WO2021086010A1 - 과당-6-인산 3-에피머화 효소 및 이의 용도 - Google Patents

과당-6-인산 3-에피머화 효소 및 이의 용도 Download PDF

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허진솔
정인석
최은수
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Definitions

  • the present invention relates to a phosphorylated saccharide epimerase protein, more specifically, a 3-epimerase protein of fructose-6-phophate, a nucleic acid molecule encoding the enzyme protein, and a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule. And it relates to a transformed strain, a composition for producing allulose using the strain.
  • Phosphorylated saccharide epimerase is an epimerase bonded to carbon in various phosphorylated saccharides, and ketohexose-6-phosphate epimerase can epimerize C3 or C4.
  • the ketohexose may be one or more ketohexose selected from the group consisting of fructose, allulose, sorbose, and tagatose.
  • Epimerase of fructose-6-phosphate includes 3-epimerase and 4-epimerase. Specifically, allulose-3-epimerase (D-allulose-3-epimerase, EC 5.1.3.30) is a 3-epimerization (3-epimerization, 3 carbon epimerization) of fructose (D-fructose). Produces allulose-6-phosphate.
  • the enzyme used In the case of industrial production of allulose using fructose as a raw material, the enzyme used must have high industrial production conditions, especially heat stability, and have the highest conversion rate.Also, since sugar is used as a substrate, browning of sugar is reduced under alkaline conditions. Because it easily occurs, it is necessary to satisfy the conversion reaction conditions in which browning of sugar is prevented as much as possible.
  • An example of the present invention relates to a 3-epimerase protein of fructose-6-phosphate, a nucleic acid molecule encoding the enzyme protein, a recombinant vector containing the nucleic acid molecule, and a transformed microorganism.
  • Another example of the present invention is a 3-epimerization enzyme protein of fructose-6-phosphate, a microbial cell expressing the enzyme, a lysate of the microbial cell, a culture of the microbial, a culture supernatant of the microbial, or these It relates to a method for producing allulose-6-phosphoric acid using fructose-6-phosphoric acid, and a composition for producing allulose-6-phosphate, comprising at least one selected from the group consisting of extracts of.
  • a further example of the present invention is a 3-epimerization enzyme protein of fructose-6-phosphate, a microbial cell expressing the enzyme, a lysate of the microbial cell, a culture of the microbe, a culture supernatant of the microbial, or a It relates to a composition for producing ketohexose, for example allulose, using fructose-6-phosphate, including at least one selected from the group consisting of extracts, and a method for producing allulose.
  • an example of the present invention is an amino acid sequence homology of 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, or 99% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • a 3-epimerase protein of fructose-6-phosphate comprising the sequence.
  • the scope of the present invention is that some sequences have an amino acid sequence that is deleted, modified, substituted or added. It is self-evident to be included within.
  • a specific example of the present invention is a fructose-6- comprising an amino acid sequence having 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, or 99% or more of sequence homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Phosphoric acid 3-epimerase is provided.
  • the fructose-6-phosphate 3-epimerase has at least 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, or 99% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 It may be encoded by a nucleotide sequence.
  • amino acid sequence showing the homology of the above numerical value it may be included without limitation as long as it is a fructose-6-phosphate 3-epimerized enzyme protein that is substantially the same as or corresponding to the enzyme.
  • sequence having such homology is an amino acid sequence that substantially exhibits a fructose-6-phosphate 3-epimerase function, protein variants in which some sequences are deleted, modified, substituted or added are also included within the scope of the present invention.
  • homology refers to the degree to which a given amino acid sequence or nucleotide sequence matches, and may be expressed as a percentage.
  • a homologous sequence thereof having the same or similar activity as a given amino acid sequence or base sequence is indicated as "% homology”.
  • the fructose-6-phosphate 3-epimerization enzyme according to the present invention catalyzes the 3-epimerization reaction of fructose-6-phosphate, and specifically, the 3-epimerization reaction of fructose-6-phosphate. Can be converted to allulose-6-phosphoric acid.
  • the protein may be an enzyme of Clostridium lundense DSM 17049 derived from the enzyme, in particular of the Clostridium lundense derived.
  • the reaction temperature range of the fructose-6-phosphate 3-epimerase derived from Clostridium lundense may be 40 to 70°C, 45 to 75°C, 45 to 77°C, 50 to 70°C, or 50 to 75°C.
  • the optimum temperature may be, for example, a result of the reaction proceeding for 5 minutes under the condition of pH 7.0, but is not limited thereto.
  • the optimum temperature condition of the fructose-6-phosphate 3-epimerase is 60°C, and it has an activity of 50% or more of the maximum activity of the enzyme in a wide range of temperature conditions over 40-70°C conditions.
  • the reaction pH range of the Clostridium lundense- derived fructose-6-phosphate 3-epimerase is pH 6 to 8, pH 6 to 7.5, pH 6.5 to 8, pH 6.5 to 7.5, pH 7 to 8, or pH 7 to 7.5 days. It has the maximum activity in the conditions of pH 7.0-7.5, and has an activity of 80% or more of the maximum activity of the enzyme in the range of pH 6.0-8.0.
  • the maximum amount of allulose produced by the Clostridium lundense-derived fructose-6-phosphate 3-epimerase is 16% by weight or more, 18% by weight or more, 20% by weight or more, 25% by weight or more, 27% by weight or more, 30% by weight or more Alternatively, it may be at least 32% by weight.
  • the maximum amount of allulose production of the enzyme may be obtained by adding 0.1 mg/ml of the enzyme to a solution in which 20 g/L fructose-6-phosphate is dissolved, and in more detail, 0.1 mg/ml of the enzyme. It may be measured by adding 20g/L fructose-6-phosphoric acid to a dissolved solution and performing an enzymatic reaction at pH 7.0 and 50°C.
  • the maximum conversion rate of allulose can be calculated by Equation 1 below.
  • the time of the enzyme reaction to obtain the maximum conversion rate of allulose may be 8 hours or more, 10 hours or more, 12 hours or more, 14 hours or more, or 16 hours or more, and the reaction time may be 18 hours or less or 20 hours or less, ,
  • the specific reaction time may be in the range of the combination of the lower limit and the upper limit, for example, may be 16 hours to 20 hours.
  • Allulose maximum conversion (%) (Allulose production (g/L) / Fructose-6-phosphate dosage g/L) * (Allulose molecular weight / Fructose-6-phosphate molecular weight) * 100
  • the ratio of allulose generation (% by weight) in the saccharides of the product of the enzymatic reaction can be calculated by the following equation.
  • the enzyme reaction time for determining the allulose production rate may be 2 hours to 6 hours, 3 hours to 6 hours, or 4 hours to 6 hours, for example, 4 hours to 6 hours.
  • the fructose-6-phosphate 3-epimerized enzyme protein according to the present invention may increase or decrease the enzyme activity by metal ions.
  • fructose-6-phosphate 3-epimerized enzyme protein increases enzymatic activity by Mn, Co and Ni ions, for example, 1.1 times or more, 1.2 times or more, and 1.3 times as compared to the enzyme activity in the absence of metal ions.
  • Mn and Co ions are 2 times or more, or 3 times or more, specifically 2 times to 5 times or less, 2 times to 4 times or less, 3 times or more compared to the conditions without metal ions. It exhibits an activity of 5 times or less, or 3 to 5 times or less.
  • the fructose-6-phosphate 3-epimerase protein has a property of decreasing activity by Ca, Cu, Fe, or Ze ions. Therefore, it is preferable that the conditions for producing allulose using the fructose-6-phosphate 3-epimerase protein do not contain at least one metal ion selected from the group consisting of Ca, Cu, Fe, and Ze ions. I can.
