 들면, FGF, 신경 성장 인자(NGF), 뇌-유도된 향신경성 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3(NT-3), 뉴로트로핀-4(NT-4) 또는 모양체 향신경성 인자(CNTF)의 유전자이다.
효소에 대한 유전자는, 예를 들면, 티로신 하이드록실라제 또는 도파 데카복실라제의 유전자이다.
사이토킨, 및 TNFα의 신경독성 효과를 억제 또는 중화시키는 이들의 억제인자에 대한 유전자는, 예를 들면, TGFβ; TNFα를 중화시키는 가용성 TNF 수용체; IFNγ, TNFα, IL-2 및 IL-4의 형성을 억제시키는 IL-10; IL-1의 활성을 중화시키는 가용성 IL-1 수용체, 예를 들면, IL-1 수용체 Ⅰ 또는 IL-1 수용체 Ⅱ; IL-1 수용체 길항제; 또는 가용성 IL-6 수용체의 유전자이다.
혈액 응고 및 순환계의 치료법
혈액 응고 및 순환계 장애의 치료법에 대한 표적 세포는, 예를 들면, 내피 세포, 증식성 내피 세포, 내피 세포 및 평활근 세포에 인접하는 체세포 또는 매크로파지이고; 사용된 프로모터는, 예를 들면, 세포 비특이적 및 세포 주기 특이적 프로모터, 또는 내피 세포, 평활근 세포 또는 매크로파지에 특이적이고 세포 주기 특이적인 프로모터이며; 사용된 효능기는 예를 들면, 다음 유전자이다:
응고를 억제시키거나 섬유소 용해를 촉진시키기 위한 유전자는, 예를 들면, 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA), 유로키나제-유형 플라스미노겐 활성인자(uPA), tPA와 uPA의 하이브리드, 단백질 C, 히루딘, 세린 프로테이나제 억제인자(세르핀), 예를 들면, C-1S 억제인자, α1-항트립신 또는 항트롬빈 Ⅲ, 또는 조직 인자 경로 억제인자(TFPI)의 유전자이다.
응고 촉진을 위한 유전자는, 예를 들면, F Ⅷ, F Ⅸ, 폰 빌레브란트 인자, F ⅩⅢ, PAI-1, PAI-2 또는 조직 인자 및 이의 단편의 유전자이다.
혈관형성 인자에 대한 유전자는, 예를 들면, VEGF 또는 FGF의 유전자이다.
혈압 강하를 위한 유전자는, 예를 들면, 칼리크레인 또는 내피 세포 "산화질소 신타제"의 유전자이다.
내피 층에 대한 손상 후에 평활근 세포의 증식을 억제시키기 위한 유전자는, 예를 들면, 항증식성, 사이토스태틱 또는 세포독성 단백질, 사이토스태틱의 전구체를 상기 언급된 바와 같이 사이토스태틱으로 분할시키기 위한 효소, 또는 이들 약물 중의 하나와 리간드, 예를 들면, 근육 세포에 특이적인 항체 또는 항체 단편과의 융합 단백질의 유전자이다.
기타 혈장 단백질에 대한 유전자는, 예를 들면, 알부민, C1 불활성인자, 혈청 콜린스테라제, 트랜스페린 또는 1-안티트립신의 유전자이다.
감염성 질환의 예방 및/또는 치료법
접종시키기 위한 표적 세포는, 예를 들면, 근육 세포 또는 매크로파지 및/또는 임파구이고; 사용된 프로모터는, 예를 들면, 비특이적 및 세포 주기 특이적이거나, 또는 표적 세포 특이적 및 세포 주기 특이적인 프로모터이며; 사용된 효능기는, 예를 들면, 감염성 질환의 예방을 위한 유전자이다.
