WO2017002978A1 - 希少糖の製造法 - Google Patents

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WO2017002978A1
WO2017002978A1 PCT/JP2016/069724 JP2016069724W WO2017002978A1 WO 2017002978 A1 WO2017002978 A1 WO 2017002978A1 JP 2016069724 W JP2016069724 W JP 2016069724W WO 2017002978 A1 WO2017002978 A1 WO 2017002978A1
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WO
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microorganism
phosphate
protein
psicose
activity
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PCT/JP2016/069724
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English (en)
French (fr)
Inventor
祐子 島並
田畑　和彦
Original Assignee
協和発酵バイオ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to an efficient production method of a rare sugar using a microorganism, a culture of the microorganism, or a processed product of the culture, and more particularly to a production method of D-psicose and a production method of D-alloheptulose.
  • rare sugars are defined as “sugars that rarely exist in nature” and are simple sugars with a small abundance in nature. In general, rare sugars are often low in yield in a synthetic reaction in an organic chemical synthesis method.
  • D-psicose a kind of rare sugar, has about 70% of the sweetness of sugar but has almost no calories, so it can be used as a low calorie sweetener.
  • an inhibitory action on blood pressure increase and an inhibitory action on visceral fat accumulation have been recognized.
  • Patent Document 1 discloses a method for producing psicose using a chemical isomerization reaction.
  • Patent Documents 2 and 3 and Non-Patent Documents 1 to 4 disclose enzymes related to biosynthesis of D-psicose.
  • Non-Patent Document 5 discloses a method of increasing reaction efficiency using boron.
  • D-alloheptulose a kind of rare sugar, is a kind of 7-carbon sugar, and it has been confirmed that it is contained in trace amounts in the roots of yellow-flowered nine cherry trees (Non-patent Document 6). There have been few reports.
  • a method for producing D-alloheptulose an enzyme method using an enzyme derived from Escherichia coli and a fermentation method using Corynebacterium glutamicum are disclosed (Non-patent Document 7).
  • the method for producing D-psicose using a chemical isomerization reaction cannot specifically produce D-psicose, so that a by-product sugar other than D-psicose is produced in a large amount, and the reaction efficiency is low. Many isomerized sugars remain as substrates.
  • the D-psicose production method using an enzyme related to the biosynthesis of D-psicose has a reaction efficiency of about 33%. Furthermore, even when the reaction efficiency to D-psicose is increased using boron, the conversion rate is about 60%.
  • an object of the present invention is to provide an efficient method for producing a rare sugar using a microorganism, a culture of the microorganism, or a processed product of the culture.
  • the present inventors have found that by using a microorganism that produces D-psicose-6-phosphate from a sugar having a D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity enhanced compared to the parent strain. It was found that D-psicose can be produced efficiently. Further, it was found that D-alloheptulose can be efficiently produced by using a microorganism having enhanced allulose-6-phosphate 3-epimerase activity as compared with the parent strain, and the present invention was completed based on these findings.
  • D-psicose-6-phosphate is produced from a sugar having an enhanced activity of the protein according to any one of the following [1] to [3] as compared to a parent strain A microorganism culture or a treated product of the culture, and (ii) a sugar as a substrate present in an aqueous medium to produce and accumulate D-psicose in the aqueous medium, and from that aqueous medium D-psicose
  • a method for producing D-psicose characterized in that [1] Protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 [2] Amino acid sequence wherein 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2
  • a mutant protein having D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity [3] comprising an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence
  • DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3] of ⁇ 1> or ⁇ 2> [5] DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 or 51
  • DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 or 51
  • DNA encoding [7] DNA encoding a homologous protein comprising a base sequence having 95% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 or 51 and having D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity ⁇ 4>
  • the microorganism according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the microorganism that produces D-psicose-6-phosphate from sugar is a microorganism in which allulose-6-phosphate 3-epime
  • a microorganism that produces D-psicose-6-phosphate from sugar further comprises D-allose-6-phosphate isomerase, RpiR, D-allose transport protein, and D-allose kinase, compared to the parent strain.
  • ⁇ 6> Any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the microorganism that produces D-psicose-6-phosphate from sugar is a microorganism in which 6-phosphofructokinase activity is further reduced or lost compared to the parent strain
  • ⁇ 7> (i) a microorganism culture having enhanced allulose-6-phosphate 3-epimerase activity as compared with the parent strain or a treated product of the culture as an enzyme source; and (ii) a sugar as a substrate in an aqueous medium.
  • D-alloheptulose in the aqueous medium, allowing D-alloheptulose to be collected from the aqueous medium, and producing D-alloheptulose.
  • a microorganism having enhanced allulose-6-phosphate 3-epimerase activity as compared to the parent strain is cultured in a medium, D-alloheptulose is produced and accumulated in the culture, and D-alloheptulose is collected from the culture.
  • a process for producing D-alloheptulose characterized in that ⁇ 9> The production method according to ⁇ 7> or ⁇ 8>, wherein the microorganism is a microorganism that produces sedheptulose-7-phosphate from sugar.
  • ⁇ 10> The production method according to any one of ⁇ 7> to ⁇ 9>, wherein the microorganism produces D-alloheptulose from D-alloheptulose-7-phosphate.
  • a microorganism having enhanced allulose-6-phosphate 3-epimerase activity as compared to the parent strain is a microorganism having enhanced activity of the protein according to any one of the following [8] to [10]: ⁇ 7
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added, and
  • a mutant protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity [10] consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and allulose-6-phosphate 3 -Homologous protein having epimerase activity ⁇ 12>
  • the protein according to any one of the following [11] to [13], wherein a microorganism that produces D-alloheptulose from D-alloheptulose-7-phosphate is compared to the parent strain ⁇ 10> or ⁇ 11>, the production method according to ⁇ 10>, wherein the microorganism has enhanced activity.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 [12] consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and A mutant protein having D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity [13] consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and D-psicose-6-phosphorus
  • a microorganism that produces cedoheptulose-7-phosphate from a homologous protein ⁇ 13> sugar having acid dephosphorylation activity is a microorganism in which 6-phosphofructokinase activity is further reduced or lost compared to the parent strain ⁇ 9
  • the production method according to any one of> to ⁇ 12>.
  • ⁇ 14> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 13>, wherein the sugar is at least one sugar selected from the group consisting of glucose, fructose, and sucrose.
  • the parent strain is a microorganism belonging to the genus Escherichia.
  • the present invention provides an efficient method for producing a rare sugar using a microorganism, a culture of the microorganism, or a processed product of the culture.
  • a microorganism that produces D-psicose-6-phosphate from a sugar having enhanced D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity as compared with the parent strain.
  • the D-allose metabolic system possessed by the microorganism can be used efficiently, production of by-product sugars and the remaining of the substrate can be suppressed, and D-psicose can be produced with high efficiency.
  • D-alloheptulose of the present invention by using a microorganism having enhanced activity of allulose-6-phosphate 3-epimerase as compared to the parent strain, sedheptulose-7-phosphate possessed by the microorganism can be converted to D- The activity of isomerizing to alloheptulose-7-phosphate can be used efficiently, and D-alloheptulose can be produced with high efficiency.
  • FIG. 1 (a) shows a schematic diagram of the metabolic system of D-allose possessed by microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • FIG. 1 (b) shows a schematic diagram of a specific example of D-psicose production by microorganisms used in the method for producing D-psicose of the present invention.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of an allose-utilizing operon of a microorganism belonging to the genus Escherichia.
  • microorganisms used in the method for producing D-psicose of the present invention and methods for producing the microorganisms include the microorganisms described in (1) to (4) below. .
  • a mutant protein consisting of a deleted, substituted or added amino acid sequence and having D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity [3] 95% or more, preferably 95% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 Homologous protein comprising an amino acid sequence having 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably 99% or more identity, and having D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity (2) ) With the parent strain as a parent strain, and the microorganism with enhanced allulose-6-phosphate 3-epimerase activity compared to the parent strain. (3) The microorganism according to (1) or (2) is used as a parent strain and compared with the parent strain.
  • a microorganism in which the activity of at least one protein selected from the group consisting of -6-phosphate isomerase, RpiR, D-allose transport protein and D-allose kinase is reduced or lost (4) Any of (1) to (3) A microorganism in which 6-phosphofructokinase activity is reduced or lost as compared with the parental strain is described below as (1) to (4).
  • a mutant protein consisting of a deleted, substituted or added amino acid sequence and having D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity [3] 95% or more, preferably 95% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 Homologous protein comprising an amino acid sequence having 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably 99% or more identity, and having D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity
  • D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity refers to an activity of dephosphorylation using D-psicose-6-phosphate as a substrate.
  • the “microorganism that produces D-psicose-6-phosphate from sugar” means that when the microorganism is cultured in a medium, D-psicose-6-phosphate is used as a starting substrate in the cells of the microorganism. This refers to microorganisms that produce and accumulate.
  • a mutated protein refers to a protein obtained by artificially deleting or substituting amino acid residues in the original protein, or inserting or adding amino acid residues into the protein.
  • Homologous proteins are proteins that are considered to have the same structure and function as the original protein, so that the gene encoding the protein has the same evolutionary origin as the gene encoding the original protein. It refers to the protein of living organisms.
  • an amino acid is deleted, substituted, inserted or added means that 1 to 10 amino acids are deleted, substituted, inserted or added at any position in the same sequence. Also good.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted or added is 1 to 10, preferably 1 to 8, and most preferably 1 to 5.
  • the amino acid to be deleted, substituted, inserted or added may be a natural type or a non-natural type.
  • Natural amino acids include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-arginine, L -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  • amino acids included in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • B group aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid group
  • C asparagine, glutamine group
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid group
  • E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homoserine
  • G group phenyl, threonine
  • the above-mentioned mutant protein or homologous protein has D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity.
  • a recombinant DNA containing DNA encoding the protein is prepared by the method described later, A microorganism that is unable to confirm D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity with recombinant DNA, such as a microorganism obtained by transforming Escherichia coli W3110 strain, is cultured, and the protein is obtained from the resulting culture.
  • a cell extract containing sucrose is prepared, the fraction is contacted with D-psicose-6-phosphate as a substrate, and the resulting D-psicose is detected by high-speed chromatography or gas chromatography. be able to.
  • the parent strain refers to the original strain that is the subject of genetic modification and transformation.
  • the original strain to be transformed by gene transfer is also called a host strain.
  • the parent strain may be a wild strain as long as it is a microorganism that produces D-psicose-6-phosphate from sugar, and the wild strain does not have the ability to produce D-psicose-6-phosphate from sugar. In some cases, it may be a breeding strain that has been artificially imparted with the ability to produce D-psicose-6-phosphate from sugar.
  • a mechanism for controlling a biosynthetic pathway for producing D-psicose-6-phosphate from sugar (B) a method for enhancing expression of at least one enzyme involved in a biosynthetic pathway for producing D-psicose-6-phosphate from a sugar, (c) a method for relaxing or releasing at least one of A method for increasing the copy number of at least one enzyme gene involved in a biosynthetic pathway that produces psicose-6-phosphate, (d) a biosynthetic pathway that produces D-psicose-6-phosphate from a sugar A method of weakening or blocking at least one metabolic pathway branching to a metabolite other than the target substance, and (e) a cell line having a higher resistance to an analog of D-psicose-6-phosphate than a wild-type strain How to-option, and
  • Such a parent strain is preferably a prokaryote or yeast strain, more preferably belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc.
  • Prokaryotic organisms or yeast strains belonging to the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Siwaniomyces, Pichia, Candida, etc. are most preferably Escherichia coli MG1655, Escherichia coli XL1-Blue.
  • Escherichia coli XL2-Blue Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichi coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.
  • the microorganism is a microorganism capable of producing D-psicose-6-phosphate from a sugar.
  • the microorganism is a recombinant DNA having a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2. Can be confirmed by culturing the transformed microorganism in a medium and detecting D-psicose accumulated in the culture using HPLC described later.
  • microorganisms (a) and (b) can be mentioned as microorganisms having enhanced activity of the protein according to any one of [1] to [3] as compared to the parental microorganism.
  • A obtained by modifying the gene encoding the protein according to any one of [1] to [3] on the chromosomal DNA of the parent strain, i) the ratio of the protein compared to the microorganism of the parent strain A microorganism having enhanced activity and ii) a microorganism having an increased transcription amount of the gene or a production amount of the protein as compared to the microorganism of the parent strain, and (b) a microorganism of the parent strain with a recombinant DNA containing a DNA encoding the protein.
  • microorganism having enhanced activity is 1 to 10 amino acids, preferably 1 to 5 amino acids, most preferably the amino acid sequence of the protein according to any one of the above [1] to [3] of the parent strain. Since it has a protein having an amino acid sequence in which 1 to 5 amino acids are substituted, there can be mentioned a microorganism having a mutant protein whose specific activity is enhanced as compared with the parent strain.
  • the microorganism having enhanced activity can be obtained by using the specific activity of the protein described in any one of the above [1] to [3] of the parent strain by a usual mutation treatment method, a gene replacement method using a recombinant DNA technique, or the like. It can be obtained by strengthening.
  • NTG N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine
  • the gene replacement method using the recombinant DNA technique is used for mutation treatment using a mutation agent in vitro or error-prone PCR on the DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3]. And a method of substituting the gene encoding the protein according to any one of [1] to [3] present on the chromosomal DNA of the parent strain by homologous recombination after the mutation is introduced. be able to.
  • the DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3] is, for example, a probe DNA that can be designed based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 or 51, In 1), it can be obtained by a method using PCR, which will be described later.
  • Examples of the homologous recombination method include a method using a plasmid for homologous recombination that can be prepared by ligating with a plasmid DNA having a drug resistance gene that cannot autonomously replicate in the host cell to be introduced.
  • a method using homologous recombination frequently used in Escherichia coli a method of introducing recombinant DNA using a homologous recombination system of lambda phage [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645 (2000)].
  • a selection method using the fact that Escherichia coli becomes sucrose-sensitive by Bacillus subtilis levanshuclase integrated on the chromosome together with the recombinant DNA, or the wild-type rpsL gene is incorporated into Escherichia coli having a mutant rpsL gene resistant to streptomycin.
  • the selection method utilizing the sensitivity of Escherichia coli to streptomycin [Mol. Ol Microbiol., 55, 137 (2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)], etc. Microorganisms in which the above target region has been replaced with recombinant DNA can be obtained.
  • the microorganism having enhanced specific activity of the protein according to any one of the above [1] to [3] compared to the parent strain means that, for example, a microorganism having a parent strain and a mutant protein is cultured, After treatment with sonic waves, etc., D-psicose-6-phosphate and other substrates are added to the treated product, and the resulting D-psicose is detected by high-speed chromatography or gas chromatography and confirmed. can do.
  • the microorganism having an increased amount or production amount of the protein includes a transcriptional regulatory region or a promoter region of the gene encoding the protein according to any one of [1] to [3] present on the chromosomal DNA of the parent strain.
  • the amount of the microorganism or the amount of the protein produced is increased by, for example, changing the transcription amount of the gene of the protein according to any one of the above [1] to [3] or the amount of the protein produced by a normal mutation. It can be obtained by enhancement using a treatment method, a gene replacement method using recombinant DNA technology, or the like.
  • Examples of the mutation treatment method include the methods described above.
  • the gene replacement method using the recombinant DNA technique comprises a transcription regulatory region and a promoter region of a gene encoding the protein according to any one of [1] to [3] possessed by the parent strain, for example, upstream of the initiation codon of the protein.
  • the DNA having a base sequence of 200 bp, preferably 100 bp, is subjected to mutation treatment in a test tube or error-prone PCR, etc., and then introduced into the DNA, and then present on the chromosomal DNA of the parent strain [1]-[ 3], a method for substitution with the gene encoding the protein according to any one of the above 3 using the homologous recombination method described above.
  • the above [1] to [3] of the parent strain by replacing the promoter region of the gene encoding the protein according to any one of the above [1] to [3] of the parent strain with a known strong promoter sequence, the above [1] to [3 ] The microorganism which the production amount of the protein as described in any one of [1] improved can also be acquired.
  • Such promoters in the case of using a microorganism belonging to the genus Escherichia as the parent strain, for example, trp promoter functional in Escherichia coli (Ptrp), lac promoter (Plac), P L promoter, P R promoter, P SE promoter and the like And promoters derived from Escherichia coli, phages, and the like. Further, for example, artificially constructed promoters such as a promoter in which two Ptrps are connected in series, a tac promoter, a lacT7 promoter and a letI promoter can also be mentioned.
