CN114729345A

CN114729345A - 果糖6-磷酸3-差向异构酶及其用途

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Publication number: CN114729345A
Application number: CN202080081591.3A
Authority: CN
Inventors: 许振率; 郑仁晳; 崔垠修
Original assignee: Samyang Corp
Current assignee: Samyang Corp
Priority date: 2019-10-28
Filing date: 2020-10-28
Publication date: 2022-07-08
Also published as: EP4053274A1; KR102453774B1; EP4053274A4; KR20210050476A

Abstract

本发明涉及果糖‑6‑磷酸的差向异构酶蛋白、用于编码该差向异构酶蛋白的核酸分子、包含该核酸分子的重组载体和转基因微生物，以及用于通过使用它们来生产阿洛酮糖的组合物。

Description

果糖6-磷酸3-差向异构酶及其用途

技术领域

本发明涉及用于磷酸化糖类的差向异构酶蛋白，更具体地涉及果糖-6-磷酸的差向异构酶蛋白、用于编码该酶蛋白的核酸分子、包含该核酸分子的重组载体和转基因菌株，以及用于使用该菌株生产阿洛酮糖的组合物。

背景技术

磷酸化糖类差向异构酶是一种与各种磷酸化糖类的碳结合的差向异构酶，并且己酮糖-6-磷酸差向异构酶可以使C3或C4差向异构化。己酮糖可以是选自果糖、阿洛酮糖、山梨糖和塔格糖中的一种或多种己酮糖。

果糖-6-磷酸差向异构酶包括3-差向异构酶和4-差向异构酶。具体而言，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(EC 5.1.3.30)通过果糖(D-果糖)的3-差向异构化(在C-3位差向异构化)产生阿洛酮糖-6-磷酸。

当使用上述酶由果糖生产阿洛酮糖时，用作底物的果糖与作为产物的阿洛酮糖之间存在一定程度的反应平衡，因此最终转化率仅为20％至35％。因此，当尝试使用酶通过单一反应制备高纯度阿洛酮糖时，需要另外的从最终反应溶液中分离和去除果糖的过程。

当工业上试图以果糖为原料生产阿洛酮糖时，所使用的酶必须具有较高的工业生产条件，尤其是热稳定性和尽可能高的转化率。另外，糖类被用作底物，在碱性条件下容易发生糖类褐变，需要满足转化反应条件，尽量防止糖类褐变。

因此，迫切需要一种满足底物转化率、酶的热稳定性和适合工业应用的酶反应条件中的至少一个且使用果糖作为原料生产磷酸化果糖的酶，以及使用该酶生产磷酸化果糖的方法。

发明内容

技术问题

本发明的一个方面涉及一种果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白、用于编码该酶蛋白的核酸分子、包含该核酸分子的重组载体和转基因微生物。

本发明的另一方面涉及一种组合物和一种用于使用果糖-6-磷酸生产阿洛酮糖-6-磷酸的方法，以及用于使用果糖-6-磷酸生产阿洛酮糖-6-磷酸的组合物，其包含选自果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白、表达该酶的微生物的微生物细胞、微生物细胞的细胞裂解物、微生物的培养物、微生物的培养上清液或它们的提取物中的至少一种。

本发明的另一方面涉及用于使用果糖-6-磷酸生产己酮糖例如阿洛酮糖的组合物和方法，所述组合物包含选自果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白、表达该酶的微生物细胞、微生物细胞的细胞裂解物、微生物的培养物、微生物的培养上清液或它们的提取物中的至少一种。

解决技术问题的技术手段

为了实现上述目的，本发明的一个实施方案涉及一种果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白，其包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、97％以上、或99％以上的序列同源性的氨基酸序列。例如，显然具有部分序列缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白质也可以包含在本发明的范围内，只要该氨基酸序列具有上述同源性并且表现出对应于由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的功效。

本发明的一个实施方案提供了一种果糖-6-磷酸3-差向异构酶，其包含与SEQ IDNO：1的氨基酸序列具有70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、97％以上或99％以上的序列同源性的氨基酸序列。果糖-6-磷酸3-差向异构酶可以由SEQ ID NO：2的核苷酸序列或与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少80％、90％、95％、97％或99％以上的同源性的核苷酸序列编码。

作为显示上述数值同源性的氨基酸序列，可以包括与该酶基本上相同或对应的任何果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白，但不限于此。此外，只要具有这种同源性的序列是实质上表现出果糖-6-磷酸3-差向异构酶功能的氨基酸序列，则在该序列的一部分中具有缺失、修饰、取代或添加的蛋白质变体也包含在本发明的范围内。

如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指与给定氨基酸序列或核苷酸序列的匹配程度，并且可以以百分比表示。在本发明中，将具有与给定氨基酸序列或核苷酸序列相同或相似的活性的同源序列表示为“同源性百分比”。

根据本发明的果糖-6-磷酸3-差向异构酶催化果糖-6-磷酸的3-差向异构化反应，具体而言，可以进行将果糖-6-磷酸转化为阿洛酮糖-6-磷酸的3-差向异构化。

根据本发明的果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白可以是来源于Clostridiumlundense的酶，并且具体地，可以是来源于Clostridium lundenseDSM 17049的酶。

来源于Clostridium lundense的果糖-6-磷酸3-差向异构酶的反应温度范围可以是40至70℃、45至75℃、45至77℃、50至70℃或50至75℃。最佳温度可以是例如在pH 7.0的条件下反应进行5分钟时的结果，但不限于此。果糖-6-磷酸3-差向异构酶的最佳温度条件为60℃，并且在40至70℃的较宽温度范围内其活性为最大酶活性的50％以上。