선택된 활성 물질은 일반적으로, 병원체에 의해 생성되고 면역 반응물 주입에 의해, 즉 항체 결합 및/또는 세포독성 T-임파구를 통하여 병원체의 중화 및/또는 사멸을 유도하는 단백질의 DNA이다. 이러한 유형의 소위 중화 항원은 이미 백신 항원으로서 사용되고 있다[참조: Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263(1992)].
본 발명의 목적상 바람직한 것은 다음 병원체의 중화 항원을 암호화하는 핵산이다: 인플루엔자 A 바이러스, HIV, 광견병 바이러스, HSV(단순 포진 바이러스), RSV(호흡 합포체성 바이러스), 파라인플루엔자 바이러스, 로타바이러스, VZV(바리셀라 조스터 바이러스), CMV(사이토메갈로바이러스), 마진 바이러스, HPV(사람 파필로마 바이러스), HBV(B형 간염 바이러스), HCV(C형 간염 바이러스), HDV(D형 간염 바이러스), HEV(E형 간염 바이러스), HAV(A형 간염 바이러스), 비브리오 콜레라 항원, 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 헬리코박터 피로리(Helicobacter pylori) 또는 말라리아 항원.
본 발명의 목적을 위한 이러한 유형의 활성 물질로는 또한, 항-유전형 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 DNA가 있으며, 이러한 항체의 항원 결합 구조물(상보성 결정 영역)은 병원체(상기 참조)의 중화 항원의 단백질 또는 탄수화물 구조물의 복사물을 나타낸다.
이러한 유형의 항-유전형 항체 및 이들의 절단 생성물이 특히 세균성 병원체에 대한 탄수화물 항원을 대신할 수 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Hawkins et al., J. Immunother. 14, 273(1993) and Westerink and Apicella, Springer Seminars in Immunopathol. 15, 227(1993)]에 검토되어 있다.
기타 효능기의 예는 "종양 백신"의 유전자이다. 이들로는 문헌[참조: Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, Munich (1988) and Contrib. to Oncol 43, Karger Verlag, Munich(1992)]에 검토된 바와 같이 종양 세포 상의 항원이 있다.
기타 예는 다음 항원의 유전자 또는 다음 항-유전형 항체의 유전자이다: 시알릴-루이스; T 세포에 의해 인식되는 종양 상의 펩타이드; 온코진에 의해 발현된 단백질; 혈액 그룹 항원 및 이들의 전구체; 다형성 상피 점소 상의 항원; 또는 열 쇽 단백질 상의 항원.
만성 감염성 질환의 치료법에 대한 표적 세포는, 예를 들면, 간 세포, 임파구 및/또는 매크로파지, 상피 세포 또는 내피 세포이고; 사용된 프로모터는, 예를 들면, 바이러스 특이적이거나 세포 특이적 및 세포 주기 특이적인 프로모터이며; 사용된 효능기는, 예를 들면, 다음 유전자이다:
사이토스태틱, 아포프토틱(apoptotic) 또는 세포독성 효과를 지니고 있는 단백질을 암호화하는 유전자, 또는 항바이러스성 또는 세포독성 물질의 전구체를 활성 물질로 분리시키는 효소를 암호화하는 유전자.
IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFβ, TNFα, IL-1 또는 TGFβ 등의 항바이러스적으로 활성인 사이토킨 및 성장 인자와 같은 항바이러스성 단백질을 암호화하는 유전자, 또는 특정한 바이러스 또는 이의 VH및 VL함유 단편 또는 앞서 기재된 바와 같은 링커를 통해 연결된 이의 VH및 VL단편을 불활성화시키는 특이성을 지닌 항체를 암호화하는 유전자. 바이러스성 항원에 대한 항체의 예는 항-HBV, 항-HCV, 항-HSV, 항-HPV, 항-HIV, 항-EBV, 항-HTLV, 항-코작키에바이러스(anti-coxsackievirus) 또는 항-한타바이러스(anti-hantavirus)이다.
