KR102581107B1

KR102581107B1 - D-알룰로스의 효소적 생산

Info

Publication number: KR102581107B1
Application number: KR1020197019532A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 조지프 위첼렉키; 에드윈 오. 로저스
Original assignee: 보너모스, 인코포레이티드
Priority date: 2016-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2023-09-21
Also published as: CA3044894A1; CO2019007313A2; IL267250B2; JP2020513247A; US11168342B2; MA46152A1; US20190249212A1; US20200208187A1; PH12019501332A1; US20190376101A1; JP2023052402A; RU2019121904A; UA126392C2; US11078506B2; CL2019001607A1; MX2019005824A; EP3555282A4; EP3555282A1; MA46152B1; AU2017376628A1

Abstract

본 발명은 당류를 알룰로스로 효소적으로 전환하기 위한 제법을 제공한다. 본 발명은 또한, 알룰로스를 제조하기 위한 제법에 관계하는데, 여기서 상기 제법은 알룰로스 6-인산염 3-입체이성체효소 (A6PE)에 의해 촉매됨으로써, 프룩토오스 6-인산염 (F6P)을 알룰로스 6-인산염 (A6P)으로 전환하고, 그리고 알룰로스 6-인산염 포스파타아제 (A6PP)에 의해 촉매됨으로써, A6P를 알룰로스로 전환하는 것을 수반한다.

Description

D-알룰로스의 효소적 생산

관련된 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2016년 12월 14일자 제출된 U.S. 출원 일련 번호 62/434,033에 우선권을 주장하고, 이것은 본원에서 참조로서 편입된다.

발명의 분야

본 발명은 당 D-알룰로스의 제조에 관계한다. 더욱 특정하게는, 본 발명은 당류 (가령, 다당류, 올리고당류, 이당류, 수크로오스, D-글루코오스 및 D-프룩토오스)를 D-알룰로스로 효소적으로 전환함으로써 D-알룰로스를 제조하는 방법에 관계한다.

발명의 배경

D-알룰로스 (D-사이코스로서 또한 알려져 있음) (차후에, 알룰로스)는 수크로오스의 단맛의 70%를 갖지만, 단지 10%의 칼로리만을 갖는 저칼로리, 천연 감미료이다. 이것은 밀 그리고 다른 식물 내에 단지 소량으로만 존재하는 자연발생 단당류 헥소오스이다. 알룰로스는 2012년에 미국 식품의약국 (FDA)에 의해 식품 첨가제로서 승인되었는데, 이것은 미국 식품의약국에 의해 안전성 인정 등급 (GRAS)으로서 지정되었다. 하지만, 알룰로스의 높은 판매 가격으로 인해, 감미료로서 이의 이용은 제한되었다. 알룰로스는 무수한 건강 유익성을 자랑한다: 이것은 저칼로리 (수크로오스의 10%)이다; 이것은 1의 매우 낮은 혈당 지수를 갖는다; 이것은 소장에서 완전히 흡수되지만 물질대사되지 않고, 그리고 그 대신에, 소변 및 대변으로 배출된다; 이것은 알파-아밀라아제, 수크레아제 및 말타아제를 저해함으로써 혈당을 조절하는데 도움을 준다; 그리고 이것은 식품 및 음료에서 수크로오스와 유사한 기능성을 갖는다. 따라서, 알룰로스는 명백히, 식품 및 음료 산업에서 다양하게 적용된다.

현재 알룰로스는 프룩토오스의 효소적 이성화를 통해 주로 생산된다 (WO 2014049373). 전반적으로, 상기 방법은 더욱 높은 공급원료 비용, 프룩토오스로부터 알룰로스의 많은 비용이 드는 분리, 그리고 상대적으로 낮은 산물 수율로 인한 어려움을 겪는다.

높은-수율 알룰로스 생산을 위한 비용-효과적인 합성 경로를 개발하는 것이 요구되는데, 여기서 상기 제법의 최소한 하나의 단계는 에너지면에서 유리한 화학 반응을 필요로 한다. 게다가, 제법 단계가 하나의 탱크 또는 생물반응기에서 수행될 수 있는 생산 제법이 요구된다. 인산염의 상대적으로 낮은 농도에서 수행될 수 있는 알룰로스 생산의 제법이 또한 요구되는데, 여기서 인산염은 재활용될 수 있고 및/또는 상기 제법은 아데노신 삼인산염 (ATP)을 인산염의 공급원으로서 이용하는 것을 필요로 하지 않는다. 반응 단계 중에서 어느 것에서도 값비싼 니코틴아미드 아데노신 디뉴클레오티드 (NAD(H)) 보조효소의 이용을 필요로 하지 않는 알룰로스 생산 경로가 또한 요구된다.

발명의 요약

본원에서 설명된 발명은 알룰로스를 제조하기 위한 제법에 관계한다. 다양한 양상에서, 이들 제법은 알룰로스 6-인산염 3-입체이성체효소 (A6PE)에 의해 촉매됨으로써, 프룩토오스 6-인산염 (F6P)을 알룰로스 6-인산염 (A6P)으로 전환하고; 그리고 알룰로스 6-인산염 포스파타아제 (A6PP)에 의해 촉매됨으로써, A6P를 알룰로스로 전환하는 것을 수반한다. 이들 발명은 또한, 본원에서 설명된 제법 중에서 어느 것에 의해 제조된 알룰로스에 관계한다.

본 발명의 일부 양상에서, 알룰로스를 제조하기 위한 제법은 또한, 글루코오스 6-인산염 (G6P)을 F6P로 전환하는 단계를 수반하는데, 여기서 상기 단계는 포도당인산이성화효소 (PGI)에 의해 촉매된다. 다른 양상에서, 알룰로스 합성을 위한 제법은 또한, 글루코오스 1-인산염 (G1P)을 G6P로 전환하는 단계를 포함하고, 그리고 이러한 전환 단계는 포도당인산무타아제 (PGM)에 의해 촉매된다.

다양한 양상에서, 알룰로스를 제조하기 위한 제법은 최소한 하나의 효소에 의해 촉매됨으로써, 당류를 G1P로 전환하고; 포도당인산무타아제 (PGM)에 의해 촉매됨으로써, G1P를 G6P로 전환하고; 포도당인산이성화효소 (PGI)에 의해 촉매됨으로써, G6P를 F6P로 전환하고; A6PE에 의해 촉매됨으로써, F6P를 알룰로스 6-인산염 (A6P)로 전환하고; 그리고 A6PP에 의해 촉매됨으로써, 생산된 A6P를 알룰로스로 전환하는 것을 수반할 수 있다.

이들 제법 중에서 어느 것에서 이용되는 당류는 녹말 또는 이의 유도체, 셀룰로오스 또는 이의 유도체, 그리고 수크로오스로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 녹말 또는 이의 유도체는 아밀로오스, 아밀로펙틴, 가용성 녹말, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토오스, 또는 글루코오스일 수 있다. 본 발명의 일부 양상에서, 알룰로스를 제조하기 위한 제법은 녹말의 효소적 가수분해에 의해 또는 산 가수분해에 의해 녹말을 녹말 유도체로 전환하는 것을 수반한다. 다른 양상에서, 녹말 유도체는 이소아밀라아제, 풀루라나아제, 알파-아밀라아제, 또는 이들 효소 중에서 2개 또는 그 이상의 조합에 의해 촉매된 녹말의 효소적 가수분해에 의해 제조될 수 있다. 알룰로스를 제조하기 위한 제법은 일정한 양상에서, 또한 4-글루칸 전달효소 (4GT)를 추가하는 것을 수반할 수 있다.

다양한 양상에서, 알룰로스를 제조하기 위한 제법은 최소한 하나의 효소에 의해 촉매됨으로써, 프룩토오스를 F6P로 전환하고; A6PE에 의해 촉매됨으로써, F6P를 알룰로스 6-인산염 (A6P)으로 전환하고; 그리고 A6PP에 의해 촉매됨으로써, 생산된 A6P를 알룰로스로 전환하는 것을 수반할 수 있다. 다른 구체예에서, 알룰로스 생산 제법은 최소한 하나의 효소에 의해 촉매됨으로써, 수크로오스를 프룩토오스로 전환하고; 최소한 하나의 효소에 의해 촉매됨으로써, 프룩토오스를 F6P로 전환하고; A6PE에 의해 촉매됨으로써, F6P를 알룰로스 6-인산염 (A6P)으로 전환하고; 그리고 A6PP에 의해 촉매됨으로써, 생산된 A6P를 알룰로스로 전환하는 것을 수반한다.

본 발명의 다른 양상에서, 알룰로스를 제조하기 위한 제법에서 이용되는 G6P는 최소한 하나의 효소에 의해 촉매됨으로써, 글루코오스를 G6P로 전환함에 의해 산출될 수 있다. 글루코오스는 차례로, 최소한 하나의 효소에 의해 촉매됨으로써, 수크로오스를 글루코오스로 전환함에 의해 생산될 수 있다.

본 발명의 다른 양상에서, 알룰로스를 제조하기 위한 제법의 단계는 ATP-없이, NAD(H)-없이, 약 0 mM 내지 약 150 mM의 인산염 농도에서 수행되고, 인산염은 재활용되고 및/또는 상기 제법의 최소한 하나의 단계는 에너지면에서 유리한 화학 반응을 수반한다.

도면의 간단한 설명
이들 도면은 본 발명의 구체예 중에서 일부의 일정한 양상을 도해하고, 그리고 본 발명을 제한하거나 또는 규정하는데 이용되지 않아야 한다.
도면 1은 프룩토오스 6-인산염을 알룰로스 6-인산염으로, 그리고 이후, 알룰로스로 전환하는 효소 경로를 도해하는 계통도이다.
도면 2는 녹말 또는 이의 파생된 산물을 알룰로스로 전환하는 효소 경로를 도해하는 계통도이다. 다음의 약어가 이용된다: αGP, 알파-글루칸 인산화효소 또는 녹말 인산화효소; PGM, 포도당인산무타아제; PGI, 포도당인산이성화효소; IA, 이소아밀라아제; PA, 풀루라나아제; MP, 말토오스 인산화효소; PPGK, 폴리인산염 글루코키나아제.
도면 3은 셀룰로오스 또는 이의 파생된 산물을 알룰로스로 전환하는 효소 경로를 보여준다. CDP, 셀로덱스트린 인산화효소; CBP, 셀로비오스 인산화효소; PPGK, 폴리인산염 글루코키나아제; PGM, 포도당인산무타아제; PGI, 포도당인산이성화효소.
도면 4는 프룩토오스를 알룰로스로 전환하는 효소 경로를 도해하는 계통도이다. PPFK, 폴리인산염 프럭토키나아제.
도면 5는 글루코오스를 알룰로스로 전환하는 효소 경로를 도해하는 계통도이다. PPGK, 폴리인산염 글루코키나아제; PGI, 포도당인산이성화효소.
도면 6은 수크로오스 또는 이의 파생된 산물을 알룰로스로 전환하는 효소 경로를 보여준다. SP, 수크로오스 인산화효소; PPFK, 폴리인산염 프럭토키나아제; PGM, 포도당인산무타아제; PGI, 포도당인산이성화효소.
도면 7은 글루코오스 1-인산염의 알룰로스로의 전환을 위한 형성 Gibbs 에너지에 근거하여, 중간체 사이에 반응 Gibbs 에너지를 보여준다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 산물 분리 비용 및 알룰로스 생산 비용을 크게 감소시키면서, 높은 산물 수율에서 알룰로스를 합성하기 위한 효소 경로, 또는 제법을 제공한다.

