JP2023526624A - アルロースの酵素生成 - Google Patents

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Abstract

本発明は、他のアルロース生成方法における酵素と比較して、発現の改善、安定性の改善、及びフルクトース変換活性に対するアルロースの低いこととして特徴付けられる酵素を使用したアルロースの酵素生成のための改善されたプロセスに関する。改善されたプロセスは、アルロース６－リン酸エピメラーゼを使用してフルクトース－６－リン酸をアルロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に変換するステップと、アルロース－６－ホスフェートホスファターゼを使用してＡ６Ｐをアルロースに変換するステップとを含む。【選択図】図３

Description

配列表
本明細書に提出された配列表は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介するＡＳＣＩＩテキストファイル（２０２１－０５－１８＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５、２０２１年５月１８日の作成、４８，１０３バイト）であり、参照により本明細書に組み込まれる。
関連出願の相互参照
この出願は、２０２０年５月１８日に出願された米国出願第６３／０２６，２９４号の優先権を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、Ｄ－アルロースを生成するための改善された酵素プロセスに関する。
Ｄ－プシコース、又は単に、アルロースとしても知られているＤ－アルロースは、低カロリーの天然甘味料であり、スクロースの７０％の甘味があるが、そのカロリーのわずか１０％である。天然に存在する単糖類ヘキソースであり、小麦などの植物に少量存在する。アルロースは、２０１２年に食品医薬品局（ＦＤＡ）によって食品添加物として承認され、一般に、安全であると認められている（ＧＲＡＳ）。しかしながら、アルロースの高コストにより、甘味料としてのその使用は制限されている。それにもかかわらず、アルロースは、スクロースのカロリーの１０％を有するに加えて、低い血糖指数１、代謝されることのない小腸で完全な吸収、尿及び糞便中でその除去をもたらすこと、並びに血糖を調節するのに役立つアルファ－アミラーゼ、スクラーゼ及びマルターゼの阻害、を含む、多くの健康上の利点を誇り、全てが、スクロースの食品及び飲料と同様の食品及び飲料の機能性を有する。したがって、アルロースは、食品及び飲料業界における様々な用途を有する。
アルロースは、主に、フルクトースの酵素異性化を伴う方法によって生成される。例えば、ＰＣＴ出願公開第２０１４／０４９３７３号を参照されたい。全体的に、そのような方法は、アルロースのフルクトースからの高価な分離、及びそれらに関連する比較的低い生成物収率が、より高い原料コストをもたらすために、商業的に実行可能ではない。
エピメラーゼを使用してフルクトース６－リン酸をアルロース６－リン酸に触媒し、続いて、脱リン酸化ステップによってアルロースを生成するための代替的なプロセスは、ＰＣＴ出願公開第２０１８／１１２１３９号、同第２０１８／００４３０８号、及び同第２０１８／１２９２７５号に記載されているが、これら、及び他の代替的なアルロース生成方法は、より低い量の酵素を使用して、より高い収率を提供するアルロースを生成するためのプロセスの長年のニーズを満たさない。このような改善を念頭に置いて、以下の開示は、より高い発現、安定性を有し、現在用いられているアルロース生成方法と比較して、低い望ましくないアルロース変換活性に関連する、アルロースの生成に使用するための酵素を記載する。上記の改善は、アルロース生成のコストを減少させることにおける強い工業的及び商業的関心に合致する。
本発明は、酵素的に、例えば、多糖類、オリゴ糖類、二糖類、スクロース、Ｄ－グルコース、及びＤ－フルクトースなどの糖類をアルロースに変換する改善されたアルロース調製方法を提供する。一態様では、糖からのアルロースの生成のための本発明の改善されたプロセスは、アルロース６－リン酸エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）を使用してフルクトース－６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をアルロース６－フォスフェート（Ａ６Ｐ）に変換するステップを含み、Ａ６ＰＥは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の態様では、糖からのアルロースの生成のための本発明による改善されたプロセスは、アルロース－６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）を使用してＡ６Ｐをアルロースに変換するステップを含み、Ａ６ＰＰは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の実施形態では、改善されたプロセスは、アルロース６－リン酸エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）を使用してフルクトース－６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をアルロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に変換する工程を含み、Ａ６ＰＥは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ａ６Ｐは、アルロース－６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）を使用してアルロースに変換する工程を含み、Ａ６ＰＰは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
アルロースを調製するための本発明のプロセスはまた、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒されるステップにおいて、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）をＦ６Ｐに変換することを伴ってもよい。本発明による他のプロセスは、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される反応によってグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をＧ６Ｐに変換するステップを更に含み得るが、それ以外のプロセスは、少なくとも１つの他の酵素によって触媒される反応による糖のＧ１Ｐへの変換を更に含み得る。
本明細書に記載の方法のいずれかで使用される糖は、デンプン又はその誘導体、セルロース又はその誘導体、及びスクロースからなる群から選択され得る。その点で、デンプン又はその誘導体は、例えば、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、マルトトリオース、又はグルコースであり得る。本発明のいくつかの改善されたプロセスでは、デンプンは、酵素加水分解によって又はデンプンの酸加水分解によってデンプン誘導体に変換される。デンプン誘導体を得るためのデンプンの酵素加水分解の例としては、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、アルファ－アミラーゼ、又はこれらの酵素のうちの２つ以上の組み合わせによって触媒される反応が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のいくつかのプロセスは、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を添加することを更に伴い得る。
アルロースを調製するための本発明の他のプロセスは、少なくとも１つの酵素によって触媒される、フルクトースをＦ６Ｐに変換するステップを更に含む。本発明の他のプロセスは、少なくとも１つの酵素によって触媒される反応において、スクロースをフルクトースに変換するステップを更に含む。アルロースを調製するためのプロセスで使用されるＧ６Ｐはまた、少なくとも１つの酵素によって触媒される反応において、グルコースをＧ６Ｐに変換することによって生成され得る。次に、グルコースは、少なくとも１つの酵素によって触媒されてスクロースをグルコースに変換することによって生成することができる。
本発明のプロセスは、約３７℃～約８５℃の範囲の温度、約４～約９の範囲のｐＨ、及び／又は約０．５時間～約４８時間、又は連続反応として、を含む、様々な反応条件下で実施され得る。いくつかの実施形態では、アルロースを調製するためのプロセスのステップは、単一の反応器内で前述の反応条件のうちのいずれか１つ以上の条件下で実施される。他の実施形態では、反応ステップは、複数のバイオリアクターを使用して、前述の反応条件下で実施され、これは、一連に配置され得る。
本発明のいくつかのプロセスでは、アルロースを調製するためのステップは、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭのリン酸濃度で、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）又はＮＡＤ（Ｈ）、すなわち、ＡＴＰ非含有又はＮＡＤ（Ｈ）非含有ではない条件下で実施され、リン酸は、再循環され、及び／又はＡ６Ｐをアルロースに変換するステップは、エネルギー的に好ましい化学反応を伴う。
デンプン又はその誘導体生成物をアルロースに変換する酵素経路を示す概略図である。以下の略語が使用されている。αＧＰ、アルファ－グルカンホスホリラーゼ又はデンプンホスホリラーゼ；ＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ；ＰＧＩ、ホスホグルコイソメラーゼ；Ａ６ＰＥ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ；Ａ６ＰＰ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ；ＩＡ、イソアミラーゼ；ＰＡ、プルラナーゼ；ＭＰ、マルトースホスホリラーゼ；ＰＰＧＫ、ポリリン酸グルコキナーゼ。本発明のプロセスでは、Ａ６ＰＥは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／又はＡ６ＰＰは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。 セルロース又はその誘導体をアルロースに変換する酵素経路を示す。ＣＤＰ、セロデキストリンホスホリラーゼ；ＣＢＰ、セロビオースホスホリラーゼ；ＰＰＧＫ、ポリリン酸グルコキナーゼ；ＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ；ＰＧＩ、ホスホグルコイソメラーゼ；Ａ６ＰＥ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ；Ａ６ＰＰ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ。本発明のプロセスでは、Ａ６ＰＥは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／又はＡ６ＰＰは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。 フルクトースをアルロースに変換する酵素経路を示す概略図である。ＰＰＦＫ、ポリリン酸フルクトキナーゼ、Ａ６ＰＥ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ、Ａ６ＰＰ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ。本発明のプロセスでは、Ａ６ＰＥは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／又はＡ６ＰＰは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。 グルコースをアルロースに変換する酵素経路を示す概略図である。ＰＰＧＫ、ポリリン酸グルコキナーゼ；ＰＧＩ、ホスホグルコイソメラーゼ；Ａ６ＰＥ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ；Ａ６ＰＰ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ。