JP6973898B2 - 新規のプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素、前記酵素を含むプシコース生産用組成物、前記酵素を利用してプシコースを製造する方法 - Google Patents

新規のプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素、前記酵素を含むプシコース生産用組成物、前記酵素を利用してプシコースを製造する方法 Download PDF

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Description

本出願は、新規のプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素、前記酵素を含むプシコース生産用組成物、前記酵素を利用してプシコースを製造する方法に関する。
プシコース−３−エピマー化酵素（Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ−３−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、ＥＣ ５．１．３．３０）及びタガトース−３−エピマー化酵素（Ｄ−ｔａｇａｔｏｓｅ−３−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、ＥＣ ５．１．３．３１）は、果糖（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ）を３−エピマー化（３−ｅｐｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、３番炭素エピマー化）してプシコース（Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ）を生産することができる酵素として知られている。前記酵素を利用する単一酵素反応でプシコースを生産する場合、基質である果糖と産物であるプシコースとの間に一定水準の反応平衡（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）が存在する（産物／基質＝約２０％から３５％）。よって、高純度のプシコースを製造するためには、酵素反応の結果物から比較的に高濃度の果糖を分離して除去しなければならない更なる精製の工程が求められるという問題点がある。
一方、Ｃｈａｎなど（２００８．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４７：９６０８−９６１７）は、果糖−６−リン酸（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びプシコース−６−リン酸（Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に対して３−エピマー化反応を行うことができるストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のリブロース−５−リン酸−３−エピマー化酵素（Ｄ−ｒｉｂｕｌｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−３−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、ＥＣ ５．１．３．１）及びＥ．ｃｏｌｉ由来のプシコース−６−リン酸−３−エピマー化酵素（Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−３−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ、ＥＣ ５．１．３．−）を報告したことがあるが、前記酵素等は耐熱性を有することができないため、産業的に利用が不可能であるという問題点がある。
このような背景の下、本発明者達は、経済的であるとともに、産業的にプシコースへの転換率を高めることができる方法を開発するために鋭意努力した。その結果、経済的原料であるスクロースまたは澱粉（例えば、マルトデキストリン）をプシコース−６−リン酸に転換させた後、前記プシコース−６−リン酸に特異的であるとともに不可逆反応経路を行う本出願のプシコース−６−リン酸脱リン酸化酵素（ｐｓｉｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）を利用してプシコースを生産する場合、プシコースの生産経路に関与する複数の酵素を同時に使用可能な同時酵素反応（ｏｎｅ−ｐｏｔ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｓ）が可能であり、プシコースの転換率を著しく高めることができることを確認することにより、本出願を完成した。
本出願の一目的は、モチーフＡ及びモチーフＢを含む新規のプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素を提供することにある。
本出願の他の一目的は、本願に記述されたプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素を暗号化する核酸と、前記核酸を含む形質転換体を提供することにある。
本出願のまた他の一目的は、イノシトール−モノ−ホスファターゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を含むプシコース生産用組成物を提供することにある。
本出願のさらに他の一目的は、プシコース−６−リン酸にイノシトール−モノ−ホスファターゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を接触させて前記プシコース−６−リン酸をプシコースに転換するステップを含むプシコースの製造方法を提供することにある。
以下、本出願の内容に対して具体的に説明する。一方、本出願で開示した一態様の説明及び実施の形態は、共通した事柄に対して他の態様の説明及び実施の形態にも適用され得る。また、本出願で開示された多様な要素の全ての組み合わせが本出願の範疇に属する。併せて、下記に記述された具体的な敍述によって本出願の範疇が制限されるとみることができない。
出願の目的を達成するため、本出願は一つの態様として、
Ｘａ１−Ｘａ２−Ｘａ３−ＤＰＬＤＧ−Ｘａ４のモチーフＡと、
Ｙａ１−Ｄ−Ｙａ２−Ｗａ１−Ｙａ３−Ｗａ２−Ｙａ４−Ｗａ３のモチーフＢとを含むプシコース−６−リン酸脱リン酸化酵素を提供し、
前記モチーフＡで、Ｘａ１は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、またはＡであり、Ｘａ２は、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ａ、または無しであり、Ｘａ３は、Ｖ、Ｉ、またはＬであり、Ｘａ４は、ＴまたはＳであり、
前記モチーフＢで、Ｙａ１は、Ｗ、Ｙ、Ｔ、Ｌ、またはＶであり、Ｙａ２は、Ｖ、Ｉ、Ｃ、Ｆ、またはＡであり、Ｗａ１は、ＡＡＧ、ＡＡＳ、ＳＡＧ、ＡＰＧ、ＡＰＦ、ＡＧＧ、ＡＰＬ、またはＡＧＡであり、Ｙａ３は、Ｗ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、Ｖ、Ｙ、Ｆ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、またはＳであり、Ｗａ２は、ＬＬＶ、ＬＩＶ、ＬＬＩ、ＬＩＩ、ＩＬＩ、ＦＩＡ、ＡＬＶ、ＩＩＡ、ＶＬＶ、ＶＩＬ、ＴＩＧ、ＮＦＣ、またはＰＩＦであり、Ｙａ４は、Ｅ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｋ、またはＰであり、Ｗａ３は、ＥＡＧＧ、ＥＧＧＧ、ＥＡＫＧ、ＫＡＧＧ、ＡＡＧＧ、ＹＶＤＧ、ＥＡＧＡ、またはＲＬＧＶである。
具体的に、前記モチーフＡで、Ｘａ１は、ＷまたはＦであり、Ｘａ２は、ＩまたはＶであり、Ｘａ３は、ＶまたはＩであり、Ｘａ４はＴであり、前記モチーフＢで、Ｙａ１はＷであり、Ｙａ２は、ＶまたはＩであり、Ｗａ１はＡＡＧであり、Ｙａ３は、Ｗ、Ｉ、またはＶであり、Ｗａ２は、ＬＬＶ、ＬＩＶ、ＬＩＩ、またはＬＬＩであり、Ｙａ４は、Ｅ、Ｒ、またはＳであり、Ｗａ３は、ＥＡＧＧまたはＥＧＧＧであってよい。
前記モチーフＡと前記モチーフＢの間、前記モチーフＡの末端、または前記モチーフＢの末端には１個以上のアミノ酸が含まれてよく、モチーフＡとモチーフＢ以外のアミノ酸配列は、公知のイノシトール−モノ−ホスファターゼの配列（例えば、配列番号１から２０の配列の中でモチーフＡとモチーフＢを除いた配列）から定義されてよい。
前記モチーフＡ及び／またはモチーフＢは、イノシトール−モノ−ホスファターゼの配列の中で活性部位として、前記酵素の基質であるイノシトールホスフェートの結合部位として知られている（参照文献：Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ、Ｖｏｌｕｍｅ ２９４、ｎｕｍｂｅｒ １、２、１６−１８、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９１）。本出願では、イノシトール−モノ−ホスファターゼがプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素としての活性を示すことと、イノシトール−モノ−ホスファターゼのモチーフＡ及び／またはモチーフＢはまた前記脱リン酸酵素の基質結合部位であり得ることとを明かした。
プシコース−６−リン酸脱リン酸酵素は、具体例として、配列番号１から２０のいずれか一つのアミノ酸配列を含むプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素（ｐｓｉｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）であってよい。
本出願のプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素は、従来のイノシトール−モノホスファターゼとしての機能が公知の酵素であってよい。
本出願のプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素は、プシコース−６−リン酸に一層選択的に脱リン酸化反応を行い、ブドウ糖−１−リン酸（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ブドウ糖−６−リン酸（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）または果糖−６−リン酸（Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）には非特異的であってよい。
本出願のプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素は、前記酵素自体またはこれを発現するＤＮＡ（例えば、本出願の配列番号２１から４０）を菌株に形質転換させ、これを培養して培養物を得、前記培養物を破砕し、カラムなどを介して精製したものであってよい。前記形質転換用菌株には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、またはバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などがある。
本出願の一具現例によれば、本出願のプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素は、モチーフＡ及び／またはモチーフＢの配列と９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上または１００％の相同性、類似性または同一性を有し、プシコース−６−リン酸脱リン酸酵素活性を示す酵素を含むことができる。さらに、モチーフＡ及びモチーフＢを除いた配列とは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上または１００％の配列相同性、類似性または同一性を有する酵素であってよい。具体例において、配列番号１から２０の中で、モチーフＡ及び／またはモチーフＢの配列と９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上または１００％の相同性、類似性または同一性を有するとともに、モチーフＡ及び／またはモチーフＢ以外の部分とは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上または１００％、若しくは、前記数値の中で任意の２個の数値によって定められる範囲内の相同性、類似性または同一性を有する配列からなるタンパク質を含むことができる。例えば、前記相同性、類似性または同一性を有するとともに、前記プシコース−６−リン酸脱リン酸酵素タンパク質、例えば、前記配列番号１から２０のいずれか一つのアミノ酸配列からなるタンパク質と相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するとしても、本出願の範囲内に含まれることは自明である。
