KR101455759B1 - 사이코스 에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 사이코스의 제조 방법 - Google Patents

사이코스 에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 사이코스의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 열 안정성이 향상된 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 변이체를 포함하는 미생물에 관한 것이다. 또한 상기 효소 변이체, 또는 상기 미생물을 이용하여 사이코스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

사이코스 에피머화 효소 변이체 및 이를 이용한 사이코스의 제조 방법{D-psicose 3-epimerase variants and production method of D-psicose using them}
본 발명은 사이코스 에피머화 효소 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 변이체를 포함하는 미생물에 관한 것이다. 또한 상기 효소 변이체, 또는 상기 미생물을 이용하여 사이코스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
D-사이코스 (D-psicose)는 천연 물질 내에 거의 존재하지 않거나 또는 소량으로만 존재하기 때문에 희소당 (rare sugar)으로 알려져 있는 단당류로서, 초저열량이면서도 설탕과 유사한 정도의 단맛을 가지고 있는 기능성 감미료로 알려져 있다.
사이코스는 과당 (fructose)의 에피머로, 감미의 강도와 종류는 과당과 매우 유사하나, 과당과 달리 체내에서 거의 대사되지 않기 때문에 열량이 제로에 가깝고, 지질합성에 관여하는 효소의 활성을 억제하여 복부 비만을 감소시키는 효능을 갖기 때문에, 다이어트 식품의 유효 성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 설탕 대체 감미료로 널리 이용되고 있는 자일리톨 등과 같은 당 알코올류의 경우 일정량 이상 섭취 시 설사를 유발하는 등의 부작용을 일으키는 반면, 사이코스는 부작용이 거의 없는 것으로 알려져 있다 (비특허문헌 1 및 비특허문헌 2 참조).
이와 같은 이유로 사이코스는 다이어트 감미료로서 각광받고 있어 식품 산업 분야에 있어서 사이코스를 효율적으로 생산할 수 있는 방법에 대한 개발의 필요성이 높아지고 있다. 이처럼 사이코스 개발의 필요성이 대두됨에 따라, 종래 생물학적인 방법을 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 다양한 연구가 진행되어 왔다. 과당을 사이코스로 전환시킬 수 있는 효소로는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소 (D-psicose 3-epimerase, DPE) 및 슈도모나스 치코리이 (Pseudomonas cichorii) 또는 로도박터 스페로이데스 (Rhodobacter sphaeroides)유래의 타가토스 에피머화 효소가 알려져 있으며, 사이코스 에피머화 효소가 타가토스 에피머화 효소에 비해 높은 활성을 보이는 것으로 알려져 있다.
사이코스의 생산에 있어서, 반응 온도가 높아질수록 사이코스의 생산량이 증가하는 경향을 나타낸다. 그러나 야생형 사이코스 에피머화 효소를 이용하는 경우에는 반응 온도가 약 50℃ 이상이 되면 효소의 변성이 일어나 효소 활성이 감소하게 되고 이에 사이코스 생산량이 오히려 감소하는 문제가 있다. 따라서, 활용 가치가 높은 사이코스를 보다 효율적으로 생산하기 위하여 내열성이 강화된 사이코스 에피머화 효소 변이체를 개발하는 것이 요구되고 있는 실정이다.
대한민국등록특허공보 B1 제10-0744479호 (2007.08.01.공고) 대한민국공개특허공보 A 제10-2011-0035805호 (2011.04.06.공개) 대한민국등록특허공보 B1 제10-1203856호 (2012.11.14.공고)
Matsue, T., Y. Baba, M. Hashiguchi, K. Takeshita, K. Izumori, 및 H. Suzuki. 2001. Dietary D-psicose, a C-3 epimer of D-fructose, suppresses the activity of hepatic lipogenic enzymes in rats. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 10:233-237 Matsuo, T., 및 K. Izumori. 2004. D-psicose, a rare sugar that provides no energy and additionally beneficial effects for clinical nutrition. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 13:S127
본 발명은 활성은 높으나 열 안정성이 매우 낮아 활용도가 떨어지는, 아그로박테리움 투메파시엔스 유래의 사이코스 에피머화 효소의 문제점을 깨닫고, 이에 오늘날 활용도가 높은 식품 소재로 관심도가 높아지고 사이코스를 산업적으로 대량 생산할 수 있도록, 열 안정성을 향상시킨 사이코스 에피머화 효소 변이체를 발명하고 이를 이용한 사이코스의 생산 방법을 발명하기에 이르렀다.