本発明のプロセスでは、Ａ６ＰＥは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／又はＡ６ＰＰは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。 スクロース又はその誘導体をアルロースに変換する酵素経路を示す。ＳＰ、スクロースホスホリラーゼ；ＰＰＦＫ、ポリリン酸フルクトキナーゼ；ＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ；ＰＧＩ、ホスホグルコイソメラーゼ；Ａ６ＰＥ、アルロース６－リン酸エピメラーゼ；Ａ６ＰＰ、アルロース６－リン酸ホスファターゼ。本発明のプロセスでは、Ａ６ＰＥは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／又はＡ６ＰＰは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。 ＨＰＬＣによって測定したマルトデキストリンからアルロースへの変換を示す。以下の酵素を使用した：αＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ８ＮＣＣ０）、ＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１）、ＰＧＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＳＬＬ６）、Ａ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｅ３ＮＣＨ４）、及び４ＧＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８ＭＸＰ８）。Ａ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８）及び（Ｕｎｉｐａｒｃ ＩＤ ＵＰＩ０００４１１８８２Ａ）を、本発明の改善されたプロセス（Ａ０Ａ２２３ＨＺＩ７）で使用されるＡ６ＰＥと比較した。 ＨＰＬＣによって測定したＧ１Ｐからアルロースへの変換を示す。以下の酵素を使用した。ＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１）、ＰＧＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＳＬＬ６）、及びＡ６ＰＥ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＱＪ４）。Ａ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ３ＤＣ２１）を、本発明の改善されたプロセスで使用されるＡ６ＰＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｅ３ＮＣＨ４）と比較した。
本明細書に記載の本発明は、糖類をアルロースに変換するための改善された酵素プロセスに関する。より具体的には、本発明は、糖類のアルロースへの変換のための改善された無細胞酵素プロセスに関する。本発明のプロセスによってアルロースに変換され得る糖類の例には、これらに限定されないが、デンプン、セルロース、スクロース、グルコース、フルクトース、及び前述の糖のいずれかに由来する生成物が挙げられる。本発明によるプロセスで使用される酵素を、組み合わせて、単一の無細胞酵素カクテルにし得る。実際、アルロースを生成するための細胞ベースの生成方法と比較して、プロセスは、少なくとも部分的には、プロセスで使用される細胞内外の基質、生成物、又はその両方の輸送を遅延させることができる細胞膜の不在に起因する、より高い反応速度を提供する。本発明のプロセスはまた、発酵培地及び細胞ベースのプロセスで使用される細胞に関連する栄養素豊富な代謝産物を含まない最終的なアルロース生成物をもたらす。
アルロースを生成するための本発明のいくつかのプロセスは、フルクトース－６－リン酸（Ｆ６Ｐ）を、本発明の前のアルロース生成方法で使用されるＡ６ＰＥ酵素のいずれか１つと比較して、１つ以上の改善された特性を有する、アルロース６－リン酸エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）によって触媒される反応によって、アルロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に変換するステップを改善する。本発明の他のプロセスは、Ａ６Ｐを、本発明の前のアルロース生成方法で使用されるＡ６ＰＰ酵素のいずれか１つと比較して、１つ以上の改善された特性を有する、アルロース－６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）によって触媒される反応によってアルロースに変換するステップを改善する。本発明のいくつかのプロセスでは、アルロースを生成するためのプロセスは、（Ｆ６ＰからＡ６Ｐへの）及び（Ａ６Ｐからアルロースへの）変換ステップを含んでもよく、改善されたＡ６ＰＥ及び改善されたＡ６ＰＰは、（Ｆ６ＰからＡ６Ｐへの）及び（Ａ６Ｐからアルロースへの）変換ステップにそれぞれ使用される。アルロースを生成するための本発明の他のプロセスは、Ａ６Ｐからアルロースへの変換ステップのための未改善のＡ６ＰＰを使用しながら、Ｆ６ＰからＡ６Ｐへの変換ステップのための改善されたＡ６ＰＥを使用してもよい。逆に、Ｆ６ＰからＡ６Ｐへの変換ステップのための未改善のＡ６ＰＥ、及びＡ６Ｐからアルロースへの変換ステップのための改善されたＡ６ＰＰを使用する、本発明のプロセスも存在する。サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリティカム（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＱＪ４）のＡ６ＰＥ、バチルス・サーモアミロボランス（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８）のＡ６ＰＥ、及びクロストリジウム・サーモセラム（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ３ＤＣ２１）のＡ６ＰＰを含むＡ６ＰＥ及びＡ６ＰＰの例については、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第２０１８／１１２１３９号を参照されたい。
アルロースを生成するためのプロセスにおいて、改善された安定性などの、より高い活性及びより良好な特性を有する酵素を使用することにより、より少量の酵素を使用することが可能になり、それにより、プロセス全体のコストが削減される。上記で論じたように、本発明の改善されたプロセスにおけるＦ６ＰのＡ６Ｐへの変換は、改善された特性を有するＡ６ＰＥによって触媒され、以下の改善された特性、のうちの１つ以上を含む、アルロース生成プロセスにおける改善に寄与する：サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリティカム（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＱＪ４）由来の好熱Ａ６ＰＥと比較して、より高い発現収率、熱安定性、及びフルクトースエピマー化活性に対する望ましくないアルロースの低さ。
本発明のいくつかのプロセスでは、改善されたプロセスにおけるＡ６ＰＥの発現収率は、発現収率を有し、これは、限定されないが、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＱＪ４（サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリティカム）のアミノ酸配列を有するＡ６ＰＥなどの未改善のプロセスにおけるＡ６ＰＥの発現収率よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、又は少なくとも４００％高い。例えば、アルロースを生成するための本発明のプロセスでは、Ｆ６ＰをＡ６Ｐに変換するステップは、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ２２３ＨＺＩ７（クロストリジウム・サーモサッカロリティクム）のアミノ酸配列を有するＡ６ＰＥを使用し、これは、発現収率がＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＱＪ４のアミノ酸配列を有するＡ６ＰＥよりも約３００％、３１０％、３２０％、３３０％、３４０％、３５０％、３６０％、３７０％、３８０％、３９０％、又は４００％高い。
本発明のいくつかのプロセスでは、改善されたプロセスにおけるＡ６ＰＥは、改善されていないプロセスにおけるＡ６ＰＥよりも安定である。より具体的には、本発明の改善されたプロセスにおけるＡ６ＰＥは、改善されていないプロセスにおけるＡ６ＰＥよりも熱安定であり得る。実際、本発明のいくつかのプロセスにおけるＡ６ＰＥは、５０℃～６０℃での３０分後、５０％～６０％可溶性、６０％～７０％可溶性、７０％～８０％可溶性、８０％～９０％可溶性、９０％～１００％可溶性、又は１００％可溶性のままであり得る。Ｆ６ＰのＡ６Ｐへの変換が、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ２２３ＨＺＩ７のアミノ酸配列を有する改善されたプロセスでＡ６ＰＥを使用する本発明のプロセスでは、Ａ６ＰＥは、約６０℃での３０分後に約８０％可溶性のままであり得、したがって、改善されたプロセスでのＡ６ＰＥは、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、又は６６℃で２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５分後に、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、又は８５％可溶性であり得る。
Ａ６ＰＥによるアルロースのフルクトースへの変換は、アルロースを生成するプロセスにおいて望ましくない。本発明のいくつかの改善されたプロセスでは、フルクトースへのＡ６ＰＥ依存性アルロース変換活性は、アルロースを生成するための未改善のプロセスよりも低い。本発明の改善されたプロセスでは、例えば、１％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、０．１％以下、又は０％の本発明のプロセスによって生成されたアルロースが、フルクトースに変換される。
本発明の改善されたプロセスで使用されるＡ６ＰＥ酵素は、Ｆ６Ｐ／Ａ６Ｐに特異的であり、Ａ６ＰＥによって触媒されるエピマー化は、可逆的である。「特異的」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の改善されたプロセスにおけるＡ６ＰＥのＦ６／Ａ６Ｐエピマー化活性が、反応中に存在する他のリン酸化単糖についてよりも高いことを意味する。例えば、本発明の改善されたプロセスにおけるＡ６ＰＥのＦ６Ｐ／Ａ６Ｐのエピマー化活性は、Ｇ６Ｐについてのそのエピマー化活性よりも高い。
本発明の改善されたプロセスにおけるＦ６ＰからＡ６Ｐへの変換は、マグネシウム、マンガン、コバルト、又は亜鉛などの二価金属Ａ６ＰＥ補因子を利用してもよい。本発明のいくつかのプロセスでは、例えば、コバルトは、Ｆ６ＰからＡ６Ｐへの変換反応ステップにおけるＡ６ＰＥの補因子である。
上述したように、本発明の改善されたプロセスにおけるＡ６ＰＥ酵素の特性の例には、限定されないが、発現収率の増加、安定性の増加、及びアルロースのフルクトースへの変換の減少が含まれる。本発明のいくつかの改善されたプロセスでは、Ａ６ＰＥのアミノ酸配列は、好熱性である。より具体的には、本発明のある特定の改善されたプロセスにおけるＡ６ＰＥは、クロストリジウム・サーモサッカロリティクム由来のＡ６ＰＥと８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する。したがって、本発明のいくつかの改善されたプロセスでは、Ａ６ＰＥのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰＲｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ２２３ＨＺＩ７の配列を有するＣ．サーモサッカロリティクム好熱性エピメラーゼのアミノ酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を共有する。