또 다른 항바이러스적으로 활성인 단백질은 rev-결합 단백질이다. 이들 단백질은 rev RNA에 결합되어 레트로바이러스 유전자 발현의 rev-의존적 해독후 단계를 억제시킨다. rev-결합 단백질의 예는 RBP9-27, RBP1-8U, RBP1-8D 또는 RBP1-8의 슈도진(pseudogene)이다.
세균성 독소를 중화시키거나 세균을 옵손화시키는(opsonize) 항체와 같은 항균성 단백질을 암호화하는 유전자. 이들의 예는 메닝고코씨(meningococci) C 또는 B, 이. 콜라이, 보렐리아, 슈도모나스, 헬리코박터 피로리 또는 스타필로코커스 아우레우스에 대한 항체이다.
다음 도면 및 실시예는 본 발명을 상세히 예시하는 것이며 이로써 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.
실시예
실시예 1
단쇄의 이중 항원-결합성 단백질의 제조 및 세균 발현
단쇄의 이중 항원-결합성 단백질의 제조는 종양 특이적 항원(CEA) 및 이. 콜라이 β-갈락토시다제를 인식하는 단백질의 예를 사용하여 기재되어 있다.
다음 DNA 서열을 다음과 같이 5'에서 3' 방향으로 함께 연결시킨다:
-LacZ 프로모터
-세균성 리보좀 결합 구조물(AAGGAG)
-세균성 시그날 서열 pelB[참조: Power et al., Gene 113, 95-99(1992)]
-VH 항-CEA[참조: Kontermann et al., Immunotechnol. 3, 137(1997)]
-링커 GGGS[참조: Kontermann et al., (1997)]
-VL 항-β-갈락토시다제[참조: Kontermann et al., (1997)]
-연결성 펩타이드 GGGGSGGRASGGGGS
-VH 항-β-갈락토시다제[참조: Kontermann et al., (1997)]
-링커 GGGGS
-VL 항-CEA[참조: Kontermann et al., (1997)]
-항체 9E10 EQKLISEEDLN에 대한 Myc 에피토프[참조: Munro & Pelham, Cell 46, 291-300(1986)]
-IMAC에 의한 폴리히스티딘 HHHHHH 정제[참조: Kontermann et al., (1997)].
상기 작제물의 연결은 각종 DNA 서열의 말단에서 PCR 증폭을 통해 포함되는 적합한 제한 부위에 의해 가능해진다[참조: Kontermann et al., Immunotechnol. 3, 137(1997)].
이러한 연결은 당해 분야의 숙련인에게 공지된, 제한 부위에 특이적인 효소 및 DNA 리가제를 사용하여 일어난다. 이러한 효소는 시판되고 있다. 상기 작제물을 세균성 발현 벡터 pAB1 내로 클로닝시킨다[참조: Kontermann et al., (1997)].
이러한 클로닝은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 LMB2 및 LMB3[참조: Kontermann, R.E.(1997), 상기 참조], 및
VK-NotFor: 5'-TTG TTC TGC GGC CGC CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT GCC AGC ACC-3',
scDb-AscBack: 5'-TGC ATG CTA GGG CGC GCC TCG GGC GGA GGT GGC TCA CAG GTG CAG CTG GTG CAA TCT GG-3',
scDb-AscForK: GCT CGG TAA GGC GCG CCC ACC GCT GCC ACC GCC TCC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC-3' 및
pelB-Metminus: 5'-TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ACG GCC CAG GT-3'를 사용하여 수행한다.
