KR20060059622A

KR20060059622A - 내열성 효소를 이용하여 전분으로부터 6-인산과당을제조하는 방법

Info

Publication number: KR20060059622A
Application number: KR1020040098757A
Authority: KR
Inventors: 신현재; 조연정; 전병진
Original assignee: 주식회사 엔지뱅크
Priority date: 2004-11-29
Filing date: 2004-11-29
Publication date: 2006-06-02

Abstract

본 발명은 내열성 효소를 이용하여 전분으로부터 인산당(phosphosugar)의 일종인 6-인산과당(fructose 6-phosphate)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 좀더 자세하게는 전분인산화효소(starch phosphorylase), 인산포도당 자리옮김효소 (phosphoglucomutase), 6-인산포도당 이성질화효소(glucose 6-phosphate isomerase) 및 플룰란아제(pullulanase) 등의 여러 내열성 효소를 이용하여 반응을 이루고, 이온교환 수지 등을 이용하여 분리하며, 결정화 등을 이용하여 정제하는 방법에 관한 것이다.

6-인산과당(fructose 6-phosphate), 1-인산포도당(glucose 1-phosphate), 6-인산포도당(glucose 6-phosphate), 글루칸 인산화효소(starch phosphorylase), 인산포도당 자리옮김효소(phosphoglucomutase), 6-인산포도당 이성질화효소(glucose 6-phosphate isomerase), 플룰란아제(pullulanase), 내열성 효소

Description

내열성 효소를 이용하여 전분으로부터 6-인산과당을 제조하는 방법{A producing method of fructose-6-phosphate using thermostable enzymes}

도 1은 당류로부터 6-인산과당을 제조하는 루트 개략도,

각 단계에서 사용되는 효소는

전분에서 G1P 생산: 전분인산화효소(a)

글리코겐에서 G1P 생산: 글리코겐 인산화효소(b)

설탕에서 G1P 생산: 설탕 인산화효소(c)

맥아당에서 G1P 생산: 맥아당 인산화효소(d)

포도당에서 G6P 생산: 포도당 키나아제(e)

과당에서 F6P 생산: 과당 키나아제(f)

G1P에서 G6P 생산: 인산포도당자리옮김효소(g)

G6P에서 F6P 생산: 6-인산포도당 이성질화효소(h)이다.

도 2는 재조합 대장균을 회분식 배양하여 생산되는 균체의 흡광도 변화 및 포도당 농도 변화를 나타낸 그래프,

도 3은 재조합 대장균을 유가식 배양하여 생산되는 균체의 흡광도 변화 및 포도당 농도 변화를 나타낸 그래프,

도 4는 내열성효소를 이용하여 1-인산 포도당(G1P)에서 6-인산 과당(F6P)으로 생전환하는 과정의 각 반응물, 생성물 농도변화를 나타낸 그래프이다.

6-인산과당(fructose 6-phosphate)은 과당의 6번 위치가 인산화된 당 화합물로서 식물세포나 동물의 조직 내에 광범위하게 존재한다. 특히 식물세포 내에서 6-인산과당은 해당과정(glycolysis)이나 당생성과정(gluconeogenesis), 5당 인산화과정(pentose phosphate pathway) 및 캘빈회로(Calvin cycle)의 중요한 중간물질이다. 이 물질은 또한 동물 조직 내에서 6-인산포도당(glucose 6-phosphate)과 평형을 이루어 존재하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 D-형 이성질체로 존재하며 약어로는 F6P라고 표기한다.

생명체 내에서 6-인산과당의 합성은 해당과정의 두 번째 단계에서 6-인산포도당에 이성질화효소(phosphoglucoisomerase)가 작용하여 생성된다. 해당과정의 다음 단계는 6-인산과당이 ATP와 만나 인산과당키나아제(phosphofructokinase)라는 효소의 도움으로 1,6-이인산과당(fructose 1,6-biphosphate)과 ADP를 생성한다.