来源于Clostridium lundense的果糖-6-磷酸3-差向异构酶的反应pH范围可以是pH 6至8、pH 6至7.5、pH 6.5至8、pH 6.5至7.5、pH 7至8或pH 7至7.5，在pH 7.0至7.5条件下其具有最大活性，并且在pH 6.0至8.0范围内其活性为最大酶活性的80％以上。

来源于Clostridium lundense的果糖-6-磷酸3-差向异构酶的最大阿洛酮糖生成量为16重量％以上、18重量％以上、20重量％以上、25重量％以上、27重量％以上、30重量％以上或32重量％以上。具体而言，酶的最大阿洛酮糖生成量可以通过将0.1mg/ml的酶添加到20g/L果糖-6-磷酸的溶解液中进行的反应来测量，更具体地，可以通过将0.1mg/ml的酶添加到20g/L果糖-6-磷酸的溶解液中，在pH 7.0和50℃下进行酶促反应来测量。

阿洛酮糖的最大转化率可以通过下面的等式1计算。获得最大阿洛酮糖转化率的酶促反应的时间可以为8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上或16小时以上，并且反应时间的上限可以为18小时以下或20小时以下。具体的反应时间可以是下限和上限的组合范围，例如可以是16小时至20小时。

[等式1]

阿洛酮糖最大转化率(％)＝(阿洛酮糖生成量(g/L)/果糖-6-磷酸投入量(g/L)*(阿洛酮糖分子量/果糖-6-磷酸分子量)*100

酶促反应产物中糖类的阿洛酮糖产率(重量％)可以通过下面的等式计算。获得阿洛酮糖产率的酶反应时间可以是2小时至6小时、3小时至6小时或4小时至6小时，例如4小时至6小时。

[等式2]

阿洛酮糖产率(重量％)＝阿洛酮糖生成量/(果糖生成量+阿洛酮糖生成量)*100

根据本发明的果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白可以通过金属离子而提高或降低其酶活性。具体而言，果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白的酶活性通过Mn离子、Co离子和Ni离子而提高。例如，与没有金属离子的条件相比，果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白表现出1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上或1.5倍以上的活性。特别地，与没有金属离子的条件相比，Mn离子和Co离子表现出2倍以上，或3倍以上，特别是2倍至5倍，2倍至4倍，3倍至5倍，或3倍至5倍的活性。果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白具有其活性因Ca离子、Cu离子、Fe离子或Zn离子而降低的特性。

根据本发明的实施方案的果糖-6-磷酸3-差向异构酶具有与SEQ ID NO：1的氨基酸序列70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、97％以上或99％以上的序列同源性。显然具有部分序列缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白质也可以包含在本发明的范围内，只要该氨基酸序列表现出对应于由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的功效即可。

对于来源于Clostridium lundense的果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白，分析了与来源于瘤胃球菌属(Ruminococcus sp.)AF14-10的磷酸核酮糖3-差向异构酶(RuFP3E：SEQID NO：5的氨基酸序列)、来源于梭菌属(Clostridium sp.)DL-VIII的磷酸核酮糖3-差向异构酶(CDFP3E：SEQ ID NO：7的氨基酸序列)和来源于胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacilluskribbensis)的磷酸核酮糖3-差向异构酶(PkFP3E：SEQ ID NO：9的氨基酸序列)的氨基酸序列同一性，结果是与RuFP3E的序列同一性为59.05％，与CDFP3E的序列同一性为63％，与PkFP3E的氨基酸序列同一性为60.96％，与SEQ ID NO：1的氨基酸序列的序列同一性小于70％。

此外，作为由果糖6-磷酸向阿洛酮糖-6-磷酸的转化活性的HPLC分析的结果，在具有SEQ ID NO：1的ClFP3E酶中鉴定出阿洛酮糖峰，但在RuFP3E、CDFP3E和PkFP3E中未鉴定出阿洛酮糖峰。因此，由于除ClFP3E酶之外的其他候选酶对F6P没有活性，因此可以确认，当处理磷酸酶时，仅生成了从作为反应步骤的初始底物的F6P中去除磷酸基团的形式的果糖(图7a，图7b)。

本发明的另一个实施方案提供了一种编码本发明的果糖-6-磷酸3-差向异构酶的核酸分子。在根据本发明的编码果糖-6-磷酸3-差向异构酶的核酸的一个具体实施方案中，果糖-6-磷酸3-差向异构酶可以包括SEQ ID NO：2的核苷酸序列或与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少80％以上、90％以上、95％以上、97％以上、或99％以上同一性的核苷酸序列。

本发明的又另一个实施方案提供了包含编码本发明的果糖-6-磷酸3-差向异构酶的核酸的载体或转化子。

如本文所用，术语“转化”是指将包含编码靶蛋白的核酸的载体引入宿主细胞的过程，从而使得由该核酸编码的蛋白能够在宿主细胞中表达。对于转化的核酸，转化的核酸是否***到宿主细胞的染色体中并位于染色体内或位于染色体外都没有关系，只要它能在宿主细胞中表达即可，且两种情况都包括在内。此外，核酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。核酸可以以任何形式***，只要它能够被引入宿主细胞并在其中表达即可。例如，核酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，表达盒是一种基因构建体，包括自我表达所需的所有基本要素。表达盒通常可以包括与核酸可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，可以将核酸原样引入宿主细胞中并且可操作地连接至其在宿主细胞中表达所必需的序列，但核酸不限于此。

此外，如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动并介导编码本发明的靶蛋白的核酸的转录的启动子序列与上述基因序列之间的功能性连接。

本发明的载体转化方法包括任何将核酸导入细胞的方法，并且可以根据宿主细胞选择本领域已知的合适的标准技术进行。该方法的实例可以包括电穿孔、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)技术、DEAE-葡聚糖技术、阳离子脂质体技术、乙酸锂-DMSO技术等，但不限于此。