본 발명은 알룰로스를 제조하기 위한 제법에 관계하는데, 여기서 상기 제법은 입체이성체효소에 의해 촉매됨으로써, 프룩토오스 6-인산염 (F6P)을 알룰로스 6-인산염 (A6P)으로 전환하고, 그리고 포스파타아제 (가령, 알룰로스 6-인산염 포스파타아제, A6PP)에 의해 촉매됨으로써, 생산된 A6P를 알룰로스로 전환하는 것을 수반한다. 이러한 제법은 도면 1에서 전반적으로 도시된다. 일정한 구체예에서, F6P의 A6P로의 전환을 촉매작용하는 입체이성체효소는 알룰로스 6-인산염 3-입체이성체효소 (A6PE)이다.

F6P를 A6P로 전환하는 입체이성체효소가 본 발명의 제법에서 이용될 수 있다. 입체이성체효소는 또한, A6P를 F6P로 전환할 수 있다. 본 발명의 일부 양상에서, F6P를 A6P로 전환하기 위해 이들 제법에서 이용하기 적합한 입체이성체효소는 서열 번호: 3 또는 6의 아미노산 서열에 최소한 45%, 더욱 바람직하게는 최소한 50%, 더욱 바람직하게는 최소한 55%, 더욱 바람직하게는 최소한 60%, 더욱 바람직하게는 최소한 65%, 더욱 바람직하게는 최소한 70%, 더욱 바람직하게는 최소한 75%, 더욱 바람직하게는 최소한 80%, 더욱 바람직하게는 최소한 85%, 이보다 더욱 바람직하게는 최소한 90%, 최소한 91%, 최소한 92%, 최소한 93%, 또는 최소한 94%, 가장 바람직하게는 최소한 95%, 그리고 심지어 가장 바람직하게는 최소한 96, 97, 98, 99 또는 100%의 동일성 정도를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합한 입체이성체효소는 서열 번호: 1, 2, 4 및 5의 뉴클레오티드 서열에 최소한 30%, 바람직하게는 최소한 35%, 더욱 바람직하게는 최소한 40%, 더욱 바람직하게는 최소한 45%, 더욱 바람직하게는 최소한 50%, 더욱 바람직하게는 최소한 55%, 더욱 바람직하게는 최소한 60%, 더욱 바람직하게는 최소한 65%, 더욱 바람직하게는 최소한 70%, 더욱 바람직하게는 최소한 75%, 더욱 바람직하게는 최소한 80%, 더욱 바람직하게는 최소한 85%, 이보다 더욱 바람직하게는 최소한 90%, 가장 바람직하게는 최소한 95%, 그리고 심지어 가장 바람직하게는 최소한 96, 97, 98, 99 또는 100%의 동일성 정도를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.

A6PEs의 실례는 UNIPROT 식별 번호에 의해 식별되는 다음의 단백질: D9TQJ4, A0A090IXZ8 및 P32719를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 이들 중에서, D9TQJ4 및 A0A090IXZ8은 고온성 생물체로부터 획득된다. P32719는 중온성 생물체로부터 획득된다. P32719는 A0A090IXZ8와 53% 동일하고 D9TQJ4와 55% 동일하고, 그리고 각 단백질은 F6P의 A6P로의 에피머화를 촉매작용한다. 게다가, A0A090IXZ8은 D9TQJ4와 45% 동일하다. 반대로, D9TQJ4에 45% 또는 그 이하의 동일성 정도를 갖는, UNIPROT 식별 번호에 의해 식별되는 다른 입체이성체효소 단백질: A0A101D823, R1AXD6, A0A150LBU8, A0A023CQG9 및 H1XWY2는 F6P의 A6P로의 에피머화를 촉매작용하지 않는다.

본 발명의 일부 양상에서, F6P를 A6P로 전환하기 위해 이들 제법에서 이용하기 적합한 입체이성체효소는 이가 금속 보조인자를 활용한다: 바람직하게는, 코발트, 하지만 이에 한정되지 않음. 본 발명의 추가 양상에서 입체이성체효소는 촉매작용을 위한 (α/β)₈-배럴 도메인을 내포하지만 이것을 내포하는 것에 한정되지 않고; 부가적으로, 상기 배럴의 7번째 β-가닥의 종결 지점에서 Ser, 상기 배럴의 8번째 β-가닥의 종결 지점에서 Ser 및 활성 부위 루프 내에 Gly를 포함하는 인산염 결합 도메인을 내포하지만 이것을 내포하는 것에 한정되지 않고; 부가적으로, 상기 배럴의 2번째와 3번째 β-가닥 내에 His를 포함하는 금속 결합 도메인을 내포하지만 이것을 내포하는 것에 한정되지 않고; 부가적으로, 1,1 양성자 전달을 위한 산/염기 촉매제로서 행동하기 위해 상기 배럴의 2번째와 7번째 β-가닥 내에 Asp를 내포하지만 이것을 내포하는 것에 한정되지 않고, 그리고 부가적으로, 상기 배럴의 2번째 β-가닥 내에 His-소수성 잔기-Asp 서명을 내포하지만 이것을 내포하는 것에 한정되지 않고, 여기서 His는 금속 결합에서 활용되고, 그리고 Asp는 산/염기 촉매작용에 활용된다. 이들 특질은 당해 분야에서 공지되고, 그리고 예로서, Chan et al., Structural Basis for Substrate Specificity in Phosphate Binding (beta/alpha)8-Barrels: D-Allulose 6-Phosphate 3-Epimerase from Escherichia coli K-12. Biochemistry. 2008; 47 (36); 9608 - 9617에서 언급된다. 바람직하게는, 본 발명의 제법에서 이용을 위한 입체이성체효소는 촉매작용을 위한 (α/β)₈-배럴 도메인, 상기 배럴의 7번째 β-가닥의 종결 지점에서 Ser, 상기 배럴의 8번째 β-가닥의 종결 지점에서 Ser, 활성 부위 루프 내에 Gly, 상기 배럴의 2번째와 3번째 β-가닥 내에 His, 상기 배럴의 2번째와 7번째 β-가닥 내에 Asp, 그리고 상기 배럴의 2번째 β-가닥 내에 His-소수성 잔기-Asp 서명을 내포한다.

본 발명의 제법은 A6P를 알룰로스 (D-알룰로스)로 전환하는 포스파타아제를 이용한다. 본 발명의 일부 양상에서, A6P를 알룰로스로 전환하기 위해 상기 제법에 적합한 포스파타아제는 서열 번호: 9의 아미노산 서열에 최소한 45%, 더욱 바람직하게는 최소한 50%, 더욱 바람직하게는 최소한 55%, 더욱 바람직하게는 최소한 60%, 더욱 바람직하게는 최소한 65%, 더욱 바람직하게는 최소한 70%, 더욱 바람직하게는 최소한 75%, 더욱 바람직하게는 최소한 80%, 더욱 바람직하게는 최소한 85%, 이보다 더욱 바람직하게는 최소한 90%, 가장 바람직하게는 최소한 95%, 최소한 91%, 최소한 92%, 최소한 93%, 또는 최소한 94%, 그리고 심지어 가장 바람직하게는 최소한 96, 97, 98, 99 또는 100%의 동일성 정도를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 적합한 입체이성체효소는 서열 번호: 7 및 8의 뉴클레오티드 서열에 최소한 30%, 바람직하게는 최소한 35%, 더욱 바람직하게는 최소한 40%, 더욱 바람직하게는 최소한 45%, 더욱 바람직하게는 최소한 50%, 더욱 바람직하게는 최소한 55%, 더욱 바람직하게는 최소한 60%, 더욱 바람직하게는 최소한 65%, 더욱 바람직하게는 최소한 70%, 더욱 바람직하게는 최소한 75%, 더욱 바람직하게는 최소한 80%, 더욱 바람직하게는 최소한 85%, 이보다 더욱 바람직하게는 최소한 90%, 가장 바람직하게는 최소한 95%, 그리고 심지어 가장 바람직하게는 최소한 96, 97, 98, 99 또는 100%의 동일성 정도를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다.

A6PPs의 실례는 UNIPROT 식별 번호에 의해 식별되는 다음의 단백질: A3DC21, Q5LGR4 및 Q89ZR1을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. A3DC21은 Q5LGR4와 46% 동일하고 Q89ZR1과 45% 동일하고, 그리고 각 단백질은 A6P의 알룰로스로의 특이적 탈인산화를 촉매작용한다. 반대로, A3DC21과 45%보다 적게 동일한, UNIPROT 식별 번호에 의해 식별되는 할로산 탈수소효소 상과, 단백질로부터 다른 포스파타아제: H0UQ29, Q67LU4, A0A0K6IPM3, C8WSJ0, A0A151YX61 등은 A6P의 알룰로스의 특이적 탈인산화를 촉매작용하지 않는다.

본 발명의 제법에서 이용하기 적합한, A6P를 알룰로스로 전환하기 위한 포스파타아제는 알룰로스 6-인산염에 대해 특이적이다. 본원에서 이용된 바와 같이, 알룰로스 6-인산염에 대해 특이적이라는 것은 글루코오스 1-인산염, 글루코오스 6-인산염, 또는 프룩토오스 6-인산염과 비교하여 알룰로스 6-인산염에서 더욱 높은 특이적 활성을 갖는다는 것을 지칭한다.

A6P를 알룰로스로 전환하기 위한 포스파타아제는 이가 금속 보조인자: 바람직하게는, 마그네슘을 활용한다. 본 발명의 추가 양상에서 포스파타아제는 촉매작용을 위한 로스마노이드 폴드 도메인 (Rossmanoid fold domain)을 내포하지만 이것을 내포하는 것에 한정되지 않고; 부가적으로, 기질 특이성을 위한 C1 캡핑 도메인을 내포하지만 이것을 내포하는 것에 한정되지 않고; 부가적으로, 마그네슘을 조정하기 위한, 상기 로스마노이드 폴드의 1번째 β-가닥 내에 DxD 서명을 내포하지만 이것을 내포하는 것에 한정되지 않고, 여기서 두 번째 Asp는 일반적인 산/염기 촉매제이고; 부가적으로, 반응 중간체의 안정성에 도움을 주는, 상기 로스마노이드 폴드의 2번째 β-가닥의 종결 지점에서 Thr 또는 Ser을 내포하지만 이것을 내포하는 것에 한정되지 않고; 부가적으로, 반응 중간체의 안정성에 도움을 주는, 상기 로스마노이드 폴드의 3번째 β-가닥의 C 말단부에 이어지는 α-나선의 N 말단에서 Lys를 내포하지만 이것을 내포하는 것에 한정되지 않고; 그리고 부가적으로, 마그네슘을 조정하기 위한, 상기 로스마노이드 폴드의 4번째 β-가닥의 종결 지점에서 GDxxxD 서명을 내포하지만 이것을 내포하는 것에 한정되지 않는다. 이들 특질은 당해 분야에서 공지되고, 그리고 예로서, Burroughs et al., Evolutionary Genomics of the HAD Superfamily: Understanding the Structural Adaptations and Catalytic Diversity in a Superfamily of Phosphoesterases and Allied Enzymes. J. Mol. Biol. 2006; 361; 1003-1034에서 언급된다. 바람직하게는, 본 발명의 제법에서 이용되는, A6P를 알룰로스로 전환하기 위한 포스파타아제는 촉매작용을 위한 로스마노이드 폴드 도메인, C1 캡핑 도메인, 상기 로스마노이드 폴드의 1번째 β-가닥 내에 DxD 서명, 상기 로스마노이드 폴드의 2번째 β-가닥의 종결 지점에서 Thr 또는 Ser, 상기 로스마노이드 폴드의 3번째 β-가닥의 C 말단부에 이어지는 α-나선의 N 말단에서 Lys, 그리고 상기 로스마노이드 폴드의 4번째 β-가닥의 종결 지점에서 GDxxxD 서명을 내포한다.

