JP2023052402A - Ｄ－アルロースの酵素的生産 - Google Patents

Abstract

【課題】本開示は、糖類をアルロースへと酵素的に変換する方法を提供する。【解決手段】本発明は、アルロースを製造する方法に関するものであって、同方法は、アルロース６－リン酸３－エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）で触媒して、フルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をアルロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）へ変換すること、及び、アルロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）で触媒して、Ａ６Ｐをアルロースへ変換すること、を含む。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月１４日に出願した米国出願第６２／４３４，０３３号の優先権を主張するものであり、参照により本明細書に援用する。

発明の分野
本発明は、糖類Ｄ－アルロースの調製に関する。より具体的には、本発明は、糖類（例えば、多糖類、オリゴ糖類、二糖類、スクロース、Ｄ－グルコース、及び、Ｄ－フルクトース）を酵素的にＤ－アルロースに変換して、Ｄ－アルロースを調製する方法に関する。

発明の背景
Ｄ－アルロース（別名、Ｄ－プシコース）（以下、アルロース）は、スクロースの甘味の７０％を有するが、カロリーは僅か１０％である、という低カロリーの天然甘味料である。このものは、天然に存在する単糖ヘキソースであり、小麦、及び、その他の植物において少量でしか存在しない。アルロースは、２０１２年に、Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）によって食品添加物として承認され、一般に安全と認められるもの（ＧＲＡＳ）に指定されている。しかしながら、アルロースの販売価格の高さが故に、甘味料としての用途は限定されている。アルロースは、低カロリー（スクロースの１０％）であり、血糖インデックスが非常に低く１であり、小腸で完全に吸収されるが、代謝を受けることはなく、代わりに、尿や糞便へと分泌されるものであり、アルファ－アミラーゼ、スクラーゼ、及び、マルターゼを阻害することで血糖調整を補助し、そして、食品や飲料においてスクロースと同様の機能性を有するなど、健康面で無数の利点を有する。このように、アルロースには、食品及び飲料業界で様々な用途がある、ことは明らかである。

現在のところ、アルロースは、主に、フルクトースの酵素的異性化を通じて製造されている（ＷＯ ２０１４０４９３７３）。概して、この方法では、原料コストが高くなり、フルクトースからアルロースへの分離費用も嵩み、そして、産物収率が比較的低いなど、問題がある。

当該プロセスの少なくとも１つのステップが、エネルギー的に有利な化学反応に関与しており、高収率でアルロースを製造するための費用効率の高い合成経路を開発する必要がある。さらに、当該プロセスステップが、１つのタンクまたはバイオリアクターで実施することができる生産方法が必要とされている。比較的低濃度のリン酸塩で実施することができるアルロース生産のプロセスであって、リン酸塩を再利用でき、及び／または、当該プロセスが、リン酸塩の供給源としてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の使用を必要としない、同プロセスも必要とされている。あらゆる反応ステップにおいて、高価なニコチンアミドアデノシンジヌクレオチド（ＮＡＤ（Ｈ））補酵素の使用を必要としない、アルロース生産経路も必要とされている。

発明の概要
本明細書に記載の発明は、アルロースを調製するためのプロセスに関する。様々な態様では、当該プロセスは、アルロース６－リン酸３－エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）で触媒して、フルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を、アルロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に変換し、及び、アルロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）で触媒して、当該Ａ６Ｐをアルロースに変換する、ことを含む。また、本発明は、本明細書に記載したあらゆるプロセスによって調製したアルロースに関する。

本発明の幾つかの態様では、アルロースを調製するためのプロセスは、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を、当該Ｆ６Ｐに変換するステップも含み、当該ステップは、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）で触媒する。その他の態様では、アルロース合成のためのプロセスは、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を、当該Ｇ６Ｐに変換するステップも含み、この変換ステップは、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）で触媒する。

様々な態様では、アルロースを調製するためのプロセスは、少なくとも１つの酵素で触媒して、糖類を当該Ｇ１Ｐに変換し、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）で触媒して、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換し、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）で触媒して、Ｇ６ＰをＦ６Ｐに変換し、Ａ６ＰＥで触媒して、Ｆ６Ｐをアルロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に変換し、及び、Ａ６ＰＰで触媒して、生成したＡ６Ｐをアルロースに変換する、ことを含むことができる。

当該プロセスのいずれかで使用する糖類は、デンプンまたはその誘導体、セルロースまたはその誘導体、及び、スクロースからなる群から選択することができる。デンプンまたはその誘導体は、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、または、グルコースとすることができる。本発明の幾つかの態様では、アルロースを調製するプロセスは、デンプンの酵素的加水分解または酸加水分解によって、デンプンを、デンプン誘導体へと変換することを含む。その他の態様では、デンプン誘導体は、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、アルファ－アミラーゼ、または、これらの酵素の２つ以上の組み合わせで触媒して、デンプンの酵素的加水分解によって調製することができる。アルロースを調製するプロセスは、特定の態様では、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を添加することも含むことができる。

様々な態様では、アルロースを調製するためのプロセスは、少なくとも１つの酵素で触媒して、フルクトースをＦ６Ｐに変換すること、Ａ６ＰＥで触媒して、Ｆ６Ｐをアルロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に変換すること、Ａ６ＰＰで触媒して、生成した当該Ａ６Ｐをアルロースに変換すること、を含むことができる。その他の実施形態では、アルロース生産プロセスは、少なくとも１つの酵素で触媒して、スクロースをフルクトースに変換すること、少なくとも１つの酵素で触媒して、フルクトースを当該Ｆ６Ｐに変換すること、Ａ６ＰＥで触媒して、Ｆ６Ｐをアルロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に変換すること、及び、Ａ６ＰＰで触媒して、生成した当該Ａ６Ｐをアルロースに変換すること、を含む。

本発明のその他の態様では、アルロースを調製する方法で使用するＧ６Ｐは、少なくとも１つの酵素で触媒して、グルコースを当該Ｇ６Ｐに変換することで、生産することができる。次に、グルコースは、少なくとも１つの酵素で触媒して、スクロースをグルコースに変換することで、生産することができる。

本発明のその他の態様では、アルロースを調製するためのプロセスのステップは、約０ｍＭ～約１５０ｍＭのリン酸濃度で、ＡＴＰ不含、ＮＡＤ（Ｈ）不含で行われ、当該リン酸塩は再利用され、及び／または、当該プロセスの少なくとも１つのステップは、エネルギー的に有利な化学反応を含む。

図面の簡単な記述
これらの図面は、本発明の実施形態の幾つかの特定の態様を例示するものであり、本発明を、限定または定義するために使用すべきではない。

図１は、フルクトース６－リン酸を、アルロース６－リン酸に、次いで、アルロースに変換する酵素経路を示す概略図である。

図２は、デンプンまたはその誘導物を、アルロースに変換する酵素経路を示す概略図である。以下の略語を使用している。αＧＰ、アルファ－グルカンホスホリラーゼ、または、デンプンホスホリラーゼ。ＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ。ＰＧＩ、ホスホグルコイソメラーゼ。ＩＡ、イソアミラーゼ。ＰＡ、プルラナーゼ。ＭＰ、マルトースホスホリラーゼ。ＰＰＧＫ、ポリリン酸グルコキナーゼ。

図３は、セルロースまたはその誘導物を、アルロースに変換する酵素経路を示す。ＣＤＰ、セロデキストリンホスホリラーゼ。ＣＢＰ、セロビオースホスホリラーゼ。ＰＰＧＫ、ポリリン酸グルコキナーゼ。ＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ。ＰＧＩ、ホスホグルコイソメラーゼ。

図４は、フルクトースを、アルロースに変換する酵素経路を示す概略図である。ＰＰＦＫ、ポリリン酸フルクトキナーゼ。

図５は、グルコースを、アルロースに変換する酵素経路を示す概略図である。ＰＰＧＫ、ポリリン酸グルコキナーゼ。ＰＧＩ、ホスホグルコイソメラーゼ。

図６は、スクロースまたはその誘導物を、アルロースに変換する酵素経路を示す。ＳＰ、スクロースホスホリラーゼ。ＰＰＦＫ、ポリリン酸フルクトキナーゼ。ＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ。ＰＧＩ、ホスホグルコイソメラーゼ。

図７は、グルコース１－リン酸をアルロースへ変換するための形成ギブスエネルギーに基づいた中間体間の反応ギブスエネルギーを示す。

発明の詳細な記述
本発明は、アルロースを高収率で合成するための酵素的経路またはプロセスを提供し、その一方で、生成物の分離コスト、及び、アルロース生産費用を大幅に減少させる。

本発明は、アルロースを調製するプロセスに関し、当該プロセスは、エピメラーゼで触媒して、フルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を、アルロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に変換すること、及び、ホスファターゼ（例えば、アルロース６－リン酸ホスファターゼ、Ａ６ＰＰ）で触媒して、生成した当該Ａ６Ｐをアルロースに変換することを含む。このプロセスの概略を、図１に示している。特定の実施形態では、Ｆ６ＰからＡ６Ｐへの変換を触媒するエピメラーゼは、アルロース６－リン酸３－エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）である。