作为宿主细胞，优选使用DNA导入效率高且导入的DNA表达效率高的宿主。例如，它可以是大肠杆菌，但不限于此。

本发明的又另一个实施方案提供了一种用于生产己酮糖例如阿洛酮糖的组合物，其包含选自根据本发明的果糖-6-磷酸3-差向异构酶、表达该酶蛋白的微生物、表达该酶蛋白的转基因微生物、微生物的微生物细胞、微生物的微生物细胞的细胞裂解物、微生物的培养物、微生物的培养上清液、微生物的培养上清液的浓缩物及它们的粉末中的至少一种。

培养物含有由产生果糖-6-磷酸3-差向异构酶的微生物产生的酶，并且可以是具有或不具有菌株的无细胞形式。细胞裂解物是指通过将产生果糖-6-磷酸3-差向异构酶的微生物的微生物细胞破坏而获得的裂解物或通过将裂解物离心而获得的上清液，并且包含由产生多聚磷酸盐依赖性葡萄糖激酶的微生物产生的酶。

该菌株的培养物含有由产生果糖-6-磷酸3-差向异构酶的微生物产生的酶，并且可以是具有或不具有微生物细胞的无细胞形式。除非本文另有说明，否则用于生产果糖-6-磷酸3-差向异构酶的微生物是指包括选自以下的至少一种：菌株的微生物细胞、菌株的培养物、微生物细胞的裂解物、裂解物的上清液及它们的提取物。

根据本发明的用于生产己酮糖例如阿洛酮糖的方法是环境友好的，因为它使用从微生物获得的酶。采用简单的酶促反应从果糖转化为阿洛酮糖的新方法，显著降低了生产成本，并且最大限度地提高了生产效果。

根据本发明的用于生产阿洛酮糖的组合物可以进一步包含选自Mn离子、Co离子和Ni离子中的一种或多种金属离子。金属离子的浓度可以是0.5mM至20mM，例如可以是0.5mM至10mM、1.0mM至10mM、1.5mM至8.0mM、2.0mM至8.0mM、3.0mM至7.0mM、4.0mM至6.0mM，或0.2mM至10mM。

当使用用于生产阿洛酮糖的组合物生产己酮糖阿洛酮糖时，使用酶或产酶微生物的反应温度和反应pH条件与上述酶的反应温度和反应pH条件相同。

用于生产阿洛酮糖的组合物可以包含选自将果糖转化为果糖-6-磷酸的己糖激酶、表达酶蛋白的转基因微生物、微生物的微生物细胞、微生物的微生物细胞裂解物、微生物培养物、微生物的培养上清液、微生物的培养上清液的浓缩物及它们的粉末中的至少一种。

果糖-6-磷酸优选通过己糖激酶处理果糖或含果糖的物质获得，但即使是通过其他化学合成方法等提供的，也落入了本发明的范围。

果糖-6-磷酸可以由葡萄糖-6-磷酸制备，并且用于生产阿洛酮糖的组合物可以进一步包括通过将葡萄糖-6-磷酸异构化而使葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸的葡萄糖-6-磷酸异构酶。

葡萄糖-6-磷酸可以通过葡萄糖的直接磷酸化制备，或者可以由葡萄糖-1-磷酸转化。葡萄糖可以通过用糖异生淀粉酶处理淀粉或淀粉水解产物例如糊精等来获得，并且可以通过用磷酸化酶处理葡萄糖来获得葡萄糖-1-磷酸。用于生产己酮糖的组合物可以进一步包括用于生产葡萄糖-6-磷酸的酶***。

具体地，本发明的用于生产阿洛酮糖的组合物中所含的酶和用于生产阿洛酮糖的底物不受限制。本发明的用于生产阿洛酮糖的组合物可以进一步包括(a)(i)淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或它们的组合；(ii)磷酸盐；(iii)阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶；(iv)葡萄糖-6-磷酸异构酶；(v)磷酸葡萄糖变位酶或葡萄糖磷酸化酶；以及(vi)α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、葡糖淀粉酶或蔗糖酶；或者(b)表达第(a)项描述的任何酶的微生物或微生物的培养物，但不限于此。

具体地，本发明的淀粉/麦芽糖糊精磷酸化酶(EC 2.4.1.1)和α-葡聚糖磷酸化酶可以包括任何蛋白，只要这些蛋白是将磷酸盐转移到葡萄糖从而具有从淀粉或麦芽糖糊精产生葡萄糖-1-磷酸的活性的蛋白即可。

本发明的蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)可以包括任何蛋白，只要它是将磷酸盐转移到葡萄糖从而具有从蔗糖产生葡萄糖-1-磷酸的活性的蛋白即可。

本发明的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)和异淀粉酶是用于淀粉糖化的酶，可以包括任何蛋白，只要它们是具有将淀粉或麦芽糖糊精转化为葡萄糖的活性的蛋白即可。

本发明的蔗糖酶(EC 3.2.1.26)可以包括任何蛋白，只要它是具有将蔗糖转化为葡萄糖的活性的蛋白即可。本发明的磷酸葡萄糖变位酶(EC5.4.2.2)可以包括任何蛋白，只要它是具有将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸的活性的蛋白即可。葡萄糖激酶可以包括任何蛋白，只要它是能够将磷酸盐转移到葡萄糖从而具有转化为葡萄糖-6-磷酸的活性的蛋白即可。具体而言，葡萄糖激酶可以是多聚磷酸盐依赖性葡萄糖激酶。

本发明的葡萄糖-6-磷酸异构酶可以包括任何蛋白，只要它具有将葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸的活性即可。

本发明的阿洛酮糖-6-磷酸去磷酸化酶可以包括任何蛋白，只要它是具有将阿洛酮糖-6-磷酸转化为阿洛酮糖的活性的蛋白即可。更具体地，阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶可以是具有将阿洛酮糖-6-磷酸不可逆地转化为阿洛酮糖的活性的蛋白。用于生产阿洛酮糖的组合物可以进一步包括植酸酶，其在阿洛酮糖-6-磷酸中进行去磷酸化反应，例如，阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶，但不限于此。用于生产己酮糖的组合物可以进一步包括阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、表达阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或表达阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的微生物的培养物。