また、本出願のモチーフＡ及びモチーフＢを含むプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素と相応する活性を有するタンパク質であれば、前記モチーフＡ及び前記モチーフＢの配列の中で配列前後の無意味な配列の追加または自然的に発生し得る突然変異、あるいはその潜在性突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を除くことではなく、特に、配列番号１から２０のいずれか一つのアミノ酸配列前後の無意味な配列の追加または自然発生の突然変異、あるいはその潜在性突然変異を除くことではなく、モチーフＡ及びモチーフＢを含むタンパク質または配列番号１から２０のアミノ酸配列を含むタンパク質もまた本出願の範囲内に属する。
本出願は、他の一つの態様として、本出願のプシコース−６−リン酸脱リン酸化酵素を暗号化する核酸を提供する。
本出願における用語『核酸』は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸において基本構成単位であるヌクレオチドは、天然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体も含むことができる（参照文献：Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３−５８４（１９９０））。
具体的に、本出願のプシコース−６−リン酸脱リン酸化酵素を暗号化する核酸は、モチーフＡ及びモチーフＢに翻訳され得るそれぞれのヌクレオチドを含む配列を含むことができ、具体例において、配列番号２１から４０のいずれか一つのヌクレオチド配列からなるものであってよく、より具体的に、本出願のモチーフＡ及びモチーフＢに翻訳され得るそれぞれのヌクレオチドと９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上または１００％の相同性、類似性または同一性を有するとともに、翻訳されて目的とする酵素活性を示すことができる核酸を含むことができる。具体的に、配列番号２１から４０の中でモチーフＡ及びモチーフＢに翻訳され得るそれぞれのヌクレオチドと９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上または１００％の相同性、類似性または同一性を有する核酸を含むことができ、これに加え、配列番号２１から４０の中でモチーフＡ及びモチーフＢ以外の部分に翻訳され得るヌクレオチドと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性、類似性または同一性を有する核酸であってよい。コドンの縮退性（ｃｏｄｏｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により、前記モチーフＡ及びモチーフＢを含むタンパク質、具体的に配列番号１から２０のいずれか一つのアミノ酸配列からなるタンパク質、またはこれと相同性、類似性または同一性を有するタンパク質に翻訳され得るポリヌクレオチドもまた本出願の範囲に含まれ得ることは自明である。
本出願のモチーフＡ及びモチーフＢを含む酵素は、耐熱性を有するか好熱性の菌株から由来された酵素であってよい。具体的に、配列番号１から２０のいずれか一つのアミノ酸配列からなる酵素は、それぞれロドサーマス・マリナス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）、サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）、メイオサーマス・ルバー（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）、ディクチオグロムス・ツルギダム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｕｒｇｉｄｕｍ）、ピロバクルム・フェリレデューセンス（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｆｅｒｒｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、サーモアナエロバクター・ウィエジェリイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ）、サームス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、サーモスルフィディバクター・タカイ（Ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｉｄｉｂａｃｔｅｒ ｔａｋａｉｉ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、アーキオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、メイオサーマス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ）、メイオサーマス・ルーファス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｆｕｓ）、メイオサーマス・タイワンエンシス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、メイオサーマス・クリアロファイルス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ）、またはメイオサーマス・セルベレウス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｒｂｅｒｅｕｓ）由来の酵素であってよい。
本出願における用語『相同性』または『同一性』は、二つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と係わる程度を意味し、百分率で表示されてよい。
『類似性』及び『同一性』の用語は、度々相互交換的に利用されてよい。
保存されている（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトギャップペナルティが共に利用されてよい。実質的に、相同性を有するか（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）、または同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般に配列全体または全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％に沿って中間の、若しくは高い厳しい条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリッドすることができる。ハイブリッドするポリヌクレオチドにおいて、コドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列が相同性、類似性または同一性を有するのか否かは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５］：２４４４でのようなデフォルトパラメータを利用し、『ＦＡＳＴＡ』プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定され得る。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ、Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）（バージョン５．０．０または以後のバージョン）で行われるところのような、ニードルマン・ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）が用いられて決定され得る（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．、ｅｔ ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ、［Ｓ．］［Ｆ．，］［ＥＴ ＡＬ、Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３（１９９０）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ、［ＥＤ．，］Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４、及び［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８）ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを利用して相同性、類似性または同一性を決定することができる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ（１９８１）２：４８２に公知の通り、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７０）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを利用して配列情報を比べることで決定され得る。要約すると、ＧＡＰプログラムは、二つの配列の中でより短いものでの記号の総数で、類似の配列された記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割算した値と定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）単項比較マトリックス（同一性のために１、そして非同一性のために０の値を含有する）及びＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ、ｅｄｓ．、Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ｐｐ．３５３−３５８（１９７９）によって開示されている通り、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ、及び各ギャップで各記号のための更なる０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのためのノーペナルティを含むことができる。よって、本願で用いられたものであって、『相同性』または『同一性』の用語は、配列同士の関連性（ｒｅｌｅｖａｎｃｅ）を表す。
本出願は、また他の態様として、本願に記載のプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素を暗号化する核酸を含むベクター、若しくは、本願のプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素を暗号化する核酸または本願のプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素を暗号化する核酸を含むベクターを含む形質転換体を提供する。
本出願における用語『ベクター』は、有機体、例えば、宿主細胞への塩基のクローニング及び／または転移のための任意の媒介物をいう。ベクターは、他のＤＮＡ断片が結合し、結合された断片の複製をもたらし得る複製単位（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）であってよい。ここで、『複製単位』とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、すなわち、自らの調節によって複製可能な、任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）をいう。『ベクター』の用語は、試験管内、生体外または生体内で有機体、例えば、宿主細胞へ塩基を取り込むためのウイルス及び非ウイルス媒介物を含む。『ベクター』の用語はまた、ミニサークルＤＮＡを含むことができる。具体的に、本出願のプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素を暗号化する核酸を含むベクターは、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｒｍａ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｔｌｅ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｂ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｄｔｕ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｓｉ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｆ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｔａ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｈ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｅ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｅ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｗｉ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔｈ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｌｉ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｇｓｔ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｔｈ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｓａｃ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔａ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｕ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｆｕ、またはｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａａｃであってよい。