  • the fructose-6-phosphate 3-epimerase has a sequence homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, or 99 % Or more, and if an amino acid sequence exhibiting efficacy corresponding to a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, some sequences are included within the scope of the present invention even if they have an amino acid sequence that has been deleted, modified, substituted or added. Is self-explanatory.
  • the fructose-6-phosphate 3-epimerase protein derived from Clostridium lundense is Ruminococcus sp. AF14-10 derived ribulose-phosphate 3-epimerase (RuFP3E: amino acid sequence-SEQ ID NO: 5), Clostridium sp.
  • CDFP3E amino acid sequence-SEQ ID NO: 7
  • Paenibacillus kribbensis derived ribulose-phosphate 3-epimerase PkFP3E: amino acid sequence-SEQ ID NO: 9
  • RuFP3E And 59.05%, CDFP3E and 63%, and PkFP3E and amino acid sequence identity were 60.96%, and sequence homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was less than 70%.
  • a nucleic acid molecule encoding the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present invention is provided.
  • a specific example of a nucleic acid encoding a fructose-6-phosphate 3-epimerase according to the present invention, the fructose-6-phosphate 3-epimerase is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 It may include a nucleotide sequence having at least 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, or 99% or more homology with.
  • the present invention provides a vector or transformant comprising a nucleic acid encoding the fructose-6-phosphate 3-epimerase of the present invention.
  • the term "transformation” means introducing a vector containing a nucleic acid encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the nucleic acid can be expressed in the host cell.
  • the transformed nucleic acid can include all of them, whether inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome, as long as it can be expressed in the host cell.
  • the nucleic acid includes DNA and RNA encoding the target protein.
  • the nucleic acid may be introduced in any form as long as it can be introduced into a host cell and expressed.
  • the nucleic acid may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may generally include a promoter operably linked to the nucleic acid, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replicating.
  • the nucleic acid may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked in the above means that a promoter sequence for initiating and mediating transcription of a nucleic acid encoding a protein of interest of the present invention and the gene sequence are functionally linked.
  • the method of transforming the vector of the present invention includes any method of introducing a nucleic acid into a cell, and can be performed by selecting an appropriate standard technique as known in the art according to the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (CaPO4) precipitation, calcium chloride (CaCl2) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, and lithium acetate -DMSO method, etc., but is not limited thereto.
  • the host cell it is good to use a host having high DNA introduction efficiency and high expression efficiency of the introduced DNA, but may be, for example, E. coli, but is not limited thereto.
  • the present invention is a fructose-6-phosphate 3-epimerase according to the present invention, an enzyme, a microorganism expressing the enzyme protein, a transformed microorganism expressing the enzyme protein, the microorganism of the microorganism, Ketohexose, for example, allulose, comprising at least one selected from the group consisting of the microbial lysate, the microbial culture, the microbial culture supernatant, the microbial culture supernatant concentrate, and powders thereof. It provides a composition for production.
  • the culture contains an enzyme produced from a microorganism that produces a fructose-6-phosphate 3-epimerase, and may be in a cell-free form that includes the strain or does not contain the strain.
  • the lysate refers to a lysate obtained by crushing the microbial cells of a microorganism producing fructose-6-phosphate 3-epimerase or a supernatant obtained by centrifuging the lysate, and is produced from a microorganism producing the polyphosphate-dependent glucose phosphorylation enzyme. It contains enzymes that have been prepared.
  • the culture of the strain contains an enzyme produced from a microorganism that produces the fructose-6-phosphate 3-epimerase, and may be in a cell-free form with or without the microbial cells.
  • the microorganisms producing the fructose-6-phosphate 3-epimerase used are the cells of the strain, the culture of the strain, the lysate of the lysate, the supernatant of the lysate, And it means to include one or more selected from the group consisting of extracts thereof.
  • ketohexose for example, allulose according to the present invention
  • the method for producing ketohexose is environmentally friendly because it uses enzymes obtained from microorganisms, and converts the production of allulose from fructose from a simple enzymatic reaction into a method that has not been previously possible, and greatly reduces production costs. Meanwhile, the production effect can be maximized.
  • the composition for producing allulose according to the present invention may further include one or more metal ions selected from the group consisting of Mn, Co, and Ni ions.
  • the concentration of the metal ion may be 0.5 mM to 20 mM, for example, 0.5 mM to 10 mM, 1.0 mM to 10 mM, 1.5 mM to 8.0mM, 2.0mM to 8.0mM, 3.0mM to 7.0mM, 4.0 mM to 6.0 mM, or 0.2 mM to 10 mM.
  • reaction temperature and reaction pH conditions using the enzyme or the microorganism producing the enzyme are as described above in the reaction temperature and reaction pH conditions of the enzyme.
  • the composition for production of allulose is a hexokinase enzyme that converts fructose into fructose-6-phosphate, a transformed microorganism expressing the enzyme protein, a microorganism of the microorganism, a lysate of the microorganism, a culture of the microorganism, the It may include at least one selected from the group consisting of a culture supernatant of microorganisms, a concentrate of the culture supernatant of the microorganisms, and powders thereof.
  • the fructose-6-phosphate is preferably obtained by hexokinase treatment of fructose or a fructose-containing substance, but is included in the protection scope of the present invention even when provided by other chemical synthesis methods.
  • the fructose-6-phosphate may be prepared from glucose-6-phosphate, and the composition for producing allulose includes a glucose-6-phosphate isomerase that isomerizes glucose-6-phosphate and converts it into fructose-6-phosphate. It may contain additionally.
  • the glucose-6-phosphate may be prepared by phosphorylating glucose directly or may be converted from glucose-1-phosphate.
  • Glucose may be glucose obtained by treating a glucose-producing amylase such as starch or a starch hydrolyzate such as dextrin, and glucose-1-phosphate may be obtained by treating the glucose with a phosphorylating enzyme.
  • the composition for producing ketohexose may further include an enzyme system for producing glucose-6-phosphate.
  • the enzyme contained in the composition for producing allulose of the present invention and the substrate used for producing allulose are not limited.
  • the composition for producing allulose of the present invention includes (a) (i) starch, maltodextrin, sucrose or a combination thereof, glucose, glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate, or fructose-6-phosphate; (ii) phosphate; (iii) allulose-6-phosphate dephosphorylation enzyme; (iv) glucose-6-phosphate-isomerase; (v) phosphoglucomutase or glucose phosphorylation enzyme; And/or (vi) ⁇ -glucan phosphorylase, starch phosphorylase, maltodextrin phosphorylase, sucrose phosphorylase, ⁇ -amylase, pullulanase, isoamylase, glucoamylase or sucrase. ; Or (b) may further include a microorganism expressing the enzyme of item (a) or a culture of a microorganis
  • starch/maltodextrin phosphorylase (EC 2.4.1.1) and ⁇ -glucan phosphorylase of the present invention are glucose from starch or maltodextrin by transferring phosphate to glucose. Any protein may be included as long as it has an activity of producing -1-phosphate.
  • the sucrose phosphorylase (EC 2.4.1.7) of the present invention may include any protein as long as it has the activity of producing glucose-1-phosphate from sucrose by transferring phosphoric acid to glucose.
  • Starch liquor enzymes of the present invention ⁇ -amylase ( ⁇ -amylase, EC 3.2.1.1), pullulanse (EC 3.2.1.41), glucoamylase (EC 3.2.1.3) and isoamylase (isoamylase) May include any protein as long as it has the activity of converting starch or maltodextrin into glucose.
  • Sucrase (EC 3.2.1.26) of the present invention may include any protein as long as it has an activity of converting sucrose into glucose.