이를 위하여, 디아보디 CEAGal[참조: Kontermann, R.E.(1997)]로부터의 단편 VHB-VLA(단편 1) 및 VHA-VLB(단편 2)를 프라이머 LMB2 및 LMB3을 사용하여 증폭시키고 겔 여과시킨다. 이어서, 단편 1을 프라이머 VK-NotFor 및 scDb-AscBack를 사용하여 증폭시켜 Ascl 부위와 7개 아미노산의 링커를 도입한다. 단편 2를 프라이머 LMB3 및 scDb-AscForλ를 사용하여 증폭시켜 Ascl 부위와 8개 아미노산의 링커를 도입한다. 이들 단편을 Ascl와 Notl(단편 1) 및 Sfil과 Ascl(단편 2)로 가수분해시키고 세균성 발현 벡터 pAB1에 클로닝시킨다[참조: Kontermann, R.E.(1997)]. 생성된 삽입체는 VHA-VLB가 서열 GGGGSGGRASGGGGS을 갖는 15개 아미노산 길이의 링커를 통하여 VHB-VLA에 연결되는 단쇄의 폴리펩타이드를 암호화한다.
이어서, 상기 플라스미드를 TG1 세균에 삽입하고 이들을 당해 분야의 숙련인에게 잘 알려진 방법에 의해 배양한다[참조: Kontermann et al., (1997)].
상기 세균을 파열시키고 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질을 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)하여 외질(periplasmic) 제제로부터 정제한다[참조: Hochuli et al., Bio/Techn. 6, 1321-1325(1988)]. 이러한 방법의 상세한 내역이 문헌[참조: Kontermann et al., (1997)]에 기재되어 있다.
이와 같이 정제된 단백질은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 겔 여과에 의해 제시된 바와 같이 분자량이 60kDa이다. 세균성 배양액 1리터 당 상기 분자 약 200 내지 300㎍을 정제하는 것이 가능하다. 세균적으로 발현된 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질은 ELISA에서 CEA 및 β-갈락토시다제와 반응하고, o-니트로페닐 β-D-갈락토피라노시드의 전환에 의해 제시된 바와 같이, 상기 효소를 플라스틱-결합된 CEA에 점증시킬 수 있다(도 6). 또한, 이러한 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질은 β-갈락토시다제를 점증시키고 기질 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-갈락토피라노시드(X-Gal)를 전환시킴으로써 고정된 및 생 CEA-발현 LoVo 세포를 염색시킬 수 있다. 이를 위하여, LoVo 세포를 적절한 항원-결합성 단백질 10㎍/ml, β-갈락토시다제 10㎍/ml 및 X-Gal(PBS, 3mM 시안화칼륨 철(Ⅲ), 3mM 시안화칼륨 철(Ⅱ) 중의 0.8mg/ml)와 함께 배양한다. 각종 대조군 세포(A549, HEK293)나 계란 라이소자임 및 β-갈락토시다제에 대한 디아보디(HELGal; Kontermann et al., (1997)]의 경우에는 염색이 전혀 관찰되지 않았다.
실시예 2
단쇄의 이중 항원-결합성 단백질의 진핵성 발현
진핵성 세포에서 발현하기 위하여, 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질의 암호화 영역을 진핵성 발현 벡터(pSecTagA, Invitrogen) 내로 클로닝시키는데, 여기서 세균성 시그날 서열은 상기 벡터에 이미 존재하고 있는 Ig-κ 시그날 서열로 대체시킨다.
이를 위하여, 상기 단쇄 작제물을 프라이머 LMB2 및 pelB-Metminus를 사용하여 증폭시킴으로써, pelB 리더 내의 메티오닌(위치 21)을 트레오닌으로 대체시킨다. 이어서, Sfil 및 EcoRI로 가수분해시키고 벡터 pSecTagA 내로 클로닝시킨다. 이러한 성숙한 단쇄의 항원-결합성 단백질은 VHA 영역의 N 말단에 7개의 부가의 아미노산(AAQPATA)를 함유한다.
상기 플라스미드를 리포펙타민(Gibco)을 사용하여 진핵성 HEK 293 세포 내로 일시적으로 형질감염시킨다. 제오신의 존재하에서 안정한 세포를 선별한다. 이들 세포를 사용한 면역형광성 실험에서 소포체 ER 및 골기체(Golgi apparatus)의 염색을 검출하는 것이 가능하다. 또한,35S-Met-표지된 세포의 상등액으로부터의 60kDa 단백질의 면역침강법 및 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의한 정제에 의해 상기 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질의 분비를 추가로 검출할 수 있다. 이와 같이 정제된 단백질은 β-갈락토시다제 및 CEA-피복된 미세역가판의 결합에 있어서 작용적으로 활성이고 또한 β-갈락토시다제를 플라스틱-결합된 CEA에 점증시키는데 있어서 작용적으로 활성이다(도 7).