使用用于生产己酮糖例如阿洛酮糖-6-磷酸的酶，使用用于生产己酮糖的组合物或产生酶的微生物的反应温度和反应pH条件与上述酶的反应温度和反应pH条件相同。

该方法可以进一步包括使用己糖激酶从果糖或含果糖的物质制备果糖-6-磷酸，和/或可以进一步包括使磷酸酶与表达磷酸酶的微生物或微生物的培养物接触以去除磷酸盐。

可以使用阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、表达阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或表达阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的微生物的培养物以生产阿洛酮糖来进行去除磷酸盐的步骤。阿洛酮糖-6-磷酸可以通过其他酶或化学方法去除磷酸基团。

本发明的一个实施方案提供了一种用于生产阿洛酮糖的方法，该方法进一步包括接触果糖-6-磷酸3-差向异构酶、表达果糖-6-磷酸3-差向异构酶的微生物或表达果糖-6-磷酸3-差向异构酶的微生物的培养物，从而将果糖-6-磷酸转化为阿洛酮糖-6-磷酸。

在本发明的将果糖-6-磷酸转化为阿洛酮糖-6-磷酸的步骤之后，本发明的制备方法可以进一步包括使阿洛酮糖-6-磷酸与阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶、表达阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的微生物，或表达阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的微生物培养物接触，从而将阿洛酮糖-6-磷酸转化为阿洛酮糖的步骤。

在将本发明的果糖-6-磷酸转化为阿洛酮糖-6-磷酸的步骤之前，本发明的制备方法可以进一步包括使葡萄糖-6-磷酸与葡萄糖-6-磷酸-异构酶、表达葡萄糖-6-磷酸-异构酶的微生物，或表达葡萄糖-6-磷酸-异构酶的微生物的培养物接触的步骤，从而将葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸。

此外，在将本发明的葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸的步骤之前，本发明的制备方法可以进一步包括，使葡萄糖-6-磷酸与磷酸葡萄糖变位酶、表达磷酸葡萄糖变位酶的微生物、或表达磷酸葡萄糖变位酶的微生物的培养物接触的步骤，从而将葡糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸。

此外，在将本发明的葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸的步骤之前，本发明的制备方法可以进一步包括使葡萄糖与葡萄糖激酶、表达葡萄糖激酶的微生物的培养物和磷酸盐接触的步骤，从而将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸。

在将本发明的葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸的步骤之前，本发明的制备方法可以进一步包括使淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或它们的组合与α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶；表达磷酸化酶的微生物；或表达磷酸化酶的微生物的培养物和磷酸盐接触的步骤，从而将淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或它们的组合转化为葡萄糖-1-磷酸。

在将本发明的葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸的步骤之前，本发明的制备方法可以进一步包括使淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或其组合与α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶；表达淀粉酶、支链淀粉酶或蔗糖酶的微生物；或表达淀粉酶、支链淀粉酶或蔗糖酶的微生物培养物接触的步骤，从而将淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或它们的组合转化为葡萄糖。

本发明的制备方法可以进一步包括使葡萄糖与4-α-葡糖基转移酶、表达4-α-葡糖基转移酶的微生物或表达4-α-葡糖基转移酶的微生物的培养物接触的步骤，从而将葡萄糖转化为淀粉、麦芽糖糊精或蔗糖。

根据该制备方法制备的阿洛酮糖可以通过将其添加到功能性食品和药物中而被有效地使用。

有益效果

根据本发明的果糖-6-磷酸3-差向异构酶满足高酶转化率、酸性或中性反应pH条件和高热稳定性中的至少一种性质，因此可在工业规模上使用果糖-6-磷酸3-差向异构酶有效地用于生产己酮糖。

附图说明

图1为证实根据本发明的实施方案的果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白表达和纯化的电泳照片；

图2示出了根据本发明的实施方案的果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白的BIO-LC分析结果；

图3示出了根据本发明的实施例通过阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶的酶促反应将反应液中的磷酸化糖类去磷酸化后的LC分析结果；

图4为示出根据本发明的实施方案的果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白的温度特性分析结果图；

图5为示出根据本发明的实施方案的果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白的pH特性分析结果图；

图6为示出根据本发明的实施方案的果糖-6-磷酸3-差向异构酶蛋白的金属离子影响图；

图7a和图7b是使用三种常规已知的磷酸核酮糖3-差向异构酶进行阿洛酮糖生产后获得的反应产物的HPLC分析结果。

具体实施方式

将参照以下实施例更详细地描述本发明，但权利范围不限于以下实施例。

实施例1：果糖-6-磷酸3-差向异构酶的生产

筛选了预期用作果糖-6-磷酸3-差向异构酶的候选酶，并且作为预期显示最佳效果的酶，编码来源于Clostridium lundense DSM 17049菌株的酶(ClFP3E)的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的多核苷酸(SEQ ID NO：2)是通过IDT基因合成请求基因合成获得的。基于合成的SEQ ID NO：2的ClFP3E DNA序列设计引物，并且进行PCR扩增该基因的核苷酸序列。用于PCR扩增的正向引物序列和反向引物序列如下。

[表1]

引物名称	序列(5'->3')	SEQ ID NO：
			pET21_ClRP3E_F	tatacatatgAAATACGGCTTCGCACC	3
pET21_ClRP3E_R	ggtgctcgagTTCTTTGTAGCTCAGGCTGTA	4

使用限制性内切酶NdeI和XhoI将大量获得的ClFP3E基因导入pET21a载体，以制备pET21_ClFP3E，将其转化到大肠杆菌ER2566菌株中。在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中制备的琼脂板上以菌落形式获得用于酶蛋白表达的重组大肠杆菌。