本出願における用語『形質転換』は、標的タンパク質を暗号化する核酸を含むベクターを宿主細胞内に取り込み、宿主細胞内で前記核酸が暗号化するタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換された核酸は、宿主細胞内で発現さえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか染色体外に位置するかはともかく、これら全てを含むことができる。また、前記核酸は、標的タンパク質を暗号化するＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記核酸は、宿主細胞内に取り込まれて発現できるものであれば、如何なる形態で取り込まれるものであっても構わない。例えば、前記核酸は、自主的な発現に必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に取り込まれ得る。前記発現カセットは、通常、前記核酸に作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含むことができる。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクターの形態であってよい。また、前記核酸は、その自らの形態で宿主細胞に取り込まれ、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに限定されない。
さらに、前記における用語『作動可能に連結』されていることとは、本出願の目的タンパク質を暗号化する核酸の転写を開示及び媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
本願におけるアミノ酸は、下記の通りの略語またはアミノ酸名で表示されてよい：
Figure 0006973898
本出願のベクターを形質転換させる方法には、核酸を細胞内に取り込む如何なる方法も含まれ、宿主細胞に従い、当分野で公知のところのような好適な標準技術を選択して行うことができる。例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱、レトロウイルス感染（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、ミクロ注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、カチオン性リポソーム法、及び酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などがあるが、これらに制限されない。
前記宿主細胞には、ＤＮＡの取込み効率が高く、取り込まれたＤＮＡの発現効率が高い宿主を用いることがよく、例えば、コリネバクテリウム属微生物、エスケリキア属微生物またはセラチア属微生物であってよく、具体的に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってよいが、これらに制限されることではない。
本出願の形質転換体は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｒｍａ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１＿ＣＪ＿Ｒｍａ，ＫＣＣＭ１２０５７Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｔｌｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ２＿ＣＪ＿Ｔｌｅ，ＫＣＣＭ１２０５８Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｂ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ３＿ＣＪ＿Ｍｒｕｂ，ＫＣＣＭ１２０５９Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｄｔｕ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ４＿ＣＪ＿Ｄｔｕ，ＫＣＣＭ１２０６０Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ５＿ＣＪ＿Ｐｆｅ，ＫＣＣＭ１２０６１Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｗｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ６＿ＣＪ＿Ｔｗｉ，ＫＣＣＭ１２０６２Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔｈ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ７＿ＣＪ＿Ｔｔｈ，ＫＣＣＭ１２０６３Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ８＿ＣＪ＿Ｔｌｉ，ＫＣＣＭ１２０６４Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｇｓｔ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ９＿ＣＪ＿Ｇｓｔ，ＫＣＣＭ１２０６５Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｔｈ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１０＿ＣＪ＿Ａｔｈ，ＫＣＣＭ１２０６６Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｓａｃ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１１＿ＣＪ＿Ｓａｃ，ＫＣＣＭ１２０６７Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔａ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１２＿ＣＪ＿Ｔｔａ，ＫＣＣＭ１２０６８Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｕ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１３＿ＣＪ＿Ｐｆｕ，ＫＣＣＭ１２０６９Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｆｕ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１４＿ＣＪ＿Ａｆｕ，ＫＣＣＭ１２０７０Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａａｃ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１５＿ＣＪ＿Ａａｃ，ＫＣＣＭ１２０７１Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｓｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１６＿ＣＪ＿Ｍｓｉ，ＫＣＣＭ１２０７２Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｆ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１７＿ＣＪ＿Ｍｒｕｆ，ＫＣＣＭ１２０７３Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｔａ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１８＿ＣＪ＿Ｍｔａ，ＫＣＣＭ１２０７４Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｈ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１９＿ＣＪ＿Ｍｃｈ，ＫＣＣＭ１２０７５Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ２０＿ＣＪ＿Ｍｃｅ，ＫＣＣＭ１２０７６Ｐ）であってよい。
本出願は、また他の一つの態様として、イノシトール−モノ−ホスファターゼ、前記イノシトール−モノ−ホスファターゼを発現する微生物、または前記イノシトール−モノ−ホスファターゼを発現する微生物の培養物を含むプシコース生産用組成物を提供する。
本出願のイノシトール−モノ−ホスファターゼは、Ｘａ１−Ｘａ２−Ｘａ３−ＤＰＬＤＧ−Ｘａ４のモチーフＡと、Ｙａ１−Ｄ−Ｙａ２−Ｗａ１−Ｙａ３−Ｗａ２−Ｙａ４−Ｗａ３のモチーフＢとを含むイノシトール−モノ−ホスファターゼであってよく、前記モチーフＡで、Ｘａ１は、Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｉ、またはＡであり、Ｘａ２は、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ａ、または無しであり、Ｘａ３は、Ｖ、Ｉ、またはＬであり、Ｘａ４は、ＴまたはＳであり、前記モチーフＢで、Ｙａ１は、Ｗ、Ｙ、Ｔ、Ｌ、またはＶであり、Ｙａ２は、Ｖ、Ｉ、Ｃ、Ｆ、またはＡであり、Ｗａ１は、ＡＡＧ、ＡＡＳ、ＳＡＧ、ＡＰＧ、ＡＰＦ、ＡＧＧ、ＡＰＬ、またはＡＧＡであり、Ｙａ３は、Ｗ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、Ｖ、Ｙ、Ｆ、Ｒ、Ｌ、Ｔ、またはＳであり、Ｗａ２は、ＬＬＶ、ＬＩＶ、ＬＬＩ、ＬＩＩ、ＩＬＩ、ＦＩＡ、ＡＬＶ、ＩＩＡ、ＶＬＶ、ＶＩＬ、ＴＩＧ、ＮＦＣ、またはＰＩＦであり、Ｙａ４は、Ｅ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｋ、またはＰであり、Ｗａ３は、ＥＡＧＧ、ＥＧＧＧ、ＥＡＫＧ、ＫＡＧＧ、ＡＡＧＧ、ＹＶＤＧ、ＥＡＧＡ、またはＲＬＧＶである。すなわち、本出願におけるイノシトール−モノ−ホスファターゼはプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素と互換して用いられてよく、そのため、プシコース−６−リン酸脱リン酸酵素に対する前述の説明はイノシトール−モノ−ホスファターゼに適用されてよい。具体例において、イノシトール−モノ−ホスファターゼは、配列番号１から２０のいずれか一つのアミノ酸配列からなる酵素であってよい。
本出願のプシコース生産用組成物は、本出願のプシコースの製造経路（図１参照）に関与する酵素及び／または基質［（ｉ）澱粉、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせ；（ｉｉ）ホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；（ｉｉｉ）果糖−６−リン酸−３−エピマー化酵素；（ｉｖ）ブドウ糖−６−リン酸−異性化酵素；（ｖ）ホスホグルコムターゼまたはブドウ糖リン酸化酵素；及び／または（ｖｉ）α−グルカンホスホリラーゼ、澱粉ホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼまたはスクラーゼ］；前記プシコースの製造経路に関与する酵素を発現する微生物；または、前記プシコースの製造経路に関与する酵素を発現する微生物の培養物をさらに含むことができる。ただし、これは例示的なものであって、本出願のプシコース−６−リン酸脱リン酸化酵素を利用してプシコースを生産することができれば、本出願のプシコース生産用組成物に含まれる酵素、及びプシコースの生産に利用される基質が制限されない。