  • Phosphoglucomutase (EC 5.4.2.2) applicable to the present invention may include any protein as long as it has an activity of converting glucose-1-phosphate into glucose-6-phosphate.
  • Glucokinase may include any protein as long as it has the activity of converting glucose into glucose-6-phosphate by transferring phosphoric acid to glucose.
  • the glucose kinase may be a polyphosphate-dependent glucose kinase.
  • the glucose-6-phosphate isomerase of the present invention may include any protein as long as it has an activity of converting glucose-6-phosphate into fructose-6-phosphate.
  • the allulose-6-phosphate dephosphorylation enzyme of the present invention may include any protein as long as it has an activity of converting allulose-6-phosphate into allulose. More specifically, the allulose-6-phosphate dephosphorylation enzyme may be a protein having an activity of irreversibly converting allulose-6-phosphate into allulose.
  • the composition for producing allulose is a phytase that performs a dephosphorylation reaction in allulose-6-phosphate, for example, allulose-6-phosphate phosphatase is added. It may be included as, but is not limited thereto.
  • the composition for producing ketohexose is a microorganism expressing an allulose-6-phosphate phosphatase, a dephosphorylation enzyme of the allulose-6-phosphate, or the allulose-6- It may further include a culture of microorganisms expressing the phosphoric acid dephosphorylation enzyme.
  • reaction temperature and reaction pH conditions using an enzyme producing ketohexose for example, allulose-6-phosphate or a microorganism producing the enzyme using the composition for producing ketohexose, are the reaction temperature and reaction pH conditions of the enzyme. As described above in.
  • the method may further include the step of preparing fructose-6-phosphate from fructose or fructose-containing material using hexokinase, and/or a microorganism expressing a dephosphorylation enzyme, or the It may further include the step of removing phosphoric acid by contacting the culture of the microorganism.
  • the step of removing the phosphate group may include allulose-6-phosphate phosphatase, a microorganism expressing the allulose-6-phosphate dephosphorylation enzyme, or the allulose-6-phosphate dephosphorylation.
  • Allulose can be produced by carrying out using a culture of a microorganism expressing an enzyme.
  • the phosphate group may be removed from the allulose 6-phosphate by other enzymes or chemical methods.
  • An example of the present invention is a microorganism expressing the fructose-6-phosphate 3-epimerase, the fructose-6-phosphate 3-epimerase, or the fructose-6-phosphate 3-epimerase. It provides a method for producing allulose comprising the step of converting fructose-6-phosphate into allulose-6-phosphate by contacting the culture.
  • the allulose-6-phosphate after the step of converting the fructose-6-phosphate to allulose-6-phosphate, allulose-6-phosphate dephosphorylation enzyme, the allulose-6-phosphate It may further include the step of converting the allulose-6-phosphate to allulose by contacting the culture of the microorganism expressing the dephosphorylation enzyme or the microorganism expressing the allulose-6-phosphate dephosphorylation enzyme.
  • the manufacturing method of the present invention prior to the step of converting the fructose-6-phosphate to allulose-6-phosphate, glucose-6-phosphate to glucose-6-phosphate-isomerase, the glucose-6-phosphate -It may further comprise the step of converting the glucose-6-phosphate into fructose-6-phosphate by contacting a culture of a microorganism expressing an isomerase or a microorganism expressing the glucose-6-phosphate-isomerase. .
  • the manufacturing method of the present invention prior to the step of converting the glucose-6-phosphate to fructose-6-phosphate, glucose-1-phosphate (Glucose-1-phosphate) to phosphoglucomutase, the phosphoglucose It may further include the step of converting the glucose-1-phosphate into glucose-6-phosphate by contacting a culture of a mutase-expressing microorganism or the phosphoglucomutase-expressing microorganism.
  • the manufacturing method of the present invention comprises a glucose phosphorylating enzyme in glucose, a microorganism expressing the glucose phosphorylating enzyme, or expressing the glucose phosphorylating enzyme before the step of converting the glucose-6-phosphate into fructose-6-phosphate. It may further include the step of converting the glucose into glucose-6-phosphate by contacting the culture of the microorganism and phosphoric acid.
  • the method of the present invention Prior to the step of converting glucose-1-phosphate to glucose-6-phosphate, the method of the present invention comprises ⁇ -glucan phosphorylase, starch phosphorylase, maltose in starch, maltodextrin, sucrose, or a combination thereof.
  • the manufacturing method of the present invention includes, prior to the step of converting glucose into glucose-6-phosphate, ⁇ -amylase, pullulanase, glucoamylase, sucrase or isoamylase in starch, maltodextrin, sucrose, or a combination thereof; Microorganisms expressing the amylase, fluranase, or sucrase; Or it may further include the step of converting the starch, maltodextrin, sucrose, or a combination thereof into glucose by contacting the culture of the microorganism with the amylase, fluranase or sucrase.
  • the production method of the present invention is a culture of a microorganism expressing 4- ⁇ -glucanotransferase, the 4- ⁇ -glucanotransferase, or a microorganism expressing the 4- ⁇ -glucanotransferase in glucose
  • the step of converting the glucose into starch, maltodextrin or sucrose may additionally be included.
  • the fructose-6-phosphate 3-epimerase according to the present invention satisfies at least one or more of characteristics of high enzyme conversion, acidic or neutral reaction pH conditions, and high thermal stability, and thus, fructose-6-phosphate 3- It can be usefully used in the production of ketohexose using an epimerization enzyme.
  • 1 is an electrophoresis photograph confirming the expression and purification of a 3-epimerase protein of fructose-6-phosphate according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows the results of BIO-LC analysis of the 3-epimerase protein of fructose-6-phosphate according to an embodiment of the present invention.
  • 3 is an LC analysis result after dephosphorylating the phosphorylated saccharide of the reaction solution through an enzymatic reaction of allulose-6-phosphate phosphatase according to an example of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of analyzing the temperature characteristics of a 3-epimerase protein of fructose-6-phosphate according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of analyzing the pH characteristics of a 3-epimerase protein of fructose-6-phosphate according to an example of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of the metal ion effect of the 3-epimerase protein of fructose-6-phosphate according to an example of the present invention.
  • 7A and 7B are HPLC analysis results of reactants obtained after performing allulose production using three known types of ribulose-phosphate 3-epimerase.
  • Candidate enzymes predicted to function as fructose-6-phosphate 3-epimerase are screened, and the amino acid sequence of the enzyme (ClFP3E) derived from Clostridium lundense DSM 17049 strain (SEQ ID NO: The polynucleotide encoding 1) (SEQ ID NO: 2) was obtained by requesting gene synthesis through IDT gene synthesis. Based on the synthesized ClFP3E DNA nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, a primer was designed and PCR was performed to amplify the nucleotide sequence of the corresponding gene. The forward sequence and reverse primer sequence used for PCR amplification are as follows.
  • the ClFP3E gene obtained in large quantities was introduced into pET21a vector using restriction enzymes NdeI and XhoI to prepare pET21_ClFP3E, which was transformed into E. coli ER2566 strain.
  • Recombinant E. coli for protein expression of the enzyme was secured as colonies on an agar plate made with LB medium containing 50 ⁇ g/ml of ampicillin.
  • the main culture was performed in 100ml LB medium, and the culture conditions were cultured at 37°C at 200 rpm until the absorbance value reached 0.6 at 600 nm, and then 0.1 mM of IPTG was added to induce the expression of the target protein.
  • the strain was cultured at 25° C. for about 16 hours, and then centrifuged to recover the cells.
  • the recovered cells were suspended in lysis buffer (50 mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole), cell disrupted using a beadbeater, and overexpression of the target protein ClFP3E from the cell disruption solution was SDS- It was confirmed through PAGE gel analysis.