Ｆ６ＰをＡ６Ｐへ変換するエピメラーゼは、本発明のプロセスにおいて使用し得る。また、エピメラーゼは、Ａ６ＰをＦ６Ｐに変換することもできる。本発明の幾つかの態様では、Ｆ６ＰをＡ６Ｐへ変換するプロセスでの使用に適したエピメラーゼは、配列番号３または６のアミノ酸配列に対して、ある程度の同一性、すなわち、少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または、少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、及び、さらに最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、９９、または、１００％の同一性を有する。適切なエピメラーゼは、配列番号１、２、４、及び、５のヌクレオチド配列に対して、ある程度の同一性、すなわち、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及び、さらに最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、９９、または、１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドでコードされる。

Ａ６ＰＥの例としては、ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤで、Ｄ９ＴＱＪ４、Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８、及び、Ｐ３２７１９と識別されるタンパク質があるが、これらに限定されない。この内、Ｄ９ＴＱＪ４、及び、Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８は、好熱性生物から得られる。Ｐ３２７１９は、中温性生物から得られる。Ｐ３２７１９は、Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８と、５３％が同一であり、かつ、Ｄ９ＴＱＪ４と５５％が同一であり、そして、各タンパク質は、Ｆ６ＰからＡ６Ｐへのエピマー化を触媒する。さらに、Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８は、Ｄ９ＴＱＪ４と４５％が同一である。逆に、Ａ０Ａ１０１Ｄ８２３、Ｒ１ＡＸＤ６、Ａ０Ａ１５０ＬＢＵ８、Ａ０Ａ０２３ＣＱＧ９、及び、Ｈ１ＸＷＹ２のＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤで識別されるその他のエピメラーゼタンパク質は、Ｄ９ＴＱＪ４に対して４５％以下の同一性しか有しておらず、Ｆ６ＰからＡ６Ｐへのエピマー化を触媒しない。

本発明の幾つかの態様では、Ｆ６ＰをＡ６Ｐに変換するためのプロセスでの使用に適したエピメラーゼとして、二価金属補因子、好ましくは、コバルトを利用するが、これらに限定されない。本発明のさらなる態様では、当該エピメラーゼは、限定をするものではないが、触媒作用のための（α／β）_８－バレルドメインを含有すること、限定をするものではないが、当該バレルの７番目のβ－ストランドの末端のＳｅｒ、当該バレルの８番目のβ－ストランドの末端のＳｅｒ、及び、当該活性部位ループのＧｌｙを含むリン酸結合部位をさらに含有すること、限定をするものではないが、当該バレルの２番目及び３番目のβ－ストランドのＨｉｓをさらに含有すること、限定をするものではないが、当該バレルの２番目及び７番目のβ－ストランドのＡｓｐをさらに含有して、１，１プロトン移動のための酸／塩基触媒として作用させること、及び、限定をするものではないが、当該バレルの２番目のβ－ストランドのＨｉｓ－疎水性残基Ａｓｐ－シグネチャーをさらに含有して、Ｈｉｓを金属結合に利用し、かつ、Ａｓｐを酸／塩基触媒作用に利用すること、を含む。これらの特徴は、当該技術分野において公知であり、そして、例えば、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ （ｂｅｔａ／ａｌｐｈａ）８－Ｂａｒｒｅｌｓ： Ｄ－Ａｌｌｕｌｏｓｅ ６－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－Ｅｐｉｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２００８；４７ （３６）；９６０８－９６１７で報告されている。好ましくは、本発明のプロセスにおける使用のためのエピメラーゼは、触媒作用のための（α／β）_８－バレルドメイン、当該バレルの７番目のβ－ストランドの末端のＳｅｒ、当該バレルの８番目のβ－ストランドの末端のＳｅｒ、当該活性部位ループのＧｌｙ、当該バレルの２番目及び３番目のβ－ストランドのＨｉｓ、当該バレルの２番目及び７番目のβ－ストランドのＡｓｐ、当該バレルの２番目のβ－ストランドのＨｉｓ－疎水性残基Ａｓｐ－シグネチャーを含有する。

本発明のプロセスは、Ａ６Ｐをアルロース（Ｄ－アルロース）へ変換するホスファターゼを使用する。本発明の幾つかの態様では、Ａ６Ｐをアルロースへ変換するプロセスでの使用に適したホスファターゼは、配列番号９のアミノ酸配列に対して、ある程度の同一性、すなわち、少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または、少なくとも９４％、及び、さらに最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、９９、または、１００％の同一性を有する。適切なホスファターゼは、配列番号７及び８のヌクレオチド配列に対して、ある程度の同一性、すなわち、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、及び、さらに最も好ましくは少なくとも９６、９７、９８、９９、または、１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドでコードされる。

Ａ６ＰＰの例として、ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤでＡ３ＤＣ２１、Ｑ５ＬＧＲ４、及び、Ｑ８９ＺＲ１と識別されるタンパク質があるが、これらに限定されない。Ａ３ＤＣ２１は、Ｑ５ＬＧＲ４と、４６％が同一であり、かつ、Ｑ８９ＺＲ１と、４５％が同一であり、そして、それぞれのタンパク質は、Ａ６Ｐからアルロースへの特異的脱リン酸化を触媒する。逆に、ハロ酸デヒドロゲナーゼスーパーファミリーに由来するその他のホスファターゼである、ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤでＨ０ＵＱ２９、Ｑ６７ＬＵ４、Ａ０Ａ０Ｋ６ＩＰＭ３、Ｃ８ＷＳＪ０、Ａ０Ａ１５１ＹＸ６１と識別されるタンパク質、及び、その他のタンパク質は、Ａ３ＤＣ２１に対して４５％未満の同一性しか有しておらず、Ａ６Ｐからアルロースへの特異的脱リン酸化を触媒しない。

Ａ６Ｐからアルロースへ変換するための本発明のプロセスでの使用に適したホスファターゼは、アルロース６－リン酸に特異的である。本明細書で使用する場合、アルロース６－リン酸に特異的とは、グルコース１－リン酸、グルコース６－リン酸、または、フルクトース６－リン酸と比較して、アルロース６－リン酸に対して高い比活性を示す、ことを指す。

Ａ６Ｐからアルロースへ変換するためのホスファターゼは、二価金属補因子、好ましくは、マグネシウムを利用する。本発明のさらなる態様では、当該ホスファターゼは、限定をするものではないが、触媒作用のためのロスマノイドフォールドドメインを含有すること、限定をするものではないが、基質特異性のためのＣ１キャッピングドメインをさらに含有すること、限定をするものではないが、当該２番目のＡｓｐが一般的な酸／塩基触媒であるマグネシウムを配位させるための当該ロスマノイドフォールドの１番目のβ－ストランドでのＤｘＤシグネチャーをさらに含有すること、限定をするものではないが、当該ロスマノイドフォールドの２番目のβ－ストランドの末端に反応中間体の安定性を補助するＴｈｒまたはＳｅｒをさらに含有すること、限定をするものではないが、Ｃ末端が当該ロスマノイドフォールドの３番目のβ－ストランドに向かう当該α－ヘリックスのＮ末端に反応中間体の安定性を補助するＬｙｓをさらに含有すること、及び、限定をするものではないが、マグネシウムを配位させるための当該ロスマノイドフォールドの４番目のβ－ストランドの末端にＧＤｘｘｘＤシグネチャーをさらに含有すること、を含む。これらの特徴は、当該技術分野において公知であり、そして、例えば、Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＡＤ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ： Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ａ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｅｓｔｅｒａｓｅｓ ａｎｄ Ａｌｌｉｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２００６；３６１；１００３－１０３４．で報告されている。好ましくは、本発明のプロセスで使用するＡ６Ｐをアルロースに変換するためのホスファターゼは、触媒作用のためのロスマノイドフォールドドメイン、Ｃ１キャッピングドメイン、当該ロスマノイドフォールドの１番目のβ－ストランドでのＤｘＤシグネチャー、当該ロスマノイドフォールドの２番目のβ－ストランドの末端のＴｈｒまたはＳｅｒ、Ｃ末端が当該ロスマノイドフォールドの３番目のβ－ストランドに向かうα－ヘリックスのＮ末端のＬｙｓ、及び、当該ロスマノイドフォールドの４番目のβ－ストランドの末端のＧＤｘｘｘＤシグネチャーを含む。

幾つかの実施形態では、本発明のアルロースを調製するプロセスは、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）をＦ６Ｐへ酵素的に転換するステップを含み、このステップは、ホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）で触媒する。その他の実施形態では、アルロースを調製するプロセスは、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をＧ６Ｐに変換するステップをさらに含んでおり、このステップは、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）で触媒する。なおもさらなる実施形態では、アルロース生産プロセスは、少なくとも１つの酵素で触媒して、糖類をＧ１Ｐへ変換するステップも含む。