일부 구체예에서, 본 발명에 따른 알룰로스를 제조하기 위한 제법은 또한, 글루코오스 6-인산염 (G6P)을 F6P로 효소적으로 전환하는 단계를 포함하고, 그리고 이러한 단계는 포도당인산이성화효소 (PGI)에 의해 촉매된다. 다른 구체예에서, 알룰로스를 제조하기 위한 제법은 글루코오스 1-인산염 (G1P)을 G6P로 전환하는 단계를 부가적으로 포함하는데, 여기서 상기 단계는 포도당인산무타아제 (PGM)에 의해 촉매된다. 추가 구체예에서, 알룰로스 생산 제법은 또한, 최소한 하나의 효소에 의해 촉매되는, 당류를 G1P로 전환하는 단계를 포함한다.

이런 이유로, 본 발명에 따른 알룰로스를 제조하기 위한 제법은 예로서, 다음의 단계를 포함할 수 있다: (i) 한 가지 또는 그 이상의 효소를 이용하여 당류를 글루코오스 1-인산염 (G1P)으로 전환하는 단계; (ii) 포도당인산무타아제 (PGM, EC 5.4.2.2)를 이용하여 G1P를 G6P로 전환하는 단계; (iii) 포도당인산이성화효소 (PGI, EC 5.3.1.9)를 이용하여 G6P를 F6P로 전환하는 단계; (iv) A6PE를 통해 F6P를 A6P로 전환하는 단계, 그리고 (v) A6PP를 통해 A6P를 알룰로스로 전환하는 단계. 당류가 녹말인 상기 제법의 실례는 도면 2에서 도시된다.

전형적으로, 개시된 제법에서 이용되는 효소 단위의 비율은 1:1:1:1:1 (αGP:PGM:PGI:A6PE:A6PP)이다. 산물 수율을 최적화하기 위해, 이들 비율은 수많은 조합으로 조정될 수 있다. 가령, 3:1:1:1:1의 비율은 인산화된 중간체의 농도를 최대화하는데 이용될 수 있는데, 이것은 하류 반응의 증가된 활성을 유발할 것이다. 반대로, 1:1:1:1:3의 비율은 αGP에 대한 인산염의 견실한 공급을 유지하는데 이용될 수 있는데, 이것은 알파-1,4-글리코시드 결합의 더욱 효율적인 가인산분해성 개열을 유발할 것이다. 가령, 3:1:1:1:3의 효소 비율은 반응 속도를 더욱 증가시키는데 이용될 수 있다. 이런 이유로, 아래에 논의된 다른 임의선택적 효소를 포함하는 효소 비율은 알룰로스 생산의 효율을 증가시키기 위해 변할 수 있다. 가령, 특정 효소는 다른 효소의 양에 비하여 약 2 x, 3 x, 4 x, 5 x 등의 양으로 존재할 수 있다.

이들 제법의 중요한 이점 중에서 한 가지는 제법 단계가 하나의 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다는 점이다. 대안으로, 이들 단계는 또한, 직렬로 배열되는 복수의 생물반응기, 또는 반응 용기에서 수행될 수 있다.

A6P의 탈인산화에 의해 생산된 인산염 이온은 이후, 특히 모든 제법 단계가 단일 생물반응기 또는 반응 용기에서 수행될 때, 당류를 G1P로 전환하는 제법 단계에서 재활용될 수 있다. 개시된 제법에서 인산염을 재활용하는 능력은 비화학양론적 양의 인산염이 이용될 수 있도록 허용하는데, 이것은 반응 인산염 농도를 낮게 유지시킨다. 이것은 이들 제법의 전체 경로 및 전체 속도에 영향을 주지만, 개별 효소의 활성을 제한하지 않고 알룰로스 제조 제법의 전체 효율을 허용한다.

가령, 반응 인산염 농도는 약 0 mM 내지 약 300 mM, 약 0 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 50 mM, 또는 더욱 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 50 mM의 범위일 수 있다. 가령, 반응 인산염 농도는 약 0.1 mM, 약 0.5 mM, 약 1 mM, 약 1.5 mM, 약 2 mM, 약 2.5 mM, 약 5 mM, 약 6 mM, 약 7 mM, 약 8 mM, 약 9 mM, 약 10 mM, 약 15 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 또는 약 55 mM일 수 있다.

이런 이유로, 낮은 인산염 농도는 낮은 전체 인산염으로 인해 감소된 생산 비용을 유발하고, 그리고 따라서, 인산염 제거의 낮아진 비용을 유발한다. 이것은 또한, 높은 농도의 유리 인산염에 의한 A6PP의 저해를 예방하고, 그리고 인산염 오염에 대한 가능성을 감소시킨다.

게다가, 본원에서 개시된 제법은 인산염의 공급원으로서 추가된 ATP 없이, 다시 말하면, ATP-없이 수행될 수 있다. 이들 제법은 또한, NAD(H)를 추가할 필요 없이, 다시 말하면, NAD(H)-없이 수행될 수 있다. 다른 이점은 또한, 알룰로스를 만들기 위한 개시된 제법의 최소한 하나의 단계가 에너지면에서 유리한 화학 반응을 수반한다는 사실을 포함한다 (도면 7).

당류를 G1P로 전환하는데 이용되는 효소의 실례는 알파-글루칸 인산화효소 (αGP, EC 2.4.1.1, 이것은 또한, 말토덱스트린 인산화효소, 녹말 인산화효소, 글리코겐 인산화효소, 그리고 다른 α-1,4 글리코시드 결합 분해 인산화효소를 포함한다), 말토오스 인산화효소 (MP, EC 2.4.1.8), 셀로덱스트린 인산화효소 (CDP, EC 2.4.1.49), 셀로비오스 인산화효소 (CBP, EC 2.4.1.20), 셀룰로오스 인산화효소, 수크로오스 인산화효소 (SP, EC 2.4.1.7), 그리고 이들의 조합을 포함한다. 효소 또는 효소 조합의 선택은 상기 제법에서 이용되는 당류에 의존한다.

G1P를 산출하는데 이용되는 당류는 다당류, 올리고당류 및/또는 이당류일 수 있다. 가령, 당류는 녹말, 녹말의 한 가지 또는 그 이상의 유도체, 셀룰로오스, 셀룰로오스의 한 가지 또는 그 이상의 유도체, 수크로오스, 수크로오스의 한 가지 또는 그 이상의 유도체, 또는 이들의 조합일 수 있다.

녹말은 자연에서 가장 폭넓게 이용되는 에너지 저장 화합물이고, 그리고 주로, 식물 종자에서 보관된다. 자연 녹말은 선형 아밀로오스 및 분지된 아밀로펙틴을 내포한다. 녹말 유도체의 실례는 아밀로오스, 아밀로펙틴, 가용성 녹말, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토오스, 프룩토오스 및 글루코오스를 포함한다. 셀룰로오스 유도체의 실례는 선처리된 바이오매스, 재생된 무정형 셀룰로오스, 셀로덱스트린, 셀로비오스, 프룩토오스 및 글루코오스를 포함한다. 수크로오스 유도체는 프룩토오스 및 글루코오스를 포함한다.

녹말의 유도체는 녹말의 효소적 가수분해에 의해 또는 녹말의 산 가수분해에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로, 녹말의 효소적 가수분해는 α-1,6-글루코시드 결합을 가수분해하는 이소아밀라아제 (IA, EC. 3.2.1.68); α-1,6-글루코시드 결합을 가수분해하는 풀루라나아제 (PA, EC. 3.2.1.41); 짧은 말토올리고당류의 글리코실전달을 촉매작용하여, 더욱 긴 말토올리고당류를 산출하는 4-α-글루칸전달효소 (4GT, EC. 2.4.1.25); 또는 α-1,4-글루코시드 결합을 개열하는 알파-아밀라아제 (EC 3.2.1.1)에 의해 촉매되거나 또는 증강될 수 있다.

게다가, 셀룰로오스의 유도체는 셀룰라아제 혼합물에 의해, 산에 의해, 또는 바이오매스의 선처리에 의해 촉매된 셀룰로오스의 효소적 가수분해에 의해 제조될 수 있다.

일정한 구체예에서, 당류를 G1P로 전환하는데 이용되는 효소는 αGP를 내포한다. 이러한 단계에서, 당류가 녹말을 포함할 때, G1P는 αGP에 의해 녹말로부터 산출된다; 당류가 가용성 녹말, 아밀로덱스트린, 또는 말토덱스트린을 내포할 때, G1P는 αGP에 의해 가용성 녹말, 아밀로덱스트린, 또는 말토덱스트린으로부터 생산된다.

당류가 말토오스를 포함하고, 그리고 효소가 말토오스 인산화효소를 내포할 때, G1P는 말토오스 인산화효소에 의해 말토오스로부터 산출된다. 만약 당류가 수크로오스를 포함하고, 그리고 효소가 수크로오스 인산화효소를 내포하면, G1P는 수크로오스 인산화효소에 의해 수크로오스로부터 산출된다.

또 다른 구체예에서, 당류가 셀로비오스를 포함하고, 그리고 효소가 셀로비오스 인산화효소를 내포할 때, G1P는 셀로비오스 인산화효소에 의해 셀로비오스로부터 산출된다.

추가 구체예에서, 당류가 셀로덱스트린을 내포하고, 그리고 효소가 셀로덱스트린 인산화효소를 포함할 때, G1P는 셀로덱스트린 인산화효소에 의해 셀로덱스트린으로부터 산출된다.

당류를 G1P로 전환하는 대안적 구체예에서, 당류가 셀룰로오스를 포함하고, 그리고 효소가 셀룰로오스 인산화효소를 내포할 때, G1P는 셀룰로오스 인산화효소에 의해 셀룰로오스로부터 산출된다.

본 발명에 따라서, 알룰로스는 또한, 프룩토오스로부터 생산될 수 있다. 상기 제법의 실례는 도면 4에서 도시된다. 가령, 상기 제법은 폴리인산염 프럭토키나아제 (PPFK)에 의해 촉매됨으로써, F6P를 프룩토오스 및 폴리인산염으로부터 산출하고; A6PE에 의해 촉매됨으로써, F6P를 A6P로 전환하고; 그리고 A6PP에 의해 촉매됨으로써, A6P를 알룰로스로 전환하는 것을 수반한다. 프룩토오스는 예로서, 수크로오스의 효소적 전환에 의해 생산될 수 있다.

다른 구체예에서, 알룰로스는 수크로오스로부터 생산될 수 있다. 이런 제법의 실례는 도면 6에서 도시된다. 상기 제법은 다음의 효소적 단계를 포함하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 수크로오스 인산화효소 (SP)에 의해 촉매됨으로써, G1P를 수크로오스 및 유리 인산염으로부터 산출하는 단계; PGM에 의해 촉매됨으로써, G1P를 G6P로 전환하는 단계; PGI에 의해 촉매됨으로써, G6P를 F6P로 전환하는 단계; A6PE에 의해 촉매됨으로써, F6P를 A6P로 전환하는 단계; 그리고 A6PP에 의해 촉매됨으로써, A6P를 알룰로스로 전환하는 단계.

A6P가 알룰로스로 전환될 때 산출된 인산염 이온은 이후, 수크로오스를 G1P로 전환하는 단계에서 재활용될 수 있다. 추가적으로, 도면 6에서 도시된 바와 같이, SP에 의한 수크로오스의 가인산분해성 개열에 의해 산출된 프룩토오스로부터 F6P를 생산함으로써, PPFK 및 폴리인산염이 알룰로스 수율을 증가시키는데 이용될 수 있다.