문헌에 따르면 6-인산과당은 다양한 용도가 잠재되어 있는 것으로 밝혀졌다. 특히 1992년도 문헌 EP0506772(WO9109604)에 따르면 탄수화물에 인산이 결합된 인산화당(phosphosugar)이 당뇨병, 염증 등 다양한 분야에 사용될 수 있는 가능성이 언급되었다. 그러나 구체적인 작용 기작이나 임상실험 자료가 자세히 나와 있지는 않다.

효소를 이용하는 생전환(bioconversion)을 산업적으로 사용하기 위해서는 효소의 안정성 및 높은 생산성이 무척 중요하다. 이런 점에서 재조합 내열성 효소는 그 산업적 가치가 무척 높다고 할 수 있다. 최근 산업적으로 유용하게 사용할 수 있는 미생물 가운데 대표적인 더머스 속(Thermus Sp.)의 게놈정보가 공개되어 (Nature Biotech. 22: 547-553 (2004)) 유용한 유전자 자원으로서의 가치가 더욱 높아졌다. 그러나, 이러한 정보가 밝혀진 것은 최근의 일이며, 내열성 효소를 이용한 인산당의 대량 생전환에 관한 보고는 아직 없다. 내열성 효소가 아닌 일반적인 효소를 이용한 인산당의 생전환에 관한 연구로서 주목할 만한 것으로는 1-인산 포도당의 생전환 연구가 있다.

본 발명에서는 전분으로부터 6-인산과당(F6P)을 생산하기 위해 세부적으로 전분으로부터 1-인산 포도당(G1P)으로 생전환, 1-인산 포도당(G1P)에서 6-인산 포도당(G6P)으로 내부 생전환, 6-인산 포도당(G6P)으로부터 6-인산과당(F6P)으로 생전환 등 총 세 단계를 거치게 된다. 이에 따른 종래 보고들을 살펴보면, 우선 효소를 이용한 1-인산 포도당(G1P)의 생산에는 설탕(sucrose)으로부터 과당 (fructose)과 1-인산 포도당을 합성하는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 설탕인산화효소(sucrose phosphorylase)가 보고되어 있으며[Agric. Biol. Chem. 557: 1805-1810 (1991)], 알파-글루칸(α-glucan) 또는 말토덱스트린 (maltodextrins), 덱스트린(dextrin), 전분 등과 같은 중합도가 높은 다당류로부터 1-인산 포도당을 합성하는 글루칸 인산화효소(α-glucan-phosphorylases)가 보고되어 있다. 특히 유럽특허의 Kayane et al.은 전분으로부터 전분 인산화효소를 이용하여 1-인산 포도당을 60%까지 생전환할 수 있음을 보고하였다[EP 0305981A2(1989), Recent developments in the chemistry of natural carbon compounds Springer Berlin(1971)]. 그리고 담체에 고정화된 전분 인산화효소를 이용한 1-인산 포도당의 연속생산 공정 개발에 관한 보고도 있다[J. Biotechnol. 36: 11-17 (1994)].

한편 6-인산 포도당(G6P)은 1-인산 포도당으로부터 내부 생전환되어야 하는데, 이는 설탕의 소비 및 합성에 있어서 자리옮김효소(phosphoglucomutases, PGM)에 의해 촉매된다. 이 효소는 유전자 재조합 방법에 의하여 여러 다양한 형태의 단백질로 발현된다[Plant Physiol. 117:997-1006(1998), Microbiol. 143:855-865(1997)].

6-인산과당을 생산하기 위해서는 6-인산포도당이 6-인산포도당 이성질화효소(phosphoglucose isomerase)에 의해 생전환되어야 한다. 이 효소는 바나나와 같은 식물 유래도 있으며, 에어로피룸 페르닉스(Aeropyrum pernix), 더모플라스마 애시도필룸(Thermoplasma acidophilum) 등과 같은 미생물 유래도 보고되어 왔다[Biosci. Biotechnol. Biochem. 65:2174-2180 (2001), J. Biologic. Chem. 279: 2262-2272 (2004)]. 언급한 사항 이외에 산업용 기질을 이용한 일반적인 6-인산과당(F6P)의 생산루트가 도 1에 자세히 나타나 있다.