本出願の澱粉／マルトデキストリンホスホリラーゼ（ｓｔａｒｃｈ／ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ、ＥＣ ２．４．１．１）及びα−グルカンホスホリラーゼは、ホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をブドウ糖にリン酸化転移させて澱粉またはマルトデキストリンからブドウ糖−１−リン酸を生産する活性を有するタンパク質であれば、如何なるタンパク質も含むことができる。具体的に、前記澱粉またはマルトデキストリンからブドウ糖−１−リン酸を生産する活性を有するタンパク質は、配列番号５９のアミノ酸配列からなるタンパク質であってよい。また、前記澱粉またはマルトデキストリンからブドウ糖−１−リン酸を生産する活性を有するタンパク質は、配列番号６０の塩基配列によって暗号化されてよい。
本出願のスクロースホスホリラーゼ（ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ、ＥＣ ２．４．１．７）は、ホスフェートをブドウ糖にリン酸化転移させてスクロースからブドウ糖−１−リン酸を生産する活性を有するタンパク質であれば、如何なるタンパク質も含むことができる。
本出願の澱粉液糖化酵素であるα−アミラーゼ（α−ａｍｙｌａｓｅ、ＥＣ ３．２．１．１）、プルラナーゼ（ｐｕｌｌｕｌａｎｓｅ、ＥＣ ３．２．１．４１）、グルコアミラーゼ（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ、ＥＣ ３．２．１．３）及びイソアミラーゼ（ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ）は、澱粉またはマルトデキストリンをブドウ糖に転換させる活性を有するタンパク質であれば、如何なるタンパク質も含むことができる。
本出願のスクラーゼ（ｓｕｃｒａｓｅ、ＥＣ ３．２．１．２６）は、スクロースをブドウ糖に転換させる活性を有するタンパク質であれば、如何なるタンパク質も含むことができる。
本出願のホスホグルコムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ、ＥＣ ５．４．２．２）は、ブドウ糖−１−リン酸をブドウ糖−６−リン酸に転換させる活性を有するタンパク質であれば、如何なるタンパク質も含むことができる。具体的に、前記ブドウ糖−１−リン酸をブドウ糖−６−リン酸に転換させる活性を有するタンパク質は、配列番号６１のアミノ酸配列からなるタンパク質であってよい。また、前記ブドウ糖−１−リン酸をブドウ糖−６−リン酸に転換させる活性を有するタンパク質は、配列番号６２の塩基配列によって暗号化されてよい。
ブドウ糖リン酸化酵素（ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ）は、ブドウ糖にリン酸を転移させてブドウ糖−６−リン酸に転換する活性を有するタンパク質であれば、如何なるタンパク質も含むことができる。具体的に、前記ブドウ糖リン酸化酵素は、ポリホスフェート依存型ブドウ糖リン酸化酵素であってよく、より具体的に、配列番号７７または７８のアミノ酸配列からなるタンパク質であってよい。本出願のブドウ糖−６−リン酸−異性化酵素は、ブドウ糖−６−リン酸を果糖−６−リン酸に転換させる活性を有するタンパク質であれば、如何なるタンパク質も含むことができる。具体的に、前記ブドウ糖−６−リン酸−異性化酵素は、配列番号６３のアミノ酸配列からなるタンパク質であってよい。また、前記ブドウ糖−６−リン酸−異性化酵素は、配列番号６４の塩基配列によって暗号化されてよい。
本出願の果糖−６−リン酸−３−エピマー化酵素は、果糖−６−リン酸をプシコース−６−リン酸に転換させる活性を有するタンパク質であれば、如何なるタンパク質も含むことができる。具体的に、本出願の果糖−６−リン酸−３−エピマー化酵素は、配列番号６５のアミノ酸配列からなるタンパク質であってよい。また、本出願の果糖−６−リン酸−３−エピマー化酵素は、配列番号６６のヌクレオチド配列によって暗号化されてよい。
本出願のプシコース生産用組成物は、ブドウ糖を澱粉、マルトデキストリンまたはスクロースに転換させる活性を有するタンパク質（例えば、４−α−グルカノトランスフェラーゼなど）をさらに含むことができる。前記ブドウ糖を澱粉、マルトデキストリンまたはスクロースに転換させる活性を有するタンパク質は、配列番号６７のアミノ酸配列からなる酵素であってよく、具体的に、配列番号６８のヌクレオチド配列によって暗号化されてよい。本願のプシコース生産用組成物は、当該プシコース生産用組成物に通常用いられる任意の好適な賦形剤をさらに含むことができる。このような賦形剤には、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤及び等張剤などが含まれてよいが、これらに限定されることではない。
本願のプシコース生産用組成物は、金属イオンまたは金属塩をさらに含むことができる。一具現例において、前記金属イオンは２価の陽イオンであってよく、具体的に、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｍｇ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｆｅ及びＺｎからなる群より選択される１種以上の金属イオンであってよい。より具体的に、本出願のプシコース生産用組成物は金属塩をさらに含んでよく、さらに具体的に、前記金属塩は、ＮｉＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＮｉＣｌ２、ＣｏＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＦｅＳＯ４及びＺｎＳＯ４からなる群より選択される１種以上であってよい。
本出願は、また他の一つの態様として、プシコース−６−リン酸にイノシトール−モノ−ホスファターゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を接触させて前記プシコース−６−リン酸をプシコースに転換するステップを含むプシコースの製造方法を提供する。
本出願の製造方法において、イノシトール−モノ−ホスファターゼは、Ｘａ１−Ｘａ２−Ｘａ３−ＤＰＬＤＧ−Ｘａ４のモチーフＡと、Ｙａ１−Ｄ−Ｙａ２−Ｗａ１−Ｙａ３−Ｗａ２−Ｙａ４−Ｗａ３のモチーフＢとを含むイノシトール−モノ−ホスファターゼであってよい。本出願において、イノシトール−モノ−ホスファターゼはプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素と互換して用いられてよく、そのため、プシコース−６−リン酸脱リン酸酵素に対する前述の態様における説明はイノシトール−モノ−ホスファターゼに適用されてよい。
本出願の方法は、プシコース−６−リン酸をプシコースに転換するステップ以前に、果糖−６−リン酸（ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に果糖−６−リン酸−３−エピマー化酵素、前記果糖−６−リン酸−３−エピマー化酵素を発現する微生物または前記果糖−６−リン酸−３−エピマー化酵素を発現する微生物の培養物を接触させ、前記果糖−６−リン酸をプシコース−６−リン酸に転換するステップをさらに含むことができる。
本出願の方法は、前記果糖−６−リン酸をプシコース−６−リン酸に転換するステップ以前に、ブドウ糖−６−リン酸（Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）にブドウ糖−６−リン酸−異性化酵素、前記ブドウ糖−６−リン酸−異性化酵素を発現する微生物または前記ブドウ糖−６−リン酸−異性化酵素を発現する微生物の培養物を接触させ、前記ブドウ糖−６−リン酸を果糖−６−リン酸に転換するステップをさらに含むことができる。
本出願の方法は、前記ブドウ糖−６−リン酸を果糖−６−リン酸に転換するステップ以前に、ブドウ糖−１−リン酸（Ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）にホスホグルコムターゼ、前記ホスホグルコムターゼを発現する微生物または前記ホスホグルコムターゼを発現する微生物の培養物を接触させ、前記ブドウ糖−１−リン酸をブドウ糖−６−リン酸に転換するステップをさらに含むことができる。
本出願の方法は、前記ブドウ糖−６−リン酸を果糖−６−リン酸に転換するステップ以前に、ブドウ糖（Ｇｌｕｃｏｓｅ）にブドウ糖リン酸化酵素、前記ブドウ糖リン酸化酵素を発現する微生物または前記ブドウ糖リン酸化酵素を発現する微生物の培養物、及びホスフェートを接触させ、前記ブドウ糖をブドウ糖−６−リン酸に転換するステップをさらに含むことができる。
本出願の方法は、前記ブドウ糖−１−リン酸をブドウ糖−６−リン酸に転換するステップ以前に、澱粉、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせに、α−グルカンホスホリラーゼ、澱粉ホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼまたはスクロースホスホリラーゼ；前記ホスホリラーゼを発現する微生物；または前記ホスホリラーゼを発現する微生物の培養物、及びホスフェートを接触させ、前記澱粉、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせをブドウ糖−１−リン酸に転換するステップをさらに含むことができる。
本出願の方法は、前記ブドウ糖をブドウ糖−６−リン酸に転換するステップ以前に、澱粉、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせに、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼまたはイソアミラーゼ；前記α−アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼまたはイソアミラーゼを発現する微生物；または前記α−アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼまたはイソアミラーゼを発現する微生物の培養物を接触させ、前記澱粉、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせをブドウ糖に転換するステップをさらに含むことができる。
本出願は、また他の一態様として、澱粉、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせ、及びホスフェートに、（ａ）イノシトール−モノ−ホスファターゼ；果糖−６−リン酸−３−エピマー化酵素；ブドウ糖−６−リン酸−異性化酵素；ホスホグルコムターゼまたはブドウ糖リン酸化酵素；及びα−グルカンホスホリラーゼ、澱粉ホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼまたはスクラーゼ；または（ｂ）前記項目（ａ）の酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物を接触させるステップを含む、プシコースの製造方法を提供する。
本出願の製造方法において、本出願の接触は、ｐＨ ５．０から９．０、具体的にｐＨ ６．０から８．０で実施することができる。
本出願の製造方法において、本出願の接触は、４０℃から８０℃の温度、具体的に４０℃から６０℃または５０℃から６０℃の温度で実施することができる。
本出願の製造方法において、本出願の接触は、２時間から２４時間、具体的に６時間から２４時間実施することができる。
本出願の製造方法において、本出願の接触は、ｐＨ ５．０から９．０、４０℃から８０℃の温度で、及び／または２時間から２４時間実施することができる。具体的に、前記接触は、ｐＨ ６．０から８．０、４０℃から６０℃または５０℃から６０℃の温度で、及び／または６時間から２４時間実施することができる。
本出願の製造方法は、プシコースを精製するステップをさらに含むことができる。本出願の精製は特に制限されることなく、本出願の技術分野で通常用いる方法を用いることができる。非制限的な例として、クロマトグラフィー、分別晶析及びイオン精製などが挙げられる。前記精製方法は、一つだけ実施されてもよく、二つ以上の方法を共に実施してもよい。例えば、クロマトグラフィーを介してプシコース生成反応物を精製してよく、前記クロマトグラフィーによる糖の分離は、分離を望む糖とイオン樹脂に付着された金属イオンとの間の弱い結合力の差異を利用して行われてよい。
また、本出願は、本出願の精製するステップの前または後に脱色、脱塩、または両方を実施することをさらに含むことができる。前記脱色及び／または脱塩を実施することにより、不純物がなく、より精製されたプシコース反応物を得ることができる。
本出願の新規のプシコース−６−リン酸脱リン酸化酵素であるイノシトール−モノ−ホスファターゼには耐熱性があるため、プシコース−６−リン酸をプシコースに転換する経路を産業的に行うことができ、経済的な原料であるブドウ糖または澱粉（例えば、マルトデキストリン）を用いてプシコースの合成経路への進行を可能とし、不可逆反応経路であるプシコース−６−リン酸脱リン酸化反応によってプシコースの生産を可能とするので、プシコースへの転換率を著しく高めることができる。
また、本出願のイノシトール−モノ−ホスファターゼを利用したプシコースの製造方法は、プシコースへの転換率の上昇によって反応結果物が高濃度のプシコースを含むため、分離精製の工程を単純化または除去することができることから、製造方法が簡単であり、かつ経済的であるという利点がある。