したがって、本発明のアルロースを調製するプロセスは、例えば、以下の（ｉ）１つ以上の酵素を使用して、糖類をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）へ変換し、（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ５．４．２．２）を使用して、Ｇ１ＰをＧ６Ｐへ変換し、（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ ５．３．１．９）を使用して、Ｇ６ＰをＦ６Ｐへ変換し、（ｉｖ）Ａ６ＰＥによって、Ｆ６ＰをＡ６Ｐへ変換し、及び、（ｖ）Ａ６ＰＰによって、Ａ６Ｐをアルロースに変換する、ステップを含むことができる。糖類をデンプンとしたプロセスの例を、図２に示す。

一般的には、開示したプロセスで使用する酵素単位の比は、１：１：１：１：１（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ａ６ＰＥ：Ａ６ＰＰ）である。産物収率を最適化するために、これらの比を、あらゆる数の組み合わせで調整することができる。例えば、３：１：１：１：１の比を使用して、リン酸化中間体の濃度を最大化することができ、それにより、下流の反応の活性が高まる。逆に、１：１：１：１：３の比を使用して、αＧＰのためのリン酸塩の安定供給を維持することができ、それにより、アルファ－１，４－グリコシド結合を、効率的に加リン酸分解性開裂する。例えば、３：１：１：１：３の酵素の比を使用して、反応速度をさらに高めることができる。したがって、後述するその他の任意の酵素も含めて、酵素比を変動させることで、アルロース生産の効率を高めることができる。例えば、特定の酵素は、その他の酵素の量と比べて、約２倍、３倍、４倍、５倍などの量で存在し得る。

当該プロセスでの重要な利点の１つは、１つのバイオリアクターまたは反応容器において、プロセスステップを実施できることである。あるいは、それらのステップは、直列に配置した複数のバイオリアクターまたは反応容器でも実施できる。

特に、全プロセスステップを、単一のバイオリアクターまたは反応容器で実施する場合に、Ａ６Ｐの脱リン酸化で生成したリン酸イオンは、次いで、糖類をＧ１Ｐへ変換するプロセスステップで再利用することができる。開示したプロセスにおいてリン酸塩を再利用する能力は、非化学量論的な量のリン酸を使用することを可能にし、これにより、反応リン酸塩濃度は低く保たれる。このことは、プロセスの全体的な経路、及び、全体的な速度に影響を及ぼすが、個別の酵素の活性を制限せずに、アルロースを得るプロセスの全体的効率を可能にする。

例えば、反応リン酸塩濃度を、約０ｍＭ～約３００ｍＭ、約０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ、または、より好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲とし得る。例えば、反応リン酸塩濃度を、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、または、約５５ｍＭとし得る。

したがって、低濃度のリン酸塩は、リン酸塩の全量が少ないが故に、リン酸塩の除去費用が抑制され、その結果、生産費用も抑制される。このことは、高濃度の遊離リン酸塩によるＡ６ＰＰの阻害も防止し、そして、リン酸塩汚染の可能性も抑制する。

さらに、本明細書に開示したプロセスは、リン酸塩供給源として添加するＡＴＰを使わずに、すなわち、ＡＴＰ不含で実施できる。これらのプロセスは、ＮＡＤ（Ｈ）を添加する必要もなく、すなわち、ＮＡＤ（Ｈ）不含で実施することもできる。その他の利点として、アルロースを生産するための開示したプロセスの少なくとも１つのステップが、エネルギー的に有利な化学反応を含む、という事実も含む（図７）。

糖類をＧ１Ｐへ変換するために使用する酵素の例として、アルファ－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ、ＥＣ２．４．１．１、マルトデキストリンホスホリラーゼ、デンプンホスホリラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、及び、その他のα－１，４グリコシド結合分解ホスホリラーゼも含む）、マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ、ＥＣ２．４．１．８）、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ、ＥＣ２．４．１．４９）、セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ、ＥＣ２．４．１．２０）、セルロースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ、ＥＣ２．４．１．７）、及び、それらの組み合わせがある。当該酵素または当該酵素の組み合わせの選択は、当該プロセスで使用する糖類による。

Ｇ１Ｐを生成するために使用する糖類を、多糖類、オリゴ糖、及び／または、二糖類とすることができる。例えば、糖類を、デンプン、１つ以上のデンプンの誘導体、セルロース、１つ以上のセルロースの誘導体、スクロース、１つ以上のスクロースの誘導体、または、それらの組み合わせ、とすることができる。

デンプンは、自然界で最も広範に使用されているエネルギー貯蔵化合物であり、大部分は、植物の種子に貯蔵されている。天然のデンプンは、直鎖状アミロースと分岐状アミロペクチンとを含む。デンプン誘導体の例として、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、フルクトース、及び、グルコースがある。セルロース誘導体の例として、前処理したバイオマス、再生した非晶性セルロース、セロデキストリン、セロビオース、フルクトース、及び、グルコースがある。スクロース誘導体として、フルクトース、及び、グルコースがある。

デンプンの誘導体は、デンプンの酵素的加水分解、または、デンプンの酸加水分解によって調製することができる。具体的には、デンプンの酵素的加水分解は、α－１，６－グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（ＩＡ、ＥＣ．３．２．１．６８）、α－１，６－グルコシド結合を加水分解するプルラナーゼ（ＰＡ、ＥＣ．３．２．１．４１）、短いマルトオリゴ糖のグリコシル転移を触媒して、より長いマルトオリゴ糖をもたらす４－α－グルカノトランスフェラーゼ（４ＧＴ、ＥＣ．２．４．１．２５）、または、α－１，４－グルコシド結合を開裂するアルファ－アミラーゼ（ＥＣ．３．２．１．１）によって、触媒または促進することができる。

さらに、セルロースの誘導体は、セルラーゼ混合物で触媒するセルロースの酵素的加水分解によって、酸によって、または、バイオマスの前処理によって、調製することができる。

特定の実施形態では、糖類をＧ１Ｐへ変換するために使用する酵素は、αＧＰを含有する。このステップでは、当該糖類が、デンプンを含む場合、当該Ｇ１Ｐは、αＧＰによって、デンプンから生成され、当該糖類が、可溶性デンプン、アミロデキストリン、または、マルトデキストリンを含有する場合、当該Ｇ１Ｐは、αＧＰによって、可溶性デンプン、アミロデキストリン、または、マルトデキストリンから生成する。

当該糖類が、マルトースを含み、かつ、当該酵素が、マルトースホスホリラーゼを含有する場合、当該Ｇ１Ｐは、マルトースホスホリラーゼによって、マルトースから生成する。当該糖類が、スクロースを含み、かつ、当該酵素が、スクロースホスホリラーゼを含有する場合、当該Ｇ１Ｐは、スクロースホスホリラーゼによって、スクロースから生成する。

さらに別の実施形態では、当該糖類が、セロビオースを含み、かつ、当該酵素が、セロビオースホスホリラーゼを含有する場合、当該Ｇ１Ｐは、セロビオースホスホリラーゼによって、セロビオースから生成する。

追加の実施形態では、当該糖類が、セロデキストリンを含有し、かつ、当該酵素が、セロデキストリンホスホリラーゼを含む場合、当該Ｇ１Ｐは、セロデキストリンホスホリラーゼによって、セロデキストリンから生成する。

糖類をＧ１Ｐへ変換する別の実施形態では、当該糖類が、セルロースを含み、かつ、当該酵素が、セルロースホスホリラーゼを含有する場合、当該Ｇ１Ｐは、セルロースホスホリラーゼによって、セルロースから生成する。

本発明では、アルロースを、フルクトースから生産することもできる。当該プロセスの例を、図４に示す。例えば、このプロセスは、ポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）で触媒して、フルクトース及びポリリン酸塩からＦ６Ｐを生成すること、Ａ６ＰＥで触媒して、Ｆ６ＰをＡ６Ｐへ変換すること、及び、Ａ６ＰＰで触媒して、Ａ６Ｐをアルロースへ変換すること、を含む。このフルクトースは、例えば、スクロースの酵素的変換で生産することができる。

その他の実施形態では、アルロースを、スクロースから生産することができる。かようなプロセスの例を、図６に示す。このプロセスは、以下の酵素的ステップ、すなわち、スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）で触媒して、スクロース及び遊離リン酸塩からＧ１Ｐを生成し、ＰＧＭで触媒して、Ｇ１ＰをＧ６Ｐへ変換し、ＰＧＩで触媒して、Ｇ６ＰをＦ６Ｐへ変換し、Ａ６ＰＥで触媒して、Ｆ６ＰをＡ６Ｐへ変換し、及び、Ａ６ＰＰで触媒して、Ａ６Ｐをアルロースへ変換する、ステップを含むインビトロでの合成経路を提供する。