本発明のいくつかの改善されたプロセスにおけるＡ６ＰＥの別の構造的特徴は、触媒作用のための（α／β）８バレルドメインである。本発明のこれらの改善されたプロセスのいくつかでは、（α／β）８バレルドメインは、バレルの７番目のβ鎖の末端にＳｅｒ、バレルの８番目のβ鎖の末端にＳｅｒ、及び活性部位ループにＧｌｙを有するリン酸結合ドメインを含有する。本発明の他の改善されたプロセスでは、Ａ６ＰＥは、バレルの２番目及び３番目のβ鎖にＨｉｓを有する金属結合ドメインを含有する。本発明の他の改善されたプロセスでは、Ａ６ＰＥは、バレルの２番目及び７番目のβ鎖にＡｓｐを含有し、１，１プロトン移動のための酸／塩基触媒として機能する。本発明の他の改善されたプロセスでは、Ａ６ＰＥは、Ｈｉｓが金属結合及び酸／塩基触媒作用のＡｓｐで利用されるバレルの２番目のβ鎖にＨｉｓ疎水性残基－Ａｓｐシグネチャーを含有する。本発明の他の改善されたプロセスでは、Ａ６ＰＥは、リブロース－リン酸３エピメラーゼファミリー（Ｐｆａｍ ＰＦ００８３４）のメンバーである。本発明の更に他の改善されたプロセスにおいて、Ａ６ＰＥは、上記の（α／β）８バレルドメイン構造特徴のうちのいずれかのうちの２つ以上を含有する。したがって、本発明のいくつかの改善されたプロセスでは、Ａ６ＰＥは、触媒作用のための（α／β）８バレルドメイン、バレルの７番目のβ鎖の末端にＳｅｒ、バレルの８番目のβ鎖の末端にＳｅｒ、活性部位ループにＧｌｙ、バレルの２番目及び３番目のβ鎖にＨｉｓ、バレルの２番目及び７番目のβ鎖にＡｓｐ、バレルの２番目のβ鎖にＨｉｓ－疎水性残基－Ａｓｐシグネチャーを含有し、リブロース－リン酸３エピメラーゼファミリー（Ｐｆａｍ ＰＦ００８３４）のメンバーである。（α／β）８バレルドメインのこれらの特徴は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ（ｂｅｔａ／ａｌｐｈａ）８－Ｂａｒｒｅｌｓ：Ｄ－Ａｌｌｕｌｏｓｅ ６－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ３－Ｅｐｉｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００８；４７（３６）：９６０８－９６１７で参照されている。
本発明の改善されたプロセスでは、アルロース－６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）は、Ａ６Ｐをアルロースに特異的に変換するホスファターゼである。したがって、本発明の改善されたプロセスにおけるＡ６ＰＰは、Ａ６Ｐに特異的である。「特異的」という用語は、本明細書で使用される場合、Ａ６ＰＰのＡ６Ｐ脱リン酸化活性が、プロセス中の他のリン酸化単糖についてよりも高いことを意味する。例えば、本発明の改善されたプロセスのＡ６ＰＰは、Ｇ１Ｐ、Ｇ６Ｐ、及びＦ６ＰにおいてよりもＡ６Ｐにおいて高い脱リン酸化活性を有する。本発明の改善されたプロセスにおけるＡ６ＰＰはまた、亜鉛、マンガン、コバルト、又はマグネシウム、好ましくは、マグネシウムなどの二価金属補因子を利用してもよい。
本発明の改善されたプロセスにおけるＡ６Ｐのアルロースへの変換は、本発明の前のアルロースを生成するプロセスで使用されるＡ６ＰＰ酵素のいずれと比較しても、活性の増加を有するＡ６ＰＰを使用し得る。本発明のいくつかの改善されたプロセスでは、例えば、Ａ６ＰＰは、Ａ６Ｐをクロストリジウム・サーモセラム（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ３ＤＣ２１）由来のＡ６ＰＰよりも高い活性を有するアルロースに変換する。国際特許出願公開第２０１８／１１２１３９号及び同第２０１８／１２９２７５号を参照されたく、これらは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。より具体的には、本発明の改善されたプロセスでは、Ａ６ＰＰは、Ａ６Ｐ活性を有するメタノサルシナ・ＣＨＴＩ－５５由来のＡ６ＰＰのアミノ酸配列を有し、これは、ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ａ３ＤＣ２１のアミノ酸配列を有するクロストリジウム・サーモセラム由来のＡ６ＰＰの活性と比較して、少なくとも１０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、又は３００％改善される。更に具体的には、本発明のいくつかの改善されたプロセスでは、Ａ６ＰＰは、Ａ６Ｐ活性を有するＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｅ３ＮＣＨ４（配列番号２）のアミノ酸配列を有し、これは、ＵＮＩＰＲＯＴ ＩＤ Ａ３ＤＣ２１のアミノ酸配列を有するクロストリジウム・サーモセラム由来のＡ６ＰＰの活性と比較して、少なくとも１０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、又は３００％改善される。
本発明のいくつかの改善されたプロセスでは、Ａ６ＰＰは、メタノサルシナ・サーモフィラＣＨＴＩ－５５由来のＡ６ＰＰと８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有する。したがって、本発明のいくつかの改善されたプロセスでは、Ａ６ＰＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｅ３ＮＣＨ４（配列番号２）の配列を有するメタノサルシナ・サーモフィラＣＨＴＩ－５５ホスファターゼのアミノ酸配列と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を共有する。
本発明のいくつかの改善されたプロセスにおけるＡ６ＰＥの別の構造的特徴は、触媒作用のためのロスマノイドフォールドドメインである。本発明のこれらの改善されたプロセスのいくつかでは、Ａ６ＰＰは、以下の特徴のうちの１つ以上を含有する：基質特異性のためのＣ１キャッピングドメイン、第２のＡｓｐが一般的な酸／塩基触媒であるマグネシウムを配位させるためのロスマノイドフォールドの１番目のβ鎖におけるＤｘＤシグネチャー、反応中間体の安定性を助けるロスマノイドフォールドの２番目のβ鎖の末端におけるＴｈｒ又はＳｅｒ、反応中間体の安定性を助けるロスマノイドフォールドの３番目のβ鎖に対するアルファ－ヘリックスＣ末端のＮ末端におけるＬｙｓ、及びマグネシウムなどの二価金属カチオンを配位させるためのロスマノイドフォールドの４番目のβ鎖の末端におけるＥ（Ｄ／Ｎ）シグネチャー。例えば、Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨＡＤ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ａ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｅｓｔｅｒａｓｅｓ ａｎｄ Ａｌｌｉｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００６；３６１；１００３－１０３４を参照されたい。
本明細書で確立されるように、本発明の改善されたプロセスは、Ａ６ＰＥを使用してＦ６ＰをＡ６Ｐに変換するステップ、及びＡ６ＰＰを使用してＡ６Ｐをアルロースに変換するステップを含む。本発明の改善されたプロセスはまた、追加の上流ステップを含んでもよい。例えば、本発明のいくつかのプロセスは、ホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）を使用して糖からアルロースを生成して、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）をＦ６Ｐに変換する。使用され得る例示的なＰＧＩには、国際特許出願公開第２０１７／０５９２７８号に開示されているもの、クロストリジウム・サーモセラム（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ３ＤＢＸ９）由来のＰＧＩ及びサーマス・サーモフィルス（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＳＬＬ６）由来のＰＧＩが含まれる。
本発明のいくつかの改善されたプロセスには、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）を使用して、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をＧ６Ｐに変換するステップも含まれる。ＰＧＭの例は、国際特許出願公開第２０１７／０５９２７８号に開示されているサーモコッカス・コダカラエンシス（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）由来のＰＧＭ、又はＰＣＴ出願公開第２０２０／０９２３１５号に開示されているカルディバチルス・デビリス（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１）由来のＰＧＭである。
本発明のいくつかの改善されたプロセスは、少なくとも１つの酵素を使用して糖をＧ１Ｐに変換するステップも含む。例えば、改善されたプロセスは、図１に記載されるデンプン若しくはその誘導体、図２に記載されるセルロース若しくはその誘導体、図３に記載されるフルクトース、図４に記載されるグルコース、又は図５に記載されるスクロースから選択される糖を変換し得る。本発明のそのような改善されたプロセスで糖をＧ１Ｐに変換するステップで使用される酵素は、例えば、アルファ－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、及び／又はセルロースホスホリラーゼ、及びそれらの混合物であり得る。Ｆ６Ｐに到達する酵素又は酵素の組み合わせの選択は、プロセスで使用される糖に依存する。
セルロースは、最も豊富な生物資源であり、植物細胞壁の主要な構成要素である。非食品リグノセルロースバイオマスは、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニン、並びに他の軽微な構成要素を含有する。アビセル（微結晶セルロース）、再生非晶質セルロース、細菌セルロース、濾紙などを含む純粋なセルロースは、一連の処理を介して調製され得る。部分的に加水分解されたセルロース基質としては、重合度が７を超える水不溶性セロデキストリン、３～６の重合度を有する水溶性セロデキストリン、セロビオース、グルコース、及びフルクトースが挙げられる。
本発明のいくつかの改善されたプロセスでは、セルロース及びその誘導体は、セロデキストリン及びセロビオース由来のＧ１Ｐ、並びにセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）によってそれぞれ触媒されて遊離リン酸を生成することと、ＰＧＭによって触媒されてＧ１ＰをＧ６Ｐに変換することと、ＰＧＩによって触媒されてＧ６ＰをＦ６Ｐに変換することと、上述のようにＦ６Ｐをアルロースに変換することと、を含む一連の酵素ステップによってアルロースに変換され得、リン酸イオンは、セロデキストリン及びセロビオースをＧ１Ｐに変換するステップによって再循環され得る。
いくつかの酵素を使用して、固体セルロースを水溶性セロデキストリン及びセロビオースに加水分解することができる。かかる酵素には、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼが含まれるが、ベータ－グルコシダーゼ（セロビアーゼ）は含まれない。セルロース加水分解及びＧ１Ｐ生成の前に、セルロース及びバイオマスを前処理して、それらの反応性を増加させ、セルロース鎖の重合度を減少させることができる。セルロース及びバイオマスの前処理方法としては、希酸前処理、セルロース溶媒ベースのリグノセルロース分画、アンモニア繊維膨張、アンモニア水性浸漬、イオン性液体処理、及び塩酸、硫酸、リン酸を含む濃縮酸を使用することによる部分加水分解、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
糖がセロビオースを含み、酵素がセロビオースホスホリラーゼを含有する場合、Ｇ１Ｐはセロビオースホスホリラーゼによってセロビオース及びリン酸塩から生成される。糖がセロデキストリンを含有し、酵素がセロデキストリンホスホリラーゼを含む場合、Ｇ１Ｐはセロデキストリンホスホリラーゼによってセロデキストリン及びリン酸塩から生成される。糖がセルロースを含み、酵素がセルロースホスホリラーゼを含有する場合、Ｇ１Ｐはセルロースホスホリラーゼによってセルロース及びリン酸塩から生成される。
糖がマルトースを含み、酵素がマルトースホスホリラーゼを含有する場合、Ｇ１Ｐはマルトースホスホリラーゼによってマルトース及びリン酸塩から生成される。糖がスクロースを含み、酵素がスクロースホスホリラーゼを含有する場合、Ｇ１Ｐはスクロースホスホリラーゼによってスクロース及びリン酸塩から生成される。