더머스 속(Thermus sp.) 박테리아는 고온에서 자라는 호열성 박테리아로서, 일반적으로 70-75℃에서 성장하고, 일부 종들은 85℃에서도 성장한다고 알려져 있다(Brock, T. D.(1986) Thermophiles, pp 27-28, John Wiley Sons, Inc., New York). 따라서, 더머스 속 박테리아는 고온에서 활성을 보이는 효소를 얻기 위한 좋은 원천 자원이며, 실제로 여러 종류의 내열성 효소들이 더머스 속 박테리아로부터 분리되어 보고된 바 있다. 그러나, 탄수화물 관련 효소는 생전환 분야에서 그 유용성이 큼에도 불구하고 더머스 속 박테리아에서 분리된 효소를 이용하여 생전환에 이용한 연구는 아직까지 많지 아니하다(Taguchi, H. et al. J. Biochem., Tokyo(1982)91, 1343-1348; Hoide, S. et al. J. Biochem., Tokyo, (1991) 109, 6-7; Park, J. H. et al. Eur. J. Biochem. (1993) 241, 135-140; Ono, M. et al. J. Biochem. (1990)107, 21-26).

본 발명의 목적은 비교적 저렴한 원료인 전분으로부터 6-인산과당을 고효율로 제조하려는 것이다.

본 발명에서는 더머스(Thermus) 균주에서 유래한 다양한 내열성 효소의 유전자를 대장균에 이식시킨 후 이 대장균을 대량 발효하고, 여기에서 생산된 효소를 이용하여 전분으로부터 6-인산과당을 생산하였다. 또한 이렇게 생산된 6-인산과당을 효율적으로 분리·정제하였다.

본 발명은 더머스 속(Thermus sp.) 유래 내열성의 전분인산화효소(starch phosphorylase), 인산포도당 자리옮김효소(phosphoglucomutase), 6-인산포도당 이성질화효소(glucose 6-phosphate isomerase)를 이용하여 반응 온도 40∼80℃에서 수용성 또는 불용성 전분으로부터 6-인산과당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 더머스 속(Thermus sp.) 유래 플룰란아제(pullulanase)를 부가하여 전분으로부터 6-인산과당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 인산포도당 자리옮김효소: 6-인산포도당 이성질화 효소의 비율이 1:1∼1:1.5인 것을 특징으로 하는, 전분으로부터 6-인산과당을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 두 효소의 비율이 위 범위 내일 때 6-인산과당의 수율이 높은 것으로 나타났다.

또한, 본 발명은 상기 반응 온도가 60∼70℃인 것을 특징으로 하는, 전분으로부터 6-인산과당을 제조하는 방법에 관한 것이다. 온도 60∼70℃일 때 기질인 전분의 용해도가 높아지고 다른 단백질이 불활성화되는 효과가 우수하다.

또한, 본 발명은 상기 불용성 전분의 농도가 0.01g/ℓ∼20g/ℓ인 것을 특징으로 하는, 전분으로부터 6-인산과당을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 범위를 넘을 경우 전분기질 대비 G1P 생산성이 낮아 산업적 활용 측면에서 바람직하지 않다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 6-인산과당 제조공정 후 분리, 정제공정을 부가하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실시예를 상세히 설명하면 다음과 같다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 당업자에게 자명하다.

[실시예 1] 효소생산을 위한 재조합 대장균의 유가식 배양

더머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) 균주에서 유래한 글루칸 인산화효소(α-glucan phosphorylase, EC 2.4.1.1) 유전자를 이식한 대장균의 대량발효를 위해 5ℓ발효조(fermentor)에서 조업부피 2ℓ, 교반속도 700rpm, 공기유량 1vvm, 배양온도 37℃, 접종량 10%로 하여 배양을 실시하였다. 회분식 배양을 시행하였을 경우 최고 세포질량이 흡광도(O.D. 600) 14에 머물렀으나(도 2), 유가식 배양을 시행한 경우 최고 세포질량이 흡광도 45(도 3)까지 증가함을 알 수 있다. 이 때 효소를 생산하기 위해 첨가되는 유도물질인 IPTG의 최종 농도는 5mM이었다.