Ａ６Ｐをアルロースへ変換する場合に生成するリン酸イオンは、次いで、スクロースをＧ１Ｐへ変換するステップで再利用することができる。加えて、図６に示したように、ＰＰＦＫ及びポリリン酸塩を使用して、ＳＰによるスクロースの加リン酸分解性開裂で生成したフルクトースからＦ６Ｐを生産することで、アルロース収率を高めることができる。

幾つかの実施形態では、アルロースを調製するプロセスは、以下のステップ、すなわち、酵素的加水分解または酸加水分解によって、多糖類及びオリゴ糖類からグルコースを生成し、少なくとも１つの酵素で触媒して、グルコースをＧ６Ｐへ変換し、酵素的加水分解または酸加水分解によって、多糖類及びオリゴ糖類からフルクトースを生成し、少なくとも１つの酵素で触媒して、フルクトースをＧ６Ｐへ変換する、ステップを含む。多糖類及びオリゴ糖類の例は、上記した通りである。

その他の実施形態では、Ｇ６Ｐは、ポリリン酸グルコキナーゼによって、グルコース及びポリリン酸ナトリウムから生成する。

本開示は、デンプン、セルロース、スクロース、及び、それらの誘導物などを構成する多糖類及びオリゴ糖類などの糖類を、アルロースに変換するプロセスを提供する。特定の実施形態では、無細胞酵素カクテルを使用して、デンプン、セルロース、スクロース、及び、それらの誘導物を、アルロースへ変換するために、人工的な（非天然の）ＡＴＰ不含酵素経路を提供する。

上記したように、幾つかの酵素を使用することで、デンプンを加水分解して、Ｇ１Ｐ収率を高めることができる。そのような酵素として、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、及び、アルファ－アミラーゼがある。トウモロコシデンプンは、αＧＰ作用を妨げる数多くの分岐を含有する。イソアミラーゼを使用することで、デンプンを脱分岐させて、直鎖アミロデキストリンを生成する。イソアミラーゼで前処理したデンプンは、最終産物に高濃度のＦ６Ｐを含有させることができる。イソアミラーゼ及びプルラナーゼは、アルファ－１，６－グリコシド結合を開裂して、アルファ－グルカンホスホリラーゼが、より完全にデンプンを分解することを可能にする。アルファ－アミラーゼは、アルファ－１，４－グリコシド結合を開裂するので、アルファ－アミラーゼを使用することで、デンプンを分解して断片にして、より迅速にアルロースへ変換する。

図２に示したように、マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を使用して、分解物であるマルトースを加リン酸分解的に開裂してＧ１Ｐ及びグルコースにすることで、アルロース収率を高めることができる。あるいは、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を使用して、分解物であるグルコース、マルトース、及び、マルトトリオースを、長いマルトオリゴ糖類へと再利用することで、アルロース収率を高めることができ、それにより、αＧＰによって加リン酸分解的に開裂してＧ１Ｐを生成することができる。

加えて、セルロースは、最も豊富な生物資源であり、また、植物細胞壁の主要な構成要素である。食品以外のリグノセルロース系バイオマスには、セルロース、ヘミセルロース、及び、リグニン、ならびに、その他の微量成分が含まれている。Ａｖｉｃｅｌ（微結晶性セルロース）、再生非晶性セルロース、細菌セルロース、フィルターペーパーなどの純粋なセルロースは、一連の処理を経て調製することができる。部分的に加水分解したセルロース系基質には、重合度が７を超える非水溶性セロデキストリン、重合度が３～６の水溶性セロデキストリン、セロビオース、グルコース、及び、フルクトースが含まれている。

特定の実施形態では、セルロース及びその誘導物は、一連のステップを介してアルロースへ変換することができる。そのようなプロセスの例を、図３に示した。このプロセスは、以下のステップ、すなわち、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）、及び、セロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）で触媒して、それぞれ、セロデキストリン、及び、セロビオース、及び、遊離リン酸塩からＧ１Ｐを生成し、ＰＧＭで触媒して、Ｇ１ＰをＧ６Ｐへ変換し、ＰＧＩで触媒して、Ｇ６ＰをＦ６Ｐへ変換し、Ａ６ＰＥで触媒して、Ｆ６ＰをＡ６Ｐへ変換し、及び、Ａ６ＰＰで触媒して、Ａ６Ｐをアルロースへ変換する、ステップを含むインビトロでの合成経路を提供する。このプロセスでは、リン酸イオンを、セロデキストリン、及び、セロビオースを、Ｇ１Ｐへ変換するステップによって、再利用することができる。

幾つかの酵素を使用して、固体セルロースを、水溶性セロデキストリン及びセロビオースへ加水分解し得る。そのような酵素として、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼがあるが、ベータ－グルコシダーゼ（セロビアーゼ）は含まれない。

セルロースの加水分解、及び、Ｇ１Ｐ生成の前に、セルロース及びバイオマスを前処理して、それらの反応性を高め、そして、セルロース鎖の重合度を抑制することができる。セルロース及びバイオマスの前処理プロセスとして、希酸前処理、セルロース溶媒ベースのリグノセルロース分画、アンモニア繊維膨張、アンモニア水浸漬、イオン液体処理、及び、塩酸、硫酸、リン酸、及び、それらの組み合わせを含む濃酸の使用による部分的加水分解がある。

幾つかの実施形態では、図３に示したように、ポリリン酸塩及びポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）を本プロセスへ添加することができ、したがって、分解物であるグルコースをＧ６Ｐにリン酸化することで、アルロースの収率を高めることができる。

その他の実施形態では、アルロースを、グルコースから生産することができる。そのようなプロセスの例を、図５に示した。このプロセスは、ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）で触媒して、グルコース及びポリリン酸塩からＧ６Ｐを生成し、ＰＧＩで触媒して、Ｇ６ＰをＦ６Ｐへ変換し、酵素で触媒して、Ｆ６ＰをＡ６Ｐへ変換し、及び、Ａ６ＰＰで触媒して、Ａ６Ｐをアルロースへ変換する、ステップを含む。

ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、ＢＩＳ－ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、Ｔｒｉｚｍａなど、当該技術分野において公知のあらゆる好適な生理学的緩衝液を、本発明のプロセスで使用することができる。すべての実施形態についての反応緩衝液は、５．０～８．０の範囲のｐＨを有することができる。より好ましくは、当該反応緩衝液のｐＨは、約６．０～約７．３の範囲とすることができる。例えば、当該反応緩衝液ｐＨは、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、または、７．３とすることができる。

当該反応緩衝液は、重要な金属カチオンも含有することができる。金属イオンの例として、Ｍｇ^２＋、Ｃｏ^２＋、及び、Ｚｎ^２＋がある。

当該プロセスのステップを実施する反応温度を、３７～８５℃の範囲とすることができる。より好ましくは、それらのステップは、約４０℃～約７０℃の範囲の温度で実施することができる。この温度を、例えば、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、または、約６０℃とすることができる。好ましくは、当該反応温度は、約５０℃である。

開示したプロセスの反応時間は、必要に応じて調整することができ、そして、約８時間～約４８時間の範囲とすることができる。例えば、当該反応時間を、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約２６時間、約２８時間、約３０時間、約３２時間、約３４時間、約３６時間、約３８時間、約４０時間、約４２時間、約４４時間、約４６時間、または、約４８時間とすることができる。より好ましくは、当該反応時間は、約２４時間である。

本発明のプロセスは、反応全体にわたる非常に有利な平衡定数に起因して、高収率を達成することができる。理論的には、出発材料が完全に中間体に変換されるのであれば、最大で９９％の収率を達成することができる。

本発明のプロセスは、低廉な出発材料を使用しており、そして、原料及び産物の分離に関連する費用が減少するので、生産費用は抑制される。デンプン、セルロース、スクロース、及び、それらの誘導体の幾つかは、例えば、フルクトースよりも安価な原料である。アルロースをフルクトースから生産する場合、その収率は、本発明における収率よりも小さく、そして、アルロースは、クロマトグラフィーを介して、フルクトースから分離しなくてはならず、これは、製造コストを高騰させる。

さらに、本発明にしたがって、Ａ６Ｐをアルロースへ変換するステップは、原料に関係なく、不可逆的ホスファターゼ反応である。したがって、アルロースは、後続の産物の分離費用を効果的に最小限にしながら、非常に高収率で生産される。

細胞ベースの製造プロセスとは対照的に、本発明は、細胞膜の排除に起因する比較的高い反応速度を有しており、細胞内外への基質／産物の輸送を遅くすることが多い、アルロースの細胞不含調製を含む。また、それは、栄養豊富な発酵培地／細胞代謝産物を含まない最終製品を有する。