  • the results of the analysis of overexpression of the target protein ClFP3E are shown in FIG. 1.
  • the molecular weight of ClFP3E confirmed through SDS-PAGE gel analysis was about 28 KDa.
  • Example 1 0.1mg/ml of the purified ClFP3E enzyme obtained in Example 1 was added to a solution in which 20g/L fructose-6-phosphate was dissolved in 50mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer, and the enzyme reaction was carried out at 50°C.
  • the reaction product of this example is the final conversion rate of ClFP3E obtained by performing an enzymatic reaction for 16 hours, and the maximum conversion rate of allulose is calculated according to the following equation.
  • Allulose maximum conversion (%) (Allulose production (g/L) / fructose-6-phosphate dosage (g/L)) * (Allulose molecular weight / fructose-6-phosphate molecular weight) * 100
  • A6PP enzyme was added to dephosphorylate all reaction compositions, and then the amount of allulose produced was quantitatively analyzed through HPLC analysis.
  • the relative activity of the enzyme according to the reaction temperature is shown in FIG. 4 on the basis of the activity at 60° C., which was measured with the highest activity.
  • the optimal temperature condition of ClFP3E was 60°C, and it was confirmed that it has an activity of 50% or more of the maximum enzyme activity in a wide temperature range over the 40-70°C condition.
  • A6PP enzyme was added to dephosphorylate all reaction compositions, and then the amount of allulose produced was quantitatively analyzed through HPLC analysis.
  • the relative activity of the enzyme according to the type of metal ion is shown in FIG. 6 based on the experimental group to which no metal ion was added.
  • ClFP3E enzyme was found to be an enzyme that uses manganese and cobalt as cofactors. Also, the activity was increased by nickel. CaCl2, CuCl2, FeSO4, ZeSO4 decreased enzyme activity.
  • Ruminococcus sp. AF14-10 derived ribulose-phosphate 3-epimerase (RuFP3E: amino acid sequence-SEQ ID NO: 5 and nucleic acid sequence-SEQ ID NO: 6), Clostridium sp. DL-VIII-derived ribulose-phosphate 3-epimerase (CDFP3E: amino acid sequence-SEQ ID NO: 7 and nucleic acid sequence-SEQ ID NO: 8), Paenibacillus kribbensis-derived ribulose-phosphate 3-epimerase (PkFP3E: amino acid sequence-SEQ ID NO: 9 and nucleic acid sequence- The polynucleotide of SEQ ID NO: 10) was obtained by requesting gene synthesis.
  • Example 2 Based on the synthesized ClFP3E DNA nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, a large amount of genes was obtained in substantially the same manner as in Example 1. In substantially the same manner as in Example 1, the obtained gene was introduced into E. coli and expressed, and then the target protein was eluted. The finally obtained protein was converted to 50mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) and stored for later use.
  • HPLC analysis conditions were RID (Refractive Index Detector Agilent 1260 RID) of HPLC (Agilent, USA) equipped with Aminex HPX-87C column (BIO-RAD). Water was used as the mobile phase solvent, and the temperature was 80° C. and the flow rate was 0.6 ml/min.
  • the HPLC analysis results are shown in Figs. 7A and 7B.
  • the reaction product of this example was to obtain the allulose conversion rate of the enzyme obtained by performing an enzymatic reaction for 4 hours.
  • the reaction solution that stopped the reaction in the intermediate stage of allulose production was analyzed. It is the result.
  • the allulose conversion rate of ClFP3E was confirmed to be 16%, and the reaction proceeded at a level of about 50% compared to the maximum conversion rate obtained in Example 2.
  • the allulose production ratio in the total product of ClFP3E of this example is 75% by weight, and the allulose production ratio is calculated according to the following equation.

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Abstract

본 발명을 과당-6-인산의 에피머화 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 미생물, 및 이들을 이용한 알룰로스 생산용 조성물에 관한 것이다.

Description

과당-6-인산 3-에피머화 효소 및 이의 용도
본 발명은 인산화당 에피머화 효소 단백질, 더욱 자세하게는 과당-6-인산(fructose-6-phophate)의 3-에피머화 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 균주, 상기 균주를 이용한 알룰로스 생산용 조성물에 관한 것이다.
인산화당의 에피머화 효소는 다양한 인산화 당에 있는 탄소에 결합된 에피머화 효소로서, 케토헥소오스-6-인산 에피머화 효소는 C3 또는 C4를 에피머화 할 수 있다. 상기 케토헥소오스는 과당 (fructose), 알룰로스, 소르보오스 (sorbose), 및 타가토오스 (tagatose)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 케토헥소오스일 수 있다.
과당-6-인산의 에피머화 효소는 3-에피머화 효소와 4-에피머화 효소를 포함한다. 구체적으로, 알룰로스-3-에피머화 효소(D-알룰로스-3-epimerase, EC 5.1.3.30)는 과당(D-fructose)을 3-에피머화(3-epimerization, 3번 탄소 에피머화)하여 알룰로스-6-인산을 생산한다.
상기 효소를 사용하여 과당에서 알룰로스를 생산하는 경우, 기질로 사용하는 과당과 산물인 알룰로스 간의 일정 수준의 반응평형이 존재하여 효율이 매우 낮다. 따라서, 상기 효소를 이용한 단일 반응을 통해서 고순도 알룰로스를 제조하고자 할 경우, 최종 반응액에서 과당을 분리하여 제거하는 추가 공정이 필요하다.
산업적으로 과당을 원료로 하여 알룰로스를 제조하고자 하는 경우에, 사용되는 효소는 산업적 생산조건, 특히 열안정성이 높으며, 최대한 높은 전환율을 가져야 하며, 또한 당을 기질로 사용하므로 당의 갈변화가 알칼리 조건에서 쉽게 일어나므로 가급적 당의 갈변이 방지되는 전환 반응 조건을 충족할 필요가 있다.
따라서, 산업적으로 사용하기에는 적합한 기질 전환율, 효소의 열안정성, 및 효소 반응조건을 적어도 하나 이상 만족하며, 과당을 원료로 하여 인산화 과당을 제조하는 효소 및 이를 이용한 인산화 과당의 생산 방법이 절실히 필요한 실정이다.
본 발명의 일 예는 과당-6-인산의 3-에피머화 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일 예는, 과당-6-인산의 3-에피머화 효소 단백질, 상기 효소를 발현하는 미생물의 균체, 상기 균체의 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양물 상등액 또는 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 과당-6-인산을 이용하여 알룰로스-6-인산을 제조하는 방법, 및 알룰로스-6-인산의 제조용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일 예는, 과당-6-인산의 3-에피머화 효소 단백질, 상기 효소를 발현하는 미생물의 균체, 상기 균체의 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양물 상등액 또는 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 과당-6-인산을 이용하여 케토헥소오스, 예를 들면 알룰로스를 생산하는 조성물 및 알룰로스 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 과당-6-인산의 3-에피머화 효소 단백질에 관한 것이다. 예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명의 구체적인 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 제공한다. 상기 과당-6-인산 3-에피머화 효소는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
상기 수치의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 효소와 동일하거나 상응하는 과당-6-인산 3-에피머화 효소 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 과당-6-인산 3-에피머화 효소 기능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
상기에서 용어 "상동성" 또는 "일치성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다.
본 발명에 따른 과당-6-인산 3-에피머화 효소는, 과당-6-인산(fructose 6-phosphate)의 3-에피머화 반응을 촉매하며, 구체적으로 과당-6-인산의 3-에피머화 반응을 수행하여 알룰로스-6-인산으로 전환할 수 있다.