糖がデンプン又はデンプン誘導体である場合、誘導体は、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、マルトトリオース、及びグルコース、及びそれらの混合物からなる群から選択され得る。本発明の特定のプロセスでは、糖をＧ１Ｐに変換するために使用される酵素は、αＧＰを含有する。このステップでは、糖がデンプンを含む場合、Ｇ１ＰがαＧＰによってデンプン及びリン酸塩から生成され、糖が可溶性デンプン、アミロデキストリン、又はマルトデキストリンを含有する場合、Ｇ１Ｐは、αＧＰによって、可溶性デンプン及びリン酸塩、アミロデキストリン及びリン酸塩、又はマルトデキストリン及びリン酸塩から生成される。αＧＰの例は、国際特許出願公開第２０１７／０５９２７８号に開示されているサーモトガ・マリティマ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）由来のαＧＰ、又は国際特許出願公開第２０２０／０９２３１５号に開示されているＴｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．ＣＣＢ＿ＵＳ３＿ＵＦ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｇ８ＮＣＣ０）由来のαＧＰである。
本発明によるいくつかのプロセスは、デンプンをデンプン誘導体に変換するステップを更に含み得、デンプン誘導体は、デンプンの酵素加水分解によって、又はデンプンの酸加水分解によって調製される。本発明の特定のプロセスでは、マルトースホスホリラーゼ（ＭＰ）を使用して、分解生成物マルトースをＧ１Ｐ及びグルコースに加リン酸分解的に切断することによってアルロース収率を増加させることができる。代わりに、４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）は、分解生成物グルコース、マルトース、及びマルトトリオースをより長いマルトオリゴ糖に再循環させることによって、アルロース収率を増加させるために使用することができ、これは、αＧＰによって加リン酸分解的に切断されて、Ｇ１Ｐを得ることができる。４ＧＴの例は、国際特許出願公開第２０１７／０５９２７８号に開示されているサーモコッカス・リトラリス（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ３２４６２）由来の４ＧＴ、又は国際特許出願公開第２０２０／０９２３１５号に開示されているアナエロリネア・サーモフィラ株ＤＳＭ １４５２３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｅ８ＭＸＰ８）由来の４ＧＴである。本発明のいくつかのプロセスでは、ポリリン酸及びポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）をプロセスに添加することができ、したがって、分解生成物グルコースをＧ６Ｐにリン酸化することによって、アルロースの収率を増加させる。
デンプンは自然界で最も広く使用されているエネルギー貯蔵化合物であり、ほとんどが植物の種子に貯えられている。天然デンプンには、直鎖アミロース及び分岐アミロペクチンが含有されている。デンプン誘導体の例としては、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、フルクトース、及びグルコースが挙げられる。セルロース誘導体の例としては、前処理されたバイオマス、再生された非晶質セルロース、セロデキストリン、セロビオース、フルクトース、及びグルコースが挙げられる。スクロース誘導体には、フルクトース及びグルコースが含まれる。
プロセスがデンプン誘導体を使用する場合、デンプン誘導体は、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、アルファ－アミラーゼ、又はそれらの組み合わせによって触媒されるデンプンの酵素加水分解によって調製され得る。トウモロコシのデンプンには、αＧＰの作用を妨げる多くの分枝が含まれている。イソアミラーゼ及びプルラナーゼは、デンプンを脱分枝するのに使用することができ、直鎖アミロデキストリンを得る。イソアミラーゼ前処理及びプルラナーゼ前処理デンプンは、最終生成物中のより高いＦ６Ｐ濃度をもたらし得る。イソアミラーゼ及びプルラナーゼは、アルファ－１，６－グリコシド結合を切断し、これによって、アルファ－グルカンホスホリラーゼによるデンプンのより完全な分解が可能になる。アルファ－アミラーゼは、アルファ－１，４－グリコシド結合を切断し、したがって、アルファ－アミラーゼは、アルロースへのより速い変換のためにデンプンを断片に分解するために使用される。
アルロースは、フルクトースからも生成することができる。図３を参照されたい。本発明によるプロセスはまた、フルクトースをＦ６Ｐに変換するステップであって、このステップが少なくとも１つの酵素によって触媒される、ステップと、任意選択で、スクロースをフルクトースに変換するステップであって、このステップが少なくとも１つの酵素によって触媒される、ステップとを含むことができる。例えば、このプロセスは、ポリリン酸フルクトキナーゼ（ＰＰＦＫ）によって触媒されるフルクトース及びポリリン酸由来のＦ６Ｐを生成することを伴う。Ｆ６Ｐのアルロースへの変換は、上記の通りである。フルクトースは、例えば、スクロースの酵素的変換によって生成され得る。次いで、Ａ６Ｐがアルロースに変換されたときに生成されるリン酸イオンを、スクロースをＧ１Ｐに変換するステップで再循環させることができる。
アルロースはまた、グルコースから生成することができる。図４を参照されたい。本発明によるプロセスはまた、少なくとも１つの酵素によって触媒される、グルコースをＧ６Ｐに変換するステップと、任意選択で、スクロースをフルクトースに変換するステップであって、このステップが少なくとも１つの酵素によって触媒される、ステップと、を含むことができる。例えば、このプロセスは、ポリリン酸グルコキナーゼ（ＰＰＧＫ）によって触媒されるグルコース及びポリリン酸からＧ６Ｐを生成することを伴う。グルコースは、例えば、マルトトリオースのより長い鎖のマルトデキストリンへの４－グルカントランスフェラーゼ再循環によって生成され得る。
本発明のいくつかの方法では、Ａ６Ｐがアルロースに変換されたときに生成されるリン酸イオンは、デンプン誘導体をＧ１Ｐに（例えば、図１を参照されたい）、セルロース誘導体をＧ１Ｐに（例えば、図２を参照されたい）、又はスクロースをＧ１Ｐに（図５を参照されたい）変換するステップで、特に、プロセスが単一の反応容器内で実施される場合に、再循環される。加えて、ＰＰＦＫ及びポリリン酸塩は、ＳＰによるスクロースの加リン酸分解的切断によって生成されたフルクトース由来のＦ６Ｐを生成することによって、アルロース収量を増加させるために使用され得る。
例えば、糖からアルロースを調製するためのプロセスとしては、以下のステップが挙げられる。（ｉ）１つ以上の酵素を使用して糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換すること、（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ５．４．２．２）を使用してＧ１ＰをＧ６Ｐに変換すること、（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ５．３．１．９）を使用してＧ６ＰをＦ６Ｐに変換すること、（ｉｖ）アルロース６－リン酸エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）を介してＦ６ＰをＡ６Ｐに変換すること、及び（ｖ）アルロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）を介してＡ６Ｐをアルロースに変換すること。本発明の改善されたプロセスでは、Ａ６ＰＥは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／又はＡ６ＰＰは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そのようなプロセスでは、例えば、ステップ（ｉ）における酵素は、αＧＰである。典型的には、プロセスで使用される酵素単位の比は、１：１：１：１：１である（αＧＰ：ＰＧＭ：ＰＧＩ：Ａ６ＰＥ：Ａ６ＰＰ）。酵素単位は、１ｕｍｏｌの基質を１分で生成物に変換するために必要な酵素の量である。したがって、より高い活性を有する酵素は、同じ反応を触媒するより低い活性を有する酵素と比較して、１酵素単位当たりの酵素のｍｇという点で、より少ない量の酵素を有することになる。生成物の収率を最適化するために、これらの比は、任意の数の組み合わせで調整され得る。例えば、特定の酵素は、別の酵素の量に対して、約２倍、３倍、４倍、５倍などの量で存在してもよい。
本発明によるアルロースの調製方法は、以下の追加のステップ、酵素加水分解又は酸加水分解によって多糖及びオリゴ糖からグルコースを生成するステップ、少なくとも１つの酵素によって触媒されてグルコースをＧ６Ｐに変換するステップ、酵素加水分解又は酸加水分解によって多糖及びオリゴ糖からフルクトースを生成するステップ、並びに少なくとも１つの酵素によって触媒されてフルクトースをＧ６Ｐに変換するステップを含み得る。多糖及びオリゴ糖の例は、上に列挙されている。
本発明によるアルロースを調製するプロセスは、単一のバイオリアクター又は反応容器内で実施され得る。あるいは、これらのステップはまた、直列に配置される複数のバイオ反応器、又は反応容器内で実施され得る。好ましいプロセスでは、アルロースの酵素産生は、単一反応容器内で実施される。
本発明で使用される酵素は、可溶性の、固定化された、構築された、又は凝集したタンパク質の形態をとってもよい。これらの酵素は、当該技術分野で既知であるように、機能性を向上させるために一般的に使用される不溶性の有機支持体又は無機支持体に吸着させ得る。これらには、アガロース、メタクリレート、ポリスチレン、フェノールホルムアルデヒド、又はデキストランなどの高分子支持体、並びにガラス、金属、又は炭素系材料などの無機支持体が含まれる。これらの材料は、しばしば、固定化酵素の付着及び活性を促進する大きい表面積対体積比及び特殊化された表面で生成される。酵素は、共有結合性、イオン性、又は疎水性の相互作用を介して、これらの固体支持体に付着され得る。酵素はまた、共有結合性融合などの遺伝子操作された相互作用を介して、固体支持体への親和性を有する別のタンパク質又はペプチド配列に、最も多くの場合にはポリヒスチジン配列）に、付着され得る。酵素は、表面若しくは表面コーティングに直接付着されてもよく、又は表面若しくは表面コーティング上に既に存在する他のタンパク質に付着されてもよい。酵素は、全て１つの担体上で、個々の担体上で、又は２つの担体の組み合わせ上で（例えば、担体当たり２つの酵素、次いで、それらの担体を混合する）、固定化することができる。これらのバリエーションは、連続反応器内のターンオーバーを最適化するために、均一に又は所定の層内で混合することができる。例えば、反応器の始まりは、ａＧＰの層を有して、高い初期Ｇ１Ｐ増加を確実にしてもよい。酵素は、１つの担体、個々の担体、又は群の状態で全て固定され得る。これらの酵素は、ターンオーバーを最適化するために、均一に又は所定の層若しくはゾーン内で混合されてもよい。
例えば、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、ＢＩＳ－ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、Ｔｒｉｚｍａ、リン酸緩衝液などの、当該技術分野において既知の任意の好適な生物学的緩衝液を、本発明の改善されたプロセスで使用することができる。全ての実施形態の反応緩衝液は、４．０～９．０の範囲のｐＨを有し得る。より好ましくは、反応緩衝液のｐＨは、約６．０～約７．８の範囲であり得る。例えば、反応緩衝液のｐＨは、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、又は７．８であり得る。
本発明のいくつかの改善されたプロセスでは、反応緩衝液は、二価の金属カチオンを含有する。例には、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋及びＺｎ２＋など、好ましくは、Ｃｏ２＋及びＭｇ２＋が含まれる。二価の金属カチオンの濃度は、約０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、又はより好ましくは、約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であり得る。例えば、二価の金属カチオンの濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、又は約５５ｍＭであり得る。