구체적으로, 본 발명은 아미노산 서열 중 특정 위치의 아미노산을 치환시킴으로써, 열 안정성을 향상시킨 사이코스 에피머화 효소 변이체를 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 열 안정성이 향상된 사이코스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 사이코스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 사이코스 에피머화 효소 변이체를 생산하도록 재조합된 미생물을 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 과당으로부터 상기 사이코스 에피머화 효소 변이체 또는 상기 변이체를 생산하도록 재조합된 미생물을 이용하여 사이코스를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 야생형 사이코스 에피머화 효소의 아미노산 서열 중 특정 위치의 아미노산을 치환시킴으로써 열 안정성이 향상되어 효율적으로 사이코스를 생산할 수 있는 사이코스 에피머화 효소 변이체를 제공하고자 한다.
구체적으로, 본 발명은 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소의 아미노산 서열에서, 77번째의 아미노산인 글루탐산이 프롤린으로 치환된 사이코스 에피머화 효소 변이체를 제공한다.
상기 변이체는 상기 야생형 사이코스 에피머화 효소의 아미노산 서열에서 33번째 아미노산인 이소류신이 류신, 시스테인 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 추가로 치환되거나/치환되고 상기 아미노산 서열에서 213번째 아미노산인 세린이 시스테인으로 추가로 치환될 수 있다.
상기 변이체는 상기 야생형 사이코스 에피머화 효소의 아미노산 서열에서 33번째 아미노산인 이소류신이 류신으로 추가로 치환되며, 상기 아미노산 서열 213번째 아미노산인 세린이 시스테인으로 추가로 치환된 변이체일 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 사이코스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 사이코스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 사이코스 에피머화 효소 변이체를 생산하도록 재조합된 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 과당에, 본원에 기재된 사이코스 에피머화 효소 변이체 또는 상기 사이코스 에피머화 효소 변이체를 생산하도록 재조합된 미생물을 제공하고 효소 반응시키는 단계; 및
상기 효소 반응물을 정제하여 사이코스를 수득하는 단계를 포함하는, 사이코스의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한,
본원에 기재된 에피머화 효소 변이체 혹은 상기 변이체를 생산하도록 재조합된 미생물을 고정화시킨 담체로 충진된 컬럼을 포함하는 사이코스 생산용 고정화 반응기에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 고정화 반응기에 과당 용액을 공급하여 사이코스를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 야생형 사이코스 에피머화 효소의 아미노산 서열 중 특정 위치의 아미노산을 치환시켜서, 효소 활성은 저하되지 않으면서도 열 안정성은 현저히 향상된 사이코스 에피머화 효소 변이체를 제공함으로써, 오늘날 활용도가 높은 식품 소재로 각광받고 있는 사이코스를 보다 효율적으로 대량 생산할 수 있는 효과를 나타낸다.
구체적으로, 본 발명의 일 예에 따른 사이코스 에피머화 효소 변이체는 야생형 사이코스 에피머화 효소 혹은 종래 공지된 이의 변이체에 비하여 효소 반응 온도에서 훨씬 연장된 반감기를 나타내므로, 사이코스를 생산함에 있어서 한번 제조된 사이코스 에피머화 효소를 보다 오랜 기간 동안 사용할 수 있어 생산 시간 및 비용을 절감시켜 사이코스의 생산 효율을 높여주는 효과를 나타낸다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 사이코스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 혹은 상기 사이코스 에피머화 효소 변이체를 생산하도록 재조합된 미생물을 이용하여 사이코스를 효율적으로 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하는 효과를 나타낸다.