일부 구체예에서, 알룰로스를 제조하기 위한 제법은 다음의 단계를 포함한다: 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 글루코오스를 다당류 및 올리고당류로부터 산출하는 단계, 최소한 하나의 효소에 의해 촉매됨으로써, 글루코오스를 G6P로 전환하는 단계, 효소적 가수분해 또는 산 가수분해에 의해 프룩토오스를 다당류 및 올리고당류로부터 산출하는 단계, 그리고 최소한 하나의 효소에 의해 촉매됨으로써, 프룩토오스를 G6P로 전환하는 단계. 다당류 및 올리고당류의 실례는 상기 열거된다.

다른 구체예에서, G6P는 폴리인산염 글루코키나아제에 의해 글루코오스 및 폴리인산나트륨으로부터 생산된다.

본 발명은 녹말, 셀룰로오스, 수크로오스 및 이들의 파생된 산물에서 당류, 예를 들면, 다당류 및 올리고당류를 알룰로스로 전환하기 위한 제법을 제공한다. 일정한 구체예에서, 무세포 효소 칵테일을 이용하여 녹말, 셀룰로오스, 수크로오스, 그리고 이들의 파생된 산물을 알룰로스로 전환하기 위한 인공 (비자연) ATP-없는 효소 경로가 제공된다.

앞서 밝힌 바와 같이, G1P 수율을 증가시키기 위해 여러 효소가 녹말을 가수분해하는데 이용될 수 있다. 이런 효소는 이소아밀라아제, 풀루라나아제 및 알파-아밀라아제를 포함한다. 옥수수 녹말은 αGP 작용을 방해하는 많은 분지를 내포한다. 이소아밀라아제는 녹말을 탈분지하여, 선형 아밀로덱스트린을 산출하는데 이용될 수 있다. 이소아밀라아제-선처리된 녹말은 최종 산물에서 더욱 높은 F6P 농도를 유발할 수 있다. 이소아밀라아제 및 풀루라나아제는 알파-1,6-글리코시드 결합을 개열하는데, 이것은 알파-글루칸 인산화효소에 의한 녹말의 더욱 완전한 분해를 허용한다. 알파-아밀라아제는 알파-1,4-글리코시드 결합을 개열하고, 이런 이유로 알파-아밀라아제는 알룰로스로의 더욱 빠른 전환을 위해 녹말을 단편으로 분해하는데 이용된다.

도면 2에서 도시된 바와 같이, 분해 산물 말토오스를 G1P 및 글루코오스로 가인산분해성으로 개열함으로써 말토오스 인산화효소 (MP)가 알룰로스 수율을 증가시키는데 이용될 수 있다. 대안으로, 분해 산물 글루코오스, 말토오스 및 말토트리오스를 더욱 긴 말토올리고당류로 재활용함으로써 4-글루칸 전달효소 (4GT)가 알룰로스 수율을 증가시키는데 이용될 수 있다; 이것은 αGP에 의해 가인산분해성으로 개열되어 G1P가 산출될 수 있다.

추가적으로, 셀룰로오스는 가장 풍부한 생물자원이고 식물 세포 벽의 주요 성분이다. 비-식품 리그노셀룰로오스 바이오매스는 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스 및 리그닌뿐만 아니라 다른 소수 성분을 내포한다. 아비셀 (미정질 셀룰로오스), 재생된 무정형 셀룰로오스, 세균 셀룰로오스, 필터 페이퍼 등을 비롯한 순수한 셀룰로오스는 일련의 처리를 통해 제조될 수 있다. 부분적으로 가수분해된 셀룰로오스 기질은 중합도가 7보다 큰 수불용성 셀로덱스트린, 3-6의 중합도를 갖는 수용성 셀로덱스트린, 셀로비오스, 글루코오스, 그리고 프룩토오스를 포함한다.

일정한 구체예에서, 셀룰로오스 및 이의 파생된 산물은 일련의 단계를 통해 알룰로스로 전환될 수 있다. 이런 제법의 실례는 도면 3에서 도시된다. 상기 제법은 다음의 단계를 수반하는 시험관내 합성 경로를 제공한다: 각각, 셀로덱스트린 인산화효소 (CDP) 및 셀로비오스 인산화효소 (CBP)에 의해 촉매됨으로써, G1P를 셀로덱스트린 및 셀로비오스 및 유리 인산염으로부터 산출하는 단계; PGM에 의해 촉매됨으로써, G1P를 G6P로 전환하는 단계; PGI에 의해 촉매됨으로써, G6P를 F6P로 전환하는 단계; A6PE에 의해 촉매됨으로써, F6P를 A6P로 전환하는 단계; 그리고 A6PP에 의해 촉매됨으로써, A6P를 알룰로스로 전환하는 단계. 이러한 제법에서, 인산염 이온은 셀로덱스트린 및 셀로비오스를 G1P로 전환하는 단계에 의해 재활용될 수 있다.

여러 효소가 고체 셀룰로오스를 수용성 셀로덱스트린 및 셀로비오스로 가수분해하는데 이용될 수 있다. 이런 효소는 엔도글루카나아제 및 셀로비오하이드롤라아제를 포함하지만, 베타-글루코시다아제 (셀로비아제)를 포함하지 않는다.

셀룰로오스 가수분해 및 G1P 산출에 앞서, 셀룰로오스 및 바이오매스는 그들의 반응성이 증가하고 셀룰로오스 사슬의 중합도가 감소하도록 선처리될 수 있다. 셀룰로오스 및 바이오매스 선처리 방법은 묽은 산 선처리, 셀룰로오스 용매-기초된 리그노셀룰로오스 분별, 암모니아 섬유 확대, 액상 암모니아 침지, 이온성 액체 처리, 그리고 염화수소산, 황산, 인산 및 이들의 조합을 비롯한 농축된 산을 이용함으로써 부분적으로 가수분해를 포함한다.

일부 구체예에서, 폴리인산염 및 폴리인산염 글루코키나아제 (PPGK)가 상기 제법에 추가될 수 있고, 따라서 도면 3에서 도시된 바와 같이, 분해 산물 글루코오스를 G6P로 인산화함으로써 알룰로스의 수율을 증가시킬 수 있다.

다른 구체예에서, 알룰로스는 글루코오스로부터 산출될 수 있다. 이런 제법의 실례는 도면 5에서 도시된다. 상기 제법은 폴리인산염 글루코키나아제 (PPGK)에 의해 촉매됨으로써, G6P를 글루코오스 및 폴리인산염으로부터 산출하는 단계; PGI에 의해 촉매됨으로써, G6P를 F6P로 전환하는 단계; 효소에 의해 촉매됨으로써, F6P를 A6P로 전환하는 단계; 그리고 A6PP에 의해 촉매됨으로써, A6P를 알룰로스로 전환하는 단계를 수반한다.

당해 분야에서 공지된 임의의 적합한 생물학적 완충액, 예를 들면, HEPES, PBS, BIS-TRIS, MOPS, DIPSO, 트리즈마 등이 본 발명의 제법에서 이용될 수 있다. 모든 구체예에 대한 반응 완충액은 5.0-8.0 범위의 pH를 가질 수 있다. 더욱 바람직하게는, 반응 완충액 pH는 약 6.0 내지 약 7.3의 범위일 수 있다. 가령, 반응 완충액 pH는 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 또는 7.3일 수 있다.

반응 완충액은 또한, 핵심 금속 양이온을 내포할 수 있다. 금속 이온의 실례는 Mg²⁺, Co²⁺ 및 Zn²⁺를 포함한다.

제법 단계가 수행되는 반응 온도는 37-85℃의 범위일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 이들 단계는 약 40℃ 내지 약 70℃ 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 온도는 예로서, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 또는 약 60℃일 수 있다. 바람직하게는, 반응 온도는 약 50℃이다.

개시된 제법의 반응 시간은 필요에 따라 조정될 수 있고, 그리고 약 8 시간 내지 약 48 시간의 범위일 수 있다. 가령, 반응 시간은 약 16 시간, 약 18 시간, 약 20 시간, 약 22 시간, 약 24 시간, 약 26 시간, 약 28 시간, 약 30 시간, 약 32 시간, 약 34 시간, 약 36 시간, 약 38 시간, 약 40 시간, 약 42 시간, 약 44 시간, 약 46 시간, 또는 약 48 시간일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 반응 시간은 약 24 시간이다.

본 발명에 따른 제법은 전체 반응에 대한 매우 유리한 평형 상수로 인해 높은 수율을 달성할 수 있다. 이론적으로, 만약 시작 물질이 중간체로 완전히 전환된다면, 99% 수율까지 달성될 수 있다.

본 발명의 제법은 저렴한 시작 물질을 이용하고, 그리고 공급원료 및 산물 분리와 연관된 비용을 감소시킴으로써 생산 비용을 낮춘다. 녹말, 셀룰로오스, 수크로오스 및 이들의 유도체 중에서 일부는 예로서, 프룩토오스보다 덜 비싼 공급원료이다. 알룰로스가 프룩토오스로부터 생산될 때, 수율이 본 발명에서보다 낮고, 그리고 알룰로스가 크로마토그래피를 통해 프룩토오스로부터 분리되어야 하는데, 이것은 더욱 높은 생산 비용을 야기한다.

또한, 본 발명에 따른 A6P를 알룰로스로 전환하는 단계는 공급원료와 상관없이, 비가역적 포스파타아제 반응이다. 이런 이유로, 차후 산물 분리 비용을 효과적으로 최소화하면서, 알룰로스가 매우 높은 수율로 생산된다.

세포-기초된 제조 방법과 대조적으로, 본 발명은 알룰로스의 무세포 제조를 수반하고, 세포막의 제거로 인해 상대적으로 높은 반응 속도를 갖는데, 이것은 종종, 세포 내외로 기질/산물의 수송의 속도를 늦춘다. 이것은 또한, 영양소-풍부한 발효 배지/세포 대사산물이 없는 최종 산물을 갖는다.

실시예

재료와 방법

화학물질

옥수수 녹말, 가용성 녹말, 말토덱스트린, 말토오스, 글루코오스, 필터 페이퍼를 비롯한 모든 화학물질은 시약 등급 또는 그 이상이고, 그리고 달리 언급되지 않으면, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 또는 Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)으로부터 구입되었다. 제한 효소, T4 리가아제 및 Phusion DNA 중합효소는 New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)로부터 구입되었다. 올리고뉴클레오티드는 Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA) 또는 Eurofins MWG Operon (Huntsville, AL, USA)에 의해 합성되었다. 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 1은 써모언에어로박테리움 써모싸카롤리티쿰 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum) (UNIPROT ID D9TQJ4)으로부터 고온성 A6PE를 인코딩한다. 서열 번호 2는 상기 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화된 버전이다. 서열 번호 3은 상기 효소에 대한 아미노산 서열이다. 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 4는 바실루스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) (UNIPROT ID A0A090IXZ8)로부터 고온성 A6PE를 인코딩한다. 서열 번호 5는 상기 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화된 버전이다. 서열 번호 6은 상기 효소에 대한 아미노산 서열이다. 뉴클레오티드 서열, 서열 번호 7은 클로스트리듐 써모셀룸 (Clostridium thermocellum) (UNIPROT ID A3DC21)으로부터 고온성 A6PP를 인코딩한다. 서열 번호 8은 상기 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화된 버전이다. 서열 번호 9는 상기 효소에 상응하는 아미노산 서열이다. 효소 정제에서 이용되는 재생된 무정형 셀룰로오스는 Ye et al., Fusion of a family 9 cellulose-binding module improves catalytic potential of Clostridium thermocellum cellodextrin phosphorylase on insoluble cellulose. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011; 92:551-560에서 설명된 바와 같이, 아비셀 PH105 (FMC BioPolymer, Philadelphia, PA, USA)의 용해 및 재생을 통해 이것으로부터 제조되었다. 대장균 (Escherichia coli) Sig10 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 DNA 조작을 위한 숙주 세포로서 이용되었고, 그리고 대장균 (E. coli) BL21 (DE3) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 재조합 단백질 발현을 위한 숙주 세포로서 이용되었다. 100 mg L^-1 암피실린 또는 50 mg L^-1 카나마이신을 포함하는 ZYM-5052 배지가 대장균 (E. coli) 세포 성장 및 재조합 단백질 발현에 이용되었다. 트리코더마 레세이 (Trichoderma reesei)로부터 셀룰라아제 (카탈로그 번호：C2730) 및 풀루라나아제 (카탈로그 번호：P1067)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)으로부터 구입되고 Novozymes (Franklinton, NC, USA)에 의해 생산되었다. 말토오스 인산화효소 (카탈로그 번호：M8284)는 Sigma-Aldrich로부터 구입되었다.