  • examples thereof include an SPO1 promoter, an SPO2 promoter, a penP promoter that function in Bacillus subtilis.
  • P54-6 promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-6792000 (2000)] can be exemplified.
  • yeast strain When a yeast strain is used as the parent strain, examples thereof include PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, CUP1 promoter and the like.
  • the microorganism obtained by the above method is a microorganism in which the transcription amount of the gene encoding the protein according to any one of [1] to [3] or the production amount of the protein is increased as compared with the parent strain.
  • the transcription amount of the gene of the microorganism can be confirmed by Northern blotting or the production amount of the protein of the microorganism by comparison with the parent strain by Western blotting.
  • the number of copies of the gene over the parent strain obtained by transforming the parent strain with a recombinant DNA containing the DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3]
  • the microorganism having an increased number of microorganisms can be obtained by transforming a parental microorganism with a recombinant DNA containing a DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3] above, and And microorganisms in which the gene is retained in addition to chromosomal DNA.
  • the DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3] may be a DNA encoding a protein having the activity of the protein according to any one of [1] to [3]. Any of these may be used, but specific examples include one DNA selected from the group consisting of the following [4] to [7].
  • DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3] [5] DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 or 51 [6] Homologous protein that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 or 51 and has D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity
  • DNA encoding [7] A nucleotide sequence having 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably 99% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 or 51, and DNA encoding a homologous protein having D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity
  • the recombinant DNA containing the DNA of any one of [4] to [7] is capable of autonomously replicating in the parent strain or integrating into the chromosome and transcribing the DNA.
  • hybridize means that the DNA hybridizes to DNA having a specific base sequence or a part of the DNA. Therefore, the DNA having the specific base sequence or a part thereof can be used as a probe for Northern or Southern blot analysis, or can be used as an oligonucleotide primer for PCR analysis.
  • DNA used as a probe examples include DNA of at least 100 bases, preferably 200 bases or more, more preferably 500 bases or more.
  • DNA used as a primer DNA of at least 10 bases or more, preferably 15 bases or more can be raised.
  • DNA hybridization experiment methods are well known. For example, those skilled in the art can determine hybridization conditions according to the present specification. The hybridization conditions are described in Molecular Cloning 2nd Edition, 3rd Edition (2001), Methods General and Molecular act Bacteriology, ASM Press (1994), Immunology methods manual, Academic press (1996). Can be done according to other standard textbooks.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions can be obtained by following the instructions attached to the commercially available hybridization kit.
  • commercially available hybridization kits include a random primed DNA labeling kit (manufactured by Roche Diagnostics) that prepares probes by a random prime method and performs hybridization under stringent conditions.
  • the above stringent conditions include a DNA-immobilized filter and probe DNA, 50% formamide, 5 ⁇ SSC (750 mmol / l sodium chloride, 75 mmol / l sodium citrate), 50 mmol / l phosphoric acid. After incubation overnight at 42 ° C. in a solution containing sodium (pH 7.6), 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / l denatured salmon sperm DNA, for example about 65 ° C. The conditions which wash
  • the DNA capable of hybridizing under the above stringent conditions includes, for example, a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 or 51 when calculated based on the above-described parameters using BLAST, FASTA, etc. And DNA having at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • a recombinant DNA is prepared by inserting the DNA fragment downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • the recombinant DNA is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA described in any one of [4] to [7] above, and a transcription termination sequence. Recombinant DNA is preferred. A gene that controls the promoter may also be included.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA, but a transcription termination sequence is preferably arranged immediately below the structural gene.
  • D-psicose-6-phosphorus by replacing the base sequence of the portion encoding the protein having D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity so as to be an optimal codon for host expression, D-psicose-6-phosphorus
  • the expression level of the protein having acid dephosphorylation activity can be improved.
  • Information on codon usage in the parent strain used in the production method of the present invention can be obtained through a public database.
  • expression vectors include pColdI (manufactured by Takara Bio Inc.), pCDF-1b, pRSF-1b (all manufactured by Novagen), and pMAL-c2x (New England Biolabs).
  • PGEX-4T-1 (manufactured by GE Healthcare Bioscience), pTrcHis (manufactured by Invitrogen), pSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-30 (manufactured by Qiagen) PET-3 (manufactured by NOVAGEN), pKYP10 (Japanese Patent Laid-Open Publication No. 58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl.
  • any promoter can be used as long as it functions in cells of microorganisms belonging to the genus Escherichia, for example, trp promoter (P trp ), lac promoter (P lac ), P L promoter, P R promoter and P SE promoter, may be used promoters derived from Escherichia coli, phage and the like.
  • An artificially designed and modified promoter such as a promoter in which two Ptrps are connected in series, a tac promoter, a lacT7 promoter, and a letI promoter can also be used.
  • examples of expression vectors include pCG1 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 57-134500), pCG2 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-35197), and pCG4 (Japanese Special No. 57-183799), pCG11 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 57-134500), pCG116, pCE54, pCB101 (all Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-105999), pCE51, pCE52, pCE53 [any] In addition, Molecularoleand General Genetics, 196, 175 (1984)] can be mentioned.
  • any promoter in the case of using the above expression vector, any promoter can be used as long as it functions in cells of coryneform bacteria.
  • P54-6 promoter [Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 ( 2000)] can be used.
  • examples of the expression vector include YEp13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like.
  • any promoter in the case of using the above expression vector, any promoter can be used as long as it functions in yeast strain cells.
  • PHO5 promoter PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, heat Examples include promoters such as shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, CUP1 promoter and the like.
  • the introduction of the recombinant DNA as a plasmid capable of autonomous replication in the parent strain or the integration into the chromosome of the parent strain amplifies the gene originally possessed by the microorganism on the chromosomal DNA.
  • the gene introduced by transformation can be confirmed by a method of confirming an amplification product by PCR using an amplifiable primer set.
  • the increase in the transcription amount of the DNA or the production amount of the protein encoded by the DNA means that the transcription amount of the gene of the microorganism is Northern blotting or the production amount of the protein of the microorganism is Western blotting. Thus, it can be confirmed by a method of comparing with that of the parent strain.
  • the DNA encoding the protein of [1] above and the DNA of [5] above have, for example, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 50 (yniC gene) or a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 51 (ybiV gene).
  • a microorganism preferably a microorganism belonging to the genus Escherichia coli, more preferably a chromosomal DNA library of Escherichia coli MG1655 strain using a probe DNA that can be designed based on the base DNA, or based on the base sequence It can be obtained by PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] using a chromosomal DNA of the microorganism as a template, using a primer DNA that can be designed.
  • Escherichia coli MG1655 strain can be obtained from the National Institute of Technology and Evaluation Biotechnology Center (NITE Biological Resource Center).
  • the DNA encoding the mutant protein of [2] above can be obtained, for example, by subjecting it to error-prone PCR or the like using a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 50 or 51 as a template.
  • PCR is performed using the DNA as a template to amplify a fragment A (a mutation is introduced at the 3 ′ end) from the 5 ′ end to the mutation introduction site of the DNA.
  • the DNA encoding the homologous protein of [3] above and the DNA of [6] and [7] above are, for example, 95% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 50 or 51 with respect to various gene sequence databases
  • a nucleotide sequence having an identity of 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably 99% or more is searched, or represented by SEQ ID NO: 2 or 4 with respect to various protein sequence databases.
  • amino acid sequence having 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, most preferably 99% or more identity with an amino acid sequence is searched, and based on the base sequence or amino acid sequence obtained by the search Using the probe DNA or primer DNA that can be designed in this manner and a microorganism having the DNA, It can be obtained by a method similar to the method of acquiring.
  • the obtained DNA described in any one of [4] to [7] above is directly or cleaved with an appropriate restriction enzyme and incorporated into a vector by a conventional method, and the obtained recombinant DNA is transformed into a host cell.
  • a base sequence analysis method usually used, for example, dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)] or 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems) etc. By analyzing using an analyzer, the base sequence of the DNA can be determined.
  • Escherichia coli XL1-Blue Escherichia coli XL2-Blue
  • Escherichia coli DH1 Escherichia coli MC1000
  • Escherichia coli KY3276 Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101
  • Escherichia coli No. 49 Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, and Escherichia coli NM522.
  • Examples of the vector include pBluescript IIKS (+) (manufactured by Stratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)], pCR-Script Amp SK (+) (manufactured by Stratagene), pT7Blue (Manufactured by Novagen), pCR II (manufactured by Invitrogen) and pCR-TRAP (manufactured by Gene Hunter).
  • any method for introducing DNA into a host cell can be used.
  • a method using calcium ion [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110]. (1972)], protoplast method (Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394), electroporation method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] and the like.
  • the full-length DNA can be obtained by Southern hybridization or the like for a chromosomal DNA library using the partial length DNA as a probe.
  • the target DNA can also be prepared by chemical synthesis using an 8905 type DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems.
  • the recombinant DNA used in the production method of the present invention can be prepared by inserting the DNA fragment downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • Examples of such recombinant DNA include Ptrp-yniC and Ptrp-ybiV described later in Examples.
  • Methods for introducing recombinant DNA as a plasmid capable of autonomous replication in the parent strain include, for example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], protoplast method (Japan) And a method of electroporation [Nucleic Acids Res., ⁇ 16, 61271988 (1988)].
  • the microorganism produced by the above method is a microorganism in which the activity of the protein according to any one of the above [1] to [3] is enhanced as compared with the parent strain. 7] Confirmed by comparing the transcription amount of the DNA according to any one of [7], the production amount of the protein according to any one of [1] to [3] above, or the specific activity of the protein with that of the parent strain can do.
  • microorganisms examples include MGC and MGV described later in Examples.
  • Allulose-6-phosphate 3-epimerase activity is defined as fructose-6-phosphate. Is the activity of isomerizing to D-psicose-6-phosphate.
  • microorganism having enhanced allulose-6-phosphate 3-epimerase activity as compared with the parent strain include the following microorganisms (a) and (b).
  • B A microorganism obtained by transforming a parental microorganism with a recombinant DNA containing a DNA encoding the protein and having an increased copy number of the gene compared to the parental strain
  • the microorganism 1-10 amino acids, preferably 1-8 amino acids, most preferably 1-5 amino acids in the amino acid sequence of the protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity of the parent strain
  • a microorganism having a mutant protein whose specific activity is enhanced as compared with the parent strain are examples of the protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity of the parent strain.
  • the microorganism produced by the method described in 1 (1) above is used as a parent strain, and the specific activity of a protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity of the parent strain is treated with a normal mutation treatment.
  • Examples of the mutation treatment method include the method described in 1 (1) above.
  • the gene replacement method using recombinant DNA technology is a method of mutating DNA encoding a protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity by subjecting it to mutation treatment using a mutation agent in vitro or error-prone PCR.
  • the DNA encoding a protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity is described in 1 (1) above using, for example, a probe DNA that can be designed based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 42 It can be obtained by a method using PCR.
  • a microorganism having enhanced specific activity of a protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity compared to the parent strain means that, for example, a microorganism having a parent strain and a mutant protein is cultured, and the culture is sonicated or the like. After the treatment, fructose-6-phosphate and other substrates are added to the treated product, and the amount of synthesized D-psicose-6-phosphate can be measured and compared by HPLC.
  • Microorganisms with increased protein production include at least one base in the base sequence of the transcriptional regulatory region or promoter region of a gene encoding a protein having an allulose-6-phosphate 3-epimerase activity present on the chromosomal DNA of the parent strain.
  • the promoter region of the gene present on the chromosomal DNA of the parent strain and a known strong promoter Obtained by replacing the over arrangement, and a microorganism expression level of the gene is increased.
  • Microorganisms with increased protein production include, for example, transcription of a gene of a protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity of the parent strain, which is a microorganism constructed by the method described in 1 (1) above.
  • the amount of the protein or the amount of the protein produced can be obtained by enhancing using a usual mutation treatment method, a gene replacement method using a recombinant DNA technique, or the like.
  • Examples of the mutation treatment method include the method described in 1 (1) above.
  • the gene replacement method using the recombinant DNA technique is a transcriptional regulatory region and a promoter region of a gene encoding a protein having an allulose-6-phosphate 3-epimerase activity possessed by the parent strain, for example, 200 bp upstream of the start codon of the protein, preferably Is introduced into the DNA by subjecting the DNA having a base sequence of 100 bp to a mutation treatment in vitro or error-prone PCR, and then allulose-6-phosphate 3-epimerase present on the chromosomal DNA of the parent strain
  • Examples of the method include substitution using a gene encoding a protein having activity and the homologous recombination method described in 1 (1) above.
  • allulose-6-phosphate 3-epimerase activity from the parent strain can also be obtained by substituting the promoter region of the gene encoding the protein having parental allulose-6-phosphate 3-epimerase activity with a known strong promoter sequence. It is also possible to obtain a microorganism with improved production of protein having
  • Examples of such a promoter include the promoter described in 1 (1) above.
  • the microorganism obtained by the above method is a microorganism in which the transcription amount of a gene encoding a protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity or the production amount of the protein is increased as compared with the parent strain, for example, The transcription amount of the gene of the microorganism can be confirmed by comparing with that of the parent strain by Northern blotting, or the production amount of the protein of the microorganism by Western blotting.
  • (B) Allulose-6-phosphate The number of copies of the gene increased compared to the parent strain obtained by transforming the parent strain with a recombinant DNA containing a DNA encoding a protein having 3-epimerase activity.
  • a microorganism the number of copies of the gene increased on the chromosomal DNA by transforming the parental microorganism with a recombinant DNA containing DNA encoding a protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity.
  • Microorganisms and microorganisms having the above genes in addition to chromosomal DNA can be mentioned as plasmid DNA.
  • the protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity may be any protein as long as it has the activity, and specifically, one protein selected from the group consisting of the following [1] to [3] Examples include proteins.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 consists of an amino acid sequence in which 1 to 10, preferably 1 to 8, and most preferably 1 to 5 amino acids are deleted, substituted or added, and Mutant protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity, [3] An amino acid sequence having 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52, and allulose-6 -Homologous protein with phosphate 3-epimerase activity
  • mutant protein having activity can be obtained by introducing a site-specific mutation into DNA encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52, for example, using the site-specific mutagenesis method described below. it can.
  • the number of amino acid residues to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is a number that can be deleted, substituted or added by a known method such as the above-mentioned site-specific mutation method, and is 1 to 10, The number is preferably 1 to 8, most preferably 1 to 5.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 1 to 10, preferably 1 to 8, and most preferably 1 to 5 or more amino acids are deleted, substituted or added is any position in the same sequence. In which one or more amino acid residues may be deleted, substituted or added.
  • a mutant protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 10, preferably 1 to 8, most preferably 1 to 5 amino acid residues are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52,
  • Allulose-6-phosphate is a protein having 3-epimerase activity.
  • a transformant expressing a protein whose activity is to be confirmed using a DNA recombination method is prepared and cultured in a medium. It can be confirmed by measuring D-psicose-6-phosphate in the medium.
  • the DNA encoding a protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity may be any DNA that encodes a protein having the activity. Specifically, the following [4] to [7] 1 DNA selected from the group consisting of [4] DNA encoding the protein according to any one of [1] to [3] above, [5] DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 42, [6] DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 42 and encodes a homologous protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity , [7] A base sequence having at least 95%, preferably 97%, more preferably 98%, most preferably 99% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 42, and allulose- DNA encoding a homologous protein having 6-phosphate 3-epimerase activity
  • the description of “hybridize”, the method of DNA hybridization experiment, and the stringent conditions described above are the same as described in 1 (1) above.
  • the DNA capable of hybridizing under the above stringent conditions includes, for example, a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 42 when calculated based on the above-mentioned parameters using the above-mentioned BLAST, FASTA, etc. And DNA having at least 95%, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the protein is obtained.
  • a transformant with an improved production rate can be obtained by substituting the base in the base sequence of the protein-encoding portion so as to be an optimal codon for expression in a host cell.
  • a recombinant DNA is prepared by inserting the DNA fragment downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a microorganism constructed by the method described in 1 (1) above By transforming a microorganism constructed by the method described in 1 (1) above with the recombinant DNA, a microorganism having an increased copy number of the gene encoding the protein than the parent strain can be obtained. .
  • a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • a transcription termination sequence is not necessarily required, but a transcription termination sequence is placed directly under the structural gene. It is preferable to arrange.