澱粉（例えば、マルトデキストリン）またはブドウ糖からプシコースを製造することができる酵素反応経路の一模式図である。 本出願の精製された組換酵素（ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｒｍａ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｔｌｅ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｂ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｄｔｕ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｅ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｗｉ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔｈ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｌｉ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｇｓｔ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｔｈ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｓａｃ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔａ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｕ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｆｕ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａａｃ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｓｉ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｆ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｔａ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｈ及びｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｅ）の分子量をタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析した結果である。Ｍは、タンパク質のサイズ測定マーカー（ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ）、Ｓは、発現された補酵素、Ｅは、それぞれの酵素を表す。 本出願の精製された組換酵素（ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｒｍａ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｔｌｅ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｂ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｄｔｕ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｅ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｗｉ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔｈ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｌｉ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｇｓｔ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｔｈ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｓａｃ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔａ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｕ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｆｕ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａａｃ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｓｉ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｆ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｔａ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｈ及びｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｅ）の分子量をタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析した結果である。Ｍは、タンパク質のサイズ測定マーカー（ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ）、Ｓは、発現された補酵素、Ｅは、それぞれの酵素を表す。 本出願の精製された組換酵素（ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｒｍａ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｔｌｅ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｂ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｄｔｕ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｅ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｗｉ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔｈ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｌｉ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｇｓｔ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｔｈ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｓａｃ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔａ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｕ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｆｕ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａａｃ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｓｉ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｆ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｔａ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｈ及びｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｅ）の分子量をタンパク質電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析した結果である。Ｍは、タンパク質のサイズ測定マーカー（ｓｉｚｅ ｍａｒｋｅｒ）、Ｓは、発現された補酵素、Ｅは、それぞれの酵素を表す。 本出願のイノシトール−モノ−ホスファターゼ（ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｒｍａ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｔｌｅ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｂ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｄｔｕ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｅ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｗｉ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔｈ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｌｉ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｇｓｔ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｔｈ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｓａｃ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔａ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｕ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｆｕ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａａｃ）のプシコース脱リン酸の相対活性（％、左側Ｙ軸、棒グラフ）と、ブドウ糖−６−リン酸、ブドウ糖−１−リン酸、果糖−６−リン酸及びプシコース−６−リン酸脱リン酸混合液におけるプシコースの選択的脱リン酸率（％、右側Ｙ軸、四角ドット）とを示した結果である。 本出願のイノシトール−モノ−ホスファターゼ（ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｂ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｓｉ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｆ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｔａ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｈ、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｅ）のプシコース脱リン酸の相対活性（％）を比較した結果である。 α−グルカンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、ブドウ糖−６−リン酸−異性化酵素、４−α−グルカノトランスフェラーゼ、果糖−６−リン酸−３−エピマー化酵素及びプシコース−６−リン酸脱リン酸化酵素が添加された複合酵素反応を利用してマルトデキストリンからプシコースが生成されることを確認したＨＰＬＣクロマトグラフィー結果である。 本出願のイノシトール−モノ−ホスファターゼがブドウ糖−１−リン酸、ブドウ糖−６−リン酸、果糖−６リン酸及びプシコース−６−リン酸が混在された複合反応液でも、プシコース−６−リン酸を選択的に脱リン酸化してプシコースを生成することを確認したＨＰＬＣクロマトグラフィー結果である。
以下、実施例を挙げて本出願を詳しく説明する。ただし、これは本出願の理解を深めるためのものに過ぎず、本出願の範囲がこれらに限定されることではない。
実施例
実施例１：イノシトール−モノ−ホスファターゼの組換発現ベクター及び形質転換微生物の製造