재조합 효소의 생산 및 정제

단백질 발현 플라스미드를 품는 대장균 (E. coli) BL21 (DE3) 균주는 100 mg L^-1 암피실린 또는 50 mg L^-1 카나마이신을 내포하는 100 mL의 ZYM-5052 배지를 갖는 1-L Erlenmeyer 플라스크에서 배양되었다. 세포는 220 rpm에서 16-24 시간 동안 회전 진탕하면서 30℃에서 성장되었다. 이들 세포는 12℃에서 원심분리에 의해 수확되고, 그리고 50 mM NaCl 및 5 mM MgCl₂ (열 침전 및 셀룰로오스-결합 모듈)을 내포하는 20 mM HEPES (pH 7.5) 또는 300 mM NaCl 및 5 mM 이미다졸 (Ni 정제)을 내포하는 20 mM HEPES (pH 7.5)로 1회 세척되었다. 세포 펠렛은 동일한 완충액에서 재현탁되고, 그리고 초음파처리 (Fisher Scientific 음파 파쇄기 모형 500; 5 s 펄스 온 및 10 s 오프, 50% 진폭에서 총 21 분)에 의해 용해되었다. 원심분리 후, 상층액 내에 표적 단백질이 정제되었다.

3가지 접근법이 다양한 재조합 단백질을 정제하는데 이용되었다. His-태깅된 단백질은 Profinity IMAC Ni-하전된 수지 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 의해 정제되었다. 셀룰로오스-결합 모듈 (CBM) 및 자가-개열 인테인을 내포하는 융합 단백질은 큰 표면적 재생된 무정형 셀룰로오스에서 높은 친화성 흡착을 통해 정제되었다. 70-95℃에서 5-30 분 동안 열 침전이 초내열성 효소를 정제하는데 이용되었다. 재조합 단백질의 순도는 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기이동 (SDS-PAGE)에 의해 조사되었다. A6PE는 성장 배지, 용리 완충액, 투석 완충액 및 단백질 저장 완충액 내에 존재하는 80 μM CoCl₂로 정제되었다.

이용된 효소 및 이들의 활성 검정

써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima) (UNIPROT ID G4FEH8)로부터 알파-글루칸 인산화효소 (αGP)가 이용되었다. 활성은 1 mM MgCl₂, 5 mM DTT 및 30 mM 말토덱스트린을 내포하는 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.2)에서 50℃에서 검정되었다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO) (Vivaproducts, Inc., Littleton, MA, USA)로 효소의 여과를 통해 중지되었다. 글루코오스 1-인산염 (G1P)은 25 U/mL 포도당인산무타아제로 보충된 글루코오스 헥소키나아제/G6PDH 검정 키트 (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 GAHK20-1KT)를 이용하여 계측되었다. 단위 (U)는 μmol/분으로서 설명된다.

써모코쿠스 코다카렌시스 (Thermococcus kodakaraensis) (UNIPROT ID Q68BJ6)로부터 포도당인산무타아제 (PGM)가 이용되었다. 활성은 5 mM MgCl₂ 및 5 mM G1P를 내포하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2)에서 50℃에서 계측되었다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)로 효소의 여과를 통해 중지되었다. 산물 글루코오스 6-인산염 (G6P)은 헥소키나아제/G6PDH 검정 키트 (Sigma Aldrich, 카탈로그 번호 GAHK20-1KT)를 이용하여 결정되었다.

포도당인산이성화효소 (PGI)의 2가지 상이한 공급원이 클로스트리듐 써모셀룸 (Clostridium thermocellum) (UNIPROT ID A3DBX9) 및 써무스 써모필러스 (Thermus thermophilus) (UNIPROT ID Q5SLL6)로부터 이용되었다. 활성은 5 mM MgCl₂ 및 10 mM G6P를 내포하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2)에서 50℃에서 계측되었다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)로 효소의 여과를 통해 중지되었다. 산물, 프룩토오스 6-인산염 (F6P)은 프룩토오스 6-인산염 키나아제 (F6PK)/피루브산염 탈수소효소 (PK)/유산 탈수소효소 (LD) 연계된 효소 검정을 이용하여 결정되었는데, 여기서 340 nm에서 흡광도에서 감소는 F6P의 생산을 지시한다. 이러한 200 μL 반응물은 50 mM HEPES (pH 7.2), 5 mM MgCl₂, 10 mM G6P, 1.5 mM ATP, 1.5 mM 포스포에놀 피루브산염, 200 μM NADH, 0.1 U PGI, 5 U PK, 그리고 5 U LD를 내포하였다.

써모언에어로박테리움 써모싸카롤리티쿰 (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum) (UNIPROT ID D9TQJ4)으로부터 알룰로스 6-인산염 3-입체이성체효소 (A6PE), 서열 번호 3이 이용되었다. 활성은 5 mM MgCl₂, 80 μM CoCl₂, 1 U/mL A6PP 및 10 mM F6P를 내포하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2)에서 50℃에서 계측되었다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)로 효소의 여과를 통해 중지되었다. 산물, 알룰로스 6-인산염 (A6P)은 알룰로스 6-인산염 포스파타아제를 이용하고 유리 인산염 방출을 검출함으로써 결정되었다. 유리 인산염 방출을 검출하기 위해, 0.1 M 아연 아세트산염 및 2 mM 암모늄 몰리브덴산염 (pH 5)을 내포하는 500 μL의 용액이 50 μL의 반응물에 추가되었다. 이것은 혼합되고, 그리고 125 μL의 5% 아스코르빈산 (pH 5)이 뒤이어 추가되었다. 이러한 용액은 혼합되고, 이후 30℃에서 20 분 동안 항온처리되었다. 유리 인산염 방출을 결정하기 위해 850 nm에서 흡광도가 판독되었다.

클로스트리듐 써모셀룸 (Clostridium thermocellum) (UNIPROT ID A3DC21)으로부터 알룰로스 6-인산염 포스파타아제 (A6PP), 서열 번호 9가 이용되었다. 활성은 5 mM MgCl₂, 80 μM CoCl₂, 1 U/mL A6PE 및 10 mM F6P를 내포하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2)에서 50℃에서 계측되었다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)로 효소의 여과를 통해 중지되었다. 산물, 알룰로스는 A6PE에 대해 설명된 바와 같이, 유리 인산염 방출을 검출함으로써 결정되었다.

클로스트리듐 써모셀룸 (C. thermocellum)으로부터 재조합 셀로덱스트린 인산화효소 및 셀로비오스 인산화효소는 Ye et al. Spontaneous high-yield production of hydrogen from cellulosic materials and water catalyzed by enzyme cocktails. ChemSusChem 2009; 2:149-152에서 설명된다. 이들의 활성은 설명된 바와 같이 검정되었다.

써모비피다 푸스카 (Thermobifida fusca) YX로부터 재조합 폴리인산염 글루코키나아제는 Liao et al., One-step purification and immobilization of thermophilic polyphosphate glucokinase from Thermobifida fusca YX: glucose-6-phosphate generation without ATP. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012; 93:1109-1117에서 설명된다. 이의 활성은 설명된 바와 같이 검정되었다.

술포로부스 토코다이이 (Sulfolobus tokodaii)로부터 재조합 이소아밀라아제는 Cheng et al., Doubling power output of starch biobattery treated by the most thermostable isoamylase from an archaeon Sulfolobus tokodaii. Scientific Reports 2015; 5:13184에서 설명된다. 이의 활성은 설명된 바와 같이 검정되었다.

써모코쿠스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis)로부터 재조합 4-알파-글루칸전달효소는 Jeon et al. 4-α-Glucanotransferase from the Hyperthermophilic Archaeon Thermococcus Litoralis. Eur. J. Biochem. 1997; 248:171-178에서 설명된다. 이의 활성은 설명된 바와 같이 계측되었다.

칼디트릭스 아비씨 (Caldithrix abyssi) (UNIPROT H1XT50)로부터 수크로오스 인산화효소가 이용되었다. 이의 활성은 10 mM 수크로오스 및 12 mM 유기 인산염을 내포하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.5)에서 계측되었다. 글루코오스 1-인산염 (G1P)은 알파-글루칸 인산화효소에서처럼, 25 U/mL 포도당인산무타아제로 보충된 글루코오스 헥소키나아제/G6PDH 검정 키트를 이용하여 계측되었다.

아래의 각 실시예에서 이용되는 효소 단위는 필요에 따라, 반응 시간을 조정하기 위해 증가되거나 또는 감소될 수 있다. 가령, 만약 실시예 9를 24 시간 대신에 8 시간 동안 수행하는 것이 요망되면, 이들 효소의 단위는 약 3-배 증가될 것이다. 반대로, 만약 실시예 9를 24 시간 대신에 48 시간 동안 수행하는 것이 요망되면, 효소 단위는 약 2-배 감소될 수 있었다. 이들 실시예는 일정한 생산성을 유지하면서 반응 시간을 증가시키거나 또는 감소시키기 위해, 효소 단위의 양이 어떻게 이용될 수 있는 지를 예시한다.

실시예 1

녹말로부터 프룩토오스 6-인산염의 효소적 생합성의 기술적인 실행가능성을 검증하기 위해, 3가지 효소가 재조합적으로 발현되었다: 써모토가 마리티마 (T. maritima) (UNIPROT ID G4FEH8)로부터 알파-글루칸 인산화효소, 써모코쿠스 코다카렌시스 (Thermococcus kodakaraensis) (UNIPROT ID Q68BJ6)로부터 포도당인산무타아제, 그리고 클로스트리듐 써모셀룸 (Clostridium thermocellum) (UNIPROT ID A3DBX9)으로부터 포도당인산이성화효소. 이들 재조합 단백질은 대장균 (E. coli) BL21 (DE3)에서 과다발현되고 전술된 바와 같이 정제되었다.

10 g/L 가용성 녹말, 50 mM 인산염 완충된 식염수 pH 7.2, 5 mM MgCl₂, 0.5 mM ZnCl₂,0.01 U의 αGP, 0.01 U PGM, 그리고 0.01 U PGI를 내포하는 0.20 mL 반응 혼합물은 50℃에서 24 시간 동안 항온처리되었다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)로 효소의 여과를 통해 중지되었다. 산물, 프룩토오스 6-인산염 (F6P)은 프룩토오스 6-인산염 키나아제 (F6PK)/피루브산염 탈수소효소 (PK)/유산 탈수소효소 (LD) 연계된 효소 검정을 이용하여 결정되었는데, 여기서 340 nm에서 흡광도에서 감소는 전술된 바와 같이, F6P의 생산을 지시한다. 24 시간 후 F6P의 최종 농도는 3.6 g/L이었다.

실시예 2

실시예 1에서와 동일한 검사 (반응 온도 이외에)가 40 내지 80℃에서 실행되었다. 10 g/L 가용성 녹말은 40 시간 반응 후 40℃에서 0.9 g/L F6P 및 80℃에서 3.6 g/L F6P를 생산하는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 효소의 이러한 세트에 대한 반응 온도를 증가시키는 것이 F6P 수율을 증가시키긴 하지만, 너무 높은 온도는 일부 효소 활성을 손상시킬 수 있다는 것을 암시한다.