  • the expression vector contains a promoter at a position where it can autonomously replicate in the above host cell or can be integrated into a chromosome, and can transcribe DNA encoding a protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity. What is used is used.
  • the recombinant DNA containing the DNA is capable of autonomous replication in prokaryotes, and at the same time, a recombinant consisting of a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA, and a transcription termination sequence. It is preferably body DNA. A gene that controls the promoter may also be included.
  • Examples of the expression vector and the promoter in the case of using the expression vector include the same expression vectors and promoters as described in 1 (1) above.
  • Examples of the recombinant DNA obtained by binding a DNA encoding a protein having an allulose-6-phosphate 3-epimerase activity to an expression vector include pUC19_alsE described later in the Examples.
  • DNA encoding a protein having the activity of allulose-6-phosphate 3-epimerase obtained by the above method can be obtained at any position of chromosomal DNA by using the homologous recombination method described in 1 (1) above. It is also possible to obtain a microorganism in which the copy number of the gene encoding the protein is increased as compared with the parent strain.
  • microorganism obtained by the above method has an increased number of copies of a gene encoding a protein having an allulose-6-phosphate 3-epimerase activity as compared to the parent strain. Can be used to confirm.
  • microorganisms examples include MGC / pUC19_alsE, MGV / pUC19_alsE, MGC ⁇ als ⁇ pfkA / pUC19_alsE and MGV ⁇ als ⁇ pfkA / pUC19_alsE described later in the examples.
  • the microorganism of (1) or (2) is selected from the group consisting of D-allose-6-phosphate isomerase, RpiR, D-allose transport protein, and D-allose kinase, compared to the parent strain.
  • D-allose-6-phosphate isomerase is a protein having an activity to isomerize D-allose-6-phosphate to D-psicose-6-phosphate. is there.
  • RpiR is a protein having an activity of suppressing gene expression by binding to an operator part of an allose-utilizing operon as a repressor and blocking transcription of the operon linked thereto.
  • the D-allose transport protein is a protein having an activity of transporting D-allose from outside the cell into the cell membrane.
  • D-allose kinase is a protein having the activity of converting D-allose into D-allose-6-phosphate.
  • the specific activity of the protein is higher than that of the parent strain 80% or less, preferably 50% or less, more preferably 30% or less, even more preferably 20% or less, particularly preferably 10% or less, most preferably reduced to 0%, and (b) compared to the parent strain,
  • the gene transcription amount or the protein production amount is 80% or less, preferably 50% or less, more preferably 30% or less, and still more preferably 20%.
  • the gene encoding D-allose-6-phosphate isomerase may be any gene encoding a protein having D-allose-6-phosphate isomerase activity. Specifically, the following [1] And one gene selected from the group consisting of [4]. [1] a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53, [2] An amino acid sequence having 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53, and D-allose A gene encoding a homologous protein having -6-phosphate isomerase activity, [3] a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 43, and [4] A gene that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 43 and encodes a homologous protein having D-allose-6-phosphate isomerase activity
  • the gene encoding RpiR may be any gene as long as it encodes a protein having an activity of blocking transcription of an allose-utilizing operon as a repressor. Specifically, from the following [1] to [4] One gene selected from the group consisting of: [1] a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54, [2] An amino acid sequence having 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54, and as a repressor A gene encoding a homologous protein having an activity to block transcription of an allose-utilizing operon, [3] a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 44, and [4] A homologous protein that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 44 and has the activity of blocking transcription of an allose-utilizing oper
  • the gene encoding the D-allose transport protein may be any gene as long as it encodes a protein having an activity of transporting D-allose from outside the cell into the cell membrane. Specifically, the following [1] to [1] One gene selected from the group consisting of [4] can be mentioned.
  • the gene encoding D-allose kinase may be any gene that encodes a protein having D-allose kinase activity, and is specifically selected from the group consisting of [1] to [4] below.
  • One gene is mentioned.
  • [1] a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 58, [2] An amino acid sequence having 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 58, and D-allose
  • hybridize the method of DNA hybridization experiment, and the stringent conditions described above are the same as described in 1 (1) above.
  • the DNA that can hybridize under the stringent conditions described above is represented by any one of SEQ ID NOs: 43 to 48, for example, when calculated based on the above-described parameters using BLAST or FASTA. Mention may be made of DNA having at least 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more identity with a DNA comprising a base sequence.
  • the microorganism in which the activity of at least one protein selected from the group consisting of D-allose-6-phosphate isomerase, RpiR, D-allose transport protein, and D-allose kinase is reduced or lost as compared with the parent strain is, for example, 1
  • a microorganism obtainable by the method of (1) or (2) is a parent strain, and at least selected from the group consisting of D-allose-6-phosphate isomerase, RpiR, D-allose transport protein, and D-allose kinase of the parent strain
  • the activity of one protein can be obtained by reducing or losing the activity using a usual mutation treatment method, a gene replacement method using a recombinant DNA technique, or the like.
  • Examples of the mutation treatment method include the method described in 1 (1) above.
  • a gene replacement method using recombinant DNA technology a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of D-allose-6-phosphate isomerase, RpiR, D-allose transport protein, and D-allose kinase in vitro.
  • One or more base substitutions, deletions or additions can be introduced into the above, and substitution can be performed using the homologous recombination method of 1 (1) above.
  • the genes encoding D-allose-6-phosphate isomerase, RpiR, D-allose transport protein, and D-allose kinase can be designed based on the base sequences represented by SEQ ID NOs: 43 to 48, respectively. Using DNA, it can be obtained by the method using PCR described in 1 (1) above.
  • Substitution or deletion of one or more bases in a gene encoding at least one protein selected from the group consisting of D-allose-6-phosphate isomerase, RpiR, D-allose transport protein, and D-allose kinase in vitro The method of introducing an addition and the method of replacing the gene prepared by the above method with the target region on the chromosomal DNA of the parent strain by homologous recombination etc. are the same as the method of 1 (1) above. .
  • a microorganism in which the activity of D-allose-6-phosphate isomerase is reduced or lost compared to the parent strain is, for example, that the parent strain and the microorganism are cultured in a medium containing D-allose-6-phosphate, and the culture solution This can be confirmed by comparing the ratio of D-psicose-6-phosphate in the microbial cells.
  • the fact that the activity of the D-allose transport protein is reduced or lost compared to the parent strain means that, for example, the parent strain and the microorganism are cultured in a medium containing D-allose, and the D-allose ratio in the culture solution is compared. This can be confirmed.
  • a microorganism in which the activity of D-allose kinase is reduced or lost compared to the parent strain is, for example, that the parent strain and the microorganism are cultured in a medium containing D-allose, and the D-allose- This can be confirmed by comparing the 6-phosphate ratio.
  • the transcription amount of the gene encoding at least one protein selected from the group consisting of D-allose-6-phosphate isomerase, RpiR, D-allose transport protein and D-allose kinase, or the production amount of the protein was reduced or lost.
  • microorganisms include those lacking the allose-utilizing operon. Specifically, for example, MG1655 ⁇ als described later in the examples can be given.
  • Microorganisms that have reduced or lost 6-phosphofructokinase activity compared to the parent strain have a base sequence of the gene encoding wild-type 6-phosphofructokinase that does not contain the mutation present on the chromosomal DNA. Obtained by introducing a deletion, substitution or addition, (a) the specific activity of the protein is 80% or less, preferably 50% or less, more preferably 30% or less, even more preferably 20% or less, compared to the parent strain Particularly preferably 10% or less, most preferably reduced to 0%, and (b) the transcription amount of the gene or the production amount of the protein is 80% or less, preferably 50% or less, more preferably compared to the parent strain. Can be mentioned microorganisms that have been reduced to 30% or less, more preferably 20% or less, particularly preferably 10% or less, and most preferably 0%. More preferred examples include microorganisms that are partially or completely deficient in the gene.
  • the gene encoding 6-phosphofructokinase may be any gene that encodes a protein having 6-phosphofructokinase activity, and specifically comprises the following [1] to [4].
  • One gene selected from the group can be mentioned.
  • a gene encoding a homologous protein having fructokinase activity [3] a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 49, and [4] A gene that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 49 and encodes a homologous protein having 6-phosphofructokinase activity
  • hybridize the method of DNA hybridization experiment, and the stringent conditions described above are the same as described in 1 (1) above.
  • the DNA that can hybridize under the above-mentioned stringent conditions includes, for example, at least a DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 49 when calculated based on the above-described parameters using BLAST, FASTA, etc.
  • a DNA having 95% or more, preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more can be mentioned.
  • a microorganism in which the activity of 6-phosphofructokinase is reduced or lost compared to the parent strain is, for example, a microorganism that can be obtained by any one of the methods 1 (1) to (3) described above as a parent strain, and the 6-phosphofructokinase activity of the parent strain
  • the fructokinase activity can be obtained by reducing or losing it using a usual mutation treatment method, a gene replacement method using recombinant DNA technology, or the like.
  • Examples of the mutation treatment method include the method described in 1 (1) above.
  • one or more base substitutions, deletions or additions are introduced into a gene encoding a protein having 6-phosphofructokinase activity in vitro, and the above 1 (1) And a method of substitution using the homologous recombination method.
  • a gene encoding a protein having 6-phosphofructokinase activity is obtained by performing PCR described in 1 (1) above using a probe DNA that can be designed based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 49, for example. It can be obtained by the method used.
  • the method of substituting the target region on the chromosomal DNA of the parent strain is the same as the method described in 1 (1) above.
  • 6-phosphofructokinase activity is reduced or lost compared to the parent strain is, for example, that the parent strain and the microorganism are cultured in a medium containing fructose-6-phosphate, and are cultured in the culture solution and in the microorganism cell. This can be confirmed by comparing the fructose 1,6-diphosphate or fructose 2,6-diphosphate ratio.
  • the amount of transcription of a gene encoding a protein having 6-phosphofructokinase activity or the production of the protein is reduced or lost.
  • the amount of transcription of the gene of the microorganism is expressed as follows: It can be confirmed by comparing the production amount of the protein of the microorganism with that of the parent strain by Northern blotting or by Western blotting.
  • microorganisms in which the transcription amount of a gene encoding a protein having 6-phosphofructokinase activity or the production amount of the protein is reduced or lost include MG1655 ⁇ als ⁇ pfkA described later in Examples.
  • D-psicose of the present invention 2.1. Method for producing D-psicose using sugar as substrate
  • the activity of the protein according to any one of [1] to [3] above as an enzyme source A culture of a microorganism that produces D-psicose-6-phosphate from sugar (hereinafter referred to as 2.1 microorganism) or a treated product of the culture, and (ii) a sugar as a substrate,
  • a method for producing D-psicose, characterized in that it is present in a medium, D-psicose is produced and accumulated in the aqueous medium, and D-psicose is collected from the aqueous medium, will be described below.
  • the method for culturing microorganisms can be performed according to a conventional method used for culturing microorganisms.
  • a medium for culturing the microorganism any of a natural medium and a synthetic medium can be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the microorganism, and can efficiently culture the microorganism. May be.
  • Any carbon source may be used as long as the microorganism can assimilate, for example, glucose, fructose, sucrose, molasses containing them, carbohydrates such as starch and starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and the like. And alcohols such as ethanol and propanol.
  • nitrogen source examples include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium salts of organic acids such as ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented bacterial cells, digests thereof, and the like can be used.
  • inorganic salt examples include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • the culture is preferably performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 15 to 40 ° C., and the culture time is usually 5 hours to 7 days.
  • the pH during the culture is preferably maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the medium as needed during the culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside is used when cultivating a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter
  • indole acrylic is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter.
  • An acid or the like may be added to the medium.
  • the culture of microorganisms obtained by the above culture or the processed product of the culture is used as an enzyme source, the enzyme source and sugar are present in an aqueous medium, and D-psicose is generated and accumulated in the aqueous medium. By collecting D-psicose from the medium, D-psicose can be produced.
  • the processed product of the culture includes the concentrate of the culture, the dried product of the culture, the cells obtained by centrifuging or filtering the culture, and the drying of the cells.
  • a concentrate of the culture, a dried product of the culture, a microbial cell obtained by centrifuging or filtering the culture, a dried product of the microbial cell Functions similar to the culture as an enzyme source such as a lyophilized product, a surfactant-treated product of the microbial cell, a solvent-treated product of the microbial cell, an enzyme-treated product of the microbial cell, and an immobilized product of the microbial cell Examples include those containing viable cells to be retained, as well as sonicated products of the cells and mechanically ground products of the cells, most preferably the concentrate of the culture and the culture.
  • a dried product of the cell a cell obtained by centrifuging or filtering the culture, a dried product of the cell, a freeze-dried product of the cell, a surfactant-treated product of the cell, As a source of enzyme such as a solvent-treated product, an enzyme-treated product of the bacterial cell, and an immobilized product of the bacterial cell, Include those which Nde.
  • the amount of the enzyme source is preferably 1 to 500 g / l, more preferably 1 to 300 g / l for each enzyme source used.
  • the sugar concentration is preferably 0.1 mM to 10 M, more preferably 1 mM to 1 M.
  • sugar include glucose, fructose and sucrose.
  • aqueous medium examples include buffers such as water, phosphate, carbonate, acetate, borate, citrate and tris, alcohols such as methanol and ethanol, esters such as ethyl acetate, acetone and the like. Examples include ketones and amides such as acetamide.
  • the culture solution of the microorganism used as an enzyme source can be used as an aqueous medium.
  • a chelating agent such as phytic acid, a surfactant or an organic solvent may be added as necessary.
  • the surfactant include nonionic surfactants such as polyoxyethylene / octadecylamine (for example, Nimine S-215, manufactured by NOF Corporation), cetyltrimethylammonium / bromide and alkyldimethyl / benzylammonium chloride (for example, cation F2-40E).
  • Cationic surfactants such as Nippon Oil & Fats Co., Ltd., anionic surfactants such as lauroyl and sarcosinate, tertiary amines such as alkyldimethylamine (eg, tertiary amine FB, manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), etc. Any one may be used as long as it promotes the generation of psicose, and one kind or a mixture of several kinds may be used.
  • the surfactant is usually used at a concentration of 0.1 to 50 g / l.
  • Examples of the organic solvent include xylene, toluene, aliphatic alcohol, acetone, ethyl acetate and the like, and they are usually used at a concentration of 0.1 to 50 ml / l.
  • the reaction for producing D-psicose is carried out in an aqueous medium at pH 5 to 10, preferably pH 6 to 8, and 20 to 50 ° C. for 1 to 96 hours.
  • adenine, adenosine-5'-monophosphate (AMP), adenosine-5'-triphosphate (ATP), magnesium sulfate, magnesium chloride and the like can be added.
  • Adenine, AMP and ATP are usually used at a concentration of 0.01 to 100 mmol / l.
  • D-psicose produced in an aqueous medium can be quantified using a sugar analyzer manufactured by Dionex [Anal. Biochem., 189, 151 (1990)].
  • the D-psicose produced in the reaction solution can be collected by a usual method using activated carbon, ion exchange resin, or the like.
  • D-psicose is obtained from a sugar having enhanced activity of the protein according to any one of [1] to [3] above.
  • -Production of D-psicose characterized by culturing a microorganism producing 6-phosphate in a medium, producing and accumulating D-psicose in the culture, and collecting D-psicose from the culture The method will be described below.
  • the method for culturing the microorganism can be performed according to a usual method used for culturing microorganisms.
  • a medium for culturing the microorganism a medium containing a receptor carbohydrate in the medium described in 2.1 above can be used.
  • D-psicose can be produced by producing and accumulating D-psicose in the culture by the above culture and collecting D-psicose from the culture.
  • a method for quantifying D-psicose the method described in 2.1 above can be used.
  • D-psicose can be collected from the culture by combining an ion exchange resin method, a precipitation method and other known methods.
  • an ion exchange resin method for example, the microbial cells are crushed by ultrasonic waves, and the microbial cells are removed by centrifugation. Can be collected.
  • FIG. 1 (a) shows a schematic diagram of the metabolic system of D-allose possessed by microorganisms belonging to the genus Escherichia.
  • FIG. 1 (b) shows a schematic diagram of a specific example of D-psicose production by microorganisms used in the method for producing D-psicose of the present invention.
  • [1] the allose-utilizing operon is destroyed, and the expression of the gene (alsE) encoding allulose-6-phosphate 3-epimerase is enhanced compared to the parent strain, and [2 ] A gene encoding phosphofructokinase (pfkA) is disrupted, and [3] D-psicose is obtained by fermentation using a microorganism having enhanced D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity than the parent strain. The case of manufacturing will be described.