改善されたプロセスステップが実施される反応温度は、３７～８５℃の範囲であり得る。より好ましくは、ステップは、約３７℃～約８５℃の範囲の温度で実施される。温度は、例えば、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、又は約６０℃であり得る。好ましくは、反応温度は、約５０℃である。本発明のいくつかの改善されたプロセスでは、反応温度は一定であり、プロセス中に変更されない。
開示されるプロセスの反応時間は、必要に応じて調整され得、約０．５時間～約４８時間の範囲であり得る。例えば、反応時間は、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約２６時間、約２８時間、約３０時間、約３２時間、約３４時間、約３６時間、約３８時間、約４０時間、約４２時間、約４４時間、約４６時間、又は約４８時間であり得る。より好ましくは、反応時間は、約２４時間である。
本発明の改善されたプロセスにおけるステップは、充填層反応器又は同様の装置を使用して、バッチプロセス又は連続プロセスで実行され得る。連続プロセスでは、溶液マルトデキストリンは、溶液が下流処理のためにカラムを離れるときにアルロースへの変換が完了するような速度で、固定化酵素の層を通してポンプで送られる。例えば、２００ｇ／Ｌのマルトデキストリンは、マルトデキストリンがカラムを離れるときに最大のアルロース収率が達成されるように、固定化された酵素を充填したカラム（例えば、５０℃に維持される）を通してポンプで送られ得る。この方法論は、バッチ法よりも高い体積生産性を提供する。これにより、我々の生成物がカラム及び反応条件と関連する時間が制限され、生成物分解（例えば、潜在的なヒドロキシメチルフルフラール形成）の可能性が低下する。バッチモードでも又は連続モードでも、本発明のプロセスの様々なステップは、他のステップと同じ反応条件を使用して実施され得る。例えば、単一のバイオリアクター又は反応容器を使用する本発明の特定のプロセスでは、ｐＨ及び温度、並びに反応緩衝液などの反応条件は、プロセスの全てのステップで一定に保たれる。
次いで、Ａ６ＰのＡ６ＰＰ脱リン酸化によって生成されたリン酸イオンを、特に、全てのプロセスステップが単一のバイオリアクター又は反応容器内で実施される場合に、糖をＧ１Ｐに変換するプロセスステップで再循環させることができる。開示されるプロセスでリン酸塩を再循環させる能力により、非化学量論的な量のリン酸塩を使用することができ、これにより反応リン酸塩濃度が低く維持される。これは、全体的な経路及びプロセスの全体的な速度に影響を与えるが、個々の酵素の活性を制限するものではなく、アルロース作製プロセスの総合効率を可能にする。
例えば、反応リン酸濃度は、約０．１ｍＭ～約３００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、又はより好ましくは、約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であり得る。例えば、反応のリン酸濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、又は約５５ｍＭであり得る。
リン酸濃度が低いと、総リン酸濃度が低いことから、生産コストが低減され、したがって、リン酸除去のコストが減少される。それはまた、高濃度の遊離リン酸によるＡ６ＰＰのプロセス酵素の阻害を防止し、リン酸汚染の可能性が減少される。
更に、本明細書に開示されるプロセスは、リン酸の、すなわち、ＡＴＰ非含有の供給源としてＡＴＰを添加することなく、実施され得る。プロセスは、ＮＡＤ（Ｈ）を、すなわち、ＮＡＤ（Ｈ）非含有を添加する必要がなく、実施され得る。他の利点としてはまた、アルロースを生成するための開示されたプロセスの少なくとも１つのステップが、エネルギー的に好ましい化学反応を伴うという事実が挙げられる。より高い活性を有する酵素の使用は、全体的なエネルギーに影響を及ぼさないが、改善されたプロセスにおいてより少量の酵素を使用する能力は有利である。利点は、生成物の総生産コストにおける酵素の全体的なコストの低減である。
本発明によるプロセスは、反応全体についての非常に好ましい平衡定数による高い収率を達成することができる。理論的には、出発材料が完全に中間体に変換される場合に、最大９９％の収率を達成することができる。また、本発明によるＡ６Ｐをアルロースに変換するステップは、原料にかかわらず、不可逆的なホスファターゼ反応である。したがって、アルロースは、非常に高い収率で生成される。
本発明のプロセスは、低コストの出発材料を使用し、原料及び生成物分離に関連するコストを減少させることによって、生成物コストを低減する。デンプン及びその誘導体、セルロース及びその誘導体、並びにスクロースは、例えば、結晶フルクトースよりも低価格の原料である。アルロースがフルクトースから生成される場合、収率は約２８％に過ぎない（ＷＯ２０１６／１６０５７３）。次いで、フルクトース及びアルロースをクロマトグラフィーによって分離し、これは、同時に、開示された方法よりも高い生成コストにつながる。
本発明によるプロセスは、アルロースの容易な回収を可能にし、分離コストを最小限に抑える。好ましくは、本発明のプロセスでは、アルロースの回収は、クロマトグラフィー分離を介してではない。連続反応におけるアルロースの生成後、生成物は、代わりに、限外濾過、イオン交換（カチオン、次いでアニオン、混床ではない）、濃縮、結晶化、結晶単離、及び乾燥に供される。アルロースの収率が高いため、アルロースを精製するために必要なのは結晶化ステップだけである。結晶化の前にアルロースを更に精製するために、結晶化プロセス及びナノ濾過に存在する酵素のリスクを排除する限外濾過を使用して、アルロースと共結晶化し得るか、又は母液（マルトデキストリン、マルトテトラオース、マルトトリオース、マルトースなど）の再循環性を制限し得る任意の未変換デキストリンを除去する限外濾過が使用され得る。
本発明によるアルロースを調製するための改善されたプロセスには、以下のステップが含まれる。（ｉ）１つ以上の酵素を使用して糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップ、（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ５．４．２．２）を使用してＧ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ５．３．１．９）を使用してＧ６ＰをＦ６Ｐに変換するステップ、（ｉｖ）アルロース６－リン酸エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）を介してＦ６ＰをＡ６Ｐに変換するステップ、及び（ｖ）アルロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）を介してＡ６Ｐをアルロースに変換するステップであって、Ａ６ＰＥが、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／又はＡ６ＰＰが、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップ。このプロセスは、好ましくは、単一のバイオリアクター又は反応容器内で実施される。
好ましくは、本発明によるアルロースの調製のための改善されたプロセスには、以下のステップが含まれる。（ｉ）αＧＰを使用して糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップであって、糖が、デンプン、デンプンの１つ以上の誘導体、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、変換するステップ、（ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ、ＥＣ５．４．２．２）を使用してＧ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、（ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ、ＥＣ５．３．１．９）を使用してＧ６ＰをＦ６Ｐに変換するステップ、（ｉｖ）アルロース６－リン酸エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）を介してＦ６ＰをＡ６Ｐに変換するステップ、（ｖ）アルロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）を介してＡ６Ｐをアルロースに変換するステップであって、Ａ６ＰＥが、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ／又はＡ６ＰＰが、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップ。プロセスは、好ましくは、単一の反応器容器内で実施され、上記で論じた様々なプロセス条件のうちの１つ以上を組み込んでもよい。
材料及び方法 グルコース１－リン酸、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム（一塩基及び二塩基）を含む全ての化学物質は、別段の記載がない限り、試薬グレード以上であり、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）又はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）から購入される。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を、組換えタンパク質発現のための宿主細胞として使用した。５０ｍｇのＬ－１カナマイシンを含有するＺＹＭ－５０５２培地を、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞増幅及び組換えタンパク質発現のために使用した。
組換え酵素の生成及び精製 タンパク質発現プラスミド（ｐＥＴ２８ａ）を含有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、５０ｍｇＬ－１のカナマイシンを含有する１００ｍＬのＺＹＭ－５０５２培地とともに１Ｌエルレンマイヤーフラスコでインキュベートした。細胞を３７℃で増殖させ、２２０ｒｐｍで１６～２４時間回転振盪させた。細胞を、１２℃での遠心分離によって採取し、以下のいずれかで１回洗浄した。熱沈殿のために５０ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）又はＮｉ精製のために３００ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのイミダゾールを含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）。細胞ペレットを、同じ緩衝液中に再懸濁し、超音波処理によって溶解させた。遠心分離後、上清中の標的タンパク質を精製した。Ｈｉｓタグ付きタンパク質を、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ Ｎｉ－Ｃｈａｒｇｅｄ Ｒｅｓｉｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって精製した。精製したタンパク質の量を、２８０ｎｍの吸光度で定量化し、表１における相対発現収率計算に使用した。
熱安定性 タンパク質発現プラスミド（ｐＥＴ２８ａ）を含有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、５０ｍｇＬ－１のカナマイシンを含有する１００ｍＬのＺＹＭ－５０５２培地とともに１－Ｌエルレンマイヤーフラスコでインキュベートした。細胞を３７℃で増殖させ、２２０ｒｐｍで１６～２４時間回転振盪させた。細胞を、１２℃での遠心分離によって採取し、５０ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するいずれかの２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）で１回洗浄した。細胞ペレットを、同じ緩衝液に再懸濁し、超音波処理により溶解した。遠心分離後、上清中の標的タンパク質を、熱安定性のために、５０～８０℃で３０分間試験した。組換えタンパク質の安定性を、表１に記載されるように、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって調べ、目視検査によって記録した。
Figure 2023526624000002