실시예 3

80℃에서, 대략 1:1:1의 αGP: PGM: PGI의 효소 단위 비율은 빠른 F6P 산출을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 만약 반응 시간이 충분히 길면, 효소 비율은 최종 F6P 농도에 별다른 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다. 하지만, 효소 비율은 반응 속도 및 시스템에서 이용되는 효소의 전체 비용에 영향을 준다.

실시예 4

10 g/L 말토덱스트린, 50 mM 인산염 완충된 식염수 pH 7.2, 5 mM MgCl₂, 0.5 mM ZnCl₂,0.01 U의 αGP, 0.01 U PGM, 그리고 0.01 U PGI를 내포하는 0.20 mL 반응 혼합물은 50℃에서 24 시간 동안 항온처리되었다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)로 효소의 여과를 통해 중지되었다. 산물, 프룩토오스 6-인산염 (F6P)은 프룩토오스 6-인산염 키나아제 (F6PK)/피루브산염 탈수소효소 (PK)/유산 탈수소효소 (LD) 연계된 효소 검정을 이용하여 결정되었는데, 여기서 340 nm에서 흡광도에서 감소는 전술된 바와 같이, F6P의 생산을 지시한다. 24 시간 후 F6P의 최종 농도는 3.6 g/L이었다.

실시예 5

아비셀로부터 F6P 생산을 검사하기 위해, Sigma 셀룰라아제가 50℃에서 셀룰로오스를 가수분해하는데 이용되었다. 상업적인 셀룰라아제로부터 베타-글루코시다아제를 제거하기 위해, 10 필터 페이퍼 단위/mL의 셀룰라아제가 얼음-수조에서 10 분 동안 10 g/L 아비셀에 혼합되었다. 4℃에서 원심분리 후, 베타-글루코시다아제를 내포하는 상층액은 옮겨 부어졌다. 엔도글루카나아제 및 셀로비오하이드롤라아제를 내포하는 셀룰라아제와 결합된 아비셀은 50℃에서 3 일 동안 가수분해를 위해 구연산염 완충액 (pH 4.8)에서 재현탁되었다. 셀룰로오스 가수분해물은 10 mM 인산염, 5 mM MgCl₂ 및 0.5 mM ZnCl₂를 내포하는 100 mM HEPES 완충액 (pH 7.2)에서 5 U/mL 셀로덱스트린 인산화효소, 5 U/L 셀로비오스 인산화효소, 5 U/mL의 αGP, 5 U/mL PGM, 그리고 5 U/mL PGI와 혼합되었다. 반응은 60℃에서 72 시간 동안 수행되었고, 그리고 높은 농도의 F6P가 발견되었다 (미량의 글루코오스 및 셀로비오스 없음). F6P는 전술된 연계된 효소 검정을 이용하여 검출되었다. 글루코오스는 전술된 바와 같이, 헥소키나아제/G6PDH 검정 키트를 이용하여 검출되었다.

실시예 6

아비셀로부터 F6P 수율을 증가시키기 위해, 아비셀은 Zhang et al. A transition from cellulose swelling to cellulose dissolution by o-phosphoric acid: evidence from enzymatic hydrolysis and supramolecular structure. Biomacromolecules 2006; 7:644-648에서 설명된 바와 같이, 무정형 셀룰로오스 (RAC)를 생산하기 위한 농축된 인산으로 선처리되었다. 상업적인 셀룰라아제로부터 베타-글루코시다아제를 제거하기 위해, 10 필터 페이퍼 단위/mL의 셀룰라아제가 얼음-수조에서 5 분 동안 10 g/L RAC와 혼합되었다. 4℃에서 원심분리 후, 베타-글루코시다아제를 내포하는 상층액은 옮겨 부어졌다. 엔도글루카나아제 및 셀로비오하이드롤라아제를 내포하는 셀룰라아제와 결합된 RAC는 50℃에서 12 시간 동안 가수분해를 위해 구연산염 완충액 (pH 4.8)에서 재현탁되었다. RAC 가수분해물은 10 mM 인산염, 5 mM MgCl₂ 및 0.5 mM ZnCl₂를 내포하는 100 mM HEPES 완충액 (pH 7.2)에서 5 U/mL 셀로덱스트린 인산화효소, 5 U/L 셀로비오스 인산화효소, 5 U/mL의 αGP, 5 U/mL PGM, 그리고 5 U/mL PGI와 혼합되었다. 반응은 60℃에서 72 시간 동안 수행되었다. 글루코오스를 F6P로 전환하기 위한 어떤 효소도 추가되지 않았기 때문에, 높은 농도의 F6P와 글루코오스가 회수되었다. F6P는 전술된 연계된 효소 검정을 이용하여 검출되었다. 글루코오스는 전술된 바와 같이, 헥소키나아제/G6PDH 검정 키트를 이용하여 검출되었다.

실시예 7

RAC로부터 F6P 수율을 더욱 증가시키기 위해, 폴리인산염 글루코키나아제 및 폴리인산염이 추가되었다. 상업적인 셀룰라아제로부터 베타-글루코시다아제를 제거하기 위해, 10 필터 페이퍼 단위/mL의 셀룰라아제가 얼음-수조에서 5 분 동안 10 g/L RAC와 혼합되었다. 4℃에서 원심분리 후, 베타-글루코시다아제를 내포하는 상층액은 옮겨 부어졌다. 엔도글루카나아제 및 셀로비오하이드롤라아제를 내포하는 셀룰라아제와 결합된 RAC는 50℃에서 가수분해를 위해 구연산염 완충액 (pH 4.8)에서 재현탁되었고 50℃에서 12 시간 동안 가수분해를 위해 구연산염 완충액 (pH 4.8)에서 항온처리되었다. RAC 가수분해물은 50 mM 폴리인산염, 10 mM 인산염, 5 mM MgCl₂ 및 0.5 mM ZnCl₂를 내포하는 100 mM HEPES 완충액 (pH 7.2)에서 5 U/mL 폴리인산염 글루코키나아제, 5 U/mL 셀로덱스트린 인산화효소, 5 U/mL 셀로비오스 인산화효소, 5 U/mL의 αGP, 5 U/mL PGM, 그리고 5 U/mL PGI와 혼합되었다. 반응은 50℃에서 72 시간 동안 수행되었다. F6P가 높은 농도로 발견되었고, 단지 미량의 글루코오스만 이제 존재하였다. F6P는 전술된 연계된 효소 검정을 이용하여 검출되었다. 글루코오스는 전술된 바와 같이, 헥소키나아제/G6PDH 검정 키트를 이용하여 검출되었다.

실시예 8

F6P로부터 알룰로스 생산을 검증하기 위해, 2 g/L F6P가 5 mM MgCl₂및 80 μM CoCl₂를 내포하는 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.2)에서 1 U/ml A6PE 및 1 U/ml A6PP와 혼합되었다. 반응물은 50℃에서 6 시간 동안 항온처리되었다. F6P의 알룰로스로의 99% 전환이 Agilent Hi-Plex H-칼럼 및 굴절률 검출기를 이용한 HPLC (Agilent 1100 시리즈)를 통해 목격되었다. 표본은 5 mM H₂SO₄에서 0.6 mL/분으로 이동되었다.

실시예 9

말토덱스트린으로부터 알룰로스의 생산을 검증하기 위해, 20 g/L 말토덱스트린, 50 mM 인산염 완충된 식염수 pH 7.2, 5 mM MgCl₂, 80 μM CoCl₂,0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U A6PE 및 0.05 U A6PP를 내포하는 0.20 mL 반응 혼합물이 50℃에서 24 시간 동안 항온처리된다. 반응은 Vivaspin 2 농축기 (10,000 MWCO)로 효소의 여과를 통해 중지된다. 알룰로스는 굴절률 검출기 및 Agilent Hi-Plex H-칼럼이 구비된 Agilent 1100 시리즈 HPLC를 이용하여 검출되고 정량된다. 이동상은 5 mM H₂SO₄인데, 이것은 0.6 mL/분으로 이동한다. 알룰로스의 다양한 농도의 표준이 우리의 수율을 정량하는데 이용된다.

실시예 10

200 g/L 말토덱스트린, 10 mM 아세트산염 완충액 (pH 5.5), 5 mM MgCl₂, 80 μM CoCl₂, 그리고 0.1 g/L 이소아밀라아제를 내포하는 반응 혼합물은 80℃에서 24 시간 동안 항온처리된다. 이것은 20 g/L 이소아밀라아제 처리된 말토덱스트린, 50 mM 인산염 완충된 식염수 pH 7.2, 5 mM MgCl₂,0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U A6PE, 그리고 0.05 U A6PP를 내포하는 다른 반응 혼합물을 창출하는데 이용되고 50℃에서 24 시간 동안 배양된다. 알룰로스의 생산은 실시예 9에서처럼 정량된다.

실시예 11

200 g/L 말토덱스트린, 10 mM 아세트산염 완충액 (pH 4.5), 5 mM MgCl₂, 그리고 Novozymes D6 풀루라나아제의 1:200 희석액을 내포하는 반응 혼합물은 50℃에서 4 시간 동안 항온처리된다. 이것은 20 g/L 풀루라나아제 처리된 말토덱스트린, 50 mM 인산염 완충된 식염수 pH 7.2, 5 mM MgCl₂,80 μM CoCl₂, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U A6PE, 그리고 0.05 U A6PP를 내포하는 다른 반응 혼합물을 창출하는데 이용되고 50℃에서 24 시간 동안 항온처리된다. 알룰로스의 생산은 실시예 9에서처럼 정량된다.

실시예 12

말토덱스트린으로부터 알룰로스 수율을 더욱 증가시키기 위해, 0.05 U 4-글루칸 전달효소 (4GT)가 실시예 9에서 설명된 반응물에 추가된다.

20 g/L 이소아밀라아제 처리된 말토덱스트린 (실시예 9 참조), 50 mM 인산염 완충된 식염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 80 μM CoCl₂, 0.05 U의 αGP, 0.05 U PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U A6PE, 0.05 U A6PP, 그리고 0.05 U 4GT를 내포하는 0.2 mL 반응 혼합물은 50℃에서 24 시간 동안 항온처리된다. 알룰로스의 생산은 실시예 9에서처럼 정량된다.

실시예 13

인산염 완충된 식염수 (PBS)의 농도 범위를 결정하기 위해, 50 g/L 말토덱스트린; 6.25 mM, 12.5 mM, 25 mM, 37.5 mM, 또는 50 mM 인산염 완충된 식염수 pH 7.2; 5 mM MgCl2; 0.1 U의 aGP; 0.1 U PGM; 및 0.1 U PGI를 내포하는 0.20 mL 반응 혼합물은 50℃에서 6 시간 동안 항온처리된다. 이러한 짧은 지속 기간은 완결이 도달되지 않도록 담보하고, 그리고 이런 이유로, 효율에서 차이가 명백히 목격될 수 있다. F6P의 생산은 프룩토오스 6-인산염 키나아제 (F6PK)/피루브산염 탈수소효소 (PK)/유산 탈수소효소 (LD) 연계된 효소 검정을 이용하여 정량되는데, 여기서 340 nm에서 흡광도에서 감소는 F6P의 생산을 지시한다. 6.25 mM, 12.5 mM, 25 mM, 37.5 mM, 또는 50 mM 인산염 완충된 식염수 pH 7.2를 내포하는 반응물에 대해 각각, 4.5 g/L, 5.1 g/L, 5.6 g/L, 4.8 g/L, 또는 4.9 g/L F6P의 수율이 획득된다 (표 1). 이들 결과는 25 mM PBS pH 7.2의 농도가 이들 특정 반응 조건에 대해 이상적이라는 것을 지시한다. 심지어 pH 7.2에서 6.25 mM PBS의 이용도 인산염 재활용에 기인한 유의미한 전환을 유발한다는 점에 주목하는 것이 중요하다. 이것은 개시된 인산염 재활용 방법이 심지어 산업 수준의 부피 생산성 (가령, 200-300 g/L 말토덱스트린)에서도 인산염 수준을 낮게 유지할 수 있다는 것을 보여준다.