  • Fig. 2 shows a schematic diagram of the allose-utilizing operon of microorganisms belonging to the genus Escherichia (J. Bacteriol. 181, 7126-7130, 1999).
  • the allose-utilizing operon of microorganisms belonging to the genus Escherichia includes a gene encoding D-allose-6-phosphate isomerase (rpiB), a gene encoding repressor (rpiR), and D-allose transport.
  • rpiB D-allose-6-phosphate isomerase
  • rpiR gene encoding repressor
  • a gene (alsB) encoding a protein (binding protein), a gene (alsA) encoding a D-allose transport protein (ATPase), a gene (alsC) encoding a D-allose transport protein (membrane protein), and allulose-6 -Phosphorus is composed of a gene (alsE) and yjct (alsK) encoding 3-epimerase activity.
  • fructose-6-phosphate is metabolized to fructose-6-phosphate by disrupting the gene (pfkA) encoding 6-phosphofructokinase. By acting, it can be suppressed to become fructose 1,6-diphosphate or fructose 2,6-diphosphate, and fructose-6-phosphate as a substrate can be accumulated in the microorganism.
  • D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity is enhanced as compared with the parent strain, so that D-psicose-6-phosphate is dephosphorylated.
  • D-psicose can be produced with high efficiency.
  • Microorganisms used in the method for producing D-alloheptulose of the present invention and methods for producing the microorganisms examples include the microorganisms described in (2A) to (2C) below. .
  • the parent strain described in 1 (1) above can be used as the parent strain of the microorganism having enhanced allulose-6-phosphate 3-epimerase activity compared to the parent strain.
  • Examples of microorganisms having enhanced allulose-6-phosphate 3-epimerase activity as compared to the parent strain include the following microorganisms (a) and (b) similar to those described in 1 (2) above.
  • the fact that the specific activity of the protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity is enhanced as compared with the parent strain is that, for example, the parent strain and the microorganism are cultured, and the culture is sonicated. This can be confirmed by adding sedoheptulose-7-phosphate and other substrates to the treated product, and measuring and comparing the amount of synthesized D-alloheptulose-7-phosphate by HPLC.
  • microorganism having enhanced allulose-6-phosphate 3-epimerase activity as compared with the parent strain include a microorganism having enhanced activity of the protein according to any one of [8] to [10] below than the parent strain. It is done.
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added
  • a mutant protein having allulose-6-phosphate 3-epimerase activity [10] consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and allulose-6-phosphate 3 -Homologous proteins with epimerase activity
  • a microorganism in which the activity of the protein described in any one of [8] to [10] is enhanced as compared with the parent strain can be obtained by the same method as described in 1 (1) above. It can be confirmed by a method similar to the method described in 1 (1) above.
  • the microorganism having an enhanced activity of the protein according to any one of [8] to [10] has an activity of isomerizing sedheptulose-7-phosphate to D-alloheptulose-7-phosphate. This activity of the protein has been revealed for the first time in the present invention.
  • microorganisms examples include MG 1655 / pUC19_alsE and MGC / pUC19_alsE described later in the examples.
  • (2B) A microorganism that produces sedheptulose-7-phosphate from a sugar having enhanced allulose-6-phosphate 3-epimerase activity as compared to the parent strain “to produce sedheptulose-7-phosphate from a sugar” When cultured in a medium, it means that sedoheptulose-7-phosphate is produced and accumulated in cells of the microorganism using sugar as a starting substrate.
  • the parent strain may be a wild strain as long as it is a microorganism that produces sedheptulose-7-phosphate from sugar, or an artificial strain if the wild strain does not have the ability to produce sedheptulose-7-phosphate from sugar.
  • it may be a breeding strain imparted with the ability to produce cedoheptulose-7-phosphate from sugar.
  • Microorganisms that produce D-alloheptulose-7-phosphate from sugars that have enhanced allulose-6-phosphate 3-epimerase activity than the parent strain can be obtained by the same method as described in 1 (2) above. it can.
  • microorganisms that produce D-alloheptulose-7-phosphate from sugar include microorganisms that have reduced or lost 6-phosphofructokinase activity compared to the parent strain.
  • a microorganism having a reduced or lost 6-phosphofructokinase activity compared to the parent strain can be obtained by the same method as described in 1 (4) above. It can confirm by the method similar to the method of description.
  • Allulose-6-phosphate 3-epimerase activity is enhanced compared to the parent strain, and further, 6-phosphofructokinase activity is reduced or lost, reducing the flow of carbon to the central metabolism and entering the pentose phosphate pathway. It is considered that the productivity of D-alloheptulose is improved by increasing the amount of inflow.
  • microorganisms examples include MG1655 ⁇ als ⁇ pfkA / pUC19_alsE and MGC ⁇ als ⁇ pfkA / pUC19_alsE described later in the Examples.
  • (2C) A microorganism that produces sedoheptulose-7-phosphate from sugar and D-alloheptulose from D-alloheptulose-7-phosphate, which has enhanced allulose-6-phosphate 3-epimerase activity compared to the parent strain.
  • “Microorganism producing D-alloheptulose from D-alloheptulose-7-phosphate” refers to D-alloheptulose-7-phosphate as a starting substrate when D-alloheptulose-7-phosphate is used as a starting substrate. It means generating and accumulating.
  • “generate sedoheptulose-7-phosphate from sugar and D-alloheptulose from D-alloheptulose-7-phosphate” means that sedoheptulose-7-phosphate is generated from sugar and sedoheptulose-7 -Production of D-alloheptulose using D-alloheptulose-7-phosphate obtained by isomerizing phosphoric acid as a substrate.
  • the parent strain may be a wild strain as long as it is a microorganism that produces sedheptulose-7-phosphate from sugar and D-alloheptulose-7-phosphate from D-alloheptulose.
  • microorganisms that produce D-alloheptulose from D-alloheptulose-7-phosphate include microorganisms in which the activity of the protein according to any one of the following [11] to [13] is enhanced as compared with the parent strain: .
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 [12] consisting of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and A mutant protein having D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity [13] consisting of an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and D-psicose-6-phosphorus Homologous protein with acid dephosphorylation activity
  • a microorganism in which the activity of the protein according to any one of [11] to [13] is enhanced as compared with the parent strain can be obtained by a method similar to the method described in 1 (1) above. It can be confirmed by a method similar to the method described in 1 (1) above.
  • microorganisms examples include MGC / pUC19_alsE and MGC ⁇ als ⁇ pfkA / pUC19_alsE described later in Examples.
  • Production method of D-alloheptulose of the present invention 4.1. Method for producing D-alloheptulose using sugar as a substrate Among the methods for producing D-alloheptulose of the present invention, (i) the above-mentioned 3.
  • a culture of the microorganisms (2A) to (2C) hereinafter referred to as 4.1 microorganisms described in 1.
  • a method for producing D-alloheptulose characterized in that it is present in a medium, D-alloheptulose is produced and accumulated in the aqueous medium, and D-alloheptulose is collected from the aqueous medium, will be described below.
  • the method described in 2.1 above can be used as the method for culturing the microorganism of 4.1.
  • 4.1 Microorganism culture obtained by culturing microorganisms or treated product thereof, and a dephosphorylation enzyme as an enzyme source, the enzyme source and sugar are present in an aqueous medium, and the aqueous medium D-alloheptulose can be produced by producing and accumulating D-alloheptulose therein and collecting D-alloheptulose from the medium.
  • the concentrate of the culture, the dried product of the culture, the culture is centrifuged, filtered, or the like Cells, dried product of the cells, freeze-dried product of the cells, surfactant-treated product of the cells, solvent-treated product of the cells, enzyme-treated product of the cells, and the What contains a living microbial cell that retains the same function as the culture as an enzyme source such as an immobilized product of the microbial cell, as well as a sonicated product of the microbial cell, a mechanically ground processed product of the microbial cell, Examples include crude enzyme extracts obtained from the treated cells and purified enzymes obtained from the treated cells.
  • any dephosphorylating enzyme may be used as long as it has an activity to dephosphorylate D-alloheptulose-7-phosphate.
  • the parent strain described in 1 (1) above originally has The phosphatase is preferably a phosphatase encoded by the yniC gene.
  • a chelating agent such as phytic acid, a surfactant, or an organic solvent may be added as necessary.
  • a surfactant and the organic solvent those described in 2.1 can be used.
  • D-alloheptulose produced in an aqueous medium can be quantified using a sugar analyzer manufactured by Dionex [Anal. Biochem., 189, 151 (1990)]. D-alloheptulose produced in the reaction solution can be collected by a usual method using activated carbon, ion exchange resin or the like.
  • D-alloheptulose-7-phosphate is produced from sugar, which has enhanced allulose-6-phosphate 3-epimerase activity compared to the parent strain.
  • a method for producing D-alloheptulose which comprises culturing a microorganism to be cultured in a medium, producing and accumulating D-alloheptulose in the culture, and collecting D-alloheptulose from the culture, is described below.
  • the method for culturing the microorganism can be performed according to a usual method used for culturing microorganisms.
  • a medium for culturing the microorganism a medium containing a receptor carbohydrate in the medium described in 2.1 above can be used.
  • D-alloheptulose can be produced by producing and accumulating D-alloheptulose in the culture by the above culture and collecting D-alloheptulose from the culture.
  • a method for quantifying D-alloheptulose the method described in 4.1 above can be used.
  • the collection of D-alloheptulose from the culture can be usually carried out by a combination of ion exchange resin method, precipitation method and other known methods.
  • D-alloheptulose accumulates in the microbial cells, for example, the microbial cells are crushed by ultrasonic waves, and the microbial cells are removed by centrifugation. Can be collected.
  • Example 1 Construction of microorganisms used in the production of D-psicose (1) Acquisition of DNA fragments used as markers in gene deletion and gene replacement Table 1 shows the DNA comprising the nucleotide sequence represented by “Primer set” in Table 1 as a primer set. PCR was carried out using the DNA described in the “template” as a template to amplify each DNA fragment.
  • Bacillus subtilis 168 strain genomic DNA was prepared by a conventional method.
  • the cat of the amplified DNA fragment contains about 200 bp upstream to about 100 bp downstream of the cat gene.
  • the amplified DNA fragment sacB contains about 300 bp upstream to about 100 bp downstream of the sacB gene.
  • a SalI recognition site is given to DNA consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 38 and 40.
  • the cat and sacB of the amplified DNA fragment were cut with the restriction enzyme SalI, and DNA ligation Kit Ver. 2 (manufactured by Takara Bio Inc.). PCR is performed using the ligation reaction solution as a template and the DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 39 and 41 as a primer set, and a DNA fragment containing the cat gene and sacB gene (hereinafter referred to as cat-sacB) fragment.
  • cat-sacB a DNA fragment containing the cat gene and sacB gene
  • AlsK upstream 1 and alsK upstream 2 contain about 1000 bp upstream from the start codon of the alsK gene.
  • rpiB downstream 1 and rpiB downstream 2 contain approximately 1000 bp downstream from the stop codon of the rpiB gene.
  • PCR was performed using as a template a mixture of alsK upstream 1, rpiB downstream 1, and cat-sacB fragment at equimolar ratios, and using a DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 3 and 6 as a primer set, A DNA fragment (hereinafter referred to as “als :: cat-sacB”) containing an allose-utilizing operon into which a cat-sacB fragment was inserted was obtained.
  • PCR is carried out using a mixture of alsK upstream 2 and rpiB downstream 2 in equimolar ratio as a template, and using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 3 and 6 as a primer set, and rpiB, ripR, alsA, A DNA (hereinafter referred to as ⁇ als) fragment containing the region around the allose-utilizing operon lacking alsB, alsC, alsE, and alsK was obtained.
  • the als :: cat-sacB fragment was transformed into plasmid pKD46 [Datsenko, KA, Warner, BL, Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, Vol. 97. 6640-6645 ( 2000)] is transferred to the Escherichia coli MG1655 strain by electroporation, and a chloramphenicol resistant and sucrose sensitive transformant (allose-utilizing operon is transformed into als :: cat-sacB). A substituted transformant) was obtained.
  • the ⁇ als fragment was introduced into the transformant by electroporation to obtain a transformant exhibiting chloramphenicol sensitivity and sucrose resistance (als :: cat-sacB replaced with ⁇ als). . Furthermore, a transformant exhibiting ampicillin sensitivity (transformant from which pKD46 had been removed) was obtained.
  • the microorganism was named MG1655 ⁇ als.
  • PfkA upstream 1 and pfkA upstream 2 contain about 700 bp upstream from the start codon of the pfkA gene.
  • pfkA downstream 1 and pfkA downstream 2 contain about 800 bp downstream from the stop codon of the pfkA gene.
  • PCR was carried out using DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 9 and 12 as a primer set, using as a template a mixture of pfkA upstream 1, pfkA downstream 1, and cat-sacB fragment at an equimolar ratio, A DNA fragment (hereinafter referred to as pfkA :: cat-sacB) containing the pfkA peripheral region into which the cat-sacB fragment was inserted was obtained.
  • pfkA a DNA fragment
  • PCR was performed using a mixture of pfkA upstream 2 and pfkA downstream 2 in equimolar ratio as a template, using the DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 9 and 12 as a primer set, and pfkA gene lacking pfkA gene A DNA fragment (hereinafter referred to as ⁇ pfkA) containing the peripheral region was obtained.
  • the ⁇ pfkA fragment was introduced into the transformant by electroporation to obtain a transformant showing chloramphenicol sensitivity and sucrose resistance (transformant in which pfkA :: cat-sacB was replaced with ⁇ pfkA). It was. Furthermore, a transformant from which pKD46 was eliminated was obtained.
  • the microorganism was named MG1655 ⁇ als ⁇ pfkA.
  • telomere sequence For the trp promoter, use pTK31 (APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2007, Vol. 73, No. 20, p. 6378-6385) as a template, and for other amplified DNA fragments, use the genomic DNA of Escherichia coli MG1655 strain as a template. PCR was performed using DNA consisting of the base sequence represented by “Primer set” in Table 4 as a primer set, and each DNA fragment was amplified.
  • YniC upstream 1 and yniC upstream 2 contain about 1000 bp upstream from the start codon of the yniC gene.
  • the yniC downstream 1 contains about 1000 bp downstream from the stop codon of the yniC gene.
  • the yniC downstream 2 contains about 1000 bp downstream from the start codon of the yniC gene to the stop codon.
  • PCR was carried out using as a template a mixture of yniC upstream 1, yniC downstream 1, and cat-sacB fragment at equimolar ratios, and using a DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 17 and 20 as a primer set, A DNA fragment (hereinafter referred to as yniC :: cat-sacB) fragment containing the region surrounding yniC into which the cat-sacB fragment was inserted was obtained.
  • a Ptrp-yniC fragment was introduced into the transformant by electroporation, and a transformant exhibiting chloramphenicol sensitivity and sucrose resistance (yniC :: cat-sacB was replaced with Ptrp-yniC) Body). Furthermore, a transformant from which pKD46 was eliminated was obtained.
  • the microorganism was named MGC.
  • PCR was performed using pTK31 as a template, and other fragments using Escherichia coli MG1655 genomic DNA as a template and DNA consisting of the nucleotide sequence represented by “Primer set” in Table 5 as a primer set. Each DNA fragment was amplified.
  • the ybiV upstream 1 and the ybiV upstream 2 of the amplified DNA fragment contain about 1000 bp upstream from the start codon of the ybiV gene.
  • ybiV downstream 1 contains approximately 1000 bp downstream from the stop codon of the ybiV gene.
  • YbiV downstream 2 contains about 1000 bp downstream from the start codon of the ybiV gene to the stop codon.
  • PCR is carried out using a mixture of equimolar ratios of ybiV upstream 1, ybiV downstream, and cat-sacB fragment as a template, using the DNA consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 29 and 32 as a primer set, and cat A DNA fragment (hereinafter referred to as ybiV :: cat-sacB) containing the region surrounding ybiV in which the sacB fragment was inserted was obtained.
  • a transformant in which the ybiV :: cat-sacB fragment was introduced into Escherichia coli MG1655 strain carrying pKD46 by electroporation and showed chloramphenicol resistance and sucrose sensitivity (ybiV gene was ybiV :: a transformant substituted with cat-sacB).
  • a Ptrp-ybiV fragment was introduced into the transformant by electroporation, and a transformant showing chloramphenicol sensitivity and sucrose resistance (ybiV :: cat-sacB was replaced with Ptrp-ybiV) Body). Furthermore, a transformant from which pKD46 was eliminated was obtained.