실시예 3
단쇄의 이중 항원-결합성 단백질을 분비하는 세포와의 공동 배양에 의한 시험관내 효소 점증
당해 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질을 생산하는 HEK 293 세포와 CEA-양성 LoVo 세포를 공동배양함으로써 점증을 시험관내에서 조사한다. 이를 위하여, 먼저, 본 발명에 따르는 단백질을 생산하는 세포를 트랜스웰 세포 배양 디쉬(Costar)에서 LoVo 세포와 함께 배양하는데, 여기서 2개의 세포주가 막에 의해 격리된다. 2일 후, β-갈락토시다제(10㎍/ml)를 가하고, 기질 X-Gal을 가함으로써 점증을 검출한다. 당해 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질을 생산하는 세포와의 공동 배양에서는 특이적 염색이 발견된 반면, 형질감염되지 않은 HEK 293 세포를 사용한 대조 실험에서는 어떠한 염색도 나타나지 않았다.
LoVo 세포를 A549 세포(CEA-음성)로 대체시킨 실험, 및 당해 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질을 생산하는 세포를 효소 및 기질과 함께 배양한 실험도 마찬가지로 음성이다. 후자는 당해 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질을 생산하는 세포가 그 자체로는 상기 효소와 결합할 수 없다는 것을 예시하고 있다.
또 다른 실험에서는, 당해 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질을 분비하는 HEK 293 세포, 및 LoVo 세포를 1:4 내지 1:24의 접종비로 직접적으로 공동배양한다. HEK 293 세포를 LoVo 세포와 구별하기 위해서는, LoVo 세포를 가하기 전에 HEK 세포를 CM-Dil(Molecular Probes)로 염색시킨다(레드 형광). 2일 후, β-갈락토시다제를 가하고, X-Gal(10㎍/ml)을 가한 다음 항-β-갈락토시다제 항체(Biotrend)로의 직접적인 면역형광에 의해 세포에 대한 결합을 검출한다. 이들 실험은 또한, 상기 효소가 LoVo 세포에 특이적으로 점증된다는 것을 나타내는 반면, HEK 293 세포는 전혀 염색되지 않았다. 형질감염시키지 않은 HEK 293 세포를 이용한 대조 실험은 음성이다. 이들 실험은 당해 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질이 종양 세포를 특이적 및 선택적으로 인식한다는 것을 입증해준다.
추가의 실험에서는, 비독성 다우노마이신 β-D-갈락토피라노시드를 세포독성 다우노마이신으로 전환시키는 것에 관해 조사하였다. LoVo 세포를 정제된 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질(10㎍/ml)와 함께 1시간 동안 배양한 다음 연속적으로 β-갈락토시다제(1㎍/ml) 및 다우노마이신 β-D-갈락토피라노시드(2μM)와 37℃에서 1시간 동안 배양함으로써, 다우노마이신과의 직접적인 배양으로 인한 염색과 비교해서, 기질의 자가형광에 의해 핵에서 생성된 다우노마이신의 특이적인 국재화를 검출할 수 있다. 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질 또는 β-갈락토시다제의 부재하에서 및 대조군 세포(HEK 293; 당해 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질을 생산하는 HEK)를 사용한 경우에는 어떠한 핵 염색도 검출할 수 없었다. 이들 실험은 당해 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질이 효소를 종양 세포에 점증시킬 수 있으며, 이러한 효소가 비독성 전구체를 독성 물질로 전환시키는데 이용될 수 있다는 것을 입증해준다.