PBS pH 7.2 (mM)의 농도	F6P의 g/L
6.25	4.5
12.5	5.1
25	5.6
37.5	4.8
50	4.9

실시예 14

단계적 연쇄반응의 pH 범위를 결정하기 위해, 50 g/L 말토덱스트린; 50 mM 인산염 완충된 식염수 pH 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0 7.2, 또는 7.3; 5 mM MgCl2; 0.02 U의 αGP; 0.02 U PGM; 및 0.02 U PGI를 내포하는 0.20 mL 반응 혼합물은 50℃에서 16 시간 동안 항온처리된다. 이들 단위는 완결이 도달되지 않도록 담보하기 위해 낮아지고, 그리고 이런 이유로, 효율에서 차이가 명백히 목격될 수 있다. F6P의 생산은 실시예 12에서처럼 정량된다. pH 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 또는 7.3에서 50 mM 인산염 완충된 식염수를 내포하는 반응물에 대해 각각, 4.0 g/L, 4.1 g/L 4.2 g/L, 4.1 g/L, 4.4 g/L, 4.1 g/L, 3.8 g/L 또는 4.0 g/L F6P의 수율이 획득되었다 (표 2). 이들 결과는 비록 상기 시스템이 넓은 pH 범위에 걸쳐 작동하긴 하지만, 6.8의 pH가 이들 특정 반응 조건에 대해 이상적이라는 것을 지시한다.

PBS의 pH	F6P의 g/L
6.0	4.0
6.2	4.1
6.4	4.2
6.6	4.1
6.8	4.4
7.0	4.1
7.2	3.8
7.3	4.0

실시예 15

정률증가를 조사하기 위해, 50 g/L 이소아밀라아제 처리된 말토덱스트린 (실시예 10 참조), 50 mM 인산염 완충된 식염수 pH 7.2, 5 mM MgCl2, 80 μM CoCl₂, 10 U의 αGP, 10 U PGM, 10 U PGI, 10 U A6PE, 그리고 10 U A6PP를 내포하는 20 mL 반응 혼합물은 50℃에서 24 시간 동안 항온처리된다. 알룰로스의 생산은 실시예 9에서처럼 정량되었다.

실시예 16

말토덱스트린으로부터 알룰로스 수율을 더욱 증가시키기 위해, 0.05 U 말토오스 인산화효소가 실시예 9에서 설명된 반응물에 추가된다.

실시예 17

말토덱스트린으로부터 알룰로스 수율을 더욱 증가시키기 위해, 0.05 U 폴리인산염 글루코키나아제 및 75 mM 폴리인산염이 실시예 9에서 설명된 반응물에 추가된다.

실시예 18

프룩토오스로부터 알룰로스를 생산하기 위해, 10 g/L 프룩토오스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리인산염, 5 mM MgCl2, 80 μM CoCl₂, 0.05 U 프룩토오스 폴리인산염 키나아제, 0.05 U A6PE, 그리고 0.05 U A6PP를 내포하는 반응 혼합물은 50℃에서 24 시간 동안 항온처리된다. 알룰로스의 생산은 실시예 9에서처럼 정량된다.

실시예 19

글루코오스로부터 알룰로스를 생산하기 위해, 10 g/L 글루코오스, 50 mM Tris 완충액 pH 7.0, 75 mM 폴리인산염, 5 mM MgCl2, 80 μM CoCl₂, 0.05 U 글루코오스 폴리인산염 키나아제, 0.05 U PGI, 0.05 U A6PE, 그리고 0.05 U A6PP를 내포하는 반응 혼합물은 50℃에서 24 시간 동안 항온처리된다. 알룰로스의 생산은 실시예 9에서처럼 정량된다.

실시예 20

수크로오스로부터 알룰로스를 생산하기 위해, 10 g/L 수크로오스, 50 mM 인산염 완충된 식염수 pH 7.0, 5 mM MgCl2, 80 μM CoCl₂, 0.05 U 수크로오스 인산화효소, 0.05 PGM, 0.05 U PGI, 0.05 U A6PE, 그리고 0.05 U A6PP를 내포하는 반응 혼합물은 50℃에서 24 시간 동안 항온처리된다. 알룰로스의 생산은 실시예 9에서처럼 정량된다.

실시예 21

수크로오스로부터 알룰로스의 수율을 더욱 증가시키기 위해, 75 mM 폴리인산염 및 0.05 폴리인산염 프럭토키나아제가 실시예 20에서 반응 혼합물에 추가된다. 알룰로스의 생산은 실시예 9에서처럼 정량된다.

SEQUENCE LISTING <110> BONUMOSE LLC <120> ENZYMATIC PRODUCTION OF D-ALLULOSE <130> 146.0003-WO00 <140> PCT/US17/66298 <141> 2017-12-14 <150> 62/434,033 <151> 2016-12-14 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 663 <212> DNA <213> Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum <400> 1 atgaaatatt tattttcgcc atctttaatg tgtatgaatt taatcaagct aaatgaacaa 60 atatctgttc ttaatagcaa ggcggatttt ttgcatgttg acatcatgga tggccatttt 120 gttaaaaata ttactttatc accgtttttt atagagcaga ttaaatcata tgtcaatatt 180 cctattgatg cacaccttat ggtagaaaat ccaggtgatt atattgaaat atgcgaaaaa 240 tcgggagcaa gttttataac tatacatgca gaaacaatta atagagaagc atttagaata 300 atagatagaa ttaaaagtca tggactcatg gttggcatag cattgaatcc agcaacacct 360 atttcggaaa ttaaacatta tattaataaa atagataaga taacaataat gactgtcgat 420 cccggcttcg ctggtcaacc atttattccg gaggtattgg aaaagatccg agatctaaag 480 agactgaaag atgataataa ttataattat ttaattgaag cagatggttc ctgcaataaa 540 aatacgtttc aagtgctaaa agatgccgga tgtaaagttt tcgtattagg ttcatcaggg 600 ctttttaatc ttagcgatga tttgggaaaa gcgtgggaaa taatgattgg caattttaat 660 gga 663 <210> 2 <211> 663 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum A6PE <400> 2 atgaagtacc tgtttagccc gagcctgatg tgcatgaatc tgattaagct gaatgaacag 60 attagcgttc tgaatagcaa agccgatttt ctgcatgttg atattatgga tggtcatttt 120 gttaagaaca tcaccctgag cccgtttttc attgaacaga ttaagagcta tgtgaatatc 180 ccgattgatg cccatctgat ggtggaaaat ccgggtgact atattgaaat ttgtgaaaaa 240 agcggcgcaa gttttattac cattcatgcc gaaaccatta atcgtgaagc atttcgtatt 300 attgaccgta ttaagagtca tggtctgatg gtgggcattg cactgaatcc ggccaccccg 360 attagcgaaa ttaagcatta tattaacaag atcgacaaga tcaccattat gaccgttgat 420 ccgggctttg caggccagcc gtttattccg gaagtgctgg aaaaaattcg cgatctgaaa 480 cgtctgaaag atgataataa ttacaactac ctgatcgaag ccgatggtag ttgcaataag 540 aatacctttc aggttctgaa agatgcaggc tgcaaagttt ttgtgctggg cagtagcggt 600 ctgtttaatc tgagtgatga tctgggcaaa gcatgggaaa ttatgattgg caattttaat 660 ggc 663 <210> 3 <211> 221 <212> PRT <213> Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum <400> 3 Met Lys Tyr Leu Phe Ser Pro Ser Leu Met Cys Met Asn Leu Ile Lys 1 5 10 15 Leu Asn Glu Gln Ile Ser Val Leu Asn Ser Lys Ala Asp Phe Leu His 20 25 30 Val Asp Ile Met Asp Gly His Phe Val Lys Asn Ile Thr Leu Ser Pro 35 40 45 Phe Phe Ile Glu Gln Ile Lys Ser Tyr Val Asn Ile Pro Ile Asp Ala 50 55 60 His Leu Met Val Glu Asn Pro Gly Asp Tyr Ile Glu Ile Cys Glu Lys 65 70 75 80 Ser Gly Ala Ser Phe Ile Thr Ile His Ala Glu Thr Ile Asn Arg Glu 85 90 95 Ala Phe Arg Ile Ile Asp Arg Ile Lys Ser His Gly Leu Met Val Gly 100 105 110 Ile Ala Leu Asn Pro Ala Thr Pro Ile Ser Glu Ile Lys His Tyr Ile 115 120 125 Asn Lys Ile Asp Lys Ile Thr Ile Met Thr Val Asp Pro Gly Phe Ala 130 135 140 Gly Gln Pro Phe Ile Pro Glu Val Leu Glu Lys Ile Arg Asp Leu Lys 145 150 155 160 Arg Leu Lys Asp Asp Asn Asn Tyr Asn Tyr Leu Ile Glu Ala Asp Gly 165 170 175 Ser Cys Asn Lys Asn Thr Phe Gln Val Leu Lys Asp Ala Gly Cys Lys 180 185 190 Val Phe Val Leu Gly Ser Ser Gly Leu Phe Asn Leu Ser Asp Asp Leu 195 200 205 Gly Lys Ala Trp Glu Ile Met Ile Gly Asn Phe Asn Gly 210 215 220 <210> 4 <211> 690 <212> DNA <213> Bacillus thermoamylovorans <400> 4 atgagcaaca aaattgaatt ttcaccgtct ttaatgacaa tggatttaga caagtttaaa 60 gaacagatta cttttttaaa taatcatgtc ggttcttacc atatcgatat tatggacgga 120 cattatgtac ctaatataac tctatcccct tggtttgtcc aagaggtacg gaaaattagt 180 gatgttccga tgtctgccca cttgatggtc acaaacccaa gtttttgggt acaacaactc 240 attgatatta agtgtgaatg gatttgcatg cacgtagaaa cccttgatgg gttagctttc 300 cgcttaattg atcaaatcca cgatgcggga ttaaaagcag gggtcgtatt aaatcctgaa 360 acaagtgttg atgcgattcg cccgtacatt gatttagtgg ataaagtcac cattatgact 420 gtcgacccag gttttgcagg tcaacgcttt attgatagta cattggagaa aatcgtggaa 480 ttaagaaaat tacgggaaga acacggttat aaatatgtga ttgaaatgga tggatcttcg 540 aatcggaaat ccttcaagaa aatttatgaa gccggtcctg acatttatat tataggtcgc 600 agcggtttgt ttggattaca cgaagatatc gaaaaagcat gggaaatcat gtgcaaagat 660 tttgaggaaa tgactggcga aaaagtatta 690 <210> 5 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thermophilic A6PE from Bacillus thermoamylovorans Codon optimized <400> 5 atgagtaaca agatcgaatt cagcccgagc ctgatgacca tggatctgga taaatttaaa 60 gaacagatca cctttctgaa caatcatgtt ggcagttatc atattgatat catggatggt 120 cattacgtgc cgaatattac cctgagcccg tggtttgttc aggaagtgcg caaaattagc 180 gatgttccga tgagcgcaca tctgatggtt accaatccga gtttttgggt tcagcagctg 240 attgatatta aatgtgaatg gatttgcatg catgttgaaa ccctggatgg cctggccttt 300 cgtctgattg atcagattca tgatgccggc ctgaaagcag gtgtggttct gaatccggaa 360 accagtgtgg atgccattcg tccgtatatt gatctggttg ataaagttac catcatgacc 420 gtggatccgg gctttgccgg ccagcgcttt attgatagca ccctggaaaa aattgtggaa 480 ctgcgtaaac tgcgtgaaga acatggttat aaatatgtga ttgagatgga tggcagcagc 540 aatcgcaaaa gctttaaaaa aatttacgag gcaggtccgg atatttatat tattggccgt 600 agtggcctgt ttggcctgca tgaagatatt gaaaaagcat gggaaattat gtgtaaggat 660 tttgaagaaa tgaccggtga aaaagtgctg 690 <210> 6 <211> 230 <212> PRT <213> Bacillus thermoamylovorans <400> 6 Met Ser Asn Lys Ile Glu Phe Ser Pro Ser Leu Met Thr Met Asp Leu 1 5 10 15 Asp Lys Phe Lys Glu Gln Ile Thr Phe Leu Asn Asn His Val Gly Ser 20 25 30 Tyr His Ile Asp Ile Met Asp Gly His Tyr Val Pro Asn Ile Thr Leu 35 40 45 Ser Pro Trp Phe Val Gln Glu Val Arg Lys Ile Ser Asp Val Pro Met 50 55 60 Ser Ala His Leu Met Val Thr Asn Pro Ser Phe Trp Val Gln Gln Leu 65 70 75 80 Ile Asp Ile Lys Cys Glu Trp Ile Cys Met His Val Glu Thr Leu Asp 85 90 95 Gly Leu Ala Phe Arg Leu Ile Asp Gln Ile His Asp Ala Gly Leu Lys 100 105 110 Ala Gly Val Val Leu Asn Pro Glu Thr Ser Val Asp Ala Ile Arg Pro 115 120 125 Tyr Ile Asp Leu Val Asp Lys Val Thr Ile Met Thr Val Asp Pro Gly 130 135 140 Phe Ala Gly Gln Arg Phe Ile Asp Ser Thr Leu Glu Lys Ile Val Glu 145 150 155 160 Leu Arg Lys Leu Arg Glu Glu His Gly Tyr Lys Tyr Val Ile Glu Met 165 170 175 Asp Gly Ser Ser Asn Arg Lys Ser Phe Lys Lys Ile Tyr Glu Ala Gly 180 185 190 Pro Asp Ile Tyr Ile Ile Gly Arg Ser Gly Leu Phe Gly Leu His Glu 195 200 205 Asp Ile Glu Lys Ala Trp Glu Ile Met Cys Lys Asp Phe Glu Glu Met 210 215 220 Thr Gly Glu Lys Val Leu 225 230 <210> 7 <211> 651 <212> DNA <213> Clostridium thermocellum <400> 7 atgattaaat acaaagcggt attctttgat tttgactata cgctggcaga ttcatctaaa 60 gctgttatag aatgtattaa ctatgcactg caaaaaatgg gttatcccga atcttctccg 120 gaaagtattt gcagaacaat aggacttacg ttggccgagg cttttaaaat acttagcggg 180 gatacttctg attccaatgc ggaccttttc cgccaatact ttaaagaaag agcagatctg 240 gttatgtgtg accggactgt aatgtacagc actgttgaat gtgttttgaa gaagctgaaa 300 aaggcggatg taaaaacagg aattgtttca acgaagtaca gatacaggat agaggatata 360 ttaaaaaggg acaaactttt acagtatttt gatgtaattg tcggcgggga agatgttgcg 420 gcccataaac cggatccgga agggcttcta aaggccatat cgatggttgg ctgccaaaag 480 gaagaagtcc tttttgtcgg agacagtacg gtggatgcaa ggactgcaaa aaatgcggga 540 gtggattttg tggcggttct tacggggaca accggggcaa atgagttttc agagtataat 600 cctggtgctg tgattgaaga tttgagtggt ttattggata tgtttatgtt a 651 <210> 8 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized A6PP from Clostridium thermocellum <400> 8 atgatcaagt acaaggccgt tttttttgat tttgattaca ccctggcaga tagcagcaaa 60 gccgttattg aatgtattaa ttacgccctg cagaaaatgg gctatccgga aagcagtccg 120 gaaagcattt gtcgtaccat tggcctgacc ctggcagaag catttaaaat tctgagcggt 180 gataccagcg atagcaatgc cgatctgttt cgccagtatt ttaaagaacg cgcagatctg 240 gttatgtgtg atcgcaccgt gatgtatagc accgtggaat gcgtgctgaa aaaactgaaa 300 aaagcagatg ttaagaccgg tattgtgagc accaaatatc gctatcgtat tgaagatatt 360 ctgaaacgtg ataaactgct gcagtatttt gatgttattg ttggtggcga agatgttgcc 420 gcccataaac cggatccgga aggcctgctg aaagcaatta gcatggtggg ctgccagaaa 480 gaagaagttc tgtttgttgg tgatagcacc gttgatgcac gtaccgccaa aaatgcaggc 540 gtggattttg tggccgttct gaccggcacc accggcgcaa atgaatttag cgaatataat 600 ccgggcgccg tgattgaaga tctgagcggt ctgctggata tgtttatgct g 651 <210> 9 <211> 217 <212> PRT <213> Clostridium thermocellum <400> 9 Met Ile Lys Tyr Lys Ala Val Phe Phe Asp Phe Asp Tyr Thr Leu Ala 1 5 10 15 Asp Ser Ser Lys Ala Val Ile Glu Cys Ile Asn Tyr Ala Leu Gln Lys 20 25 30 Met Gly Tyr Pro Glu Ser Ser Pro Glu Ser Ile Cys Arg Thr Ile Gly 35 40 45 Leu Thr Leu Ala Glu Ala Phe Lys Ile Leu Ser Gly Asp Thr Ser Asp 50 55 60 Ser Asn Ala Asp Leu Phe Arg Gln Tyr Phe Lys Glu Arg Ala Asp Leu 65 70 75 80 Val Met Cys Asp Arg Thr Val Met Tyr Ser Thr Val Glu Cys Val Leu 85 90 95 Lys Lys Leu Lys Lys Ala Asp Val Lys Thr Gly Ile Val Ser Thr Lys 100 105 110 Tyr Arg Tyr Arg Ile Glu Asp Ile Leu Lys Arg Asp Lys Leu Leu Gln 115 120 125 Tyr Phe Asp Val Ile Val Gly Gly Glu Asp Val Ala Ala His Lys Pro 130 135 140 Asp Pro Glu Gly Leu Leu Lys Ala Ile Ser Met Val Gly Cys Gln Lys 145 150 155 160 Glu Glu Val Leu Phe Val Gly Asp Ser Thr Val Asp Ala Arg Thr Ala 165 170 175 Lys Asn Ala Gly Val Asp Phe Val Ala Val Leu Thr Gly Thr Thr Gly 180 185 190 Ala Asn Glu Phe Ser Glu Tyr Asn Pro Gly Ala Val Ile Glu Asp Leu 195 200 205 Ser Gly Leu Leu Asp Met Phe Met Leu 210 215