  • the microorganism was named MGV.
  • MGV ⁇ als ⁇ pfkA in which the trp promoter was inserted upstream of the ybiV gene of MG1655 ⁇ als ⁇ pfkA was constructed in the same manner.
  • MUC, MGV, MGC ⁇ als ⁇ pfkA and MGV ⁇ als ⁇ pfkA were transformed with pUC19_alsE to obtain MGC / pUC19_alsE, MGV / pUC19_alsE, MGC ⁇ als ⁇ pfkA / pUC19pAlsEp19As
  • Escherichia coli MG1655 and MG1655 ⁇ als ⁇ pfkA were transformed with pUC19_alsE to obtain MG1655 / pUC19_alsE and MG1655 ⁇ als ⁇ pfkA / pUC19_alsE, respectively.
  • Example 2 Manufacture of D-psicose The cells were cultured overnight, inoculated into a large test tube containing 5 mL of LB medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 12 hours. 100 mg / L ampicillin was added as needed.
  • Test tube production medium [glucose 20 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 2 g / L, casamino acid 5 g / L, ammonium sulfate 2 g / L, citric acid 1 g / L, potassium dihydrogen phosphate 14 g / L, hydrogen hydrogen phosphate Potassium 16 g / L, thiamine hydrochloride 10 mg / L, ferrous sulfate heptahydrate 50 mg / L, manganese sulfate pentahydrate 10 mg / L, adjusted to pH 7.2 with sodium hydroxide solution, glucose and magnesium sulfate The heptahydrate aqueous solution is separately autoclaved, cooled, and mixed.
  • the culture solution was appropriately diluted and centrifuged, and the psicose concentration in the supernatant was quantified with a sugar analyzer ICS-5000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific). The results are shown in Table 6.
  • the yniC gene and the ybiV gene have D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity, and D-psicose-6-phosphate dephosphorylation obtained by transforming the gene. It was found that D-psicose can be efficiently produced by using a microorganism that has enhanced phosphorylation activity and produces D-psicose-6-phosphate from sugar.
  • Example 3 Production of D-psicose using a treated product of the culture of microorganisms MG1655 / pUC19_alsE, MG1655 ⁇ als ⁇ pfkA / pUC19_alsE, MGC / pUC19_alsFs19, MGV / pUC19_als19, MGV / pUC19_als19
  • a large test tube containing 5 ml of LB medium [Bactotryptone (Difco) 10 g / l, Yeast extract (Difco) 5 g / l, Sodium chloride 5 g / l] containing 50 mg / ml of ampicillin. Incubate at 30 ° C. for 16 hours.
  • 10% of the culture solution is inoculated into an Erlenmeyer flask with baffle containing 50 ml of LB medium containing 50 mg / ml of ampicillin, and cultured at 30 ° C. and 220 rpm for 8 hours. Centrifuge 40 ml of the culture solution to obtain wet cells.
  • reaction buffer 0.1 M bicine buffer (pH 8.0), 10 mM manganese chloride
  • reaction buffer 0.1 M bicine buffer (pH 8.0), 10 mM manganese chloride
  • the mixture is centrifuged at 18,000 ⁇ g for 5 minutes to precipitate the membrane fraction, and then the supernatant is collected.
  • the supernatant is quantified for protein using the Bradford method and used for the reaction.
  • the reaction is performed by adding the above-described supernatant protein solution to a reaction buffer containing 12.5 mM glucose to a final concentration of 0.25 mg / ml and shaking at 30 ° C. and 330 rpm.
  • the reaction is terminated by adding a 1/4 amount of 6.7M phosphoric acid.
  • reaction solution After completion of the reaction, the reaction solution is appropriately diluted and centrifuged, and the psicose concentration of the supernatant is quantified with a sugar analyzer ICS-5000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • Example 4 Production of D-alloheptulose MG1655 / pUC19_alsE, MG1655 ⁇ als ⁇ pfkA / pUC19_alsE, MGC / pUC19_alsE, MGV / pUC19_alsE, MGV / pUC19_alsE, MGC ⁇ alp ⁇ 19
  • the cells were cultured overnight at 30 ° C., inoculated into a large test tube containing 5 mL of LB medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 12 hours.
  • Test tube production medium [glucose 20 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 2 g / L, casamino acid 5 g / L, ammonium sulfate 2 g / L, citric acid 1 g / L, potassium dihydrogen phosphate 14 g / L, dihydrogen phosphate Potassium 16 g / L, thiamine hydrochloride 10 mg / L, ferrous sulfate heptahydrate 50 mg / L, manganese sulfate pentahydrate 10 mg / L, adjusted to pH 7.2 with sodium hydroxide solution, glucose and magnesium sulfate The heptahydrate aqueous solution is separately autoclaved, cooled, and mixed.
  • Example 5 Production of D-alloheptulose using a processed product of a microorganism culture MG1655 / pUC19_alsE, MG1655 ⁇ als ⁇ pfkA / pUC19_alsE, MGC / pUC19_als19, MGf / pUC19_als19, MGC ⁇ p1919 was inoculated into a large test tube containing 5 ml of LB medium [Bactotryptone (Difco) 10 g / l, Yeast extract (Difco) 5 g / l, Sodium chloride 5 g / l] containing 50 mg / ml of ampicillin. Incubate at 30 ° C. for 16 hours.
  • 10% of the culture solution is inoculated into an Erlenmeyer flask with baffle containing 50 ml of LB medium containing 50 mg / ml of ampicillin, and cultured at 30 ° C. and 220 rpm for 8 hours. Centrifuge 40 ml of the culture solution to obtain wet cells.
  • reaction buffer 0.1 M bicine buffer (pH 8.0), 10 mM manganese chloride
  • reaction buffer 0.1 M bicine buffer (pH 8.0), 10 mM manganese chloride
  • the mixture is centrifuged at 18,000 ⁇ g for 5 minutes to precipitate the membrane fraction, and then the supernatant is collected.
  • the supernatant is quantified for protein using the Bradford method and used for the reaction.
  • the reaction is performed by adding the above-described supernatant protein solution to a reaction buffer containing 12.5 mM glucose to a final concentration of 0.25 mg / ml and shaking at 30 ° C. and 330 rpm.
  • the reaction is terminated by adding a 1/4 amount of 6.7M phosphoric acid.
  • reaction solution After completion of the reaction, the reaction solution is appropriately diluted, centrifuged, and the alloheptulose concentration in the supernatant is quantified with a sugar analyzer ICS-5000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • the method for producing D-psicose of the present invention by using a microorganism that produces D-psicose-6-phosphate from a sugar having enhanced D-psicose-6-phosphate dephosphorylation activity as compared with the parent strain. Therefore, the metabolic system of D-allose possessed by microorganisms can be used efficiently, the production of by-product sugar and the remaining of the substrate can be suppressed, and D-psicose can be produced with high efficiency.
  • D-alloheptulose of the present invention by using a microorganism that produces D-alloheptulose-7-phosphate from a sugar having an allulose-6-phosphate 3-epimerase activity enhanced compared to the parent strain. D-alloheptulose can be produced with high efficiency.

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Abstract

本発明は、微生物、微生物の培養物または該培養物の処理物を用いた効率的な希少糖の製造法を提供することを目的とする。本発明は、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化酵素活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物を利用することにより、微生物が有するＤ－アロースの代謝系を利用してＤ－プシコースを製造する方法、およびアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物を利用することによりＤ－アロヘプツロースを製造する方法に関する。

Description

希少糖の製造法
　本発明は、微生物、微生物の培養物または該培養物の処理物を用いた希少糖の効率的な製造法、より詳しくはＤ－プシコースの製造法およびＤ－アロヘプツロースの製造法に関する。
　希少糖は国際希少糖学会の定義によれば「自然界に希にしか存在しない糖」と定義されており、自然界における存在量が少ない単糖である。希少糖は、一般に有機化学的合成方法における合成反応においては収量の少ないものが多い。
　希少糖の一種であるＤ－プシコースは、砂糖の７割程度の甘味がありながらカロリーはほとんどなく、そのため低カロリー甘味料として用いることが出来る。また血圧上昇の抑制作用および内臓脂肪蓄積の抑制作用なども認められている。
　プシコースの製造法としては、アルカリを用いた化学異性化反応および酵素法が知られている。特許文献１には、化学異性化反応を用いたプシコースの製造法が開示されている。また、特許文献２および３並びに非特許文献１～４には、Ｄ－プシコースの生合成に係る酵素が開示されている。また、非特許文献５には、ホウ素を用いて反応効率を上げる方法が開示されている。
　また、希少糖の一種であるＤ－アロヘプツロースは、７炭糖の一種であり、黄花九輪桜の根に微量含まれていることが確認されているが（非特許文献６）、その生理機能についての報告はほとんどされていない。Ｄ－アロヘプツロースの製造法としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ由来の酵素を用いた酵素法やＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを用いた発酵法が開示されている（非特許文献７）。
国際公開第２０１０１１３７８５号 日本国特開平６－１２５７７６号公報 日本国特表２０１３－５０１５１９号公報
Journal of fermentation and bioengineering (1995) vol. 80, p. 101-103. Appl. Environ. Microbiol.（2006）vol. 72, p. 981-985 Biotechnology Letters （2009）vol. 31, p. 857-862 World Journal of Microbiology and Biotechnology(2007) vol. 23, p. 559-563 Appl. Environ. Microbiol.（2008）vol. 74, p. 3008-3013 Carbohydrate Research 2.4 (1966): 272-288. Biotechnology and bioengineering 112.1 (2015): 168-180.
　化学異性化反応を用いたＤ－プシコースの製造法は、特異的にＤ－プシコースを製造することができないため、Ｄ－プシコース以外の副生糖も大量に生成される他、反応効率が低く、基質となる異性化糖が多く残存する。
　また、Ｄ－プシコースの生合成に係る酵素を用いたＤ－プシコースの製造法は、反応効率は良くて３３％程度である。さらに、ホウ素を用いてＤ－プシコースへの反応効率を上げた場合でもその変換率は６０％程度となっている。
　このように、これまでの方法はいずれも可逆的な反応を用いたものであり、基質となるグルコースまたはフルクトースの残存が避けられないという問題があった。
　したがって、本発明は、微生物、微生物の培養物または該培養物の処理物を用いた効率的な希少糖の製造法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を検討した結果、親株よりもＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物を利用することにより、効率的にＤ－プシコースを製造できることを見出した。また、親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物を利用することにより、効率的にＤ－アロヘプツロースを製造できることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下に関する。
＜１＞（ｉ）酵素源として、親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物の培養物または該培養物の処理物、および（ｉｉ）基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＤ－プシコースを採取することを特徴とする、Ｄ－プシコースの製造法。
［１］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
＜２＞親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物を培地に培養し、培養物中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－プシコースを採取することを特徴とする、Ｄ－プシコースの製造法。
［１］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
＜３＞糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、以下の［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強した微生物である、＜１＞または＜２＞に記載の製造法。
［４］＜１＞または＜２＞の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］配列番号５０または５１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［６］配列番号５０または５１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［７］配列番号５０または５１で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
＜４＞糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、前記親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物である、＜１＞～＜３＞のいずれか１に記載の製造法。
＜５＞糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質の活性が低下または喪失した微生物である、＜１＞～＜４＞のいずれか１に記載の製造法。
＜６＞糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物である、＜１＞～＜５＞のいずれか１に記載の製造法。
＜７＞（ｉ）酵素源として、親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物の培養物または該培養物の処理物、及び（ｉｉ）基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＤ－アロヘプツロースを採取することを特徴とする、Ｄ－アロヘプツロースの製造法。
＜８＞親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物を培地に培養し、培養物中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－アロヘプツロースを採取することを特徴とする、Ｄ－アロヘプツロースの製造法。
＜９＞前記微生物が糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物である＜７＞または＜８＞に記載の製造法。
＜１０＞前記微生物がＤ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物である＜７＞～＜９＞のいずれか１に記載の製造法。
＜１１＞親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物が、以下の［８］～［１０］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物である、＜７＞～＜１０＞のいずれか１に記載の製造法。
［８］配列番号５２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［９］配列番号５２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する変異蛋白質
［１０］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質
＜１２＞Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物が、前記親株に比べ、以下の［１１］～［１３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物である、＜１０＞または＜１１＞に記載の製造法。
［１１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［１２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
［１３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
＜１３＞糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物である、＜９＞～＜１２＞のいずれか１に記載の製造法。
＜１４＞糖が、グルコース、フルクトースおよびスクロースからなる群より選ばれる少なくとも１の糖である、＜１＞～＜１３＞のいずれか１に記載の製造法。
＜１５＞親株が、エシェリヒア属に属する微生物である、＜１＞～＜１４＞のいずれか１に記載の製造法。
　本発明により、微生物、微生物の培養物または該培養物の処理物を用いた効率的な希少糖の製造法が提供される。本発明のＤ－プシコースの製造法によれば、親株よりもＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物を用いることにより、該微生物が有するＤ－アロースの代謝系を効率的に利用することができ、副生糖の生成および基質の残存を抑制し、高効率でＤ－プシコースを製造することができる。
　また、本発明のＤ－アロヘプツロースの製造法によれば、親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物を用いることにより、該微生物が有するセドヘプツロース－７－リン酸をＤ－アロヘプツロース－７－リン酸へ異性化する活性を効率的に利用することができ、高効率でＤ－アロヘプツロースを製造することができる。
図１（ａ）は、エシェリヒア属に属する微生物が有するＤ－アロースの代謝系の概略図を示す。図１（ｂ）は本発明のＤ－プシコースの製造法に用いられる微生物によるＤ－プシコース製造の具体例の概略図を示す。 図２はエシェリヒア属に属する微生物のアロース資化オペロンの概略図を示す。
１．本発明のＤ－プシコースの製造法に用いられる微生物および該微生物を造成する方法
　本発明の製造法で用いられる微生物としては、以下の（１）～（４）に記載の微生物を挙げることができる。
（１）親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物
［１］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
（２）前記（１）の微生物を親株として、該親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物
（３）前記（１）または（２）の微生物を親株として、該親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質の活性が低下または喪失した微生物
（４）前記（１）～（３）のいずれか１の微生物を親株として、該親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物
　以下、（１）～（４）について説明する。
（１）親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物
［１］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［２］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
　Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性とは、Ｄ－プシコース－６－リン酸を基質として、脱リン酸化する活性をいう。また、「糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物」とは、該微生物を培地に培養したときに、糖を出発基質としてＤ－プシコース－６－リン酸を該微生物の細胞中に生成、蓄積する微生物をいう。
　変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、または該蛋白質中にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
　相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造および機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
　上記［２］の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されていてもよい。欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸の数は１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個である。
　欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システインなどが挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリンＧ群：フェニルアラニン、チロシン
　上記の変異蛋白質または相同蛋白質が、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有していることは、後述する方法により該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡでＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を確認することができない微生物、例えばエシェリヒア・コリＷ３１１０株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液を調製し、該画分を基質であるＤ－プシコース－６－リン酸と接触させ、結果として生成するＤ－プシコースを高速クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーによって検出することで確認することができる。
　親株とは、遺伝子改変および形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。
　親株は、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物であれば、野生株であってもよいし、野生株が糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する能力を有しない場合は、人工的に糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する能力を付与した育種株であってもよい。
　微生物に、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する能力を人工的に付与する方法としては、（ａ）糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する生合成経路を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、（ｂ）糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、（ｃ）糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、（ｄ）糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、及び（ｅ）野生型株に比べ、Ｄ－プシコース－６－リン酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、などを挙げることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
　このような親株としては、好ましくは原核生物または酵母菌株を、より好ましくは、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、またはサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属、若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｃｏｄｏｎ　ｐｌｕｓ（ストラタジーン社製）、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ　ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ　ＡＴＣＣ１５３５４、若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．　Ｄ－０１１０等の原核生物、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、若しくはＣａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株を挙げることができる。
　微生物が糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成することのできる微生物であることは、配列番号１または２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで該微生物を形質転換し、形質転換した該微生物を培地に培養し、培養物中に蓄積したＤ－プシコースを後述のＨＰＬＣを用いて検出することにより確認することができる。
　親株の微生物に比べ前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物としては、以下の（ａ）および（ｂ）の微生物が挙げられる。（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にある前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物およびｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物、（ｂ）該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物
　（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にある前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物としては、親株が有する前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質のアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸、好ましくは１～５個のアミノ酸、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が置換しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株の該蛋白質と比較して、その比活性が増強した変異型蛋白質を有する微生物を挙げることができる。
　（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にある前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物は、例えば、親株の前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の比活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて増強させることにより得ることができる。
　突然変異処理法としては、例えば、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、紫外線照射法等を挙げることができる。
　組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡに、試験管内における変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子と、相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号５０または５１で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、１（１）において後述するＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
　相同組換え法としては、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法を挙げることができる。エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000)］を挙げることができる。
　さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がシュクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Mol. Microbiol., 55, 137(2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)］等を用いて、親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された微生物を取得することができる。
　親株に比べ、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の比活性が増強した微生物であることは、例えば、親株および変異型蛋白質を有する微生物を培養し、培養物を超音波等で処理した後、該処理物にＤ－プシコース－６－リン酸とその他の基質を加え、結果として生成するＤ－プシコースを高速クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーによって検出して比較することで確認することができる。
　（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にある前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物としては、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域またはプロモーター領域の塩基配列において１塩基以上、好ましくは１～１０塩基、より好ましくは１～５塩基、さらに好ましくは１～３塩基の塩基が置換しているプロモーター領域を有しているため、親株と比較して、該遺伝子の発現量が増大した微生物、および親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換して得られる、該遺伝子の発現量が増大した微生物を挙げることができる。
　（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にある前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、親株の前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。
　突然変異処理法は、上記に記載の方法を挙げることができる。
　組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、親株が有する前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側２００ｂｐ、好ましくは１００ｂｐの塩基配列を有するＤＮＡを試験管内における変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子と、上記の相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
　また、親株の前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株より前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することもできる。
　そのようなプロモーターとしては、親株としてエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合、例えば、エシェリヒア・コリで機能するｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを挙げることができる。また、例えば、Ｐｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターおよびｌｅｔＩプロモーターなどの人為的に造成したプロモーターも挙げることができる。
　親株としてバチルス属に属する微生物を用いる場合は、例えば、バチルス・サチルスで機能するＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。
　親株としてコリネ型細菌を用いる場合は、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］等を挙げることができる。
　親株として酵母菌株を用いる場合は、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等を挙げることができる。
　上記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、例えば、該微生物の該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株とそれと比較することにより確認することができる。
　（ｂ）前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物としては、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において前記遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。
　前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡとしては、前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、具体的には以下の［４］～［７］からなる群より選ばれる１のＤＮＡが挙げられる。
［４］前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［５］配列番号５０または５１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［６］配列番号５０または５１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［７］配列番号５０または５１で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
　前記［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡとは、該ＤＮＡが、親株において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、該ＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに組み込まれている組換え体ＤＮＡをいう。
　アミノ酸配列および塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993）］やＦＡＳＴＡ［Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
　上記［６］において「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。
　プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡを挙げることができる。プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡを上げることができる。
　ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(1996)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。
　また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などを挙げることができる。
　上記のストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、７５ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウム）、５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ***ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号５０または５１で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　（ｂ）前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得することができる。
　上記の方法で得られる前記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
　前記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで親株を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。
　細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、該組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記の［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡ、および転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　また、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する蛋白質をコードする部分の塩基配列を宿主の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する蛋白質の発現量を向上させることができる。本発明の製造法に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手することができる。
　親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ（タカラバイオ社製）、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもノバジェン社製）、ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロジェン社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０（キアゲン社製）、ｐＥＴ－３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（－）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＴＫ３１［APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、 2007、 Vol. 73、No. 20、p.6378-6385］ｐＰＡＣ３１（国際公開第１９９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Gene, 33, 103 (1985)］、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３－２３３７９８号公報）等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることもできる。
　親株にコリネ型細菌を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３〔いずれもMolecular and General Genetics, 196, 175 (1984)〕等を挙げることがきる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］を用いることができる。
　親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を挙げることができる。
　上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
　該組換え体ＤＮＡが、親株において自立複製可能なプラスミドとして導入されたこと、または親株の染色体中に組み込まれたことは、例えば、微生物が元来、染色体ＤＮＡ上に有する該遺伝子を増幅することはできないが、形質転換により導入された該遺伝子は増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅産物を確認する方法等により確認することができる。また、該ＤＮＡの転写量若しくは該ＤＮＡがコードする蛋白質の生産量が増大したことは、該微生物の該遺伝子の転写量をノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較する方法等により確認することができる。
　上記［１］の蛋白質をコードするＤＮＡ、および上記［５］のＤＮＡは、例えば、配列番号５０で表される塩基配列（ｙｎｉＣ遺伝子）または配列番号５１で表される塩基配列（ｙｂｉＶ遺伝子）に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくは、エシェリヒア・コリ属に属する微生物、より好ましくは、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［PCR Protocols, Academic Press (1990)］により取得することができる。
　エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＩＴＥ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒ）から入手することができる。
　上記［２］の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号５０または５１で表される塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。
　または、目的の変異（欠失、置換、挿入または付加）が導入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ［Gene, 77, 51(1989)］によっても、上記［２］のＤＮＡを取得することができる。
　すなわち、まず該ＤＮＡの５’端に対応するセンスプライマーと、５’端に変異の配列と相補的な配列を有する、変異導入部位の直前（５’側）の配列に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、該ＤＮＡの５’端から変異導入部位までの断片Ａ（３’端に変異が導入されている）を増幅する。次いで、５’端に変異の配列を有する、変異導入部位の直後（３’側）の配列に対応するセンスプライマーと、該ＤＮＡの３’端に対応するアンチセンスプライマーで該ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行い、５’端に変異が導入された該ＤＮＡの変異導入部位から３’端までの断片Ｂを増幅する。これらの増幅断片同士を精製後、混合して鋳型やプライマーを加えずにＰＣＲを行うと、増幅断片Ａのセンス鎖と増幅断片Ｂのアンチセンス鎖は変異導入部位が共通しているのでハイブリダイズし、プライマー兼鋳型としてＰＣＲの反応が進行し、変異が導入されたＤＮＡが増幅する。
　上記［３］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに上記［６］および［７］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号５０または５１で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、または、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号２または４で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列またはアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡまたはプライマーＤＮＡ、および当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様の方法によって取得することができる。
　取得した上記の［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡは、そのまま、または適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)］または３７００　ＤＮＡアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
　前記宿主細胞としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＭＰ３４７およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２が挙げられる。
　上記のベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)］、ｐＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ　Ａｍｐ　ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲ　ＩＩ（インビトロジェン社製）およびｐＣＲ－ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）が挙げられる。
　組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 69, 2110 (1972)］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)］等が挙げられる。
　塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
　更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
　該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、本発明の製造法に用いられる組換え体ＤＮＡを作製することができる。このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば、実施例において後述するＰｔｒｐ－ｙｎｉＣおよびＰｔｒｐ－ｙｂｉＶが挙げられる。
　組換え体ＤＮＡを親株において自立複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３－２４８３９４号公報）およびエレクトロポレーション法［Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)］等の方法が挙げられる。
　組換え体ＤＮＡを親株の染色体中に組み込む方法としては、上記において記載した相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
　上記の方法で造成した微生物が、親株よりも上記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物であることは、上述の方法により、上記［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡの転写量、上記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の生産量、または該蛋白質の比活性を、親株のそれと比較することにより確認することができる。
　このような微生物の例としては、実施例において後述するＭＧＣおよびＭＧＶを挙げることができる。
（２）前記（１）の微生物を親株として、該親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物
　アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性とは、フルクトース－６－リン酸を異性化してＤ－プシコース－６－リン酸とする活性をいう。
　親株の微生物に比べアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物としては、以下の（ａ）および（ｂ）の微生物が挙げられる。
（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物およびｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物、
（ｂ）該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物
　（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物としては、親株が有するアルロース－６－リン酸
　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列において１～１０個のアミノ酸、好ましくは１～８個のアミノ酸、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が置換しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株の該蛋白質と比較して、その比活性が増強した変異型蛋白質を有する微生物を挙げることができる。
　（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物は、例えば、上記１（１）に記載の方法で造成される微生物を親株として、該親株のアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質の比活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて増強させることにより得ることができる。
　突然変異処理法は、上記１（１）に記載の方法を挙げることができる。
　組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡに、試験管内における変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子と、上記１（１）において記載した相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
　アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号４２で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、上記１（１）において記載したＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
　親株に比べ、アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質の比活性が増強した微生物であることは、例えば、親株および変異型蛋白質を有する微生物を培養し、培養物を超音波等で処理した後、該処理物にフルクトース－６－リン酸とその他の基質を加え、合成されたＤ－プシコース－６－リン酸量をＨＰＬＣで測定、比較することにより確認することができる。
　（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物としては、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域またはプロモーター領域の塩基配列において１塩基以上、好ましくは１～１０塩基、より好ましくは１～５塩基、さらに好ましくは１～３塩基の塩基が置換しているプロモーター領域を有しているため、親株と比較して、該遺伝子の発現量が増大した微生物、および親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換して得られる、該遺伝子の発現量が増大した微生物を挙げることができる。
　（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、上記１（１）に記載の方法で造成される微生物を親株として、該親株のアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質の遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。
　突然変異処理法は、上記１（１）に記載の方法を挙げることができる。
　組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、親株が有するアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側２００ｂｐ、好ましくは１００ｂｐの塩基配列を有するＤＮＡを試験管内における変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在するアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子と、上記１（１）に記載の相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
　また、親株のアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株よりアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することもできる。
　そのようなプロモーターとしては、上記１（１）に記載のプロモーターを挙げることができる。
　上記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、例えば、該微生物の該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較することにより確認することができる。
　（ｂ）アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物としては、アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において前記遺伝子のコピー数が増大した微生物、およびプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に前記遺伝子を保有させた微生物を挙げることができる。
　アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］～［３］からなる群より選ばれる１の蛋白質が挙げられる。
［１］配列番号５２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号５２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する変異蛋白質、
［３］配列番号５２で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質
　上記において、１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する変異蛋白質は、後述の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号５２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。
　欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個である。
　配列番号５２で表されるアミノ酸配列において１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されていてもよい。
　配列番号５２で表されるアミノ酸配列において１～１０個、好ましくは１～８個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異蛋白質が、アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質であることは、例えば、ＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製して、培地で培養し、培養物中のＤ－プシコース－６－リン酸を測定することにより確認することができる。
　アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、該活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、具体的には以下の［４］～［７］からなる群より選ばれる１のＤＮＡが挙げられる。
［４］上記［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［５］配列番号４２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［６］配列番号４２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ、
［７］配列番号４２で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
　上記でいう「ハイブリダイズする」との記載、ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法、およびストリンジェントな条件は、上記１（１）の記載と同じである。上記のストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号４２で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　（ｂ）アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得することができる。
　上記の方法で得られるアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
　前記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで、上記１（１）に記載の方法で造成される微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。
　リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
　アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
　原核生物を宿主細胞として用いる場合は、前記ＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該ＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　発現ベクターおよび該発現ベクターを用いる場合のプロモーターは、上記１（１）において記載したものと同様の発現ベクターおよびプロモーターが挙げられる。アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡとしては、例えば、実施例において後述するｐＵＣ１９＿ａｌｓＥを挙げることができる。
　また、上記の方法で得られるアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを、上記１（１）に記載の相同組換え法を用いることで、染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込むことによっても、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。
　上記の方法で取得した微生物が、親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物であることは、上記１（１）に記載の方法を用いて確認することができる。
　このような微生物の例としては、実施例において後述するＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＶ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥおよびＭＧＶ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥを挙げることができる。
（３）前記（１）または（２）の微生物を親株として、該親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質、およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質の活性が低下または喪失した微生物
　Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼは、Ｄ－アロース－６－リン酸をＤ－プシコース－６－リン酸に異性化する活性を有する蛋白質である。ＲｐｉＲは、リプレッサーとしてアロース資化オペロンのオペレーター部分に結合して、それに連なるオペロンの転写を阻止することにより遺伝子の発現を抑制する活性を有する蛋白質である。
　Ｄ－アロース輸送蛋白質は、Ｄ－アロースを細胞外から細胞膜内に輸送する活性を有する蛋白質である。Ｄ－アロースキナーゼとは、Ｄ－アロースをＤ－アロース－６－リン酸にする活性を有する蛋白質である。
　親株に比べＤ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質の活性が低下、または喪失した微生物は、染色体ＤＮＡ上に存在する変異が入っていない野生型の該蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、（ａ）親株に比べ、該蛋白質の比活性が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物、および（ｂ）親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物を挙げることができる。より好ましくは該遺伝子の一部または全部が欠損した微生物を挙げることができる。
　Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子としては、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］～［４］からなる群より選ばれる１の遺伝子が挙げられる。
［１］配列番号５３で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
［２］配列番号５３で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子、
［３］配列番号４３で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
［４］配列番号４３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子
　ＲｐｉＲをコードする遺伝子としては、リプレッサーとしてアロース資化オペロンの転写を阻止する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］～［４］からなる群より選ばれる１の遺伝子が挙げられる。
［１］配列番号５４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
［２］配列番号５４で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつリプレッサーとしてアロース資化オペロンの転写を阻止する活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子、
［３］配列番号４４で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
［４］配列番号４４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつリプレッサーとしてアロース資化オペロンの転写を阻止する活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子
　Ｄ－アロース輸送蛋白質をコードする遺伝子としては、Ｄ－アロースを細胞外から細胞膜内に輸送する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］～［４］からなる群より選ばれる１の遺伝子が挙げられる。
［１］配列番号５５～５７のいずれか１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
［２］配列番号５５～５７のいずれか１で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－アロースを細胞外から細胞膜内に輸送する活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子、
［３］配列番号４５～４７のいずれか１で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
［４］配列番号４５～４７のいずれか１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤ－アロースを細胞外から細胞膜内に輸送する活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子
　Ｄ－アロースキナーゼをコードする遺伝子としては、Ｄ－アロースキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］～［４］からなる群より選ばれる１の遺伝子が挙げられる。