이러한 효과를 추가의 실험에 사용하여 종양 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있다.
이를 위하여, LoVo 세포를 96웰 판에서 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질(10㎍/ml)과 배양한 다음 37℃에서 1시간 동안 다우노마이신 β-D-갈락토피라노시드(5μM)와 배양한다. 2일 후에 WST 시험(Boehringer Mannheim)을 사용하여 세포의 사멸을 분석한다(도 8). 이러한 경우, 프로드럭이 약물로 전환할 때의 세포 사멸은 대략적으로 약물의 존재하에서 만큼이나 우수하다(도 8A). 한 성분의 부재하 또는 CEA-음성 A549 세포를 사용한 경우에는 어떠한 효과도 거의 발견되지 않았다(도 8B).
실시예 4
단쇄의 이중 항원-결합성 단백질의 세포내 발현을 위한 작제물의 제조
당해 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질의 세포내 발현을 위해, 이러한 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질에 대한 유전자의 DNA를 각종 프라이머로 증폭시킨다:
-막관통 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질(TM-scDAP). 여기에는 상기 유전자의 3' 말단에 PDGFR의 막관통 영역을 삽입시키는 프라이머가 사용된다
-(LPFKVVVISAIIALVVLTIISLIILIMLWQKKPRYES)
-소포체에 국재된 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질(ER-scDAP). 여기에는 상기 유전자의 3' 말단에 ER 보유 시그날(SEKDEL)을 삽입시키는 프라이머가 사용된다.
-세포질에 국재된 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질(cyto-scDAP). 여기에는 상기 유전자의 5' 말단에서 시그날 서열을 메티오닌 및 최적 해독 개시용 코작 서열로 대체시키는 프라이머가 사용된다.
-핵에 국재된 단쇄의 이중 항원-결합성 단백질(nuc-scDb). 여기에는 상기 유전자의 5' 말단에서 시그날 서열을 메티오닌 및 최적 해독 개시용 코작 서열로 대체시키고 상기 유전자의 3' 말단에 핵 국재화 서열(PKKKRKVGGGT: 핵 국재화 서열은 밑줄쳐 있다)을 삽입시키는 프라이머가 사용된다.
이들 단편을 적합한 진핵성 발현 벡터(pSecTagA 및 pcDNA3; Invitrogen)에 클로닝시킨다. 이어서, 이로써 생성된 작제물(TM-scDAP, ER-scDAP, cyto-scDAP, nuc-scDAP, 및 sec-scDAP(=분비된 단백질; 실시예 2 참조))을 일시적으로 진핵성 세포(3T3)에 형질감염시키고, 항-Myc 에피토프 항체를 사용하여 면역형광성에 의해, 발현된 단백질의 국재화를 조사한다. 작제물 sec-scDAP, ER-scDAP 및 TM-scDAP에 대해서는, 분비 경로에 전형적인 염색을 검출할 수 있는 반면, cyto-scDAP는 세포질에서 산만한 국재화를 나타내고 nuc-scDAP는 핵에서 국재화를 나타낸다.
본 발명에 따라 간단한 방식에 의해 다중 항원-결합성 분자가 제공된다.