또한, 본 발명에서 사용되는 더머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) 유래의 재조합 효소인 인산포도당 자리옮김효소(phosphoglucomutase)와 인산포도당 이성질화효소(phosphoglucose isomerase) 역시 위와 같은 방법으로 대량발효하여 유사한 결과를 얻을 수 있었다(J. Ind. Microbiol. Biot. (2000) 24, 89-93 참조).

[실시예 2] 전분으로부터 1-인산포도당의 제조

1-인산 포도당(G1P)은 용해성 전분으로부터 글루칸 인산화효소(α-glucan phosphorylase)를 이용하여 제조되었다. 더머스 속(Thermus sp.) 유래의 재조합 글 루칸 인산화효소는 SDS-PAGE 에서 단일 밴드 90kDa로 특성화되었고, 최적 pH 7.0, 70℃에서 최대 활성을 나타내었다. 상기 효소는 고온(70℃ 이상)에서 반응이 원활하게 이루어지므로 실온에서 용해도가 낮은 전분의 용해도를 증가시킬 수 있어 고농도의 기질반응이 가능하다는 장점이 있다. 무게비로 5% 용해성 전분과 1M 인산완충용액(potassium phosphate buffer, pH7.0, 70℃) 하에서 효소 9.4 U/g-전분을 첨가함으로써 반응이 시작되었으며 이때 164mM의 G1P가 생성되었다. 기질 전분 g당 13-50U 사이에서 효소 첨가량을 조절하여 G1P의 생산을 시간별로 조사한 결과 최종 생성물 농도는 유사하게 높았으나 기질 전분의 농도가 초기 반응속도에 영향을 미침을 볼 수 있었다. 반응동안 전분의 노화 방지 등을 고려해 볼 때 효소 첨가량을 조절하여 최적 반응시간의 조절이 필요하다(표 1). 온도 조건 70℃에서 수행되었다.

효소량 (U/g starch)	G1P 생산(mM)
효소량 (U/g starch)	1h	4h	8h	72h
13	-	20	60	141.6
25	45.1	91.7	100	152.2
50	55.5	95	109.8	158.7

반면 산업용 불용성 전분으로 반응시킬 경우 용해도 제한으로 인해 고농도의 전분을 기질로 이용할 수 없었다. 산업용 2% 불용성 전분을 300mM 인산완충용액에 녹여 효소 37 U/g-전분으로 반응이 이루어질 경우 15.3mM의 G1P를 얻을 수 있었다. 불용성 전분의 농도별 G1P생성량을 비교해 보면 다음 표 2와 같다. 온도 조건 70℃ 에서 수행되었다.

불용성 전분 (g/ℓ)	300mM 인산 나트륨 완충용액(pH 7.0)
불용성 전분 (g/ℓ)	1-인산 포도당(g/ℓ)	생산성(Ys/g)*
1	0.5(0.2)	0.17
5	10(3.3)	0.67
10	10.8(3.6)	0.36
20	15.3(5.1)	0.26

*Ys/g = 1-인산 포도당 농도(g/ℓ)/전분 농도(g/ℓ)

기질농도가 높아질수록 1-인산 포도당(G1P) 생산량이 증가하는 경향을 나타내었다. 또한 생산성을 고려하면 저농도에서의 반응이 효율적이나 전분 가격대비 G1P 가격을 고려하면 적정선의 기질농도는 가변적이라 할 수 있다.

다음으로 G1P의 대량생산을 위해 500ℓ반응기에서 200ℓ규모의 반응이 수행되었다. 1.2% 용해성 전분과 200mM의 인산나트륨완충액(sodium phosphate buffer, pH 7.0)을 기질로 이용하여 70℃에서 16시간 반응 결과 생산된 G1P는 1.253Kg으로 대략 초기 전분 양의 50%가 생전환되었음을 알 수 있었다. 또한 반응액에 플루란아제(pullulanase)를 추가로 첨가하면 초기 G1P 수율이 10∼50% 이상 증가되는 것을 관찰할 수 있었다.