実施例１．改善されたプロセスにおいて、Ｇ１Ｐのアルロースへのアルロース６－リン酸エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）依存性変換の相対的活性を評価すること。ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ２２３ＨＺＩ７（「Ａ０Ａ２２３ＨＺＩ７ Ａ６ＰＥ」）のアミノ酸配列を有するＡ６ＰＥを含む酵素プロセスによるＧ１Ｐのアルロースへの変換を、各プロセスで使用されるＡ６ＰＥに対してのみ異なるＧ１Ｐからアルロースへの変換プロセスと比較した。より具体的には、Ｇ１Ｐからアルロースへの変換は、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１のアミノ酸配列を有するＰＧＭ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＳＬＬ６のアミノ酸配列を有するＰＧＩ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＱＪ４、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ８ＵＶ２８、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｇ７Ｍ２Ｉ３、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０９４ＷＬＭ１、Ｕｎｉｐａｒｃ ＩＤ ＵＰＩ０００４１１８８２Ａ、又はＵｎｉｐｒｏｔ Ｐ３２７１９のアミノ酸配列を有するＡ０Ａ２２３ＨＺＩ７ Ａ６ＰＥ又はＡ６ＰＥ（Ｐ３２７１９酵素は５０℃で不安定である）、及びＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｅ３ＮＣＨ４のアミノ酸配列を有するＡ６ＰＰ、を含むプロセスを使用して比較した。各プロセスは、３８．５ｍＭのＧ１Ｐ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＣｏＣｌ２、０．０５ｇ／ＬのＰＧＭ、０．０５ｇ／ＬのＰＧＩ、０．０２５ｇ／ＬのＡ６ＰＥ、及び０．１５ｇ／ＬのＡ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物で実行した。反応物を５０℃で３時間インキュベートした。Ａ６ＰＥは、Ｇ１Ｐのアルロースへの変換における速度制限酵素であった。Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を使用した酵素濾過によって反応を停止し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈカラム及び屈折率検出器を使用したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）によって分析した。試料の実行は、５ｍＭのＨ２ＳＯ４中０．６ｍＬ／分で、１５．５分間、６５℃におけるものであった。
結果において、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａ８ＵＶ２８アミノ酸配列を有するＡ６ＰＥが試験した条件下では活性でなかったことを除いて、活性における有意なＡ６ＰＥ依存的差異は示されなかった。
実施例２．より低いアルロース６リン酸エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）依存性アルロースからフルクトースへの変換活性の評価。Ａ０Ａ２２３ＨＺＩ７ Ａ６ＰＥを含む酵素プロセスによるアルロースからフルクトースへの変換を、各プロセスで使用されるＡ６ＰＥに関してのみ異なるアルロースからフルクトースへの変換プロセスと比較した。より具体的には、アルロースからフルクトースへの変換を、Ａ０Ａ２２３ＨＺＩ７ Ａ６ＰＥ、又はＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＱＪ４、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｇ７Ｍ２Ｉ３、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０９４ＷＬＭ１、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ２２３ＨＺＩ７、若しくはＵｎｉＰａｒｃ ＩＤ ＵＰＩ０００４１１８８２Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ３２７１９及びＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ８ＵＶ２８のアミノ酸配列を有するＡ６ＰＥは、経路との不適合により省略された）のアミノ酸配列を有するＡ６ＰＥを含むプロセスを使用して、比較した。各プロセスは、２００ｇ／Ｌのアルロース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＣｏＣｌ２、及び０．０２５ｇ／Ｌ又は０．２５ｇ／ＬのＡ６ＰＥを含有する０．２０ｍＬの反応混合物中で実行した。反応物を、５０℃で６時間インキュベートした。反応を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）による酵素の濾過によって停止し、ＳｕｐｅｌＣｏｇｅｌ Ｐｂカラム及び屈折率検出器を使用してＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）によって分析した。試料の実行は、８０℃で４０分間、０．６ｍＬ／分の超純水中におけるものであった。
表２に要約された結果は、試験したＡ６ＰＥが、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８及びＵｎｉＰａｒｃ ＩＤ ＵＰＩ０００４１１８８２Ａのアミノ酸配列を有する酵素を除いて、アルロースから比較的少ないフルクトースを生成したことを示した。特に、アルロースのフルクトースへの変換は、０．０２５ｇ／Ｌの酵素組成物におけるＡ０Ａ２２３ＨＺＩ７ Ａ６ＰＥについては観察なかった。
Figure 2023526624000003
実施例３．マルトデキストリンのアルロースへの変換において改善された特性を有するアルロース６－リン酸エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）の相対的活性の評価。Ａ０Ａ２２３ＨＺＩ７ Ａ６ＰＥ（フルクトースからアルロースへの活性が示されなかった）を含む酵素プロセスによる、マルトデキストリンのアルロースへの完全カスケード変換を、各プロセスで使用されるＡ６ＰＥに対してのみ異なるマルトデキストリンからアルロースへの変換プロセスと比較して、異なるフルクトースからアルロースへの活性を有するＦ６ＰＥがアルロース収率にどのように影響するかを決定した。より具体的には、マルトデキストリンからアルロースへの変換を、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｇ８ＮＣＣ０のアミノ酸配列を有するαＧＰ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１のアミノ酸配列を有するＰＧＭ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＳＬＬ６のアミノ酸配列を有するＰＧＩ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８（高いフルクトースからアルロースへの活性を示した）若しくはＵｎｉＰａｒｃ ＩＤ ＵＰＩ０００４１１８８２Ａ（中程度のフルクトースからアルロースへの活性を示した）を有するＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ２２３ＨＺＩ７ Ａ６ＰＥ又はＡ６ＰＥ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｅ３ＮＣＨ４のアミノ酸配列を有するＡ６ＰＰ、及びＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｅ８ＭＸＰ８のアミノ酸配列を有する４ＧＴを含むプロセスを使用して比較した。各プロセスは、１００ｇ／Ｌの脱分枝Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈマルトデキストリンＤＥ ４－７、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＣｏＣｌ２、０．３ｇ／ＬのαＧＰ、０．０７５ｇ／ＬのＰＧＭ、０．０７５ｇ／ＬのＰＧＩ、０．１ｇ／ＬのＡ６ＰＥ、０．１ｇ／ＬのＡ６ＰＰ、及び０．０４ｇ／Ｌの４ＧＴを含有する０．２０ｍＬ反応混合物で実行した。反応が分析時に完全に完了しなかったような反応物を、５０℃で１８時間インキュベートした。反応を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）による酵素の濾過によって停止し、ＳｕｐｅｌＣｏｇｅｌ（登録商標）Ｐｂカラム及び屈折率検出器を使用してＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）１１００シリーズ）によって分析した。試料の実行は、８０℃で４０分間、０．６ｍＬ／分の超純水中におけるものであった。
図６に示される結果は、ＵｎｉＰａｒｃ ＩＤ ＵＰＩ０００４１１８８２Ａのアミノ酸配列を有するＡ６ＰＥを伴うプロセスが、Ａ０Ａ２２３ＨＺＩ７Ａ６ＰＥを伴うプロセスよりも実質的に多くのフルクトースを生成したことを示した。予想通り、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８のアミノ酸配列を有するＡ６ＰＥを含むプロセスは、中間量のフルクトースを生成した。Ａ０Ａ２２３ＨＺＩ７ Ａ６ＰＥを含むプロセスは、１８時間で最も多くのアルロースを生成した。これは、最も高いアルロース収率経路、Ａ６ＰＥを使用したアルロースを生成するための任意の以前に開示されたよりも効率的なものをもたらした。所与のＡ６ＰＥ酵素に対するＦ６Ｐ／Ａ６Ｐ対アルロースについての相対的親和性は、フルクトースからアルロースへの活性とアルロースからマルトロデキストリンへのカスケードとの間の観察された差異によって実証される。例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８のアミノ酸配列を有するＡ６ＰＥは、Ｕｎｉｐａｒｃ ＩＤ ＵＰＩ０００４１１８８２Ａのアミノ酸配列を有するＡ６ＰＥと比較して、アルロース単独からより高い量のフルクトースを生成したが、完全なカスケード反応では、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８のアミノ酸配列を有するＡ６ＰＥは、Ｆ６Ｐ／Ａ６Ｐが、Ｕｎｉｐａｒｃ ＩＤ ＵＰＩ０００４１１８８２Ａのアミノ酸配列を有するＡ６ＰＥよりもこの酵素についてより効率的にアルロースと競合することができるために、より良い性能を示す。