本出願のプシコースの製造経路に必要なプシコース−６−リン酸脱リン酸化酵素を提供するため、耐熱性のイノシトール−モノ−ホスファターゼ遺伝子を選抜した。具体的に、Ｇｅｎｂａｎｋに登録されているロドサーマス・マリナス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）、サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）、メイオサーマス・ルバー（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）、ディクチオグロムス・ツルギダム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｕｒｇｉｄｕｍ）、ピロバクルム・フェリレデューセンス（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｆｅｒｒｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、サーモアナエロバクター・ウィエジェリイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ）、サームス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、サーモスルフィディバクター・タカイ（Ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｉｄｉｂａｃｔｅｒ ｔａｋａｉｉ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、アーキオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、メイオサーマス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ）、メイオサーマス・ルーファス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｆｕｓ）、メイオサーマス・タイワンエンシス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、メイオサーマス・クリアロファイルス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ）、メイオサーマス・セルベレウス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｒｂｅｒｅｕｓ）誘電体配列を対象に、イノシトール−モノ−ホスファターゼ遺伝子（Ｒｍａ、Ｔｌｅ、Ｍｒｕｂ、Ｄｔｕ、Ｍｓｉ、Ｍｒｕｆ、Ｍｔａ、Ｍｃｈ及びＭｃｅ）を選抜した。
前記選抜した遺伝子の塩基配列［前記遺伝子の順にそれぞれ配列番号２１、２２、２３、２４、３６、３７、３８、３９、４０］とアミノ酸配列［前記遺伝子の順にそれぞれ配列番号１、２、３、４、１６、１７、１８、１９ないし２０］情報に基づき、正方向プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、配列番号４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７）及び逆方向プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ、配列番号４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８）を考案した。合成されたプライマーを利用し、各ロドサーマス・マリナス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）、サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）、メイオサーマス・ルバー（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）、ディクチオグロムス・ツルギダム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｕｒｇｉｄｕｍ）、メイオサーマス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ）、メイオサーマス・ルーファス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｆｕｓ）、メイオサーマス・タイワンエンシス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、メイオサーマス・クリアロファイルス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ）、メイオサーマス・セルベレウス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｒｂｅｒｅｕｓ）の染色体ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）からそれぞれの遺伝子を重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、増幅されたそれぞれのイノシトール−モノ−ホスファターゼを、制限酵素Ｎｄｅ Ｉ及びＸｈｏ ＩまたはＳａｌ Ｉを用いて大腸菌発現用プラスミドベクターｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入することで、それぞれｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｒｍａ（Ｎｄｅ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉ）、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｔｌｅ（Ｎｄｅ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉ）、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｂ（Ｎｄｅ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉ）、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｄｔｕ（Ｎｄｅ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉ）、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｓｉ（Ｎｄｅ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ）、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｆ（Ｎｄｅ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ）、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｔａ（Ｎｄｅ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ）、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｈ（Ｎｄｅ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ）、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｅ（Ｎｄｅ Ｉ／Ｓａｌ Ｉ）と命名された組換発現ベクターを作製した。
さらにピロバクルム・フェリレデューセンス（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ｆｅｒｒｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、サーモアナエロバクター・ウィエジェリイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ）、サームス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、アナエロリネア・サーモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、サーモスルフィディバクター・タカイ（Ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｉｄｉｂａｃｔｅｒ ｔａｋａｉｉ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、アーキオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）由来のイノシトール−モノホスファターゼ遺伝子（Ｐｆｅ、Ｔｗｉ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｇｓｔ、Ａｔｈ、Ｓａｃ、Ｔｔａ、Ｐｆｕ、Ａｆｕ、Ａａｃ）を選抜し、前記遺伝子の各塩基配列［前記遺伝子の順にそれぞれ配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５］とアミノ酸配列［前記遺伝子の順にそれぞれ配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５］情報に基づいてＤＮＡの合成を依頼し（バイオニア社）、ベクターｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ（バイオニア社製）に挿入した、それぞれｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｅ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｗｉ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔｈ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｌｉ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｇｓｔ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｔｈ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｓａｃ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔａ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｕ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｆｕ、ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａａｃと命名された組換発現ベクターを作製した。
前記発現ベクターは、通常の形質転換方法［参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９］で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株にそれぞれ形質転換することで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｒｍａ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１＿ＣＪ＿Ｒｍａ、ＫＣＣＭ１２０５７Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｔｌｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ２＿ＣＪ＿Ｔｌｅ、ＫＣＣＭ１２０５８Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｂ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ３＿ＣＪ＿Ｍｒｕｂ、ＫＣＣＭ１２０５９Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｄｔｕ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ４＿ＣＪ＿Ｄｔｕ、ＫＣＣＭ１２０６０Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ５＿ＣＪ＿Ｐｆｅ、ＫＣＣＭ１２０６１Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｗｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ６＿ＣＪ＿Ｔｗｉ、ＫＣＣＭ１２０６２Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔｈ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ７＿ＣＪ＿Ｔｔｈ、ＫＣＣＭ１２０６３Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ８＿ＣＪ＿Ｔｌｉ、ＫＣＣＭ１２０６４Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｇｓｔ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ９＿ＣＪ＿Ｇｓｔ、ＫＣＣＭ１２０６５Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｔｈ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