본 발명에 따른 과당-6-인산 3-에피머화 효소 단백질은 Clostridium lundense 유래의 효소, 구체적으로 Clostridium lundense DSM 17049 유래의 효소 일 수 있다.
상기 Clostridium lundense 유래 과당-6-인산 3-에피머화 효소의 반응 온도 범위는 40 내지 70℃, 45 내지 75℃, 45 내지 77℃, 50 내지 70 ℃ 또는 50 내지 75 ℃일 수 있다. 상기 최적 온도는, 예컨대, pH 7.0 조건에서 5분간 반응 진행 시의 결과일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 과당-6-인산 3-에피머화 효소의 최적 온도 조건은 60 ℃이며 40~70 ℃조건에 걸친 넓은 온도조건 범위에서 효소 최대활성의 50% 이상의 활성을 가진다.
상기 Clostridium lundense 유래 과당-6-인산 3-에피머화 효소의 반응 pH 범위는 pH 6 내지 8, pH 6 내지 7.5, pH 6.5 내지 8, pH 6.5 내지 7.5, pH 7 내지 8, 또는 pH 7 내지 7.5일 수 있으며, pH 7.0~7.5 조건에서 최대 활성을 가지며, pH6.0~8.0 범위에서 효소 최대활성의 80% 이상의 활성을 가진다.
상기 Clostridium lundense 유래 과당-6-인산 3-에피머화 효소의 최대의 알룰로스 생성량은 16 중량% 이상, 18 중량% 이상, 20 중량% 이상, 25 중량% 이상, 27 중량% 이상, 30 중량% 이상 또는 32 중량% 이상일 수 있다. 구체적으로 상기 효소의 최대 알룰로스 생성량은, 효소 0.1mg/ml를 20g/L 과당-6-인산을 용해한 용해액에 첨가하여 반응을 수행한 것일 수 있으며, 더욱 자세하게는 상기 효소 0.1mg/ml를 20g/L 과당-6-인산을 용해한 용해액에 첨가하여 pH 7.0 및 50 ℃조건에서 효소 반응을 수행하여 측정한 것일 수 있다.
상기 알룰로스 최대 전환율은 하기 수학식 1에 의해서 계산될 수 있다. 상기 알룰로스 최대 전환율을 구하기 위한 효소 반응의 시간은 8시간 이상, 10시간 이상, 12시간 이상, 14시간 이상 또는 16시간 이상일 수 있으며, 상기 반응시간의 상항은 18시간 이하 또는 20시간 이하일 수 있으며, 구체적인 반응시간은 상기 하한과 상한을 조합한 범위일 수 있으며, 예를 들면 16시간 내지 20 시간일 수 있다.
[수학식 1]
알룰로스 최대 전환율(%) = (알룰로스 생성량(g/L) / 과당-6-인산 투여량g/L) * (알룰로스 분자량 / 과당-6-인산 분자량) * 100
상기 효소 반응의 생성물의 당류중에서 알룰로스 생성 비율(중량 %)은 하기 수학식에 의해서 계산될 수 있다. 상기 알룰로스 생성 비율을 구하기 위한 효소 반응 시간은 2시간 내지 6시간, 3시간 내지 6시간, 또는 4시간 내지 6시간일 수 있으며, 예를 들어 4 시간 내지 6시간일 수 있다.
[수학식 2]
상기 알룰로스 생성 비율(중량 %) = 알룰로스 생성량 / (과당 생성량+알룰로스 생성량) * 100
본 발명에 따른 과당-6-인산 3-에피머화 효소 단백질은 금속이온에 의해 효소 활성이 증가 또는 감소할 수 있다. 구체적으로, 과당-6-인산 3-에피머화 효소 단백질은 Mn, Co 및 Ni 이온에 의해 효소 활성이 증가하며, 예컨대 금속이온이 없는 조건의 효소 활성에 비해 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 또는 1.5배 이상의 활성을 나타내며, 특히 Mn과 Co 이온은 2배 이상, 또는 3배 이상의 활성, 구체적으로 금속 이온 없는 조건 대비 2 배 내지 5 배 이하, 2 배 내지 4 배 이하, 3 배 내지 5 배 이하, 또는 3 배 내지 5 배 이하의 활성을 나타낸다. 과당-6-인산 3-에피머화 효소 단백질은 Ca, Cu, Fe, 또는 Ze 이온에 의해 활성이 감소하는 특성을 가진다. 따라서, 과당-6-인산 3-에피머화 효소 단백질을 이용하여 알룰로스를 생산하는 조건은 Ca, Cu, Fe, 및 Ze 이온으로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 금속이온을 포함하지 않는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열 상동성이 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
상기 Clostridium lundense 유래 과당-6-인산 3-에피머화 효소 단백질은 Ruminococcus sp. AF14-10 유래 ribulose-phosphate 3-epimerase (RuFP3E: 아미노산 서열-서열번호 5), Clostridium sp. DL-VIII 유래 ribulose-phosphate 3-epimerase (CDFP3E: 아미노산 서열-서열번호 7), Paenibacillus kribbensis 유래 ribulose-phosphate 3-epimerase (PkFP3E: 아미노산 서열-서열번호 9)와 아미노산 서열 동일성을 분석한 결과, RuFP3E와 59.05%이고, CDFP3E과 63%이고, PkFP3E 와 아미노산 서열 동일성은 60.96%으로서, 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열 상동성이 70% 미만이었다.
또한, 프럭토오스 6-인산으로부터 알룰로스 6-인산으로의 전환 활성을 분석한 HPLC 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 ClFP3E 효소에서는 알룰로스 피크가 확인되었으나, 상기 RuFP3E, CDFP3E 및 PkFP3E는에서는 알룰로스 피크가 확인되지 않았다. 이에 ClFP3E 효소 외 다른 후보군 효소는 F6P에 대한 활성이 없었기 때문에 phosphatase를 처리하였을 때, 반응 단계의 최초 기질인 F6P에서 phosphate가 제거된 형태인 과당만 생성된 것을 확인할 수 있다 (도 7a, 7b).
본 발명의 추가 예로서, 본 발명의 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 암호화하는 핵산분자를 제공한다. 본 발명에 따른 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 암호화하는 핵산의 구체적인 일 예는, 상기 과당-6-인산 3-에피머화 효소는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명의 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 형질전환체를 제공한다.
본 명세서서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 핵산 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 핵산은 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 발명의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 예를 들어 대장균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 과당-6-인산 3-에피머화 효소, 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양 상등액, 상기 미생물의 배양 상등액의 농축물 및 이들의 분말로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 케토헥소오스, 예를 들면 알룰로스 생산용 조성물을 제공한다.
상기 배양물은 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 생산하는 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 생산하는 미생물의 균체를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 폴리포스페이트 의존형 포도당 인산화 효소를 생산하는 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다.
상기 균주의 배양물은 상기 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 생산하는 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 미생물 균체를 포함하거나 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사용되는 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 생산하는 미생물은 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 이들의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 케토헥소오스, 예를 들면 알룰로스 생산 방법은 미생물로부터 얻은 효소를 이용하므로 환경 친화적이며, 간단한 효소 반응으로부터 과당으로부터 알룰로스 생산을 이전에 없던 방법으로 전환시키고, 생산경비를 크게 줄이는 한편 생산 효과를 극대화할 수 있다.
본 발명에 따른 알룰로스 생산용 조성물은, Mn, Co 및 Ni 이온으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 금속이온을 추가로 포함할 수 있다. 상기 금속이온의 농도는 0.5 mM 내지 20 mM일 수 있고, 예를 들어, 0.5 mM 내지 10 mM, 1.0 mM 내지 10 mM, 1.5 mM 내지 8.0mM, 2.0mM 내지 8.0mM, 3.0mM 내지 7.0mM, 4.0mM 내지 6.0mM, 또는 0.2 mM 내지 10 mM일 수 있다.