在4ml LB培养基中进行种子培养后，在100ml LB培养基中进行主培养。培养条件为在37℃、200rpm下孵育，至600nm处的吸光度值为0.6，然后向其中加入0.1mM IPTG以诱导靶蛋白表达。诱导后，将菌株在25℃培养约16小时，然后离心回收细胞。将回收的细胞悬浮在裂解缓冲液(50mM磷酸钠(pH 7.0)缓冲液、300mM NaCl、10mM咪唑)中，并使用珠磨机(beadbeater)破坏细胞。通过SDS-PAGE凝胶分析证实了来自细胞破碎溶液的靶蛋白ClFP3E的过表达。靶蛋白ClFP3E的过表达分析结果如图1所示。经SDS-PAGE凝胶分析证实，ClFP3E的分子量约为28KDa。

此外，去除细胞沉淀后，仅获得细胞上清液并将其结合到Ni-NTA柱(Ni-NTAsuperflow，Qiagen公司)上，然后用洗涤缓冲液(50mM磷酸钠(pH7.0)缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑)去除未与柱结合的蛋白。作为最后一步，用洗脱缓冲液(50mM磷酸钠(pH 7.0)缓冲液、300mM NaCl、200mM咪唑)洗脱感兴趣的蛋白。将最终固定的蛋白转至50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)并储存以备后续使用。

实施例2：酶转化活性的评估

将0.1mg/ml的实施例1中获得的纯化后的ClFP3E酶添加到将20g/L的果糖-6-磷酸溶解在50mM磷酸钠(pH 7.0)缓冲液中的溶液中，，并且在50℃下进行酶促反应。

通过Bio-LC分析，酶促反应溶液的分析证实了与底物相比新产生的物质。然而，由于不存在阿洛酮糖-6-磷酸标准品，因此无法准确确认，因此，在用阿洛酮糖-6-磷酸的磷酸酶(A6PP)进一步处理后，最终确认了所得的阿洛酮糖。Bio-LC分析证实，在ClFP3E酶反应过程中，F6P减少，并产生了一个被认为是A6P的新峰。Bio-LC分析的结果如下图2所示。

通过A6PP酶促反应将反应溶液中的磷酸化糖类去磷酸化后的LC分析结果如下。使用Aminex HPX-87C柱在80℃的温度和0.6ml/分钟的流速下进行分析，结果如图3所示。作为分析的结果，可以确认果糖和阿洛酮糖。

通过量化产生的阿洛酮糖的量计算得出的ClFP3E的最终转化率是34.3％，阿洛酮糖是通过阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)酶促反应去磷酸化的反应溶液的最终产物。本实施例的反应产物为进行酶促反应16小时获得的ClFP3E的最终转化，并且阿洛酮糖的最大转化率按下式计算。

[等式1]

实施例3：酶的温度特性分析

为了确定温度对ClFP3E酶活性的影响，将10g/L果糖-6-磷酸溶解在50mM磷酸钠(pH 7.0)缓冲液中，然后向其中加入0.01mg/ml ClFP3E纯化蛋白，将反应在40℃至80℃之间的各种温度条件下进行5分钟。

然后，加入A6PP酶使所有反应组合物去磷酸化，然后通过HPLC分析定量分析产生的阿洛酮糖的量。基于在60℃下测得的最高活性的活性，根据反应温度的酶的相对活性示于图4中。

作为实验结果，确认了ClFP3E的最佳温度条件为60℃，并且在40℃至70℃的宽温度条件范围内，其活性为最大酶活性的50％以上。

实施例4：酶的pH特性分析

为确认pH值对ClFP3E酶活性的影响，将10g/L果糖-6-磷酸溶解在pH 5.0至8.5的缓冲液(pH 5.0至6.5，柠檬酸钠/pH 6.5至8.5，Tris-HCl)中，向其中加入0.01mg/ml的纯化后的ClFP3E蛋白，并在60℃的温度下进行酶促反应5分钟。然后，加入A6PP酶使所有反应组合物去磷酸化，然后通过HPLC分析定量分析阿洛酮糖生成量。基于具有最佳活性的pH7.5的相对活性，根据反应pH的酶活性结果如图5所示。

作为实验结果，可以确认在pH 7.0至7.5下的最大活性，并且确认它在pH 6.0至8.0的范围内具有最大酶活性的80％以上。

实施例5：金属离子对酶的作用分析

为了根据反应过程中添加的金属离子的类型确定ClFP3E的活性，将10g/L果糖-6-磷酸溶解在50mM磷酸钠(pH 7.0)缓冲液中，添加5mM的每种金属离子(MgCl₂、MnCl₂、CaCl₂、CoCl₂、CuCl₂、NiSO₄、FeSO₄、ZeSO₄)。将0.01mg/ml的ClFP3E纯化蛋白添加到含有各种金属离子的反应缓冲液中，并且在60℃的温度下进行5分钟的反应。

然后，加入A6PP酶使所有反应组合物去磷酸化，然后通过HPLC分析定量分析产生的阿洛酮糖的量。基于未添加金属离子的实验组，依赖于金属离子类型的酶的相对活性如图6所示。

作为实验结果，当添加MnCl₂和CoCl₂时，证实活性比不添加金属离子的条件高出三倍。发现ClFP3E酶是一种利用锰和钴作为辅因子的酶。此外，镍也能增加活性。CaCl₂、CuCl₂、FeSO₄、ZeSO₄降低了酶的活性。