[실시예 3] 1-인산 포도당의 분리, 정제

생성된 인산 포도당은 이온교환수지 및 결정화 등 주지의 방법(JACS 66:560-563(1944))을 본 발명의 상황에 맞게 변형하여 분리, 정제 공정을 수행하였다. 실 시예 2에서 얻어진 1-인산 포도당(G1P) 반응물은 전분, 인산완충용액, 단백질 등 기타 불순물들을 포함하고 있다. 이를 강산성 양이온 교환수지와 약염기성 음이온 교환수지 컬럼에 순차적으로 적용하여 수행하였다. 강산성 양이온 교환수지 컬럼은 4% HCl로 수세 및 전처리하였고, 초순수로 용출시켰으며, G1P가 포함된 분획을 모았다. 이어 약염기 음이온 교환수지 컬럼에 적용시킨 후 4% 암모니아수로 용출시켜 G1P 분획을 회수하였다. 결정화시킨 후 1-인산 포도당의 수율은 80% 이상, 순도는 95% 이상이었다. 최종 생성물의 색도를 증가시키기 위해 활성탄 등의 부가적인 컬럼 조작을 수행할 수 있다.

[실시예 4] 1-인산 포도당으로부터 6-인산과당의 제조

실시예 3에서 제조된 순수 1-인산 포도당(G1P)은 6-인산과당(F6P) 생산을 위한 기질로 이용된다. 본 실시예에서 사용되는 효소는 더머스 속(Thermus sp.) 유래의 단일 분자량 61kDa의 재조합 자리옮김효소(phosphoglucomutase, EC 5.4.2.2.)와 46kDa의 이성질화효소(phosphoglucose isomerase, EC 5.3.1.9.)이다. 본 효소들은 더머스 속 유래의 재조합 효소들로써 반응온도뿐만 아니라 여러 반응 조건들이 같아 한 단계로 두 가지 효소반응을 동시에 실시할 수 있다. 25g/ℓ 1-인산포도당(G1P), 2mM MgCl₂, 두 가지 효소 즉, 더머스 속(Thermus sp.) 유래의 재조합 인산포도당 자리옮김효소(phosphoglucomutase)와 인산포도당 이성질화효소(phosphoglucose isomerase)가 포함된 반응물을 70℃에서 72시간동안 반응기에서 정치하거나 또는 약하게 진탕배양하였다. 반응 후 최대 6-인산과당(F6P) 생산은 배양 44시간 후 수율 21%였으며, 그 후 6-인산과당의 양이 줄면서 6-인산포도당양이 증가되고 결국 평형을 이루었다(도 4).

반응을 저해하는 물질의 영향을 확인하기 위하여 4mM 1-인산포도당과 2mM MgCl₂, 저해제로서 전분 또는 인산완충액을 다양한 농도로 조절한 것, 더머스 속(Thermus sp.) 유래의 재조합 자리옮김효소(phosphoglucomutase)와 이성질화효소 (phosphoglucose isomerase)를 첨가한 반응물을 70℃에서 21시간 교반하면서 반응을 수행하였다. 6-인산과당을 생산을 하는데 있어 주요한 저해제인 전분과 인산완충액의 저해결과를 다음 표 3, 표 4에 나타내었다.

수용성전분 (g/ℓ)	전환율(%)
수용성전분 (g/ℓ)	G1P	G6P	F6P
5	10.6	82.7	6.7
1	8.9	82.3	8.8
0.5	7.9	81.4	10.7
0.1	8.3	81.9	9.8

인산완충액 (mM)	전환율(%)
인산완충액 (mM)	G1P	G6P	F6P
50	26	74	n.d.*
25	19.9	71.5	8.6
10	9	82	9
5	8.1	77.8	14.1

*n.d.: not determined

위 결과 표 3, 표 4를 보면 전분과 인산완충액은 최종 산물인 6-인산과당을 생산하는데 모두 저해 작용을 하고 있음을 볼 수 있다. 따라서 전분으로부터 6-인산과당을 효율적으로 생산하기 위해서는 두 물질 사이의 최적농도비가 존재함을 알 수 있다.