상기 알룰로스 생산용 조성물을 이용하여 알룰로스를 생산하는 경우, 효소 또는 효소를 생산하는 미생물을 이용한 반응 온도 및 반응 pH 조건은 상기 효소의 반응온도 및 반응 pH 조건에서 상술한 바와 같다.
상기 알룰로스 생산용 조성물은, 과당을 과당-6-인산으로 전환하는 헥소카이네이즈 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양 상등액, 상기 미생물의 배양 상등액의 농축물 및 이들의 분말로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 과당-6-인산은 과당 또는 과당 함유 물질을 헥소카이네이즈 처리하여 얻은 것이 바람직하나 다른 화학적 합성방법 등에 의하여 제공되는 경우에도 본 발명의 보호범위에 포함된다.
상기 과당-6-인산은 포도당-6-인산으로부터 제조될 수 있으며, 상기 알룰로스 생산용 조성물은, 포도당-6-인산을 이성화하여 과당-6-인산으로 전환하는 포도당-6-인산 이성화 효소를 추가로 포함할 수 있다.
상기 포도당-6-인산은 포도당을 직접 인산화하여 제조되거나, 포도당-1-인산에서 전환될 수 있다. 포도당은 전분 또는 전분 가수분해물, 예를 들면 덱스트린 등에 포도당 생성 아밀라제를 처리하여 얻어진 포도당일 수 있고, 포도당-1-인산은 상기 포도당에 인산화 효소를 처리하여 얻어지는 것일 수 있다. 상기 케토헥소오스 생산용 조성물은, 포도당-6-인산을 제조하기 위한 효소 시스템을 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 알룰로스 생산용 조성물에 포함되는 효소 및 알룰로스 생산에 이용되는 기질이 제한되지 않는다. 본 발명의 알룰로스 생산용 조성물은 (a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합, 포도당, 포도당-1-인산, 포도당-6-인산, 또는 과당-6-인산; (ii) 인산(phosphate); (iii) 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소; (iv) 포도당-6-인산-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및/또는 (vi) α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는 (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 전분/말토덱스트린 포스포릴라아제(starch/maltodextrin phosphorylase, EC 2.4.1.1) 및 α-글루칸 포스포릴라아제는, 인산(phosphate)를 포도당에 전이시켜 전분 또는 말토덱스트린으로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 발명의 수크로스 포스포릴라아제(sucrose phosphorylase, EC 2.4.1.7)는 인산을 포도당에 전이시켜 수크로스로부터 포도당-1-인산을 생산하는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 발명의 전분 액당화 효소인 α-아밀라아제(α-amylase, EC 3.2.1.1), 풀루란아제(pullulanse, EC 3.2.1.41), 글루코아밀라아제(glucoamylase, EC 3.2.1.3) 및 이소아밀라아제(isoamylase)는 전분 또는 말토덱스트린을 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 발명의 수크라제(sucrase, EC 3.2.1.26)는 수크로스를 포도당으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 본 발명에 적용 가능한 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2)는 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 포도당인산화효소(glucokinase)는 포도당에 인산을 전이시켜 포도당-6-인산으로 전환하는 활성을 가지는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 포도당인산화효소는 폴리포스페이트 의존형 포도당인산화 효소일 수 있다.
본 발명의 포도당-6-인산 이성화효소는 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다.
본 발명의 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소는 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환시키는 활성을 갖는 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소는 비가역적으로 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환시키는 활성을 갖는 단백질일 수 있다. 상기 알룰로스 생산용 조성물은, 알룰로스-6-인산에서 탈인산화 반응을 수행하는 파이테이즈(phytase), 예를 들면 알룰로스 6-인산의 탈인산화 효소 (allulose-6-phosphate phosphatase)를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 상기 케토헥소오스 생산용 조성물은, 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소(allulose-6-phosphate phosphatase), 상기 알룰로스-6-인산의 탈인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 케토헥소오스 생산용 조성물을 이용하여 케토헥소오스, 예를 들면 알룰로스-6-인산 생산하는 효소 또는 효소를 생산하는 미생물을 이용한 반응 온도 및 반응 pH 조건은 상기 효소의 반응온도 및 반응 pH 조건에서 상술한 바와 같다.
상기 방법은, 헥소키나제(hexokinase)를 이용하여, 과당 또는 과당 함유 물질로부터 과당-6-인산을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있거나, 및/또는 탈인산화효소를 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜 인산을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 인산기를 제거하는 단계는, 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소(allulose-6-phosphate phosphatase), 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 이용하여 수행하여 알룰로스를 제조할 수 있다. 상기 알룰로스 6-인산은 다른 효소 또는 화학적인 방법 등에 의하여 인산기가 제거될 수도 있다.
본 발명의 일 예는, 과당-6-인산 3-에피머화 효소, 상기 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 단계를 포함하는 알룰로스 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은, 상기 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 단계 이후, 알룰로스-6-인산에 알룰로스-6-인산 탈인산화효소, 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 알룰로스-6-인산 탈인산화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법은, 상기 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환하는 단계 이전에, 포도당-6-인산에 포도당-6-인산-이성화효소, 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당-6-인산-이성화효소를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전에, 포도당-1-인산(Glucose-1-phosphate)에 포스포글루코무타아제, 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물 또는 상기 포스포글루코무타아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 상기 포도당-6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 단계 이전에, 포도당(Glucose)에 포도당 인산화 효소, 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 포도당 인산화 효소를 발현하는 미생물의 배양물, 및 인산을 접촉시켜, 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 포도당-1-인산을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전에, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-글루칸 포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제 또는 수크로오스 포스포릴라아제; 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 포스포릴라아제를 발현하는 미생물의 배양물, 및 인산을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당-1-인산으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 상기 포도당을 포도당-6-인산으로 전환하는 단계 이전에, 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합에 α-아밀라아제, 풀루란아제, 글루코아밀라아제, 수크라아제 또는 이소아밀라아제; 상기 아밀라아제, 플루란아제 또는 수크라아제를 발현하는 미생물; 또는 상기 아밀라아제, 플루란아제 또는 수크라아제를 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합을 포도당으로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 포도당에 4-α-글루카노트랜스퍼라아제, 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물 또는 상기 4-α-글루카노트랜스퍼라아제를 발현하는 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 포도당을 전분, 말토덱스트린 또는 수크로스로 전환하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
이와 같은 방법으로 생산된 알룰로스는 기능성 식품 및 의약품에 첨가되어 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 과당-6-인산 3-에피머화 효소는 높은 효소 전환율, 산성 또는 중성의 반응 pH 조건 및 높은 열안정성의 특성 중 적어도 하나 이상을 충족하므로, 산업적 규모로 과당-6-인산 3-에피머화 효소를 이용한 케토헥소오스의 생산에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 과당-6-인산의 3-에피머화 효소 단백질의 발현 및 정제를 확인한 전기영동 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 과당-6-인산의 3-에피머화 효소 단백질의 BIO-LC 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따라 알룰로스-6-인산 포스파타제의 효소반응을 통해서 반응액의 인산화당을 탈인산화 시킨 후 LC로 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 예에 따라 과당-6-인산의 3-에피머화 효소 단백질의 온도 특성을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 예에 따라 과당-6-인산의 3-에피머화 효소 단백질의 pH 특성을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 예에 따라 과당-6-인산의 3-에피머화 효소 단백질의 금속 이온 영향을 나타낸 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7a 및 도 7b는 알려진 3종류의 ribulose-phosphate 3-epimerase를 이용한 알룰로스 생산을 수행한 후 얻어진 반응물의 HPLC 분석 결과이다.