実施例４．Ｇ１Ｐのアルロースへの変換における改善された特性を有するアルロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）の相対的活性の評価。ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｅ３ＮＣＨ４（「Ａ０Ａ０Ｅ３ＮＣＨ４ Ａ６ＰＰ」）のアミノ酸配列を有するＡ６ＰＰを使用した酵素プロセスによるＧ１Ｐのアルロースへの変換を、各プロセスで使用されるＡ６ＰＰのみに関して異なるアルロース変換プロセスに対するＧ１Ｐと比較した。より具体的には、Ｇ１Ｐからアルロースへの変換を、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１のアミノ酸配列を有するＰＧＭ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＳＬＬ６のアミノ酸配列を有するＰＧＩ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＱＪ４のアミノ酸配列を有するＡ６ＰＥ、及びＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ３ＤＣ２１のアミノ酸配列を有するＡ０Ａ０Ｅ３ＮＣＨ４ Ａ６ＰＰ又はＡ６ＰＰのいずれかを含むプロセスを使用して比較した。以前に開示された、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＬＧＲ４又はＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ８９ＺＲ１のいずれかのアミノ酸配列を有するＡ６ＰＰは、これらの酵素が５０℃で不安定であるため、比較に含めることができなかった。各プロセスを、３８．５ｍＭのＧ１Ｐ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、０．５ｍＭのＣｏＣｌ２、０．０５ｇ／ＬのＰＧＭ、０．０５ｇ／ＬのＰＧＩ、０．０２５ｇ／ＬのＡ６ＰＥ、及び０．０５ｇ／ＬのＡ６ＰＰを含有する０．２０ｍＬの反応混合物中で実行した。反応物を、５０℃で３時間インキュベートした。Ａ６ＰＰは、Ｇ１Ｐからアルロースへの変換における速度制限酵素であった。Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）２濃縮器（１０，０００ ＭＷＣＯ）を使用する酵素の濾過によって反応を停止し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ（登録商標）Ｈカラム及び屈折率検出器を使用したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）によって分析した。試料の実行は、５ｍＭのＨ２ＳＯ４中、０．６ｍＬ／分で、１５．５分間、６５℃におけるものであった。表３に要約された結果は、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ３ＤＣ２１のアミノ酸配列を有する以前に開示されたＡ６ＰＰを使用したプロセスと比較して、Ａ０Ａ０Ｅ３ＮＣＨ４Ａ６ＰＰを使用したアルロース生成において２．２倍の改善を示した。
Figure 2023526624000004
配列表
配列番号１、Ａ６ＰＥ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ２２３ＨＺＩ７、サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリティカム
ＭＫＰＭＦＡＰＳＬＭＣＡＮＦＬＤＬＫＮＱＩＥＩＬＮＥＲＡＤＩＹＨＩＤＩＭＤＧＨＹＶＫＮＦＡＬＳＰＹＬＭＥＱＬＫＴＩＡＫＩＰＭＤＡＨＬＭＶＥＮＰＡＤＦＬＥＣＩＡＫＳＧＡＴＹＩＳＰＨＡＥＴＩＮＫＤＡＦＲＩＭＲＴＩＫＡＬＧＣＫＴＧＩＶＬＮＰＡＴＰＶＥＹＩＫＹＹＩＧＭＬＤＫＩＴＩＬＴＶＤＡＧＦＡＧＱＴＦＩＮＥＭＬＤＫＩＡＥＩＫＳＬＲＤＱＮＧＹＳＹＬＩＥＶＤＧＳＣＮＥＫＴＦＫＱＬＡＥＡＧＴＤＶＦＶＶＧＳＳＧＬＦＮＬＤＴＤＬＫＶＡＷＤＫＭＭＤＴＦＴＲＣＴＳＮ
配列番号２、Ａ６ＰＰ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｅ３ＮＣＨ４、メタノサルシナ・サーモフィラ
ＭＬＫＡＬＩＦＤＭＤＧＶＬＶＤＳＭＰＦＨＡＡＡＷＫＫＡＦＦＥＭＧＭＥＩＱＤＳＤＩＦＡＩＥＧＳＮＰＲＮＧＬＰＬＬＩＲＫＡＲＫＥＰＥＡＦＤＦＥＡＩＴＳＩＹＲＱＥＦＫＲＶＦＥＰＫＡＦＥＧＭＫＥＣＬＥＶＬＫＫＲＦＬＬＳＶＶＳＧＳＤＨＶＩＶＨＳＩＩＮＲＬＦＰＧＩＦＤＩＶＶＴＧＤＤＩＩＮＳＫＰＨＰＤＰＦＬＫＡＶＥＬＬＮＶＲＲＥＥＣＶＶＩＥＮＡＩＬＧＶＥＡＡＫＮＡＲＩＹＣＩＧＶＰＴＹＶＥＰＳＨＬＤＫＡＤＬＶＶＥＤＨＲＱＬＭＱＨＬＬＳＬＥＰＡＮＧＦＲＱ
配列番号３、Ａ６ＰＥ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＱＪ４、サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリティカム
ＭＫＹＬＦＳＰＳＬＭＣＭＮＬＩＫＬＮＥＱＩＳＶＬＮＳＫＡＤＦＬＨＶＤＩＭＤＧＨＦＶＫＮＩＴＬＳＰＦＦＩＥＱＩＫＳＹＶＮＩＰＩＤＡＨＬＭＶＥＮＰＧＤＹＩＥＩＣＥＫＳＧＡＳＦＩＴＩＨＡＥＴＩＮＲＥＡＦＲＩＩＤＲＩＫＳＨＧＬＭＶＧＩＡＬＮＰＡＴＰＩＳＥＩＫＨＹＩＮＫＩＤＫＩＴＩＭＴＶＤＰＧＦＡＧＱＰＦＩＰＥＶＬＥＫＩＲＤＬＫＲＬＫＤＤＮＮＹＮＹＬＩＥＡＤＧＳＣＮＫＮＴＦＱＶＬＫＤＡＧＣＫＶＦＶＬＧＳＳＧＬＦＮＬＳＤＤＬＧＫＡＷＥＩＭＩＧＮＦＮＧ
配列番号４、Ａ６ＰＥ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０９０ＩＸＺ８、バチルス・サーモアミロボランス
ＭＳＮＫＩＥＦＳＰＳＬＭＴＭＤＬＤＫＦＫＥＱＩＴＦＬＮＮＨＶＧＳＹＨＩＤＩＭＤＧＨＹＶＰＮＩＴＬＳＰＷＦＶＱＥＶＲＫＩＳＤＶＰＭＳＡＨＬＭＶＴＮＰＳＦＷＶＱＱＬＩＤＩＫＣＥＷＩＣＭＨＶＥＴＬＤＧＬＡＦＲＬＩＤＱＩＨＤＡＧＬＫＡＧＶＶＬＮＰＥＴＳＶＤＡＩＲＰＹＩＤＬＶＤＫＶＴＩＭＴＶＤＰＧＦＡＧＱＲＦＩＤＳＴＬＥＫＩＶＥＬＲＫＬＲＥＥＨＧＹＫＹＶＩＥＭＤＧＳＳＮＲＫＳＦＫＫＩＹＥＡＧＰＤＩＹＩＩＧＲＳＧＬＦＧＬＨＥＤＩＥＫＡＷＥＩＭＣＫＤＦＥＥＭＴＧＥＫＶＬ
配列番号５、Ａ６ＰＥ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｐ３２７１９、大腸菌
ＭＫＩＳＰＳＬＭＣＭＤＬＬＫＦＫＥＱＩＥＦＩＤＳＨＡＤＹＦＨＩＤＩＭＤＧＨＦＶＰＮＬＴＬＳＰＦＦＶＳＱＶＫＫＬＡＴＫＰＬＤＣＨＬＭＶＴＲＰＱＤＹＩＡＱＬＡＲＡＧＡＤＦＩＴＬＨＰＥＴＩＮＧＱＡＦＲＬＩＤＥＩＲＲＨＤＭＫＶＧＬＩＬＮＰＥＴＰＶＥＡＭＫＹＹＩＨＫＡＤＫＩＴＶＭＴＶＤＰＧＦＡＧＱＰＦＩＰＥＭＬＤＫＬＡＥＬＫＡＷＲＥＲＥＧＬＥＹＥＩＥＶＤＧＳＣＮＱＡＴＹＥＫＬＭＡＡＧＡＤＶＦＩＶＧＴＳＧＬＦＮＨＡＥＮＩＤＥＡＷＲＩＭＴＡＱＩＬＡＡＫＳＥＶＱＰＨＡＫＴＡ
配列番号６、Ａ６ＰＥ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ８ＵＶ２８、ヒドロゲニビルガ種１２８－５－Ｒ１－１
ＭＥＫＬＬＡＰＳＩＬＡＧＤＷＷＮＩＧＥＱＩＥＡＴＬＲＧＧＡＤＩＩＨＦＤＶＭＤＧＨＦＶＰＮＩＴＶＧＰＥＩＬＴＳＩＳＲＲＶＮＶＰＶＤＡＨＬＭＩＥＮＰＤＲＹＩＰＳＦＶＥＡＧＡＫＷＩＳＶＨＩＥＮＶＰＨＩＨＲＴＬＴＬＩＲＥＬＧＡＫＡＧＶＶＬＮＰＧＴＰＬＳＡＶＥＥＡＩＨＹＡＤＹＶＬＬＭＳＶＮＰＧＦＳＧＱＲＦＩＥＲＳＬＥＲＬＳＬＬＲＤＭＲＤＲＬＮＰＤＣＬＩＥＶＤＧＧＶＫＥＤＮＶＶＥＶＶＲＡＧＡＤＶＶＶＶＧＳＧＩＦＳＡＫＤＶＥＡＱＴＲＫＬＫＤＬＩＳＳＡＶＡＶ
配列番号７、Ａ６ＰＥ、ＵｎｉＰａｒｃ ＩＤ ＵＰＩ０００４１１８８２Ａ、ブレビバチルス・サーモルバー
ＭＧＦＫＦＳＰＳＬＭＣＭＮＬＬＤＩＱＨＱＩＥＶＭＮＲＲＡＤＬＶＨＩＤＩＭＤＧＨＹＶＫＮＬＴＬＳＰＦＦＩＥＱＬＫＥＳＬＨＶＰＭＤＶＨＬＭＶＥＮＰＴＤＦＩＥＲＶＫＥＡＧＡＳＩＩＳＰＨＡＥＴＩＮＴＤＡＦＲＩＩＤＫＶＫＳＬＧＣＱＭＧＩＶＬＮＰＡＴＰＩＡＹＩＱＨＹＩＨＬＶＤＫＩＴＩＭＴＶＤＰＧＹＡＧＱＫＦＩＰＥＭＬＥＫＩＲＱＡＫＲＬＫＥＥＲＧＹＲＹＬＩＥＶＤＧＳＣＮＶＧＴＦＫＲＬＡＥＡＧＡＥＶＦＩＶＧＳＳＧＬＦＮＬＨＰＤＬＥＶＡＷＤＭＭＭＤＮＦＱＲＥＶＧＥＴＴＡ
配列番号８、Ａ６ＰＥ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｇ７Ｍ２Ｉ３、クロストリジウム種ＤＬ－ＶＩＩＩ
ＭＫＰＭＦＡＰＳＬＭＣＡＮＦＬＤＬＫＮＱＩＥＩＬＮＥＲＡＤＩＦＨＶＤＩＭＤＧＨＹＶＫＮＦＳＬＳＰＡＭＭＥＱＬＫＴＩＴＫＩＰＭＤＡＨＬＭＶＥＮＰＡＤＦＬＥＧＩＡＫＡＧＡＴＹＩＳＰＨＡＥＴＩＮＫＤＡＦＲＩＭＲＴＩＫＡＬＧＣＫＴＧＶＶＬＮＰＡＴＰＶＥＹＩＫＨＹＬＧＭＬＤＫＩＴＩＬＴＶＤＡＧＦＡＧＱＴＦＩＥＥＭＬＤＫＩＥＥＶＫＲＬＲＥＥＮＧＹＳＹＬＩＥＶＤＧＳＣＮＥＫＴＦＫＫＬＡＥＡＧＴＥＶＦＩＶＧＳＳＧＬＦＮＬＤＡＤＬＫＶＳＷＤＫＭＭＮＭＦＮＫＣＩＮＮ
配列番号９、Ａ６ＰＥ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０９４ＷＬＭ１、バチルス・アルカロフィラス
ＭＹＫＦＳＰＳＬＭＣＭＤＬＳＲＦＫＥＱＶＥＶＬＮＤＫＡＤＦＹＨＶＤＩＭＤＧＨＦＶＫＮＩＴＬＳＰＦＦＩＱＥＬＫＫＩＴＤＶＰＩＤＡＨＬＭＶＴＮＰＡＤＦＶＥＭＴＩＤＡＧＡＤＹＩＳＬＨＡＥＴＩＮＧＮＡＦＲＬＩＮＱＩＫＥＫＧＫＫＦＧＶＶＬＮＰＡＴＰＬＥＳＩＲＨＹＩＱＨＶＤＫＬＴＩＭＴＶＤＰＧＦＡＧＱＫＦＶＥＥＭＩＧＫＩＫＥＡＫＥＬＫＥＲＮＧＹＫＹＬＩＴＩＤＧＳＣＮＫＮＴＦＫＫＬＶＥＡＧＡＥＶＬＩＶＧＳＳＧＬＦＧＬＤＥＤＶＮＩＡＷＤＫＭＭＤＴＦＨＬＥＶＫＤＩＳＱＶ
配列番号１０、Ａ６ＰＰ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ３ＤＣ２１、Ｈｕｎｇａｔｅｉｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ
ＭＩＫＹＫＡＶＦＦＤＦＤＹＴＬＡＤＳＳＫＡＶＩＥＣＩＮＹＡＬＱＫＭＧＹＰＥＳＳＰＥＳＩＣＲＴＩＧＬＴＬＡＥＡＦＫＩＬＳＧＤＴＳＤＳＮＡＤＬＦＲＱＹＦＫＥＲＡＤＬＶＭＣＤＲＴＶＭＹＳＴＶＥＣＶＬＫＫＬＫＫＡＤＶＫＴＧＩＶＳＴＫＹＲＹＲＩＥＤＩＬＫＲＤＫＬＬＱＹＦＤＶＩＶＧＧＥＤＶＡＡＨＫＰＤＰＥＧＬＬＫＡＩＳＭＶＧＣＱＫＥＥＶＬＦＶＧＤＳＴＶＤＡＲＴＡＫＮＡＧＶＤＦＶＡＶＬＴＧＴＴＧＡＮＥＦＳＥＹＮＰＧＡＶＩＥＤＬＳＧＬＬＤＭＦＭＬ
配列番号１１、Ａ６ＰＰ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＬＧＲ４、バクテロイデス・フラジリス
ＭＫＹＴＶＹＬＦＤＦＤＹＴＬＡＤＳＳＲＧＩＶＴＣＦＲＳＶＬＥＲＨＧＹＴＧＩＴＤＤＭＩＫＲＴＩＧＫＴＬＥＥＳＦＳＩＬＴＧＩＴＤＡＤＱＬＥＳＦＲＱＥＹＳＫＥＡＤＩＹＭＮＡＮＴＩＬＦＰＤＴＬＰＴＬＴＨＬＫＫＱＧＩＲＩＧＩＩＳＴＫＹＲＦＲＩＬＳＦＬＲＮＨＭＰＤＤＷＦＤＩＩＩＧＧＥＤＶＴＨＨＫＰＤＰＥＧＬＬＬＡＩＤＲＬＫＡＣＰＥＥＶＬＹＩＧＤＳＴＶＤＡＧＴＡＡＡＡＧＶＳＦＴＧＶＴＳＧＭＴＴＡＱＥＦＱＡＹＰＹＤＲＩＩＳＴＬＧＱＬＩＳＶＰＥＤＫＳＧＣＰＬ
配列番号１２、Ａ６ＰＰ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ８９ＺＲ１、バクテロイデス・シータイオタオミクロン
ＭＮＹＫＴＹＬＦＤＦＤＹＴＬＡＤＳＳＲＧＩＶＴＣＦＲＮＶＬＮＲＨＱＹＴＮＶＴＤＥＡＩＫＲＴＩＧＫＴＬＥＥＳＦＳＩＬＴＧＶＴＤＷＥＱＬＴＡＦＲＱＥＹＲＬＥＡＤＶＨＭＮＶＮＴＲＬＦＰＤＴＬＳＴＬＫＥＬＫＥＲＧＡＲＩＧＩＩＳＴＫＹＲＦＲＩＬＳＦＬＤＥＹＬＰＥＮＦＬＤＩＶＶＧＧＥＤＶＱＡＡＫＰＳＰＥＧＩＫＦＡＬＥＨＬＧＲＴＰＱＥＴＬＹＩＧＤＳＴＶＤＡＥＴＡＱＮＡＧＶＤＦＡＧＶＬＮＧＭＴＴＡＤＥＬＲＡＹＰＨＲＦＩＭＥＮＬＳＧＬＬＹＩ
配列番号１３、ＰＧＭ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１、カルディバチルス・デビリス
ＭＥＷＫＱＲＡＥＲＷＬＲＦＥＮＬＤＰＥＬＫＫＱＬＥＥＭＡＫＤＥＫＫＬＥＤＬＦＹＫＹＬＥＦＧＴＧＧＭＲＧＥＩＧＰＧＴＮＲＩＮＩＹＴＶＲＫＡＳＥＧＬＡＲＦＬＬＡＳＧＧＥＥＫＡＫＱＧＶＶＩＡＹＤＳＲＲＫＳＲＥＦＡＬＥＴＡＫＴＶＧＫＨＧＩＫＡＹＶＦＥＳＬＲＰＴＰＥＬＳＦＡＶＲＹＬＨＡＡＡＧＶＶＩＴＡＳＨＮＰＰＥＹＮＧＹＫＶＹＧＥＤＧＧＱＬＴＰＫＡＡＤＥＬＩＲＹＶＹＥＶＥＤＥＬＳＬＴＶＰＧＥＱＥＬＩＤＲＧＬＬＱＹＩＧＥＮＩＤＬＡＹＩＥＫＬＫＴＩＱＬＮＲＤＶＩＬＮＧＧＫＤＬＫＩＶＦＴＰＬＨＧＴＡＧＱＬＶＱＴＧＬＲＥＦＧＦＱＮＶＹＶＶＫＥＱＥＱＰＤＰＤＦＳＴＶＫＳＰＮＰＥＥＨＥＡＦＥＩＡＩＲＹＧＫＫＹＤＡＤＬＩＭＧＴＤＰＤＳＤＲＬＧＩＶＶＫＮＧＱＧＤＹＶＶＬＴＧＮＱＴＧＡＩＬＬＹＹＬＬＳＱＫＫＥＫＧＭＬＶＲＮＳＡＶＬＫＴＩＶＴＳＥＬＧＲＡＩＡＳＤＦＧＶＥＴＩＤＴＬＴＧＦＫＦＩＧＥＫＩＫＥＦＫＥＴＧＳＨＶＦＱＦＧＹＥＥＳＹＧＹＬＩＧＤＦＶＲＤＫＤＡＩＱＡＡＬＦＡＡＥＡＡＡＹＹＫＡＱＧＫＳＬＹＤＶＬＭＥＩＹＫＫＹＧＦＹＫＥＳＬＲＳＩＴＬＫＧＫＤＧＡＥＫＩＲＡＩＭＤＡＦＲＱＮＰＰＥＥＶＳＧＩＰＶＡＩＴＥＤＹＬＴＱＫＲＶＤＫＡＡＧＱＴＴＰＩＨＬＰＫＳＮＶＬＫＹＹＬＡＤＥＳＷＦＣＩＲＰＳＧＴＥＰＫＣＫＦＹＦＡＶＲＧＤＳＥＡＱＳＥＡＲＬＲＱＬＥＴＮＶＭＡＭＶＥＫＩＬＱＫ
配列番号１４、ＰＧＩ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＳＬＬ６、サーマス・サーモフィルス
ＭＬＲＬＤＴＲＦＬＰＧＦＰＥＡＬＳＲＨＧＰＬＬＥＥＡＲＲＲＬＬＡＫＲＧＥＰＧＳＭＬＧＷＭＤＬＰＥＤＴＥＴＬＲＥＶＲＲＹＲＥＡＮＰＷＶＥＤＦＶＬＩＧＩＧＧＳＡＬＧＰＫＡＬＥＡＡＦＮＥＳＧＶＲＦＨＹＬＤＨＶＥＰＥＰＩＬＲＬＬＲＴＬＤＰＲＫＴＬＶＮＡＶＳＫＳＧＳＴＡＥＴＬＡＧＬＡＶＦＬＫＷＬＫＡＨＬＧＥＤＷＲＲＨＬＶＶＴＴＤＰＫＥＧＰＬＲＡＦＡＥＲＥＧＬＫＡＦＡＩＰＫＥＶＧＧＲＦＳＡＬＳＰＶＧＬＬＰＬＡＦＡＧＡＤＬＤＡＬＬＭＧＡＲＫＡＮＥＴＡＬＡＰＬＥＥＳＬＰＬＫＴＡＬＬＬＨＬＨＲＨＬＰＶＨＶＦＭＶＹＳＥＲＬＳＨＬＰＳＷＦＶＱＬＨＤＥＳＬＧＫＶＤＲＱＧＱＲＶＧＴＴＡＶＰＡＬＧＰＫＤＱＨＡＱＶＱＬＦＲＥＧＰＬＤＫＬＬＡＬＶＩＰＥＡＰＬＥＤＶＥＩＰＥＶＥＧＬＥＡＡＳＹＬＦＧＫＴＬＦＱＬＬＫＡＥＡＥＡＴＹＥＡＬＡＥＡＧＱＲＶＹＡＬＦＬＰＥＶＳＰＹＡＶＧＷＬＭＱＨＬＭＷＱＴＡＦＬＧＥＬＷＥＶＮＡＦＤＱＰＧＶＥＬＧＫＶＬＴＲＫＲＬＡＧ