実施例
材料及び方法
化学薬品

トウモロコシデンプン、可溶性デンプン、マルトデキストリン、マルトース、グルコース、フィルターペーパーなどのすべての化学物質は、特に断りのない限り、試薬グレード以上のものであり、そして、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、または、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入した。制限酵素、Ｔ４リガーゼ、及び、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）、または、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）のいずれかで合成した。ヌクレオチド配列、配列番号１は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来の好熱性Ａ６ＰＥ（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ｄ９ＴＱＪ４）をコードする。配列番号２は、当該ヌクレオチド配列のコドン最適化バージョンである。配列番号３は、当該酵素のアミノ酸配列である。ヌクレオチド配列、配列番号４は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｖｏｒａｎｓ由来の好熱性Ａ６ＰＥ（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８）をコードする。配列番号５は、当該ヌクレオチド配列のコドン最適化バージョンである。配列番号６は、当該酵素のアミノ酸配列である。ヌクレオチド配列、配列番号７は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来の好熱性Ａ６ＰＰ（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ａ３ＤＣ２１）をコードする。配列番号８は、当該ヌクレオチド配列のコドン最適化バージョンである。配列番号９は、当該酵素に対応するアミノ酸配列である。酵素精製に使用した再生非晶質セルロースは、その溶解及び再生を通して、Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ１０５（ＦＭＣ ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ）から調製され、Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ９ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ ｃｅｌｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｏｎ ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ． Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；９２：５５１－５６０に記載されているようにして調製した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓｉｇ１０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を、ＤＮＡ操作のための宿主細胞として使用し、そして、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を、組換えタンパク質発現のための宿主細胞として使用した。１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、または、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンのいずれかを含むＺＹＭ－５０５２培地を、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞増殖、及び、組換えタンパク質発現のために使用した。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼ（カタログ番号：Ｃ２７３０）、及び、プルラナーゼ（カタログ番号：Ｐ１０６７）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入したものであり、かつ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ，ＵＳＡ）が製造したものであった。マルトースホスホリラーゼ（カタログ番号：Ｍ８２８４）を、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

組換え酵素の生産と精製

タンパク質発現プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、または、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンのいずれかを含有する１００ｍＬのＺＹＭ－５０５２培地が入った１Ｌのエルレンマイヤーフラスコでインキュベートした。細胞を、２２０ｒｐｍで、回転式振盪により、３７℃で、１６～２４時間増殖させた。これらの細胞を、１２℃で、遠心分離をして回収し、そして、５０ｍＭのＮａＣｌ、及び、５ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（加熱沈殿、及び、セルロース結合モジュール）、または、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び、５ｍＭイミダゾールを含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）（Ｎｉ精製）のいずれかで、１回洗浄した。これらの細胞ペレットを、同じ緩衝液で再懸濁し、そして、超音波処理（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｎｉｃ Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ Ｍｏｄｅｌ ５００；５秒パルスオン、及び、１０秒オフ、５０％の振幅で、全体で２１分間）して溶解した。遠心分離後に、上清に含まれる標的タンパク質を精製した。

３つのアプローチを使用して、様々な組換えタンパク質を精製した。Ｈｉｓタグ付加タンパク質を、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ Ｎｉ－Ｃｈａｒｇｅｄ Ｒｅｓｉｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で精製した。セルロース結合モジュール（ＣＢＭ）、及び、自己開裂インテインを含有する融合タンパク質を、大きな表面積を有する再生した非晶性セルロースでの高親和性吸着を介して精製した。７０～９５℃で、５～３０分間の加熱沈殿を使用して、超耐熱性酵素を精製した。組換えタンパク質の純度を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって検討した。増殖培地、溶出緩衝液、透析緩衝液、及び、タンパク質貯蔵緩衝液に存在する８０μＭ ＣｏＣｌ_２で、Ａ６ＰＥを精製した。

使用した酵素とそれらの活性アッセイ

Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のアルファ－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）を使用した。１ｍＭのＭｇＣｌ_２、５ｍＭのＤＴＴ、及び、３０ｍＭのマルトデキストリンを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で、５０℃で、活性をアッセイした。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）（Ｖｉｖａｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて酵素を濾過して、反応を停止した。グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を、２５Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼを補充したグルコースヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＧＡＨＫ２０－１ＫＴ）を使用して、測定をした。単位（Ｕ）は、μｍｏｌ／分と表示する。

Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）を使用した。５ｍＭのＭｇＣｌ_２及び５ｍＭのＧ１Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で、５０℃で、活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）を用いて酵素を濾過して、反応を停止した。産物であるグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を、ヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＧＡＨＫ２０－１ＫＴ）を使用して、決定をした。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来のホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ａ３ＤＢＸ９）、及び、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＰＧＩ（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ｑ５ＳＬＬ６）という異なる２つの供給源を使用した。５ｍＭのＭｇＣｌ_２、及び、１０ｍＭのＧ６Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で、５０℃で、活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）を用いて酵素を濾過して、反応を停止した。産物であるフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を、フルクトース６－リン酸キナーゼ（Ｆ６ＰＫ）／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＫ）／乳酸脱水素酵素（ＬＤ）共役酵素アッセイを使用して決定を行い、同アッセイにおいて、３４０ｎｍでの吸光度の減少は、Ｆ６Ｐの生成を示す。この２００μＬ反応物は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＧ６Ｐ、１．５ｍＭのＡＴＰ、１．５ｍＭのホスホエノールピルビン酸、２００μＭのＮＡＤＨ、０．１ＵのＰＧＩ、５ＵのＰＫ、及び、５ＵのＬＤを含んでいた。

Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のアルロース６－リン酸３－エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ｄ９ＴＱＪ４）、配列番号３、を使用した。５ｍＭのＭｇＣｌ_２、８０μＭのＣｏＣｌ_２、１Ｕ／ｍＬのＡ６ＰＰ、及び、１０ｍＭのＦ６Ｐを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で、５０℃で、活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）を用いて酵素を濾過して、反応を停止した。産物であるアルロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）を、アルロース６－リン酸ホスファターゼを使用し、かつ、遊離リン酸の放出を検出して、確認した。遊離リン酸の放出を検出するために、０．１Ｍ酢酸亜鉛、及び、２ｍＭモリブデン酸アンモニウム（ｐＨ５）を含有する５００μｌの溶液を、５０μｌの反応物に添加した。これを混合し、続いて、１２５μｌの５％アスコルビン酸（ｐＨ５）を加えた。この溶液を混合し、次いで、３０℃で、２０分間、インキュベートした。８５０ｎｍでの吸光度を読み取って、遊離リン酸の放出を確認した。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来のアルロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ａ３ＤＣ２１）、配列番号９、を使用した。５ｍＭのＭｇＣｌ_２、８０μＭのＣｏＣｌ_２、１Ｕ／ｍＬのＡ６ＰＥ、及び、１０ｍＭのＦ６Ｐを含有する５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で、５０℃で、活性を測定した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）を用いて酵素を濾過して、反応を停止した。産物であるアルロースを、Ａ６ＰＥについて記載したようにして、遊離リン酸の放出を検出することで確認した。

Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来の組換えセロデキストリンホスホリラーゼ、及び、セロビオースホスホリラーゼは、Ｙｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｃｋｔａｉｌｓ．ＣｈｅｍＳｕｓＣｈｅｍ ２００９；２：１４９－１５２に記載されている。記載されている通りに、それらの活性を、アッセイした。

Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ ＹＸ由来の組換えポリリン酸グルコキナーゼは、Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ ＹＸ：ｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ＡＴＰ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２；９３：１１０９－１１１７に記載されている。記載されている通りに、それらの活性を、アッセイした。

Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ由来の組換えイソアミラーゼは、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｐｏｗｅｒ ｏｕｔｐｕｔ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｂｉｏｂａｔｔｅｒｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ ａｎ ａｒｃｈａｅｏｎ Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｔｏｋｏｄａｉｉ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１５；５：１３１８４に記載されている。記載されている通りに、それらの活性を、アッセイした。

Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来の組換え４－アルファ－グルカノトランスフェラーゼは、Ｊｅｏｎ ｅｔ ａｌ．４－α－Ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ａｒｃｈａｅｏｎ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ Ｌｉｔｏｒａｌｉｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７；２４８：１７１－１７８に記載されている。記載されている通りに、それらの活性を、アッセイした。

Ｃａｌｄｉｔｈｒｉｘ ａｂｙｓｓｉ由来のスクロースホスホリラーゼ（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｈ１ＸＴ５０）を使用した。１０ｍＭのスクロース、及び、１２ｍＭの有機リン酸塩を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）にて、その活性を測定した。グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を、２５Ｕ／ｍＬのホスホグルコムターゼを補充したグルコースヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキットを使用して、アルファ－グルカンホスホリラーゼと同様にして、測定した。

以下の各実施例で使用する酵素単位を、必要に応じて増減することで、反応時間を調整できる。例えば、もし２４時間ではなく、８時間で実施例９を実施するのであれば、当該酵素の単位を、約３倍にまで引き上げる。反対に、もし２４時間ではなく、４８時間で実施例９を実施するのであれば、当該酵素単位を、約半分にまで抑制する。これらの例は、酵素単位の量を使用して、一定の生産性を維持しながら、反応時間を加減する方法を例示している。