［１］配列番号５８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
［２］配列番号５８で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－アロースキナーゼ活性を細胞外から細胞膜内に輸送する活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子、
［３］配列番号４８で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
［４］配列番号４８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤ－アロースキナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子
　Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる蛋白質をコードする遺伝子への塩基の欠失、置換または付加の導入、およびアミノ酸配列や塩基配列の同一性についての記載は、上記１（１）の記載と同じである。
　上記でいう「ハイブリダイズする」との記載、ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法、およびストリンジェントな条件は上記１（１）の記載と同じである。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号４３～４８のいずれか１で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質の活性が低下または喪失した微生物は、例えば、前記１（１）または（２）の方法で取得できる微生物を親株とし、該親株のＤ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質、およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質の活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、低下、または喪失させることにより得ることができる。
　突然変異処理法は、上記１（１）に記載の方法を挙げることができる。
　組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法としては、試験管内でＤ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質をコードする遺伝子に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入し、上記１（１）の相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
　Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼをコードする遺伝子は、例えば、それぞれ配列番号４３～４８で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、上記１（１）に記載のＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
　試験管内でＤ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質、およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質をコードする遺伝子に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する方法、および、上記の方法で調製した遺伝子を、相同組換え等により親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域と置換する方法は、上記１（１）の方法と同じである。
　親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼの活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物をＤ－アロース－６－リン酸を含む培地で培養し、培養液中と微生物細胞内のＤ－プシコース－６－リン酸比を比較することにより確認することができる。
　親株に比べ、ＲｐｉＲの活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株の図２に示すアロース資化オペロンの転写量と該微生物のそれとをノーザン・ブロッティングにより比較することにより確認することができる。
　親株に比べ、Ｄ－アロース輸送蛋白質の活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物をＤ－アロースを含む培地で培養し、培養液中のＤ－アロース比を比較することにより確認することができる。
　親株に比べ、Ｄ－アロースキナーゼの活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物をＤ－アロースを含む培地で培養し、培養液中と微生物細胞内のＤ－アロース－６－リン酸比を比較することにより確認することができる。
　親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物であることは、例えば、該微生物の該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較することにより確認することができる。
　Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物の例としては、アロース資化オペロンが欠損した微生物が挙げられる。具体的には、例えば、実施例において後述するＭＧ１６５５　Δａｌｓを挙げることができる。
（４）前記（１）～（３）のいずれか１の微生物を親株として、該親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物
　６－ホスホフルクトキナーゼ活性とは、フルクトース－６－リン酸に作用してフルクトース１，６－二リン酸またはフルクトース２，６－二リン酸とする活性である。
　親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下、または喪失した微生物は、染色体ＤＮＡ上に存在する変異が入っていない野生型の６－ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入することにより得られる、（ａ）親株に比べ、該蛋白質の比活性が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物、および（ｂ）親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、特に好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％に低下した微生物を挙げることができる。より好ましくは該遺伝子の一部または全部が欠損した微生物を挙げることができる。
　６－ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子としては、６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１］～［４］からなる群より選ばれる１の遺伝子が挙げられる。
［１］配列番号３７で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、
［２］配列番号３７で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子、
［３］配列番号４９で表される塩基配列からなる遺伝子、および、
［４］配列番号４９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する相同蛋白質をコードする遺伝子
　６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子への塩基の欠失、置換または付加の導入、およびアミノ酸配列や塩基配列の同一性についての記載は、上記１（１）の記載と同じである。
　上記でいう「ハイブリダイズする」との記載、ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法、およびストリンジェントな条件は上記１（１）の記載と同じである。
　上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号４９で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　親株に比べ、６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物は、例えば、前記１（１）～（３）のいずれか１の方法で取得できる微生物を親株とし、該親株の６－ホスホフルクトキナーゼ活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、低下、または喪失させることにより得ることができる。
　突然変異処理法は、上記１（１）に記載の方法を挙げることができる。
　組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法としては、試験管内で６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入し、上記１（１）の相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
　６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子は、例えば、配列番号４９で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いて、上記１（１）に記載のＰＣＲを用いた方法等により取得することができる。
　試験管内で６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に１以上の塩基の置換、欠失、または付加を導入する方法、および、上記の方法で調製した遺伝子を、相同組換え等により親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域と置換する方法は、上記１（１）に記載の方法と同じである。
　親株に比べ、６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物であることは、例えば、親株および該微生物をフルクトース－６－リン酸を含む培地で培養し、培養液中と微生物細胞内のフルクトース１，６－二リン酸またはフルクトース２，６－二リン酸比を比較することにより確認することができる。
　親株に比べ、６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物であることは、例えば、該微生物の該遺伝子の転写量を、ノーザン・ブロッティングにより、または該微生物の該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株のそれと比較することにより確認することができる。
　６－ホスホフルクトキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が低下または喪失した微生物の例としては、実施例において後述するＭＧ１６５５　ΔａｌｓΔｐｆｋＡを挙げることができる。
２．本発明のＤ－プシコースの製造法
２．１．糖を基質として用いるＤ－プシコースの製造法
　本発明のＤ－プシコースの製造法のうち、（ｉ）酵素源として、上記１の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物（以下、２．１の微生物という。）の培養物または該培養物の処理物、および（ｉｉ）基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＤ－プシコースを採取することを特徴とする、Ｄ－プシコースの製造法について、以下説明する。
　２．１の微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、シュクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンおよびデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸およびプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノールおよびプロパノール等のアルコール類等が挙げられる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅および炭酸カルシウム等が挙げられる。
　培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は１５～４０℃が好ましく、培養時間は、通常５時間～７日間である。培養中のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
　また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。
　例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　上記の培養により得られた微生物の培養物又は該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、糖を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該媒体からＤ－プシコースを採取することにより、Ｄ－プシコースを製造することができる。
　本明細書において、培養物の処理物としては、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物、および当該処理した菌体から得られる精製酵素が挙げられる。
　これらの中でも、好ましくは、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物が挙げられ、最も好ましくは、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるものが挙げられる。
　酵素源の量は、用いる各酵素源について、１～５００ｇ／ｌであることが好ましく、より好ましくは１～３００ｇ／ｌである。
　糖の濃度は、０．１ｍＭ～１０Ｍであることが好ましく、より好ましくは１ｍＭ～１Ｍである。糖としては、例えば、グルコース、フルクトースおよびシュクロースが挙げられる。
　水性媒体としては、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩およびトリスなどの緩衝液、メタノールおよびエタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、並びにアセトアミドなどのアミド類などが挙げられる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。
　Ｄ－プシコースの生成反応においては、必要に応じてフィチン酸等のキレート剤、界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ－２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２－４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、Ｄ－プシコースの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１～５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
　有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１～５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。Ｄ－プシコースの生成反応は、水性媒体中、ｐＨ５～１０、好ましくはｐＨ６～８、２０～５０℃の条件で１～９６時間行う。該生成反応を促進させるために、アデニン、アデノシン－５’－一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン－５’－三リン酸（ＡＴＰ）、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムなどを添加することができる。アデニン、ＡＭＰ、ＡＴＰは、通常０．０１～１００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いられる。
　水性媒体中に生成したＤ－プシコースの定量はＤｉｏｎｅｘ社製の糖分析装置などを用いて行うことができる〔Anal. Biochem., 189, 151 (1990)〕。反応液中に生成したＤ－プシコースの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
２．２．発酵法によるＤ－プシコースの製造法
　本発明のＤ－プシコースの製造法のうち、上記１の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物を培地に培養し、培養物中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－プシコースを採取することを特徴とする、Ｄ－プシコースの製造法について、以下説明する。
　前記微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。前記微生物を培養する培地としては、上記２．１に記載の培地に受容体糖質を含む培地を用いることができる。
　上記の培養により、培養物中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－プシコースを採取することにより、Ｄ－プシコースを製造することができる。Ｄ－プシコースの定量方法は、上記２．１に記載の方法を用いることができる。
　該培養物中からのＤ－プシコースの採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＤ－プシコースが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｄ－プシコースを採取することができる。
　図１（ａ）に、エシェリヒア属に属する微生物が有するＤ－アロースの代謝系の概略図を示す。また、図１（ｂ）に本発明のＤ－プシコースの製造法に用いられる微生物によるＤ－プシコース製造の具体例の概略図を示す。
　図１（ｂ）の具体例においては、〔１〕アロース資化オペロンが破壊され、且つ親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼをコードする遺伝子（ａｌｓＥ）の発現が増強され、〔２〕６－ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（ｐｆｋＡ）が破壊され、〔３〕親株よりもＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強した微生物を用いて、発酵法によりＤ－プシコースを製造する場合を説明する。
　図２にエシェリヒア属に属する微生物のアロース資化オペロンの概略図（J. Bacteriol. 181, 7126-7130, 1999）を示す。図２に示すように、エシェリヒア属に属する微生物のアロース資化オペロンは、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子（ｒｐｉＢ）、リプレッサーをコードする遺伝子（ｒｐｉＲ）、Ｄ－アロース輸送蛋白質（結合蛋白質）をコードする遺伝子（ａｌｓＢ）、Ｄ－アロース輸送蛋白質（ＡＴＰアーゼ）をコードする遺伝子（ａｌｓＡ）、Ｄ－アロース輸送蛋白質（膜蛋白質）をコードする遺伝子（ａｌｓＣ）、アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性をコードする遺伝子（ａｌｓＥ）およびｙｊｃｔ（ａｌｓＫ）から構成される。
　図１（ｂ）の具体例においては、親株における微生物が元来有するアロース資化オペロンが破壊されているので、該親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ（ＲｐｉＢ）、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質（ＡｌｓＡ、ＡｌｓＢおよびＡｌｓＣ）およびＤ－アロースキナーゼ（ａｌｓＫ）の活性が喪失している。また、該親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼをコードする遺伝子（ａｌｓＥ）の発現が特異的に増強されていることにより、フルクトース－６－リン酸からの異性化でプシコース－６－リン酸が効率的に生産される。
　また、図１（ｂ）に示すように、６－ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子（ｐｆｋＡ）が破壊されていることにより、フルクトース－６－リン酸が代謝されてフルクトース－６－リン酸に作用してフルクトース１，６－二リン酸またはフルクトース２，６－二リン酸となるのを抑制することができ、基質となるフルクトース－６－リン酸を微生物内に蓄積することができる。
　さらに、図１（ｂ）に示す具体例においては、親株よりもＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強されていることにより、Ｄ－プシコース－６－リン酸を脱リン酸化して、Ｄ－プシコースを高効率で生産することができる。
３．本発明のＤ－アロヘプツロースの製造法に用いられる微生物および該微生物を造成する方法
　本発明の製造法で用いられる微生物としては、以下の（２Ａ）～（２Ｃ）に記載の微生物を挙げることができる。
（２Ａ）親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物
（２Ｂ）親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物
（２Ｃ）親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成し、かつＤ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物
　以下、（２Ａ）、（２Ｂ）および（２Ｃ）について説明する。
（２Ａ）親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物
　親株は、上記１（１）に記載の親株を用いることができる。親株の微生物に比べアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物としては、上記１（２）に記載したものと同様の以下の（ａ）および（ｂ）の微生物が挙げられる。（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上にあるアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物およびｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物、（ｂ）該蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより得られる、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物
　前記微生物が親株に比べ、アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質の比活性が増強した微生物であることは、例えば、親株および当該微生物を培養し、培養物を超音波処理した後、該処理物にセドヘプツロース－７－リン酸とその他基質を加え、合成されたＤ－アロヘプツロース－７－リン酸量をＨＰＬＣで測定、比較することにより確認することができる。
　また、親株に比べ、アルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、上記１（２）に記載の方法と同様の方法により確認することができる。
　親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物としては、例えば、親株よりも以下の［８］～［１０］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物が挙げられる。
［８］配列番号５２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［９］配列番号５２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する変異蛋白質
［１０］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質
　親株に比べ前記［８］～［１０］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物は、上記１（１）に記載の方法と同様の方法で取得することができ、当該微生物であることは、上記１（１）に記載の方法と同様の方法により確認することができる。
　前記［８］～［１０］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物はセドヘプツロース－７－リン酸をＤ－アロヘプツロース－７－リン酸へ異性化する活性を有している。該蛋白質の当該活性は本発明において初めて明らかになったものである。
　このような微生物の例としては、実施例において後述するＭＧ　１６５５／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、を挙げることができる。
（２Ｂ）親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物
　「糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する」とは、微生物を培地に培養したときに、糖を出発基質としてセドヘプツロース－７－リン酸を該微生物の細胞中に生成、蓄積することをいう。
　親株は、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物であれば、野生株であってもよいし、野生株が糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する能力を有しない場合は、人工的に糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する能力を付与した育種株であってもよい。
　親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からＤ－アロヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物は上記１（２）に記載の方法と同様の方法により取得することができる。
　糖からＤ－アロヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物としては、親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物が挙げられる。親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物は、上記１（４）に記載の方法と同様の方法で取得することができ、当該微生物であることは、上記１（４）に記載の方法と同様の方法により確認することができる。
　親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した上で、さらに６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失することにより、中央代謝へのカーボンの流れが減少し、ペントースリン酸経路への流入が増えることによりＤ－アロヘプツロースの生産性が向上すると考えられる。
　このような微生物の例としては、実施例において後述するＭＧ１６５５　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、を挙げることができる。
（２Ｃ）親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成し、かつＤ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物
　「Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物」とは、微生物を培地に培養したときに、Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸を出発基質としてＤ－アロヘプツロースを該微生物の細胞中に生成、蓄積することをいう。
　また、「糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成し、かつＤ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する」とは、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成し、セドヘプツロース－７－リン酸を異性化して得られたＤ－アロヘプツロース－７－リン酸を基質としてＤ－アロヘプツロースを生成することをいう。
　親株は、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成し、かつ、Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物であれば、野生株であってもよいし、野生株が糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成し、かつ、Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する能力を有しない場合は、人工的に糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成し、かつ、Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する能力を付与した育種株であってもよい。
　Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物としては、例えば、親株よりも以下の［１１］～［１３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物が挙げられる。
［１１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
［１２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
［１３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
　親株に比べ前記［１１］～［１３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物は、上記１（１）に記載の方法と同様の方法で取得することができ、当該微生物であることは、上記１（１）に記載の方法と同様の方法により確認することができる。
　このような微生物としては、実施例において後述するＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥを挙げることができる。
４．本発明のＤ－アロヘプツロースの製造法４．１．糖を基質として用いるＤ－アロヘプツロースの製造法
　本発明のＤ－アロヘプツロースの製造法のうち、（ｉ）酵素源として、上記３．に記載の（２Ａ）～（２Ｃ）の微生物（以下、４．１の微生物という。）の培養物または該培養物の処理物、および脱リン酸化酵素、並びに（ｉｉ）基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＤ－アロヘプツロースを採取することを特徴とする、Ｄ－アロヘプツロースの製造法について、以下説明する。
　４．１の微生物を培養する方法は、上記２．１に記載の方法を用いることができる。４．１の微生物の培養により得られた微生物の培養物又は該培養物の処理物、および脱リン酸化酵素を酵素源に用い、該酵素源、糖を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該媒体からＤ－アロヘプツロースを採取することにより、Ｄ－アロヘプツロースを製造することができる。
　前記培養物の処理物としては、上記２．１に記載の培養物の処理物と同様に、前記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物、および当該処理した菌体から得られる精製酵素が挙げられる。
　脱リン酸化酵素としては、Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸を脱リン酸化する活性を有する脱リン酸化酵素であればいずれでもよいが、例えば、上記１（１）に記載の親株が元来有する脱リン酸化酵素を、好ましくは、ｙｎｉＣ遺伝子がコードする脱リン酸化酵素を挙げることができる。
　Ｄ－アロヘプツロースの生成反応においては、必要に応じてフィチン酸等のキレート剤、界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤および有機溶媒は２．１に記載したものを用いることができる。
　水性媒体中に生成したＤ－アロヘプツロースの定量はＤｉｏｎｅｘ社製の糖分析装置などを用いて行うことができる〔Anal. Biochem., 189, 151 (1990)〕。反応液中に生成したＤ－アロヘプツロースの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
４．２．発酵法によるＤ－アロヘプツロースの製造法
　本発明のＤ－アロヘプツロースの製造法のうち、親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からＤ－アロヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物を培地に培養し、培養物中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－アロヘプツロースを採取することを特徴とする、Ｄ－アロヘプツロースの製造法について、以下説明する。
　前記微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。前記微生物を培養する培地としては、上記２．１に記載の培地に受容体糖質を含む培地を用いることができる。
　上記の培養により、培養物中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－アロヘプツロースを採取することにより、Ｄ－アロヘプツロースを製造することができる。Ｄ－アロヘプツロースの定量方法は、上記４．１に記載の方法を用いることができる。
　該培養物中からのＤ－アロヘプツロースの採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＤ－アロヘプツロースが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｄ－アロヘプツロースを採取することができる。
　以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
Ｄ－プシコースの製造に用いる微生物の造成
（１）遺伝子欠損および遺伝子置換の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得
　表１の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして、表１の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　バチルス・サチルス　１６８株のゲノムＤＮＡは定法により調製した。増幅ＤＮＡ断片のｃａｔは、ｃａｔ遺伝子の上流約２００ｂｐから下流約１００ｂｐを含む。増幅ＤＮＡ断片のｓａｃＢは、ｓａｃＢ遺伝子の上流約３００ｂｐから下流約１００ｂｐを含む。配列番号３８および４０で表される塩基配列からなるＤＮＡにはＳａｌＩ認識サイトが付与されている。
　増幅ＤＮＡ断片のｃａｔおよびｓａｃＢを制限酵素ＳａｌＩで切断し、ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結した。該連結反応液を鋳型とし、配列番号３９および４１で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ（以下、ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
（２）アロース資化オペロンが欠損した微生物の造成
　常法により調製したエシェリヒア・コリ　ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ａｌｓＫ上流１およびａｌｓＫ上流２は、ａｌｓＫ遺伝子の開始コドンからその上流約１０００ｂｐを含む。ｒｐｉＢ下流１およびｒｐｉＢ下流２は、ｒｐｉＢ遺伝子の終止コドンからその下流約１０００ｂｐを含む。
　ａｌｓＫ上流１、ｒｐｉＢ下流１、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３および６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入されたアロース資化オペロンを含むＤＮＡ（以下、ａｌｓ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