１０＿ＣＪ＿Ａｔｈ、ＫＣＣＭ１２０６６Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｓａｃ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１１＿ＣＪ＿Ｓａｃ、ＫＣＣＭ１２０６７Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔａ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１２＿ＣＪ＿Ｔｔａ、ＫＣＣＭ１２０６８Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｕ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１３＿ＣＪ＿Ｐｆｕ、ＫＣＣＭ１２０６９Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｆｕ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１４＿ＣＪ＿Ａｆｕ、ＫＣＣＭ１２０７０Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａａｃ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１５＿ＣＪ＿Ａａｃ、ＫＣＣＭ１２０７１Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｓｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１６＿ＣＪ＿Ｍｓｉ、ＫＣＣＭ１２０７２Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｆ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１７＿ＣＪ＿Ｍｒｕｆ、ＫＣＣＭ１２０７３Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｔａ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１８＿ＣＪ＿Ｍｔａ、ＫＣＣＭ１２０７４Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｈ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１９＿ＣＪ＿Ｍｃｈ、ＫＣＣＭ１２０７５Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ２０＿ＣＪ＿Ｍｃｅ、ＫＣＣＭ１２０７６Ｐ）と命名された形質転換微生物を製造した。
前記形質転換菌株をブダペスト条約下で２０１７年７月１０日付で韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１２０５７ＰからＫＣＣＭ１２０７６Ｐが付与された。
実施例２：プシコースの製造経路に必要な酵素の製造
サーモトガ・ネアポリタナ由来の本出願のプシコースの製造経路に必要な耐熱性酵素であるα−グルカンホスホリラーゼ（α−ｇｌｕｃａｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、ホスホグルコムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ）、ブドウ糖−６−リン酸−異性化酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）及び果糖−６−リン酸−３−エピマー化酵素（ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−３−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）を提供するため、前記酵素に予想される遺伝子（前記酵素の記載の順にそれぞれｃｔ１、ｃｔ２、ｔｎ１及びｆｐ３ｅ）を選抜した。
前記選抜した遺伝子の塩基配列［前記酵素の記載の順にそれぞれ配列番号６０、６２、６４及び６６］及びアミノ酸配列［前記酵素の記載の順にそれぞれ配列番号５９、６１、６３及び６５］に基づき、正方向プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、配列番号６９、７１、７３及び７５）及び逆方向プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ、配列番号７０、７２、７４及び７６）を考案して合成した。これを利用し、サーモトガ・ネアポリタナの染色体ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を鋳型に、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）によって９５℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、及び６８℃で２分間重合しており、前記反応は２５回繰り返した条件を用いて各酵素の遺伝子を増幅した。増幅された各酵素遺伝子は、制限酵素Ｎｄｅ Ｉ及びＸｈｏ Ｉを用いて大腸菌発現用プラスミドベクターｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入することで、それぞれｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿ｃｔ１、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿ｃｔ２、ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿ｔｎ１及びｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿ｆｐ３ｅと命名された組換発現ベクターを作製した。前記組換発現ベクターを通常の形質転換方法（参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９）で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換して形質転換された微生物を製造し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿ｃｔ１（ＫＣＣＭ１１９９０Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿ｃｔ２（ＫＣＣＭ１１９９１Ｐ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿ｔｎ１（ＫＣＣＭ１１９９２Ｐ）及びＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ｔｎ＿ｆｐ３ｅ（ＫＣＣＭ１１８４８Ｐ）と命名した。菌株は、ブダペスト条約下で２０１６年６月２３日付で韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に寄託して寄託番号が付与された。
実施例３：組換酵素の製造
組換酵素を製造するため、実施例１及び２で製造した各形質転換微生物を、ＬＢ液体培地５ｍｌを含む培養チューブに接種し、６００ｎｍで吸光度が２．０になるまで３７℃の振盪培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液を、ＬＢ液体培地を含む培養フラスコに接種して本培養を進めた。６００ｎｍでの吸光度が２．０になるまで１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して組換酵素の発現生産を誘導した。前記培養過程中の撹拌速度は１８０ｒｐｍであり、培養温度は３７℃に維持されるようにした。培養液は、８，０００×ｇ及び４℃で２０分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）緩衝溶液で２回洗浄し、同一の緩衝溶液で懸濁した後、超音波ホモジナイザーを利用して細胞を破砕した。細胞破砕物は、１３，０００×ｇ及び４℃で２０分間遠心分離した後、上澄液のみを取った。前記上澄液からＨｉｓ−ｔａｇ親和クロマトグラフィーを用いて組換酵素を精製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）緩衝溶液で透析した後、反応に用いた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を介して分子量を確認しており、各形質転換微生物により製造した精製された酵素名及び分子量（図２ａから図２ｃ）は下記の通りである：
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｒｍａ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１＿ＣＪ＿Ｒｍａ）から製造された酵素（ＲＭＡと記載）は３０．３ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｔｌｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ２＿ＣＪ＿Ｔｌｅ）から製造された酵素（ＴＬＥと記載）は２８．５ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｂ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ３＿ＣＪ＿Ｍｒｕｂ）から製造された酵素（ＭＲＵＢと記載）は２８ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｄｔｕ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ４＿ＣＪ＿Ｄｔｕ）から製造された酵素（ＤＴＵと記載）は３０．２ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ５＿ＣＪ＿Ｐｆｅ）から製造された酵素（ＰＦＥと記載）は２７．２ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｗｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ６＿ＣＪ＿Ｔｗｉ）から製造された酵素（ＴＷＩと記載）は２８．８ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔｈ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ７＿ＣＪ＿Ｔｔｈ）から製造された酵素（ＴＴＨと記載）は２８．６ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ８＿ＣＪ＿Ｔｌｉ）から製造された酵素（ＴＬＩと記載）は２８ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｇｓｔ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ９＿ＣＪ＿Ｇｓｔ）から製造された酵素（ＧＳＴと記載）は２９．６ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｔｈ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１０＿ＣＪ＿Ａｔｈ）から製造された酵素（ＡＴＨと記載）は２８．７ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｓａｃ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１１＿ＣＪ＿Ｓａｃ）から製造された酵素（ＳＡＣと記載）は２９．９ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｔｔａ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１２＿ＣＪ＿Ｔｔａ）から製造された酵素（ＴＴＡと記載）は２８．６ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ｐｆｕ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１３＿ＣＪ＿Ｐｆｕ）から製造された酵素（ＰＦＵと記載）は２７．９ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａｆｕ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１４＿ＣＪ＿Ａｆｕ）から製造された酵素（ＡＦＵと記載）は２８ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＢＴ７−Ｃ−Ｈｉｓ−ＣＪ＿Ａａｃ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１５＿ＣＪ＿Ａａｃ）から製造された酵素（ＡＡＣと記載）は２９ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｓｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１６＿ＣＪ＿Ｍｓｉ）から製造された酵素（ＭＳＩと記載）は２８．１ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｒｕｆ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１７＿ＣＪ＿Ｍｒｕｆ）から製造された酵素（ＭＲＵＦと記載）は２８ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｔａ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１８＿ＣＪ＿Ｍｔａ）から製造された酵素（ＭＴＡと記載）は２８．１ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｈ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ１９＿ＣＪ＿Ｍｃｈ）から製造された酵素（ＭＣＨと記載）は２８．４ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿Ｍｃｅ（Ｅ．ｃｏｌｉ＿Ｐ２０＿ＣＪ＿Ｍｃｅ）から製造された酵素（ＭＣＥと記載）は２８．１ｋＤａ、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿ｃｔ１（ＫＣＣＭ１１９９０Ｐ）から製造された酵素（ＣＴ１と記載）、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿ｃｔ２（ＫＣＣＭ１１９９１Ｐ）から製造された酵素（ＣＴ２と記載）、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＣＪ＿ｔｎ１（ＫＣＣＭ１１９９２Ｐ）から製造された酵素（ＴＮ１と記載）、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＣＪ＿ｔｎ＿ｆｐ３ｅ（ＫＣＣＭ１１８４８Ｐ）から製造された酵素（ＦＰ３Ｅと記載）。
実施例４：イノシトール−モノ−ホスファターゼの活性の分析
４−１．プシコース−６−リン酸脱リン酸酵素の活性の分析
プシコース−６−リン酸の購入が困難なので、果糖−６−リン酸からプシコース−６−リン酸を製造した後、イノシトール−モノ−ホスファターゼによるプシコースの生産活性を確認した。
具体的に、５０ｍＭの果糖−６−リン酸を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．０）緩衝溶液に懸濁した後、実施例３で製造した果糖−６−リン酸−３−エピマー化酵素（以下、ＦＰ３Ｅ）及びイノシトール−モノ−ホスファターゼ２０種をそれぞれ０．１ｕｎｉｔ／ｍｌ添加し、７０℃で１時間反応させた。ＨＰＬＣを利用してプシコースの生成可否を分析しており、ＨＰＬＣ分析は、ＳＰ＿０８１０（Ｓｈｏｄｅｘ社製）カラムとＡｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｃ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社製）カラムを用いて８０℃、移動相で０．６ｍｌ／ｍｉｎの流速で流しながら行い、示差屈折率検出器（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、ＲＩＤ）で検出した。
その結果、２０種の全てのイノシトール−モノ−ホスファターゼからプシコース−６−リン酸の脱リン酸力価を確認した（図３ａ及び図３ｂ）。
４−２．プシコース−６−リン酸特異的脱リン酸化活性の分析
ブドウ糖−６−リン酸、ブドウ糖−１−リン酸、果糖−６−リン酸及びプシコース−６−リン酸の混合液から各イノシトール−モノ−ホスファターゼのプシコース−６−リン酸特異的脱リン酸化率を測定した。
具体的に、０．１ｕｎｉｔ／ｍｌのそれぞれのイノシトール−モノ−ホスファターゼ及び５ｍＭのＭｇＣｌ２を１％（ｗ／ｖ）のブドウ糖−６−リン酸、ブドウ糖−１−リン酸、果糖−６−リン酸及びプシコース−６−リン酸の混合液に添加して５０℃で１２時間反応させた後、ＨＰＬＣを利用して反応物を分析した。ＨＰＬＣ分析は、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｃ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社製）カラムを用いて８０℃、移動相で０．６ｍｌ／ｍｉｎの流速で流しながら行い、生成されたプシコース及びその他の糖（果糖及びブドウ糖）を示差屈折率検出器で検出した。
その結果、ＭＲＵＢ酵素のプシコース−６−リン酸特異的脱リン酸化率が最も高いことを確認した（図３ａ）。
実施例５：複合酵素反応によるプシコースの生産活性の分析
マルトデキストリンからプシコースを生産するため、ＣＴ１、ＣＴ２、ＴＮ１、ＦＰ３Ｅ及びＭＲＵＢ酵素を同時に反応させた。各酵素は０．１ｕｎｉｔ／ｍｌを用いており、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐＨ ７．０）に５％（ｗ／ｖ）のマルトデキストリンを添加して５０℃の温度で１２時間反応させた後、ＨＰＬＣを利用して反応結果物からプシコースを分析した。ＨＰＬＣ分析は、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｃ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社製）カラムを用いて８０℃、移動相で０．６ｍｌ／ｍｉｎの流速で流しながら行い、示差屈折率検出器で検出した。
その結果、複合酵素反応によってマルトデキストリンからプシコースが生成されることを確認した（図４ａ）。
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者は、本出願が、その技術的思想や必須の特徴を変更しなくとも、他の具体的な形態に実施され得るということが理解できるだろう。これに関し、以上で記述した実施例は全ての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価の概念から導き出される全ての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されなければならない。
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Claims (13)

  1. イノシトール−モノ−ホスファターゼ（ｉｎｏｓｉｔｏｌ−ｍｏｎｏ−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を含むプシコース生産用組成物。
  2. 前記イノシトール−モノ−ホスファターゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０のアミノ酸配列を有するプシコース−６−リン酸脱リン酸化酵素である、請求項１に記載のプシコース生産用組成物。
  3. 前記プシコース生産用組成物は、（ａ）（ｉ）澱粉、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせ；（ｉｉ）ホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；（ｉｉｉ）果糖−６−リン酸−３−エピマー化酵素；（ｉｖ）ブドウ糖−６−リン酸−異性化酵素；（ｖ）ホスホグルコムターゼまたはブドウ糖リン酸化酵素；及び（ｖｉ）α−グルカンホスホリラーゼ、澱粉ホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼまたはスクラーゼ；または、（ｂ）前記項目（ａ）の酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物をさらに含む、請求項２に記載のプシコース生産用組成物。
  4. プシコース−６−リン酸に、イノシトール−モノ−ホスファターゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を接触させることで、前記プシコース−６−リン酸をプシコースに転換するステップを含むプシコースの製造方法。
  5. 前記イノシトール−モノ−ホスファターゼは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０のアミノ酸配列を有するプシコース−６−リン酸脱リン酸化酵素である、請求項４に記載のプシコースの製造方法。
  6. 前記方法は、プシコース−６−リン酸をプシコースに転換するステップ以前に、果糖−６−リン酸（ｆｒｕｃｔｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に果糖−６−リン酸−３−エピマー化酵素、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を接触させ、前記果糖−６−リン酸をプシコース−６−リン酸に転換するステップをさらに含む、請求項４に記載のプシコースの製造方法。
  7. 前記方法は、前記果糖−６−リン酸をプシコース−６−リン酸に転換するステップ以前に、ブドウ糖−６−リン酸（Ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）にブドウ糖−６−リン酸−異性化酵素、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を接触させ、前記ブドウ糖−６−リン酸を果糖−６−リン酸に転換するステップをさらに含む、請求項６に記載のプシコースの製造方法。
  8. 前記方法は、前記ブドウ糖−６−リン酸を果糖−６−リン酸に転換するステップ以前に、ブドウ糖−１−リン酸（Ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）にホスホグルコムターゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を接触させ、前記ブドウ糖−１−リン酸をブドウ糖−６−リン酸に転換するステップをさらに含む、請求項７に記載のプシコースの製造方法。
  9. 前記方法は、前記ブドウ糖−６−リン酸を果糖−６−リン酸に転換するステップ以前に、ブドウ糖（Ｇｌｕｃｏｓｅ）にブドウ糖リン酸化酵素、これを発現する微生物または前記微生物の培養物、及びホスフェートを接触させ、前記ブドウ糖をブドウ糖−６−リン酸に転換するステップをさらに含む、請求項７に記載のプシコースの製造方法。
  10. 前記方法は、前記ブドウ糖−１−リン酸をブドウ糖−６−リン酸に転換するステップ以前に、澱粉、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせに、α−グルカンホスホリラーゼ、澱粉ホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼまたはスクロースホスホリラーゼ；これを発現する微生物；または前記微生物の培養物、及びホスフェートを接触させ、前記澱粉、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせをブドウ糖−１−リン酸に転換するステップをさらに含む、請求項８に記載のプシコースの製造方法。
  11. 前記方法は、前記ブドウ糖をブドウ糖−６−リン酸に転換するステップ以前に、澱粉、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせに、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼまたはイソアミラーゼ；これを発現する微生物；または前記微生物の培養物を接触させ、前記澱粉、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせをブドウ糖に転換するステップをさらに含む、請求項９に記載のプシコースの製造方法。
  12. 澱粉、マルトデキストリン、スクロースまたはその組み合わせ、及びホスフェートに、（ａ）プシコース−６−リン酸脱リン酸化酵素；果糖−６−リン酸−３−エピマー化酵素；ブドウ糖−６−リン酸−異性化酵素；ホスホグルコムターゼまたはブドウ糖リン酸化酵素；及びα−グルカンホスホリラーゼ、澱粉ホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、α−アミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼ、グルコアミラーゼまたはスクラーゼ；または、（ｂ）前記項目（ａ）の酵素を発現する微生物または前記微生物の培養物を接触させるステップを含む、プシコースの製造方法であって、前記プシコース−６−リン酸脱リン酸化酵素は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０のアミノ酸配列を有する酵素である、プシコースの製造方法。
  13. 前記接触は、ｐＨ ５．０から９．０、４０℃から８０℃の温度で、及び／または２時間から２４時間実施する、請求項４〜１２のいずれか一項に記載のプシコースの製造方法。
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