例１

デンプンからフルクトース６－リン酸の酵素的生合成の技術的実現可能性を検証するために、３つの酵素、すなわち、Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ由来のアルファ－グルカンホスホリラーゼ（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来のホスホグルコムターゼ（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）、及び、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来のホスホイソメラーゼ（ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ａ３ＤＢＸ９）を、組換え的に発現した。これらの組換えタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）で過剰に発現させ、上記したようにして精製した。

１０ｇ／Ｌの可溶性デンプン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．２、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭのＺｎＣｌ_２、０．０１ＵのαＧＰ、０．０１ＵのＰＧＭ、及び、０．０１ＵのＰＧＩを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で、２４時間、インキュベートした。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）を用いて酵素を濾過して、反応を停止した。産物であるフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を、上記したようにして、フルクトース６－リン酸キナーゼ（Ｆ６ＰＫ）／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＫ）／乳酸脱水素酵素（ＬＤ）共役酵素アッセイを使用して決定を行い、同アッセイにおいて、３４０ｎｍでの吸光度の減少は、Ｆ６Ｐの生成を示す。２４時間後のＦ６Ｐの最終濃度は、３．６ｇ／Ｌであった。

例２

実施例１と同じ試験（反応温度を除く）を、４０～８０℃で実施した。４０時間の反応の後に、１０ｇ／Ｌの可溶性デンプンが、４０℃で、０．９ｇ／ＬのＦ６Ｐ、及び、８０℃で、３．６ｇ／ＬのＦ６Ｐを生成したことが認められた。これらの結果は、この酵素セットの反応温度を上げると、Ｆ６Ｐの収率を高めることを示唆しているが、高温にしすぎると、酵素活性が損なわれる可能性がある。

例３

８０℃で、約１：１：１のαＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩの酵素単位比が、迅速にＦ６Ｐを生成することが認められた。反応時間が十分に長ければ、酵素比が、最終Ｆ６Ｐ濃度に大きな影響を与えないことが注目された。しかしながら、酵素比は、反応速度及び系において使用する酵素の総コストに影響を及ぼす。

例４

１０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．２、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭのＺｎＣｌ_２、０．０１ＵのαＧＰ、０．０１ＵのＰＧＭ、及び、０．０１ＵのＰＧＩを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で、２４時間、インキュベートした。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）を用いて酵素を濾過して、反応を停止した。産物であるフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を、上記したようにして、フルクトース６－リン酸キナーゼ（Ｆ６ＰＫ）／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＫ）／乳酸脱水素酵素（ＬＤ）共役酵素アッセイを使用して決定を行い、同アッセイにおいて、３４０ｎｍでの吸光度の減少は、Ｆ６Ｐの生成を示す。２４時間後のＦ６Ｐの最終濃度は、３．６ｇ／Ｌであった。

例５

ＡｖｉｃｅｌからのＦ６Ｐ生成について試験するために、Ｓｉｇｍａセルラーゼを使用して、５０℃で、セルロースを加水分解した。市販のセルラーゼからベータ－グルコシダーゼを除去するために、１０濾紙分解活性／ｍＬのセルラーゼを、氷浴で、１０ｇ／ＬのＡｖｉｃｅｌに対して、１０分間、混合した。４℃での遠心分離の後に、ベータ－グルコシダーゼを含有する上清をデカントした。エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼを含有するセルラーゼと結合したＡｖｉｃｅｌを、加水分解のために、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）で、５０℃で、３日間、再懸濁した。このセルロース加水分解物を、１０ｍＭのリン酸塩、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、及び、０．５ｍＭのＺｎＣｌ_２を含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に含まれる、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／Ｌのセロビオースホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのαＧＰ、５Ｕ／ｍＬのＰＧＭ、及び、５Ｕ／ｍＬのＰＧＩと混合した。この反応を、７２時間、６０℃で実施し、そして、高濃度のＦ６Ｐが認められた（グルコースは少量しかなく、セロビオースは無かった）。上記した共役酵素アッセイを使用して、Ｆ６Ｐを検出した。ヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキットを、上記したように使用して、グルコースを検出した。

例６

ＡｖｉｃｅｌからのＦ６Ｐ収率を高めるために、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｓｗｅｌｌｉｎｇ ｔｏ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００６；７：６４４－６４８に記載されているようにして、Ａｖｉｃｅｌを、濃リン酸で前処理して、非晶性セルロース（ＲＡＣ）を生成した。市販のセルラーゼからベータ－グルコシダーゼを除去するために、１０濾紙分解活性／ｍＬのセルラーゼを、氷浴で、１０ｇ／ＬのＲＡＣに対して、５分間、混合した。４℃での遠心分離の後に、ベータ－グルコシダーゼを含有する上清をデカントした。エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼを含有するセルラーゼと結合したＲＡＣを、加水分解のために、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）で、５０℃で、１２時間、再懸濁した。このＲＡＣ加水分解物を、１０ｍＭのリン酸塩、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、及び、０．５ｍＭのＺｎＣｌ_２を含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に含まれる、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／Ｌのセロビオースホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのαＧＰ、５Ｕ／ｍＬのＰＧＭ、及び、５Ｕ／ｍＬのＰＧＩと混合した。この反応を、７２時間、６０℃で実施した。グルコースをＦ６Ｐへ変換する酵素を添加しなかったので、高濃度のＦ６Ｐとグルコースとを回収した。上記した共役酵素アッセイを使用して、Ｆ６Ｐを検出した。ヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキットを、上記したように使用して、グルコースを検出した。

例７

ＲＡＣからのＦ６Ｐ収率をさらに高めるために、ポリリン酸グルコキナーゼとポリリン酸とを添加した。市販のセルラーゼからベータ－グルコシダーゼを除去するために、１０濾紙分解活性／ｍＬのセルラーゼを、氷浴で、１０ｇ／ＬのＲＡＣに対して、５分間、混合した。４℃での遠心分離の後に、ベータ－グルコシダーゼを含有する上清をデカントした。エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼを含有するセルラーゼと結合したＲＡＣを、加水分解のために、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）で、５０℃で、再懸濁し、そして、加水分解のために、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）で、５０℃で、１２時間、インキュベートした。このＲＡＣ加水分解物を、５０ｍＭのポリリン酸塩、１０ｍＭのリン酸塩、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、及び、０．５ｍＭのＺｎＣｌ_２を含有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に含まれる、５Ｕ／ｍＬのポリリン酸グルコキナーゼ、５Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ、５Ｕ／Ｌのセロビオースホスホリラーゼ、５Ｕ／ｍＬのαＧＰ、５Ｕ／ｍＬのＰＧＭ、及び、５Ｕ／ｍＬのＰＧＩと混合した。この反応を、５０℃で、７２時間、実施した。Ｆ６Ｐは、高濃度で認められたが、グルコースは少量でしか存在していなかった。上記した共役酵素アッセイを使用して、Ｆ６Ｐを検出した。ヘキソキナーゼ／Ｇ６ＰＤＨアッセイキットを、上記したように使用して、グルコースを検出した。

例８

Ｆ６Ｐからのアルロースの生成を検証するために、２ｇ／ＬのＦ６Ｐを、５ｍＭのＭｇＣｌ_２及び８０μＭのＣｏＣｌ_２を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）に含まれる１Ｕ／ｍｌのＡ６ＰＥ、及び、１Ｕ／ｍｌのＡ６ＰＰと混合した。その反応物を、５０℃で、６時間インキュベートした。Ｆ６Ｐのアルロースへの９９％の変換が、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈ－カラム、及び、屈折率検出器を装備しているＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）で認められた。試料を、０．６ｍＬ／分で、５ｍＭのＨ_２ＳＯ_４に流した。

例９

マルトデキストリンからのアルロースの生成を検証するために、２０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．２、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、８０μＭのＣｏＣｌ_２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＡ６ＰＥ、及び、０．０５ＵのＡ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で、２４時間、インキュベートする。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００分子量カットオフ）を用いて酵素を濾過して、反応を停止する。屈折率検出器とＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈ－カラムとを装備したＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣを使用して、アルロースを、検出及び定量する。移動相は、５ｍＭのＨ_２ＳＯ_４であり、０．６ｍＬ／分で流す。アルロースの様々な濃度のスタンダードを使用して、この収率を定量する。

例１０
２００ｇ／Ｌのマルトデキストリン、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、８０μＭのＣｏＣｌ_２、及び、０．１ｇ／Ｌのイソアミラーゼを含有する反応混合物を、８０℃で、２４時間、インキュベートする。これを使用して、２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼ処理マルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．２、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＡ６ＰＥ、及び、０．０５ＵのＡ６ＰＰを含有する別の反応混合物を生成し、そして、５０℃で、２４時間インキュベートする。実施例９に記載のようにして、アルロースの生成を定量する。