도 1은 아그로박테리움 투메파시엔스 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소의 분석 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 비교예 1의 야생형 사이코스 에피머화 효소와 대비하여 본 발명에 따른 실시예 1의 사이코스 에피머화 효소 변이체들의 열안정성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 비교예 2의 종래 사이코스 에피머화 효소 변이체(133L/S213C)와 대비하여 본 발명에 따른 실시예 2의 사이코스 에피머화 효소 변이체(133L/E77P/S213C)의 열안정성을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본원 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 발명은 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소의 아미노산 서열에서, 77번째의 아미노산인 글루탐산이 프롤린으로 치환된 사이코스 에피머화 효소 변이체(이하, 이를 E77P 변이체라 한다)에 관한 것이다. 상기 효소 변이체의 아미노산 서열은 서열목록 번호 2와 같다.
상기 아그로박테리움 투메파시엔스는 공지의 균주로써, 보다 구체적으로 아그로박테리움 투메파시엔스 ATCC 33970을 사용할 수 있다.
아그로박테리움 투메패시엔스 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소의 구조는 2006년도에 밝혀졌으며 현재 프로테인 데이터 뱅크 (Protein Data Bank, 이하, 'PDB')에 모든 구조적 정보가 공개되어있다. 사이코스 에피머화 효소 (PDB ID: 2HK1)는 309개의 아미노산으로 구성되어 있으며 네 개의 단일체 (monomer)가 하나의 복합체, 테트라머 (tetramer)를 형성하는 것으로 알려져 있다. 야생형 사이코스 에피머화 효소는 α-헬릭스 (α-helix)와 β-스트랜드 (β-strand)가 반복적으로 이어져서 기질인 과당이 결합할 수 있는 활성 부위 (active site)를 형성하는 구조를 갖는다.
상기 아그로박테리움 투메파시엔스 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소의 아미노산 서열은 서열목록 번호 1과 같으며 그의 기능성 단편들을 포함한다. 상기 "기능성 단편"이란 서열목록 번호 1의 아미노산 서열에 있어서 일부 아미노산이 치환, 삽입 또는 결실 등에 의해 변이되었으나 여전히 과당을 사이코스로 전환시키는 활성을 가지고 있는 단편들을 의미한다.
상기 E77P 변이체는 상기 야생형 사이코스 에피머화 효소의 아미노산 서열에서 33번째 아미노산인 이소류신이 류신, 시스테인 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 추가로 치환되거나/치환되고 상기 아미노산 서열에서 213번째 아미노산인 세린이 시스테인으로 추가로 치환될 수 있다.
바람직하게 상기 E77P 변이체는 상기 야생형 사이코스 에피머화 효소의 아미노산 서열에서 33번째 아미노산인 이소류신이 류신으로 추가로 치환되며, 상기 아미노산 서열 213번째 아미노산인 세린이 시스테인으로 추가로 치환된 변이체(이를 I33L/E77P/S213C 변이체라 한다)일 수 있다. 상기 I33L/E77P/S213C 변이체의 아미노산 서열은 서열목록 번호 3과 같다.
상기와 같이 야생형 사이코스 에피머화 효소의 아미노산 서열 중 특정 위치의 아미노산, 즉, 77번째 아미노산, 추가로 33번째 및/또는 213번째 아미노산을 치환시킴으로써 야생형 효소 또는 종래의 효소 변이체에 비해 열안정성이 향상된 사이코스 에피머화 효소 변이체를 제조할 수 있으며 이를 이용하여 보다 효율적으로 사이코스를 제조할 수 있는 이점이 있다.