Claims (37)

  1. a) 제1 특이성(A)을 지닌 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역(VH) 및 이의 작용성 부분,
    b) 제2 특이성(B)을 지닌 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역(VL) 및 이의 작용성 부분,
    c) 특이성(B)을 지닌 면역글로불린의 중쇄의 가변 영역(VH) 및 이의 작용성 부분, 및
    d) 특이성(A)을 지닌 면역글로불린의 경쇄의 가변 영역(VL) 및 이의 작용성 부분을 포함하고, 상기 VH 영역과 VL 영역이 VH-VL 작제물 또는 VL-VH 작제물의 형태로 연결되어 있으며 2개의 VH-VL 작제물이 펩타이드(P)를 통하여 연결되어 있는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  2. 제1항에 있어서, 2개 초과의 VH-VL 작제물을 포함하는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, VH-VL 작제물이 동일한 특이성을 지닌 영역을 통하여 연결되어 있는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 특이성(A)와 (B)가 본질적으로 동일한 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, VH 영역과 VL 영역이 VH-L-VL 작제물 또는 VL-L-VH 작제물의 형태로 펩타이드 링커(L)를 통하여 연결되는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  6. 제5항에 있어서, 링커(L)가 약 1 내지 20개 아미노산, 바람직하게는 약 1 내지 5개 아미노산 길이인 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  7. 제5항에 있어서, 링커(L)가 아미노산 서열 GGGGS를 포함하는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 펩타이드(P)가 약 12 내지 40개 아미노산, 바람직하게는 약 12 내지 20개 아미노산, 특히 약 14개 아미노산 길이인 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  9. 제8항에 있어서, 펩타이드(P)가 아미노산 서열 GGGGSGGRASGGGS 또는 GGGGSGGRASGGGGS를 포함하는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 추가의 성분으로서 하나 이상의 효능기(effector; E)(들)를 포함하는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  11. 제10항에 있어서, 효능기(E)가 연결기(B)를 통하여 분자에 연결되는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  12. 제11항에 있어서, 연결기(B)가 프로테아제 절단 서열, 바람직하게는 PSA, 카텝신, 플라스미노겐 및/또는 플라스미노겐 활성인자 절단 서열을 포함하는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 특이성(A)이 분석하고자 하는 분자에 대해 지시되고, 제2 특이성(B)이 분석물에 대해 지시되는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  14. 제13항에 있어서, 분석물이 방사능 분자, 형광성 분자 및/또는 효소인 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  15. 제10항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 특이성(A)이 분석하고자 하는 분자에 대해 지시되고, 제2 특이성(B)이 분석하고자 하는 또 다른 분자에 대해 지시되며, 효능기(E)가 분석물인 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  16. 제15항에 있어서, 분석물이 방사능 분자, 형광성 분자 및/또는 효소인 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  17. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 펩타이드(P) 및/또는 효능기(E)가 퓨소제닉(fusogenic) 펩타이드를 포함하는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 특이성(A)이 표적 세포에 대해 지시되고, 제2 특이성(B)이 벡터에 대해 지시되는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  19. 제18항에 있어서, 벡터가 핵산, 양이온성 펩타이드 또는 단백질, 양이온성 지질, 양이온성 중합체, 양이온성 포르피린, 또는 AdV, AAV, 백시니아, RSV, HSV, 인플루엔자 또는 렌티바이러스 벡터로 이루어진 그룹 중에서 선택된 바이러스성 벡터인 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  20. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 특이성(A)이 세포막, 특히 임파구, 매크로파지, 단구, 과립구, 조혈 세포, 내피 세포, 평활근 세포, 횡문근(striped muscle) 세포, 상피 세포, 간 세포, 신장 세포, 신경교 세포, 지지성 조직의 세포, 종양 세포 또는 백혈병 세포; 세포외 매트릭스의 단백질, 보체 시스템의 단백질, 응고 시스템의 단백질, 키닌 시스템의 단백질, 혈장의 단백질, 지지성 조직의 단백질; 사이토킨 또는 케모카인; 내인성 또는 외인성 독소; 약제, 특히 디지탈리스(digitalis) 및/또는 병원체, 예를 들면, 특히 세균성, 바이러스성 및/또는 기생충 병원체에 대해 지시되는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  21. 