例１１
２００ｇ／Ｌのマルトデキストリン、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、及び、１：２００希釈のＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｄ６プルラナーゼを含有する反応混合物を、５０℃で、４時間、インキュベートする。これを使用して、２０ｇ／Ｌのプルラナーゼで処理したマルトデキストリン、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．２、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、８０μＭのＣｏＣｌ_２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＡ６ＰＥ、及び、０．０５ＵのＡ６ＰＰを含有する別の反応混合物を生成し、そして、５０℃で、２４時間インキュベートする。実施例９に記載のようにして、アルロースの生成を定量する。

例１２

マルトデキストリンからのアルロース収率をさらに高めるために、０．０５Ｕの４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を、実施例９に記載の反応に加える。

２０ｇ／Ｌのイソアミラーゼで処理したマルトデキストリン（実施例９を参照されたい）、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、８０μＭのＣｏＣｌ_２、０．０５ＵのαＧＰ、０．０５ＵのＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＡ６ＰＥ、０．０５ＵのＡ６ＰＰ、及び、０．０５Ｕの４ＧＴを含有する０．２ｍＬの反応混合物を、５０℃で、２４時間インキュベートする。実施例９に記載のようにして、アルロースの生成を定量する。

例１３

リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の濃度範囲を決定するために、５０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、６．２５ｍＭ、１２．５ｍＭ、２５ｍＭ、３７．５ｍＭ、または、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ＵのａＧＰ、０．１ＵのＰＧＭ、及び、０．１ＵのＰＧＩを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で、６時間、インキュベートする。短い継続時間は、完了に至らなかったことを保証しており、したがって、効率の差異を明確に示すことができる。Ｆ６Ｐの生成を、フルクトース６－リン酸キナーゼ（Ｆ６ＰＫ）／ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＫ）／乳酸脱水素酵素（ＬＤ）共役酵素アッセイを使用して決定を行い、同アッセイにおいて、３４０ｎｍでの吸光度の減少は、Ｆ６Ｐの生成を示す。６．２５ｍＭ、１２．５ｍＭ、２５ｍＭ、３７．５ｍＭ、または、５０ｍＭのいずれかのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を含む反応では、それぞれ、４．５ｇ／Ｌ、５．１ｇ／Ｌ、５．６ｇ／Ｌ、４．８ｇ／Ｌ、または、４．９ｇ／ＬのＦ６Ｐの収率が得られる（表１）。これらの結果は、２５ｍＭのＰＢＳ ｐＨ７．２の濃度が、これらの特定の反応条件に関しては理想的である、ことを示している。ｐＨ７．２である６．２５ｍＭのＰＢＳの使用でさえ、リン酸塩リサイクルに起因する有意な代謝回転に引き起こす、ことに注目することは重要である。このことは、開示したリン酸塩の再利用法が、低レベルのリン酸塩で、工業レベルの体積あたりの生産性（例えば、２００～３００ｇ／Ｌのマルトデキストリン）さえも維持できる、ことを示す。

例１４

カスケード反応のｐＨ範囲を決定するために、５０ｇ／Ｌのマルトデキストリン、ｐＨ６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、または、７．３のリン酸緩衝生理食塩水、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０２ＵのαＧＰ、０．０２ＵのＰＧＭ、及び、０．０２ＵのＰＧＩを含有する０．２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で、１６時間、インキュベートする。完了に至らなかったことを保証するために単位を低下することで、効率の差異を明確に示すことができる。Ｆ６Ｐの生成を、実施例１２に記載のようにし定量する。ｐＨ６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、または、７．３の５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水を含む反応では、それぞれ、４．０ｇ／Ｌ、４．１ｇ／Ｌ、４．２ｇ／Ｌ、４．１ｇ／Ｌ、４．４ｇ／Ｌ、４．１ｇ／Ｌ、３．８ｇ／Ｌ、または、４．０ｇ／ＬのＦ６Ｐの収率が得られる（表２）。これらの結果は、この系が広範なｐＨ領域で作用するが、６．８のｐＨが、これらの特定の反応条件に関しては理想的である、ことを示している。

例１５

スケールアップを調べるために、５０ｇ／Ｌのイソアミラーゼで処理したマルトデキストリン（実施例１０を参照されたい）、５０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水 ｐＨ７．２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、８０μＭのＣｏＣｌ_２、１０ＵのαＧＰ、１０ＵのＰＧＭ、１０ＵのＰＧＩ、１０ＵのＡ６ＰＥ、及び、１０ＵのＡ６ＰＰを含有する２０ｍＬの反応混合物を、５０℃で、２４時間インキュベートする。実施例９に記載のようにして、アルロースの生成を定量する。

例１６

マルトデキストリンからのアルロース収率をさらに高めるために、０．０５Ｕのマルトースホスホリラーゼを、実施例９に記載の反応に添加する。

例１７

マルトデキストリンからのアルロース収率をさらに高めるために、０．０５Ｕのポリリン酸グルコキナーゼ、及び、７５ｍＭのポリリン酸を、実施例９に記載の反応に添加する。

例１８

フルクトースからアルロースを生産するために、１０ｇ／Ｌのフルクトース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液 ｐＨ ７．０、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、８０μＭのＣｏＣｌ_２、０．０５Ｕのフルクトースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＡ６ＰＥ、及び、０．０５ＵのＡ６ＰＰを含む反応混合物を、５０℃で、２４時間、インキュベートする。実施例９に記載のようにして、アルロースの生成を定量する。

例１９

グルコースからアルロースを生産するために、１０ｇ／Ｌのグルコース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液 ｐＨ ７．０、７５ｍＭのポリリン酸、５ｍＭのＭｇＣｌ２、８０μＭのＣｏＣｌ_２、０．０５Ｕのグルコースポリリン酸キナーゼ、０．０５ＵのＰＧＩ、及び、０．０５ＵのＡ６ＰＥを含む反応混合物を、５０℃で、２４時間、インキュベートする。実施例９に記載のようにして、アルロースの生成を定量する。

例２０

スクロースからアルロースを生産するために、１０ｇ／Ｌのスクロース、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水 ｐＨ ７．０、５ｍＭのＭｇＣｌ２、８０μＭのＣｏＣｌ_２、０．０５Ｕのスクロースポリリン酸、０．０５のＰＧＭ、０．０５ＵのＰＧＩ、０．０５ＵのＡ６ＰＥ、及び、０．０５ＵのＡ６ＰＰを含む反応混合物を、５０℃で、２４時間、インキュベートする。実施例９に記載のようにして、アルロースの生成を定量する。

例２１

スクロースからのアルロースの収率をさらに高めるために、７５ｍＭのポリリン酸、及び、０．０５のポリリン酸フルクトキナーゼを、実施例２０に記載の反応に添加する。実施例９に記載のようにして、アルロースの生成を定量する。

配列番号２：＜２２３＞コドン最適化thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum A6PE
配列番号５：＜２２３＞コドン最適化Bacillus thermoamylovorans由来の好熱性A6PE
配列番号８：＜２２３＞コドン最適化Clostridium thermocellum由来のA6PP