[실시예 5] 통계적 기법을 사용한 6-인산과당 생산 최적화

본 실시예에서는 6-인산과당의 생산에 있어 좀더 효율적인 반응 조건을 조사하기 위해 통계적 기법을 사용하였다. 반응물은 10mM 1-인산포도당, 2mM MgCl₂, 20mM 완충액을 이용하고, 반응조건 변수로는 온도, pH, 효소비율(투입된 자리옮김 효소와 이성화효소의 활성 비율)이며, 최종 산물 6-인산과당 생산량을 기준으로 평가하여 표 5와 같은 결과를 얻었다.

실험번호	효소비율 (GM:GI)	온도 (℃)	pH	실제 F6P 수율(g/l)	이론적 F6P 수율(g/l)
1	1:2	70	5	1.652144067	1.59684175
2	1:2	70	9	0.138300833	0.08443214
3	1:2	50	7	1.167886	1.48221169
4	1.5:1.5	70	7	1.229571	1.21223371
5	1:2	30	9	0.125368533	0.05371415
6	2:1	30	9	0.154782833	0.17076195
7	1.5:1.5	50	7	1.382317067	1.2509859
8	2:1	70	9	0.314321133	0.40849824
9	2:1	70	5	1.919574667	1.95190585
10	1.5:1.5	50	7	1.434240333	1.2509859
11	2:1	30	5	0.1071289	0.12167439
12	1.5:1.5	50	5	0.9238225	1.06574844
13	2:1	50	7	1.875300533	1.71826764
14	1.5:1.5	30	7	0.1071289	0.28175898
15	1:2	30	5	0.1071289	-0.0263714
16	1.5:1.5	50	9	0.318720567	0.33408742

R=0.964, R²=0.911

본 실시예에서 보는 바와 같이 실험적 데이타와 이론적 데이타 사이의 상관관계는 R값이 0.96, R²값이 0.91로 실험값과 이론값이 일치함을 알 수 있었다. 본 반응표면분석(response surface analysis) 결과에 따르면 효소의 비율은 GM:GI = 1:1.23, 온도 63.5℃, pH 6.85로서 이 조건이 최적 반응조건으로 결정되었다. 생산된 6-인산과당은 실시예 3에서 언급된 분리방법과 실리카 컬럼을 이용한 분리방법을 사용하여 수율 50% 이상, 순도 95% 이상의 순수한 6-인산과당을 얻을 수 있었다.

본 발명을 통하여 내열성 효소를 이용한 인산당의 제조방법, 보다 자세하게는 1-인산포도당, 6-인산포도당, 6-인산과당을 제조하는 생화학적 공정을 확립하였다. 특히 산업용 기질인 전분을 이용하여 고부가가치 잠재 의약품으로서 사용가능한 인산당을 제조할 수 있다는 것이 중요한 효과라고 할 수 있다.

Claims

더머스 속(Thermus sp.) 유래 내열성의 전분인산화효소(starch phosphorylase), 인산포도당 자리옮김효소(phosphoglucomutase), 6-인산포도당 이성질화효소(glucose 6-phosphate isomerase)를 이용하여 반응 온도 40∼80℃에서 수용성 또는 불용성 전분으로부터 6-인산과당을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 더머스 속(Thermus sp.) 유래 플룰란아제(pullulanase)를 부가하여 전분으로부터 6-인산과당을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 인산포도당 자리옮김효소: 6-인산포도당 이성질화 효소는 그 비율이 1:1∼1:1.5인 것을 특징으로 하는, 전분으로부터 6-인산과당을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 반응 온도는 60∼70℃인 것을 특징으로 하는, 전분으로부터 6-인산과당을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 불용성 전분은 농도 0.01g/ℓ∼20g/ℓ인 것을 특징으로 하는, 전분으로부터 6-인산과당을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 6-인산과당 제조공정 후 분리, 정제공정을 부가하는 것을 특징으로 하는, 내열성 효소를 이용하여 전분으로부터 6-인산과당을 제조하는 방법.