제1항 내지 제12항 및 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 제2 특이성(B)이 세포막, 특히 임파구, 매크로파지, 단구 또는 과립구; 사이토킨, 케모카인 또는 성장 인자; 보체 시스템의 단백질; 응고 시스템의 단백질; 섬유소 용해성 단백질; 표적 구조물 상의 약물의 불활성 전구체를 활성, 특히 세포독성 약물로 전환시킬 수 있는 효소; 펩타이드 호르몬 또는 스테로이드 호르몬; 면역글로불린의 불변 영역; 매개인자, 예를 들면, 특히 히스타민, 세로토닌, 류코트리엔, 프로스타사이클린 또는 키닌; 병원체; 종양 세포; 내인성 또는 외인성 독소; 약제, 특히 디지탈리스에 대해 지시되는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  22. 제1항 내지 제12항, 제20항 및 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 효능기(E)가 막관통(transmembrane) 영역, 글리코포스포리피드 앵커, 수용체의 리간드-결합 부분; 수용체에 대한 리간드 또는 리간드의 수용체 결합 부분; 펩타이드 호르몬; 사이토킨; 성장 인자, 성장 인자 억제제; 케모카인; 인터페론; 매개인자; 순환시 작용하는 펩타이드; 약물의 불활성 전구체를 활성 약물로 전환시키는 효소; 응고를 활성화시키거나 억제시키는 단백질; 섬유소 용해를 활성화시키거나 억제시키는 단백질; 보체 시스템을 활성화시키거나 억제시키는 단백질; 면역글로불린의 하나 이상의 불변 영역; 세포독성 펩타이드; 또 다른 단쇄의 단일 또는 다중, 특히 이중 항원-결합성 분자; 종양 항원 또는 병원체의 항원, 예를 들면, 세균성 항원 또는 바이러스성 항원; 시스테인을 포함하는 펩타이드; 및/또는 이량체화 또는 다량체화 펩타이드 중에서 선택되는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자.
  23. 제1항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 따르는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자를 암호화하는 핵산.
  24. 제23항에 있어서, 5' 말단에 시그날 또는 막관통 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 5' 말단에 프로모터 및/또는 활성인자를 포함하는 핵산.
  26. 제25항에 있어서, 활성인자가 세포 특이적으로, 세포 주기 특이적으로, 대사 특이적으로 및/또는 약물에 의해 활성화되거나 억제될 수 있는 핵산.
  27. 제23항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 출발 코돈의 5' 말단에 서열 GCCACC 또는 GCCGCC를 포함하는 핵산.
  28. 제23항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 따르는 핵산을 포함하는 벡터.
  29. 제28항에 있어서, 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터인 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 비-바이러스성 벡터가 양이온성 지질, 양이온성 중합체, 양이온성 펩타이드 또는 양이온성 포르피린 중에서 선택되는 벡터.
  31. 제23항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 따르는 핵산 또는 제28항 또는 제29항에 따르는 벡터를 포함하는 세포.
  32. 제31항에 있어서, 세균성, 효모, 곤충 또는 포유류 세포인 세포.
  33. 제32항에 있어서, 포유류 세포가 임파구, 매크로파지, 신경교 세포, 상피 세포, 간 세포, 신장 세포, 골수 세포, 내피 세포, 평활근 또는 횡문근 세포 또는 섬유아세포인 세포.
  34. 제31항 또는 제32항에 따르는 세포를 배양한 다음, 경우에 따라 발현 생성물을 분리시키는 것을 포함하여, 단쇄의 다중 항원-결합성 분자를 제조하는 방법.
  35. 제1항 내지 제12항 및 제17항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 따르는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자, 제23항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 따르는 핵산, 제28항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 따르는 벡터 또는 제31항 내지 제33항 중의 어느 한 항에 따르는 세포를 포함하는 약제.
  36. 제13항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따르는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자를 포함하는 진단 보조제.
  37. 종양, 자가면역 질환, 염증성 질환, 혈액 장애, 특히 혈액 응고 및/또는 순환 시스템의 장애, 신경계 장애 및/또는 감염성 질환을 치료, 예방 또는 진단하기 위한, 제1항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 따르는 단쇄의 다중 항원-결합성 분자, 제23항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 따르는 핵산, 제28항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 따르는 벡터 또는 제31항 내지 제33항 중의 어느 한 항에 따르는 세포의 용도.
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