比较例1：使用磷酸核酮糖3-差向异构酶的阿洛酮糖生产分析

通过请求基因合成来获得来源于瘤胃球菌属AF14-10的磷酸核酮糖3-差向异构酶(RuFP3E：SEQ ID NO：5的氨基酸序列和SEQ ID NO：6的核酸序列)、来源于梭菌属DL-VIII的磷酸核酮糖3-差向异构酶(CDFP3E：SEQ ID NO：7的氨基酸序列和SEQ ID NO：8的核酸序列)、来源于胶冻样类芽孢杆菌的磷酸核酮糖3-差向异构酶(PkFP3E：SEQ ID NO：9的氨基酸序列和SEQ ID NO：10的核酸序列)的多核苷酸。

作为分析与来源于Clostridium lundense DSM 17049菌株的果糖-6-磷酸3-差向异构酶(ClFP3E)的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列同源性的结果，与具有SEQ IDNO：5的氨基酸序列的RuFP3E的氨基酸序列同一性为59.05％，与具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDFP3E的氨基酸序列同一性为63％，与具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的PkFP3E的氨基酸序列同一性为60.96％。

基于合成的SEQ ID NO：2的ClFP3E DNA序列，以与实施例1基本相同的方法获得大量基因。以与实施例1基本相同的方法，将获得的基因导入大肠杆菌并使其表达，然后洗脱感兴趣的蛋白。最后，将获得的蛋白转入50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)并储存以备后续使用。

为了分析果糖-6-磷酸向阿洛酮糖-6-磷酸的转化活性，以与实施例2相同的方法使用获得的酶进行以果糖-6-磷酸为底物的酶促反应。酶促反应后，进行使用阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶(A6PP)的去磷酸化反应，然后，使用高效液相色谱法(HPLC)测量反应产物溶液中产生的阿洛酮糖的量。

至于HPLC分析条件，使用配备有Aminex HPX-87C柱(BIO-RAD)的HPLC(Agilent，美国)的RID(示差折光检测器Agilent 1260RID)。使用水作为流动相溶剂，并且温度为80℃，流速为0.6ml/分钟。HPLC分析的结果如图7a和图7b所示。本实施例的反应产物通过进行4小时的酶促反应获得，以获得酶的阿洛酮糖转化率。作为筛选FP3E候选酶的实验，分析了在阿洛酮糖产生的中间阶段停止反应的反应溶液。在图7a和图7b中，CIFP3E的阿洛酮糖转化率为16％，并且反应进行到实施例2的最大转化率的50％左右。在本实施例中，总反应产物的阿洛酮糖产率为75％。阿洛酮糖产率通过下式计算。

如图7a和图7b所示，除了实施例1的ClFP3E酶之外，在其他候选酶中没有确认阿洛酮糖峰。因此，由于除ClFP3E酶之外的其他候选酶对F6P没有活性，因此证实了当处理磷酸酶时，仅产生由作为反应步骤的初始底物的F6P产生的去磷酸化产物的果糖。

<110> 株式会社三养社（SYMYANG COOPERATION）

<120> 果糖6-磷酸3-差向异构酶及其用途

<130> KHP222110542.9

<150> KR 10-2019-0134730

<151> 2019-10-28

<150> KR 10-2020-0141069

<151> 2020-10-28

<160> 10

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列（ Artificial Sequence）

<220>

<223> 果糖6-磷酸3-差向异构酶

<400> 1

Met Lys Tyr Gly Phe Ala Pro Ser Leu Met Cys Met Asn Ile Leu Lys

1 5 10 15

Leu Glu Glu Gln Ile Lys Ile Leu Asn Lys Lys Ala Asp Phe Tyr His

20 25 30

Val Asp Ile Met Asp Gly His Tyr Val Lys Asn Ile Thr Leu Ser Pro

35 40 45

Phe Phe Ile Gln Gln Ile Arg Pro Leu Ala Thr Ile Pro Ile Asp Ala

50 55 60

His Leu Met Val Glu Asn Pro Asn Asp Phe Leu Asp Glu Leu Lys Lys

65 70 75 80

Ala Gly Thr Asp Tyr Val Ser Leu His Val Glu Thr Ile Asn Lys Asp

85 90 95

Val Phe Arg Ile Thr Asn Lys Ile Lys Ser Leu Gly Met Lys Val Gly

100 105 110

Val Val Leu Asn Pro Ala Thr Pro Ile Asp Glu Ile Lys His Tyr Ile

115 120 125

Asn Arg Leu Asp Lys Ile Thr Val Met Thr Val Asp Pro Gly Phe Ala

130 135 140

Gly Gln Ala Phe Ile Pro Glu Met Leu Asp Lys Ile Arg Glu Leu Lys

145 150 155 160

Glu Ile Lys Glu Lys Glu Gly Tyr Lys Tyr Ile Ile Glu Ile Asp Gly

165 170 175

Ser Cys Asn Glu Lys Thr Phe Ala Gln Leu Lys Glu Ala Gly Ala Glu

180 185 190

Val Phe Val Val Gly Ser Ser Gly Leu Phe Asn Lys Asp Glu Asp Leu

195 200 205

Glu Lys Ala Trp Glu Met Met Met Ser Asp Phe Asn Tyr Ser Leu Ser

210 215 220

Tyr Lys Glu

225

<210> 2

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列（ Artificial Sequence）

<220>

<223> 果糖6-磷酸3-差向异构酶的多核苷酸序列

<400> 2

atgaaatacg gcttcgcacc gtccctgatg tgcatgaaca tcctgaaact ggaagaacaa 60

atcaaaattc tgaacaaaaa agcggatttc taccacgtag acattatgga tgggcactat 120

gttaaaaaca tcacgctgtc tccgttcttt atccaacaga tccgcccgct ggcgaccatt 180

ccaatcgacg cgcatctgat ggtcgagaac ccgaacgact ttctggacga actgaaaaaa 240

gctggtactg actacgtgtc tctgcacgta gaaaccatta acaaagatgt tttccgcatc 300

acgaacaaaa tcaaatcgtt aggtatgaaa gttggcgtgg ttctgaaccc tgcgactccg 360

atcgacgaaa tcaaacatta catcaaccgt ctggacaaaa tcactgttat gactgttgac 420

cctggtttcg ctggccaagc gttcatcccg gaaatgctgg acaaaatccg tgaactcaag 480

gaaatcaaag aaaaagaggg ttacaaatac attattgaaa tcgatggcag ctgcaacgaa 540

aagactttcg cccaactgaa agaagcgggt gcggaagttt tcgtagtcgg ctctagcggc 600

ctgtttaaca aagatgaaga cctggaaaaa gcctgggaaa tgatgatgtc cgacttcaat 660

tacagcctga gctacaaaga atag 684

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（ Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物 pET21_ClRP3E_F