본 발명은 또한, E77P 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 77번째의 아미노산인 글루탐산이 프롤린으로 치환된 것 외에, 33번째 아미노산인 이소류신이 류신, 시스테인 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 추가로 치환되거나/치환되고 213번째 아미노산인 세린이 시스테인으로 추가로 치환된 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 I33L/E77P/S213C 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명은 본원에 개시된 사이코스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 상기 재조합 벡터를 제조하기 위해 사용되는 벡터의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 벡터를 사용할 수 있다. 상기 벡터로 바람직하게는 플라스미드 벡터를 사용할 수 있으며, 상기 플라스미드 벡터의 비제한적인 일 예로 바람직하게는 pUC계 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 후술하는 바와 같이 대장균, 재조합 대장균, 바실러스, 효모, 코리네박테리움 또는 아그로박테리움속 미생물로 형질전환시키기 위하여 상기 각각의 미생물로부터 유래된 셔틀 벡터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 코리네박테리움 또는 아그로박테리움속 미생물로부터 유래된 셔틀 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 사이코스 에피머화 효소 변이체를 생산하도록 재조합된 미생물에 관한 것이다. 상기 재조합 미생물은 예를 들어, 본원에 개시된 사이코스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 포함할 수 있다. 상기 미생물의 예로 대장균, 재조합 대장균, 바실러스, 효모, 코리네박테리움 또는 아그로박테리움 속인 미생물을 들 수 있다. 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 미생물이 본원에서 사용될 수 있다.
특히 코리네박테리움 속 균주는 GRAS (Generally Recognized As Safe) 균주로서, 유전자 조작 및 대량 배양에 용이한 특성을 가지고 있는 균주이다. 코리네박테리움 속 균주는 다양한 공정 조건에서 높은 안정성을 가지는 균주이며, 다른 세균에 비하여 상대적으로 단단한 세포막 구조를 가지고 있어 높은 당 농도 등에 의한 높은 삼투압 하에서도 균체가 안정적인 상태로 존재하는 생물학적 특성을 가지고 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 사이코스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ KY(KCCM11403P)에 관한 것이다. 상기 재조합된 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ KY은 부다페스트 조약에 따라 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2013년 3월 28일자로 수탁번호 KCCM11403P로 기탁되었다.
본 발명은 또한 상기 사이코스 에피머화 효소 변이체 또는 상기 미생물을 이용하여 과당으로부터 사이코스를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법은, 과당에, 본원에 개시된 사이코스 에피머화 효소 변이체 또는 상기 사이코스 에피머화 효소 변이체를 생산하도록 재조합된 미생물을 제공하고 효소 반응시키는 단계; 및
상기 효소 반응물을 정제하여 사이코스를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 사이코스 제조 방법에 있어서, 사용하는 사이코스 에피머화 효소 변이체 또는 미생물의 농도, 반응 온도, 반응 시간, pH, 과당의 농도 등의 반응 조건은 목적하는 바에 따라 적절하게 조절될 수 있다.
예를 들어, 상기 효소 반응의 반응 온도는 20 내지 60℃, 반응 시간은 1분 내지 2시간의 범위일 수 있다. 상기 상이코스 에피머화 효소 변이체 또는 미생물 대 상기 과당의 중량비는 약 1:10 내지 10:1의 범위일 수 있다. 바람직하게는 상기 반응 온도는 30 내지 55℃이고, 반응 시간은 10분 내지 90분의 범위이고, 상기 중량비는 약 1:5 내지 약 5:1의 범위일 수 있다.
상기 효소 반응 단계에서 금속 이온이 추가로 제공될 수 있다.
구체적으로, 금속이 존재하는 반응 조건하에서 상기 효소 반응을 수행할 수 있다. 사이코스 에피머화 효소는 금속 이온에 의해 활성화가 조절되는 금속 효소 (metalloenzyme)으로서 금속 이온의 존재시에 효소 활성이 증가하는 이점이 있다.
상기 사용되는 금속의 종류로는 망간, 니켈, 구리 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 망간을 사용할 수 있다. 상기 금속의 농도는 바람직하게는 0.01 mM 내지 5 mM일 수 있으며 보다 바람직하게는 0.1 mM 내지 5 mM일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.5 mM 내지 3 mM일 수 있다. 상기 범위 내에서 본 발명의 상기 사이코스 에피머화 효소 변이체의 활성을 적절히 조절하여 사이코스의 생산 효율을 향상시키는 이점이 있다.
상기 사이코스 제조 방법을 수행함에 있어서, 사이코스의 생산 효율을 높이기 위한 반응 조건으로 바람직하게는 pH가 약 5 내지 9 인 조건에서 수행할 수 있다.