配列番号１５、４ＧＴ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｅ８ＭＸＰ８、アナエロリネア・サーモフィラ
ＭＳＬＦＫＲＡＳＧＩＬＬＨＰＴＳＬＰＧＰＤＧＩＧＤＬＧＰＥＡＹＲＷＶＮＦＬＡＥＳＧＣＳＬＷＱＩＬＰＬＧＰＴＧＦＧＤＳＰＹＱＣＦＳＡＦＡＧＮＰＹＬＶＳＰＡＬＬＬＤＥＧＬＬＴＳＥＤＬＡＤＲＰＥＦＰＡＳＲＶＤＹＧＰＶＩＱＷＫＬＴＬＬＤＲＡＹＶＲＦＫＲＳＴＳＱＫＲＫＡＡＦＥＡＦＫＥＥＱＲＡＷＬＬＤＦＳＬＦＭＡＩＫＥＡＨＧＧＡＳＷＤＹＷＰＥＰＬＲＫＲＤＰＥＡＬＮＡＦＨＲＡＨＥＶＤＶＥＲＨＳＦＲＱＦＬＦＦＲＱＷＱＡＬＲＱＹＡＨＥＫＧＶＱＩＩＧＤＶＰＩＦＶＡＹＤＳＡＤＶＷＳＨＰＤＬＦＹＬＤＥＴＧＫＰＴＶＶＡＧＶＰＰＤＹＦＳＡＴＧＱＬＷＧＮＰＬＹＲＷＤＹＨＲＥＴＧＦＡＷＷＬＥＲＬＫＡＴＦＡＭＶＤＩＶＲＬＤＨＦＲＧＦＡＧＹＷＥＶＰＹＧＭＰＴＡＥＫＧＲＷＶＰＧＰＧＩＡＬＦＥＡＩＲＮＡＬＧＧＬＰＩＩＡＥＤＬＧＥＩＴＰＤＶＩＥＬＲＥＱＬＧＬＰＧＭＫＩＦＱＦＡＦＡＳＤＡＤＤＰＦＬＰＨＮＹＶＱＮＣＶＡＹＴＧＴＨＤＮＤＴＡＩＧＷＹＮＳＡＰＥＫＥＲＤＦＶＲＲＹＬＡＲＳＧＥＤＩＡＷＤＭＩＲＡＶＷＳＳＶＡＭＦＡＩＡＰＬＱＤＦＬＫＬＧＰＥＡＲＭＮＹＰＧＲＰＡＧＮＷＧＷＲＹＥＡＦＭＬＤＤＧＬＫＮＲＩＫＥＩＮＹＬＹＧＲＬＰＥＨＭＫＰＰＫＶＶＫＫＷＴ
配列番号１６、αＧＰ、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｇ８ＮＣＣ０、サーマス種ＣＣＢ＿ＵＳ３＿ＵＦ１
ＭＰＬＬＰＥＰＬＳＧＬＫＥＬＡＹＮＬＷＷＳＷＮＰＥＡＡＥＬＦＱＥＩＤＰＳＬＷＫＲＦＲＧＮＰＶＫＬＬＬＥＡＤＰＧＲＬＥＧＬＡＡＴＳＹＰＡＲＶＧＡＶＶＥＡＬＲＡＹＬＲＥＲＥＥＫＱＧＰＬＶＡＹＦＳＡＥＹＧＦＨＳＳＬＰＩＹＳＧＧＬＧＶＬＡＧＤＨＶＫＡＡＳＤＬＧＬＮＬＶＧＶＧＩＦＹＨＥＧＹＦＨＱＲＬＳＰＥＧＶＱＶＥＶＹＥＴＬＨＰＥＥＬＰＬＹＰＶＱＤＲＥＧＲＰＬＲＶＧＶＥＦＰＧＲＴＬＷＬＳＡＹＲＶＱＶＧＡＶＰＶＹＬＬＴＡＮＬＰＥＮＴＰＥＤＲＡＩＴＡＲＬＹＡＰＧＬＥＭＲＩＱＱＥＬＶＬＧＬＧＧＶＲＬＬＲＡＬＧＬＡＰＥＶＦＨＭＮＥＧＨＳＡＦＬＧＬＥＲＶＲＥＬＶＡＥＧＨＰＦＰＶＡＬＥＬＡＲＡＧＡＬＦＴＴＨＴＰＶＰＡＧＨＤＡＦＰＬＥＬＶＥＲＹＬＧＧＦＷＥＲＭＧＴＤＲＥＴＦＬＳＬＧＬＥＥＫＰＷＧＫＶＦＳＭＳＮＬＡＬＲＴＳＡＱＡＮＧＶＳＲＬＨＧＥＶＳＲＥＭＦＨＨＬＷＰＧＦＬＲＥＥＶＰＩＧＨＶＴＮＧＶＨＴＷＴＦＬＨＰＲＬＲＲＨＹＡＥＶＦＧＰＥＷＲＫＲＰＥＤＰＥＴＷＫＶＥＡＬＧＥＥＦＷＱＩＨＫＤＬＲＡＥＬＶＲＥＶＲＴＲＬＹＥＱＲＲＲＮＧＥＳＰＳＲＬＲＥＡＥＫＶＬＤＰＥＡＬＴＩＧＦＡＲＲＦＡＴＹＫＲＡＶＬＬＦＫＤＰＥＲＬＲＲＬＬＨＧＨＹＰＩＱＦＶＦＡＧＫＡＨＰＫＤＥＰＧＫＡＹＬＱＥＬＦＡＫＩＲＥＹＧＬＥＤＲＭＶＶＬＥＤＹＤＭＹＬＡＲＶＬＶＨＧＳＤＶＷＬＮＴＰＲＲＰＭＥＡＳＧＴＳＧＭＫＡＡＬＮＧＡＬＮＬＳＶＬＤＧＷＷＡＥＡＹＮＧＫＮＧＦＡＩＧＤＥＲＶＹＥＳＥＥＡＱＤＭＡＤＡＱＡＬＹＤＶＬＥＦＥＶＬＰＬＦＹＡＫＧＰＥＧＹＳＳＧＷＬＳＭＶＨＥＳＬＲＴＶＧＰＲＹＳＡＡＲＭＶＧＤＹＬＥＩＹＲＲＧＧＡＷＡＥＡＡＲＡＧＱＥＡＬＡＡＦＨＱＡＬＰＡＬＱＧＶＴＬＲＡＱＶＰＧＤＬＴＬＮＧＶＰＭＲＶＲＡＦＬＥＧＥＶＰＥＡＬＲＰＦＬＥＶＱＬＶＶＲＲＳＳＧＨＬＥＶＶＰＭＲＰＧＰＤＧＹＥＶＡＹＲＰＳＲＰＧＳＹＡＹＧＶＲＬＡＬＲＨＰＩＴＧＨＶＡＷＶＲＷＡ

Claims (23)

  1. 糖由来のアルロースの生成のための改善されたプロセスであって、前記改善が、アルロース６－リン酸エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）を使用してフルクトース－６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をアルロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に変換することを含み、前記Ａ６ＰＥが、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロセス。
  2. 糖由来のアルロースの生成のための改善されたプロセスであって、前記改善が、アルロース－６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）を使用してＡ６Ｐをアルロースに変換することを含み、前記Ａ６ＰＰが、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、プロセス。
  3. アルロース６－リン酸エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）を使用してフルクトース－６－リン酸（Ｆ６Ｐ）をアルロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に変換するステップを更に含み、前記Ａ６ＰＥが、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のプロセス。
  4. グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を前記Ｆ６Ｐに変換するステップを更に含み、前記ステップが、ホスホグルコースイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、請求項１～３のいずれか一項に記載のプロセス。
  5. グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）を前記Ｇ６Ｐに変換するステップを更に含み、前記ステップが、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、請求項４に記載のプロセス。
  6. 糖を前記Ｇ１Ｐに変換するステップを更に含み、前記ステップが、少なくとも１つの酵素によって触媒され、前記糖が、デンプン又はその誘導体、セルロース又はその誘導体、及びスクロースからなる群から選択される、請求項５に記載のプロセス。
  7. 前記少なくとも１つの酵素が、アルファ－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）、マルトースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロデキストリンホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、及びセルロースホスホリラーゼからなる群から選択される、請求項６に記載のプロセス。
  8. 前記糖が、デンプン、又はアミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、マルトトリオース、及びグルコースからなる群から選択されるそれらの誘導体である、請求項６に記載のプロセス。
  9. デンプンをデンプン誘導体に変換するステップを更に含み、前記デンプン誘導体が、デンプンの酵素加水分解によって、又はデンプンの酸加水分解によって調製される、請求項８に記載のプロセス。
  10. ４－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）が、前記プロセスに添加される、請求項９に記載のプロセス。
  11. 前記デンプン誘導体が、イソアミラーゼ、プルラナーゼ、アルファ－アミラーゼ、又はこれらの組み合わせによって触媒されるデンプンの酵素加水分解によって調製される、請求項９に記載のプロセス。
  12. 少なくとも１つの酵素によって触媒されてフルクトースをＦ６Ｐに変換するステップと、
    任意選択で、少なくとも１つの酵素によって触媒されてスクロースをフルクトースに変換するステップと、を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のプロセス。
  13. 少なくとも１つの酵素によって触媒されてグルコースをＧ６Ｐに変換するステップと、
    任意選択で、少なくとも１つの酵素によって触媒されてスクロースをグルコースに変換するステップと、を更に含む、請求項４に記載のプロセス。
  14. 前記プロセスが、以下のステップを含むアルロースを生成する酵素プロセスであって、
    （ｉ）アルファ－グルカンホスホリラーゼ又はデンプンホスホリラーゼを使用して糖をグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップであって、前記糖が、デンプン、デンプンの１つ以上の誘導体、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、変換するステップと、
    （ｉｉ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）を使用してＧ１Ｐをグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップと、
    （ｉｉｉ）ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）を使用してＧ６Ｐをフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換するステップと、
    （ｉｖ）アルロース６－リン酸エピメラーゼ（Ａ６ＰＥ）を使用して前記Ｆ６Ｐをアルロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に変換するステップと、
    （ｖ）アルロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）を使用して前記Ａ６Ｐをアルロースに変換するステップであって、前記Ａ６ＰＰが、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、変換するステップと、を含み、
    プロセスステップ（ｉ）～（ｖ）が、単一の反応容器内で実施される、請求項２に記載のプロセス。
  15. 前記Ａ６ＰＥが、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のプロセス。
  16. 前記プロセスステップが、以下のプロセス条件、
    （ａ）約３７℃～約８５℃の範囲の温度、
    （ｂ）約５．０～約９．０の範囲のｐＨ、又は
    （ｃ）約１時間～約４８時間、のうちの少なくとも１つの下で実施される、請求項１４又は１５に記載のプロセス。
  17. 前記プロセスステップが、以下のプロセス条件、
    （ａ）リン酸塩の供給源としてのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）なし、
    （ｂ）ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチドなし、
    （ｃ）約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭのリン酸塩濃度、
    （ｄ）約０．１ｍＭ～５０ｍＭのＭｇ２＋濃度、
    （ｅ）約０．１ｍＭ～５０ｍＭのＣｏ２＋濃度、
    （ｆ）リン酸塩が再循環される、
    （ｇ）前記プロセスの少なくとも１つのステップが、エネルギー的に好ましい化学反応を伴う、のうちの少なくとも１つの下で実施される、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のプロセス。
  18. リン酸塩が再循環され、Ａ６ＰのＡ６ＰＰ脱リン酸化によって生成されるリン酸イオンが、糖をＧ１Ｐに変換する前記プロセスステップで使用される、請求項１７に記載のプロセス。
  19. 前記Ａ６Ｐをアルロースに変換するステップが、エネルギー的に好ましい、不可逆的な反応である、請求項１７に記載のプロセス。
  20. 前記生成されたアルロースを分離回収するステップを更に含み、前記分離回収がクロマトグラフィー分離によるものではない、請求項１４～１９のいずれか一項に記載のプロセス。
  21. 前記デンプンの誘導体が、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトトリオース、マルトース、及びグルコースからなる群から選択される、請求項１４又は１５に記載のプロセス。
  22. 請求項１～２１のいずれか一項に記載のプロセスから生成される、アルロース。
  23. 請求項１～２１のいずれか一項に記載のプロセスから生成されたアルロースを含有する、消耗品。
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