　ａｌｓＫ上流２およびｒｐｉＢ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３および６で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｒｐｉＢ、ｒｉｐＲ、ａｌｓＡ、ａｌｓＢ、ａｌｓＣ、ａｌｓＥ、およびａｌｓＫが欠損したアロース資化オペロン周辺領域を含むＤＮＡ（以下、Δａｌｓという。）断片を得た。
　ａｌｓ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６［Datsenko, K.A., Warner, B.L., Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, Vol. 97. 6640-6645（2000）］を保持するエシェリヒア・コリ　ＭＧ１６５５株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した形質転換体（アロース資化オペロンがａｌｓ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　Δａｌｓ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示す形質転換体（ａｌｓ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔａｌｓに置換した形質転換体）を得た。さらに、アンピシリン感受性を示す形質転換体（ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体）を得た。当該微生物をＭＧ１６５５　Δａｌｓと命名した。
（３）アロース資化オペロンおよびｐｆｋＡ遺伝子が欠損した微生物の造成
　常法により調製したエシェリヒア・コリ　ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ｐｆｋＡ上流１およびｐｆｋＡ上流２は、ｐｆｋＡ遺伝子の開始コドンからその上流約７００ｂｐを含む。ｐｆｋＡ下流１およびｐｆｋＡ下流２は、ｐｆｋＡ遺伝子の終止コドンからその下流約８００ｂｐを含む。
　ｐｆｋＡ上流１、ｐｆｋＡ下流１、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号９および１２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入されたｐｆｋＡ周辺領域を含むＤＮＡ（以下、ｐｆｋＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
　ｐｆｋＡ上流２およびｐｆｋＡ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号９および１２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｐｆｋＡ遺伝子が欠損したｐｆｋＡ周辺領域を含むＤＮＡ（以下、ΔｐｆｋＡという。）断片を得た。
　ｐｆｋＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢを、ｐＫＤ４６を保持するＭＧ１６５５　Δａｌｓ株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｐｆｋＡ遺伝子がｐｆｋＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　ΔｐｆｋＡ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した形質転換体（ｐｆｋＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｐｆｋＡに置換した形質転換体）を得た。さらに、ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体を得た。当該微生物をＭＧ１６５５　ΔａｌｓΔｐｆｋＡと命名した。
（４）ｙｎｉＣ遺伝子の発現が増強した微生物の造成
　ｙｎｉＣ遺伝子の開始コドン上流に、ｔｒｐプロモーターを挿入した大腸菌を、以下の方法で造成した。
　ｔｒｐプロモーターについてはｐＴＫ３１（APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、 2007、 Vol. 73、No. 20、p. 6378-6385）を鋳型とし、その他の増幅ＤＮＡ断片についてはエシェリヒア・コリ　ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表４の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ｙｎｉＣ上流１およびｙｎｉＣ上流２は、ｙｎｉＣ遺伝子の開始コドンからその上流約１０００ｂｐを含む。ｙｎｉＣ下流１は、ｙｎｉＣ遺伝子の終止コドンからその下流約１０００ｂｐを含む。ｙｎｉＣ下流２は、ｙｎｉＣ遺伝子の開始コドンから終止コドンの下流約１０００ｂｐを含む。
　ｙｎｉＣ上流１、ｙｎｉＣ下流１、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１７および２０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入されたｙｎｉＣ周辺領域を含むＤＮＡ（以下、ｙｎｉＣ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
　ｔｒｐプロモーター、ｙｎｉＣ上流２、ｙｎｉＣ下流２断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号１７および２０で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｙｎｉＣ遺伝子の上流にｔｒｐプロモーターが挿入されたＤＮＡ（以下、Ｐｔｒｐ－ｙｎｉＣという。）断片を得た。
　ｙｎｉＣ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、ｐＫＤ４６を保持するエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｙｎｉＣ遺伝子がｙｎｉＣ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　Ｐｔｒｐ－ｙｎｉＣ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した形質転換体（ｙｎｉＣ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがＰｔｒｐ－ｙｎｉＣに置換した形質転換体）を得た。さらに、ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体を得た。当該微生物をＭＧＣと命名した。
（５）ｙｂｉＶ遺伝子の発現が増強した微生物の造成
　ｙｂｉＶ遺伝子の開始コドン上流に、ｔｒｐプロモーターを挿入した大腸菌を、以下の方法で造成した。
　ｔｒｐプロモーターについてはｐＴＫ３１を鋳型として、その他の断片についてはエシェリヒア・コリ　ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表５の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　増幅ＤＮＡ断片のｙｂｉＶ上流１およびｙｂｉＶ上流２は、ｙｂｉＶ遺伝子の開始コドンからその上流約１０００ｂｐを含む。ｙｂｉＶ下流１は、ｙｂｉＶ遺伝子の終止コドンからその下流約１０００ｂｐを含む。ｙｂｉＶ下流２は、ｙｂｉＶ遺伝子の開始コドンから終止コドンの下流約１０００ｂｐを含む。
　ｙｂｉＶ上流１、ｙｂｉＶ下流、およびｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２９および３２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入されたｙｂｉＶ周辺領域を含むＤＮＡ（以下、ｙｂｉＶ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
　ｔｒｐプロモーター、ｙｂｉＶ上流２、ｙｂｉＶ下流２断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２９および３２で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｙｂｉＶ遺伝子の上流にｔｒｐプロモーターが挿入されたＤＮＡ（以下、Ｐｔｒｐ－ｙｂｉＶという。）断片を得た。
　ｙｂｉＶ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、ｐＫＤ４６を保持するエシェリヒア・コリ　ＭＧ１６５５株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示した形質転換体（ｙｂｉＶ遺伝子がｙｂｉＶ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換した形質転換体）を得た。
　Ｐｔｒｐ－ｙｂｉＶ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した形質転換体（ｙｂｉＶ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがＰｔｒｐ－ｙｂｉＶに置換した形質転換体）を得た。さらに、ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体を得た。当該微生物をＭＧＶと命名した。
　同様の方法で、ＭＧ１６５５　ΔａｌｓΔｐｆｋＡのｙｂｉＶ遺伝子の上流にｔｒｐプロモーターを挿入したＭＧＶ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡを造成した。
（６）ａｌｓＥ遺伝子の発現が増強した微生物の造成
　エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号３５および３６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ反応を行い、制限酵素切断領域を含むａｌｓＥ遺伝子を増幅した。該ＰＣＲによって得られた増幅産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで切断し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで切断した発現ベクターｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＵＣ１９＿ａｌｓＥを得た。
　ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥで、ＭＧＣ、ＭＧＶ、ＭＧＣ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡおよびＭＧＶ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡを形質転換し、それぞれ、ＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＶ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥおよびＭＧＶ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥを得た。
　また、コントロールとして、ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥでエシェリヒア・コリＭＧ１６５５およびＭＧ１６５５　ΔａｌｓΔｐｆｋＡを形質転換し、それぞれ、ＭＧ１６５５／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧ１６５５　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥを得た。
［実施例２］
Ｄ－プシコースの製造
　実施例１で得られた、ＭＧ１６５５／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧ１６５５　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＶ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、およびＭＧＶ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ　をＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、ＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養した。必要に応じて、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加した。試験管生産培地［グルコース　２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物　２ｇ／Ｌ、カザミノ酸　５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム　２ｇ／Ｌ、クエン酸　１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム　１４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム　１６ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩　１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物　５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物　１０ｍｇ／Ｌ、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調整後、グルコースおよび硫酸マグネシウム７水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が４ｍＬ入った太型試験管に０．０４ｍＬ植菌し、３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して、ＭＧ１６５５／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、およびＭＧＶ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥについては３０℃で３２時間、ＭＧ１６５５　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、およびＭＧＶ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥについては３０℃で４８時間振盪培養した。
　培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のプシコース濃度を糖分析装置ＩＣＳ－５０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて定量した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すように、ｙｎｉＣ遺伝子およびｙｂｉＶ遺伝子が、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有すること、および当該遺伝子を形質転換して得られる、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物を用いることにより、効率的にＤ－プシコースを製造することができることがわかった。
［実施例３］
微生物の培養物の処理物を用いたＤ－プシコースの製造
　実施例１で得られた、ＭＧ１６５５／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧ１６５５　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＶ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、およびＭＧＶ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥをアンピシリン５０ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ］５ｍｌの入った太型試験管に接種し、３０℃で１６時間培養する。
　該培養液をアンピシリン５０ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地　５０ｍｌの入ったバッフル付三角フラスコに１０％接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで８時間培養する。該培養液　４０ｍｌ分を遠心分離し湿菌体を取得する。
　各菌株の培養液各４０ｍｌ分を、反応バッファー（０．１Ｍビシンバッファー（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　塩化マンガン）で一回洗浄したのち、４ｍｌの当該反応バッファーに懸濁し、超音波破砕を行う。破砕後１８，０００×ｇで５分間遠心し、膜画分を沈殿させた後、上清を採取する。上清はブラッドフォード法を用いてタンパク量を定量し、反応に用いる。
　反応は１２．５ｍＭのグルコースを含む反応バッファーに前述した上清タンパク質液を終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌになるように添加して、３０℃、３３０ｒｐｍで振とうすることによって行う。反応開始後９０分が経過した時点で１／４量の６．７Ｍリン酸を添加することで反応を終了させる。
　反応終了後、反応液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のプシコース濃度を糖分析装置ＩＣＳ－５０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて定量する。
［実施例４］
Ｄ－アロへプツロースの製造
　実施例１で得られた、ＭＧ１６５５／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧ１６５５　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＶ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＶ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧ１６５５、およびＭＧ１６５５　ΔａｌｓΔｐｆｋＡをＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、ＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１２時間、振盪培養した。
　必要に応じて、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加した。試験管生産培地［グルコース　２０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム７水和物　２ｇ／Ｌ、カザミノ酸　５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム　２ｇ／Ｌ、クエン酸　１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム　１４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム　１６ｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩　１０ｍｇ／Ｌ、硫酸第一鉄七水和物　５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン五水和物　１０ｍｇ／Ｌ、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調整後、グルコースおよび硫酸マグネシウム７水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が４ｍＬ入った太型試験管に０．０４ｍＬ植菌し、３０℃で５時間培養した後、終濃度が０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して、３０℃で４８時間振盪培養した。
　培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のアロヘプツロース濃度を糖分析装置ＩＣＳ－５０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて定量した。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示すように、親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からＤ－セドヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物を用いることにより、効率的にＤ－アロヘプツロースを製造できることがわかった。
［実施例５］
微生物の培養物の処理物を用いたＤ－アロヘプツロースの製造
　実施例１で得られた、ＭＧ１６５５／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧ１６５５　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＶ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、ＭＧＣ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥ、およびＭＧＶ　ΔａｌｓΔｐｆｋＡ／ｐＵＣ１９＿ａｌｓＥをアンピシリン５０ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ］５ｍｌの入った太型試験管に接種し、３０℃で１６時間培養する。
　該培養液をアンピシリン５０ｍｇ／ｍｌを含むＬＢ培地　５０ｍｌの入ったバッフル付三角フラスコに１０％接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで８時間培養する。該培養液　４０ｍｌ分を遠心分離し湿菌体を取得する。
　各菌株の培養液各４０ｍｌ分を、反応バッファー（０．１Ｍビシンバッファー（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　塩化マンガン）で一回洗浄したのち、４ｍｌの当該反応バッファーに懸濁し、超音波破砕を行う。破砕後１８，０００×ｇで５分間遠心し、膜画分を沈殿させた後、上清を採取する。上清はブラッドフォード法を用いてタンパク量を定量し、反応に用いる。
　反応は１２．５ｍＭのグルコースを含む反応バッファーに前述した上清タンパク質液を終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌになるように添加して、３０℃、３３０ｒｐｍで振とうすることによって行う。反応開始後９０分が経過した時点で１／４量の６．７Ｍリン酸を添加することで反応を終了させる。
　反応終了後、反応液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のアロヘプツロース濃度を糖分析装置ＩＣＳ－５０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて定量する。
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１５年７月２日付けで出願された日本特許出願（特願２０１５－１３３７０９）および２０１６年３月２５日付けで出願された日本特許出願（特願２０１６－６２３３１）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
　本発明のＤ－プシコースの製造法によれば、親株よりもＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物を用いることにより、微生物が有するＤ－アロースの代謝系を効率的に利用することができ、副生糖の生成および基質の残存を抑制し、高効率でＤ－プシコースを製造することができる。また、本発明のＤ－アロヘプツロースの製造法によれば、親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した、糖からＤ－アロヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物を用いることにより、高効率でＤ－アロヘプツロースを製造することができる。
配列番号１－ｙｎｉＣのアミノ酸配列
配列番号２－ｙｂｉＶのアミノ酸配列
配列番号３－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号５－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号６－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号７－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号８－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号９－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１０－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１１－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１２－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１３－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１４－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１５－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１６－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１７－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１８－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号１９－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２０－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２１－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２２－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２３－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２４－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２５－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２６－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２７－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２８－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号２９－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３０－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３１－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３２－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３３－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３４－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３５－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３６－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３７－ｐｆｋＡのアミノ酸配列
配列番号３８－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号３９－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４０－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４１－人工配列の説明：合成ＤＮＡの塩基配列
配列番号４２－ａｌｓＥの塩基配列
配列番号４３－ｒｐｉＢの塩基配列
配列番号４４－ｒｐｉＲの塩基配列
配列番号４５－ａｌｓＡの塩基配列
配列番号４６－ａｌｓＢの塩基配列
配列番号４７－ａｌｓＣの塩基配列
配列番号４８－ａｌｓＫの塩基配列
配列番号４９－ｐｆｋＡの塩基配列
配列番号５０－ｙｎｉＣの塩基配列
配列番号５１－ｙｂｉＶの塩基配列
配列番号５２－ａｌｓＥのアミノ酸配列
配列番号５３－ｒｐｉＢのアミノ酸配列
配列番号５４－ｒｐｉＲのアミノ酸配列
配列番号５５－ａｌｓＡのアミノ酸配列
配列番号５６－ａｌｓＢのアミノ酸配列
配列番号５７－ａｌｓＣのアミノ酸配列
配列番号５８－ａｌｓＫのアミノ酸配列

Claims (15)

  1. 　（ｉ）酵素源として、親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物の培養物または該培養物の処理物、および（ｉｉ）基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＤ－プシコースを採取することを特徴とする、Ｄ－プシコースの製造法。
    ［１］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
    ［２］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
    ［３］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
  2. 　親株よりも、以下の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した、糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物を培地に培養し、培養物中にＤ－プシコースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－プシコースを採取することを特徴とする、Ｄ－プシコースの製造法。
    ［１］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
    ［２］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
    ［３］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
  3. 　糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、以下の［４］～［７］のいずれか１に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性が増強した微生物である、請求項１または２に記載の製造法。
    ［４］請求項１または２の［１］～［３］のいずれか１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
    ［５］配列番号５０または５１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
    ［６］配列番号５０または５１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
    ［７］配列番号５０または５１で表される塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、Ｄ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
  4. 　糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、前記親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造法。
  5. 　糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ、Ｄ－アロース－６－リン酸イソメラーゼ、ＲｐｉＲ、Ｄ－アロース輸送蛋白質およびＤ－アロースキナーゼからなる群より選ばれる少なくとも１の蛋白質の活性が低下または喪失した微生物である、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造法。
  6. 　糖からＤ－プシコース－６－リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物である、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造法。
  7. 　（ｉ）酵素源として、親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物の培養物または該培養物の処理物、及び（ｉｉ）基質として糖を、水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該水性媒体中からＤ－アロヘプツロースを採取することを特徴とする、Ｄ－アロヘプツロースの製造法。
  8. 　親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物を培地に培養し、培養物中にＤ－アロヘプツロースを生成、蓄積させ、該培養物中からＤ－アロヘプツロースを採取することを特徴とする、Ｄ－アロヘプツロースの製造法。
  9. 　前記微生物が糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物である請求項７または８に記載の製造法。
  10. 　前記微生物がＤ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物である請求項７～９のいずれか１項に記載の製造法。
  11. 　親株よりもアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性が増強した微生物が、以下の［８］～［１０］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物である、請求項７～１０のいずれか１項に記載の製造法。
    ［８］配列番号５２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
    ［９］配列番号５２で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する変異蛋白質
    ［１０］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアルロース－６－リン酸　３－エピメラーゼ活性を有する相同蛋白質
  12. 　Ｄ－アロヘプツロース－７－リン酸からＤ－アロヘプツロースを生成する微生物が、前記親株に比べ、以下の［１１］～［１３］のいずれか１に記載の蛋白質の活性が増強した微生物である、請求項１０または１１に記載の製造法。
    ［１１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
    ［１２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する変異蛋白質
    ［１３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＤ－プシコース－６－リン酸脱リン酸化活性を有する相同蛋白質
  13. 　糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する微生物が、さらに、前記親株に比べ６－ホスホフルクトキナーゼ活性が低下または喪失した微生物である、請求項９～１２のいずれか１項に記載の製造法。
  14. 　糖が、グルコース、フルクトースおよびスクロースからなる群より選ばれる少なくとも１の糖である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の製造法。
  15. 　親株が、エシェリヒア属に属する微生物である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の製造法。
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