본 발명은 또한, 본원에 개시된 사이코스 에피머화 효소 변이체 혹은 상기 변이체를 생산하도록 재조합된 미생물을 고정화시킨 담체로 충진된 컬럼을 포함하는 사이코스 생산용 고정화 반응기에 관한 것이다. 본 발명은 상기 고정화 반응기에 과당 용액을 공급하여 사이코스를 생산하는 방법에 관한 것이다.
상기 고정화 반응기란 사이코스를 생산하기 위한 반응이 담체에 고정화된 균주 또는 효소에 의해, 또는 담체에 고정화된 균주 또는 효소가 충진된 컬럼을 통해 일어나는 반응기를 의미한다. 즉, 고정화는 생물학적 활성을 제공하는 물질, 이 경우, 사이코스 에피머화 효소 또는 이를 포함하는 균주가 담체에 고정화되었다는 것을 의미한다.
상기 효소 변이체 또는 미생물을 고정화시킨 담체는, 본 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 효소 또는 미생물의 고정화 용도로 사용할 수 있는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있으며, 바람직하게는 알긴산나트륨을 사용할 수 있다.
알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누론산 및 글루론산으로 구성되며, 함량면에서 무작위로 베타-1,4-결합을 이루어 형성되어, 미생물이나 효소가 안정적으로 고정화될 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
사이코스 에피머화 효소의 E77P 변이체의 제조
(1) 치환시킬 아미노산 서열 위치 선정
통상적으로 사용되는 단백질 구조 분석 프로그램인 PyMol을 이용하여 야생형 사이코스 에피머화 효소의 구조 (도 1)를 분석한 후, 효소 활성에 영향을 주지 않으면서 효소의 내열성을 향상시킬 수 있는 아미노산 서열 지점으로 77번째 아미노산을 선정하였다.
도 1에는 상기 아미노산 서열 77번째 아미노산인 글루탐산의 위치가 표시되어 있다.
(2) E77P 변이체 제조
위치 선택적 돌연변이 (site-directed mutagenesis) 방법을 통하여 아그로박테리움 투메패시엔스 ATCC33970 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소의 아미노산 서열 77번째 아미노산인 글루탐산 (Glu, E)을 프롤린으로 치환하였다. 상기 치환된 사이코스 에피머화 효소 변이체를 과발현시키기 위하여 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 pUC_HCE 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제작하고 이를 열충격법을 이용하여 E. coli K12G에 삽입하였다.
상기 형질 전환된 E. coli K12G를 50 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유하고 있는 LB배지에 접종하고 37℃에서 6시간 동안 배양한 다음, 이를 일부 취하여 50 ㎍/㎖의 앰피실린 및 0.1 mM의 IPTG (Isopropyl-beta-thiogalactopyranoside)를 포함하고 있는 배지로 옮겨 37℃에서 6시간 동안 배양하여 효소 변이체의 발현을 유도하였다. 그 다음, 상기 배양액을 60℃에서 5분간 열처리를 하고 최종 농도가 15 mM이 되도록 과당을 넣어 55℃에서 30분간 반응시킨 다음, 통상 사용되는 과당 분석 키트 (fructose assay kit)를 이용하여 남아있는 과당의 양을 측정하였다. 측정 결과, 본 발명의 효소 변이체 E77P가 55℃의 반응 온도에서 높은 반감기를 보이는 것을 확인하였다.
상기 "반감기"는 효소 또는 효소 변이체의 효소 반응 초기의 상대적 활성을 100으로 하였을 때, 상기 상대적 활성이 50이 되기까지 걸리는 기간을 의미한다.
실시예 2
사이코스 에피머화 효소의 I33L / E77P / S213C 복합 변이체의 제조
아그로박테리움 투메패시엔스 ATCC33970 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소를 과발현시키기 위하여 해당 효소의 유전자를 pUC_HCE 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제작한 후, 위치 선택적 돌연변이 방법을 통하여 I33L/E77P/S213C 변이체를 제조하였다. 상기 재조합 벡터로 E. coli K12G를 형질 전환시킨 다음, 상기 균주를 배양하여 효소 변이체를 과발현시켰다.