<400> 3

tatacatatg aaatacggct tcgcacc 27

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（ Artificial Sequence）

<220>

<223> 引物 pET21_ClRP3E_R

<400> 4

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<210> 5

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列（ Artificial Sequence）

<220>

<223> 磷酸核酮糖 3-差向异构酶 (RuFP3E)

<400> 5

Met Lys Val Glu Phe Ser Pro Ser Leu Met Cys Met Asp Phe Leu Lys

1 5 10 15

Met Glu Glu Gln Phe Asn Ile Leu Asn Asp Lys Val Asp Met Tyr His

20 25 30

Ile Asp Ile Met Asp Gly His Phe Cys Lys Asn Ile Thr Leu Ser Pro

35 40 45

Asp Leu Val Lys Thr Phe Ser Lys Val Ala Lys Lys Pro Met Asp Val

50 55 60

His Leu Met Thr Thr Asn Pro Thr Asp Trp Ile Glu Lys Val Ala Ala

65 70 75 80

Ala Gly Ala Glu Tyr Ile Ser Pro His Ala Glu Thr Ile Asn Gly Asp

85 90 95

Ala Phe Arg Val Met Asn Met Ile Lys Ser Leu Gly Cys Lys Thr Gly

100 105 110

Val Val Leu Asn Pro Ala Thr Pro Leu Ser Tyr Val Lys His Tyr Leu

115 120 125

Asn Arg Ile Asp Leu Leu Thr Ile Met Thr Val Asp Val Gly Phe Ala

130 135 140

Gly Gln Pro Phe Ile Glu Glu Met Leu Asp Lys Ile Lys Glu Ala Lys

145 150 155 160

Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Gly Tyr Thr Tyr Lys Ile Gln Ile Asp Gly

165 170 175

Ser Cys Asn Pro Lys Thr Tyr Lys Arg Met Tyr Asp Ala Gly Ala Glu

180 185 190

Val Leu Ile Val Gly Ser Ser Gly Leu Phe Gly Leu Asn Glu Asp Leu

195 200 205

Asn Lys Ala Cys Asp Gln Met Phe Glu Asp Phe Asn Arg Ala Ile Ala

210 215 220

Glu

225

<210> 6

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列（ Artificial Sequence）

<220>

<223> 磷酸核酮糖 3-差向异构酶 (RuFP3E)的多核苷酸序列

<400> 6

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ttcaacattc tgaatgacaa agtggacatg tatcatatcg acatcatgga cggccatttc 120

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ccgatggatg tgcacttgat gaccaccaac ccgaccgatt ggatcgaaaa agttgccgcg 240

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gaactgaaag agaaatatgg ttacacctac aagatccaga tcgacggctc ttgcaacccg 540

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<210> 7

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列（ Artificial Sequence）

<220>

<223> 磷酸核酮糖 3-差向异构酶 (CDFP3E)

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Leu Lys Asn Gln Ile Glu Ile Leu Asn Glu Arg Ala Asp Ile Phe His

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Val Asp Ile Met Asp Gly His Tyr Val Lys Asn Phe Ser Leu Ser Pro

35 40 45

Ala Met Met Glu Gln Leu Lys Thr Ile Thr Lys Ile Pro Met Asp Ala

50 55 60

His Leu Met Val Glu Asn Pro Ala Asp Phe Leu Glu Gly Ile Ala Lys

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Ala Gly Ala Thr Tyr Ile Ser Pro His Ala Glu Thr Ile Asn Lys Asp

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Ala Phe Arg Ile Met Arg Thr Ile Lys Ala Leu Gly Cys Lys Thr Gly

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Val Val Leu Asn Pro Ala Thr Pro Val Glu Tyr Ile Lys His Tyr Leu

115 120 125

Gly Met Leu Asp Lys Ile Thr Ile Leu Thr Val Asp Ala Gly Phe Ala

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Gly Gln Thr Phe Ile Glu Glu Met Leu Asp Lys Ile Glu Glu Val Lys

145 150 155 160

Arg Leu Arg Glu Glu Asn Gly Tyr Ser Tyr Leu Ile Glu Val Asp Gly

165 170 175

Ser Cys Asn Glu Lys Thr Phe Lys Lys Leu Ala Glu Ala Gly Thr Glu

180 185 190

Val Phe Ile Val Gly Ser Ser Gly Leu Phe Asn Leu Asp Ala Asp Leu

195 200 205

Lys Val Ser Trp Asp Lys Met Met Asn Met Phe Asn Lys Cys Ile Asn

210 215 220

Asn

225

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<212> DNA

<213> 人工序列（ Artificial Sequence）

<220>

<223> 磷酸核酮糖 3-差向异构酶(CDFP3E)的多核苷酸序列

<400> 8

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atcgaaatct tgaacgaacg cgctgacatc ttccatgtag acatcatgga tggccattac 120