본 발명은 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예로 권리범위가 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1: 과당-6-인산 3-에피머화 효소 생산
과당-6-인산 3-에피머화 효소로서 기능할 것으로 예상되는 후보 효소들을 스크리닝 하여, 가장 우수한 효과를 나타낼 것으로 예상되는 효소로서 Clostridium lundense DSM 17049 균주로부터 유래한 효소(ClFP3E)의 아미노산 서열(서열번호 1)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 (서열번호 2)를 IDT gene 합성을 통해 유전자 합성 의뢰하여 확보하였다. 합성된 서열번호 2의 ClFP3E DNA 염기서열을 기본으로 하여 primer를 고안하여 PCR을 실시하여 해당 유전자의 염기서열을 증폭하였다. PCR 증폭에 사용된 정방향 서열과 역방향 프라이머 서열은 하기와 같다.
프라이머명 서열 (5'->3') 서열 번호
pET21_ClRP3E_F tatacatatgAAATACGGCTTCGCACC 3
pET21_ClRP3E_R ggtgctcgagTTCTTTGTAGCTCAGGCTGTA 4
대량으로 얻은 ClFP3E 유전자는 제한효소 NdeI 과 XhoI을 사용하여 pET21a vector에 도입하여 pET21_ClFP3E를 제조하고, 이를 대장균 ER2566균주에 형질전환하였다. 효소의 단백질 발현을 위한 재조합 E. coli는 50 μg/ml의 ampicillin을 함유한 LB 배지로 제작된 아가 플레이트에서 콜로니로 확보하였다.
4ml LB 배지에서 종배양 후, 100ml LB 배지에서 본 배양을 수행하였으며, 배양조건은 37℃ 200rpm 조건으로 600nm에서 흡광도값 0.6이 될 때까지 배양 후 IPTG 0.1mM 첨가하여 목적단백질의 발현을 유도하였다. induction 후 25 ℃에서 약 16시간 정도 균주 배양 후, 원심분리하여 균체 회수하였다. 상기 회수된 균체는 lysis buffer (50 mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole)로 현탁하여, beadbeater를 이용하여 세포 파쇄하고, 세포 파쇄용액으로부터 목적단백질 ClFP3E의 과발현을 SDS-PAGE gel 분석을 통해 확인하였다. 상기 목적단백질 ClFP3E의 과발현 분석 결과를 도 1에 나타낸다. SDS-PAGE gel 분석을 통해 확인한 ClFP3E의 분자량은 약 28 KDa이었다.
또한, 세포 pellet을 제거한 후 세포 상등액만을 얻어 Ni-NTA 컬럼(Ni-NTA superflow, Qiagen)에 binding 시킨 다음 washing buffer(50 mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole)으로 컬럼에 binding되지 않은 단백질을 제거해주고, 마지막 과정으로 elution buffer(50 mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer, 300 mM NaCl, 200 mM imidazole)로 목적 단백질을 용출하였다. 최종적으로 확보한 단백질은 50mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)으로 전환하여 이후 사용을 위해 보관하였다.
실시예 2: 효소의 전환 활성 평가
실시예 1에서 얻어진 정제된 ClFP3E 효소 0.1mg/ml를, 50mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer에 20g/L 과당-6-인산을 용해한 용해액에 첨가하여 50 ℃에서 효소 반응을 수행하였다.
효소 반응액의 분석은 Bio-LC 분석을 통해 기질과 비교하여 신규하게 생성된 물질을 확인하였으나 알룰로스-6-인산 표준물질이 존재하지 않아 정확한 확인이 불가하여 추가로 알룰로스-6-인산(A6PP)의 탈인산화 효소를 처리한 후 생성된 알룰로스를 최종적으로 확인하였다. Bio-LC 분석을 통해서는 ClFP3E 효소 반응 시, F6P의 감소와 A6P로 생각되는 새로운 peak가 생성되는 것을 확인하였다. 상기 Bio-LC 분석 결과를 하기 도 2에 나타낸다.
A6PP 효소반응을 통해서 반응액의 인산화당을 탈인산화시킨 후 LC로 분석한 결과는 다음과 같다. Aminex HPX-87C column을 사용하여 80℃ 온도에서 0.6ml/min의 유속 조건으로 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타낸다. 상기 분석결과 과당과 알룰로스를 확인할 수 있었다.
알룰로스-6-인산 포스파타제 (A6PP) 효소반응을 통해 탈인산화 시킨 반응액의 최종산물인 알룰로스의 생성량을 정량하여 계산한 ClFP3E의 최종 전환율은 34.3%로 계산되었다. 본 실시예의 반응생성물은 효소 반응을 16시간 동안 수행하여 얻은 ClFP3E의 최종 전환율이며, 알룰로스 최대 전환율은 하기 수학식에 따라 계산된다.
[수학식 1]
알룰로스 최대 전환율(%) = (알룰로스 생성량(g/L) / 과당-6-인산 투여량(g/L)) * (알룰로스 분자량 / 과당-6-인산 분자량) * 100
실시예 3: 효소의 온도 특성 분석
ClFP3E 효소 활성에 온도가 미치는 영향을 확인하기 위해, 50mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer에 10g/L의 과당-6-인산을 녹인 후, 0.01mg/ml의 ClFP3E 정제 단백질을 첨가하여 40~80 ℃사이의 여러 온도조건에서 5분간 반응 진행하였다.
그런 후에, A6PP 효소를 첨가하여 모든 반응 조성물을 탈인산화시킨 후, HPLC 분석을 통해 알룰로스 생성량을 정량 분석하였다. 상기 반응 온도에 따른 효소의 상대 활성을 가장 활성이 높게 측정된 60 ℃의 활성을 기준으로 하여 도 4에 나타내었다.
실험 결과, ClFP3E의 최적 온도 조건은 60 ℃로 확인되었으며 40~70 ℃ 조건에 걸친 넓은 온도조건 범위에서 효소 최대활성의 50% 이상의 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 효소의 pH 특성 분석
ClFP3E 효소 활성에 pH가 미치는 영향을 확인하기 위해, pH 5.0~8.5 사이의 완충용액 (pH 5.0~6.5, 시트르산 나트륨 / pH 6.5~8.5, Tris-HCl)에 10g/L의 과당-6-인산을 녹인 후, 0.01mg/ml의 ClFP3E 정제 단백질을 첨가하여 60 ℃온도에서 5 분의 조건으로 효소 반응 진행하였다. 그런 후에, A6PP 효소를 첨가하여 모든 반응 조성물을 탈인산화시킨 후, HPLC 분석을 통해 알룰로스 생성량을 정량 분석하였다. 상기 반응 pH에 따른 효소 활성의 결과는 가장 활성이 좋았던 pH 7.5를 기준으로 하여 상대 활성으로 도 5에 나타낸다.
실험 결과, pH 7.0~7.5 조건에서 최대 활성을 확인할 수 있었고, pH6.0~8.0 범위에서 효소 최대활성의 80% 이상의 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 효소의 금속이온 영향 분석
반응 시 첨가하는 금속이온의 종류에 따른 ClFP3E의 활성을 확인하기 위해, 50mM sodium phosphate (pH 7.0) buffer에 10g/L의 과당-6-인산을 녹인 후, 각각의 금속이온(MgCl2, MnCl2, CaCl2, CoCl2, CuCl2, NiSO4, FeSO4, ZeSO4) 5mM을 첨가하였다. 각 금속이온을 포함하는 반응 버퍼에 0.01mg/ml의 ClFP3E 정제 단백질을 첨가하여 60 ℃ 온도에서 5 분간 반응 진행하였다.