실시예 3
사이코스 에피머화 효소의 I33L / E77P / S213C 복합 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조 및 이를 이용한 코리네박테리움 속 균주의 형질 전환
(1) 재조합 벡터의 제조 및 이를 이용한 균주의 형질 전환
상기 실시예 3에 따른 I33L/E77P/S213C 변이체의 DNA를 주형으로 하고, 각각 PstI과 XbaI 제한 효소 인식 부위의 서열이 도입된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합 연쇄 반응을 통해 사이코스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 증폭시켰다. 상기 증폭된 유전자가 코딩하고 있는 사이코스 에피머화 효소 변이체를 대량 발현하기 위하여, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 미생물에서 유래된 셔틀 벡터 pCJ-1 (2004년 11월 6일자로 국제기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁, 수탁번호 KCCM-10611)에 제한 효소 KpnI과 XbaI으로 절단하여 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 lysC (NCgl0247)　프로모터와 상기 증폭된 PCR 산물을 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제작하였다. 상기 재조합 발현 벡터를 전기천공을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032을 형질 전환시켜 사이코스 에피머화 효소 변이체(I33L/E77P/S213C)를 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 재조합 균주를 제조하였다. 상기 재조합된 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ KY은 부다페스트 조약에 따라 서울 서대문구 홍제1동 소재의 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2013년 3월 28일자로 수탁번호 KCCM11403P로 기탁되었다.
(2) 형질 전환된 균주의 배양
상기 (1)에서 얻어진 형질 전환 균주를 각각 10 ㎍/㎖ 농도의 카나마이신을 포함한 MB 배지 (박토-트립톤 (Bacto-trypton) 10 g/ℓ, 박토-이스트 추출물 (Bacto-yeast extract) 5 g/ℓ, NaCl 5 g/ℓ, 소이톤 (Soytone) 5 g/ℓ)에 초기 농도 OD600 = 0.1로 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 배양하여 사이코스 에피머화 효소 변이체의 발현을 유도하였다. 상기에서 수득된 배양액을 10 ㎍/㎖ 농도의 카나마이신을 함유한 변이 배지 (포도당 8 g/ℓ, 소이톤 20 g/ℓ, (NH4)2SO4 10 g/ℓ, KH2PO4 1.2 g/ℓ, MgSO4 1.4 g/ℓ)를 담은 발효기에 OD600 = 0.6으로 접종하고 30℃에서 20시간 동안 배양하였다.
비교예 1
실시예 1에서 E77P 변이체 대신 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소 발현 유전자를 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 실시하여 상기 유전자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 코리네박테리움 속 균주를 제조하였다.
비교예 2
실시예 1에서 위치 선택적 돌연변이 (site-directed mutagenesis) 방법을 통하여 아그로박테리움 투메패시엔스 ATCC33970 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소의 아미노산 서열 33번째 아미노산인 이소류신을 류신으로 치환하고, 213번 아미노산인 세린을 시스테인으로 치환된 (Glu, E)을 프롤린으로 치환한, 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 비교예 2의 I33L/S213C 변이체, 상기 변이체 유전자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 이용해 재조합된 코리네박테리움 속 균주를 제조하였다.
실험예 1
사이코스 에피머화 효소 변이체의 내열성 및 효소 활성 평가
(1) 열처리
상기 실시예 1, 실시예 3, 비교예 1 및 비교예 2에서 제조한 형질 전환된 각각의 E. coli K12G 균주를 LB 배지 50 ㎖가 담긴 250 ㎖ 플라스크에 접종하여 37℃ 진탕 배양기에서 약 12시간 동안 배양하였다. 상기 배양이 끝난 E. coli K12G 배양액을 7,000 × g로 4℃에서 10분간 원심분리한 후, 50 mM EPPS, pH 8.0 완충용액 5 ㎖로 현탁하였다. 그 다음, 상기 현탁액을 얼음 위에서 초음파 분쇄기를 이용하여 10분간 세포를 분쇄한 후 13,000 × g로 4℃에서 40분 동안 원심분리하여 나온 상등액을 따로 보관하였다.