gtaaagaatt tttctctctc tccggcgatg atggaacagc ttaaaaccat tactaaaatc 180

ccgatggacg cccacctgat ggtggaaaac ccggcggatt tcctggaagg aatcgcaaaa 240

gcgggcgcga cctacatcag ccctcacgcc gaaaccatta acaaagatgc gtttcgtatc 300

atgcgcacca tcaaagctct gggctgtaaa actggtgttg tgctgaatcc ggccactccg 360

gtagagtaca ttaaacacta tctgggcatg ctggacaaaa ttaccatcct gactgttgac 420

gcaggtttcg cgggtcagac ctttatcgaa gagatgctgg ataaaattga agaagttaaa 480

cgtctgcgtg aagaaaacgg ttactcgtat ttaattgagg tcgacggttc ctgcaacgag 540

aagactttca aaaaattagc ggaagctggt accgaagttt tcattgttgg ctctagcggc 600

ctgttcaacc tggacgcgga cctgaaagtg agctgggata aaatgatgaa catgttcaat 660

aaatgtatca acaactaa 678

<210> 9

<211> 228

<212> PRT

<213> 人工序列（ Artificial Sequence）

<220>

<223> 磷酸核酮糖 3-差向异构酶 (PkFP3E)

<400> 9

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Asp Ala Gly Ala Thr Tyr Ile Ser Pro His Ala Glu Val Ile Asn Ser

85 90 95

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Gly Ile Ala Leu Asn Pro Ala Thr Pro Leu Ser His Ile Gln His Tyr

115 120 125

Ile His His Leu Asp Lys Ile Thr Phe Met Ser Val Asp Pro Gly Phe

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Ala Gly Gln Lys Phe Ile Pro Glu Val Leu Asp Lys Ile Arg Glu Ala

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Gly Ser Cys Asn Glu Lys Thr Phe Lys Ile Leu Glu Glu Ala Gly Val

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<212> DNA

<213> 人工序列（ Artificial Sequence）

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tatgttaaaa acattaccct gagcccgtac ttcatggaac agattcgcga atcgctgact 180

atccctatgg atgttcatct gatggttgaa aaaccgagcg aattcattaa aatgattatc 240

gatgcgggtg ccacctacat tagccctcat gctgaagtta tcaactctga agcgtttcgt 300

atgatcgaca ccatcaaatc cgcgggttgc aaagctggta ttgcactgaa cccggcaacc 360

ccgctgtctc acatccaaca ttacatccat catctcgaca agatcacctt tatgtccgtt 420

gatcctggtt tcgctgggca gaaattcatc cctgaagtcc tggataagat tcgtgaagct 480

cgtgcactga aagaaaaaca cggctacaac tacttaatcg aaatcgatgg ttcttgcaat 540

gagaaaacct ttaagatcct cgaagaagca ggtgtagaag ttttcatcgt tggtacttcg 600

ggactgttca acctggatag cgacctgaac aaggcttggg accagatgat ggaacatttc 660

aactctcagg tcaacgcaga ggtctga 687

Claims

1.一种果糖-6-磷酸的差向异构酶蛋白，其与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性，并将果糖-6-磷酸转化为阿洛酮糖-6-磷酸。

2.根据权利要求1所述的差向异构酶蛋白，其中，所述酶由与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少80％的核苷酸序列同一性的核苷酸序列编码。

3.根据权利要求1所述的差向异构酶蛋白，其中，所述酶来源于Clostridiumlundense，并且酶反应温度为40℃至70℃，酶反应pH为6至8。

4.根据权利要求1所述的差向异构酶蛋白，其中，通过锰离子、钴离子或镍离子提高所述酶的活性。

5.一种用于生产阿洛酮糖的组合物，其包含选自权利要求1至4中任一项所述的果糖-6-磷酸的差向异构酶蛋白、表达所述酶的微生物、表达所述酶蛋白的转基因微生物、所述微生物的微生物细胞、所述微生物的微生物细胞的细胞裂解物、所述微生物的培养物、所述微生物的培养上清液、所述微生物的培养上清液的浓缩物及它们的粉末中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的用于生产阿洛酮糖的组合物，其中，所述组合物进一步包含阿洛酮糖-6-磷酸的磷酸酶、表达所述阿洛酮糖-6-磷酸的磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物。

7.根据权利要求5所述的用于生产阿洛酮糖的组合物，其中，所述组合物进一步包含选自锰离子、钴离子和镍离子中的一种或多种金属离子。

8.根据权利要求5所述的用于生产阿洛酮糖的组合物，其中，所述组合物进一步包含将葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸的异构酶、表达所述异构酶的微生物或所述微生物的培养物。

9.根据权利要求5所述的用于生产阿洛酮糖的组合物，其中，所述组合物进一步包括：

(a)(i)淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖或它们的组合；(ii)磷酸盐；(iii)阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶；(iv)葡萄糖-6-磷酸异构酶；(v)磷酸葡萄糖变位酶或葡萄糖磷酸化酶；以及(vi)α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糖糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、α-淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、葡萄糖淀粉酶或蔗糖酶；或者

(b)表达所述第(a)项的酶的微生物或所述微生物的培养物，和

其中所述组合物进一步包含阿洛酮糖-6-磷酸的磷酸酶。

10.一种用于生产阿洛酮糖的方法，其包括使用权利要求1至4中任一项所述的果糖-6-磷酸的差向异构酶将果糖-6-磷酸转化为阿洛酮糖-6-磷酸的步骤。

11.根据权利要求10所述的方法，其进一步包括通过使阿洛酮糖-6-磷酸与植酸酶、表达植酸酶的微生物或所述微生物的培养物接触而将阿洛酮糖-6-磷酸转化为阿洛酮糖的步骤。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述将果糖-6-磷酸转化为阿洛酮糖-6-磷酸的步骤在40℃至70℃的反应温度和pH 6至8的反应pH下进行。

13.根据权利要求10所述的方法，其进一步包括使用己糖激酶由果糖或含果糖的物质制备果糖-6-磷酸的步骤。