Claims

알룰로스 6-인산염 3-입체이성체효소(A6PE)에 의해 촉매되어, 프룩토오스 6-인산염(F6P)을 알룰로스 6-인산염(A6P)으로 전환하는 단계, 및
알룰로스 6-인산염 포스파타아제(A6PP)에 의해 촉매되어, 생산된 A6P를 알룰로스로 전환하는 단계
를 포함하는, 알룰로스를 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
포도당인산이성화효소(PGI)에 의해 촉매되어, 글루코오스 6-인산염(G6P)을 F6P로 전환하는 단계
를 더 포함하는 방법.
제2항에 있어서,
포도당인산무타아제(PGM)에 의해 촉매되어, 글루코오스 1-인산염(G1P)을 G6P로 전환하는 단계
를 더 포함하는 방법.
제3항에 있어서,
최소한 하나의 효소에 의해 촉매되어, 당류를 G1P로 전환하는 단계
를 더 포함하며,
여기서 상기 당류는 녹말 또는 이의 유도체, 셀룰로오스 또는 이의 유도체, 및 수크로오스로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제4항에 있어서, 최소한 하나의 효소가 알파-글루칸 인산화효소(αGP), 말토오스 인산화효소, 수크로오스 인산화효소, 셀로덱스트린 인산화효소, 셀로비오스 인산화효소, 및 셀룰로오스 인산화효소로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제4항에 있어서, 당류가 아밀로오스, 아밀로펙틴, 가용성 녹말, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토오스, 및 글루코오스로 구성된 군으로부터 선택되는 녹말 또는 이의 유도체인 방법.
제6항에 있어서,
녹말을 녹말 유도체로 전환하는 단계
를 더 포함하며,
여기서 상기 녹말 유도체는 녹말의 효소적 가수분해에 의해 또는 녹말의 산 가수분해에 의해 제조되는 것인 방법.
제6항에 있어서, 4-글루칸 전달효소(4GT)가 방법에 추가되는 것인 방법.
제7항에 있어서, 녹말 유도체가 이소아밀라아제, 풀루라나아제, 알파-아밀라아제, 또는 이들의 조합에 의해 촉매된 녹말의 효소적 가수분해에 의해 제조되는 것인 방법.
제1항에 있어서,
최소한 하나의 효소에 의해 촉매되어, 프룩토오스를 F6P로 전환하는 단계를 더 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 최소한 하나의 효소에 의해 촉매되어, 수크로오스를 프룩토오스로 전환하는 단계를 더 포함하는 방법.
제2항에 있어서,
최소한 하나의 효소에 의해 촉매되어, 글루코오스를 G6P로 전환하는 단계를 더 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 최소한 하나의 효소에 의해 촉매되어, 수크로오스를 글루코오스로 전환하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, A6PE 가 서열 번호: 3 또는 6과 최소한 90%, 최소한 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 A6PE는 F6P의 A6P로의 전환을 촉매작용하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, A6PE 가
촉매작용을 위한 (α/β)₈-배럴 도메인,
상기 배럴의 7번째 β-가닥의 종결 지점에서 Ser,
상기 배럴의 8번째 β-가닥의 종결 지점에서 Ser,
활성 부위 루프 내에 Gly,
상기 배럴의 2번째와 3번째 β-가닥 내에 His,
상기 배럴의 2번째와 7번째 β-가닥 내에 Asp, 및
상기 배럴의 2번째 β-가닥 내에 His-소수성 잔기-Asp 서명
을 함유하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, A6PP가 서열 번호: 9와 최소한 90%, 최소한 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 A6PP는 A6P의 알룰로스로의 전환을 촉매작용하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, A6PP가
촉매작용을 위한 로스마노이드 폴드 도메인,
C1 캡핑 도메인,
상기 로스마노이드 폴드의 1번째 β-가닥 내에 DxD 서명,
상기 로스마노이드 폴드의 2번째 β-가닥의 종결 지점에서 Thr 또는 Ser,
상기 로스마노이드 폴드의 3번째 β-가닥의 C 말단부에 이어지는 α-나선의 N 말단에서 Lys, 및
상기 로스마노이드 폴드의 4번째 β-가닥의 종결 지점에서 GDxxxD 서명
을 함유하는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 방법 단계는 다음 조건 중에 최소한 하나의 조건 하에서 수행되는 것인 방법: 37℃ 내지 85℃ 범위의 온도; 5.0 내지 8.0 범위의 pH; 및 8 시간 내지 48 시간 동안.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 방법 단계는 하나의 생물반응기에서 또는 직렬로 배열된 복수의 생물반응기에서 수행되는 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
방법은 다음 중 최소한 하나를 특징으로 하는 것인 방법:
방법 단계는 ATP-없이, NAD(H)-없이, 0 mM 초과 내지 150 mM의 인산염 농도에서 수행되고;
인산염은 재활용되고; 및
방법의 최소한 하나의 단계는 에너지면에서 유리한 화학 반응을 수반함.
삭제
삭제