브래드포드 단백질 정량법으로 상기 상등액의 단백질 농도를 측정한 후 50 mM EPPS, pH 8.0 완충용액을 이용하여 총 단백질의 농도가 0.1 mg/㎖가 되도록 하였다. SDS-PAGE를 통하여 사이코스 에피머화 효소 변이체의 과발현을 확인한 후, 항온 진탕 수조에서 50℃와 55℃에서 각각 1시간, 2시간, 4시간 동안 열처리하였다.
(2) 과당을 기질로 한 사이코스 생산 반응을 통한 효소 활성 측정
상기 열처리 후, 효소 변이체의 효소 활성을 측정하기 위하여 40 mM의 과당이 함유된 50 mM EPPS, pH 8.0 완충용액에 상기 열처리한 각 단백질 용액을 1:1로 혼합한 후 50℃에서 10분간 반응시켰다. 그 다음, 100℃에서 5분간 가열하여 상기 반응을 중지시키고 반응액을 1/40로 희석하여 HPLC를 이용하여 과당으로부터 생성된 사이코스의 양을 측정하였다.
분석 결과 야생형 사이코스 에피머화 효소(비교예 1)보다 E77P 변이체(실시예 1)가 4℃ 이상 향상된 내열성을 보였다(도 2 참조).
또한, 분석 결과 I33L/S213C 변이체(비교예 2)보다 I33L/E77P/S213C 변이체(실시예 2)가 5℃ 이상 향상된 내열성을 보였으며, I33L/E77P/S213C 변이체의 55℃에서의 반감기가 I33L/S213C 변이체의 50℃에서의 반감기보다 증가하였음이 확인되었다(도 3 참조).
상기 효소 활성을 측정한 결과는 각각 도 2, 도 3에 나타내었다. 구체적으로 도 2는 비교예 1의 야생형 사이코스 에피머화 효소와 실시예 1의 E77P 변이체 각각을 두 가지 온도 조건 (50℃ 및 55℃)에서 1시간, 2시간 및 4시간 동안 반응시킨 후, 야생형 효소와 효소 변이체의 상대적인 잔류 효소 활성을 측정하여 그래프화한 것이다. 또한, 도 3은 비교예 2의 I33L/S213C 변이체와 실시예 2의 I33L/E77P/S213C 변이체 각각을 두 가지 온도 조건 (50℃ 및 55℃)에서 1시간, 2시간 및 4시간 동안 반응시킨 후, 각 효소 변이체의 상대적인 잔류 효소 활성을 측정하여 그래프화한 것이다.
상기 도 2 및 도 3으로부터 확인한 바와 같이, 본 발명에 따른 효소 변이체는 종래 야생형 균주나 종래 공지된 변이체인 I33L/S213C 에 비해 개선된 열 안정성을 나타낸다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11403P 20130328
<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> D-psicose 3-epimerase variants and production method of D-psicose using them <130> P13-0291 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 289 <212> PRT <213> Wild-type psicose epimerase derived from Agrobacterium tumefaciens <400> 1 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala 1 5 10 15 Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Glu Asp Ala Ala 65 70 75 80 Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val 85 90 95 Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg 115 120 125 Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly 130 135 140 Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu 145 150 155 160 Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn 165 170 175 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 180 185 190 Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe 195 200 205 His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro 210 215 220 Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala 225 230 235 240 Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp 245 250 255 Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met 260 265 270 Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly 275 280 285 Gly <210> 2 <211> 289 <212> PRT <213> E77P variants of psicose epimerase <400> 2 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala 1 5 10 15 Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Ile Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Pro Asp Ala Ala 65 70 75 80 Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val 85 90 95 Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg 115 120 125 Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly 130 135 140 Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu 145 150 155 160 Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn 165 170 175 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 180 185 190 Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe 195 200 205 His Thr Gly Glu Ser Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro 210 215 220 Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala 225 230 235 240 Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp 245 250 255 Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met 260 265 270 Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly 275 280 285 Gly <210> 3 <211> 289 <212> PRT <213> I33LE77PS213C variants of psicose epimerase <400> 3 Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ser Tyr Trp Glu His Glu Trp Ser Ala 1 5 10 15 Lys Phe Gly Pro Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Val Ala Ala His His Ile Asn Glu Tyr Ser Asp Ala Glu Leu 35 40 45 Ala Thr Ile Arg Lys Ser Ala Lys Asp Asn Gly Ile Ile Leu Thr Ala 50 55 60 Gly Ile Gly Pro Ser Lys Thr Lys Asn Leu Ser Ser Pro Asp Ala Ala 65 70 75 80 Val Arg Ala Ala Gly Lys Ala Phe Phe Glu Arg Thr Leu Ser Asn Val 85 90 95 Ala Lys Leu Asp Ile His Thr Ile Gly Gly Ala Leu His Ser Tyr Trp 100 105 110 Pro Ile Asp Tyr Ser Gln Pro Val Asp Lys Ala Gly Asp Tyr Ala Arg 115 120 125 Gly Val Glu Gly Ile Asn Gly Ile Ala Asp Phe Ala Asn Asp Leu Gly 130 135 140 Ile Asn Leu Cys Ile Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn His Val Leu 145 150 155 160 Asn Thr Ala Ala Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Asp Val Gly Lys Asn 165 170 175 Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp 180 185 190 Ser Phe Gly Asp Ala Ile Arg Thr Ala Gly Pro Leu Leu Gly His Phe 195 200 205 His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Arg Val Pro Gly Lys Gly Arg Met Pro 210 215 220 Trp His Glu Ile Gly Leu Ala Leu Arg Asp Ile Asn Tyr Thr Gly Ala 225 230 235 240 Val Ile Met Glu Pro Phe Val Lys Thr Gly Gly Thr Ile Gly Ser Asp 245 250 255 Ile Lys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gly Gly Ala Asp Ile Ala Lys Met 260 265 270 Asp Glu Asp Ala Arg Asn Ala Leu Ala Phe Ser Arg Phe Val Leu Gly 275 280 285 Gly

Claims (14)

  1. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 유래의 야생형 사이코스 에피머화 효소의 아미노산 서열에서, 77번째의 아미노산인 글루탐산이 프롤린으로 치환된 사이코스 에피머화 효소 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열에서 33번째 아미노산인 이소류신이 류신, 시스테인 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 아미노산으로 치환되거나, 상기 아미노산 서열에서 213번째 아미노산인 세린이 시스테인으로 치환된 사이코스 에피머화 효소 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열 33번째 아미노산인 이소류신이 류신으로 치환되며, 상기 아미노산 서열 213번째 아미노산인 세린이 시스테인으로 치환된 사이코스 에피머화 효소 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따른 사이코스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 따른 사이코스 에피머화 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  6. 제1항 내지 제3항 중의 어느 하나의 항에 따른 사이코스 에피머화 효소 변이체를 생산하도록 재조합된 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)인 미생물.
  8. 과당에, 제1항 내지 제3항 중의 어느 하나의 항에 따른 사이코스 에피머화 효소 변이체 또는 상기 사이코스 에피머화 효소 변이체를 생산하도록 재조합된 미생물을 제공하고 효소 반응시키는 단계; 및
    상기 효소 반응물을 정제하여 사이코스를 수득하는 단계를 포함하는, 사이코스의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 효소 반응 단계에서 금속 이온이 추가로 제공되는 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 금속이 망간인 제조 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 금속 이온이 0.01 mM 내지 5 mM의 농도로 추가되는 제조 방법.
  12. 제1항 내지 제3항 중의 어느 하나의 항에 따른 사이코스 에피머화 효소 변이체를 고정화시킨 담체로 충진된 컬럼을 포함하는 사이코스 생산용 고정화 반응기.
  13. 제12항에 따른 고정화 반응기에 과당 용액을 공급하여 사이코스를 생산하는 방법.
  14. 제6항에 따른 미생물을 고정화시킨 담체로 충진된 컬럼을 포함하는 사이코스 생산용 고정화 반응기.
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