그런 후에, A6PP 효소를 첨가하여 모든 반응 조성물을 탈인산화시킨 후, HPLC 분석을 통해 알룰로스 생성량을 정량 분석하였다. 상기 금속이온의 종류에 따른 효소의 상대 활성을 금속이온을 넣어주지 않은 실험군을 기준으로 하여 도 6에 나타낸다.
실험 결과, MnCl2와 CoCl2를 첨가하였을 때 금속이온을 넣지 않은 조건보다 3배 이상의 활성을 확인할 수 있었다. ClFP3E 효소는 망간과 코발트를 cofactor로 사용하는 효소임을 알 수 있었다. 또한 니켈에 의해서도 활성이 증가하였다. 효소 활성을 감소시키는 것은 CaCl2, CuCl2, FeSO4, ZeSO4 이었다.
비교예 1: ribulose-phosphate 3-epimerase를 이용한 알룰로스 생산 분석
Ruminococcus sp. AF14-10 유래 ribulose-phosphate 3-epimerase (RuFP3E: 아미노산 서열-서열번호 5 및 핵산 서열-서열번호 6), Clostridium sp. DL-VIII 유래 ribulose-phosphate 3-epimerase (CDFP3E: 아미노산 서열-서열번호 7 및 핵산 서열-서열번호 8), Paenibacillus kribbensis 유래 ribulose-phosphate 3-epimerase (PkFP3E: 아미노산 서열-서열번호 9 및 핵산 서열-서열번호 10)의 폴리뉴클레오타이드를 유전자 합성 의뢰하여 확보하였다.
상기 Clostridium lundense DSM 17049 균주로부터 유래한 과당-6-인산 3-에피머화 효소(ClFP3E)의 아미노산 서열(서열번호 1)과 아미노산 서열 상동성을 분석한 결과, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 RuFP3E와 아미노산 서열 동일성은 59.05%이고, 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDFP3E와 아미노산 서열 동일성은 63%이고, 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 PkFP3E 와 아미노산 서열 동일성은 60.96%이었다.
합성된 서열번호 2의 ClFP3E DNA 염기서열을 기본으로 하여, 상기 실시예 1와 실질적으로 동일한 방법으로 대량으로 유전자를 얻었다. 실시예 1와 실질적으로 동일한 방법으로, 상기 얻어진 유전자를 E.coli에 도입하여 발현시킨 후에 목적 단백질을 용출하였다. 최종적으로 확보한 단백질은 50mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)으로 전환하여 이후 사용을 위해 보관하였다.
프럭토오스 6-인산으로부터 알룰로스 6-인산으로의 전환 활성을 분석하기 위해, 실시예 2와 동일한 방법으로, 상기 얻어진 상기 얻어진 효소를 이용하여 과당-6-인산을 기질로 사용한 효소 반응을 수행하였다. 상기 효소 반응 후에, 알룰로스-6-인산 포스파타제 (A6PP) 효소를 이용한 탈인산화 반응을 수행한 후에, 상기 반응 산물액을 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)을 사용하여 알룰로스 생성량으로 측정하였다.
HPLC 분석 조건은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 RID(Refractive Index Detector Agilent 1260 RID)를 이용하였다. 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80 ℃, 유속은 0.6ml/min로 하여 수행하였다. 상기 HPLC 분석결과를 도 7a 및 7b에 나타낸다. 본 실시예의 반응생성물은 효소 반응을 4시간 동안 수행하여 얻은 효소의 알룰로스 전환율을 얻은 것이며, FP3E 후보군 효소에 대해 screening을 하기 위한 실험으로 알룰로스 생성 중간단계에서 반응을 정지시킨 반응액을 분석한 결과이다. 7a 및 7b 에서 ClFP3E의 알룰로스 전환율은 16%로 확인되었으며, 실시예 2에서 얻어진 최대 전환율과 비교하여 약 50% 수준 반응 진행된 것이다. 본 실시예의 ClFP3E의 전체 생성물 중 알룰로스 생성 비율은 75 중량%이며, 알룰로스 생성 비율은 하기 수학식에 따라 계산된다.
[수학식 2]
상기 알룰로스 생성 비율(중량 %) = 알룰로스 생성량 / (과당 생성량+알룰로스 생성량) X 100
7a 및 7b에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 ClFP3E 효소를 제외한 다른 후보군 효소에서는 알룰로스 피크가 확인되지 않았다. 이에 ClFP3E 효소 외 다른 후보군 효소는 F6P에 대한 활성이 없었기 때문에 phosphatase를 처리하였을 때, 반응 단계의 최초 기질인 F6P에서 phosphate가 제거된 형태인 과당만 생성된 것을 확인할 수 있었다.

Claims (13)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 아미노산 서열 상동성 (identity)을 가지며, 과당-6-인산(Fructose-6-phosphate)를 알룰로스-6-인산(allulose-6-phosphate)로 전환시키는 과당-6-인산(fructose 6-phosphate) 에피머화 효소 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열과 과 80% 이상의 뉴클레오타이드 서열 동일성 (identity)을 가지는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 것인 효소 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 효소는 Clostridium lundense 에서 유래되며, 40 내지 70 ℃의 효소 반응 온도 및 pH 6 내지 8의 효소 반응 pH을 갖는 것인 효소 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 효소는 망간 이온, 코발트 이온 또는 니켈 이온에 의해 활성이 증가하는 것인 효소 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 과당-6-인산 에피머화 효소, 상기 효소 단백질을 발현하는 미생물, 상기 효소 단백질을 발현하는 형질전환 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양 상등액, 상기 미생물의 배양 상등액의 농축물 및 이들의 분말로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 알룰로스 생산용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 알룰로스 6-인산의 탈인산화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가로 포함하는, 알룰로스 생산용 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 망간 이온, 코발트 이온 및 니켈 이온으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 금속이온을 추가로 포함하는 것인 알룰로스 생산용 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 포도당 6-인산을 과당-6-인산으로 전환하는 이성화 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가로 포함하는, 알룰로스 생산용 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 (a) (i) 전분, 말토덱스트린, 수크로스 또는 이의 조합; (ii) 인산 (phosphate); (iii) 알룰로스-6-인산 탈인산화 효소; (iv) 포도당-6-인산-이성화효소; (v) 포스포글루코무타아제 또는 포도당 인산화 효소; 및 (vi) α-글루카노포스포릴라아제, 전분 포스포릴라아제, 말토덱스트린 포스포릴라아제, 수크로오스 포스포릴라아제, α-아밀라아제, 풀루란아제, 이소아밀라아제, 글루코아밀라아제 또는 수크라아제; 또는
    (b) 상기 항목 (a)의 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 추가적으로 포함하는, 알룰로스 6-인산의 탈인산화 효소를 추가로 포함하는, 알룰로스 생산용 조성물.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 과당-6-인산 에피머화 효소를 이용하여, 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환시키는 단계를 포함하는, 알룰로스를 제조하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 알룰로스-6-인산에 파이타제(phytase), 이를 발현하는 미생물, 또는 상기 미생물의 배양물을 접촉시켜, 상기 알룰로스-6-인산을 알룰로스로 전환하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 과당-6-인산을 알룰로스-6-인산으로 전환시키는 단계는 40 내지 70 ℃의 반응 온도 및 pH 6 내지 8의 반응 pH 에서 수행되는 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 헥소키나제(hexokinase)를 이용하여, 과당 또는 과당 함유 물질로부터 과당-6-인산을 제조하는 단계를 추가로 수행하는 것인 방법.
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