本発明のその他の態様では、アルロースを調製するためのプロセスのステップは、約０ｍＭ～約１５０ｍＭのリン酸濃度で、ＡＴＰ不含、ＮＡＤ（Ｈ）不含で行われ、当該リン酸塩は再利用され、及び／または、当該プロセスの少なくとも１つのステップは、エネルギー的に有利な化学反応を含む。
本発明に関連して、以下の内容を更に開示する。
［１］
アルロースを調製するプロセスであって、
エピメラーゼで触媒して、フルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を、アルロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に変換する、及び、
ホスファターゼで触媒して、生成した前記Ａ６Ｐをアルロースに変換する、
ことを含む、前記プロセス。
［２］
グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を、前記Ｆ６Ｐに変換するステップをさらに含み、前記ステップを、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）で触媒する、［１］に記載のプロセス。
［３］
グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を、前記Ｇ６Ｐに変換するステップをさらに含み、前記ステップを、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）で触媒する、［２］に記載のプロセス。
［４］
糖類を、前記Ｇ１Ｐに変換するステップをさらに含み、前記ステップを、少なくとも１つの酵素で触媒し、前記糖類を、デンプンもしくはその誘導体、セルロースもしくはその誘導体、及び、スクロースからなる群から選択する、［３］に記載のプロセス。
［５］
少なくとも１つの酵素を、アルファ－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、及び、セルロースホスホリラーゼからなる群から選択する、［４］に記載のプロセス。
［６］
前記糖類が、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、及び、グルコースからなる群から選択されるデンプンもしくはその誘導体である、［４］に記載のプロセス。
［７］
デンプンを、デンプン誘導体に変換するステップをさらに含み、前記デンプン誘導体を、デンプンの酵素加水分解、または、デンプンの酸加水分解で調製する、［６］に記載のプロセス。
［８］
４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を、前記プロセスに加える、［６］に記載のプロセス。
［９］
前記デンプン誘導体を、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、アルファ－アミラーゼ、または、それらの組み合わせで触媒した、デンプンの酵素加水分解で調製する、［７］に記載のプロセス。
［１０］
フルクトースを前記Ｆ６Ｐに変換するステップであって、少なくとも１つの酵素で触媒した前記ステップ、及び、任意に、スクロースを前記フルクトースに変換するステップであって、少なくとも１つの酵素で触媒した前記ステップ、をさらに含む、［１］に記載のプロセス。
［１１］
グルコースを前記Ｇ６Ｐに変換するステップであって、少なくとも１つの酵素で触媒した前記ステップ、及び、任意に、スクロースを前記グルコースに変換するステップであって、少なくとも１つの酵素で触媒した前記ステップ、をさらに含む、［２］に記載のプロセス。
［１２］
前記エピメラーゼが、アルロース６－リン酸３－エピメラーゼである、［１］～［１１］のいずれかに記載のプロセス。
［１３］
前記アルロース６－リン酸３－エピメラーゼが、配列番号３または６と、４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記エピメラーゼが、Ｆ６ＰからＡ６Ｐへの変換を触媒する、［１２］に記載のプロセス。
［１４］
前記アルロース６－リン酸３－エピメラーゼが、触媒作用のための（α／β） _８ －バレルドメイン、前記バレルの７番目のβ－ストランドの末端のＳｅｒ、前記バレルの８番目のβ－ストランドの末端のＳｅｒ、活性部位ループのＧｌｙ、前記バレルの２番目及び３番目のβ－ストランドのＨｉｓ、前記バレルの２番目及び７番目のβ－ストランドのＡｓｐ、及び、前記バレルの２番目のβ－ストランドのＨｉｓ－疎水性残基Ａｓｐ－シグネチャーを含む、［１２］に記載のプロセス。
［１５］
前記ホスファターゼが、アルロース６－リン酸ホスファターゼである、［１］～［１１］のいずれかに記載のプロセス。
［１６］
前記アルロース６－リン酸ホスファターゼが、配列番号９と、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ホスファターゼが、Ａ６Ｐからアルロースへの変換を触媒する、［１５］に記載のプロセス。
［１７］
前記アルロース６－リン酸ホスファターゼが、アルロース６－リン酸に特異的である、［１５］に記載のプロセス。
［１８］
前記アルロース６－リン酸ホスファターゼが、触媒作用のためのロスマノイドフォールドドメイン、Ｃ１キャッピングドメイン、前記ロスマノイドフォールドの１番目のβ－ストランドでのＤｘＤシグネチャー、前記ロスマノイドフォールドの２番目のβ－ストランドの末端のＴｈｒまたはＳｅｒ、Ｃ末端が前記ロスマノイドフォールドの３番目のβ－ストランドに向かうα－ヘリックスのＮ末端のＬｙｓ、及び、前記ロスマノイドフォールドの４番目のβ－ストランドの末端のＧＤｘｘｘＤシグネチャーを含む、［１５］に記載のプロセス。
［１９］
前記プロセスステップを、約４０℃～約７０℃の範囲の温度で、約５．０～約８．０の範囲のｐＨで、及び／または、約８時間～約４８時間かけて実施をする、［１］～［１１］のいずれかに記載のプロセス。
［２０］
前記プロセスステップを、１つのバイオリアクター、または、直列に配置した複数のバイオリアクターにおいて実施をする、［１］～［１１］のいずれかに記載のプロセス。
［２１］
前記プロセスステップを、ＡＴＰ不含、ＮＡＤ（Ｈ）不含で、約０ｍＭ～約１５０ｍＭのリン酸塩濃度で実施し、前記リン酸塩を再利用し、及び／または、前記プロセスの少なくとも１つのステップが、エネルギー的に有利な化学反応に関係する、［１］～［１１］のいずれかに記載のプロセス。
［２２］
［１］～［１１］のいずれかに記載のプロセスで製造したアルロース。

Claims (22)

1. アルロースを調製するプロセスであって、
   エピメラーゼで触媒して、フルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を、アルロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に変換する、及び、
   ホスファターゼで触媒して、生成した前記Ａ６Ｐをアルロースに変換する、
   ことを含む、前記プロセス。
2. グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を、前記Ｆ６Ｐに変換するステップをさらに含み、前記ステップを、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）で触媒する、請求項１に記載のプロセス。
3. グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を、前記Ｇ６Ｐに変換するステップをさらに含み、前記ステップを、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）で触媒する、請求項２に記載のプロセス。
4. 糖類を、前記Ｇ１Ｐに変換するステップをさらに含み、前記ステップを、少なくとも１つの酵素で触媒し、前記糖類を、デンプンもしくはその誘導体、セルロースもしくはその誘導体、及び、スクロースからなる群から選択する、請求項３に記載のプロセス。
5. 少なくとも１つの酵素を、アルファ－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、及び、セルロースホスホリラーゼからなる群から選択する、請求項４に記載のプロセス。
6. 前記糖類が、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、及び、グルコースからなる群から選択されるデンプンもしくはその誘導体である、請求項４に記載のプロセス。
7. デンプンを、デンプン誘導体に変換するステップをさらに含み、前記デンプン誘導体を、デンプンの酵素加水分解、または、デンプンの酸加水分解で調製する、請求項６に記載のプロセス。
8. ４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を、前記プロセスに加える、請求項６に記載のプロセス。
9. 前記デンプン誘導体を、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、アルファ－アミラーゼ、または、それらの組み合わせで触媒した、デンプンの酵素加水分解で調製する、請求項７に記載のプロセス。
10. フルクトースを前記Ｆ６Ｐに変換するステップであって、少なくとも１つの酵素で触媒した前記ステップ、及び、任意に、スクロースを前記フルクトースに変換するステップであって、少なくとも１つの酵素で触媒した前記ステップ、をさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
11. グルコースを前記Ｇ６Ｐに変換するステップであって、少なくとも１つの酵素で触媒した前記ステップ、及び、任意に、スクロースを前記グルコースに変換するステップであって、少なくとも１つの酵素で触媒した前記ステップ、をさらに含む、請求項２に記載のプロセス。
12. 前記エピメラーゼが、アルロース６－リン酸３－エピメラーゼである、請求項１～１１のいずれか１項に記載のプロセス。
13. 前記アルロース６－リン酸３－エピメラーゼが、配列番号３または６と、４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記エピメラーゼが、Ｆ６ＰからＡ６Ｐへの変換を触媒する、請求項１２に記載のプロセス。
14. 前記アルロース６－リン酸３－エピメラーゼが、触媒作用のための（α／β）_８－バレルドメイン、前記バレルの７番目のβ－ストランドの末端のＳｅｒ、前記バレルの８番目のβ－ストランドの末端のＳｅｒ、活性部位ループのＧｌｙ、前記バレルの２番目及び３番目のβ－ストランドのＨｉｓ、前記バレルの２番目及び７番目のβ－ストランドのＡｓｐ、及び、前記バレルの２番目のβ－ストランドのＨｉｓ－疎水性残基Ａｓｐ－シグネチャーを含む、請求項１２に記載のプロセス。
15. 前記ホスファターゼが、アルロース６－リン酸ホスファターゼである、請求項１～１１のいずれか１項に記載のプロセス。
16. 前記アルロース６－リン酸ホスファターゼが、配列番号９と、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または、少なくとも１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ホスファターゼが、Ａ６Ｐからアルロースへの変換を触媒する、請求項１５に記載のプロセス。
17. 前記アルロース６－リン酸ホスファターゼが、アルロース６－リン酸に特異的である、請求項１５に記載のプロセス。
18. 前記アルロース６－リン酸ホスファターゼが、触媒作用のためのロスマノイドフォールドドメイン、Ｃ１キャッピングドメイン、前記ロスマノイドフォールドの１番目のβ－ストランドでのＤｘＤシグネチャー、前記ロスマノイドフォールドの２番目のβ－ストランドの末端のＴｈｒまたはＳｅｒ、Ｃ末端が前記ロスマノイドフォールドの３番目のβ－ストランドに向かうα－ヘリックスのＮ末端のＬｙｓ、及び、前記ロスマノイドフォールドの４番目のβ－ストランドの末端のＧＤｘｘｘＤシグネチャーを含む、請求項１５に記載のプロセス。
19. 前記プロセスステップを、約４０℃～約７０℃の範囲の温度で、約５．０～約８．０の範囲のｐＨで、及び／または、約８時間～約４８時間かけて実施をする、請求項１～１１のいずれか１項に記載のプロセス。
20. 前記プロセスステップを、１つのバイオリアクター、または、直列に配置した複数のバイオリアクターにおいて実施をする、請求項１～１１のいずれか１項に記載のプロセス。
21. 前記プロセスステップを、ＡＴＰ不含、ＮＡＤ（Ｈ）不含で、約０ｍＭ～約１５０ｍＭのリン酸塩濃度で実施し、前記リン酸塩を再利用し、及び／または、前記プロセスの少なくとも１つのステップが、エネルギー的に有利な化学反応に関係する、請求項１～１１のいずれか１項に記載のプロセス。
22. 請求項１～１１のいずれか１項に記載のプロセスで製造したアルロース。

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